SK287954B6 - Human monoclonal antibody or antigen-binding portion thereof that specifically binds to IGF-IR, pharmaceutical composition comprising the antibody or antigen-binding portion thereof, isolated cell line producing the antibody, isolated nucleic acid molecule, vector, host cell, transgenic animal, method of making of antibody or antigen-binding portion thereof and use of the antibody and the isolated nucleic acid molecule - Google Patents

Human monoclonal antibody or antigen-binding portion thereof that specifically binds to IGF-IR, pharmaceutical composition comprising the antibody or antigen-binding portion thereof, isolated cell line producing the antibody, isolated nucleic acid molecule, vector, host cell, transgenic animal, method of making of antibody or antigen-binding portion thereof and use of the antibody and the isolated nucleic acid molecule Download PDF

Info

Publication number
SK287954B6
SK287954B6 SK993-2003A SK9932003A SK287954B6 SK 287954 B6 SK287954 B6 SK 287954B6 SK 9932003 A SK9932003 A SK 9932003A SK 287954 B6 SK287954 B6 SK 287954B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
antibody
igf
antigen
amino acid
acid sequence
Prior art date
Application number
SK993-2003A
Other languages
English (en)
Other versions
SK9932003A3 (en
Inventor
Bruce D. Cohen
Jean Beebe
Penelope E. Miller
James D. Moyer
Jose R. Corvalan
Michael Gallo
Original Assignee
Pfizer Inc.
Amgen Fremont Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22987016&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK287954(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Pfizer Inc., Amgen Fremont Inc. filed Critical Pfizer Inc.
Publication of SK9932003A3 publication Critical patent/SK9932003A3/sk
Publication of SK287954B6 publication Critical patent/SK287954B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/517—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinazoline, perimidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/138—Aryloxyalkylamines, e.g. propranolol, tamoxifen, phenoxybenzamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/65—Insulin-like growth factors (Somatomedins), e.g. IGF-1, IGF-2
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators

Abstract

Described is a human monoclonal antibody or antigen-binding portion thereof that specifically binds to insulin-like growth factor I receptor (IGF-IR), wherein said antibody or portion inhibits the binding of IGF-I or IGF-II to IGF-IR and inhibits tumor growth in-vivo; a pharmaceutical composition comprising thereof; an isolated cell line producing the antibody; an isolated nucleic acid molecule, that encodes a heavy chain or an antigen-binding portion thereof or a light chain or an antigen-binding portion thereof of an antibody; a vector comprising the nucleic acid molecule; a host cell; a non-human transgenic animal; a method of making an anti-IGF-IR antibody or antigen-binding portion thereof and use of the antibody.

Description

Oblasť techniky
Predkladaný vynález sa týka protilátky a antigén viažucej časti protilátky, ktorá sa špecificky viaže na receptor inzulínu podobného rastového faktora I (IGF-IR), ktorým je výhodne humánny IGF-IR. Vynález sa taktiež týka humánnej anti-IFG-IR protilátky, vrátane chimérickej, bišpecifickej, derivatizovanej, jednoreťazovej protilátky alebo časti fúzneho proteínu. Vynález sa taktiež týka izolovaného ľahkého a ťažkého reťazca imunoglobulínovej molekuly odvodenej z anti-IFG-IR protilátky zodpovedajúcej kódujúcej molekuly nukleovej kyseliny. Vynález sa ďalej týka spôsobov prípravy anti-IFG-IR protilátky a farmaceutických kompozícií, ktoré obsahujú tieto protilátky. Vynález sa týka aj použitia protilátok a kompozícií podľa vynálezu pri diagnóze a liečení. Vynález sa ďalej týka génovej terapie s využitím molekuly nukleovej kyseliny kódujúcej ťažký a/alebo ľahký reťazec molekúl imunoglobulínov, ktoré zahrnujú humánne anti-IGF-IR protilátky. Vynález sa tiež týka transgénnych zvierat obsahujúcich molekuly nukleovej kyseliny podľa vynálezu.
Doterajší stav techniky
Rastový faktor podobný inzulínu (IGF-I) je 7,5 kD polypeptid, ktorý cirkuluje v plazme vo vysokých koncentráciách a je detekovateľný vo väčšine tkanív. IGF-I stimuluje bunkovú diferenciáciu a bunkovú proliferáciu a vyžaduje ho väčšina typov cicavčích buniek na udržanie proliferácie. K takýmto bunkovým typom patria, medzi inými, humánne diploidné fibroblasty, epitelové bunky, bunky hladkého svalstva, T lymfocyty, nervové bunky, myeloidné bunky, chondrocyty, osteoblasty a kmeňové bunky kostnej drene. Prehľad širokého spektra bunkových typov, pri ktorých interakcia IGF-I/ receptor IGF-I sprostredkuje bunkovú proliferáciu, je uvedený napr. v Goldring et al., Eukar. Gene Express., 1: 31-326,1991.
Prvým krokom v transdukčnej dráhe vedúcim k IGF-I-stimulovanej bunkovej proliferácii alebo diferenciácii je väzba IGF-I alebo IGF-II (alebo inzulínu vo vyššej ako fyziologickej koncentrácii) k receptoru IGF-I. Receptor IGF-I je zložený z dvoch typov podjednotiek: z alfa podjednotky (130-135 kD proteín, ktorý je plne extracelulámy a jeho funkciou je väzba ligandu) a z beta podjednotky (95-kD transmembránový proteín, s transmembránovými a cytoplazmatickými doménami). IGF-IR patrí k rodine receptorov tyrozínkinázových rastových faktorov (Ullrich et al., Celí 61: 203-212, 1990) a je štrukturálne podobný receptoru inzulínu (Ullrich et al., EMBO J. 5: 2503-2512, 1986). IGF-IR sa najskôr syntetizuje ako jednoreťazcový proreceptorový polypeptid, ktorý je opracovaný glykozyláciou, proteolytickým štiepením a kovalentnou väzbou, takže vytvára zrelý 460 kD heterotetramér, ktorý obsahuje dve alfa-podjednotky a dve beta podjednotky. Beta podjednotka vykazuje tyrozínkinázovú aktivitu aktivovanú ligandom. Táto aktivita je zapojená do signálnej dráhy sprostredkovávajúcej pôsobenie ligandu, ktorá zahrnuje autofosforyláciu beta-podjednotky a fosforyláciu IGF-IR substrátov.
V podmienkach in vivo sú sérové hladiny IGF-I závislé od prítomnosti rastového hormónu (GH) hypofýzy. Aj keď pečeň je hlavným miestom GH-závislej syntézy IGF-I, nedávne práce ukazujú, že väčšina normálnych tkanív tiež produkuje IGF-I. Celý rad nádorových tkanív tiež produkuje IGF-I. Takže IGF-I môže pôsobiť ako regulátor normálnej aj abnormálnej bunkovej proliferácie prostredníctvom autokrinného, parakrinného a tiež endokrinného mechanizmu. IGF-I a IGF-II sa viažu in vivo na IGF väzobné proteíny (IGFBP). Dostupnosť voľného IGF pre interakciu s IGF-IR je modulovaná IGFBP. Prehľad IGFBP a IGF-1 možno nájsť napr. v Grimberg et al., J. Celí. Physiol. 183: 1-9, 2000.
Existujú dôkazy pre úlohu IGF-I a/alebo IGF-IR v udržiavaní nádorových buniek in vitro a in vivo. IGF-IR hladiny sú zvýšené v pľúcnych nádoroch (Kaiser et al., J. Cancer Res. Clin Oncol. 119: 665-668, 1993, Moody et al., Life Sciences 52: 1161-1173, 1993, Macauley et al., Cancer Res., 50: 2511-2517, 1990), prsníku (Poliak et al., Cancer Lett. 38: 223-230, 1987, Foekens et al., Cancer Res. 49: 7002-7009, 1989, Cullen et al., Cancer Res. 49: 7002-7009, 1990, Arteaga et al., J. Clin. Invest. 84: 1418-1423, 1989), v prostate a kólone (Remaole Bennet et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 75: 609-616, 1992, Guo et al., Gastroenterol. 102: 1101-1108, 1992). Deregulovaná expresia IGF-I v epiteli prostaty vedie k neoplázii pri transgénnych myšiach (Digiovanni et al., Proc. Natl. ACAD. Sci. USA 97: 3455-60, 2000). Okrem toho sa zdá, že IGF-I je autokrinným stimulátorom humánnych gliómov (Sandberg-Nordqvist et al., Cancer Res. 53: 2475-2478, 1993), zatiaľ čo IGF-I stimuluje rast fibrosarkómov, ktoré nadmerne exprimujú IGF-IR (Butler et al., Cancer Res. 58: 3021-27, 1998). Ďalej, jedinci s „vysokou normálnou“ hladinou IGF-I majú zvýšené všeobecné riziko karcinómu v porovnaní s jednotlivcami s IGF-I v „nízkej normálnej“ hladine (Rosen et al., Trends Endocrinol. Metab. 10: 136-41, 1999). Mnoho z týchto typov nádorových buniek reaguje na IGF-I proliferatívnym signálom v kultúre (Nakanishi et al., J. Clin. Invest. 82: 354 359, 1988, Freed et al., J. Mol. Endocrinol. 3: 509-514,1989) a bola preto postulovaná existencia autokrinnej alebo parakrinnej slučky na proliferáciu in vivo (LeRoith et al., Endocrine Revs. 16: 143-163, 1995, Yee et al., Mol. Endocrinol. 3: 509-514, 1989). Prehľad o úlohe interakcie IGF-I/IGF-I receptor v raste pri celom rade humánnych nádorov je uvedený v Macaulay, Br. J. Cancer, 65: 311-320,1992.
Zvýšené hladiny IGF-I tiež korelujú s niekoľkými patologickými stavmi inými než je rakovina, ako je napr. akromegália a gigantizmus (Barkan, Cleveland Clin. J. Med. 65: 343, 347-349, 1998), zatiaľ čo abnormálna funkcia IGF-I/IGF-I receptor sa zrejme podieľa na psoriáze (Wraight et al., Nat. Biotech. 18: 521-526, 2000), ateroskleróze a restenóze hladkého svalstva krvných ciev po angioplastike (Bayes-Genis et al., Circ. Res. 86: 125-130, 2000). Zvýšené hladiny IGF-I tiež môžu byť problémom pri diabete alebo jeho komplikáciách, ako je napríklad proliferácia mikrociev (Smith et al., Nat. Med. 5: 1390-1395, 1999). Zníženie hladiny IGF-I, ku ktorému dochádza, inter alia, v prípadoch, keď sú nízke sérové hladiny GH alebo keď existuje necitlivosť alebo rezistencia k GH, je asociované s takými chorobnými stavmi, ako je zakrpatenosť (Laron, Paediatr. Drugs 1: 155-159, 1999), neuropatia, pokles objemu svalovej hmoty a osteoporóza (Rosen et al., Trends Endocrinol. Metab. 10: 136-141, 1999).
S použitím antisense expresných vektorov alebo antisense oligonukleotidov k IGF-IR RNA bolo ukázané, že interferencia s IGF-IR vedie k inhibícii IGF-I-sprostredkovaného alebo IGF-II-sprostredkovaného bunkového rastu (pozri napr. Wraight et al., Nat. Biotech. 18: 521-526, 2000). Antisense stratégia bola úspešná na inhibíciu bunkovej proliferácie pri niekoľkých typoch normálnych buniek a humánnych nádorových bunkových línií. Rast môže byť tiež inhibovaný s použitím peptidových analógov IGF-I (Pietrzkowski et al., Celí Growth & Diff. 3: 199-205, 1992, a Pietrzkowski et al., Mol. Celí. Biol., 12: 3883-3889,1992) alebo vektora exprimujúceho antisense RNA k IGF-I RNA (Trojan et al., Science 259: 94-97, 1992). Okrem toho, protilátky k IGF-IR (Arteaga et al., Breast Canc. Res. Treatm., 22: 101-106, 1992, and Kalebic et al., Cancer Res. 54: 5531-5534, 1994) a dominantné negatívne mutanty IGF-IR (Prager et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2181-2185, 1994, Li et al., J. Biol. Chem., 269: 32558-32564, 1994 a Jiang et al., Oncogene 18: 6071-77, 1999) môžu revertovať transformovaný fenotyp, inhibovať tumorigenézu a indukovať stratu metastázujúceho fenotypu.
IGF-I je tiež dôležitým činiteľom v regulácii apoptózy. Apoptóza, programovaná bunková smrť, je zapojená v celom rade vývojových procesov, vrátane vyzrievania imunitného a nervového systému. Okrem tejto úlohy vo vývoji, apoptóza tiež zrejme pôsobí ako dôležitá bunková zábrana proti tumorigenéze (Williams, Celí 65: 1097-1098, 1991, Lane, Náture 362: 786-787, 1993). Potlačenie apoptotického programu celým radom genetických lézií môže prispieť k rozvoju a progresii malígnych ochorení.
IGF-I chráni pred apoptózou indukovanou odstránením cytokínu IL-3 dependentnej hemopoetickej bunky (Rodriguez-Tarduchy, G. et al., J. Immunol. 149: 535-540, 1992) a odstránením séra pri Rat-l/mycÉR bunkác (Harrington, E., et al., EMBO J. 13: 3286-3295, 1994). Anti-apoptotická funkcia IGF-I je dôležitá v pokojovom stupni bunkového cyklu a tiež pri bunkách, pri ktorých je priebeh bunkového cyklu blokovaný etopozidom alebo tymidínom. Demonštrácia toho, že prežívanie c-myc riadených fibroblastov je závislé od IGF-I, ukazuje na existenciu dôležitej úlohy IGF-IR pri udržiavaní nádorových buniek špecifickou inhibíciou apoptózy, čo je úloha zreteľne odlišná od proliferatívnych účinkov IGF-I alebo IGF-IR. To je podobné úlohe, ktorú zrejme hrajú aj iné anti-apoptotické gény ako napríklad bcl-2 pri podpore prežívania nádorov (McDonnell et al., Celí 57: 79-88, 1989, Hockenberry et al., Náture 348: 334-336, 1990).
Protektívne účinky IGF-I na apoptózu sú závislé od toho, či sú na bunkách prítomné IGF-IR na interakciu s IGF-I (Resnicoff et al., Cancer Res. 55: 3739-3741, 1995). Podpora pre anti-apoptotickú funkciu IGF-IR v udržiavaní nádorových buniek bola tiež poskytnutá v štúdii s použitím antisense oligonukleotidov k IGF-IR, ktorá identifikovala kvantitatívny vzťah medzi hladinou IGF-IR, rozsahom apoptózy a tumorigénnym potenciálom u syngénnych nádorov laboratórneho potkana (Rescinoff et al., Cancer Res. 55: 3739-3741, 1995). Zistilo sa, že overexpresia IGF-IR chráni nádorové bunky in vitro pred apoptózou indukovanou etopozidom (Sell et al., Cancer Res. 55: 303-306, 1995), a ešte výraznejšie, že pokles hladiny IGF-IR pod hladinu zodpovedajúcu divému typu spôsobuje masívnu apoptózu nádorových buniek in vivo (Resnicoff et al., Cancer Res. 55: 2463-2469, 1995).
Potenciálne stratégie pre indukciu apoptózy alebo pre inhibíciu bunkovej proliferácie spojené so zvýšením hladiny IGF-I, zvýšením IGF-11 a/alebo zvýšením IGF-IR receptora zahrnujú zníženie hladiny IGF-I alebo IGF-II, alebo zabránenie väzby IGF-I k IGF-IR. Napríklad dlhodobo pôsobiaci somatostatínový analóg octreotid sa použil na redukciu syntézy a/alebo sekréciu IGF. Rozpustný IGF-IR sa použil na indukciu apoptózy pri nádorových bunkách in vivo a inhibíciu tumorigenézy v experimentálnom zvieracom systéme (D'Ambrosio et al., Cancer Res. 56: 4013-20, 1996). Okrem toho, IGF-IR antisense oligonukleotidy, peptidové analógy IGF-I a protilátky k IGF-IR boli použité na zníženie expresie IGF-I alebo IGF-IR (pozri skôr). Aj tak ale žiadna z týchto zlúčenín nebola vhodná na dlhodobé podávanie (humánnym) pacientom. Navyše, aj keď IGF-I bol podávaný pacientom na liečenie zakrpatosti, osteoporózy, zníženia objemu svalovej hmoty, neuropatie alebo diabetu, väzba IGF-I na 1GFBP často spôsobila, že takáto liečba bola ťažko alebo bola úplne neúčinná.
Preto, s ohľadom na úlohy, ktoré IGF-I a IGF-IR majú v takýchto chorobných stavoch ako karcinóm a iné proliferatívne ochorenia, keď sú IGF-I a/alebo IGF-IR nadmerne exprimované, a úlohy príliš malého množstva IGF-I a IGF-IR pri chorobných stavoch, ako napríklad zakrpatenosť a svalová slabosť, keď sú IGF-I a/alebo IGF-IR nedostatočne exprimované, bolo by potrebné pripraviť protilátky k IGF-IR, ktoré by sa mohli použiť buď na inhibíciu, alebo stimuláciu IGF-IR. Hoci bolo publikované, že anti-IGF-IR protilátky boli zistené pri niektorých pacientoch trpiacich autoimúnnymi ochoreniami, žiadna z týchto protilátok nebola purifikovaná a nebolo ukázané, že by mohla byť vhodná na inhibíciu aktivity IGF-I pre diagnostické alebo terapeutické postupy (pozri napr. Thompson et al., Pediat. Res. 32: 455459, 1988, Tappy et al., Diabetes 37: 1708-1714, 1988, Weightman et al., Autoimmunity 16: 251-257, 1993, Drexhage et al., Nether. J. of Med. 45: 285-293, 1994). Takže sa javí ako potrebné získať vysokoafmitné humánne anti-IGF-IR protilátky, ktoré by sa mohli použiť pri liečení ochorení u ľudí.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1A ukazuje porovnanie nukleotidovej sekvencie variabilných úsekov ľahkého reťazce (VL) protilátok 2.12.1 (SEQ ID NO: 1), 2.13.2 (SEQ ID NO: 5), 2.14.3 (SEQ ID NO: 9) a 4.9.2 (SEQ ID NO: 13) navzájom a tiež so sekvenciou zárodočnej línie Vk A30 (SEQ ID NO: 39).
Obr. 1A - 1C ukazujú vzájomné porovnanie nukleotidových sekvencií variabilných úsekov ľahkého reťazca šiestich humánnych anti-IGF-IR protilátok a tiež ich porovnanie so sekvenciou zárodočnej línie.
Obr. 1B ukazuje porovnanie nukleotidovej sekvencie VL protilátky 4.17.3 (SEQ ID NO: 17) a sekvencie zárodočnej línie Vk 012 (SEQ ID NO: 41).
Obr. 1C ukazuje porovnanie nukleotidovej sekvencie VL protilátky 6.1.1 (SEQ ID NO: 21) a sekvencie zárodočnej línie Vk A27 (SEQ ID NO: 37). Priradenie sekvencií tiež ukazuje CDR úseky VL každej protilátky. Kanonické sekvencie pre obr. 1A-1C sú uvedené v zozname sekvencií ako SEQ ID NO: 53 až 55, v danom poradí.
Obr. 2A - 2D ukazujú vzájomné porovnanie nukleotidových sekvencií variabilných úsekov ťažkého reťazca šiestich humánnych anti-IGF-IR protilátok a porovnanie so sekvenciou zárodočnej línie.
Obr. 2A ukazuje porovnanie nukleotidovej sekvencie VH protilátky 2.12.1 (SEQ ID NO: 3) so sekvenciou zárodočnej línie VH DP-35 (SEQ ID NO: 29).
Obr. 2B ukazuje porovnanie nukleotidovej sekvencie VH protilátky 2.14.3 (SEQ ID NO: 11) a sekvencie zárodočnej línie VIV-4/4,35 (SEQ ID NO: 43).
Obr. 2C-1 a 2C-2 ukazujú porovnanie nukleotidovej sekvencie VH protilátok 2.13.2 (SEQ ID NO: 7), 4.9.2 (SEQ ID NO: 15) a 6.1.1 (SEQ ID NO: 23) navzájom a ešte so sekvenciou zárodočnej línie VH DP-47 (SEQ ID NO: 31).
Obr. 2D ukazuje porovnanie nukleotidovej sekvencie VH protilátky 4.17.3 (SEQ ID NO: 19) so sekvenciou zárodočnej línie VH DP-71 (SEQ ID NO: 35). Porovnanie tiež ukazuje CDR úseky protilátok. Kanonické sekvencie pre obr. 2A - 2D sú uvedené ako SEQ ID NO: 56-59, v danom poradí.
Obr. 3 ukazuje, že anti-IGF-IR protilátky 2.13.2, 4.9.2 a 2.12.1 inhibujú väzbu IGF-I na 3T3-IGF-IR bunky.
Obr. 4 ukazuje, že anti-IGF-IR protilátka 4.9.2 inhibuje IGF-I-indukovanú fosforyláciu tyrozínu receptora (horný panel) a indukuje pokles expresie IGF-IR („down-regulácie“ IGF-IR) na bunkovom povrchu (spodný panel).
Obr. 5 ukazuje, že anti-IGF-IR protilátky 2.13.2 a 4.9.2 redukujú IGF-IR fosfotyrozínovú signalizáciu pri 3 T3-IGF-IR nádoroch.
Obr. 6 ukazuje, že anti-IGF-IR protilátky 2.13.2 a 4.9.2 redukujú IGF-IR pri 3T3-IGF-IR nádoroch.
Obr. 7 ukazuje, že anti-IGF-IR protilátka 2.13.2 inhibuje in vivo rast 3T3-IGF-IR nádorov, samotná (ľavý panel) alebo v kombinácii s adriamycínom (pravý panel).
Obr. 8 ukazuje vzťah medzi sérovou hladinou anti-IGF-IR protilátky 2.13.2 a IGF-IR down-reguláciou pri 3T3-IGF-IR nádoroch.
Obr. 9 ukazuje, že opakované dávky anti-IGF-IR protilátky 2.13.2, samotné alebo v kombinácii s adriamycínom, inhibujú in vivo rast 3T3-IGF-IR nádorov.
Obr. 10 ukazuje, že anti-IGF-IR protilátka 2.13.2 v kombinácii s adriamycínom inhibuje nádorový rast in vivo.
Obr. 11 ukazuje, že anti-IGF-IR protilátka 2.13.2, samotná alebo v kombinácii s 5-deoxyuridínem (5-FU), inhibuje in vivo rast nádoru Colo 205.
Obr. 12 ukazuje, že opakované dávky anti-IGF-IR protilátky 2.13.2, samotné alebo v kombinácii s 5-FU, inhibujú in vivo rast nádoru Colo 205.
Obr. 13 ukazuje, že opakované dávky anti-IGF-IR protilátka 2.13.2, samotné alebo v kombinácii s taxolom, inhibujú in vivo rast nádoru MCF-7.
Obr. 14 ukazuje, že anti-IGF-IR protilátka 2.13.2 inhibuje in vivo rast nádoru MCF-7, buď to samotná (ľavý panel), alebo v kombinácii s adriamycínom (pravý panel).
Obr. 15 ukazuje, že opakované dávky anti-IGF-IR protilátky 2.13.2, samotné alebo v kombinácii s tamoxifenom, inhibujú in vivo rast nádoru MCF-7.
Obr. 16 ukazuje, že opakované dávky anti-IGF-IR protilátky 2.13.2 inhibujú in vivo rast nádoru A431, a to buď samotné, alebo v kombinácii s inhibítorom CP-358,774 tyrozínkinázového receptora epidermálneho rastového faktora (EGF-R).
Obr. 17 ukazuje farmakokinetické hodnotenie jedinej intravenóznej injekcie anti-IGF-IR protilátky 2.13.2 u makaka.
Obr. 18 ukazuje, že kombinácia anti-IGF-IR protilátky 2.13.2 a adriamycínu zosilňuje in vivo down-reguláciu IGF-IR v 3T3-IGF-IR nádoroch.
Obr. 19A ukazuje počet mutácií v rôznych úsekoch ťažkého a ľahkého reťazca 2.13.2 a 2.12.1 v porovnaní so sekvenciou zárodočnej línie.
Obr. 19A-D ukazujú porovnanie aminokyselinovej sekvencie ťažkého a ľahkého reťazca protilátok 2.13.2 a 2.12.1 so sekvenciou zárodočnej línie, z ktorej pochádzajú.
Obr. 19B ukazuje porovnanie aminokyselinovej sekvencie ťažkého reťazca protilátky 2.13.2 (SEQ ID NO: 45) so sekvenciou zárodočnej línie DP-47 (3-23)/D6-19/JH6 (SEQ ID NO: 46).
Obr. 19C ukazuje porovnanie aminokyselinovej sekvencie ľahkého reťazca protilátky 2.13.2 (SEQ ID NO: 47) so sekvenciou zárodočnej línie A30/Jk2 (SEQ ID NO: 48).
Obr. 19D ukazuje porovnanie aminokyselinovej sekvencie ťažkého reťazca protilátky 2.12.1 (SEQ ID NO: 49) so sekvenciou zárodočnej línie DP-35 (3-ll)/D3-3/JH6 (SEQ ID NO: 50).
Obr. 19E ukazuje porovnanie aminokyselinovej sekvencie ľahkého reťazca protilátky 2.12.1 (SEQ ID NO: 51) so sekvenciou zárodočnej línie A30/Jkl (SEQ ID NO: 52).
Pre obr. 19B-E platí, že signálne sekvencie sú uvedené kurzívou, úseky CDR sú podčiarknuté, variabilné domény sú tučným písmom, mutácie kostrových (FR) úsekov sú zvýraznené znamienkom plus („+“) nad aminokyselinovým zvyškom a mutácie úsekov CDR sú zvýraznené hviezdičkou nad aminokyselinovým zvyškom.
Podstata vynálezu
Predkladaný vynález poskytuje izolovanú protilátku alebo antigén-väzobnú časť (t. j. časť viažucu antigén) protilátky, ktorá sa viaže na IGF-IR, výhodne na IGF-IR primátov a človeka, najvýhodnejšie ide o humánnu protilátku. Vynález poskytuje anti-IGF-IR protilátku, ktorá inhibuje väzbu IGF-I alebo IGF-II k IGF-1R, a tiež poskytuje anti-IGF-IR protilátku, ktorá aktivuje IGF-IR.
Vynález poskytuje farmaceutickú kompozíciu obsahujúcu protilátku a farmaceutický prijateľný nosič. Farmaceutická kompozícia môže ďalej obsahovať ďalšie zložky, ako napríklad anti-nádorové agens alebo zobrazovacie činidlo.
Vynález sa ďalej týka aj diagnostických a terapeutických metód. Diagnostické metódy sa týkajú spôsobu diagnózy prítomnosti alebo lokalizácie tkaniva exprimujúceho IGF-IR s použitím anti-IGF-IR protilátky. Terapeutický spôsob zahrnuje podávanie protilátky pacientovi, ktorý to potrebuje, výhodne v spojení s podávaním ďalšieho terapeutického agensu.
Vynález poskytuje izolovanú bunkovú líniu, ako napríklad hybridom, ktorá produkuje anti-IGF-IR protilátku.
Vynález tiež poskytuje molekuly nukleovej kyseliny kódujúce ťažký a/alebo ľahký reťazec anti-IGF-IR protilátok alebo ich antigén-väzobné časti.
Vynález ďalej poskytuje vektory a hostiteľské bunky obsahujúce molekuly nukleovej kyseliny, a tiež spôsoby rekombinantnej produkcie polypeptidov kódovaných molekulami nukleovej kyseliny podľa vynálezu.
A ďalej vynález poskytuje transgénne zvieratá, organizmy iného než ľudského pôvodu, ktoré exprimujú ťažký a/alebo ľahký reťazec alebo jeho antigén-väzobnú časť z anti-IGF-IR protilátky.
Vynález sa tiež týka liečenia pacienta, ktorý to potrebuje, podávaním účinného množstva molekuly nukleovej kyseliny kódujúcej ťažký a/alebo ľahký reťazec alebo jeho antigén-väzobnú časť z anti-IGF-IR protilátky.
Podrobný opis vynálezu
Definície termínov a všeobecné postupy
Ak nie je uvedené inak, vedecké a technické termíny používané v súvislosti s predkladaným vynálezom majú význam, ktorý je odborníkovi všeobecne zrozumiteľný a známy. A ďalej, ak kontext nevyžaduje inak, termíny vyjadrené jednotným číslom zahrnujú aj množné číslo a termíny vyjadrené množným číslom zahrnujú aj jednotné číslo. Všeobecne, nomenklatúra v tomto texte uvádzaná v spojení s metódami bunkových a tkanivových kultúr, molekulárnej biológie, imunológie, mikrobiológie, genetiky a chémie hybridizácie proteínov a nukleových kyselín, je všeobecne v odbore používaná a odborníkovi zrozumiteľná. Metódy a techniky použité v predkladanom vynáleze sú všeobecne uskutočnené podľa obvyklých postupov, ktoré sú pre odborníka známe, ktoré boli opísané v rôznych všeobecných alebo špecifických publikáciách, ktoré sú citované a rozoberané v predkladanom opise, ak nie je uvedené inak. Ide napr. o nasledujúce publikácie: Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989, a Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992, a Harlow and Lane antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1990, ktoré sú zahrnuté formou odkazu v tomto texte. Enzymatické reakcie a purifikačné techniky sú uskutočňované podľa špecifikácií výrobcov, tak ako sa obvykle v odbore používajú, alebo ako je opísané v tomto texte. Nomenklatúra použitá v spojení s laboratórnymi postupmi a technikami analytickej chémie, syntetickej organickej chémie a lekárskej a farmaceutickej chémie, opisovanými v tomto texte, je všeobecne známa a používaná v odbore. Na chemické syntézy, chemické analýzy, formuláciu farmaceutických prípravkov a ich aplikáciu pri liečení pacientov sa používajú štandardné techniky.
Nasledujúce termíny, ak nie je uvedené ešte inak, je treba chápať v nasledujúcom význame:
Termín „polypeptid“ označuje natívny alebo umelý proteín, proteínový fragment a polypeptidový analóg proteínovej sekvencie. Polypeptid môže byť monomémy alebo polymémy.
Termín „izolovaný proteín“ alebo „izolovaný polypeptid“ označuje proteín alebo polypeptid, ktorý v dôsledku svojho pôvodu alebo zdroja (1) nie je asociovaný s prirodzene asociovanými súčasťami, s ktorými je asociovaný vo svojom natívnom stave, (2) je zbavený iných proteínov z toho istého biologického druhu, (3) je exprimovaný bunkou iného biologického druhu alebo (4) nevyskytuje sa v prírode. Takže polypeptid, ktorý bol chemicky syntetizovaný, alebo bol syntetizovaný v bunkovom systéme odlišnom od buniek, v ktorých sa prirodzene tvorí, je „izolovaný“ od svojich prirodzene asociovaných zložiek. Proteín je izoláciou v podstate zbavený prirodzene asociovaných zložiek, a to s využitím techník purifikácie proteínov, ktoré sú dobre známe v odbore.
Proteín alebo polypeptid je „v podstate čistý“, „v podstate homogénny“ alebo „v podstate purifikovaný“, keď aspoň približne 60 až 75 % vzorky vykazuje prítomnosť jediného druhu polypeptidu. Polypeptid alebo proteín môže byť monomémy alebo multimémy. V podstate čistý polypeptid alebo proteín bude typicky obsahovať približne 50 %, 60 %, 70 %, 80 % alebo 90 % (hmotnosť/hmotnosť) proteínu, obvykle má čistotu približne 95 % a výhodne má dokonca 99 % čistotu. Čistota alebo homogenita proteínu môže byť demonštrovaná radom metód známych v odbore, napríklad elektroforézou proteínovej vzorky na polyakrylamidovom géli nasledovanou vizualizáciou pásu, ktorý zodpovedá jednému polypeptidu, zafarbením gélu farbivom, ktoré je v odbore známe. Na niektoré účely možno dosiahnuť vyššieho rozlíšenia s použitím HPLC alebo iných prostriedkov purifikácie, ktoré sú v odbore dobre známe.
Termín „polypeptidový fragment“ (zameniteľný s „fragment polypeptidu“), ako sa v tomto texte používa, sa týka polypeptidu, ktorý má deléciu aminokoncového a/alebo karboxykoncového úseku, ale pritom zostávajúca aminokyselinová sekvencia je totožná so zodpovedajúcimi polohami v prirodzene sa vyskytujúcej sekvencii. Fragmenty sú typicky dlhé aspoň 5, 6, 8 alebo 10 aminokyselín, výhodne sú dlhé aspoň 14 aminokyselín, výhodnejšie sú dlhé aspoň 20 aminokyselín, obvykle sú dlhé aspoň 50 aminokyselín, dokonca výhodnejšie sú aspoň 70, 80, 90, 100, 150 alebo 200 aminokyselín dlhé.
Termín „polypeptidový analóg“, ako sa v tomto texte používa, sa týka polypeptidu, ktorý je zložený zo segmentu obsahujúceho prinajmenšom 25 aminokyselín, ktorý je v podstate identický s časťou aminokyselinovej sekvencie, a ktorý má aspoň jednu z nasledujúcich vlastností: (1) špecificky sa viaže k IGF-IR v podmienkach vhodných pre väzbu, (2) je schopný blokovať IGF-I alebo IGF-II väzbu na IGF-IR alebo (3) je schopný redukovať expresiu IGF-IR na bunkovom povrchu alebo fosforyláciu tyrozínu in vitro alebo in vivo. Typicky polypeptidové analógy obsahujú konzervatívne aminokyselinové substitúcie (alebo inzercie, alebo delécie) v porovnaní s prirodzene sa vyskytujúcou sekvenciou. Analógy sú typicky dlhé aspoň 20 aminokyselín, výhodne aspoň 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 alebo 200 aminokyselín dlhé alebo i dlhšie, a často sú rovnako dlhé ako prirodzene sa vyskytujúci polypeptid celej dĺžky.
Výhodné substitúcie aminokyselín sú také, ktoré: (1) redukujú citlivosť k proteolýze, (2) redukujú citlivosť k oxidácii, (3) menia väzobnú afinitu na vytvorenie proteínového komplexu, (4) menia väzobné afinity všeobecne a (5) zapožičiavajú alebo prispôsobujú ďalšie fyzikálno-chemické alebo funkčné vlastnosti takého analógu. Analógy zahrnujú rôzne muteíny danej sekvencie okrem prirodzene sa vyskytujúcej peptidovej sekvencie. Napríklad jednoduchá alebo mnohonásobná substitúcia aminokyselín (výhodne konzervatívne substitúcie aminokyselín) môže byť vytvorená v prirodzene sa vyskytujúcej sekvencii (výhodne v časti polypeptidu mimo domény (s) vytvárajúcej intermolekuláme kontakty). Konzervatívna aminokyselinová substitúcia by nemala v podstate zmeniť štrukturálnu vlastnosť základnej sekvencie (napr. nahradená aminokyselina by nemala inklinovať k narušeniu špirály, ktorú tvoria základné sekvencie, alebo k narušeniu iného typu sekundárnej štruktúry, ktorá je charakteristická pre základnú sekvenciu). Príklady sekundárnych a terciámych štruktúr polypeptidov, ktoré sú odborníkom známe, sú opísané v publikáciách Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Vyd., W. H. Freeman and Company, New York, 1984), Introduction to Proteín Structure (C. Branden and J. Tooze, vyd., Garland Publishing, New York, N. Y., 1991), a Thomton et al. Náture 354: 105, 1991, ktoré sú zahrnuté formou odkazu v tomto texte.
Nepeptidové analógy sú všeobecne používané vo farmaceutickom priemysle ako liečivá s vlastnosťami podobnými, ako majú templátové peptidy. Tieto typy nepeptidových zlúčenín sú nazývané „peptidové mimetiká“ alebo „peptidomimetiká“ (Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29, 1986, Veber a Freidinger TINS p. 392, 1985, a Evans et al. J. Med. Chem. 30: 1229, 1987, ktoré sú zahrnuté formou odkazu v tomto texte). Takéto zlúčeniny sú často konštruované pomocou počítačového modelovania molekúl. Peptidomimetiká, ktoré sú štrukturálne podobné terapeuticky použiteľným peptidom, môžu byť použité s dosiahnutím rovnocenného terapeutického alebo profylaktického účinku. Všeobecne, peptidomimetiká sú štrukturálne podobné vzorovému polypeptidu (t. j. polypeptidu, ktorý má požadovanú biochemickú vlastnosť alebo farmakologickú aktivitu), ako je napríklad humánna protilátka, ale majú jednu alebo viac peptidových väzieb voliteľne nahradených väzbou vybranou zo skupiny, ktorú tvorí -CH2NH2-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis a trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- a -CH2SO-, a to metódami dobre známymi v odbore. Systematická substitúcia jednej alebo viacerých aminokyselín kanonickej sekvencie D-aminokyselinou rovnakého typu (napr. D-lyzín namiesto L-lyzínu) môže tiež byť využitá na prípravu peptidov s vyššou stabilitou. Okrem toho, obmedzené peptidy obsahujúce kanonickú sekvenciu alebo v podstate totožnú variáciu kanonickej sekvencie môžu byť pripravené metódami známymi v odbore (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61: 387, 1992, zahrnuté formou odkazu v tomto texte), napríklad pridanie vnútorného cysteínového zvyšku schopného vytvoriť intramolekulámy disulfidický mostík, ktorým sa cyklizuje peptid.
„Imunoglobulín“ je tetraméma molekula. V prirodzene sa vyskytujúcom imunoglobulíne je každý tetramér zložený z dvoch totožných párov polypeptidových reťazcov, každý pár obsahuje jeden „ľahký“ (približne 25 kDa) a jeden „ťažký“ reťazec (približne 50-70 kDa). Aminokoncová časť každého reťazca zahrnuje variabilný úsek približne 100 až 110 alebo aj viac aminokyselín, ktorý je primáme zodpovedný za rozpoznávanie antigénu. Karboxykoncová časť každého reťazca definuje konštantný úsek primáme zodpovedný za efektorové funkcie. Humánne ľahké reťazce sú klasifikované ako κ a λ ľahké reťazce. Ťažké reťazce sú označované ako μ, Δ, γ, a alebo ε, čím sú definované protilátkové izotypy IgM, IgD, IgG, IgA a IgE, v danom poradí. V ľahkom a ťažkom reťazci sú variabilné a konštantné úseky spojené „J“ úsekom z približne 12 alebo viac aminokyselín, a ťažký reťazec ešte obsahuje „D“ úsek z približne 10 či viac aminokyselín. Pozri Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., vyd., 2. vyd. Raven Press, N. Y., 1989) (zahrnuté formou odkazu). Variabilné úseky z každého páru ľahkého/ťažkého reťazca vytvárajú väzobné miesto pre protilátku, takže intaktný imunoglobulín má dve väzobné miesta.
Imunoglobulínové reťazce majú rovnakú všeobecnú štruktúru s relatívne konzervatívnymi rámcovými úsekmi (FR) spojenými troma hypervariabilnými úsekmi, ktoré sa označujú ako „komplementaritu určujúce úseky“ alebo CDR. CDR z dvoch reťazcov každého páru sú spojené rámcovými úsekmi, čo umožňuje väzbu k špecifickému epitopu. Smerom od N-konca k C-koncu, ľahký a ťažký reťazec obsahujú domény FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 a FR4. Priradenie aminokyselín do každej domény je v súlade s definíciou podľa Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 a 1991)), alebo Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987, Chothia et al. Náture 342: 878-883, 1989.
Termín „protilátka“ sa týka intaktného imunoglobulínu alebo jeho antigén-väzobnej časti (t. j. časti protilátky schopnej viazať antigén), ktorá kompetuje s intaktnou protilátkou o špecifickú väzbu. Antigén-väzobné časti môžu byť pripravené technikami rekombinantnej DNA alebo enzymatickým, alebo chemickým štiepením intaktných protilátok. Antigén-väzobné časti zahrnujú, inter alia, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb a fragmenty úsekov určujúcich komplementaritu (CDR), jednoreťazcovej protilátky (scFv), chimérickej protilátky, tzv. „diabodies“ a polypeptidy, ktoré obsahujú aspoň časť imunoglobulínu, ktorá je dostatočná na to, aby im prepožičala schopnosť špecifickej väzby k antigénu.
Ako sa v tomto texte používa, protilátka, ktorá je označená napr. 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 4.9.2, 4.17.3 alebo 6.1.1, je protilátka, ktorá pochádza z hybridómu rovnakého mena. Napríklad protilátka 2.12.1 pochádza z hybridómu 2.12.1.
Fab fragment je monovalentný fragment, ktorý tvorí VL, VH, CL a CH1 domény, F(ab')2 fragment je dvojvalentný fragment pozostávajúci z dvoch Fab fragmentov spojených disulfidovým mostíkom v tzv. oblastiach kĺbu, Fd fragment obsahuje VH a CH1 domény, Fv fragment obsahuje VL a VH domény jedného ramena protilátky a dAb fragment (Ward et al., Náture 341: 544-546, 1989) pozostáva z VH domény.
Jednoreťazcová protilátka (scFv) je protilátka, kde VL a VH úseky sú párované a vytvárajú monovalentnú molekulu prostredníctvom syntetickej spojovacej sekvencie (linkeru), ktorá umožňuje vytvoriť jednoduchý proteínový reťazec (Bird et al., Science 242: 423-426, 1988 and Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883, 1988). Tzv. „diabodies“ sú divalentné bišpecifické protilátky, kde VH a VL domény sú exprimované na jednoduchom polypeptidovom reťazci, ale s použitím linkera, ktorý je príliš krátky na to, aby sa umožnilo párovanie medzi dvoma doménami na rovnakom reťazci, a tým sú domény nútené k párovaniu s komplementárnymi doménami ďalšieho reťazca a vytvárajú sa tak dve väzobné miesta pre antigén (pozri napr. Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, 1993 a Poljak, R. J., et al., Structure 2: 1121-1123, 1994). Jeden alebo viac úsekov CDR môže byť zavedených do molekuly buďto kovalentne, ale7 bo nekovalentné, čím sa pripravia tzv. imunoadhezíny. Imunoadhezíny môžu obsahovať jeden alebo viac CDR ako časť väčšieho polypeptidového reťazca, môžu kovalentne spojovať CDR s ďalším polypeptidovým reťazcom alebo môžu zaviesť CDR do molekuly nekovalentne. CDR dovoľujú imunoadhezínom viazať sa špecificky na požadovaný konkrétny antigén.
Protilátka môže mať jedno alebo viac väzobných miest. Ak existuje viac než jedno väzobné miesto, potom väzobné miesta môžu byť navzájom totožné alebo môžu byť rôzne. Napríklad prirodzene sa vyskytujúci imunoglobulín má dve totožné väzobné miesta, jednoreťazcová protilátka alebo Fab fragment majú jedno väzobné miesto, zatiaľ čo „bišpecifická“ alebo „bifunkčná“ protilátka má dve rôzne väzobné miesta.
„Izolovaná protilátka“ je protilátka, ktorá (1) nie je spojená (asociovaná) so zložkami, s ktorými je spojená v prírodnom stave, vrátane ostatných prirodzene asociovaných protilátok, ktoré ju sprevádzajú v jej natívnom stave, (2) je bez iných proteínov rovnakého druhu, (3) je exprimovaná bunkou iného biologického druhu alebo (4) vôbec sa nevyskytuje v prírode. Príklady izolovaných protilátok zahrnujú anti-IGF-IR protilátku, ktorá bola afinitne purifikovaná s použitím IGF-IR, anti-IGF-IR protilátku, ktorá bola syntetizovaná hybridómom alebo inou bunkovou líniou in vitro a humánnu anti-IGF-IR protilátku pochádzajúcu z transgénnej myši.
Termín „humánna protilátka“ zahrnuje všetky protilátky, ktoré majú jeden alebo viac variabilných a konštantných úsekov pochádzajúcich z humánnej imunoglobulínovej sekvencie. Vo výhodnom uskutočnení všetky variabilné a konštantné domény pochádzajú z humánnej imunoglobulínovej sekvencie (plne humánna protilátka). Tieto protilátky môžu byť pripravené celým radom postupov, ako bude opísané.
Humanizovaná protilátka je taká protilátka, ktorá pochádza z iného biologického druhu než človeka, kde určité aminokyseliny v rámcovom úseku a konštantných doménach ťažkého a ľahkého reťazca boli mutované tak, aby bola zrušená alebo odstránená imunitná reakcia u ľudí. Alternatívne, humanizovaná protilátka môže byť vytvorená fuziou konštantnej domény z humánnej protilátky s variabilnými doménami iného než ľudského pôvodu. Príklady prípravy humanizovaných protilátok možno nájsť v patentoch US 6,054,297, US 5,886,152 a US 5,877,293.
Termín „chimérická protilátka“ sa týka protilátky, ktorá obsahuje jeden alebo viac úsekov z jednej protilátky a jeden alebo viac úsekov z jednej alebo viacerých iných protilátok. Vo výhodnom uskutočnení jeden alebo viac CDR pochádzajú z humánnej anti-IGF-IR protilátky. Vo výhodnejšom uskutočnení všetky CDR pochádzajú z humánnej anti-IGF-IR protilátky. V ďalšom výhodnom uskutočnení CDR z viac ako jednej humánnej anti-IGF-IR protilátky sú zmiešané a zostavené v chimérickej protilátke. Napríklad chimérická protilátka môže zahrnovať CDR1 z ľahkého reťazca prvej humánnej anti-IGF-IR protilátky v kombinácii s CDR2 a CDR3 z ľahkého reťazca druhej humánnej anti-IGF-IR protilátky a CDR ťažkého reťazca môže pochádzať z tretej anti-IGF-IR protilátky. A ďalej rámcové úseky môžu pochádzať z jednej rovnakej anti-IGF-IR protilátky, z jednej alebo viacerých rôznych protilátok, ako napríklad humánne protilátky, alebo z humanizovanej protilátky.
„Neutralizačná protilátka“ alebo „inhibičná protilátka“ je protilátka, ktorá inhibuje väzbu IGF-IR k IGF-I, keď nadbytok anti-IGF-IR protilátky redukuje množstvo IGF-I viazaného k IGF-IR aspoň približne o 20 %. Vo výhodnom uskutočnení protilátka redukuje množstvo IGF-I viazaného k IGF-IR aspoň o 40 %, výhodnejšie o 60 %, dokonca výhodnejšie o 80 % alebo dokonca ešte výhodnejšie o 85 %. Redukcia väzby môže byť meraná ktoroukoľvek metódou v odbore známou, napríklad v in vitro kompetitívnom väzobnom teste. Príklad merania redukcie väzby IGF-I k IGF-IR je prezentovaný ďalej v príklade 4.
„Aktivačná protilátka“ je protilátka, ktorá aktivuje aspoň približne 20 % IGF-IR, keď je pridaná k bunke, tkanivu alebo organizmu, ktoré exprimujú IGF-IR. Vo výhodnom uskutočnení protilátka aktivuje IGF-IR aktivitu na aspoň 40 %, výhodnejšie 60 %, dokonca ešte výhodnejšie 80 % alebo dokonca najvýhodnejšie 85 %. Vo výhodnejšom uskutočnení aktivačná protilátka je pridaná v prítomnosti IGF-I alebo IGF-II. V ďalšom výhodnom uskutočnení je aktivita aktivačnej protilátky meraná tým, že sa určuje množstvo autofosforylácie tyrozínu IGF-IR.
Fragmenty alebo analógy protilátok môžu byť ľahko pripravené odborníkom na základe predloženého opisu. Výhodné aminokoncové a karboxykoncové fragmenty alebo analógy sa vyskytujú v blízkosti hraníc funkčných domén. Štrukturálne a funkčné domény môžu byť identifikované porovnaním nukleotidovej a/alebo aminokyselinovej sekvencie s dátami, ktoré sú vo verejných alebo súkromných databázach. Výhodne sa použijú počítačové porovnávacie metódy na rozpoznanie sekvenčných motívov alebo predikciu proteínových konformačných domén, ktoré sa vyskytujú pri iných proteínoch so známou štruktúrou a/alebo funkciou. Metódy identifikácie proteínových sekvencií, ktoré sa zvinujú do známych trojrozmerných štruktúr, sú známe (Bowie et al. Science 253: 164,1991).
Termín „povrchová plazmónová rezonancia“, ako sa v tomto texte používa, sa týka optického javu, ktorý umožňuje analyzovať biošpecifické interakcie v reálnom čase tým, že sa detegujú zmeny v proteínových koncentráciách v biosenzorovej matici, napríklad s použitím systému BIACORE (Pharmacia Biosenzor AB, Uppsala, Švédsko a Piscataway, N. J.). Pre ďalší opis napr. pozri Jonsson, U., et al., 1993, Ann. Biol. Clin.
51: 19-26, Jonsson, U., et al., 1991, Biotechniques 11: 620-627, Johnsson, B., et al., 1995, J. Mol. Recognit. 8: 125-131 a Johnson, B., et al., 1991, Anál. Biochem. 198: 268-277.
Termín „Kofe“ sa týka rýchlostnej konštanty na oddelenie protilátky z komplexu protilátka/antigén.
Termín „Kď‘ sa týka disociačnej konštanty konkrétnej interakcie protilátka-antigén.
Termín „epitop“ označuje akýkoľvek proteínový determinant schopný špecifickej väzby k imunoglobulínu alebo receptoru T lymfocytu. Epitopové determinanty obvykle pozostávajú z chemicky aktívneho povrchového zoskupenia molekúl, ako sú napríklad aminokyseliny alebo sacharidové postranné reťazce a obvykle majú špecifické priestorové (trojrozmerné) štrukturálne vlastnosti, a tiež špecifické vlastnosti, ak ide o náboj. Protilátky špecificky viažu antigén, keď je disociačná konštanta < 1 μΜ, výhodne < 100 nM a najvýhodnejšie je < 10 nM.
Ako sa v tomto texte uvádza, dvadsať obvyklých aminokyselín a ich skratky sa používajú podľa bežných zvyklostí v odbore (pozri publikáciu Immunology-A Synthesis, 2d Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Ed., Sinauer Associates, Sunderland, Mass., 1991, ktorá je zahrnutá formou odkazu v tomto texte). Stereoizoméry (napr. D-aminokyselina) dvadsiatich obvyklých aminokyselín, „neprírodné“ aminokyseliny (v prírode sa nevyskytujúce) ako napríklad α-, α-disubstituované aminokyseliny, N-alkylaminokyseliny, kyselina mliečna a iné nekonvenčné aminokyseliny môžu tiež byť vhodnými zložkami polypeptidov podľa predkladaného vynálezu. Príklady nekonvenčných aminokyselín zahrnujú: 4-hydroxyprolín, γ-karboxyglutamát, ε-Ν, N, N-trimetyllyzín, ε-Ν-acetyllyzín, O-fosfoserín, N-acetylserín, N-formylmetionín, 3-metylhistidín, 5-hydroxylyzín, ε-N-metylarginín a ďalšie podobné aminokyseliny a iminokyseliny (napr. 4-hydroxyprolín). V zápise polypeptidov, ktorý sa používa v tomto texte, je smer doľava amino-koncový smer a smer doprava je karboxykoncový smer, čo zodpovedá štandardu a konvencii.
Termín „polynukleotid“, ako sa používa v tomto texte, znamená polymému formu nukleotidov obsahujúcich aspoň 10 báz, buďto ribonukleotidov, alebo deoxynukleotidov, alebo modifikovaných foriem oboch z uvedených typov nukleotidov. Termín zahrnuje jednoduché a dvojvláknové (dvojreťazcové) formy DNA.
Termín „izolovaný polynukleotid“, ako sa v tomto texte používa, znamená polynukleotid genómového, cDNA alebo syntetického pôvod, alebo akejkoľvek ich kombinácie, ktorý z dôvodu svojho pôvodu ako „izolovaný polynukleotid“ (1) nie je asociovaný ani so všetkými ani časťou polynukleotidov, s ktorými je „izolovaný polynukleotid“ asociovaný v prírode, (2) je operatívne pripojený na polynukleotid, s ktorým nie je spojený v prírode alebo (3) nevyskytuje sa v prírode ako časť väčšej sekvencie.
Termín „oligonukleotid“ v tomto texte zahrnuje prirodzene sa vyskytujúce a modifikované nukleotidy spojené prirodzene sa vyskytujúcimi oligonukleotidovými väzbami a oligonukleotidovými väzbami, ktoré sa prirodzene nevyskytujú. Oligonukleotidy sú podmnožinou polynukleotidov všeobecne obsahujúcou 200 báz alebo menej. Výhodne oligonukleotidy sú dlhé 10 až 60 báz, a najvýhodnejšie 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 alebo 20 až 40 báz. Oligonukleotidy sú obvykle jednoduché vlákna, napr. pre sondy, aj keď oligonukleotid môže byť dvojvláknový, napr. oligonukleotid na použitie v konštrukcii génových mutantov. Oligonukleotidy podľa vynálezu môžu byť buď „sense“, alebo „antisense“ oligonukleotidy.
Termín „prirodzene sa vyskytujúce nukleotidy“ v tomto texte zahrnuje deoxyribonukleotidy a ribonukleotidy. Termín „modifikované nukleotidy“ v tomto texte zahrnuje nukleotidy s modifikovanými alebo substituovanými sacharidovými skupinami a pod. Termín „oligonukleotidové väzby“ v tomto texte zahrnuje oligonukleotidové väzby, ako je napríklad väzba fosforotioátová, fosforoditioátová, fosforoselenoátová, fosforodiselenoátová, fosforoanilotioárová, fosforaniladátová, fosforamidátová a pod. (pozri napr. LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14: 9081, 1986, Steč et al. J. Am. Chem. Soc. 106: 6077, 1984, Stein et al. Nucl. Acids Res. 16: 3209, 1988, Zon et al. anti-Cancer Drug Design 6: 539,1991, Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Vyd., Oxford University Press, Oxford England, 1991), Steč et al., patent US 5,151,510, Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90: 543,1990).
Ak je to potrebné, oligonukleotid môže obsahovať „značku“ pre detekciu.
„Operatívne spojené“ sekvencie zahrnujú expresné kontrolné sekvencie, ktoré sú bezprostredne susediace s požadovaným génom, tak aj expresné kontrolné sekvencie, ktoré pôsobia v trans alebo na diaľku kontrolujú požadovaný gén. Termín „expresné kontrolné sekvencie“, ako sa v tomto texte používa, sa týka polynukleotidových sekvencií, ktoré sú nutné na realizáciu expresie a opracovanie kódujúcej sekvencie, ku ktorej sú ligované. Expresné kontrolné sekvencie zahrnujú vhodné sekvencie iniciácie a ukončenia transkripcie, promótorové a enhancerové (zosilňujúce) sekvencie, účinné sekvencie opracovania RNA ako napríklad zostrihové a polyadenylačné signály, sekvencie stabilizujúce cytoplazmatickú mRNA, sekvencie zosilňujúce translačnú účinnosť (t. j. Kozákova kanonická sekvencie), sekvencie zlepšujúce stabilitu proteínu, sekvencie zosilňujúce sekréciu proteínu. Povaha takej kontrolnej sekvencie závisí od hostiteľského organizmu, pri prokaryotoch takéto kontrolné sekvencie všeobecne zahrnujú promótor, ribozomálne väzobné miesto a sekvenciu pre termináciu transkripcie, pri eukaryotoch všeobecne takéto kontrolné sekvencie zahrnujú promótor a sekvenciu pre termináciu transkripcie. Termín „kontrolná sekvencia“ zahrnuje prinajmenšom všetky zložky, ktorých prítomnosť je esenciálna pre expresiu a opracovanie a môže tiež zahrnovať ďalšie zložky, ktorých prítomnosť je výhodná, napríklad vedúce sekvencie a fúzne partnerské sekvencie.
Termín „vektor“, ako je použitý v tomto texte, sa týka molekuly nukleovej kyseliny schopnej transportovať ďalšiu nukleovú kyselinu, s ktorou bol spojený. Jeden typ vektora je „plazmid“, čo je kruhová dvoj vláknová DNA slučka, do ktorej môžu byť ligované ďalšie segmenty DNA. Ďalším typom vektora je vírusový vektor, kde ďalšie DNA segmenty môžu byť ligované do vírusového genómu. Určité vektory sú schopné autonómnej replikácie v hostiteľskej bunke, do ktorej sú vnesené (napr. bakteriálne vektory majúce bakteriálny replikačný počiatok a epizomálne cicavčie vektory). Iné vektory (napr. neepizomálne cicavčie vektory) môžu byť integrované do genómu hostiteľskej bunky po vnesení do hostiteľskej bunky a preto sú kopírované spoločne s hostiteľským genómom. Navyše určité vektory sú schopné riadiť expresiu génu, ku ktorému sú operatívne pripojené. Takéto vektory sa v tomto texte nazývajú „rekombinantné expresné vektory“ (alebo jednoducho „expresné vektory“). Všeobecne platí, že expresné vektory použiteľné v rekombinantných DNA technikách sú často vo forme plazmidu. V predkladanom opise preto termíny „plazmid“ a „vektor“ môžu byť použiteľné zameniteľné, pretože plazmid je najčastejšie používaná forma vektora. Ale, vynález zahrnuje aj iné formy expresných vektorov, ako napríklad vírusové vektory (napr. replikačne defektné retrovírusy, adenovírusy a adeno-asociované vírusy), ktoré majú ekvivalentné funkcie.
Termín „rekombinantná hostiteľská bunka“ (alebo jednoducho „hostiteľská bunka“), ako je použitý v tomto texte, sa týka bunky, do ktorej sa vniesol rekombinantný expresný vektor. Je treba rozumieť, že tento termín nezahrnuje iba konkrétnu bunku, ale aj potomstvo takejto bunky. Pretože sa môžu vyskytovať určité modifikácie v následných generáciách spôsobené buďto mutáciou, alebo environmentálnymi vplyvmi, takéto potomstvo nemôže v skutočnosti byť totožné so základnou, rodičovskou bunkou, ale aj tak je zahrnuté v rozsahu termínu „hostiteľská bunka“, ako sa v tomto texte používa.
Termín „selektívne hybridizovať“ v tomto texte znamená špecificky a detekovateľne viazať. Polynukleotidy, oligonukleotidy a fragmenty podľa vynálezu selektívne hybridizujú s vláknom nukleovej kyseliny v podmienkach hybridizácie, a premývania, ktoré významne minimalizujú detekovateľnú väzbu k nešpecifickým nukleový kyselinám. „Vysoko stringentné“ alebo „vysoko prísne“ podmienky sa používajú na dosiahnutie selektívnej hybridizácie ako je v odbore známe a ako je ďalej ešte diskutované. Príkladom „vysoko stringentných“ alebo „veľmi prísnych“ podmienok je spôsob inkubácie polynukleotidu s ďalším polynukleotidom, keď jeden polynukleotid môže byť fixovaný na povrchu pevnej látky, ako je napríklad membrána, v hybridizačnom pufri obsahujúcom 6x SSPE alebo SSC, 50 % formamid, 5x Denhardtovo činidlo, 0,5 % SDS, 100 pg/ml denaturovanej DNA z lososích spermií, pri hybridizačnej teplote 42 °C počas 12 - 16 hodín, po ktorom nasleduje dvakrát premytie v 55 °C v premývacom pufri s lx SSC, 0,5 % SDS (podrobnejšie pozri Sambrook et al., ktorý už bol citovaný, str. 9,50-9,55).
Termín „percento sekvenčnej identity“ v kontexte sekvencii nukleovej kyseliny sa týka dvoch sekvencii, ktoré sú rovnaké, keď sa priradia (porovnajú) kvôli dosiahnutiu maximálnej zhody. Dĺžka sekvencie porovnania identity môže byť aspoň deväť nukleotidov, obvykle aspoň 18 nukleotidov, obvyklejšie aspoň 24 nukleotidov, typicky aspoň približne 28 nukleotidov, typickejšie aspoň 32 nukleotidov a výhodne aspoň približne 36, 48 alebo ešte viac nukleotidov. V odbore je známy rad rôznych algoritmov, ktoré môžu byť použité na určenie miery identity nukleotidových sekvencii. Napríklad polynukleotidové sekvencie môžu byť porovnávané s použitím algoritmov FASTA, Gap alebo Bestfit, ktoré sú súčasťou programového balíka Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, ktorý zahrnuje, napr. programy FASTA2 a FASTA3, poskytuje porovnanie sekvencii a určí percento sekvenčnej, identity úseku najlepšieho priradenia (prekrytia) medzi skúmanou a vyhľadanou sekvenciou (Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98, 1990, Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219, 2000, Pearson, Methods Enzymol. 266: 227-258, 1996, Pearson, J. Mol. Biol. 276: 71-84, 1998, v tomto texte zahrnuté formou odkazu). Ak nie je uvedené inak, pre konkrétny program alebo algoritmus sú použité štandardné parametre. Napríklad percentá sekvenčnej identity medzi sekvenciami nukleovej kyseliny môžu byť určené s použitím programu FASTA s jeho štandardnými parametrami (veľkosť slova 6 a faktor pre skórovací matrix NOPAM) alebo s použitím programu GAP so štandardnými parametrami, ktoré poskytuje GCG Verzia 6,1, ktoré sú v tomto texte zahrnuté formou odkazu.
Ak sa v texte odkazuje na sekvenciu nukleovej kyseliny, potom je zahrnutý aj jej komplement (komplementárna sekvencia), ak nie je uvedené inak. Takže doteraz sa opis týka molekuly nukleovej kyseliny majúcej konkrétnu sekvenciu, zahrnuje aj jej komplementárne vlákno, s jej komplementárnou sekvenciou.
V odbore molekulárnej biológie sa termíny „percentá sekvenčnej identity“, „percentá sekvenčnej podobnosti“ a „percentá sekvenčnej homológie“, resp. termíny „sekvenčná identita“, „sekvenčná podobnosť“ a „sekvenčná homológia“ používajú úplne zameniteľné. V tejto prihláške majú tieto termíny rovnaký význam iba ak ide o sekvencie nukleovej kyseliny.
Termín „podstatná podobnosť“ alebo „podstatná sekvenčná podobnosť“, vo vzťahu k nukleovým kyselinám alebo ich fragmentom, odkazuje na to, že keď sa sekvencia optimálne priradí (porovná) použitím vhodnej nukleotidovej inzercie alebo delécie s ďalšou nukleovou kyselinou (alebo jej komplementárnym vláknom), dosiahne sa nukleotidovej sekvenčnej identity aspoň približne 85 %, výhodne aspoň približne 90 % a výhodnejšie aspoň približne 95 %, 96 %, 97 %, 98 % alebo 99 % nukleotidových báz, pri meraní ktorýmkoľ10 vek známym algoritmom pre sekvenčnú identitu, ako je napríklad FASTA, BLAST alebo Gap, ako sa už opísalo.
Ak ide o polypeptidy, potom termín „podstatná identita“ znamená, že dve peptidové sekvencie, keď sú optimálne porovnané, ako napríklad pomocou programu GAP alebo BESTFIT s použitím štandardnej váhy pre medzeru, majú aspoň 75 % alebo 80 % sekvenčnú identitu, výhodne aspoň 90 % alebo 95 % sekvenčnú identitu, dokonca výhodnejšie aspoň 98 % alebo 99 % sekvenčnú identitu. Výhodne, pozícia zvyškov, ktoré nie sú totožné, sa líši vďaka konzervatívnej substitúcii aminokyselín. „Konzervatívna substitúcia aminokyseliny“ je taká substitúcia, keď jeden aminokyselinový zvyšok je substituovaný iným aminokyselinovým zvyškom majúcim postranný reťazec (R skupina) s podobnými chemickými vlastnosťami (ako je napr. náboj alebo hydrofobicita). Všeobecne, konzervatívne substituovaná aminokyselina v podstate nemení funkčné vlastnosti proteínu. V prípadoch, kde sa dve alebo viac aminokyselinových sekvencii líši konzervatívnou substitúciou, percentá sekvenčnej identity alebo miery podobnosti môžu byť korigované smerom k vyšším hodnotám vzhľadom na konzervatívnu povahu substitúcie. Prostriedky na takéto úpravy sú odborníkom známe, pozri napr. Pearson, Methods Mol. Biol. 24: 307-31, 1994, v tomto texte zahrnuté formou odkazu. Príklady skupín aminokyselín, ktoré majú postranné reťazce s podobnými chemický vlastnosťami, zahrnujú (1) alifatické postranné reťazce: glycín, alanín, valín, leucín a izoleucín, (2) alifatické-hydroxylové postranné reťazce: serín a treonín, (3) amid obsahujúce postranné reťazce: asparagín a glutamín, (4) aromatické postranné reťazce: fenylalanín, tyrozín a tryptofán, (5) bázické postranné reťazce: lyzín, arginín a histidín a (6) síru obsahujúce postranné reťazce: cysteín a metionín. Výhodnými konzervatívnymi aminokyselinovými substitučnými skupinami sú nasledujúce skupiny: valín-leucín-izoleucín, fenylalanín-tyrozín, lyzín-arginín, alanín-valín, glutamát-aspartát a asparagín-glutamín.
Alternatívne, konzervatívna substitúcia je akákoľvek zmena majúca pozitívnu hodnotu v PAM250 logpravdepodobnostnej matici opísanej v Gonnet et al., Science 256: 1443-45, 1992, v tomto texte zahrnutej formou odkazu. „Mierne konzervatívna“ substitúcia je ktorákoľvek zmena majúca hodnotu v PAM250 logaritmickej pravdepodobnostnej matici inú než negatívnu.
Sekvenčná podobnosť polypeptidov, ktorá sa tiež nazýva sekvenčná identita, je typicky meraná s použitím softvéru pre analýzy sekvencie. Softvér pre analýzy proteínov priraďuje podobné sekvencie na základe miery podobnosti priradenej rôznym substitúciám, deléciám a iným modifikáciám, vrátane konzervatívnych substitúcií aminokyselín. Napríklad programový balík GCG obsahuje programy ako napríklad „Gap“ a „Bestfit , ktoré môžu byť použité so štandardnými parametrami na určovanie sekvenčnej homológie alebo sekvenčnej identity medzi blízko príbuznými polypeptidmi, ako sú napríklad homológne polypeptidy z rôznych druhov organizmov, alebo medzi proteínom divého typu a jeho muteínom (pozri napr. GCG Verzia 6,1). Polypeptidové sekvencie tiež môžu byť porovnávané pomocou programu FASTA s použitím štandardných alebo doporučených parametrov, čo je tiež program v GCG Verzia 6,1. FASTA (napr. FASTA2 a FASTA3) poskytuje porovnanie a percentá sekvenčnej identity pre úseky najlepšieho prekrývania medzi skúmanou a vyhľadávanou sekvenciou (Pearson, 1990, Pearson, 2000). Ďalší výhodný algoritmus na porovnanie sekvencie podľa vynálezu s databázou obsahujúcou veľký počet sekvencii z rôznych organizmov je počítačový program BLAST, obzvlášť jeho varianty blastp alebo tblastn, s použitím štandardných parametrov (pozri napr. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990, Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-402, 1997, v tomto texte zahrnuté formou odkazu).
DÍžka polypeptidovej sekvencie porovnávanej kvôli homológii je všeobecne aspoň asi 16 aminokyselinových zvyškov, obvykle aspoň asi 20 zvyškov, obvyklejšie aspoň približne 24 zvyškov, typicky aspoň približne 28 zvyškov a výhodne viac než približne 35 zvyškov. Keď sa prehľadáva databáza obsahujúca sekvencie z veľkého počtu rôznych organizmov, je výhodné porovnávať aminokyselinové sekvencie.
Ako sa v tomto texte používa, termíny „značka“ alebo „značený“ sa týkajú inkorporácie ďalšej molekuly do protilátky. V jednom uskutočnení vynálezu je značka detekovateľný marker, napr. inkorporácia rádioaktívne značenej aminokyseliny do polypetidu alebo pripojenie biotinylových skupín k polypeptidu, ktoré môžu byť detekované značeným avidinom (napr. streptavidinom obsahujúcim fluorescenčné markery alebo enzymatickú aktivitu, ktorý môže byť detekovaný optickými alebo kolorimetrickými metódami). V ďalšom uskutočnení značka alebo marker môžu byť terapeutické, napr. konjugát s liečivom alebo toxín. Rôzne metódy značenia polypeptidov a glykoproteínov sú známe v odbore a môžu byť použité. Príklady značiek pre polypeptidy zahrnujú, ale bez obmedzenia, nasledujúce: rádioizotopy alebo rádionuklidy (napr. 3H, l4C, l5N, 35S, 9θγ, 99jc, i 11 jn i25j, ΐ3ΐ|χ fluroescenčné značky (napr. FITC, rodamín, lantanoidové fosforeskujúce látky), enzymatické značky (napr. chrenová peroxidáza, p-galaktozidáza, luciferáza, alkalická fosfatáza), chemiluminescenčné značky, biotinylové skupiny, predeterminované polypeptidové epitopy rozpoznávané sekundárnym reportérom (napr. sekvencie leucínového zipsu, väzobné miesta pre sekundárne protilátky, väzobné domény kovov, epitopové „prívesky“), magnetické činidlá ako napríklad cheláty gadolínia, toxíny ako napríklad toxín čierneho kašľa, taxol, cytochalasín B, gramicidín D, etídium bromid, emetín, mitomycín, etoposid, tenoposid, vinkristín, vinblastín, kolchicín, doxorubicin, daunorubicín, dihydroxydion antracínu, mitoxan11 trón, mitramycín, aktinomycín D, 1-dehydrotestosterón, glukokortikoidy, prokaín, tetrakaín, lidokaín, propranolol a puromycín a ich analógy alebo homológy.
V niektorých uskutočneniach sú značky pripojené pomocou oddeľovača, spaceru, rôznych dĺžok, aby sa znížila možnosť sférických zábran.
Termín „agens“ alebo „činidlo“ sa používa v tomto texte na označenie chemickej zlúčeniny, zmesi chemických zlúčenín, biologickej makromolekuly alebo extraktu získaného z biologického materiálu. Termín „farmaceutické agens alebo liečivo“, ako sa v tomto texte používa, sa týka chemických zlúčenín alebo kompozícií schopných vyvolať požadovaný terapeutický účinok, keď sú vhodne podávané pacientovi. Ďalšie chemické termíny v tomto texte sú použité v súlade so zvyklosťami v odbore, ako je možné nájsť napr. v publikácii The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Vyd., McGraw-Hill, San Francisco, 1985), zahrnuté formou odkazu v tomto texte.
Termín „antineoplazické agens“ sa používa v tomto texte na označenie činidiel, ktoré majú takú funkčnú vlastnosť, že inhibujú rozvoj alebo progresiu neoplázie, čiže novotvaru u človeka, konkrétne malígnej (rakovinovej) lézie, ako je napríklad karcinóm, zhubný nádor, lymfóm alebo leukémia. Inhibícia metastáz je tiež časťou vlastností antineoplazického agens.
Termín pacient zahrnuje pacientov tak humánnych ako aj veterinárnych, teda ľudí a zvieratá.
Humánne anti-IGF-IR protilátky a ich charakterizácia
Humánne protilátky zabraňujú určitým problémom, ktoré sú spojené s protilátkami, ktoré obsahujú variabilné a/alebo konštantné úseky z myši alebo laboratórneho potkana. Prítomnosť sekvencie pochádzajúcej z myši alebo laboratórneho potkana môže viesť k rýchlemu vymiznutiu protilátok alebo môže dokonca vyvolať imunitnú reakciu pacienta proti podanej protilátke.
Preto v jednom uskutočnení vynález poskytuje humanizované anti-IGF-IR protilátky. Vo výhodnom uskutočnení vynález poskytuje úplne humánne anti-IGF IR protilátky tak, že humánne imunoglobulínové gény sú vnesené do hlodavca, takže hlodavec potom vytvára úplne humánne protilátky. Výhodnejšie sú úplne humánne anti-humánne IGF-IR protilátky. Úplne humánne anti-IGF-IR protilátky by mali podľa očakávania minimalizovať imunogénnu a alergickú odpoveď, ktorá je vlastná myším alebo z myší odvodeným monoklonálnym protilátkam (Mab), a tým zvýšiť účinnosť a bezpečnosť podávania protilátok. Použitie úplne humánnych protilátok by malo poskytnúť podstatné výhody pri liečbe chronických a periodických ľudských ochorení, ako je napríklad zápal a karcinóm, keď je vyžadované opakované podávanie protilátky. V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje anti-IGF-IR protilátku, ktorá sa naviaže na komplement.
Vo výhodnom uskutočnení anti-IGF-IR protilátka je protilátka 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 alebo 6.1.1. V ďalšom výhodnom uskutočnení anti-IGF-IR protilátka obsahuje ľahký reťazec obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo sekvencii SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18 alebo 22, alebo jeden, alebo viac úsekov CDR z týchto aminokyselinových sekvencii. V ďalšom výhodnom uskutočnení anti-IGF-IR protilátka obsahuje ťažký reťazec obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu vybranú z SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20 alebo 24, alebo jeden, alebo viac úsekov CDR z týchto aminokyselinových sekvencii.
Triedy a podtriedy anti-IGF-IR protilátok
Protilátka môže byť molekula IgG, IgM, IgE, IgA alebo IgD. Vo výhodnom uskutočnení protilátka je IgG protilátka a je podtypu IgGl, IgG2, IgG3 alebo IgG4. Vo výhodnejšom uskutočnení anti-IGF-IR protilátka je protilátka podtriedy lgG2. V ďalšom výhodnom uskutočnení anti-IGF-IR protilátka je rovnakej triedy a podtriedy ako protilátka 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2,4.17.3 alebo 6.1.1, čo je IgG2.
Trieda a podtrieda anti-IGF-IR protilátky môžu byť určené akýmkoľvek spôsobom známym v odbore. Všeobecne, trieda a podtrieda protilátky môžu byť určené pomocou protilátok, ktoré sú špecifické pre konkrétnu triedu a podtriedu protilátky. Takéto protilátky sú dostupné komerčne. Trieda a podtrieda môžu byť určené napr. testom ELISA, Western blot, a inými technikami.
Alternatívne trieda a podtrieda môžu byť určené sekvenovaním celých alebo časti konštantných domén ťažkého a/alebo ľahkého reťazca protilátok, porovnaním ich aminokyselinovej sekvencie so známou aminokyselinovou sekvenciou rôznych tried a podtried imunoglobulínov a určením triedy a podtriedy protilátky.
Druhová a molekulová selektivita
V ďalšom aspekte vynálezu anti-IGF-IR protilátka má tak druhovú ako aj molekulovú selektivitu. V jednom uskutočnení sa anti-IGF-IR protilátka viaže na IGF-IR človeka alebo makakov (Macaca fascicularis alebo M. rhesus). Vo výhodnom uskutočnení sa anti-IGF-IR protilátka neviaže na IGF-IR myši, laboratórneho potkana, morčaťa, psa alebo králika. V ďalšom výhodnom uskutočnení sa anti-IGF-IR protilátka neviaže pri druhoch opíc Nového sveta, ako je napríklad marmoset. Na základe opisu vynálezu je možné určiť druhovú selektivitu anti-IGF-IR protilátky pomocou metód dobre známych v odbore. Napríklad je možné určiť druhovú selektivitu s použitím testov Western blot, FACS, ELISA alebo RIA. Vo výhodnom uskutočnení môže byť určená druhová selektivita s použitím Western blotu.
V ďalšom uskutočnení má anti-IGF-IR protilátka selektivitu pre IGF-IR, ktorá je aspoň 50-krát väčšia ako jej selektivita pre inzulínový receptor. Vo výhodnom uskutočnení selektivita anti-IGF-IR protilátky je viac ako 100-krát vyššia ako jej selektivita pre inzulínový receptor. V ešte výhodnejšom uskutočnení anti-IGF-IR protilátka neprejavuje žiadnu zreteľnú špecifickú väzbu na akýkoľvek iný proteín okrem IGF-IR. Selektivita anti-IGF-IR protilátky pre IGR-IR môže byť určená na základe opisu vynálezu s použitím metód dobre známych v odbore. Napríklad selektivita môže byť určená pomocou testov Western blot, FACS, ELISA alebo RIA. Vo výhodnom uskutočnení môže byť určená molekulárna selektivita s použitím Western blotu.
Väzobná afinita anti-IGF-IR k IGF-IR
V ďalšom aspekte vynálezu sa anti-IGF-IR protilátky viažu k IGF-IR s vysokou afinitou. V jednom uskutočnení sa anti-IGF-IR protilátka viaže k IGF-IR sKj 1 x 10‘8 M alebo menšou. Vo výhodnejšom uskutočnení sa protilátka viaže k IGF-IR s Kd alebo 1 x 10'9 M alebo menšou. V ešte výhodnejšom uskutočnení sa protilátka viaže k IGF-IR s Kd 5 x 1010 M alebo menšou. V ďalšom výhodnom uskutočnení sa protilátka viaže k IGF-IR s Kd 1 x 10‘10 M alebo menšou. V ďalšom výhodnom uskutočnení sa protilátka viaže k IGF-IR s v podstate rovnakou Kd ako protilátka vybraná z protilátok 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 alebo
6.1.1. V ďalšom výhodnom uskutočnení sa protilátka viaže k IGF-IR s v podstate rovnakou K,j ako protilátka, ktorá obsahuje jeden alebo viac CDR z protilátky vybranej z protilátok 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2,
4.17.3 alebo 6.1.1. V ešte ďalšom výhodnom uskutočnení sa protilátka viaže k IGF-IR s v podstate rovnakou Kd ako protilátka, ktorá obsahuje jednu z aminokyselinových sekvencií vybranú zo SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18,20, 22 alebo 24. V ďalšom výhodnom uskutočnení sa protilátka viaže k IGF-IR s v podstate rovnakou IQ ako protilátka, ktorá obsahuje jeden alebo viac CDR z protilátky, ktorá obsahuje jednu alebo viac aminokyselinových sekvencií vybraných zo SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 alebo 24.
V ďalšom aspekte vynálezu anti-IGF-IR protilátka má nízku rýchlosť disociácie. V jednom uskutočnení anti-IGF-IR protilátka má K<,ff hodnotu I x 10'4 s'1 alebo nižšiu. Vo výhodnom uskutočnení Koff je 5 x 10’5 s’1 alebo nižšia. V ďalšom výhodnom uskutočnení Koff je v podstate rovnaká ako Koff protilátky vybranej z protilátok 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 alebo 6.1.1. V ďalšom výhodnom uskutočnení sa protilátka viaže k IGF-IR s v podstate rovnakou Koff ako protilátka, ktorá obsahuje jeden alebo viac CDR z protilátky vybranej z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 alebo 6.1.1. V ešte ďalšom výhodnom uskutočnení sa protilátka viaže k IGF-IR s v podstate rovnakou Koff ako protilátka, ktorá obsahuje jednu z aminokyselinových sekvencií vybranú zo SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 alebo 24. V ďalšom výhodnom uskutočnení sa protilátka viaže k IGF-IR s v podstate rovnakou K<,ffako protilátka, ktorá obsahuje jeden alebo viac CDR z protilátky, ktorá obsahuje jednu z aminokyselinových sekvencií vybraných zo SEQ ID NO: 2, 4, 6,8, 10, 12, 14,16, 18,20, 22.
Väzobná afinita a rýchlosť disociácie anti-IGF-IR protilátky a IGF-IR môžu byť určené akýmkoľvek spôsobom známym v odbore. V jednom uskutočnení je väzobná afinita meraná kompetitívnou ELISA, RIA alebo povrchovou plazmónovou rezonanciou, ako je napríklad systém BIACORE. Rýchlosť disociácie môže byť tiež meraná povrchovou plazmónovou rezonanciou. Vo výhodnejšom uskutočnení väzobná afinita a rýchlosť disociácie sú merané povrchovou plazmónovou rezonanciou. V ešte výhodnejšom uskutočnení väzobná afinita a rýchlosť disociácie sú merané s použitím systému BIACORE. Príklady stanovenia väzobnej afinity a rýchlosti disociácie sú opísané ďalej v príklade 2.
Polčas anti-IGF-IR protilátky
Podľa ďalšieho predmetu vynálezu anti-IGF-IR protilátka má biologický polčas in vitro alebo in vivo aspoň jeden deň. Vo výhodnom uskutočnení má protilátka alebo jej časť polčas aspoň tri dni. Vo výhodnejšom uskutočnení má protilátka alebo jej časť polčas štyri dni alebo dlhší. V ďalšom uskutočnení má protilátka alebo jej časť polčas osem dní alebo dlhší. V ďalšom uskutočnení je protilátka alebo jej antigén-väzobná časť derivatizovaná alebo modifikovaná tak, že má dlhší polčas, ako je diskutované ešte ďalej. V ďalšom výhodnom uskutočnení protilátka môže obsahovať bodové mutácie, ktoré zvyšujú polčas v sére, ako bolo napríklad opísané v dokumente WO 00/09560, publikovanom 24. 2. 2000.
Polčas protilátky môže byť meraný ktoroukoľvek z metód známych v odbore. Napríklad polčas protilátky môže byť meraný pomocou Western blot, ELISA alebo RIA počas vhodné časové obdobia. Polčas protilátky môže byť meraný na akýchkoľvek vhodných zvieratách, napr. opiciach, ako napríklad makaky, primáty alebo aj človek.
Identifikácia IGF-IR epitopov rozpoznávaných protilátkou anti-IGF-IR
Vynález tiež poskytuje anti-IGF-IR protilátku, ktorá viaže rovnaký antigén alebo epitop ako humánna anti-IGF-IR protilátka. Ďalej vynález poskytuje anti-IGF-IR protilátku, ktorá skrížené kompetuje s humánnou anti-IGF-IR protilátkou. Vo výhodnom uskutočnení humánna anti-IGF-IR protilátka je protilátka 2.12.1,
2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 alebo 6.1.1. V ďalšom výhodnom uskutočnení humánna anti-IGF-IR obsahuje jeden alebo viac úsekov CDR z protilátky vybranej z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 alebo
6.1.1, V ešte ďalšom výhodnom uskutočnení humánna anti-IGF-IR obsahuje jednu z aminokyselinových sekvencií vybraných zo SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 alebo 24. V ďalšom výhodnom uskutočnení humánna anti-IGF-IR obsahuje jeden alebo viac CDR z protilátky, ktorá obsahuje jednu z aminokyselinových sekvencií vybraných zo SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 alebo 24. Vo vysoko výhodnom uskutočnení anti-IGF-IR protilátka je ďalšou humánnou protilátkou.
Či sa anti-IGF-IR protilátka viaže k rovnakému antigénu je možné určiť použitím celého radu metód, ktoré sú známe v odbore. Napríklad sa môže určovať, či sa testovaná anti-IGF-IR protilátka viaže k rovnakému antigénu s použitím anti-IGF-IR protilátky na zachytenie antigénu, o ktorom je známe, že sa viaže na anti-IGF-IR protilátku, ako napríklad IGF-IR, potom eluovať antigén z protilátky a nakoniec určiť, či sa testovaná protilátka viaže k eluovanému antigénu. Môže sa tiež určovať, či sa protilátka viaže k rovnakému epitopu ako anti-IGF-IR protilátka, a síce väzbou anti-IGF-IR protilátky k IGF-IR v saturujúcich podmienkach a potom meraním schopnosti testovanej protilátky viazať sa k IGF-IR. Ak je testovaná protilátka schopná viazať sa k IGF-IR súčasne ako anti-IGF-IR protilátka, potom sa testovaná protilátka viaže k odlišnému epitopu ako anti-IGF-IR protilátka. Ale, ak testovaná protilátka nie je schopná viazať sa k IGF-IR súčasne, potom sa testovaná protilátka viaže k rovnakému epitopu ako humánna anti-IGF-IR protilátka. Tento experiment sa môže uskutočniť s použitím ELISA, RIA alebo povrchovej plazmónovej rezonancie. Vo výhodnom uskutočnení sa experiment realizuje s použitím povrchovej plazmónovej rezonancie. Vo výhodnejšom uskutočnení je použitý systém BIACORE. Môže sa tiež zisťovať, či anti-IGF-IR protilátka skrížené kompetuje s anti-IGF-IR protilátkou. Vo výhodnom uskutočnení sa môže zisťovať, či anti-IGF-IR protilátka skrížené kompetuje s inou, a to tak, že sa použije rovnaký spôsob, ktorým sa určuje, či je anti-IGF-IR protilátka schopná viazať sa k rovnakému epitopu ako iná anti-IGF-IR protilátka.
Využitie ľahkých a ťažkých reťazcov
Vynález tiež poskytuje anti-IGF-IR protilátku, ktorá obsahuje variabilné sekvencie kódované humánnym génom k. Vo výhodnom uskutočnení sú variabilné sekvencie kódované génmi rodiny buď Vk A27, A30, alebo 012. Vo výhodnom uskutočnení sú variabilné sekvencie kódované humánnou génovou rodinou Vk A30. Vo výhodnejšom uskutočnení ľahký reťazec obsahuje nie viac ako desať substituovaných aminokyselín zo zárodočnej línie Vk A27, A30 alebo 012, výhodne nie viac ako šesť substituovaných aminokyselín a výhodnejšie nie viac ako tri substituované aminokyseliny. Vo výhodnom uskutočnení sú aminokyselinové substitúcie konzervatívnymi substitúciami.
SEQ ID NO: 2, 6,10,14, 18 a 22 poskytujú aminokyselinové sekvencie variabilných úsekov šiestich anti-IGF-IR k ľahkých reťazcov. SEQ ID NO: 38, 40 a 42 poskytujú aminokyselinové sekvencie troch zárodočných k ľahkých reťazcov, z ktorých pochádza šesť anti-IGF-IR κ ľahkých reťazcov. Obr. IA - 1C ukazujú porovnanie nukleotidových sekvencií variabilných úsekov ľahkých reťazcov šiestich anti-IGF-IR protilátok a zárodočnej sekvencie, z ktorej pochádzajú. Na základe opisu vynálezu odborník môže určiť kódované aminokyselinové sekvencie pre týchto šesť anti-IGF IR κ ľahkých reťazcov a zárodočného κ ľahkého reťazca a stanoviť rozdiely medzi zárodočnými sekvenciami a sekvenciami protilátky.
Vo výhodnom uskutočnení VL z anti-IGF-IR protilátky obsahuje rovnaké substitúcie aminokyselín vzhľadom na zárodočné aminokyselinové sekvencie, ako ktorýkoľvek jeden alebo viac VL z protilátok
2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 alebo 6.1.1. Napríklad VL anti-IGF-IR protilátky môže obsahovať jednu alebo viac aminokyselinových substitúcií, ktoré sú rovnaké ako substitúcie prítomné v protilátke
2.13.2, ďalšiu aminokyselinovú substitúciu, ktorá je rovnaká ako substitúcia prítomná v protilátke 2.14.3 a ďalšiu aminokyselinovú substitúciu, ktorá je rovnaká ako substitúcia v protilátke 4.9.2. Týmto spôsobom sa môžu mixovať a spájať rôzne rysy väzby protilátky, aby sa napr. zmenila afinita protilátky pre IGF-IR alebo jej rýchlosť disociácie od antigénu. V ďalšom uskutočnení sú aminokyselinové substitúcie vytvorené v rovnakých polohách, v ktorých boli zistené v ktorejkoľvek jednej alebo viacerých VL z protilátok 2.12.1, 2.13.2,
2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 alebo 6.1.1, pričom sú tvorené konzervatívne substitúcie namiesto použitia úplne rovnakých aminokyselín. Napríklad, ak aminokyselinová substitúcia porovnaná so zárodočnou sekvenciou v jednej z protilátok 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 alebo 6.1.1 je glutamát, môže byť konzervatívne substituovaný aspartát. Podobne, ak je substituovaná aminokyselina serín, môže byť konzervatívne substituovaný treonín.
V ďalšom výhodnom uskutočnení ľahký reťazec obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je rovnaká ako aminokyselinová sekvencia VL z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 alebo 6.1.1. V ďalšom vysoko výhodnom uskutočnení ľahký reťazec obsahuje aminokyselinové sekvencie, ktoré sú rovnaké ako CDR úseky ľahkého reťazca z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 alebo 6.1.1. V ďalšom výhodnom uskutočnení ľahký reťazec obsahuje aminokyselinovú sekvenciu aspoň z jedného CDR úseku ľahkého reťazca z
2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 alebo 6.1.1. V ďalšom výhodnom uskutočnení ľahký reťazec obsahuje aminokyselinové sekvencie z CDR z rôznych ľahkých reťazcov. Vo výhodnejšom uskutočnení CDR z rôznych ľahkých reťazcov sú získané z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 alebo 6.1.1. V ďalšom výhodnom uskutočnení ľahký reťazec obsahuje aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo SEQ ID NO: 2, 6, 10,
14, 18 alebo 22. V ďalšom uskutočnení ľahký reťazec obsahuje aminokyselinovú sekvenciu kódovanú sekvenciou nukleovej kyseliny vybranou zo SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17 alebo 21 alebo sekvenciou nukleovej kyseliny, ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu majúcu 1 až 10 aminokyselinových inzercií, delécií alebo substitúcií. Výhodne, substitúcie aminokyselín sú konzervatívne substitúcie aminokyselín. V ďalšom uskutočnení vynálezu protilátka alebo jej časť obsahuje ľahký reťazec lambda.
Predkladaný vynález tiež poskytuje anti-IGF-IR protilátku alebo časť protilátky, ktorá obsahuje humánny ťažký reťazec alebo sekvenciu pochádzajúcu z humánneho ťažkého reťazca. V jednom uskutočnení aminokyselinová sekvencia ťažkého reťazca pochádza z humánnej génovej rodiny VH DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 alebo VIV-4/4.35. Vo výhodnom uskutočnení aminokyselinová sekvencia ťažkého reťazca pochádza z humánnej génovej rodiny VH DP47. Vo výhodnejšom uskutočnení ťažký reťazec obsahuje nie viac ako osem aminokyselinových substitúcií zo zárodočnej línie VH DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 alebo VIV-4/4.35, výhodnejšie nie viac ako šesť aminokyselinových substitúcií a dokonca výhodnejšie nie viac ako tri aminokyselinové substitúcie.
SEQ ID NO: 4, 8, 12,16,20 a 24 poskytujú aminokyselinové sekvencie variabilných úsekov šiestich anti-IGF-IR ťažkých reťazcov. SEQ ID NO: 30, 32, 34, 36 a 44 poskytujú aminokyselinové sekvencie a SEQ ID NO: 29, 31, 33, 35 a 43 poskytujú nukleotidové sekvencie zárodočného ťažkého reťazca DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 a VIV-4, v danom poradí. Obr. 2A - 2D ukazujú porovnanie aminokyselinových sekvencií variabilných úsekov šiestich anti-IGF-IR protilátok s im zodpovedajúcou zárodočnou sekvenciou. Na základe opisu vynálezu odborník môže určiť kódované aminokyselinové sekvencie pre týchto šesť anti-IGF IR ťažkých reťazcov a zárodočného ťažkého reťazca a stanoviť rozdiely medzi zárodočnou sekvenciou a sekvenciou protilátky.
Vo výhodnom uskutočnení VH anti-IGF-IR protilátky obsahuje rovnaké substitúcie aminokyselín vzhľadom na zárodočné aminokyselinové sekvencie ako ktorýkoľvek jeden alebo viac VH protilátok 2.12.1,
2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 alebo 6.1.1. Podobne ako už bolo opisované, VH anti-IGF-IR protilátky môže obsahovať jednu alebo viac aminokyselinových substitúcií, ktoré sú rovnaké ako substitúcie prítomné v protilátke 2.13.2, ďalšiu aminokyselinovú substitúciu, ktorá je rovnaká ako substitúcia prítomná v protilátke
2.14.3 a ďalšiu aminokyselinovú substitúciu, ktorá je rovnaká ako v protilátke 4.9.2. Týmto spôsobom sa môžu mixovať a spájať rôzne rysy väzby protilátky, aby sa napr. zmenila afinita protilátky pre IGF-IR alebo jej rýchlosť disociácie od antigénu. V inom uskutočnení sú aminokyselinové substitúcie vytvorené v rovnakých polohách, v ktorých boli zistené v ktoromkoľvek jednom alebo viacerých VH z protilátok 2.12.1,
2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 alebo 6. 1.1, pričom sú tvorené konzervatívnymi substitúciami miesto použitia úplne rovnakých aminokyselín.
V ďalšom výhodnom uskutočnení ťažký reťazec obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je zhodná ako aminokyselinová sekvencia VH z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1,4.9.2, 4.17.3 alebo 6.1.1. V ďalšom vysoko výhodnom uskutočnení ťažký reťazec obsahuje aminokyselinové sekvencie, ktoré sú rovnaké ako CDR úseky ťažkého reťazca z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 alebo 6.1.1. V ďalšom výhodnom uskutočnení ťažký reťazec obsahuje aminokyselinovú sekvenciu aspoň z jedného CDR úseku ťažkého reťazca z
2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 alebo 6.1.1. V ďalšom výhodnom uskutočnení ťažký reťazec obsahuje aminokyselinové sekvencie z CDR z rôznych ťažkých reťazcov. Vo výhodnejšom uskutočnení CDR z rôznych ťažkých reťazcov sú získané z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 alebo 6.1.1. V ďalšom výhodnom uskutočnení ťažký reťazec obsahuje aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20 alebo 23. V ďalšom uskutočnení ťažký reťazec obsahuje aminokyselinovú sekvenciu kódovanú sekvenciou nukleovej kyseliny vybranou zo SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19 alebo 23, alebo sekvenciou nukleovej kyseliny, ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu majúcu 1 až 10 aminokyselinových inzercií, delécií alebo substitúcií. Výhodne, substitúcie aminokyselín sú konzervatívne substitúcie aminokyselín.
Inhibícia IGF-IR aktivity anti-IGF-IR protilátkou
Inhibícia väzby IGF-I k IGF-IR
V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje anti-IGF-IR protilátku, ktorá inhibuje väzbu IGF-I k IGF-IR alebo väzbu IGF-II k IGF-IR. Vo výhodnom uskutočnení je IGF-IR humánna. V ďalšom výhodnom uskutočnení anti-IGF-IR protilátka je humánna protilátka. V ďalšom uskutočnení protilátka alebo jej časť inhibuje väzbu medzi IGF-IR a IGF-I s hodnotou IC50 nie vyššou ako 100 nM. Vo výhodnom uskutočnení IC50 nie je vyššie ako 10 nM. Vo výhodnejšom uskutočnení ICS0 nie je vyššie ako 5 nM. Hodnota IC50 môže byť meraná akýmkoľvek spôsobom známym v odbore. Typicky, IC50 môže byť meraná ELISA alebo RIA. Vo výhodnom uskutočnení IC50 je meraná pomocou RIA.
V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje anti-IGF-IR protilátku, ktorá zabraňuje aktivácii IGF-IR v prítomnosti IGF-I. Vo výhodnom uskutočnení anti-IGF-IR protilátka inhibuje IGF-IR-indukovanú fosforyláciu tyrozínu, ktorá nastáva po obsadení receptora. V ďalšom výhodnom uskutočnení anti-IGF-IR protilátka inhibuje ďalšie „downstream“ (po smere) bunkové udalosti. Napríklad anti-IGF-IR môže inhibovať fosforyláciu tyrozínu Shc a substrátu inzulínového receptora (IRS) 1 a 2, keď každý z nich je normálne fosforylovaný, keď sú bunky ošetrené IGF-I (Kim et al., J. Biol. Chem. 273: 34543-34550, 1998). Môže sa určiť, či anti-IGF-IR protilátka môže zabrániť aktivácii IGF-IR v prítomnosti IGF-1 tým, že sa určia hladiny autofosforylácie pre IGF-IR, Shc, IRS-1 alebo IRS-2 pomocou Western blotu alebo imunoprecipitácie. Vo výhodnom uskutočnení sa určia hladiny autofosforylácie IGF-IR Western blotom (pozri napr. príklad 7).
V ďalšom aspekte vynálezu protilátka spôsobuje down-reguláciu IGF-IR z buniek ošetrených protilátkou. V jednom uskutočnení je IGF-IR intemalizovaný do cytoplazmy bunky. Po naviazaní anti-IGF-IR protilátky na IGF-IR je protilátka intemalizovaná, ako ukázala konfokálna mikroskopia. Bez väzby na akékoľvek teórie, predpokladá sa, že komplex protilátka-IGF-IR je intemalizovaný do lyzozómu a degradovaný. Down-regulácia IGF-IR sa môže merať akýmkoľvek spôsobom známym v odbore vrátane imunoprecipitácie, konfokálnej mikroskopie alebo Western blotu (pozri napr. príklad 7). Vo výhodnom uskutočnení protilátka je vybraná z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 alebo 6.1.1, alebo obsahuje ich ťažký reťazec, ľahký reťazec alebo antigén-väzobný úsek.
Aktivácia IGF-IR vplyvom anti-IGF-IR protilátky
Ďalší aspekt predkladaného vynálezu zahrnuje aktivačné anti-IGF-IR protilátky. Aktivačná protilátka sa líši od inhibičnej protilátky, pretože zosilňuje alebo nahradzuje účinky IGF-I na IGF-IR. V jednom uskutočnení aktivačná protilátka je schopná viazať sa na IGF-IR a prinútiť ho, aby bol aktivovaný bez prítomnosti IGF-I. Tento typ aktivačnej protilátky v podstate napodobňuje IGF-I. V ďalšom uskutočnení aktivačná protilátka zosilňuje účinok IGF-I na IGF-IR. Tento typ protilátky nespôsobuje aktiváciu IGF-IR samotnú, ale skôr zvyšuje aktiváciu IGF-IR v prítomnosti IGF-1. Napodobňujúca anti-IGF-IR protilátka môže byť ľahko odlíšená od zosilňujúcej anti-IGF-IR protilátky, a síce ošetrením buniek in vitro protilátkou v prítomnosti alebo neprítomnosti nízkej hladiny IGF-1. Ak je protilátka schopná spôsobiť aktiváciu IGF-IR bez výskytu IGF-I, napr. zvyšuje sa tyrozínová fosforylácia IGF-IR, potom je protilátka napodobňujúca protilátka. Ak protilátka nemôže spôsobiť aktiváciu IGF-IR bez výskytu IGF-I, aleje schopná zosilniť mieru aktivácie IGF-IR, potom protilátka je zosilňujúca protilátka. Vo výhodnom uskutočnení aktivačná protilátka je 4.17.3. V ďalšom výhodnom uskutočnení protilátka obsahuje jeden alebo viac úsekov CDR z 4.17.3. V ďalšom výhodnom uskutočnení je protilátka odvodená buďto z jednej, alebo z oboch zárodočných sekvencii 012 (ľahký reťazec) a/alebo D71 (ťažký reťazec).
Inhibícia fosforylácie tyrozínu IGF-IR, hladiny IGF-IR a nádorová bunka
Rast in vivo s anti-IGF-IR protilátkou
Ďalšie uskutočnenie vynálezu poskytuje anti-IGF-IR protilátku, ktorá in vivo inhibuje fosforyláciu tyrozínu IGF-IR a hladín receptora. V jednom uskutočnení podávanie anti-IGF-IR protilátky zvieraťu vyvolá zníženie IGF-IR fosfotyrozínovej signalizácie v IGF-IR-exprimujúcich nádoroch. Vo výhodnom uskutočnení anti-IGF-IR protilátka vyvolá zníženie fosfotyrozínového signálu aspoň o 20 %. Vo výhodnejšom uskutočnení anti-IGF-IR protilátka spôsobí pokles fosfotyrozínového signálu aspoň o 60 %, výhodnejšie o 50 %. V ešte výhodnejšom uskutočnení protilátka spôsobí pokles fosfotyrozínového signálu aspoň o 40 %, výhodnejšie o 30 %, dokonca výhodnejšie o 20 %. Vo výhodnom uskutočnení protilátka je podávaná približne 24 hodín pred tým, než sú merané hladiny tyrozínovej fosforylácie. Hladiny fosforylácie tyrozínu môžu byť merané akýmkoľvek spôsobom známym v odbore, ako boli napríklad už tu uvedené spôsoby (pozri tiež napr. príklad 3 a obr. 5). Vo výhodnom uskutočnení protilátka je vybraná zo skupiny, ktorú tvorí 2.12.1, 2.13.2,
2.14.3, 3.1.1,4.9.2 alebo 6.1.1, alebo obsahuje jej ťažký reťazec, ľahký reťazec alebo antigén-väzobnú časť.
V ďalšom uskutočnení anti-IGF-IR protilátka inhibuje in vivo rast nádorových buniek. Nádorové bunky môžu pochádzať z akéhokoľvek bunkového typu, a to vrátane, bez akéhokoľvek obmedzenia, epidermálnych, epitelových a endotelových buniek, leukemických buniek, buniek sarkómu, buniek mnohopočetného myelómu alebo mezodermálnych buniek. Príklady nádorových buniek zahrnujú bunky A549 (nemalobunkový pľúcny karcinóm), bunky MCF-7, bunky Colo 205, bunky 3T3/IGF-IR a bunky A431. Vo výhodnom uskutočnení protilátka inhibuje rast nádorových buniek v porovnaní s rastom nádoru neošetreného zvieraťa. Vo výhodnejšom uskutočnení protilátka inhibuje rast nádorových buniek z 50 %. V ešte výhodnejšom uskutočnení protilátka inhibuje rast nádorových buniek zo 60 %, 65 %, 70 % alebo 75 %. V jednom uskutočnení vynálezu je inhibícia rastu nádorových buniek meraná aspoň 7 dní potom, čo zvieratá začali liečbu s protilátkou. Vo výhodnejšom uskutočnení je inhibícia rastu nádorových buniek meraná aspoň 14 dní potom, čo zvieratá začali liečbu s protilátkou. V ďalšom výhodnom uskutočnení je zvieraťu s anti-IGF-IR protilátkou podávané iné antineoplazické agens. Vo výhodnom uskutočnení antineoplazické agens je schopné ďalšej inhibície rastu nádorových buniek. V ešte výhodnejšom uskutočnení antineoplazické agens je adriamycín, taxol, tamoxifén, 5-fluórdeoxyuridín (5-FU) alebo CP-358,774. Vo výhodnom uskutočnení súbežné podávanie antineoplazického agens a anti-IGF-IR protilátky inhibuje rast nádorových buniek aspoň z 50 %, výhodne z 60 %, 65 %, 70 % alebo 75 %, výhodnejšie z 80 %, 85 % alebo 90 % počas 22 až 24 dní (pozri napr. obr. 7 a prí16 klad 9). Vo výhodnom uskutočnení je protilátka vybraná zo skupiny, ktorú tvorí 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 a 6.1.1, alebo obsahuje ťažký reťazec, ľahký reťazec alebo antigén-väzobnú časť takejto protilátky. Indukcia apoptózy anti-IGF-IR protilátkami
Ďalší aspekt vynálezu poskytuje anti-IGF-IR protilátku, ktorá indukuje bunkovú smrť. V jednom uskutočnení protilátka spôsobuje apoptózu. Protilátka môže indukovať apoptózu buď in vivo alebo in vitro. Všeobecne, nádorové bunky sú citlivejšie na apoptózu ako normálne bunky, takže podávanie anti-IGF-IR protilátky spôsobí apoptózu nádorovej bunky skôr než normálnej bunky. V ďalšom uskutočnení vynálezu podávanie anti-IGF-IR protilátky zníži hladiny enzýmu akt, ktorý sa zúčastňuje na fosfatidylinozitolkinázovej (PI-kináza) dráhe. PI-kinázová dráha je zase zapojená do bunkovej proliferácie a prevencie apoptózy. Takže inhibícia akt môže spôsobiť apoptózu. Vo výhodnejšom uskutočnení je protilátka podávaná in vivo, aby spôsobila apoptózu IGF-IR-exprimujúcich buniek. Vo výhodnom uskutočnení je protilátka vybraná zo skupiny, ktorú tvorí 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 a 6. 1,1 alebo obsahuje ťažký reťazec, ľahký reťazec alebo antigén-väzobnú časť takejto protilátky.
Spôsoby produkcie protilátok a prípravy bunkovej línie produkujúcej protilátky
Imunizácia
V jednom uskutočnení predkladaného vynálezu sú humánne protilátky produkované imunizáciou zvieraťa iného než ľudského pôvodu, ktoré obsahujú niektoré alebo všetky humánne imunoglobulínové lokusy s 1GF-1R antigénom. Vo výhodnom uskutočnení je zvieraťom odlišným od človeka XENOMOUSE™, čo je geneticky upravený myší kmeň, ktorý obsahuje veľké fragmenty humánnych imunoglobulínových lokusov a pritom je defektný v produkcii myších protilátok (pozri napr. Green et al. Náture Genetics 7: 13-21, 1994, a patenty Spojených štátov č. 5,916,771, 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181, 6,091,001, 6,114,598 a 6,130,364, a tiež dokument WO 91/10741, publikovaný 25. 7. 1991, WO 94/02602, publikovaný 3. 2. 1994, WO 96/34096 a WO 96/33735, obidva publikované 31. 10. 1996, WO 98/16654, publikované 23. 4. 1998, WO 98/24893, publikované 11. 6. 1998, WO 98/50433, publikované 12. 11. 1998, WO 99/45031, publikované 10. 9. 1999, WO 99/53049, publikované 21. 10. 1999, WO 00 09560, publikované 24. 2. 2000 a WO 00/037504, publikované 29. 6. 2000. Myši XENOMOUSE™ produkujú humánny, dospelému podobný repertoár, úplne humánnych protilátok a generujú antigén-špecifícké humánne monoklonálne protilátky. Druhá generácia myší XENOMOUSE™ obsahuje približne 80 % repertoáru humánnych protilátok, vnesený zárodočnou konfiguráciou YAC fragmentov megabázovej veľkosti obsahujúcich lokusy humánneho ťažkého reťazca a lokusy ľahkého reťazce κ (pozri Mendez et al. Náture Genetics 15: 146-156, 1997, Green a Jakobovits, J. Exp. Med. 188: 483-495, 1998, ktoré sú týmto zahrnuté formou odkazu).
Vynález tiež poskytuje spôsob prípravy anti-IGF-IR protilátok zo zvierat okrem človeka a myši, a síce imunizáciou transgénnych zvierat s výnimkou človeka, ktoré obsahujú humánne imunoglobulínové lokusy. Takéto zvieratá môžu byť pripravené využitím metód, ktoré tu už boli opísané. Metódy opísané v týchto patentoch môžu byť modifikované, ako boli opísané v patente Spojených štátov č. 5,994,619. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu zvieratá iného než ľudského pôvodu sú laboratórne potkany, ovce, prasatá, kozy, hovädzí dobytok alebo kone.
V ďalšom uskutočnení vynálezu zviera iného než ľudského pôvodu obsahujúce génové lokusy humánneho imunoglobulínu je zviera, ktoré obsahuje „minilokus“ humánneho imunoglobulínu. V metóde „minilokusu“ je exogénne Ig miesto napodobené tým, že sú vložené jednotlivé gény z Ig lokusu. Takže jeden alebo viac VH génov, jeden alebo viac DH génov, jeden alebo viac JH génov, konštantný úsek mu a druhý konštantný úsek (výhodne konštantný úsek gama) sú spojené do jedného konštruktu pre inzerciu do zvieraťa. Tento prístup je opísaný, inter alia, v patentoch Spojených štátov č. 5,545,807, 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,591,669, 5,612,205, 5,721,367, 5,789,215 a 5,643,763, ktoré sú týmto zahrnuté formou odkazu.
Výhodou metódy „minilokusov“ je rýchlosť, s ktorou možno vytvárať konštrukty obsahujúce časti Ig lokusov a vnášať ich do zvierat. Ale potenciálnou nevýhodou metódy „minilokusov“ je niekedy nedostatočná diverzita imunoglobulínov, ktorá by podporovala plný vývoj B lymfocytov, takže môže byť nižšia produkcia protilátok.
Aby bolo možné produkovať humánnu anti-IGF-IR protilátku, zviera (iné než ľudského pôvodu) obsahujúce niektoré alebo všetky lokusy humánneho imunoglobulínu je imunizované IGF-IR antigénom a potom sú zo zvieraťa izolované protilátky alebo bunky produkujúce protilátky. IGF-IR antigén môže byť izolovaný a/alebo purifikovaný IGF-IR a je to výhodne humánny IGF-IR. V ďalšom uskutočnení IGF-IR antigén je fragment IGF-IR, výhodne extraceluláma doména IGF-IR. V ďalšom uskutočnení IGF-IR antigén je fragment, ktorý obsahuje aspoň jeden epitop IGF-IR. V ďalšom uskutočnení IGF-IR antigén je bunka, ktorá exprimuje IGF-IR na svojom bunkovom povrchu, výhodne bunka, ktorá nadmerne exprimuje (over-expression) IGF-IR na bunkovom povrchu.
Imunizácia zvierat môže byť uskutočnená akýmkoľvek spôsobom známym v odbore (pozri napr. Harlow a Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990). Metódy imunizácie zvierat (iného než ľudského pôvodu), ako sú napríklad myši, laboratórne potkany, ovce, kozy, prasatá, hovädzí dobytok a kone, sú v odbore dobre známe (pozri napr. Harlow a Lane, už citovaná publikácia, a patent Spojených štátov č. 5,994,619). Vo výhodnom uskutočnení IGF-IR antigén je podávaný s adjuvans stimulujúcim imunitnú reakciu. Takéto adjuvans zahrnujú úplné alebo neúplné Freundovo adjuvans, RIBI (muramyldipeptidy) alebo ISCOM (imunostimulačné komplexy). Takéto adjuvans môžu chrániť polypeptid pred rýchlym rozptýlením tým, že ho zadržia v lokálnom depozite alebo môžu obsahovať látky, ktoré stimulujú hostiteľa, aby sekretoval faktory, ktoré sú chemotaktické pre makrofágy a iné zložky imunitného systému. Výhodne, ak je podávaný polypeptid, imunizačná schéma bude zahrnovať dve alebo viac podaní polypeptidu v časovom rozpätí niekoľko týždňov.
Príklad 1 poskytuje protokol pre imunizáciu myší XENOMOUSE™ humánnym IGF-IR úplnej dĺžky vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátmi.
Produkcia protilátok a bunkové línie produkujúce protilátky
Po imunizácii zvieraťa IGF-IR antigénom sa protilátky a/alebo bunky produkujúce protilátky môžu získať zo zvieraťa. Sérum obsahujúce anti-IGF-IR protilátku sa získa odberom krvi alebo utratením zvieraťa. Sérum môže byť použité tak, ako je získané zo zvieraťa alebo môže byť zo séra získaná imunoglobulínová frakcia alebo môžu byť zo séra purifikované anti-IGF-IR protilátky. Sérum alebo imunoglobulíny získané týmto spôsobom sú polyklonálne, čo je nevýhodné, pretože množstvo protilátok, ktoré sa môžu získať, je obmedzené, a polyklonáína protilátka má rad heterogénnych vlastností.
V ďalšom uskutočnení vynálezu sú pripravené z imunizovaného zvieraťa imortalizované hybridómy produkujúce protilátku. Po imunizácii je zviera utratené a splenické B lymfocyty sú fúzované s imortalizovanými myelómovými bunkami, ako je v odbore známe (pozri napr. Harlow a Lane, citovaná publikácia). Vo výhodnom uskutočnení myelómové bunky nesekretujú imunoglobulínové polypeptidy (neskretujúca bunková línia). Po fúzii a selekcii antibiotikami sa uskutoční skríning s použitím IGF-IR, jeho časti alebo buniek exprimujúcich IGF-IR. Vo výhodnom uskutočnení počiatočný skríning sa uskutočňuje s použitím ELISA testu alebo rádioimunotestu (RIA), výhodne ELISA. Príklad skríningu pomocou ELISA je poskytnutý vo WO 00/37504, v tomto texte zahrnuté formou odkazu.
V inom uskutočnení bunky produkujúce protilátky môžu byť pripravené z človeka, ktorý má autoimunitné ochorenie, a ktorý exprimuje anti-IGF-IR protilátky. Bunky exprimujúce anti-IGF-IR protilátky môžu byť izolované tak, že sa izolujú biele krvinky a podrobia sa fluorescenciou aktivovanému triedeniu buniek (FACS), alebo tak, že sa prehľadávajú doštičky potiahnuté IGF-IR alebo jeho časťou. Tieto bunky môžu byť fúzované s humánnymi nesekretujúcimi myelómami, čím sa pripravia humánne hybridómy exprimujúce humánne anti-IGF-IR protilátky. Všeobecne je toto menej výhodné uskutočnenie, pretože je pravdepodobné, že anti-IGF-IR protilátky budú mať nízku afinitu k IGF-IR.
Hybridómy produkujúce protilátky anti-IGF-IR sú selektované, klonované a ďalej podrobené skríningu na žiaduce vlastnosti zahrnujúce robustný rast hybridómu, vysokú produkciu protilátky a požadované vlastnosti protilátky, ako bude opisované ďalej. Hybridómy môžu byť pestované a množené in vivo v syngénnych zvieratách, v zvieratách bez imunitného systém, ako sú napr. nahé myši, alebo in vitro v tkanivových kultúrach. Metódy selekcie, klonovania a množenia hybridómov sú odborníkom dobre známe.
Výhodne je imunizované zviera iné než ľudského pôvodu, ktoré exprimuje gény humánneho imunoglobulínu, a splenické B lymfocyty sa izolujú z myelómu pochádzajúceho z rovnakého druhu zvieraťa iného než ľudského pôvodu. Výhodnejšie, imunizované zviera je myš XENOMOUSE™ a myelómová bunková línia je nesekretujúci myší myelóm, ako je napríklad myelómová bunková línia NSO-BCL2 (pozri napr. príklad 1).
V jednom aspekte vynález poskytuje hybridómy, ktoré produkujú humánne anti-IGF-IR protilátky. Vo výhodnom uskutočnení sú hybridómami myšie hybridómy, ako už tu bolo opísané. V ďalšom výhodnom uskutočnení sú hybridómy vytvorené z biologického druhu iného než človek a iného než myš, ako napríklad z laboratórneho potkana, ovce, prasaťa, kozy, hovädzieho dobytka alebo koňa. V ďalšom uskutočnení sú hybridómami humánne hybridómy, v ktorých je humánny nesekretujúci myelóm fúzovaný s humánnymi bunkami exprimujúcimi anti-IGF-IR protilátku.
Nukleové kyseliny, vektory, hostiteľské bunky a rekombinantné metódy prípravy protilátok
Nukleové kyseliny
Poskytnuté sú molekuly nukleovej kyseliny kódujúce anti-IGF-IR protilátky podľa vynálezu. V jednom uskutočnení vynálezu molekula nukleovej kyseliny kóduje ťažký a/alebo ľahký reťazec anti-IGF-IR imunoglobulínu. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu jediná molekula nukleovej kyseliny kóduje ťažký reťazec anti-IGF-IR imunoglobulínu a ďalšia molekula nukleovej kyseliny kóduje ľahký reťazec anti-IGF-IR imunoglobulínu. Vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu je kódovaným imunoglobulínom humánny imunoglobulín, výhodne humánny IgG. Kódovaný ľahký reťazec môže byť λ reťazec alebo κ reťazec, výhodne je to κ reťazec.
Molekula nukleovej kyseliny kódujúca variabilný úsek ľahkého reťazca môže pochádzať z A30, A27 alebo 012 Vk génu. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu ľahký reťazec pochádza z A30 Vk génu. V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu molekula nukleovej kyseliny kódujúca ľahký reťazec obsahuje spojovací úsek pochádzajúci z Jkl, Jk2 alebo Jk4. V ešte výhodnejšom uskutočnení vynálezu molekula nukleovej kyseliny kódujúca ľahký reťazec obsahuje nie viac než desať aminokyselinových substitúcií z A30 Vk génu zárodočnej línie, výhodne nie viac než šesť aminokyselinových substitúcií a dokonca výhodnejšie nie viac než tri aminokyselinové substitúcie.
Vynález poskytuje molekulu nukleovej kyseliny, ktorá kóduje variabilný úsek ľahkého reťazca (VL) obsahujúci najmenej tri aminokyselinové substitúcie v porovnaní so sekvenciou zárodočnej línie, pričom aminokyselinové substitúcie sú identické s aminokyselinovými substitúciami zo sekvencie VL zárodočnej línie jednej z protilátok 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 alebo 6.1.1. Vynález tiež poskytuje molekulu nukleovej kyseliny obsahujúcu sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu variabilného úseku ľahkého reťazca z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 alebo 6.1.1. Vynález tiež poskytuje molekulu nukleovej kyseliny obsahujúcu sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu jedného alebo viacerých úsekov CDR z ktoréhokoľvek ľahkého reťazca z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3,
3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 alebo 6.1.1. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu molekula nukleovej kyseliny obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu všetkých úsekov CDR ktoréhokoľvek ľahkého reťazca z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 alebo 6.1.1. V ďalšom uskutočnení vynálezu molekula nukleovej kyseliny obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu jednej zo sekvencii SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18 alebo 22, alebo obsahuje jednu zo sekvencii SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17 alebo 21. V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu molekula nukleovej kyseliny obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu jedného alebo viacerých CDR s ktoroukoľvek zo SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18 alebo 22, alebo obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny jedného alebo viacerých CDR s ktoroukoľvek sekvenciou zo SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17 alebo 21. Vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu molekula nukleovej kyseliny obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu všetkých CDR z ktorejkoľvek zo SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18 alebo 22, alebo obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny všetkých CDR z ktorejkoľvek zo SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17 alebo 21.
Vynález tiež poskytuje molekuly nukleovej kyseliny, ktoré kódujú aminokyselinové sekvencie VL, ktoré majú aminokyselinové sekvencie aspoň na 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 alebo 99 % identické s VL, ktorá tu už bola opísaná, konkrétne s VL, ktorá obsahuje aminokyselinovú sekvenciu jednej zo SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18 alebo 22. Vynález tiež poskytuje sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá je aspoň na 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 alebo 99 % identická so sekvenciou nukleovej kyseliny jednej zo SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17 alebo 21. V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje molekulu nukleovej kyseliny kódujúcu VL, ktorá hybridizuje za vysoko stringentných podmienok s molekulou nukleovej kyseliny kódujúcou VL, ako tu už bolo opísané, konkrétne s molekulou nukleovej kyseliny, ktorá obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18 alebo 22. Vynález tiež poskytuje sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu VL, ktorý hybridizuje za vysoko stringentných podmienok s molekulou nukleovej kyseliny obsahujúcou sekvenciu nukleovej kyseliny jednej zo SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17 alebo 21.
Vynález tiež poskytuje molekulu nukleovej kyseliny kódujúcu variabilný úsek ťažkého reťazca (VH) pochádzajúci z DP-35, DP-47, DP-71 alebo Vit-4/4.35 VH génu, výhodne DP-35 VH génu. V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu molekula nukleovej kyseliny kóduje VH obsahujúci spojovací úsek pochádzajúci z JH6 alebo JH5, výhodnejšie JH6. V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu D segment pochádza z 3-3, 6-19 alebo 4-17. V ešte výhodnejšom uskutočnení vynálezu molekula nukleovej kyseliny kóduje VH obsahujúci nie viac než desať aminokyselinových substitúcií z DP-47 génu zárodočnej línie, výhodne nie viac než šesť aminokyselinových substitúcií a dokonca výhodnejšie nie viac než tri aminokyselinové substitúcie. Vo vysoko výhodnom uskutočnení vynálezu molekula nukleovej kyseliny kóduje VH obsahujúci aspoň jednu aminokyselinovú substitúciu v porovnaní so sekvenciou zárodočnej línie, pričom kde aminokyselinové substitúcie sú identické s aminokyselinovými substitúciami sekvencie zárodočnej línie od ťažkého reťazca jednej z protilátok 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 alebo 6.1.1. V ešte výhodnejšom uskutočnení vynálezu VH obsahuje aspoň tri aminokyselinové substitúcie v porovnaní so sekvenciou zárodočnej línie, pričom substitúcie sú identické so substitúciami zo sekvencie VH zárodočnej línie jednej z protilátok 2.12.1, 2.13.2,
2.14.3,3.1.1,4.9.2,4.17.3 alebo 6. 1. 1.
V jednom uskutočnení vynálezu molekula nukleovej kyseliny obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu VH z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 alebo 6.1.1. V ďalšom uskutočnení vynálezu molekula nukleovej kyseliny obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu jedného alebo viacerých CDR ťažkého reťazca z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1,
4.9.2, 4.17.3 alebo 6.1.1. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu molekula nukleovej kyseliny obsahuje sek19 venciu nukleovej kyseliny, ktorá kóduje aminokyselinové sekvencie všetkých CDR ťažkého reťazca z 2.12.1,
2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 alebo 6.1.1. V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu molekula nukleovej kyseliny obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu jednej zo SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20 alebo 24, alebo ktorá obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny jednej zo SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19 alebo 23. V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu molekula nukleovej kyseliny obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu jedného alebo viacerých CDR ktorejkoľvek zo SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20 alebo 24, alebo obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny jedného alebo viacerých CDR ktorejkoľvek zo SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19 alebo 23. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu molekula nukleovej kyseliny obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá kóduje aminokyselinové sekvencie všetkých CDR ktorejkoľvek zo SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20 alebo 24, alebo obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny všetkých CDR ktorejkoľvek zo SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19 alebo 23.
V ďalšom uskutočnení vynálezu molekula nukleovej kyseliny kóduje aminokyselinovú sekvenciu VH, ktorá je aspoň na 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 alebo 99 % identická s jednou z aminokyselinových sekvencií kódujúcich VH, ako boli opísané bezprostredne pred týmto, konkrétne s VH, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu jednej zo SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20 alebo 24. Vynález tiež poskytuje sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá je aspoň na 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 alebo 99 % identická s jednou zo sekvencii nukleových kyselín SEQ ID NO: 3,7, 11, 15, 19 alebo 23. V ďalšom uskutočnení vynálezu molekula nukleovej kyseliny kódujúca VH je molekula, ktorá hybridizuje za vysoko stringentných podmienok so sekvenciou nukleovej kyseliny kódujúcou VH, ako tu už bolo opísané, konkrétne VH obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu jednej zo SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20 alebo 24. Vynález tiež poskytuje sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu VH, ktorý hybridizuje za vysoko stringentných podmienok s molekulou nukleovej kyseliny obsahujúcou sekvenciu nukleovej kyseliny vybranú zo SEQ ID NO: 3, 7,11, 15, 19 alebo 23.
Molekula nukleovej kyseliny kódujúca buď jeden, alebo obidva, tak ťažký ako ľahký reťazec anti-IGF-IR protilátky alebo ich variabilné úseky, môže byť získaná z akéhokoľvek zdroja, ktorý vytvára anti-IGF-IR protilátky. Metódy izolácie mRNA kódujúcej protilátky sú v odbore známe (pozri napr. Sambrook et al.). mR-NA môže byť použitá na prípravu cDNA na ďalšie použitie v polymerázovej reťazovej reakcii (PCR) alebo na cDNA klonovanie protilátkových génov. V jednom uskutočnení vynálezu molekuly nukleovej kyseliny môžu byť získané z hybridómu, ktorý exprimuje anti-IGF-IR protilátku, ako tu už bolo opísané, výhodne z hybridómu, ktorý má ako jeden z fúznych partnerov bunku transgénneho zvieraťa iného nezje človek, ako je napríklad XENOMOUSE™, ktorá exprimuje humánne imunoglobulínové gény, alebo zvieraťa iného než je človek, napr. myši, alebo zvieraťa iného než je človeka a iného ako myš. V ďalšom uskutočnení vynálezu hybridom pochádza zo zvieraťa, ktoré nieje ľudského pôvodu, a nieje transgénne, ktoré môže byť použité napr. na humanizované protilátky.
Molekula nukleovej kyseliny kódujúca celý ťažký reťazec z anti-IGF-IR protilátky môže byť konštruovaná fúzovaním molekuly nukleovej kyseliny kódujúcej variabilnú doménu ťažkého reťazca alebo jej antigén-väzobnú doménu s konštantnou doménou ťažkého reťazca. Podobne, molekula nukleovej kyseliny kódujúca ľahký reťazec z anti-IGF-IR protilátky môže byť konštruovaná fúzovaním molekuly nukleovej kyseliny kódujúcej variabilnú doménu ľahkého reťazca alebo jej antigén-väzobnú doménu s konštantnou doménou ľahkého reťazca. Molekuly nukleovej kyseliny kódujúce VH a VL reťazec môžu byť premenené na gény kompletných protilátok tým, že sa vložia do expresného vektora, ktorý už kóduje konštantné úseky ťažkého reťazca a ľahkého reťazca, v danom poradí, a to tak, že VH segment je operatívne spojený so segmentom alebo segmentami konštantného úseku ťažkého reťazca (CH) vo vektore a VL segment je operatívne spojený so segmentom alebo segmentmi konštantného úseku ľahkého reťazca (CL) vo vektore. Alternatívne, molekuly nukleovej kyseliny kódujúce VH alebo VL reťazce sú zmenené na gény kompletnej protilátky spojením, napr. ligáciou, molekuly nukleovej kyseliny kódujúce VH reťazec s molekulou nukleovej kyseliny kódujúcou CH reťazec s použitím štandardných metód molekulárnej biológie. Rovnakého výsledku sa môže dosiahnuť s použitím molekuly nukleovej kyseliny kódujúcej VL a CL reťazce. Sekvencie konštantných úsekov humánneho ťažkého a ľahkého reťazca sú v odbore dobre známe (pozri napr. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. vyd. NIH Publ. 91-3242, 1991). Molekuly nukleovej kyseliny kódujúce kompletný ťažký a/alebo ľahký reťazec môžu potom byť exprimované v bunke, do ktorej boli vložené, a potom izolované anti-IGF-IR protilátky.
Vo výhodnom uskutočnení vynálezu nukleová kyselina kódujúca variabilný úsek ťažkého reťazca kóduje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20 alebo 24 a molekula nukleovej kyseliny kódujúca variabilný úsek ľahkého reťazca kóduje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18 alebo 22. Sekvencia SEQ ID NO: 28 ukazuje aminokyselinovú sekvenciu a SEQ ID NO: 27 ukazuje sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcej konštantný úsek ťažkého reťazca z anti-IGF-IR protilátky 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3,
3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 a 6.1.1. SEQ ID NO: 26 ukazuje aminokyselinovú sekvenciu a SEQ ID NO: 25 ukazuje sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu konštantný úsek ľahkého reťazca z anti-IGF-IR protilátky 2.12.1,
2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 a 6.1.1. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu molekula nukleovej kyseliny kódujúca konštantnú doménu ťažkého reťazca kóduje SEQ ID NO: 28 a molekula nukleovej kyseliny kódu20 júca konštantnú doménu ľahkého reťazca kóduje SEQ ID NO: 26. Vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu molekula nukleovej kyseliny kódujúca konštantnú doménu ťažkého reťazca má sekvenciu nukleovej kyseliny SEQ ID NO: 27 a molekula nukleovej kyseliny kódujúca konštantnú doménu má sekvenciu nukleovej kyseliny SEQ ID NO: 25.
V ďalšom uskutočnení vynálezu molekula nukleovej kyseliny kódujúca buďto ťažký reťazec z anti-IGF-IR protilátky alebo jej antigén-väzobnú doménu, alebo ľahký reťazec z anti-IGF-IR protilátky, alebo jeho antigén-väzobnú doménu, môže byť izolovaná zo zvieraťa iného než človek a iného než myš, ktoré exprimuje humánne imunoglobulínové gény a bolo imunizované IGF-IR antigénom. V inom uskutočnení vynálezu molekula nukleovej kyseliny môže byť izolovaná z buniek produkujúcich anti-IGF-IR protilátky, kde bunky pochádzajú z netransgénneho zvieraťa alebo z humánneho pacienta, ktorý vytvára anti-IGF-IR protilátky. Metódy izolácie mRNA z buniek produkujúcich anti-IGF-IR protilátky sú známe: RNA je z buniek izolovaná štandardnými technikami, klonovaná a/alebo amplifikovaná s použitím PCR a techník konštruovania knižníc a potom skrínovaná s použitím štandardných postupov na získanie molekuly nukleovej kyseliny kódujúcej ťažký a ľahký reťazec anti-IGF-IR.
Molekuly nukleovej kyseliny môžu byť použité na rekombinantnú expresiu veľkého množstva anti-IGF-IR protilátky, ako bude opísané. Molekuly nukleovej kyseliny môžu tiež byť použité na vytvorenie chimérických protilátok, jednoreťazcových protilátok, imunoadhezínov, „diabodies“, mutovaných protilátok a protilátkových derivátov, ak bude ešte opísané. Ak molekuly nukleovej kyseliny nepochádzajú z človeka ani z transgénneho zvieraťa, molekuly nukleovej kyseliny sa môžu použiť na humanizáciu protilátky, ako bude opísané.
V ďalšom uskutočnení vynálezu molekuly nukleovej kyseliny podľa vynálezu môžu byť použité ako sondy alebo PCR priméry na špecifické protilátkové sekvencie. Napríklad molekula nukleovej kyseliny ako sonda môže byť použitá v diagnostických metódach alebo molekula nukleovej kyseliny ako PCR primér môže byť použitá na amplifikovanie úseku DNA, ktorý môže byť použitý, inier alia, na izoláciu sekvencie nukleovej kyseliny na použitie pri produkcii variabilných domén anti-IGF-IR protilátky. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu molekuly nukleovej kyseliny sú oligonukleotidy. Vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu oligonukleotidy sú z vysoko variabilných úsekov ťažkého a ľahkého reťazca požadovanej protilátky. V ešte výhodnejšom uskutočnení vynálezu oligonukleotidy kódujú celý alebo časť jedného alebo viacerých CDR.
Vektory
Vynález poskytuje vektory obsahujúce molekuly nukleovej kyseliny podľa vynálezu, ktoré kódujú ťažký reťazec alebo jeho antigén-väzobnú časť. Vynález tiež poskytuje vektory obsahujúce molekulu nukleovej kyseliny podľa vynálezu, ktorá kóduje ľahký reťazec alebo jeho antigén-väzobnú časť. Vynález tiež poskytuje vektory obsahujúce molekuly nukleovej kyseliny kódujúce fúzne proteíny, modifikované protilátky, protilátkové fragmenty a sondy.
Na expresiu protilátok alebo častí protilátok podľa vynálezu, DNA kódujúca časť alebo kompletný ľahký a ťažký reťazec získané už opísaným spôsobom, môžu byť vložené do expresného vektoru, takže gény sú operatívne spojené s transkripčnými a translačnými kontrolnými sekvenciami. Expresné vektory zahrnujú plazmidy, retrovírusy, kozmidy, YAC, epizómy odvodené z EBV a pod. Protilátkový gén sa liguje do vektora tak, že transkripčné a translačné kontrolné sekvencie vo vektore slúžia zamýšľanej funkcii a riadia transkripciu a transláciu protilátkového génu. Expresný vektor a expresné kontrolné sekvencie sú zvolené tak, aby boli kompatibilné s použitými expresnými hostiteľskými bunkami. Gén pre ľahký reťazec protilátky a gén pre ťažký reťazec protilátky môžu byť vložené do oddelených vektorov. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sú obidva gény vložené do rovnakého expresného vektora. Protilátkové gény sa vložia do expresného vektora štandardnými metódami (ako je napr. ligácia komplementárnych reštrikčných miest na fragmente protilátkového génu a vektora alebo ligácia tupých koncov, ak nie sú prítomné žiadne reštrikčné miesta), ktoré sú odborníkom známe.
Vhodným vektorom je vektor, ktorý kóduje fúnkčne kompletné humánne CH alebo CL imunoglobulínové sekvencie, s vhodnými reštrikčnými miestami, ktoré sú vložené metódami génového inžinierstva tak, že akákoľvek VH alebo VL sekvencia môže byť do vektora ľahko vložená a exprimovaná, ako tu už bolo opísané. V takom vektore zostrih obvykle nastáva medzi donorovým zostrihovým miestom vloženým do J úseku a akceptorovým zostrihovým miestom predchádzajúcim humánny C úsek, a tiež v zostrihových úsekoch, ktoré sa vyskytujú v humánnych CH exónoch. Polyadenylácia a terminácia transkripcie nastávajú v natívnych chromozómových miestach po smere („downstream“) od kódujúceho úseku. Rekombinantný expresný vektor môže tiež kódovať signálny peptid, ktorý uľahčí sekréciu protilátky z hostiteľskej bunky. Gén pre protilátkový reťazec môže byť klonovaný do vektora tak, že signálny peptid je spojený v zhodnom čítacom rámci s aminokoncom protilátkového reťazca. Signálnym peptidom môže byť imunoglobulínový signálny peptid alebo heterológny signálny peptid (t. j. signálny peptid z iného proteínu než je imunoglobulín).
Okrem génov pre protilátkové reťazce nesú rekombinantné expresné vektory podľa vynálezu regulačné sekvencie, ktoré riadia expresiu génov pre protilátkové reťazce v hostiteľskej bunke. Odborník šije vedomý toho, že konštrukcia expresného vektora, vrátane výberu regulačnej sekvencie, závisí od rôznych faktorov, ako je napr. voľba hostiteľskej bunky, ktorá má byť transformovaná, hladina expresie proteínu, ktorá má byť dosiahnutá a pod. Výhodné regulačné sekvencie pre expresiu v cicavčej hostiteľskej bunke zahrnujú vírusové elementy, ktoré riadia vysoké hladiny proteínovej expresie v cicavčích bunkách, ako sú napríklad promótory a/alebo enhancery (zosilňovače) pochádzajúce z retrovírusových LTR, cytomegalovírusu (CMV) (ako napríklad promótor CMV), opičieho vírusu 40 (SV40) (ako napríklad promótor SV40), adenovírusu (napr. adenovírusový hlavný neskorý promótor (ADMLP)), polyoma a silné cicavčie promótory ako napríklad natívne promótory imunoglobulínového a aktínového génu. Na ďalší opis vírusových regulačných prvkov a sekvencii pozri napr. patent US 5,168,062, Stinski, patent US 4,510,245, Bell et al., a patent US 4,968,615, Schaffner et al.
Okrem génov pre protilátkové reťazce a regulačné sekvencie môže rekombinantný expresný vektor podľa vynálezu niesť ďalšie sekvencie, ako napríklad sekvencie, ktoré regulujú replikáciu vektora v hostiteľských bunkách (napr. počiatok replikácie), a ďalej gény selekčných markerov. Gény selekčných markerov umožňujú selekciu hostiteľských buniek, do ktorých bol vnesený vektor (pozri napr. patenty US 4,399,216, 4,634,665 a 5,179,017, Axel et al.). Napríklad typicky gén selekčného markeru udeľuje rezistenciu na liečivo, ako napríklad G418, hygromycín alebo methotrexát, hostiteľskej bunke, do ktorej bol príslušný vektor vnesený. Výhodné markerové gény zahrnujú gén pre dihydrofolátreduktázu (DHFR) (na použitie v dhfr hostiteľských bunkách s methotrexátovou selekciou/amplifikáciou) a gén neo (pre selekciu G418).
Nehybridómové hostiteľské bunky a metódy rekombinantnej produkcie proteínov
Molekuly nukleovej kyseliny kódujúce ťažký reťazec alebo jeho antigén-väzobnú časť a/alebo ľahký reťazec alebo jeho antigén-väzobnú časť z anti-IGF-IR protilátky a vektory obsahujúce tieto molekuly nukleovej kyseliny môžu byť použité na transformáciu vhodnej cicavčej hostiteľskej bunky. Transformácia môže byť uskutočnená ktorýmkoľvek známym spôsobom na vnášanie polynukleotidov do hostiteľskej bunky. Metódy vnesenia heterológneho polynukleotidu do cicavčích buniek sú v odbore dobre známe a zahrnujú metódy, ako je napr. dextránom sprostredkovaná transfekcia, precipitácia s fosfátom vápenatým, polybrenom sprostredkovaná transfekcia, fúzia protoplastov, elektroporácia, zabalenie polynukleotidu(ov) do lipozómov, biolistická injekcia a piama mikroinjekcia DNA do jadra. Okrem toho, molekuly nukleovej kyseliny môžu byť vnesené do cicavčích buniek prostredníctvom vírusových vektorov. Metódy transformácie buniek sú v odbore dobre známe, pozri napr. patenty US 4,399,216, 4,912,040,4,740,461 a 4,959,455 (ktoré sú týmto zahrnuté formou odkazu).
Cicavčie bunkové línie dostupné ako hostitelia pre expresii sú v odbore dobre známe a patria k nim mnohé imortalizované bunkové línie z Americkej zbierky mikroorganizmov ATCC (American Type Culture Collection). Patria sem, inter alia, bunky vaječníkov čínskeho škrečka (CHO), NSO, SP2 bunky, HeLa bunky, obličkové bunky mláďat škrečkov (BHK), opičie obličkové bunky (COS), bunky humánneho hepatocelulárneho karcinómu (napr. Hep G2), A549 bunky, 3T3 bunky a rad ďalších bunkových línií. Cicavčie hostiteľské bunky zahrnujú humánne a myšie bunky, a ďalej bunky laboratórneho potkana, psa, opice, prasaťa, kozy, hovädzieho dobytka, koňa a škrečkov. Výhodné bunkové línie sa vyberú tak, že sa určia, ktoré bunkové línie majú vysoké hladiny expresie. Ďalšie bunkové línie, ktoré môžu byť použité, sú hmyzie bunkové línie, ako napríklad Sf9 bunky, bunky obojživelníkov, bakteriálne bunky, rastlinné bunky a hubové bunky. Keď rekombinantné expresné vektory kódujúce ťažký reťazec alebo jeho antigén-väzobnú časť, ľahký reťazec a/alebo jeho antigén-väzobnú časť sú vnesené do cicavčích hostiteľských buniek, protilátky sú vytvorené kultiváciou hostiteľských buniek počas obdobia dostatočného na expresiu protilátky v hostiteľských bunkách alebo, výhodnejšie, na sekréciu protilátky do kultivačného média, v ktorom sú hostiteľské bunky pestované. Protilátky sa môžu získať z kultivačného média použitím štandardných metód purifikácie proteínov.
Ďalej, expresia protilátky podľa vynálezu (alebo jej častí) z produkčnej bunkovej línie môže byť zosilnená s použitím radu známych techník. Napríklad expresný systém glutamínsyntetázového génu (GS systém) je bežný spôsob na zosilnenie expresie za určitých podmienok. GS systém je opísaný ako celok alebo časť v európskych patentoch č. 0 216 846, 0 256 055 a 0 323 997 a európskej patentovej prihláške č. 89303964.4.
Je pravdepodobné, že protilátky exprimované v rôznych bunkových líniách alebo v transgénnych zvieratách budú mať vzájomne odlišnú glykozyláciu. Ale všetky protilátky kódované molekulami nukleovej kyseliny podľa predkladaného vynálezu alebo obsahujúce aminokyselinové sekvencie podľa predkladaného vynálezu spadajú do rozsahu predkladaného vynálezu bez ohľadu na glykozyláciu protilátok.
Transgénne zvieratá
Vynález tiež poskytuje transgénne zvieratá s výnimkou človeka obsahujúce jednu alebo viac molekúl nukleovej kyseliny podľa vynálezu, ktoré možno využiť na produkciu protilátok podľa vynálezu. Protilátky môžu byť produkované a získavané z tkaniva alebo telesnej tekutiny, ako je napríklad mlieko, krv alebo moč, zvierat, ako sú kozy, kravy, kone, prasatá, laboratórne potkany, myši, králiky, škrečky alebo iné cicavce. Pozri napr. patenty US 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172 a 5,741,957. Ako už bolo opísané, transgénne zvieratá iného než ľudského pôvodu, ktoré obsahujú humánne imunoglobulínové lokusy, môžu byť vytvorené imunizáciou IGF-IR alebo jeho častí.
V ďalšom uskutočnení vynálezu transgénne zvieratá iného než ľudského pôvodu sú vytvorené tak, že sa jedna alebo viac molekúl nukleovej kyseliny podľa vynálezu vnesie do zvieraťa štandardnými transgénnymi technikami. Pozri napr. už citovaného Hogana. Transgénne bunky použité na prípravu transgénneho zvieraťa môžu byť embryonálne kmeňové bunky alebo somatické bunky. Transgénne organizmy iného než ľudského pôvodu môžu byť chimérické, nechimérické heterozygoty a nechimérické homozygoty. Pozri napr. Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2ed., Cold Spring Harbor Press, 1999, Jackson et al., Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press, 2000, and Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press, 1999. V ďalšom uskutočnení vynálezu transgénne organizmy iného než ľudského pôvodu môžu mať cielené prerušenia a substitúcie, ktoré kóduje požadovaný ťažký reťazec a/alebo ľahký reťazec. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu transgénne zvieratá obsahujú a exprimujú molekuly nukleovej kyseliny kódujúce ťažký a ľahký reťazec, ktoré sa viažu špecificky k IGF-IR, výhodne k humánnemu IGF-IR. V ďalšom uskutočnení vynálezu transgénne zvieratá obsahujú molekuly nukleovej kyseliny kódujúce modifikované protilátky, ako je napríklad jednoreťazcová protilátka, chimérická protilátka alebo humanizovaná protilátka. Anti-IGF-IR protilátky môžu byť produkované v ktoromkoľvek transgénnom zvierati. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu zvieratá iného než ľudského pôvodu sú myši, laboratórne potkany, ovce, prasatá, kozy, hovädzí dobytok alebo kone. Transgénne zviera iného než ľudského pôvodu exprimuje kódované polypeptidy v krvi, mlieku, moči, slinách, slzách, hliene či iných telesných tekutinách.
Fágové displejové knižnice
Vynález poskytuje spôsob prípravy anti-IGF-IR protilátky alebo jej antigén-väzobných častí zahrnujúci kroky syntézy knižnice humánnych protilátok vo fágu, skríning knižnice pomocou IGF-IR alebo jeho časti, izolácie fágu, ktorý viaže IGF-IR a získania protilátky z fága. Jeden spôsob prípravy knižnice protilátok obsahuje kroky imunizácie hostiteľského zvieraťa iného než ľudského pôvodu obsahujúceho humánny imunoglobulínový lokus s IGF-IR alebo jeho antigénnou časťou, aby sa vyvolala imunitná reakcia, extrakcie buniek z hostiteľského zvieraťa, ktoré sú zodpovedné za produkciu protilátok, izolácie RNA z extrahovaných buniek, reverznej transkripcie RNA za vzniku cDNA, amplifikácie cDNA s použitím priméru a inzercie cDNA do fágového displejového vektora, aby boli protilátky exprimované na fágu. Rekombinantné anti-IGF-IR protilátky podľa vynálezu sa môžu získať práve týmto spôsobom.
Rekombinantné anti-IGF-IR humánne protilátky podľa vynálezu navyše k anti-IGF-IR protilátkam opísaným v tomto texte môžu byť izolované pomocou skríningu rekombinantnej kombinačnej protilátkovej knižnice, výhodne scFv fágovej displejovej knižnice, pripravených s použitím humánnej VL a VH cDNA získanej z mRNA pochádzajúcej z humánnych lymfocytov. Metódy na prípravu a skríning takejto knižnice sú v odbore známe. Tiež sú komerčne dostupné súpravy na prípravu fágovej displejovej knižnice (napr. Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, katalóg č. 27-9400-01, a Stratagene SurfZAPTM phage display kit, katalóg č. 240612). Existujú tiež iné metódy a činidlá, ktoré môžu byť použité na prípravu a skríning protilátkovej displejovej knižnice (pozri napr. Ladner et al. patent US 5,223,409, Kang et al., publikovaná PCT prihláška WO 92/18619, Dower et al., publikovaná PCT prihláška WO 91/17271, Winter et al., publikovaná PCT prihláška WO 92/20791, Markland et al., publikovaná PCT prihláška WO 92/15679, Breitling et al., publikovaná PCT prihláška WO 93/01288, McCafferty et al., publikovaná PCT prihláška WO 92/01047, Garrard et al., publikovaná PCT prihláška WO 92/09690, Fuchs et al., 1991, Bio/Technology 9: 1370-1372, Hay et al., 1992, Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85, Huse et al., 1989, Science 246: 1275-1281, McCafferty et al., Náture, 1990, 348: 552-554, Griffiths et al., 1993, EMBO J 12: 725-734, Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol. 226: 889-896, Clackson et al., 1991, Náture 352: 624-628, Gram et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580, Garrad et al., 1991, Bio/Technology 9: 1373-1377, Hoogenboom et al., 1991, Nuc Acid Res 19: 4133-4137, a Barbas et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982.
Vo výhodnom uskutočnení vynálezu na izoláciu humánnej anti-IGF-IR protilátky s požadovanými vlastnosťami, humánna anti-IGF-IR protilátka, ako bola opísaná v tomto texte, je najskôr použitá na výber sekvencie humánneho ťažkého a ľahkého reťazca, ktoré majú podobnú väzobnú aktivitu k IGF-IR, s použitím metódy epitopového imprintingu, ako bola opísaná v Hoogenboom et al., PCT publikácia č. WO 93/06213. Protilátkové knižnice použité pri tomto spôsobe sú výhodne scFv knižnice pripravené a skrínované, ako bolo opísané v McCafferty et al., PCT publikácie č. WO 92/01047, McCafferty et al., Náture, 1990, 348: 552-554 a Griffiths et al., 1993, EMBO J 12: 725-734. ScFv protilátkové knižnice sú výhodne skrínované s použitím humánneho IGF-IR ako antigénu.
Hneď ako sa vyberú východiskové humánne VL a VH segmenty, uskutočnia sa experimenty „mix and match“, v ktorých sú rôzne páry na začiatku vybraných VL a VH segmentov podrobené skríningu na IGF-IR väzbu, aby sa vybrali výhodné kombinácie párov VL/VH. A navyše na ďalšie zlepšenie kvality protilátky, VL a VH segmenty výhodných párov VL/VH môžu byť náhodne mutované, výhodne v úseku CDR3 VH a/alebo VL, a síce postupom, ktorý je analogický in vivo somatickému mutačnému postupu zodpovednému za afinitné zrenie protilátok počas prirodzenej imunitnej reakcie. Toto afinitné zrenie in vitro sa môže uskutočniť tým, že sa amplifikujú VH a VL úseky s použitím PCR primérov komplementárnych k VH CDR3 alebo VL CDR3, v danom poradí, pričom tieto priméry boli „zaostrené“ náhodnou zmesou štyroch nukleotidových báz v určitej polohe, takže výsledné PCR produkty kódujú VH a VL segmenty, do ktorých boli zavedené náhodné mutácie do úsekov VH a/alebo VL CDR3. Tieto náhodne mutované VH a VL segmenty môžu byť testované skríningom na väzbu k IGF-IR.
Následne po skríningu a izolácii anti-IGF-IR protilátky podľa vynálezu z rekombinantnej imunoglobulínovej displejovej knižnice sa môže získať nukleová kyselina kódujúca vybranú protilátku z displejového balíčka (napr. z fágového genómu) a subklonovať do iného expresného vektora štandardnými rekombinantnými DNA technikami. Ak je potrebné, nukleová kyselina sa môže ďalej upraviť, aby sa vytvorila iná protilátková forma podľa vynálezu, ako bude opísané. Na expresiu rekombinantnej humánnej protilátky izolovanej skríningom kombinačnej knižnice je DNA kódujúca protilátku klonovaná do rekombinantného expresného vektora a vnesená do cicavčej hostiteľskej bunky, ako to bolo opísané už v texte.
Prešmyk tried
Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje mechanizmus, ktorým jedna trieda anti-IGF-IR protilátky môže byť prešmyknutá (zmenená) na iný. Podľa jedného aspektu vynálezu sa molekula nukleovej kyseliny kódujúca VL alebo VH izoluje metódami známymi v odbore tak, že neobsahuje žiadne sekvencie nukleovej kyseliny kódujúce CL alebo CH. Molekula nukleovej kyseliny kódujúca VL alebo VH je potom operatívne spojená so sekvenciou nukleovej kyseliny kódujúcou CL alebo CH z odlišnej triedy imunoglobulínových molekúl. Tohto sa môže dosiahnuť použitím vektora alebo molekuly nukleovej kyseliny obsahujúcej CL alebo CH reťazec, ako bol opísaný už v texte. Napríklad anti-IGF-IR protilátka, ktorá bola pôvodne IgM, môže byť prešmyknutá na triedu IgG. Ďalej prešmyk tried sa môže využiť na prestavbu jednej IgG podtriedy na inú, napr. IgGl na IgG2. Výhodný spôsob prípravy protilátky podľa vynálezu obsahujúci požadované izotypy obsahuje kroky izolácie nukleovej kyseliny kódujúcej ťažký reťazec anti-IGF-IR protilátky a nukleovej kyseliny kódujúcej ľahký reťazec anti-IGF-IR protilátky, získania variabilného úseku ťažkého reťazca, ligácie variabilného úseku ťažkého reťazca s konštantnou doménou ťažkého reťazca požadovaného izotypu, expresie ľahkého reťazca a ligovaného ťažkého reťazca v bunke a odber anti-IGF-IR protilátky požadovaného izotypu.
Deriváty protilátok
Molekuly nukleovej kyseliny, ktoré už boli v texte opísané, môžu byť použité na prípravu derivátov protilátok s použitím techník a metód, ktoré sú odborníkom známe.
Humanizované protilátky
Ako už bolo v texte opísané v súvislosti s generovaním humánnych protilátok, je výhodné produkovať protilátky s redukovanou imunogenicitou. To je možné uskutočniť v určitom rozsahu s použitím techniky humanizácie a displejovej techniky s využitím vhodných knižníc. Odborníkom je známe, že myšie protilátky alebo protilátky z iného biologického druhu môžu byť humanizované alebo primatizované technikami, ktoré sú v odbore dobre známe (pozri napr. Winter and Harris Immunol Today 14: 43-46, 1993, a Wright et al. Crit. Reviews in Immunol. 12125168, 1992). Požadovaná protilátka môže byť geneticky upravená technikami rekombinantnej DNA tak, že sa nahradí CH1, CH2, CH3, kĺbové domény, a/alebo rámcové domény zodpovedajúcimi humánnymi sekvenciami (pozri WO 92/02190 a patenty US 5,530,101, 5,585,089, 5,693,761, 5,693,792, 5,714,350 a 5,777,085). Vo výhodnom uskutočnení vynálezu anti-IGF-IR protilátka môže byť humanizovaná tým, že sa substituujú CH1, CH2, CH3, kĺbová doména a/alebo rámcová doména zodpovedajúcimi humánnymi sekvenciami, zatiaľ čo sa ponechajú všetky CDR ťažkého reťazca, ľahkého reťazca alebo tak ťažkého ako aj ľahkého reťazca.
Mutované protilátky
V ďalšom uskutočnení vynálezu molekuly nukleovej kyseliny, vektory a hostiteľské bunky môžu byť použité na prípravu mutovaných anti-IGF-IR protilátok. Protilátky môžu byť mutované vo variabilných doménach ťažkého a/alebo ľahkého reťazca, aby sa zmenili väzobné vlastnosti protilátky. Napríklad mutácia sa môže vytvoriť v jednom alebo viacerých CDR úsekoch na zvýšenie alebo zníženie hodnoty Kd protilátky pre IGF-IR, na zvýšenie alebo zníženie alebo kvôli zmene väzobnej špecifickosti protilátky. Techniky miestne cielenej mutagenézy sú v odbore dobre známe (pozri napr. Sambrook et al. a Ausubel et al., cit. Výše). Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sú mutácie vytvorené v aminokyselinovom zvyšku, o ktorom je známe, že je vo variabilnom úseku odlišný v porovnaní so zárodočnou líniou anti-IGF-IR protilátky. Vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu jedna alebo viac mutácií je vytvorených v aminokyselinovom zvyšku, o ktorom je známe, že bol v porovnaní s variabilným úsekom zárodočnej línie alebo CDR úsekom zmenený pri anti-IGF-IR. protilátke 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 alebo 6.1.1. V inom uskutočnení vynálezu je jedna alebo viac mutácií vytvorené v aminokyselinovom zvyšku, o ktorom je známe, že bol zmenený v porovnaní s variabilným úsekom zárodočnej línie alebo CDR úsekom, ktorých sekvencie sú uvedené ako aminokyselinové sekvencie SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 alebo 24, alebo ktorých sekvencie nukleových kyselín sú uvedené ako SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 alebo 23. V ďalšom uskutočnení vynálezu sú molekuly nukleovej kyseliny mutované v jednom alebo viacerých rámcových úsekoch. Mutácie sa môžu vytvoriť v rámcovom úseku alebo v konštantnej doméne na zvýšenie polčasu anti-IGF-IR protilátka (pozri napr. WO 00/09560, publikované 24. 2. 2000, zahrnuté formou odkazu). V jednom uskutočnení vynálezu tu môže byť jedna, tri alebo päť bodových mutácií, ale nie viac než desať bodových mutácií. Môže sa tiež vytvoriť mutácia v rámcovom úseku alebo v konštantnej doméne, aby sa zmenila imunogenicita protilátky, poskytlo miesto pre kovalentnú alebo nekovalentnú väzbu na ďalšej molekule alebo aby sa zmenili také vlastnosti, ako je napr. fixácia komplementu. Mutácie môžu byť vytvorené v každom z rámcového úseku, konštantnej domény a variabilných úsekov, v jedinej mutovanej protilátke. Alternatívne mutácie môžu byť vytvorené iba v jednom z rámcových úsekov, variabilných úsekov alebo konštantných domén v jedinej mutovanej protilátke.
V jednom uskutočnení nie je viac než desať aminokyselinových substitúcií buďto vo VH, alebo VL úsekoch mutovanej anti-IGF-IR protilátky v porovnaní s anti-IGF-IR protilátkou pred mutáciou. Vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu existuje nie viac než päť aminokyselinových substitúcií buďto vo VH, alebo VL úseku mutovanej anti-IGF-IR protilátky, ešte výhodnejšie nie viac než tri aminokyselinové substitúcie. V ďalšom uskutočnení vynálezu je nie viac než pätnásť aminokyselinových substitúcií v konštantných doménach, výhodnejšie, nie viac než desať aminokyselinových substitúcií, dokonca ešte výhodnejšie nie viac než päť aminokyselinových substitúcií.
Modifikované protilátky
V ďalšom uskutočnení vynálezu môžu byť vytvorené fúzne protilátky alebo imunoadhezíny, ktoré obsahujú celé alebo časť anti-IGF-IR protilátky spojené s ďalším polypeptidom. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sú s polypeptidom spojené iba variabilné úseky anti-IGF-IR protilátky. V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu VH doména anti-IGF-IR protilátky je spojená s prvým polypeptidom, zatiaľ čo VL doména anti-IGF-IR protilátky je spojená s druhým polypeptidom, ktorý asociuje s prvým polypeptidom takým spôsobom, že VH a VL domény môžu interagovať a tým vytvoriť protilátkové väzobné miesto. V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu VH doména je oddelená od VL domény spojovacou sekvenciou (linkerovou sekvenciou, linkerom), takže VH a VL domény môžu vzájomne interagovať (pozri kapitola jednoreťazcové protilátky). Protilátka „VH-linker-VL je potom spojená s požadovaným polypeptidom. Fúzna protilátka je užitočná na cielenie polypeptidu do IGF-IR-exprimujúcej bunky alebo tkaniva. Polypeptid môže byť terapeutické agens, ako je napríklad toxín, rastový faktor alebo iný regulačný proteín, alebo to môže byť diagnostické agens, ako je napríklad enzým, ktorý môže byť ľahko zviditeľnený, ako napríklad chrenová peroxidáza. Okrem toho môžu byť vytvorené fúzne protilátky, v ktorých dve (alebo viac) jednoreťazcové protilátky sú spojené k sebe. To je užitočné, ak je potrebné vytvoriť dvojmocné alebo polyvalentné protilátky s jednoduchým polypeptidovým reťazcom alebo ak je potrebné vytvoriť bišpecifickú protilátku.
Na vytvorenie jednoreťazcovej protilátky (scFv) sú VH a VL-kódujúce DNA fragmenty operatívne spojené s ďalším fragmentom kódujúcim flexibilnú spojovaciu sekvenciu (linker), napr. kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu (Gly4-Ser)3 (SEQ ID NO: 60), takže VH a VL sekvencie môžu byť exprimované ako súvislý jednoreťazcový proteín, s VL a VH úsekmi spojenými flexibilným linkerom (pozri napr. Bird et al., 1988, Science 242: 423-426, Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883, McCafferty et al., Náture, 1990, 348: 552-554). J ednoreťazco vá protilátka môže byť jednomocná, ak je použité iba po jednom VH a VL, dvojmocná, ak sú použité dva VH a VL, alebo polyvalentná, ak je použitých viac než dva VH a VL.
V ďalšom uskutočnení vynálezu sa môžu pripraviť iné modifikované protilátky s použitím anti-IGF-IR-kódujúcej molekuly nukleovej kyseliny. Napríklad tzv. „Kappa-bodies“ (111 et al., Protein Eng 10: 949-57, 1997), „Minibodies“ (Martin et al., EMBO J 13: 53039, 1994), „diabodies“ (Holliger et al., PNAS USA 90: 6444-6448, 1993) alebo „Janusiny“ (Traunecker et al., EMBO J 10: 3655-3659, 1991, a Traunecker et al. „Janusin: new molecular design for bispecific reagents“ Int J Cancer Suppl 7: 51-52, 1992) sa môžu pripraviť s použitím štandardných techník molekulárnej biológie na základe predloženého opisu vynálezu.
Podľa ďalšieho aspektu vynálezu sa môžu tvoriť chimérické a bišpecifické protilátky. Môže sa vytvoriť chimérická protilátka, ktorá obsahuje CDR a rámcové úseky z rôznych protilátok. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu CDR chimérickej protilátky obsahujú všetky CDR variabilného úseku ľahkého reťazca alebo ťažkého reťazca z anti-IGF-IR protilátky, zatiaľ čo rámcové úseky sú odvodené z jednej alebo viacerých rôznych protilátok. Vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu CDR chimérickej protilátky obsahujú všetky z CDR variabilných úsekov ľahkého reťazca a ťažkého reťazca anti-IGF-IR protilátky. Rámcové úseky môžu byť z iného druhu (biologického) a môžu byť vo výhodnom uskutočnení vynálezu humanizované. Alternatívne, rámcové úseky môžu byť z inej humánnej protilátky.
Môže byť tiež vytvorená bišpecifická protilátka, ktorá sa viaže špecificky k IGF-IR prostredníctvom jednej väzobnej domény a k druhej molekule prostredníctvom druhej väzobnej domény. Bišpecifická protilátka môže byť vytvorená rekombinantnými technikami molekulárnej biológie alebo môže byť vytvorená vzájomným fyzickým spojením. Okrem toho môže byť vytvorená jednoreťazcová protilátka obsahujúca viac než jeden úsek VH a VL, ktorá sa viaže špecificky k IGF-IR a k ďalšej molekule. Takéto bišpecifické protilátky sa môžu tvoriť s využitím techník, ktoré sú odborníkom dobre známe, napríklad v spojení s (i) a (ii) pozri napr. Fanger et al. Immunol Methods 4: 72-81, 1994, a Wright a Harris, už citovaná publikácia, a v spojení s (iii) pozri napr. Traunecker et al. Int. J. Cancer (Suppl.) 7: 51-52, 1992. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sa bišpecifická protilátka viaže k IGF-IR a k ďalšej molekule, ktorá je exprimovaná vo vysokej hladine na karcinómových alebo nádorových bunkách. Vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu je ďalšia molekula erbB2 receptor, VEGF, CD20 alebo EGF-R.
V uskutočnení vynálezu sú modifikované už opísané protilátky pripravené s použitím jedného alebo viacerých variabilných úsekov alebo jedného alebo viacerých CDR úsekov z jednej z protilátok vybraných z 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 alebo 6.1.1. V ďalšom uskutočnení vynálezu sú pripravené modifikované protilátky použitím jedného alebo viacerých variabilných úsekov alebo jedného alebo viacerých CDR úsekov, ktorých aminokyselinové sekvencie sú uvedené ako SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12,14, 16, 18, 20, 22 alebo 24, alebo ktorých sekvencia nukleovej kyseliny je uvedená ako SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19,21 alebo 23.
Derivatizované a značené protilátky
Protilátka alebo časť protilátky podľa vynálezu môžu byť derivatizované alebo spojené s ďalšou molekulou (napr. ďalším peptidom alebo proteínom). Všeobecne platí, že protilátky alebo ich časti sú derivatizované tak, že väzba IGF-IR nie je nepriaznivo ovplyvnená derivatizáciou alebo značením. Taktiež protilátky a časti protilátky podľa vynálezu zahrnujú tak intaktné ako aj modifikované formy humánnej anti-IGF-IR protilátky opísanej v tomto texte. Napríklad protilátka alebo časť protilátky podľa vynálezu môže byť funkčne spojená (tým, že je chemicky kondenzovaná, geneticky fúzovaná, nekovalentne asociovaná alebo inak napojená) s jednou alebo viacerými ďalšími molekulárnymi entitami, ako je napríklad ďalšia protilátka (napr. bišpecifická protilátka alebo „diabody“), detekčný agens, cytotoxický agens, farmaceutický agens a/alebo proteín, alebo peptid, ktorý môže sprostredkovať asociáciu protilátky alebo časť protilátky s ďalšou molekulou (ako je napríklad streptavidínový jadrový úsek alebo polyhistidínová „tag“ („značka“).
Jeden typ derivatizovanej protilátky je vytvorený zosietením („crosslinking“) dvoch alebo viacerých protilátok (rovnakého typu alebo rôznych typov, napr. na vytvorenie bišpecifickej protilátky). Vhodné zosieťujúce činidlá (crosslinkery) zahrnujú také, ktoré sú heterobifunkčné, majú dve odlišné reaktívne skupiny oddelené vhodným spacerom (napr. m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysukcínimid) alebo homobifunkčné (napr. disukcinimidyl suberát). Takéto linkery sú dostupné napr. od firmy Pierce Chemical Company, Rockford, III.
Ďalší typ derivatizovanej protilátky je značená protilátka. Použiteľné detekčné činidlá, ktorými protilátka alebo časť protilátky podľa vynálezu môže byť derivatizovaná, zahrnujú fluorescenčné zlúčeniny, vrátane fluoresceínu, izotiokyanátu fluoresceínu, rodamínu, 5-dimetylamín-l-naftalénesulfonyl-chloridu, fykoerytrínu, lantanidových fosforov a pod. Protilátka môže tiež byť značená enzýmami, ktoré sú použiteľné na detekciu, ako napríklad chrenová peroxidáza, β-galaktozidáza, luciferáza, alkalická fosfatáza, glukózaoxidáza a pod. Keď je protilátka značená detekovateľným enzýmom, je detekovaná po pridaní ďalších činidiel, tak že enzým použije na vznik reakčného produktu, ktorý sa môže ľahko rozpoznať. Napríklad, keď je ako agens prítomná chrenová peroxidáza, pridanie peroxidu vodíku a diaminobenzidínu vedie k farebnému reakčnému produktu, ktorý je detekovateľný. Protilátka môže tiež byť značená biotínom a detekovaná prostredníctvom nepriameho merania väzby avidínu alebo streptavidínu. Protilátka môže byť tiež značená magnetickým agensom, ako je napríklad gadolínium. Protilátka môže tiež byť značená s predurčenými polypeptidovými epitopmi, rozpoznanými sekundárnym reportérom (napr. párové sekvencie leucínového zipsu, väzobné miesta pre sekundárne protilátky, väzobné domény kovov, epitopové prívesky). V niektorých uskutočneniach vynálezu sú značky pripojené oddeľovacím ramienkom (spacerom) rôznych dĺžok, aby sa redukovali potenciálne stérické zábrany.
Anti-IGF-IR protilátka môže byť tiež značená pomocou rádioaktívne značenej aminokyseliny. Rádioaktívna značka môže byť použitá tak na diagnostické ako aj na terapeutické účely. Napríklad rádioaktívna značka môže byť použitá na detekciu IGF-IR-exprimujúcich nádorov rôntgenom alebo inou diagnostickou technikou. Ďalej rádioaktívna značka môže byť použitá terapeuticky ako toxín pre rakovinové bunky alebo nádory. Príklady značiek pre polypeptidy zahrnujú, ale bez obmedzenia, nasledujúce rádioizotopy alebo rádionuklidy: 3H, l4C, 1SN, 35S, 9°Y, 99Tc, “'in, l25I, 131I.
Anti-IGF-IR protilátka môže tiež byť derivatizovaná chemickými skupinami, ako je napríklad polyetylénglykol (PEG), metylová skupina alebo etylová skupina, alebo sacharidová skupina. Tieto skupiny môžu byť použité na zlepšenie biologických vlastností protilátky, napr. predĺženie sérového polčasu alebo zvýšenie tkanivovej väzby.
Farmaceutické kompozície a súpravy
Vynález sa tiež týka farmaceutickej kompozície na liečenie hyperproliferatívnych chorobných stavov u cicavca, ktorá obsahuje terapeuticky účinné množstvo zlúčeniny podľa vynálezu a farmaceutický prijateľný nosič. V jednom uskutočnení vynálezu farmaceutická kompozícia je určená na liečbu karcinómu, ako je napríklad karcinóm mozgu, pľúc, dlaždicových (skvamóznych) buniek, močového mechúra, žalúdka, pankreasu, prsníka, hlavy, krku, obličky, vaječníkov, prostaty, kolorektálny karcinóm, karcinóm pažeráka, karcinóm maternice a štítnej žľazy. V inom uskutočnení vynálezu je farmaceutická kompozícia určená na liečenie nerakovinových hyperproliferatívnych chorobných stavov, ako je napríklad restenóza po angioplastike a psoriáza, pričom tento výpočet nie je obmedzujúci. V ďalšom uskutočnení vynálezu je farmaceutická kompozícia určená na liečbu cicavca, ktorý potrebuje aktiváciu IGF-IR, kde farmaceutická kompozícia obsahuje terapeuticky účinné množstvo aktivačnej protilátky podľa vynálezu a farmaceutický prijateľný nosič. Farmaceutické kompozície obsahujúce aktivačné protilátky môžu byť použité na liečbu zvierat, ktoré trpia nedostatkom IGF-I alebo IGF-II, alebo sa môžu použiť na liečbu osteoporózy alebo zdravotného oslabenia, alebo chorobného stavu, keď cicavec vylučuje príliš málo aktívneho rastového hormónu alebo je neschopný reagovať na rastový hormón.
Anti-IGF-IR protilátky podľa vynálezu sa môžu inkorporovať do farmaceutickej kompozície vhodnej na podávanie pacientovi. Typická farmaceutická kompozícia obsahuje protilátku podľa vynálezu a farmaceutický prijateľný nosič. Ako sa v tomto texte používa, termín „farmaceutický prijateľný nosič“ zahrnuje ktorékoľvek a všetky rozpúšťadlá, disperzívne médiá, obaľovacie činidlá, antibakteriálne a protiplesňové činidlá, izotonizujúce činidlá, činidlá oneskorujúce absorpciu a pod., ktoré sú fyziologicky kompatibilné. Príklady farmaceutický prijateľného nosiča zahrnujú jednu alebo viac z nasledujúcich zlúčenín: voda, fyziologický roztok, fyziologický roztok pufrovaný fosfátmi, dextróza, glycerol, etanol a pod., a tiež akékoľvek ich kombinácie. V mnohých prípadoch bude výhodné zahrnúť do farmaceutickej kompozície izotonizujúce činidlá, napríklad sacharidy, polyalkoholy ako napríklad manitol alebo sorbitol, alebo chlorid sodný. Farmaceutický prijateľné látky zahrnujú tiež látky ako napríklad zmáčadlá alebo menšie množstvo pomocných látok ako napríklad zmáčadlá alebo emulgačné činidlá, konzervačné činidlá alebo pufŕe, ktoré zlepšujú skladovateľnosť alebo účinnosť protilátky alebo časti protilátky.
Kompozície podľa predkladaného vynálezu môžu byť v mnohých rôznych formách. Tieto formy zahrnujú napríklad kvapalnú, polotuhú a tuhú dávkovú formu, ako napríklad roztoky (napr. roztok pre injekciu a pre infúziu), disperziu alebo suspenziu, tablety, pilulky, prášky, lipozómy a čapíky. Výhodná forma závisí od zamýšľaného spôsobu podávania a terapeutického použitia. Typické výhodné kompozície sú vo forme roztoku pre injekciu alebo pre infúziu, podobne ako napríklad kompozície používané na pasívnu imunizáciu ľudí inými protilátkami. Výhodný spôsob podávania je parenterálne (napr. intravenózne, subkutánne, intraperitoneálne, intramuskulárne). Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je protilátka podávaná intravenóznou infúziou alebo injekciou. V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je protilátka podávaná intramuskulárne alebo subkutánnou injekciou.
Terapeutické kompozície typicky musia byť sterilné a stabilné v podmienkach výroby a uskladnenia. Kompozície môžu byť formulované ako roztok, mikroemulzia, disperzia, lipozómy alebo iná usporiadaná štruktúra vhodná pre vysokú koncentráciu liečiva. Sterilné roztoky pre injekciu môžu byť pripravené tak, že sa anti-IGF-IR protilátka vnesie v požadovanom množstve do vhodného rozpúšťadla v kombinácii s jednou alebo viacerými už uvedenými ďalšími zložkami, podľa potreby, a potom sa uskutoční sterilizácie filtrovaním. Všeobecne, disperzie sa pripravujú tak, že sa vnesie účinná zlúčenina do sterilného vehíkula, ktoré obsahuje základné disperzívne médium a požadované ďalšie zložky z už tu uvedených. V prípade sterilného prášku na prípravu sterilného roztoku pre injekciu, výhodné metódy prípravy sú vákuové sušenie a lyofilizácia, ktoré poskytujú účinnú zložku vrátane ktorejkoľvek ďalšej požadovanej zložky vo forme prášku z roztoku, ktorý bol pred tým sterilizovaný filtrovaním roztoku. Potrebná tekutosť roztoku môže byť udržovaná napríklad použitím povlaku, napríklad lecitínu, udržovaním požadovanej veľkosti častíc a v prípade disperzie použitím surfaktantov. Predĺžená absorpcia injekčných kompozícií môže byť upravená tým, že sa do kompozície zahrnie agens pre oneskorenú absorpciu, napríklad monosoli kyseliny stearovej alebo želatína.
Protilátky podľa predkladaného vynálezu sa môžu podávať celým radom spôsobov známych v odbore, ale pre mnohé terapeutické aplikácie je výhodným spôsobom podávania spôsob intraperitoneálny, subkutánny, intramuskulámy, intravenózny alebo infúzny. Ako je odborníkovi zrejmé, spôsob podávania sa bude meniť a bude závisieť od požadovaného výsledku. V jednom uskutočnení vynálezu sú protilátky podľa predkladaného vynálezu podávané ako jediná dávka alebo sa môžu podávať ako opakované (mnohonásobné) dávky.
V určitom uskutočnení vynálezu môže byť účinná zlúčenina pripravená s nosičom, ktorý bude chrániť zlúčeninu pred rýchlym uvoľňovaním, ako je napríklad lieková forma s riadeným uvoľňovaním liečiva, ktorá zahrnuje implantáty, transdermálne náplasti a mikro-opuzdrené aplikačné systémy. Môžu sa použiť biologicky rozložiteľné, biologicky kompatibilné polyméry, ako je napríklad etylvinylacetát, polyanhydridy, polyglykolová kyselina, kolagén, polyortoestery a kyselina polymliečna. Mnoho z týchto spôsobov prípravy ta27 kýchto formulácií je patentovaných alebo sú pre odborníkov všeobecne známe (pozri napr. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, vyd., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978).
V určitom uskutočnení vynálezu anti-IGF-lR podľa vynálezu sa môže podávať perorálne, napríklad s inertným riedidlom alebo stráviteľným jedlým nosičom. Zlúčenina (a prípadne ďalšie zložky, ak sú potrebné) môžu tiež byť uzavreté v tvrdej alebo mäkkej želatínovej tobolke, lisované do tablety alebo primiešavané priamo do pacientovej stravy. Na perorálne terapeutické podávanie sa zlúčeniny vnesú do excipientu a užívajú sa potom vo forme, ako sú tablety (na prehítanie), bukálne tablety, pastilky, tobolky, elixíry, suspenzie, sirupy, oplátky a pod. Na podávanie zlúčeniny podľa vynálezu iným než parenterálnym podaním, môže byť nutné potiahnuť zlúčeninu s, alebo podať zlúčeninu spolu s, materiálom na zabránenie jej inaktivácie.
Do kompozícií môžu byť taktiež vložené dodatočne aktívne zlúčeniny. V určitom uskutočnení vynálezu anti-IGF-IR podľa vynálezu je spolu formulovaný s a/alebo spolu podávaný s jedným alebo viacerými prídavnými terapeutickými činidlami, ako sú chemoteraputické činidlo, antineoplastické činidlo alebo antitumorové činidlo. Napríklad, anti-IGF-IR protilátka môže byť spolu formulovaná a/alebo spolu podávaná s jedným alebo viacerými prídavnými terapeutickými činidlami. Takéto činidlá zahrnujú, ale bez obmedzenia, protilátky, ktoré viažu iné ciele (napr. protilátky, ktoré viažu jeden alebo viac rastových faktorov alebo cytokínov, ich receptory na povrchu buniek alebo IGF-I), IGF-I viažuce proteíny, antineoplastické činidlá, chemoterapeutické činidlá, antitumorové činidlá, antisense oligonukleotidy proti IGF-IR alebo IGF-I, analógy peptidov, ktoré blokujú IGF-IR aktiváciu, rozpustné IGF-IR a/alebo jeden, alebo viac chemických činidiel, ktoré inhibujú produkciu alebo aktivitu IGF-I, ktoré sú známe zo stavu techniky, napr. octreotid. Pre farmaceutickú kompozíciu obsahujúcu aktivujúcu protilátku, anti-IGF-IR protilátka môže byť formulovaná s faktorom, ktorý zvyšuje bunkovú proliferáciu alebo bráni apoptóze. Takéto faktory zahrnujú rastové faktory ako sú IGF-I a/alebo analógy IGF-I, ktoré aktivujú IGF-IR. Takéto kombinované terapie môžu vyžadovať nižšie dávkovanie anti-IGF-IR protilátok ako aj spolu podávaných činidiel, a takto sa vyhnú možnej toxicite alebo komplikáciám spojených s rôznymi monoterapiami. V jednom uskutočnení, protilátka a jedno alebo viac prídavných terapeutických činidiel.
Farmaceutické prípravky podľa vynálezu obsahujú „terapeuticky účinné množstvo“ alebo „profylaktický účinné množstvo“ protilátky alebo časti protilátky podľa vynálezu. Termín „terapeuticky účinné množstvo“ označuje množstvo účinné, v dávke a počas obdobia, ktoré je nutné, na dosiahnutie požadovaného terapeutického výsledku. Terapeuticky účinné množstvo protilátky alebo časti protilátky sa môže meniť podľa rôznych faktorov ako napríklad stav ochorenia, vek, pohlavie a hmotnosť jedinca, a ďalej schopnosť protilátky alebo časti protilátky vyvolať požadovanú reakciu pri jedincovi. Terapeuticky účinné množstvo je také množstvo, pri ktorom akékoľvek toxické alebo škodlivé účinky protilátky alebo časti protilátky sú prevážené terapeuticky prospešnými účinkami. Termín „profylaktický účinné množstvo“ označuje množstvo účinné, v dávke a počas obdobia, ktoré je nutné, na dosiahnutie požadovaného profylaktického účinku. Typicky platí, pretože profylaktická dávka je používaná u pacienta pred ochorením alebo v skoršej fáze ochorenia, že profylaktický účinné množstvo je menšie než terapeuticky účinné množstvo.
Dávkovacie schémy môžu byť upravené tak, aby poskytovali optimálnu požadovanú odpoveď (napr. terapeutickú alebo profylaktickú odpoveď). Napríklad môže byť podaný jednoduchý bolus, niekoľko čiastkových dávok v priebehu určitého času alebo môže byť podaná proporcionálne redukovaná alebo naopak zvýšená dávka v závislosti od okolností terapeutickej situácie. Farmaceutická kompozícia obsahujúca protilátku alebo obsahujúca kombináciu obsahujúcu protilátku a jedno alebo viac ďalších terapeutických agensov môže byť formulovaná na podávanie jednorazových alebo opakovaných dávok. Je zvlášť výhodné formulovať parenterálne prípravky do jednotkovej liekovej formy kvôli jednoduchosti podávania a udržania uniformity dávky. Jednotková lieková forma, ako sa termín v tomto texte používa, sa týka fyzicky oddelenej jednotky určenej ako nečlenená dávka na podávanie cicavcovi, ktorý má byť liečený, keď každá jednotka obsahuje predurčené množstvo účinné zlúčeniny vypočítané tak, aby poskytla požadovaný terapeutický účinok, v spojení s požadovaným farmaceutickým nosičom. Špecifikácia jednotkovej liekovej formy podľa vynálezu je určovaná a priamo závisí od (a) jedinečných vlastností účinnej zlúčeniny a konkrétneho terapeutického alebo profylaktického účinku, ktorý sa má dosiahnuť, a (b) limitácií, ktoré sú vlastné odboru prípravy účinných zlúčenín pre liečbu senzitivity. Konkrétne užitočná formulácia je 5 mg/ml anti-IGF-IR protilátky v pufre obsahujúcom 20mM citrát sodný, pH 5,5,140mM NaCl a 0,2 mg/ml polysorbát 80.
Príkladom, ktorý však nie je obmedzujúci, rozsahu terapeuticky alebo profylaktický účinného množstva protilátky alebo časti protilátky podľa vynálezu je 0,1 až 100 mg/kg, výhodnejšie 0,5 až 50 mg/kg, výhodnejšie I až 20 mg/kg a dokonca ešte výhodnejšie 1 až 10 mg/kg. Je treba poznamenať, že dávka sa môže meniť s typom a závažnosťou ochorenia alebo stavu, ktorý má byť zmiernený. Je preto zrejmé, že pre konkrétneho pacienta by mali byť upravené špecifické dávkovacie schémy v priebehu času podľa individuálnej potreby a profesionálneho názoru odborníka, ktorý kompozíciu podáva alebo na podávanie dozerá, a že dávky uvedené v tomto texte sú iba príklady a nijako neobmedzujú skutočný rozsah dávok kompozície podľa vynálezu. V jednom uskutočnení vynálezu je terapeuticky alebo profylaktický účinné množstvo protilátky alebo jej antigén-väzobnej časti podávané spoločne s jedným alebo viacerými ďalšími terapeutickými agensmi.
V ďalšom aspekte sa vynález týka podávania anti-IGF-IR protilátky na liečbu karcinómu v dávke nižšej než 300 mg za mesiac.
Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje súpravy obsahujúce anti-IGF-IR protilátky a farmaceutické kompozície obsahujúce tieto protilátky. Súprava môže obsahovať, okrem protilátky alebo farmaceutickej kompozície, diagnostické alebo terapeutické agensy. Súprava môže tiež obsahovať inštrukcie na použitie pri diagnostickom alebo terapeutickom spôsobe. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu súprava obsahuje protilátku alebo jej farmaceutickú kompozíciu a diagnostické agens, ktoré môžu byť použité pri spôsobe opísanom ďalej. V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu súprava obsahuje protilátku alebo jej farmaceutickú kompozíciu a jedno alebo viacej terapeutických agens, ako je napríklad ďalšie antineoplázické agens, protinádorové agens alebo chemoterapeutické agens, ktoré môžu byť použité pri spôsobe opísanom ďalej.
Predkladaný vynález sa tiež týka farmaceutických kompozícií na inhibíciu abnormálneho bunkového rastu u cicavca, ktorý obsahuje množstvo zlúčeniny podľa vynálezu v kombinácii s množstvom chemoterapeutického agens, kde množstvo zlúčeniny, jej soli, solvátu alebo proliečivá a chemoterapeutického agensu sú spoločne účinné pri inhibícii abnormálneho bunkového rastu. V odbore je v súčasnosti známych mnoho chemoterapeutických agensov. V jednom uskutočnení vynálezu je chemoterapeutické agens vybrané zo skupiny, ktorá obsahuje mitotické inhibítory, alkylačné činidlá, antimetabolity, interkalujúce antibiotiká, inhibítory rastových faktorov, inhibítory bunkového cyklu, enzýmy, inhibítory topoizomerázy, protiprežívacie agensy („anti-survival“ agens), modifikátory biologickej reakcie, antihormóny, napr. antiandrogény, a antiangiogénne činidlá.
V spojení so zlúčeninami podľa vynálezu môžu byť použité anti-angiogénne agensy ako napríklad inhibítory MMP-2 (matrix-metaloproteináza 2), MMP-9 (matrix-metaloproteináza 9) a inhibítory COX-II (cyklooxygenáza II). Príklady použiteľných COX-II inhibítorov zahrnujú CELEBREX™ (alecoxib), valdecoxib a rofecoxib. Príklady použiteľných inhibítorov matrixových metaloproteináz sú opísané v dokumentoch: WO 96/33172 (publikovaná 24. októbra 1996), WO 96/27583 (publikovaná 7. marca 1996), európska patentová prihláška č. 97304971.1 (podaná 8. júla 1997), európska patentová prihláška č. 99308617.2 (podaná 29. októbra 1999), WO 98/07697 (publikovaná 26. februára 1998), WO 98/03516 (publikovaná 29. januára 1998), WO 98/34918 (publikovaná 13. augusta 1998), WO 98/34915 (publikovaný 13. augusta 1998), WO 98/33768 (publikovaný 6. augusta 1998), WO 98/30566 (publikovaná 16. júla 1998), európsky patent 606,046 (publikovaný 13. júla 1994), európsky patent 931,788 (publikovaný 28. júla 1999), WO 90/05719 (publikovaný 31. mája, 1990), WO 99/52910 (publikovaný 21. októbra 1999), WO 99/52889 (publikovaný 21. októbra 1999), WO 99/29667 (publikovaný 17. júna 1999), PCT medzinárodná prihláška č. PCT/IB98/01113 (podaná 21. júla 1998), európska patentová prihláška č. 99302232.1 (podaná 25. marca 1999), britská patentová prihláška č. 9912961.1 (podaná 3. júna 1999), dočasná prihláška Spojených štátov č. 60/148,464 podaná 12. augusta 1999), patent Spojených štátov č. 5,863,949 (publikovaný 26. januára 1999), patent Spojených štátov č. 5,861,510 (publikovaný 19. januára 1999) a európsky patent 780,386 (publikovaný 25. júna 1997), pričom každá z týchto publikácií je ako celok zahrnutá formou odkazu. Výhodné MMP inhibítory sú tie, pri ktorých sa neprejavuje artralgia. Výhodnejšie sú tie, ktoré selektívne inhibujú MMP-2 a/alebo MMP-9 vzhľadom na ostatné matrixové metaloproteinázy (t. j. MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 a MMP-13). Niektoré špecifické príklady MMP inhibítorov použiteľných v predkladanom vynálezu sú AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830 a ďalej zlúčeniny uvedené v nasledujúcom zozname:
3-[[4-(4-fluórfenoxy)benzénsufonyl]-(l-hydroxykarbamoyl-cyklo-pentyl)amino]propiónová kyselina, hydroxamid 3-exo-3-[4-(4-fluórfenoxy)benzénsulfonylamino]-8-oxabicyklo[3.2.1]oktán-3-karboxylovej kyseliny, hydroxamid (2R,3R)-l-[4-(2-chlór-4-fluórbenzyloxy)benzénsulfonyl]-3-hydroxy-3-metylpiperidín-2-karboxylovej kyseliny, hydroxamid 4-[4-(4-fluórfenoxy)benzénsulfonylamino]tetrahydropyrán-4-karboxylovej kyseliny, 3-[[4-(4-fluórfenoxy)benzénsulfonyl]-(l-hydroxykarbamoylcyklo-butyl)amino]propiónová kyselina, hydroxamid 4-[4-(4-chlór-fenoxy)benzénsulfonylamino]tetrahydropyrán-4-karboxylovej kyseliny, hydroxamid (R)-3-[4(4-chlórfenoxy)benzénsulfonyl-amino]tetrahydropyrán-3-karboxylovej kyseliny, hydroxamid (2R,3R)-l-[4-(4-fluór-2-metylbenzyloxy)benzénsulfonyl]-3-hydroxy-3-metylpiperidín-2-karboxylovej kyseliny, 3-[[4-(4-fluórfenoxy)benzénsulfonyl]-(l-hydroxykarbamoyl-l-metyl-etyl)amino]propiónová kyselina, 3-[[4-(4-fluór-fenoxy)benzénsulfonyl]-(4-hydroxykarbamoyltetrahydropyrán-4-yl)amino]propiónová kyselina, hydroxamid 3-exo-3-[4-(4-chlór-fenoxy)benzénsulfonylamino]-8-oxaicyklo[3.2.1]oktán-3-karboxylovej kyseliny, hydroxamid 3-endo-3-[4-(4-fluórfenoxy)benzén-sulfonylamino]-8-oxaicyklo[3.2.1]oktán-3-karboxylovej kyseliny a hydroxamid (R)-3-[4-(4-fluórfenoxy)benzénsulfonyl-amino]tetrahydrofurán-3-karboxylovej kyseliny, a farmaceutický prijateľné soli a solváty týchto zlúčenín.
Zlúčenina podľa vynálezu môže tiež byť použitá s inhibítormi signálnej transdukcie, ako sú napríklad činidlá, ktoré inhibujú reakcie EGF-R (receptor epidermálneho rastového faktora), ako napríklad EGF-R protilátky, EGF protilátky a molekuly, ktoré sú inhibítory EGF-R, inhibítory VEGF (rastový faktor cievneho endotelu), ako napríklad VEGF receptory a molekuly, ktoré inhibujú VEGF, a inhibítory erbB2 receptora, ako napríklad organické molekuly alebo protilátky, ktoré sa viažu na erbB2 receptor, napríklad HERCEPTIN™ (Genentech, Inc.). Inhibítory EGF-R sú opísané napríklad v nasledujúcich publikáciách: WO 95/19970 (publikovaná 27. júla 1995), WO 98/14451 (publikovaná 9. apríla 1998), WO 98/02434 (publikovaná 22. januára 1998), patent Spojených štátov 5,747,498 (publikovaný 5. mája 1998), a tieto látky môžu byť použité v predkladanom vynáleze, ako už bolo opísané. EGFR-inhibujúce činidlá zahrnujú, bez toho aby bol tento výpočet obmedzujúci, monoklonálne protilátky C225 a anti-EGFR 22Mab (ImClone Systems Incorporated), ABXEGF (Abgenix/Cell Genesys), EMD-7200 (Merck KgaA), EMD-5590 (Merck KgaA), MDX-447/H-477 (Medarex Inc. a Merck KgaA) a zlúčeniny ZD1834, ZD-1838 a ZD-1839 (AstraZeneca), PKI-166 (Novartis), PKI-166/CGP75166 (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 (Cephalon), leflunomid (Pharmacia/Sugen), CI-1033 (Warner Lambert Parke Davis), CI-1033PD 183, 805 (Warner Lambert Parke Davis), CL-387, 785 (Wyeth-Ayerst), BBR-1611 (Boehringer Mannheim GmbH/Roche), Naamidin A (Bristol Myers Squibb), RC-3940-II (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), OLX-103 (Merck & Co.), VRCTC310 (Ventech Research), EGF fúzny toxín (Seragen Inc.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM-252808 (Imperiál Cancer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (Parker Hughes Cancer Center), WHI-P97 (Parker Hughes Cancer Center), GW-282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko) a EGF-R vakcínu (York Medical/Centro de Immunologia Molecular (CIM)). Tieto a ešte ďalšie EGF-R-inhibujúce činidlá môžu byť použité v predkladanom vynálezu.
So zlúčeninami podľa predkladaného vynálezu môžu byť kombinované ďalej VEGF inhibítory, napríklad SU-5416 a SU-6668 (Sugen Inc.), SH-268 (Sobering) a NX-1838 (NeXstar). VEGF inhibítory sú opísané napríklad v nasledujúcich publikáciách: WO 99/24440 (publikovaná 20. mája 1999), PCT medzinárodná prihláška PCT/IB99/00797 (podaná 3. mája 1999), WO 95/21613 (publikovaná 17. augusta 1995), WO 99/61422 (publikovaná 2. decembra 1999), patent Spojených štátov 5,834,504 (publikovaný 10. novembra
1998) , WO 98/50356 (publikovaná 12. novembra 1998), patent Spojených štátov 5,883,113 (publikovaný 16. marca 1999), patent Spojených štátov 5,886,020 (publikovaný 23. marca 1999), patent Spojených štátov 5,792,783 (publikovaný 11. augusta 1998), WO 99/10349 (publikovaná 4. marca 1999), WO 97/32856 (publikovaná 12. septembra 1997), WO 97/22596 (publikovaná 26. júna 1997), WO 98/54093 (publikovaná 3. decembra 1998), WO 98/02438 (publikovaná 22.. januára 1998), WO 99/16755 (publikovaná 8. apríla 1999) a WO 98/02437 (publikovaná 22. januára 1998), každá z týchto publikácií je zahrnutá formou odkazu. Ďalšie príklady niektorých špecifických VEGF inhibítorov použiteľných v predkladanom vynáleze sú IM862 (Cytran Inc.), anti-VEGF monoklonálna protilátka (Genentech, Inc.) a angiozým, syntetický ribozým (Ribozyme a Chiron). Tieto a ešte ďalšie VEGF inhibítory môžu byť použité v predkladanom vynáleze, ako už bolo opísané.
So zlúčeninami podľa predkladaného vynálezu môžu byť kombinované ďalej inhibítory ErbB2 receptora, ako napríklad GW-282974 (Glaxo Wellcome plc) a monoklonálne protilátky AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc.) a 2B-1 (Chiron), napríklad ako boli uvedené v nasledujúcich publikáciách: WO 98/02434 (publikovaná 22. januára 1998), WO 99/35146 (publikovaná 15. júna 1999), WO 99/35132 (publikovaná 15. júla
1999) , WO 98/02437 (publikovaná 22. januára 1998), WO 97/13760 (publikovaná 17. apríla 1997), WO 95/19970 (publikovaná 27. júla 1995), patent Spojených štátov 5,587,458 (publikovaný 24. decembra 1996) a patent Spojených štátov 5,877,305 (publikovaný 2. marca 1999), ktoré sú všetky zahrnuté formou odkazu. Inhibítory ErbB2 receptora užitočné v predkladanom vynáleze sú tiež opísané v dočasnej patentovej prihláške Spojených štátov č. 60/117/, 341, podanej 27. januára 1999 a č. 60/117/,346, podanej 27. januára 1999, ktoré sú zahrnuté formou odkazu. Inhibítory ErbB2 receptora a zlúčeniny opísané v uvedených citovaných PCT prihláškach, patentoch Spojených štátov a dočasných prihláškach Spojených štátov, a tiež ďalšie zlúčeniny a látky, ktoré inhibujú erbB2 receptor, môžu byť použité so zlúčeninami podľa vynálezu v zmysle predkladaného vynálezu.
Protiprežívacie činidlá zahrnujú anti-IGF-IR protilátky a anti-integrínové činidlá, ako napríklad anti-integrínové protilátky.
Diagnostické metódy
Anti-IGF-IR protilátky môžu byť použité na detekovanie IGF-IR v biologickej vzorke in vitro alebo in vivo. Anti-IGF-IR protilátky môžu byť použité v obvyklých imunotestoch, vrátane testov ELISA, RIA, FACS, tkanivových imunohistochemických testoch, Western blote alebo imunoprecipitácii, bez toho, aby bol tento výpočet obmedzujúci. Anti-IGF-IR protilátky podľa vynálezu môžu byť použité na detekovanie IGF-IR u ľudí. V ďalšom uskutočnení vynálezu anti-IGF-IR protilátky môžu byť použité na detekovanie IGF-IR u primátov starého sveta, ako sú makaky (napr. rhesus), šimpanzy a ľudoopy.
Vynález poskytuje spôsob detekcie anti-IGF-IR v biologickej vzorke, ktorý zahrnuje kontaktovanie biologickej vzorky s anti-IGF-IR protilátkou podľa vynálezu a detekciu naviazanej protilátky, ktorá je naviazaná na anti-IGF-IR, na detekciu IGF-IR v biologickej vzorke. V jednom uskutočnení vynálezu anti-IGF-IR protilátka je priamo značená detekovateľnou značkou. V ďalšom uskutočnení vynálezu je anti-IGF-IR protilátka (prvá protilátka) neznačená a druhá protilátka alebo iná molekula, ktorá sa viaže na anti-IGF-IR protilátku, je značená. Ako je v odbore dobre známe, druhá protilátka je zvolená tak, že je schopná špecificky viazať špeci30 fický druh a triedu prvej protilátky. Napríklad ak anti-IGF-IR protilátka je humánna IgG, potom sekundárna protilátka môže byť anti-humánna-lgG. Iné molekuly, ktoré sa môžu viazať na protilátky, zahrnujú proteín A a proteín G, ktoré sú oba komerčne dostupné od firmy Pierce Chemical Co., pričom tento výpočet nie je obmedzujúci.
Vhodné značky pre protilátku alebo sekundárnu protilátku tu už boli opísané a zahrnujú rôzne enzýmy, prostetické skupiny, fluorescenčné látky, luminiscenčné látky, magnetické činidlá a rádioaktívne látky. Príklady vhodného enzýmu zahrnujú chrenovú peroxidázu, alkalickú fosfatázu, β-galaktozidázu a acetylcholínesterázu, príklady vhodných komplexov prostetickej skupiny zahrnujú streptavidín/biotín a avidín/biotín, príklady vhodnej fluorescenčnej látky zahrnujú umbeliferón, fluoresceín, fluoresceín izotiokyanát, rodamín, dichlórtriazinylamín fluoresceínu, danzylchlorid alebo fykoerytrín, príkladom luminiscenčnej látky je luminol, príkladom magnetického agensu je gadolínium a príkladom vhodnej rádioaktívnej látky sú l25I, l3lI, 35S alebo 3H.
V alternatívnom uskutočnení vynálezu IGF-IR môže byť testovaný v biologickej vzorke kompetitívnym imunotestom využívajúcim IGF-IR štandardy značené detekovateľnou látkou a neznačené anti-IGF-IR protilátky. V tomto teste sa kombinujú biologická vzorka, značený IGF-IR štandard a anti-IGF-IR protilátka a stanovuje sa množstvo značeného IGF-IR štandardu naviazaného na neznačenú protilátku. Množstvo IGF-IR v biologickej vzorke je nepriamo úmerné množstvu značeného IGF-IR štandardu viazaného na anti-IGF-IR protilátku.
Opísané imunotesty možno použiť na veľa účelov. V jednom uskutočnení vynálezu môžu byť anti-IGF-IR protilátky použité na detekciu IGF-IR v bunkách v tkanivových kultúrach. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu anti-IGF-IR protilátky môžu byť použité na určovanie hladiny fosforylácie tyrozínu, autofosforylácie tyrozínu z IGF-IR a/alebo množstva IGF-IR na bunkovom povrchu po ošetrení buniek rôznymi zlúčeninami. Tento spôsob môže byť použitý na testovanie zlúčenín, ktoré môžu byť použité na aktiváciu alebo inhibíciu IGF-IR. V tomto spôsobe je jedna vzorka buniek podrobená pôsobeniu testovanej zlúčeniny po určité časové obdobie, zatiaľ čo ďalšia vzorka bola ponechaná neošetrená. Ak má byť meraná autofosforylácia tyrozínu, bunky sú lyzované a fosforylácia tyrozínu IGF-IR je meraná s použitím už opísaného imunotestu alebo tak, ako bolo opísané v príklade III, ktorý používa test ELISA. Ak má byť meraná hladina celkového IGFIR, bunky sú lyzované a hladina celkového IGF-IR je meraná s použitím jedného z už opísaných imunotestov.
Výhodným imunotestom na určovanie IGF-IR fosforylácie tyrozínu alebo na meranie hladín celkového IGF-IR je ELISA alebo Western blot. Ak má byť meraná iba hladina IGF-IR bunkového povrchu, bunky nie sú lyzované a hladiny IGF-IR bunkového povrchu sú merané s použitím jedného z už opísaných imunotestov. Výhodný imunotest na určovanie hladiny IGF-IR bunkového povrchu zahrnuje kroky značenia proteínov bunkového povrchu detekovateľnou značkou, ako je napríklad biotín alebo 125I, imunoprecipitáciu IGF-IR s anti-IGF-IR protilátkou, a potom detekciu značeného IGF-IR. Ďalší výhodný imunotest na určovanie lokalizácie IGF-IR, napr. hladiny bunkového povrchu, je použitie imunohistochemického vyšetrenia. Metódy, ako je napríklad ELISA, RIA, Western blot, imunohistochemické vyšetrenie, značenie bunkového povrchu proteínov základnej membrány a imunoprecipitácia, sú v odbore dobre známe. Pozri napr. Harlow a Lane, už uvedená referencia. Okrem toho imunotesty môžu byť zväčšené pre vysoko výkonný skríning, aby sa testoval veľký počet zlúčenín buď na aktiváciu, alebo inhibíciu IGF-IR.
Anti-IGF-IR protilátky podľa vynálezu môžu tiež byť použité na určovanie hladín IGF-IR v tkanive alebo v bunkách pochádzajúcich z tkaniva. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu tkanivom je choré tkanivo. Vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu tkanivom je nádor alebo jeho biopsia. Vo výhodnom uskutočnení spôsobu podľa vynálezu, tkanivá alebo ich biopsie sú odobrané z pacienta. Tkanivo alebo biopsia sú potom použité v imunoteste na určovanie napr. hladiny IGF-IR, hladiny IGF-IR bunkového povrchu, hladiny fosforylácie tyrozínu IGF-IR alebo lokalizácie IGF-IR spôsobmi už diskutovanými v texte. Spôsob môže byť použitý na určovanie, či nádor exprimuje IGF-IR vo vysokej hladine.
Opísaný diagnostický spôsob sa môže použiť na určovanie toho, či nádor exprimuje vysoké hladiny IGF-IR, ktoré môžu byť indikatívom, že nádor bude dobre odpovedať na liečbu anti-IGF-IR protilátkou. Diagnostický spôsob sa môže tiež použiť na určovanie, či nádor je potenciálne rakovinový, ak exprimuje vysoké hladiny IGF-IR alebo benígny, ak exprimuje nízke hladiny IGF-IR. Ďalej sa tiež môže diagnostický spôsob použiť na určovanie, či liečba anti-IGF-IR protilátkou (pozri ďalej) spôsobuje, že nádor exprimuje nižšie hladiny IGF-IR a/alebo vykazuje nižšie hladiny autofosforylácie tyrozínu, a tak môže byť použitý na určovanie toho, či liečebný postup je úspešný. Všeobecne, spôsob určovania, či anti-IGF-IR protilátka zníži fosforyláciu tyrozínu, obsahuje kroky merania hladiny fosforylácie tyrozínu v bunke alebo požadovanom tkanive, inkubáciu buniek alebo tkaniva s anti-IGF-IR protilátkou alebo jej antigén-väzobnou časťou, a potom opakované meranie hladiny fosforylácie tyrozínu v bunke alebo tkanive. Môže sa merať fosforylácia tyrozínu IGF-IR alebo ďalšieho proteínu (proteínov). Diagnostický spôsob môže tiež byť použitý na určovanie, či tkanivo alebo bunka neexprimuje dostatočne vysoké hladiny IGF-IR alebo dostatočne vysoké hladiny aktivovaného IGF-IR, čo môže byť prípad u jedincov s nanizmom, osteoporózou alebo diabetom. Diagnóza, že hladiny
IGF-IR alebo účinného IGF-IR sú príliš nízke, môže byť použitá na liečenie aktivujúcimi anti-IGF-IR protilátkami, IGF-I alebo ďalšími terapeutickými agensami na zvyšovanie IGF-IR hladín alebo aktivity.
Protilátky podľa predkladaného vynálezu môžu tiež byť používané in vivo, aby sa lokalizovali tkanivá a orgány, ktoré exprimujú IGF-IR. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu anti-IGF-IR protilátky môžu byť použité na lokalizáciu IGF-IR-exprimujúcich nádorov. Výhoda anti-IGF-IR protilátok podľa predkladaného vynálezu je tá, že nebudú tvoriť imunitnú reakciu pri podávaní. Spôsob obsahuje kroky podávania anti-IGF-IR protilátky alebo jej farmaceutickej kompozície pacientovi, ktorý takýto diagnostický test potrebuje, a podrobenie pacienta zobrazovacej analýze na určovanie lokalizácie IGF-IR-exprimujúcich tkanív. Zobrazovacia analýza je dobre známa v lekárskom odbore a zahrnuje, bez obmedzenia, rôntgenovú analýzu, zobrazovanie magnetickou rezonanciou (MRI) alebo počítačovou tomografiou (CE). V ďalšom uskutočnení spôsobu podľa vynálezu je od pacienta získavaná skôr biopsia na určovanie, či požadované tkanivo exprimuje IGF-IR, než podrobovanie pacienta zobrazovacej analýze. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu anti-IGF-IR protilátky môžu byť značené detekovateľným agensom, ktoré môže byť zobrazené v pacientovi. Napríklad protilátka môže byť značená kontrastným agensom, ako napríklad báriom, ktoré môže byť použité na rôntgenovú analýzu alebo magnetické kontrastné agens, ako napríklad chelát gadolínia, ktorý môže byť použitý pre MRI alebo CE. Ďalšie značiace činidlá zahrnujú, bez obmedzenia, rádioizotopy, ako je napríklad 99Tc. V ďalšom uskutočnení vynálezu anti-IGF-IR protilátka je neznačená a je zobrazená podávaním druhej protilátky alebo ďalšej molekuly, ktorá je detekovateľná a ktorá môže viazať anti-IGF-IR protilátku.
Terapeutické spôsoby použitia
V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje spôsob inhibície IGF-IR aktivity podávaním anti-IGF-IR protilátky pacientovi, ktorý to potrebuje. Každý z typov protilátok opísaných v tomto texte sa môže terapeuticky použiť. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu anti-IGF-IR protilátka je humánna, chimérická alebo humanizovaná protilátka. V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu IGF-IR je humánny a pacientom je človek. Alternatívne, pacientom môže byť cicavec, ktorý exprimuje IGF-IR, s ktorým anti-IGF-IR protilátka reaguje skrížené. Protilátka môže byť podávaná cicavcovi iného než ľudského pôvodu exprimujúcemu IGF-IR, s ktorým protilátka skrížené reaguje (t. j. primáty alebo makaky Macaca fascicularis („cynomologous“) alebo Macaca mullata („rhesus“)) na veterinárne účely alebo ako zvieraciemu modelu humánneho ochorenia. Takéto zvieracie modely môžu byť použiteľné na hodnotenie terapeutickej účinnosti protilátok podľa tohto vynálezu.
Ako sa v tomto texte používa, termín „chorobný stav, v ktorom IGF-IR aktivita je škodlivá“ zahrnuje ochorenia a ďalšie chorobné stavy, v ktorých bolo preukázané, že prítomnosť vysokých hladín IGF-IR u pacienta trpiaceho chorobným stavom priamo je, alebo je podozrievaná, že je, zodpovedná buď za patofyziológiu chorobného stavu, alebo je faktorom, ktorý prispieva k zhoršovaniu chorobného stavu. V súlade s tým, chorobný stav, v ktorom sú škodlivé vysoké hladiny IGF-IR aktivity, je chorobný stav, keď sa očakáva, že inhibícia IGF-IR aktivity zmierni symptómy a/alebo priebeh chorobného stavu. Takéto chorobné stavy môžu byť preukázané napríklad zvýšením hladín IGF-IR bunkového povrchu alebo zvýšenou autofosforyláciou tyrozínu IGF-IR v postihnutých bunkách alebo tkanivách pacienta trpiaceho chorobným stavom. Zvýšenie IGF-IR hladín môže byť detekované napríklad s použitím anti-IGF-IR protilátky, ako tu už bolo opísané.
Vo výhodnom uskutočnení vynálezu anti-IGF-IR protilátka môže byť podávaná pacientovi, ktorý má nádor exprimujúci IGF-IR. Nádor môže byť pevný nádor alebo to môže byť nádor nepevný, ako je napríklad lymfóm. Vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu anti-IGF-IR protilátka môže byť podávaná pacientovi, ktorý má IGF-IR-exprimujúci nádor, ktorý je rakovinový. V ešte výhodnejšom uskutočnení vynálezu anti-IGF-IR protilátka je podávaná pacientovi, ktorý má pľúcny nádor, nádor prsníka, prostaty alebo kólonu. Vo vysoko výhodnom uskutočnení spôsob podľa vynálezu spôsobí, že nádor nezvýši hmotnosť alebo objem alebo sa jeho hmotnosť alebo objem zníži. V ďalšom uskutočnení spôsob podľa vynálezu spôsobí, že IGF-IR na nádore budú intemalizované. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je protilátka vybraná zo skupiny, ktorú tvorí 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 alebo 6.1.1, alebo obsahuje ťažký reťazec, ľahký reťazec alebo ich úsek viažuci antigén.
V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu anti-IGF-IR protilátka môže byť podávaná pacientovi, ktorý exprimuje neprimerane vysoké hladiny IGF-I. V odbore je známe, že vysoká hladina expresie IGF-I môže viesť k celému radu bežných karcinómov. Vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu anti-IGF-IR protilátka je podávaná pacientovi s karcinómom prostaty, gliómom alebo fibrosarkómom. V ešte výhodnejšom uskutočnení spôsob podľa vynálezu spôsobí, že karcinóm prestane abnormálne proliferovať alebo sa nezvyšuje jeho hmotnosť či objem alebo sa hmotnosť či objem znižuje.
V jednom uskutočnení vynálezu sa spôsob týka liečby karcinómov, ako sú napríklad karcinómy mozgu, spinocelulámy karcinóm, karcinóm močového mechúra, žalúdka, pankreasu, prsníka, hlavy, krku, pažeráka, prostaty, kolorektálne karcinómy, karcinómy pľúc, obličiek, vaječníkov, gynekologické karcinómy alebo karcinómy štítnej žľazy. Pacienti, ktorí môžu byť liečení zlúčeninami podľa vynálezu spôsobmi podľa tohto vynálezu, zahrnujú napríklad pacientov, u ktorých bolo diagnostikované, že majú pľúcny karcinóm, karci32 nóm kostí, karcinóm pankreasu, karcinóm kože, karcinómy hlavy a krku, kožné alebo intraokuláme melanómy, karcinómy maternice, karcinóm vaječníkov, rektálny karcinóm, karcinóm análnej oblasti, karcinóm žalúdka, karcinóm kólonu, karcinóm prsníka, gynekologické nádory (napr. sarkómy maternice, karcinóm vajcovodov, karcinóm endometria, karcinóm krčka maternice, karcinóm vagíny alebo karcinóm vulvy), Hodgkinove ochorenie, karcinóm pažeráka, karcinóm tenkého čreva, karcinómy endokrinného systému (napr. karcinóm štítnej žľazy, príštítnych teliesok alebo nadobličiek), sarkómy mäkkých tkanív, karcinóm uretry, karcinóm penisu, karcinóm prostaty, chronická alebo akútna leukémia, pevné nádory detského veku, lymfocytáme lymfómy, karcinóm močového mechúra, karcinóm obličiek alebo ureteru (napr. karcinóm obličkových buniek, karcinóm obličkových panvičiek) alebo novotvary centrálneho nervového systému (napr. primárny lymfóm CNS, nádory miechy, gliómy mozgového kmeňa alebo adenómy hypofýzy).
Protilátka sa môže podávať jedenkrát, ale výhodnejšie je podávaná viackrát. Protilátka môže byť podávaná trikrát denne až jedenkrát každých šesť mesiacov. Podávanie môže byť plánované, ako napríklad trikrát denne, dvakrát denne, jedenkrát denne, jedenkrát každé dva dni, jedenkrát každé tri dni, jedenkrát týždenne, jedenkrát každé dva týždne, jedenkrát každý mesiac, jedenkrát každé dva mesiace, jedenkrát každé tri mesiace a jedenkrát každých šesť mesiacov. Protilátka môže byť podávaná perorálne, sliznicou, bukálne, intranazálne, inhalačné, intravenózne, subkutánne, intramuskulárne, parenterálne, intranádorovo alebo topicky. Protilátka môže byť podávaná do miesta vzdialeného od miesta nádoru. Protilátka môže tiež byť podávaná kontinuálne prostredníctvom minipumpy. Protilátka môže byť podávaná jedenkrát, aspoň dvakrát alebo aspoň po časovom období, pokiaľ nie je chorobný stav liečený, zmiernený alebo vyliečený. Protilátka všeobecne bude podávaná aspoň tak dlho, pokiaľ je nádor prítomný za predpokladu, že protilátka spôsobí, že nádor alebo karcinóm zastaví rast alebo sa zníži jeho hmotnosť či objem. Protilátka bude všeobecne podávaná ako časť farmaceutickej kompozície, ako tu už bolo opísané. Dávka protilátky bude všeobecne v rozsahu 0,1 až 100 mg/kg, výhodnejšie 0,5 až 50 mg/kg, výhodnejšie 1 až 20 mg/kg a ešte výhodnejšie 1 až 10 mg/kg. Sérová koncentrácia protilátky môže byť meraná každou metódou v známou odbore. Napr. pozri príklad XVII, ktorý je uvedený ďalej. Protilátka môže tiež byť podávaná profylaktický, aby sa zabránilo výskytu karcinómu alebo nádoru. To môže byť obzvlášť užitočné u pacientov, ktorí majú „vysoko normálnu“ hladinu IGF-I, pretože bolo ukázané, že títo pacienti majú vyššie riziko rozvoja bežných karcinómov. Pozri Rosen et al., ktorý už bol citovaný.
V ďalšom aspekte anti-IGF-IR protilátka môže byť spoločne podávaná s ďalšími terapeutickými agensmi, ako sú napríklad antineoplázické lieky alebo molekuly, pacientovi, ktorý má hyperproliferatívny chorobný stav, ako je napríklad karcinóm alebo nádor. V jednom aspekte sa vynález týka spôsobu liečby hyperproliferatívneho chorobného stavu u cicavca obsahujúceho podávanie cicavcovi terapeuticky účinného množstva zlúčeniny podľa vynálezu v kombinácii s anti-nádorovým agensom vybraným zo skupiny, ktorú tvoria, bez obmedzenia, mitotické inhibítory, alkylačné činidlá, anti-metabolity, interkalujúce činidlá, inhibítory rastového faktora, inhibítory bunkového cyklu, enzýmy, inhibítory topoizomerázy, modifikátory biologickej reakcie, anti-hormóny, inhibítory kináz, inhibítory metaloproteáz medzibunkovej hmoty, genetické liečivá a antiandrogény. Vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu protilátka môže byť podávaná s antineoplázickým agensom, ako je napríklad adriamycín alebo taxol. V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je protilátka alebo kombinačná liečba podávaná spolu s rádioterapiou, chemoterapiou, fotodynamickou terapiou, chirurgickou liečbou alebo inou imunoterapiou. V ešte ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je protilátka podávaná s ďalšou protilátkou. Napríklad anti-IGF-IR protilátka môže byť podávaná s protilátkou alebo iným agensom, o ktorom je známe, že inhibuje proliferáciu buniek nádoru alebo karcinómu, napr. protilátka alebo agens, ktoré inhibuje erbB2 receptor, EGF-R, CD20 alebo VEGF.
Spoločné podávanie protilátky s ďalším terapeutickým agensom (kombinačná liečba) zahrnuje podávanie farmaceutickej kompozície obsahujúcej anti-IGF-IR protilátku a ďalší terapeutický agens a podávanie dvoch alebo viacerých samostatných farmaceutických kompozícií, jedna obsahujúca anti-IGF-IR protilátku a druhá obsahujúca ďalší terapeutický agens. Ďalej, aj keď spoločné podávanie alebo kombinačná liečba všeobecne znamená, že protilátka a ďalšie terapeutické činidlá sú podávané súčasne v rovnaký čas, zahrnuje tiež príklady, keď sú protilátka a ďalší terapeutický agens podávané v rôznych časoch. Napríklad protilátka môže byť podávaná jedenkrát každé tri dni, zatiaľ čo ďalší terapeutický agens je podávaný jedenkrát denne. Alternatívne, protilátka môže byť podávaná pred alebo po liečbe chorobného stavu ďalším terapeutickým agensom. Podobne podávanie anti-IGF-IR protilátky môže byť aplikované pred alebo po ďalšej terapii, ako je napríklad rádioterapia, chemoterapia, fotodynamická terapia, chirurgický výkon alebo iná imunoterapia.
Protilátka a jedno alebo viac ďalších terapeutických agensov (kombinačná liečba) môže byť podávaná jedenkrát, dvakrát alebo aspoň počas obdobia, pokiaľ nie je chorobný stav liečený, zmiernený alebo vyliečený. Výhodne je kombinačná liečba podávaná viackrát. Kombinačná liečba môže byť podávaná trikrát denne až jedenkrát každých šesť mesiacov. Podávanie môže byť plánované, ako napríklad trikrát denne, dvakrát denne, jedenkrát denne, jedenkrát každé dva dni, jedenkrát každé tri dni, jedenkrát týždenne, jedenkrát každé dva týždne, jedenkrát každý mesiac, jedenkrát každé dva mesiace, jedenkrát každé tri mesiace a jedenkrát každých šesť mesiacov alebo môže byť podávaná kontinuálne prostredníctvom minipumpy. Kombinačná liečba môže byť podávaná perorálne, sliznicou, bukálne, intranazálne, inhalačné, intravenózne, subkutánne, intramuskuláme, parenterálne, intranádorovo alebo topicky. Kombinačná liečba môže byť podávaná do miesta vzdialeného od miesta nádoru. Kombinačná liečba všeobecne bude podávaná aspoň tak dlho, pokiaľ je nádor prítomný za predpokladu, že protilátka spôsobí, že nádor alebo karcinóm zastaví rast alebo sa zníži jeho hmotnosť či objem.
V ešte ďalšom uskutočnení vynálezu je anti-IGF-IR protilátka značená rádioaktívnou značkou, imunotoxínom alebo toxínom, alebo fúznym proteínom obsahujúcim toxický peptid. Anti-IGF-IR protilátka alebo anti-IGF-lR protilátkový fúzny proteín riadi rádioaktívnu značku, imunotoxín, toxín alebo toxický peptid k IGF-IR-exprimujúcemu nádoru alebo karcinómovej bunke. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu rádioaktívna značka, imunotoxín, toxín alebo toxický peptid je intemalizovaný po tom, čo sa anti-IGF-IR protilátka viaže k IGF-IR na povrchu nádorovej alebo karcinómovej bunky.
V ďalšom aspekte anti-IGF-IR protilátka môže byť použitá terapeuticky na indukciu apoptózy špecifických buniek u pacienta, ktorý to potrebuje. V mnohých prípadoch bunky cielené pre apoptózu sú rakovinové alebo nádorové bunky. Vo výhodnom uskutočnení teda vynález poskytuje spôsob indukcie apoptózy podávaním terapeuticky účinného množstva anti-IGF-IR protilátky pacientovi, ktorý to potrebuje. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je protilátka vybraná zo skupiny, ktorú tvorí 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 alebo 6.1.1, alebo obsahuje ťažký reťazec, ľahký reťazec alebo jej úsek viažuci antigén.
V ďalšom aspekte anti-IGF-IR protilátka môže byť použitá na liečbu nerakovinových stavov, keď sú vysoké hladiny IGF-I a/alebo IGF-IR asociované s nerakovinovým stavom alebo ochorením. V jednom uskutočnení vynálezu spôsob obsahuje krok podávania anti-IGF-IR protilátky pacientovi, ktorý má nerakovinový patologický stav spôsobený alebo exacerbovaný vysokými hladinami IGF-I a/alebo hladinami, či aktivitou IGF-IR. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu nerakovinový patologický stav je akromegália, gigantizmus, psoriáza, ateroskleróza, restenóza hladkého svalstva krvných ciev alebo nepatričná mikrovaskuláma proliferácia, ako napríklad proliferácia zisťovaná ako komplikácia diabetes, obzvlášť oka. Vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu anti-IGF-IR protilátka spomaľuje progresiu nerakovinového patologického stavu. Vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu anti-IGF-IR protilátka zastaví alebo zvráti, aspoň čiastočne, nerakovinový patologický stav.
V ďalšom aspekte vynález poskytuje spôsob podávania aktivujúcej anti-IGF-IR protilátky pacientovi, ktorý to potrebuje. V jednom uskutočnení vynálezu aktivujúca protilátka alebo farmaceutická kompozícia je podávaná pacientovi, ktorý to potrebuje, v množstve účinnom na zvýšenie IGF-IR aktivity. Vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu aktivujúca protilátka je schopná obnoviť normálnu IGF-IR aktivitu. V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu aktivujúca protilátka môže byť podávaná pacientovi, ktorý má malú postavu, neuropatiu, zníženú svalovú hmotu alebo osteoporózu. V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu aktivujúca protilátka môže byť podávaná s jedným alebo viacerými ďalšími faktormi, ktoré zvyšujú bunkovú proliferáciu, zabraňujú apoptóze alebo zvyšujú IGF-IR aktivitu. Takéto faktory zahrnujú rastové faktory, ako je napríklad IGF-I, a/alebo analógy IGF-I, ktoré aktivujú IGF-IR. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je protilátka vybraná zo skupiny, ktorú tvorí 4.17.3 alebo obsahuje ťažký reťazec, ľahký reťazec alebo ich časť viažucu antigén.
Génová terapia
Molekuly nukleovej kyseliny podľa predkladaného vynálezu môžu byť podávané pacientovi, ktorý to potrebuje, prostredníctvom génovej terapie. Terapia môže byť buď in vivo, alebo ex vivo. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sú molekuly nukleovej kyseliny kódujúce tak ťažký reťazec ako ľahký reťazec podávané pacientovi. Vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu molekuly nukleovej kyseliny sú podávané tak, že sú trvalé začlenené do chromozómu B lymfocytov, pretože tieto bunky sú špecializované na produkciu protilátok. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu prekurzoravé B lymfocyty sú transfekované alebo infikované ex vivo a spätne transplantované pacientovi, ktorý potrebuje liečbu. V ďalšom uskutočnení vynálezu prekurzorové B lymfocyty alebo ďalšie bunky sú infikované in vivo s použitím vírusu známeho infikovať požadovaný bunkový typ. Typické vektory použité na génovú terapiu zahrnujú lipozómy, plazmidy alebo vírusové vektory, ako sú napríklad retrovírusy, adenovírusy a adeno-asociované vírusy. Po infekcii buď in vivo, alebo ex vivo môžu byť hladiny expresie protilátok monitorované odberom vzorky liečenému pacientovi a s použitím ktoréhokoľvek imunotestu v odbore známeho a opísaného v tomto texte.
Vo výhodnom uskutočnení vynálezu spôsob génovej terapie zahrnuje kroky podávania účinného množstva izolovanej molekuly nukleovej kyseliny kódujúcej ťažký reťazec alebo jeho antigén-väzobnú časť humánnej protilátky alebo jej časti a exprimujúcu molekulu nukleovej kyseliny. V ďalšom uskutočnení vynálezu spôsob génovej terapie zahrnuje kroky podávania účinného množstva izolovanej molekuly nukleovej kyseliny kódujúcej ľahký reťazec alebo jeho antigén-väzobnú časť humánnej protilátky alebo jej časti a exprimujúcu molekulu nukleovej kyseliny. Vo výhodnejšom spôsobe spôsob génovej terapie zahrnuje kroky podávania účinného množstva izolovanej molekuly nukleovej kyseliny kódujúcej ťažký reťazec alebo jeho antigén-väzobnú časť humánnej protilátky alebo jej časti a účinné množstvo izolovanej molekuly nukleovej ky34 seliny kódujúcej ľahký reťazec alebo jeho antigén-väzobnú časť humánnej protilátky alebo jej časti a exprimujúcu molekulu nukleovej kyseliny. Spôsob génovej terapie môže tiež zahrnovať krok podávania ďalších anti-rakovinových agensov, ako je napríklad taxol, tamoxifén, 5-FU, adriamycín alebo CP-358,774.
Na lepšie pochopenie vynálezu sú uvedené nasledujúce príklady. Tieto príklady sú iba na ilustračné účely a nieje možné vykladať ich ako príklady obmedzujúce rozsah vynálezu.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad I
Príprava hybridómov produkujúcich anti-IGF-IR protilátku
Protilátky podľa vynálezu boli pripravené, vybrané a testované nasledujúcim spôsobom:
Imunizácia a vytvorenie hybridómu
Osem až desať týždňov staré myši XENOMICE™ boli imunizované intraperitoneálne alebo do chodidiel ich zadných nôh buď extracelulámou doménou humánneho IGF-IR (10 pg/dávka/myš), alebo bunkami 3T3-IGF-IR, alebo 300.19-IGF-IR, čo sú dve transfekované bunkové línie, ktoré exprimujú humánnu IGF-IR na svojich plazmatických membránach (10 x 106 buniek/dávka/myš). Táto dávka bola opakovaná päť až sedemkrát počas troch až ôsmich týždňov. Štyri dni pred fúziou myši dostali konečnú injekciu extracelulámej domény humánneho IGF-IR v PBS. Slezina a lymfocyty z lymfatickej uzliny imunizovaných myší boli fúzované s bunkovou líniou nesekrečného myelómu P3-X63-Ag8.653 a boli podrobené HAT selekcii, ako už bolo opísané skôr (Galfre a Milstein, Methods Enzymol. 73: 3-46, 1981). Získal sa panel hybridómov, ktoré všetky sekretovali IGF-IR špecifické humánne IgG2x protilátky. Sedem hybridómov produkujúcich monoklonálne protilátky špecifické pre IGF-IR bolo vybraných na ďalšie štúdie a boli nazvané 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1,4.9.2,4.17.3 a 6.1.1.
Hybridómy 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 a 4.17.3 boli uložené v American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, 12. decembra 2000 s nasledujúcimi prístupovými číslami:
Hybridom Depozit, č.
2.12.1 PTA-2792
2.13.2 PTA-2788
2.14.3 PTA-2790
3.1.1 PTA-2791
4.9.2 PTA-2789
4.17.3 PTA-2793
Príklad II
Stanovenie afinitných konštánt (Kd) plne humánnych anti-IGF-IR monoklonálnych protilátok pomocou BIAcore
Uskutočnili sa merania afinity purifikovaných protilátok povrchovou plazmónovou rezonanciou s použitím prístroja BIAcore 3000, podľa protokolov výrobcu.
Protokol 1
Na uskutočnenie kinetických analýz bol proteín-A imobilizovaný na povrchu senzorového čipu BIAcore. Senzorový čip sa potom použil na zachytenie anti-IGF-IR protilátok podľa predkladaného vynálezu. Na senzorový čip boli injikované rôzne koncentrácie extracelulámej domény IGF-IR a bola analyzovaná väzobná a disociačná kinetika interakciou medzi anti-IGF-IR protilátkami a extracelulámou doménou IGF-IR. Dáta sa vyhodnotili globálnou zhodou podľa Langmuira 1 : 1, s použitím modelov posunu základnej línie, ktoré sú zo softvéru BIAevaluation poskytovaného BIAcore.
Protokol 2
Merania na prístroji BIAcore sa uskutočnili v podstate tak, ako bolo opísané autormi Fagerstam et al. „Detection of antigen-antibody interactions by surface plasmon resonance. Applications to epitope mapping.“ J. Mol. Recog. 3: 208-214., 1990.
Tabuľka I uvádza v zozname merania afinity pre zástupcu anti-IGF-IR protilátok podľa predkladaného vynálezu.
Tabuľka I
Monoklonálna protilátka Kd (M) Protokol 1 Kd (M) Protokol 2
2.12.1 7,37 x 10'9
2.13.2 3,5 x 10'9 1,53 x 10'9
2.14.3 6,41 x 10’iU
3.1.1 1,15 x 10y
4.9.2 6,84 x 101θ 4,27 x 10’10
4.17.3 13 x 10'8
6.1.1 5,65 x 10 lu
Kinetické analýzy vyjadrujú, že protilátky pripravené podľa vynálezu majú vysoké afinity a silné väzobné konštanty pre extracelulámu doménu IGF-IR.
Príklad III
Protilátkou sprostredkovaná inhibícia IGF-I-indukovanej fosforylácie IGF-IR
Uskutočnili sa experimenty ELISA, aby sa určilo, či protilátky podľa tohto vynálezu sú schopné blokovať IGF-I-sprostredkovanú aktiváciu IGF-IR. IGF-I-sprostredkovaná aktivácia IGF-IR bola detekovaná zvýšenou fosforyláciou tyrozínu spojenou s receptorom.
Príprava ELISA doštičiek
Pripravili sa ELISA záchytné doštičky pridaním 100 μΐ blokovacieho pufra (3 % bovinný sérový albumín [BSA] v Tris-pufrovanom fyziologickom roztoku [TBS]) do každej jamky 96 jamkových doštičiek potiahnutých ReactiBind Protein G (Pierce) a doštičky sa inkubovali pri trepaní počas 30 minút pri teplote miestnosti. Králičia pan-špecifická SC-713 anti-IGF-IR protilátka sa nariedila (Santa Cruz) v blokovacom pufri na koncentráciu 5 pg/ml a do každej jamky sa pridalo 100 pl nariedenej protilátky. Doštičky sa inkubovali pri trepaní počas 60 až 90 minút pri teplote miestnosti. Potom sa doštičky päťkrát premyli premývacím pufrom (TBS + 0,1 % Tween 20) a zostávajúci pufor sa jemne odsal na papierových ručníkoch. Pred pridaním lyzátu sa nenechali doštičky vyschnúť.
Príprava lyzátu z IGF-IR-exprimujúcich buniek
Bunky NIH-3T3 transfekované IGF-IR boli vložené (5xl04/ml) do 100 pl rastového média (DMEM médium s vysokým obsahom glukózy doplnené 0,29 mg/ml L-glutamínu, 10 % teplom inaktivovaným FBS a 500 pg/ml každého z geneticínu, penicilínu a streptomycínu na 96 jamkové doštičky s dnom jamiek v tvare U. Doštičky sa cez noc inkubovali v 37 °C, 5 % CO2, aby sa umožnilo prichytenie buniek. Médium bolo zliate z doštičiek a nahradené 100 pl čerstvého rastového média na jamku. Na testovanie boli potenciálne antiIGF-IR protilátky nariedené na päťnásobok požadovanej konečnej koncentrácie v rastových médiách a pridané po 25 pl na jamku. Všetky vzorky sa testovali v troch opakovaniach. Potom sa doštičky inkubovali v 37 °C počas jednej hodiny. Bunky sa stimulovali 25 pl/jamka IGF-1 v koncentrácii 600 ng/ml (pripravené v rastovom médiu) a doštičky sa inkubovali pri teplote miestnosti počas 10 minút. Potom sa médium zlialo prevrátením doštičiek a jemným osušením na papierových ručníkoch a adherované bunky sa lyžovali pridaním 50 pl lyzačného pufra (50mM HEPES, pH 7,4, lOmM EDTA, 150mM NaCl, l,5mM MgCl2, l,6mM NaVO4, 1 % Triton X-100, 1 % glycerol, doplnený bezprostredne pred použitím jednou tabletou inhibítora proteázy bez EDTA [Roche Molecular Sciences] na 50 ml) a trepali počas 5 minút pri teplote miestnosti. Do každej jamky sa pridalo 200 pl riediaceho pufra (50mM HEPES, pH 7,4, 1,6 mM NaVO4) a miešalo opakovaným pipetovaním. 100 pl lyzátu z každej jamky bolo prenesených do každej jamky ELISA záchytnej doštičky pripravenej tak, ako tu už bolo opísané a inkubovalo sa pri jemnom trepaním počas dvoch hodín pri teplote miestnosti.
ELISA s protilátkami anti-tyrozínfosfát (pTYR)
Bunkový lyzát sa odstránil prevrátením doštičiek, doštičky sa premyli päťkrát premývacím pufrom a osušili na papierových ručníkoch. Na jamku sa pridalo 100 pl pTYR-špecifickej protilátky (HRP-PY54) nariedenej blokovacím pufrom na koncentráciu 0,2 pg/ml a doštičky sa inkubovali pri trepaní počas 30 minút pri teplote miestnosti. Potom boli doštičky päťkrát premyté premývacím pufrom a osušené na papierových ručníkoch.
Väzba HRP-PY54 protilátky bola detekovaná pridaním 100 pl TMB peroxidázového substrátového roztoku (Kirkegaard & Perry) na jamku a inkubáciou pri trepaní pri vývoji farby (približne 2 až 10 minút). Rozvoj farebnej reakcie sa zastavil pridaním 100 pl na jamku TMB stopovacieho roztoku (Kirkegaard &Perry). Potom sa doštičky trepali počas 10 sekúnd pri teplote miestnosti, aby sa roztok premiešal a kvantifikovali meraním v OD45onm·
Tabuľka II a obrázok 4 ukazujú výsledky tohto experimentu uskutočneného s niekoľkými protilátkami podľa vynálezu. Výsledky tohto experimentu demonštrujú schopnosť protilátok podľa tohto vynálezu blokovať IGF-I-sprostredkovanú aktiváciu IGF-IR, ako je ukázané zvýšenou fosforyláciou tyrozínu spojenou s receptorom. Okrem toho môžu byť tieto výsledky použité na kvantifikáciu relatívnej účinnosti protilátok podľa tohto vynálezu.
Tabuľka II
Monoklonálna protilátka IC50 (pg/ml)
2.12.1 0,172
2.13.2 0,0812
2.14.3 0,325
4.9.2 0,0324
Príklad IV
Protilátkou sprostredkovaná blokáda väzby IGF-I/IGF-IR
Uskutočnili sa ELISA experimenty na kvantifikáciu schopnosti protilátok podľa vynálezu inhibovať IGF-I väzbu na IGF-IR v teste založenom na bunkách. Na 96 jamkové doštičky s dnom jamiek v tvare U boli nanesené bunky NIH-3T3 transfekované IGF-IR (5xl04/ml) do 100 μΐ DMEM média s vysokým obsahom glukózy doplneného 0,29 mg/ml L-glutamínu, 10 % teplom inaktivovaným FBS a 500 pg/ml každého z geneticínu, penicilínu a streptomycínu. Potom sa doštičky cez noc inkubovali v 37 °C, 5 % CO2, aby sa umožnilo prichytenie buniek. Médium sa zlialo z doštičiek a nahradilo sa 100 μΐ čerstvého rastového média na jamku. Na testovanie boli protilátky nariedené v testovacom médiu (DMEM médium s vysokým obsahom glukózy doplnené L-glutamínom, 10 % teplom inaktivovaným FBS, 200 pg/ml BSA a 500 pg/ml každého z geneticínu, penicilínu a streptomycínu) na požadovanú konečnú koncentráciu a na jamku bolo pridaných 50 pl. Všetky vzorky boli podrobené trom opakovaniam. Potom sa doštičky inkubovali v 37 °C počas desať minút. [i25I]-IGF-I bol nariedený na koncentráciu 1 pCi/ml v testovacom médiu a do každej jamky doštičky sa pridalo 50 pl. Ako kontrola pre rádioaktivitu pozadia sa pridal neznačený IGF-I do konečnej koncentrácie 100 ng/ml. Doštičky sa inkubovali počas 10 minút v 37 °C, médiá sa zliali, doštičky sa jemne osušili na papierových ručníkoch a premyli dvakrát testovacím médiom. Potom sa bunky lyžovali pridaním 50 pl 0,lN NaOH, 0,1 % SDS a doštičky sa trepali päť minút pri teplote miestnosti. Potom sa vzorky preniesli na scintilačnú doštičku, pridalo sa 150 pl OptiPhase Supermix a signály sa odčítali na počítači Wallac Micro-Beta.
Tabuľka III a obrázok 3 ukazujú výsledky tohto experimentu uskutočneného s tromi reprezentatívnymi protilátkami podľa vynálezu. Tento experiment demonštroval, že protilátky podľa vynálezu špecificky inhibujú väzbu [i25I]-IGF-I na bunky nadmerne exprimujúce IGF-IR.
Tabuľka III
Monoklonálna protilátka IC50
2.12.1 0,45 pg/ml
2.13.2 0,18 pg/ml
4.9.2 0,1 pg/ml
Príklad V
Štúdie mapovania epitopu
Pri dokazovaní, že protilátky podľa vynálezu rozpoznávajú IGF-IR, boli uskutočnené štúdie mapovania epitopu s niekoľkými protilátkami podľa vynálezu. Tieto experimenty boli konkrétne zamerané na protilátky 2.12.1,2.13.2, 2.14.3 a4.9.2.
Uskutočnili sa kompetitívne štúdie na prístroji BIAcore na určovanie, či sa protilátky podľa tohto vynálezu viažu na rovnaké alebo odlišné miesto na IGF-IR molekule. Extraceluláma doména (ECD) IGF-IR bola naviazaná na senzorový čip BIAcore, ako už bolo opísané v príklade II. Prvá protilátka podľa vynálezu bola naviazaná na tento IGF-IR naviazaný na senzorový čip v saturujúcich podmienkach. Potom bola meraná schopnosť následných sekundárnych protilátok podľa vynálezu kompetovať s primárnou protilátkou o väzbu na IGF-IR. Táto technika umožnila priradiť protilátky podľa tohto vynálezu k rôznym väzobným skupinám.
Tento experiment sa uskutočnil s protilátkami 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3 a 4.9.2. Pozorovalo sa, že 2.13.2 a
4.9.2 kompetovali o rovnaké miesto na extracelulámej doméne IGF-IR. Ďalšie protilátky, 2.12.1 a 2.14.3, sa viažu na miesta na IGF-IR, ktoré sú odlišné od seba navzájom a od miesta viazaného 2.13.2 a 4.9.2.
Príklad VI
Druhová skrížená reaktivita protilátok podľa vynálezu
Aby sa určila druhová skrížená reaktivita protilátok podľa vynálezu, uskutočnilo sa niekoľko experimentov vrátane imunoprecipitácie, protilátkou sprostredkovanej blokády IGF-I-indukovanej fosforylácie receptora a analýza FACS.
Na uskutočnenie imunoprecipitačných pokusov boli bunky nanesené do T25 fliaš s DMEM médiom s vysokým obsahom glukózy doplneným 0,29 mg/ml L-glutamínu, 10 % teplom inaktivovaným FBS a 500 pg/ml každého z geneticínu, penicilínu a streptomycínu do 50 % konfluencie. Potom sa pridalo 100 μΐ protilátky podľa vynálezu v Hankovom pufrovanom fyziologickom roztoku (HBSS, Gibco BRL) v koncentrácii 1 pg/ml. Doštičky sa inkubovali počas 30 minút v 37 °C v inkubátore, a potom sa bunky stimulovali IGF-I v koncentrácii 100 ng/ml počas 10 minút pri teplote miestnosti. Bunky boli lyzované v RIPA pufre (Harlow a Lane, už citované referencie) a imunoprecipitované IGF-IR s 2 pg pan-špecifickej SC-713 anti-IGF-IR protilátky (Santa Cruz) plus protein A agarózovými perličkami počas 1 hodiny v 4 °C. Perličky boli peletované a boli trikrát premyté PBS/T (PBS +0,1 % Tween-20), a potom boli perličky povarené v 40 μΐ Laemmliho pufra obsahujúcom 5 % β-ΜΕ.
Vzorky pripravené tak, ako už bolo opísané, potom boli analyzované technikou Westem blot. 12 μΐ každej vzorky na dráhu bolo nanesených na gély Novex™ s 4-10 % gradientom lx MES pufri (Novex™). Gély boli pustené pri 150 V počas 1 hodiny alebo pri 200 V počas približne 30 minút. Potom boli gély prenesené na membránu v Novex™ prenosovom pufri s 10 % metanolom buď cez noc pri 100 mA, alebo počas 1-1,5 hodiny pri 250 mA. Potom sa membrána nechala úplne uschnúť a blokovala sa pri teplote miestnosti pufrom TBS (Trisom pufrovaný fyziologický roztok, pH 8,0) obsahujúcim Superblock (Pierce Chemical Co.). Na detekciu imunoprecipitovaného IGF-IR sa pridala IGF-IR blotovacia protilátka SC713 (Santa Cruz).
Tento experiment sa uskutočnil s protilátkami podľa vynálezu, konkrétne 2.12.1, 2.13.2,4.17.3 a 4.9.2, na bunkách z celého radu zvierat. Zistilo sa, že protilátky 2.12.1, 2.13.2 a 4.9.2 boli schopné viazať humánny, ale nie psí, morčací alebo králičí IGF-IR. Ďalej boli tieto protilátky schopné viazať IGF-IR z COS7 a opíc Rhesus, pochádzajúcich z opíc Starého sveta, ale nie IGF-IR z marmoseta, čo je opica z Nového sveta. Tieto experimenty ukazujú, že protilátky sú vysoko špecifické.
Protilátkou sprostredkovaná blokáda väzby IGF-I/IGF-1R u primátov iného než ľudského pôvodu
Po pozorovaní, že protilátky podľa vynálezu rozpoznávajú IGF-IR z opíc starého sveta, bola tiež testovaná ich schopnosť blokovať väzbu IGF-I/IGF-IR v bunkách pochádzajúcich z týchto opíc starého sveta. Bunky boli nanesené do T25 fliaš s DMEM médiom s vysokým obsahom glukózy doplneným s L-glutamínom, 10 % teplom inaktivovaným FBS a 500 pg/ml každého z geneticínu, penicilínu a streptomycínu do 50 % konfluencie. Potom bola pridaná protilátka podľa vynálezu alebo médium bez protilátky ako kontrola a bunky boli stimulované IGF-I v koncentrácii 100 ng/ml počas 10 minút pri teplote miestnosti. Po stimulácii bunky boli lyzované a imunoprecipitované IGF-IR s pan-špecifickou IGF-IR protilátkou SC713, ako už bolo opísané. Potom bola uskutočnená analýza Westem blot, ako už bolo opísané, s použitím HRP-PY54 protilátky na detekciu fosforylovaného tyrozínu v aktivovanom IGF-IR.
Zistilo sa, že protilátky podľa tohto vynálezu, konkrétne 2.13.2 a 4.9.2, môžu blokovať IGF-I indukovanú fosforyláciu IGF-IR v bunkách COS7 i Rhesus. Hodnota IC50 pre pozorovanú inhibíciu bola 0,02 pg/ml a 0,005 pg/ml pre IGF-IR COS7 a Rhesus, v danom poradí.
Stanovenie medzidruhovej (skríženej) afinity protilátok podľa vynálezu
Uskutočnila sa FACS analýza na určovanie afinity protilátok podľa vynálezu pre IGF-IR z ostatných zvierat, konkrétne opíc starého sveta, ktoré už boli opísané. Inkubovali sa alikvóty humánnych a opičích buniek (5x105) počas 1 hodiny na ľade so stúpajúcimi koncentráciami biotinylovaných anti-IGF-IR protilátok podľa vynálezu alebo s biotinylovanou protilátkou anti-hemokyanín prílipky (KLH) (Abgenix) ako negatívnej kontroly. Potom boli vzorky inkubované počas 30 minút na ľade s RPE (fykoerytrín) konjugovaným so streptavidínom. Väzba bola meraná prietokovou cytometriou a analyzovaná histogramy intenzity fluorescencie (F12-H) proti počtu buniek (Počty) s použitím softvéru CellQuest. Väzba (Kj) bola vypočítaná pre každú protilátku z grafov priemernej intenzity fluorescencie proti koncentrácii protilátky. Vo väčšine experimentov bola meraná väzba v pestovaných humánnych bunkách MCF-7 a bunkách tkanivových kultúr makakov rhesus (Macaca mullatá) alebo cynomologus (M. fascicularis). Deplecia protilátky bola kontrolovaná meraním väzby v rozsahu koncentrácií buniek.
Uvedená FACS analýza bola uskutočnená na testovanie schopnosti protilátok podľa vynálezu, konkrétne
2.13.2 a 4.9.2, viazať sa na humánne bunky a bunky makakov rhesus (Macaca mullatá) alebo cynomologus (M. fascicularis). Pozorovala sa polovičná maximálna väzba (Kd) 0,1 pg/ml pre všetky testované bunkové línie.
Príklad VII
Down-regulácia receptora IGF-I
Uskutočnili sa blokujúce experimenty v podstate tak, ako už bolo opísané v príklade IV, až po pridaní IGF-1 značeného [l25I]. V tomto bode boli bunky povarené v 40 μί Laemmliho pufra obsahujúceho 50 % ME. Vzorky potom boli analyzované analýzou Western blot, ako bolo opísané v príklade VI, a bloty boli skúšané s pan-špecifickou IGF-IR protilátkou SC713 na kvantifikáciu hladín IGF-IR a s protilátkou HRP-PY54 na sledovanie hladín fosforylovaného tyrozínu v aktivovanom IGF-IR ako sondami.
Ako bolo pozorované skôr (príklad III), bola zistená blokáda IGF-I indukovanej fosforylácie IGF-IR po ošetrení buniek protilátkou podľa tohto vynálezu (obrázok 4). Ďalej bolo pozorované, že táto blokáda IGF-I indukovanej fosforylácie bola nasledovaná down-reguláciou IGF-IR v týchto bunkách. Pozri napr. obr. 4, IGF-IR hladiny boli maximálne redukované 16 hodín po stimulácii s IGF-I v prítomnosti protilátky podľa vynálezu.
Príklad VIII
Účinky protilátok podľa vynálezu na IGF-IR in vivo
Zisťovalo sa, či účinky protilátok podľa vynálezu na IGF-IR, ako boli opísané v predchádzajúcich príkladoch, by nastali in vivo. V atýmusových myšiach boli indukované nádory podľa publikovaných metód (V. A. Pollack et al., „Inhibition of epidermal growth factor receptor-associated tyrosine phosphorylation in human carcinomas with CP-358,774: Dynamics of receptor inhibition in situ and antitumor effects in athymic mice, „J. Pharmacol. Exp. Ther. 291: 739-748, 1999). Krátko, bunky NIH-3T3 transfekované IGF-IR (5xl06) boli injikované subkutánne atýmusovým (nu/nu) myšiam vo veku 3 až 4 týždne s 0,2 ml prípravku Matrigel. Potom boli myši intraperitoneálne injikované protilátkou podľa vynálezu potom, čo sa vytvorili stabilné nádory (t. j. približne 400 mm3).
Po 24 hodinách boli nádory extrahované, homogenizované a určila sa hladina IGF-IR. Aby sa určili hladiny IGF-IR, bola SC-713 protilátka nariedená v blokovacom pufri na konečnú koncentráciu pg/ml a 100 μί bolo pridaných do každej jamky doštičky potiahnutej Reacti-Bind kozou anti-králičou protilátkou (GAR) (Pierce). Doštičky boli inkubované pri teplote miestnosti počas 1 hodiny pri trepaní a potom boli doštičky päťkrát premyté premývacím pufrom. Potom boli odvážené vzorky nádorov, ktoré boli pripravené tak, ako už bolo opísané, a homogenizované v lyzačnom pufri v množstve 1 ml/100 mg. 12,5 μί nádorového extraktu bolo nariedených lyzačným pufrom na konečný objem 100 μί a toto bolo pridané do každej jamky 96 jamkovej doštičky. Doštičky boli inkubované pri teplote miestnosti pri trepaní počas 1 až 2 hodín, a potom boli doštičky päťkrát premyté premývacím pufrom. Potom bolo pridaných 100 μί HRP-PY54 alebo biotinylovanej anti-IGF-IR protilátky v blokovacom pufre do každej jamky a inkubovalo sa pri teplote miestnosti pri trepaní počas 30 minút. Potom boli doštičky päťkrát premyté premývacím pufrom a doštičky boli vyvolané. Doštičky testované s HRP-PY54 boli vyvolané pridaním 100 μί TMB mikrojamkového substrátu na jamku a rozvoj farby bol zastavený pridaním 100 μί 0,9M H2SO4. Potom bol signál kvantifíkovaný trepaním počas 10 sekúnd a meraním OD45onm· Signál bol normalizovaný k celkovému proteínu. Doštičky skúšané s anti-IGF-IR protilátkou boli vyvolané pridaním 100 μί streptavidínu-HRP nariedeného v blokovacom pufri do každej jamky, inkubáciou pri teplote miestnosti pri trepaní počas 30 minút, a potom sa pokračovalo tak, ako bolo opísané pre HRP-PY54.
Zistilo sa, že intraperitoneálna injekcia protilátky podľa tohto vynálezu, obzvlášť 2.13.2 a 4.9.2, mala za následok inhibíciu IGF-IR aktivity, ako bolo merané poklesom [oboch IGF-IR fosfotyrozínu (fosforylovaného IGF-IR) a] celkového IGF-IR proteínu (obrázok 6). Okrem toho bol tiež pozorovaný pokles IGF-IR fosfotyrozínu (fosforylovaného IGF-IR) (obrázok 5). Bez väzby na ktorúkoľvek teóriu znížené hladiny IGF-IR fosfotyrozínu môžu byť spôsobené zníženými hladinami IGF-IR proteínu in vivo po ošetrení protilátkou alebo môžu byť spôsobené kombináciou znížených hladín IGF-IR proteínu a poklesom fosforylácie tyrozínu na IGF-IR, ktorá je prítomná vďaka blokáde aktivácie ligandom (napr. IGF-I alebo IGF-II). Okrem toho táto inhibícia bola citlivá na dávku injikovanej protilátky (obrázok 6). Tieto dáta dokazujú, že protilátky podľa vynálezu sú schopné cieliť IGF-IR in vivo spôsobom analogickým spôsobu, ktorý sa pozoroval in vitro.
Príklad IX
Inhibícia rastu (TGI) 3T3/IGF-IR bunkových nádorov
Testovalo sa, či by anti-IGF-IR protilátky podľa vynálezu pôsobili na inhibíciu nádorového rastu. Nádory boli indukované tak, ako už bolo opísané (príklad VIII) a keď sa vytvorili palpačné nádory (t. j. 250 mm3, počas 6 až 9 dní), boli myši ošetrené jednou dávkou 0,20 ml protilátky intraperitoneálnou injekciou. Veľkosť nádoru bola meraná Vemierovým kaliperom v dvoch priemeroch každý tretí deň a objem bol vypočítaný s použitím vzorca (dĺžka x [šírka]2)/2 s použitím metód zavedených autormi Geran, et al., „Protocols for screening Chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems“, Cancer Chemother. Rep. 3: 1-104.
Keď bola uskutočnená táto analýza s protilátkou podľa vynálezu, bolo zistené, že jedno ošetrenie protilátkou 2.13.2 samotnou inhibovalo rast nádorov indukovaných NIH-3T3 bunkami transfekovanými IGF-IR (obrázok 7, ľavý panel). Okrem toho, v kombinačných štúdiách s jednou dávkou 7,5 mg/kg intravenózne podávaného adriamycínu bolo pozorované, že podávanie jednej dávky 2.13.2 zosilnilo účinnosť adriamycínu, známeho inhibítora nádorového rastu. Kombinácia adriamycínu s protilátkou podľa vynálezu, 2.13.2, vykázala spomalenie rastu 7 dní oproti liečbe samotnou protilátkou alebo samotným adriamycínom (obrázok 7, pravý panel).
Príklad X
Vzťah hladín protilátok k down-regulácii IGF-IR
Pri nahých myšiach boli indukované nádory tak, ako už bolo opísané v príklade VIII. Myši potom boli ošetrené 125 pg 2.13.2 intraperitoneálnou injekciou, ako bolo opísané v príkladu VIII. Nádory boli extrahované a hladiny IGF-IR boli merané testom ELISA tak, ako už bolo opísané v príklade VIII. Obrázok 8 ukazuje sérové hladiny protilátky 2.13.2 a hladiny receptora IGF-IR v priebehu času. Experiment demonštruje, že IGF-IR je down-regulovaný protilátkou a že stupeň IGF-IR inhibície je podľa dávky úmerný sérovej koncentrácii protilátky.
Príklad XI
Inhibícia rastu 3T3/IGF-IR nádorov mnohonásobnou dávkou protilátky v kombinácii s adriamycínom
Pri nahých myšiach boli indukované nádory tak, ako bolo opísané v príklade IX. Myši s pevne zavedenými subkutánnymi nádormi s veľkosťou približne 250 mm3 boli ošetrené v dňoch 1, 8, 15 a 22 rôznym množstvom protilátky 2.13.2 (i. p.) alebo adriamycínom v dávke 7,5 mg/kg (i. v.), buď ako jednotlivými agensmi, alebo v kombinácii, ako bolo opísané v príklade IX. Obrázok 9 ukazuje veľkosť nádoru vo vzťahu k rôznemu ošetreniu v priebehu času. Experiment demonštruje, že ošetrenie anti-IGF-IR protilátkou podávanou jedenkrát každých sedem dní inhibuje rast nádorových buniek a zvýši inhibíciu rastu nádorových buniek v kombinácii s adriamycínom, známym nádorovým inhibítorom.
Príklad XII
Inhibícia rastu veľkých nádorov
Pri nahých myšiach boli indukované nádory tak, ako bolo opísané v príklade IX. Myši s veľkými pevne zavedenými subkutánnymi nádormi trochu menšími než 2000 mm3 boli ošetrené v dňoch 1 a 8 rôznym množstvom protilátky 2.13.2 (i. p.) alebo adriamycínom v dávke 7,5 mg/kg (i. v.), buď ako jednotlivými agensmi, alebo v kombinácii, ako bolo opísané v príklade IX. Obrázok 10 ukazuje veľkosť nádoru vo vzťahu k rôznemu ošetreniu v priebehu času. Kontrolná skupina zvierat, skupina zvierat so samotnou protilátkou a samotným adriamycínom boli ukončené v deň 5, keď veľkosť nádoru prekročila 2000 mm3. Experiment demonštruje, že ošetrenie anti-IGF-IR protilátkou v kombinácii s adriamycínom je vysoko účinné proti veľkým nádorom, keď sú podávané mnohonásobné dávky.
Príklad XIII
Inhibícia rastu buniek kolorektálnych nádorov
Pri nahých myšiach boli indukované nádory tak, ako bolo opísané v príklade IX okrom toho, že boli použité bunky Colo 205 (ATCC CCL 222). Colo 205 bunky sú bunky humánneho kolorektálneho adenokarcinómu. Myši s pevne zavedenými subkutánnymi nádormi s veľkosťou približne 250 mm3 boli ošetrené rôznym množstvom protilátky 2.13.2 (i. p.) alebo 5-fluórdeoxyuridínom (5-FU, i. v.) v dávke 100 mg/kg, buď ako jednotlivými agensmi, alebo v kombinácii, ako bolo opísané v príklade IX. Obrázok 11 ukazuje veľkosť nádoru vo vzťahu k rôznemu ošetreniu v priebehu času. Experiment demonštruje, že ošetrenie anti-IGF-IR protilátkou podávanou jedenkrát inhibuje rast buniek humánneho kolorektálneho karcinómu, keď bola poskytnutá ako jedno agens a zosilňuje účinnosť 5-FU, známeho nádorového inhibítora.
Myši s pevne zavedenými Colo 205 nádormi boli ošetrené v dňoch 1,8, 15 a 22 s 500 gg 2.13.2 (i. p.), 100 mg/kg 5-FU (i. v.) alebo ich kombináciou. Obrázok 12 ukazuje veľkosť nádoru vo vzťahu k rôznemu ošetreniu v priebehu času. Experiment demonštruje, že ošetrenie anti-IGF-IR protilátkou podávanou jedenkrát každých sedem dní inhibuje rast buniek humánneho kolorektálneho karcinómu a zosilňuje účinnosť 5-FU.
Príklad XIV
Inhibícia rastu buniek karcinómu prsníka
Nahým myšiam, ako boli opísané v príklade VIII, boli implantované biologicky rozložiteľné tablety s estrogénom (0,72 mg 17-P-estradiol/tableta, 60 dní uvoľňovanie, Innovative Research of America). Po 48 hodinách boli pri nahých myšiach indukované nádory v podstate tak, ako bolo opísané v príklade IX, okrom toho, že boli použité bunky MCF-7 (ATCC HTB-22). Bunky MCF-7 sú od estrogénu závislé bunky humánne40 ho karcinómu prsníka. Myši s pevne zavedenými subkutánnymi nádormi s veľkosťou približne 250 mm3 boli ošetrené 50 pg protilátky 2.13.2 (i. p.) v dňoch 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19 a 22 (q3dx7) alebo taxolom v dávke 6,25 mg/kg (i. p.) vo dňoch 1, 2, 3, 4, 5 (qldx5), buď ako jednotlivými agensmi, alebo v kombinácii, v podstate tak, ako bolo opísané v príklade IX. Obrázok 13 ukazuje veľkosť nádoru vo vzťahu k rôznemu ošetreniu v priebehu času. Experiment demonštruje, že ošetrenie anti-IGF-IR protilátkou samotnou inhibuje rast buniek humánneho karcinómu prsníka, keď je podávaná jedenkrát každé tri dni, a tiež zosilňuje účinnosť taxolu, známeho inhibítora karcinómu prsníka, keď je podávaná v kombinácii.
Myši s pevne stanovenými nádormi z buniek MCF-7, ako už bolo opísané bezprostredne pred týmto, boli ošetrené v deň 1 rôznym množstvom protilátky 2.13.2 (i. p.) samotnou alebo s adriamycínom v dávke 3,75 mg/kg (i. v.), v podstate tak, ako bolo opísané v príklade IX. Obrázok 14 ukazuje veľkosť nádoru vo vzťahu k rôznemu ošetreniu v priebehu času. Experiment dokazuje, že jedno ošetrenie anti-IGF-IR protilátkou samotnou inhibuje rast buniek humánneho karcinómu prsníka a zosilňuje účinnosť adriamycínu, známeho nádorového inhibítora.
Myši s pevne zavedenými nádormi z buniek MCF-7, ako už bolo opísané bezprostredne pred týmto, boli ošetrené 250 pg protilátky 2.13.2 (i. p.) v dňoch 1, 8, 15 a 23 alebo biologicky rozložiteľnou tabletou s tamoxifénom v dávke 25 mg/tableta (voľná báza, 60 dní uvoľňovanie, Innovative Research of America), buď ako jednotlivými agensmi, alebo v kombinácii, v podstate tak, ako bolo opísané v príklade IX. Tableta s tamoxifénom bola implantovaná v deň 1 potom, čo bol preukázaný nádor. Obrázok 15 ukazuje veľkosť nádoru vo vzťahu k rôznemu ošetreniu v priebehu času. Experiment demonštruje, že ošetrenie anti-IGF-IR protilátkou podávanou jedenkrát každých sedem dní inhibuje samotné rast humánneho karcinómu prsníka a zosilňuje účinnosť tamoxifénu, známeho nádorového inhibítora.
Príklad XVI
Inhibícia rastu buniek epidermoidného karcinómu
Pri nahých myšiach boli indukované nádory v podstate tak, ako bolo opísané v príkladu IX okrem toho, že boli použité bunky A431 (ATCC CRL 1555). Bunky A431 sú bunky humánneho epidermoidného karcinómu, ktoré nadmerne exprimujú EGFR. Myši s pevne zavedenými subkutánnymi nádormi s veľkosťou približne 250 mm3 boli ošetrené v dňoch 1, 8, 15, 22 a 29 s 500 pg protilátky 2.13.2 (i. p.) alebo boli ošetrené jedenkrát denne počas 27 dní s CP-358,774 v dávke 10 mg/kg, podávanej perorálne (p. o.), buď ako jednotlivými agensmi, alebo v kombinácii, ako bolo opísané v príklade IX. CP-358,774 je opísaná v patente Spojených štátov 5 747 498 a v práci autorov Moyer et al., Cancer Research, 57: 4838-4848, 1997, zahrnuté formou odkazu v tomto texte. Obrázok 16 ukazuje veľkosť nádoru vo vzťahu k rôznemu ošetreniu v priebehu času. Experiment demonštruje, že ošetrenie anti-IGF-IR protilátkou zosilňuje účinnosť CP-358,774, známeho inhibítora EGF-R tyrozínkinázy, v inhibícii rastu humánneho epidermoidného karcinómu.
Príklad XVII
Farmakokinetika anti-IGF-IR protilátok in vivo
Aby sa vyhodnotila farmakokinetika anti-IGF-IR protilátok, cynomolgným opiciam (Macaca fascicularis) bola podávaná intravenózna injekcia protilátky 2.13.2 v acetátovom pufri v dávke 3, 30 alebo 100 mg/kg. Opiciam sa odobralo sérum v rôznych časových bodoch a v období až desať týždňov bola určovaná koncentrácia anti-IGF-IR protilátky u opíc. Na kvantifikáciu funkčných sérových hladín protilátky bola extraceluláma doména humánneho IGF-IR (IGF-I-sR, R&D Systems, katalóg, č. 391GR) naviazaná na 96 jamkové doštičky. Opičie sérum (nariedené medzi 1 : 100 a 1 : 15 000) bolo pridané na testovacie doštičky tak, že každá vzorka bola v lineárnom rozsahu kalibračnej krivky a inkubovaná v podmienkach, v ktorých sa každá anti-IGF-IR protilátka viaže na IGF-I-sR. Po premytí doštičiek značená anti-humánna IgG protilátka bola pridaná na doštičky a inkubovaná v podmienkach, v ktorých sa anti-humánna IgG protilátka viaže na anti-IGF-IR protilátku. Doštičky potom boli premyté a vyvolané a kontrolná kalibračná krivka a jej lineárna regresia boli použité na kvantifikáciu množstva anti-IGF-IR protilátky. Obrázok 17 ukazuje koncentráciu z 2.13.2 v sére v priebehu času. Experiment demonštruje, že polčas anti-IGF-IR protilátky je 4,6 až 7,7 dní a má distribučný objem 74 až 105 ml/kg. Ďalej experiment demonštruje, že podávané množstvá sú u opíc úmerné dávke, čo ukazuje, že anti-IGF-IR protilátka saturovala každé dostupné IGF-IR väzobné miesto v organizme dokonca aj v najnižšej dávke 3 mg/kg.
Príklad XVIII
Kombinačná liečba anti-IGF-IR protilátkou a adriamycínom down-reguluje IGF-IR in vivo
Pri nahých myšiach boli indukované nádory tak, ako bolo opísané v príklade IX. Myši s pevne zavedenými subkutánnymi nádormi s veľkosťou približne 400 mm3 boli ošetrené jednou injekciou 250 pg protilátky
2.13.2 (i. p.) alebo adriamycínom v dávke 7,5 mg/kg (i. v.), buď ako jednotlivými agensmi, alebo v kombinácii, ako bolo opísané v príklade IX. 72 hodín po podávaní agensu boli nádory extrahované, ako bolo opísané v príklade VIII, a rovnaké množstvá nádorových extraktov boli podrobené elektroforéze v polyakrylamido41 vom géli s dodecylfosfátom sodným (SDS-PAGE) a analýze Western blot s použitím anti-IGF-IR protilátky SC-713 (Santa Cruz). Obrázok 18 ukazuje množstvo IGF-IR v nádorových bunkách pri kontrolných zvieratách (prvé tri dráhy každého panelu), pri zvieratách ošetrených samotnou protilátkou (horný panel), pri zvieratách ošetrených samotným adriamycínom (prostredný panel) a pri zvieratách ošetrených protilátkou a adriamycínom (spodný panel). Každá dráha reprezentuje rovnaké množstvo proteínu z jednotlivých nádorov od individuálnych myší. Experiment demonštruje, že ošetrení adriamycínom samotným má malý účinok na hladiny IGF-IR, a že ošetrenie samotnou protilátkou ukazuje určitý pokles hladín IGF-IR. Prekvapivo, liečba adriamycínom a protilátkou spoločne ukazuje dramatický pokles hladín IGF-IR, čo demonštruje, že adriamycín a protilátka značne down-regulujú hladiny IGF-IR.
Všetky publikácie a patentové prihlášky, ktoré boli citované v tomto opise, sú zahrnuté formou odkazu v tomto texte, akoby každá jednotlivá publikácia alebo patentová prihláška boli špecificky a individuálne uvedené ako zahrnuté formou odkazu. Aj keď niektoré detaily predkladaného vynálezu boli opísané ilustratívnym spôsobom a pomocou príkladov na účely lepšieho porozumenia, odborníkom v odbore je zrejmé vo svetle náuky tohto vynálezu, že určité zmeny a modifikácie môžu byť vytvorené bez odchýlenia sa od vynálezcovskej myšlienky alebo rozsahu pripojených patentových nárokov.
Zoznam sekvencií <160> 60 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 291 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tgcatctgta tttaggctgg ccgtttacaa tctcacaatc taattatcct ggagacagag tatcagcaga agtggggtcc agcagcctgc cggacgttcg tcaccttcac aaccagggaa catcaaggtt agcctgaaga gccaagggac ttgccgggca agtcaggaca ttagacgtga 60 agctcctaag cgcctgatct atgctgcatc 120 cagcggcagt ggatctggga cagaattcac 180 ttttgcaact tattactgtc tacagcataa 240 cgaggtggaa atcatacgaa c 291 <210>2 <211>136 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Ala 1 Ser Val Gly Asp 5 Arg val Thr Phe Thr 10 Cys Arg Ala Ser Gin 15 Asp
íle Arg Arg Asp 20 Leu Gly Trp Tyr Gin 25 Gin Lys Pro Gly Lys 30 Ala Pro
Lys Arg Leu 35 íle Tyr Ala Ala Ser 40 Arg Leu Gin Ser Gly 45 Val Pro Ser
Arg Phe 50 Ser Gly Ser Gly Ser 55 Gly Thr Glu Phe Thr 60 Leu Thr íle Ser
Ser 65 Leu Gin Pro Glu Asp 70 Phe Ala Thr Tyr Tyr 75 Cys Leu Gin His Asn 80
Asn Tyr Pro Arg Thr 85 Phe Gly Gin Gly Thr 90 Glu Val Glu íle íle 95 Arg
Thr Val Ala Ala 100 Pro Ser Val Phe íle 105 Phe Pro Pro Ser Asp 110 Glu Gin
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 115 120 125
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp 130 135 <210>3 <211> 352 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gggaggcttg gtcaagcctg gaggtccctg agactctcct gtgcagcctc tggattcact 60 ttcagtgact actatatgag ctggatccgc caggctccag ggaaggggct ggaatgggtt 120 tcatacatta gtagtagtgg tagtaccaga gactacgcag actctgtgaa gggccgattc 180 accatctcca gggacaacgc caagaactca ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc 240 gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgtgaga gatggagtgg aaactacttt ttactactac 300 tactacggta tggacgtctg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc ag 352 <210>4 <211> 174 <212>PRT <213> Homo sapiens
<400> 4 Gly Arg 1 Leu Gly Gin Ala Trp Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
5 10 15
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp íle Arg Gin Ala
20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr íle Ser Ser Ser Gly Ser
35 40 45
Thr Arg Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg
50 55 60
Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala
65 70 75 80
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Gly Val Glu Thr Thr
85 90 95
Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn· Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ser Cys Ala
165 170 <210> 5 <211>322 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gacatccaga tgacccagtt tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatcccgtt tgcacagagg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtttacaa cataatagtt acccgtgcag ttttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa ac 322 <210>6 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 6
Asp 1 íle Gin Met Thr Gin 5 Phe Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr 20 íle Thr Cys Arg Ala 25 Ser Gin Gly íle Arg 30 Asn Asp
Leu Gly Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Gly Lys Ala Pro Lys 45 Arg Leu íle
Tyr Ala 50 Ala Ser Arg Leu His 55 Arg Gly Val Pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly
Ser 65 Gly Ser Gly Thr Glu 70 Phe Thr Leu Thr íle 75 Ser Ser Leu Gin Pro 80
Glu Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Leu Gin 90 His Asn Ser Tyr Pro 95 Cys
Ser Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu íle Lys
100 105 <210> 7 <211> 375 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 7 aggtgcagct gttggagtct gggggaggct tggtacagcc tggggggtcc ctgagactct 60 cctgtacagc ctctggattc acctttagca gctatgccat gaactgggtc cgccaggctc 120 cagggaaggg gctggagtgg gtctcagcta ttagtggtag tggtggtacc acattctacg 180 cagactccgt gaagggccgg ttcaccatct ccagagacaa ttccaggacc acgctgtatc 240 tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggccgtata ttactgtgcg aaagatcttg 300 gctggtccga ctcttactac tactactacg gtatggacgt ctggggccaa gggaccacgg 360 <210> 8 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8
Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
35 40 45
Ala íle Ser Gly ser Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Asp Leu Gly Tip Ser Asp Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 <210>9 <211> 302 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 9 tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga gtcaccttca cttgccgggc aagtcaggac 60 attagacgtg atttaggctg gtatcagcag aaaccaggga aagctcctaa gcgcctgatc 120 tatgctgcat cccgtttaca aagtggggtc ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg 180 acagaattca ctctcacaat cagcagcctg cagcctgaag attttgcaac ttattactgt 240 ctacagcata ataattatcc tcggacgttc ggccaaggga ccgaggtgga aatcatacga 300 ac 3 02 <210> 10 10 <211>100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg 15 10 15
Ala Ser Gin Asp 20 íle Arg Arg Asp Leu 25 Gly Trp Tyr Gin Gin 30 Lys Pro
Gly Lys Ala 35 Pro Lys Arg Leu íle 40 Tyr Ala Ala Ser Arg 45 Leu Gin Ser
Gly Val 50 Pro Ser Arg Phe Ser 55 Gly Ser Gly Ser Gly 60 Thr Glu Phe Thr
Leu 65 Thr íle Ser Ser Leu 70 Gin Pro Glu Asp Phe 75 Ala Thr Tyr Tyr Cys 80
Leu Gin His Asn Asn 85 Tyr Pro Arg Thr Phe 90 Gly Gin Gly Thr Glu 95 Val
Glu íle íle Arg 100 <210> 11 <211> 338 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 11 gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc acctgcactg tctctggtgg 60 ctccatcagt aattactact ggagctggat ccggcagccc gccgggaagg gactggagtg 120 gattgggcgt atctatacca gtgggagccc caactacaac ccctccctca agagtcgagt 180 caccatgtca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg aagctgaact ctgtgaccgc 240 cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcggt aacgattttt ggagtggtta ttatctttga 300 ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcag 338 <210> 12 <211>112 <212> PRT <213 > Homo sapiens
<400> 12 Gly Pro Gly 1 Leu Val 5 Lys Pro Ser Glu Thr 10 Leu Ser Leu Thr Cys 15 Thr
Val Ser Gly Gly 20 Ser íle Ser Asn Tyr 25 Tyr Trp Ser Trp íle 30 Arg Gin
Pro Ala Gly 35 Lys Gly Leu Glu Trp 40 íle Gly Arg íle Tyr 45 Thr Ser Gly
Ser Pro 50 Asn Tyr Asn Pro Ser 55 Leu Lys Ser Arg Val 60 Thr Met Ser Val
Asp 65 Thr Ser Lys Asn Gin 70 Phe Ser Leu Lys Leu 75 Asn Ser Val Thr Ala 80
Ala Asp Thr Ala Val 85 Tyr Tyr Cys Ala Val 90 Thr íle Phe Gly val 95 Val
íle íle Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110 <210> 13 <211>322 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga agtgatttag gctggtttca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccaaat tacaccgtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagccg cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatagtt accctctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa ac 322 <210> 14 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 14 Asp Xle Gin 1 Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg val Thr 20 íle Thr Cys Arg Ala 25 Ser Gin Gly íle Arg 30 Ser Asp
Leu Gly Trp 35 Phe Gin Gin Lys pro • 40 Gly Lys Ala Pro Lys 45 Arg Leu íle
Tyr Ala 50 Ala Ser Lys Leu Hĺb 55 Arg Gly Val Pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly
Ser 65 Gly Ser Gly Thr Glu 70 Phe Thr Leu Thr íle 75 Ser Arg Leu Gin Pro 80
Glu Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Leu Gin 90 His Asn Ser Tyr Pro 95 Leu
Thr Phe Gly Gly 100 Gly Thr Lys val Glu 105 íle Lys
<210> 15 <211> 376 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 15 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtat cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatctg 300 ggctacggtg acttttacta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360 gtcaccgtct cctcag <210> 16 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens
376
<400> 16
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp val
35 40 45
Ser Ala íle Ser Gly Ser Gly Gly íle Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Leu Gly Tyr Gly Asp Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 17 <211>279 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 caggagacag agtcaccatc acttgccggg caagtcagag cattagtacc tttttaaatt 60 ggtatcagca gaaaccaggg aaagccccta aactcctgat ccatgttgca tccagtttac 120 aaggtggggt cccatcaagg ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc actctcacca 180 tcagcagtct gcaacctgaa gattttgcaa cttactactg tcaacagagt tacaatgccc 240 cactcacttt cggcggaggg accaaggtgg agatcaaac 279 <210> 18 <211> 92 <212> PRT <213 > Homo sapiens <400> 18
Gly 1 Asp Arg Val Thr 5 íle Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser íle Ser Thr
10 15
Phe Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
20 25 30
íle His Val Ala Ser Ser Leu Gin Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
35 40 45
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr íle Ser Ser Leu Gin
50 55 60
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Asn Ala Pro
65 70 75 80
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu íle Lys
90 <210> 19 15 <211>341 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 19 cccaggactg gtgaagcctt cggagaccct gtccctcacc tgcactgtct ctggtggctc 60 catcagtagt tactactgga gttggatccg gcagccccca gggaagggac tggagtggat 120 tgggtatatc tattacagtg ggagcaccaa ctacaacccc tccctcaaga gtcgagtcac 180 catatcagta gacacgtcca agaaccagtt ctccctgaag ctgagttctg tgaccgctgc 240 ggacacggcc gtgtattact gtgccaggac gtatagcagt tcgttctact actacggtat 300 ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca g 341 <210>20 <211>113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20
Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser 20 íle Ser Ser Tyr Tyr 25 Trp Ser Trp íle Arg 30 Gin Pro
Pro Gly Lys 35 Gly Leu Glu Trp íle 40 Gly Tyr íle Tyr Tyr 45 Ser Gly Ser
Thr Asn 50 Tyr Asn Pro Ser Leu 55 Lys Ser Arg Val Thr 60 íle Ser Val Asp
Thr 65 Ser Lys Asn Gin Phe 70 Ser Leu Lys Leu Ser 75 Ser Val Thr Ala Ala 80
Asp Thr Ala Val Tyr 85 Tyr Cys Ala Arg Thr 90 Tyr Ser Ser Ser Phe 95 Tyr
Tyr Tyr Gly Met 100 Asp Val Trp Gly Gin 105 Gly Thr Thr Val Thr 110 Val Ser
Ser <210> 21 <211> 274 <212>DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> modifikovaná báza <222> (240) <223> a, c, t, g, iná alebo neznáma <400> 21 agagccaccc tctcctgtag ggccagtcag agtgttcgcg gcaggtactt agcctggtac 60 cagcagaaac ctggccaggc tcccaggctc ctcatctatg gtgcatccag cagggccact 120 ggcatcccag acaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcactct caccatcagc 180 agactggagc ctgaagattt tgcagtgttt tactgtcagc agtatggtag ttcacctcgn. 240 acgttcggcc aagggaccaa ggtggaaatc aaac 274 <210> 22 <211> 91 <212>PRT <213> Homo sapiens
<400> 22 Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Arg Gly Arg Tyr
Arg 1 Ala Thr Leu Ser 5
10 15
Leu Ala Trp Tyr 20 Gin Gin Lys Pro Gly 25 Gin Ala Pro Arg Leu 30 Leu íle
Tyr Gly Ala 35 Ser Ser Arg Ala Thr 40 Gly íle Pro Asp Arg 45 Phe Ser Gly
Ser Gly 50 Ser Gly Thr Asp Phe 55 Thr Leu Thr íle Ser 60 Arg Leu Glu Pro
Glu 65 Asp Phe Ala Val Phe 70 Tyr Cys Gin Gin Tyr 75 Gly Ser Ser Pro Arg 80
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu íle Lys
90 <210> 23 <211>367 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 23 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacčtttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attactggga gtggtggtag tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa caegctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcca 300 gggactacgg tgattatgag ttggttcgac ccctggggoc agggaaccct ggtcaccgtc 360 5 tcctcag 367 <210> 24 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly íle Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Pro Gly Thr Thr Val íle Met Ser Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 <210> 25 <211> 320 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 25 gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg 60 gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt 120 ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca 180 gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga 240 aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga 300 gcttcaacag gggagagtgt 320 <210> 26 20 <211>106 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 26
Thr 1 Val Ala Ala Pro Ser Val 5 Phe íle Phe 10 Pro Pro Ser Asp Glu 15 Gin
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105 <210> 27 <211>978 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 27 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60 agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cagctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 240 tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 300 aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 360 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 420 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 480 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 540 gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 600 aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 660 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 720 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 780 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 840 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 900 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 960 tccctgtctc cgggtaaa 978 <210>28 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 28 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
Ala 1 Ser Thr Lys Gly 5
10 15
Ser Thr Ser Glu 20 Ser Thr Ala Ala Leu 25 Gly Cys Leu val Lys 30 Asp Tyr
Phe Pro Glu 35 Pro Val Thr Val Ser 40 Trp Asn Ser Gly Ala 45 Leu Thr Ser
Gly Val 50 His Thr Phe Pro Ala 55 Val Leu Gin Ser ser 60 Gly Leu Tyr Ser
Leu 65 Ser Ser Val Val Thr 70 Val Pro Ser Ser Asn 75 Phe Gly Thr Gin Thr 80
Tyr Thr Cys Asn Val 85 Asp His Lys Pro Ser 90 Asn Thr Lys Val Asp 95 Lys
Thr Val Glu Arg 100 Lys Cys Cys Val Glu 105 Cys Pro Pro Cys Pro 110 Ala Pro
Pro Val Ala 115 Gly Pro Ser Val Phe 120 Leu Phe Pro Pro Lys 125 Pro Lys Asp
Thr Leu 130 Met íle Ser Arg Thr 135 Pro Glu Val Thr Cys 140 Val Val Val Asp
Val 145 Ser His Glu Asp Pro 150 Glu Val Gin Phe Asn 155 Trp Tyr Val Asp Gly 160
Val Glu Val His Asn 165 Ala Lys Thr Lys Pro 170 Arg Glu Glu Gin Phe 175 Asn
Ser Thr Phe Arg 180 Val Val Ser Val Leu 185 Thr Val Val His Gin 190 Asp Trp
Leu Asn Gly 195 Lys Glu Tyr Lys Cys 200 Lys Val Ser Asn Lys 205 Gly Leu Pro
Ala Pro 210 íle Glu Lys Thr íle 215 Ser Lys Thr Lys Gly 220 Gin Pro Arg Glu
Pro 225 Gin Val Tyr Thr Leu 230 Pro Pro Ser Arg Glu 235 Glu Met Thr Lys Asn 240
Gin Val Ser Leu Thr 245 Cys Leu Val Lys Gly 250 Phe Tyr Pro Ser Asp 255 íle
Ala Val Glu Trp 260 Glu Ser Asn Gly Gin 265 Pro Glu Asn Asn Tyr 270 Lys Thr
Thr Pro Pro 275 Met Leu Asp Ser Asp 280 Gly Ser Phe Phe Leu 285 Tyr Ser Lys
Leu Thr 290 Val Asp Lys Ser Arg 295 Trp Gin Gin Gly Asn 300 Val Phe Ser Cys
Ser 305 Val Met His Glu Ala 310 Leu His Asn His Tyr 315 Thr Gin Lys Ser Leu 320
Ser Leu Ser Pro Gly 325 Lys
<210> 29 <211> 296 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 29 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaago ctggagggtc cctgagactc SO tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactactaca tgagctggat ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtagta gtggtagtac catatactac 180 gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296 <210> 30 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 3C Gin Val 1 1 Gin Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Lys Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Asp Tyr
Tyr Met Ser 35 Trp íle Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val
Ser Tyr 50 íle Ser Ser Ser Gly 55 Ser Thr íle Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Val
Lys 65 Gly Arg Phe Thr íle 70 Ser Arg Asp Asn Ala 75 Lya Asn Ser Leu Tyr 80
Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys
Ala Arg <210> 31 <211> 296 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 31 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaga 296 <210> 32 <211> 98 <212>PRT <213> Homo sapiens <400> 32
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Ser Tyr
Ala Met Ser 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val
Ser Ala 50 íle ser Gly Ser Gly 55 Gly Ser Thr Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Val
Lys 65 Gly Arg Phe Thr íle 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80
Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys
Ala Lys <210>33 <211> 296 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 33 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggggac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctctggtgg ctccatcagc agtagtaact ggtggagttg ggtccgccag 120 cccccaggga aggggctgga gtggattggg gaaatctatc atagtgggag caccaactac 180 aacccgtccc tcaagagtcg agtcaccata tcagtagaca agtccaagaa ccagttctcc 240 ctgaagctga gctctgtgac cgccgcggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296 <210> 34 <211> 98 <212> PRT <213 > Homo sapiens
<400> 34
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser íle Ser Ser Ser
20 25 30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
íle Gly Glu íle Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr íle Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gin Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 35 <211> 293 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 35 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aga 293 <210> 36 20 <211>97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36
Gin 1 Val Gin Leu Gin 5 Glu Ser Gly Pro Gly 10 Leu Val Lys Pro Ser 15 Glu
Thr Leu Ser Leu 20 Thr Cys Thr Val Ser 25 Gly Gly Ser íle Ser 30 Ser Tyr
Tyr Trp Ser 35 Trp íle Arg Gin Pro 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp íle
Gly Tyr 50 íle Tyr Tyr Ser Gly 55 Ser Thr Asn' Tyr Asn 60 Pro Ser Leu Lys
Ser 65 Arg Val Thr íle Ser 70 Val Asp Thr Ser Lys 75 Asn Gin Phe Ser Leu 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
90 95
Arg <210> 37 <211>290 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 37 gaaattgtgt ctctcctgca cctggccagg gacaggttca cctgaagatt tgacgcagtc gggccagtca ctcccaggct gtggcagtgg ttgcagtgta tccaggcacc gagtgttagc cctcatctat gtctgggaca ttactgtcag ctgtctttgt agcagctact ggtgcatcca gacttcactc cagtatggta ctccagggga tagcctggta gcagggccac tcaccatcag gctcacctcc
aagagccacc 60
ccagcagaaa 120
tggcatccca 180
cagactggag 240
290
<210> 38 10 <211>96 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 36 Glu íle 1 1 Val Leu Thr 5 Gin Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr 20 Leu Ser Cys Arg Ala 25 Ser Gin Ser Val Ser 30 Ser Ser
Tyr Leu Ala 35 Trp Tyr Gin Gin Lys 40 Pro Gly Gin Ala Pro 45 Arg Leu Leu
íle Tyr 50 Gly Ala Ser Ser Arg 55 Ala Thr Gly íle Pro 60 Asp Arg Phe Ser
Gly 65 Ser Gly Ser Gly Thr 70 Asp Phe Thr Leu Thr 75 íle Ser Arg Leu Glu 80
Pro Glu Asp Phe Ala 85 Val Tyr Tyr Cys Gin 90 Gin Tyr Gly Ser ser 95 Pro
<210>39 <211>288 <212>DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> modifikovaná báza <222> (288) <223> a, c, t, g, iná alebo neznáma <400> 39 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatagtt accctccn 288 <210>40 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40
Asp 1 íle Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr 20 íle Thr Cys Arg Ala 25 Ser Gin Gly íle Arg 30 Asn Asp
Leu Gly Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Gly Lys Ala Pro Lys 45 Arg Leu íle
Tyr Ala 50 Ala Ser Ser Leu Gin 55 Ser Gly val Pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly
Ser 65 Gly Ser Gly Thr Glu 70 Phe Thr Leu Thr íle 75 Ser Ser Leu Gin Pro 80
Glu Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Leu Gin 90 His Asn Ser Tyr Pro 95 Pro
<210> 41 <211> 288 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctcch 288 <210> 42 <211> 96 <212>PRT <213> Homo sapiens
<400> 42 Asp íle 1 1 Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr 20 íle Thr Cys Arg Ala 25 Ser Gin Ser íle Ser 30 Ser Tyr
Leu Asn Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Gly Lys Ala Pro Lys 45 Leu Leu íle
Tyr Ala 50 Ala Ser Ser Leu Gin 55 Ser Gly Val Pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly
Ser 65 Gly Ser Gly Thr Asp 70 Phe Thr Leu Thr íle 75 Ser Ser Leu Gin Pro 80
Glu Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Gin Gin 90 Ser Tyr Ser Thr Pro 95 Pro
<210> 43 <211> 293 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 43 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc 120 gccgggaagg gactggagtg gattgggcgt atctatacca gtgggagcac caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatgtca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aga 293 <210>44 10 <211>97 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 44 Glu Ser Gly Pro Gly 10 Leu Val Lys Pro Ser 15 Glu
Gin 1 Val Gin Leu Gin 5
Thr Leu Ser Leu 20 Thr Cys Thr Val Ser 25 Gly Gly Ser íle Ser 30 Ser Tyr
Tyr Trp Ser 35 Trp íle Arg Gin Pro 40 Ala Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp íle
Gly Arg íle 50 Tyr Thr Ser Gly 55 Ser Thr Asn Tyr Asn 60 Pro Ser Leu Lys
Ser 65 Arg Val Thr Met Ser Val 70 Asp Thr Ser Lys Asn 75 Gin Phe Ser Leu 80
Lys Leu Ser Arg <210> 45 <211> 470 <212>PRT Ser Val 85 Thr Ala Ala Asp Thr 90 Ala Val Tyr Tyr Cys 95 Ala
<213> Homo sapiens <400> 45
Met Glu Phe Gly 1 Leu Ser 5 Trp Leu Phe Leu Val Ala íle Leu Lys Gly
10 15
Val Gin Cys Glu 20 Val Gin Leu Leu Glu Ser 25 Gly Gly Gly Leu Val 30 Gin
Pro Gly Gly Ser 35 Leu Arg Leu Ser 40 Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr 45 Phe
ser Ser Tyr Ala 50 Met Asn Trp 55 Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly 60 Leu
Glu Trp Val Ser 65 Ala íle 70 Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Phe Tyr 75 Ala 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg 85 Phe Thr íle Ser 90 Arg Asp Asn Ser Arg 95 Thr
Thr Leu Tyr Leu 100 Gin Met Asn Ser Leu Arg 105 Ala Glu Asp Thr Ala 110 Val
Tyr Tyr Cys Ala 115 Lys Asp Leu Gly 120 Trp Ser Asp Ser Tyr Tyr Tyr 125 Tyr
Tyr Gly Met Asp 130 Val Trp Gly 135 Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 140 Ser
Ala Ser Thr Lys 145 Gly Pro 150 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser 155 Arg 160
Ser Thr Ser Glu Ser Thr 165 Ala Ala Leu Gly 170 Cys Leu Val Lys Asp 175 Tyr
Phe Pro Glu Pro 180 Val Thr Val Ser Trp Asn 185 Ser Gly Ala Leu Thr 190 Ser
Gly Val His Thr 195 Phe Pro Ala val 200 Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr 205 Ser
Leu Ser Ser Val 210 Val Thr Val 215 Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin 220 Thr
Tyr Thr Cys Asn 225 Val Asp 230 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 235 Lys 240
Thr Val Glu Arg Lys Cys 245 Cys Val Glu Cys 250 Pro Pro Cys Pro Ala 255 Pro
Pro Val Ala Gly 260 Pro Ser Val Phe Leu Phe 265 Pro Pro Lys Pro Lys 270 Asp
Thr Leu Met íle 275 Ser Arg Thr Pro 280 Glu Val Thr Cys Val Val Val 285 Asp
Val Ser His Glu 290 Asp Pro Glu 295 Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp 300 Gly
Val 305 Glu Val His Asn Ala 310 Lys Thr Lys Pro Arg 315 Glu Glu Gin Phe Asn 320
Ser Thr Phe Arg val 325 Val Ser Val Leu Thr 330 Val Val His Gin Asp 335 Trp
Leu Asn Gly Lys 340 Glu Tyr Lys Cys Lys 345 Val Ser Asn Lys Gly 350 Leu Pro
Ala Pro íle 355 Glu Lys Thr íle Ser 360 Lys Thr Lys Gly Gin 365 Pro Arg Glu
Pro Gin 370 Val Tyr Thr Leu Pro 375 Pro Ser Arg Glu Glu 380 Met Thr Lys Asn
Gin 385 Val Ser Leu Thr Cys 390 Leu val Lys Gly Phe 395 Tyr Pro Ser Asp íle 400
Ala Val Glu Trp Glu 405 Ser Asn Gly Gin Pro 410 Glu Asn Asn Tyr Lys 415 Thr
Thr Pro Pro Met 420 Leu Asp Ser Asp Gly 425 Ser Phe Phe Leu Tyr 430 Ser Lys
Leu Thr Val 435 Asp Lys Ser Arg Trp 440 Gin Gin Gly Asn Val 445 Phe Ser Cys
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 46 5 <211>470 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46
Met 1 Glu Phe Gly Leu 5 Ser Trp Leu Phe Leu 10 Val Ala íle Leu Lys 15 Gly
Val Gin Cys Glu 20 Val Gin Leu Leu Glu 25 Ser Gly Gly Gly Leu 30 Val Gin
Pro Gly Gly 35 Ser Leu Arg Leu Ser 40 Cys Ala Ala Ser Gly 45 Phe Thr Phe
Ser Ser Tyr 50 Ala Met Ser Trp 55 Val Arg Gin Ala Pro 60 Gly Lys Gly Leu
Glu 65 Trp Val Ser Ala íle 70 Ser Gly Ser Gly Gly 75 Ser Thr Tyr Tyr Ala 80
Asp Ser Val Lys Gly 85 Arg Phe Thr íle Ser 90 Arg Asp Asn Ser Lys 95 Asn
Thr Leu Tyr Leu 100 Gin Met Asn Ser Leu 105 Arg Ala Glu Asp Thr 110 Ala Val
Tyr Tyr Cys 115 Ala Lys Gly Tyr Ser 120 Ser Gly Trp Tyr Tyr 125 Tyr Tyr Tyr
Tyr Gly 130 Met Asp Val Trp Gly 135 Gin Gly Thr Thr Val 140 Thr Val Ser Ser
Ala 145 Ser Thr Lys Gly Pro 150 Ser Val Phe Pro Leu 155 Ala Pro Cys Ser Arg 160
Ser Thr Ser Glu Ser 165 Thr Ala Ala Leu Gly 170 Cys Leu Val Lys Asp 175 Tyr
Phe Pro Glu Pro 180 val Thr Val Ser Trp 195 Asn ser Gly Ala Leu 190 Thr Ser
Gly Val His 195 Thr Phe Pro Ala Val 200 Leu Gin Ser Ser Gly 205 Leu Tyr Ser
Leu Ser 210 Ser Val Val Thr Val 215 Pro Ser Ser Asn Phe 220 Gly Thr Gin Thr
Tyr 225 Thr Cys Asn Val Asp 230 His Lys Pro Ser Asn 235 Thr Lys Val Asp Lys 240
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 260 265 270
Thr Leu Met íle Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn
305 310 315 320
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 340 345 350
Ala Pro íle Glu Lys Thr íle Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu 355 360 365
Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 370 375 380
Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp íle
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Met 420 Leu Asp Ser Asp Gly 425 Ser Phe Phe Leu Tyr 430 Ser Lys
Leu Thr Val 435 Asp Lys Ser Arg Trp 440 Gin Gin Gly Asn Val 445 Phe Ser Cys
Ser Val 450 Met His Glu Ala Leu 455 His Asn His Tyr Thr 460 Gin Lys Ser Leu
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 <210> 47 <211> 236 <212>PRT <213> Homo sapiens c400> 47
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 15 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp íle Gin Met Thr Gin Phe Pro Ser Ser 20 25 30
Leu Ser Ala 35 Ser Val Gly Asp Arg 40 Val Thr íle Thr Cys 45 Arg Ala Ser
Gin Gly 50 íle Arg Asn Asp Leu 55 Gly Trp Tyr Gin Gin 60 Lys Pro Gly Lys
Ala 65 Pro Lys Arg Leu íle 70 Tyr Ala Ala Ser Arg 75 Leu His Arg Gly Val 80
Pro Ser Arg Phe Ser 85 Gly Ser Gly Ser Gly 90 Thr Glu Phe Thr Leu 95 Thr
íle Ser Ser Leu 100 Gin Pro Glu Asp Phe 105 Ala Thr Tyr Tyr Cys 110 Leu Gin
His Asn Ser 115 Tyr Pro Cys Ser Phe 120 Gly Gin Gly Thr Lys 125 Leu Glu íle
Lys Arg 130 Thr Val Ala Ala Pro 135 Ser val Phe íle Phe 140 Pro Pro Ser Asp
Glu 145 Gin Leu Lys Ser Gly 150 Thr Ala Ser Val Val 155 Cys Leu Leu Asn Asn 160
Phe Tyr Pro Arg Glu 165 Ala Lys Val Gin Trp 170 Lys val Asp Asn Ala 175 Leu
Gin Ser Gly Asn 180 Ser Gin Glu Ser Val 185 Thr Glu Gin Asp Ser 190 Lys Asp
Ser Thr Tyr 195 Ser Leu Ser Ser Thr 200 Leu Thr Leu Ser Lys 205 Ala Asp Tyr
Glu Lys 210 His Lys Val Tyr Ala 215 Cys Glu Val Thr His 220 Gin Gly Leu Ser
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235 <210> 48 <211> 236 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48
Met 1 Asp Met Arg Val 5 Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp íle Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr íle Thr Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gin Gly íle Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys
50 55 60
.Ala Pro Lys Arg Leu íle Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
85 90 95
íle Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin
100 105 110
His Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu íle
115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe íle Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 49 <211>470 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu 10 val Ala íle íle Lys 15 Gly
1 5
Val Gin Cys Gin Ala 20 Gin Leu Val Glu Ser 25 Gly Gly Gly Leu 30 Val Lys
Pro Gly Gly 35 Ser Leu Arg Leu Ser 40 Cys Ala Ala Ser Gly 45 Phe Thr Phe
Ser Asp Tyr 50 Tyr Met Ser Trp 55 Ue Arg Gin Ala Pro 60 Gly Lys Gly Leu
Glu Trp Val 65 Ser Tyr íle Ser 70 Ser ser Gly Ser Thr 75 Arg Asp Tyr Ala 80
Asp Ser Val Lys Gly Θ5 Arg Phe Thr íle Ser 90 Arg Asp Asn Ala Lys 95 Asn
Ser Leu Tyr Leu Gin 100 Met Asn Ser Leu Arg 105 Ala Glu Asp Thr 110 Ala Val
Tyr Tyr Cys 115 Val Arg Asp Gly Val 120 Glu Thr Thr Phe Tyr 125 Tyr Tyr Tyr
Tyr Gly Met 130 Asp Val Trp Gly 135 Gin Gly Thr Thr Val 140 Thr Val Ser Ser
Ala Ser Thr 145 Lys Gly Pro Ser 150 Val Phe Pro Leu Ala 155 Pro Cys Ser Arg 160
Ser Thr Ser Glu Ser 165 Thr Ala Ala Leu G.ly 170 Cys Leu Val Lys Asp 175 Tyr
Phe Pro Glu Pro Val 180 Thr Val Ser Trp Asn 185 Ser Gly Ala Leu 190 Thr Ser
Gly Val His 195 Thr Phe Pro Ala Val 200 Leu Gin Ser Ser Gly 205 Leu Tyr Ser
Leu Ser Ser 210 Val Val Thr Val 215 Pro Ser Ser Asn Phe 220 Gly Thr Gin Thr
Tyr Thr Cys 225 Asn Val Asp His 230 Lys Pro Ser Asn Thr 235 Lys Val Asp Lys 240
Thr Val Glu Arg Lys 245 Cys Cys Val Glu Cys 250 Pro Pro Cys Pro Ala 255 Pro
Pro Val Ala Gly Pro 260 Ser Val Phe Leu Phe 265 Pro Pro Lys Pro 270 Lys Asp
Thr Leu Met 275 íle Ser Arg Thr Pro 280 Glu Val Thr Cys Val 285 Val val Asp
Val Ser His 290 Glu Asp Pro Glu 295 Val Gin Phe Asn Txp 300 Tyr Val Asp Gly
Val 305 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 310 Pro Arg Glu 315 Glu Gin Phe Asn 320
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val val His Gin Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
340 345 350
Ala Pro íle Glu Lys Thr íle Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
370 375 380
Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp íle
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser LyB
420 425 430
Leu Thr val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pró Gly Lys
465 470 <210> 50 5 <211>473 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala íle íle Lys Gly
1 5 10 15
Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp íle Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp val Ser Tyr íle Ser Ser Ser Gly Ser Thr íle Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr íle Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg 115 Val Leu Arg Phe Leu Glu Trp Leu Leu Tyr Tyr
120 125
Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr
130 135 140
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
145 150 155 160
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
165 170 175
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
180 185 190
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly
195 200 205
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly
210 215 220
Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
225 230 235 240
val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys
245 250 255
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met íle Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
275 280 285
Val Val Asp val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr
290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
305 310 315 320
Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val val Ser Val Leu Thr Val Val His
325 330 335
Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
Gly Leu Pro Ala Pro íle Glu Lys Thr íle Ser Lys Thr Lys Gly Gin
355 360 365
Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
370 375 380
Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385 390 395 400
Ser Asp íle Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn
405 410 415
Tyr * Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
420 425 430
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 <210> 51 <211> 236 <212>PRT <213> Homo sapiens
<400> 51 Trp
Met 1 Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu 15
5 10
Phe Pro Gly Ala 20 Arg Cys Asp. íle Gin 25 Met Thr Gin Ser Pro 30 Ser Ser
Leu Ser Ala 35 Ser Val Gly Asp Arg 40 Val Thr Phe Thr Cys 45 Arg Ala Ser
Gin Asp 50 íle Arg Arg Asp Leu 55 Gly Trp Tyr Gin Gin 60 Lys Pro Gly Lys
Ala 65 Pro Lys Arg Leu íle 70 Tyr Ala Ala Ser Arg 75 Leu Gin. Ser Qiy Val 80
Pro Ser Arg Phe Ser 85 Gly Ser Gly Ser Gly 90 Thr Glu Phe Thr Leu 95 Thr
íle Ser Ser Leu 100 Gin Pro Glu Asp Phe 105 Ala Thr Tyr Tyr Cys 110 Leu Gin
His Asn Asn 115 Tyr Pro Arg Thr Phe 120 Gly Gin Gly Thr Glu 125 val Glu íle
íle Arg 130 Thr Val Ala Ala Pro 135 Ser Val Phe íle Phe 140 Pro Pro Ser Asp
Glu 145 Gin Leu Lys Ser Gly 150 Thr Ala Ser Val Val 155 Cys Leu Leu Asn Asn 160
Phe Tyr Pro Arg Glu 165 Ala Lys Val Gin Trp 170 Lys Val Asp Asn Ala 175 Leu
Gin Ser Gly Asn 180 Ser Gin Glu Ser Val 185 Thr Glu Gin Asp Ser 190 Lys Asp
Ser Thr Tyr 195 Ser Leu Ser Ser Thr 200 Leu Thr Leu Ser Lys 205 Ala Asp Tyr
Glu Lys 210 His Lys Val Tyr Ala 215 Cys Glu Val Thr His 220 Gin Gly Leu Ser
Ser 225 Pro Val Thr Lys Ser 230 Phe Asn Arg Gly Glu 235 Cys
<210> 52 <211> 236 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp íle Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr íle Thr Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gin Gly íle Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Arg Leu íle Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
85 90 95
íle Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin
100 105 110
His Asn Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu íle
115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe íle Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 53
<211> 326
<212>DNA
<213> Umelá sekvencia
<220>
<223> Popis umelej sekvencie: Kanonická sekvencia
<220>
<221> modifikovaná báza
<222> (289) <223> a, c, t, g, iná alebo neznáma <400> 53 gacatccaga tgacccagty tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 wtcacttgcc gggcaagtca ggrcattaga mrtgatttag gctggtwtca gcagaaacca 120 gggaaagcyc ctaagcgcct gatctatgct gcatccmrwt trcammgwgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcmg cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtytacar cataatartt aycckybsns kttyggcsrr 300 gggaccrags tggaratcaw acgaac 326 <210 54 <211> 322 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220 <223> Popis umelej sekvencie: Kanonická sekvencia <400> 54 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgyaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagy asctwtttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaarctect gatcyatgyt gcatccagtt trcaargtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacartr ccccayychc tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa ac 322 <210>55 <211>325 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220 <223> Popis umelej sekvencie: Kanonická sekvencia <220 <221> modifikovaná báza <222> (291) <223> a, c, t, g, iná alebo neznáma <400> 55 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgya gggccagtca gagtgttmgc rgcagstact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgtw ttactgtcag cagtatggta gytcacctcs nacgttcggc 300 caagggacca aggtggaaat caaac 325 <210> 56 <211> 376 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220 <223> Popis umelej sekvencie: Kanonická sekvencia <400> 56 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacyttcagt gactactaya tgagctggat ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggartg ggtttcatac attagtagta gtggtagtac cakakactac 180 gcagactctg tgaagggccc attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgy gagagatgga 300 gtggaaacta ctttttacta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360 gtcaccgtct cctcag 376 <210> 57 <211> 358 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: Kanonická sekvencia <220>
<221> modifikovaná báza <222> (337) <223> a, c, t, g, iná alebo neznáma <400> 57 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt arttactact ggagctggat ccggcagccc gccgggaagg gactggagtg gattgggcgt atctatacca gtgggagcmc caactacaac ccctccctca agagtcgagt caccatgtca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg aagctgarct ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcggt aacgattttt ggagtggtta ttatctttga ctactggggc cagrganccc tggtcaccgt ctcctcag <210> 58 <211> 418 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: Kanonická sekvencia <400> 58 caggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc tcctgtrcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgarctgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagst attastggka gtggtggtab yacatwctac gcagactccg tgaagggccc gttcaccatc tccagagaca attccargam cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatctk ggctrsksyg actyttacta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggacyacg gtgattatga gttggttcga cccctggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcag <210> 59 <211> 364 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220 <223> Popis umelej sekvencie: Kanonická sekvencia <400> 59 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagytggat ccggcagccc ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caactacaac ccctccctca agagtcgact caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg aagctgagyt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgccag gacgtatagc agttcgttct actactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc t cag <210 60 <211> 15 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: Gly-Ser Linker <400> 60
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly .Gly Gly Ser 15 10 15
Protokoly o uložení vzoriek biologického materiálu
Hybridom označený v opise vynálezu 4.9.2.
Bol uložený v súlade s Budapeštianskou zmluvou dňa 12. 12. 2000 pod prístupovým číslom PTA 2789 v Americkej zbierke mikroorganizmov ATCC s adresou:
American Type Culture Collection 10801 University Boulevard Manassas, Virginia 20110-2209 United States of America
Vzorku uloženého biologického materiálu je možné sprístupniť len nezávislému expertovi v súlade so znením §5 odst. 3 a 4 zákona 206/2000 Zb.
Hybridom označený v opise vynálezu 4.17.3.
Bol uložený v súlade s Budapeštianskou zmluvou dňa 12. 12. 2000 pod prístupovým číslom PTA 2793 v Americkej zbierke mikroorganizmov ATCC s adresou:
American Type Culture Collection 10801 University Boulevard Manassas, Virginia 20110-2209 United States of America
Vzorku uloženého biologického materiálu je možné sprístupniť len nezávislému expertovi v súlade so znením §5 odst. 3 a 4 zákona 206/2000 Zb.
Hybridom označený v opise vynálezu 2.12.1.
Bol uložený v súlade s Budapeštianskou zmluvou dňa 12. 12. 2000 pod prístupovým číslom PTA 2792 v Americkej zbierke mikroorganizmov ATCC s adresou:
American Type Culture Collection 10801 University Boulevard Manassas, Virginia 20110-2209 United States of America
Vzorku uloženého biologického materiálu je možné sprístupniť len nezávislému expertovi v súlade so znením §5 odst. 3 a 4 zákona 206/2000 Zb.
Hybridom označený v opise vynálezu 2.13.2
Bol uložený v súladu s Budapeštianskou zmluvou dňa 12. 12. 2000 pod prístupovým číslom PTA 2788 v Americkej zbierke mikroorganizmov ATCC s adresou:
American Type Culture Collection 10801 University Boulevard Manassas, Virginia 20110-2209 United States of America
Vzorku uloženého biologického materiálu je možné sprístupniť len nezávislému expertovi v súlade so znením §5 odst. 3 a 4 zákona 206/2000 Zb.
Hybridom označený v opise vynálezu 2.14.3
Bol uložený v súlade s Budapeštianskou zmluvou dňa 12. 12. 2000 pod prístupovým číslom PTA 2790 v Americkej zbierke mikroorganizmov ATCC s adresou:
American Type Culture Collection 10801 University Boulevard Manassas, Virginia 20110-2209 United States of America
Vzorku uloženého biologického materiálu je možné sprístupniť len nezávislému expertovi v súlade so znením §5 odst. 3 a 4 zákona 206/2000 Zb.
Hybridom označený v opise vynálezu 3.1.1.
Bol uložený v súlade s Budapeštianskou zmluvou dňa 12. 12. 2000 pod prístupovým číslom PTA 2791 v Americkej zbierke mikroorganizmov ATCC s adresou:
American Type Culture Collection 10801 University Boulevard Manassas, Virginia 20110-2209 United States of America
Vzorku uloženého biologického materiálu je možné sprístupniť len nezávislému expertovi v súlade so znením §5 odst. 3 a 4 zákona 206/2000 Zb.

Claims (34)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Humánna monoklonálna protilátka alebo jej antigén-väzobná časť, ktorá sa špecificky viaže na receptor inzulínu podobného rastového faktora I (IGF-IR), pričom uvedená protilátka alebo jej časť inhibuje väzbu IGF-I alebo IGF-II na IGF-IR a inhibuje rast nádoru in vivo; a pričom uvedená protilátka alebo jej antigén-väzobná časť protilátky zahrnuje aminokyselinové sekvencie CDR1, CDR2 a CDR3 z variabilného úseku ťažkého reťazca a aminokyselinové sekvencie CDR1, CDR2 a CDR3 z variabilného úseku ľahkého reťazca, pričom uvedený ťažký reťazec a ľahký reťazec sú:
    a) ťažký reťazec a ľahký reťazec protilátky 2.13.2 s ATCC depozitným číslom PTA-2788; alebo
    b) ťažký reťazec a ľahký reťazec protilátky 4.9.2 s ATCC depozitným číslom PTA-2789; alebo
    c) ťažký reťazec zahrnujúci variabilný úsek majúci aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 8 a ľahký reťazec zahrnujúci variabilný úsek majúci aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 6; alebo
    d) ťažký reťazec zahrnujúci variabilný úsek majúci aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 16 a ľahký reťazec zahrnujúci variabilný úsek majúci aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 14; alebo
    e) ťažký reťazec zahrnujúci aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 45 bez signálnej sekvencie a ľahký reťazec zahrnujúci aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 47 bez signálnej sekvencie.
  2. 2. Protilátka alebo jej antigén-väzobná časť podľa nároku 1, pričom IGF-IR je humánny.
  3. 3. Protilátka alebo jej antigén-väzobná časť podľa nároku 1 alebo 2, kde protilátka alebo antigén-väzobná časť protilátky má aspoň jednu vlastnosť vybranú zo skupiny pozostávajúcej z vlastností:
    a) neviaže sa na IGF-IR psa alebo králika;
    b) viaže sa na IGF-IR cynomológnej opice alebo makaka rhesus, ale neviaže sa na IGF-IR marmoseta;
    c) má selektivitu pre IGF-IR, ktorá je aspoň 50-krát väčšia než je jej selektivita pre inzulínový receptor;
    d) spôsobuje miznutie IGF-IR z bunkového povrchu, keď je inkubovaná s bunkou exprimujúcou IGF-IR;
    e) inhibuje IGF-IR-indukovanú fosforyláciu tyrozínu;
    f) viaže sa na IGF-IR s Kd 8 x 10'9 M alebo menšou; a
    g) má KofTpre IGF-IR 10'4 s'1 alebo menšiu.
  4. 4. Protilátka alebo jej antigén-väzobná časť podľa nároku 3, kde protilátka alebo jej antigén-väzobná časť má všetky vymenované vlastnosti.
  5. 5. Protilátka alebo jej antigén-väzobná časť podľa nároku 1 alebo 2, kde protilátka alebo jej antigén-väzobná časť má aspoň jednu z vlastností vybranú zo skupiny pozostávajúcej z vlastností:
    a) skrížené kompetuje o väzbu na IGF-IR s protilátkou 2.13.2 alebo 4.9.2;
    b) viaže sa na rovnaký epitop IGF-IR ako protilátka 2.13.2 alebo 4.9.2;
    c) viaže sa na rovnaký antigén, ktorý je viazaný protilátkou 2.13.2 alebo 4.9.2;
    d) viaže sa na IGF-IR v podstate s rovnakou hodnotou Kj ako protilátka 2.13.2 alebo 4.9.2; a
    e) viaže sa na IGF-IR v podstate s rovnakou rýchlosťou rozpadu ako protilátka 2.13.2 alebo 4.9.2.
  6. 6. Protilátka alebo jej antigén-väzobná časť podľa nároku 5, kde protilátka alebo jej antigén-väzobná časť má všetky vymenované vlastnosti.
  7. 7. Protilátka alebo jej antigén-väzobná časť podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 - 6, kde protilátka alebo jej antigén-väzobná časť inhibuje väzbu medzi IGF-IR a IGF-I alebo IGF-II s hodnotou IC5() menšou než 100 nM.
  8. 8. Protilátka alebo jej antigén-väzobná časť podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 - 7, kde protilátka alebo jej antigén-väzobná časť zahrnuje variabilný úsek ľahkého reťazca k, pričom sekvencia variabilného úseku ľahkého reťazca κ zahrnuje nie viac než desať aminokyselinových zmien z aminokyselinovej sekvencie kódovanej génom zárodočnej línie Vk A30.
  9. 9. Protilátka alebo jej antigén-väzobná časť podľa nároku 8, kde variabilný úsek ľahkého reťazca κ zahrnuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 6 alebo SEQ ID NO: 14, alebo aminokyselinovú sekvenciu majúcu vzhľadom na uvedené sekvencie 1 až 10 aminokyselinových inzercií, delécií alebo substitúcií.
  10. 10. Protilátka alebo jej antigén-väzobná časť podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, kde protilátka alebo jej antigén-väzobná časť zahrnuje variabilný úsek ťažkého reťazca, pričom sekvencia variabilného úseku zahrnuje nie viac než osem aminokyselinových zmien z aminokyselinovej sekvencie kódovanej génom zárodočnej línie VH DP47.
  11. 11. Protilátka alebo jej antigén-väzobná časť podľa nároku 10, kde variabilný úsek ťažkého reťazca obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 8 alebo SEQ ID NO: 16, alebo aminokyselinovú sekvenciu majúcu vzhľadom na uvedené sekvencie 1 až 10 aminokyselinových inzercií, delécií alebo substitúcií.
  12. 12. Protilátka alebo jej antigén-väzobná časť podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 11, ktorou je
    a) molekula imunoglobulínu G (IgG), IgM, IgE, IgA alebo IgD, alebo molekula z nej pochádzajúca, alebo
    b) fragment Fab, fragment F(ab')2, fragment Fv, jednoreťazcová protilátka, humanizovaná protilátka, chimérická protilátka alebo bišpecifická protilátka.
  13. 13. Protilátka podľa nároku 1, pričom protilátkou je 2.13.2 s ATCC depozitným číslom PTA-2788 alebo 4.9.2 s ATCC depozitným číslom PTA-2789.
  14. 14. Protilátka podľa nároku 1, pričom uvedená protilátka zahrnuje ťažký reťazec a ľahký reťazec, a pričom aminokyselinové sekvencie ťažkého reťazca a ľahkého reťazca sú:
    a) aminokyselinová sekvencia ťažkého reťazca a aminokyselinová sekvencia ľahkého reťazca z 4.9.2 s ATCC depozitným číslom PTA-2789; alebo
    b) aminokyselinová sekvencia ťažkého reťazca a aminokyselinová sekvencia ľahkého reťazca z 2.13.2 s ATCC depozitným číslom PTA-2788; alebo
    c) aminokyselinová sekvencia SEQ ID NO: 45 bez signálnej sekvencie a aminokyselinová sekvencia SEQ ID NO: 47 bez signálnej sekvencie.
  15. 15. Monoklonálna protilátka podľa nároku 1, pričom aminokyselinová sekvencia ťažkého reťazca zahrnuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 8 variabilného úseku alebo túto sekvenciu obsahujúcu najviac päť konzervatívnych substitúcií aminokyselín, a aminokyselinová sekvencia ľahkého reťazca obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 6 variabilného úseku alebo túto sekvenciu obsahujúcu najviac päť substitúcií aminokyselín.
  16. 16. Monoklonálna protilátka podľa nároku 15, pričom aminokyselinová sekvenciu ťažkého reťazca zahrnuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 8 variabilného úseku a aminokyselinová sekvencia ľahkého reťazca zahrnuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 6 variabilného úseku.
  17. 17. Humánna monoklonálna protilátka, ktorá sa špecificky viaže na IGF-IR, pričom ťažký reťazec uvedenej protilátky pozostáva z aminokyselinovej sekvencie SEQ ID NO: 45 bez signálnej sekvencie, a ľahký reťazec uvedenej protilátky pozostáva z aminokyselinovej sekvencie SEQ ID NO: 47 bez signálnej sekvencie.
  18. 18. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje protilátku alebo antigén-väzobnú časť protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 14 a farmaceutický prijateľný nosič.
  19. 19. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 18, vyznačujúca sa tým, že ďalej obsahuje antineoplázické, chemoterapeutické antiangiogénne alebo protinádorové činidlo.
  20. 20. Izolovaná bunková línia, ktorá produkuje protilátku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 14.
  21. 21. Bunková línia podľa nároku 20, ktorá produkuje protilátku 2.13.2 s ATCC depozitným číslom PTA-2788 alebo 4.9.2 s ATCC depozitným číslom PTA-2789, alebo protilátku, ktorá má rovnaké aminokyselinové sekvencie ako 2.13.2 alebo 4.9.2.
  22. 22. Izolovaná molekula nukleovej kyseliny, ktorá obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá kóduje ťažký reťazec alebo jeho antigén-väzobnú časť alebo ľahký reťazec alebo jeho antigén-väzobnú časť z protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 14.
  23. 23. Izolovaná molekula nukleovej kyseliny podľa nároku 22, kde molekula nukleovej kyseliny zahrnuje:
    a) sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu tri sekvencie CDR z ťažkého reťazca protilátky 2.13.2 s ATCC depozitným číslom PTA-2788 alebo 4.9.2 s ATCC depozitným číslom PTA-2789; alebo
    b) sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu ťažkého reťazca alebo jej antigén-väzobnú časť protilátky 2.13.2 s ATCC depozitným číslom PTA-2788 alebo 4.9.2 s ATCC depozitným číslom PTA-2789; alebo
    c) sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 8 alebo 16; alebo,
    d) sekvenciu nukleovej kyseliny SEQ ID NO: 7 alebo 15;
    kde molekula nukleovej kyseliny prípadne obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 28.
  24. 24. Izolovaná molekula nukleovej kyseliny podľa nároku 22, kde molekula nukleovej kyseliny zahrnuje:
    a) sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu tri sekvencie CDR z ľahkého reťazca protilátky 2.13.2 s ATCC depozitným číslom PTA-2788 alebo 4.9.2 s ATCC depozitným číslom PTA-2789; alebo
    b) sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu ľahkého reťazca alebo jej antigén-väzobnú časť protilátky 2.13.2 s ATCC depozitným číslom PTA-2788 alebo 4.9.2 s ATCC depozitným číslom PTA-2789; alebo
    c) sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 6 alebo 14; alebo,
    d) sekvenciu nukleovej kyseliny SEQ ID NO: 5 alebo 13;
    kde molekula nukleovej kyseliny prípadne obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 26.
  25. 25. Vektor zahrnujúci molekulu nukleovej kyseliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 22 až 24, kde vektor prípadne zahrnuje expresnú kontrolnú sekvenciu operatívne spojenú s molekulou nukleovej kyseliny.
  26. 26. Hostiteľská bunka zahrnujúca sekvencie nukleovej kyseliny kódujúce ťažký reťazec alebo jeho antigén-väzobnú časť a ľahký reťazec alebo jeho antigén-väzobnú časť protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 -14.
  27. 27. Transgénny živočích iného než ľudského pôvodu zahrnujúci sekvencie nukleovej kyseliny kódujúce ťažký reťazec alebo jeho antigén-väzobnú časť a ľahký reťazec alebo jeho antigén-väzobnú časť protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1-14, pričom transgénny živočích iného než ľudského pôvodu exprimuje uvedené sekvencie nukleovej kyseliny.
  28. 28. Spôsob prípravy anti-IGF-IR protilátky alebo jej antigén-väzobnej časti, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje kultiváciu hostiteľskej bunky podľa nároku 26 alebo bunkovej línie podľa nároku 20 za vhodných podmienok a získanie protilátky alebo antigén-väzobnej časti.
  29. 29. Spôsob prípravy protilátky alebo jej antigén-väzobnej časti podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 - 14, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje kroky:
    a) imunizácie cicavca iného než ľudského pôvodu imunogénom obsahujúcim IGF-IR, kde cicavec je schopný exprimovať humánne protilátky v B lymfocytoch živočícha;
    b) izolácie B lymfocytov z cicavca;
    c) skríning B lymfocytov alebo bunkových línií z nich pochádzajúcich na identifikáciu bunkovej línie, ktorá tvorí protilátky, ktoré sa viažu na IGF-IR;
    d) kultivácie bunkovej línie, ktorá exprimuje protilátky, ktoré sa viažu na IGF-IR; a
    d) izolácie protilátok, ktoré sa viažu na IGF-IR, z bunkovej línie.
  30. 30. Použitie protilátky alebo jej antigén-väzobnej časti podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 - 14 na prípravu liečiva na diagnostikovanie prítomnosti alebo lokalizácie nádoru exprimujúceho IGF-IR u subjektu, ktorý to potrebuje.
  31. 31. Použitie protilátky alebo jej antigén-väzobnej časti podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 - 14 na prípravu liečiva na liečenie rakoviny u človeka.
  32. 32. Použitie protilátky alebo jej antigén-väzobnej časti podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 - 14 na prípravu liečiva na liečenie pacienta, ktorý to potrebuje.
  33. 33. Použitie podľa nároku 31 alebo 32, pričom uvedené liečivo ďalej zahrnuje antineoplázické, protinádorové, antiangiogénne alebo chemoterapeutické činidlo.
  34. 34. Použitie izolovanej molekuly nukleovej kyseliny kódujúcej ťažký reťazec alebo jeho antigén-väzobnú časť a izolovanej molekuly nukleovej kyseliny kódujúcej ľahký reťazec alebo jeho antigén-väzobnú časť alebo izolovanej molekuly nukleovej kyseliny kódujúcej ľahký reťazec aj ťažký reťazec alebo jeho antigén- väzobnú časť protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 - 14 na prípravu liečiva na liečenie subjektu s rakovinou.
SK993-2003A 2001-01-05 2001-12-20 Human monoclonal antibody or antigen-binding portion thereof that specifically binds to IGF-IR, pharmaceutical composition comprising the antibody or antigen-binding portion thereof, isolated cell line producing the antibody, isolated nucleic acid molecule, vector, host cell, transgenic animal, method of making of antibody or antigen-binding portion thereof and use of the antibody and the isolated nucleic acid molecule SK287954B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25992701P 2001-01-05 2001-01-05
PCT/US2001/051113 WO2002053596A2 (en) 2001-01-05 2001-12-20 Antibodies to insulin-like growth factor i receptor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK9932003A3 SK9932003A3 (en) 2004-06-08
SK287954B6 true SK287954B6 (sk) 2012-07-03

Family

ID=22987016

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK993-2003A SK287954B6 (sk) 2001-01-05 2001-12-20 Human monoclonal antibody or antigen-binding portion thereof that specifically binds to IGF-IR, pharmaceutical composition comprising the antibody or antigen-binding portion thereof, isolated cell line producing the antibody, isolated nucleic acid molecule, vector, host cell, transgenic animal, method of making of antibody or antigen-binding portion thereof and use of the antibody and the isolated nucleic acid molecule

Country Status (51)

Country Link
US (7) US7037498B2 (sk)
EP (4) EP2796468A2 (sk)
JP (4) JP2004531217A (sk)
KR (1) KR100830082B1 (sk)
CN (2) CN1854157B (sk)
AP (1) AP2072A (sk)
AR (1) AR032028A1 (sk)
AT (1) ATE464322T1 (sk)
AU (1) AU2002231368C1 (sk)
BG (3) BG66460B1 (sk)
BR (2) BR0116728A (sk)
CA (1) CA2433800C (sk)
CR (4) CR7045A (sk)
CU (1) CU23447B7 (sk)
CZ (1) CZ301712B6 (sk)
DE (1) DE60141855D1 (sk)
DK (1) DK1399483T3 (sk)
DZ (1) DZ3494A1 (sk)
EA (1) EA012079B3 (sk)
EC (1) ECSP034711A (sk)
EE (2) EE05715B1 (sk)
ES (1) ES2344592T3 (sk)
GE (1) GEP20084484B (sk)
GT (1) GT200100257A (sk)
HK (3) HK1072059A1 (sk)
HN (1) HN2001000283A (sk)
HR (2) HRP20030627A2 (sk)
HU (1) HUP0302525A2 (sk)
IL (2) IL156661A0 (sk)
IS (1) IS2790B (sk)
MA (1) MA26040A1 (sk)
ME (1) ME00502B (sk)
MX (2) MX349009B (sk)
MY (1) MY143465A (sk)
NO (1) NO339789B1 (sk)
NZ (2) NZ527302A (sk)
OA (1) OA12589A (sk)
PA (1) PA8535501A1 (sk)
PE (1) PE20020801A1 (sk)
PL (3) PL224873B1 (sk)
PT (1) PT1399483E (sk)
RS (1) RS51373B (sk)
SG (1) SG138469A1 (sk)
SK (1) SK287954B6 (sk)
SV (1) SV2007000775A (sk)
TN (1) TNSN01177A1 (sk)
TW (1) TWI324609B (sk)
UA (1) UA87804C2 (sk)
UY (2) UY27087A1 (sk)
WO (1) WO2002053596A2 (sk)
ZA (1) ZA200305995B (sk)

Families Citing this family (294)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR032028A1 (es) 2001-01-05 2003-10-22 Pfizer Anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento similar a insulina
PL222211B1 (pl) * 2001-06-26 2016-07-29 Amgen Fremont Inc Przeciwciało przeciwko OPGL, kompozycja je zawierająca, jego zastosowanie i sposób jego wytwarzania, sposób wykrywania poziomu OPGL, kompozycja obejmująca polinukleotydy i komórka gosodarza
AU2013204100A1 (en) * 2001-06-26 2013-05-09 Amgen Fremont Inc. Antibodies to OPGL
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
US20080063639A1 (en) * 2002-01-18 2008-03-13 Pierre Fabre Medicament Method for the treatment of psoriasis comprising novel anti-IGF-IR antibodies
FR2834900B1 (fr) * 2002-01-18 2005-07-01 Pf Medicament Nouvelles compositions a activite anti-igf-ir et anti-egfr et leurs applications
JP4606739B2 (ja) * 2002-01-18 2011-01-05 ピエール、ファーブル、メディカマン 新規抗ｉｇｆ−ｉｒ抗体およびその使用
FR2834990A1 (fr) * 2002-01-18 2003-07-25 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
FR2834991B1 (fr) * 2002-01-18 2004-12-31 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
US7553485B2 (en) 2002-01-18 2009-06-30 Pierre Fabre Medicament Anti-IGF-IR and/or anti-insulin/IGF-I hybrid receptors antibodies and uses thereof
US7241444B2 (en) 2002-01-18 2007-07-10 Pierre Fabre Medicament Anti-IGF-IR antibodies and uses thereof
US6936427B2 (en) 2002-02-08 2005-08-30 Trellis Bioscience, Inc. Real time detection of intermolecular interaction
US8658773B2 (en) 2011-05-02 2014-02-25 Immunomedics, Inc. Ultrafiltration concentration of allotype selected antibodies for small-volume administration
EP3100719A3 (en) 2002-05-15 2017-02-22 California Pacific Medical Center Delivery of nucleic acid-like compounds
WO2003100008A2 (en) 2002-05-24 2003-12-04 Schering Corporation Neutralizing human anti-igfr antibody
US7538195B2 (en) 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
US8034904B2 (en) * 2002-06-14 2011-10-11 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
US7456260B2 (en) 2002-06-17 2008-11-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Humanized antibody
US20040176291A1 (en) * 2002-09-24 2004-09-09 Elly Nedivi Methods and compositions for soluble CPG15
NZ540971A (en) * 2003-02-13 2008-04-30 Pfizer Prod Inc Uses of anti-insulin-like growth factor I receptor antibodies
EP1603948A1 (en) * 2003-03-14 2005-12-14 Pharmacia Corporation Antibodies to igf-i receptor for the treatment of cancers
JP4473257B2 (ja) 2003-04-02 2010-06-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー インスリン様成長因子ｉ受容体に対する抗体及びその使用
CN100378127C (zh) * 2003-04-02 2008-04-02 霍夫曼-拉罗奇有限公司 针对***i受体的抗体及其应用
US7310537B2 (en) * 2003-04-25 2007-12-18 Nokia Corporation Communication on multiple beams between stations
WO2005016970A2 (en) 2003-05-01 2005-02-24 Imclone Systems Incorporated Fully human antibodies directed against the human insulin-like growth factor-1 receptor
EP1479695B1 (en) * 2003-05-14 2010-02-17 Kenta Biotech AG Human monoclonal antibody specific for lipopolysaccharides (LPS) of serotype IATS O6 of Pseudomonas aeruginosa
AR046071A1 (es) * 2003-07-10 2005-11-23 Hoffmann La Roche Anticuerpos contra el receptor i del factor de crecimiento de tipo insulinico y los usos de los mismos
US7902338B2 (en) 2003-07-31 2011-03-08 Immunomedics, Inc. Anti-CD19 antibodies
HN2004000285A (es) * 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
KR100825156B1 (ko) * 2003-08-13 2008-04-24 화이자 프로덕츠 인코포레이티드 변형된 인간 ｉｇｆ-ｉｒ 항체
WO2005028515A1 (ja) * 2003-09-24 2005-03-31 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. ヒトインスリン様成長因子に対する遺伝子組換え抗体
US20050187175A1 (en) * 2003-09-30 2005-08-25 Elly Nedivi Methods and compositions for CPG15-2
US9011880B2 (en) * 2003-10-21 2015-04-21 Igf Oncology, Llc Compounds and methods for treating cancer
EP1694850B1 (en) 2003-11-12 2011-06-29 Schering Corporation Plasmid system for multigene expression
TW200526684A (en) * 2003-11-21 2005-08-16 Schering Corp Anti-IGFR1 antibody therapeutic combinations
EP1692176A4 (en) * 2003-12-08 2008-11-12 Immunogen Inc ANTI-IGF-I RECEPTOR ANTIBODY
BRPI0510716A (pt) * 2004-05-05 2007-11-20 Merrimack Pharmaceuticals Inc uso de um agente de ligação bi-especìfico, agente de ligação bi-especìfico, composição de um agente de ligação bi-especìfico, e, kit
CA2573821A1 (en) * 2004-07-16 2006-01-26 Pfizer Products Inc. Combination treatment for non-hematologic malignancies using an anti-igf-1r antibody
FR2873699B1 (fr) * 2004-07-29 2009-08-21 Pierre Fabre Medicament Sa Nouveaux anticorps anti igf ir rt leurs utilisations
WO2006060419A2 (en) 2004-12-03 2006-06-08 Schering Corporation Biomarkers for pre-selection of patients for anti-igf1r therapy
MY146381A (en) * 2004-12-22 2012-08-15 Amgen Inc Compositions and methods relating relating to anti-igf-1 receptor antibodies
NZ562453A (en) 2005-03-31 2010-04-30 Agensys Inc Antibodies and related molecules that bind to 161P2F10B proteins
CA2604393A1 (en) * 2005-04-15 2006-10-26 Schering Corporation Methods and compositions for treating or preventing cancer
BRPI0608096A2 (pt) 2005-04-26 2009-11-10 Pfizer anticorpos p-caderina
GB0510790D0 (en) 2005-05-26 2005-06-29 Syngenta Crop Protection Ag Anti-CD16 binding molecules
ES2776657T3 (es) * 2005-06-14 2020-07-31 Amgen Inc Formulaciones de proteínas autotamponantes
WO2006138315A2 (en) * 2005-06-15 2006-12-28 Schering Corporation Anti-igf1r antibody formulations
CN101613409B (zh) 2005-06-17 2014-06-04 英克隆有限责任公司 抗-PDGFRα抗体
WO2007000328A1 (en) * 2005-06-27 2007-01-04 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa Antibodies that bind to an epitope on insulin-like growth factor 1 receptor and uses thereof
FR2888850B1 (fr) 2005-07-22 2013-01-11 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
UA94060C2 (ru) 2005-09-07 2011-04-11 Эмджен Фримонт Инк. Моноклональное антитело, которое специфически связывает alk-1
CN100445300C (zh) * 2005-09-30 2008-12-24 李玉新 Glp-1融合蛋白及其制备方法和医药用途
EP1957541A2 (en) 2005-11-21 2008-08-20 Laboratoires Serono SA Compositions and methods of producing hybrid antigen binding molecules and uses thereof
RS52357B (en) * 2005-12-13 2012-12-31 Medimmune Limited BINDING PROTEINS SPECIFIC TO INSULIN SIMILAR GROWTH FACTORS AND THEIR USE
AR060017A1 (es) 2006-01-13 2008-05-21 Novartis Ag Composiciones y metodos de uso para anticuerpos de dickkopf -1
JP5554925B2 (ja) 2006-01-20 2014-07-23 セル・シグナリング・テクノロジー・インコーポレイテツド ヒト非小細胞肺癌における転座及び変異体ｒｏｓキナーゼ
US20120208824A1 (en) 2006-01-20 2012-08-16 Cell Signaling Technology, Inc. ROS Kinase in Lung Cancer
WO2009051846A2 (en) 2007-10-18 2009-04-23 Cell Signaling Technology, Inc. Translocation and mutant ros kinase in human non-small cell lung carcinoma
CA2641310C (en) 2006-02-03 2013-08-20 Imclone Systems Incorporated Igf-ir antagonists as adjuvants for treatment of prostate cancer
WO2007095113A2 (en) * 2006-02-10 2007-08-23 Massachusetts Institute Of Technology Cpg15 and cpg15-2 compounds and inhibitors as insulin receptor and insulin-like growth factor receptor agonists and antagonists
KR20080113268A (ko) * 2006-03-28 2008-12-29 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 항 ｉｇｆ-1ｒ 항체 및 그의 용도
KR20080104160A (ko) * 2006-03-28 2008-12-01 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-ｉｇｆ-１ｒ 인간 단일클론 항체 제형
US7846724B2 (en) 2006-04-11 2010-12-07 Hoffmann-La Roche Inc. Method for selecting CHO cell for production of glycosylated antibodies
EP2447360A1 (en) 2006-04-14 2012-05-02 Cell Signaling Technology, Inc. Gene defects and mutant ALK kinase in human solid tumors
EA200802058A1 (ru) 2006-05-09 2009-06-30 Пфайзер Продактс Инк. Производные циклоалкиламинокислот и их фармацевтические композиции
EP2032989B2 (en) 2006-06-30 2015-10-28 Merck Sharp & Dohme Corp. Igfbp2 biomarker
MX2009006466A (es) 2006-12-13 2009-06-26 Schering Corp Metodos de tratamiento de cancer con inhibidores del receptor del factor 1 de crecimiento similar a la insulina.
US20090068110A1 (en) * 2006-12-22 2009-03-12 Genentech, Inc. Antibodies to insulin-like growth factor receptor
MX2009008754A (es) * 2007-02-14 2009-11-02 Glaxo Group Ltd Anticuerpos novedosos contra igf-1r.
GB0702888D0 (en) * 2007-02-14 2007-03-28 Glaxo Group Ltd Novel Antibodies
EP2126565B1 (en) * 2007-02-27 2011-10-26 F. Hoffmann-La Roche AG Method for the assessment of the inhibitory activity of antibodies against insulin-like growth factor i receptor
WO2008108986A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Amgen Inc. Methods and compositions for treating tumor diseases
US8642067B2 (en) 2007-04-02 2014-02-04 Allergen, Inc. Methods and compositions for intraocular administration to treat ocular conditions
JP5926487B2 (ja) 2007-04-13 2016-05-25 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド ＥｒｂＢ療法に耐性である癌を治療するための方法
WO2008144345A2 (en) 2007-05-17 2008-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Biomarkers and methods for determining sensitivity to insulin growth factor-1 receptor modulators
PE20090368A1 (es) 2007-06-19 2009-04-28 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-igf
KR20100052545A (ko) * 2007-08-28 2010-05-19 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 Ｉｇｆ―１ｒ의 다중 에피토프에 결합하는 조성물
EP2190480A4 (en) * 2007-08-28 2013-01-23 Biogen Idec Inc ANTI-IGR-1R ANTIBODIES AND ITS USES
AU2008293425B2 (en) * 2007-08-31 2014-09-18 Amgen Inc. Solid-state protein formulation
EP2205280B1 (en) 2007-09-27 2019-09-04 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
WO2009064838A1 (en) 2007-11-15 2009-05-22 Amgen, Inc. Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stablised by antioxidants for parenteral administration
CN101918447B (zh) 2007-12-14 2014-06-11 布里斯托尔-米尔斯·斯奎布公司 人ox40受体的结合分子
EP2225273B1 (en) 2007-12-21 2012-05-23 Roche Glycart AG Stability testing of antibodies
US20110104256A1 (en) * 2008-03-25 2011-05-05 Yaolin Wang Methods for treating or preventing colorectal cancer
SG190572A1 (en) 2008-04-29 2013-06-28 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
RU2010153578A (ru) 2008-06-03 2012-07-20 Эбботт Лэборетриз (Us) Иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами и их применение
CA2726087A1 (en) 2008-06-03 2009-12-10 Tariq Ghayur Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
RU2011104348A (ru) 2008-07-08 2012-08-20 Эбботт Лэборетриз (Us) Иммуноглобулины с двойным вариабельным доменом против простагландина е2 и их применение
US8518952B2 (en) 2008-08-06 2013-08-27 Pfizer Inc. 6 substituted 2-heterocyclylamino pyrazine compounds as CHK-1 inhibitors
MX2011006055A (es) 2008-12-12 2011-07-04 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-igf.
US9364477B2 (en) 2009-02-12 2016-06-14 Cell Signaling Technology, Inc. Mutant ROS expression in human cancer
EP3243527B1 (en) 2009-02-13 2019-06-05 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage
EP2236139A1 (en) 2009-03-31 2010-10-06 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of erlotinib with an anti-IGF-1R antibody, which does not inhibit binding of insulin to the insulin receptor
AR075982A1 (es) 2009-03-31 2011-05-11 Roche Glycart Ag Terapia de combinacion de un anticuerpo afucosilado y una o mas de las citoquinas seleccionadas de gm- csf humano, m -csf humano y/o il-3 humano y composicion
CN102481361B (zh) 2009-04-16 2014-10-22 默沙东公司 用于治疗癌症的组合物和方法
JP5766179B2 (ja) * 2009-04-27 2015-08-19 ノバルティス アーゲー 筋肉増殖を増加させるための組成物および方法
US20100316639A1 (en) 2009-06-16 2010-12-16 Genentech, Inc. Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy
EP2564695B1 (en) 2009-07-08 2015-04-15 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US20120204278A1 (en) 2009-07-08 2012-08-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
KR20120060877A (ko) 2009-09-01 2012-06-12 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
CA2774260C (en) 2009-09-16 2018-10-09 Immunomedics, Inc. Class i anti-cea antibodies and uses thereof
AU2010306677B2 (en) 2009-10-15 2013-05-23 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US9662271B2 (en) 2009-10-23 2017-05-30 Amgen Inc. Vial adapter and system
KR101436219B1 (ko) 2009-10-26 2014-09-01 에프. 호프만-라 로슈 아게 글리코실화된 면역글로불린의 제조 방법
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
EP2494070A2 (en) 2009-10-30 2012-09-05 Bristol-Myers Squibb Company Methods for treating cancer in patients having igf-1r inhibitor resistance
EP2506881B1 (en) 2009-12-02 2024-03-06 Immunomedics, Inc. Combining radioimmunotherapy and antibody-drug conjugates for improved cancer therapy
WO2011083391A2 (en) 2010-01-05 2011-07-14 Pfizer Inc. Biomarkers for anti-igf-ir cancer therapy
EP3095871B1 (en) 2010-02-08 2019-04-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common light chain mouse
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
WO2011101328A2 (en) 2010-02-18 2011-08-25 Roche Glycart Ag Treatment with a humanized igg class anti egfr antibody and an antibody against insulin like growth factor 1 receptor
US9238080B2 (en) 2010-05-21 2016-01-19 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bi-specific fusion proteins
EA032537B1 (ru) 2010-06-07 2019-06-28 Эмджен Инк. Способ работы устройства для доставки лекарственного средства
WO2011161119A1 (en) 2010-06-22 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof
PE20130643A1 (es) 2010-07-12 2013-06-07 Covx Technologies Ireland Ltd Conjugados de anticuerpos multifuncionales
KR20130100118A (ko) 2010-08-03 2013-09-09 아비에 인코포레이티드 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
US20120101108A1 (en) 2010-08-06 2012-04-26 Cell Signaling Technology, Inc. Anaplastic Lymphoma Kinase In Kidney Cancer
CA2809433A1 (en) 2010-08-26 2012-03-01 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
KR101527300B1 (ko) 2010-09-09 2015-06-09 화이자 인코포레이티드 4-1ｂｂ 결합 분자
UA114592C2 (uk) * 2010-09-28 2017-07-10 Ноно Інк. Пептид nd2 та спосіб лікування неврологічного захворювання
EP3974453A3 (en) * 2010-11-16 2022-08-03 Amgen Inc. Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
CA2820619C (en) 2010-11-24 2020-01-07 Litron Laboratories, Ltd. Rapid in vivo gene mutation assay based on the pig-a gene
JP2014510265A (ja) 2011-02-02 2014-04-24 アムジェン インコーポレイテッド Ｉｇｆ−１ｒの阻害に関する方法および組成物
CA2824252A1 (en) 2011-02-10 2012-08-16 Roche Glycart Ag Improved immunotherapy
GB201103578D0 (en) 2011-03-02 2011-04-13 Sabrepharm Ltd Dipyridinium derivatives
CN103561771B (zh) 2011-03-17 2019-01-04 伯明翰大学 重新定向的免疫治疗
WO2012135517A2 (en) 2011-03-29 2012-10-04 Immunogen, Inc. Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
ME03353B (me) 2011-03-29 2019-10-20 Immunogen Inc Priprema konjugata antitela i majtanzinoida jednostepenim postupkom
WO2012135315A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Amgen Inc. Vial adapter and system
EP2699598B1 (en) 2011-04-19 2019-03-06 Pfizer Inc Combinations of anti-4-1bb antibodies and adcc-inducing antibodies for the treatment of cancer
KR101517320B1 (ko) * 2011-04-19 2015-05-28 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 단일특이적 및 이중특이적 항-igf-1r 및 항 erbb3 항체
LT2699293T (lt) 2011-04-20 2019-04-25 Amgen Inc. Automatinio purškimo prietaisas
MY172718A (en) 2011-08-05 2019-12-11 Regeneron Pharma Humanized universal light chain mice
CN103857700A (zh) 2011-08-26 2014-06-11 梅里麦克制药股份有限公司 串联fc双特异性抗体
WO2013041844A2 (en) * 2011-09-19 2013-03-28 Kymab Limited Antibodies, variable domains & chains tailored for human use
WO2013045916A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
US20140309229A1 (en) 2011-10-13 2014-10-16 Bristol-Myers Squibb Company Methods for selecting and treating cancer in patients with igf-1r/ir inhibitors
EP3335747B1 (en) 2011-10-14 2021-04-07 Amgen Inc. Injector and method of assembly
US20130122005A1 (en) * 2011-10-27 2013-05-16 Paul Adam Anticancer combination therapy
EP3559049A4 (en) 2011-10-28 2019-12-04 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd POLYPEPTIDE CONSTRUCTS AND APPLICATIONS THEREOF
EP2776042B1 (en) 2011-11-11 2019-03-20 Duke University Combination drug therapy for the treatment of solid tumors
US20140341922A1 (en) * 2011-11-25 2014-11-20 SUN R & D Foundation Method for Overcoming Tolerance to Targeted Anti-Cancer Agent
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9997847B2 (en) 2011-12-27 2018-06-12 Perfectvision Manufacturing, Inc. Coaxial Connector with grommet biasing for enhanced continuity
TW201333035A (zh) 2011-12-30 2013-08-16 Abbvie Inc 針對ｉｌ－１３及／或ｉｌ－１７之雙特異性結合蛋白
EP2631653A1 (en) 2012-02-24 2013-08-28 Charité - Universitätsmedizin Berlin Identification of modulators of binding properties of antibodies reactive with a member of the insulin receptor family
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
DK2838998T3 (en) 2012-04-18 2018-01-15 Cell Signaling Technology Inc EGFR AND ROS1 IN CANCER
DK2844282T3 (da) 2012-05-04 2019-07-15 Pfizer Prostata-associerede antigener og vaccine-baserede immunterapiregimener
CN104994872B (zh) 2012-06-21 2018-09-14 索伦托治疗有限公司 与igf1r结合的抗原结合蛋白
WO2014014821A1 (en) 2012-07-19 2014-01-23 Redwood Biosciences, Inc. Antibody specific for cd22 and methods of use thereof
US8980259B2 (en) 2012-07-20 2015-03-17 Novartis Ag Combination therapy
SG10201800535XA (en) 2012-08-07 2018-02-27 Roche Glycart Ag Composition comprising two antibodies engineered to have reduced and increased effector function
US9315567B2 (en) 2012-08-14 2016-04-19 Ibc Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
NZ707091A (en) 2012-10-04 2018-12-21 Immunogen Inc Use of a pvdf membrane to purify cell-binding agent cytotoxic agent conjugates
CA2890263C (en) 2012-11-01 2020-03-10 Abbvie Inc. Anti-vegf/dll4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
ES2780395T3 (es) 2012-11-21 2020-08-25 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos
EP2925745B1 (en) 2012-11-29 2018-04-04 ChemoCentryx, Inc. Cxcr7 antagonists
HRP20220399T1 (hr) 2012-12-13 2022-05-13 Immunomedics, Inc. Režim doziranja imunokonjugata protutijela i sn-38 za poboljšanu učinkovitost i smanjenu toksičnost
US9458245B2 (en) 2013-03-06 2016-10-04 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. ANTI-C-MET tandem Fc bispecific antibodies
US20140255413A1 (en) 2013-03-07 2014-09-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination therapy for neoplasia treatment
JP6336564B2 (ja) 2013-03-15 2018-06-06 アムゲン・インコーポレーテッド 薬物カセット、自動注入器、および自動注入器システム
WO2014144280A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Abbvie Inc. DUAL SPECIFIC BINDING PROTEINS DIRECTED AGAINST IL-1β AND / OR IL-17
US10492990B2 (en) 2013-03-15 2019-12-03 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
US9708375B2 (en) 2013-03-15 2017-07-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to WNT inhibitors
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
CN113559363B (zh) 2013-03-22 2023-10-31 美国安进公司 注射器及装配方法
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
EP2992013B1 (en) 2013-04-29 2019-12-04 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-cd38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2b
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
CA2918787A1 (en) * 2013-06-13 2014-12-18 George Tachas Combination therapy
TW201605896A (zh) 2013-08-30 2016-02-16 安美基股份有限公司 Gitr抗原結合蛋白
EP3712166A1 (en) 2013-09-05 2020-09-23 Amgen Inc. Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles
DE112014004537T5 (de) 2013-10-01 2016-07-21 Kymab Limited Tiermodelle und therapeutische Moleküle
JP7051293B2 (ja) 2013-10-24 2022-04-11 アムジエン・インコーポレーテツド 温度感知制御を伴う薬剤送達システム
US11097055B2 (en) 2013-10-24 2021-08-24 Amgen Inc. Injector and method of assembly
US9675671B2 (en) 2014-01-12 2017-06-13 Igf Oncology, Llc Fusion proteins containing insulin-like growth factor-1 and epidermal growth factor and variants thereof and uses thereof
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
MX2016010683A (es) 2014-02-21 2017-05-11 Ibc Pharmaceuticals Inc Terapia para tratar enfermedades mediante la induccion de respuesta inmune de las células que expresan trop-2.
CN106029098A (zh) 2014-02-25 2016-10-12 免疫医疗公司 人源化rfb4抗cd22抗体
SG11201607203XA (en) 2014-03-21 2016-09-29 Regeneron Pharma Non-human animals that make single domain binding proteins
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
SG11201609219QA (en) 2014-05-07 2016-12-29 Amgen Inc Autoinjector with shock reducing elements
WO2015175861A1 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Amgen Inc. Assay for detecting th1 and th2 cell populations
KR102506249B1 (ko) 2014-06-03 2023-03-03 암겐 인코포레이티드 약물 전달 시스템 및 사용 방법
US9580495B2 (en) 2014-06-24 2017-02-28 Immunomedics, Inc. Anti-histone therapy for vascular necrosis in severe glomerulonephritis
CN106999517A (zh) 2014-10-07 2017-08-01 免疫医疗公司 抗体‑药物缀合物的新辅助剂用途
CA2957960C (en) 2014-10-14 2023-08-22 Amgen, Inc. Drug injection device with visual and audible indicators
AU2015337858B2 (en) 2014-10-29 2020-09-24 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd. Interferon alpha2b variants
MA40934A (fr) 2014-11-19 2017-09-27 Immunogen Inc Procédé de préparation de conjugués agent de liaison cellulaire-agent cytotoxique
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
JP6716566B2 (ja) 2014-12-19 2020-07-01 アムジエン・インコーポレーテツド 近接センサ付き薬物送達装置
EP3233159B1 (en) 2014-12-19 2020-03-04 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
ES2748750T3 (es) 2015-02-17 2020-03-17 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con sujeción asistida por vacío y/o realimentación
CA2977257A1 (en) * 2015-02-22 2016-08-25 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody therapeutics that bind cd137
ES2905870T3 (es) 2015-02-27 2022-04-12 Amgen Inc Dispositivo de suministro de fármacos que tiene un mecanismo de protección de aguja con un umbral de resistencia ajustable al movimiento de la protección de aguja
CA2979702A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen
EP3286224A4 (en) 2015-04-22 2018-11-14 Immunomedics, Inc. Isolation, detection, diagnosis and/or characterization of circulating trop-2-positive cancer cells
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
WO2016210108A1 (en) 2015-06-25 2016-12-29 Immunomedics, Inc. Combining anti-hla-dr or anti-trop-2 antibodies with microtubule inhibitors, parp inhibitors, bruton kinase inhibitors or phosphoinositide 3-kinase inhibitors significantly improves therapeutic outcome in cancer
SI3316885T1 (sl) 2015-07-01 2021-09-30 Immunomedics, Inc. Imunokonjugati protitelo-SN-38 z linkerjem CL2A
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
EP3355907B1 (en) 2015-10-02 2021-01-20 Silver Creek Pharmaceuticals, Inc. Bi-specific therapeutic proteins for tissue repair
GB2543550A (en) 2015-10-21 2017-04-26 Hox Therapeutics Ltd Peptides
US11351308B2 (en) 2015-12-09 2022-06-07 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
US11154661B2 (en) 2016-01-06 2021-10-26 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
CN108601848A (zh) 2016-02-05 2018-09-28 伊缪诺金公司 用于制备细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的有效方法
WO2017156488A2 (en) 2016-03-10 2017-09-14 Acceleron Pharma, Inc. Activin type 2 receptor binding proteins and uses thereof
EP3721922B1 (en) 2016-03-15 2022-05-04 Amgen Inc. Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
WO2017192287A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
AU2017263558B2 (en) 2016-05-13 2022-12-22 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
US11238150B2 (en) 2016-05-16 2022-02-01 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
US11541176B2 (en) 2016-06-03 2023-01-03 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
WO2018004842A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
MX2019004580A (es) 2016-10-21 2019-08-12 Amgen Inc Formulaciones farmaceuticas y metodos para prepararlas.
US20200261643A1 (en) 2016-10-25 2020-08-20 Amgen Inc. On-body injector
CN108084262A (zh) * 2016-11-23 2018-05-29 复旦大学 针对寨卡病毒的全人源单域抗体或抗原结合片段及应用
AU2018210301A1 (en) 2017-01-17 2019-08-01 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
JP7064501B2 (ja) 2017-02-17 2022-05-10 アムジエン・インコーポレーテツド 無菌流体流路を備える薬物送達デバイスおよび関連する組立方法
AU2018221351B2 (en) 2017-02-17 2023-02-23 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
CA3050927A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Brian Stonecipher Drug delivery device with activation prevention feature
IL268478B2 (en) 2017-03-07 2023-10-01 Amgen Inc Inserting a needle using super pressure
JP2020509837A (ja) 2017-03-09 2020-04-02 アムジエン・インコーポレーテツド 薬剤送達装置のための挿入機構
AU2018235928B2 (en) 2017-03-14 2023-09-21 Amgen Inc. Control of total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
CN110446512B (zh) 2017-03-28 2022-03-18 美国安进公司 柱塞杆和注射器组件***以及方法
CA3059593A1 (en) 2017-05-21 2018-11-29 Igf Oncology, Llc An insulin-like growth factor-chemotherapeputic conjugate for treating myelodysplastic syndrome
US11590294B2 (en) 2017-06-08 2023-02-28 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
EP3634546A1 (en) 2017-06-08 2020-04-15 Amgen Inc. Torque driven drug delivery device
MX2019015472A (es) 2017-06-22 2020-02-19 Amgen Inc Reduccion del impacto/choque de la activacion del mecanismo.
WO2018237225A1 (en) 2017-06-23 2018-12-27 Amgen Inc. ELECTRONIC DRUG DELIVERY DEVICE COMPRISING A CAP ACTIVATED BY A SWITCH ASSEMBLY
EP3651832B1 (en) 2017-07-14 2023-12-13 Amgen Inc. Needle insertion-retraction system having dual torsion spring system
MA49626A (fr) 2017-07-21 2020-05-27 Amgen Inc Élément d'étanchéité perméable aux gaz pour récipient à médicament et procédés d'assemblage
WO2019022950A1 (en) 2017-07-25 2019-01-31 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE WITH CONTAINER ACCESS SYSTEM AND ASSEMBLY METHOD THEREOF
WO2019022951A1 (en) 2017-07-25 2019-01-31 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE WITH GEAR MODULE AND ASSEMBLY METHOD THEREOF
EP3664863A2 (en) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc. Hydraulic-pneumatic pressurized chamber drug delivery system
MA49897A (fr) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc Injecteur sur-corps avec patch adhésif stérile
CN111511762A (zh) 2017-08-21 2020-08-07 天演药业公司 抗cd137分子及其用途
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
US20210332141A1 (en) 2017-08-30 2021-10-28 Amgen Inc. Insulin-like growth factor-1 receptor (igf-1r) binding proteins and methods of use
WO2019070472A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 Amgen Inc. FLOW ADAPTER FOR MEDICATION DELIVERY DEVICE
CN111132711B (zh) 2017-10-06 2022-07-01 安进公司 带有联锁组件的药物递送装置及相关组装方法
EP3694578A1 (en) 2017-10-09 2020-08-19 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
CN111885914B (zh) * 2017-10-27 2022-05-13 投资健康有限责任公司 使用芴衍生物制造扩增的造血干细胞的组合物和方法
WO2019090079A1 (en) 2017-11-03 2019-05-09 Amgen Inc. System and approaches for sterilizing a drug delivery device
WO2019090303A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
WO2019089178A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
CA3079665A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 Amgen Inc. Plungers for drug delivery devices
MX2020005066A (es) 2017-11-16 2020-08-20 Amgen Inc Autoinyector con deteccion de detencion y punto final.
WO2019099324A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 Amgen Inc. Door latch mechanism for drug delivery device
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
WO2019148444A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
MA52186A (fr) 2018-03-26 2021-02-17 Amgen Inc Glycoformes afucosylées totales d'anticorps produits en culture cellulaire
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
EP3826701A1 (en) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
US20210228815A1 (en) 2018-07-24 2021-07-29 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
CA3103682A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
EP3829692A1 (en) 2018-07-31 2021-06-09 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
MA53724A (fr) 2018-09-24 2021-12-29 Amgen Inc Systèmes et procédés de dosage interventionnel
AU2019350660A1 (en) 2018-09-28 2021-03-18 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
AR116679A1 (es) 2018-10-02 2021-06-02 Amgen Inc Sistemas de inyección para la administración de fármacos con transmisión de fuerza interna
EP3860686A1 (en) 2018-10-05 2021-08-11 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
SG11202103800RA (en) 2018-10-15 2021-05-28 Amgen Inc Drug delivery device having damping mechanism
CA3109988A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Amgen Inc. Platform assembly process for drug delivery device
WO2020092056A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial needle retraction
EP3873566A1 (en) 2018-11-01 2021-09-08 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
MA54057A (fr) 2018-11-01 2022-02-09 Amgen Inc Dispositifs d'administration de médicament à rétraction partielle d'élément d'administration de médicament
AU2019393487A1 (en) * 2018-12-03 2021-06-03 Teijin Pharma Limited Anti-IGF-I receptor humanized antibody
JP2022512367A (ja) 2018-12-12 2022-02-03 ケモセントリックス，インコーポレイティド 癌治療のためのｃｘｃｒ７阻害剤
EP3897851A2 (en) 2018-12-17 2021-10-27 Revitope Limited Twin immune cell engager
US20220160972A1 (en) 2019-04-24 2022-05-26 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
CA3148261A1 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Amgen Inc. Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
WO2021062372A1 (en) 2019-09-26 2021-04-01 Amgen Inc. Methods of producing antibody compositions
EP4162257A1 (en) 2020-06-04 2023-04-12 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
EP4229080A1 (en) 2020-10-15 2023-08-23 Amgen Inc. Relative unpaired glycans in antibody production methods
AU2022213913A1 (en) 2021-01-27 2023-08-17 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Single-domain antibody against cd16a and use thereof
AU2022233150A1 (en) * 2021-03-08 2023-09-21 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education MOLECULES THAT BIND TO CD66e POLYPEPTIDES
CN112794912B (zh) * 2021-04-14 2021-07-06 苏州普乐康医药科技有限公司 一种抗igf-1r抗体及其应用
EP4342497A1 (en) 2021-05-10 2024-03-27 Kawasaki Institute of Industrial Promotion Antibody having reduced binding affinity for antigen
WO2022246055A1 (en) 2021-05-21 2022-11-24 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container
EP4352094A1 (en) 2021-06-07 2024-04-17 Amgen Inc. Using fucosidase to control afucosylation level of glycosylated proteins
WO2023059607A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
WO2023143484A1 (zh) * 2022-01-29 2023-08-03 明慧医药（杭州）有限公司 一种抗原结合蛋白及其用途
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
CN117079823B (zh) * 2023-10-17 2024-01-02 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 早期预测选择性胎儿生长受限发病风险筛查的***和方法

Family Cites Families (132)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US586510A (en) * 1897-07-13 Coal-grading machine
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
WO1986005807A1 (en) 1985-04-01 1986-10-09 Celltech Limited Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
GB8827305D0 (en) 1988-11-23 1988-12-29 British Bio Technology Compounds
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6020145A (en) * 1989-06-30 2000-02-01 Bristol-Myers Squibb Company Methods for determining the presence of carcinoma using the antigen binding region of monoclonal antibody BR96
US4968516A (en) * 1989-07-24 1990-11-06 Thompson Neal W Method and apparatus for cooking foodstuffs using auxiliary steam
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
GB8928874D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US6657103B1 (en) * 1990-01-12 2003-12-02 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
DK0585287T3 (da) 1990-07-10 2000-04-17 Cambridge Antibody Tech Fremgangsmåde til fremstilling af specifikke bindingsparelementer
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5165424A (en) 1990-08-09 1992-11-24 Silverman Harvey N Method and system for whitening teeth
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1992003917A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International Homologous recombination in mammalian cells
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2246502T3 (es) 1990-08-29 2006-02-16 Genpharm International, Inc. Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
DE69233697T2 (de) 1991-03-01 2008-01-24 Dyax Corp., Cambridge Verfahren zur Entwicklung von bindenden Mikroproteinen
DE69233750D1 (de) 1991-04-10 2009-01-02 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer Rezeptoren mittels Phagemiden
JP2527896B2 (ja) 1991-04-19 1996-08-28 ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング ヒト骨由来インスリン様成長因子結合タンパク
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
AU2515992A (en) 1991-08-20 1993-03-16 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
DK0605522T3 (da) 1991-09-23 2000-01-17 Medical Res Council Fremgangsmåde til fremstilling af humaniserede antistoffer
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
JPH05244982A (ja) 1991-12-06 1993-09-24 Sumitomo Chem Co Ltd 擬人化ｂ−ｂ１０
US5777085A (en) 1991-12-20 1998-07-07 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with GPIIB/IIIA
AU675929B2 (en) 1992-02-06 1997-02-27 Curis, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
WO1993016043A1 (en) 1992-02-18 1993-08-19 Otsuka Kagaku Kabushiki Kaisha β-LACTAM COMPOUND AND CEPHEM COMPOUND, AND PRODUCTION THEREOF
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
ATE381614T1 (de) 1992-07-24 2008-01-15 Amgen Fremont Inc Bildung von xenogenen antikörpern
US6177401B1 (en) 1992-11-13 2001-01-23 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften Use of organic compounds for the inhibition of Flk-1 mediated vasculogenesis and angiogenesis
US5455258A (en) 1993-01-06 1995-10-03 Ciba-Geigy Corporation Arylsulfonamido-substituted hydroxamic acids
ES2146648T3 (es) 1993-03-09 2000-08-16 Genzyme Corp Procedimiento de aislamiento de proteinas de la leche.
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
IT1270882B (it) * 1993-10-05 1997-05-13 Isagro Srl Oligopeptidi ad attivita' fungicida
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
JPH08140528A (ja) 1993-12-03 1996-06-04 Genpharm Internatl Inc 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
IL112248A0 (en) 1994-01-25 1995-03-30 Warner Lambert Co Tricyclic heteroaromatic compounds and pharmaceutical compositions containing them
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
US5863949A (en) 1995-03-08 1999-01-26 Pfizer Inc Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
CA2218503C (en) 1995-04-20 2001-07-24 Pfizer Inc. Arylsulfonyl hydroxamic acid derivatives
EP0826034A4 (en) 1995-04-21 2002-06-19 Cell Genesys Inc PRODUCTION OF LARGE GENOMIC DNA DELETIONS
ES2304786T3 (es) * 1995-04-27 2008-10-16 Amgen Fremont Inc. Anticuerpos anti-il-8 humanos, derivados a partir de xenoratones inmunizados.
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
US5747498A (en) 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
US5880141A (en) 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
GB9520822D0 (en) 1995-10-11 1995-12-13 Wellcome Found Therapeutically active compounds
US6084085A (en) * 1995-11-14 2000-07-04 Thomas Jefferson University Inducing resistance to tumor growth with soluble IGF-1 receptor
GB9624482D0 (en) 1995-12-18 1997-01-15 Zeneca Phaema S A Chemical compounds
ATE225343T1 (de) 1995-12-20 2002-10-15 Hoffmann La Roche Matrix-metalloprotease inhibitoren
JP4464466B2 (ja) 1996-03-05 2010-05-19 アストラゼネカ・ユーケイ・リミテッド ４―アニリノキナゾリン誘導体
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5994619A (en) 1996-04-01 1999-11-30 University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus Production of chimeric bovine or porcine animals using cultured inner cell mass cells
IL118626A0 (en) * 1996-06-11 1996-10-16 Xtl Biopharmaceuticals Limited Anti HBV antibody
EP0818442A3 (en) 1996-07-12 1998-12-30 Pfizer Inc. Cyclic sulphone derivatives as inhibitors of metalloproteinases and of the production of tumour necrosis factor
ES2186908T3 (es) 1996-07-13 2003-05-16 Glaxo Group Ltd Compuestos heterociciclos condensados como inhibidores de pproteina-tirosina-quinasas.
HRP970371A2 (en) 1996-07-13 1998-08-31 Kathryn Jane Smith Heterocyclic compounds
TR199900048T2 (xx) 1996-07-13 1999-04-21 Glaxo Group Limited Protein tirozin kinaz inhibit�rleri olarak bisiklik heteroaromatik bile�ikler
HUP9903014A3 (en) 1996-07-18 2000-08-28 Pfizer Phosphinate derivatives having matrix metalloprotease inhibitor effect and medicaments containing the same
US6153609A (en) 1996-08-23 2000-11-28 Pfizer Inc Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
ID18494A (id) 1996-10-02 1998-04-16 Novartis Ag Turunan pirazola leburan dan proses pembuatannya
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
DK1500329T3 (da) 1996-12-03 2012-07-09 Amgen Fremont Inc Humane antistoffer, der specifikt binder TNF-alfa
CA2277100C (en) 1997-01-06 2005-11-22 Pfizer Inc. Cyclic sulfone derivatives
TR199901849T2 (xx) 1997-02-03 2000-02-21 Pfizer Products Inc. Arils�lfonilamino hidroksamik asit t�revleri.
CA2279863A1 (en) 1997-02-07 1998-08-13 Pfizer Inc. N-hydroxy-beta-sulfonyl-propionamide derivatives and their use as inhibitors of matrix metalloproteinases
NZ336836A (en) 1997-02-11 2001-02-23 Pfizer Arylsulfonyl hydroxamic acid derivatives suitable for a broad range of medicinal treatments
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
CA2289102A1 (en) 1997-05-07 1998-11-12 Sugen, Inc. 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity
JP2002501532A (ja) 1997-05-30 2002-01-15 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド 新規血管形成阻害薬
ATE263147T1 (de) 1997-08-08 2004-04-15 Pfizer Prod Inc Derivate von aryloxyarylsulfonylamino hydroxyaminsäuren
ATE368665T1 (de) 1997-08-22 2007-08-15 Astrazeneca Ab Oxindolylchinazolinderivate als angiogenesehemmer
EP1017682A4 (en) 1997-09-26 2000-11-08 Merck & Co Inc NEW ANGIOGENESIS INHIBITORS
CN1280580A (zh) 1997-11-11 2001-01-17 辉瑞产品公司 用作抗癌药的噻吩并嘧啶和噻吩并吡啶衍生物
GB9725782D0 (en) 1997-12-05 1998-02-04 Pfizer Ltd Therapeutic agents
GB9800575D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
GB9800569D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
GB9801690D0 (en) 1998-01-27 1998-03-25 Pfizer Ltd Therapeutic agents
JP2002505097A (ja) 1998-03-03 2002-02-19 アブジェニックス インク． 治療薬としてのｃｄ１４７結合分子
PA8469501A1 (es) 1998-04-10 2000-09-29 Pfizer Prod Inc Hidroxamidas del acido (4-arilsulfonilamino)-tetrahidropiran-4-carboxilico
PA8469401A1 (es) 1998-04-10 2000-05-24 Pfizer Prod Inc Derivados biciclicos del acido hidroxamico
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
HUP0103617A2 (hu) 1998-05-29 2002-02-28 Sugen, Inc. Protein kinázt gátló, pirrolilcsoporttal helyettesített 2-indolszármazékok, e vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények, valamint e vegyületek alkalmazása
UA60365C2 (uk) 1998-06-04 2003-10-15 Пфайзер Продактс Інк. Похідні ізотіазолу, спосіб їх одержання, фармацевтична композиція та спосіб лікування гіперпроліферативного захворювання у ссавця
EP1105427A2 (en) 1998-08-17 2001-06-13 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US7173005B2 (en) * 1998-09-02 2007-02-06 Antyra Inc. Insulin and IGF-1 receptor agonists and antagonists
DK1004578T3 (da) 1998-11-05 2004-06-28 Pfizer Prod Inc 5-oxo-pyrrolidin-2-carboxylsyrehydroxamidderivater
KR100856446B1 (ko) 1998-12-23 2008-09-04 화이자 인크. Ｃｔｌａ－４에 대한 인간 단일클론 항체
AU3579200A (en) 1999-02-26 2000-09-14 Saltech I Goteborg Ab Method and composition for the regulation of hepatic and extrahepatic productionof insulin-like growth factor-1
KR101222450B1 (ko) 1999-03-25 2013-01-16 애보트 게엠베하 운트 콤파니 카게 사람 ｉｌ-12에 결합하는 사람 항체 및 이의 제조방법
JP4224894B2 (ja) * 1999-06-04 2009-02-18 チッソ株式会社 複合強化ポリオレフィン樹脂組成物の製造方法及びその製造装置
US20030165502A1 (en) * 2000-06-13 2003-09-04 City Of Hope Single-chain antibodies against human insulin-like growth factor I receptor: expression, purification, and effect on tumor growth
US7329745B2 (en) 2000-06-13 2008-02-12 City Of Hope Single-chain antibodies against human insulin-like growth factor I receptor: expression, purification, and effect on tumor growth
AR032028A1 (es) 2001-01-05 2003-10-22 Pfizer Anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento similar a insulina
PL222211B1 (pl) * 2001-06-26 2016-07-29 Amgen Fremont Inc Przeciwciało przeciwko OPGL, kompozycja je zawierająca, jego zastosowanie i sposób jego wytwarzania, sposób wykrywania poziomu OPGL, kompozycja obejmująca polinukleotydy i komórka gosodarza
US7538195B2 (en) * 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
WO2005016970A2 (en) 2003-05-01 2005-02-24 Imclone Systems Incorporated Fully human antibodies directed against the human insulin-like growth factor-1 receptor
KR100825156B1 (ko) * 2003-08-13 2008-04-24 화이자 프로덕츠 인코포레이티드 변형된 인간 ｉｇｆ-ｉｒ 항체
SV2006001990A (es) * 2004-01-09 2006-01-30 Pfizer Anticuerpos contra madcam
US9672526B2 (en) 2012-03-13 2017-06-06 American Express Travel Related Services Company, Inc. Systems and methods for tailoring marketing
US10884952B2 (en) 2016-09-30 2021-01-05 Intel Corporation Enforcing memory operand types using protection keys

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0302525A2 (hu) 2003-10-28
BG112197A (bg) 2016-05-31
US8642037B2 (en) 2014-02-04
JP6166243B2 (ja) 2017-07-19
ES2344592T3 (es) 2010-09-01
EE05724B1 (et) 2014-10-15
EP2194067A2 (en) 2010-06-09
US20100255538A1 (en) 2010-10-07
NO20033074L (no) 2003-07-04
PL224873B1 (pl) 2017-02-28
US7037498B2 (en) 2006-05-02
GT200100257A (es) 2002-09-02
CN1854157A (zh) 2006-11-01
TWI324609B (en) 2010-05-11
HRP20030627A2 (en) 2005-06-30
AP2001002365A0 (en) 2001-12-31
BR0116728A (pt) 2005-04-12
BG111652A (en) 2014-03-31
CA2433800C (en) 2016-09-13
PT1399483E (pt) 2010-07-20
TNSN01177A1 (fr) 2005-11-10
CR10134A (es) 2010-09-14
NZ569856A (en) 2010-03-26
BG108037A (bg) 2005-04-30
EP2275446A3 (en) 2012-08-15
EA012079B3 (ru) 2018-07-31
US20120005767A1 (en) 2012-01-05
PL217921B1 (pl) 2014-09-30
CA2433800A1 (en) 2002-07-11
UA87804C2 (ru) 2009-08-25
CN1330668C (zh) 2007-08-08
KR100830082B1 (ko) 2008-05-20
SG138469A1 (en) 2008-01-28
US20140120089A1 (en) 2014-05-01
EP2194067B1 (en) 2017-12-06
CR10786A (es) 2009-06-04
UY35948A (es) 2016-08-31
EE05715B1 (et) 2014-06-16
MX349009B (es) 2017-07-06
JP4456166B2 (ja) 2010-04-28
US20050244408A1 (en) 2005-11-03
HK1072059A1 (en) 2005-08-12
IL156661A (en) 2008-11-26
IS6866A (is) 2003-07-04
NO20033074D0 (no) 2003-07-04
HN2001000283A (es) 2002-05-09
IS2790B (is) 2012-06-15
US9234041B2 (en) 2016-01-12
US7700742B2 (en) 2010-04-20
MX337162B (es) 2016-02-15
DK1399483T3 (da) 2010-08-02
EE201300037A (et) 2014-04-15
RS51373B (sr) 2011-02-28
US20040086503A1 (en) 2004-05-06
US20050281812A1 (en) 2005-12-22
US20160096894A1 (en) 2016-04-07
NZ527302A (en) 2006-10-27
HRP20130659A2 (hr) 2013-09-30
CN1854157B (zh) 2013-01-02
CR7045A (es) 2005-09-02
ATE464322T1 (de) 2010-04-15
AU2002231368C1 (en) 2018-08-16
ECSP034711A (es) 2003-10-28
MA26040A1 (fr) 2004-04-01
EP2275446A2 (en) 2011-01-19
SV2007000775A (es) 2007-03-15
HK1203521A1 (en) 2015-10-30
PE20020801A1 (es) 2002-09-06
PL407889A1 (pl) 2014-10-13
MY143465A (en) 2011-05-13
GEP20084484B (en) 2008-09-25
BRPI0116728B1 (pt) 2018-10-30
NO339789B1 (no) 2017-01-30
EP2194067A3 (en) 2012-08-15
UY27087A1 (es) 2002-06-20
BG66460B1 (bg) 2014-10-31
WO2002053596A2 (en) 2002-07-11
ME00502B (me) 2011-10-10
OA12589A (en) 2006-06-08
EA200300766A1 (ru) 2004-06-24
US7815907B2 (en) 2010-10-19
IL156661A0 (en) 2004-01-04
CZ301712B6 (cs) 2010-06-02
EP2796468A2 (en) 2014-10-29
DE60141855D1 (de) 2010-05-27
PL366340A1 (en) 2005-01-24
HK1098162A1 (en) 2007-07-13
AU2002231368B2 (en) 2006-11-23
ZA200305995B (en) 2004-08-04
CN1564829A (zh) 2005-01-12
PL413188A1 (pl) 2016-01-18
KR20040030481A (ko) 2004-04-09
PL228041B1 (pl) 2018-02-28
JP2009297037A (ja) 2009-12-24
WO2002053596A3 (en) 2004-01-08
JP2015057428A (ja) 2015-03-26
CU23447B7 (es) 2009-10-16
YU54203A (en) 2006-03-03
MXPA03006034A (es) 2005-07-01
DZ3494A1 (fr) 2002-07-11
AR032028A1 (es) 2003-10-22
US7982024B2 (en) 2011-07-19
EE200300318A (et) 2003-10-15
EP1399483B1 (en) 2010-04-14
JP5697862B2 (ja) 2015-04-08
EP1399483A2 (en) 2004-03-24
EA012079B1 (ru) 2009-08-28
AP2072A (en) 2009-12-10
JP2004531217A (ja) 2004-10-14
CZ20032131A3 (cs) 2004-01-14
CR20140001A (es) 2014-02-05
SK9932003A3 (en) 2004-06-08
JP2009108055A (ja) 2009-05-21
PA8535501A1 (es) 2003-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2433800C (en) Antibodies to insulin-like growth factor i receptor
AU2007200793A1 (en) Antibodies to Insulin-like Growth Factor I Receptor

Legal Events

Date Code Title Description
TE4A Change of owner's address

Owner name: AMGEN FREMONT INC., THOUSAND OAKS, CA, US

Effective date: 20130429

MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20121220

MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20191220