EA012079B1 - Моноклональное антитело к рецептору инсулиноподобного фактора роста i (igf-i) и способы его применения - Google Patents

Моноклональное антитело к рецептору инсулиноподобного фактора роста i (igf-i) и способы его применения Download PDF

Info

Publication number
EA012079B1
EA012079B1 EA200300766A EA200300766A EA012079B1 EA 012079 B1 EA012079 B1 EA 012079B1 EA 200300766 A EA200300766 A EA 200300766A EA 200300766 A EA200300766 A EA 200300766A EA 012079 B1 EA012079 B1 EA 012079B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
amino acid
acid sequence
antibodies
nucleic acid
Prior art date
Application number
EA200300766A
Other languages
English (en)
Other versions
EA012079B3 (ru
EA200300766A1 (ru
Inventor
Брюс Д. Кохен
Жан Биб
Пенелопа Э. Миллер
Джеймс Д. Мойер
Хосе Р. Корвалан
Майкл Галло
Original Assignee
Пфайзер Инк.
Эмджен Фримонт Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22987016&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA012079(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Пфайзер Инк., Эмджен Фримонт Инк. filed Critical Пфайзер Инк.
Publication of EA200300766A1 publication Critical patent/EA200300766A1/ru
Publication of EA012079B1 publication Critical patent/EA012079B1/ru
Publication of EA012079B3 publication Critical patent/EA012079B3/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/517—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinazoline, perimidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/138—Aryloxyalkylamines, e.g. propranolol, tamoxifen, phenoxybenzamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/65—Insulin-like growth factors (Somatomedins), e.g. IGF-1, IGF-2
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells

Abstract

Данное изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим частям, которые специфично связываются с рецептором инсулинподобного фактора роста I (IGF-IR), который предпочтительно является IGF-IR человека. Изобретение также относится к человеческим анти-IGF-IR-антителам, включая химерные, биспецифичные, дериватизированные, одноцепочечные антитела или части слитых белков. Изобретение также относится к выделенным молекулам тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина, полученным из анти-IGF-IR-антител, и молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим такие молекулы. Данное изобретение также относится к способам получения анти-IGF-IR-антител, фармацевтическим композициям, содержащим указанные антитела, и способам применения антител и их композиций для диагностики и лечения. Изобретение также относится к способам генотерапии с использованием молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих молекулы тяжелой и/или легкой цепей иммуноглобулина, которые включают человеческие анти-IGF-IR-антитела. Изобретение также относится к способам генотерапии и трансгенным животным, содержащим молекулы нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению.

Description

Данная заявка претендует на приоритет по предварительной заявке США 60/259927, поданной 5 января 2001г.
Предпосылки изобретения
Инсулиноподобный фактор роста (ЮР-1) является полипептидом с М.м. 7,5 кД, циркулирующим в плазме в высоких концентрациях и обнаруживаемым в большинстве тканей. ЮР-1 стимулирует дифференцировку и пролиферацию клеток и необходим для длительной пролиферации большинства типов клеток млекопитающих. Указанные типы клеток, помимо прочих, включают в себя диплоидные фибробласты, эпителиальные клетки, гладкомышечные клетки, Т-лимфоциты, нервные клетки, миелоидные клетки, хондроциты, остеобласты и стволовые клетки костного мозга человека. С целью обзора обширного множества типов клеток, в которых клеточная пролиферация опосредована взаимодействием ЮР-1/ЮРΙ-рецептора, см. Со1бгшд е! а1., Еикаг. Сеие Ехргекк., 1: 31-326 (1991).
Первым этапом пути трансдукции, ведущего к стимулируемой 1СР-1 пролиферации или дифференцировке клеток, является связывание 1СР-1 или 1СР-11 (или инсулина в концентрациях выше физиологических) с рецептором 1СР-1. Рецептор 1СР-1 состоит из субъединиц двух типов: альфа-субъединицы (полностью внеклеточный белок в 130-135 кД, который функционирует при связывании с лигандом) и бета-субъединицы (трансмембранный белок в 95 кД с трансмембранным и цитоплазматическим доменами). 1СР-1К относится к семейству тирозинкиназных рецепторов факторов роста (и11г1сП е! а1., Се11 61: 203-212, 1990) и по структуре сходен с рецептором инсулина (ИПпсй е! а1., ЕМВО 1. 5: 2503-2512, 1986). ЮР-ΙΚ. сначала синтезируется в виде одноцепочечного полипептида прорецептора, который затем подвергается процессингу посредством гликозилирования, протеолитического расщепления и ковалентного связывания, образуя зрелый гетеротетрамер с М.м. 460 кД, содержащий две альфа-субъединицы и две бета-субъединицы. Бета-субъединица(цы) обладает активируемой лигандом тирозинкиназной активностью. Указанная активность участвует в путях передачи сигнала, которыми опосредовано действие лиганда, заключающееся в аутофосфорилировании бета-субъединицы и фосфорилировании субстратов 1СР-1К.
Уровни 1СР-1 в сыворотке ίη νίνο зависят от присутствия гипофизарного гормона роста (СН). Хотя печень является основным местом зависимого от СН синтеза 1СР-1, недавняя работа показала, что большинство нормальных тканей также продуцируют 1СР-1. Множество неопластических тканей также могут продуцировать 1СР-1. Таким образом, 1СР-1 может действовать как регулятор нормальной и аномальной пролиферации клеток посредством аутокринного или паракринного, а также эндокринного механизмов. 1СР-1 и 1СР-11 связываются с 1СР-связывающими белками (1СРВР) ίη νίνο. Доступность свободного 1СР для взаимодействия с 1СР-1К модулируется 1СРВР. Для обзора 1СРВР и 1СР-1 см. СптЬегд е! а1., 1. Се11. РЬу8ю1. 183: 1-9, 2000.
Есть немало доказательств роли 1СР-1 и/или 1СР-1К в поддержании опухолевых клеток ίη νί!το и ίη νίνο. Уровни ЮР-ΙΚ повышены в опухолях легкого (Кащет е! а1., 1. Сансег Кек. С1ш. Опсо1. 119: 665-668, 1993; Мообу е! а1., Ьйе Зие^ек 52: 1161-1173, 1993; Масаи1еу е! а1., Сансе!· Кек., 50: 2511-2517, 1990), молочной железы (Ро11ак е! а1., Саисег Ьей. 38: 223-230, 1987; Роекенк е! а1., Саисег Кек. 49: 7002-7009, 1989; СнПеи е! а1., Саисег Кек. 49: 7002-7009, 1990; Айеада е! а1., 1. С1ш. ΙηνΌκΙ. 84: 1418-1423, 1989), простаты и толстой кишки (Κетаο1е-Веηие! е! а1., 1. С1ш. Еп6осппо1. Ме!аЬ. 75: 609-616, 1992; Сио е! а1., Сак1гоегИего1. 102: 1101-1108, 1992). Нерегулируемая экспрессия 1СР-1 в эпителии простаты ведет к неоплазии у трансгенных мышей (ОЮюуш1ш е! а1., Ргос. ИаЙ. Асаб. 8ск И8А 97: 3455-60, 2000). Кроме того, оказалось, что 1СР-1 является аутокринным стимулятором глиом человека (8апбЬе^д-Nο^б^ν^к! е! а1., Сансе!· Кек. 53: 2475-2478, 1993), в то время как 1СР-1 стимулировал рост фибросарком, которые сверхэкспрессировали 1СР-1К (Вийет е! а1., Саасег Кек. 58: 3021-27, 1998). Кроме того, для субъектов с «высокими нормальными» уровнями 1СР-1 повышен риск развития общих злокачественных опухолей по сравнению с субъектами с уровнями 1СР-1 в «низких нормальных» пределах (Кокен е! а1., Тгеибк Еп6осппо1. Ме!аЬ. 10: 136-41, 1999). Многие из указанных типов опухолевых клеток отвечают на 1СР-1 пролиферативным сигналом в культуре (ИакагакЫ е! а1., 1. С1ш. Муек! 82: 354-359, 1988; Ргееб е! а1., 1. Мо1. Еп6осппо1. 3: 509-514, 1989), и высказано предположение об аутокринной или паракринной петлях пролиферации ίη νίνο (ЬеКойй е! а1., Епбосипе Кетк. 16: 143-163, 1995; Уее е! а1., Мо1. Еп6осппо1. 3: 509-514, 1989). Для обзора того, какую роль взаимодействие 1СР-1/1СР-1-рецептор играет в росте различных опухолей человека, см. Масаи1ау, Вг. 1. Сшсет, 65: 311-320, 1992.
Повышенные уровни 1СР-1 также коррелируют с несколькими незлокачественными патологическими состояниями, включая акромегалию и гигантизм (Ваткащ С^е^б С1ш. 1. Меб. 65: 343, 347-349, 1998), в то время как аномальное функционирование 1СР-1/1СР-1-рецептор вовлечено в псориаз (^та1дй! е! а1., №11. Вю!есй. 18: 521-526, 2000), атеросклероз и рестеноз гладкой мускулатуры кровеносных сосудов после ангиопластики (Вауек-Сешк е! а1., Сйс. Кек. 86: 125-130, 2000). Повышенные уровни 1СР-1 также могут быть проблемой при диабете и его осложнениях, таких как пролиферация микрососудов (81Ш111 е! а1., Иа!. Меб. 5: 1390-1395, 1999). Пониженные уровни 1СР-1, которые, в частности, могут иметь место в тех случаях, когда уровни СН в сыворотке снижены или когда существует нечувствительность или резистентность к СН, связаны с такими нарушениями, как маленький рост (Кающ Раеб1а!г. Итидк 1: 155-159, 1999), нейропатия, уменьшение мышечной массы и остеопороз (Кокен е! а1., Тгеибк Еп6осппо1.
- 1 012079
Ме!аЬ. 10: 136-141, 1999).
С использованием антисмысловых экспрессирующих векторов или антисмысловых олигонуклеотидов к РНК ЮР-ΙΚ было показано, что воздействие ЮР-ΙΚ приводит к ингибированию опосредованного ЮР-Ι или опосредованного ЮГ-П роста клеток (см., например, Χνηίβΐιΐ е! а1., №11. Вю!есй. 18: 521-526, 2000). Антисмысловая стратегия оказалась успешной при ингибировании клеточной пролиферации в нескольких нормальных типах клеток и линиях клеток опухолей человека. Рост также можно ингибировать с использованием пептидного аналога ЮР-Ι (Рк1гхко\укк| е! а1., Се11 Сго\\111 аиб Όί££. 3: 199-205, 1992; и Рк1г/ко\\'кк| е! а1., Мо1. Се11. Вю1., 12: 3883-3889, 1992), или вектора, экспрессирующего антисмысловую РНК к РНК ЮР-Ι (Тго)ап е! а1., 8с1еисе 259: 94-97, 1992). Кроме того, антитела к ЮР-ΙΚ (Лйеада е! а1., Вгеак! Саис. Кек. Тгеа1т., 22: 101-106, 1992; и Ка1еЫс е! а1., Саисег Кек. 54: 5531-5534, 1994) и доминантные негативные мутанты ЮР-ΙΚ (Ргадег е! а1., Ргос. N111. Асаб. 8ст ϋ.δ.Ά. 91: 21812185, 1994; Ы е! а1., 1. Вю1. СИет., 269: 32558-32564, 1994 и Паи§ е! а1., Опсодепе 18: 6071-77, 1999) могут реверсировать трансформированный фенотип, ингибировать образование опухолей и индуцировать потерю метастазирующего фенотипа.
ЮР-Ι также имеет важное значение в регуляции апоптоза. Апоптоз, который является запрограммированной гибелью клеток, вовлечен в широкое множество процессов развития, включая созревание иммунной и нервной системы. Сделан вывод, что кроме роли в развитии апоптоз также является важной клеточной защитой от образования опухолей (^1Шатк, Се11 65: 1097-1098, 1991; Ьаие, №!иге 362: 786787, 1993). Подавление программы апоптоза за счет множества генетических повреждений может вносить вклад в развитие и прогрессирование злокачественных новообразований.
ЮР-Ι защищает ΙΕ-3-зависимые гемопоэтические клетки от апоптоза, индуцированного удалением цитокина (Кобгщиех-Тагбисйу. 6. е! а1., 1. Iттиио1. 149: 535-540, 1992), и клетки Ка!-1/тусЕК при удалении сыворотки (Натид!ои, Е., е! а1., ЕМВО 1. 13: 3286-3295, 1994). Противоапоптозная функция ЮР-Ι имеет важное значение на стадии, следующей после задержки клеточного цикла, а также в клетках, прохождение клеточного цикла которых блокировано этопозидом или тимидином. Демонстрация того, что жизнеспособность регулируемых с-тус фибробластов зависит от ЮР-Ι, свидетельствует о том, что ЮРΙΚ играет важную роль в поддержании опухолевых клеток посредством специфичного ингибирования апоптоза, роль, отличную от пролифератизного действия ЮР-Ι или ЮР-ΙΚ. Это подобно той роли, которую, как считается, играют другие противоапоптозные гены, такие как Ьс1-2 в стимулировании жизнеспособности опухолей (МсЭоииеН е! а1., Се11 57: 79-88, 1989; НоскеиЬеггу е! а1., №Шге 348: 334-336, 1990).
Защитное действие ЮР-Ι от апоптоза зависит от имеющихся ЮР-ΙΚ, присутствующих на клетках для взаимодействия с ЮР-Ι (ЮкикоН е! а1., Саисег Век. 55: 3739-3741, 1995). Подтверждение противоапоптозной функции ЮР-ΙΚ при поддержании опухолевых клеток также получили при исследовании с использованием антисмысловых олигонуклеотидов к ЮР-ΙΚ, в котором выявлена количественная взаимосвязь между уровнями ЮР-ΙΚ, степенью апоптоза и канцерогенным потенциалом сингенной опухоли крыс (^^^£1 е! а1., Саисег Иек. 55: 3739-3741, 1995). Обнаружено, что сверхэкспрессированный ЮР-ΙΚ защищает опухолевые клетки ш νίΙΐΌ от апоптоза, индуцированного этопозидом (8е11 е! а1., Саисег Век. 55: 303-306, 1995), и, что еще более поразительно, что снижение уровней ЮР-ΙΚ ниже уровней дикого типа вызывало массовый апоптоз опухолевых клеток 1и νί\Ό (ЮкикоН е! а1., Саисег Еек. 55: 2463-2469, 1995).
Возможная методика индукции апоптоза или ингибирования клеточной пролиферации, связанной с повышенными уровнями ЮР-Ι, повышенными уровнями ЮР-ΙΙ и/или повышенными уровнями рецептора ЮР-ΙΚ, включает подавление уровней ЮР-Ι или уровней ЮР-ΙΙ или предотвращение связывания ЮР-Ι с ЮР-ΙΚ. Например, длительно действующий аналог соматостатина октреотид использовали для снижения синтеза и/или секреции ЮР. Растворимый ЮР-ΙΚ использовали для того, чтобы индуцировать апоптоз в опухолевых клетках ш у1уо и ингибировать образование опухоли в экспериментальной системе на животных (Э'ЛтЬгокю е! а1., Саисег Еек. 56: 4013-20, 1996). Кроме того, антисмысловые олигонуклеотиды ЮР-ΙΚ, пептидные аналоги ЮР-Ι и антитела к ЮР-ΙΚ использовали для снижения экспрессии ЮР-Ι или ЮР-ΙΚ (см. выше). Однако ни одно из указанных соединений не подходило для долговременного введения больным людям. Кроме того, несмотря на то, что ЮР-Ι вводили пациентам для лечения низкого роста, остеопороза, пониженной мышечной массы, нейропатии или диабета, связывание ЮР-Ι с ЮРВР часто делало лечение ЮР-Ι трудным или неэффективным.
Таким образом, принимая во внимание роль, которую играют ЮР-Ι и ЮР-ΙΚ в таких нарушениях, как рак и другие пролиферативные расстройства, в том случае, когда ЮР-Ι и/или ЮР-ΙΚ сверхэкспрессированы, и роли, которые играют слишком малые количества ЮР-Ι и ЮР-ΙΚ при таких нарушениях, как низкий рост и хрупкость костей, в том случае, когда либо ЮР-Ι, и/или ЮР-ΙΚ недоэкспрессированы, было бы желательно создать антитела к ЮР-ΙΚ, которые можно использовать либо для ингибирования, либо для стимулирования ЮР-ΙΚ. Хотя сообщалось, что анти-ЮР-IΚ-антитела были обнаружены у некоторых пациентов с аутоиммунными заболеваниями, ни одно из обнаруженных антител не было очищено и не было показано ни для одного из них, что оно подходит для ингибирования активности ЮР-Ι для диагностических и клинических способов. См., например, ТИотркои е! а1., Реб1а!. Век. 32: 455-459, 1988; Тарру е! а1., Э1аЬе!ек 37: 1708-1714, 1988; ^е^Ытаи е! а1., Ли!о1ттиш1у 16: 251-257, 1993; Эгехйаде е! а1., №!йег. 1. о£ Меб. 45: 285-293, 1994. Таким образом, является актуальным получение высокоаффин
- 2 012079 ных анти-ЮР-ТВ-антител человека, которые можно использовать для лечения заболеваний у людей.
Краткое описание фигур
На фиг. 1А-1С показано сопоставление нуклеотидных последовательностей вариабельных областей легких цепей шести анти-ЮР-ТВ-антител человека по отношению друг к другу и к последовательностям зародышевой линии. На фиг. 1А показано сопоставление нуклеотидных последовательностей вариабельной области легкой цепи (УЬ) антител 2.12.1 (8Ер ГО N0: 1), 2.13.2 (8ЕО ГО N0: 5), 2.14.3 (8ЕО ГО N0: 9) и 4.9.2 (8Е0 ГО N0: 13) друг с другом и с последовательностью Ук А30 зародышевой линии (8Е0 ГО N0: 39). На фиг. 1В показано сопоставление нуклеотидной последовательности УЬ антитела 4.17.3 (8Е0 ГО N0: 17) с последовательностью Ук 012 зародышевой линии (8Е0 ГО N0: 41). На фиг. 1С показано сопоставление нуклеотидной последовательности УЬ антитела 6.1.1 (8Е0 ГО N0: 21) с последовательностью Ук А27 зародышевой линии (8Е0 ГО N0: 37). Также показаны сопоставления СОВ-областей УЬ из каждого антитела. Консенсусные последовательности для фиг. 1А-1С показаны в 8Е0 ГО N0: 53-55, соответственно.
На фиг. 2Α-2Ό показаны сопоставления нуклеотидных последовательностей вариабельных областей тяжелых цепей шести анти-ТСР-ТВ-антител человека по отношению друг к другу и к последовательностям зародышевой линии. На фиг. 2А показано сопоставление нуклеотидной последовательности УН антитела 2.12.1 (8Е0 ГО N0: 3) с последовательностью УН ΌΡ-35 зародышевой линии (8Е0 ГО N0: 29). На фиг. 2В показано сопоставление нуклеотидной последовательности УН антитела 2.14.3 (8Е0 ГО N0: 11) с последовательностью У1У-4/4.35 зародышевой линии (8Е0 ГО N0: 43). На фиг. 2С-1 и 2С-2 показаны сопоставления нуклеотидных последовательностей УН антител 2.13.2 (8Е0 ГО N0: 7), 4.9.2 (8Е0 ГО N0: 15) и 6.1.1 (8Е0 ГО N0: 23) друг с другом и с последовательностью УН ΌΡ-47 зародышевой линии (8Е0 ГО N0: 31). На фиг. 2Ό показано сопоставление нуклеотидной последовательности УН антитела 4.17.3 (8Е0 ГО N0: 19) с последовательностью УН ΌΡ-71 зародышевой линии (8Е0 ГО N0: 35). Также показаны сопоставления СГОВ-областей антител. Консенсусные последовательности для фиг. 2Α-2Ό показаны в 8Е0 ГО N0: 56-59, соответственно.
На фиг. 3 показано, что анти-ТСР-ТВ-антитела 2.13.2, 4.9.2 и 2.12.1 ингибируют связывание ЮР-1 с клетками 3Т3-ЮР-1В.
На фиг. 4 показано, что анти-ЮР-ГВ-антитело 4.9.2 ингибирует индуцированное ЮР-1 фосфорилирование рецептора тирозина (верхняя панель) и индуцирует понижающую регуляцию ЮР-ТВ на поверхности клеток (нижняя панель).
На фиг. 5 показано, что анти-ЮР-1В-антитела 2.13.2 и 4.9.2 уменьшают сигнал фосфотирозина ЮРТВ в опухолях 3Т3-ТСР-ТВ.
На фиг. 6 показано, что анти-ЮР-ТВ-антитела 2.13.2 и 4.9.2 уменьшают количество ЮР-ТВ в опухолях 3Т3-ТСР-ТВ.
На фиг. 7 показано, что анти-ЮР-ТВ-антитело 2.13.2 отдельно (левая панель) или в комбинации с адриамицином (правая панель) ингибирует рост опухоли 3Т3-ЮР-ТВ ίη νίνο.
На фиг. 8 показана взаимосвязь между уровнями анти-ЮР-ТВ-антитела 2.13.2 в сыворотке и понижающей регуляцией ЮР-ТВ в опухолях 3Т3-ЮР-ТВ.
На фиг. 9 показано, что многократные дозы анти-ЮР-ТВ-антитела 2.13.2 отдельно или в комбинации с адриамицином ингибируют рост опухоли 3Т3-ЮР-ТВ ίη νίνο.
На фиг. 10 показано, что анти-ЮР-ТВ-антитело 2.13.2 в комбинации с адриамицином ингибирует рост крупной опухоли ίη νίνο.
На фиг. 11 показано, что анти-ЮР-ТВ-антитело 2.13.2 отдельно или в комбинации с 5-дезоксиуридином (5-РИ) ингибирует рост опухоли Со1о 205 ίη νίνο.
На фиг. 12 показано, что многократные дозы анти-ЮР-ТВ-антитела 2.13.2 отдельно или в комбинации с 5-РИ ингибируют рост опухоли Τ’οίο 205 ίη νίνο.
На фиг. 13 показано, что многократные дозы анти-ЮР-ТВ-антитела 2.13.2 отдельно или в комбинации с таксолом ингибируют рост опухоли МСР-7 ίη νίνο.
На фиг. 14 показано, что анти-ЮР-ТВ-антитело 2.13.2 отдельно (левая панель) или в комбинации с адриамицином (правая панель) ингибирует рост опухоли МСР-7 ίη νίνο.
На фиг. 15 показано, что многократные дозы анти-ЮР-ТВ-антитела 2.13.2 отдельно или в комбинации с тамоксифеном ингибируют рост опухоли МСР-7 ίη νίνο.
На фиг. 16 показано, что многократные дозы анти-ЮР-ТВ-антитела 2.13.2 отдельно или в комбинации с ингибитором тирозинкиназы рецептора эпидермального фактора роста (ЕСР-В) СР-358774 ингибируют рост опухоли А431 ίη νίνο.
На фиг. 17 показана фармакокинетическая оценка однократной внутривенной инъекции анти-ЮРТВ-антитела 2.13.2 макакам-крабоедам.
На фиг. 18 показано, что комбинация анти-ЮР-ТВ-антитела 2.13.2 и адриамицина увеличивает понижающую регуляцию ТСР-ТВ на опухолях 3Т3-ТСР-ТВ ίη νίνο.
На фиг. 19 А показан ряд мутаций в различных областях тяжелой и легкой цепей 2.13.2 и 2.12.1 по сравнению с последовательностями зародышевой линии.
На фиг. 19В-Е показаны сопоставления аминокислотных последовательностей тяжелой и легкой
- 3 012079 цепей антител 2.13.2 и 2.12.1 с последовательностями зародышевой линии, из которых они получены. На фиг. 19В показано сопоставление аминокислотной последовательности тяжелой цепи антитела 2.13.2 (8ЕО ΙΌ N0: 45) с последовательностью зародышевой линии ΌΡ-47 (3-23)/О6-19/1Нб (8Е0 ГО N0: 46). На фиг. 19С показано сопоставление аминокислотной последовательности легкой цепи антитела 2.13.2 (8Е0 ГО N0: 47) с последовательностью зародышевой линии Л30/1к2 (8Е0 ГО N0: 48). На фиг. 19Ό показано сопоставление аминокислотной последовательности тяжелой цепи антитела 2.12.1 (8Е0 ГО N0: 49) с последовательностью зародышевой линии ΌΡ-35 (3-11)/ϋ3-3/1Η6 (8Е0 ΙΌ N0: 50). На фиг. 19Е показано сопоставление аминокислотной последовательности легкой цепи антитела 2.12.1 (8Е0 ГО N0: 51) с последовательностью зародышевой линии А30/1к1 (8Е0 ГО N0: 52). На фиг. 19В-Е сигнальные последовательности указаны курсивом, СЭВ подчеркнуты, вариабельные домены выделены жирным шрифтом, мутации каркасной области (ЕВ) выделены знаком плюс («+») над остатком аминокислоты и мутации СОВ выделены звездочкой над остатком аминокислоты.
Сущность изобретения
Данное изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающей части, которая связывает ЮЕ-1В, предпочтительно к антителу, которое связывает ЮЕ-1В примата или человека, и более предпочтительно к антителу, которое является антителом человека. Изобретение относится к антиЮЕ-1В-антителу, которое ингибирует связывание ЮЕ-Ι или ΙΟΡ-ΙΙ с ЮЕ-ΙΒ, а также относится к антиЮЕ-1В-антителу, которое активирует ЮЕ-ГВ.
Изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать другой компонент, такой как противоопухолевый агент или реагент для визуализации.
Изобретение также относится к диагностическим и терапевтическим способам. Диагностические способы включают способ диагностики наличия или локализации ткани, экспрессирующей ЮЕ-Ш, с использованием анти-ЮЕ-ЕВ-антитела. Терапевтический способ включает введение антитела нуждающемуся в этом субъекту, предпочтительно в сочетании с другим терапевтическим средством.
Изобретение относится к выделенной линии клеток, такой как гибридома, которая продуцирует анти-IСЕ-IΒ-антитело.
Изобретение также относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующих тяжелую и/или легкую цепь анти-IСЕ-IΒ-антитела или их антигенсвязывающие части. Изобретение относится к векторам и клеткам-хозяевам, содержащим молекулы нуклеиновых кислот, а также к способам рекомбинантного получения полипептидов, кодируемых молекулами нуклеиновых кислот.
Также представлены трансгенные животные, отличные от человека, которые экспрессируют тяжелую и/или легкую цепь анти-IСЕ-IΒ-антитела или их антигенсвязывающие части. Изобретение также относится к способу лечения нуждающегося в этом субъекта с помощью эффективного количества молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую и/или легкую цепь анти-IСЕ-IΒ-антитела или их антигенсвязывающие части.
Подробное описание изобретения
Определения и общие способы
Если не оговорено особо, научные и технические термины, используемые в связи с данным изобретением, будут иметь значения, которые обычно подразумеваются специалистами в данной области. Кроме того, если не подразумевается иное, исходя из контекста, термины в единственном числе будут включать понятие во множественном числе, а термины во множественном числе будут включать единственное число. Как правило, используемая номенклатура и методики, связанные с культурой клеток и тканей, молекулярной биологией, иммунологией, микробиологией, генетикой и химией белков и нуклеиновых кислот и гибридизацией, приведенные в данном описании, являются хорошо известными и обычно используемыми в данной области. Способы и методики согласно данному изобретению обычно осуществляют в соответствии со стандартными способами, хорошо известными в данной области, и так, как описано в различных общих и более конкретных источниках информации, которые цитированы и обсуждаются в данном описании, если не указано особо. См., например, 8атЬтоок е! а1. Мо1еси1аг С1ои1ид: А ЬаЬога1оту Мапиа1, 26 еб., Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога1оту Рге§8, Со1б 8рппд НагЬог, N. Υ. (1989) и Аи8иЬе1 е! а1., Ситтеп! РтоФсок ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Огеепе РиЫкЫпд А55ос1а1е5 (1992), и Наг1о\у апб Ьапе Ап6Ьоб1е§: А ЬаЬогаФту Мапиа1 Со1б 8рппд НагЬог БаЬогаЮгу Рге§8, Со1б 8рппд НагЬог, N. Υ. (1990), которые включены в данное описание в виде ссылки. Ферментативные реакции и способы очистки выполняют согласно описаниям производителя, которые обычно прилагаются в данной области, или как описано в данной заявке. Используемая номенклатура и лабораторные способы, связанные с аналитической химией, химией органического синтеза и медицинской и фармацевтической химией, приведенные в данном описании, хорошо известны и широко используются в данной области. Стандартные способы используют в случае химического синтеза, химического анализа, фармацевтического препарата, композиции и доставки и лечения пациентов.
Если не оговорено особо, следует понимать, что следующие термины имеют нижеприведенные значения.
Термин «полипептид» охватывает нативные или искусственные белки, белковые фрагменты и по
- 4 012079 липептидные аналоги последовательности белка. Полипептид может быть мономерным или полимерным.
Термин «выделенный белок» или «выделенный полипептид» означает белок или полипептид, которые в силу своей природы или источника происхождения: (1) не связаны с компонентами, связанными в природных условиях, которые сопутствуют ему в нативном состоянии, (2) не содержат других белков из того же самого вида, (3) экспрессируются клеткой другого вида или (4) не встречаются в природе. Таким образом, полипептид, который синтезирован химическим путем или синтезирован в клеточной системе, отличной от клетки, из которой он происходит в естественных условиях, будет «выделенным» от связанных с ним в природе компонентов. Белок также можно сделать в значительной степени свободным от компонентов, связанных с ним в природных условиях, посредством выделения с использованием способов очистки белка, хорошо известных в данной области.
Белок или полипептид является «в значительной степени чистым», «в значительной степени гомогенным» или «в значительной степени очищенным» в том случае, когда по меньшей мере примерно 6075% образца представлено одним видом полипептида. Полипептид или белок может быть мономерным или полимерным. В значительной степени чистый полипептид или белок обычно будет содержать примерно 50, 60, 70, 80 или 90% мас./мас. образца белка, более обычно примерно 95% и предпочтительно будет очищен более чем на 99%. Чистота или гомогенность белка может быть показана рядом способов, хорошо известных в данной области, таких как электрофорез образца белка в полиакриламидном геле с последующей визуализацией отдельной полосы полипептида при окрашивании геля красителем, хорошо известным в данной области. Для некоторых целей более высокое разрешение можно получить с использованием ВЭЖХ или других способов, хорошо известных в данной области для очистки. Термин «полипептидный фрагмент» в используемом в данном описании смысле относится к полипептиду, который имеет делецию по аминоконцу и/или по карбоксильному концу, но в котором сохраняется аминокислотная последовательность, идентичная соответствующим положениям последовательности природного происхождения. Обычно фрагменты имеют длину по меньшей мере из 5, 6, 8 или 10 аминокислот, предпочтительно имеют длину, по меньшей мере равную 14 аминокислотам, более предпочтительно длину, по меньшей мере равную 20 аминокислотам, обычно длину, по меньшей мере равную 50 аминокислотам, еще более предпочтительно длину, по меньшей мере равную 70, 80, 90, 100, 150 или 200 аминокислотам.
Термин «аналог полипептида» в используемом в данном описании смысле относится к полипептиду, который состоит из участка по меньшей мере из 25 аминокислот, который в значительной степени идентичен части аминокислотной последовательности и который обладает по меньшей мере одним из следующих свойств: (1) специфичное связывание с ЮР-ΙΒ при подходящих условиях связывания, (2) способность блокировать связывание ЮР-Ι или ЮР-ΙΙ с ЮР-ΙΒ или (3) способность уменьшать экспрессию ЮР-ΙΒ на поверхности клеток или фосфорилирование тирозина ίη νίίτο или ίη νίνο. Обычно аналоги полипептида содержат консервативную аминокислотную замену (или инсерцию или делецию) относительно последовательности природного происхождения. Обычно аналоги имеют длину, равную по меньшей мере 20 аминокислотам, предпочтительно длину, равную по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 или 200 аминокислотам или длиннее, и часто могут иметь длину полноразмерного полипептида природного происхождения.
Предпочтительными аминокислотными заменами являются замены, которые: (1) уменьшают чувствительность к протеолизу, (2) уменьшают чувствительность к окислению, (3) изменяют аффинность связывания при образовании белковых комплексов, (4) изменяют аффинности связывания и (4) придают или модифицируют другие физико-химические или функциональные свойства таких аналогов. Аналоги могут включать различные мутеины с последовательностью, отличной от последовательности пептида природного происхождения. Например, можно произвести единичные или множественные аминокислотные замены (предпочтительно консервативные аминокислотные замены) в последовательности природного происхождения (предпочтительно в части полипептида вне домена(нов), образующего внутримолекулярные контакты). Консервативная аминокислотная замена не должна в значительной степени изменять структурные характеристики исходной последовательности (например, замена аминокислоты не должна способствовать разрушению спирали, которая имеется в исходной последовательности, или разрушать другие типы вторичной структуры, которые характеризуют исходную последовательность). Примеры общеизвестных в данной области вторичных и третичных структур полипептидов описаны в ΡΐΌΐοίηχ 8йис1ше8 апб Мо1еси1аг Ргшар1ек (Сге^Поп, Еб., \У.Н. Ргеетап апб Сотрапу, Νο\ν Уогк (1984)); ΙηΐΓθ6υοΙίοη ΐο Рго1еш 81гисШге (С. Вганбен анб 1. Тоохе, ебк., СаНанб ΡπόΙίδΗιηβ, №\ν Уогк, Ν. Υ. (1991)); и ΤΙιοιτιΙοη е! а!. №1Шге 354: 105 (1991), которые включены в данное описание в виде ссылки.
Непептидные аналоги широко используют в фармацевтической промышленности в качестве лекарственных средств со свойствами, аналогичными свойствам матричного пептида. Указанные типы непептидного соединения называют «миметиками пептида» или «пептидомиметиками». Раисйете, 1. Абу. Эгид Век. 15: 29 (1986); УеЬет аиб Рге1бшдег ΤΙΝ8 р. 392 (1985); и Еуаш е! а1. 1. Меб. Сйет. 30: 1229 (1987), которые включены в данное описание в виде ссылки. Такие соединения часто разрабатывают с помощью компьютеризованного молекулярного моделирования. Миметики пептидов, которые структурно сходны с терапевтически полезными пептидами, можно использовать для получения эквивалентного терапевтического или профилактического действия. Как правило, пептидомиметики структурно сходны с образ
- 5 012079 цом полипептида (т.е. полипептидом, который обладает требуемым биохимическим свойством или фармакологической активностью), таким как антитело человека, но имеют одну или более пептидных связей, необязательно замененных связью, выбранной из группы, состоящей из -СН2№Н-, -СН2З-, -СН2-СН2-, -СН=СН- (цис- и транс-), -СОСН2-, -СН(ОН)СН2- и -СН2З0-, способами, хорошо известными в данной области. Направленную замену одной или более аминокислот консенсусной последовательности Ό-аминокислотой того же самого типа (например, Ό-лизином вместо Ь-лизина) также можно использовать для создания более стабильных пептидов. Кроме того, ограниченные пептиды, содержащие консенсусную последовательность или в значительной степени идентичный вариант консенсусной последовательности, можно создать способами, известными в данной области (Κίζο апб С1ега8сб Апп. Кеу. Вюсбет. 61: 387 (1992), включенная в данное описание в виде ссылки), например добавлением внутренних остатков цистеина, способных образовывать внутримолекулярные дисульфидные мостики, которые циклизуют пептид.
«Иммуноглобулин» является тетрамерной молекулой. В иммуноглобулине природного происхождения каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, при этом каждая пара имеет одну «легкую» (примерно 25 кД) и одну «тяжелую» цепь (примерно 50-70 кД). Аминоконцевая часть каждой цепи включает вариабельную область длиной примерно от 100 до 110 или более аминокислот, главным образом, ответственных за узнавание антигена. Часть карбоксильного конца каждой цепи определяет константную область, главным образом, ответственную за эффекторную функцию. Легкие цепи иммуноглобулина человека классифицируют как легкие цепи к и λ. Тяжелые цепи подразделяют на μ, Δ, γ, α или ε, и изотипы антител определяют как 1дМ, 1дЭ. 1дС. 1дА и 1дЕ, соответственно. В легких и тяжелых цепях вариабельные и константные области связаны областью «1» примерно из 12 или большего количества аминокислот, при этом тяжелая цепь также содержит область «Ό» еще примерно из 10 или более аминокислот. В общих чертах, см. Еипбашеп1а1 1ттипо1оду Сб. 7 (Раи1, ^., еб., 2пб еб. Рагеп Ргекк, Ν. Υ. (1989)) (включена в виде ссылки в полном объеме для всех целей). Вариабельные области каждой пары легкая/тяжелая цепь образуют связывающий сайт антитела, так что интактный иммуноглобулин имеет два связывающих сайта.
Для цепей иммуноглобулинов обнаружена одна и та же общая структура из относительно консервативных каркасных областей (РК), связанных тремя гипервариабельными областями, также называемыми областями, определяющими комплементарность, или СОК. СОК из двух цепей каждой пары сопоставлены посредством каркасных областей, обеспечивая при этом связывание со специфичным эпитопом. От Ν-конца к С-концу и легкая, и тяжелая цепи содержат домены РК1, СОРТ, РК2, СОК2, РК3, СЭК3 и РК4. Распределение аминокислот в каждом домене соответствует определениям Каба! Зесщепсех οί Рго1еб15 οί 1ттипо1о§1са1 1п1еге8( (№абопа1 1п8б1и1е8 οί Неабб, ВеШекба, Мб. (1987 апб 1991)) или Сбо1Ыа апб Ьекк 1. Мо1. Βίο1. 196: 901-917 (1987); Сбо1Ыа е! а1. №а!иге 342: 878-883 (1989).
«Антитело» относится к интактному иммуноглобулину или к его антигенсвязывающей части, которая конкурирует с интактным антителом за специфичное связывание. Антигенсвязывающие части можно получить способами на основе рекомбинантной ДНК или ферментативным или химическим расщеплением интактных антител. Антигенсвязывающие части включают наряду с другими фрагменты Раб, Раб', Р(аЬ')2, Ρν, бАб и фрагменты гипервариабельной области (СОК), одноцепочечные антитела (ксРу), химерные антитела, диантитела и полипептиды, которые содержат по меньшей мере часть иммуноглобулина, которая достаточна для придания полипептиду способности специфично связывать антиген.
В используемом в данном описании смысле антитело, которое названо, например, 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 4.9.2, 4.17.3 и 6.1.1, является антителом, которое получают из гибридомы с таким же названием. Например, антитело 2.12.1 получают из гибридомы 2.12.1.
Раб-фрагмент является моновалентным фрагментом, состоящим из доменов УЬ, УН, СЬ и СН I; Р(аб')2-фрагмент является бивалентным фрагментом, содержащим два Раб-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в области шарнира; Рб-фрагмент состоит из доменов УН и СН1; Ρν-фрагмент состоит из доменов УЪ и УН одного плеча антитела; и бАб-фрагмент (^атб е! а1., №а!иге 341: 544-546, 1989) состоит из домена УН.
Однсцепочечное антитело (δ№ν) является антителом, в котором области УЪ и УН спарены, образуя моновалентные молекулы, посредством синтетического линкера, который дает возможность образовать из них одну белковую цепь (Впб е! а1., 8с1еисе 242: 423-426, 1988 и Нийои е! а1., Ргос. №111. Асаб. Зск ИЗА 85: 5879-5883, 1988). Диантитела являются бивалентными, биспецифичными антителами, в которых домены УН и УЪ экспрессированы в виде одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который слишком короткий, чтобы обеспечить спаривание между двумя доменами на одной и той же цепи, тем самым, усиливая спаривание доменов с комплементарными доменами другой цепи и создавая при этом два антигенсвязывающих сайта (см., например, НоШдет, Р., е! а1., Ргос. №16. Асаб. За. ИЗА 90: 6444-6448, 1993 и РоЩак, К.1., е! а1., Збис!ите 2: 1121-1123, 1994). Один или более СОК можно включить в молекулу либо ковалентно, либо нековалентно, чтобы превратить ее в иммуноадгезин. Иммуноадгезин может содержать СОК в виде части большей по размеру полипептидной цепи, может содержать СОК, ковалентно связанные с другой полипептидной цепью, или может содержать СОК, связанный(ые) нековалентно. СОК дают возможность иммуноадгезину специфично связываться с конкретным представ
- 6 012079 ляющим интерес антигеном.
Антитело может иметь один или более сайтов связывания. В том случае, если имеется более одного сайта связывания, связывающие сайты могут быть идентичными по отношению друг к другу или могут быть разными. Например, иммуноглобулин природного происхождения имеет два идентичных сайта связывания, одноцепочечное антитело или РаЬ-фрагмент имеет один сайт связывания, тогда как «биспецифичное» или «бифункциональное антитело» имеет два разных сайта связывания.
«Выделенное антитело» является антителом, которое: (1) не связано с компонентами, с которыми оно связано в природных условиях, включая другие связанные в природных условиях антитела, которые являются сопутствующими в его нативном состоянии, (2) не содержит других белков из того же вида, (3) экспрессируется клеткой от другого вида или (4) не встречается в природе. Примеры выделенных антител включают анти-ЮР-ГВ-антитело, которое было аффинно очищено с использованием ЮР-ГВ и является выделенным антителом, анти-ЮР-ГВ-антитело, которое было синтезировано гибридомой или другой линией клеток ίη νίίτο, и анти-ЮР-ГВ-антитело человека, полученное из трансгенной мыши.
Термин «антитело человека» включает все антитела, которые имеют одну или более вариабельных и константных областей, полученных из последовательностей иммуноглобулина человека. В предпочтительном варианте все вариабельные и константные домены получены из последовательностей иммуноглобулина человека (полностью человеческое антитело). Указанные антитела можно получить множеством способов, которые описаны далее.
Гуманизированным антителом является антитело, которое получают из вида, отличного от человека, в котором аминокислоты в каркасных областях и константных доменах тяжелой и легкой цепей были мутированы с тем, чтобы избежать или исключить иммунный ответ у людей. Альтернативно гуманизированное антитело можно получить слиянием константных доменов из антитела человека с вариабельными доменами вида, отличного от человека. Примеры того, как получить гуманизированные антитела, можно найти в патентах США №№ 6054297, 5886152 и 5877293.
Термин «химерное антитело» относится к антителу, которое содержит одну или более областей из одного антитела и одну или более областей из одного или более других антител. В предпочтительном варианте один или более СЭВ получают из анти-ЮР-ГВ-антитела человека. В более предпочтительном варианте все СЭВ получают из анти-ЮР-ГВ-антитела человека. В другом предпочтительном варианте объединяют СЭВ из более чем одного анти-ЮР-ГВ-антитела человека и собирают в химерное антитело. Например, химерное антитело может содержать СЭР1 из легкой цепи первого анти-ЮР-ГВ-антитела человека, которое можно объединить с СЭВ2 и СЭВ3 из легкой цепи второго анти-ЮР-ГВ-антитела человека, и СЭВ из тяжелой цепи можно получить из третьего анти-ЮР-ГВ-антитела. Кроме того, каркасные области можно получить из одного из тех же самых анти-ЮР-ГВ-антител, из одного или более других антител, таких как антитело человека, или из гуманизированного антитела.
«Нейтрализующим антителом» или «ингибирующим антителом» является антитело, которое ингибирует связывание ЮР-ГВ с ЮР-Г в том случае, когда избыток анти-ЮР-ГВ-антитела уменьшает количество ЮР-Г, связанного с ЮР-ГВ, по меньшей мере примерно на 20%. В предпочтительном варианте антитело уменьшает количество ЮР-Г, связанного с ЮР-ГВ, по меньшей мере примерно на 40%, более предпочтительно на 60%, еще более предпочтительно на 80% или еще более предпочтительно на 85%. Уменьшение связывания можно измерить способами, известными специалисту в данной области, например так, как измеряют при анализе конкурентного связывания ίη νίίτο. Пример измерения уменьшения связывания ЮР-Г с ЮР-ГВ представлен ниже в примере 4.
«Активирующим антителом» является антитело, которое активирует ЮР-ГВ по меньшей мере примерно на 20% при добавлении к клетке, ткани или введении в организм, экспрессирующий ЮР-ГВ. В предпочтительном варианте антитело активирует активность ЮР-ГВ по меньшей мере на 40%, более предпочтительно на 60%, еще более предпочтительно на 80% или еще более предпочтительно на 85%. В более предпочтительном варианте активирующее антитело добавляют в присутствии ЮР-Г или ЮР-ГГ. В другом предпочтительном варианте активность активирующего антитела измеряют посредством количественного определения автофосфорилирования тирозина в ЮР-ГВ.
Специалисты в данной области легко могут получить фрагменты или аналоги антител, следуя руководствам данного описания. Предпочтительные амино- и карбоксильные концы фрагментов или аналогов находятся вблизи границ функциональных доменов. Структурные и функциональные домены можно идентифицировать путем сравнения данных о нуклеотидной и/или аминокислотной последовательности с опубликованной или собственной базой данных последовательностей. Предпочтительно используют компьютеризованные способы сравнения для идентификации мотивов последовательностей или рассчитанных конформационных доменов белка, которые имеются в других белках известной структуры и/или функции. Способы идентификации белковых последовательностей, которые укладываются в известную трехмерную структуру, известны. ВоЮе с1 а1. 8с1епсе 253: 164 (1991).
Термин «резонанс поверхностного плазмона» в используемом в данном описании смысле относится к оптическому явлению, которое позволяет анализировать в режиме реального времени биоспецифичные взаимодействия посредством определения изменений концентраций белка в биочувствительной матрице, например, с использованием системы ВГАсоге (Рйатшааа Вюэепэот АВ, Иррэа1а, 8\уебеп апб Р^5саίаνау,
- 7 012079
N.1.). Дополнительное описание см. в Ιοηκδοη, и., е! а1. (1993) Αηη. ΒίοΙ. С1ш. 51: 19-26; Ιοπδδοη, и., е! а1. (1991) Вю1ес1шк|иек 11: 620-627; ΙοΗηδδοη, В., е! а1. (1995) 1. Μο1. Ве^дт!. 8: 125-131; и ΙοΗηκοη, В., е! а1. (1991) Атк Вюсйет. 198: 268-277.
Термин «ΚοΓΓ» относится к константе скорости распада при диссоциации антитела из комплекса антитело/антиген.
Термин «Κ,ι» относится к константе диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген.
Термин «эпитоп» включает любую белковую детерминанту, способную специфично связываться с иммуноглобулином или рецептором Т-клетки. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как боковые цепи аминокислот или сахаров, и обычно имеют специфичные параметры трехмерной структуры, а также специфичные характеристики заряда. Говорят, что антитело специфично связывается с антигеном в том случае, когда константа диссоциации <1 мкМ, предпочтительно <100 нМ и наиболее предпочтительно <10 нМ.
В используемом в данном описании смысле названия 20 обычных аминокислот и их сокращения не отличаются от традиционного применения. См. Ιιηιηι.ιηο1οβν-Α ЗуЩйекк (2η6 Ε6ί!ίοη, Е.З. Οο1ιώ аг1б Ό.Β. Сгег1. Ебк., Зшаиег Ак^иа^к, Зи^еЛа^, Макк. (1991)), которая включена в данное описание в виде ссылки. Стереоизомеры (например, Ό-аминокислоты) 20 обычных аминокислот, неприродные аминокислоты, такие как α-, α-дизамещенные аминокислоты, Ν-алкиламинокислоты, молочная кислота и другие необычные аминокислоты, также могут быть подходящими компонентами полипептидов согласно данному изобретению. Примеры необычных аминокислот включают 4-гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, ε-Ν,Ν,Ν-триметиллизин, ε-Ν-ацетиллизин, О-фосфосерин, Ν-ацетилсерин, Ν-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, κ-Ν-метиларгинин и другие подобные аминокислоты и иминокислоты (например, 4-гидроксипролин). В используемом в данном описании обозначении полипептида направление влево является направлением аминоконца, а направление вправо является направлением карбоксильного конца в соответствии со стандартным использованием и правилами.
Термин «полинуклеотид», указываемый в данном описании, означает полимерную форму нуклеотидов по меньшей мере длиной 10 оснований, либо рибонуклеотидов, либо дезоксирибонуклеотидов, или модифицированной формы любого типа нуклеотида. Термин включает одноцпочечные и двуцепочечные формы ДНК.
Термин «выделенный полинуклеотид» в используемом в данном описании смысле будет означать полинуклеотид геномной, кДНК или синтетической природы или их комбинации, и на основании своего происхождения указанный «выделенный полинуклеотид»: (1) не связан с полным или с частью полинуклеотида, в котором «выделенный полинуклеотид» выявляют в природе, (2) функционально связан с полинуклеотидом, с которым не связан в природе, или (3) не встречается в природе в виде части последовательности большего размера.
Упоминаемый в данном описании термин «олигонуклеотид» включает нуклеотиды природного происхождения и модифицированные нуклеотиды, связанные вместе посредством олигонуклеотидных связей природного происхождения и неприродного происхождения. Олигонуклеотиды являются подгруппой полинуклеотидов, обычно содержащих в длину 200 оснований или меньше. Предпочтительно олигонуклеотиды имеют длину от 10 до 60 оснований и наиболее предпочтительно длину 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20-40 оснований. Олигонуклеотиды обычно являются одноцепочечными, например, для зондов; хотя олигонуклеотиды могут быть двуцепочечными, например, для применения при конструировании мутантного гена. Олигонуклеотиды согласно изобретению могут быть либо смысловыми, либо антисмысловыми олигонуклеотидами.
Упоминаемый в данном описании термин «нуклеотиды природного происхождения» включает дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды. Упоминаемый в данном описании термин «модифицированные нуклеотиды» включает нуклеотиды с модифицированными или замещенными группами сахаров и т.п. Упоминаемый в данном описании термин «олигонуклеотидные связи» включает такие связи в олигонуклеотидах, как фосфоротиоатные, фосфородитиоатные, фосфороселеноатные, фосфородиселеноатные, фосфороанилотиоатные, фосфороаниладатные, фосфороамидатные и т.п. См., например, ГаРйтсйе е! а1. №с1. Ас1бк Век. 14: 9081 (1986); З!ес е! а1. 1. Ат. Сйет. 8ο^ 106: 6077 (1984); 8!еш е! а1. Νϋθ1. Ас1бк Век. 16: 3209 (1988); Ζοη е! а1. Αηί^-Саπсе^ Эгид Эек^ 6: 539 (1991); Ζοη е! а1. О1^дοηис1еοΐ^беκ аг1б Αη^ο^κ: А Ргасбса1 Арргоасй, рр. 87-108 (Е. Ескк!еш, Еб., ΟχΓογ6 Ишуегкйу Ргекк, Охйэгб Егщкшб (1991)); З!ес е! а1. патент США № 5151510; υЫтаππ аиб Реутаη Сйетюа1 Веу1е^к 90: 543 (1990), описания которых включены в данное описание в виде ссылки. При необходимости олигонуклеотид может содержать метку для регистрации.
«Функционально связанные» последовательности включают как последовательности регуляции экспрессии, которые непосредственно прилегают к представляющему интерес гену, так и последовательности регуляции экспрессии, которые действуют в транс-положении или на расстоянии, регулируя представляющий интерес ген. Термин «последовательность регуляции экспрессии» в используемом в данном описании смысле относится к полинуклеотидным последовательностям, которые необходимы для воздействия на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, с которыми они связаны. По
- 8 012079 следовательности регуляции экспрессии включают соответствующие последовательности инициации транскрипции, терминации, промоторные и энхансерные последовательности; эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые усиливают эффективность трансляции (т.е. консенсусная последовательность Козака); последовательности, которые повышают стабильность белка; и, при желании, последовательности, которые усиливают секрецию белка. Природа таких регуляторных последовательностей различна в зависимости от организма хозяина; у прокариот такие регуляторные последовательности обычно включают промотор, сайт связывания рибосомы и последовательность терминации транскрипции; у эукариот, как правило, такие регуляторные последовательности включают промоторы и последовательности терминации транскрипции. Подразумевается, что термин «регуляторные последовательности» включает, как минимум, все компоненты, присутствие которых необходимо для экспрессии и процессинга, а также может включать дополнительные компоненты, присутствие которых является преимущественным, например лидерные последовательности и последовательности партнеров при слиянии.
Подразумевается, что в используемом в данном описании смысле термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она была связана. Одним типом вектора является «плазмида», которая относится к кольцевой двуцепочечной петле ДНК, в которую можно лигировать дополнительные участки ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, где дополнительные участки ДНК можно лигировать в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальное начало репликации, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина и поэтому реплицируются вместе с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы называют в данном описании «рекомбинантными экспрессирующими векторами» (или просто «экспрессирующими векторами»). В общем, экспрессирующие векторы, применяемые в способах на основе рекомбинантной ДНК, часто имеют форму плазмид. В данном описании термины «плазмида» и «вектор» могут использоваться взаимозаменяемо, так как плазмида является наиболее широко используемой формой вектора. Однако подразумевается, что изобретение включает в себя другие формы экомпрессирующих векторов, такие как вирусные векторы (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые подходят для выполнения эквивалентных функций.
Имеется в виду, что термин «рекомбинантная клетка-хозяин» (или просто «клетка-хозяин») в используемом в данном описании смысле относится к клетке, в которую был введен рекомбинантный экспрессирующий вектор. Следует понимать, что имеется в виду, что такие термины относятся не только к конкретной клетке-объекту, но и к потомству такой клетки. Так как в последующих поколениях могут возникать определенные модификации либо вследствие мутации, либо вследствие влияния окружающей среды, в действительности, такое потомство может быть неидентичным родительской клетке, но еще включено в рамки термина «клетка-хозяин» в используемом в данном описании смысле.
Термин «селективно гибридизуется», упоминаемый в данном описании, означает регистрируемо и специфично связывается. Полинуклеотиды, олигонуклеотиды и их фрагменты согласно изобретению селективно гибридизуются с цепями нуклеиновой кислоты в условиях гибридизации и промывки, которые минимизируют существенные количества регистрируемого связывания с неспецифичными нуклеиновыми кислотами. Для достижения условий для селективной гибридизации можно использовать условия «высокой жесткости» или «высокожесткие» условия, которые известны в данной области и обсуждаются в данном описании. Примером условий «высокой жесткости» или «высокожестких» условий является способ инкубирования полинуклеотида с другим полинуклеотидом, при этом один полинуклеотид может быть прикреплен к твердой поверхности, такой как мембрана, в буфере для гибридизации 6Х 88РЕ или 88С, 50% формамиде, 5Х реагенте Денхардта, 0,5% 8Ό8, 100 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося при температуре гибридизации 42°С в течение 12-16 ч с последующей двукратной промывкой при 55°С с использованием буфера для промывки IX 88С, 0,5% 8Ό8. См. также 8ашЬгоок е1 а1., выше, рр. 9.50-9.55.
Термин «процент идентичности последовательностей» в контексте последовательностей нуклеиновых кислот относится к остаткам в двух последовательностях, которые являются теми же самыми при сопоставлении в отношении максимального соответствия. Длина сравнения идентичности последовательностей может быть на протяжении участка по меньшей мере примерно из 9 нуклеотидов, обычно по меньшей мере примерно из 18 нуклеотидов, более обычно по меньшей мере примерно из 24 нуклеотидов, типично по меньшей мере примерно из 28 нуклеотидов, более обычно по меньшей мере примерно из 32 нуклеотидов и предпочтительно по меньшей мере примерно из 36, 48 или большего количества нуклеотидов. В данной области известен ряд различных алгоритмов, которые можно использовать для измерения идентичности нуклеотидных последовательностей.
- 9 012079
Например, полинуклеотидные последовательности можно сравнивать с использованием ΡΑ8ΤΑ, Сар или ВсЧПи которые представляют собой программы в пакете Χνίδοοηδίη, версия 10.0, Сеиебек Сотри1ет Стоир (ССС), Маб1кои, νίδοοηδίη. ΡΑ8ΤΑ, которая включает, например, программы ΡΑ8ΤΑ2 и ΡΑ8ΤΑ3, обеспечивает сопоставление и процент идентичности последовательностей в областях наилучшего перекрывания между запрашиваемой и исследуемой последовательностями (Реагкои, Мебюбк Εηζνιηοΐ. 183: 63-98 (1990); Реагкои, МеЙюбк Мо1. ΒίοΙ. 132: 185-219 (2000); Реагкои, МеЙюбк Εηζутο1. 266: 227-258 (1996); Реагкои, 1. Мо1. Βίο1. 276: 71-84 (1998); включенные в данное описание в виде ссылки). Если не оговорено особо, для конкретной программы или алгоритма используют параметры по умолчанию. Например, идентичность последовательностей в процентах между последовательностями нуклеиновых кислот можно определить, используя ΡΑ8ΤΑ с его параметрами по умолчанию (размер слова 6 и фактор ЙОРАМ для матрицы подсчета очков) или используя Сар с его параметрами по умолчанию, которые даны в версии 6.1 ССС, включенной в данное описание в виде ссылки.
Упоминание последовательности нуклеиновой кислоты охватывает ее комплемент, если не оговорено особо. Таким образом, следует понимать, что ссылка на молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую конкретную последовательность, охватывает комплементарную ей цепь с комплементарной последовательностью.
В области молекулярной биологии исследователи используют термины «процент идентичности последовательностей», «процент сходства последовательностей» и «процент гомологии последовательностей» взаимозаменяемо. В данной заявке указанные термины будут иметь одинаковые значения только по отношению к последовательностям нуклеиновых кислот.
Термин «значительное сходство» или «значительное сходство последовательностей» по отношению к нуклеиновой кислоте или ее фрагменту свидетельствует о том, что при оптимальном сопоставлении с соответствующими инсерциями или делециями нуклеотидов в другой нуклеиновой кислоте (или комплементарной ей цепи) идентичность последовательности нуклеотидов составляет по меньшей мере примерно 85%, предпочтительно по меньшей мере примерно 90% и более предпочтительно по меньшей мере примерно 95, 96, 97, 98 или 99% оснований нуклеотидов, что измеряют с помощью любого хорошо известного алгоритма идентичности последовательностей, такого как ΡΑ8ΤΑ, ΒΕΑ8Τ или Сар, которые обсуждаются выше.
В применении к полипептидам термин «значительная идентичность» означает, что две пептидные последовательности при оптимальном сопоставлении, таком как с помощью программ САР или ΒΕ8ΤΡΙΤ, с использованием параметров пробелов по умолчанию, обладают по меньшей мере 75 или 80% идентичностью по последовательностям, предпочтительно по меньшей мере 90 или 95% идентичностью по последовательностям, еще более предпочтительно по меньшей мере 98 или 99% идентичностью по последовательностям. Предпочтительно положения остатков, которые не являются идентичными, отличаются консервативными заменами аминокислот. «Консервативной заменой аминокислот» является замена, при которой аминокислотный остаток заменяют другим аминокислотным остатком, имеющим боковую цепь (Я-группу) со сходными химическими свойствами (например, заряд или гидрофобность). В общем, консервативная аминокислотная замена не будет в значительной степени изменять функциональные свойства белка. В тех случаях, когда две или большее количество аминокислотных последовательностей отличаются друг от друга консервативными заменами, процент идентичности последовательностей или степень сходства можно скорректировать как более высокую, введя поправку на консервативную природу замены. Способы осуществления такой корректировки хорошо известны специалистам в данной области. См., например, Реагкои, МеЙюбк Мо1. Βίο1. 24: 307-31 (1994), которая включена в данное описание в виде ссылки. Примеры групп аминокислот, которые имеют боковые цепи со сходными химическими свойствами, включают аминокислоты: 1) с алифатическими боковыми цепями: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; 2) с алифатическими содержащими гидроксил боковыми цепями: серин и треонин; 3) с амидосодержащими боковыми цепями: аспарагин и глутамин; 4) с ароматическими боковыми цепями: фенилаланин, тирозин и триптофан; 5) с основными боковыми цепями: лизин, аргинин и гистидин; и 6) с серосодержащими боковыми цепями: цистеин и метионин. Предпочтительными группами консервативных аминокислотных замен являются валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамат-аспартат и аспарагин-глутамин.
Альтернативно, консервативной заменой является любое изменение, имеющее положительное значение в матрице логарифмической функции правдоподобия РАМ250, описанной в работе Соине! е1 а1., 8е1еиее 256: 1443-45 (1992), включенной в данное описание в виде ссылки. «Умеренно консервативной» заменой является любое изменение, имеющее неотрицательное значение в матрице логарифмической функции правдоподобия РАМ250.
Сходство последовательностей в случае полипептидов, которое также называют идентичностью последовательностей, обычно измеряют с использованием компьютерной программы анализа последовательностей. Компьютерная программа анализа белков подбирает сходные последовательности на основе использования критериев сходства, приписываемых различным заменам, делециям и другим модификациям, включая консервативные аминокислотные замены. Например, ССС содержит такие программы, как «Сар» и «ΒекПϊί», которые можно использовать с параметрами по умолчанию для определения гомо
- 10 012079 логии последовательностей или идентичности последовательностей между близкородственными полипептидами, такими как гомологичные полипептиды из разных видов организмов, или между белком дикого типа и его мутеином. См., например ССС, версия 6.1. Полипептидные последовательности также можно сравнивать с применением ΡΆ8ΤΆ, используя параметры по умолчанию или рекомендуемые параметры, программа в ССС версии 6.1. ΡΆ8ΤΆ (например, ΡΆ8ΤΆ2 и ΡΆ8ΤΆ3) осуществляет сопоставления и дает процент идентичности последовательностей областей наилучшего перекрывания между запрашиваемой и исследуемой последовательностями (Реагкоп (1990); Реагкоп (2000)). Другим предпочтительным алгоритмом при сравнении последовательности согласно изобретению с базой данных, содержащей большое количество последовательностей из разных организмов, является компьютерная программа ΒΕΑ8Τ, особенно Ыак1р или 1Ыак1п. с использованием параметров по умолчанию. См., например, А11ксНи1 е! а1., 1. Мо1. ΒίοΙ. 215: 403-410 (1990); А11ксйи1 е! а1., Ыис1е1с АсИк Век. 25: 3389-402 (1997); включенные в данное описание в виде ссылки.
Длина сравниваемых в отношении гомологии полипептидных последовательностей, как правило, будет составлять по меньшей мере примерно 16 аминокислотных остатков, обычно по меньшей мере примерно 20 остатков, более обычно по меньшей мере примерно 24 остатка, обычно по меньшей мере 28 остатков и предпочтительно примерно более 35 остатков. В случае поиска в базе данных, содержащей последовательности из большого числа различных организмов, предпочтительно сравнивать аминокислотные последовательности.
В используемом в данном описании смысле термин «метка» или «меченый» относится к включению другой молекулы в антитело. В одном варианте меткой является регистрируемый маркер, например включение радиоактивно меченной аминокислоты или присоединение к полипептиду фрагментов биотинила, которые можно регистрировать маркированным авидином (например, стрептавидин, содержащий флуоресцентный маркер или ферментативную активность, которую можно регистрировать оптическими или колориметрическими способами). В другом варианте меткой или маркером может быть терапевтическое средство, например конъюгат лекарственного средства или токсин. Различные способы мечения полипептидов и гликопротеидов известны в данной области и могут быть использованы. Примеры меток полипептидов включают, но не ограничены указанным, следующие метки: радиоизотопы или радионуклиды (например, 3Н, 14С, 15Ν, 358, 90Υ, 99Тс, ш1п, 1251, 1311), флуоресцентные метки (например, ФИТЦ, родамин, люминофоры на основе лантанидов), ферментные метки (например, пероксидаза хрена, β-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза), хемилюминесцентные маркеры, группы биотинила, предварительно определенные полипептидные эпитопы, узнаваемые вторичным репортером (например, парные последовательности лейциновой молнии, сайты связывания вторичных антител, домены, связывающие металлы, эпитопные метки), магнитные агенты, такие как хелаты гадолиния, токсины, такие как токсин коклюша, таксол, цитохалазин Β, грамицидин Ό, бромид этидия, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин Ό, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол, и пуромицин, и их аналоги или гомологи.
В некоторых вариантах метки присоединяют посредством спейсерного плеча различной длины, чтобы уменьшить возможные стерические помехи.
Термин «агент» в данном описании используют для обозначения химического соединения, смеси химических соединений, биологической макромолекулы или экстракта, полученного из биологических материалов. Термин «фармацевтический агент или лекарственное средство» в данном описании используют по отношению к химическому соединению или композиции, способной индуцировать требуемое терапевтическое действие при правильном введении пациенту. Другие химические термины в данном описании используют согласно традиционному применению в данной области, примеры которого приведены в Τίκ МсСга\\-НП1 ШсДопату о£ Сйеш1са1 Τе^тк (Рагкег, 8., Еб., МсСга^-НШ, 8ап РтапДксо (1985)), включенном в данное описание в виде ссылки).
Термин «антинеопластическое средство» в данном описании используют по отношению к агентам, которые обладают функциональным свойством ингибировать развитие или прогрессирование неоплазмы у человека, особенно злокачественного (канцерогенного) повреждения, такого как карцинома, саркома, лимфома или лейкоз. Часто свойством антинеопластических средств является ингибирование метастазов. Термин «пациент» включает человека и субъекты ветеринарии.
Анти-1СР-1В-антитела человека и их характеристика
Антитела человека позволяют избежать некоторые проблемы, связанные с антителами, которые имеют вариабельные и/или константные области мышей или крыс. Присутствие таких полученных от мышей или крыс последовательностей может приводить к быстрому клиренсу антител или может приводить к возникновению у пациента иммунного ответа против антитела. Таким образом, в одном варианте изобретение относится к гуманизированным анти-1СР-Ш-антителам. В предпочтительном варианте изобретение относится к полностью человеческим анти-1СР-Ш-антителам, полученным благодаря введению генов иммуноглобулинов человека в организм грызуна, так чтобы у грызуна продуцировались полностью человеческие антитела. Более предпочтительны полностью человеческие антитела против 1СР-1В человека. Предполагается, что полностью человеческие анти-1СР-Ш-антитела минимизируют иммуно
- 11 012079 генные и аллергенные ответы, свойственные мышиным или полученным из мышей моноклональным антителам (мАт), и таким образом повышают эффективность и безопасность вводимых антител. Можно ожидать, что применение полностью человеческих антител обеспечит значительное преимущество при лечение хронических и рецидивирующих заболеваний у человека, таких как воспаление и рак, при которых могут требоваться многократные введения антител. В другом варианте изобретение относится к анти-ЮР-1В-антителу, которое не связывается с комплементом.
В предпочтительном варианте анти-ЮР-ГК.-антителом является 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2,
4.17.3 или 6.1.1. В другом предпочтительном варианте анти-ЮР-ГЙ-антитело включает легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕО ΙΌ N0: 2, 6, 10, 14, 18 или 22, или один или более СИВ из указанных аминокислотных последовательностей. В другом предпочтительном варианте анти-ЮР-1В-антитело включает тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из 8Е0 ΙΌ N0: 4, 8, 12, 16, 20 или 24, или один или более СИВ из указанных аминокислотных последовательностей.
Класс и подкласс анти-ЮР-1В-антител
Антитело может представлять собой молекулу ΙβΟ. 1дМ, 1дЕ, 1дА или Ι§Ό. В предпочтительном варианте антитело представляет собой 1дС и относится к подтипу 1дС1, 1дС2, ЦС3 или 1дС4. В более предпочтительном варианте анти-ЮР-1В-антитело представлено подклассом 1дС2. В другом предпочтительном варианте анти-ЮР-1В-антитело относится к тому же классу, что и антитело 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3,
3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1, которые представляют собой ЦС2.
Класс и подкласс анти-ЮР-1В-антител можно определить любым способом, известным в данной области. В общем, класс и подкласс антитела можно определить с использованием антител, которые специфичны по отношению к конкретному классу и подклассу антитела. Такие антитела коммерчески доступны. Класс и подкласс можно определить посредством ЕЫ8А, Вестерн-блота, а также других способов. Альтернативно, класс и подкласс можно определить секвенированием всех или части константных доменов тяжелой и/или легкой цепей антител, сравнением их аминокислотных последовательностей с известными аминокислотными последовательностями иммуноглобулинов различных классов и подклассов и определением класса и подкласса антител.
Видовая и молекулярная избирательность
В другом аспекте изобретения анти-ЮР-1В-антитело проявляет видовую и молекулярную избирательность. В одном варианте анти-ЮР-1В-антитело связывается с ЮР-1В человека, макак-крабоедов и макак-резус. В предпочтительном варианте анти-ЮР-1В-антитело не связывается с ЮР-1В мыши, крысы, морской свинки, собаки или кролика. В другом предпочтительном варианте анти-ЮР-1В-антитело не связывается с рецепторами вида обезьян Нового Света, такого как мартышка. Следуя инструкциям описания, можно определить видовую избирательность анти-ЮР-1В-антитела с использованием способов, хорошо известных в данной области. Например, можно определить видовую избирательность, используя Вестерн-блот, РАС8, ЕЫ8А или РИА. В предпочтительном варианте видовую избирательность можно определить с использованием Вестерн-блота.
В другом варианте анти-ЮР-1В-антитело обладает избирательностью по отношению к ЮР-1В, которая по меньшей мере в 50 раз выше, чем избирательность по отношению к рецептору инсулина. В предпочтительном варианте избирательность анти-ЮР-1В-антитела более чем в 100 раз выше, чем его избирательность по отношению к рецептору инсулина. В еще более предпочтительном варианте антиЮР-1В-антитело не проявляет какого-либо заметного специфичного связывания с любым другим белком, отличным от ЮР-1В. Избирательность анти-ЮР-1В-антитела по отношению ЮР-1В можно определить с использованием способов, хорошо известных в данной области, следуя инструкциям описания. Например, избирательность можно определить с использованием Вестерн-блота, РАС8, ЕЫ8А или РИА. В предпочтительном варианте молекулярную избирательность можно определить с использованием Вестерн-блота.
Аффинность связывания анти-ЮР-1В с ЮР-1В
В другом аспекте изобретения анти-ЮР-1В-антитела связываются с ЮР-1В с высокой аффинностью. В одном варианте анти-ЮР-1В-антитело связывается с ЮР-1В с К4, равной 1х10-8М или меньше. В более предпочтительном варианте антитело связывается с ЮР-1В с К,| либо 1х10-9М, либо меньше. В еще более предпочтительном варианте антитело связывается с ЮР-1В с К| либо 5х10-10М, либо меньше. В другом предпочтительном варианте антитело связывается с ЮР-1В с К| либо 1х10-10М, либо меньше. В другом предпочтительном варианте антитело связывается с ЮР-1В, по существу, с такой же К4, как и антитело, выбранное из 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В другом предпочтительном варианте антитело связывается с ЮР-1В, по существу, с такой же К4, как и антитело, которое содержит один или более СЭВ из антитела, выбранного из 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. Еще в одном предпочтительном варианте антитело связывается с ЮР-1В, по существу, с такой же К4, как антитело, которое содержит одну из аминокислотных последовательностей, выбранных из 8Е0 ΙΌ N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 или 24. В другом предпочтительном варианте антитело связывается с ЮРНВ, по существу, с такой же К, как антитело, которое содержит один или более СЭВ из антитела, которое
- 12 012079 содержит одну из аминокислотных последовательностей выбранных из 8ЕО ΙΌ N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 или 24.
В другом аспекте изобретения анти-ЮР-1К.-антитело имеет низкую скорость диссоциации. В одном варианте анти-ЮЕ-Ж-антитело имеет Κ,,π. равную 1 х 10-4 с-1 или ниже. В предпочтительном варианте Κ^ составляет 5х10-5 с-1 или ниже. В другом предпочтительном варианте Ко££, по существу, имеет такое же значение, как и в случае антитела, выбранного из 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В другом предпочтительном варианте антитело связывается с ЮЕ-ΙΚ, по существу, с такой же Ко££, как и антитело, которое содержит один или более СЭР из антитела, выбранного из 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2,
4.17.3 или 6.1.1. Еще в одном предпочтительном варианте антитело связывается с ЮЕ-ΙΚ, по существу, с такой же Ко££, как и антитело, которое содержит одну из аминокислотных последовательностей, выбранных из 8Е0 ΙΌ N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 или 24. В другом предпочтительном варианте антитело связывается с ЮЕ-ΙΚ, по существу, с такой же Ко££, как и антитело, которое содержит один или более СОК из антитела, которое содержит одну из аминокислотных последовательностей, выбранных из 8ЕО Ш N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22.
Аффинность связывания и скорость диссоциации анти-ЮЕ-1К-антитела с ЮЕ-ΙΚ можно определить любым способом, известным в данной области. В одном варианте аффинность связывания можно измерить с помощью конкурентного ΕΕΙ8Α, РИА или резонанса поверхностного плазмона, такого как В1Лсоге. Скорость диссоциации также можно измерить с помощью резонанса поверхностного плазмона. В более предпочтительном варианте аффинность связывания и скорость диссоциации измеряют с помощью резонанса поверхностного плазмона. В еще более предпочтительном варианте аффинность связывания и скорость диссоциации измеряют с использованием В1Асоге. Пример определения аффинности связывания и скорости диссоциации описан ниже в примере 2.
Время полужизни анти-ЮЕ-1К-антител
Согласно другой цели изобретения анти-ЮЕ-1К-антитело имеет время полужизни, составляющее ίη νίίτο или ίη νίνο по меньшей мере 1 день. В предпочтительном варианте антитело или его часть имеет время полужизни, составляющее по меньшей мере 3 дня. В более предпочтительном варианте антитело или его часть имеет время полужизни, составляющее 4 дня или больше. В другом варианте антитело или его часть имеет время полужизни, составляющее 8 дней или больше. В другом варианте антитело или его антигенсвязывающая часть дериватизированы или модифицированы так, что имеют более длительное время полужизни, как обсуждается ниже. В другом предпочтительном варианте антитело может содержать точечные мутации, чтобы увеличить время полужизни в сыворотке, так, как описано в заявке \У0 00/09560, опубликованной 24 февраля 2000г. Время полужизни антитела можно измерить любыми способами, известными специалисту в данной области. Например, время полужизни антитела можно измерить с помощью Вестерн-блота, ЕЬ18А или РИА на протяжении соответствующего периода времени. Время полужизни антитела можно измерить у любого подходящего животного, например обезьяны, такой как макака-крабоед, примата или человека.
Идентификация эпитопов ЮЕ-ΙΚ, распознаваемых анти-ЮЕ-1К-антителом
Изобретение также относится к анти-ЮЕ-1К-антителу, которое связывается с тем же самым антигеном или эпитопом, что и анти-ЮЕ-1К-антитело человека. Кроме того, изобретение относится к анти-ЮЕΙΚ-антителу, которое перекрестно конкурирует с анти-ЮЕ-1К-антителом человека. В предпочтительном варианте анти-ЮЕ-1К-антителом человека является 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В другом предпочтительном варианте анти-ЮЕ-ΙΚ человека содержит один или более СЭК из антитела, выбранного из 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. Еще в одном предпочтительном варианте анти-ЮЕ-ΙΚ человека содержит одну из аминокислотных последовательностей, выбранных из 8Е0 ΙΌ N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 или 24. В другом предпочтительном варианте анти-ЮЕ-ΙΚ человека содержит один или более СЭВ из антитела, которое содержит одну из аминокислотных последовательностей, выбранных из 8Е0 ΙΌ N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 или 24. В высокопредпочтительном варианте анти-ЮЕ-Ж-антителом является другое антитело человека.
Определить, связывается ли анти-ЮЕ-Ж-антитело с тем же самым антигеном, можно с использованием ряда способов, известных в данной области. Например, можно определить, связывается ли тестируемое анти-ЮЕ-Ж-антитело с тем же самым антигеном, используя анти-ЮЕ-Ж-антитело для захвата антигена, о котором известно, что он связывается с анти-ЮЕ-Ж-антителом, такого как ЮЕ-ΙΚ, элюируя антиген из связи с антителом и затем определяя, будет ли тестируемое антитело связываться с элюированным антигеном. Связывается ли антитело с тем же самым эпитопом, что и анти-ЮЕ-Ж-антитело, можно определить, связывая анти-ЮЕ-Ж-антитело с ЮЕ-ΙΚ в условиях насыщения и затем измеряя способность тестируемого антитела связываться с ЮЕ-ΙΚ. Если тестируемое антитело способно связываться с ЮЕ-ΙΚ одновременно с анти-ЮЕ-Ж-антителом, то тестируемое антитело связывается с другим эпитопом, отличным от эпитопа для анти-ЮЕ-Ж-антитела. Однако если тестируемое антитело не способно одновременно связываться с ЮЕ-ΙΚ, то тестируемое антитело связывается с тем же самым эпитопом, что и анти-ЮЕ-Ж-антитело человека. Указанный эксперимент можно выполнить с использованием ЕЫ8А, РИА или резонанса поверхностного плазмона. В предпочтительном варианте эксперимент проводят с
- 13 012079 использованием резонанса поверхностного плазмона. В более предпочтительном варианте используют В1Асоге. Также можно определить, конкурирует ли анти-ЮР-1К.-антитело перекрестно с анти-ЮР-1В-антителом. В предпочтительном варианте можно определить, конкурирует ли анти-ЮР-1К.-антитело перекрестно с другим антителом, используя тот же способ, который используют для измерения того, способно ли анти-ЮР-1К.-антитело связываться с тем же самым эпитопом, что и другое анти-ЮР-1В-антитело.
Использование легкой и тяжелой цепей
Изобретение также относится к анти-ЮР-1В-антителу, которое содержит вариабельные последовательности, кодируемые геном к человека. В предпочтительном варианте вариабельные последовательности кодируются семейством генов либо У к А27, А30, либо 012. В предпочтительном варианте вариабельные последовательности кодируются семейством генов Ук А30 человека. В более предпочтительном варианте легкая цепь содержит не более 10 аминокислотных замен по сравнению с Ук А27, А30 или 012 зародышевой линии, предпочтительно не более 6 аминокислотных замен и более предпочтительно не более 3 аминокислотных замен. В предпочтительном варианте аминокислотные замены являются консервативными заменами.
8ЕО ΙΌ N0: 2, 6, 10, 14, 18 и 22 определяют аминокислотные последовательности вариабельных областей 6 легких к-цепей анти-ЮР-ΙΒ. 8Е0 ΙΌ N0: 38, 40 и 42 определяют аминокислотные последовательности 3 легких к-цепей зародышевой линии, из которых получены 6 легких к-цепей анти-ЮР-ΙΒ. На фиг. 1А-1С показаны сопоставления нуклеотидных последовательностей вариабельных областей легких цепей 6 анти-ЮР-1К.-антител друг с другом и с последовательностями зародышевой линии, из которых они получены. Следуя инструкциям данного описания, специалист в данной области сможет определить кодируемую аминокислотную последовательность 6 легких к-цепей анти-ЮР-ΙΒ и легких к-цепей зародышевой линии и определить различия между последовательностями зародышевой линии и последовательностями антител.
В предпочтительном варианте УЪ анти-ЮР-ГВ-антитела содержит такие же аминокислотные замены относительно аминокислотной последовательности зародышевой линии, что и любая одна или более УЪ антител 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. Например, УЪ анти-ЮР-Ш.-антитела может содержать одну или более аминокислотных замен, которые являются такими же, как замены, присутствующие в антителе 2.13.2, другую аминокислотную замену, которая является такой же, как замена, присутствующая в антителе 2.14.3, и другую аминокислотную замену, которая является такой же, как в антителе 4.9.2. Таким образом, можно сочетать и подбирать различные характеристики связывания антител для того, чтобы изменить, например, аффинность антитела в отношении ЮР-ΙΚ или скорость его диссоциации из комплекса с антигеном. В другом варианте аминокислотные замены осуществляют в таком же положении, как и положения, обнаруживаемые в любом одной или более УЪ антител 2.12.1, 2.13.2,
2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1, но не используют ту же самую аминокислоту, а осуществляют консервативные аминокислотные замены. Например, если аминокислотная замена по сравнению с зародышевой линией в одном из антител 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1 представляет собой глутамат, его можно консервативно заменить аспартатом. Подобным образом, если аминокислотной заменой является серин, его можно консервативно заменить треонином.
В другом предпочтительном варианте легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, которая является такой же, как аминокислотная последовательность УЪ 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2,
4.17.3 или 6.1.1. В другом высокопредпочтительном варианте легкая цепь содержит аминокислотные последовательности, которые являются такими же, как СЭВ-области легкой цепи 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3,
3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В другом предпочтительном варианте легкая цепь содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере из одной СЭВ-области легкой цепи 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1,
4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В другом предпочтительном варианте легкая цепь содержит аминокислотные последовательности СОВ из разных легких цепей. В более предпочтительном варианте СОВ из разных легких цепей получают из 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В другом предпочтительном варианте легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, выбранную из 8Е0 ΙΌ N0: 2, 6, 10, 14, 18 или 22. В другом варианте легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из 8Е0 ΙΌ N0: 1, 5, 9, 13, 17 или 21, или последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность, имеющую 1-10 инсерций, делеций или замен аминокислот. Предпочтительно аминокислотные замены являются консервативными аминокислотными заменами. В другом варианте антитело или его часть содержит легкую цепь лямбда.
Данное изобретение также относится к анти-ЮР-IВ-антителу или его части, которое содержит тяжелую цепь человека или последовательность, полученную из тяжелой цепи человека. В одном варианте аминокислотную последовательность тяжелой цепи получают из семейства генов Ун ΌΡ-35, ΌΡ-47, ΌΡ70, ΌΡ-71 или УЕУ-4/4.35 человека. В предпочтительном варианте аминокислотную последовательность тяжелой цепи получают из семейства генов Ун ΌΡ-47 человека. В более предпочтительном варианте тяжелая цепь содержит не более 8 изменений аминокислот по сравнению с Ун ΌΡ-35, ΌΡ-47, ΌΡ-70, ΌΡ-71 или ΥΙΥ-4/4.35 зародышевой линии, более предпочтительно не более 6 изменений аминокислот и еще
- 14 012079 более предпочтительно не более 3 изменений аминокислот.
8ЕО ΙΌ N0: 4, 8, 12, 16, 20 и 24 представляют аминокислотные последовательности вариабельных областей 6 тяжелых цепей анти-ЮР-ΙΒ. 8Е0 ΙΌ N0: 30, 32, 34, 36 и 44 представляют аминокислотные последовательности, а 8Е0 ΙΌ N0: 29, 31, 33, 35 и 43, соответственно, представляют нуклеотидные последовательности тяжелых цепей ΌΡ-35, ΌΡ-47, ΌΡ-70, ΌΡ-71 и У1У-4, соответственно, зародышевой линии. На фиг. 2Ά-2Ό показаны сопоставления аминокислотных последовательностей вариабельной области 6 анги-ЮЕ-1К.-антител с соответствующими им последовательностями зародышевой линии. Следуя инструкциям данного описания, специалист в данной области может определить кодируемую аминокислотную последовательность 6 тяжелых цепей анти-ЮР-ΙΒ и тяжелых цепей зародышевой линии и определить различия между последовательностями зародышевой линии и последовательностями антител.
В предпочтительном варианте УН анти-ЮР-ГК-антитела содержит такие же аминокислотные замены по сравнению аминокислотной последовательностью зародышевой линии, как и любая одна или более УН антител 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. Подобно тому, как обсуждалось выше, УН анти-ЮР-ЕК.-антитела может содержать одну или более аминокислотных замен, которые являются такими же, как замены, присутствующие в антителе 2.13.2, другую аминокислотную замену, которая является такой же, как замена, присутствующая в антителе 2.14.3, и другую аминокислотную замену, которая является такой же, как в антителе 4.9.2. Таким образом, можно сочетать и подбирать различные характеристики связывания антител для того, чтобы изменить, например, аффинность антитела в отношении ЮР-ΙΒ или скорость его диссоциации из комплекса с антигеном. В другом варианте аминокислотные замены осуществляют в таком же положении, как и положения, обнаруживаемые в любой одной или более УН антител 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1, но не используют ту же самую аминокислоту, а осуществляют консервативные аминокислотные замены.
В другом предпочтительном варианте тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, которая является такой же, как аминокислотная последовательность УН 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1,
4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В другом высокопредпочтительном варианте тяжелая цепь содержит аминокислотные последовательности, которые являются такими же, как СЭК-области легкой цепи 2.12.1, 2.13.2,
2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В другом предпочтительном варианте тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере из одной ΟΟΒ-области тяжелой цепи 2.12.1, 2.13.2,
2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В другом предпочтительном варианте тяжелая цепь содержит аминокислотные последовательности из СЭК. из разных тяжелых цепей. В более предпочтительном варианте СОВ из разных тяжелых цепей получают из 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В другом предпочтительном варианте тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, выбранную из 8Е0 ΙΌ N0: 4, 8, 12, 16, 20 или 24. В другом варианте тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из 8Е0 ΙΌ N0: 3, 7, 11, 15, 19 или 23, или последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность, имеющую 1-10 инсерций, делеций или замен аминокислот. В другом варианте замены являются консервативными аминокислотными заменами.
Ингибирование активности ΙΟΡ-ΙΒ анти-IСР-IВ-антителом
Ингибирование связывания ЮР-Ι с ΙΟΡ-ΙΒ
В другом варианте изобретение относится к анти-IСР-IΒ-антителу, которое ингибирует связывание ЮР-Ι с ЮР-ΙΒ или связывание ЮР-ΙΙ с ЮР-ΙΒ. В предпочтительном варианте ЮР-ΙΒ относится к человеку. В другом предпочтительном варианте анти-ЮР-Ш.-антитело является антителом человека. В другом варианте антитело или его часть ингибирует связывание между ЮР-ΙΒ и ЮР-Ι с Ю50, не превышающим 100 нМ. В предпочтительном варианте Ю50 составляет не более 10 нМ. В более предпочтительном варианте Ю50 составляет не более 5 нМ. Ю50 можно измерить любым способом, известным в данной области. Обычно Ю50 можно измерить с помощью ЕЫ8А или РИА. В предпочтительном варианте Ю50 измеряют с помощью РИА.
В другом варианте изобретение относится к анти-ЮР-1В-антителу, которое предотвращает активацию ЮР-ΙΒ в присутствии ЮР-Ι. В предпочтительном варианте анти-ЮР-ΙΒ-антитело ингибирует индуцируемое ЮР-ΙΒ фосфорилирование тирозина, которое происходит после того, как рецептор становится занятым. В другом предпочтительном варианте анти-ЮР-IΒ-антитело ингибирует последующие события в клетке, после того как это происходит. Например, анти-ЮР-ΙΒ может ингибировать фосфорилирование тирозина 81с и субстрата рецептора инсулина (ΙΒ8) 1 и 2, которые все в норме фосфорилируются в том случае, когда клетки обрабатывают ЮР-Ι (К1т с1 а1., 1. ΒίοΙ. С1ет. 273: 34543-34550, 1998). Выявить, может ли анти-ЮР-IΒ-антитело предотвращать активацию ЮР-ΙΒ в присутствии ЮР-1, можно посредством определения уровней автофосфорилирования ЮР-ΙΒ, 811с. ΙΒ8-1 или ΙΒ8-2 с помощью Вестерн-блоттинга или иммунопреципитации. В предпочтительном варианте уровни автофосфорилирования ЮР-ΙΒ могут быть определены с помощью Вестерн-блоттинга. См., например, пример 7.
В другом аспекте изобретения антитело вызывает понижающую регуляцию ЮР-ΙΒ в случае клетки, обработанной антителом. В одном варианте ЮР-ΙΒ интернализуется в цитоплазму клетки. После того, как анти-ЮР-IΒ-антитело связывается с ЮР-ΙΒ, антитело интернализуется, что показано с помощью конфокальной микроскопии. Не имея намерения связывать с какой-либо теорией, предполагается, что ком
- 15 012079 плекс антитело-ЮЕ-ΙΚ интернализуется в лизосому и разрушается. Понижающую регуляцию ЮЕ-ΙΚ можно измерить любым способом, известным в данной области, включая иммунопреципитацию, конфокальную микроскопию или Вестерн-блоттинг. См., например, пример 7. В предпочтительном варианте антитело выбрано из 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 или 6.1.1 или содержит их тяжелую цепь, легкую цепь или антигенсвязывающую область.
Активация ЮЕ-ΙΚ анти-ЮЕ-1К-антителом
Другой аспект данного изобретения включает активирующие анти-ЮЕ-1К-антитела. Активирующее антитело отличается от ингибируюшего антитела, поскольку оно усиливает или заменяет действие ЮЕ-Ι на ЮЕ-ΙΚ. В одном варианте активирующее антитело способно связываться с ЮЕ-ΙΚ и вызывать его активацию в отсутствие ЮЕ-Ι. Указанный тип активирующего антитела, по существу, имитирует ЮЕ-Ι. В другом варианте активирующее антитело усиливает действие ЮЕ-Ι на ЮЕ-ΙΚ. Указанный тип антитела не активирует ЮЕ-ΙΚ сам по себе, а повышает активацию ЮЕ-ΙΚ в присутствии ЮЕ-Ι. Имитирующее анти-ЮЕ-ГК-антитело можно легко отличить от усиливающего анти-ЮЕ-IΚ-антитела с помощью обработки клеток ίη νίίτο антителом в присутствии или в отсутствие низких уровней ЮЕ-Ι. Если антитело способно вызывать активацию ЮЕ-ΙΚ в отсутствие ЮЕ-Ι, например оно увеличивает фосфорилирование тирозина ЮЕ-ΙΚ, то антитело является имитирующим антителом. Если антитело не может вызывать активацию ЮЕ-ΙΚ в отсутствие ЮЕ-Ι, но способно количественно усиливать активацию ЮЕ-ΙΚ, то антитело является усиливающим антителом. В предпочтительном варианте активирующим антителом является
4.17.3. В другом предпочтительном варианте антитело содержит один или более ΟΩΚ из 4.17.3. В другом предпочтительном варианте антитело получают либо из одной из двух, либо из обеих последовательностей зародышевой линии 012 (легкая цепь) и/или Ό71 (тяжелая цепь).
Ингибирование фосфорилирования тирозина ЮЕ-ΙΚ, уровней ЮЕ-ΙΚ и роста опухолевых клеток ίη νίνο анти-ЮЕ-ΙΚ-антителами
Другой вариант изобретения относится к анти-ЮЕ-IΚ-антителу, которое ингибирует фосфорилирование тирозина ЮЕ-ΙΚ и уровни рецептора ίη νίνο. В одном варианте введение анти-ЮЕ-IΚ-антитела животному вызывает снижение сигнала фосфотирозина ЮЕ-ΙΚ в опухолях, экспрессирующих ЮЕ-ΙΚ. В предпочтительном варианте анти-ЮЕ-IΚ-антитело вызывает снижение сигнала фосфотирозина по меньшей мере на 20%. В более предпочтительном варианте анти-ЮЕ-IΚ-антитело вызывает уменьшение сигнала фосфотирозина по меньшей мере на 60%, более предпочтительно на 50%. В еще более предпочтительном варианте антитело вызывает уменьшение сигнала фосфотирозина по меньшей мере на 40%, более предпочтительно на 30%, еще более предпочтительно на 20%. В предпочтительном варианте антитело вводят примерно за 24 ч до измерения уровней фосфорилирования тирозина. Уровни фосфорилирования тирозина можно измерить любым способом, известным в данной области, таким как способы, описанные ниже. См., например, пример 3 и фиг. 5. В предпочтительном варианте антитело выбрано из
2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 или 6.1.1 или содержит его тяжелую цепь, легкую цепь или антигенсвязывающую часть.
В другом варианте введение анти-ЮЕ-IΚ-антитела животному вызывает снижение уровней ЮЕ-ΙΚ в опухолях, экспрессирующих ЮЕ-ΙΚ. В предпочтительном варианте анти-ЮЕ-IΚ-антитело вызывает снижение уровней рецептора по меньшей мере на 20% по сравнению с необработанным животным. В более предпочтительном варианте анти-ЮЕ-IΚ-антитело вызывает снижение уровней рецептора по меньшей мере на 60%, более предпочтительно на 50% от уровней рецептора у животных, не подвергнутых лечению. В еще более предпочтительном варианте антитело вызывает уменьшение уровней рецептора по меньшей мере на 40%, более предпочтительно на 30%. В предпочтительном варианте антитело вводят примерно за 24 ч до измерения уровней ЮЕ-ΙΚ. Уровни ЮЕ-ΙΚ можно измерить любым способом, известным в данной области, таким как способы, описанные ниже. См., например, пример 8 и фиг. 6. В предпочтительном варианте антитело выбрано из 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 или 6.1.1 или содержит его тяжелую цепь, легкую цепь или антигенсвязывающую часть.
В другом варианте анти-ЮЕ-IΚ-антитело ингибирует рост опухолевых клеток ίη νίνο. Опухолевую клетку можно получить из любого типа клеток, включая без ограничения эпидермальные, эпителиальные, эндотелиальные клетки, клетки лейкоза, саркомы, множественной миеломы или мезодермальные клетки. Примеры опухолевых клеток включают клетки А549 (немелкоклеточная карцинома легкого), клетки МСЕ-7, клетки Со1о 205, клетки 3Τ3/ЮЕ-IΚ и клетки А431. В предпочтительном варианте антитело ингибирует рост опухолевых клеток по сравнению с ростом опухоли у животного, не подвергшегося лечению. В более предпочтительном варианте антитело ингибирует рост опухолевых клеток на 50%. В еще более предпочтительном варианте антитело ингибирует рост опухолевых клеток на 60, 65, 70 или 75%. В одном варианте ингибирование роста опухолевых клеток измеряют по меньшей мере через 7 дней после того, как животным начинают проводить лечение антителом. В более предпочтительном варианте ингибирование роста опухолевых клеток измеряют по меньшей мере через 14 дней после того, как животным начинают проводить лечение антителом. В другом предпочтительном варианте с антиЮЕ-IΚ-антителом животному вводят другое антинеопластическое средство. В предпочтительном варианте антинеопластическое средство способно дополнительно ингибировать рост опухолевых клеток. В еще более предпочтительном варианте антинеопластическим средством является адриамицин, таксол,
- 16 012079 тамоксифен, 5-фтордезоксиуридин (5-РИ) или СР-358774. В предпочтительном варианте совместное введение антинеопластического средства и анти-ЮР-ГВ-антитела ингибирует рост опухолевых клеток по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на 60, 65, 70 или 75%, более предпочтительно на 80, 85 или 90% через промежуток, равный 22-24 дням. См., например, фиг. 7 и пример 9. В предпочтительном варианте антитело выбрано из 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 или 6.1.1 или содержит его тяжелую цепь, легкую цепь или антигенсвязывающую часть.
Индукция апоптоза анти-ЮР-IΒ-антителами
Другой аспект изобретения относится к анти-ЮР-IΒ-антителу, которое индуцирует гибель клеток. В одном варианте антитело вызывает апоптоз. Антитело может индуцировать апоптоз либо ίη νίνο, либо ίη νίΐτο. В общем, опухолевые клетки являются более чувствительными к апоптозу, чем нормальные клетки, так что введение анти-ЮР-IΒ-антитела предпочтительно вызывает апоптоз опухолевой клетки по сравнению с нормальной клеткой. В другом варианте введение анти-ЮР-IΒ-антитела уменьшает уровни фермента ак!, который вовлечен в фосфатидилинозитол (Р^-киназный путь. ΡΙ-киназный путь, в свою очередь, вовлечен в пролиферацию клеток и предотвращение апоптоза. Таким образом, ингибирование ак! может вызвать апоптоз. В более предпочтительном варианте антитело вводят ίη νίνο, чтобы вызвать апоптоз ЮР-ΙΒ-экспрессирующей клетки. В предпочтительном варианте антитело выбрано из 2.12.1,
2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 или 6.1.1 или содержит его тяжелую цепь, легкую цепь или антигенсвязывающую часть.
Способы получения антител и линий клеток, продуцирующих антитела
Иммунизация
В одном варианте данного изобретения антитела человека получают путем иммунизации животного, отличного от человека, содержащего некоторые или все локусы иммуноглобулина человека, ЮР-ΙΒантигеном. В предпочтительном варианте животным, отличным от человека, является ксеномышь ΧΕΝΟΜΟυδΕ™, которая представляет собой сконструированный штамм мышей, который содержит большие фрагменты локусов иммуноглобулина человека и дефицитна по продуцированию мышиных антител. См., например, Сгееа е! а1. №11иге беиеНск 7: 13-21 (1994) и патенты США 5916771, 5939598, 5985615, 5998209, 6075181, 6091001, 6114598 и 6130364. См. также заявку АО 91/10741, опубликованную 25 июля 1991, АО 94/02602, опубликованную 3 февраля 1994, АО 96/34096 и АО 96/33735, которые обе опубликованы 31 октября 1996, АО 98/16654, опубликованную 23 апреля 1998, АО 98/24893, опубликованную 11 июня 1998, АО 98/50433, опубликованную 12 ноября 1998, АО 99/45031, опубликованную 10 сентября 1999, АО 99/53049, опубликованную 21 октября 1999, АО 00/09560, опубликованную 24 февраля 2000, и АО 00/037504, опубликованную 29 июня 2000. XЕNΟΜΟυ8Е™ продуцирует набор полностью человеческих антител, соответствующий набору у взрослого человека, и образует антиген-специфичные мАт человека. XЕNΟΜΟυ8Е™ второго поколения содержит примерно 80% набора антител человека вследствие введения ΥАС-фрагментов локусов тяжелой цепи и локусов легкой цепи к человека, имеющих структуру зародышевой линии и размер, измеряемый миллионами оснований. См. Меибех е! а1. №1иге Северск 15: 146-156 (1997), Сгеев ип6 ^акοЬον^!к 1. Ехр. Меб. 188: 483-495 (1998), описания которых включены в данную заявку в виде ссылки.
Изобретение также относится к способу получения анти-ЮР-IΒ-антител из организма животного, отличного от человека и отличного от мыши, путем иммунизации трансгенных животных, отличных от человека, которые содержат локусы иммуноглобулинов человека. Таких животных можно получить с использованием способов, описанных непосредственно выше. Способы, описанные в указанных патентах, можно модифицировать, как описано в патенте США 5994619. В предпочтительном варианте животными, отличными от человека, могут быть крысы, овцы, свиньи, козы, крупный рогатый скот или лошади.
В другом варианте животными, отличными от человека, содержащими локусы иммуноглобулиновых генов человека, являются животные, которые имеют «мини-локус» иммуноглобулинов человека. В методике на основе мини-локуса осуществляют имитацию экзогенного локуса Ιβ посредством включения отдельных генов из локуса Ιβ. Таким образом, из одного или более генов Ун, одного или более генов ΌΗ, одного или более генов 1н, константной области ти и второй константной области (предпочтительно константной области гамма) образуют конструкцию для встраивания в организм животного. Указанная методика описана наряду с другими в патентах США №№ 5545807, 5545806, 5625825, 5625126, 5633425, 5661016, 5770429, 5789650, 5814318, 5591669, 5612205, 5721367, 5789215 и 5643763,включенных в данное описание в виде ссылки.
Преимуществом методики на основе мини-локуса является скорость, с которой могут быть созданы и введены в животных конструкции, включающие части локуса Ιβ. Однако возможным недостатком методики на основе мини-локуса является то, что может иметь место недостаточное разнообразие иммуноглобулинов, чтобы поддержать полное развитие В-клеток, так что продукция антител может быть ниже.
Для того, чтобы получить анти-ЮР-IΒ-антитело человека, животное, отличное от человека, содержащее некоторые или все локусы иммуноглобулинов человека, иммунизируют ЮР-IΒ-антигеном и из организма животного выделяют антитело или клетку, продуцирующую антитело. ЮР-IΒ-антиген может
- 17 012079 представлять собой выделенный и/или очищенный ЮР-ГВ и предпочтительно является ЮР-ГВ человека. В другом варианте ЮР-ГВ-антигеном является фрагмент ЮР-ГВ, предпочтительно внеклеточный домен ЮР-ГВ. В другом варианте ЮР-ГВ-антигеном является фрагмент, который содержит по меньшей мере один эпитоп ЮР-ГВ. В другом варианте ЮР-ГВ-антигеном является клетка, которая экспрессирует ЮРГВ на своей клеточной поверхности, предпочтительно клетка, которая сверхэкспрессирует ЮР-ГВ на своей клеточной поверхности.
Иммунизацию животных можно проводить любым способом, известным в данной области. См., например, Наг1о\у апб Ьапе, АпйЬоЛеэ: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, №\ν Уогк: Со1б 8рттд НагЬог Ргеээ, 1990. В данной области хорошо известны способы иммунизации животных, отличных от человека, таких как мыши, крысы, овцы, козы, свиньи, крупный рогатый скот и лошади. См., например, Наг1оте апб Ьапе и патент США 5994619. В предпочтительном варианте ЮР-ГВ-антиген вводят с адъювантом, чтобы стимулировать иммунный ответ. Такие адъюванты включают неполный адъювант Фрейнда, ВГВГ (мурамилдипептиды) или Г8СОМ (иммуностимулирующие комплексы). Такие адъюванты могут защищать полипептид от быстрого рассеивания посредством депонирования в виде локального отложения, или они могут содержать вещества, которые стимулируют хозяина к секреции факторов, которые являются хемотаксическими для макрофагов и других компонентов иммунной системы. Предпочтительно при введении полипептида схема иммунизации будет включать два или большее количество введений полипептида, проводимых в течение нескольких недель.
В примере 1 представлен протокол иммунизации ксеномыши ΧΕΝΟΜΟυδΕ™ полноразмерным ЮР-ГВ человека в фосфатно-солевом буфере.
Получение антител и линий клеток, продуцирующих антитела
После иммунизации животного ЮР-ГВ-антигеном от животного можно получить антитела и/или клетки, продуцирующие антитела.
Сыворотку, содержащую анти-ЮР-ГВ-антитела, получают от животного посредством взятия крови или забоя животного. Можно использовать сыворотку в том виде, как она получена от животного, из сыворотки можно получить иммуноглобулиновую фракцию или из сыворотки можно очистить анти-ЮРГВ-антитела. Сыворотка или иммуноглобулины, полученные таким образом, являются поликлональными, что имеет недостатки, поскольку количество антител, которое можно получить, ограничено и поликлональное антитело обладает гетерогенным набором свойств.
В другом варианте от иммунизированного животного можно получить иммортализованные гибридомы, продуцирующие антитела. После иммунизации животного умерщвляют, и В-клетки селезенки сливают с иммортализованными клетками миеломы, как хорошо известно в данной области. См., например, Нат1оте апб Ьапе, выше. В предпочтительном варианте клетки миеломы не секретируют полипептиды иммуноглобулинов (несекретирующая линия клеток). После слияния и селекции с использованием антибиотиков проводят скрининг гибридом, используя ЮР-ГВ, его часть или клетку, экспрессирующую ЮР-ГВ. В предпочтительном варианте начальный скрининг выполняют с использованием твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЬГ8А) или радиоиммуноанализа (РИА), предпочтительно ЕЬГ8А. Пример скрининга с применением ЕЬГ8А представлен в заявке \УО 00/37504, включенной в данное описание в виде ссылки.
В другом варианте клетки, продуцирующие антитела, можно получить от человека, у которого имеется аутоиммунное нарушение и у которого экспрессируются анти-ЮР-ГВ-антитела. Клетки, экспрессирующие анти-ЮР-ГВ-антитела, можно выделить, выделяя лейкоциты и подвергая их флуоресцентно активируемой сортировке клеток (РАС8) или посредством пэннинга на чашках, покрытых ЮР-ГВ или его частью. Указанные клетки можно слить с несекретирующей миеломой человека, чтобы получить гибридомы человека, экспрессирующие анти-ЮР-ГВ-антитела человека. В общем, это менее предпочтительный вариант, так как анти-ЮР-ГВ-антитела, вероятно, будут иметь низкую аффинность по отношению к ЮР-ГВ.
Гибридомы, продуцирующие анти-ЮР-ГВ-антитело, отбирают, клонируют и подвергают дальнейшему скринингу в отношении требуемых характеристик, включая устойчивый рост гибридомы, высокую продукцию антител и требуемые характеристики антитела, которые обсуждаются далее. Гибридомы можно культивировать и размножать ш νί\Ό в сингенных животных, в животных, у которых отсутствует иммунная система, например у «голых» мышей, или в культуре клеток ш νίΙΐΌ. Способы отбора, клонирования и размножения гибридом хорошо известны специалистам в данной области.
Предпочтительно иммунизированным животным является животное, отличное от человека, которое экспрессирует гены иммуноглобулинов человека, и В-клетки селезенки сливают с миеломой, полученной от того же самого вида животного, отличного от человека. Более предпочтительно иммунизированным животным является ксеномышь ΧΕΝΟΜΟυδΕ™, а линией клеток миеломы является несекретирующая миелома мышей, такая как линия клеток миеломы ΝδΟ-ЬсЕ. См., например, пример 1.
В одном аспекте изобретение относится к получаемым гибридомам, которые продуцируют антиЮР-ГВ-антитела человека. В предпочтительном варианте гибридомы являются мышиными гибридомами, которые описаны выше. В другом предпочтительном варианте гибридомы получают для вида, отличного
- 18 012079 от человека, отличного от мыши, такого как крысы, овцы, свиньи, козы, крупный рогатый скот или лошади. В другом варианте гибридомы являются гибридомами человека, при этом несекретирующую миелому человека сливают с клеткой человека, экспрессирующей анти-1СР-1Я-антитело.
Нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева и рекомбинантные способы получения антител Нуклеиновые кислоты
Представлены молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие анти-1СР-1Я-антитела согласно изобретению. В одном варианте молекула нуклеиновой кислоты кодирует тяжелую и/или легкую цепь анти1СР-1Я-иммуноглобулина. В предпочтительном варианте одна молекула нуклеиновой кислоты кодирует тяжелую цепь анти-1СР-1Я-иммуноглобулина, а другая молекула нуклеиновой кислоты кодирует легкую цепь анти-1СР-1Я-иммуноглобулина. В более предпочтительном варианте кодируемый иммуноглобулин является иммуноглобулином человека, предпочтительно 1дС человека. Кодируемая легкая цепь может быть λ-цепью или κ-цепью, предпочтительно κ-цепью.
Молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вариабельную область легкой цепи, можно получить из гена Ук А30, А27 или 012. В предпочтительном варианте легкую цепь получают из гена Ук А30. В другом предпочтительном варианте молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь, содержит соединительную область, полученную из Σκ1, Σκ2 или Σκ4. В еще более предпочтительном варианте молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь, содержит не более десяти изменений аминокислот по сравнению с геном νκ А30 зародышевой линии, предпочтительно не более шести изменений аминокислот и еще более предпочтительно не более трех изменений аминокислот.
Изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариабельную область легкой цепи (УБ), содержащую по меньшей мере три изменения аминокислот по сравнению с последовательностью зародышевой линии, при этом изменения аминокислот идентичны изменениям аминокислот по сравнению с последовательностью зародышевой линии в УБ одного из антител 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3,
3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. Изобретение также относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. Изобретение также относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность одного или более СИЯ любой из легких цепей
2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В предпочтительном варианте молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность всех СИЯ любой из легких цепей 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В другом варианте молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность одной из 8ΕΟ ΙΌ N0: 2, 6, 10, 14, 18 или 22, или содержит последовательность нуклеиновой кислоты одной из 8Ε0 ΙΌ N0: 1, 5, 9, 13, 17 или 21. В другом предпочтительном варианте молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность одного или более СИЯ любой из 8Ε0 ΙΌ N0: 2, 6, 10, 14, 18 или 22, или содержит последовательность нуклеиновой кислоты одного или более СИЯ любой из 8Ε0 ΙΌ N0: 1, 5, 9, 13, 17 или 21. В более предпочтительном варианте молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность всех СИЯ любой из 8Ε0 ΙΌ N0: 2, 6, 10, 14, 18 или 22, или содержит последовательность нуклеиновой кислоты всех СИЯ любой из 8Ε0 ΙΌ N0: 1, 5, 9, 13, 17 или 21.
Изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые кодируют аминокислотную последовательность УБ, которая имеет последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична описанной выше УБ, в частности УБ, которая содержит аминокислотную последовательность одной из 8Ε0 ΙΌ N0: 2, 6, 10, 14, 18 или 22. Изобретение также относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты одной из 8Ε0 ΙΌ N0: 1, 5, 9, 13, 17 или 21. В другом варианте изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей УБ, которая в условиях высокой жесткости гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей УБ, которая описана выше, в частности молекулой нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность 8Ε0 ΙΌ N0: 2, 6, 10, 14, 18 или 22. Изобретение также относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей УБ, которая в условиях высокой жесткости гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты одной из 8Ε0 ΙΌ N0: 1, 5, 9, 13, 17 или 21.
Изобретение также относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи (УН), полученной из УН-гена БР-35. БР-47. БР-71 или УГУ-4/4.35, предпочтительно УН-гена БР-35. В другом предпочтительном варианте молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая УН, содержит соединительную область из 1Н6 или 1Н5, более предпочтительно 1Н6. В другом предпочтительном варианте Ό-участок получен из 3-3, 6-19 или 4-17. В еще более предпочтительном варианте молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая УН, содержит не более десяти изменений аминокислот по сравнению с геном БР-47 зародышевой линии, предпочтительно не более шести изменений аминокислот
- 19 012079 и еще более предпочтительно не более трех изменений аминокислот. В высокопредпочтительном варианте молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая УН, содержит по меньшей мере одно изменение аминокислот по сравнению с последовательностью зародышевой линии, при этом изменение аминокислоты идентично изменению аминокислоты по сравнению с последовательностью зародышевой линии в тяжелой цепи одного из антител 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В еще более предпочтительном варианте УН содержит по меньшей мере три изменения аминокислот по сравнению с последовательностями зародышевой линии, при этом изменения идентичны изменениям по сравнению с последовательностью зародышевой линии в УН одного из антител 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или
6.1.1.
В одном варианте молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность УН 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В другом варианте молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность одного или более СОВ тяжелой цепи 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В предпочтительном варианте молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотные последовательности всех СОВ тяжелой цепи 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В другом предпочтительном варианте молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность одной из 8Е0 ΙΌ N0: 4, 8, 12, 16, 20 или 24, или содержит последовательность нуклеиновой кислоты одной из 8Е0 ΙΌ N0: 3, 7, 11, 15, 19 или 23. В другом предпочтительном варианте молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность одного или более СОВ любой из 8Е0 ΙΌ N0: 4, 8, 12, 16, 20 или 24, или содержит последовательность нуклеиновой кислоты одного или более СОВ любой из 8Е0 ΙΌ N0: 3, 7, 11, 15, 19 или 23. В предпочтительном варианте молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотные последовательности всех СОВ любой из 8Е0 ΙΌ N0: 4, 8, 12, 16, 20 или 24, или содержит последовательность нуклеиновой кислоты всех СОВ любой из 8Е0 ΙΌ N0: 3, 7, 11, 15, 19 или 23.
В другом варианте молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность УН, которая по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична одной из аминокислотных последовательностей, кодирующих УН, которые описаны непосредственно выше, в частности УН, которая содержит аминокислотную последовательность одной из 8Е0 ΙΌ N0: 4, 8, 12, 16, 20 или 24. Изобретение также относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты одной из 8Е0 ΙΌ N0: 3, 7, 11, 15, 19 или 23. В другом варианте молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей УН, является молекула, которая в условиях высокой жесткости гибридизуется с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей УН, которая описана выше, в частности УН, которая содержит аминокислотную последовательность одной из 8Е0 ΙΌ N0: 4, 8, 12, 16, 20 или 24. Изобретение также относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей УН, которая в условиях высокой жесткости гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты одной из 8Е0 ΙΌ N0: 3, 7, 11, 15, 19 или 23.
Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая одну из двух или обе полные тяжелую и легкую цепи анти-ЮЕ-IΒ-антитела или их вариабельные области, можно получить из любого источника, который продуцирует анти-ЮЕ-IΒ-антитело. Способы выделения мРНК, кодирующей антитело, хорошо известны в данной области. См., например, 8атЬгоок е! а1. мРНК можно использовать для получения кДНК для применения в полимеразной цепной реакции (ПЦР) или при кДНК-клонировании генов антитела. В одном варианте изобретения молекулы нуклеиновой кислоты можно получить из гибридомы, которая экспрессирует анти-ЮЕ-IΒ-антитело, которая описана выше, предпочтительно из гибридомы, которая имеет в качестве одного из партнеров слияния клетку трансгенного животного, которая экспрессирует гены иммуноглобулинов человека, такого как ХЕ/Ы0М0и8Е™, трансгенного животного, отличного от человека, такого как мышь, или трансгенного животного, отличного от человека и отличного от мыши. В другом варианте гибридому получают из нетрансгенного животного, отличного от человека, которое можно использовать, например, для получения гуманизированных антител.
Молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полную тяжелую цепь анти-ЮЕ-IΒ-антитела, можно сконструировать посредством слияния молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный домен тяжелой цепи или ее антигенсвязывающий домен, с константным доменом тяжелой цепи. Подобным образом молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую легкую цепь анти-ЮЕ-IΒ-антитела, можно сконструировать посредством слияния молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный домен легкой цепи или ее антигенсвязывающий домен, с константным доменом легкой цепи. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие цепь УН и УЬ, можно превратить в полноразмерные гены антитела путем их встраивания в экспрессирующие векторы, уже кодирующие константную область тяжелой цепи и константную область легкой цепи, соответственно, так, чтобы участок УН был функционально связан с участком(ами) константной области тяжелой цепи (СН) в векторе, а участок УЬ был функционально связан с участком константной области легкой цепи (СЬ) в векторе. Альтернативно, молекулы нуклеиновой
- 20 012079 кислоты, кодирующие цепи УН или УЬ, превращают в полноразмерные гены антитела связыванием, например лигированием, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей цепь УН, с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей цепь СН, используя стандартные способы молекулярной биологии. Этого же можно достичь с использованием молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих цепи УЬ и СЬ. Последовательности генов константных областей тяжелой и легкой цепей человека известны в данной области. См., например, КаЬаТ с1 а1., 8сцнспсс5 ο£ РгоТетк ο£ [ιηιηιιηο1οβ№1 [ЩсгскТ, 5(Н Еб., NТН РиЫ. №. 91-3242, 1991. Затем молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полноразмерные тяжелые и/или легкие цепи, можно экспрессировать из клетки, в которую они введены, и выделить анти-ЮР-ТВ-антитело.
В предпочтительном варианте нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, кодирует аминокислотную последовательность 8ЕЦ ТЭ N0: 4, 8, 12, 16, 20 или 24, а молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельную область легких цепей, кодирует аминокислотную последовательность 8ЕЦ ТЭ N0: 2, 6, 10, 14, 18 или 22. 8ЕЦ ТЭ N0: 28 показывает аминокислотную последовательность, а 8ЕЦ ТЭ N0: 27 показывает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую константную область тяжелой цепи анти-ЮР-ТВ-антител 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 и 6.1.1. 8ЕЦ ГО N0: 26 показывает аминокислотную последовательность, а 8ЕЦ ГО N0: 25 показывает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую константную область легкой цепи анти-ЮР-ТВ-антител
2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 и 6.1.1. Таким образом, в предпочтительном варианте молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая константную область тяжелой цепи, кодирует 8ЕЦ ГО N0: 28, а молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая константную область легкой цепи, кодирует 8ЕЦ ГО N0: 26. В более предпочтительном варианте молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая константный домен тяжелой цепи, имеет последовательность нуклеиновой кислоты 8ЕЦ ГО N0: 27, а молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая константный домен, имеет последовательность нуклеиновой кислоты 8ЕЦ ГО N0: 25.
В другом варианте молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую либо тяжелую цепь анти-ЮР-ТВантитела или ее антигенсвязывающий домен, либо легкую цепь анти-ЮР-ТВ-антитела или ее антигенсвязывающий домен, можно выделить из животного, отличного от человека и отличного от мыши, которое экспрессирует гены иммуноглобулина человека и было иммунизировано ТСР-ТВ-антигеном. В другом варианте молекулу нуклеиновой кислоты можно выделить из клетки, продуцирующей анти-ЮР-ТВ-антитело, полученной из нетрансгенного животного или из организма пациента-человека, у которого продуцируются анти-ТСР-ТВ-антитела. В качестве способов выделения мРНК из клеток, продуцирующих антиЮР-ТВ-антитела, можно использовать стандартные способы выделения, мРНК можно клонировать и/или амплифицировать с использованием ПЦР и способов конструирования библиотек и провести скрининг с использованием стандартных протоколов, чтобы получить молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие тяжелые и легкие цепи анти-ТСР-ТВ-антител.
Молекулы нуклеиновой кислоты можно использовать для того, чтобы на основе рекомбинантного способа экспрессировать большие количества анти-ТСР-ТВ-антител, как описано ниже. Молекулы нуклеиновой кислоты также можно использовать для получения химерных антител, одноцепочечных антител, иммуноадгезинов, диантител, мутантных антител и производных антител, которые описаны далее. Если молекулы нуклеиновой кислоты получают от нетрансгенного животного, отличного от человека, молекулы нуклеиновой кислоты можно использовать для гуманизации антител так, как описано ниже.
В другом варианте молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению можно использовать в качестве зондов или праймеров ПЦР для специфичных последовательностей антител. Например, зонд на основе молекулы нуклеиновой кислоты можно использовать в диагностических способах или праймер ПЦР на основе молекулы нуклеиновой кислоты можно использовать для амплификации областей ДНК, которые можно использовать, наряду с прочим, для выделения последовательностей нуклеиновой кислоты для применения при получении вариабельных доменов анти-ТСР-ТВ-антител. В предпочтительном варианте молекулы нуклеиновой кислоты представляют собой олигонуклеотиды. В более предпочтительном варианте олигонуклеотиды получены из высоковариабельных областей тяжелой и легкой цепей представляющего интерес антитела. В еще более предпочтительном варианте олигонуклеотиды кодируют все или часть одного или более СЭВ.
Векторы
Изобретение относится к векторам, содержащим молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, которые кодируют тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть. Изобретение также относится к векторам, содержащим молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, которые кодируют легкую цепь или ее антигенсвязывающую часть. Изобретение также относится к векторам, содержащим молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие слитые белки, модифицированные антитела, фрагменты антител и их зонды.
Для того, чтобы экспрессировать антитела или части антител согласно изобретению, ДНК, кодирующие неполные или полноразмерные легкие и тяжелые цепи, полученные, как описано выше, встраивают в экспрессирующие векторы так, чтобы гены были функционально связаны с последовательностями регуляции транскрипции и трансляции. Экспрессирующие векторы включают плазмиды, ретровирусы, космиды, УАС, эписомы, полученные из ЕВУ, и т.п. Ген антитела лигируют в вектор так, чтобы последовательности регуляции транскрипции и трансляции в векторе выполняли свою предназначенную
- 21 012079 функцию регулирования транскрипции и трансляции гена антитела. Экспрессирующий вектор и последовательности регуляции экспрессии выбирают так, чтобы они были совместимы с используемой клеткой-хозяином для экспрессии. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела можно встроить в отдельные векторы. В предпочтительном варианте оба гена встраивают в один и тот же экспрессирующий вектор. Гены антитела встраивают в экспрессирующий вектор стандартными способами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела и векторе или лигированием тупых концов, если сайты рестрикции отсутствуют).
Подходящим вектором является вектор, который кодирует функционально полную последовательность СН или СЬ иммуноглобулина человека, с соответствующими сайтами рестрикции, сконструированными так, чтобы можно было легко встроить и экспрессировать любую последовательность УН или УЬ, которые описаны выше. В таких векторах сплайсинг обычно происходит между донорным сайтом сплайсинга во встроенной 1-области и акцепторным сайтом сплайсинга, предшествующим С-области человека, а также в областях сплайсинга, которые имеются в экзонах СН человека. Полиаденилирование и терминация транскрипции происходят в нативных сайтах хромосомы ниже кодирующих областей. Рекомбинантный экспрессирующий вектор также может кодировать сигнальный пептид, который способствует секреции цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела можно клонировать в векторе так, чтобы сигнальный пептид был связан в рамке с аминоконцом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может представлять собой сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный сигнальный пептид (т.е. сигнальный пептид из белка, отличного от иммуноглобулина).
Кроме генов цепей антител рекомбинантные экспрессирующие векторы согласно изобретению несут регуляторные последовательности, которые регулируют экспрессию генов цепей антител в клеткехозяине. Специалистам в данной области будет понятно, что конструирование экспрессирующего вектора, включая подбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, которую необходимо трансформировать, уровня экспрессии требуемого белка и т.д.
Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии в клетке-хозяине млекопитающего включают вирусные элементы, которые обеспечивают высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, полученные из ретровирусных ПК, цитомегаловируса (СМУ) (такие, как промотор/энхансер СМУ), обезьяньего вируса 40 (3У40) (такой, как промотор/энхансер 3У40), аденовируса (например, главный поздний промотор аденовируса (АбМЬР)), полиомы, и сильных промоторов млекопитающих, таких как нативные промоторы иммуноглобулина и актина. Для дальнейшего знакомства с описанием вирусных регуляторных элементов и их последовательностей см., например, патент США № 5168062, 81ткк1; патент США № 4510245, Ве11 е! а1.; и патент США № 4968615, Зсйайиег е! а1.
Кроме генов цепей антител и регуляторных последовательностей рекомбинантные экспрессирующие векторы согласно изобретению могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетке-хозяине (например, начала репликации) и гены селективных маркеров. Ген селективного маркера облегчает селекцию клеток-хозяев, в которые был введен вектор (см., например, патенты США №№ 4399216, 4634665 и 5179017, все патенты Ахе1 е! а1.). Например, ген селективного маркера обычно придает клетке-хозяину, в которую был введен вектор, резистентность к лекарственным средствам, таким как С418, гигромицин или метотрексат. Предпочтительные гены селективного маркера включают ген дигидрофолатредуктазы (ЭНРК) (для применения в клеткаххозяевах бЫг- при селекции/амплификации с метотрексатом) и ген мео (для селекции с помощью С418).
Негибридомные клетки-хозяева и рекомбинантные способы получения белка
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть и/или легкую цепь или ее антигенсвязывающую часть анти-1СР-1К-антитела, и векторы, содержащие указанные молекулы нуклеиновых кислот, можно использовать для трансформации подходящей клеткихозяина млекопитающего. Трансформацию можно осуществлять любым известным способом для введения полинуклеотидов в клетку-хозяин. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области и включают трансфекцию, опосредованную декстраном, осаждение фосфатом кальция, трансфекцию, опосредованную полибреном, слияние протопластов, электропорацию, инкапсулирование полинуклеотида(тов) в липосомы, биолистическую инъекцию и прямую микроинъекцию ДНК в ядра. Кроме того, молекулы нуклеиновых кислот можно ввести в клетки млекопитающих с помощью вирусных векторов. Способы трансформации клеток хорошо известны в данной области. См., например, патенты США №№ 4399216, 4912040, 4740461 и 4959455 (и указанные патенты, таким образом, включены в данное описание в виде ссылки).
Линии клеток млекопитающих, доступные в качестве хозяев для экспрессии, хорошо известны в данной области и включают многие иммортализованные линии клеток, доступные из Американской коллекции типов культур (АТСС). Указанные клетки наряду с другими включают клетки яичника китайского хомячка (СНО), N30, клетки 3Р2, клетки НеЬа, клетки почки детеныша хомячка (ВНК), клетки почки обезьяны (СО3), клетки гепатоклеточной карциномы человека (например, Нер С2), клетки А549, клетки 3 Т3 и ряд других клеточных линий. Клетки-хозяева млекопитающих включают клетки человека, мыши, крысы, собаки, обезьяны, свиньи, козы, коровы, лошади и хомячка. Особенно предпочтительные линии
- 22 012079 клеток отбирают посредством определения того, какие линии клеток имеют высокие уровни экспрессии. Другими линиями клеток, которые можно использовать, являются линии клеток насекомых, такие как клетки 3ί9, клетки амфибий, бактериальные клетки, клетки растений и клетки грибов. В том случае, когда рекомбинантные экспрессирующие векторы, кодирующие тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть, легкую цепь и/или ее антигенсвязывающую часть, вводят в клетки-хозяева млекопитающих, антитела получают посредством культивирования клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для того, чтобы обеспечить экспрессию антитела в клетках-хозяевах или более предпочтительно секрецию антитела в культуральную среду, в которой выращивают клетки-хозяева. Антитела можно извлечь из культуральной среды с использованием стандартных способов очистки белка.
Кроме того, экспрессию антител согласно изобретению (или других их фрагментов) продуцирующими линиями клеток можно усилить, используя ряд известных способов. Например, широко используемым подходом для усиления экспрессии при некоторых условиях является система экспрессии гена глутаминсинтетазы (система СЗ). Система СЗ обсуждается в целом или частично в европейских патентах №№ 0216846, 0256055 и 0323997 и европейской патентной заявке № 89303964.4.
Возможно, что антитела, экспрессируемые различными линиями клеток или трансгенными животными, будут отличаться друг от друга гликозилированием. Однако все антитела, кодируемые представленными в данном описании молекулами нуклеиновых кислот или содержащие представленные в данном описании аминокислотные последовательности, являются частью данного изобретения независимо от гликозилирования антител.
Трансгенные животные
Изобретение также относится к трансгенным животным, отличным от человека, содержащим одну или более молекул нуклеиновой кислоты согласно изобретению, которые можно использовать для получения антител согласно изобретению. Антитела можно получить и извлечь из ткани или жидкостей организма, таких как молоко, кровь или моча, коз, коров, лошадей, свиней, крыс, мышей, кроликов, хомячков или других млекопитающих. См., например, патенты США №№ 5827 690, 5756687, 5750172 и 5741957. Как описано выше, трансгенных животных, отличных от человека, которые содержат локусы иммуноглобулинов человека, можно получить иммунизацией 1СР-1К или его частью.
В другом варианте трансгенных животных, отличных от человека, получают введением в животного одной или более молекул нуклеиновой кислоты согласно изобретению стандартными трансгенными способами. См. Нодап, выше. Трансгенными клетками, используемыми для получения трансгенного животного, могут быть эмбриональные стволовые клетки или соматические клетки. Трансгенные организмы, отличные от человека, могут быть химерными, нехимерными гетерозиготами и нехимерными гомозиготами. См., например, Нодап е! а1., Машри1а!тд !бе Мойке Етбгуо: А Ъабога!огу Мапиа1 2еб., Со1б Зргтд Нагбог Ргекк (1999); 1асккоп е! а1., Мойке Сепебск апб Тгапкдешск: А Ргасбса1 Арргоасб, ОхГогб ЪштегкНу Ргекк (2000); и Рб1кег1 Тгапкдешс Ашта1 Тесбпо1оду: А Ъабога!огу Напббоок, Асабетю Ргекк (1999). В другом варианте трансгенные организмы, отличные от человека, могут иметь целенаправленное нарушение и замену, которая кодирует представляющую интерес тяжелую цепь и/или легкую цепь. В предпочтительном варианте трансгенные животные содержат и экспрессируют молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие тяжелую и легкую цепи, которые специфично связываются с 1СР-1К, предпочтительно с 1СР-1К человека. В другом варианте трансгенные животные содержат молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие модифицированное антитело, такое как одноцепочечное антитело, химерное антитело или гуманизированное антитело. Анти-1СР-1К-антитела можно получить в любом трансгенном животном. В предпочтительном варианте животными, отличными от человека, являются мыши, крысы, овцы, свиньи, козы, крупный рогатый скот или лошади. Трансгенное животное, отличное от человека, экспрессирует указанные кодируемые полипептиды в крови, молоке, моче, слюне, слезах, слизи и других жидкостях организма.
Библиотеки на основе фагового дисплея
Изобретение относится к способу получения анти-1СР-1К-антитела или его антигенсвязывающей части, включающему стадии синтеза библиотеки человеческих антител на фаге, скрининга библиотеки с помощью 1СР-1К или его части, выделения фага, который связывает 1СР-1К, и получения антитела из фага. Один из способов получения библиотеки антител включает стадии иммунизации животного-хозяина, отличного от человека, содержащего локус иммуноглобулина человека, с помощью 1СР-1К или его антигенной части, чтобы вызвать иммунный ответ, извлечения клеток из животного-хозяина, клеток, которые ответственны за продукцию антител; выделения РНК их извлеченных клеток, обратной транскрипции РНК для получения кДНК, амплификации кДНК с использованием праймера и встраивания кДНК в вектор для фагового дисплея так, чтобы на фаге экспрессировались антитела. Таким образом можно получить рекомбинантные анти-1СР-1К-антитела согласно изобретению.
Рекомбинантные анти-1СР-1К-антитела человека согласно изобретению, дополнительно к описанным в данном изобретении анти-1СР-1К-антителам, можно выделить посредством скрининга рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител, предпочтительно библиотеки на основе фагового дисплея ксΡν, полученного с использованием кДНК УЪ и УН человека, приготовленной на мРНК, полученной из лимфоцитов человека. Методики получения и скрининга таких библиотек известны в данной области.
- 23 012079
Имеются коммерчески доступные наборы для создания библиотек на основе фагового дисплея (например, система для антител на основе рекомбинантного фага Рйагтааа, № по каталогу 27-9400-01; и набор для фагового дисплея 81га1адепе ^игЕАР™, № по каталогу 240612). Также существуют другие способы и реагенты, которые можно использовать при создании и скрининге дисплейных библиотек антител (см., например, Ъабпег е! а1., патент США № 5223409; Капд е! а1., заявка РСТ № АО 92/18619; Эо^ег е! а1., заявка РСТ № АО 91/17271; АйНег е! а1., заявка РСТ № АО 92/20791; Магк1апб е! а1., заявка РСТ № АО 92/15679; Вгеййпд е! а1., заявка РСТ № АО 93/01288; МсСа££ейу е! а1., заявка РСТ № АО 92/01047; Саггагб е! а1., заявка РСТ № АО 92/09690; Рисйк е! а1. (1991) Β^ο/ΤесЬηο1οду 9: 1370-1372; Нау е! а1. (1992) Нит. АпбЬоб. НуЬпботак 3: 81-85; Нике е! а1. (1989) 8с1епсе 246: 1275-1281; МсСаГГеПу е! а1., АЦиге (1990) 348: 552-554; СгЖШк е! а1. (1993) ЕМВО I. 12: 725-734; Наиктк е! а1. (1992) I. Мо1. Вю1. 226: 889-896; С1асккоп е! а1. (1991) АПиге 352: 624-628; Сгат е! а1. (1992) Ргос. Асаб. 8с1. И8А 89: 3576-3580; Саггаб е! а1. (1991) Β^ο/ΤесЬηο1οду 9: 1373-1377; НоодепЬоот е! а1. (1991) Шс. Ас1б Век. 19: 4133-4137; и ВагЬак е! а1. (1991) Ргос. Асаб. 8ск И8А 88: 7978-7982).
В предпочтительном варианте для выделения анти-1СР-1В-антител человека с требуемыми параметрами описанное в данной заявке анти-1СР-1В-антитело человека сначала используют для отбора последовательностей тяжелой и легкой цепей человека, обладающих сходной связывающей активностью по отношению к 1СР-1В, используя способы импринтинга эпитопов, описанные в НоодепЬоот е! а1., заявка РСТ № АО 93/06213. Библиотеки антител, используемые в данном способе, предпочтительно представляют собой ксРу-библиотеки, полученные и подвергнутые скринингу, как описано в МсСайег1у е! а1., заявка РСТ № АО 92/01047, МсСа££ег1у е! а1., АПиге (1990) 348: 552-554; и Сп£й!йк е! а1., (1993) ЕМВО I. 12: 725-734. Скрининг библиотек ксРу-антител предпочтительно осуществляют с использованием в качестве антигена 1СР-1В человека.
После того, как выбраны исходные участки УЪ и УН человека, выполняют эксперименты по «сочетанию и подбору пар», в которых проводят скрининг различных частей исходно выбранных участков УЪ и УН в отношении связывания 1СР-1В, чтобы выбрать предпочтительные комбинации в паре УЪ/УН. Кроме того, для дальнейшего улучшения качества антитела участки УЪ и УН в предпочтительной паре(ах) УЪ/УН можно подвергнуть случайному мутированию предпочтительно в области СЭВ3 УН и/или УЪ, в процессе, аналогичном процессу образования соматических мутаций ίη у1уо, ответственных за аффинное созревание антител во время естественного иммунного ответа. Указанное аффинное созревание ίη У1!го можно осуществить посредством амплификации областей УН и УЪ с использованием ПЦР-праймеров, комплементарных СЭВ3 УН или СЭВ3 УЪ, соответственно, при этом указанные праймеры в определенных положениях «мечены» с помощью случайной смеси четырех оснований нуклеотидов так, чтобы полученные в результате продукты ПЦР кодировали участки УН и УЪ, в которые были введены случайные мутации в областях СЭВ3 УН и/или УЪ. Такие случайно мутированные участки УН и УЪ можно подвергнуть повторному скринингу в отношении связывания с 1СР-1В.
После скрининга и выделения анти-1СР-1В-антитела согласно изобретению из рекомбинантной дисплейной библиотеки иммуноглобулинов нуклеиновую кислоту, кодирующую выбранное антитело, можно извлечь из упаковки в фаг (например, из фагового генома) и субклонировать в другие экспрессирующие векторы стандартными способами на основе рекомбинантной ДНК. При желании, нуклеиновую кислоту можно подвергнуть дальнейшей обработке, чтобы создать другие формы антитела согласно изобретению, как описано ниже. Чтобы экспрессировать рекомбинантное антитело человека, выделенное в результате скрининга комбинаторной библиотеки, ДНК, кодирующую антитело, клонируют в рекомбинантном экспрессирующем векторе и вводят в клетки-хозяева млекопитающих, которые описаны выше.
Переключение классов
Другим аспектом данного изобретения является предоставление механизма, посредством которого можно переключить класс анти-1СР-1В-антитела на другой. В одном аспекте изобретения молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую УЪ или УН, выделяют с использованием способов, хорошо известных в данной области, так, чтобы они не содержали никаких последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих СЪ или СН. Затем молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую УЪ или УН, функционально связывают с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей СЪ или СН из молекулы иммуноглобулина другого класса. Это можно осуществить с использованием вектора или молекулы нуклеиновой кислоты, которая содержит цепь СЪ или СН, как описано выше. Например, анти-1СР-1В-антитело, которое исходно представляло собой 1дМ, можно переключить на другой класс 1дС. Кроме того, переключение классов можно использовать для превращения одного подкласса 1дС в другой, например 1дС1 в 1дС2. Предпочтительный способ получения антитела согласно изобретению, содержащего требуемые изотипы, включает стадии выделения нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь анти-1СР-1Вантитела, и нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь анти-1СР-1В-антитела, получения вариабельной области тяжелой цепи, лигирования вариабельной области тяжелой цепи с константным доменом тяжелой цепи требуемого изотипа, экспрессии легкой цепи и лигированной тяжелой цепи в клетке и сбора анти-1СР-1В-антитела требуемого изотипа.
Производные антител
Описанные выше молекулы нуклеиновых кислот можно использовать для создания производных
- 24 012079 антител с использованием методик и способов, известных специалисту в данной области.
Гуманизированные антитела
Как обсуждалось выше в связи с созданием антител человека, получение антител с пониженной иммуногенностью имеет преимущества. В некоторой степени это можно осуществить с использованием способа гуманизации и методики дисплея с применением подходящих библиотек. Будет понятно, что мышиные антитела или антитела из других видов можно гуманизировать или приматизировать с использованием способа, хорошо известного в данной области. См., например, Ат!ег аиб Натк Iттиио1 Тобау 14: 43-46 (1993) и Апд1Ц е! а1. Сгй. Веу1е\\'к ш Iттиио1. 12125-168 (1992). Представляющее интерес антитело можно сконструировать способом на основе рекомбинантной ДНК, чтобы заменить домены СН1, СН2, СН3, шарнирный домен и/или каркасный домен соответствующей последовательностью человека (см. АО 92/02190 и патенты США №№ 5530101, 5585089, 5693761, 5693792, 5714350 и 5777085). В предпочтительном варианте анти-ЮР-Ш-антитело можно гуманизировать заменой доменов СН1, СН2, СН3, шарнирного домена и/или каркасного домена соответствующей последовательностью человека при сохранении всех СЭВ тяжелой цепи, легкой цепи или обеих, тяжелой и легкой, цепей.
Мутантные антитела
В другом варианте молекулы нуклеиновой кислоты, векторы и клетки-хозяева можно использовать для получения мутантных анти-ЮР-IΚ-антител. Можно получить мутации антител в вариабельных доменах тяжелой и/или легкой цепей, чтобы изменить связывающие свойства антитела. Например, можно получить мутацию в одной или более областях ΟΩΚ, чтобы увеличить или уменьшить Кб антитела по отношению к ЮР-ΙΚ, увеличить или уменьшить Ко££ или изменить специфичность связывания антитела. Способы сайт-специфичного мутагенеза хорошо известны в данной области. См., например, 8атЬгоок е! а1. аиб АикиЬе1 е! а1., выше. В предпочтительном варианте осуществляют мутацию в аминокислотном остатке, о котором известно, что он изменен по сравнению с зародышевой линией в вариабельной области анти-ЮР-IΚ-антитела. В более предпочтительном варианте получают одну или более мутаций в аминокислотном остатке, о котором известно, что он изменяется по сравнению с зародышевой линией, в вариабельной области или С^Κ-области одного из анти-ЮР-Ш-антител 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В другом варианте получают одну или более мутаций в аминокислотном остатке, о котором известно, что он изменен по сравнению с зародышевой линией, в вариабельной области или ΕΌΚобласти, аминокислотная последовательность которых представлена в 8ЕО ΙΌ N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 или 24 или последовательность нуклеиновой кислоты которых представлена в 8ЕО ΙΌ N0: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 или 23. В другом варианте молекулы нуклеиновой кислоты подвергают мутированию в одной или более каркасных областях. Можно получить мутацию в каркасной области или константном домене, чтобы увеличить время полужизни анти-ЮР-IΚ-антитела. См., например, АО 00/09560, опубликованную 24 февраля 2000г., включенную в данное описание в виде ссылки. В одном варианте может иметь место одна, три или пять точечных мутаций и не более десяти точечных мутаций. Также можно получить мутацию в каркасной области или константном домене, чтобы изменить иммуногенность антитела, получить сайт для ковалентного или нековалентного связывания с другой молекулой, или для того, чтобы изменить такие свойства, как фиксация комплемента. Мутации можно осуществлять в каждой из каркасных областей, в константном домене и вариабельных областях в одном мутантном антителе. Альтернативно, мутации можно осуществить только в одной из каркасных областей, вариабельных областей или константном домене в одном мутантном антителе.
В одном варианте имеется не более десяти изменений аминокислот в одной из УН- или УБ-областей мутантного анти-ЮР-ΙΚ-антитела по сравнению с анти-ЮР-IΚ-антителом до мутивирования. В более предпочтительном варианте имеется не более пяти изменений аминокислот в одной из УН- или УБ-областей мутантного анти-ЮР-IΚ-антитела, более предпочтительно не более трех изменений аминокислот. В другом варианте имеется не более пятнадцати изменений аминокислот в константных доменах, более предпочтительно не более десяти изменений аминокислот, еще более предпочтительно не более пяти изменений аминокислот.
Модифицированные антитела
В другом варианте можно получить слитое антитело или иммуноадгезин, который содержит все или часть анти-ЮР-IΚ-антитела, связанного с другим полипептидом. В предпочтительном варианте с полипептидом связаны только вариабельные области анти-ЮР-Ш-антитела. В другом предпочтительном варианте домен УН анти-ЮР-Ш-антитела связан с первым полипептидом, тогда как домен УБ анти-ЮРΙΚ-антитела связан со вторым полипептидом, который связан с первым полипептидом таким образом, при котором домены УН и УБ могут взаимодействовать друг с другом, образуя связывающий сайт антитела. В другом предпочтительном варианте домен УН отделен от домена УБ линкером так, чтобы домены УН и УБ могли взаимодействовать друг с другом (см. далее одноцепочечные антитела). Затем антитело УН-линкер-УБ связывают с представляющим интерес полипептидом. Слитое антитело применимо для направления полипептида в клетку или ткань, экспрессирующую ЮР-ΙΚ. Полипептид может представлять собой терапевтическое средство, такое как токсин, фактор роста или другой регуляторный белок, или может являться диагностическим средством, таким как фермент, который можно легко визуализировать, такой как пероксидаза хрена. Кроме того, можно создать слитые антитела, в которых два (или
- 25 012079 большее количество) одноцепочечных антител связаны друг с другом. Это применяется в том случае, когда требуется создать дивалентное или поливалентное антитело в одной полипептидной цепи или если требуется создать биспецифичное антитело.
Чтобы создать одноцепочечное антитело (ксЕу), фрагменты ДНК, кодирующие УН и УЪ, функционально связывают с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например кодирующим аминокислотную последовательность (С1у4-Зег)3 (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 60), так, чтобы последовательности УН и УЪ могли экспрессироваться в виде непрерывного одноцепочечного белка, содержащего УЬ- и УН-области, связанные гибким линкером (см., например, В1гб е! а1. (1988) Заемсе 242: 423-426; НикЮп е! а1. (1988) Ргас. №!1. Асаб. 8с1. ИЗА 85: 5879-5883; МсСаГГейу е! а1., №11иге (1990) 343: 552-554). Одноцепочечное антитело может быть моновалентным в том случае, если используют только одну УН и УЪ, бивалентым, если используют две УН и УЪ, или поливалентным, если используют больше двух УН и УЪ.
В другом варианте можно получить другие модифицированные антитела, используя молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие анти-ЮЕ-ΙΒ. Например, можно получить «каппа-тела» (Ι11 е! а1., Рго!ет Εη§ 10: 949-57 (1997)), «мини-антитела» (Майш е! а1., ЕМВО 1 13 : 5303-9 (1994)), «диантитела» (^Шдег е! а1., РNΑЗ ИЗА 90: 6444-6448 (1993)) или (Т^аиηеске^ е! а1., ЕМВО 1. 10: 3655-3659 (1991) и
Т^аиηеске^ е! а1. «кншкт: 1теху ιηοΕαιΕπ бек1§11 Γογ ЬкресШс геадегИк», Ιη!. 1. Сатсег Зирр1. 7: 51-52 (1992)), используя стандартные способы молекулярной биологии, следуя инструкциям описания.
В другом аспекте можно создать химерные и биспецифичные антитела. Можно получить химерное антитело, которое содержит СОВ и каркасные области из разных антител. В предпочтительном варианте СОВ химерного антитела содержат все СОВ вариабельной области легкой цепи или тяжелой цепи антиΙΟΕ-ΙΒ-антитела, тогда как каркасные области получены из одного или более разных антител. В более предпочтительном варианте СОВ химерного антитела содержат все СОВ вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи анти-ЮЕ-ГВ-антитела. Каркасные области могут быть из другого вида и в предпочтительном варианте могут быть гуманизированы. Альтернативно, каркасные области могут быть из другого антитела человека.
Можно создать биспецифичное антитело, которое специфично связывается с ЮЕЧВ посредством одного связывающего домена, а со второй молекулой посредством второго связывающего домена. Биспецифичное антитело можно получить рекомбинантным молекулярно-биологическим способом или в результате физической конъюгации друг с другом. Кроме того, можно создать одноцепочечное антитело, содержащее более одной УН и УЪ, которое специфично связывается с ЮЕ-ТВ и с другой молекулой. Такие биспецифичные антитела можно создать, используя способы, которые хорошо известны, например, в связи с (ί) и (ίί), см., например, Е;тдег е! а1. Iттиηο1 МеЙюбк 4: 72-81 (1994), и \Упд1Ц а11б Натк, выше, и в связи с (ш), см., например, Тгагтескег е! а1. Ιη!. 1. Сатсег (Зирр1.) 7: 51-52 (1992). В предпочтительном варианте биспецифичное антитело связывается с ЮЕ-Ш. и с другой молекулой, экспрессируемой на высоком уровне на злокачественных или опухолевых клетках. В более предпочтительном варианте другой молекулой является рецептор егЬВ2, УЕСЕ, СЭ20 или ЕСЕ-В.
В одном варианте описанные выше модифицированные антитела получают, используя одну или более вариабельных областей или одну или более СЭВ-областей из одного из антител, выбранного из 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 или 6.1.1. В другом варианте модифицированные антитела получают, используя одну или более вариабельных областей или одну или более СОВ-областей, аминокислотная последовательность которых представлена в ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 или 24 или последовательность нуклеиновой кислоты которых представлена в ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 или 23.
Дериватизированные и меченые антитела
Антитело или часть антитела согласно изобретению можно дериватизировать или связать с другой молекулой (например, другим пептидом или белком). В общем, антитела или их часть дериватизируют так, чтобы дериватизация или мечение не оказывали неблагоприятного воздействия на связывание ЮЕГО. Таким образом, подразумевается, что антитела и части антител согласно изобретению включают как интактные, так и модифицированные формы анти-IСЕ-IΒ-антител человека, приведенные в данном описании. Например, антитело или часть антитела согласно изобретению могут быть функционально связаны (посредством химического связывания, генетического слияния, нековалентной ассоциации или другим образом) с одной или более молекулярными единицами, такими как другое антитело (например, биспецифичное антитело или диантитело), детектирующее средство, цитотоксическое средство, фармацевтическое средство и/или белок или пептид, который может опосредовать связывание антитела или части антитела с другой молекулой (такой, как коровая область стрептавидина или полигистидиновая метка).
Один тип дериватизированного антитела получают посредством перекрестного сшивания двух или более антител (одного и того же типа или разных типов, например, чтобы создать биспецифичные антитела). Подходящие перекрестно-сшивающие агенты включают агенты, которые являются гетеробифункциональными, имеющими две отдельные реакционноспособные группы, разделенные подходящим спейсером (например, сложный эфир мета-малеимидобензоил-№гидроксисукцинимида), или гомобифункциональными (например, дисукцинимидилсуберат). Такие линкеры доступны из Р1егсе Сйет1са1 Сοтраπу,
- 26 012079
ВоскГогб, III.
Другим типом дериватизированного антитела является меченое антитело. Пригодные детектирующие средства, которыми может быть дериватизирозано антитело или часть антитела согласно изобретению, включают флуоресцентные соединения, включая флуоресцеин, изотиоцианат флуоресцеина, родамин, 5-диметиламин-1-нафталинсульфонилхлорид, фикоэритрин, люминофоры на основе лантанидов и т.п. Антитело также можно метить ферментами, которые применимы для делеции, такими как пероксидаза хрена, β-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза, глюкозоксидаза и т.п. В том случае, когда антитело метят детектируемым ферментом, его выявляют посредством добавления дополнительных реагентов, которые фермент использует для получения продукта реакции, который можно различить. Например, в том случае, когда присутствует агент пероксидаза хрена, добавление перекиси водорода и диаминобензидина приводит к образованию окрашенного продукта реакции, который можно детектировать. Антитело также можно метить биотином и детектировать с помощью непрямого измерения связывания авидина или стрептавидина. Антитело можно метить магнитным агентом, таким как гадолиний. Антитело также можно метить предварительно определенными полипептидными эпитопами, распознаваемыми вторичным репортером (например, парные последовательности лейциновой молнии, сайты связывания вторичных антител, домены, связывающие металлы, эпитопные метки). В некоторых вариантах метки связаны плечами спейсера различной длины, чтобы уменьшить возможные стерические помехи.
Анти-ЮЕ-Ж-антитело также можно метить радиоактивно меченной аминокислотой. Радиоактивную метку можно использовать как для диагностических, так и терапевтических целей. Например, радиоактивную метку можно использовать для детекции опухолей, экспрессирующих ЮЕ-ΙΚ, с помощью рентгеновского излучения или другими диагностическими способами. Кроме того, радиоактивную метку можно использовать терапевтически в качестве токсина для злокачественных клеток или опухолей. Примеры меток для полипептидов включают без ограничения следующие радиоизотопы или радионуклиды: 3Н, 14С, |5№ 35δ, 90Υ, 99Тс, π1Ιη, 125Ι, 131Ι.
Анти-ЮЕ-Ж-антитело также можно дериватизирвоать химической группой, такой как полиэтиленгликоль (ПЭГ), метильная или этильная группа или углеводная группа. Указанные группы можно применять для улучшения биологических характеристик антитела, например для увеличения времени полужизни в сыворотке или для увеличения связывания в ткани.
Фармацевтические композиции и наборы
Изобретение также относится к фармацевтической композиции для лечения гиперпролиферативного нарушения у млекопитающего, которая содержит терапевтически эффективное количество соединения согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. В одном варианте указанная фармацевтическая композиция предназначена для лечения злокачественной опухоли, такой как рак головного мозга, легкого, сквамозных клеток, мочевого пузыря, желудка, поджелудочной железы, молочной железы, головы, шеи, почек, яичника, простаты, ободочной и прямой кишки, пищевода, женских половых органов или щитовидной железы. В другом варианте указанная фармакологическая композиция имеет отношение к незлокачественным гиперпролиферативным нарушениям без ограничения, таким как рестеноз после ангиопластики и псориаз. В другом варианте изобретение относится к фармацевтическим композициям для лечения млекопитающего, которому требуется активация ЮЕ-ΙΚ, при этом фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество активирующего антитела согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтические композиции, содержащие активирующие антитела, можно использовать для лечения животных, у которых отсутствует достаточное количество ЮЕ-Ι или ЮЕ-ΙΙ, или можно использовать для лечения остеопороза, ломкости или расстройств, при которых млекопитающее секретирует слишком мало активного гормона роста или не способно отвечать на гормон роста.
Анти-ЮЕ-Ж-антитела согласно изобретению можно включать в фармацевтические композиции, подходящие для введения субъекту. Обычно фармацевтическая композиция содержит антитело согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. В используемом в данном описании смысле «фармацевтически приемлемый носитель» включает любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотоничные и замедляющие всасывание агенты и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают один или более из следующих носителей: воду, физиологический раствор, фосфатно-солевой буфер, декстрозу, глицерин, этанол и т.п., а также их комбинации. Во многих случаях будет предпочтительно включать в композицию агенты для изотоничности, например сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит, или хлорид натрия. Используют фармацевтически приемлемые вещества, такие как увлажняющие или небольшие количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие агенты, консерванты или буферы, которые увеличивают срок хранения или эффективность антитела или части антитела.
Композиции согласно данному изобретению могут иметь множество форм. Формы включают, например, жидкие, полутвердые и твердые дозированные формы, такие как жидкие растворы (например, растворы, пригодные для инъекций и инфузий), дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы и суппозитории. Предпочтительная форма зависит от планируемого способа введения и тера
- 27 012079 певтического применения. Обычные предпочтительные композиции имеют форму пригодных для инъекций или инфузий растворов, такие как композиции, подобные композициям, используемым для пассивной иммунизации людей другими антителами. Предпочтительным способом введения является парентеральное (например, внутривенное, подкожное, внутрибрюшинное, внутримышечное). В предпочтительном варианте антитело вводят посредством внутривенной инфузии или инъекции. В другом предпочтительном варианте антитело вводят посредством внутримышечной или подкожной инъекции.
Терапевтические композиции обычно должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может быть приготовлена в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Стерильные инъекционные растворы можно приготовить введением анти-ЮР-ТВ-антитела в требуемом количестве в соответствующий растворитель при необходимости с одним ингредиентом или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, с последующей стерилизацией фильтрованием. Как правило, дисперсии готовят введением активного соединения в стерильный наполнитель, который содержит основную дисперсионную среду и необходимые другие ингредиенты из ингредиентов, перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и сушка вымораживанием, которые дают порошок активного ингредиента плюс любой требуемый дополнительный ингредиент из его предварительно простерилизованного фильтрованием раствора. Подходящую текучесть раствора можно поддерживать, например, посредством использования покрытия, такого как лецитин, посредством поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и благодаря использованию поверхностноактивных веществ.
Длительное всасывание инъекционных композиций можно вызвать посредством включения в композицию агента, который замедляет всасывание, например солей моностеаратов и желатина.
Антитела согласно данному изобретению можно вводить множеством способов, известных в данной области, хотя для многих терапевтических применений предпочтительным путем/способом введения является внутрибрюшинный, подкожный, внутримышечный, внутривенный способ или инфузия. Специалисту в данной области будет понятно, что путь и/или способ введения будет варьировать в зависимости от требуемых результатов. В одном варианте антитела согласно данному изобретению можно вводить в виде однократной дозы или можно вводить в виде многократных доз.
В некоторых вариантах активное соединение можно приготовить с носителем, который будет защищать соединение от быстрого высвобождения, а именно в виде композиции контролируемого высвобождения, включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Можно использовать биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы приготовления таких композиций запатентованы и, как правило, известны специалистам в данной области. См., например, 8и51а1ией аий Соп1го11ей Ве1еа§е Эгид ОеНуегу 8у51еш5. кВ ВоЫикои, ей., Магсе1 Эеккег, Мс., №\ν Уогк, 1978.
В некоторых вариантах анти-ЮР-!В согласно изобретению можно вводить перорально, например, с инертным разбавителем или усваиваемым съедобным носителем. Соединение (и при необходимости другие ингредиенты) также можно заключать в желатиновую капсулу с твердой или мягкой оболочкой, прессовать в таблетки или непосредственно включать в питание субъекта. Для перорального терапевтического введения соединения можно включать вместе с эксципиентами и использовать в форме таблеток для глотания, буккальных таблеток, пилюль, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, пластинок и т. п.. Для того, чтобы соединение согласно данному изобретению ввести другим, отличным от парентерального способом введения, может быть необходимо покрыть соединение или ввести соединение вместе с материалом, предотвращающим его инактивацию.
В композиции также можно включить дополнительные активные соединения. В некоторых вариантах анти-ЮР-[В согласно изобретению готовят в виде совместной композиции и/или вводят совместно с одним или более дополнительными терапевтическими средствами, такими как химиотерапевтическое средство, антинеопластическое средство или противоопухолевое средство.
Например, анти-ЮР-!В-антитело можно приготовить в виде совместной композиции и/или ввести совместно с одним или более дополнительными терапевтическими средствами. Указанные средства включают без ограничения антитела, которые связывают другие мишени (например, антитела, которые связывают один или более факторов роста или цитокинов, их рецепторов на клеточной поверхности или ΙΟΡ-Ι), ΙΟΡ-Ι-связывающие белки, антинеопластические средства, химиотерапевтические средства, противоопухолевые средства, антисмысловые олигонуклеотиды против ΙΟΕ-ΙΒ или ЮР-Ι, пептидные аналоги, которые блокируют активацию ΙΟΡ-ΙΒ, растворимый ЮРЛВ и/или один или более химических агентов, которые ингибируют продукцию или активность ΙΟΡ-Ι, которые известны в данной области, например октреотид.
В случае фармацевтической композиции, содержащей активирующее антитело, анти-ЮΡ-IΒ-антитело можно приготовить в виде композиции с фактором, который увеличивает пролиферацию клеток или предотвращает апоптоз. Такие факторы включают факторы роста, такие как ΙΟΡ-Ι, и/или аналоги ΙΟΡ-Ι,
- 28 012079 которые активируют ЮР-ΙΒ. При такой комбинаторной терапии могут требоваться более низкие дозы анти-ЮР-IΒ-антитела, а также совместно вводимых агентов, позволяя таким образом избежать возможной токсичности или осложнений, связанных с различными случаями монотерапии. В одном варианте вводят антитело и один или более дополнительных терапевтических средств.
Фармацевтические композиции согласно изобретению могут включать «терапевтически эффективное количество» или «профилактически эффективное количество» антитела или части антитела согласно изобретению. «Терапевтически эффективное количество» относится к количеству, эффективному при используемых дозах и в течение необходимых периодов времени для достижения требуемого терапевтического результата.
Терапевтически эффективное количество антитела или части антитела может варьировать в соответствии с такими факторами, как состояние заболевания, возраст, пол и масса индивидуума и способность антитела или части антитела вызывать требуемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективным количеством также является количество, при котором токсичные или вредные воздействия антитела или части антитела компенсируются терапевтически полезными воздействиями. «Профилактически эффективное количество» относится к количеству, эффективному при используемых дозах и в течение необходимых периодов времени для достижения требуемого профилактического результата. Как правило, в связи с тем, что профилактическую дозу используют у субъектов до заболевания или на более ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество будет меньше, чем терапевтически эффективное количество.
Режим дозирования можно скорректировать, чтобы обеспечить оптимальное значение требуемого ответа (например, терапевтического или профилактического ответа). Например, можно вводить однократный болюс, можно вводить несколько отдельных доз в течение периода времени или дозу можно пропорционально уменьшить или увеличить, как того требует терапевтическая ситуация. Фармацевтическую композицию, содержащую антитело или содержащую комбинацию терапевтических средств, включающую антитело и одно или более дополнительных терапевтических средств, можно приготовить в виде однократной или многократных доз. Особенно предпочтительным является приготовление парентеральных композиций в дозированной лекарственной форме для простоты введения и равномерности дозирования. В используемом в данном описании смысле дозированная лекарственная форма относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве однократных доз для видов млекопитающих, которых необходимо лечить; при этом каждая единица содержит предварительно определенное количество активного соединения, рассчитанное для получения требуемого терапевтического действия, в ассоциации с требуемым фармацевтическим носителем. Технические характеристики дозированных форм согласно изобретению продиктованы и непосредственно зависят от: (а) уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического или профилактического действия, которое необходимо достичь, и (Ь) ограничений, свойственных области приготовления такого активного соединения для лечения чувствительности у индизидуумов. Особенно пригодной композицией является 5 мг/мл антиЮР-IΒ-антитела в буфере, содержащем 20 мМ цитрат натрия, рН 5,5, 140 мМ №1С1 и 0,2 мг/мл полисорбата 80.
Примерными неограничивающими пределами терапевтически или профилактически эффективного количества антитела или части антитела согласно изобретению являются 0,1-100 мг/кг, более предпочтительно 0,5-50 мг/кг, более предпочтительно 1-20 мг/кг и еще более предпочтительно 1-10 мг/кг. Следует отметить, что значения доз могут варьировать в зависимости от типа и тяжести состояния, которое необходимо облегчить. Кроме того, понятно, что для любого конкретного субъекта конкретный режим дозирования следует корректировать в течение времени в соответствии с индивидуальной потребностью и профессиональным мнением человека, осуществляющего введение или контролирующего введение композиций, и что указанные в данном описании пределы доз являются только примерными и не предназначены для ограничения пределов или практического применения заявленной композиции. В одном варианте терапевтически или профилактически эффективное количество антитела или его антигенсвязывающей части вводят вместе с одним или более терапевтическими средствами.
В другом аспекте изобретение относится к введению анти-ЮР-IΒ-антитела для лечения рака в дозе менее 300 мг в месяц.
Другой аспект данного изобретения относится к наборам, содержащим анти-ЮР-IΒ-антитела и фармацевтические композиции, содержащие указанные антитела. Набор может включать кроме антитела или фармацевтической композиции диагностические или терапевтические средства. Набор также может содержать инструкции по применению в диагностическом или терапевтическом способе. В предпочтительном варианте набор содержит антитело или его фармацевтическую композицию и диагностическое средство, которое можно использовать в описанном далее способе. В другом предпочтительном варианте набор содержит антитело или его фармацевтическую композицию и одно или более терапевтических средств, таких как дополнительное антинеопластическое средство, противоопухолевое средство или химиотерапевтическое средство, которое можно использовать в описанном далее способе.
Данное изобретение также относится к фармацевтическим композициям для ингибирования аномального роста клеток у млекопитающего, которые содержат некоторое количество соединения согласно
- 29 012079 изобретению в комбинации с некоторым количеством химиотерапевтического средства, причем количества соединения, соли, сольвата или пролекарства и химиотерапевтического средства вместе эффективны в ингибировании аномального роста клеток. В настоящее время в данной области известны многие химиотерапевтические средства. В одном варианте химиотерапевтические средства выбраны из группы, состоящей из ингибиторов митоза, алкилирующих агентов, антиметаболитов, интеркалирующих антибиотиков, ингибиторов фактора роста, ингибиторов клеточного цикла, ферментов, ингибиторов топоизомераз, средств, понижающих жизнеспособность, модификаторов биологического ответа, антигормонов, например антиандрогенов, и средств, направленных против ангиогенеза.
Средства против ангиогенеза, такие как ингибиторы ММР-2 (металлопротеиназа матрикса 2), ингибиторы ММР-9 (металлопротеиназа матрикса 9) и ингибиторы ЦОГ-ΙΙ (циклооксигеназа ΙΙ), можно использовать вместе с соединением согласно изобретению. Примеры пригодных ингибиторов ЦОГ-ΙΙ включают ΟΈΕΕΒΚΕΧ™ (алекоксиб), вальдекоксиб и рофекоксиб. Примеры пригодных ингибиторов металлопротеиназ матрикса описаны в XVО 96/33172 (опубликована 24 октября 1996), XVО 96/27583 (опубликована 7 марта 1996), европейской патентной заявке № 97304971.1 (подана 8 июля 1997), европейской патентной заявке № 99308617.2 (подана 29 октября 1999), ΧνΟ 98/07697 (опубликована 26 февраля 1998), νΟ 98/03516 (опубликована 29 января 1998), νΟ 98/34918 (опубликована 13 августа 1998), νΟ 98/34915 (опубликована 13 августа 1998), νΟ 98/33768 (опубликована 6 августа 1998), νΟ 98/30566 (опубликована 16 июля 1998), европейской патентной публикации 606046 (опубликована 13 июля 1994), европейской патентной публикации 931788 (опубликована 28 июля 1999), νΟ 90/05719 (опубликована 31 мая 1990), νΟ 99/52910 (опубликована 21 октября 1999), νΟ 99/52889 (опубликована 21 октября 1999), νΟ 99/29667 (опубликована 17 июня 1999), международной заявке РСТ № РСТЛВ98/01113 (поданной 21 июля 1998), европейской патентной заявке № 99302232.1 (поданной 25 марта 1999), патентной заявке Великобритании № 9912961.1 (поданной 3 июня 1999), предварительной патентной заявке США № 60/148464 (поданной 12 августа 1999), патенте США 5863949 (выданном 26 января 1999), патенте США 5861510 (выданном 19 января 1999) и европейской патентной публикации 780386 (опубликованной 25 июня 1997), которые все включены в данное описание в виде ссылки в полном объеме. Предпочтительными ингибиторами ММР являются ингибиторы, которые не вызывают артралгии. Более предпочтительными являются ингибиторы, которые селективно ингибируют ММР-2 и/или ММР-9 по отношению к другим металлопротеиназам матрикса (т.е. ММР-1, ММР-3, ММР-4, ММР-5, ММР-6, ММР-7, ММР-8, ММР-10, ММР-11, ММР-12 и ММР-13).
Некоторыми конкретными примерами ингибиторов ММР, пригодных в данном изобретении, являются АС-3340. ΚΟ 32-3555, Κ8 13-0830 и соединения, перечисленные в следующем списке:
3-[[4-(4-фторфенокси)бензолсульфонил]-(1-гидроксикарбамоилциклопентил)амино]пропионовая кислота;
гидроксиамид 3-экзо-3-[4-(4-фторфенокси)бензолсульфониламино]-8-окса-бицикло[3,2,1]октан-3-карбоновой кислоты;
гидроксиамид (2Κ,3Κ)-1 -[4-(2-хлор-4-фторбензилокси)бензолсульфонил]-3 -гидрокси-3 -метилпиперидин-2-карбоновой кислоты;
гидроксиамид 4-[4-(4-фторфенокси)бензолсульфониламино]тетрагидропиран-4-карбоновой кислоты; 3-[[4-(4-фторфенокси)бензолсульфонил]-(1-гидроксикарбамоилциклобутил)амино]пропионовая кислота;
гидроксиамид 4-[4-(4-хлорфенокси)бензолсульфониламино]тетрагидропиран-4-карбоновой кислоты; гидроксиамид (Κ)-3-[4(4-хлорфенокси)бензолсульфониламино]тетрагидропиран-3-карбоновой кислоты;
гидроксиамид (2Κ,3Κ)- 1-[4-(4-фтор-2-метилбензилокси)бензолсульфонил]-3 -гидрокси-3 -метилпиперидин-2-карбоновой кислоты;
3- [[4-(4-фторфенокси)бензолсульфонил]-(1 -гидроксикарбамоил-1 -метилэтил)амино] пропионовая кислота;
3-[[4-(4-фторфенокси)бензолсульфонил]-(4-гидроксикарбамоилтетрагидропиран-4-ил)амино]пропионовая кислота;
гидроксиамид 3-экзо-3-[4-(4-хлорфенокси)бензолсульфониламино]-8-оксаицикло[3,2,1]октан-3-карбоновой кислоты;
гидроксиамид 3-эндо-3-[4-(4-фторфенокси)бензолсульфониламино]-8-оксаицикло[3,2,1]октан-3-карбоновой кислоты; и гидроксиамид (Κ)-3-[4-(4-фторфенокси)бензолсульфониламино]тетрагидрофуран-3-карбоновой кислоты; и фармацевтически приемлемые соли и сольваты указанных соединений.
Соединение согласно изобретению также можно использовать вместе с ингибиторами сигнальной трансдукции, такими как агенты, которые могут ингибировать ответы ЕСЕ-Κ (рецептор эпидермального фактора роста), такие как ЕСЕ-Κ-антитела, ЕСЕ-антитела и молекулы, которые являются ингибиторами ЕСЕ-Κ; ингибиторами УЕСЕ (васкулярный эндотелиальный фактор роста), такими как рецепторы УЕСЕ и молекулы, которые могут ингибировать; и ингибиторами рецептора егЬВ2, такими как органические
- 30 012079 молекулы или антитела, которые связываются с рецептором егЬВ2, например НЕВСЕРТЮ™ (СеветесЬ йю.). Ингибиторы ЕСР-В описаны, например, в АО 95/19970 (опубликованной 27 июля 1995), АО 98/14451 (опубликованной 9 апреля 1998), АО 98/02434 (опубликованной 22 января 1998) и патенте США 5747498 (выданном 5 мая 1998), и такие вещества можно использовать в данном изобретении, как описано в данной заявке. ЕСРВ-ингибирующие агенты включают, но не ограничены указанным, моноклональные антитела С225 и анти-ЕСРВ 22 мАт ^тС^е 8ук!етк ШсогрогаВб), АВХ-ЕСР (АЬдешх/Се11 Сеηекук), ЕМЭ-7200 (Мегск КдаА), ЕМЭ-5590 (Мегск КдаА), ΜΌΧ-447/Η-477 (Мебагех Шс. и Мегск КдаА) и соединения ΖΌ-1834, ΖΌ-1838 и ΖΌ-1839 (Ак^е^са), РЮ-166 (Nονа^ί^к), РЮ-166/ССР-75166 (Nονа^ί^к), РТК 787 (Nονа^ί^к), СР 701 (Серйа1оп), лефлюномид (Рйагтас1а/8идец), 0-1033 (Аатег ЬатЬей Рагке Пас1к), СЧ-1033/РО 183805 (Аатег ЬатЬей Рагке Пас1к), СЬ-387785 (АуеШ-Ауегк!), ВВВ-1611 (Воейттдет ΜаввНе^т СтЬН/ВосНе), наамидин А (Впк!о1 Муегк 8дшЬЬ), ВС-3940-ΙΙ (Рйаттааа), ΕΙΕΧ1382 (Воейгшдег Iвβе1Не^т). ОЬХ-103 (Мегск ааб Со.), УВСТС-310 (УейесН ВекеагсН), токсин, слитый с ЕСР (8егадеа Шс.), ЭАВ-389 (8е^аβев/^^1βавб). ΖΜ-252808 (Еврепа! Саасег ВекеагсН Рцп6), ВС-50864 (Ю8ЕВМ), ЬРМ-А12 (Рагкег НидНек Саисег Сейег), АШ-Р97 (Рагкег НидНек Саисег Сейег), СА-282974 (С1ахо), КТ-8391 (Куо^а Накко) и вакцина ЕСР-В (ΥοιΉ МебкакСейто бе Iттивο1οβ^а Мо1еси1аг (ОМ)). В данном изобретении можно использовать указанные и другие ЕСР-В-ингибируюшие агенты.
Ингибиторы УЕСР, например δυ-5416 и δυ-6668 (8иβеη Шс.), 8Н-268 (8сЬег1ид) и ΝΧ-1838 (№Хк!ат) также можно комбинировать с соединением согласно данному изобретению. Ингибиторы УЕСР описаны, например, в АО 99/24440 (опубликованной 20 мая 1999), международной РСТ-заявке РСТЛВ99/00797 (поданной 3 мая 1999), АО 95/21613 (опубликованной 17 августа 1995), АО 99/61422 (опубликованной 2 декабря 1999), патенте США 5834504 (выданном 10 ноября 1998), АО 98/50356 (опубликованной 12 ноября 1998), патенте США 5883113 (выданном 16 марта 1999), патенте США 5886020 (выданном 23 марта 1999), патенте США 5792783 (выданном 11 августа 1998), АО 99/10349 (опубликованной 4 марта 1999), АО 97/32856 (опубликованной 12 сентября 1997), АО 97/22596 (опубликованной 26 июня 1997), АО 98/54093 (опубликованной 3 декабря 1998), АО 98/02438 (опубликованной 22 января 1998), АО 99/16755 (опубликованной 8 апреля 1999) и АО 98/02437 (опубликованной 22 января 1998), и все указанные публикации включены в данное описание в виде ссылки в полном объеме. Другими примерами некоторых конкретных ингибиторов УЕСР, применимых в данном изобретении, являются ^862 (СуЗгаи Шс.); моноклональное анти-УЕСР-антитело СеиейесН, Шс.; и ангиозим, синтетический рибозим из В|Ьохуте аиб СЫтоп. Указанные и другие ингибиторы УЕСР можно использовать в данном изобретении, как описано в данной заявке.
Кроме того, с соединением согласно данному изобретению можно комбинировать ингибиторы рецептора егЬВ2, такие как СА-282974 (С1ахо Ае11соте р1с) и моноклональные антитела АВ-209 (Агоиех РНагтасев11са1к Шс.) и 2В-1 (СЫгоп), например такие, которые указаны в АО 98/02434 (опубликованной 22 января 1998), АО 99/35146 (опубликованной 15 июля 1999), АО 99/35132 (опубликованной 15 июля 1999), АО 98/02437 (опубликованной 22 января 1998), АО 97/13760 (опубликованной 17 апреля 1997), АО 95/19970 (опубликованной 27 июля 1995), патенте США 5587458 (выданном 24 декабря 1996), и патенте США 5877305 (выданном 2 марта 1999), и все указанные публикации включены в данное описание в виде ссылки в полном объеме. Ингибиторы рецептора егЬВ2, применимые в данном изобретении, также описаны в предварительной патентной заявке США № 60/117341, поданной 27 января 1999, предварительной патентной заявке США № 60/117346, поданной 27 января 1999, которые включены в данное описание в полном объеме в виде ссылки. Согласно данному изобретению соединения ингибиторов рецептора егЬВ2 и вещества, описанные в вышеуказанных заявках РСТ, патентах США и предварительных патентных заявках США, а также другие соединения и вещества, которые ингибируют рецептор егЬВ2, можно использовать с соединением согласно данному изобретению.
Агенты, понижающие жизнеспособность, включают анти-IСР-IΒ-антитела и антиинтегриновые агенты, такие как антиинтегриновые антитела.
Подходящие диагностические способы
Анти-ЮРЛВ-антитела можно использовать для выявления ЮРЛВ в биологическом образце ίη νί!το или ίη νίνο. Анти-IСР-IΒ-антитела можно использовать в обычном иммуноанализе, включая без ограничения ЕЫ8А, РИА, РАС8, иммуногистохимию тканей, Вестерн-блот или иммунопреципитацию. АнтиЮРЛВ-антитела согласно изобретению можно использовать для выявления ЮРЛВ человека. В другом варианте анти-ЮРЛВ-антитела можно использовать для выявления ЮРЛВ приматов Старого Света, таких как макаки-крабоеды и макаки-резус, шимпанзе и человекообразные обезьяны. Изобретение относится к способу выявления анти-ЮРЛВ в биологическом образце, включающему осуществление контакта биологического образца с анти-ЮРЛВ-антителом согласно изобретению и выявление связанного антитела, связанного с анти-ЮРЛВ для выявления ЮР-]В в биологическом образце. В одном варианте анти-ЮРЛВ-антитело непосредственно метят детектируемой меткой. В другом варианте анти-ЮРЛВантитело (первое антитело) не метят, а метят второе антитело или другую молекулу, которая может связывать анти-ЮРЛВ-антитело. Как хорошо известно специалисту в данной области, в качестве второго антитела выбирают антитело, которое способно специфично связывать конкретный вид и класс первого антитела. Например, если аити-ЮРЛВ-антитело является кС человека, то вторичным антителом может
- 31 012079 быть антитело против Ι§0 человека. Другие молекулы, которые могут связываться с антителами, включают без ограничения белок А и белок С, и оба указанных белка коммерчески доступны, например, из Р1егсе Сйешюа1 Со.
Подходящие метки для антитела или вторичного антитела описаны выше и включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества, магнитные агенты и радиоактивные вещества. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных веществ включают умбеллиферон, флуоресцеин, изотиоцианат флуоресцеина, родамин, дихлортриазиниламин-флуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; примером люминесцентного вещества является люминол; примером магнитного агента является гадолиний; и примеры подходящих радиоактивных материалов включают 125Ι, 131Ι, 35§ или 3Н.
В альтернативном варианте можно проводить анализ ЮРПВ в биологическом образце посредством конкурентного иммуноанализа, используя стандарты ЮР-IВ, меченные детектируемым веществом, и немеченое анти-ЮР-IВ-антитело. В данном анализе смешивают биологический образец, меченые стандарты ЮРПВ и анти-ЮР-IВ-антитело и определяют количество меченого стандарта ЮР-IВ, связанного с немеченым антителом. Количество ЮРПВ в биологическом образце обратно пропорционально количеству меченого стандарта ЮР-IВ, связанного с анти-ЮР-IВ-антителом.
Описанный выше иммуноанализ можно использовать для ряда целей. В одном варианте анти-ЮРIВ-антитела можно использовать для выявления ЮР-ТВ в клетках в культуре клеток. В предпочтительном варианте анти-ЮР-IВ-антитела можно использовать для определения уровня фосфорилирования тирозина, аутофосфорилирования тирозина ЮРПВ и/или количества ЮРПВ на поверхности клеток после обработки клеток различными соединениями. Указанный способ можно использовать для тестирования соединений, которые можно применять для того, чтобы активировать или ингибировать ЮР4В. В указанном способе один образец клеток обрабатывают тестируемым соединением в течение некоторого периода времени, тогда как другой образец оставляют необработанным. Если необходимо измерить аутофосфорилирование тирозина, клетки лизируют и фосфорилирование тирозина ЮР4В измеряют с использованием описанного выше иммуноанализа или как описано в примере 3, где используют ЕЫ8А. Если необходимо измерить общий уровень ЮР4В, клетки лизируют и общий уровень ЮР4В измеряют, используя один из иммуноанализов, описанных выше.
Предпочтительным иммуноанализом для определения фосфорилирования тирозина ЮР4В или для измерения общих уровней ЮР4В является ЕЫ8Л или Вестерн-блот. Если необходимо измерить только уровень ЮР4В на поверхности клеток, клетки не лизируют и уровни ЮР4В на поверхности клеток измеряют, используя один из иммуноанализов, описанных выше.
Предпочтительный иммуноанализ для определения уровней ЮР4В на поверхности клеток включает стадии мечения белков клеточной поверхности детектируемой меткой, такой как биотин или 125Ι, иммунопреципитации ЮР4В с помощью анти-ЮР-IВ-антитела и затем детекции меченого ЮР4В. Другим предпочтительным иммуноанализом для определения локализации ЮР4В, например уровней на поверхности клеток, является анализ с использованием иммуногистохимии. Такие способы, как ЕЬРЗА, РИА, Вестерн-блот, иммуногистохимия, мечение на поверхности клеток интегральных мембранных белков и иммунопреципитация, хорошо известны в данной области. См., например, Наг1о\у аий Ьаие, выше. Кроме того, иммуноанализ можно проводить в большем масштабе для высокопроизводительного скрининга для того, чтобы тестировать большое количество соединений либо в отношении активации, либо ингибирования ЮР-ТВ.
Анти-ЮР-IВ-антитела согласно изобретению также можно использовать для определения уровней ЮР4В в ткани или в клетках, полученных из ткани. В предпочтительном варианте тканью является пораженная ткань. В более предпочтительном варианте тканью является опухоль или биопсия опухоли. В предпочтительном варианте способа ткань или биопсию ткани извлекают из организма пациента. Затем ткань или биопсию используют в иммуноанализе, чтобы определить, например, уровни ЮР-IВ, уровни ЮР4В на поверхности клеток, уровни фосфорилирования тирозина ЮР4В или локализацию ЮР4В способами, которые обсуждались выше. Способ можно использовать для определения того, экспрессирует ли опухоль ЮР4В на высоком уровне.
Описанный выше диагностический способ можно использовать для определения того, экспрессирует ли опухоль высокие уровни ЮР-IВ, которые свидетельствуют о том, что опухоль будет хорошо отвечать на лечение анти-ЮР-IВ-антителом. Диагностический способ также можно использовать для определения того, является ли опухоль потенциально канцерогенной в том случае, если она экспрессирует высокие уровни ЮР-IВ, или доброкачественной в том случае, если она экспрессирует низкие уровни ЮРIВ. Кроме того, диагностический способ также можно использовать для определения того, приводит ли лечение анти-ЮР-IВ-антителом (см. ниже) к тому, что опухоль экспрессирует более низкие уровни ЮРIВ и/или экспрессирует более низкие уровни аутофосфорилирования тирозина и, следовательно, антитело можно использовать для определения того, будет ли лечение успешным. В общем, способ определения того, снижает ли анти-ЮР-IВ-антитело фосфорилирование тирозина, включает стадии измерения
- 32 012079 уровня фосфорилирования тирозина в представляющей интерес клетке или ткани, инкубации клетки или ткани с анти-ЮР-ГВ-антителом или его антигенсвязывающей частью, затем повторное измерение уровня фосфорилирования тирозина в клетке или ткани. Фосфорилирование тирозина ЮР-ГВ или другого белка(ков) можно измерить. Диагностический способ также можно использовать для определения того, что ткань или клетка не экспрессирует достаточно высокие уровни ЮР-ГВ или достаточно высокие уровни активированного ЮР-ГВ, что может быть причиной карликовости, остеопороза или диабета у индивидуума. Диагноз, свидетельствующий о том, что уровни ЮР-ГВ или активного ЮР-ГВ слишком малы, можно использовать для лечения активирующими анти-ЮР-ГВ-антителами, ЮР-Г или другими терапевтическими средствами для повышения уровней или активности ЮР-ГВ.
Антитела согласно данному изобретению также можно использовать при локализации ш νί\Ό тканей и органов, которые экспрессируют ЮР-ГВ. В предпочтительном варианте анти-ЮР-ГВ-антитела можно использовать для локализации опухолей, экспрессирующих ЮР-ГВ. Преимущество анти-ЮР-ГВантител согласно данному изобретению состоит в том, что они не будут вызывать иммунный ответ при введении. Способ включает стадию введения анти-ЮР-ГВ-антитела или его фармацевтической композиции пациенту, нуждающемуся в таком диагностическом тестировании, и стадию, на которой пациента подвергают анализу для визуального определения локализации тканей, экспрессирующих ЮР-ГВ. Визуализационный анализ хорошо известен в области медицины и включает без ограничения рентгеновский анализ, визуализацию на основе магнитного резонанса (МВГ) или компьютерную томографию (СЕ). В другом варианте способа пациента не подвергают визуализационному анализу, а получают от пациента биопсию, чтобы определить, экспрессирует ли представляющая интерес ткань ЮР-ГВ. В предпочтительном варианте анти-ЮР-ГВ-антитела можно метить детектируемым агентом, который можно визуализировать в организме пациента. Например, антитело можно метить контрастным веществом, таким как барий, который можно использовать для рентгеновского анализа, или магнитным контрастным веществом, таким как хелат гадолиния, который можно использовать для МВГ или СЕ. Другие агенты для мечения включают без ограничения радиоизотопы, такие как 99Тс. В другом варианте анти-ЮР-ГВ-антитело будет немеченым и его будут визуализировать посредством введения второго антитела или другой детектируемой молекулы, которая может связывать анти-ЮР-ГВ-антитело.
Подходящие терапевтические способы
В другом варианте изобретение относится к способу ингибирования активности ЮР-ГВ посредством введения анти-ЮР-ГВ-антитела нуждающемуся в этом пациенту. Терапевтически можно использовать любой из описанных в данной заявке типов антител. В предпочтительном варианте анти-ЮР-ГВ-антитело является антителом человека, химерным или гуманизированным антителом. В другом предпочтительном варианте ЮР-ГВ является рецептором человека, а пациентом является пациент-человек. Альтернативно пациентом может быть млекопитающее, которое экспрессирует ЮР-ГВ, с которым перекрестно реагирует анти-ЮР-ГВ-антитело. Антитело можно вводить млекопитающему, отличному от человека, экспрессирующему ЮР-ГВ, с которым антитело перекрестно реагирует (т.е. примату или макаке-крабоеду или макаке-резус) для ветеринарных целей или в качестве животной модели заболевания человека. Такие модели на животных могут быть пригодны для оценки терапевтической эффективности антител согласно данному изобретению.
В используемом в данном описании смысле подразумевается, что термин «расстройство, при котором активность ЮР-ГВ вредна» включает заболевания и другие расстройства, при которых показано, что наличие высоких уровней ЮР-ГВ у субъекта, страдающего от расстройства, является или предположительно является либо ответственным за патофизиологию расстройства, либо фактором, который участвует в обострении расстройства. Таким образом, заболеванием, при котором вредны высокие уровни активности ЮР-ГВ, является заболевание, при котором предполагается, что ингибирование активности ЮР-ГВ уменьшит симптомы и/или прогрессирование расстройства. Признаками таких расстройств могут быть, например, увеличение уровней ЮР-ГВ на поверхности клеток или повышенное аутофосфорилирование тирозина ЮР-ГВ в пораженных клетках или тканях субъекта, страдающего расстройством. Повышение уровней ЮР-ГВ можно, например, выявить с использованием анти-ЮР-ГВ-антитела, как описано выше.
В предпочтительном варианте анти-ЮР-ГВ-антитело можно вводить пациенту, у которого имеется опухоль, экспрессирующая ЮР-ГВ. Опухоль может представлять собой солидную опухоль или может быть несолидной опухолью, такой как лимфома. В более предпочтительном варианте анти-ЮР-ГВ-антитело можно вводить пациенту, у которого имеется опухоль, экспрессирующая ЮР-ГВ, которая является злокачественной. В еще более предпочтительном варианте анти-ЮР-ГВ-антитело вводят пациенту, у которого имеется опухоль легкого, молочной железы, простаты или ободочной кишки. В высокопредпочтительном варианте способ приводит к тому, что опухоль не увеличивается по массе или объему или уменьшается по массе или объему. В другом варианте способ вызывает интернализацию ЮР-ГВ на опухоли. В предпочтительном варианте антитело выбрано из 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 или 6.1.1 или содержит их тяжелую цепь, легкую цепь или антигенсвязывающую область.
В другом предпочтительном варианте анти-ЮР-ГВ-антитело можно вводить пациенту, у которого экспрессируются несоответствующие высокие уровни ЮР-1. В данной области известно, что экспрессия
- 33 012079
ЮР-Ι на высоком уровне может приводить к ряду распространенных злокачественных опухолей. В более предпочтительном варианте анти-ЮРЧЯ-антитело вводят пациенту с раком простаты, глиомой или фибросаркомой. В еще более предпочтительном варианте способ приводит к остановке аномальной пролиферации злокачественной опухоли или приводит к тому, что опухоль не увеличивается по массе или объему или уменьшается по массе или объему.
В одном варианте указанный способ относится к лечению рака, такого как рак головного мозга, сквамозных клеток, мочевого пузыря, желудка, поджелудочной железы, молочной железы, головы, шеи, пищевода, простаты, ободочной и прямой кишки, легкого, почек, яичника, женских половых органов или щитовидной железы. Пациенты, которых можно лечить соединениями согласно изобретению в соответствии со способами согласно данному изобретению, включают, например, пациентов, у которых диагностировали наличие рака легкого, рака кости, рака поджелудочной железы, рака кожи, рака головы и шеи, кожной или внутриглазной меланомы, рака матки, рака яичника, рака прямой кишки, рака анальной области, рака желудка, рака ободочной кишки, рака молочной железы, опухолей женских половых органов (например, маточных сарком, карциномы фаллопиевых труб, карциномы эндометрия, карциномы шейки матки, карциномы влагалища или карциномы вульвы), болезни Ходжкина, рака пищевода, рака тонкого кишечника, рака эндокринной системы (например, рака щитовидной, паращитовидной или надпочечниковой желез), сарком мягких тканей, рака мочеиспускательного канала, рака пениса, рака простаты, хронического или острого лейкоза, солидных опухолей в детском возрасте, лимфоцитарных лимфом, рака мочевого пузыря, рака почки или мочеточника (например, карциномы клеток почек, карциномы почечной лоханки) или неоплазмы центральной нервной системы (например, первичной лимфомы ЦНС, опухоли спинного мозга, глиом ствола головного мозга или аденом гипофиза).
Антитело можно вводить однократно, но более предпочтительно его вводят многократно. Антитело можно вводить от 3 раз в сутки до 1 раза каждые 6 месяцев. Схема введения может быть такой, как 3 раза в сутки, 2 раза в сутки, 1 раз в сутки, 1 раз каждые 2 дня, 1 раз каждые 3 дня, 1 раз еженедельно, 1 раз каждые 2 недели, 1 раз ежемесячно, 1 раз каждые 2 месяца, 1 раз каждые 3 месяца и 1 раз каждые 6 месяцев. Антитело можно вводить посредством перорального, мукозального, буккального, интраназального, ингаляционного, внутривенного, подкожного, внутримышечного, парентерального, внутриопухолевого или местного пути. Антитело можно вводить в место, удаленное от места опухоли. Антитело также можно вводить непрерывно через мини-насос. Антитело можно вводить однократно, по меньшей мере двукратно или по меньшей мере в течение периода времени вплоть до того, как состояние подвергают лечению, облегчают или излечивают. Как правило, антитело будет вводиться до тех пор, пока будет присутствовать опухоль, при условии, что антитело вызывает остановку роста опухоли или злокачественной опухоли или уменьшает ее массу или объем. Как правило, антитело будет вводиться в виде части фармацевтической композиции, которая описана выше. Доза антитела, как правило, будет в пределах 0,1-100 мг/кг, более предпочтительно 0,5-50 мг/кг, более предпочтительно 1-20 мг/кг и еще более предпочтительно 110 мг/кг. Концентрацию антитела в сыворотке можно измерить любым способом, известным в данной области. См., например, пример 17 далее. Антитело также можно вводить профилактически, чтобы предотвратить возникновение рака или опухоли. Особенно полезным это может быть для пациентов, которые имеют «высокий уровень ЮР-Ι в норме», так как показано, что для таких пациентов существует более высокая степень риска развития обычно встречающихся раков. См. Яокеи е! а1., выше.
В другом аспекте анти-ЮРЧЯ-антитело можно вводить совместно с другими терапевтическими средствами, такими как антинеопластические лекарственные средства или молекулы, пациенту с гиперпролиферативным расстройством, таким как злокачественная опухоль или опухоль. В одном аспекте изобретение относится к способу лечения гиперпролиферативного расстройства у млекопитающего, включающему введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества соединения согласно изобретению в комбинации с противоопухолевым агентом, выбранным из группы, состоящей из ингибиторов митоза, алкилирующих агентов, антиметаболитов, интеркалирующих агентов, ингибиторов фактора роста, ингибиторов клеточного цикла, ферментов, ингибиторов топоизомераз, модификаторов биологического ответа, антигормонов, ингибиторов киназ, ингибиторов металлопротеаз матрикса, генетических терапевтических средств и антиандрогенов, но не ограниченных указанным. В более предпочтительном варианте антитело можно вводить с антинеопластическим средством, таким как адриамицин или таксол. В другом предпочтительном варианте антитело или комбинацию терапевтических средств назначают наряду с лучевой терапией, химиотерапией, фотодинамической терапией, хирургией или другой иммунотерапией. Еще в одном предпочтительном варианте антитело будет вводиться с другим антителом. Например, анти-ЮРЧЯ-антитело можно вводить с антителом или другим агентом, о котором известно, что он ингибирует пролиферацию клеток опухоли или злокачественной опухоли, например антителом или агентом, который ингибирует рецептор ег№2, БСР-Я, СЭ20 или УБСР.
Совместное введение антитела и дополнительного терапевтического средства (комбинаторная терапия) охватывает введение фармацевтической композиции, содержащей анти-ЮР-ГЯ-антитело и дополнительное терапевтическое средство, и введение двух или большего количества отдельных фармацевтических композиций, из которых одна содержит анти-IСΡ-IЯ-антитело, а другая(ие) содержит дополнительное терапевтическое средство(ва). Кроме того, хотя совместное введение или комбинаторная терапия,
- 34 012079 как правило, означает, что антитело и дополнительные терапевтические средства вводят одновременно друг с другом, она также включает в себя случаи, при которых антитело и дополнительные терапевтические средства вводят в разное время. Например, антитело можно вводить 1 раз каждые 3 дня, тогда как дополнительное терапевтическое средство вводят 1 раз ежедневно. Альтернативно, антитело можно вводить до или после лечения расстройства дополнительным терапевтическим средством. Подобным образом, введение анти-1СР-1К-антитела можно осуществлять до или после другой терапии, такой как лучевая терапия, химиотерапия, фотодинамическая терапия, хирургия или другая иммунотерапия.
Антитело и одно или более дополнительных терапевтических средств (комбинаторная терапия) можно вводить однократно, двукратно или, по меньшей мере, в течение периода времени вплоть до того, как состояние подвергают лечению, облегчают или излечивают. Предпочтительно комбинаторную терапию проводят многократно. Комбинаторную терапию можно назначать от 3 раз в сутки до 1 раза каждые 6 месяцев. Схема введения может быть такой, как 3 раза в сутки, 2 раза в сутки, 1 раз в сутки, 1 раз каждые 2 дня, 1 раз каждые 3 дня, 1 раз еженедельно, 1 раз каждые 2 недели, 1 раз ежемесячно, 1 раз каждые 2 месяца, 1 раз каждые 3 месяца и 1 раз каждые 6 месяцев, или можно вводить непрерывно через мининасос. Комбинаторную терапию можно проводить посредством перорального, мукозального, буккального, интраназального, ингаляционного, внутривенного, подкожного, внутримышечного, парентерального, внутриопухолевого или местного пути. Комбинаторную терапию можно назначать в место, удаленное от места опухоли. Как правило, комбинаторная терапия будет назначаться до тех пор, пока будет присутствовать опухоль, при условии, что антитело вызывает остановку роста опухоли или злокачественной опухоли или уменьшает ее массу или объем.
Еще в одном варианте анти-1СР-1К-антитело метят радиоактивной меткой, иммунотоксином или токсином, или антитело является слитым белком, содержащим токсичный пептид. Анти-1СР-1К-антитело или слитый белок анти-1СР-1К-антитела направляет радиоактивную метку, иммунотоксин, токсин или токсичный пептид к опухолевой или злокачественной клетке, экспрессирующей 1СР-1К. В предпочтительном варианте радиоактивная метка, иммунотоксин, токсин или токсичный пептид интернализуется после того, как анти-1СР-1К-антитело связывается с 1СР-1К на поверхности опухолевой или злокачественной клетки.
В другом аспекте анти-1СР-1К-антитело можно использовать терапевтически, чтобы индуцировать апоптоз специфичных клеток у пациента, который в этом нуждается. Во многих случаях клетками, представляющими собой мишени для апоптоза, являются канцерогенные или опухолевые клетки. Таким образом, в предпочтительном варианте изобретение относится к способу индуцирования апоптоза посредством введения терапевтически эффективного количества анти-1СР-1К-антитела нуждающемуся в этом пациенту. В предпочтительном варианте антитело выбрано из 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 или 6.1.1 или содержит их тяжелую цепь, легкую цепь или антигенсвязывающую область.
В другом аспекте анти-1СР-1К-антитело можно использовать для лечения неканцерогенных состояний, при которых высокие уровни 1СР-1 и/или 1СР-1К были связаны с неканцерогенным состоянием или заболеванием. В одном варианте способ включает стадию введения анти-1СР-1К-антитела пациенту, у которого имеется неканцерогенное патологическое состояние, вызванное или усиленное высокими уровнями 1СР-1 и/или 1СР-1К или высокими уровнями их активности. В предпочтительном варианте неканцерогенным патологическим состоянием является акромегалия, гигантизм, псориаз, атеросклероз, рестеноз гладкой мускулатуры кровеносных сосудов или несоответствующая пролиферация микрососудов, такая как пролиферация, обнаруженная как осложнение при диабете, особенно на глаза. В более предпочтительном варианте анти-1СР-1К-антитело замедляет прогрессирование неканцерогенного патологического состояния. В более предпочтительном варианте анти-1СР-1К-антитело останавливает или реверсирует, по меньшей мере, частично неканцерогенное патологическое состояние.
В другом аспекте изобретение относится к способу введения активирующего анти-1СР-1К-антитела нуждающемуся в этом пациенту. В одном варианте активирующее антитело или фармацевтическую композицию вводят нуждающемуся в этом пациенту в количестве, эффективном для того, чтобы увеличить активность 1СР-1К. В более предпочтительном варианте актизирующее антитело способно восстанавливать нормальную актизность 1СР-1К. В другом предпочтительном варианте активирующее антитело можно вводить пациенту, который страдает низкорослостью, невропатией, снижением мышечной массы или остеопорозом. В другом предпочтительном варианте активирующее антитело можно вводить с одним или более другими факторами, которые увеличивают пролиферацию клеток, предотвращают апоптоз или увеличивают активность 1СР-1К. Такие факторы включают факторы роста, такие как 1СР-1 и/или аналоги 1СР-1, которые активируют 1СР-1К. В предпочтительном варианте антитело выбрано из
4.17.3 или содержит его тяжелую цепь, легкую цепь или антигенсвязывающую часть.
Генотерапия
Молекулы нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению можно вводить нуждающемуся в этом пациенту с помощью генотерапии. Терапию можно проводить либо ίη νίνο, либо ех νίνο. В предпочтительном варианте пациенту вводят молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие как тяжелую цепь, так и легкую цепь. В более предпочтительном варианте молекулы нуклеиновой кислоты вводят так, чтобы они были стабильно интегрированы в хромосому В-клеток, поскольку указанные клетки яв
- 35 012079 ляются специализированными клетками для продукции антител. В предпочтительном варианте В-клетки-предшественники трансфицируют или инфицируют ех у1уо и снова трансплантируют нуждающемуся в этом пациенту. В другом варианте В-клетки-предшественники или другие клетки инфицируют ш У1уо, используя вирус, о котором известно, что он инфицирует клетки представляющего интерес типа. Обычные векторы, используемые для генотерапии, включают липосомы, плазмиды или вирусные векторы, такие как ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы. После инфицирования либо ш У1уо, либо ех у1уо уровни экспрессии антител можно контролировать посредством отбора образца у пациента, подвергаемого лечению, и используя любой иммуноанализ, известный в данной области и обсуждаемый в данном описании.
В предпочтительном варианте генотерапевтический способ включает стадии введения эффективного количества выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть антитела человека или его части, и экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты. В другом варианте генотерапевтический способ включает стадии введения эффективного количества выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь или ее антигенсвязывающую часть антитела человека или его части, и экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты. В более предпочтительном варианте генотерапевтический способ включает стадии введения эффективного количества выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть антитела человека или его части, и эффективного количества выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь или ее антигенсвязывающую часть антитела человека или его части, и экспрессии молекул нуклеиновой кислоты. Генотерапевтический способ также может включать стадию введения другого противоракового средства, такого как таксол, тамоксифен, 5-ЕИ, адриамицин или СР-358774.
Для лучшего понимания данного изобретения приведены следующие примеры. Указанные примеры приведены только в целях иллюстрации, и их никоим образом не следует считать ограничивающими объем изобретения.
Пример 1. Создание гибридом, продуцирующих анти-ЮЕ-[В-антитело.
Антитела согласно изобретению получают, отбирают и анализируют следующим образом.
Иммунизация и создание гибридом
Ксеномышей ХЕК0МТСЕ™ 8-10-недельного возраста иммунизировали внутрибрюшинно или в подушечку их задней лапы либо внеклеточным доменом ЮЕЛВ человека (10 мкг/дозу/мышь), либо клетками 3Т3-ЮЕ-IΒ или 300.19-ЮЕ-IΒ, которые представляют собой две трансфицированные линии клеток, которые экспрессируют ЮЕ4В человека на своих плазматических мембранах (10х106 клеток/дозу/мышь). Указанную дозу повторяли 5-7 раз в течение периода времени от 3 до 8 недель. За 4 дня до слияния мышам вводили последнюю инъекцию внеклеточного домена ЮЕ4В человека в РВ8. Лимфоциты селезенки и лимфатических узлов иммунизированных мышей сливали с несекретирующей линией клеток миеломы Р3-Х63-Ад8.653 и подвергали селекции на НАТ, как описано ранее (Са1Гге апб Мйк1ет, Ме!йобк Епхуто1. 73: 3-46, 1981). Получали панель гибридом, каждая из которых секретировала специфичные по отношению к ЮЕ4В антитела Ι§62κ человека. Для дальнейшего исследования отобрали семь гибридом, продуцирующих моноклональные антитела, специфичные по отношению к ЮЕ4В, и обозначили 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 и 6.1.1.
Гибридомы 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3 депонированы в американской коллекции типов культур (АТСС), 10801 Итуегкйу Вои1еуагб, Мапаккак, УА 20110-2209, 12 декабря 2000г. под следующими регистрационными номерами:
Гибридома
2.12.1
Регистрационный номер
РТА-2792
РТА-2788
2.13.2
2.14.3
3.1.1
РТА-2790
РТА-2791
4.9.2 РТА-2789
4,17.3 РТА-2793
Пример 2. Определение констант аффинности (Кб) полностью человеческих моноклональных антиЮЕЛВ-антител с помощью ВМсою.
Авторы выполнили измерения аффинности очищенных антител с помощью резонанса поверхностного плазмона, используя прибор ВТАсоге 3000, следуя протоколам производителя.
Протокол 1.
Для выполнения кинетических анализов белок-А иммобилизовали на поверхностях сенсорных чипов В^сого. Затем сенсорный чип использовали для захвата анти-ЮЕ-IΒ-антител согласно данному изобретению. Различные концентрации внеклеточного домена ЮЕЛВ инъецировали на сенсорный чип и анализировали кинетики связывания и диссоциации при взаимодействиях анти-ЮЕ-IΒ-антител и внекле
- 36 012079 точного домена ТСР-ТВ. Данные оценивали с помощью общей подгонки Ленгмюра 1:1, используя модели смещения базовой линии, имеющимися в компьютерной программе ВТΑеνа1иаΐ^οη, предоставляемой ВТАтоге.
Протокол 2.
Измерения ВТАотге выполняли, по существу, так, как описано Радегйат е1 а1. «ПеТес!^ οΤ апΐ^деηаηΐ^Ьοάу ^ηΐе^асΐ^οη8 Ьу кшТасе ρΐηδίηοη геют-шсе. АррИстОих ΐο ер1Юре тарртд.» Ε Μο1. Веотд. 3: 208214 (1990).
В табл. 1 перечислены результаты измерения аффинности для типичных анти-ТСР-ТВ-антител согласно данному изобретению:
Таблица 1
Кинетические анализы свидетельствуют о том, что антитела, полученные согласно изобретению, обладают высокой аффинностью и значительными константами связывания для внеклеточного домена ТСР-ТВ.
Пример 3. Опосредованное антителом ингибирование индуцированного ТСР-Т фосфорилирования ТСР-ТВ.
Авторы изобретения проводили эксперименты ЕЫ8А для того, чтобы определить, способны ли антитела согласно данному изобретению блокировать опосредованную ТСР-Т активацию ТСР-ТВ. Опосредованную ТСР-Т активацию ТСР-ТВ детектировали по повышенному фосфорилированию тирозина, связанного с рецептором.
Подготовка планшетов для ЕБТ8А
Авторы изобретения готовили иммобилизирующие планшеты для ЕБТ8А добавлением 100 мкл блокирующего буфера (3% бычий сывороточный альбумин [БСА] в забуференном трисом физиологическом растворе [ТВ8]) в каждую лунку 96-луночных планшетов ВеасБВшб, покрытых белком С (Р1егсе), и планшеты инкубировали при встряхивании в течение 30 мин при комнатной температуре. Авторы изобретения разводили пан-специфичное анти-ТСР-ТВ-антитело кролика 8С-713 (8апТа С'гих) в блокирующем буфере до концентрации 5 мкг/мл и в каждую лунку добавляли по 100 мкл разведенного антитела. Авторы изобретения инкубировали планшеты при встряхивании в течение 60-90 мин при комнатной температуре. Затем авторы изобретения 5 раз промывали планшеты буфером для промывки (ТВ8+0,1% твин 20) и осторожно промокали оставшийся буфер на бумажные полотенца. Указанным планшетам не позволяли высыхать до добавления лизата.
Приготовление лизата из клеток, экспрессирующих ТСР-ТВ
Авторы изобретения помещали клетки МН-3Т3. трансфицированные ТСР-ТВ (5х104/мл), в 100 мкл среды роста (среда ЭМЕМ с высоким содержанием глюкозы с добавлением Ь-глутамина (0,29 мг/мл), 10% инактивированной нагреванием РВ8 и 500 мкг/мл каждого из антибиотиков - генетицина, пенициллина и стрептомицина) в 96-луночные планшеты с И-образным дном. Авторы изобретения инкубировали планшеты при 37°С, 5% СО2 в течение ночи, давая возможность клеткам прикрепиться. Авторы изобретения среду декантировали из планшетов и заменяли ее 100 мкл свежей среды на лунку. Для тестирования авторы изобретения разводили потенциальные анти-ТСР-ТВ-антитела до пятикратной требуемой конечной концентрации в среде роста и добавляли 25 мкл на лунку. Все образцы готовили в трех повторах. Затем авторы изобретения инкубировали планшеты при 37°С в течение 1 ч. Авторы изобретения стимулировали клетки 25 мкл/лунку 600 нг/мл ТСР-1 (приготовленном в среде роста) и инкубировали планшеты при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем авторы изобретения декантировали среду, переворачивая планшеты и осторожно промокая на бумажные полотенца, и лизировали адгезированные клетки добавлением 50 мкл лизирующего буфера (50 мМ НЕРЕ8, рН 7,4, 10 мМ БОТА, 150 мМ №С1, 1,5 мМ МдС12, 1,6 мМ №У04, 1% тритон Х-100, 1% глицерин при добавлении непосредственно перед использованием 1 таблетки ингибитора протеазы, не содержащего ЕЭТА [Вοсйе Μο1еси1а^ 8с1Спсс5| на 50 мл) и перемешивая в течение 5 мин при комнатной температуре. В каждую лунку авторы изобретения добавляли 200 мкл буфера для разведения (50 мМ НЕРЕ8, рН 7,4, 1,6 мМ №1У04) и перемешивали пипетированием вверх и вниз. Авторы изобретения переносили 100 мкл лизата из каждой лунки в каждую лунку
- 37 012079 иммобилизирующего планшета для ЕЬ18А, приготовленного, как описано выше, и инкубировали при осторожном встряхивании в течение 2 ч при комнатной температуре.
ЕЫ8А с использованием антител против фосфата тирозина (ρΤΥΚ)
Авторы изобретения удаляли лизат клеток, переворачивая планшеты, промывали планшеты 5 раз буфером для промывки и промокали на бумажные полотенца. Авторы изобретения добавляли по 100 мкл на лунку ρΤΥΚ-специфичного антитела (ΗΚΡ-ΡΥ54), разведенного в блокирующем буфере до концентрации 0,2 мкг/мл, и планшеты инкубировали при встряхивании в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем авторы изобретения 5 раз промывали указанные планшеты буфером для промывки и промокали на бумажных полотенцах.
Авторы изобретения детектировали связывание ΗΚΡ-ΡΥ54-антитела, добавляя по 100 мкл на лунку раствора субстрата пероксидазы ТМВ (Кпкедаагб апб Реггу), и инкубировали со встряхиванием до окрашивания (примерно 2-10 мин). Авторы изобретения останавливали реакцию окрашивания добавлением по 100 мкл на лунку раствора для остановки ТМВ (Югкедаагб апб Реггу). Затем авторы изобретения встряхивали планшеты в течение 10 с при комнатной температуре, чтобы перемешать раствор, и проводили количественное определение посредством измерения 0Ό 450 нм.
В табл. 2 и на фиг. 4 показаны результаты данного эксперимента, выполненного с несколькими антителами согласно изобретению. Результаты данного эксперимента демонстрируют способность антител согласно данному изобретению блокировать опосредованную ЮЕ-Ι активацию ЮЕ-ΙΚ, о чем свидетельствует повышенное фосфорилирование тирозина, связанного с рецептором. Кроме того, полученные результаты можно использовать для количественного определения относительной эффективности антител согласно данному изобретению.
Таблица 2
Пример 4. Опосредованное антителом блокирование связывания ΙΟΡ-Ι/ΙΟΡ-ΙΚ.
Авторы изобретения проводили эксперименты ЕЬ18А, чтобы количественно оценить способность антител согласно изобретению ингибировать связывание ЮЕ-Ι с ЮЕ-ΙΚ в анализе, основанном на клетках. Авторы высевали трансфицированные ЮЕ-ΙΚ клетки ЮН-3Т3 (5х104/мл) в 100 мкл ЭМЕМ с высоким содержанием глюкозы с добавлением Ь-глутамина (0,29 мг/мл), 10% инактивированной нагреванием ЕВ8 и 500 мкг/мл каждого из антибиотиков генетицина, пенициллина и стрептомицина в 96-луночные планшеты с И-образным дном. Затем авторы изобретения инкубировали планшеты при 37°С, 5% С02 в течение ночи, давая возможность клеткам прикрепиться. Затем авторы изобретения сливали среду из планшетов и заменяли 100 мкл свежей среды на лунку. Для тестирования авторы изобретения разбавляли антитела в среде для анализа (ЭМЕМ с высоким содержанием глюкозы с добавлением Ь-глутамина, 10% инактизированной нагреванием ЕВ8, 200 мкг/мл БСА и 500 мкг/мл каждого из антибиотиков - генетицина, пенициллина и стрептомицина) до требуемой конечной концентрации и добавляли по 50 мкл на лунку. Все образцы готовили в трех повторах. Затем авторы изобретения инкубировали планшеты при 37°С в течение 10 мин. Авторы изобретения разбавляли [1251]-ЮЕ-1 до концентрации 1 мкКи/мл в среде для анализа и добавляли в планшет по 50 мкл на лунку. В качестве контроля фоновой радиоактивности авторы изобретения добавляли холодный ЮЕ-Ι до конечной концентрации 100 нг/мл. Авторы изобретения инкубировали планшеты в течение 10 мин при 37°С, среду декантировали осторожным промоканием на бумажные полотенца и дважды промывали средой для анализа. Затем авторы изобретения лизировали клетки добавлением 50 мкл 0,1н. №10Н, 0,1% 8Ό8 и встряхиванием планшетов в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем авторы изобретения переносили образцы в планшет для сцинтилляции, добавляли 150 мкл 0р1|РНазе 8ирегш1х и регистрировали сигнал в счетчике \Уа11ас М1сго-Ве1а.
В табл. 3 и на фиг. 3 показаны результаты данного эксперимента, выполненного с тремя типичными антителами согласно изобретению. Данный эксперимент показывает, что антитела согласно изобретению специфично ингибируют связывание [1251]-1ОЕ-1 с клетками, сверхэкспрессирующими ЮЕ-ΙΚ.
Таблица 3
Моноклональное антитело 1С5О
2.12.1 0,45 мкг/мл
2.13.2 0,18 мкг/мл
4.9.2 0,1 мкг/ыл
- 38 012079
Пример 5. Исследование по картированию эпитопов.
Показав, что антитела согласно изобретению распознают 1СР-1К, авторы изобретения провели исследование по картированию эпитопов нескольких антител согласно изобретению. В частности, авторы изобретения сосредоточили эксперименты на антителах 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3 и 4.9.2.
Авторы изобретения провели конкурентные исследования В1Асоге, чтобы определить, связываются ли антитела согласно данному изобретению с одним и тем же или с разными местами на молекуле ЮРГК.. Авторы изобретения связывали внеклеточный домен (ЕСЬ) 1СР-1К с сенсорным чипом ВГАсоге, как описано выше в примере 2. Авторы изобретения связывали первое антитело согласно изобретению с данным 1СР-1К, связанным с сенсорным чипом, в условиях насыщения. Затем авторы изобретения измеряли способность следующих вторичных антител согласно изобретению конкурировать с первичным антителом за связывание с 1СР-1К. Указанный способ позволил авторам изобретения определить антитела согласно данному изобретению с разными связывающими группами.
Авторы изобретения проводили указанный эксперимент с антителами 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3 и 4.9.2. Авторы изобретения отметили, что 2.13.2 и 4.9.2 конкурируют за один и тот же сайт во внеклеточном домене 1СР-1К. Другие антитела 2.12.1 и 2.14.3 связываются с сайтами 1СР-1К, которые отличаются друг от друга и от сайта, связываемого 2.13.2 и 4.9.2.
Пример 6. Видовая перекрестная реактивность антител согласно изобретению.
Для того, чтобы определить видовую перекрестную реактивность антител согласно изобретению, авторы изобретения выполнили несколько экспериментов, включая иммунопреципитацию, опосредованное антителом блокирование индуцированного 1СР-1 фосфорилирования рецептора и РАСЗ-анализ.
Чтобы выполнить эксперименты по иммунопреципитации, авторы изобретения высевали клетки в среду ЭМЕМ с высоким содержанием глюкозы с добавлением Ь-глутамина (0,29 мг/мл), 10% инактивированной нагреванием РВЗ и 500 мкг/мл каждого из антибиотиков - генетицина, пенициллина и стрептомицина, до слияния на 50% во флаконах Т25. Затем авторы изобретения добавляли 100 мкл антитела согласно изобретению в забуференном физиологическом растворе Хенкса (НВЗЗ; С1бсо ВКЬ) при концентрации 1 мкг/мл. Авторы изобретения инкубировали планшеты в течение 30 мин при 37°С в инкубаторе и затем стимулировали клетки 1СР-1 при концентрации 100 нг/мл в течение 10 мин при комнатной температуре. Авторы изобретения лизировали клетки в буфере КГРА (Наг1оте апб Гапе, выше) и иммунопреципитировали 1СР-1К с помощью 2 мкг пан-специфичного анти-1СР-1К-антитела ЗС-713 (Зап!а ί'πιζ) плюс агарозные шарики с белком А в течение 1 ч при 4°С. Авторы изобретения осаждали шарики и 3 раза промывали РВЗ/Т (РВЗ+0,1% твин-20) и затем кипятили шарики в 40 мкл буфера Лэммли, содержащего 5% β-МЭ.
Затем образцы, приготовленные, как описано выше, анализировали с помощью Вестерн-блота. Авторы изобретения наносили 12 мкл каждого образца на дорожку на 4-10% градиентные гели Nονеx™ и разгоняли в буфере 1Х МЕЗ (Nονеx™). Гели разгоняли при 150 В в течение 1 ч или при 200 В примерно в течение 30 мин. Затем авторы изобретения осуществляли перенос с геля на мембрану в буфере для переноса Nονеx™ с 10% метанола либо в течение ночи при 100 мА, либо в течение 1-1,5 ч при 250 мА. Затем авторы изобретения давали возможность мембране полностью высохнуть и блокировали при комнатной температуре ТВЗ (забуференный трисом физиологический раствор рН 8,0), содержащим Зирегб1оск (Р1егсе Сйетка1 Со.). Авторы изобретения добавляли антитело для блоттинга 1СР-1К - ЗС713 (Зап!а Ουζ), чтобы выявить иммунопреципитированный 1СР-1К.
Указанный эксперимент выполняли с антителами согласно изобретению, в частности 2.12.1, 2.13.2,
4.17.3 и 4.9.2, на клетках из разных животных. Авторы изобретения обнаружили, что антитела 2.12.1,
2.13.2 и 4.9.2 способны связывать 1СР-1К человека, но не рецептор собаки, морской свинки или кролика. Кроме того, указанные антитела способны связываться с 1СР-1К СОЗ7 и Кбекик, которые получены от обезьян Старого Света, но не с 1СР-1К мартышки, которая является обезьяной Нового Света. Указанные эксперименты свидетельствуют о том, что антитела являются высокоспецифичными.
Опосредованное антителом блокирование связывания 1СР-1/1СР-1К у приматов, отличных от человека
После обнаружения того, что антитела согласно изобретению узнают 1СР-1К обезьян Старого Света, авторы изобретения также тестировали их способность блокировать связывание 1СР-1/1СР-1К в клетках, полученных из указанных обезьян Старого Света. Авторы изобретения высевали клетки в среду ЭМЕМ с высоким содержанием глюкозы с добавлением Ь-глутамина, 10% инактивированной нагреванием РВЗ и 500 мкг/мл каждого из антибиотиков - генетицина, пенициллина и стрептомицина - до слияния на 50% во флаконах Т25. Затем авторы изобретения добавляли антитело согласно изобретению или среду без антитела в качестве контроля и стимулировали клетки 1СР-1 при концентрации 100 нг/мл в течение 10 мин при комнатной температуре. После стимуляции авторы изобретения лизировали клетки и иммунопреципитировали 1СР-1К с помощью пан-специфичного 1СР-1К-антитела ЗС713, как описано выше. Затем авторы изобретения проводили Вестерн-блот-анализ, как описано выше, используя антитело ΗКР-РΥ54, чтобы выявить фосфорилированный тирозин в активированном 1СР-1К.
Авторы изобретения обнаружили, что антитела согласно данному изобретению, в частности 2.13.2
- 39 012079 и 4.9.2, могут блокировать индуцированное ЮР-Ι фосфорилирование ЮР-ΙΒ как в клетках С087, так и в клетках Βίκκιικ. Ю50 для измеряемого ингибирования составляло 0,02 и 0,005 мкг/мл для ЮР-ΙΒ С087 и ВЬекик, соответственно.
Определение перекрестно-видовой аффинности антител согласно изобретению
Авторы изобретения выполняли РАС8-анализ, чтобы определить аффинность антител согласно изобретению по отношению к ЮР-ΙΒ разных животных, в частности обезьян Старого Света, описанных выше. Авторы изобретения инкубировали аликвоты клеток человека и обезьян (5х105) в течение 1 ч на льду с возрастающими концентрациями биотинилированных анти-ЮР-IΒ-антител согласно изобретению или с биотинилирозанным антителом против гемоцианина слизня (КЬН) (АЬдешх) в качестве негативного контроля. Затем авторы изобретения инкубировали образцы в течение 30 мин на льду с конъюгированным со стрептавидином ΒΡΕ (фикоэритрин). Авторы изобретения измеряли связывание посредством проточной цитометрии и анализировали гистограммы интенсивности флуоресценции (Р12-Н) против количества клеток (счет), используя компьютерную программу Се110иек1. Авторы изобретения рассчитывали связывание (Кб) для каждого антитела на основе графиков средней интенсивности флуоресценции против концентрации антитела. В большинстве экспериментов авторы изобретения измеряли связывание в культивируемых клетках МСР-7 человека и клетках культуры ткани либо макак-резус, либо макак-крабоедов. Авторы изобретения определяли истощение антитела, измеряя связывание в диапазоне концентраций клеток.
Авторы изобретения выполняли вышеупомянутый РАС8-анализ, чтобы тестировать способность антител согласно изобретению, в частности 2.13.2 и 4.9.2, связываться с клетками человека, макак-резус и макак-крабоедов. Авторы изобретения регистрировали половину максимального связывания (Кб), составляющую 0,1 мкг/мл для всех тестированных клеточных линий.
Пример 7. Понижающая регуляция рецептора ЮР-Ι.
Эксперименты по блокированию авторы изобретения выполняли, по существу, так, как описано выше в примере 4, вплоть до добавления ['^(-меченного ЮР-Ι. В указанной точке авторы изобретения кипятили клетки в 40 мкл буфера Лэммли, содержащего 50% МЭ. Затем авторы изобретения анализировали образцы посредством Вестерн-блот-анализа, как описано выше в примере 6, и зондировали блоты с помощью пан-специфичного ЮР-Ш.-антитела 8С713, чтобы количественно определить уровни ЮР-ΙΒ, и с помощью НΒΡ-ΡΥ54-антитела, чтобы определить уровни фосфорилированного тирозина в активированном ЮР-ΙΒ.
Как обнаружено ранее (пример 3), авторы изобретения наблюдали блокирование индуцированного ЮР-Ι фосфорилирования ЮР-ΙΒ после обработки клеток антителом согласно данному изобретению (фиг. 4). Кроме того, авторы изобретения наблюдали, что после блокирования индуцированного ЮР-Ι фосфорилирования следовала понижающая регуляция ЮР-ΙΒ в указанных клетках. См., например, фиг. 4. Уровни ЮР-ΙΒ максимально снижались через 16 ч после стимуляции ЮР-Ι в присутствии антитела согласно изобретению.
Пример 8. Влияние антител согласно изобретению на ЮР-ΙΒ ίη νίνο.
Авторы изобретения определяли, будет ли проявляться ίη νίνο влияние антител согласно изобретению на ЮР-ΙΒ, которое описано в предыдущих примерах. Авторы изобретения индуцировали опухоли у бестимусных мышей в соответствии с опубликованными способами (У.А. Ρο11;κ1< е( а1., «ΙηΙιίΝΐίοη οί ер1бегта1 дго\\111 ГасЮг ^есерίο^-аккοс^аίеб (угокте ρ1ιο8ρ1ιοιν1;·ιΙίοη ίη Питан сагснютак \νί(1ι СΡ-358774: Оунат1С8 οί гесерЮг ίηΙιίΝΐίοη ίη кби аиб аηί^ίитο^ еГГес(к ίη аШутю тюе», ί. Ρ1ι;·ιπη;·κο1. Ехр. ТЬег. 291: 739-748 (1999). Вкратце, авторы изобретения инъецировали трансфицированные ЮР-ΙΒ клетки ЮН-3Т3 (5х106) подкожно бестимусным мышам (ии/ии) 3-4-недельного возраста с 0,2 мл препарата Ма1пде1. Затем авторы изобретения внутрибрюшинно инъецировали мышам антитело согласно изобретению после образования определяемых опухолей (т. е. объемом примерно 400 мм3).
Через 24 ч авторы изобретения извлекали опухоли, гомогенизировали их и определяли уровень ЮРΙΒ. Чтобы определить уровни ЮР-ΙΒ, авторы изобретения разбавляли антитело 8С-713 в блокирующем буфере до конечной концентрации мкг/мл и добавляли по 100 мкл в каждую лунку планшета ^етее), покрытого антикроличьими антителами козы ^;·κΙί-Βίη6 (ΌΛΒ). Авторы изобретения инкубировали планшеты при комнатной температуре в течение 1 ч при перемешивании и затем промывали планшеты 5 раз буфером для промывки. Затем авторы изобретения взвешивали образцы опухолей, которые были приготовлены, как описано выше, и гомогенизировали их в лизирующем буфере (1 мл/100 мг). Авторы изобретения разбавляли 12,5 мкл экстракта опухоли лизирующим буфером до конечного объема 100 мкл и добавляли его в каждую лунку 96-луночного планшета. Авторы изобретения инкубировали планшеты при комнатной температуре при встряхивании в течение 1-2 ч и затем 5 раз промывали планшеты буфером для промывки. Затем авторы изобретения добавляли в каждую лунку по 100 мкл 4ΒΡ-ΡΥ54 или биотинилированного анти-ЮР-IΒ-антитела в блокирующем буфере и инкубировали при комнатной температуре и встряхивании в течение 30 мин. Затем авторы изобретения промывали планшеты 5 раз буфером для промывки и проявляли планшеты. Авторы изобретения проявляли планшеты, используя в качестве зонда НΒΡ-ΡΥ54, добавляя в лунку по 100 мкл субстрата ТМВ Мюготе11, и останавливали развитие окраски
- 40 012079 добавлением 100 мкл 0,9М Н2§04. Затем авторы изобретения количественно оценивали сигнал, встряхивая в течение 10 с и измеряя 0Э450 нм. Сигнал нормализовали по отношению к общему белку. Авторы изобретения проявляли планшеты, используя в качестве зонда анти-ЮР-!В-антитело, посредством добавления в каждую лунку 100 мкл стрептавидина-ΗΚΡ, разведенного в блокирующем буфере, инкубируя при комнатной температуре и встряхивании в течение 30 мин и затем продолжая обработку, как описано для ΗΚΡ-ΡΥ54.
Авторы изобретения обнаружили, что внутрибрюшинная инъекция антитела согласно изобретению, в частности 2.13.2 и 4.9.2, приводила к ингибированию активности ЮР-[В, измеряемому по снижению (как фосфотирозина ЮР-ΙΚ (фосфорилированного ЮР-ΙΚ), так и) общего белка ЮР4В (фиг. 6). Кроме того, авторы изобретения также наблюдали уменьшение количества фосфотирозина ЮРЛВ (фосфорилированного ЮР-ΙΚ) (фиг. 5). Не имея намерения связать с какой-либо теорией, полагают, что сниженные уровни фосфотирозина ЮРЛВ могут быть следствием пониженных уровней белка ЮРЛВ 1и у1уо после лечения антителом или могут быть следствием комбинации пониженных уровней белка ЮРЛВ и снижения фосфорилирования тирозина в ЮЕЛВ, которое имеет место вследствие блокирования активации лигандом (например, ЮР-Ι или ЮР-ΙΙ). Кроме того, указанное ингибирование зависит от дозы инъецированного антитела (фиг. 6). Полученные данные свидетельствуют о том, что антитела согласно изобретению способны действовать на мишень ЮРЛВ ίη у1уо аналогично действию, наблюдаемому ίη νίΙΐΌ.
Пример 9. Ингибирование роста (ΤΟΙ) 3Τ3/ЮΡ-IΒ-клеточных опухолей.
Авторы изобретения проверяли, будут ли анти-ЮΡ-IΒ-антитела согласно изобретению функционировать как ингибиторы роста опухолей. Авторы изобретения индуцировали опухоли, как описано выше (пример 8), и, когда формировались устанавливаемые пальпируемые опухоли (т.е. 250 мм3, в течение
6-9 дней), авторы изобретения обрабатывали мышей однократной внутрибрюшинной инъекцией антитела в дозе 0,20 мл. Авторы изобретения измеряли размер опухоли штангенциркулями по двум диаметрам каждый третий день и рассчитывали объем, используя формулу (длинах [ширина]2)/2, используя способы, разработанные Сега и, е1 а1., «ГгоЮсо1к £ог ксгеешид сйешюа1 адеиТк аий иаТига1 ргойисТк адатк! ашша1 1итогк аий оТйег Ью1одюа1 кукТетк», Саисег СНетоТйег. Вер. 3: 1-104.
В том случае, когда авторы изобретения проводили данный анализ с антителом согласно изобретению, они обнаружили, что обработка только антителом 2.13.2 ингибировала рост опухолей, индуцированных клетками М[Н-3Т3, трансфицированными ЮРЛВ (фиг. 7 левая панель). Кроме того, при комбинированных исследованиях с использованием однократной дозы 7,5 мг/кг внутривенно доставляемого адриамицина авторы изобретения наблюдали, что введение однократной дозы 2.13.2 усиливало эффективность адриамицина, известного ингибитора опухолевого роста. При комбинировании адриамицина с антителом согласно изобретению 2.13.2 показано замедление роста на 7 дней по сравнению с лечением одним антителом или адриамицином (фиг. 7, правая панель).
Пример 10. Взаимосвязь уровней антител и понижающей регуляции ЮРЛВ.
Опухоли индуцировали у «голых» мышей, как описано в примере 8. Затем мышей обрабатывали 125 мкг 2.13.2 путем внутрибрюшинной инъекции, как описано в примере 8. Опухоли извлекали и измеряли уровни ЮРЛВ с помощью ЕЫ8А, как описано в примере 8. На фиг. 8 показаны уровни антитела
2.13.2 в сыворотке и уровни рецептора ЮРЛВ в течение времени. Эксперимент свидетельствует о том, что происходит понижающая регуляция ЮРЛВ антителом и что степень ингибирования ЮРЛВ пропорциональна по дозе концентрации антитела в сыворотке.
Пример 11. Ингибирование роста опухолей 3Τ3/ЮΡ-IΒ многократными дозами антитела в комбинации с адриамицином.
Опухоли индуцировали у «голых» мышей, как описано в примере 9. Мышей с устанавливаемыми подкожными опухолями объемом примерно 250 мм3 обрабатывали на 1, 8, 15 и 22 день различными количествами антитела 2.13.2 (в/б) или 7,5 мг/кг адриамицина (в/в) либо в виде отдельных агентов, либо в комбинации, как описано в примере 9. На фиг. 9 показан размер опухолей в зависимости от различных обработок в течение времени. Эксперимент показывает, что обработка анти-ЮΡ-IΒ-антителом 1 раз каждые 7 дней ингибирует рост клеток опухоли и усиливает ингибирование роста клеток опухоли в комбинации с адриамицином, известным ингибитором опухолей.
Пример 12. Ингибирование роста крупных опухолей.
Опухоли индуцировали у «голых» мышей, как описано в примере 9. Мышей с крупными устанавливаемыми подкожными опухолями по объему немного меньше 2000 мм3 обрабатывали на 1 и 8 день различными количествами антитела 2.13.2 (в/б) или 7,5 мг/кг адриамицина (в/в) либо в виде отдельных агентов, либо в комбинации, как описано в примере 9. На фиг. 10 показан размер опухолей в зависимости от различных обработок в течение времени. Группы животных в контроле с использованием только антитела и только адриамицина погибали на 5 день, когда размер опухоли превышал 2000 мм3. Эксперимент показывает, что обработка анти-ЮΡ-IΒ-антителом в комбинации с адриамицином является высокоэффективной против крупных опухолей при введении многократных доз.
Пример 13. Ингибирование роста опухолей клеток ободочной и прямой кишки.
Опухоли индуцировали у «голых» мышей, как описано в примере 9, за исключением того, что использовали клетки Со1о 205 (АТСС ССЬ 222). Клетки Со1о 205 являются клетками аденокарциномы обо
- 41 012079 дочной и прямой кишки человека. Мышей с устанавливаемыми подкожными опухолями объемом примерно 250 мм3 обрабатывали различными количествами антитела 2.13.2 (в/б) или 100 мг/кг 5-фтордезоксиуридина (5-РИ, в/в) либо в виде отдельных агентов, либо в комбинации, как описано в примере 9. На фиг. 11 показан размер опухоли в зависимости от различных обработок в течение времени. Эксперимент показывает, что обработка анти-IСР-IΚ-антителом, вводимым однократно, ингибирует рост злокачественных клеток ободочной и прямой кишки человека при введении в виде отдельного агента и усиливает эффективность 5-Ри, известного ингибитора опухолей.
Мышей с устанавливаемыми опухолями Со1о 205 обрабатывали на 1, 8, 15 и 22 день 500 мкг 2.13.2 (в/б), 100 мг/кг 5-РИ (в/в) или их комбинацией. На фиг. 12 показан размер опухолей в зависимости от различных обработок в течение времени. Эксперимент показывает, что обработка анти-IСР-IΚ-антителом, вводимым 1 раз каждые 7 дней, ингибирует рост клеток рака ободочной и прямой кишки человека и усиливает эффективность 5-РИ.
Пример 14. Ингибирование роста опухолей клеток рака молочной железы.
«Голым» мышам, описанным в примере 8, имплантировали биодеградируемые таблетки эстрогена (0,72 мг 17-в-эстрадиола/таблетку, высвобождение в течение 60 дней; Iηηоνа!^νе ВекеагсН о£ Атепса). Через 48 ч у «голых» мышей индуцировали опухоли, по существу, как описано в примере 9, за исключением того, что использовали клетки МСР-7 (АТСС НТВ-22). Клетки МСР-7 являются эстрогензависимыми клетками карциномы молочной железы человека. Мышей с устанавливаемыми подкожными опухолями объемом примерно 250 мм3 обрабатывали 50 мкг антитела 2.13.2 (в/б) на 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19 и 22 день (с.|3б/7) или 6,25 мг/кг таксола (в/б) на 1, 2, 3, 4, 5 день (с.|1б/5) либо в виде отдельных агентов, либо в комбинации, по существу, как описано в примере 9. На фиг. 13 показан размер опухолей в зависимости от различных обработок в течение времени. Эксперимент показывает, что обработка самим анти-ЮР-ΙΚантителом ингибирует рост клеток рака молочной железы человека при введении 1 раз каждые 3 дня, а также усиливает эффективность таксола, известного ингибитора рака молочной железы, при введении в комбинации.
Мышей, имеющих устанавливаемые опухоли из клеток МСР-7, как описано непосредственно выше, обрабатывали в 1 день различными количествами антитела 2.13.2 (в/б) отдельно или с 3,75 мг/кг адриамицина (в/в), по существу, как описано в примере 9. На фиг. 14 показан размер опухолей в зависимости от различных обработок в течение времени. Эксперимент показывает, что однократная обработка самим анти-IСР-IΚ-антителом ингибирует рост клеток рака молочной железы человека и усиливает эффективность адриамицина, известного ингибитора опухолей.
Мышей, имеющих устанавливаемые опухоли из клеток МСР-7, как описано непосредственно выше, обрабатывали 250 мкг антитела 2.13.2 (в/б) в 1, 8, 15 и 23 день или биодеградируемой таблеткой тамоксифена (25 мг/таблетку, свободное основание, высвобождение в течение 60 дней, [ппоуайуе ВекеагсН о£ Атепса) либо в виде отдельных агентов, либо в комбинации, по существу, как описано в примере 9. Таблетку тамоксифена имплантировали в 1 день после установления опухоли. На фиг. 15 показан размер опухоли в зависимости от различных обработок в течение времени. Эксперимент показывает, что обработка анти-IСР-IΚ-антителом, вводимым 1 раз каждые 7 дней, ингибирует рост злокачественной опухоли молочной железы человека сам по себе и усиливает эффективность тамоксифена, известного ингибитора опухолей.
Пример 16. Ингибирование роста опухолей клеток эпидермоидной карциномы.
Опухоли индуцировали у «голых» мышей, по существу, как описано в примере 9, за исключением того, что использовали клетки А431 (АТСС СИГ 1555). Клетки А431 являются клетками эпидермоидной карциномы человека, которые сверхэкспрессируют ЕСЕВ. Мышей с установленными подкожными опухолями объемом примерно 250 мм3 обрабатывали в 1, 8, 15, 22 и 29 день 500 мкг антитела 2.13.2 (в/б) или обрабатывали 1 раз в день в течение 27 дней 10 мг/кг СР-358774, вводимым перорально (п/о) либо в виде отдельных агентов, либо в комбинации, как описано в примере 9. СР-358774 описан в патенте США 5747498 и Моуег е! а1., Саисег ΚοκοιγοΗ 57: 4838-4848 (1997), включенных в данное описание в виде ссылки. На фиг. 16 показан размер опухолей в зависимости от различных обработок в течение времени. Эксперимент показывает, что обработка анти-IСР-IΚ-антителом усиливает эффективность СР-358774, известного ингибитора тирозинкиназы ЕСР-Κ, при ингибировании роста опухоли эпидермоидной карциномы человека.
Пример 17. Фармакокинетика анти-IСР-IΚ-антител ίη у|уо.
Чтобы оценить фармакокинетику анти-IСР-IΚ-антител, макакам-крабоедам внутривенно инъецировали 3,30 или 100 мг/кг антитела 2.13.2 в ацетатном буфере. Сыворотку обезьян собирали в разных временных точках и определяли концентрации анти-IСР-IΚ-антитела у обезьян в течение периода вплоть до 10-недельных уровней.
Чтобы количественно оценить уровни функциональных антител в сыворотке, внеклеточный домен ЮР-ΙΚ человека (ЮР-Ι-κΚ, Κ&Ό 8ук!етк, номер в каталоге 3916Κ) связывали с 96-луночными планшетами. В анализируемые планшеты добавляли сыворотку обезьян (разведенную от 1:100 до 1:15000) так, чтобы каждый образец находился в линейных пределах стандартной кривой, и инкубировали в условиях,
- 42 012079 при которых любое анти-ЮРЛЯ-антитело связывалось бы с ЮРЛ-кЯ. После промывки планшетов в планшеты добавляли меченое антитело против Ι§Ο человека и инкубировали в условиях, при которых антитело против Ι§Ο человека связывалось бы с анти-ЮРЛЯ-антителом. Затем планшеты промывали и проявляли и использовали стандартную контрольную кривую и подгонки с использованием линейной регрессии, чтобы определить количество анти-ЮРЛЯ-антител. На фиг. 17 показана концентрация 2.13.2 в сыворотке в течение времени. Эксперимент показывает, что время полужизни анти-ЮР-Ж-антитела составляет от 4,6 до 7,7 дней и имеет объем распределения 74-105 мл/кг. Кроме того, эксперимент показывает, что вводимые количества у обезьян пропорциональны по дозе, что свидетельствует о том, что анти-ЮР-Ж-антитело заняло любые доступные сайты связывания ЮР-Ж в организме даже при самой низкой дозе 3 мг/кг.
Пример 18. Комбинаторная терапия анти-ЮРЛЯ-антителом и адриамицином приводит к понижающей регуляции ЮР-Ж ш νίνο.
Опухоли индуцировали у «голых» мышей, как описано в примере 9. Мышей с установленными подкожными опухолями объемом примерно 400 мм3 обрабатывали однократной инъекцией 250 мкг антитела
2.13.2 (в/б) или 7,5 мг/кг адриамицина (в/в) либо в виде отдельных агентов, либо в комбинации, как описано в примере 9. Через 72 ч после введения агентов опухоли экстрагировали, как описано в примере 8, и равные количества экстрактов опухолей подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилфосфатом натрия (505-1ПААГ) и Вестерн-блот-анализу с использованием анти-ЮΡ-IЯ-антитела 5С-713 (8аи1а Сг^). На фиг. 18 показаны количества ЮР-Ж в опухолевых клетках у контрольных животных (первые три дорожки каждой панели), у животных, которых обрабатывали только антителом (верхняя панель), у животных, которых обрабатывали только адриамицином (средняя панель), и у животных, которых обрабатывали антителом и адриамицином (нижняя панель). Каждая дорожка представляет равные количества белка из отдельных опухолей от отдельных мышей. Эксперимент показывает, что обработка только адриамицином незначительно влияет на уровни ЮРЛЯ и что при обработке только антителом наблюдается некоторое снижение уровней ЮРЛЯ. Неожиданно при обработке адриамицином вместе с антителом наблюдается резкое снижение уровней ЮР-Ж, что свидетельствует о том, что адриамицин и антитело вызывают значительную понижающую регуляцию уровней ЮРЛЯ.
Все публикации и заявки на выдачу патентов, цитированные в данном описании, включены в данное описание в виде ссылки так же, как в случае, когда для каждой отдельной публикации или заявки на выдачу патента было бы конкретно и отдельно указано, что они включены в виде ссылки. Хотя в целях четкого понимания вышеприведенное изобретение было описано подробно посредством иллюстраций и примеров, специалисты в данной области легко поймут в свете инструкций данного изобретения, что могут быть осуществлены некоторые изменения и модификации изобретения без отхода от сути и без превышения объема прилагаемой формулы изобретения.
10801 ШутИувМ · Мюаом, УА20110421» · ТЫерЬаи·. 703-365-2700 · Г АХ 703-365-2745
ВЦВАРЕ8Т ΤΚΕΑΊΎ ΟΝ ТНЕ ΙΝΤΕΡΝΑΊΤΟΝΑΙ, ΒΕΟΟΟΝΓΠΟΝ ОГ
ΊΉΕ ΏΕΡΟ8ΓΓ ОГ М1СКООЯО ΑΝΙ5Μ8 ГОК ТНЕ ΡϋΚΡΟδΕδ ОТ ΡΑΤΕΝΤ РКОСЕО1ЖЕ
ΙΝΤΕΚΝΑΤΙΟΝΑί РОКИ
ЕЕСЕ1РТΙΝ ΊΉΕ САЗЕ ΟΕ ΑΝ ΟΜΟΙΝΑΣ. ΒΕΡΟ5ΓΓ155ЦЕВ ΡϋΚ5ϋΑΝΤ ТО К1ДЕ 7.3 ΑΝΓ>
Веровйей он ВеЬаИ оЪ Ог.Р.С.ЯйЬагймщРбгег Ьс.
иепШзсавоа ВеГегепсе Ьу ВеробЙог:
Моиве НуЬпйоша Сей Ыпе: 1Ν15842 Мойве НуЬпйота Сей 1дпе: 1Ν15843 Мойве НуЬпйота Сей Ыпе: ΕΝ 15844 Мойве НуЬпйота СеИЬте: 1Ν 15845 Мойве НуЬпйота Сей 1дпе: ΕΝ15846 Мойве НуЬпйота Сей Ьшс; 1Ν15847 (ЯеГ. Боскес ог 0«βΝο.: РС11098)
РаЗай Вермй Веидовов
РТА-2788
РТА-2789
РТА-2790
РТА-2791
РТА-2792
РТА-2793
ТЪе ώφοδΐϋ чесе асишфатей Ьу: _ а вссетШс йевсприст. а ргоромй сахоштсс йевспросп шФсаХей аЬсуе, ТЬс йерояк чете ссселгей РесесвЬег 12.2000 Ьу Ф1$ Ъйегш&лза! Верояму АиФопСу апй Ъам Ъееп ассерой. '
АТ ΥΟϋΒ КЕОЦЕ8Т: X \Уе чШ ίηίαπη уои сГтедпевВ&г Фе ягатв Сот 30 уеап.
Тке $спш чШ Ье тайе ауаЙаЫе И а расеш оШсе адлаСосу со Фе Вийареа Тгеасу ссгё&а опе*в п|ЬС й> гесеСуе, ог «Га 0.5. Рагий ΰ &ией сЩод О* 5М1П8, апй АТСС к ЬясшсейЪу Фе Ршсей БСаСеа Раши & Тгайеяшк Сйсе от Фе йвровког ю геказа $асй атаки.
ίί Фе сиЙшта вЬоиМ Фе от Ье йюноуей йшиф Фе евеагее Село с£ Фе йерояС, й $Ьа11 Ье уоиг севрОД£1ЫИ(у Со гер1аое Фет «4Ф 1тп| сийогез оГФе валю.
ТЪеяга1пзмиЪета1та1пей1огарепойоГа11еаЯЗОуеагзйотйа1еаГйероя1, огбуеуеаяайегФеаюя гесеас ссфкя бзг а 5атр1е, чЫсЬтг 1$ Ιοηςβτ. ТНе Шеей Висев апй талу оФег сошипее асе Яришу со Фе ВийареЯ ТгеаСу.
ТЬе νίοΒϊΙΰν сСФе си1сиге8 ейей аЬоуе чав илей РесетпЬсг 28.2000. ОпФаСйасс.ФесиЙигевчсгеуйФк.
Ьсепабма! Реровйогу Аифогйу: Ателсап Туре СиНиге СоИесйоп, Мадавваз, УА 20] 10-2209 ЩА хогергезепСАТСС:
___________ Васс: Дапиагу 10,2001
Ргшк 51т1«пе, ВиесСог, Рашй ВероаМму
Заявители: компания «Пфайзер Инк.» и др.
Дата подачи: 20 декабря 2001г. (20.12.01).
Название: «Антитела к рецептору инсулиноподобного фактора роста Ι». Справ. № агента: ΑΒX-РΡ/2 РСТ.
- 43 012079
Указания, относящиеся к экспертному решению в отношении депонированного материала, на который даются ссылки в описании
Все указания, относящиеся к депонированному биологическому материалу, содержатся в описании. Ниже приведены дополнительные указания, которые не должны входить в описание, и их следует рассматривать как «отдельные указания». Они относятся только к экспертному решению.
Дополнительные указания, приведенные ниже, относятся к депонированному биологическому материалу, который упоминается как «гибридома 4.9.2.» в описании на стр. 75, строки 8-18.
Материал депонирован в следующем депозитарии:
«Американская коллекция типовых культур» (АТСС)
10801 Юниверсити Булевард, Манассас, штат Виржиния 20110-2209
Соединенные Штаты Америки декабря 2000г., под номером РТА 2789.
Дополнительные указания.
В отношении Канады:
Касательно Канады, до выдачи патента Канады или до даты, когда по заявке будет вынесено решение об отказе, или если заявка изъята из рассмотрения и больше не подлежит восстановлению или отозвана, как оговорено Правилами 107 и 108 Патентных Правил в соответствии с Законом Канады о патентах, образцы депонированного биологического материала будут доступны только в виде образца, предоставляемого независимому эксперту, назначенному Комиссионером (Правило 104(4)).
В отношении Европатента:
Касательно Европатента, до публикации указания о выдаче Европатента или до истечения 20 лет от даты подачи заявки, если по заявке было вынесено решение об отказе или заявка была отозвана или считается отозванной, как оговорено в Правиле 28(3) Правил по применению Европейской патентной конвенции, образцы депонированного биологического материала будут предоставляться только посредством выдачи образца эксперту, назначенному лицом, направившим запрос (Правило 28(4) ЕРС).
В отношении Финляндии:
Касательно Финляндии, до публикации указания о выдаче патента Национальным советом по патентам и регистрациям или в течение 20 лет от даты подачи заявки, если в результате рассмотрения заявки патент выдан не был, образцы депонированного биологического материала будут предоставляться только эксперту в данной области.
В отношении Великобритании:
Касательно Великобритании, заявитель настоящим уведомляет о своем желании, чтобы образцы депонированного биологического материала предоставлялись только эксперту в данной области.
В отношении Исландии:
Касательно Исландии, пока патент не будет выдан Исландским патентным ведомством или Исландским патентным ведомством не будет принято решение, в результате рассмотрения патентной заявки, об отказе в выдаче патента, образцы депонированного биологического материала могут выдаваться только эксперту в данной области.
В отношении Швеции:
Касательно Швеции, пока заявка не будет представлена на изучение общественности (Шведским патентным ведомством) или пока Шведским патентным ведомством не будет принято окончательное решение по заявке (без предоставления заявки на изучение общественности), образцы депонированного биологического материала могут выдаваться только эксперту в данной области.
В отношении Сингапура:
Заявитель настоящим уведомляет о своем желании, чтобы образцы вышеуказанной культуры предоставлялись только экспертам в соответствии с параграфом 3 Четвертой таблицы Патентных правил 1995г.
- 44 012079
Список последовательностей <110> ΑΜΕΝΙΧ, 1ЫС.
ΡΡΊΖΕΚ, ΙΝΟ.
<120* антитела к рецептору инсулин-подобного фактора роста I <130> АВХ-РР2 <140>
<141>
<150> 60/259,927 <151> 2001-01-05 <160> 60 <170> Патент, версия 2.1 <2Ю> 1 <211> 291 <212 > ДНК <213> Ното вартепа <400> 1
СдсагсСдса ддадасадад ссассессас Сйдссдддса адесаддаса ыадасдсда60
Ессаддсбдд еайсадсада аассадддаа адсйссйаад сдсссдасы ыдсйдсаЫ120 ссдЬЫасаа адСддддссс сассааддьс садсддсадс ддаЬсйддда садааЬСоас1Θ0
Ъсесасаапс адсадсссдс адссйдаада ыыдсаасп СаЕГасГдсс Еаоадсасаа240
СааЕбасссб. сддасдсссд дссаадддас сдаддеддаа аЫайасдаа с291 <210> 2 <211> 136 <212> белок <213> Ното варгепв
<400> 2
А1а 1 Зег Уа1 С1у Авр Агд 5 Уа1 ТЬг РЬе ТЫ 10 Сув Агд А1а Зег С1п 15 Авр
Не Агд Агд Авр Ьеи О1у Тгр Туг С1п αΐπ Ьуа Рго С1у Ьуа А1а Рго
20 25 30
Ьуз Агд Ьеи Не Туг А1а А1а Зег Агд Ьеи <31п Зег О1у Уа1 Рго Зег
35 40 45
Агд Рле Зег О1у Зег О1у Зег О1у ТЫ О1и РЪе ТЫ Ьеи ТЫ Не Зег
50 55 60
Зег Ьеи С1п Рго С1и Аар РЬе А1а ТЪг Туг Туг Сув Ьеи ΟΙ η Н1в Аап
65 70 75 90
Да η Туг Рго Агд ТЪг РЪе О1у О1п □1у ТЫ О1и Уа1 О1и Не Не Агд
Θ5 90 95
ТЫ Уа1 А1а А1а Рго Зег Уа1 РЬе Не РНе Рго Рго Зег Авр О1и С1л
100 105 НО
- 45 012079
Ьец Ьув Зег Е1у ТНг А1а Зег νβΐ νβΐ Сув Ьец ьеи Авл Авл РЬе туг
115 120 125
Рго Агд С1и А1а Ьув Уа1 С1п Тгр
130 115 с210^ 3 <211> 352 <212> ДНК <213 > Ното варХепв <400> 3 дддаддсСЬд дЕсаадсскд даддЕссеед адасЕсЕссЕ дЬдсадссЕс ЕддаЕЕсасЕ€0
ЕЕСадЕдасе асЕаЕаЕдад ссддаЕссдс саддсЕсоад ддааддддсЕ ддааЕдддЕС120
ЕсасасаЕЕа дЕадсадедд садЕассада дассасдсад асЕсЕдЕдаа дддссдаЕЕс180 ассассЕсса дддасаасдс саадаасЕса сЕдЕаЕссдс аааЕдаасад сссдададсс240 даддасасдд ссдЕдЕасса ссдсдЕдада дасддадбдд ааассасссг ссассасЕас300
ЕасЕасддЕа Еддасдссгд дддссааддд ассасддьса ссдЕсЕссЕс ад352 <210> 4 <211> 174 <212> Белок <213> Ното вархепв <400> 4
Е1у Агд 1 Ьеи С1у Е1ц А1а Тгр Агд Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Сув А1а 15 А1а
5 10
Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Авр Туг Туг МеЕ Зег Тгр 11е Агд С1п А1а
20 25 30
Рго Е1у Ьув С1у Ьеи С1и тгр νβΐ Зег Туг Не Зег Зег Зет 01у Зег
35 40 45
ТНг Агд Абр Туг А1а Авр Зег νβΐ Ьув Е1у Агд РЬе ΤΊ1Γ Пе Зег Агд
50 55 80
Авр Аол А1а Ьуз Аеп Зег Ьеи Туг Ьеи С1п МеЕ Авл 5ег Ьеи Агд А1а
85 70 75 80
О1и Аар ТНг А1а Ча1 Туг Туг Сув 7а1 Агд Авр С1у ν»1 С1и ТЬг ТНг
85 90 95
?Не Туг Туг Туг Туг Туг О1у МеЬ Авр νβΐ Тгр Е1у αΐη 01у ТЫ ТЬг
100 105 110
Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТНг Ьув <31у Рго Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи
115 120 125
АЗа Рго Сув зег Агд Эег ТИг Зег □1и Зег ТЬг А1а А1а Ьеи (31у Сув
13 0 135 14 0
Ьеи Уа1 Ьуз Авр Туг РЬе Рго С1и Рго Уа1 ТНг ΥβΙ Зег Тгр А. 5 η Зег
145 150 155 180
- 46 012079
С1у А1а Ьеи ТЬг Зег 01у Уд1 Нхв ТЬг РЬе Рго 5ег Сув А1а
155 170 <210> 5 <211> 322 <212> ДНК <213 > Ното варГепе <400> 5 дасаьссада ЕдасссадЕЕ Ессаессосс ссдсссдса€ ссдсаддада сададЬсасс 60 ассасккдсс дддсаадкса дддсаскада ааЕдаЕЕЕад дсьддиасса дсадааасса 120 дддааадссс ссаадсдссс даЕскакдсс дсаЕсссдЕЕ Едсасададд ддссссаьса 180 аддЫсадсд дсадЕддаЕс Едддасадаа ЕЕеаеЕеЕса сааЕсадсад ссЕдсадссЪ 240 даадаЕЕЕЕд саасЕЕакЕа срдЕЕрасаа сардакадЕс асссдрдсад ЕЕЕЕддссад 300 дддассаадс кддадассаа ас 322 <210> 6 <211> Ю7 <212> Белок <213 > Ното вархелв <400> 6
Авр 1 Не С1п МеЕ ТЬг С1п РЬе Рго вег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у
5 10 15
Авр Агд νβΐ ТЬг Не ТЬг Сув Агд А1а Зег (31п (31у Не Агд АВЛ Айр
20 25 30
Ьеи 31у Тгр Туг 01п С1п Ьув Рго 31у Ьув А1а Рго Ьуз Агд Ьеи Не
35 40 43
Туг А1а А1а Зег Агд Ьеи Нхе Агд 31у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 50
Зег □1у Зег <Э1у ТЫ с1и РЬе ТЬг ьеи ТЫ Не Зег Зег Ьеи 01П РГО
65 70 75 80
<31и Аяр РЬе А1а ТЫ Туг Туг Суя Ьеи С1П 818 Аяп Зег Туг Рго суе
85 $0 95
Зег РЬе С1у С1п 01у ТЬг Ьув Ьеи 01и Не Ьув
100 105
<210> 7 <211> 375 <212> ДНК <213> Ногао вар1елз <400> 7 аддедсадсс дЕСддадрсЕ дддддаддск еддсасадсс Еддддддрсс ссдадасссс 60 ссЕдеасадс сЕссддаЕЕс ассЕЬЕадса дсЕакдссаЕ даасЕдддЕс сдссаддсЕс 120 садддааддд дсЕддадрдд дЕсгсадсЕа ЕЕадЕддЕад ЕддЕддЕасс асаЕЕсЕасд 180 садасЕссдх даадддссдд ЕЕсассаЕсЕ ссададасаа еесеаддасс асдсидсаЕс 240
ЕдсаааЕдаа садсскдада дседаддаеа сддссдЕаЕа ЕЕасЕдЕдсд ааадаЕсЕЕд 300 дссддрссда сЕСЕЕасЕас ЕасЕасЕасд драЬддасди сЕддддссаа дддассасдд 360
- 47 012079
Нсассдкскс сСсад <210> В <211> 124 <212> Белок <213> Ното варйепв <400> б
ν·1 □1п Ьеи Ьеи О1и 5ег С1у С1у О1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у 01у Зег
1 5 10 15
Ьеи Агд Ьеи Зег сув ТЫ А1а Зег 01у РНе ТЬг РНе Зег зег Туг А1а
20 25 30
Мес Аап Тгр V*! Агд С1 п А1а Рго 01у Ьуе 01у Ьеи (31и Тгр Уа1 Зег
35 40 45
А1а Не Зег 31у Зег О1у О1у ТЬг ТЬг РЬе Туг А 1а Авр Зег 7а1 Ьуе
50 55 50
01у Агд РЬе ТЬг Не бег Агд Авр Аеп Зег Агд ТЫ ТЬг Ьеи Туг Ьеи
65 70 75 60
αΐη МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а □1и Авр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг сув А1а
65 90 95
Ьуя Лер Ьеи О1у Тгр Зег Аар Зег Туг Туг Туг Туг Туг 01у мен Авр
100 105 110
νβΐ Тгр 01у 01 п о1у ТЫ ТЫ νβΐ ТНг νβΐ Зег Зег
115 120
<210> 9 <211> 302 <212> ДНК <213 > Ηοπιο Ββρίβηβ <400> 9 гссдссссдк сндсаесндс аддадасада дссассннса ссьдссдддс аадНсаддас аСкадасдсд анРЬаддсСд драСсадсад ааассаддда аадсСсскаа дсдсскдаЕс сасдссдсан сссдынаса аадкддддсс ссансааддн ссадсддсад сддагссддд асадаасеса сСсксасааР садсадсснд садсскдаад аьсыдсаас сРаНЬасЬдс ссасадсаса аСааССаксс нсддасдые ддссааддда ссдаддсдда аансагасда с
375
120
180
240
300
302 <210> 10 <211> 100 <212 > Белок <213> Ното варкепб <400> 10
Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег νβΐ О1у Лер Агд Уа1 ТНг РЬе ТНг Суб Агд 15 10 15
- 48 012079
А1а 5ег О1п Авр Не Агд Агд Авр Ьеи О1у Тгр Туг 01п О1п Ьув Рго
20 25 30
□1у Ьуа А1а Рго Ьув Агд Ьеи Не Туг А1а А1а Зег Агд Ьеи 01п Зег
35 40 45
01у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у Зег 51у Бег О1у ТЬг Оби РЬе ТЬг
50 55 60
Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи 81П Рго 01и Авр РЬе А1а ТЫ Туг Туг Сув
65 70 75 ВО
Ьеи С1п нбв Ави Ав η Туг РГО Агд ТЬг РЬе 01у <31 η 01 у ТЬг Оби Уа1
35 90 95
01и 11е Не Агд
100 <210> 11 <211? 33В <212> ДНК <211> него варбепв <400> 11 дддсссадда ОГССаДсадБ даССдддсдЬ сассаидсса сдсддасасд ссасгддддс сгддбдаадс ааЫассасс аесбасасса дьадасасдо дссдбдСаЫ: садддаассо сЫсддадас ддадсСддаС дсдддадссс ссаадаасса асЬдГдсддГ СддСсассдС сседбсссСс ссддсадссс саасбасаас диссесссед аасдаЪЫЫ сиссссад асЫдсассд дссдддаадд сссЬсссЬса аадстдаасс ддадиддКЬа
ЬсксСддСдд дассддадсд ададесдадЬ ссдьдассдс ььаесссбда
120
160
240
300
338 <210> 12 <211> 112 <212? Белок <213? Ното варбеде <400> 12
О1у 1 Рго 01 у Ьеи Уа1 5 Ьув Рго Зег □1и ТЬг 10 Ьеи Зег Ьеи ТЬг Сув 15 ТЫ
Уа1 Зег С1у □1у 20 Зег Не Зег Авп Туг 25 Туг Тгр Зег Тгр Не 30 Агд αΐη
₽го Аба С1у 35 Ьув 01у Ьеи 01 и Тгр 40 Не 01у Агд Не туг 45 ТЫ зег С1у
Зег Рго 50 Аеп Туг Ав η Рго Зег 55 Ьеи ьув Зег Агд Уаб 60 ТЬг МеД зег Уа1
Авр 65 ТНг Зег Ьув Αβη Сбп 70 РНе Зег Ьеи Ьув Ьеи 75 Авп Зег Уа1 ТНг Аба ВО
Аба Авр ТЬг Аба Уа1 65 Туг туг Сув Аба Уа1 90 ты Не рЬе □1у Уа1 95 Уа1
- 49 012079
Не 11е РНе Авр Туг Тгр 01 у 01 п <31у ТЫ Ьеи Уа1 ТЫ νβΐ Зег Зег
100 105 110 <210> <211> <212> <213>
322 ДНК Ното варίеле <400> дасагссада арсаеЕЕдсс дддааадссс аддЕЕсадсд даадаЕЕЕЕд дддассаадд
ЕдасссадЕс дддсаадЕеа сгаадсдсср дсадЕддаЕс саасЕЕасЕа ЕддадаЕсаа
Ессасссбсс дддсаЕЕада даЕсЕаЕдсг Едддасадаа сЕдгссасад ас сЕдСсодсаг адЕдаЕЕЕад дсаЕссаавЕ ЕЕсасЕсЕса саЕааЕадЕЕ сЕдгаддада деЕддбСкса гасассдсдд сааЕсадссд асссЕсЕсас сададЕсасс дсадааасса ддссссаЕса ссбдсадссг ЕЕЕсддсдда
120
130
240
300
322 <210? 14 <211> 107 <212> Белок <213> Ното зархепв <400> 14
Дер 11е 01п Мер ТЫ 01п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег Д1а Зег Уа1 О1у
1 5 10 15
Авр Агд Уа1 ТЫ Не ТЫ Сув Агд Айа Зег <31П О1у Не Агд Зег Авр
20 25 30
Ьеи О1у Тгр РНе 01а О1П Ьуз Рго <Э1у Ьув А1а Рго Ьув Агд Ьеи Не
35 40 45
Туг А1а А1а Зег Ьув Ьеи ΗίΒ Агд О1у Уа1 Рго Зег Агд РНе Зег 01у
50 55 60
Зег С1у Зег <31у ТЫ 01и РНе ТЬг Ьеи ТЫ Не Зег Агд Ьеи <31п Рго
65 70 75 90
С1и Авр РНе А1а ТЫ Туг Туг Сув Ьеи ΟΙ η Н1В Азп Зег Туг РГО Ьеи
85 50 95
ТЫ РЬе О1у О1у О1у ТЫ Ьув νβΐ О1и Не Ьув
100 105
<2Ю> 15 <211> 376 <212> ДНК <213> Ното вар!епв <400> 15 даддрдсадс ЕссЕдЕдсад ссадддаадд дсадасЕссд сбдсаааСда ддсЕасддЕд
ЬдСЬддадСс ссЕсЕддаЕЕ ддссддадЕд Одаадддссд асадссЕдад асЕсерасЕа едддддаддс сассЕЕрадс ддссссадсЕ дЕЕсассаЕе адссдаддас срасЕасЕас
ЕЕддЕасадс адссаЕдсса аЕЕадЕддЕа Ессададаса асддссдЕаЕ ддРаРддасд сЬддддддРс ЕдадсЕдддЕ дЪддЕддсаЕ аЕЕссаадаа аЕЕасЕдЕдс рерддддсса ссЕдадасЕе ссдссаддсЕ сасаЕдсЕас сасдСЕдраг дааадассЕд адддассасд
120
160
240
300
360
- 50 012079 дГсассдСсЬ ссссад 376 <210> 16 <211> 125 <212> Белок <213> Коню вариепя <400> 16
61и 1 Уа1 61п Ьеи Ьеи 01 и Зег 61у 31у С1у Ьеи Уа1 61п Рго 01у О1у 15
5 10
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Сув А1а А1а Зег О1у РЬе ТЫ РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
А1а МеЕ Зег Тгр ν*ι Агд С1п А1а Рго С1у Ьуа в1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег А1а Не Зег О1у Зег О1у 61у Не ТЬг Туг туг А1а Аар Зег Уа1
50 55 60
Ьуз 61у Агд РНе ТЬг Не зег Агд Авр лап Зег Ьуа АЗП ТЬг Ьеи туг
65 70 75 60
Ьеи 61п мее Ав η Зег Ьеи Агд А1а 61и Авр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суа
85 90 95
Д1а Ьуе Авр Ьеи 61у Туг с1у Аар РНе Туг туг туг Туг туг <31у мее
100 105 но
Авр Уа1 Тгр 61у 61п С1у ТЬг ТЬх Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 125
<210> 17 <211> 279 <212> ДНК <213> Ното эар1ел0 <400а· 17 саддадасад адСеассасс асеедссддд саадьсадад саееадеасс еееыаааеь 60 ддеассадса дааассаддд ааадссссеа аасесседае ссаедеедс* сссадЫЕас 120 ааддСддддЬ сссаЕсаадд ЕСсадСддса дсддаЬсЬдд дасадаРЬЪс асссНсасса 190 Есадсадесе дсаасссдаа даСЕССдсаа сЕЕасЕассд есаасададЕ сасаасдссс 240 сасЕсасЕЕЕ еддеддаддд ассааддЬдд адаЕсааас 279 <210> 16 <211> 92 <212> белок <213> Ното вариепз <400> 16
61у Авр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег 61п Зег 11е Зег ТЬг 15 10 15
РНе Ьеи Авп Тгр Туг С1п 61п 1>ув Рго С1у Ьуа А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи
25 30
- 51 012079
Не ΗΪΒ ναΙ 35 А1а зег Зег ьеи <31п 40 *31у С1у иа1 Рго Зег 45 Агд РЬе Зег
С1у зег 50 С1у Зег С1у ТЫ Авр 55 РЬе ТЬг Ьеи ты Не 60 Зег Зег Ьеи (31л
Рго 55 С1и Аар РЬе А1а ТЬг 70 Туг Туг Суя <31п <31п 75 Зег Туг Ав η А1а Рго во
Ьеи ТЫ РКе 01у □1у 85 01у ТЫ ьув νβΐ С1и 90 Не Ьуе
<210> 19 <211> 341 <212 > ДНК <213> Ηοπιο эардепе <400> 1$ сссаддасСд дЕдаадссСС сддадаессс днсссесасс бдсассдссс ссддеддсбс 60 сабсадеаде баснасСдда дгСддаСссд дсадссссса дддаадддас сддадбддаб 120 ЬдддеаСаЪс еаЫасадбд ддадсассаа сеасаасссс бсссбсаада дбсдадесас 180 сабансадСа дасасдПсса адаассадеб сбссседаад срдадснсбд едассдсндс 240 ддасасддсс дбдбаннасн дНдссаддас днабадсадС бсдснснасб асбасддПаС 300 ддасдбсбдд ддссааддда ссасддесас сднсбсссса д 341 <210> 20 <211> 113 <212> Белок <213> Ното еар!епв <400> 20
Рго С1у Ьеи Уа1 Ьув Рго Зег О1и ТЬг Ьеи Зег Ьеи ТЫ Суе ТЫ Уа1
1 5 10 15
Зег <31у <31у Зег 20 Не Зег Зег Туг Туг 25 Тгр Зег Тгр Не Агд 30 αΐπ Рго
Рго 01у Ьув 35 01у Ьеи 01и Тгр 11е 40 С1у туг Не Туг Туг 45 Зег 01у Зег
ТЬГ Авп 50 Туг Авп Рго Зег Ьеи 55 Ьуа Зег Агд ν>1 ТЬг 60 Не Зег Уа1 Авр
ты 55 Зег Ьув Авп (Э1п РЬе 70 Зег Ьеи Ьуя Ьеи Зег 75 Зег Уа1 ТЬг А1а А1а 30
Авр ТЬг А1а ν«ι Туг 85 Туг Суе А1а Агд ТЬг 90 туг Зег Зег Зег РЬе 95 Туг
Туг Туг С1у Мее 100 Авр νβΐ Тгр С1у С1п 105 01у ТЬг ТЬг 7а1 ТЬг но Уа1 Зег
Еег
- 52 012079 <210> 21 <211> 274 <212> ДНК <21з> Ното вар!епв <220>
<221> модифицированное основание <222> (240) <223> а, с, ΐ, д, другое или неизвестное <400> 21 ададссассс ЕсЕссГдЕад ддссадссад адЪдььсдсд дсаддПасгс адссбддсас 60 садсадааас сьддссаддс БсссаддсБс сСсакскасд дкдсаСссад садддссасС 120 ддсаСсссад асаддббсад сддсадсддд ссгдддасад асЕЪсасксЕ сассаЬаадс 180 адасцддадс сЬдаадаЬЕХ сдсадрдььь ЪасЬдьсадс адЬаСддТад ъесассГсдп 240 аедгрсддсс аадддассаа ддбддааабс ааас 274 <210> 22 <211> 91 <212> Белок <213> Ното яархепз <400> 22
Агд А1а 1 ТЬг Ьеи Зег 5 Суз Агд А1а Зег αΐη 10 Зег Уа1 Агд С1у Атд 15 Туг
Ьеи А1а тгр Тут 01 η <31 η ьув Рго □1у αΐη А1а Рго Агд Ьеи Ьеи Не
20 25 30
Туг <Э1у А1а Зег Зег Агд А1а ТЬг С1у Не Рго Авр Агд РЬе бег С1у
35 40 45
Зег (Пу- Зег О1у ТЬг Авр РНе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Агд Ьеи С1и Рго
ЗО 55 60
◦1и Аар РЬе А1а Уа1 РЬе Туг Суя 01л О1п Туг е1у Зег Зег рго Агд
65 70 75 ВО
ТЪГ ₽Ь· С1у С1п С1у ТЬг Ьув 0*1 <31и Не Ьув
аз 90
<210> 23 <211> 367 <212> ДНК <213> Ното вараепв <400> 23 даддсдсадс СссОдбдсад ссадддаадд дсадасьссд сбдсааасда дддасеасдд Сссссад одсйддадсс ссЕсбддаСЬ ддссддадсд ьдаадддссд асадссЕдад ЕдагьаГдад сдддддаддс сассьеъадс ддСсЕсаддС дСЕсассаЕс адссдаддас ЬЬддОСсдас
СЬддЬасадс сГддддддьс ссбдадассс 60 адс“асдсс* ьдадсЬдддЬ седссаддсо 120 ассасьддда дсддсддсад пасасассас 1В0 Ьссададаса аЬЬссаадаа сасдсЕдсас 240 асддссдсаЬ ассасЕдбдс дааадаьсса 300 ссеСддддсс адддаасссб ддЕсассдЕс 360 367
- 53 012079 <210> 24 <211> 122 <212? Белок <213? Ното аархепн <400? 24
<31и 1 Уа1 αΐη Ьеи Ьеи 5 О1и Зег 01у 01у (Ну Ьеи Уа1 01п Рго <31у □1у
10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Сув А1а А1а Зег <31у РЬе ТЫ РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
А1а МеЪ Зег тгр Уа1 Агд αΐη А1а РГО <31у ьув (Пу- Ьеи 31 и Тгр Уа1
35 40 45
Зег С1у 11е ТЬг С1у Зег О1у □1у Зег ТЬг Туг Тут А1а Авр Зег Уа1
50 55 60
Ьув 01у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Авр Авп Вег Ьув Аап ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи 31п нее Авп Зег Ьеи Агд А1а 01 и Авр ТЬг А1а V®! Туг туг Сув
85 90 »5
А1а Ьув Авр Рго С1у ТЬг ТНг Уа1 Не меь вег Тгр РЬе Аар Рго Тгр
100 105 110
О1у □1п О1у ТЬг Ьеи Уа1 ты ν<ι Зег Зег
115 120
<210> 25 <211> 320 <212> ДНК «213» Ното яархепв <400> 25 дааоьдбддс даасЬдссЪс ддааддбдда дсааддаоад аасасааадс доеесаасад
ЪдсассассЪ ЕдЫдбдсдс ЕаасдсссСс сассЬасадс сбасдсседс дддададьдь дсссбсассс седсбдааЬа саассдддса с&садсадса даадссассс ссссдссабс асЕЬсЕаЬсс асЁсссадда сссбдасдсб ассадддссс
Сдабдадсад садададдсс дадьдссаса двдеааадса дадсссдссс ьсдааасссд ааадЬасадЪ дадсаддаса даЫасдада дссасааада
120
180
240
300
320 <210> 26 <211? 106 <212? Белок <213> Ното варЬепв <400> 26
ТЬг Уа1 А1а А1а Рго Зег Уа1 РЬе Не РЬе ₽го ₽го Зег Авр О1и αΐη
1 5 10 15
Ьеи Ьуя Зег О1у ТЬг А1а Зег Уа1 Уа1 Сув Ьеи Ьеи Авп Аап РЬе Туг
25 30
- 54 012079
РГО Агд С1и 35 А1а Ьув Уа1 <31п Тгр 40 Буе Уа1 Авр Авп А1а 45 Ьеи С1п Зег
О1у Аап 50 Зег αΐη С1и Зег Уа1 55 ТЬг 01и 31 и Авр Зег 60 Ьув Азр Зег ТЬг
Туг 65 5ег Ьеи Зег Зег ТЬг 70 Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьув 75 А1а Аар Туг 01 и Ьув во
ΗΪ3 Ьун Уа1 туг А1а 85 Сув □1и Уа1 ТЬг Н1в 90 (31П <31у Ьеи Зег Зег 95 Рго
Уа1 ТЬг Ьув бег 100 РЬе А. а η Агд С1у С1и 105 Сув
<210» 27 <211> 978 <212> ДНК <213 > Ното яар1еца <400> 27 дссРссасса адсасадсдд ЕддаасСсад ддассскась касассгдса аааЬдггдЬд СГСГЕССССС деддгддсдд дГддаддСдс дГддСсадсд ааддСЫсса садссссдад саддьсадсс дададсаасд ддсьссеесь дессссгсас ссссЬдГсГс адддсссагс сссЕдддсГд дсдсгссдас сссьсадсад аедсадаеса ГсдадЬдссс саааасссаа асдьдадсса агаасдссаа ЬссЬсассдс асаааддсск аассасаддЬ ЕдассЕдссЕ ддсддссдда ЬссЬсГасад дасссдьдае сдддЬааа ддссЬГсссс ссГддЬсаад садсддсдсд сдГддйдасс саадсссадс ассдгдссса ддасасссгс сдаадасссс дасааадсса Ъдедсассад сссадссссс дЪасассссд ддГсаааддс даасаасС.ас саадсЕсасс дсасдаддсс сЬддсдссег дасСасгссс сасассехсс дедсссесса аасассаадд дсассасоЬд аСдаГСЕСсс даддсссадс сдддаддадс даскддссда аЬсдадаааа сссссаЬссс ССсГасссса аадассасас дЬддасаада седсасаасс дсГссаддад ссдааесддс садседСссс дсаасессдд Гддасаадас Ьддсаддасс ддассссСда есаасгддьа адГСсаасад асддсаадда ссаЬсЬссаа дддаддадаЬ дсдасаСсдс сс.сссае,дсь дсаддеддса асгасасдса сассЕссдад дасддЪдгсд асадссссса сасссадасс адССдадсдс дссадЕсГЬс ддЕсасдОдс сдхддасддс сасдЫссдГ дСасаадГдс аассаааддд дассаадаас сдеддадедд ддасГссдас дсаддддаас даададссЬс
120
180
240
300
360
420
480
640
600 €60
720
7В0
840
900
960
978 <210» 28 <211» 326 <212> белок <213» Ното варЕепв <400» 28
А1а 1 Зег ТЬг Ьув С1у 5 Рго Зег Уа1 РЬе Рго 10 Ьеи А1а рго сув Зег 15 Агд
5ег ТЬг Зег 01и 20 зег ТЬг А1а А1а Ьеи 25 □1у Сув Ьеи Уа1 Ьув 30 Аар Туг
РЬе Рго 31и 35 Рго Уа1 ТЬг Уа1 Зег 40 Тгр Аян Зег <31у А1а 45 Ьеи ТЬг Зег
<Э1у ¥а1 50 Н1з ТЫ РЬе Рго А1а 55 Уа1 ьеи С1П Зег зег 60 С1у Ьеи Туг Зег
- 55 012079
Ьей 5ег 65 Зег Уа1 Уа1 ТЫ 70 Уа1 рго Зег Зег АВП 75 РЪе С1у ТЙГ αΐη Тйг 80
Туг ТЪг Сув Аап Уа1 Азр Н18 Був Рго Зег Ляп ТЫ Буа Уа1 Аар Був
35 90 95
ТЪг Уа1 □1и Агд Був Су в Сун Уа1 □1и С/в Рго рго Суа Рго А1а Рго
100 105 110
Рго Уа1 А1а С1у Рго Зег Уа1 рЬе Беи РЪе Рго Рго Був Рго Був Авр
115 120 125
ТЪг Ьей Мек: 11е Зег Агд ТЪг Рго 31и Уа1 ТЪг Сув Уа1 Уа1 Уа1 Авр
130 135 14 0
Уа1 Зег Н1В 01и Авр Рго 31и Уа1 <31п РЪе Аап Тгр Туг Уа1 Аар 01у
145 150 155 160
Уа1 С1и Уа1 ΗΪ8 Азп А1а Був ТЪг Буз Рго Агд <31 и С1и С1п РЪе А8П
165 170 175
Зег ты РЪе Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Беи ТЪг Уа1 Уа1 Н1б 01п Аар тгр
160 185 190
Ъеи Да η 01у Ьуз □1и Туг Буе Суз БуВ Уа1 Зег АзП Був С1у Беи Рго
195 200 205
А1а Рго Не С1и Буя ТЫ 11е Зег Був ТЪг Буе □1у <31 п Рго Агд С1и
210 215 220
Рго 01л Уа1 Тут ТЪг Ьей Рго Рго Зег Агд О1и □1и Мек: ТЙГ Буе Ляп
225 230 235 240
<31п Уа1 Зег Ьей ТЫ Суз Беи Уа1 Буя □1у РЪе Туг Рго Зег Аар 11е
245 250 255
А1а Уа1 31ч Тгр С1и 56Г АбП 31у О1п РГО С1и Аап Аап ТУГ Ьуз ТЪг
260 205 270
ТЪг Рго Рго Мей Ъеи Авр Зег Авр 31у Зег РЪе РЪе Беи Туг Зег Був
275 200 2Θ5
Ъеи Ткг Уа1 Авр Ьуз зег Агд Тгр <31 η 31п О1у Аап Уа1 РЪе Зег Сув
290 295 300
Зег Уа1 Меь Н1в С1и А1а Беи ΗΪΒ Авп Н1в Туг ТЪг С1п Був Зег Ьей
305 310 315 320
Зег Ъеи бег Рго О1у Був
<210> 29 <211> 296 <212> ДНК <213> Нота ааркепа
325
- 56 012079 <400> 29 саддедсадс сддеддадес едддддаддс ССддСсаадо сСддадддес сссдадасСс 60 осседСдсад сссссддасс сасссссадс дасСассаса едадссддаС ссдссаддсо. 120 ссадддаадд ддссддадсд ддсеесаеао ассадеадеа доддеадсас саоасасеас 180 дсадасЪсЪд едаадддссд аССсассаЬс Сссадддаса асдссаадаа сссасСдОаЬ 240 седсааасда асадсседад адссдаддас асддссдСдС аССасСдедс дадада 296 <210> 30 <211> 98 <212> Белок <213> Ното зарХепз <400> 30
С1п Уа1 αΐη Ьеи Уа1 С1и вег О1у (31у С1у Ьеи Уа1 ьув Рго <51у <з1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи вег суа А1а А1а вег □1у РЬе ТЫ РЬе Зег Авр Туг
20 25 30
Туг МеЬ вег Тгр Пэ Агд С1л А1а Рго 01у Ьув О1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
вег Туг Не вег вег вег <31у Зег ТЬг Не Туг Туг АЛ а Авр Зег 7а1
50 55 60
Ьув <31у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Авр Азп Айа Ьув Авп вег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи αΐη Мес Аап вег Ьеи Агд А1а <31и Аер ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Сув
85 90 95
А1а Агд <210> 31 <211> 298 <212> ДНК <213* Ното аар1еп0 <400* 31 даддьдсадс СсссдЪдсад ссадддаадд дсадасСссд ссдсааасда едсьддадсс ссГссддаее ддседдадСд Сдаадддссд асадсседад
Ьдддддаддс сассСССадс ддесСсадсе деСсасеаес адссдаддас ееддСасадс адсеасдсса аееадОддеа ессададаса асддсодсае сСддддддес сдадссдддс дьддеддьад аОсссаадаа аесассдедс сседадасСс ссдссаддсС сасасасСас сасдсСдСаС. дааада
120
180
240
296 <210> 32 <211> 98 <212> Белок <213> Ното эарЛепз <400> 32
О1и Уа1 <31п ьеи Ьеи 01 и Зег й1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у <31у 15 10 15
- 57 012079
Зег Ьеи Агд Ьеи 20 Зег Суз А1а А1а Зег 25 С1у РЬе ТЬг РЬе Зег 30 Зег Туг
А1а Мек Зег 35 Тгр ν«ι Агд αΐη А1а 40 Рго О1у Ьуз О1у Ьеи 45 С1и Тгр 7а1
Зег А1а 50 Не Зег 31у Зег С1у 55 в1у Зег ТЬг Туг Туг 60 А 1а Авр Зег Уа1
Ьуз 65 О1у Агд РЬе ТНг 11е 70 Зег Агд Аар Азп Зег 75 Ьуз Азп ТЬг Ьеи туг 90
Ьеи 01 η Мек Авп Зег Ьеи Агд А1а С1и Аар ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Сув
ВБ 90 95
А1а Ьув <210> 03 <Щ> 296 <212> ДНК <213 > Нолю вархепв <400> 33 саддьдсадс кдсаддадкс дддсссадда скддгдаадс сгссддддас сскдСссскс6о ааскдсдскд кскскддкдд скссаксадс адьадкааск ддкддадккд ддсссдссад120 сссссаддда аддддскдда дкддаккддд дааакскакс акадкдддад сассааскас180 аасссдьесс Есаададксд адксассака ксадСадаса адкссаадаа ссадсксксс240 скдаадсЬда дсксрдсдае сдесдсддас асддссдкдк аккассдкдс дадада296 <210> 34 <211» 98 <212> Белок <213> Ното вараепа <400* 34
С1п Уа1 1 О1п Ьеи О1п 5 (Пи Зег <31у Рго С1у 10 Ьеи Уа1 Ьув Рго Зег 15 (Иу
тьг Ьеи зег Ьеи ТНг Суз А 1а Уа1 Зег О1у 01у зег Не Зег Зег Зег
20 25 30
Аап Тгр Тгр Зег Тгр ν<1 Агд 01п Рго Рго 01у Ьуз О1у Ьеи С1и Тгр
35 40 45
Не <31у С1и 11е Туг ΗΪΘ Зег <31у Зег ТЬг Азп Туг АВП Рго Зег Ьеи
50 55 60
Ьув Зег Агд Уа1 ТНг 11е Зег Уа1 Авр Ьуз Зег Ьуз Азп О1 п РЬе Зег
65 70 75 ВО
Ьеи Ьуз Ьеи Зет Зег 7а1 ТНг А1а А1а Азр ТНг А1а Уа1 Туг туг Сув
85 эо 95
А1а Агд
- 58 012079 <21Й> 35 <211> 293 <212> ДНК <213 > Ното Ββρίβηβ <400> 35
Саддйдсаде СдсаддадСС дддсссадда ССддСдаадс сЫсддадас сссдйсссйс€0 асссдсаыд йсйсъддйдд ссссабсаде адееасйаы ддадсьддаь ссддсадссс120 ссадддаадд даЫддадсд даЫдддсай айсЫЫаса дьдддадсас саасйасаас180 сссСсссеса ададъсдадс сассабайса дйадасасдй ссаадаасса дЫЫсссйд240 аадссдадсс ссдсдассдс сдсддасасд дссдсдйаы ассдедсдад ада293 <210* 36 <211» 97 <212» Белок <213» Ното варбепа <400» 36
С1л Уа1 1 С1п Ьеи 31в 5 С1и Зег О1у Рго (31у 10 Ьеи Уа1 Ьуя Рго Зег 15 С1и
ТЫ Ьеи Зег Ьеи ТЫ Сув ТЫ Уа1 Зег С1у О1у Зег Не Зег Зег Туг
20 25 30
Туг Тгр Зег Тгр Не Агд 31л Рго рго С1у Ьув 01у Ьеи <31и Тгр Не
35 40 45
С1у Туг Не Туг Туг Зег С1у Зег ТЫ Аял' Туг Αβη Рго Зег Ьеи Ьув
50 55 60
бег Агд уа1 ТЫ Не Зег Уа1 Авр ТЬг Зег Ьуз Лап С1п РЬе Зег Ьеи
65 70 75 80
Ьув Ьеи Зег Зег Уа1 ТЫ А1а А1а Авр ТЫ А1а Уа1 Туг Туг Сув А1а
85 90 95
Агд <210» 37 <211> 290 <212» ДНК <213» Ното ββρίβηβ <400» 37 даааййдйдс йдасдсадсс сссаддсасс сйдсссьедс сйссадддда аададссасс 60 сбсбссйдса дддссадйса дадйдсбадс адсадсйасй йадсссддйа ссадсадааа 120 ссйддссадд сйсссаддсЕ ссьсайсйай ддйдсайсса дсадддссас йддсайссса 190 дасаддййса дйддсадйдд дйосдддаса дасййсасйс йсассайсад садасбддад 240 ссйдаадаЫ Ыдсадйдга ййассдссад садеайддса дсссассбсс 290 <21о> за <211> 96 <212 > Белок <213 > Ното вар1епв
- 59 012079 <400? 38
31и Не 1 νβΐ Ьеи ТЬг 5 С1п Зег Рго б1у ТЬг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 01у
10 15
□1и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Сув Агд А1а Зег 61с зег νβΐ Зег Зег Зег
20 25 30
Туг Ьеи А1а Тгр Туг О1п αΐη Ьуз Рго 61у αΐη А1а Рго Агд Ьеи Ьеи
35 40 45
Г1е Туг □1у А1а зег Зег Агд А1а ТЬг □1у Не Рго Авр Агд РЬе Зег
50 55 60
□1у Зег □1у зег О1у ТЬГ Авр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Агд Ьеи С1и
65 70 75 80
Рго С1и Аар РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суя С1п С1п Туг С1у Зег Зег Рго
85 90 95
<210? 39 <2Ш 238 <212> ДНК <213 > Ното вар!епв <220>
<221? модифицированное основание <222> (288) <223? а, с, ζ д, другое или неизвестное <400? 39 дасаСссада ЕдасссадСс ЕссаЕссСсс сЕдЕсСдсаЕ сЕдСаддада сададЕсасс 60 аЕсасЕЕдсс дддсаадьса дддсаЕЕада ааЕдаЕЕЕад дсЕддЕаЕса дсадааасса 120 дддааадссс сЕаадсдссЕ даЕсЕаЕдсЕ дсасссадЕЕ ЕдсааадЕдд ддЕсссаЕса 180 аддЕЕсадсд дсадЕддаЕс Едддасадаа ессасЕсЕса сааЕсадсад ссЕдсадссЕ 240 даадаЕЕЕЕд саасЕЕаЕЕа сЕдЕСЕасад саЕааЕадЕЕ асссЕссп 288 <210> 40 <211> 96 <212> Белок <213> Ното вар1еле <400> 40
Авр 1 Не αΐη МеЕ ТЬг С1» 5 Зег Рго Зег Вег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 О1у
10 15
Авр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суя Агд А1а Зег Ολη 61у Не Агд Азл Авр
20 25 30
Ьеи О1у Тгр Туг С1п αΐη Ьув Рго О1у Ьув А1а Рго Ьув Агд Ьеи Не
35 40 45
Тут А1а А1а Зег Зег ьеи <31п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг с1и РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
- 60 012079
01и Аар РНе А1а ТЬг Туг Туг сув Ьеи С1п Ηίβ Ави Зег Туг Рго Рго
90 95 <210> 41 <211> 286 <212> ДНК <213> Ното дарХепя <400> 41 дасакссада кдасссадкс кссасссксс ссдкссдсас ссдкаддада сададксасс 60 аксасЫдсс дддсаадНса дадсаЫадс адскаснеаа аккддкакса дсадааасса 120 дддааадссс скаадсксск дасссандск дсакссадск сдсааадсдд ддссссакса 180 аддк-ксадкд дсадкддакс кдддасадак кксаскскса ссаксадсад ьскдсаасск 240 даадаккСкд саасссасса скдксаасад адккасадса сссскссН 288 <210> 42 <211> 96 <212> Белок <213> Ното яардепв <4ОО> 42
Авр 11е 1 □1п Мек ТЫ 5 <31п Зег РГО Зег Зег 10 Ьеи Зег А1а Зег Уа1 15 О1у
Аар Агд ν*ι ТЬг Не ТЬг Сув Агд А1а Зег 01п Зег Не Зег Зег Туг
20 25 30
Ьеи Ав П Тгр Туг О1л <зт Ьуа Рго О1у Ьув А1а РГО Ьуе Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у 7а1 Рго Зег Агд РЬе Зег О1у
50 55 60
Зег 01у зег <з1у ТЬГ Авр РНе ТЫ Ьеи ТЫ Не Зег Зег Ьеи 31П РГО
65 70 75 80
<31 и Аар РНе А1а ТЬг Туг Туг Сув <31п αΐη Зег Туг Зег ТЫ ₽го Рго
85 90 95
<210> 43 <211> 293 <212> ДНК <213> Ното 8ар1елв <400> 43 саддкдсадс асскдсаскд деедддаадд ссскссскса аадскдадск кдеаддадке кскскддкдд даскддадкд ададкедадк скдндассдс дддессадда скссаксадк даккдддсдЪ сассакдсса сдсддасасд скддкдаадс адкЬаскаск акскакасса дкадасасдк. дссдндкаЬЪ еккеддадао ддадссддас дкдддадсас сеаадаасса аскдЬдсдад ссндкссскс ссддсадссс сааскасаас дкксксССкд ада
120
180
240
93 <210 44 <211> 97
- 61 012079 <212> Белок <213> Ното ·*ρίβηβ <400> 44
Ил 1 ν*1 □1л Ьеи С1п 5 □1и Зег С1у Рго (31у 10 Ьеи УаХ Ьув Рго Зег 15 □Хи
ТЬг Ьеи Зег Ьеи ТЬг Сув ТЬг Уа1 Вег О1у С1у Зег 11е Зег Зег Туг
20 25 30
Туг Тгр Зег ТГр Не Агд □1л РГО А1а О1у Ьув □1у Ьеи С1и ТГр 11е
35 40 45
С1у Агд Пе Туг ТЬг зег □Ху зег ТЬг Аал Туг АЗП Рго Зег Ьеи Ьув
50 55 60
Зег Агд Уа1 ТЬг МеЕ Зег Уа1 Аар ТЬг Зег Ьув АЗП □1п РЬе Зег Ьеи
65 70 75 во
Ьун Ьеи Зег 5ег Уа1 ТЬг А1а А1а Авр ТЬг АХ а УаХ Туг Туг Суа А1а
В5 90 95
Агд <210> 45 <211> 470 <212> Белок <213> Ното вартепз <400> 45
МеЕ О1и 1 РЬе <31у Ьеи 5ег Тгр ьеи РЬе Ьеи Уа1 А1а 11е Ьеи Ьув 15 О1у
5 10
ν»Χ □1п Суа С1и УаХ 01п Ьеи Ьеи □1и Зег СХу О1у О1у Ьеи Уа1 С1п
20 25 30
Рго □Ху аху Зег Ьеи Агд Ьеи Зег суа ТЫ А1а Зег □1у РЬе ТЬг РЬе
35 40 45
Зег Зег Туг АХа МеЕ Аеп Тгр νβΐ Агд С1П А1а Рго О1у Ьув □1у Ьеи
50 55 60
С1и Тгр Уа1 Зег А1а Не зег О1у зег С1у О1у ТЬг ТЫ РЬе Туг А1а
65 70 75 во
Авр Зег Уа1 Ьуа О1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Авр Авп Зег Агд ТЬг
35 90 95
ТЬг Ьеи Туг Ьеи ОХп МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а □ Хи Авр ТЬг А1а УаХ
100 105 но
Туг Туг Су в А1а ьув АВр Ьеи □Ху Тгр Зег Авр зег Туг туг Туг Туг
115 120 125
Туг □ Ху МеЕ Аяр Уа1 Тгр С1у □1л <31у ТЬг ТЫ Уа1 ТЬг УаХ Зег Зег
130 135 140
- 62 012079
А1а 145 Зег ТЬг Ьув <31У Рго 150 Зег νβΐ РЬе РГО Ьеи А1а 155 ₽х*о Сув Зег Агд 160
Зег ТЬг 5« Г С1и Зег ТЬг А1а А1а Ьеи С1у Сув Ьеи 7а1 Ьув Авр туг
165 170 175
РЬе Рго О1и РГО νιΐ ТЬг Уа1 Зег Тгр АВИ Зег □1у А1а Ьеи ТЬг Зег
130 185 190
С1у Уа1 Ηίβ ТЬг РЬе Рго А1а Уа1 Ьеи 31П Зег Зег 01у Ьеи Туг зег
195 200 205
Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТЬг 7а1 ₽го Зег зег Ави РЬе 01у ТНг 31П ТЬг
210 215 220
Туг ТЬг Сув Аз η Уа1 Авр ΗΪΒ Ьув Рго Зег Авп ТЬг Ьув Уа1 Аяр Ьув
225 230 235 240
ТЬг Уа1 С1и Агд Ьуя Суз Сув Уа1 С1и Сув Рго Рго Сув Рго А1а Рго
245 250 255
РГО Уа1 А1а 01у РГО Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьув РГО Ьув Аар
260 265 270
ТЬг Ьеи МеЕ 11е Зег Агд ТЬг Рго 01 и Уа1 ТЬг Сув Уа1 Уа1 Уа1 Авр
275 200 285
Уа1 Зег Ηχβ С1и Авр Рго 01и Уа1 01п РЬе Авп Тгр Тут Уа1 Авр σι у
290 295 300
Уа1 <31 и ν»ι ΗΪΒ А Я Г. А1а Ьув ТЬг Ьув Рго Агд <з1и С1и С1п РЬе Авп
305 310 315 320
5ег ТЬг РЬе Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 VII Н1в <5113 Авр Тгр
325 330 335
Ьеи Ав η О1у ьув □1и Туг Ьув Сув Ьув Уа1 Зег Авп Ьув <31у Ьеи РГО
340 345 350
А1а Рго Не С1и Ьув ТЬг 11е Зег Ьув ТЬг Ьув О1у αΐη Рго Агд <31и.
355 360 365
Рго С1п 7а1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго зег Агд С1и <31и МеЕ ТЬг Ьув Авп
370 3 75 380
01п νβΐ Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьув С1у РЬе Туг Рго Зег Авр Не
385 390 395 400
А1а ν&1 01 и Тгр □1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и Авп Авп Туг Ьув ТЬг
405 410 415
ТЬг Рго Рго МеЕ Ьеи Айр Зег Авр О1у зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьув
420 425 430
Ьеи тНг Уа! Авр Ьув Зег Агд Тгр С1п С1п С1у АВП Уа1 РЬе Зег Сув
435 440 445
- 63 012079
Зег 7а1 МеС 450 ΗΪΒ Рго (Ни А1а Ьеи Н1в Авп Н1в Туг ТЬг С1П Ьув Зег Ьеи
С1у 455 Ьув 470 460
Зег 435 Ьеи Зег
<210> 46
<211> 470
<212? Белок
<213> Ното 1 варгепа
<400> 46
Мее (Ни РНе С1у Ьеи Зег Тгр Ьеи РЬе Ьеи νβΐ А1а Не Ьеи Ьув □1у
1 5 10 15
Уа1 С1п Суа О1и νβΐ С1п Ьеи Ьеи (Ни Зег 01у О1у (Ну Ьеи Уа1 σΐη
20 25 30
Рго □1у С1у Зег Ьеи АГд Ьеи Зег Сув А1а А1а Зег О1у РЬе ТЬг РЬе
35 40 45
Зег Зег Туг Д1а мес Зег Тгр νβΐ Агд С1п А1а Рго С1у Ьув О1у Ьеи
50 55 60
<31и Тгр Уа1 Зег А1а Не Зег С1у Зег □1у □1у Зег ТЫ Туг Туг А1а
65 70 75 80
Дер Зег Уа1 Ьув О1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Авр АВП Зег Ьув Авп
85 90 95
ТЬг Ьеи Туг Ьеи 01П МеС АВП Зег Ьеи Агд А1а (Ни Авр ТЬг А1а Уа1
100 105 НО
туг туг Суа А1а Ьув С1у Туг Зег Зег 01у Тгр Туг Туг Тут Туг Туг
115 120 125
Туг О1у Мес Авр Уа1 Тгр 01у 01п 01у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг ν<1 Зег Зег
13 0 135 140
А1а Зег ТЬг Ьув 01у Рго Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а РГО Сув Зег Агд
145 150 155 160
Зег ТЬг Зег (Пи Зег ТЬг А1а А1а Ьеи С1у Сув Ьеи Уа1 Ьув Авр Туг
165 17 0 175
РЬе Рго □1и Рго ν«1 ТЬс νβΐ Зег Тгр Авп зет С1у А1а Ьеи ТЬг Зег
180 135 190
С1у Уа1 Н18 ТЬг РЬе Рго А1а Уа1 Ьеи С1П Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег
195 200 205
Ьеи Зег Зег Уа! Уа1 ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Авп РЬе С1у ТЬг С1П ТЬг
210 215 220
Туг ТЫ Сув Авп Уа1 Авр ΗΪΒ Ьув Рго Зег Аап ТЬг ьув Уа1 Авр Ьув
225 230 235 24 0
- 64 012079
ТЬг Уа1 О1и Агд Ьув 245 Сув Сув Уа1 С1и Сув Рго Рго Сув Рго А1а Рго
250 255
Рго Уа1 А1а 01у Рго Зег νβΐ РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьув Рго Ьув Аар
260 265 270
ТЫ Ьеи нее Не Зег Агд ТЬг Рго <31и Уа1 ты Сув Уа1 Уа1 Уа1 Авр
275 280 285
Уа1 Зег ΗΪ8 □1и Авр Рго С1и Уа1 61п РЬе АяП Тгр Туг Уа1 Авр □1у
290 295 300
ν<ι □1и уа! Яба Аеп А1а Ьув ть.г Ьув Рго Агд С1и Э1и С1п РЬе Авп
305 310 315 320
Зег ТЬг РЬе Агд уа! ν»1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа! Уа1 ΗΪ8 □1п Авр Тгр
325 ззо 335
Ьеи Аеп □1у Ьув □1и Туг Ьув Сув Ьув Уа1 Зег Аап Ьув (31у Ьеи Рго
340 345 350
А1а Рго Не С1и Ьув ТЬг Не Зег Ьув ты Ьув О1у αΐη Рго Агд С1и
355 360 365
Рго О1П Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд С1и (31и мее ТЬг Ьув Авп
370 375 380
□Ιη Уа1 Зег ьеи ТЬг сув Ьеи Уа1 Ьув 01у РЬе Туг РГО Зег Лер Пе
385 390 395 400
А1а ν»1 □1и Тгр □1и Зег Аеп 01у (31п Рго СЭ1и Аап АВИ Туг Ьув ТЬГ
405 410 415
ТЬг Рго Рго Мее Ьеи Аар Зег Аар □ 1у Зег РЬе РЬе Ьеи туг Зег Ьув
420 425 430
Ьеи ТЫ Уа1 Авр Ьув Зег Агд Тгр С1п □1д О1у Аеп Уа1 РЬе Зег Суз
435 440 445
Зег Уа1 мее ΚΪ0 □1и А1а Ьеи Н1в Аеп ИХ в Туг ТЫ С1п Ьуя Зег Ьеи
450 455 460
Зег Ьеи Бег РГО □1у Ьув
465 470 <210> 47 <211> 236 <212? Белок <213? Ното вархепя <400? 47
Мее 1 Аар Мес Агд Уа1 5 Рго А1а Сбп Ьеи Ьеи 10 01у Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи 15 Тгр
РЬе Рго 01у Аба Агд Сув Авр 11е αΐη МеС ТЬг О1п РЬе Рго Зег Зег
25 30
- 65 012079
ьеи Зег А1а 35 Зег Уа1 С1у Авр Агд Уа1 ТЬг Не ТЫ Сув Агд А1а Зег
40 45
С1п О1у Не Агд АвП Аар Ьеи О1у Тгр Туг 01л 01п Ьув РГО 01 у Ьув
50 55 60
А1а Рго Ьув Агд Ьеи Не Туг А1а А 1а Зег Агд Ьеи Ηίβ Агд О1у Уа1
65 70 75 ВО
Рго Зег Агд РЬе Зег <31у Зег 01у Зег С1у ТЫ О1и РЬе ТНг Ьеи ТЬг
85 90 95
11е Зег Зег Ьеи 01п Рго О1и Аар РЬе А1а ты Туг туг сув Ьеи <51п
100 105 но
Ηίβ АВП Зег Туг Рго Сув Зег РЬе О1у О1п 01у ТЫ ьув Ьеи С1и Не
115 12 0 125
Ьув Агд ТЬг Уа1 А1а А1а рго Зег Уа1 РЬе Не РЬе Рго Рго Зег Авр
130 135 140
01 и О1п Ьец Ьув Зег О1у ТЫ А1а Зег Уа1 Уа1 Сув Ьеи Ьеи Авп Авп
14 5 150 155 160
РЬе Туг Рго Агд 01и А1а Ьув Уа1 С1п Тгр Ьуа Уа1 Авр Авп А1а Ьеи
155 170 175
Й1п Зег 01у Авп Зег О1п С1и Зег Уа1 ТЫ О1и О1п Авр Зег ьув Авр
100 105 190
Зег ТЪг Туг Зег Ьеи Зег Зег ТЫ Ьеи ТЫ Ьеи Зег Ьув А1а Авр Туг
195 200 205
С1и Ьув ΗΪ0 Ьув Уа1 Туг А1а Сув С1и Уа1 ТЬг Н1я О1п С1у Ьеи Зег
210 215 220
Зег Рго Уа1 ТЫ Ьув Зег РЬе Авп Агд 01у С1и Сув
225 230 235 <210> 40 <211> 236 <212> Белок <213 > Ното вар1епв <400> 40
МеЕ Авр Мес Агд Уа1 Рго А1а 01п Ьеи Ьеи 01у Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Тгр
1 5 10 15
РЬе Рго С1у А1а Агд сув Авр 11е <31п Мег ТЬг С1П Зег РГО зег Зег
20 25 30
Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у Авр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Сув Агд А1а Зег
35 40 45
С1П С1у Не Агд Авп Авр Ьеи С1у Тгр Туг С1п □1п ьув Рго С1у Ьув
55 60
- 66 012079
А1а Рго Ьув Агд Ьеи 11е Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи 75 С1п Зег С1у Уа1 80
65 70
Рго Зег Агд РЬе Зег С1у Зег □1у Зег О1у ТЬг (31и РЬе ТЬг Ьеи ТЬг
85 90 95
Не Зег зет Ьеи С1п Рго 31 и Авр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Сун Ьеи αΐη
100 105 110
Н1а АЯН Зег Туг РГО Туг ТЬг РЬе 31у αΐη □ 1у ТЫ Ьув Ьеи □1и Не
115 120 125
Ьув Агд ТЬг ν«1 А1< А1а РгО Зет Уа1 РЬе 11е РЬе РГО РГО Зег Аар
130 135 140
□1и О1п Ьеи Ьуа Зег О1у ТЬг А1а Зег Уа1 Уа1 Сув Ьеи ьеи Авп Авп
14 5 150 155 130
РЬе Туг Рго Агд □1и А1а Ьув ν*1 С1п Тгр Ьув Уа1 Авр Авп А1а Ьеи
155 170 175
С1П Зег С1у Азп Зег С1п С1и Зег Уа1 ТЬг О1и С1п Авр Зег ьув Авр
180 185 190
5ег ТЬг Туг Зег Ьеи Зег Зег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьув А1а Авр Туг
195 200 205
01и Ьув Н1з Ьув ν*ι Туг А1а Суе С1и Уа1 ТЬг Н1а αΐη О1у Ьеи Зег
210 215 220
Зег Рго Уа1 ТЬг Ьув Зег РЬе Ав η Агд С1у С1и Суй
225 230 235
<21Э> 49 <211> 470 <212> Белок <213> Иото вар1епв <400> 49
МеС С1и 1 РЬе 01у Ьеи 5 Зег Тгр ν*ι РЬе Ьеи 10 ν<ι А1а ’1е Не Ьув 15 С1у
Уа1 О1П Сув О1п А1а αΐη Ьеи Уа1 31и Зег С1у С1у С1у Ьеи 7а1 Ьув
20 35 30
Рго О1у 01 у Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Сув А1а А1а Зег 31у РЬе ТЬг РЬе
35 40 45
Зег Авр Туг Туг МеС Зег Тгр Х1е Агд О1п А1а Рго □1у ьув <Ну Ьеи
50 55 60
С1и Тгр Уа1 Зег Туг Не Зег Зег Зег С1у Зег ТЬг Агд Аср Туг А1а
65 70 75 80
Авр Зег V»! Ьув С31у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Авр АВП А1а Ьув Авл
85 90 95
- 67 012079
Зег Ьеи Туг Ьеи О1п Мее Авп Зег Ьеи Агд 105 А1а 01и Авр ты но А1а Уа1
100
Туг Туг Сув ν«1 Агд Азр С1у νβΐ О1и ТЬг ТЬг РЬе тут Тут туг Туг
115 12 0 135
Туг С1у Мее Авр ν*1 Тгр 31у 01 п <31у ТЬг ТЫ ν«1 ТЬг Уа1 Зег Зег
130 135 140
А1а Зег ТЬг Ьуз <31у Рго Зег V»! РЬе РГО Ьеи А1а Рго Сув Зег Агд
145 150 155 160
Зег ТЬг Зег С1и Зег ТЬг А1а А1а Ьеи О1у Сув Ьеи νβΐ Ьув Авр Туг
165 170 175
РЬе Рго □1и Рго νβΐ ТЫ Уа1 Зег Тгр Авп Зег С1у А1а Ьеи ТЬг Зет
180 185 190
С1у Ча! Н1в ТЬг РЬе Рто А1а Уа1 Ьеи С1п Зег Зег С1у ьеи Туг Зег
195 200 205
Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТЫ Уа1 Рго Зег Зег Авп РЬе С1у ТЫ αΐη ТЫ
210 215 220
Туг ТЫ Суз АвП ν»ι Авр Н1в Ьув Рго Зег Аап ТЬг Ьув Уа1 Авр Ьув
225 33 0 235 24 0
ТЬг ν&ι <31и Агд Ьув Сув Сув νδΐ С1и Сув Рго Рго Сув Рго А1а Рго
245 250 255
Рго ν®ι А1а О1у Рго зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьув РГО Ьув Авр
260 265 270
ТЬг Ьеи Мее 11е Зег Агд ТЬг Рго <31и Уа1 ТЬг Суз Уа1 уа1 ν·ι Авр
275 280 285
νβΐ Зег Нгв <31и Авр Рго □1и ν*ι 31п РЬе Авп Тгр Туг Уа1 Авр С1у
290 295 300
Уа1 <Э1и Уа1 Н1в Авп А1В Ьув ТЬг Ьув Рго Агд <31и □1и О1п РЬе Авп
305 310 315 320
Зег ТЬг РЬе Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЫ Уа1 νβΐ ΗΪ6 СЗп Авр Тгр
325 330 335
Ьеи Авп С1у Ьув (31и Туг Ьув Сув Ьув Уа1 Зег ΑβΠ Ьув С1у Ьеи РГО
340 345 350
А1а Рго Пе С1и Ьув ТЫ 11е Зег ьув ты Ьув (31у С1п РГО Агд О1и
355 360 365
Рго С1п V»! Тук ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд <31и С1и нее ТЬг Ьув Авп
370 375 380
С1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи νβΐ Ьув □1у РЬе Туг РГО Зег Авр Не
385 390 395 400
- 68 012079
А1а Уа1 О1и Тгр 61и 405 Зег Аап О1у 01п РГО 410 □1и Аап Аап туг Ъув 415 ТЪг
Тйг Рго Рго МеС 420 Ъеи Аар Зег Аар О1у 4 25 Зег Рйе РЪе Ъеи Туг 430 Зег Ъув
Ъеи Тйг Уа1 435 Аар ъув Зег Агд тгр 440 01л О1п О1у Аап Уа1 445 РЪе Зег Сув
Вег Уа1 450 МеС Н1а <31и А1а ъеи 455 Н1в Авп Н1з Туг ТЙГ 460 С1п Ьув Зег Ъеи
Зег Ъеи Зег Рго О1у Ъуя
465 470 <210> 50 <211> 473 <212> Белок <213 > Ното ва₽1йп0 <400> 50
МеС (Ни РКе О1у Ъеи Зет Тгр Уа1 РЪе Ъеи Уа1 А1а Не Не Ъув О1у
1 5 10 15
Уа1 О1п Сув <31п Уа1 О1п Ъеи Уа1 О1и Зег <31у О1у 01у Ъеи Уа1 Ъув
20 25 30
РГО С1 у О1у Зег Ъеи Агд Ъеи Зег Суя А} а А1а Зег 01 у Рйе ТЪг РЪе
35 40 45
Зег Авр Тут Тут Мес Зег Тгр Не Агд О1п А1а Рго С1у Ъув С1у Ъеи
50 55 60
С1и ТГР Уа1 Зег Туг Не Зег Зег Зег 01у Зег ТЪг Не Тут Туг А1а
65 70 75 80
Аар Зег Уа1 Ъув О1у Агд РЪе ТЪг Не Зег Агд Аар Авп А1а ъув Авп
85 90 95
вег Ъеи Туг Ъеи С1П МеС Авп Зег Ъеи Агд А1а О1и Авр ТЙГ А1а Уа1
100 105 110
Туг Туг Сув А1а Агд νβΐ ъеи Агд РЪе Ъеи С1и Тгр ъеи Ъеи туг Туг
115 120 125
туг Туг Туг Туг О1у МеС Авр Уа1 Тгр 01у ОЬп С1у ТЙГ ТЙГ Уа1 Тйг
130 135 140
Уа1 Зет Зег А1а Зег ТЙГ Ъув О1у Рго Зег ν»ι РЪе Рго Ъеи А1а Рго
145 150 155 160
Суя Зет Агд Зег ТЪг Зег С1и Зег Тйг А1а А1а Ъеи О1у Суз Ъеи 17а 1
165 170 175
Ьуя Авр Туг РЬе Рго О1и РГО Уа1 Тйг Уа1 Бег тгр Авп Зег 01у А1а
180 185 190
- 69 012079
Ьеи ТЬг Зег С1у V»! Ηίο ТЬг РЬе 200 Рго А1а 7а1 ьеи αΐη 205 Зег Зег 01У
195
Ьеи Туг зет Ьеи зег Зег Уа1 Уа1 ты ν<ι Рго Зег Зег Азп РЬе С1у
210 215 220
ты βΐη ТЫ Туг ты Суз Авп ν«1 Авр Н1в Ьуз Рго зег Авп ТЬг Ьув
225 230 235 240
Ча1 Авр Ьув ты ν»1 <31и Агд Ьув Сув Сув Уа1 С1и Сув Рго Рго Сув
245 250 255
РГО А1а Рго Рго Уа1 А1а (Пу ₽ГО Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз
260 265 270
Рго Ьув Азр ТЫ Ьеи Меи Не Зег Агд ТЫ Рго □1и ναΐ ТЫ Суз Уа1
275 2Θ0 285
Уа1 να! Авр νβΐ Зег Ηίβ (Пи Авр Рго (Пи Уа1 С1п РЬе Авп Тгр Туг
290 295 300
ν*1 Авр □ 1у Уа1 О1и Уа1 Ηίβ Авп А1а Ьув ТЫ Ьув Рго Агд (31 и (31 и
305 310 315 320
αΐη РЬе Авп Зег ГЫ РЬе Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТНг Уа1 Уа1 Ηίβ
325 330 335
(31η Авр Тгр Ьеи Авп £31у Ьуз □1и Тут ьуз суз ьув Уа1 Зег Авп Ьув
340 34 5 350
<Э1у Ьеи Рго А1а Рго 11е С1и Ьув ТЫ Не Зег Ьуз ТЬг Ьув О1у С1п
355 330 365
Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЫ Ьеи Рго Рго Зег Агд С1и <Э1и Мек
370 375 380
ТНг Ьув Авп αΐη Уа1 Зег Ьеи ТЫ Суз Ьеи Уа1 Ьув О1у РЬе Туг Рго
ЗВ5 390 395 400
Зег Авр 11е А1а Уа1 <31и Тгр О1ц Зег АВП (Яу □1п Рго 01и Авп Авп
405 410 415
Туг ьув ТЫ ТЫ РГО Рго Мек Ьеи Авр Зег Авр <31у Зег РЬе РЬе Ьеи
420 425 430
Туг Зег Ьув Ьеи ТНг Уа1 Авр Ьув Зег Агд Тгр αΐη С1п С1у АВП Уа1
435 440 445
РЬе Зег Сув Зег ν·ι Мек Н1в С1и А1а Ьеи Н1в Авп Н1В Туг ТЬг αΐη
450 45Ξ 460
Ьув Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго (Пу Ьув
465 470 <210> 51 <211> 236
- 70 012079 <212> Белок <213> Ното аарЛепя <400> 51
МеС 1 Авр МеС Агд ν*ι 5 Рго Айа Сйп Ьеи Ьеи Сйу Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Тгр
10 15
РЬе Рго <31у Айа Агд Сув Авр Не С1п МеС ТЬг Сйп Зег Рго Зег Зег
20 25 30
Ьеи Зег Айа Зег Уай Сйу Авр Агд Уай ТЫ РЬе ТЬг Сув Агд Айа Зег
35 40 45
Сйп Аар 11е Агд Агд Авр Ьеи Сйу Тгр Туг Сйп Сйп Ьув Рго Сйу Ьув
50 55 60
Айа Рго Ьув Агд Ьеи 11е Туг Айа Айа Зег Агд Ьеи Сйп Зег Сйу Уай
65 70 75 80
Рго Зег Агд РЬе Зег Сйу Зег □йу Зег Сйу ТЫ С1и РЬе ТЬг Ьеи ТЬг
35 90 95
11е Зег Зег Ьеи αΐπ Рго айи Авр РЬе Айа ТЬг Туг Туг Сув Ьеи сйп
100 105 Ий
Н10 А8П Авп Туг Рго Агд ТЬг РЬе Сйу Сйп Сйу ТЬг С1и уай 01 и 1йе
115 120 125
11е Агд ТЬг Уа1 А1а Айа Рго Зег Уай РЬе 11е РЬе Рго Рго Зег Авр
130 13 5 140
С1и Сйп Ьеи Ьув Зег Сйу ТЬг Айа Зег Уай Уай Сув Ьеи Ьеи Аап Авп
145 150 155 160
РЬе Туг Рго Агд С1и Айа Ьув Уай Сйп Тгр Ьув уай Авр А9П Айа Ьеи
16 5 170 175
О1п Зег Сйу Авп Зег Сйп айи Зег Уай ТЬг Сйи Сйп Авр Зег Ьув Авр
100 185 190
Зег ТЬг Туг Зег Ьеи Зег Зег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьув Айа Авр туг
195 200 205
<Э1и Ьув Ηίβ Ьуз Уай Туг Айа Сув (31ц Уай ТЬг Н1я Сйп Сйу Ьеи Зег
210 215 220
Зег Рго УЯ1 ТЬг ьув Зег ₽ье АВП Агд С1у С1и Сув
225 230 235
<21С 1> 52
<213 .> 236
<212 !> Белок
<213> Ното варЛепв
<400> 52
МеС Авр МеС Агд Уай Рго Айа Сйп Ьеи Ьеи Сйу Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Тгр
10 15
- 71 012079
РЬе Рго 01у А1а Агд Суе Авр Не αΐη 25 Нес ТЬг С1п Зег Рго 30 Зег Зег
20
Ьеи Зег А1а Зег Уа1 01у Аар Агд νβΐ ТЬг Не ТЬг Сув Агд А1а Зег
35 40 45
□1п С1у Не Агд Авп Авр Ьеи С1у Тгр Туг С1п 01п Ьув Рго С1у Ьув
50 55 60
А1а РГО ьув Агд Ьеи Не туг А1а А1а Зег Зег Ьеи 01п Зег С1у νβΐ
65 70 75 80
Рго Зег Агд РЬе Зег 01у Зег С1у Зег 01у ТЬг (Пи РЬе ТЬг Ьеи ТЫ
85 90 95
Не 5ег Зег Ьеи С1п Рго (31и Авр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Сув Ьеи С1п
100 105 но
Н1в Авп Зег Туг Рго Тгр ТЬг РЬе С1у О1п <Э1у ТЬг Ьув Уа1 С1и Не
115 120 125
Ьув Агд ТЬг Уа1 А1а А1а Рго Зег Ув1 РЬе 11е РЬе Рго Рго Зег Авр
130 13 5 14 0
01и 01п Ьеи Ьув Зег □1у ТЬГ А1а Зет Уа1 Уа1 Сув Ьеи Ьеи Авп Авп
145 150 155 160
РЬе Туг Рго Агд С1и А1а Ьуз Уа1 С1п Тгр Ьув Уа1 Αβρ АВП А1а Ьеи
165 170 175
αΐη Зег О1у Авп Зег <31п □1и Зег Уа1 ТЬг <31и О1п АВр Зег Ьув Авр
180 185 190
Зег ТЬг Туг Зег Ьеи Зег Зег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег ьув А1а Авр Туг
195 200 205
О1и Ьув НЛ0 ьув Уа1 Туг А1а Сув С1и 7а1 ТЬг Н1э С1п С1У Ьеи Зег
210 215 220
Зег Рго Уа1 ТЬг Ьув Зег РЬе Авп Агд О1у 01и Суа
225 230 235
<210> 53 <211> 326 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: консенсусная последовательность <22о>
<221> модифицированное основание <222> (289) <223 > а, с, I, д, другое или неизвестное
- 72 012079 <400» 53 дасабссада бдасссадбу бссабссбсс ссдссбдсаб сйдбаддада сададбсасс 60 месасйСдсс дддсаадбса ддгсаЫада тгбдаЫбад дсйддЬЛса дсадааасса 120 дддааадсус сбаадсдссб дабсбаСдсб дсабсстгьб йгсаттдндд ддйсссаСса 180 аддййсадсд дсадсддасс сдддасадаа ьесасСсйса саабсадстд ссйдсадссб 240 даадаббссд саасссасйа сбдсуйасаг сабааъагбб аусскуЬяпз кббуддсягг 300 дддассгадэ бддагабсаы асдаас 326 <210> 54 <211> 322 <212» ДНК <213 > Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: консенсусная поел едовател ьн ость <400» 54 дасабссада бдасссадпс сссаЬссбсс сгдбсйдсай ебдуаддада сададбсасс60 аСсасййдсс дддсаадбса дадсаббаду авсб*ббЬаа аССддбаСса дсадааасса120 дддааадссс сбаагсбссй дабсуасдуб дсабссадбб бгсаагдбдд ддбсссабса180 аддсссадбд дсадсддабс бдддасадаб сбсасбсйса ссабсадсад бсбдсаассб240 даадабСббд саасббасба сбдбсаасад адббасагбг ссссауусйс ССбсддсдда300 дддассаадд бддадабсаа ас322 <210> 55 <211» 325 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: консенсусная последовательность <220>
<221> модифицированное основание <222> (291) <22 3 > а, с, 1 д, другое или неизвестное <400> 55 дааабйдсдс бдасдсадбс бссаддсасс ссдбсбббдб сйссадддда аададссасс60 сбсбссбдуа дддссадбса дадбдббтдс гдеадябаей ЪадсееддЬа ссадсадааа120 ссбддссадд сссссаддсс ссбсасссас ддсдсассса дсадддссас сддсасссса160 дасаддббса дбддсадбдд дбссдддаса дасббсасбс бсассабсад садассддад240 ссЪдаадайс ббдеадбдбы ееасбдбеад садбабддба дуйсассйся пасдййсддс300 саадддасса аддбддаааб сааас325 <2Ю> 56 <211> 376 <212> ДНК <213 > Искусственная последовательность <220>
<223» Описание искусственной последовательности: консенсусная последовательность
- 73 012079 <400* 56 саддЕдсадс ЕддЕддадЕс Едддддаддс ССддЕсаадс сЕддадддЕс ссЕдадасЕС 60 ЕссЕдСдсад ссЕсЕддаЕЕ сасуЕссадс дассассауа сдадсгддас ссдссаддсс. 120 ссадддаадд ддседдагЕд ддСЕЕсаеас асс.адсадЕа дЕддеадЕас сакакасЕас 1ВО дсадасЕсед Сдаадддссс астсассасс Ессадддаса асдссаадаа сссасЕдеас 240 ССдсаавЕда асадссЕдад адссдаддас асддссдЕдс аЕЕасЕдСду дададаЕдда 300 дЕддааасЕа сЕЕЕЕЕасЕа сЕасЕасЕас ддЕасддасд Ессддддсса адддассасд 360 дЕсассдЕсс ссссад 376 <210* 57 <211* 358 <212* ДНК <213* Искусственная последовательность <220>
<223* Описание искусственной последовательности: консенсусная последовательность <220>
<221* модифицированное основание <222* (337) <223* а, с, ί, д, другое или неизвестное <400* 57 саддЕдсадс ЕдсаддадЕс дддсссадда ссддсдаадс сЕЕсддадас ссЕдЕсссЕс60 ассЕдсасСд ЕсЕсЕддЕдд сЕссаЕсадЕ агСЕассасЕ ддадсЕддаЕ ссддсадссс120 дссдддаадд дасЕддадЕд даЕЕдддсдЕ ассЕаЕасса дсдддадсте саасеасаас180 сссЕсссЕса ададссдадЕ сассасдгса дсадасасдс ссаадаасса дЕссссссЕд240 аадсЕдагсЕ сЕдсдассдс сдсддасасд дссдЪдсаЕЕ ассдЕдсддЕ аасдаЕЕЕЕЕ300 ддадЕддЕЕа ЕЕаЕсЕЕЕда сЕассддддс садгдапссс сддЕсассдЕ ссссЕсад358 <210* 58 <211* 418 <212* ДНК <213* Искусственная последовательность <220* <223* Описание искусственной последовательности: консенсусная последовательность <400* 58 саддЕдсадс ЕдЕеддадСс Едддддаддс ЕЕддЕасадс сСддддддЕс ссЕдадассс60
ЕйсЕдЕгсад ссЕсЕддаЕЕ сассЕЕЕадс адсЕаЕдсса ЕдагсЕдддЕ содссаддсЕ120 ссадддаадд ддсЕддадЕд ддЕСЕсадаЕ аЕЕавЕддк» дСддсддсаЬ уасаЕшсЕас180 дсадасЕссд Сдаадддссс дЕЕсассвЕс Ессададаса аСЕссагдат сасдсЕдЕаЕ240 ссдсаааЕда асадссЕдад адссдаддас асддссдЕаЕ аЕЕасЕдЕдс дааадаЕсЕк300 ддссгвХвуд асЕуЕСасса ссасЕассас ддЕасддасд Ессддддсса адддасуасд360 дЕдаСЕаЕда дЕЕддсгсда ссссЬддддс садддаассс ЕддЕсассдЕ сЬссЕсад418 <210* 59 <211* 364 <212* ДНК <213* Искусственная последовательность
- 74 012079 <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: консенсусная п осл едовател ьность <400 > 59 саддкдсадс ЬдсаддадСс дддсссадда скддкдаадс ссксддадас ссСдСссскс60 асскдсаскд кссскддсдд ссссаксадк адккассаск ддадусддак ссддсадссс120 ссадддаадд дасСддадкд даккдддкас акскаскаса дкдддадсас сааскасаас180 сссксссиса ададксдаск сассакакса дсадасасдк сеаадаасса дссссссссд240 аадскдадук ссдкдассдс сдсддасасд деедкдкакк аскдсдссад дасдсакадс300 адкксдккск аскаскасдд сакддасдкс кддддссаад ддассасддс сассдксксс360 ксад364 <210> 60 <211> 15 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223 * Описание искусственной последовательности: линкер С1у-5ег <400> во
О1у 01 у <31 у 01 у Зег О1у О1у <31у О1у 5ег 01у О1у О1у О1у 5ег 15 10 15

Claims (43)

1. Человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфически связываются с рецептором инсулиноподобного фактора роста Ι (ЮР4В), где указанное антитело или его часть ингибируют индуцированное ЮР4В фосфорилирование тирозина.
2. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, обладающие по меньшей мере одним из следующих свойств:
a) не связываются с ЮР4В мыши, крысы, собаки или кролика;
b) связываются с ЮР4В макаки-крабоеда или макаки-резус, но не связываются с ЮР4В мартышки;
c) ингибируют связывание ЮР-Ι или ЮР-ΙΙ с ЮР-ТВ;
й) обладают избирательностью в отношении ЮР4В, которая по меньшей мере в 50 раз превышает их избирательность в отношении рецептора инсулина;
е) ингибируют рост опухоли ίη νίνο;
Т) вызывают элиминацию ЮР4В с поверхности клетки при инкубации с клеткой, экспрессирующей ЮР4В;
д) имеют Кй для ЮР4В, составляющую 8х 10-9 М или менее; и
11) имеет КоТТ для ЮР4В, составляющую 10-4 или менее.
3. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.2, обладающие всеми указанными свойствами.
4. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.2, которые ингибируют связывание ЮР-Ι или ЮР-ΙΙ с ЮР4В, имеют Кй для ЮР4В, составляющую 8х10-9 М или менее, и обладают избирательностью в отношении ЮР4В, которая по меньшей мере в 50 раз превышает их избирательность в отношении рецептора инсулина.
5. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1 или 2, обладающие по меньшей мере одним из следующих свойств:
a) перекрестно конкурируют за связывание с ЮР4В с антителом, выбранным из группы, состоящей из 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3;
b) связываются с тем же самым эпитопом ЮР4В, что и антитело, выбранное из группы, состоящей из 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3;
c) имеют, по существу, такую же Кй для ЮР4В, что и антитело, выбранное из группы, состоящей из
2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3; и
й) имеют, по существу, такую же КоТТ для ЮР4В, что и антитело, выбранное из группы, состоящей из 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3.
6. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по любому из пп.1-5, ингибирующие связывание ЮР4В с ЮР-Ι или ЮР-ΙΙ с Ю50, составляющей менее 100 нМ.
7. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по любому из пп.1-6, содержащие
- 75 012079 вариабельную область легкой цепи, которая содержит не более 10 изменений аминокислот по сравнению с аминокислотной последовательностью, кодируемой геном νκ А30, А27 или О12 зародышевой линии.
8. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по любому из пп.1-6, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит не более 8 изменений аминокислот по сравнению с аминокислотной последовательностью, кодируемой геном νΗ ΌΡ47, ΌΡ35, ΌΡ71 или νΐν-4 зародышевой линии.
9. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по любому из пп.1-8, содержащие аминокислотную последовательность по меньшей мере одной СОВ вариабельной области, выбранной из группы, состоящей из:
a) вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из 8ΕΟ ГО ΝΟ: 2, 8ΕΟ ГО ΝΟ: 6, 8ΕΟ ГО ΝΟ: 10, 8ΕΟ ГО ΝΟ: 14, 8ΕΟ ГО ΝΟ: 18 и 8ΕΟ ГО ΝΟ: 22, или аминокислотную последовательность, имеющую 1-10 аминокислотных инсерций, делеций или замен в указанных последовательностях; и
b) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из 8ΕΟ ГО ΝΟ: 4, 8ΕΟ ГО ΝΟ: 8, 8ΕΟ ГО ΝΟ: 12, 8ΕΟ ГО ΝΟ: 16, 8ΕΟ ГО ΝΟ: 20 и 8ΕΟ ГО ΝΟ: 24, или аминокислотную последовательность, имеющую 1-10 аминокислотных инсерций, делеций или замен в указанных последовательностях.
10. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по любому из пп.1-8, содержащие аминокислотную последовательность по меньшей мере одной СОВ вариабельной области, выбранной из группы, состоящей из:
a) вариабельной области легкой цепи антитела, выбранного из группы, состоящей из 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3;
b) вариабельной области тяжелой цепи антитела, выбранного из группы, состоящей из 2.12.1,
2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3.
11. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.9, содержащие все аминокислотные последовательности СОВ вариабельной области, выбранной из группы, состоящей из:
a) вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из 8ΕΟ ГО ΝΟ: 2, 8ΕΟ ГО ΝΟ: 6, 8ΕΟ ГО ΝΟ: 10, 8ΕΟ ГО ΝΟ: 14, 8ΕΟ ГО ΝΟ: 18 и 8ΕΟ ГО ΝΟ: 22, или аминокислотную последовательность, имеющую 1-10 аминокислотных инсерций, делеций или замен в указанных последовательностях; и
b) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из 8ΕΟ ГО ΝΟ: 4, 8ΕΟ ГО ΝΟ: 8, 8ΕΟ ГО ΝΟ: 12, 8ΕΟ ГО ΝΟ: 16, 8ΕΟ ГО ΝΟ: 20 и 8ΕΟ ГО ΝΟ: 24, или аминокислотную последовательность, имеющую 1-10 аминокислотных инсерций, делеций или замен в указанных последовательностях.
12. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.10, содержащие все аминокислотные последовательности СОВ вариабельной области, выбранной из группы, состоящей из:
a) вариабельной области легкой цепи антитела, выбранного из группы, состоящей из 2.12.1, 2.13.2,
2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3;
b) вариабельной области тяжелой цепи антитела, выбранного из группы, состоящей из 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3; и
c) вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи антитела, выбранного из группы, состоящей из 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3.
13. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.11, отличающиеся тем, что вариабельная область легкой цепи антитела содержит аминокислотную последовательность, выбранную из 8ΕΟ ГО ΝΟ: 2, 8ΕΟ ГО ΝΟ: 6, 8ΕΟ ГО ΝΟ: 10, 8ΕΟ ГО ΝΟ: 14, 8ΕΟ ГО ΝΟ: 18 и 8ΕΟ ГО ΝΟ: 22, или аминокислотную последовательность, имеющую 1-10 аминокислотных инсерций, делеций или замен в указанных последовательностях.
14. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.11, отличающиеся тем, что вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит аминокислотную последовательность, выбранную из 8ΕΟ ГО ΝΟ: 4, 8ΕΟ ГО ΝΟ: 8, 8ΕΟ ГО ΝΟ: 12, 8ΕΟ ГО ΝΟ: 16, 8ΕΟ ГО ΝΟ: 20 и 8ΕΟ ГО ΝΟ: 24, или аминокислотную последовательность, имеющую 1-10 аминокислотных инсерций, делеций или замен в указанных последовательностях.
15. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, отличающиеся тем, что указанное антитело выбрано из группы, состоящей из 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3.
16. Моноклональное антитело по любому из пп.1-15, отличающееся тем, что указанное антитело относится к изотипу ГдС, ГдМ, ^Ε, ГдА или ГдЭ.
17. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по любому из пп.1-15, представляющие собой РаЬ-фрагмент, Р(аЬ')2-фрагмент, Рν-фрагмент, одноцепочечное антитело, гуманизированное антитело, химерное антитело или биспецифическое антитело.
18. Моноклональное антитело по п.1, содержащее тяжелую и легкую цепи, причем аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи выбраны из группы, состоящей из:
а) аминокислотной последовательности 8ΕΟ ГО ΝΟ: 45 без сигнальной последовательности и ами
- 76 012079 нокислотной последовательности 8ЕР ΙΌ NΟ: 47 без сигнальной последовательности и
Ь) аминокислотной последовательности 8ЕР ΙΌ NΟ: 49 без сигнальной последовательности и аминокислотной последовательности 8ЕР ΙΌ NΟ: 51 без сигнальной последовательности.
19. Моноклональное антитело по п.1, содержащее тяжелую и легкую цепи, причем аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи выбраны из группы, состоящей из:
a) аминокислотной последовательности тяжелой цепи и аминокислотной последовательности легкой цепи 2.12.1 и
b) аминокислотной последовательности тяжелой цепи и аминокислотной последовательности легкой цепи 2.13.2.
20. Моноклональное антитело по п.1, содержащее аминокислотную последовательность, содержащую СЭВ антител 2.12.1 или 2.13.2, или последовательности СЭВ указанных антител, имеющие не более 5 консервативных аминокислотных замен.
21. Моноклональное антитело, которое специфически связывается с ЮРЛВ и ингибирует индуцированное ЮРЛВ фосфорилирование тирозина, содержащее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, содержащую СЭВЕ СЭВ2 и СЭВ3 последовательности 8ЕР ΙΌ NΟ: 4, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, содержащую СПВ1, СЭВ2 и СОВ3 последовательности 8ЕР ΙΌ NΟ: 2.
22. Моноклональное антитело по п.21, отличающееся тем, что аминокислотная последовательность тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность вариабельной области 8ЕР ΙΌ NΟ: 4 или указанную последовательность, содержащую вплоть до 5 консервативных аминокислотных замен, и аминокислотная последовательность легкой цепи содержит аминокислотную последовательность вариабельной области 8ЕР ΙΌ NΟ: 2 или указанную последовательность, содержащую вплоть до 5 аминокислотных замен.
23. Моноклональное антитело по п.22, отличающееся тем, что аминокислотная последовательность тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность вариабельной области 8 Ер ΙΌ NΟ: 4 и аминокислотная последовательность легкой цепи содержит аминокислотную последовательность вариабельной области 8ЕР ΙΌ NΟ: 2.
24. Моноклональное антитело по любому из пп.21-23, отличающееся тем, что аминокислотная последовательность тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность 8ЕР ΙΌ NΟ: 49 без сигнальной последовательности и аминокислотная последовательность легкой цепи содержит аминокислотную последовательность 8ЕР ΙΌ NΟ: 51 без сигнальной последовательности.
25. Моноклональное антитело, которое специфически связывается с ЮРЛВ и ингибирует индуцированное ЮРЛВ фосфорилирование тирозина, содержащее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, содержащей СЭВЕ СЭВ2 и СЭВ3 последовательности 8ЕР ΙΌ NΟ: 8, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, содержащей СПВ1, СПВ2 и СОВ3 последовательности 8ЕР ΙΌ NΟ: 6.
26. Моноклональное антитело по п.25, отличающееся тем, что аминокислотная последовательность тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность вариабельной области 8ЕР ΙΌ NΟ: 8 или указанную последовательность, содержащую вплоть до 5 консервативных аминокислотных замен, и аминокислотная последовательность легкой цепи содержит аминокислотную последовательность вариабельной области 8ЕР ΙΌ NΟ: 6 или указанную последовательность, содержащую вплоть до 5 аминокислотных замен.
27. Моноклональное антитело по п.26, отличающееся тем, что аминокислотная последовательность тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность вариабельной области 8 Ер ΙΌ NΟ: 8 и аминокислотная последовательность легкой цепи содержит аминокислотную последовательность вариабельной области 8ЕР ΙΌ NΟ: 6.
28. Моноклональное антитело по любому из пп.25-27, отличающееся тем, что аминокислотная последовательность тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность 8ЕР ΙΌ NΟ: 45 без сигнальной последовательности и аминокислотная последовательность легкой цепи содержит аминокислотную последовательность 8ЕР ΙΌ NΟ: 47 без сигнальной последовательности.
29. Фармацевтическая композиция, содержащая моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп.1-28 и фармацевтически приемлемый носитель.
30. Фармацевтическая композиция по п.29, дополнительно содержащая антинеопластическое, химиотерапевтическое или противоопухолевое средство.
31. Способ получения моноклонального аити-IСР-IΒ-аититела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-28, предусматривающий следующие стадии:
a) иммунизацию трансгенного млекопитающего, отличного от человека, которое способно продуцировать человеческие антитела иммуногеном, содержащим ЮРЛВ;
b) выдерживание трансгенного животного в течение периода, необходимого для созревания у него иммунного ответа на ЮРЛВ; и
c) выделение антитела или его антигенсвязывающей части.
32. Выделенная линия клеток, которая продуцирует моноклональное антитело по любому из пп.1-28.
- 77 012079
33. Линия клеток по п.32, отличающаяся тем, что продуцирует моноклональное антитело, выбранное из группы, состоящей из 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3, или антитело, которое имеет те же самые аминокислотные последовательности, что и указанные антитела.
34. Способ диагностики наличия или локализации опухоли, экспрессирующей 1СР-1К, у нуждающегося в этом человека, предусматривающий стадии:
а) инъецирования человеку антитела по любому из пп.1-28;
б) определения экспрессии 1СР-1К у человека путем определения локализации связывания антитела;
с) сравнения экспрессии в части (б) с экспрессией у нормального контрольного субъекта-человека или со стандартом и
б) диагностирования наличия или локализации опухоли.
35. Способ лечения рака у человека, включающий стадию введения человеку антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-28 в количестве, эффективном для лечения указанного рака.
36. Способ по п.34 или 35, дополнительно предусматривающий стадию введения человеку антинеопластического, противоопухолевого, антиангиогенного или химиотерапевтического средства.
37. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть или легкую цепь или ее антигенсвязывающую часть моноклонального антитела по любому из пп.1-28.
38. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.37, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из:
а) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере одну СОК вариабельной области тяжелой цепи антитела, выбранного из группы, состоящей из 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1,
4.9.2 и 4.17.3;
б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей три СОК вариабельной области тяжелой цепи антитела, выбранного из группы, состоящей из 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3;
с) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть антитела, выбранного из группы, состоящей из 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3;
б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере одну СОК вариабельной области легкой цепи антитела, выбранного из группы, состоящей из 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3;
е) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей три СОК вариабельной области легкой цепи антитела, выбранного из группы, состоящей из 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3;
ί) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь или ее антигенсвязывающую часть антитела, выбранного из группы, состоящей из 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 и 4.17.3;
д) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные области тяжелой или легкой цепей, выбранные из группы, состоящей из ЗЕО Ш N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 и 22 и 24; и
б) последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из ЗЕО Ш N0: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 и 23.
39. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.37 или 38, при необходимости содержащий последовательность регуляции экспрессии, функционально связанную с молекулой нуклеиновой кислоты.
40. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.39 или молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.37 или 38.
41. Способ получения моноклонального анти-1СР-1К-антитела или его антигенсвязывающей части, предусматривающий культивирование клетки-хозяина по п.40 или линии клеток по п.32 в подходящих условиях и выделение указанного антитела или его антигенсвязывающей части.
42. Трансгенное животное, отличное от человека, содержащее молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.37 или 38, экспрессирующее указанную нуклеиновую кислоту.
43. Способ лечения рака у человека, включающий стадию введения человеку эффективного количества молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.37 или 38, с обеспечением ее экспрессии.
EA200300766A 2001-01-05 2001-12-20 Моноклональное антитело к рецептору инсулиноподобного фактора роста i (igf-i) и способы его применения EA012079B3 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25992701P 2001-01-05 2001-01-05
PCT/US2001/051113 WO2002053596A2 (en) 2001-01-05 2001-12-20 Antibodies to insulin-like growth factor i receptor

Publications (3)

Publication Number Publication Date
EA200300766A1 EA200300766A1 (ru) 2004-06-24
EA012079B1 true EA012079B1 (ru) 2009-08-28
EA012079B3 EA012079B3 (ru) 2018-07-31

Family

ID=22987016

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200300766A EA012079B3 (ru) 2001-01-05 2001-12-20 Моноклональное антитело к рецептору инсулиноподобного фактора роста i (igf-i) и способы его применения

Country Status (51)

Country Link
US (7) US7037498B2 (ru)
EP (4) EP2796468A2 (ru)
JP (4) JP2004531217A (ru)
KR (1) KR100830082B1 (ru)
CN (2) CN1854157B (ru)
AP (1) AP2072A (ru)
AR (1) AR032028A1 (ru)
AT (1) ATE464322T1 (ru)
AU (1) AU2002231368C1 (ru)
BG (3) BG66460B1 (ru)
BR (2) BR0116728A (ru)
CA (1) CA2433800C (ru)
CR (4) CR7045A (ru)
CU (1) CU23447B7 (ru)
CZ (1) CZ301712B6 (ru)
DE (1) DE60141855D1 (ru)
DK (1) DK1399483T3 (ru)
DZ (1) DZ3494A1 (ru)
EA (1) EA012079B3 (ru)
EC (1) ECSP034711A (ru)
EE (2) EE05715B1 (ru)
ES (1) ES2344592T3 (ru)
GE (1) GEP20084484B (ru)
GT (1) GT200100257A (ru)
HK (3) HK1072059A1 (ru)
HN (1) HN2001000283A (ru)
HR (2) HRP20030627A2 (ru)
HU (1) HUP0302525A2 (ru)
IL (2) IL156661A0 (ru)
IS (1) IS2790B (ru)
MA (1) MA26040A1 (ru)
ME (1) ME00502B (ru)
MX (2) MX349009B (ru)
MY (1) MY143465A (ru)
NO (1) NO339789B1 (ru)
NZ (2) NZ527302A (ru)
OA (1) OA12589A (ru)
PA (1) PA8535501A1 (ru)
PE (1) PE20020801A1 (ru)
PL (3) PL224873B1 (ru)
PT (1) PT1399483E (ru)
RS (1) RS51373B (ru)
SG (1) SG138469A1 (ru)
SK (1) SK287954B6 (ru)
SV (1) SV2007000775A (ru)
TN (1) TNSN01177A1 (ru)
TW (1) TWI324609B (ru)
UA (1) UA87804C2 (ru)
UY (2) UY27087A1 (ru)
WO (1) WO2002053596A2 (ru)
ZA (1) ZA200305995B (ru)

Families Citing this family (294)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR032028A1 (es) 2001-01-05 2003-10-22 Pfizer Anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento similar a insulina
PL222211B1 (pl) * 2001-06-26 2016-07-29 Amgen Fremont Inc Przeciwciało przeciwko OPGL, kompozycja je zawierająca, jego zastosowanie i sposób jego wytwarzania, sposób wykrywania poziomu OPGL, kompozycja obejmująca polinukleotydy i komórka gosodarza
AU2013204100A1 (en) * 2001-06-26 2013-05-09 Amgen Fremont Inc. Antibodies to OPGL
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
US20080063639A1 (en) * 2002-01-18 2008-03-13 Pierre Fabre Medicament Method for the treatment of psoriasis comprising novel anti-IGF-IR antibodies
FR2834900B1 (fr) * 2002-01-18 2005-07-01 Pf Medicament Nouvelles compositions a activite anti-igf-ir et anti-egfr et leurs applications
JP4606739B2 (ja) * 2002-01-18 2011-01-05 ピエール、ファーブル、メディカマン 新規抗ｉｇｆ−ｉｒ抗体およびその使用
FR2834990A1 (fr) * 2002-01-18 2003-07-25 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
FR2834991B1 (fr) * 2002-01-18 2004-12-31 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
US7553485B2 (en) 2002-01-18 2009-06-30 Pierre Fabre Medicament Anti-IGF-IR and/or anti-insulin/IGF-I hybrid receptors antibodies and uses thereof
US7241444B2 (en) 2002-01-18 2007-07-10 Pierre Fabre Medicament Anti-IGF-IR antibodies and uses thereof
US6936427B2 (en) 2002-02-08 2005-08-30 Trellis Bioscience, Inc. Real time detection of intermolecular interaction
US8658773B2 (en) 2011-05-02 2014-02-25 Immunomedics, Inc. Ultrafiltration concentration of allotype selected antibodies for small-volume administration
EP3100719A3 (en) 2002-05-15 2017-02-22 California Pacific Medical Center Delivery of nucleic acid-like compounds
WO2003100008A2 (en) 2002-05-24 2003-12-04 Schering Corporation Neutralizing human anti-igfr antibody
US7538195B2 (en) 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
US8034904B2 (en) * 2002-06-14 2011-10-11 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
US7456260B2 (en) 2002-06-17 2008-11-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Humanized antibody
US20040176291A1 (en) * 2002-09-24 2004-09-09 Elly Nedivi Methods and compositions for soluble CPG15
NZ540971A (en) * 2003-02-13 2008-04-30 Pfizer Prod Inc Uses of anti-insulin-like growth factor I receptor antibodies
EP1603948A1 (en) * 2003-03-14 2005-12-14 Pharmacia Corporation Antibodies to igf-i receptor for the treatment of cancers
JP4473257B2 (ja) 2003-04-02 2010-06-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー インスリン様成長因子ｉ受容体に対する抗体及びその使用
CN100378127C (zh) * 2003-04-02 2008-04-02 霍夫曼-拉罗奇有限公司 针对***i受体的抗体及其应用
US7310537B2 (en) * 2003-04-25 2007-12-18 Nokia Corporation Communication on multiple beams between stations
WO2005016970A2 (en) 2003-05-01 2005-02-24 Imclone Systems Incorporated Fully human antibodies directed against the human insulin-like growth factor-1 receptor
EP1479695B1 (en) * 2003-05-14 2010-02-17 Kenta Biotech AG Human monoclonal antibody specific for lipopolysaccharides (LPS) of serotype IATS O6 of Pseudomonas aeruginosa
AR046071A1 (es) * 2003-07-10 2005-11-23 Hoffmann La Roche Anticuerpos contra el receptor i del factor de crecimiento de tipo insulinico y los usos de los mismos
US7902338B2 (en) 2003-07-31 2011-03-08 Immunomedics, Inc. Anti-CD19 antibodies
HN2004000285A (es) * 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
KR100825156B1 (ko) * 2003-08-13 2008-04-24 화이자 프로덕츠 인코포레이티드 변형된 인간 ｉｇｆ-ｉｒ 항체
WO2005028515A1 (ja) * 2003-09-24 2005-03-31 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. ヒトインスリン様成長因子に対する遺伝子組換え抗体
US20050187175A1 (en) * 2003-09-30 2005-08-25 Elly Nedivi Methods and compositions for CPG15-2
US9011880B2 (en) * 2003-10-21 2015-04-21 Igf Oncology, Llc Compounds and methods for treating cancer
EP1694850B1 (en) 2003-11-12 2011-06-29 Schering Corporation Plasmid system for multigene expression
TW200526684A (en) * 2003-11-21 2005-08-16 Schering Corp Anti-IGFR1 antibody therapeutic combinations
EP1692176A4 (en) * 2003-12-08 2008-11-12 Immunogen Inc ANTI-IGF-I RECEPTOR ANTIBODY
BRPI0510716A (pt) * 2004-05-05 2007-11-20 Merrimack Pharmaceuticals Inc uso de um agente de ligação bi-especìfico, agente de ligação bi-especìfico, composição de um agente de ligação bi-especìfico, e, kit
CA2573821A1 (en) * 2004-07-16 2006-01-26 Pfizer Products Inc. Combination treatment for non-hematologic malignancies using an anti-igf-1r antibody
FR2873699B1 (fr) * 2004-07-29 2009-08-21 Pierre Fabre Medicament Sa Nouveaux anticorps anti igf ir rt leurs utilisations
WO2006060419A2 (en) 2004-12-03 2006-06-08 Schering Corporation Biomarkers for pre-selection of patients for anti-igf1r therapy
MY146381A (en) * 2004-12-22 2012-08-15 Amgen Inc Compositions and methods relating relating to anti-igf-1 receptor antibodies
NZ562453A (en) 2005-03-31 2010-04-30 Agensys Inc Antibodies and related molecules that bind to 161P2F10B proteins
CA2604393A1 (en) * 2005-04-15 2006-10-26 Schering Corporation Methods and compositions for treating or preventing cancer
BRPI0608096A2 (pt) 2005-04-26 2009-11-10 Pfizer anticorpos p-caderina
GB0510790D0 (en) 2005-05-26 2005-06-29 Syngenta Crop Protection Ag Anti-CD16 binding molecules
ES2776657T3 (es) * 2005-06-14 2020-07-31 Amgen Inc Formulaciones de proteínas autotamponantes
WO2006138315A2 (en) * 2005-06-15 2006-12-28 Schering Corporation Anti-igf1r antibody formulations
CN101613409B (zh) 2005-06-17 2014-06-04 英克隆有限责任公司 抗-PDGFRα抗体
WO2007000328A1 (en) * 2005-06-27 2007-01-04 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa Antibodies that bind to an epitope on insulin-like growth factor 1 receptor and uses thereof
FR2888850B1 (fr) 2005-07-22 2013-01-11 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
UA94060C2 (ru) 2005-09-07 2011-04-11 Эмджен Фримонт Инк. Моноклональное антитело, которое специфически связывает alk-1
CN100445300C (zh) * 2005-09-30 2008-12-24 李玉新 Glp-1融合蛋白及其制备方法和医药用途
EP1957541A2 (en) 2005-11-21 2008-08-20 Laboratoires Serono SA Compositions and methods of producing hybrid antigen binding molecules and uses thereof
RS52357B (en) * 2005-12-13 2012-12-31 Medimmune Limited BINDING PROTEINS SPECIFIC TO INSULIN SIMILAR GROWTH FACTORS AND THEIR USE
AR060017A1 (es) 2006-01-13 2008-05-21 Novartis Ag Composiciones y metodos de uso para anticuerpos de dickkopf -1
JP5554925B2 (ja) 2006-01-20 2014-07-23 セル・シグナリング・テクノロジー・インコーポレイテツド ヒト非小細胞肺癌における転座及び変異体ｒｏｓキナーゼ
US20120208824A1 (en) 2006-01-20 2012-08-16 Cell Signaling Technology, Inc. ROS Kinase in Lung Cancer
WO2009051846A2 (en) 2007-10-18 2009-04-23 Cell Signaling Technology, Inc. Translocation and mutant ros kinase in human non-small cell lung carcinoma
CA2641310C (en) 2006-02-03 2013-08-20 Imclone Systems Incorporated Igf-ir antagonists as adjuvants for treatment of prostate cancer
WO2007095113A2 (en) * 2006-02-10 2007-08-23 Massachusetts Institute Of Technology Cpg15 and cpg15-2 compounds and inhibitors as insulin receptor and insulin-like growth factor receptor agonists and antagonists
KR20080113268A (ko) * 2006-03-28 2008-12-29 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 항 ｉｇｆ-1ｒ 항체 및 그의 용도
KR20080104160A (ko) * 2006-03-28 2008-12-01 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-ｉｇｆ-１ｒ 인간 단일클론 항체 제형
US7846724B2 (en) 2006-04-11 2010-12-07 Hoffmann-La Roche Inc. Method for selecting CHO cell for production of glycosylated antibodies
EP2447360A1 (en) 2006-04-14 2012-05-02 Cell Signaling Technology, Inc. Gene defects and mutant ALK kinase in human solid tumors
EA200802058A1 (ru) 2006-05-09 2009-06-30 Пфайзер Продактс Инк. Производные циклоалкиламинокислот и их фармацевтические композиции
EP2032989B2 (en) 2006-06-30 2015-10-28 Merck Sharp & Dohme Corp. Igfbp2 biomarker
MX2009006466A (es) 2006-12-13 2009-06-26 Schering Corp Metodos de tratamiento de cancer con inhibidores del receptor del factor 1 de crecimiento similar a la insulina.
US20090068110A1 (en) * 2006-12-22 2009-03-12 Genentech, Inc. Antibodies to insulin-like growth factor receptor
MX2009008754A (es) * 2007-02-14 2009-11-02 Glaxo Group Ltd Anticuerpos novedosos contra igf-1r.
GB0702888D0 (en) * 2007-02-14 2007-03-28 Glaxo Group Ltd Novel Antibodies
EP2126565B1 (en) * 2007-02-27 2011-10-26 F. Hoffmann-La Roche AG Method for the assessment of the inhibitory activity of antibodies against insulin-like growth factor i receptor
WO2008108986A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Amgen Inc. Methods and compositions for treating tumor diseases
US8642067B2 (en) 2007-04-02 2014-02-04 Allergen, Inc. Methods and compositions for intraocular administration to treat ocular conditions
JP5926487B2 (ja) 2007-04-13 2016-05-25 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド ＥｒｂＢ療法に耐性である癌を治療するための方法
WO2008144345A2 (en) 2007-05-17 2008-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Biomarkers and methods for determining sensitivity to insulin growth factor-1 receptor modulators
PE20090368A1 (es) 2007-06-19 2009-04-28 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-igf
KR20100052545A (ko) * 2007-08-28 2010-05-19 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 Ｉｇｆ―１ｒ의 다중 에피토프에 결합하는 조성물
EP2190480A4 (en) * 2007-08-28 2013-01-23 Biogen Idec Inc ANTI-IGR-1R ANTIBODIES AND ITS USES
AU2008293425B2 (en) * 2007-08-31 2014-09-18 Amgen Inc. Solid-state protein formulation
EP2205280B1 (en) 2007-09-27 2019-09-04 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
WO2009064838A1 (en) 2007-11-15 2009-05-22 Amgen, Inc. Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stablised by antioxidants for parenteral administration
CN101918447B (zh) 2007-12-14 2014-06-11 布里斯托尔-米尔斯·斯奎布公司 人ox40受体的结合分子
EP2225273B1 (en) 2007-12-21 2012-05-23 Roche Glycart AG Stability testing of antibodies
US20110104256A1 (en) * 2008-03-25 2011-05-05 Yaolin Wang Methods for treating or preventing colorectal cancer
SG190572A1 (en) 2008-04-29 2013-06-28 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
RU2010153578A (ru) 2008-06-03 2012-07-20 Эбботт Лэборетриз (Us) Иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами и их применение
CA2726087A1 (en) 2008-06-03 2009-12-10 Tariq Ghayur Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
RU2011104348A (ru) 2008-07-08 2012-08-20 Эбботт Лэборетриз (Us) Иммуноглобулины с двойным вариабельным доменом против простагландина е2 и их применение
US8518952B2 (en) 2008-08-06 2013-08-27 Pfizer Inc. 6 substituted 2-heterocyclylamino pyrazine compounds as CHK-1 inhibitors
MX2011006055A (es) 2008-12-12 2011-07-04 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-igf.
US9364477B2 (en) 2009-02-12 2016-06-14 Cell Signaling Technology, Inc. Mutant ROS expression in human cancer
EP3243527B1 (en) 2009-02-13 2019-06-05 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage
EP2236139A1 (en) 2009-03-31 2010-10-06 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of erlotinib with an anti-IGF-1R antibody, which does not inhibit binding of insulin to the insulin receptor
AR075982A1 (es) 2009-03-31 2011-05-11 Roche Glycart Ag Terapia de combinacion de un anticuerpo afucosilado y una o mas de las citoquinas seleccionadas de gm- csf humano, m -csf humano y/o il-3 humano y composicion
CN102481361B (zh) 2009-04-16 2014-10-22 默沙东公司 用于治疗癌症的组合物和方法
JP5766179B2 (ja) * 2009-04-27 2015-08-19 ノバルティス アーゲー 筋肉増殖を増加させるための組成物および方法
US20100316639A1 (en) 2009-06-16 2010-12-16 Genentech, Inc. Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy
EP2564695B1 (en) 2009-07-08 2015-04-15 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US20120204278A1 (en) 2009-07-08 2012-08-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
KR20120060877A (ko) 2009-09-01 2012-06-12 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
CA2774260C (en) 2009-09-16 2018-10-09 Immunomedics, Inc. Class i anti-cea antibodies and uses thereof
AU2010306677B2 (en) 2009-10-15 2013-05-23 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US9662271B2 (en) 2009-10-23 2017-05-30 Amgen Inc. Vial adapter and system
KR101436219B1 (ko) 2009-10-26 2014-09-01 에프. 호프만-라 로슈 아게 글리코실화된 면역글로불린의 제조 방법
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
EP2494070A2 (en) 2009-10-30 2012-09-05 Bristol-Myers Squibb Company Methods for treating cancer in patients having igf-1r inhibitor resistance
EP2506881B1 (en) 2009-12-02 2024-03-06 Immunomedics, Inc. Combining radioimmunotherapy and antibody-drug conjugates for improved cancer therapy
WO2011083391A2 (en) 2010-01-05 2011-07-14 Pfizer Inc. Biomarkers for anti-igf-ir cancer therapy
EP3095871B1 (en) 2010-02-08 2019-04-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common light chain mouse
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
WO2011101328A2 (en) 2010-02-18 2011-08-25 Roche Glycart Ag Treatment with a humanized igg class anti egfr antibody and an antibody against insulin like growth factor 1 receptor
US9238080B2 (en) 2010-05-21 2016-01-19 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bi-specific fusion proteins
EA032537B1 (ru) 2010-06-07 2019-06-28 Эмджен Инк. Способ работы устройства для доставки лекарственного средства
WO2011161119A1 (en) 2010-06-22 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof
PE20130643A1 (es) 2010-07-12 2013-06-07 Covx Technologies Ireland Ltd Conjugados de anticuerpos multifuncionales
KR20130100118A (ko) 2010-08-03 2013-09-09 아비에 인코포레이티드 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
US20120101108A1 (en) 2010-08-06 2012-04-26 Cell Signaling Technology, Inc. Anaplastic Lymphoma Kinase In Kidney Cancer
CA2809433A1 (en) 2010-08-26 2012-03-01 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
KR101527300B1 (ko) 2010-09-09 2015-06-09 화이자 인코포레이티드 4-1ｂｂ 결합 분자
UA114592C2 (uk) * 2010-09-28 2017-07-10 Ноно Інк. Пептид nd2 та спосіб лікування неврологічного захворювання
EP3974453A3 (en) * 2010-11-16 2022-08-03 Amgen Inc. Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
CA2820619C (en) 2010-11-24 2020-01-07 Litron Laboratories, Ltd. Rapid in vivo gene mutation assay based on the pig-a gene
JP2014510265A (ja) 2011-02-02 2014-04-24 アムジェン インコーポレイテッド Ｉｇｆ−１ｒの阻害に関する方法および組成物
CA2824252A1 (en) 2011-02-10 2012-08-16 Roche Glycart Ag Improved immunotherapy
GB201103578D0 (en) 2011-03-02 2011-04-13 Sabrepharm Ltd Dipyridinium derivatives
CN103561771B (zh) 2011-03-17 2019-01-04 伯明翰大学 重新定向的免疫治疗
WO2012135517A2 (en) 2011-03-29 2012-10-04 Immunogen, Inc. Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
ME03353B (me) 2011-03-29 2019-10-20 Immunogen Inc Priprema konjugata antitela i majtanzinoida jednostepenim postupkom
WO2012135315A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Amgen Inc. Vial adapter and system
EP2699598B1 (en) 2011-04-19 2019-03-06 Pfizer Inc Combinations of anti-4-1bb antibodies and adcc-inducing antibodies for the treatment of cancer
KR101517320B1 (ko) * 2011-04-19 2015-05-28 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 단일특이적 및 이중특이적 항-igf-1r 및 항 erbb3 항체
LT2699293T (lt) 2011-04-20 2019-04-25 Amgen Inc. Automatinio purškimo prietaisas
MY172718A (en) 2011-08-05 2019-12-11 Regeneron Pharma Humanized universal light chain mice
CN103857700A (zh) 2011-08-26 2014-06-11 梅里麦克制药股份有限公司 串联fc双特异性抗体
WO2013041844A2 (en) * 2011-09-19 2013-03-28 Kymab Limited Antibodies, variable domains & chains tailored for human use
WO2013045916A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
US20140309229A1 (en) 2011-10-13 2014-10-16 Bristol-Myers Squibb Company Methods for selecting and treating cancer in patients with igf-1r/ir inhibitors
EP3335747B1 (en) 2011-10-14 2021-04-07 Amgen Inc. Injector and method of assembly
US20130122005A1 (en) * 2011-10-27 2013-05-16 Paul Adam Anticancer combination therapy
EP3559049A4 (en) 2011-10-28 2019-12-04 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd POLYPEPTIDE CONSTRUCTS AND APPLICATIONS THEREOF
EP2776042B1 (en) 2011-11-11 2019-03-20 Duke University Combination drug therapy for the treatment of solid tumors
US20140341922A1 (en) * 2011-11-25 2014-11-20 SUN R & D Foundation Method for Overcoming Tolerance to Targeted Anti-Cancer Agent
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9997847B2 (en) 2011-12-27 2018-06-12 Perfectvision Manufacturing, Inc. Coaxial Connector with grommet biasing for enhanced continuity
TW201333035A (zh) 2011-12-30 2013-08-16 Abbvie Inc 針對ｉｌ－１３及／或ｉｌ－１７之雙特異性結合蛋白
EP2631653A1 (en) 2012-02-24 2013-08-28 Charité - Universitätsmedizin Berlin Identification of modulators of binding properties of antibodies reactive with a member of the insulin receptor family
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
DK2838998T3 (en) 2012-04-18 2018-01-15 Cell Signaling Technology Inc EGFR AND ROS1 IN CANCER
DK2844282T3 (da) 2012-05-04 2019-07-15 Pfizer Prostata-associerede antigener og vaccine-baserede immunterapiregimener
CN104994872B (zh) 2012-06-21 2018-09-14 索伦托治疗有限公司 与igf1r结合的抗原结合蛋白
WO2014014821A1 (en) 2012-07-19 2014-01-23 Redwood Biosciences, Inc. Antibody specific for cd22 and methods of use thereof
US8980259B2 (en) 2012-07-20 2015-03-17 Novartis Ag Combination therapy
SG10201800535XA (en) 2012-08-07 2018-02-27 Roche Glycart Ag Composition comprising two antibodies engineered to have reduced and increased effector function
US9315567B2 (en) 2012-08-14 2016-04-19 Ibc Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
NZ707091A (en) 2012-10-04 2018-12-21 Immunogen Inc Use of a pvdf membrane to purify cell-binding agent cytotoxic agent conjugates
CA2890263C (en) 2012-11-01 2020-03-10 Abbvie Inc. Anti-vegf/dll4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
ES2780395T3 (es) 2012-11-21 2020-08-25 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos
EP2925745B1 (en) 2012-11-29 2018-04-04 ChemoCentryx, Inc. Cxcr7 antagonists
HRP20220399T1 (hr) 2012-12-13 2022-05-13 Immunomedics, Inc. Režim doziranja imunokonjugata protutijela i sn-38 za poboljšanu učinkovitost i smanjenu toksičnost
US9458245B2 (en) 2013-03-06 2016-10-04 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. ANTI-C-MET tandem Fc bispecific antibodies
US20140255413A1 (en) 2013-03-07 2014-09-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination therapy for neoplasia treatment
JP6336564B2 (ja) 2013-03-15 2018-06-06 アムゲン・インコーポレーテッド 薬物カセット、自動注入器、および自動注入器システム
WO2014144280A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Abbvie Inc. DUAL SPECIFIC BINDING PROTEINS DIRECTED AGAINST IL-1β AND / OR IL-17
US10492990B2 (en) 2013-03-15 2019-12-03 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
US9708375B2 (en) 2013-03-15 2017-07-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to WNT inhibitors
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
CN113559363B (zh) 2013-03-22 2023-10-31 美国安进公司 注射器及装配方法
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
EP2992013B1 (en) 2013-04-29 2019-12-04 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-cd38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2b
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
CA2918787A1 (en) * 2013-06-13 2014-12-18 George Tachas Combination therapy
TW201605896A (zh) 2013-08-30 2016-02-16 安美基股份有限公司 Gitr抗原結合蛋白
EP3712166A1 (en) 2013-09-05 2020-09-23 Amgen Inc. Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles
DE112014004537T5 (de) 2013-10-01 2016-07-21 Kymab Limited Tiermodelle und therapeutische Moleküle
JP7051293B2 (ja) 2013-10-24 2022-04-11 アムジエン・インコーポレーテツド 温度感知制御を伴う薬剤送達システム
US11097055B2 (en) 2013-10-24 2021-08-24 Amgen Inc. Injector and method of assembly
US9675671B2 (en) 2014-01-12 2017-06-13 Igf Oncology, Llc Fusion proteins containing insulin-like growth factor-1 and epidermal growth factor and variants thereof and uses thereof
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
MX2016010683A (es) 2014-02-21 2017-05-11 Ibc Pharmaceuticals Inc Terapia para tratar enfermedades mediante la induccion de respuesta inmune de las células que expresan trop-2.
CN106029098A (zh) 2014-02-25 2016-10-12 免疫医疗公司 人源化rfb4抗cd22抗体
SG11201607203XA (en) 2014-03-21 2016-09-29 Regeneron Pharma Non-human animals that make single domain binding proteins
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
SG11201609219QA (en) 2014-05-07 2016-12-29 Amgen Inc Autoinjector with shock reducing elements
WO2015175861A1 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Amgen Inc. Assay for detecting th1 and th2 cell populations
KR102506249B1 (ko) 2014-06-03 2023-03-03 암겐 인코포레이티드 약물 전달 시스템 및 사용 방법
US9580495B2 (en) 2014-06-24 2017-02-28 Immunomedics, Inc. Anti-histone therapy for vascular necrosis in severe glomerulonephritis
CN106999517A (zh) 2014-10-07 2017-08-01 免疫医疗公司 抗体‑药物缀合物的新辅助剂用途
CA2957960C (en) 2014-10-14 2023-08-22 Amgen, Inc. Drug injection device with visual and audible indicators
AU2015337858B2 (en) 2014-10-29 2020-09-24 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd. Interferon alpha2b variants
MA40934A (fr) 2014-11-19 2017-09-27 Immunogen Inc Procédé de préparation de conjugués agent de liaison cellulaire-agent cytotoxique
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
JP6716566B2 (ja) 2014-12-19 2020-07-01 アムジエン・インコーポレーテツド 近接センサ付き薬物送達装置
EP3233159B1 (en) 2014-12-19 2020-03-04 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
ES2748750T3 (es) 2015-02-17 2020-03-17 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con sujeción asistida por vacío y/o realimentación
CA2977257A1 (en) * 2015-02-22 2016-08-25 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody therapeutics that bind cd137
ES2905870T3 (es) 2015-02-27 2022-04-12 Amgen Inc Dispositivo de suministro de fármacos que tiene un mecanismo de protección de aguja con un umbral de resistencia ajustable al movimiento de la protección de aguja
CA2979702A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen
EP3286224A4 (en) 2015-04-22 2018-11-14 Immunomedics, Inc. Isolation, detection, diagnosis and/or characterization of circulating trop-2-positive cancer cells
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
WO2016210108A1 (en) 2015-06-25 2016-12-29 Immunomedics, Inc. Combining anti-hla-dr or anti-trop-2 antibodies with microtubule inhibitors, parp inhibitors, bruton kinase inhibitors or phosphoinositide 3-kinase inhibitors significantly improves therapeutic outcome in cancer
SI3316885T1 (sl) 2015-07-01 2021-09-30 Immunomedics, Inc. Imunokonjugati protitelo-SN-38 z linkerjem CL2A
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
EP3355907B1 (en) 2015-10-02 2021-01-20 Silver Creek Pharmaceuticals, Inc. Bi-specific therapeutic proteins for tissue repair
GB2543550A (en) 2015-10-21 2017-04-26 Hox Therapeutics Ltd Peptides
US11351308B2 (en) 2015-12-09 2022-06-07 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
US11154661B2 (en) 2016-01-06 2021-10-26 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
CN108601848A (zh) 2016-02-05 2018-09-28 伊缪诺金公司 用于制备细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的有效方法
WO2017156488A2 (en) 2016-03-10 2017-09-14 Acceleron Pharma, Inc. Activin type 2 receptor binding proteins and uses thereof
EP3721922B1 (en) 2016-03-15 2022-05-04 Amgen Inc. Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
WO2017192287A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
AU2017263558B2 (en) 2016-05-13 2022-12-22 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
US11238150B2 (en) 2016-05-16 2022-02-01 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
US11541176B2 (en) 2016-06-03 2023-01-03 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
WO2018004842A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
MX2019004580A (es) 2016-10-21 2019-08-12 Amgen Inc Formulaciones farmaceuticas y metodos para prepararlas.
US20200261643A1 (en) 2016-10-25 2020-08-20 Amgen Inc. On-body injector
CN108084262A (zh) * 2016-11-23 2018-05-29 复旦大学 针对寨卡病毒的全人源单域抗体或抗原结合片段及应用
AU2018210301A1 (en) 2017-01-17 2019-08-01 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
JP7064501B2 (ja) 2017-02-17 2022-05-10 アムジエン・インコーポレーテツド 無菌流体流路を備える薬物送達デバイスおよび関連する組立方法
AU2018221351B2 (en) 2017-02-17 2023-02-23 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
CA3050927A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Brian Stonecipher Drug delivery device with activation prevention feature
IL268478B2 (en) 2017-03-07 2023-10-01 Amgen Inc Inserting a needle using super pressure
JP2020509837A (ja) 2017-03-09 2020-04-02 アムジエン・インコーポレーテツド 薬剤送達装置のための挿入機構
AU2018235928B2 (en) 2017-03-14 2023-09-21 Amgen Inc. Control of total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
CN110446512B (zh) 2017-03-28 2022-03-18 美国安进公司 柱塞杆和注射器组件***以及方法
CA3059593A1 (en) 2017-05-21 2018-11-29 Igf Oncology, Llc An insulin-like growth factor-chemotherapeputic conjugate for treating myelodysplastic syndrome
US11590294B2 (en) 2017-06-08 2023-02-28 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
EP3634546A1 (en) 2017-06-08 2020-04-15 Amgen Inc. Torque driven drug delivery device
MX2019015472A (es) 2017-06-22 2020-02-19 Amgen Inc Reduccion del impacto/choque de la activacion del mecanismo.
WO2018237225A1 (en) 2017-06-23 2018-12-27 Amgen Inc. ELECTRONIC DRUG DELIVERY DEVICE COMPRISING A CAP ACTIVATED BY A SWITCH ASSEMBLY
EP3651832B1 (en) 2017-07-14 2023-12-13 Amgen Inc. Needle insertion-retraction system having dual torsion spring system
MA49626A (fr) 2017-07-21 2020-05-27 Amgen Inc Élément d'étanchéité perméable aux gaz pour récipient à médicament et procédés d'assemblage
WO2019022950A1 (en) 2017-07-25 2019-01-31 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE WITH CONTAINER ACCESS SYSTEM AND ASSEMBLY METHOD THEREOF
WO2019022951A1 (en) 2017-07-25 2019-01-31 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE WITH GEAR MODULE AND ASSEMBLY METHOD THEREOF
EP3664863A2 (en) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc. Hydraulic-pneumatic pressurized chamber drug delivery system
MA49897A (fr) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc Injecteur sur-corps avec patch adhésif stérile
CN111511762A (zh) 2017-08-21 2020-08-07 天演药业公司 抗cd137分子及其用途
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
US20210332141A1 (en) 2017-08-30 2021-10-28 Amgen Inc. Insulin-like growth factor-1 receptor (igf-1r) binding proteins and methods of use
WO2019070472A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 Amgen Inc. FLOW ADAPTER FOR MEDICATION DELIVERY DEVICE
CN111132711B (zh) 2017-10-06 2022-07-01 安进公司 带有联锁组件的药物递送装置及相关组装方法
EP3694578A1 (en) 2017-10-09 2020-08-19 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
CN111885914B (zh) * 2017-10-27 2022-05-13 投资健康有限责任公司 使用芴衍生物制造扩增的造血干细胞的组合物和方法
WO2019090079A1 (en) 2017-11-03 2019-05-09 Amgen Inc. System and approaches for sterilizing a drug delivery device
WO2019090303A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
WO2019089178A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
CA3079665A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 Amgen Inc. Plungers for drug delivery devices
MX2020005066A (es) 2017-11-16 2020-08-20 Amgen Inc Autoinyector con deteccion de detencion y punto final.
WO2019099324A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 Amgen Inc. Door latch mechanism for drug delivery device
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
WO2019148444A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
MA52186A (fr) 2018-03-26 2021-02-17 Amgen Inc Glycoformes afucosylées totales d'anticorps produits en culture cellulaire
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
EP3826701A1 (en) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
US20210228815A1 (en) 2018-07-24 2021-07-29 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
CA3103682A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
EP3829692A1 (en) 2018-07-31 2021-06-09 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
MA53724A (fr) 2018-09-24 2021-12-29 Amgen Inc Systèmes et procédés de dosage interventionnel
AU2019350660A1 (en) 2018-09-28 2021-03-18 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
AR116679A1 (es) 2018-10-02 2021-06-02 Amgen Inc Sistemas de inyección para la administración de fármacos con transmisión de fuerza interna
EP3860686A1 (en) 2018-10-05 2021-08-11 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
SG11202103800RA (en) 2018-10-15 2021-05-28 Amgen Inc Drug delivery device having damping mechanism
CA3109988A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Amgen Inc. Platform assembly process for drug delivery device
WO2020092056A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial needle retraction
EP3873566A1 (en) 2018-11-01 2021-09-08 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
MA54057A (fr) 2018-11-01 2022-02-09 Amgen Inc Dispositifs d'administration de médicament à rétraction partielle d'élément d'administration de médicament
AU2019393487A1 (en) * 2018-12-03 2021-06-03 Teijin Pharma Limited Anti-IGF-I receptor humanized antibody
JP2022512367A (ja) 2018-12-12 2022-02-03 ケモセントリックス，インコーポレイティド 癌治療のためのｃｘｃｒ７阻害剤
EP3897851A2 (en) 2018-12-17 2021-10-27 Revitope Limited Twin immune cell engager
US20220160972A1 (en) 2019-04-24 2022-05-26 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
CA3148261A1 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Amgen Inc. Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
WO2021062372A1 (en) 2019-09-26 2021-04-01 Amgen Inc. Methods of producing antibody compositions
EP4162257A1 (en) 2020-06-04 2023-04-12 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
EP4229080A1 (en) 2020-10-15 2023-08-23 Amgen Inc. Relative unpaired glycans in antibody production methods
AU2022213913A1 (en) 2021-01-27 2023-08-17 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Single-domain antibody against cd16a and use thereof
AU2022233150A1 (en) * 2021-03-08 2023-09-21 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education MOLECULES THAT BIND TO CD66e POLYPEPTIDES
CN112794912B (zh) * 2021-04-14 2021-07-06 苏州普乐康医药科技有限公司 一种抗igf-1r抗体及其应用
EP4342497A1 (en) 2021-05-10 2024-03-27 Kawasaki Institute of Industrial Promotion Antibody having reduced binding affinity for antigen
WO2022246055A1 (en) 2021-05-21 2022-11-24 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container
EP4352094A1 (en) 2021-06-07 2024-04-17 Amgen Inc. Using fucosidase to control afucosylation level of glycosylated proteins
WO2023059607A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
WO2023143484A1 (zh) * 2022-01-29 2023-08-03 明慧医药（杭州）有限公司 一种抗原结合蛋白及其用途
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
CN117079823B (zh) * 2023-10-17 2024-01-02 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 早期预测选择性胎儿生长受限发病风险筛查的***和方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996033735A1 (en) * 1995-04-27 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice

Family Cites Families (131)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US586510A (en) * 1897-07-13 Coal-grading machine
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
WO1986005807A1 (en) 1985-04-01 1986-10-09 Celltech Limited Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
GB8827305D0 (en) 1988-11-23 1988-12-29 British Bio Technology Compounds
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6020145A (en) * 1989-06-30 2000-02-01 Bristol-Myers Squibb Company Methods for determining the presence of carcinoma using the antigen binding region of monoclonal antibody BR96
US4968516A (en) * 1989-07-24 1990-11-06 Thompson Neal W Method and apparatus for cooking foodstuffs using auxiliary steam
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
GB8928874D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US6657103B1 (en) * 1990-01-12 2003-12-02 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
DK0585287T3 (da) 1990-07-10 2000-04-17 Cambridge Antibody Tech Fremgangsmåde til fremstilling af specifikke bindingsparelementer
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5165424A (en) 1990-08-09 1992-11-24 Silverman Harvey N Method and system for whitening teeth
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1992003917A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International Homologous recombination in mammalian cells
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2246502T3 (es) 1990-08-29 2006-02-16 Genpharm International, Inc. Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
DE69233697T2 (de) 1991-03-01 2008-01-24 Dyax Corp., Cambridge Verfahren zur Entwicklung von bindenden Mikroproteinen
DE69233750D1 (de) 1991-04-10 2009-01-02 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer Rezeptoren mittels Phagemiden
JP2527896B2 (ja) 1991-04-19 1996-08-28 ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング ヒト骨由来インスリン様成長因子結合タンパク
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
AU2515992A (en) 1991-08-20 1993-03-16 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
DK0605522T3 (da) 1991-09-23 2000-01-17 Medical Res Council Fremgangsmåde til fremstilling af humaniserede antistoffer
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
JPH05244982A (ja) 1991-12-06 1993-09-24 Sumitomo Chem Co Ltd 擬人化ｂ−ｂ１０
US5777085A (en) 1991-12-20 1998-07-07 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with GPIIB/IIIA
AU675929B2 (en) 1992-02-06 1997-02-27 Curis, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
WO1993016043A1 (en) 1992-02-18 1993-08-19 Otsuka Kagaku Kabushiki Kaisha β-LACTAM COMPOUND AND CEPHEM COMPOUND, AND PRODUCTION THEREOF
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
ATE381614T1 (de) 1992-07-24 2008-01-15 Amgen Fremont Inc Bildung von xenogenen antikörpern
US6177401B1 (en) 1992-11-13 2001-01-23 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften Use of organic compounds for the inhibition of Flk-1 mediated vasculogenesis and angiogenesis
US5455258A (en) 1993-01-06 1995-10-03 Ciba-Geigy Corporation Arylsulfonamido-substituted hydroxamic acids
ES2146648T3 (es) 1993-03-09 2000-08-16 Genzyme Corp Procedimiento de aislamiento de proteinas de la leche.
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
IT1270882B (it) * 1993-10-05 1997-05-13 Isagro Srl Oligopeptidi ad attivita' fungicida
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
JPH08140528A (ja) 1993-12-03 1996-06-04 Genpharm Internatl Inc 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
IL112248A0 (en) 1994-01-25 1995-03-30 Warner Lambert Co Tricyclic heteroaromatic compounds and pharmaceutical compositions containing them
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
US5863949A (en) 1995-03-08 1999-01-26 Pfizer Inc Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
CA2218503C (en) 1995-04-20 2001-07-24 Pfizer Inc. Arylsulfonyl hydroxamic acid derivatives
EP0826034A4 (en) 1995-04-21 2002-06-19 Cell Genesys Inc PRODUCTION OF LARGE GENOMIC DNA DELETIONS
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
US5747498A (en) 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
US5880141A (en) 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
GB9520822D0 (en) 1995-10-11 1995-12-13 Wellcome Found Therapeutically active compounds
US6084085A (en) * 1995-11-14 2000-07-04 Thomas Jefferson University Inducing resistance to tumor growth with soluble IGF-1 receptor
GB9624482D0 (en) 1995-12-18 1997-01-15 Zeneca Phaema S A Chemical compounds
ATE225343T1 (de) 1995-12-20 2002-10-15 Hoffmann La Roche Matrix-metalloprotease inhibitoren
JP4464466B2 (ja) 1996-03-05 2010-05-19 アストラゼネカ・ユーケイ・リミテッド ４―アニリノキナゾリン誘導体
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5994619A (en) 1996-04-01 1999-11-30 University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus Production of chimeric bovine or porcine animals using cultured inner cell mass cells
IL118626A0 (en) * 1996-06-11 1996-10-16 Xtl Biopharmaceuticals Limited Anti HBV antibody
EP0818442A3 (en) 1996-07-12 1998-12-30 Pfizer Inc. Cyclic sulphone derivatives as inhibitors of metalloproteinases and of the production of tumour necrosis factor
ES2186908T3 (es) 1996-07-13 2003-05-16 Glaxo Group Ltd Compuestos heterociciclos condensados como inhibidores de pproteina-tirosina-quinasas.
HRP970371A2 (en) 1996-07-13 1998-08-31 Kathryn Jane Smith Heterocyclic compounds
TR199900048T2 (xx) 1996-07-13 1999-04-21 Glaxo Group Limited Protein tirozin kinaz inhibit�rleri olarak bisiklik heteroaromatik bile�ikler
HUP9903014A3 (en) 1996-07-18 2000-08-28 Pfizer Phosphinate derivatives having matrix metalloprotease inhibitor effect and medicaments containing the same
US6153609A (en) 1996-08-23 2000-11-28 Pfizer Inc Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
ID18494A (id) 1996-10-02 1998-04-16 Novartis Ag Turunan pirazola leburan dan proses pembuatannya
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
DK1500329T3 (da) 1996-12-03 2012-07-09 Amgen Fremont Inc Humane antistoffer, der specifikt binder TNF-alfa
CA2277100C (en) 1997-01-06 2005-11-22 Pfizer Inc. Cyclic sulfone derivatives
TR199901849T2 (xx) 1997-02-03 2000-02-21 Pfizer Products Inc. Arils�lfonilamino hidroksamik asit t�revleri.
CA2279863A1 (en) 1997-02-07 1998-08-13 Pfizer Inc. N-hydroxy-beta-sulfonyl-propionamide derivatives and their use as inhibitors of matrix metalloproteinases
NZ336836A (en) 1997-02-11 2001-02-23 Pfizer Arylsulfonyl hydroxamic acid derivatives suitable for a broad range of medicinal treatments
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
CA2289102A1 (en) 1997-05-07 1998-11-12 Sugen, Inc. 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity
JP2002501532A (ja) 1997-05-30 2002-01-15 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド 新規血管形成阻害薬
ATE263147T1 (de) 1997-08-08 2004-04-15 Pfizer Prod Inc Derivate von aryloxyarylsulfonylamino hydroxyaminsäuren
ATE368665T1 (de) 1997-08-22 2007-08-15 Astrazeneca Ab Oxindolylchinazolinderivate als angiogenesehemmer
EP1017682A4 (en) 1997-09-26 2000-11-08 Merck & Co Inc NEW ANGIOGENESIS INHIBITORS
CN1280580A (zh) 1997-11-11 2001-01-17 辉瑞产品公司 用作抗癌药的噻吩并嘧啶和噻吩并吡啶衍生物
GB9725782D0 (en) 1997-12-05 1998-02-04 Pfizer Ltd Therapeutic agents
GB9800575D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
GB9800569D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
GB9801690D0 (en) 1998-01-27 1998-03-25 Pfizer Ltd Therapeutic agents
JP2002505097A (ja) 1998-03-03 2002-02-19 アブジェニックス インク． 治療薬としてのｃｄ１４７結合分子
PA8469501A1 (es) 1998-04-10 2000-09-29 Pfizer Prod Inc Hidroxamidas del acido (4-arilsulfonilamino)-tetrahidropiran-4-carboxilico
PA8469401A1 (es) 1998-04-10 2000-05-24 Pfizer Prod Inc Derivados biciclicos del acido hidroxamico
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
HUP0103617A2 (hu) 1998-05-29 2002-02-28 Sugen, Inc. Protein kinázt gátló, pirrolilcsoporttal helyettesített 2-indolszármazékok, e vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények, valamint e vegyületek alkalmazása
UA60365C2 (ru) 1998-06-04 2003-10-15 Пфайзер Продактс Інк. Производные изотиазола, способ их получения, фармацевтическая композиция и способ лечения гиперпролиферативного заболевания у млекопитающего
EP1105427A2 (en) 1998-08-17 2001-06-13 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US7173005B2 (en) * 1998-09-02 2007-02-06 Antyra Inc. Insulin and IGF-1 receptor agonists and antagonists
DK1004578T3 (da) 1998-11-05 2004-06-28 Pfizer Prod Inc 5-oxo-pyrrolidin-2-carboxylsyrehydroxamidderivater
KR100856446B1 (ko) 1998-12-23 2008-09-04 화이자 인크. Ｃｔｌａ－４에 대한 인간 단일클론 항체
AU3579200A (en) 1999-02-26 2000-09-14 Saltech I Goteborg Ab Method and composition for the regulation of hepatic and extrahepatic productionof insulin-like growth factor-1
KR101222450B1 (ko) 1999-03-25 2013-01-16 애보트 게엠베하 운트 콤파니 카게 사람 ｉｌ-12에 결합하는 사람 항체 및 이의 제조방법
JP4224894B2 (ja) * 1999-06-04 2009-02-18 チッソ株式会社 複合強化ポリオレフィン樹脂組成物の製造方法及びその製造装置
US20030165502A1 (en) * 2000-06-13 2003-09-04 City Of Hope Single-chain antibodies against human insulin-like growth factor I receptor: expression, purification, and effect on tumor growth
US7329745B2 (en) 2000-06-13 2008-02-12 City Of Hope Single-chain antibodies against human insulin-like growth factor I receptor: expression, purification, and effect on tumor growth
AR032028A1 (es) 2001-01-05 2003-10-22 Pfizer Anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento similar a insulina
PL222211B1 (pl) * 2001-06-26 2016-07-29 Amgen Fremont Inc Przeciwciało przeciwko OPGL, kompozycja je zawierająca, jego zastosowanie i sposób jego wytwarzania, sposób wykrywania poziomu OPGL, kompozycja obejmująca polinukleotydy i komórka gosodarza
US7538195B2 (en) * 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
WO2005016970A2 (en) 2003-05-01 2005-02-24 Imclone Systems Incorporated Fully human antibodies directed against the human insulin-like growth factor-1 receptor
KR100825156B1 (ko) * 2003-08-13 2008-04-24 화이자 프로덕츠 인코포레이티드 변형된 인간 ｉｇｆ-ｉｒ 항체
SV2006001990A (es) * 2004-01-09 2006-01-30 Pfizer Anticuerpos contra madcam
US9672526B2 (en) 2012-03-13 2017-06-06 American Express Travel Related Services Company, Inc. Systems and methods for tailoring marketing
US10884952B2 (en) 2016-09-30 2021-01-05 Intel Corporation Enforcing memory operand types using protection keys

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996033735A1 (en) * 1995-04-27 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HERMANTO U. ET AL.: "Inhibition of mitogen-activated protein kinase kinase selectively inhibits cell proliferation in human breast cancer cells displaying enhanced insulin-like growth factor I-mediated mitogen-activated protein kinase activation", CELL GROWTH & DIFFERENTIATION: THE MOLECULAR BIOLOGY JOURNAL OF THE AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH. UNITED STATES DEC. 2000, vol. 11, no. 12, December 2000 (2000-12), pages 655-664, XP002229921, ISSN: 1044-9523, abstract, page 659, right-hand column, line 33-41 *
LI S.-L. ET AL.: "SINGLE-CHAIN ANTIBODIES AGAINST HUMAN INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR I RECEPTOR: EXPRESSION, PURIFICATION AND EFFECT ON TUMOR GROWTH", CANCER IMMUNOLOGY AND IMMUNOTHERAPY, BERLIN, DE, vol. 49, no. 4/5, July 2000 (2000-07), pages 243-252, XP001113064, ISSN: 0340-7004, figure 1, page 243, right-hand column, line 40 page 244, left-hand column, line 22 page 250, right-hand column, line 21-28 *

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0302525A2 (hu) 2003-10-28
BG112197A (bg) 2016-05-31
US8642037B2 (en) 2014-02-04
JP6166243B2 (ja) 2017-07-19
ES2344592T3 (es) 2010-09-01
EE05724B1 (et) 2014-10-15
EP2194067A2 (en) 2010-06-09
US20100255538A1 (en) 2010-10-07
NO20033074L (no) 2003-07-04
PL224873B1 (pl) 2017-02-28
US7037498B2 (en) 2006-05-02
GT200100257A (es) 2002-09-02
CN1854157A (zh) 2006-11-01
TWI324609B (en) 2010-05-11
HRP20030627A2 (en) 2005-06-30
AP2001002365A0 (en) 2001-12-31
BR0116728A (pt) 2005-04-12
BG111652A (en) 2014-03-31
CA2433800C (en) 2016-09-13
PT1399483E (pt) 2010-07-20
TNSN01177A1 (fr) 2005-11-10
CR10134A (es) 2010-09-14
NZ569856A (en) 2010-03-26
BG108037A (bg) 2005-04-30
EP2275446A3 (en) 2012-08-15
EA012079B3 (ru) 2018-07-31
US20120005767A1 (en) 2012-01-05
PL217921B1 (pl) 2014-09-30
CA2433800A1 (en) 2002-07-11
UA87804C2 (ru) 2009-08-25
CN1330668C (zh) 2007-08-08
KR100830082B1 (ko) 2008-05-20
SG138469A1 (en) 2008-01-28
US20140120089A1 (en) 2014-05-01
EP2194067B1 (en) 2017-12-06
CR10786A (es) 2009-06-04
UY35948A (es) 2016-08-31
EE05715B1 (et) 2014-06-16
MX349009B (es) 2017-07-06
JP4456166B2 (ja) 2010-04-28
US20050244408A1 (en) 2005-11-03
HK1072059A1 (en) 2005-08-12
IL156661A (en) 2008-11-26
IS6866A (is) 2003-07-04
NO20033074D0 (no) 2003-07-04
HN2001000283A (es) 2002-05-09
IS2790B (is) 2012-06-15
US9234041B2 (en) 2016-01-12
US7700742B2 (en) 2010-04-20
MX337162B (es) 2016-02-15
DK1399483T3 (da) 2010-08-02
EE201300037A (et) 2014-04-15
RS51373B (sr) 2011-02-28
US20040086503A1 (en) 2004-05-06
SK287954B6 (sk) 2012-07-03
US20050281812A1 (en) 2005-12-22
US20160096894A1 (en) 2016-04-07
NZ527302A (en) 2006-10-27
HRP20130659A2 (hr) 2013-09-30
CN1854157B (zh) 2013-01-02
CR7045A (es) 2005-09-02
ATE464322T1 (de) 2010-04-15
AU2002231368C1 (en) 2018-08-16
ECSP034711A (es) 2003-10-28
MA26040A1 (fr) 2004-04-01
EP2275446A2 (en) 2011-01-19
SV2007000775A (es) 2007-03-15
HK1203521A1 (en) 2015-10-30
PE20020801A1 (es) 2002-09-06
PL407889A1 (pl) 2014-10-13
MY143465A (en) 2011-05-13
GEP20084484B (en) 2008-09-25
BRPI0116728B1 (pt) 2018-10-30
NO339789B1 (no) 2017-01-30
EP2194067A3 (en) 2012-08-15
UY27087A1 (es) 2002-06-20
BG66460B1 (bg) 2014-10-31
WO2002053596A2 (en) 2002-07-11
ME00502B (me) 2011-10-10
OA12589A (en) 2006-06-08
EA200300766A1 (ru) 2004-06-24
US7815907B2 (en) 2010-10-19
IL156661A0 (en) 2004-01-04
CZ301712B6 (cs) 2010-06-02
EP2796468A2 (en) 2014-10-29
DE60141855D1 (de) 2010-05-27
PL366340A1 (en) 2005-01-24
HK1098162A1 (en) 2007-07-13
AU2002231368B2 (en) 2006-11-23
ZA200305995B (en) 2004-08-04
CN1564829A (zh) 2005-01-12
PL413188A1 (pl) 2016-01-18
KR20040030481A (ko) 2004-04-09
PL228041B1 (pl) 2018-02-28
JP2009297037A (ja) 2009-12-24
WO2002053596A3 (en) 2004-01-08
JP2015057428A (ja) 2015-03-26
CU23447B7 (es) 2009-10-16
YU54203A (en) 2006-03-03
MXPA03006034A (es) 2005-07-01
DZ3494A1 (fr) 2002-07-11
AR032028A1 (es) 2003-10-22
US7982024B2 (en) 2011-07-19
EE200300318A (et) 2003-10-15
EP1399483B1 (en) 2010-04-14
JP5697862B2 (ja) 2015-04-08
EP1399483A2 (en) 2004-03-24
AP2072A (en) 2009-12-10
JP2004531217A (ja) 2004-10-14
CZ20032131A3 (cs) 2004-01-14
CR20140001A (es) 2014-02-05
SK9932003A3 (en) 2004-06-08
JP2009108055A (ja) 2009-05-21
PA8535501A1 (es) 2003-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA012079B1 (ru) Моноклональное антитело к рецептору инсулиноподобного фактора роста i (igf-i) и способы его применения
JP6960485B2 (ja) 線維芽増殖因子受容体２に対するモノクローナル抗体
RU2365382C2 (ru) Композиции и способы для регуляции развития сосудов
KR100480985B1 (ko) 표피 성장 인자 수용체에 대한 사람화된 항체
US20060134121A1 (en) DII4 antagonists, assays, and therapeutic methods thereof
EA006972B1 (ru) Моноклональное антитело человека к ctla-4 и способы его применения
EA011449B1 (ru) Моноклональное антитело человека к cd40 и способы его применения
CN101160321A (zh) Q3 sparc缺失突变体及其用途
CN107188969A (zh) 抗‑表皮生长因子受体变体iii嵌合抗原受体及其用于治疗癌症的用途
EA015589B1 (ru) Антитела против миостатина и их применение
EA020465B1 (ru) ИЗОЛИРОВАННЫЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С ErbB3, НАБОРЫ И КОМПОЗИЦИИ, ИХ СОДЕРЖАЩИЕ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
CN103619881A (zh) 新的egfr结合蛋白
JP2005530687A (ja) Ｆｇｆｒアゴニスト
US20090123462A1 (en) Fgfr agonists
DE69837897T2 (de) Mit A33 verwandte Antigene und deren pharmazeutische Verwendungen
KR20210142638A (ko) Cd3 항원 결합 단편 및 이의 응용
KR20100023869A (ko) 페리오스틴의 Ｅｘｏｎ-17 부위에 의해 코드되는 펩티드에 대한 항체를 함유하는 암 치료제
US20210379147A1 (en) Method and system for treating cancer utilizing tinagl1
JPWO2007043200A1 (ja) Ｔ細胞分化調節剤
US20220112559A1 (en) Targeting treatment for adam30 in pathological cells
CN106714833A (zh) Rspo1结合剂及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
LD4A Eurasian patent limited on request of patent holder (b3)
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU