CN102481361B - 用于治疗癌症的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

公开了使用mTOR抑制剂和抗-IGF-1R抗体治疗癌症的方法。

Description

用于治疗癌症的组合物和方法

背景技术

磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)信号传递途径对于许多不同类型的人恶性肿瘤中的癌细胞的生长和存活而言是重要的。参见，Granville CA 等人, “Handicapping the Race to Develop Inhibitors of the Phosphoinositide 4-Kinase/Akt/Mammalian Target of Rapamycin Pathway,”Clin Cancer Res, 2006; 12(3) 679-89。该途径接受来自配体-受体相互作用（诸如表皮生长因子受体和胰岛素-样生长因子受体）的上游输入，并通过诸如雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)等下游效应物发信号。mTOR是一种关键的下游效应分子，其调节对于细胞周期进程和许多其它重要的细胞生长过程而言关键的蛋白的生产。参见，Abraham RT和Gibbons, JJ, “The mammalian target of rapamycin signaling pathway: twists and turns in the road to cancer therapy”. Clin Cancer Res, 2007; 13(11) 3109-14。

PI3激酶轴（axis）的失调在人癌症中是常见的，这是由于过度活跃的生长因子受体信号传递、激活PI3K的突变、PTEN肿瘤抑制基因丧失功能和几种其它的导致mTOR激酶活性活化的机理。在临床上，PI3K轴的成功的药理学抑制已经集中于PI3激酶的上游生长因子受体和下游效应物，诸如mTOR。现在有大量临床证据表明，mTOR抑制剂可以为具有晚期恶性肿瘤的患者提供临床益处。

胰岛素-样生长因子受体1 (IGF-1R，胰岛素受体家族的一种酪氨酸激酶受体)参与细胞增生、分化，并在许多类型的癌症的恶性细胞的转化和维持中起重要作用。参见，Baserga, R等人, “Mini Review: The IGF-1R receptor in cancer biology,” Int. J. Cancer 2003; 107: 873-77。IGR-1R和它的配体IGF-2在许多类型的晚期癌中过表达，且配体-刺激的受体信号传递会在体外促进癌细胞的增生。重要的是，IGF-1R信号传递与PI3K轴紧密相关。IGF-1R抑制已经在临床前研究中表现出有效的抗癌作用，且许多IGF-1R抑制剂目前处于临床开发中。

通过抑制PI3K轴中的上游和下游分子靶标，mTOR和IGF-1R抑制剂的组合可以提供协同效应。mTOR的抑制可以导致反馈环的活化，所述反馈环激活Akt 癌基因，后者在体外和在取自用mTOR抑制剂治疗的患者的肿瘤活组织检查中，表现为肿瘤细胞中增强水平的磷酸-Akt。参见，Sun, S-Y 等人, “Priority Report: Activation of Akt and eIF4E survival pathways by rapamycin-mediated mammalian target of rapamycin inhibition,”Cancer Res 2005; 65(16): 7052-58,和Gardner, H 等人, “Biomarker analysis of a phase II double-blind randomized trial of daily oral RAD001 (everolimus) plus letrozole or placebo plus letrozole as neoadjuvant therapy for patients with estrogen receptor positive breast cancer,” San Antonio Breast Cancer Symposium. San Antonio, TX, 2007年12月 13-16日. 2006年摘要。该反馈环可以通过IGF-1R和胰岛素受体底物参与信号传递，且被IGF-1R抑制剂抑制。结果，临床前研究已经证实，IGF-1R抑制剂和mTOR抑制剂的组合会在体外产生累加的或协同的抗肿瘤活性。最近，2个研究组已经独立地报道了在人肉瘤的异种移植物模型中组合雷帕霉素和抗-IGF-1R抗体的结果。参见，Kurmasheva RT等人, Poster: “Combination of CP-751871, a human monoclonal antibody against the IGF-1 receptor with rapamycin results in highly effective therapy for xenografts derived from childhood sarcomas,”EORTC 2007,和Darko, IA 等人, Abstract: “Evaluation of combined insulin-like growth factor receptor type I (IGF-1R) and mTOR pathway blockade in sarcoma xenograft models”. AACR年会2007, 4760。在这些研究之一中，观察到建立的尤因肉瘤和骨肉瘤异种移植物的完全消退，同时观察到其它有效的抗肿瘤活性（具有来自组合的至少累加益处）。

发明内容

本发明提供了用mTOR抑制剂和抗-IGF-1R抗体治疗选自下述的癌症的方法：非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌、软组织或骨肉瘤和子宫内膜癌，其中所述mTOR抑制剂是ridaforolimus、依维莫司、坦罗莫司、雷帕霉素-类似物或其组合，且所述抗-IGF-1R抗体是dalotuzumab、figitumumab、cixutumumab、SHC 717454、Roche R1507、EM164或Amgen AMG479。

附图说明

图1: 使用Ridaforolimus + MK-0646组合提高致癌的PI3K信号传递的靶向。使用MK-0646和Ridaforolimus的联合治疗会增加PI3K途径抑制，并阻断癌细胞增生。(A) 图解负反馈环的PI3激酶信号传递途径；(B) 证实mTOR 抑制会导致患者肿瘤中升高的AKT-P的公开数据；(C) 在体外H2122细胞中响应于Ridaforolimus (10nM) 、MK-0646 (10ug/ml)或组合的途径信号传递；(D) 指示在细胞中的细胞周期分布和细胞死亡的FACS分析数据，所述细胞用在C中使用的浓度处理24小时。

图2: Ridaforolimus和MK-0646组合在体外会增加效力。在有MK-0646或ridaforolimus或组合存在下，在软琼脂中培养肺癌细胞系。使用荧光染料(LavaCell)定量软琼脂菌落形成，并使用图象采集和分析平台 (Isocyte)计算菌落面积和数目。A) 绘制96孔板的孔中的相对菌落面积。组合显著增强A549和H2122细胞系的生长抑制 (P<0.02)。在下面指示了通过P-RTK阵列测得的RTK的活化状态和KRAS中的活化突变。B) 绘制了9个NSCLC细胞系中响应于Ridaforolimus (10 nM)或MK-0646 (10ug/ml)或组合的相对软琼脂菌落形成。基于KRAS中的活化突变，区分细胞系。

图3: Ridaforolimus和MK-0646组合在突变型-KRAS 异种移植物肿瘤中的抗肿瘤活性。使用MK-0646和Ridaforolimus的联合治疗可以有效地阻断A549异种移植物生长。通过2路ANOVA分析测得，在多个浓度的MK-0646和Ridaforolimus组合的联合治疗组中，观察到显著的肿瘤生长抑制。

图4: 与Ridaforolimus组合的高浓度的MK-0646会在统计学上减小肿瘤重量。给小鼠施用单独的或与Ridaforolimus (0.1 mpk) 组合的MK-0646 (20 mpk) 3周。在与Ridaforolimus组合的更高剂量的MK-0646时，肿瘤重量(参见上面)在统计学上更小，这突出了肿瘤的消退。

图5: A549 异种移植物模型对厄洛替尼治疗是抗性的。与载体相比，在厄洛替尼治疗组中没有观察到显著的生长抑制。

图6: IGF1受体信号转导。靶向磷脂酰-肌醇3-激酶(PIK3CA)途径和Ras途径的筛选命中（hits）分别具有红色或蓝色框。

图7: 通过菌落试验进行的命中验证证实，靶向PI3K途径调节物的shRNA会强烈地影响MK-0646 效能。通过在Alpha图像仪上扫描平板，测定菌落数(A)和菌落面积(B)。MK-0646的顶部的3个最强的增强剂是沉默PI3K途径的效应物的shRNA(用红色突出显示)，而靶向PTEN的shRNA赋予抗药性。

图8: HT29 结肠癌细胞中PTEN的稳定沉默会赋予对MK-0646的抗性。制备了表达靶向PTEN或CSK或MAP3K的不同shRNA的稳定的HT29细胞，并在菌落形成试验中测试了对MK-0646的敏感度。PTEN的沉默证实MK-0646的减少的生长抑制。

图9: PI3K的沉默，而不是PDPK1或MELK的沉默，会重新使PTEN-缺陷型 HT29细胞对MK-0646的作用敏感。RNAi介导的PTEN的敲低（knock-down）会赋予对MK-0646介导的生长抑制的抗性(参见图7和8)。通过MK-0646和PI3K RNAi对IGF1R和PIK3CA的联合抑制，可以阻断PTEN-敲低的细胞的生长。

图10: PI3K和Ras途径激酶在MK-0646增强剂筛选的前列共同命中（top consensus hits）中是突出的。PI3K和Ras途径的标准的和假定的激酶调节物分别用红色和蓝色突出显示。进行定量PCR分析，以评估靶标沉默效率。使用在图7和8中所述的菌落形成试验或短期生长试验，进行命中验证。

图11: 证实的MK-0646敏化命中。在下面显示了在暴露于药物的一个滴度（啊titration of drug）以后，在菌落生长试验中(> 2-倍)或在72-小时阿尔玛（Alamar）试验中(p<0.05)增强肿瘤细胞对MK-0646的敏感度的筛选命中。应当指出，由于在没有药物存在时的毒性，在任一个试验中不能验证某些载体。彩色编码与在图10中的定义相同。

图12: 患者对ridaforolimus-dalotuzumab组合做出应答的CT图像。图像来自具有向肝脏（如图所示）和其它部位转移的***受体阳性的乳腺癌的56岁女性。患者已经经历过多次先前的化疗和激素治疗。上图显示了在肝脏左叶的大肿瘤，下图显示了在与dalotuzumab相组合的ridaforolimus的1期临床试验中治疗2个周期以后的相同肿瘤，其大小显著减小。患者达到在超过8个月的研究治疗以后进行的部分应答。

具体实施方式

作为刻苦研究的结果，发明人已经发现，通过使用与抗-IGF-1R抗体组合的mTOR抑制剂或其药学上可接受的盐，可以实现协同地优良的抗癌活性，其中所述mTOR抑制剂是ridaforolimus、依维莫司、坦罗莫司、雷帕霉素-类似物或其组合，且所述抗-IGF-1R抗体是dalotuzumab、figitumumab、cixutumumab、SHC 717454、Roche R1507、EM164或Amgen AMG479。本发明特别适用于治疗选自下述的癌症：非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌、软组织或骨肉瘤和子宫内膜癌。但是，本发明可以用于治疗不同的其它癌症，诸如脑癌、颅颈癌、食管癌、甲状腺癌、小细胞肺癌、肺癌、胃癌、胆囊/胆管癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、绒毛膜癌、子宫体癌、***、肾盂/输尿管癌、膀胱癌、***癌、***癌、睪丸癌、胎儿癌、Wilms癌、皮肤癌、恶性黑素瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、尤因瘤、软部肉瘤（soft part sarcoma）、急性白血病、慢性淋巴性白血病、慢性髓细胞性白血病和霍奇金淋巴瘤。

因此，本发明涉及用mTOR抑制剂和抗-IGF-1R抗体治疗选自下述的癌症的方法：非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌、软组织或骨肉瘤和子宫内膜癌，其中所述mTOR抑制剂是ridaforolimus、依维莫司、坦罗莫司、雷帕霉素-类似物或其组合，且所述抗-IGF-1R抗体是dalotuzumab、figitumumab、cixutumumab、SHC 717454、Roche R1507、EM164或Amgen AMG479。

在本发明的一个实施方案中，所述mTOR抑制剂是ridaforolimus。

在本发明的另一个实施方案中，所述抗-IGF-1R抗体包含至少一个非人起源的重链互补决定区(CDR)和至少一个源自非人来源的轻链互补决定区(CDR)，其中结合IGF-IR的抗体具有至少一种选自下述的性质：a) 结合IGF-1R，但是不结合IR；(b) 结合包含胰岛素受体和胰岛素生长因子受体的杂合受体(IR/IGF-1R杂合-R)，但是不结合单独的IR；c) 抑制人IGF-1R和IGF-1和/或IGF-2之间的结合；(d) 以小于100 nM的抑制常数和/或IC50，结合杂合-R和它的天然配体，优选地在本文中命名为IGF1和/或IGF2和/或胰岛素；(e) 特异性地抑制所述IGF-1R的酪氨酸激酶活性；(f) 特异性地抑制所述杂合-R的酪氨酸激酶活性；(g) 对所述杂合-R具有10 nM或更小的结合亲和力；(h) 下调IGF-1R表达；(i) 下调杂合-R表达；(j) 抑制体内肿瘤生长。

在本发明的一个类别中，重链CDR包含选自SEQ ID NO. 4、5或6的氨基酸序列，且轻链CDR包含选自SEQ ID NO. 1、2或3的氨基酸序列。

在本发明的另一个类别中，人源化的抗体或它的功能片段之一包含：含有选自SEQ ID No. 7或8的氨基酸序列的轻链，或含有选自SEQ ID NO.: 9、10或11的氨基酸序列的重链。

在本发明的另一个类别中，所述抗-IGF-1R抗体是dalotuzumab。

在本发明的另一个实施方案中，所述mTOR抑制剂是ridaforolimus，且所述抗-IGF-1R抗体是dalotuzumab。

在本发明的另一个实施方案中，以10 mg至40 mg的剂量施用mTOR抑制剂。在本发明的一个类别中，每周施用ridaforolimus 5次。

在本发明的另一个实施方案中，以10 mg/kg的剂量，静脉内地施用抗-IGF-1R抗体。在本发明的一个类别中，每周施用抗-IGF-1R抗体1次。在本发明的另一个类别中，每隔一周施用抗-IGF-1R抗体1次。

可以制备mTOR抑制剂和抗-IGF-1R抗体，用于同时、分别或连续施用。

对上述的优选实施方案的提及意在包括特定和优选组的所有组合，除非另有说明。下面描述了在本说明书中使用的术语的含义，且在下文中更详细地描述了本发明。

在本说明书中使用的术语“同时”是指，本发明的药物制剂在时间上同时施用。

在本说明书中使用的术语“分别”是指，本发明的药物制剂在共同的治疗时间表中的不同时间施用。

在本说明书中使用的术语“连续”是指，在施用一种药物制剂以后，施用其它药物制剂；在施用一种药物制剂以后，可以基本上在第一种药物制剂之后立即施用第二种药物制剂，或可以在第一种药物制剂以后的有效时间段之后施用第二种药物制剂；且所述有效时间段是为了实现施用第一种药物制剂的最大益处而给出的时间量。

在本说明书中使用的术语“癌症”包括不同的肉瘤和癌，且包括实体癌和造血癌。本文提及的实体癌包括，例如，脑癌、颅颈癌、食管癌、甲状腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、胆囊/胆管癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、卵巢癌、绒毛膜癌、子宫体癌、子宫***、肾盂/输尿管癌、膀胱癌、***癌、***癌、睪丸癌、胎儿癌、威尔曼瘤、皮肤癌、恶性黑素瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、尤因瘤、软部肉瘤。另一方面，造血癌包括，例如，急性白血病、慢性淋巴性白血病、慢性髓细胞性白血病、真性红细胞增多症、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤。

在本说明书中使用的术语“治疗癌症”是指，将抗癌剂施用于癌症患者，从而抑制患者中癌细胞的生长。优选地，治疗导致癌症生长消退，或换而言之，它减小可检测的癌的大小。更优选地，治疗导致癌症的完全消失。

mTOR抑制剂

在当前的临床开发中的mTOR抑制剂是雷帕霉素的结构类似物。本发明的mTOR抑制剂包括ridaforolimus、坦罗莫司、依维莫司、雷帕霉素-类似物和它们的组合。

Ridaforolimus（也称作AP 23573、MK-8669和deforolimus）是雷帕霉素的独特的、非前药类似物，其在体外在广范围的人肿瘤细胞系中和在使用人肿瘤细胞系的鼠肿瘤异种移植物模型中具有抗增生活性。已经将Ridaforolimus施用给具有晚期癌症的患者，且目前处于不同晚期恶性肿瘤的临床开发中，包括在具有晚期软组织或骨肉瘤的患者中的研究。迄今，这些试验已经证实，ridaforolimus通常被较好地耐受，具有可预测的和可控制的不利事件特性，且在广范围的癌症中具有抗肿瘤活性。在授权给Ariad Gene Therapeutics, Inc.的美国专利号7,091,213（它通过引用整体并入）中，描述了ridaforolimus的介绍和制备。

坦罗莫司（也称作Torisel®）目前被销售用于治疗肾细胞癌。在授权给American Home Products Corporation的美国专利号5,362,718（它通过引用整体并入）中，描述了坦罗莫司的介绍和制备。

与雷帕霉素(西罗莫司)相比，依维莫司（也称作Certican®或RAD001，由Novartis销售）在有机溶剂中具有更大的稳定性和提高的溶解度，以及更有利的药物动力学和更少的副作用。依维莫司已经与微乳剂环孢素(Neoral®, Novartis)联合使用，用于增加免疫抑制方案的效能。

本发明的mTOR抑制剂也可以作为不同的晶体、无定形物质、药学上可接受的盐、水合物和溶剂化物而存在。此外，本发明的mTOR抑制剂可以作为前药来提供。一般而言，这样的前药是本发明的mTOR抑制剂的功能衍生物，其可以被活体容易地转化成需要的化合物。因此，在本发明的不同癌症的治疗方法中，术语“施用”不仅包括特定化合物的施用，而且包括这样的化合物的施用，所述化合物在施用给患者以后可以在活体中转化成特定化合物。用于选择和生产合适的前药衍生物的常规方法描述在，例如，“Design of Prodrugs”, H. Bundgaard编, Elsevier, 1985，它在本文中提及，并且整体并入本文，作为本说明书的一部分。化合物的代谢物可以包括将化合物放入生物环境中生成的活性化合物，且在本发明化合物的范围内。

抗-IGF-1R抗体

本发明的抗-IGF-1R抗体是分离的抗体或其功能片段，其中所述抗体或它的所述片段之一能够特异性地结合人胰岛素-样生长因子I受体，且如果必要，优选地此外能够抑制配体IGF1和/或IGF2与IGF-IR的结合，和/或能够特异性地抑制使至少一种配体结合所述IGF-IR受体的信号传递级联。本发明的IGF-1R抗体包括能够特异性地结合IGF-1R的单克隆和/或多克隆抗体。本发明的抗-IGF-1R抗体包括dalotuzumab、figitumumab、cixutumumab、SHC 717454、Roche R1507、EM164和Amgen AMG479。

Dalotuzumab的特征在于，它包含这样的轻链，所述轻链包含至少一个选自氨基酸序列SEQ ID No. 1、2或3的CDR的互补性决定区CDR，或至少一个其序列在最佳比对后与序列SEQ ID No. 1、2或3具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的CDR，或特征在于，它包含这样的重链，所述重链包含至少一个选自氨基酸序列SEQ ID No. 4、5和6的CDR的CDR，或至少一个其序列在最佳比对后与序列SEQ ID No. 4、5和6具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的CDR。制备和使用所述抗-IGF-1R抗体的方法描述在美国专利号7,214,444中，它通过引用整体并入本文。

在本说明书中，术语“结合”和“连接”具有相同的含义，且是可互换的。

在本说明书中，与抗体化合物或它们的序列相结合的术语多肽、多肽序列、肽和蛋白是可互换的。

在本文必须理解，本发明不涉及天然形式的抗体，也就是说，它们不是在它们的天然环境中，但是已经能够通过从天然来源的纯化而分离或得到，或者通过基因重组或通过化学合成而得到，它们还可以含有在将来要描述的非天然的氨基酸。

CDR区或CDR意在指示免疫球蛋白的重链和轻链的高变区，如由Kabat 等人 (Kabat 等人, Sequences of proteins of immunological interest, 第5版, 美国健康和人类服务部, NIH, 1991,和更晚的版本)所定义的。存在3个重链CDR和3个轻链CDR。术语CDR在本文中用于表示（根据情况）这些区域之一或这些区域中的几个或甚至全部，所述区域含有负责抗体对它识别的抗原或表位的结合亲和力的大部分氨基酸残基。

在本发明的意义上，2个核酸或氨基酸序列之间的“同一性百分比” 意在表示，在最好比对(最佳比对)后得到的在要对比的2个序列之间相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比，该百分比纯粹是统计学的，2个序列之间的差异在它们的整个长度上随机分布。传统地，如下进行2个核酸或氨基酸序列之间的序列对比：在已经以最佳方式比对它们以后，对比这些序列，所述对比能够按照区段或按照“对比窗”来进行。除了手工地进行序列的最佳比对以外，还可以借助于Smith和Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482]的局部同源性算法，借助于Neddleman和Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48: 443]的局部同源性算法，借助于Pearson和Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444)的相似性搜索方法，借助于使用这些算法的计算机软件 (在威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI，或通过BLAST N或BLAST P对比软件)。

如下确定2个核酸或氨基酸序列之间的同一性百分比：通过对比以最佳方式比对的这2个序列，且其中要对比的核酸或氨基酸序列可以包含相对于参照序列的添加或删除，所述参照序列用于这2个序列之间的最佳比对。如下计算同一性百分比：确定2个序列之间具有相同核苷酸或氨基酸残基的相同位置的数目，将该相同位置的数目除以对比窗中的位置总数，并将得到的结果乘以100，以便得到这2个序列之间的同一性百分比。

例如，可能使用BLAST程序、“BLAST 2序列” (Tatusova 等人, “Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences”, FEMS Microbiol Lett. 174:247-250)，其可以在网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/bl2.html上得到，使用的参数是默认给出的那些(具体地，对于参数“开放间隙罚分”: 5，“延伸间隙罚分: 2；选择的矩阵是，例如，该程序建议的矩阵“BLOSUM 62”)，通过程序直接地计算要对比的2个序列之间的同一性百分比。

与参照氨基酸序列具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的氨基酸序列是指，相对于参照序列具有某些修饰的氨基酸序列，具体地，至少一个氨基酸的删除、添加或置换、截短或延长是优选的。在置换一个或多个连续或不连续氨基酸的情况下，其中用“等效”氨基酸替换被置换的氨基酸的置换是优选的。表述“等效氨基酸”在本文中目的在于表示，能够被基础结构的氨基酸之一置换的任意氨基酸，但是基本上没有改变对应的抗体的生物活性，诸如在以后特别是在实施例中所定义的。

依赖于它们与它们替换的氨基酸的结构同源性，或能够实现的不同抗体之间的生物活性的对比试验的结果，可以确定这些等效氨基酸。

通过实施例，可以阐述能够进行的置换的可能性，而不导致对应的修饰的抗体的生物活性的深远改变。因而可能用缬氨酸或异亮氨酸替换亮氨酸、用谷氨酸替换门冬氨酸、用天冬酰胺替换谷氨酰胺、用赖氨酸替换精氨酸等，在相同的条件下，可以自然地预见到反向置换。

根据本发明的抗体优选地是特异性的单克隆抗体，特别是鼠、嵌合的或人源化的起源的单克隆抗体，它们可以根据本领域技术人员众所周知的标准方法得到。

一般而言，为了制备单克隆抗体或它们的功能片段（特别是鼠起源的），可能参考在手册“Antibodies” (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, 第726页, 1988)中具体描述的技术，或Kohler和Milstein (Nature, 256:495-497, 1975)描述的从杂交瘤制备的技术。

例如，从针对IGF-IR受体（或它的片段之一，其含有根据本发明的所述单克隆抗体所特异性地识别的表位）免疫的动物细胞，可以得到根据本发明的单克隆抗体。根据常见的工作方法，通过基因重组（从编码IGF-IR受体的cDNA序列的所含有的核酸序列开始），或通过肽合成（从IGF-IR受体的肽序列中所包含的氨基酸序列开始），可以具体地生产所述IGF-IR受体或它的所述片段之一。

可以在例如亲和柱上，纯化根据本发明的单克隆抗体，在所述亲和柱上，已经预先固定化了被根据本发明的所述单克隆抗体特异性地识别的IGF-IR受体或它的含有表位的片段之一。更具体地，可以如下纯化所述单克隆抗体：通过在蛋白A和/或G上的色谱法，其后有或没有离子交换色谱法（目的在于消除残余蛋白污染物以及DNA和LPS），其本身后面有或没有在琼脂糖凝胶上的排阻色谱法（以便消除由于二聚体或其它多聚体的存在造成的潜在聚集体）。以甚至更优选的方式，这些技术整体可以同时地或连续地使用。

根据本发明的抗体同样包括嵌合的或人源化的抗体。

嵌合抗体意在表示这样的抗体，其含有源自给定物种的抗体的天然可变(轻链和重链) 区，所述可变区与所述给定物种的异种物种的抗体的轻链和重链恒定区相组合。

使用基因重组技术，可以制备根据本发明的抗体或它们的嵌合类型的片段。例如，通过克隆重组DNA，可以制备嵌合抗体，所述重组DNA含有启动子、编码根据本发明的非人类的（特别是鼠的）单克隆抗体的可变区的序列、和编码人抗体的恒定区的序列。由这样的重组基因编码的本发明的嵌合抗体是，例如，小鼠-人嵌合体，该抗体的特异性由源自鼠DNA的可变区决定，它的同种型由源自人DNA的恒定区决定。关于嵌合抗体的制备方法，可能参考例如文件Verhoeyn 等人 (BioEssays, 8:74, 1988)。

人源化的抗体意在表示这样的抗体，其含有源自非人起源的抗体的CDR区，所述抗体分子的其它部分源自一种(或几种)人抗体。此外，可以修饰骨架(称作FR)的区段的一些残基，以便保持结合亲和力(Jones 等人, Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen 等人, Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann 等人, Nature, 332:323-327, 1988)。

通过本领域技术人员已知的技术(例如，在下述文献中描述的那些：Singer 等人, J. Immun. 150:2844-2857, 1992; Mountain 等人, Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10: 1-142, 1992;或Bebbington 等人, Bio/Technology, 10:169-175, 1992)，可以制备根据本发明的人源化的抗体或它们的片段。对于它们在体外诊断方法中的应用，或在或体内预防和/或治疗性处理中，根据本发明的这样的人源化的抗体是优选的。

根据本发明的抗体的功能片段意在特别地表示这样的抗体片段，诸如Fv、scFv (sc表示单链)、Fab、F(ab’)₂、Fab’、scFv-Fc 片段或双特异抗体或已经通过化学修饰（诸如添加聚(亚烷基)乙二醇诸如聚(亚乙基)乙二醇(“聚乙二醇化”)）或通过掺入脂质体中增加了其半衰期的任意片段(聚乙二醇化的片段称作Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)₂-PEG或Fab’-PEG) (“PEG”表示聚(亚乙基)乙二醇)，所述片段具有根据本发明的序列SEQ ID No. 1、2、3、4、5或6的特征CDR中的至少一个，且具体地，它能够以一般方式发挥它的来源抗体的甚至部分活性，诸如具体地，识别和结合IGF-IR受体的能力，和如果必要，抑制IGF-IR受体的活性的能力。

优选地，所述功能片段构成或包含它们的来源抗体的重或轻可变链的部分序列，所述部分序列足以保持与它的来源抗体相同的对IGF-IR受体的结合特异性和足够的亲和力，优选至少等于它的来源抗体的1/100、更优选至少1/10。

这样的功能片段含有它的来源抗体的序列的最少5个氨基酸，优选10、15、25、50和100个连续氨基酸。

优选地，这些功能片段是Fv、scFv、Fab、F(ab’)₂、F(ab’)、scFv-Fc型的片段或双特异抗体，其通常具有与它们的来源抗体相同的结合特异性。根据本发明，通过诸如酶消化（诸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化）和/或经由化学还原来切割二硫键等方法，从诸如上述的抗体开始，可以得到本发明的抗体片段。以另一个方式，通过本领域技术人员同样众所周知的基因重组技术，或通过肽合成（借助于例如自动的肽合成仪，诸如由Applied Biosystems公司等提供的那些），可以得到在本发明中包含的抗体片段。

以一个更优选的方式，本发明包含根据本发明的抗体或它们的功能片段，尤其是通过基因重组或通过化学合成得到的嵌合的或人源化的抗体。

在一个优选的实施方案中，本发明的主题是根据本发明的抗体或它的功能片段之一，其特征在于，它包含：含有至少一个序列SEQ ID No. 6的CDR的重链，或在最佳比对后与序列SEQ ID No. 6具有至少80%同一性的序列。

在6个短的CDR序列中，重链的第三个CDR (CDRH3)具有更大的尺寸变异性(更大的多样性，主要是由于产生它的基因的排列的机理)。它可以短至2个氨基酸，尽管已知的最长尺寸是26。在功能上，CDRH3在抗体特异性的确定中起部分作用(Segal 等人, PNAS, 71:4298-4302, 1974; Amit 等人, Science, 233:747-753, 1986; Chothia 等人, J. Mol. Biol., 196:901-917, 1987; Chothia 等人, Nature, 342:877-883, 1989; Caton 等人, J. Immunol., 144:1965-1968, 1990; Sharon 等人, PNAS, 87:4814-4817, 1990; Sharon 等人, J. Immunol., 144:4863-4869, 1990; Kabat 等人, J. Immunol., 147:1709-1719, 1991)。

已知，仅低百分比的CDR氨基酸促成抗体结合部位的构建，但是这些残基必须维持非常特异性的三维构象。

以一个更优选的方式，本发明涉及根据本发明的抗体或它的功能片段之一，其特征在于，它包含这样的重链，所述重链含有序列SEQ ID No. 4、5和6的3个CDR中的至少2个或3个CDR，或在最佳比对后与序列SEQ ID No. 4、5和6分别具有至少80%同一性的3个CDR序列中的至少2个或3个CDR。

在一个同样优选的实施方案中，本发明的主题是根据本发明的抗体或它的功能片段之一，其特征在于，它包含这样的轻链，所述轻链含有选自序列SEQ ID No. 1、2或3的CDR中的至少一个CDR，或在最佳比对后其序列与序列SEQ ID No. 1、2或3具有至少80%同一性的CDR。

在一个更优选的实施方案中，本发明的主题是根据本发明的抗体或它的功能片段之一，其特征在于，它包含这样的轻链，所述轻链含有序列SEQ ID No. 1、2和3的3个CDR中的至少2个或3个CDR，或在最佳比对后与序列SEQ ID No. 1、2和3分别具有至少80%同一性的3个CDR序列中的至少2个或3个CDR。

以一个更优选的方式，根据本发明的抗体或它的功能片段之一的特征在于，它包含这样的重链，所述重链含有序列SEQ ID No. 4、5和6的3个CDR，或在最佳比对后与序列SEQ ID No. 4、5和6分别具有至少80%同一性的3个CDR序列，且特征在于，它另外包含这样的轻链，所述轻链含有序列SEQ ID No. 1、2和3的3个CDR，或在最佳比对后与序列SEQ ID No. 1、2和3分别具有至少80%同一性的3个CDR序列。

根据另一个方面，本发明的主题是根据本发明的抗体或它的功能片段之一，其特征在于，它不结合或它不以显著的方式结合人胰岛素受体IR。

以一个优选的方式，根据本发明的所述功能片段选自片段 Fv、scFv、Fab、(Fab’)₂、Fab’、scFv-Fc或双特异抗体或已经通过化学修饰（特别是通过聚乙二醇化）或通过掺入脂质体中增加了其半衰期的任意功能片段。

根据另一个方面，本发明涉及能够分泌根据本发明的单克隆抗体的鼠杂交瘤，尤其是鼠起源的杂交瘤，诸如于2001年9月19日在编号I-2717下保藏在Centre National de Culture De Microorganisme (CNCM, 法国微生物培养中心) (Institut Pasteur, Paris, France)的杂交瘤。

所述单克隆抗体（在本文中称作7C10）或它的功能片段之一的特征在于，所述抗体是由在2001年9月19日在编号I-2717下保藏在CNCM的杂交瘤分泌，且当然是本发明的一部分。

“Dalotuzumab”、“h7C10”、“MK-0646”或“F50035”可互换地用于描述人源化的抗体，所述抗体被表征为结合IGF-1R以及结合IR/IGF-1杂合受体。这样的抗体可以包括在例如美国系列号10/735,916 (US20050084906，它是PCT/FR03/00178和/或US20050249730的部分继续申请)中描述的抗体，其中所述抗体是人源化的抗体或其片段，且包含这样的轻链和/或重链，其中所述轻链和/或重链的骨架区段FR1至FR4分别源自人抗体轻链和/或重链的骨架区段FR1至FR4。人源化的抗体可以包含至少一个轻链和至少一个重链，所述轻链包含至少一个或多个源自非人来源且具有选自SEQ ID NO: 1、2或3的氨基酸序列的互补决定区，所述重链包含至少一个或多个具有选自SEQ ID NO 4、5或6的氨基酸序列的互补决定区。所述轻链可以包含一个或多个如在SEQ ID No. 7或8之一中所述的氨基酸序列，或在最佳比对后与序列SEQ ID No. 7或8具有至少80%同一性的序列。同样地，所述重链包含一个或多个如在SEQ ID No. 9、10或11之一中所述的氨基酸序列，或在最佳比对后与序列SEQ ID No. 9、10或11具有至少80%同一性的序列。

在一个具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的鼠抗体或它的功能片段之一，其特征在于，所述抗体包含这样的轻链序列，其含有氨基酸序列SEQ ID No. 12，或在最佳比对后与序列SEQ ID No. 12具有至少80%同一性的序列，或/和特征在于，它包含这样的重链序列，其含有氨基酸序列SEQ ID No. 13，或在最佳比对后与序列SEQ ID No. 13具有至少80%同一性的序列。

Figitumumab（也称作CP 751,871）是由Pfizer研究的一种全人抗体。在授权给Abgenix, Inc和Pfizer, Inc.的美国专利号7,037,498（它通过引用整体并入本文）中，描述了figitumumab的介绍和制备。

Cixutumumab（也称作IMC A-12）是由ImClone研究的一种全人抗体。在美国专利公开号US2008/0025990（它通过引用整体并入本文）中，描述了cixutumumab的介绍和制备。

SHC717454（也称作CP 751,871）是由Schering Plough(现在为Merck & Co., Inc.)研究的一种全人抗体。在授权给Schering Corporation的美国专利号7,217,796（它通过引用整体并入本文）中，描述了SHC717454的介绍和制备。

Roche R1507由Hoffmann-LaRoche研制。在授权给Hoffmann-Laroche, Inc.的美国专利号7,378,503（它通过引用整体并入本文）中，描述了Roche R1507的介绍和制备。

EM164由Immuogen研制。在Imunogen, Inc.的国际专利公开WO03/106621（它通过引用整体并入本文）中，描述了EM164的介绍和制备。

Amgen AMG479由Amgen, Inc研制。在Amgen, Inc.的国际专利公开WO06/069202（它通过引用整体并入本文）中，描述了Amgen AMG479的介绍和制备。

根据一个类似的具体方面，本发明涉及根据本发明的嵌合抗体或它的功能片段之一，其特征在于，所述抗体另外包含源自小鼠异源物种（特别是人）的抗体的轻链和重链恒定区，且以优选的方式，特征在于，源自人抗体的轻链和重链恒定区分别是κ和γ-1、γ-2或γ-4区。

根据一个类似的具体方面，本发明涉及根据本发明的人源化的抗体或它的功能片段之一，其特征在于，所述抗体包含轻链和/或重链，其中所述轻链和/或重链的骨架区段FR1至FR4 (诸如下面在实施例12和13中、在表5和6中所定义的)分别源自人抗体轻链和/或重链的骨架区段FR1至FR4。

优选地，根据本发明的人源化的抗体或它的功能片段之一的特征在于，所述人源化的抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID No. 8的轻链，且特征在于，它包含含有氨基酸序列SEQ ID No. 10或11（优选SEQ ID No. 11）的重链序列。

在本发明中无区别地使用的术语核酸或核酸序列、多核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸序列、核苷酸序列意在表示修饰的或未修饰的精确核苷酸连接，其允许确定核酸的片段或区域，其含有或不含有非天然的核苷酸，且能够对应双链DNA、单链DNA，恰如对应所述DNA的转录产物一样好。

在本文中还必须理解，本发明不涉及在它们的天然染色体环境中（也就是说在它们的天然状态）的核苷酸序列。它涉及已经分离和/或纯化的序列，也就是说，已经直接地或间接地选择它们（例如通过拷贝），它们的环境已经被至少部分地改变。因而在本文中同样意在表示通过基因重组（借助于例如宿主细胞）得到的或通过化学合成得到的分离的核酸。

在最佳比对后与优选序列具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%的同一性百分比的核酸序列意在表示，与参照核酸序列相比，具有某些修饰（例如，具体地，删除、截短、延长、嵌合的融合物和/或置换，特别是点置换）的核酸序列。它优选地涉及这样的序列，其中所述序列编码与参照序列相同的氨基酸序列，这与遗传密码的简并性有关，或涉及能够与参照序列特异性地杂交的互补序列，优选地在高严谨性条件下，特别是诸如下面定义的条件。

在高严谨性条件下的杂交表示，以使它们允许维持互补DNA的2个片段之间的杂交的方式，选择温度条件和离子强度条件。作为例证，用于定义上述多核苷酸片段的目的，杂交步骤的高严谨性条件有利地如下所述。

在2个步骤中进行DNA-DNA或DNA-RNA杂交：(1) 在含有5 x SSC (1 x SSC对应于0.15 M NaCl + 0.015 M 柠檬酸钠溶液)、50%的甲酰胺、7%的十二烷基硫酸钠 (SDS)、10 x Denhardt’s、5%的硫酸葡聚糖和1%的鲑鱼精 DNA的磷酸盐缓冲液 (20 mM, pH 7.5)中在42℃预杂交3小时；(2) 在依赖于探针大小的温度(即：对于> 100个核苷酸的探针大小，42℃)实际杂交20小时，随后是在2 x SSC + 2%的SDS中在20℃洗涤20分钟2次，在0.1 x SSC + 0.1%的SDS中在20℃洗涤20分钟1次。最后一次洗涤是在0.1 x SSC + 0.1%的SDS中在60℃进行30分钟（对于> 100个核苷酸的探针大小）。对于更大或更小尺寸的寡核苷酸，根据Sambrook 等人 (1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 第2版. Cold Spring Harbor)的教导，本领域技术人员可以调节对于确定大小的多核苷酸的如上所述的高严谨性杂交条件。

给药剂量和途径

关于本发明的mTOR抑制剂和抗-IGF-1R抗体，可以选择不同的制剂形式，其实例包括口服制剂诸如片剂、胶囊、散剂、颗粒或液体，或灭菌的液体肠胃外制剂诸如溶液或悬浮液、栓剂、软膏等。mTOR抑制剂可作为药学上可接受的盐得到。使用药学上可接受的载体或稀释剂，制备本发明的mTOR抑制剂和抗-IGF-1R抗体。

在本说明书中使用的术语“药学上可接受的盐”是指常见的药学上可接受的盐。例如，当化合物具有羟基或酸性基团诸如羧基和四唑基时，则它可以在羟基或酸性基团处形成碱加成盐；或当化合物具有氨基或碱性杂环基团时，则它可以在氨基或碱性杂环基团处形成酸加成盐。

碱加成盐包括，例如，碱金属盐，如钠盐、钾盐；碱土金属盐，如钙盐、镁盐；铵盐；和有机胺盐，如三甲胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐、乙醇胺盐、二乙醇胺盐、三乙醇胺盐、普鲁卡因盐、N,N’-二苄基乙二胺盐。

酸加成盐包括，例如，无机酸盐，如盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、高氯酸盐；有机酸盐，如马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、三氟乙酸盐；和磺酸盐，如甲磺酸盐、羟乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐。

术语“药学上可接受的载体或稀释剂”表示赋形剂[例如，脂肪、蜂蜡、半固体和液体多元醇、天然的或氢化的油等]；水(例如，蒸馏水、特别是注射用蒸馏水等)、生理盐水、醇(例如，乙醇)、甘油、多元醇、葡萄糖水溶液、甘露醇、植物油等)；添加剂[例如，扩张剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、润湿剂、稳定剂、乳化剂、分散剂、防腐剂、甜味剂、着色剂、调味剂或芳香剂、浓缩剂、稀释剂、缓冲物质、溶剂或增溶剂、用于实现储存效果的化学品、用于调节渗透压的盐、包衣剂或抗氧化剂]等。

固体制剂可以制成不含有任何添加剂的片剂、胶囊剂、颗粒剂和散剂的形式，或使用适当的载体(添加剂)来制备。这样的载体(添加剂) 的实例可以包括：糖类诸如乳糖或葡萄糖；玉米、小麦或大米的淀粉；脂肪酸诸如硬脂酸；无机盐诸如硅铝酸镁（magnesium metasilicate aluminate）或无水磷酸钙；合成的聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮或聚亚烷基乙二醇；醇诸如十八烷醇或苯甲醇；合成的纤维素衍生物诸如甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素或羟丙基甲基纤维素；和其它常规使用的添加剂诸如明胶、滑石粉、植物油和***树胶。

这些固体制剂（诸如片剂、胶囊剂、颗粒剂和散剂）通常可以含有例如0.1-100%（按重量计算）、优选5-98%（按重量计算）的mTOR抑制剂（基于每种制剂的总重量）。

液体制剂可以制成混悬液、糖浆剂、注射剂和点滴输注剂(静脉内流体)的形式，其中使用在液体制剂中常规使用的适当添加剂，诸如水、醇或植物-衍生的油，诸如大豆油、花生油和芝麻油。

具体地，当以肌肉内注射剂、静脉内注射剂或皮下注射剂的形式肠胃外地施用制剂时，适当的溶剂或稀释剂可以用下述物质例证：注射用蒸馏水，盐酸利多卡因的水溶液(用于肌肉内注射)，生理盐水，葡萄糖水溶液，乙醇，聚乙二醇，丙二醇，用于静脉内注射的液体 (例如，柠檬酸、柠檬酸钠等的水溶液)或电解质溶液(用于静脉内点滴输注和静脉内注射)，或它们的混合溶液。

这样的注射剂可以是初步溶解的溶液的形式，或粉末本身或与合适的载体(添加剂)结合的粉末的形式（其可以在使用时溶解）。基于每种制剂的总重量，注射液可以含有例如0.1-10%（按重量计算）的活性成分。

基于每种制剂的总重量，液体制剂（诸如用于口服给药的悬浮液或糖浆剂）可以含有例如0.1-10%（按重量计算）的活性成分。

根据常规方法或普通技术，本领域的普通技术人员可以制备本发明中的每个制剂。例如，如果制剂是口服制剂，可以如下制备：例如，通过混合适当量的本发明化合物和适当量的乳糖，将该混合物装入适合口服给药的硬明胶胶囊中。另一方面，如果含有本发明化合物的制剂是注射剂，可以如下制备：例如，通过混合适当量的本发明化合物和适当量的0.9% 生理盐水，将该混合物装入注射用管形瓶中。

根据标准药学实践，本发明的组分可以单独地或者与药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂组合地在药物组合物中施用给哺乳动物，包括人。所述组分可以口服给药或肠胃外给药，包括静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下、直肠和局部给药途径。

合适的剂量是医学从业人员已知的，且当然取决于特定疾病状态、施用的组合物的比活、和接受治疗的特定患者。在有些情况下，为了达到希望的治疗量，可能必须提供重复施用，即，重复地单次施用特定监测的或计量的剂量，其中重复单次施用，直到达到希望的日剂量或效果。下面提供了关于合适的剂量的其它信息。

关于本发明组分的术语“施用”及其变体(例如，“施用”化合物)是指，将组分或组分的前药导入需要治疗的动物的***中。当与一种或多种活性剂(例如，mTOR抑制剂)组合地提供本发明的组分或其前药时，“施用”及其变体各自意在包括同时和先后导入组分或其前药和其它药剂。

本文使用的术语“组合物”意在包括包含指定量的指定成分的产品，以及直接或间接由指定量的指定成分的组合所产生的任何产品。

本文使用的术语“治疗有效量”是指可以在组织、***、动物或人体内引起生物学或医学响应的活性化合物或药剂的量，所述响应是研究者、兽医、医生或其它临床医师所寻求的。

将合适量的mTOR抑制剂施用给接受癌症治疗的患者。在一个实施方案中，以约10 mg – 40 mg/天的剂量，施用mTOR抑制剂。在本发明的一个实施方案中，以10 mg/天的剂量，施用mTOR抑制剂。在本发明的另一个实施方案中，以20 mg/天的剂量，施用mTOR抑制剂。在本发明的另一个实施方案中，以30 mg/天的剂量，施用mTOR抑制剂。在本发明的另一个实施方案中，以40 mg/天的剂量，施用mTOR抑制剂。

在本发明的一个实施方案中，所述mTOR抑制剂可以每周施用5次。例如，ridaforolimus在第1天开始，并在指定的剂量水平继续连续5天，然后2天不进行ridaforolimus治疗。然后继续Ridaforolimus的这种每周5天的计划。

根据已知的方法，将包含本发明的抗-IGF-1R抗体和mTOR抑制剂的组合治疗剂施用给人患者，诸如作为推注静脉内施用，或通过在一段时间内连续输注，通过肌肉内的、腹膜内的、脑脊髓内的、皮下的、关节内的、滑膜内的、鞘内的、口服的、局部的或吸入的途径。抗体的静脉内或皮下施用是优选的。预见到3种不同的递送方案可用于递送根据本发明的抗体。据推测，常规的静脉内递送是大多数肿瘤的标准递送技术。但是，关于某些肿瘤，诸如在腹腔中的那些（由卵巢、胆管、其它管等的肿瘤来例证），腹膜内给药可能有利地用于在肿瘤处得到高剂量的抗体，并使抗体清除最小化。以类似的方式，某些实体肿瘤具有适合局部灌注的脉管***。局部灌注允许在肿瘤部位保留（Obtention）高剂量的抗体，并使抗体的短期清除最小化。

象任何基于蛋白或抗体输注的治疗剂一样，安全性问题主要涉及：(i)细胞因子释放综合征，即，低血压、发热、摇动、恶寒，(ii) 对所述物质的免疫原性应答的发展(即，患者形成针对抗体治疗剂的人抗体，或HAHA或HACA应答)，和(iii) 对表达EGF受体的正常细胞的毒性，例如，表达EGFR和/或IGF-1R的肝细胞。可以使用标准试验和随访来监测这些安全性问题中的每一种。具体地，在临床试验过程中，经常监测肝功能，以便评估对肝脏的损害（如果有的话）。

为了预防或治疗疾病，抗体的适当剂量取决于要治疗的疾病的类型（如上面所定义）、疾病的严重性和病程、抗体是为了预防还是治疗目的而施用、以前的治疗、患者的病历和对抗体的应答、以及主治医师的判断。合适地，一次性地或在一系列治疗中，将抗体施用给患者。在联合治疗方案中，以治疗上有效的或协同的量，施用本发明的组合物。本文使用的治疗有效量是，抗-IGF-1R抗体和mTOR抑制剂的共同施用或本发明的组合物的施用会导致靶向的疾病或病症的减轻或抑制的量。治疗协同量是，协同地或显著地减轻或消除与特定疾病有关的病症或症状所必需的抗-IGF-1R抗体和mTOR抑制剂的量。

在一个宽的实施方案中，本发明的治疗包含抗-IGF-1R抗体和mTOR抑制剂的联合施用。联合施用包括使用分开的制剂或单个药物制剂的共同施用和任意次序的连续施用，其中优选地，存在两种(或所有)活性剂同时地发挥它们的生物活性的时间段。根据生产商的说明书，可以使用这样的化学治疗剂的准备和给药计划，或由熟练的从业人员以经验为主地确定。在Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md. (1992)中，也描述了化疗的准备和给药计划。可以在施用抗体之前或之后，施用mTOR抑制剂，或可以与其同时施用。本发明的治疗组合的临床给药剂量可能受到不良反应程度的限制。

根据疾病的类型和严重性，约1 μg/kg-50 mg/kg (例如0.1-20 mg/kg)的抗体是施用给患者的初始候选剂量，例如，通过一次或多次单独的施用，或通过连续输注。典型的日剂量范围可以是约1 μg/kg至约100 mg/kg或更多，取决于上述的因素。对于在几天或更长的时间内重复施用，根据病症，持续进行治疗，直到发生疾病症状的理想抑制。但是，其它剂量方案可能是有用的。

在一个方面，以范围为约5 mg/kg至约15 mg/kg的剂量，每周施用本发明的抗体，或可以每2-3周施用。在有些方面，化疗方案包括传统的高剂量间歇施用。在某些其它的方面，使用更小的剂量和更高的频率，施用化学治疗剂，且不存在有计划的中断 (“节拍化疗”)。通过常规技术和试验，可以容易地监测本发明的治疗进程。

在一个实施方案中，所述给药次序包括，与IGF-1R抗体同时施用mTOR抑制剂——例如，每天施用ridaforolimus，同时每周施用IGF-1R抗体(dalotuzumab)。具体地，在10 mg/kg的剂量每周静脉内施用dalotuzumab，同时每天施用10 mg ridaforolimus。

在另一个实施方案中，所述给药次序包括，与IGF-1R抗体同时施用mTOR抑制剂——例如，每天施用ridaforolimus，同时每周施用IGF-1R抗体(dalotuzumab)。具体地，在10 mg/kg的剂量每周静脉内施用dalotuzumab，同时每天施用20 mg ridaforolimus。

在一个实施方案中，所述给药次序包括，与IGF-1R抗体同时施用mTOR抑制剂——例如，每天施用ridaforolimus，同时每周施用IGF-1R抗体(dalotuzumab)。具体地，在10 mg/kg的剂量每周静脉内施用dalotuzumab，同时每天施用30 mg ridaforolimus。

在一个实施方案中，所述给药次序包括，与IGF-1R抗体同时施用mTOR抑制剂——例如，每天施用ridaforolimus，同时每周施用IGF-1R抗体(dalotuzumab)。具体地，在10 mg/kg的剂量每周静脉内施用dalotuzumab，同时每天施用40 mg ridaforolimus。

IGF-1R抗体的替代给药方案如下：(a) 15 mg/kg负载，随后每周7.5 mg/kg；(b) 每周7.5 mg/kg；(c) 每周10.0 mg/kg；(d) 隔周7.5 mg/kg；(e) 隔周10.0 mg/kg；(f) 隔周20 mg/kg；(g) 每3周30 mg/kg。

所述组合的实例给药方案如下：

其它适应症

除了治疗非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌、软组织或骨肉瘤和子宫内膜癌以外，mTOR抑制剂和抗-IGF-1R抗体组合还可以用于治疗下述癌症：心脏的：肉瘤(血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肉瘤)、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤；肺：支气管原癌(鳞状上皮细胞、未分化的小细胞、未分化的大细胞、腺癌)、肺泡(细支气管)癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨错构瘤、间皮瘤；胃肠的：食管(鳞状上皮细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰腺(导管的腺癌、胰岛瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤、舒血管肠肽瘤)、小肠(腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、卡波济氏(Karposi's)肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤)、大肠(腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤、平滑肌瘤)、结肠的、结直肠的、直肠的；泌尿生殖道:肾(腺癌、维耳母斯氏瘤[肾胚细胞瘤]、淋巴瘤、白血病)、膀胱和尿道(鳞状上皮细胞癌、过渡型细胞癌、腺癌)、***(腺癌、肉瘤)、睾丸(***瘤、畸胎瘤、胚胎性癌、畸胎瘤、绒毛膜癌、肉瘤、***癌、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样瘤、脂肪瘤)；肝：肝细胞瘤(肝细胞癌)、胆管癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞腺瘤、血管瘤；骨：成骨肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤 脊索瘤、osteochronfroma(骨软骨外生骨疣(exostoses))、良性软骨瘤、成软骨细胞瘤、软骨粘液纤维瘤(chondromyxofibroma)、骨样骨瘤和巨细胞瘤；神经***：头颅(骨瘤、血管瘤、肉芽瘤、黄瘤、畸形性骨炎)、脑脊膜(脑脊膜瘤、脑脊膜肉瘤(meningiosarcoma)、神经胶质瘤病)、脑(星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤[松果体瘤]、多形性成胶质细胞瘤(glioblastoma multiform)、少突神经胶质细胞瘤、神经鞘瘤、成视网膜细胞瘤、先天性肿瘤)、脊髓神经纤维瘤、脑脊膜瘤、神经胶质瘤、肉瘤)；妇科：子宫(子宫内膜癌)、宫颈(***、肿瘤前宫颈发育异常)、卵巢(卵巢癌[浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、未被分类的癌]、粒层-鞘细胞瘤、Sertoli-Leydig细胞瘤、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)、外阴(鳞状上皮细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑素瘤)、***(透明细胞癌、鳞状上皮细胞癌、葡萄状肉瘤(胚胎横纹肌肉瘤)、输卵管(癌)；血液：血(髓细胞性白血病[急性和慢性]、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征)、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤[恶性淋巴瘤]；皮肤：恶性黑素瘤、基底细胞癌、鳞状上皮细胞癌、卡波济氏(Karposi's)肉瘤、发育异常性痣(moles dysplastic nevi)、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤；和肾上腺：成神经细胞瘤。因此，本文所提供的术语“癌性细胞”包括受上面所确定病症中的任一种所折磨的细胞。

本发明的mTOR抑制剂和抗-IGF-1R抗体组合还可以用于治疗下述疾病状态：疤痕瘤和银屑病。

在本发明的范围内还包括，治疗或预防其中涉及血管生成的疾病的方法，所述方法包括：给需要该类治疗的哺乳动物施用治疗有效量的本发明的组合。眼新血管(neovascular)疾病是其中所产生的大部分组织损害可以归因于眼中血管的异常浸润的病症的实例(参见WO 00/30651, 2000年6月2日公开)。该不希望的浸润可以由缺血性视网膜病变或由退行性疾病触发，所述缺血性视网膜病变例如源自糖尿病性视网膜病变、早产性视网膜病变、视网膜静脉闭合的那些，所述退行性疾病例如在年龄相关性黄斑变性中观察到的脉络膜新血管生成。因此，通过施用本发明的化合物来抑制血管的生长，可以预防血管的浸润，并预防或治疗其中涉及血管生成的疾病，诸如眼疾病如视网膜血管形成、糖尿病性视网膜病变、年龄相关性黄斑变性等。

在本发明的范围内还包括，治疗或预防其中涉及血管生成的非恶性疾病的方法，所述疾病包括但不限于：眼疾病(例如，视网膜血管形成、糖尿病性视网膜病变和年龄相关性黄斑变性)、动脉粥样硬化、关节炎、银屑病、肥胖症和阿尔茨海默氏病 (Dredge 等人, Expert Opin. Biol. Ther. (2002) 2(8):953-966)。在另一个实施方案中，治疗或预防其中涉及血管生成的疾病的方法包括：眼疾病(例如，视网膜血管形成、糖尿病性视网膜病变和年龄相关性黄斑变性)、动脉粥样硬化、关节炎和银屑病。

在本发明的范围内还包括：治疗诸如再狭窄、炎症、自身免疫病和***反应/哮喘等过度增生障碍的方法。

在本发明的范围内还包括：本发明的组合用于涂敷支架的应用，以及因此产生的位于所涂敷的支架上的本发明化合物用于治疗和/或预防再狭窄的应用(WO03/032809)。

在本发明的范围内还包括：本发明的组合用于治疗和/或预防骨关节炎的应用(WO03/035048)。

在本发明的范围内还包括：治疗低胰岛素症的方法。

上述的mTOR抑制剂和抗-IGF-1R抗体组合用于制备药剂的应用，例证了本发明，所述药剂用于治疗和/或预防非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌、软组织或骨肉瘤和子宫内膜癌。

其它抗癌剂

本发明的mTOR抑制剂和抗-IGF-1R抗体组合还可以与其它治疗剂、化疗剂和抗癌剂组合使用。本发明的mTOR抑制剂和抗-IGF-1R抗体组合与治疗剂、化疗剂和抗癌剂的其它组合是在本发明的范围内。在V.T. Devita和S. Hellman (主编)的Cancer Principles and Practice of Oncology，第6版(2001年2月15日)，Lippincott Williams & Wilkins Publisher中，可以找到该类药剂的实例。根据所述药物和所涉及的癌症的特定特性，本领域普通技术人员能辨别哪个药剂组合是有用的。该类其它药剂包括下面的：***受体调节剂、雄激素受体调节剂、类视色素受体调节剂、细胞毒性剂/细胞抑制剂、抗增生剂、异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂和其它血管生成抑制剂、HIV蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、细胞增生和存活信号传递的抑制剂、双膦酸酯、芳香酶抑制剂、siRNA治疗剂、γ-分泌酶抑制剂、干扰受体酪氨酸激酶(RTK)的药剂和干扰细胞周期检验点的药剂。当与放射疗法共同施用时，本发明的mTOR抑制剂和抗-IGF-1R抗体组合是特别有用的。

“***受体调节剂”是指，不管机理是什么，可以干扰或抑制***与受体的结合的化合物。***受体调节剂的实例包括、但不限于：他莫昔芬、雷洛昔芬、艾多昔芬、LY353381、LY117081、托瑞米芬、氟维司群、4-[7-(2,2-二甲基-1-氧代丙氧基-4-甲基-2-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-2H-1-苯并吡喃-3-基]-苯基-2,2-二甲基丙酸酯、4,4’-二羟基二苯甲酮-2,4-二硝基苯基-腙、和SH646。

“雄激素受体调节剂”是指，不管其机理是什么，可以干扰或抑制雄激素与受体的结合的化合物。雄激素受体调节剂的实例包括：非那雄胺和其它5α-还原酶抑制剂、尼鲁米特、氟他胺、比卡鲁胺、利阿唑、和醋酸阿比特龙。

“类视色素受体调节剂”是指，不管其机理是什么，可以干扰或抑制类视色素与受体的结合的化合物。该类类视色素受体调节剂的实例包括：贝沙罗汀、维甲酸、13-顺式-视黄酸、9-顺式-视黄酸、α-二氟甲基鸟氨酸、ILX23-7553、反式-N-(4’-羟基苯基)视黄酰胺(retinamide)、和N-4-羧基苯基视黄酰胺。

“细胞毒性剂/细胞抑制剂”是指，主要通过直接干扰细胞功能或抑制或干扰细胞减数***（myosis）而造成细胞死亡或抑制细胞增生的化合物，包括烷化剂、肿瘤坏死因子、***剂、低氧活化的化合物(hypoxia activatable compounds)、微管抑制剂/微管稳定剂、有丝***驱动蛋白的抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、有丝***进程中所涉及的激酶的抑制剂、生长因子和细胞因子信号转导途径中所涉及的激酶的抑制剂、抗代谢物、生物应答调节剂；激素/抗激素治疗剂、造血生长因子、单克隆抗体靶向治疗剂、拓扑异构酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、泛素连接酶抑制剂和极光（aurora）激酶抑制剂。

细胞毒性剂/细胞抑制剂的实例包括、但不限于：sertenef、恶病质素、异环磷酰胺、他索纳明、氯尼达明、卡铂、六甲密胺、泊尼莫司汀、二溴卫矛醇、雷莫司汀、福莫司汀、奈达铂、奥沙利铂、替莫唑胺、heptaplatin、雌莫司汀、英丙舒凡甲苯磺酸盐(tosilate)、曲磷胺、尼莫司汀、二溴螺氯铵、嘌嘧替派、洛铂、沙铂、甲基丝裂霉素、顺铂、伊罗夫文、右异环磷酰胺（dexifosfamide）、顺式-胺化二氯(2-甲基-吡啶)铂、苄基鸟嘌呤、葡磷酰胺、GPX100、(反式,反式,反式)-二-mu-(己烷-1,6-二胺)-mu-[二胺-铂(II)]二[二胺(氯)铂(II)]四氯化物、diarizidinylspermine、三氧化二砷、1-(11-十二烷基氨基-10-羟基十一烷基)-3,7-二甲基黄嘌呤、佐柔比星、伊达比星、柔红霉素、比生群、米托蒽醌、吡柔比星、吡萘非特、戊柔比星、氨柔比星、抗瘤酮(antineoplaston)、3’-脱氨基-3’-吗啉代-13-脱氧代-10-羟基洋红霉素、annamycin、加柔比星、依利奈法德、MEN10755、4-脱甲氧基-3-脱氨基-3-氮丙啶基-4-甲磺酰基-柔红霉素(参见WO 00/50032)、Raf激酶抑制剂 (诸如Bay43-9006)和其它mTOR抑制剂。

低氧活化的化合物的实例是替拉扎明。

蛋白酶体抑制剂的实例包括、但不限于：乳胞素和MLN-341 (Velcade)。

微管抑制剂/微管稳定剂的实例包括紫杉醇、硫酸长春地辛、3’,4’-二脱氢-4’-脱氧-8’-去长春花碱、docetaxol、根霉素、多拉司他汀、米伏布林羟乙基磺酸盐、auristatin、西马多丁、RPR109881、BMS184476、长春氟宁、cryptophycin、2,3,4,5,6-五氟-N-(3-氟-4-甲氧基苯基)苯磺酰胺、无水长春碱(anhydrovinblastine)、N,N-二甲基-L-缬氨酰基-L-缬氨酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-L-脯氨酰基-L-脯氨酸-叔-丁酰胺、TDX258、epothilones(参见例如美国专利号6,284,781和6,288,237)和BMS188797。在一个实施方案中，在微管抑制剂/微管稳定剂中不包括epothilones。

拓扑异构酶抑制剂的一些实例有托泊替康、hycaptamine、伊立替康、卢比替康、6-乙氧基丙酰基-3’,4’-O-外-亚苄基-教酒菌素、9-甲氧基-N,N-二甲基-5-硝基吡唑并[3,4,5-kl]吖啶-2-(6H)丙胺、1-氨基-9-乙基-5-氟-2,3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3’,4’:b,7]-吲嗪并[1,2b]喹啉-10,13(9H,15H)二酮、勒托替康、7-[2-(N-异丙基氨基)乙基]-(20S)喜树碱、BNP1350、BNPI1100、BN80915、BN80942、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、索布佐生、2’-二甲基氨基-2’-脱氧-依托泊苷、GL331、N-[2-(二甲基氨基)乙基]-9-羟基-5,6-二甲基-6H-吡啶并[4,3-b]咔唑-1-甲酰胺、asulacrine、(5a,5aB,8aa,9b)-9-[2-[N-[2-(二甲基氨基)乙基]-N-甲基氨基]乙基]-5-[4-羟基-3,5-二甲氧基苯基]-5,5a,6,8,8a,9-六氢furo(3’,4’:6,7)萘并(2,3-d)-1,3-间二氧杂环戊烯-6-酮、2,3-(亚甲二氧基)-5-甲基-7-羟基-8-甲氧基苯并[c]-啡啶、6,9-二[(2-氨基乙基)氨基]苯并[g]异喹啉-5,10-二酮、5-(3-氨基丙基氨基)-7,10-二羟基-2-(2-羟基乙基氨基甲基)-6H-吡唑并[4,5,1-de]吖啶-6-酮、N-[1-[2(二乙基氨基)乙基氨基]-7-甲氧基-9-氧代-9H-噻吨-4-基甲基]甲酰胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)吖啶-4-甲酰胺、6-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-3-羟基-7H-茚并[2,1-c]喹啉-7-酮、和地美司钠。

在公开WO03/039460、WO03/050064、WO03/050122、WO03/049527、WO03/049679、WO03/049678、WO04/039774、WO03/079973、WO03/099211、WO03/105855、WO03/106417、WO04/037171、WO04/058148、WO04/058700、WO04/126699、WO05/018638、WO05/019206、WO05/019205、WO05/018547、WO05/017190、US2005/0176776中，描述了有丝***驱动蛋白（特别是人有丝***驱动蛋白KSP）的抑制剂的实例。在一个实施方案中，有丝***驱动蛋白的抑制剂包括、但不限于：KSP的抑制剂、MKLP1的抑制剂、CENP-E的抑制剂、MCAK的抑制剂和Rab6-KIFL的抑制剂。

“组蛋白脱乙酰基酶抑制剂”的实例包括、但不限于：SAHA、TSA、oxamflatin、PXD101、MG98和scriptaid。在下面的原稿：Miller, T.A. 等人 J. Med. Chem. 46(24):5097-5116 (2003)中，可以找到其它组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的另外一些参考。

“在有丝***进程中涉及的激酶的抑制剂”包括、但不限于：极光激酶抑制剂、Polo-样激酶(PLK) 的抑制剂 (特别是PLK-1的抑制剂)、bub-1的抑制剂和bub-R1的抑制剂。“极光激酶抑制剂”的一个实例是VX-680。

“抗增生剂”包括反义RNA和DNA寡核苷酸如G3139、ODN698、RVASKRAS、GEM231、和INX3001，以及抗代谢物如依诺他滨、卡莫氟、替加氟、喷司他丁、去氧氟尿苷、曲美沙特、氟达拉滨、卡培他滨、加洛他滨、阿糖胞苷ocfosfate、fosteabine sodium水合物、雷替曲塞、paltitrexid、乙嘧替氟、噻唑呋林(tiazofurin)、地西他滨、诺拉曲塞、培美曲塞、nelzarabine、2’-脱氧-2’-亚甲基胞苷、2’-氟亚甲基-2’-脱氧胞苷、N-[5-(2,3-二氢-苯并呋喃基)磺酰基]-N’-(3,4-二氯苯基)脲、 N6-[4-脱氧-4-[N2-[2(E),4(E)-十四碳二烯酰基]甘氨酰基氨基]-L-甘油-B-L-甘露糖-庚糖吡喃糖基]腺嘌呤、aplidine、ecteinascidin、曲沙他滨、4-[2-氨基-4-氧代-4,6,7,8-四氢-3H-嘧啶并[5,4-b][1,4]噻嗪-6-基-(S)-乙基]-2,5-噻吩酰基-L-谷氨酸、氨基蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿拉诺新、11-乙酰基-8-(氨基甲酰氧基甲基)-4-甲酰基-6-甲氧基-14-氧杂-1,11-二氮杂四环(7.4.1.0.0)-十四碳-2,4,6-三烯-9-基乙酸酯、苦马豆碱、洛美曲索、右雷佐生、蛋氨酸酶、2’-氰基-2’-脱氧-N4-棕榈酰基-1-B-D-阿糖呋喃糖基胞嘧啶、3-氨基吡啶-2-醛缩氨基硫脲和曲妥单抗。

单克隆抗体靶向治疗剂的实例包括：具有与癌细胞特异性的或靶细胞特异性的单克隆抗体相连的细胞毒性剂或放射性同位素的那些治疗剂。实例包括Bexxar。

“HMG-CoA还原酶抑制剂”是指3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA还原酶的抑制剂。可以使用的HMG-CoA还原酶抑制剂的实例包括、但不限于：洛伐它汀(MEVACOR®；参见美国专利号4,231,938、4,294,926和4,319,039)、辛伐它汀(ZOCOR®；参见美国专利号4,444,784、4,820,850和4,916,239)、普伐它汀(PRAVACHOL®；参见美国专利号4,346,227、4,537,859、4,410,629、5,030,447和5,180,589)、氟伐它汀(LESCOL®；参见美国专利号5,354,772、4,911,165、4,929,437、5,189,164、5,118,853、5,290,946和5,356,896)和阿伐它汀(LIPITOR®；参见美国专利号5,273,995、4,681,893、5,489,691和5,342,952)和西立伐他汀 (也称作rivastatin和BAYCHOL®; 参见美国专利号5,177,080)。可用于本发明方法中的这些和其它HMG-CoA还原酶抑制剂的结构式描述在：M. Yalpani, “Cholesterol Lowering Drugs”, Chemistry & Industry, 第85-89页(1996年2月5日)的第87页和美国专利号4,782,084和4,885,314中。本文所用的术语HMG-CoA还原酶抑制剂包括具有HMG-CoA还原酶抑制活性的化合物的所有药学上可接受的内酯和开放酸(open-acid)形式(即，其中内酯环打开形成游离酸)以及盐和酯形式，并且因此本发明包括该类盐、酯、开放酸和内酯形式的应用。

“异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂”是指可以抑制任何一种异戊二烯基-蛋白转移酶或任何异戊二烯基-蛋白转移酶的组合的化合物，所述的酶包括法呢基-蛋白转移酶(FPTase)、I型香叶基香叶基-蛋白转移酶(GGPTase-I)、和II型香叶基香叶基-蛋白转移酶(GGPTase-II，也被称为Rab GGPTase)。

可以在下面的公开和专利中找到异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂的实例：WO 96/30343、WO 97/18813、WO 97/21701、WO 97/23478、WO 97/38665、WO 98/28980、WO 98/29119、WO 95/32987、美国专利号5,420,245、美国专利号5,523,430、美国专利号5,532,359、美国专利号5,510,510、美国专利号5,589,485、美国专利号5,602,098、欧洲专利公开0 618 221、欧洲专利公开0 675 112、欧洲专利公开0 604 181、欧洲专利公开0 696 593、WO 94/19357、WO 95/08542、WO 95/11917、WO 95/12612、WO 95/12572、WO 95/10514、美国专利号5,661,152、WO 95/10515、WO 95/10516、WO 95/24612、WO 95/34535、WO 95/25086、WO 96/05529、WO 96/06138、WO 96/06193、WO 96/16443、WO 96/21701、WO 96/21456、WO 96/22278、WO 96/24611、WO 96/24612、WO 96/05168、WO 96/05169、WO 96/00736、美国专利号5,571,792、WO 96/17861、WO 96/33159、WO 96/34850、WO 96/34851、WO 96/30017、WO 96/30018、WO 96/30362、WO 96/30363、WO 96/31111、WO 96/31477、WO 96/31478、WO 96/31501、WO 97/00252、WO 97/03047、WO 97/03050、WO 97/04785、WO 97/02920、WO 97/17070、WO 97/23478、WO 97/26246、WO 97/30053、WO 97/44350、WO 98/02436和美国专利号5,532,359。关于异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂对血管生成的作用的实例，参见European J. of Cancer, 第35卷,第9期, 第1394-1401页(1999)。

“血管生成抑制剂”是指，不管其机理是什么，可以抑制新血管形成的化合物。血管生成抑制剂的实例包括、但不限于：酪氨酸激酶抑制剂，如酪氨酸激酶受体Flt-1(VEGFR1)和Flk-1/KDR(VEGFR2)的抑制剂、表皮衍生的、成纤维细胞衍生的、或血小板衍生的生长因子的抑制剂、MMP(基质金属蛋白酶)抑制剂、整联蛋白阻滞剂、干扰素-α、白介素-12、戊聚糖聚硫酸酯、环氧合酶抑制剂，包括非甾体抗炎药(NSAID)如阿司匹林和布洛芬以及选择性环氧合酶-2抑制剂如塞来考昔和罗非考昔(PNAS, 第89卷, 第7384页(1992)；JNCI, 第69卷,第475页(1982); Arch. Opthalmol., 第108卷,第573页(1990); Anat. Rec.,第238卷,第68页(1994); FEBS Letters,第372卷,第83页(1995); Clin, Orthop.第313卷,第76页(1995); J. Mol. Endocrinol.,第16卷,第107页(1996); Jpn. J. Pharmacol.,第75页,第105页(1997); Cancer Res.,第57卷,第1625页(1997); Cell, 第93卷,第705页(1998); Intl. J. Mol. Med.,第2卷,第715页(1998); J. Biol. Chem.,第274卷,第9116页(1999))、甾体抗炎药(如皮质类固醇、盐皮质激素、***、***、***龙、甲泼尼龙、倍他米松)、羧基酰氨基***、考布它汀A-4、角鲨胺、6-O-氯乙酰基-羰基)-烟曲霉醇、沙利度胺、血管它汀、肌钙蛋白-1、血管紧张素II拮抗剂(见Fernandez等人, J. Lab. Clin. Med. 105:141-145(1985))、和VEGF抗体(见, Nature Biotechnology, 第17卷, 第963-968页(1999年10月)；Kim等人, Nature, 362, 841-844(1993)；WO 00/44777；和WO 00/61186)。

可调控或抑制血管生成并且也可以与本发明的化合物联合的其它治疗剂包括可调控或抑制凝血和纤维蛋白溶解***的药剂(见在Clin. Chem. La. Med. 38:679-692(2000)中进行的综述)。可以调控或抑制凝血和纤维蛋白溶解途径的该类药剂的实例包括、但不限于：肝素(见Thromb. Haemost. 80:10-23(1998))、低分子量肝素和羧肽酶U抑制剂(也被称为活性凝血酶活化的纤维蛋白溶解抑制剂[TAFIa]的抑制剂)(见Thrombosis Res. 101:329-354(2001))。已经在美国系列号60/310,927 (2001年8月8日提交) 和60/349,925 (2002年1月18日提交)中描述了TAFIa抑制剂。

“干扰细胞周期检验点的药剂”是指可以抑制转导细胞周期检验点信号的蛋白激酶，从而可以使癌细胞对DNA损害剂敏感的化合物。该类药剂包括ATR、ATM、CHK11和CHK12激酶的抑制剂以及cdk和cdc激酶抑制剂，并且其特定的例子有7-羟基十字孢碱(staurosporin)、flavopiridol、CYC202(Cyclacel)和BMS-387032。

“干扰受体酪氨酸激酶(RTK)的药剂”是指抑制RTK并且因此抑制瘤形成和肿瘤进程中涉及的一些机理的化合物。该类药剂包括c-Kit、Eph、PDGF、Flt3和c-Met的抑制剂。另一些药剂包括如Bume-Jensen和Hunter, Nature, 411:355-365, 2001所述的RTK的抑制剂。

“细胞增殖和存活信号传递途径的抑制剂”是指，抑制在细胞表面受体下游的信号转导级联的化合物。该类药剂包括丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制剂(包括但不限于Akt的抑制剂，诸如在WO 02/083064、WO 02/083139、WO 02/083140、US 2004-0116432、WO 02/083138、US 2004-0102360、WO 03/086404、WO 03/086279、WO 03/086394、WO 03/084473、WO 03/086403、WO 2004/041162、WO 2004/096131、WO 2004/096129、WO 2004/096135、WO 2004/096130、WO 2005/100356、WO 2005/100344、US 2005/029941、US 2005/44294、US 2005/43361、60/734188、60/652737、60/670469中描述的那些)、Raf激酶的抑制剂(例如BAY-43-9006 )、MEK 的抑制剂(例如CI-1040和PD-098059)、mTOR的抑制剂(例如Wyeth CCI-779)和PI3K的抑制剂 (例如LY294002)。

如上所述，与NSAID的组合涉及作为有效的COX-2抑制剂的NSAID的应用。为了本说明书的目的，如果通过细胞或微粒体试验测得它具有1μM或更低的IC₅₀（对于抑制COX-2而言），则NSAID是有效的。

本发明还包括与作为选择性的COX-2抑制剂的NSAID的组合。为了本说明书的目的，作为选择性的COX-2抑制剂的NSAID被定义为，通过细胞或微粒体试验进行评估时，在用对COX-2的IC₅₀与对COX-1的IC₅₀之比进行测量时，抑制COX-2的特异性比COX-1高至少100倍的那些药剂。该类化合物包括、但不限于在美国专利5,474,995、美国专利5,861,419、美国专利6,001,843、美国专利6,020,343、美国专利5,409,944、美国专利5,436,265、美国专利5,536,752、美国专利5,550,142、美国专利5,604,260、美国5,698,584、美国专利5,710,140、WO 94/15932、美国专利5,344,991、美国专利5,134,142、美国专利5,380,738、美国专利5,393,790、美国专利5,466,823、 美国专利5,633,272 和美国专利5,932,598中公开的那些，所有这些专利通过引用并入本文。

在本发明的治疗方法中特别有用的COX-2抑制剂是：3-苯基-4-(4-(甲基磺酰基)苯基)-2-(5H)-呋喃酮；和5-氯-3-(4-甲基磺酰基)苯基-2-(2-甲基-5-吡啶基)吡啶；或其药学上可接受的盐。

已经被描述为特异性的COX-2抑制剂并且因此可用于本发明中的化合物包括、但不限于下面的：帕瑞考昔、BEXTRA®和CELEBREX®或其药学上可接受的盐。

血管生成抑制剂的其它实例包括、但不限于：内皮它汀、ukrain、豹蛙酶、IM862、5-甲氧基-4-[2-甲基-3-(3-甲基-2-丁烯基)环氧乙烷基]-1-氧杂螺环[2,5]辛-6-基(氯乙酰基)氨基甲酸酯、aceyldinanaline、5-氨基-1-[[3,5-二氯-4-(4-氯苯甲酰基)-苯基]甲基]-1H-1,2,3-***-4-甲酰胺、CM101、角鲨胺、布考它汀、RPI4610、NX31838、硫酸盐化甘露糖戊糖磷酸盐(sulfated mannopentaose phosphate)、7,7-(羰基-二[亚氨基-N-甲基-4,2-吡咯羰基亚氨基[N-甲基-4,2-吡咯]-羰基亚氨基]-二-(1,3-萘二磺酸酯)、和3-[(2,4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-二氢吲哚酮(SU5416)。

上面所用的“整联蛋白阻滞剂”是指可以选择性拮抗、抑制或抵抗生理学配体与αvβ3整联蛋白的结合的化合物、选择性拮抗、抑制或抵抗生理学配体与αvβ5整联蛋白的结合的化合物、拮抗、抑制或对抗生理学配体与αvβ3整联蛋白和αvβ5整联蛋白的结合的化合物、以及拮抗、抑制或抵抗在毛细管内皮细胞中表达的特定整联蛋白活性的化合物。该术语还涉及αvβ6、αvβ8、α1β1、α2β1、α5β1、α6β1和α6β4整联蛋白的拮抗剂。该术语还表示αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α1β1、α2β1、α5β1、α6β1和α6β4 整联蛋白任何组合的拮抗剂。

一些特定酪氨酸激酶抑制剂的实例包括N-(三氟甲基苯基)-5-甲基异唑-4-甲酰胺、3-[(2,4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基)二氢吲哚-2-酮、17-(烯丙基氨基)-17-脱甲氧基格尔德霉素、4-(3-氯-4-氟苯基氨基)-7-甲氧基-6-[3-(4-吗啉基)丙氧基]喹唑啉、N-(3-乙炔基苯基)-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺、BIBX1382、2,3,9,10,11,12-六氢-10-(羟基甲基)-10-羟基-9-甲基-9,12-环氧-1H-二吲哚并[1,2,3-fg:3’,2’,1’-kl]吡咯并[3,4-i][1,6]苯并二氮杂环辛间四烯-1-酮、SH268、染料木素、imatinib(STI571)、CEP2563、4-(3-氯苯基氨基)-5,6-二甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶甲磺酸酯、4-(3-溴-4-羟基苯基)氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉、4-(4’-羟基苯基)氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉、SU6668、STI571A、N-4-氯苯基-4-(4-吡啶基甲基)-1-酞嗪胺、和EMD121974。

在本发明的方法中还包括与除抗癌化合物之外的化合物的组合。例如，本发明的mTOR抑制剂和抗-IGF-1R抗体组合与PPAR-γ (即，PPAR-γ) 激动剂和PPAR-δ (即，PPAR-δ) 激动剂的组合可以用于治疗某些恶性疾病(malingnancies)。PPAR-γ和PPAR-δ是核过氧化物酶体增生子-活化的受体γ和δ。在文献中已经报道了PPAR-γ在内皮细胞上进行表达并且参与血管生成(参见J. Cardiovasc. Pharmacol. 1998; 31:909-913; J. Biol. Chem. 1999;274:9116-9121; Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 2000; 41:2309-2317)。最近，已经表明PPAR-γ激动剂可在体外抑制VEGF的血管生成响应；曲格列酮和罗格列酮马来酸盐都可以抑制小鼠视网膜新血管形成的发展(Arch. Ophthamol. 2001; 119:709-717)。PPAR-γ激动剂和PPAR- γ/α激动剂的实例包括、但不限于：噻唑烷二酮类(如DRF2725、CS-011、曲格列酮、罗格列酮、和吡格列酮)、非诺贝特、吉非贝特、氯贝特、GW2570、SB219994、AR-H039242、JTT-501、MCC-555、GW2331、GW409544、NN2344、KRP297、NP0110、DRF4158、NN622、GI262570、PNU182716、DRF552926、2-[(5,7-二丙基-3-三氟甲基-1,2-苯并异唑-6-基)氧基]-2-甲基丙酸(公开在USSN 09/782,856中)和2(R)-7-(3-(2-氯-4-(4-氟苯氧基)苯氧基)丙氧基)-2-乙基色满-2-甲酸(公开在USSN 60/235,708和60/244,697中)。

本发明另一个实施方案是本发明所公开的化合物与基因疗法联合用于治疗癌症的应用。治疗癌症的遗传学策略的综述可参见Hall等人(Am J Hum Genet 61:785-789, 1997)和Kufe等人(Cancer Medicine, 第5版, 第876-889页, BC Decker, Hamilton 2000)。可以用基因疗法来传递任何抑制肿瘤的基因。该类基因的实例包括、但不限于：p53(其可以通过重组病毒-介导的基因转移来被传递(例如参见美国专利号6,069,134))、uPA/uPAR拮抗剂(“uPA/uPAR拮抗剂腺病毒介导的传递抑制了小鼠体内依赖于血管生成的肿瘤生长和扩散(Adenovirus-Mediated Delivery of a uPA/uPAR Antagonist Suppresses Angiogenesis-Dependent Tumor Growth and Dissemination in Mice)” Gene Therapy, 1998年8月；5(8):1105-13)、以及γ干扰素(J Immunol 2000；164:217-222)。

本发明的化合物还可以与固有的多药抗药性(MDR)抑制剂，特别是与运载蛋白表达水平高有关的MDR抑制剂联合给药。该类MDR抑制剂包括p-糖蛋白(P-gp)的抑制剂，如LY335979、XR9576、OC144-093、R101922、VX853和PSC833(伐司朴达)。

本发明的化合物可以与用于治疗恶心或呕吐的止吐药联用，所述的呕吐包括急性、延迟的、晚期、和前期发生的(anticipatory)呕吐，其可能是由于单独使用本发明的化合物或者将本发明的化合物与放疗联用所导致的。为了预防或治疗呕吐，可以将本发明的化合物与其它止吐药，尤其是神经激肽-1受体拮抗剂、5HT3受体拮抗剂，如奥坦西隆、格拉司琼、托吡西隆、和zatisetron、GABAB受体激动剂，如巴氯芬、皮质类固醇如地卡特隆(***)、曲安缩松、Aristocort、鼻松(Nasalide)、Preferid、Benecorten或其它药剂如在US专利2,789,118、2,990,401、3,048,581、3,126,375、3,929,768、3,996,359、3,928,326和3,749,712中所公开的药剂、抗多巴胺能药，如吩噻嗪类药剂(例如丙氯拉嗪、氟奋乃静、硫利哒嗪和美索达嗪)、甲氧氯普胺或屈***酚联用。在另一个实施方案中，公开了与选自神经激肽-1受体拮抗剂、5HT3受体拮抗剂和皮质类固醇的止吐药的联合治疗用于治疗或预防可能由于施用本发明的化合物而产生的呕吐。

与本发明化合物联用的神经激肽-1受体拮抗剂被充分描述在，例如：美国专利号5,162,339、5,232,929、5,242,930、5,373,003、5,387,595、5,459,270、5,494,926、5,496,833、5,637,699、5,719,147；欧洲专利公开号EP 0 360 390、0 394 989、0 428 434、0 429 366、0 430 771、0 436 334、0 443 132、0 482 539、0 498 069、0 499 313、0 512 901、0 512 902、0 514 273、0 514 274、0 514 275、0 514 276、0 515 681、0 517 589、0 520 555、0 522 808、0 528 495、0 532 456、0 533 280、0 536 817、0 545 478、0 558 156、0 577 394、0 585 913、0 590 152、0 599 538、0 610 793、0 634 402、0 686 629、0 693 489、0 694 535、0 699 655、0 699 674、0 707 006、0 708 101、0 709 375、0 709 376、0 714 891、0 723 959、0 733 632和0 776 893；PCT 国际专利公开号WO 90/05525、90/05729、91/09844、91/18899、92/01688、92/06079、92/12151、92/15585、92/17449、92/20661、92/20676、92/21677、92/22569、93/00330、93/00331、93/01159、93/01165、93/01169、93/01170、93/06099、93/09116、93/10073、93/14084、93/14113、93/18023、93/19064、93/21155、93/21181、93/23380、93/24465、94/00440、94/01402、94/02461、94/02595、94/03429、94/03445、94/04494、94/04496、94/05625、94/07843、94/08997、94/10165、94/10167、94/10168、94/10170、94/11368、94/13639、94/13663、94/14767、94/15903、94/19320、94/19323、94/20500、94/26735、94/26740、94/29309、95/02595、95/04040、95/04042、95/06645、95/07886、95/07908、95/08549、95/11880、95/14017、95/15311、95/16679、95/17382、95/18124、95/18129、95/19344、95/20575、95/21819、95/22525、95/23798、95/26338、95/28418、95/30674、95/30687、95/33744、96/05181、96/05193、96/05203、96/06094、96/07649、96/10562、96/16939、96/18643、96/20197、96/21661、96/29304、96/29317、96/29326、96/29328、96/31214、96/32385、96/37489、97/01553、97/01554、97/03066、97/08144、97/14671、97/17362、97/18206、97/19084、97/19942和97/21702；和英国专利公开号2 266 529、2 268 931、2 269 170、2 269 590、2 271 774、2 292 144、2 293 168、2 293 169和2 302 689。在上述专利和公开中对该类化合物的制备进行了充分描述，这些专利和公开通过引用并入本文。

在一个实施方案中，与本发明化合物联用的神经激肽-1受体拮抗剂选自: 2-(R)-(1-(R)-(3,5-二(三氟甲基)苯基)乙氧基)-3-(S)-(4-氟苯基)-4-(3-(5-氧代-1H,4H-1,2,4-***并)甲基)吗啉或其药学上可接受的盐，在美国专利号5,719,147中对其进行了描述。

本发明的mTOR抑制剂和抗-IGF-1R抗体组合还可以与用于治疗贫血的药剂一起给药。该类贫血治疗剂是例如连续的红细胞生成受体活化剂(如阿尔法依伯汀)。

本发明的mTOR抑制剂和抗-IGF-1R抗体组合还可以与用于治疗嗜中性粒细胞减少症的药剂一起给药。该类嗜中性粒细胞减少症治疗剂是例如，调节嗜中性粒细胞的产生和功能的造血生长因子，如人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。G-CSF的实例包括非格司亭。

本发明的mTOR抑制剂和抗-IGF-1R抗体组合还可以与免疫增强药物（如左旋咪唑、异丙肌苷和日达仙）一起给药。

本发明的mTOR抑制剂和抗-IGF-1R抗体组合还可以与二膦酸盐(被理解为包括双膦酸盐、二膦酸盐、双膦酸和二膦酸)联合用于治疗或预防包括骨癌在内的癌症。双膦酸盐的实例包括、但不限于：依替膦酸盐(Didronel)、帕米膦酸盐(阿可达)、阿仑膦酸盐(福善美)、利塞膦酸盐(Actonel)、唑来膦酸盐(Zometa)、伊班膦酸盐(Boniva)、英卡膦酸盐或cimadronate、氯磷酸盐、EB-1053、米诺膦酸盐、奈立膦酸盐、吡膦酸盐和替鲁膦酸盐，包括其任何和所有药学上可接受的盐、衍生物、水合物以及混合物。

本发明的mTOR抑制剂和抗-IGF-1R抗体组合还可以与芳香酶抑制剂联合用于治疗或预防乳腺癌。芳香酶抑制剂的实例包括、但不限于：阿那曲唑、来曲唑和依西美坦。

本发明的mTOR抑制剂和抗-IGF-1R抗体组合还可以与siRNA疗法联合用于治疗或预防癌症。

本发明的mTOR抑制剂和抗-IGF-1R抗体组合还可以与γ-分泌酶抑制剂和/或NOTCH信号传递的抑制剂联合给药。该类抑制剂包括在WO 01/90084、WO 02/30912、WO 01/70677、WO 03/013506、WO 02/36555、WO 03/093252、WO 03/093264、WO 03/093251、WO 03/093253、WO 2004/039800、WO 2004/039370、WO 2005/030731、WO 2005/014553、USSN 10/957, 251、WO 2004/089911、WO 02/081435、WO 02/081433、WO 03/018543、WO 2004/031137、WO 2004/031139、WO 2004/031138、WO 2004/101538、WO 2004/101539和WO 02/47671中所述的化合物(包括LY-450139)。

本发明的mTOR抑制剂和抗-IGF-1R抗体组合还可以与Akt抑制剂联合用于治疗或预防癌症。该类抑制剂包括、但不限于在下述公开中描述的化合物：WO 02/083064、WO 02/083139、WO 02/083140、US 2004-0116432、WO 02/083138、US 2004-0102360、WO 03/086404、WO 03/086279、WO 03/086394、WO 03/084473、WO 03/086403、WO 2004/041162、WO 2004/096131、WO 2004/096129、WO 2004/096135、WO 2004/096130、WO 2005/100356、WO 2005/100344、US 2005/029941、US 2005/44294、US 2005/43361、60/734188、60/652737、60/670469。

本发明的mTOR抑制剂和抗-IGF-1R抗体组合还可以与PARP抑制剂联合用于治疗或预防癌症。

放射疗法本身是指癌症治疗领域的一种普通方法。关于放射疗法，可以采用不同的辐射，诸如X-射线、γ-射线、中子射线、电子束、质子束和辐射源。在大多数普通的放射疗法中，将直线加速器用于具有外辐射的辐照，γ-射线。

本发明的mTOR抑制剂和抗-IGF-1R抗体组合还可以与下面的治疗剂进一步联合用于治疗癌症：阿巴瑞克(Plenaxis depot^®)；阿地白介素(Prokine^®); 阿地白介素(Proleukin^®)；Alemtuzumabb(Campath^®)；阿利维A酸(Panretin^®)；别嘌醇(Zyloprim^®)；六甲密胺(Hexalen^®)；氨磷汀(Ethyol^®)；阿那曲唑(Arimidex^®)；三氧化二砷(Trisenox^®)；天门冬酰胺酶(Elspar^®)；阿扎胞苷(Vidaza^®)；bevacuzimab(Avastin^®)；贝沙罗汀胶囊(Targretin^®)；贝沙罗汀凝胶(Targretin^®)；博来霉素(Blenoxane^®)；bortezomib(Velcade^®)；静脉内的白消安(Busulfex^®)；口服的白消安(Myleran^®)；卡普睾酮(Methosarb^®)；卡培他滨(Xeloda^®)；卡铂(Paraplatin^®)；卡莫司汀(BCNU^®, BiCNU^®)；卡莫司汀(Gliadel^®)；使用Polifeprosan 20 Implant的卡莫司汀(Gliadel Wafer^®)；赛拉考昔(Celebrex^®)；西妥昔单抗(Erbitux^®)；苯丁酸氮芥(Leukeran^®)；顺铂(Platinol^®)；克拉屈滨(Leustatin^®, 2-CdA^®)；clofarabine(Clolar^®)；环磷酰胺(Cytoxan^®, Neosar^®)；环磷酰胺(Cytoxan Injection^®)；环磷酰胺(Cytoxan Tablet^®)；阿糖胞苷(Cytosar-U^®)；阿糖胞苷脂质体(DepoCyt^®)；达卡巴嗪(DTIC-Dome^®)；更生霉素，放线菌素D(Cosmegen^®)；Darbepoetin alfa(Aranesp^®)；柔红霉素脂质体(DanuoXome^®)；柔红霉素, 柔毛霉素(柔红霉素^®)；柔红霉素，柔毛霉素(Cerubidine^®)；地尼白介素-毒素连接物(Denileukin diftitox)(Ontak^®)；右雷佐生(Zinecard^®)；多西紫杉醇(Taxotere^®)；多柔比星(Adriamycin PFS^®)；多柔比星(Adriamycin^®, Rubex^®)；多柔比星(Adriamycin PFS Injection^®)；多柔比星脂质体(Doxil^®)；丙酸屈他雄酮(Dromostanolone^®)；丙酸屈他雄酮(Masterone Injection^®)；Elliott's B溶液(Elliott's B Solution^®)；表柔比星(Ellence^®)；阿尔法依泊汀(epogen^®)；erlotinib(Tarceva^®)；雌莫司汀(Emcyt^®)；磷酸依托泊苷(Etopophos^®)；依托泊苷，VP-16(Vepesid^®)；依西美坦(Aromasin^®)；非格司亭(Neupogen^®)；氟尿苷(动脉内的)(FUDR^®)；氟达拉滨(Fludara^®)；氟尿嘧啶，5-FU(Adrucil^®)；氟维司群(Faslodex^®)；gefitinib(Iressa^®)；吉西他滨(Gemzar^®)；吉姆单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)(Mylotarg^®)；醋酸戈舍瑞林(Zoladex Implant^®)；醋酸戈舍瑞林(Zoladex^®)；醋酸组氨瑞林(Histrelin implant^®)；羟基脲(Hydrea^®)；替伊莫单抗(Zevalin^®)；伊达比星(Idamycin^®)；异环磷酰胺(IFEX^®)；甲磺酸伊马替尼(Gleevec^®)；干扰素α 2a(Roferon A^®)；干扰素α-2b(Intron A^®)；依立替康(Camptosar^®)；lenalidomide(Revlimid^®)；来曲唑(Femara^®)；亚叶酸(Wellcovorin^®, Leucovorin^®)；醋酸亮丙瑞林(Eligard^®)；左旋咪唑(Ergamisol^®)；罗莫司汀，CCNU(CeeBU^®)；meclorethamine，氮芥(Mustargen^®)；醋酸甲地孕酮(Megace^®)；美法仑，L-PAM(Alkeran^®)；巯基嘌呤，6-MP(Purinethol^®)；美司钠(Mesnex^®)；美司钠(Mesnex tabs^®)；甲氨蝶呤(Methotrexate^®)；甲氧沙林(Uvadex^®)；丝裂霉素C(Mutamycin^®)；米托坦(Lysodren^®)；米托蒽醌(Novantrone^®)；苯丙酸诺龙(Durabolin-50^®)；奈拉滨(Arranon^®)；诺非单抗(Verluma^®)；奥普瑞白介素(Neumega^®)；奥沙利铂(Eloxatin^®)；紫杉醇(Paxene^®)；紫杉醇(Taxol^®)；紫杉醇蛋白结合的微粒(Abraxane^®)；palifermin(Kepivance^®)；氨羟二磷酸二钠(Aredia^®)；培加酶(Adagen(Pegademase Bovine)^®)；天门冬酰胺酶(Oncaspar^®)；Pegfilgrastim(Neulasta^®)；培美曲塞二钠(Alimta^®)；喷司他丁(Nipent^®)；哌泊溴烷(Vercyte^®)；普卡霉素，光辉美塞(Mithracin^®)；卟吩姆钠(Photofrin^®)；丙卡巴肼(Matulane^®)；奎那克林(Atabrine^®)；拉布立酶(Elitek^®)；利妥昔单抗(Rituxan^®)；沙格司亭(Leukine^®)；沙格司亭(Prokine^®)；sorafenib(Nexavar^®)；链佐星(Zanosar^®)；sunitinib maleate(Sutent^®)；滑石粉(Sclerosol^®)；他莫昔芬(Nolvadex^®)；替莫唑胺(Temodar^®)；替尼泊苷，VM-26(Vumon^®)；睾内酯(Teslac^®)；硫鸟嘌呤，6-TG(Thioguanine^®)；噻替哌(Thioplex^®)；托泊替康(Hycamtin^®)；托瑞米芬(Fareston^®)；托西莫单抗(Bexxar^®)；托西莫单抗/I-131托西莫单抗(Bexxar^®)；曲妥单抗(Herceptin^®)；维甲酸，ATRA(Vesanoid^®)；乌拉莫司汀(Uracil Mustard Capsules^®)；戊柔比星(Valstar^®)；长春碱(Velban^®)；长春新碱(Oncovin^®)；长春瑞滨(Navelbine^®)；和唑来膦酸盐(Zometa^®)。

指出的所有专利、公开和未决的专利申请都通过引用并入本文。

本文使用的缩写具有下表中的含义。下表中未列出的缩写具有与通常所用相同的含义，除非另外特别说明.

Cu(OAc)2	乙酸铜
		DIPEA	二异丙基乙胺
EDC	1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐
		HOBt	N-羟基苯并***
NH4Cl	氯化铵

根据下述的一般方案，使用适当的材料，可以制备本发明的mTOR抑制剂和抗-IGF-1R抗体，并通过后面的具体实施例进一步例证。但是，在实施例中列出的具体抗癌剂不应解释为形成本发明考虑的唯一种类。因此，下面的示例性实施例不受列出的抗癌剂或为了例证目的而采用的任何具体取代基的限制。本领域技术人员会容易地理解，下述制备操作的条件和过程的已知变体可以用于制备这些化合物。所有温度都是摄氏度，除非另外指出。

合成方法

方案 1

现在，在下面的非限制性实施例中例证本发明，除非另有说明，其中：

1. 通过NMR、LCMS，分析所有终产物。

2. 通过NMR和/或TLC和/或LCMS，分析中间体。

3. 通过硅胶上的快速色谱法、反相HPLC、重结晶和/或swish (悬浮在溶剂中，随后过滤固体)，纯化大多数化合物。

4. 通过薄层色谱法 (TLC)和/或LCMS，跟踪反应进程，仅为了例证而给出反应时间。

实施例1

二甲基-次膦酸C-43雷帕霉素酯

在N₂流下，向冷却的(0℃)雷帕霉素(0.1 g, 0.109 mmol)在1.8 mL 二氯甲烷中的溶液中，加入0.168 g (0.82 mmol)的2,6-二-叔丁基-4-甲基吡啶，随后立即加入二甲基次膦酰氯 (0.062 g, 0.547 mmol)在0.2 mL 二氯甲烷中的溶液。在N₂气氛下，在0℃搅拌该浅黄色的反应液3.5 h (通过TLC监测反应)。用~20 mL EtOAc稀释冷的(0℃)反应液，然后转移至含有EtOAc (150 mL)和饱和NaHCO₃ (100 mL)的分液漏斗中。在去除水层后，用冰冷的1N HCl (1x100 mL)、饱和NaHCO₃(1x100 mL)和盐水(1x100 mL) 依次洗涤有机层，然后经MgSO₄干燥，并浓缩。通过硅胶快速色谱法(用1:10:3:3 MeOH/DCM/EtOAc/己烷洗脱) 纯化粗产物，得到0.092 g白色固体：¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ4.18 (m, 1H), 4.10 (m, 1H), 3.05 (m, 1H), 1.51 (m, 6H); ³¹P NMR (121 MHz, CDCl₃) δ 53.6; 1013 m/z (M+Na)。

实施例2

二甲基-次膦酸C-43雷帕霉素酯，替代合成

将雷帕霉素和二氯甲烷装入氮净化的反应瓶中。将搅拌的溶液冷却至大约0℃ (在反应期间，维持-5 ± 5℃的外部温度)。然后在大约8-13分钟的时间段内，加入二甲基次膦酰氯(2.0摩尔当量)在二氯甲烷中的溶液。随后立即在大约15-20分钟的时间段内，加入3,5-二甲基吡啶 (2.2摩尔当量)在二氯甲烷中的溶液。在两次加入的过程中，反应的内部温度保持低于0℃。将冷却的反应液搅拌1小时，然后在仍然冷时，转移至含有饱和NaHCO₃水溶液和甲基-叔丁基醚(MTBE)、乙酸乙酯或二***的萃取器。在30和60分钟时间点，取出过程中样品。以与关于反应后处理（reaction workup）所述类似的方式，制备样品。通过TLC (1:10:3:3 MeOH/DCM/EtOAc/己烷)和反相HPLC分析，监测反应进程。用冰冷的1N HCl、饱和NaHCO₃水溶液 (2x)、饱和NaCl水溶液连续洗涤分离的有机层，经硫酸钠干燥。在过滤和去除溶剂以后，用丙酮对残余物进行溶剂更换，随后在真空中浓缩，得到粗产物，其可以通过正相和反相HPLC来分析纯度。

实施例3

鼠单克隆抗体(MAb)的制备和选择

为了制备特异性地针对IGF-IR、且不识别IR的Mab，预见到包含6个筛选阶段的方法。

它包括：

- 用重组IGF-IR免疫小鼠，以便制备杂交瘤，

- 针对用于免疫的重组蛋白，通过ELISA筛选培养上清液，

- 针对在MCF-7肿瘤细胞表面上过表达的天然受体，通过ELISA测试所有阳性杂交瘤的上清液，

- 在被分别表达IGF-IR或IR的杆状病毒感染的昆虫细胞上，关于IGF-IR和IR的差别化识别，评价在前2次筛选中阳性的杂交瘤的上清液，

- 验证在该阶段选择的抗体能够在体外抑制MCF-7细胞的诱导的IGF1增生，

- 在裸鼠中确定保留的候选物关于对肿瘤MCF-7的生长的影响的体内活性。

所有这些不同的阶段和得到的结果将在下面在实施例1中予以简要描述。

对于免疫阶段，通过皮下途径，给小鼠注射2次各8 μg重组IGF-IR。在雌性大鼠的细胞与鼠骨髓瘤Sp2OAg14的细胞融合之前3天，通过静脉内注射3 μg 重组受体，刺激小鼠。在融合后14天，在用重组IGF-IR敏化的平板上，通过ELISA筛选杂交瘤的上清液。保留发现其上清液为阳性的杂交瘤，并扩增，然后在流式细胞计（FACScan）上测试，从而证实生产的抗体同样能够识别天然 IGF-IR。为此，用在ELISA中选择的杂交瘤所生产的每一种培养上清液，温育来自***-依赖性的过表达IGF-IR的乳腺肿瘤的MCF-7细胞。通过偶联到荧光染料上的第二抗-物种抗体，揭示细胞表面上的天然/MAb受体复合物。图3A-3C显示了与标有单独+第二抗体的细胞(图3A)或与标有使用对照同种型的细胞(图3B)相比，使用杂交瘤7C10的上清液得到的直方图类型(图3C)。

在该选择阶段，仅选择和克隆分泌Mab、并同时识别重组受体和天然受体的杂交瘤。制备由这些杂交瘤分泌的Mab，然后纯化，随后根据上述的方法，在表达IGF-IR或IR的Sf9 昆虫细胞上，在流式细胞计上测试，以便消除同时识别两种受体的杂交瘤。图4A显示了直方图1、2、3的总回收量，它们分别对应着未感染的细胞 + 第二抗体(1)、用αIR3标记的未感染的细胞+ 第二抗体(2)和用抗-IR抗体标记的未感染的细胞+ 第二抗体(3)。该第一个结果较好地显示了在这些未感染的昆虫细胞的表面上可检测的IGF-IR和IR的缺失。图4B显示了用表达IGF-IR的杆状病毒标记受感染的细胞。在该第二个图中，如预期的，用作阳性对照的αIR3较好地标记了该细胞(峰 2)，而抗-IR (峰 3)与单个细胞的峰重叠。最后，在图4C中，如预期的，显示了抗-IR较好地标记了表达IR的Sf9细胞(峰 3)，但是意外地，在文献中描述为IGF-IR特异性的αIR3似乎同样识别IR (峰 2)。

在该第三个筛选***中得到的结果总结在表1中，并显示了MAb: 7C10的制备，其满足识别IGF-IR且不识别IR的标准。Mab 7C10的同种分型已经证实，它包含IgG1。

表 1

在表达IGF-IR或IR的Sf9 昆虫细胞上进行的MAb 7C10反应性对比

最后2次筛选用于选择这样的Mab，所述Mab可以用于证实其非常能够抑制IGF-I在体外和在体内诱导的细胞系MCF-7的细胞增生。

关于体外选择，接种MCF-7细胞，剥夺胎牛血清，然后在有或没有要测试的7C10抗体存在下（加至10 μg/ml的终浓度），在有递增浓度的IGF-I (1-50 ng/ml)存在下温育。在该实验中，引入商业的αIR3 Mab作为阳性对照，并引入7G3 MAb (与7C10平行地分离，且弱识别天然受体(在FACS上的MFI为50，而MAb 7C10为200)) 作为对照同种型。通过在β计数器上跟踪细胞对氚化的胸苷的掺入，估测细胞增生。将结果表示为增生指数。图5所示的数据表明，IGF1能够以剂量-依赖性的方式刺激MCF-7细胞的增生。用作阳性对照的MAb αIR3完全抑制由IGF-I诱导的MCF-7细胞的增生。以相同的方式，MAb 7C10显著抑制由IGF-I诱导的MCF-7细胞的生长。最后，如预期的，用作同种型对照的MAb 7G3被证实较好，对MCF-7细胞的体外肿瘤细胞生长没有影响。

在确定的肿瘤模型中进行体内选择。为此，裸鼠接受缓释***的皮下植入物，这是在鼠模型中建立肿瘤所必需的。植入***24小时后，将5x10⁶ MCF-7细胞皮下地移植到小鼠的右侧。在该细胞移植后5天，肿瘤是可测量的，随机地形成6只小鼠的组。以250 μg/给药/小鼠的剂量，每周治疗小鼠2次，进行5-6周。在对照组中，以与鼠对照同种型相同的方式，治疗小鼠。在图6A中显示的结果表明，抗体7C10会非常显著地抑制诱导的肿瘤生长。如果参考关于αIR3（它总是用作IGF1的受体的结构域的参照，且已知对***-依赖性的肿瘤的生长不具有任何体内活性）可得到的数据，该活性是特别意外的(参见图6B)。以相同的方式，与用源自鼠MAb 1H7的重组抗体scFv-Fc得到的结果相比(参见图6C)，在MCF-7细胞的生长的体内抑制方面，MAb 7C10远远更有效。

实施例4

MK-0646和RIDAFOROLIMUS对人肺癌细胞系的影响

概述：提出的组合的原理基于下述观察结果，所述观察结果表明，当组合时，MK-0646和Ridaforolimus各自通过抑制致癌信号传递（经由PI3激酶信号传递途径）来起作用，且组合的二者产生比单独起作用的任一种药剂更有效的途径抑制。也参见(Cao 等人 Cancer Research 2008)。

简而言之，MK-0646（一种靶向IGF1R的单克隆抗体）和mTOR抑制剂（一种雷帕霉素类似物Ridaforolimus）中的每一种目前被开发用于治疗肺癌。使用雷帕霉素类似物的治疗导致AKT信号传递的上调节，这通过AKT的磷酸化测得。尽管Ridaforolimus对mTOR的抑制可以诱导肿瘤生长停止，它会废除由IRS-1介导的负反馈环，导致AKT的活化，其已经涉入降低它的抗肿瘤活性。AKT的该反馈活化经由IGF1R信号传递途径来介导。近期的临床研究提示，经由该反馈机理的AKT活化可能与用雷帕霉素治疗的患者中更短的进展时间有关 (Cloughesy 等人 PLoS Medicine, 2008)。另外，mTOR似乎是MK-0646 效能的关键增强剂，因而通过组合ridaforolimus和MK-0646来阻断AKT的该反馈活化可以有益地用于抑制PI3K途径以及增强MK0646的抗肿瘤活性。提出的组合的原理部分地基于上述观察结果。为了研究该可能性，发明人在一组肺癌细胞系中检查了提出的组合。下文详述了支持下述假说的数据，即包含MK-0646和Ridaforolimus的联合治疗会显著增强PI3K途径抑制和细胞增生。同样，提出的组合在厄洛替尼-抗性的、KRAS-突变型肺癌异种移植物模型中表现出增强的抗肿瘤活性。

(A) MK-0646 + Ridaforolimus 组合会增强 PI3K 途径靶向：

方法：从ATCC得到所有NSCLC细胞系，并在含有10%胎牛血清的RPMI 1640 (Invitrogen)中维持。为了蛋白印迹分析，从在6孔板中培养、并用Ridaforolimus (10nM)或MK-0646 (10ng/ml)或二者组合处理4小时的细胞制备总蛋白裂解物，并在SDS凝胶装载染料 (Invitrogen)中收获。使用指示的总抗体或磷酸特异性的抗体，随后使用第二抗体，对样品进行蛋白印迹(Cell Signaling Technology, CST)，然后用SuperSignal化学发光底物(Pierce)温育。然后将印迹暴露于Kodak Biomax光胶片。从CST得到针对ERK、p-ERK (Thr202/Tyr204)、AKT和p-AKT (Ser473)、IGF1R S6K和P-S6K (T389)、IRS1和P-IRS1 (S302)和肌动蛋白的抗体。在用指示的化合物处理24小时以后，在H2122细胞中进行细胞周期分析 (参见上面)。使100万细胞渗透化，并如生产商(BD Pharmingen #550825)所述，用碘化丙啶(PI)染色。PI会结合DNA和RNA，所以通过核糖核酸酶(RNA酶A)消化来去除RNA。通过流式细胞术测定DNA的含量，可以揭示关于细胞周期的有用信息。在细胞周期的G2和M期的细胞的DNA含量是G0和G1期的细胞的2倍。在S期的细胞的DNA含量位于这些端值之间。使用流式细胞计，使用562-588 nm 带通滤波器，在波谱的橙色范围内检测到PI。

分析：已经在人肺癌细胞系中评价了Ridaforolimus和MK-0646 的组合。两种化合物都通过抑制致癌信号传递（经由PI3激酶信号传递途径）来起作用。在本文中进行的研究证实了其它报道，即2种试剂产生比单独的任一种试剂更有效的途径抑制。以前已经报道，mTOR (TORC1复合物)的抑制会导致继发效应，该继发效应导致有活性的、磷酸化形式的AKT升高，这会促进肿瘤细胞存活。重要的是，MK-0646对IGF1R的抑制可以有效地阻断该效应。图1解释了反馈环现象，表明组合两种药剂会消除（counter）该效应，并改善致癌的PI3K信号传递的靶向。mTOR抑制剂是S6激酶的有效抑制剂，并因而是蛋白翻译的有效抑制剂。但是，S6激酶的抑制也导致由S6激酶(S6K)介导的负反馈环的废除，这会抑制IGF1R信号传递。阻断该反馈环的效应是，IGF1R信号传递升高，导致有活性的、磷酸化形式的AKT (AKT-P)的水平增加，这驱动肿瘤存活。用雷帕霉素类似物（rapalogue）RAD001（它类似于ridaforolimus）治疗患者，会导致升高的AKT-P (O'Reilly, K.E. 等人, Cancer Research, 2006; 图1B)。有些研究人员已经提出，当在某些背景下作为单一药剂使用时，这可能限制化合物的有效性(Cloughesy 等人 PLoS Medicine, 2008)。由于认为该效应依赖于IGF1R活性，发明人提出使用与MK-0646（IGF1R的一种抑制剂）相组合的mTOR抑制剂。迄今为止，收集的数据与先前的发现相一致。数据表明，使用Ridaforolimus和MK-0646的组合共同治疗非小细胞肺癌细胞系H2122，可以比单独的任一种药剂更有效地阻断信号传递 (图1C，右)，防止S6K磷酸化(通过Ridaforolimus)和AKT 磷酸化(通过MK-0646)。该组合也可以比单一药剂更有效地在体外抑制这些肿瘤细胞的细胞周期和存活。用该组合治疗H2122肿瘤细胞系，会导致活跃***的细胞的百分比的降低和死亡的或垂死的细胞的增加(图1D)。

(B) Ridaforolimus+MK-0646 组合会增加体外效能

为了评估MK-0646或ridaforolimus或组合的效能，发明人使用软琼脂试验，在一组肺肿瘤细胞系中，在有这些抑制剂存在下，评价了锚着非依赖性的生长。在没有添加的IGF存在下，进行菌落形成试验。在9个细胞系 (5个突变型-KRAS；4个野生型-KRAS)中，评估了MK-0646或ridaforolimus或组合的效应。在KRAS突变型细胞系(H23)和3个KRAS野生型细胞系(图2)中，观察了MK-0646单一药剂敏感度。具有IGF1R低表达的H1703是MK-0646抗性的。在2个具有高水平的IGF1R的KRAS突变型细胞系(A549和H2122)中，仅存在有限的单一药剂活性，而组合表现出显著的生长抑制。总体上，该组中的大多数细胞系表现出组合优势。没有观察到KRAS-状态和对组合的应答之间的显著关联。

方法：在96孔玻璃底平板 (MatriCal)中进行软琼脂试验。以3,000-9,000细胞/孔的浓度，将细胞接种进100 μl添加了14% FBS和0.3% (w/v) SeaPlaque琼脂糖的RMPI 1640(Lonza Rockland, Inc)中，该细胞层在由添加了0.8%琼脂糖的相同培养基组成的底层的上面。在琼脂糖已经固化后，将化合物加入100 μl培养基中。将细胞温育7-14天，然后用LavaCell (Active Motif) 染色过夜。使用Isocyte™激光扫描细胞计数器，定量菌落。在软琼脂菌落形成试验中，评价了单独的或与治疗标准药剂（standard of care agents）组合的MK-0646的抑制锚着（anchorage）非依赖性生长的能力。如生产商所述，使用P-RTK阵列(R&D biosciences)，在总蛋白裂解物中评价了RTK状态。从公开的癌症基因组数据库 (Sanger)中，鉴别出KRAS中的活化突变。

(C ) MK-0646 和 Ridaforolimus 的组合在 A549 肺异种移植物模型中的组合优势

在A549突变型-KRAS异种移植物模型中，评价了Ridaforolimus和MK-0646的组合。当与ridaforolimus (0.1 mpk)组合地施用剂量为0.2或2 mpk的MK-0646时，该组合表现出显著的抗肿瘤活性。但是，与ridaforolimus (0.1 mpk) 组合地施用剂量为20 mpk的MK-0646，显示的肿瘤消退的统计显著性超过单独的任一种药剂 (图3)。当在组之间对比肿瘤重量时，观察到类似的结果。与单独的任一种药剂相比，在与Ridaforolimus (0.1 mpk)组合地施用MK-0646 (20 mpk)的小鼠中，存在肿瘤重量的统计上显著的降低(图3)。这些数据一起提供了有力的体内证据，表明与Ridaforolimus组合的更低剂量的MK-0646会诱导肿瘤停滞，而与Ridaforolimus组合的更高剂量的MK-0646 (20 mpk)可以造成肿瘤消退。在该组合时，还观察到肿瘤重量的显著降低(图4)。在该模型中用厄洛替尼进行治疗，没有导致任何可察觉的肿瘤生长抑制 (图5)。在该模型中，由于在该模型中存在KRAS的活化突变，厄洛替尼缺乏效力就不足为奇。结果，数据证实了MK-0646和Ridaforolimus在厄洛替尼难以治疗的NSCLC模型中的组合优势。

方法：将2.5x10⁶ A549 人NSCLC细胞皮下地注射进4-6 周龄无胸腺的裸-Foxn1nu小鼠(Charles River Laboratories)的右侧。当肿瘤达到~300 mm³ (长度*宽度*宽度*0.5)的大小时，将小鼠随机地分成处理组。给小鼠(n=8/组)施用载体，每周1次、持续3周(qwk x 3) (20 mM L-组氨酸, 150mM NaCl, 0.5% PS80 pH= 6)，或腹膜内地施用0.2或2或20 mpk的MK-0646（mg/kg MK-0646）qwk x 3，或施用与MK-0646组合的Ridaforolimus (0.1 mg/kg) 3周。在研究过程中每周2次和在结束时，将动物称重，并通过测径器测量，测定肿瘤体积。在结束时，测定肿瘤重量。在第21天，通过CO₂ 窒息，处死动物。在最终剂量后24小时，处死小鼠。在处死时，收集并处理组织样品。

在下表中描绘了在处理结束时的相对肿瘤体积。负值代表肿瘤消退。与单一药剂相比，在所有MK-0646和Ridaforolimus组合组中，观察到显著的肿瘤生长抑制。

表2 与Ridaforlolimus组合的MK-0646的肿瘤生长抑制.

* P<0.05; ** P<0.01。

实施例5

MK-0646增强剂筛选

概述：众多证据表明，IGF1R信号传递的过度活化与肿瘤的发展（tumor progession）有关联。IGF1R和它的配体IGF1经常在人癌症中过表达，且与预后不良有关 (Miller和Yee, 2005)。此外，IGF1或IGF1R在动物组织中的受迫的过表达会导致自发的肿瘤形成(Jones 等人, 2006)。相反，降低的IGF1R功能可以防止肿瘤形成，因为从IGF1R 敲除的小鼠分离出的成纤维细胞可以耐受癌基因过表达的转化 (Sell 等人 1994)。

使用慢病毒-介导的RNAi筛选来确定IGF-1R特异性的抗体(MK-0646)是否可以用于增强在联合治疗方案中的有效性。作为筛选的结果，鉴别出37个靶物，它们的沉默会显著增强肿瘤细胞对MK-0646的敏感度。这些增强剂是靶向PI3激酶信号传递级联的4种不同的正调节物 (PI3KCA、PDPK1、AKT2和FRAP1/mTOR)的 shRNA。不同于靶向该途径的负调节物PTEN的shRNA，这些靶向正调节物的shRNA赋予对MK-0646的抗性。总之，这些数据提示，PTEN阴性的肿瘤可以表现出对MK-0646的抗性。此外，所述数据支持下述的假说，所述假说表明：将靶向PI3K途径的抑制剂（诸如mTORi或AKTi或PI3Ki）与MK-0646相组合的确可以增强MK-0646应答。

结果：发明人应用慢病毒-介导的RNAi筛选来鉴别肿瘤细胞的激酶调节物对胰岛素-样生长因子1受体(IGF1R) mab（尤其是MK-0646）的敏感度。为此目的，筛选了1439种靶向480种不同人激酶的慢病毒shRNA载体，以鉴别MK0646的抗肿瘤细胞活性的潜在增强剂。

使用MK-0646和靶向激酶的慢病毒shRNA载体，进行了9个使用不同浓度的MK-0646 (200 μg/ml-300 ng/ml)的不同筛选。从所述筛选中，鉴别出37个共有命中（consensus hit）的列表，它们代表前3%的MK-0646 增强剂。参见图10。在这些命中内突出的是靶向标准的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)途径的多个成员的shRNA载体：PIK3CA（通过2种不同的载体）、PDPK1、AKT2和FRAP1/mTOR。以前已经在siRNA筛选中将来自该筛选的2个单独的共有命中(CCRK和NEK8)鉴别为PI3K/AKT途径的调节物，参见Brace 等人 2006。在MK-0646 增强剂的列表中还值得注意的是：靶向Ras信号传递级联的2个成员的shRNA (通过两种不同载体的B-Raf，和通过两种不同载体的MAP2K1)。总之，前37个shRNA命中里的11个靶向作为2个确定的信号传递级联的成员的激酶，假定所述激酶在IGF1R活化后被活化。参见图6。

进行了一个基于HT29 结肠癌细胞的菌落形成的独立增生试验，以确证上述的筛选命中。

方法/分析 – 图6：在用新载体感染后，将细胞暴露于MK-0646的5-剂量滴定，然后使其在9天期间形成菌落。将37个shRNA 命中内的每一个的增强对MK-0646的敏感度的能力与空载体对照以及3个从shRNA激酶载体集合中随机选择的“非命中” shRNA载体相对比。另外，因为PI3K途径的多种正效应物被评为命中，还测试了有效地沉默脂质磷酸酶PTEN（PI3K信号传递的主要负调节物）的单独载体。PTEN是如下起作用的确定的肿瘤抑制基因：通过去磷酸化PI3K活性的产物，从而防止下游激酶的活化。还进行了无载体(单独的MK-0646)和无治疗(没有病毒且没有药物)对照。

方法：如下制备靶向480个单独基因（大多数是激酶）的慢病毒：如invitrogen慢病毒包装*** (Virapower 包装***, Invitrogen)所述推荐的，通过用包装载体共转染，在293T细胞中包装1439种慢病毒shRNA载体 (Kalypsis库, GNF)。在384孔板内，在10%FBS存在的DMEM中培养HT-29细胞 (n=500)。次日，用10ul包装的病毒感染细胞。在第3天，取出培养基，并使细胞恢复1天。在第4天，用MK0646 (200 μg/ml-300 ng/ml)处理细胞。在第8天，如前所述，通过阿尔玛蓝染色，评估细胞生长的量(Klinghoffer等人2008 Assay and Drug Development Technologies)。

方法–图7：以1500细胞/孔，将HT29细胞接种在6孔板中，并暴露于病毒16小时。去除病毒，并替换为不含有药物或含有MK-0646稀释物(0.05、0.1、0.5、1或10 ug/ml)的新鲜培养基。在试验过程中，每3天更换MK-0646。在添加药物后第9天，用结晶紫进行平板染色。通过用Alpha图像仪成像，计算菌落数目和面积。

3个随机选择的shRNA载体与空载体和无载体对照的对比，表明肿瘤细胞对MK-0646的敏感度没有差异。相反，在该试验中评估的20个筛选命中内的11个导致肿瘤细胞增生的MK-0646 抑制的2倍或更大增强。参见图7。

定量实时PCR分析证实，10/11的这些载体沉默了它们的靶物>50%，7/11的这些载体沉默了它们的靶物> 70%，表明观察到的增强是由于有意的沉默（intended silencing） – 图10。同样，使用该试验，37个shRNA命中内的17个在没有药物存在下产生细胞毒性，这阻止了MK-0646 致敏作用的评估。使用与初期筛选类似的短期(72小时)阿尔玛蓝试验，分析这些有毒的shRNA，但是在感染后将细胞暴露于MK-0646的10-剂量滴定。作为该试验的结果，鉴别出的另外8个shRNA显著地(p < 0.05)增强了肿瘤细胞对MK-0646的敏感度。参见图11。

参考图7和10，与PI3K途径信号传递在IGF-介导的肿瘤生长中的主要作用相一致，通过菌落试验鉴别出的前3种MK-0646增强剂是靶向PI3K、FRAP1/mTOR和NEK8的载体 (这3种载体分别产生86%、80%和70%的靶物沉默)。

另外，通过72-小时阿尔玛蓝试验鉴别出的最强增强剂是靶向假定的PI3K途径调节物CCRK的载体 (64%靶物沉默；未显示)。相反，暴露于靶向PTEN的载体的细胞可以耐受MK-0646的抗增生作用，表现出与没有治疗的细胞类似的生长(图6)。还证实了靶向Ras途径的成员MAP2K1和B-raf (分别是97%和75%沉默)的载体。参见图10。鉴于PI3K和Ras信号传递级联的成员之间存在广泛的交互调节，假定MAP2K1和B-raf shRNA的致敏效应部分地归因于PI3K信号传递的猝灭。

迄今为止，在其中靶向相同基因(PIK3CA、B-raf、MAP2K1、BUB1和CSNK1A1)的2种shRNA在初期筛选中表现出增强的情况下，2种shRNA之一得到证实，而另一种似乎在没有药物存在下表现出毒性。第二种shRNA的验证可能需要更短的试验形式。

为了进一步支持PTEN结果，在携带PTEN shRNA的稳定整合的细胞上，进行试验。对比了这些细胞与稳定表达载体对照或靶向CSK和MAP4K5的shRNA的细胞。靶向CSK和MAP4K5的载体是来自初期筛选的共有命中，但是在菌落试验中仅证实了MAP4K5。与使用新病毒的结果相类似，表达PTEN shRNA的细胞系在菌落试验中表现出MK-0646抗性，而表达CSK shRNA的细胞系以与载体对照类似的方式做出响应，且表达MAP4K5 shRNA的细胞对药物敏化。参见图8。

方法-图8：以1500细胞/孔，将HT29细胞（携带稳定整合的靶向PTEN、CSK和MAP4K5的shRNA）接种进6孔板中。次日，给细胞提供不含有药物或含有0.01、0.1、1、10或100 ug/ml MK-0646的新鲜培养基。在试验过程中，每3天更换MK-0646。在添加药物后第9天，用结晶紫进行平板染色。如上所述，定量菌落生长。对MK-0646的应答类似于在急性暴露于上面分析的每种慢病毒载体以后观察到的应答。

数据和伴随的观察结果表明，携带PTEN中的功能缺失突变的肿瘤的患者可能对MK-0646的治疗做出较差的响应。因为这样的突变是癌症中常见的，发明人尝试通过抑制PI3K peroemed 额外试验，确定是否能够重新使MK-0646抗性的细胞对药物敏感。

方法– 图9：用靶向PI3K、PDPK1或MELK的shRNA载体感染HT29细胞，所述细胞稳定表达对MK-0646做出应答的载体对照(红线)，或稳定表达MK-0646抗性的PTEN shRNA (蓝线)。(A) 与图6所示的我们的试验相类似，使用靶向PI3K或MELK的shRNA载体感染载体对照 HT29细胞，分别产生强烈的和中等的针对MK-0646的致敏作用，而靶向PDPK1的shRNA不具有作用。(B) 使用MELK或PDPK1感染稳定的PTEN shRNA HT29细胞，对逆转由PTEN缺乏造成的MK-0646抗性没有影响。相反，用PI3K shRNA 载体进行感染，会完全逆转该抗性。

分析：与我们以前的结果相一致，与表达载体对照的细胞相比，表达PTEN shRNA的细胞是MK-0646抗性的。参考图9A，与我们以前的实验相一致，用靶向PI3K或MELK的载体感染对照细胞，可以使细胞对MK-0646敏感，但是PDPK1则不然。在PTEN-缺陷型细胞中，MELK shRNA的感染没有影响，因为这些细胞保留对MK-0646的抗性。但是，用靶向PI3K的shRNA进行感染，能够重新使PTEN shRNA系对MK-0646的作用敏感 - 图9B。因而，经由PI3K的信号传递似乎是IGF1R-介导的肿瘤细胞增生的速率限制。该观察结果表明，尽管具有过度活跃的PI3K信号传递的患者可能对抗-IGF1R药剂的单一疗法无应答，与PI3K途径成员（诸如mTOR）的抑制剂的联合治疗可能确实是有效的。

尽管已经描述了本发明的许多实施方案，显然可以改变基础实施例来提供本发明包括的其它实施方案。因此，应当理解，本发明的范围由所附的权利要求来界定，而不是由已经用实施例表示的具体实施方案来界定。

序列表

Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln – SEQ. ID. NO. 1

Lys Val Ser Asn Arg Leu Tyr – SEQ. ID. NO. 2

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr – SEQ. ID. NO. 3

Gly Gly Tyr Leu Trp Asn – SEQ. ID. NO. 4

Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu Lys Asp – SEQ. ID. NO. 5

Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr – SEQ. ID. NO. 6

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys – SEQ. ID. NO. 7

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys – SEQ. ID. NO. 8

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Gly Gly Tyr Leu Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu Lys Asp Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser – SEQ. ID. NO. 9

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Gly Gly Tyr Leu Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser – SEQ. ID. NO. 10

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Gly Gly Tyr Leu Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser – SEQ. ID. NO. 11

Asp Val Leu Met Thr Gln Ile Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys – SEQ. ID. NO. 12

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Gly Gly Tyr Leu Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu Lys Asp Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser – SEQ. ID. NO. 13

序列表

<110> Merck Sharp & Dohme Corp.

Sathyanarayanan, Sriram

Winter, Christopher

Klinghoffer, Richard

<120> 用于治疗癌症的组合物和方法

<130> MRL-ONC-00014

<150> 61/169,757

<151> 2009-04-16

<160> 13

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸

<400> 1

Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln

1 5 10 15

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸

<400> 2

Lys Val Ser Asn Arg Leu Tyr

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸

<400> 3

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr

1 5

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸

<400> 4

Gly Gly Tyr Leu Trp Asn

1 5

<210> 5

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸

<400> 5

Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu Lys Asp

1 5 10 15

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸

<400> 6

Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr

1 5

<210> 7

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸

<400> 7

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Tyr Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 8

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸

<400> 8

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Tyr Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 9

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸

<400> 9

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Gly Gly

20 25 30

Tyr Leu Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Asp Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸

<400> 10

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Gly Gly

20 25 30

Tyr Leu Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 11

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸

<400> 11

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Gly Gly

20 25 30

Tyr Leu Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸

<400> 12

Asp Val Leu Met Thr Gln Ile Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Tyr Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 13

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全合成的氨基酸

<400> 13

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Gly Gly

20 25 30

Tyr Leu Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Asp Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser

115

Claims (6)

1.mTOR抑制剂和抗-IGF-1R抗体在制备用于治疗非小细胞肺癌的药物中的用途，其中所述mTOR抑制剂为 ridaforolimus，且所述抗-IGF-1R抗体为dalotuzumab。

2.如权利要求1所述的用途，其中以10 mg至40 mg的剂量口服施用ridaforolimus。

3.如权利要求2所述的用途，其中每周施用ridaforolimus 5次。

4.如权利要求1所述的用途，其中以10 mg/kg的剂量静脉内施用dalotuzumab。

5.如权利要求4所述的用途，其中每周施用dalotuzumab 1次。

6.如权利要求4所述的用途，其中每隔一周施用dalotuzumab 1次。