SK285256B6

SK285256B6 - O-Alkylovaný derivát rapamycínu, farmaceutická kompozícia a jeho použitie, najmä ako imunosupresíva

Info

Publication number: SK285256B6
Application number: SK465-95A
Authority: SK
Inventors: Sylvain Cottens; Richard Sedrani
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1992-10-09
Filing date: 1993-09-24
Publication date: 2006-10-05
Also published as: CA2145383A1; CY2005010I1; FI20001943A; KR100308598B1; DK0867438T3; HU224074B1; PT867438E; EP1413581A1; RO114451B1; BR1100353A; JPH08502266A; EP0867438A1; JP3117462B2; US6440990B1; FR04C0012I2; FI951678A0; ES2225919T3; EP0663916A1; HUT71232A; HU9501016D0

Abstract

Opisuje sa 40-O-(2-hydroxy)etylrapamycín (I) a farmaceutická kompozícia obsahujúca 40-O-(2-hydroxy)etylrapamycín spolu s farmaceuticky prijateľným riedidlom alebo nosičom. Použitie 40-O-(2-hydroxy)etylrapamycínu na prípravu liečiva na použitie spolus imunosupresívnym liečivom; na použitie v kombinácii s Ciclosporinom, FK-506, kortikosteroidmi alebo imunosupresívnou monoklonálnou protilátkou; na použitie v kombinácii s imunomodulačnou zlúčeninou; a na prípravu liečiva na použitie spoločne s protizápalovým činidlom alebo protiinfekčným činidlom.

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka nového alkylovaného derivátu rapamycínu, ktorý je farmaceutický využiteľný, najmä ako imunosupresívum.

Doterajší stav techniky

Rapamycín je známe makrolidové antibiotikum produkované Streptomyces hygroscopicus, majúce štruktúru znázornenú vzorcom (A):

(A)

Pozri napríklad McAlpine, J. B. a spol., J. Antibiotics (1991)44: 688, Schreiber, S. L. a spol., J. Am. Chem. Soc. (1991) H3: 7433, US patent č. 3 929 992. Rapamycín je neobyčajne silné imunosupresivum a preukázalo sa, že má protinádorovú a protiplesňovú účinnosť. Jeho použiteľnosť ako farmaceutika je však obmedzená jeho veľmi nízkou a nestálou biodostupnosťou, ako aj jeho vysokou toxicitou. Navyše, rapamycín je veľmi nerozpustný, čo sťažuje prípravu stabilných liekových foriem.

Podstata vynálezu

Neočakávane sa zistilo, že nový derivát rapamycínu (nová zlúčenina) má lepší farmakologický profil než rapamycín, má lepšiu stabilitu a biodostupnosť a umožňuje jednoduchšiu výrobu liekových foriem. Nová zlúčenina je alkylovaný derivát rapamycínu so štruktúrou všeobecného vzorca (I):

(I), v ktorom

R¹ je -CH₂CH₂-OH

R² je H

R⁴ je metyl,

X je kyslík,

Y je kyslík.

Výhodne, O-substitúcia na C40 sa vykoná podľa nasledovného všeobecného postupu: Rapamycín reaguje s organickým zvyškom pripojeným na odstupujúcu skupinu (napr. RX, kde R je organický zvyšok, napr. alkyl, ktorý sa požaduje ako O-substituent, a X je odstupujúca skupina, napr. CCI₃C(NH)O alebo CF₃SO₃) za vhodných reakčných podmienok, výhodne kyslých alebo neutrálnych podmienok, napr. v prítomnosti kyseliny ako je trifluórmetánsulfónová kyselina, gáforsulfónová kyselina, p-toluénsulfónová kyselina alebo ich zodpovedajúce pyridíniové alebo substituované pyridíniové soli, keď X je CCI₃C(NH)O alebo v prítomnosti zásady ako je pyridin, substituovaný pyridín, diizopropyletylamín alebo pentametylamín, keď X je CF₃SO₃

Nová zlúčenina je zvlášť užitočná na nasledujúce stavy:

a) Liečenie a prevencia odmietnutia transplantovaných orgánov alebo tkanív, napríklad na ošetrenie príjemcov napr. transplantátov srdca, pľúc, spoločne srdca a pľúc, pečene, obličky, pankreasu, kože alebo rohovky. Sú tiež indikované na prevenciu ochorenia štep vs. hostiteľ, takého ako po transplantácii kostnej drene.

b) Liečenie a prevencia autoimúnneho ochorenia a zápalových stavov, najmä zápalových stavov s etiológiou zahŕňajúcou autoimúnnu zložku, ako artritída (napríklad reumatoidná artritída, chronická progresívna artritída a deformujúca artritída) a reumatických chorôb. Špecifické autoimúnne ochorenia, na ktoré sa môžu zlúčeniny podľa vynálezu použiť, zahŕňajú autoimúnne hematologické poruchy (vrátane napríklad hemolytickej anémie, aplastickej anémie, anémie z nedostatku červených krviniek a idiopatickej trombocytopénie), systémový lupus erythematosus, polychondritídu, sklerodermiu, Wegenerovu granulomatózu, dermatomyozitózu, chronickú aktívnu hepatitídu, myasténiu gravis, psoriázu, Steven-Johnsonov syndróm, idiopatickú spruc, autoimúnne zápalové ochorenie čriev (vrátane napr. ulceróznej kolitídy a Crohnovej choroby), endokrinnú oftalmopatiu, gravesovu chorobu, sarkoidózu, roztrúsenú sklerózu, primárnu biliámu cirhózu, juvenilný diabetes (diabetes mellitus typ I), uveitídu (prednú a zadnú), suchú keratokonjunktivitídu a jarnú keratokonjunktivitídu, intersticiálnu fibrózu pľúc, psoriatickú artritídu, glomerulonefritídu, (s alebo bez nefrotického syndrómu), napr. vrátane idiopatického nefrotického syndrómu alebo nefropatie s minimálnymi zmenami) a juvenilnú dermatomyozitózu.

c) Liečenie a prevencia astmy.

d) Liečenie viacliekovej rezistencie (MDR). Nová zlúčenina potláča P-glykoproteíny (Pgp), čo sú molekuly zúčastňujúce sa na membránovom transporte v spojení s MDR. MDR je obzvlášť problémová u chorých na rakovinu a AIDS, ktorí nereagujú na obvyklú chemoterapiu, pretože chemoterapeutické liečivá sú z buniek odčerpané Pgp. Nová zlúčenina je preto užitočná na zvýšenie účinnosti iných chemoterapcutických činidiel pri liečbe a zvládaní stavov viacliekovej rezistencie, takých ako viacliekovo rezistentnej rakoviny alebo viacliekovo rezistentného AIDS.

e) Liečenie proliferačných porúch, napr. nádorov, hyperproliferačných kožných porúch a podobne.

f) Liečenie plesňových infekcií.

g) Liečenie a prevencia zápalov, najmä potenciovaním účinku steroidov.

h) Liečenie a prevencia infekcie, najmä infekcie patogénmi s faktormi Mip alebo s faktormi podobnými Mip.

Predmetom vynálezu je teda tu opísaná nová zlúčenina na použitie ako nový medziprodukt alebo ako farmaceutikum, spôsoby liečenia alebo prevencie uvedených porúch podaním účinného množstva novej zlúčeniny pacientovi, ktorý to potrebuje, použitie novej zlúčeniny pri výrobe liečiva na liečbu alebo prevenciu uvedených porúch a farma ceutické kompozície obsahujúce novú zlúčeninu v kombinácii alebo v spojení s farmaceutický prijateľným riedidlom alebo nosičom.

Tu opísaná nová zlúčenina je vysoko imunosupresívna a je obzvlášť vhodná na indikácie a a b.

Nová zlúčenina sa používa podaním farmaceutický účinnej dávky vo farmaceutický prijateľnej forme subjektu, ktorý potrebuje liečbu Vhodné dávky novej zlúčeniny budú samozrejme rôzne napr. v závislosti od stavu, ktorý sa má liečiť (napríklad od typu choroby alebo povahy rezistencie), od požadovaného účinku a spôsobu aplikácie.

Vo všeobecnosti sa však dosahujú uspokojivé výsledky po orálnom podaní dávok rádovo od 0,05 do 5 alebo až do lOmg/kg/deň, napríklad od 0,1 do 2 alebo do 7,5 mg/kg/deň podaných naraz alebo v rozdelených dávkach 2 až 4x za deň, alebo po parenterálnom podaní, napr. intravenózne, napríklad i.v. infúziou, v dávkach rádovo od 0,01 do 2,5 až do 5 mg/kg/deň, napríklad od 0,05 alebo 0,1 do 1 mg/kg/deň. Vhodné denné dávkovanie pre pacientov je teda rádovo 500 mg p.o., rádovo 5 až 100 mg p.o., alebo rádovo od 0,5 do 125 až 250 mg i.v., napr. rádovo 2,5 až 50 mg i.v..

Alternatívne a dokonca výhodne sa dávkovanie upraví pre chorého špecifickým spôsobom tak, aby boli vopred zaistené stanovené najnižšie účinné hladiny v krvi, napr. tak ako sa určí technikou RIA. Dávkovanie chorému sa teda môže upraviť tak, aby sa dosiahlo rovnomerných priebežných najnižších účinných hladín, zmeraných technikou RIA, rádovo od 50 alebo 150 do 500 alebo 1000 ng/ml, t. j. analogicky s metódami dávkovania bežne používanými pre cyklosporínovú imunosupresívnu liečbu.

Nová zlúčenina sa môže podávať ako jediná účinná zložka alebo spoločne s inými liekmi. Napríklad pri imunosupresívnych aplikáciách ako je prevencia a liečba ochorenia štep vs. hostiteľ, odmietnutie transplantátu alebo autoimúnne ochorenie, sa nová zlúčenina môže použiť v kombinácii s Ciclosporinom, FK-506 alebo ich imunosupresívnymi derivátmi; kortikosteroidmi; azatioprénom, imunosupresívnymi monoklonálnymi protilátkami, napr. monoklonálnymi protilátkami na CD3, CD4, CD25, CD28 alebo CD45; a/alebo inými imunomodulačnými zlúčeninami. Na protizápalové aplikácie sa môže nová zlúčenina používať spoločne s inými protizápalovými činidlami, napr. kortikosteroidmi. Na protiinfekčné použitie sa nová zlúčenina môže použiť v kombinácii s inými protiinfekčnými činidlami, napr. protivírusovými liekmi alebo antibiotikami.

Nová zlúčenina sa podáva ľubovoľnou obvyklou cestou, najmä enterálne, napr. orálne, napríklad vo forme roztokov na vypitie, tabliet alebo kapsúl, alebo parenterálne, napríklad vo forme injekčných roztokov alebo suspenzií. Vhodné formy dávkovacích jednotiek na orálnu aplikáciu obsahujú napr. 1 až 50 mg zlúčeniny podľa vynálezu, obvykle 1 až 10 mg. Farmaceutické kompozície obsahujúce novú zlúčeninu sa môžu pripraviť analogicky ako farmaceutické kompozície obsahujúce rapamycin, napr. ako sa opisuje v EPA 0 041 795, čo by malo byť zrejmé odborníkom v odbore.

Farmakologická účinnosť novej zlúčeniny sa demonštruje napr. v nasledovných testoch:

1. Zmiešaná lymfocytová reakcia (MLR)

Zmiešaná lymfocytová reakcia sa pôvodne vyvinula v súvislosti s aloštepmi, na stanovenie tkanivovej kompatibility medzi potenciálnymi darcami orgánov a ich príjemcami, a je jedným z najlepšie vypracovaných modelov imunitnej reakcie in vitro. Myší model mlR, napr. ako ho opísali v „Immunological Methods“, L. Lefkovits a B. Períš, Eds., Acadamic Press, M.Y. str. 227 až 239 (1979), sa používa na demonštrovanie imunosupresívneho účinku novej zlúčeniny. Bunky sleziny (0,5 x 10⁶) z myší Balb/c (samica 8 až 10 týždňov) sa inkubujú 5 dní spoločne s 0,5 x 10⁶ ožiarenými (2000 rad) alebo mitomycínom C ošetrenými bunkami sleziny myši CBA (samica, 8 až 10 týždňov). Ožiarené alogénne bunky vyvolávajú proliferačnú odpoveď v bunkách sleziny myši Balb/c, ktorá sa môže zmerať inkorporáciou značeného prekurzora do DNA. Pretože stimulátorové bunky sú ožiarené (alebo ošetrené mitomycínom C), nereagujú na bunky myši Balb/c proliferáciou, ale zachovávajú si svoju antigenicitu. Antiproliferačný účinok novej zlúčeniny na bunky myši Balb/c sa meria pri rôznych riedeniach a vypočíta sa koncentrácia, pri ktorej sa dosahuje 50 % inhibícia proliferácie buniek (IC₅₀). Inhibičná schopnosť testovanej vzorky sa môže porovnať s rapamycinom a vyjadriť ako relatívne IC₅₀ (t. j. IC_5C testovanej vzorky/IC₅₀ rapamycinu).

2. Proliferácia sprostredkovaná IL-6

Schopnosť novej zlúčeniny interferovať so signálnymi dráhami spojenými s rastovým faktorom sa stanoví s použitím bunkovej línie myšieho hybridómu závislého od interleukínu-6 (IL-6). Test sa uskutoční na mikrotitračných doštičkách s 96 jamkami. Kultivuje sa 5000 buniek/jamka v prostredí bez séra (ako ho opísali M. H. Schreier a R. Tees v Immunological Methods, I. Lefkovits a B. Pemis, Academic Press 1981, zv. II, str. 263 az 275), doplneného 1 ng rekombinantného IL-6/ml. Po 66 hodinách inkubácie v prítomnosti alebo neprítomnosti testovanej vzorky bunky sú značené s lgCi (3-H)tymidínu/jamka ďalších 6 hodín, odoberú sa a spočítajú kvapalinovým scintilačným počítačom. Inkorporácia (3-H)tymidínu do DNA koreluje so zvýšením počtu buniek a teda mierou proliferácie buniek. Séria riedenia testovanej vzorky umožňuje vypočítať koncentráciu, pri ktorej dochádza ku 50 % inhibícii proliferácie buniek (IC₅o)· Inhibičná kapacita testovanej vzorky sa môže porovnať s rapamycinom a vyjadriť ako relatívne IC₅₀ (t. j. IC₅₀ testovanej vzorky/IC₅₀ rapamycinu).

3. Skúška viazania makrofilínu

Rapamycin a štruktúrne príbuzné imunosupresívum FK-506 sú oba známe, že sa viažu in vivo na makrofilín-12 (známy tiež ako proteín viažuci FK-506 alebo FKBP-12) a predpokladá sa, že toto viazanie súvisí s imunosupresívnou účinnosťou týchto zlúčenín. Nová zlúčenina sa tiež silno viaže na makrofilín-12, ako sa demonštruje v kompetitívnom teste viazania.

Pri tomto teste sa použije FK-506 viazaný na BSA na pokrytie mikrotitračných jamiek. Biotínovaný rekombinantný ľudský makrofilín-12 (biot-MAP) sa nechá viazať v prítomnosti alebo neprítomnosti testovanej vzorky na imobilizovaný FK-506. Po premytí (na odstránenie nešpecifický viazaného makrofilínu) sa viazaný biot-MAP vyhodnotí inkubáciou s konjugátom streptavidínu a alkalickej fosfatázy, nasledované premytím a následným pridaním p-nitrofenylfosfátu ako substrátu. Odpočítaná hodnota je OD pri 405 nm. Väzba testovanej vzorky na biot-MAP má za následok zníženie množstva biot-MAP viazaného na FK-506 a teda zníženie OD405. Séria zriedení testovanej vzorky umožňuje stanoviť koncentráciu poskytujúcu 50 % inhibiciu väzby biot-MAP na imobilizovaný FK-506 (IC_S0). Inhibičná schopnosť testovanej vzorky sa porovná s IC₅₀ voľ ného FK-506 ako štandardu a vyjadri sa ako relatívne 1C_5O. (t. j. IC₅₀ testovanej vzorky/IC₅₀ voľného FK-506).

4. Lokalizovaná reakcia štep versus hostiteľ (GvH)

Účinnosť novej zlúčeniny in vivo je preukázaná na vhodnom zvieracom modeli, ako sa opísalo napr. vo Ford a spol. Transplantation 10 (1970) 258. Bunky sleziny (1 x 10⁷) zo 6 týždňov starých potkaních samíc Wistar/Furth (WF) sa injikujú subkutánne v deň 0 do ľavej zadnej labky potkaních samíc (F344 x WF)F] s hmotnosťou približne 100 g. Zvieratá sú ošetrované 4 dni po sebe a na 7. deň sa im odoberú podkolenné lymfatické uzliny a zvážia. Rozdiel medzi hmotnosťou oboch lymfatických uzlín sa zoberie ako základ na vyhodnotenie reakcie.

5. Reakcia obličkového aloštepu pri potkanovi

Jedna oblička zo samice potkana fishcr 344 sa transplantuje na renálnu cievu potkanieho príjemcu WF po jednostrannej (ľavostrannej) nefrektómii spojením koncom ku koncu. Spojenie močovodu je tiež koncom ku koncu. Liečba začína v deň transplantácie a pokračuje 14 dní. Sedem dni po transplantácii sa urobí kontralaterálna nefrektómia, tak že príjemca transplantovanej obličky zostáva výhradne na funkcii tejto obličky. Prežitie príjemcu štepu sa berie ako parameter funkčnosti štepu.

6. Experimentálne vyvolaná alergická encefalomyelitída (EAE) potkanov

Účinnosť novej zlúčeniny pri EAE sa meria napr. postupom opísaným v Levine and Wenk, Amer. J. Path 47 (1965) 61; McFarlin a spol. J. Immunol. 113 (1974) 712; Bore], Transplant. and Clin. Immunol. 13 (1981) 3. EAE je široko prijímaný model pre roztrúsenú sklerózu. Samcom potkanov Wistar sa podá injekčné do zadných labiek zmes hovädzej miechy a kompletného Freundovho adjuvans. Symptómy choroby (ochrnutie chvosta a oboch zadných nôh) sa obvykle vyvinú počas 16 dní. Zaznamená sa počet zvierat, ktoré ochoreli, ako aj čas začiatku choroby.

7. Artritída vyvolaná Freundovým adjuvans

Účinnosť proti experimentálne vyvolanej artritíde sa demonštruje použitím postupu opísaného napr. vo Winter and Nuss. Arťhtritis and Rheumatism 9 (1966) 394; Billingham and Davies, Handbook of Experimental Pharmacol. (Vane and Ferreira Eds. Springer-Verlag, Berlín) 50/11 (1979) 108 až 144. Potkanom OFA a Wistar (samce alebo samice, 150 g telesnej hmotnosti) sa injikuje podkožné do koreňa chvosta alebo zadnej labky 0,1 ml minerálneho oleja obsahujúceho 0,6 mg lyofilizovaných, teplom usmrtených Mycobacterium smegmatis. Pri vyvíjaní modelu artritídy sa s liečbou začne ihneď po injekcii adjuvans (1. až 18. deň), v už rozvinutom modeli artritídy sa s liečbou začne 14. deň, keď je dobre vyvinutý sekundárny zápal (14. až 20. deň). Na konci pokusu sa odmeria opuch kĺbov pomocou posuvného mikromeradla. ED₅₀ je orálna dávka v mg/kg, ktorá zmenšuje opuch (primárny alebo sekundárny) na polovicu oproti kontrolám.

8. Účinnosť protinádorová a proti MDR

Protinádorová účinnosť novej zlúčeniny a jej schopnosť zvýšiť účinnosť protinádorových prostriedkov zmiernením viacliekovej rezistencie sa demonštruje napr. aplikáciou protinádorového činidla, napr. kolchicinu alebo etoposidu, viacliekovo rezistentným bunkám a bunkám citlivým na lieky in vitro alebo zvieratám, ktoré majú viacliekovo rezistentné nádory alebo infekcie, s alebo bez spoločnej aplikácie novej zlúčeniny, ktorá sa má testovať, a aplikáciou samotnej novej zlúčeniny.

Pri realizácii týchto testov sa používa ľubovoľná vhodná bunková línia a kontrolná (rodičovská) bunková línia, vytvorená napr., ako opísali Ling a spol., J. Celí. Physiol. 83, 103 až 116 (1974) a Bech-Hansen a spol. J. Celí. Physiol. 88, 23 až 32 (1976). Konkrétnymi zvolenými klonmi sú línie CHR (subklon C553.2), rezistentný proti viacerým liekom (napr. rezistentný proti kolchicinu) a rodičovská, senzitívna línia AUX BI (subklon ABI SI 1).

Protinádorová účinnosť a účinnosť proti MDR in vivo sa demonštruje napr. pri myšiach injekčnou aplikáciou rakovinových buniek rezistentných proti viacerým liekom a rakovinových buniek senzitívnych na lieky. Sublínie Ehrlichovho ascitického karcinómu (EA) rezistentného na liečivú látku DR, VC, AM, ET, TE alebo CC sa vyvinú sekvenčným transferom buniek EA na nasledujúce generácie hostiteľských myši BALB/c podľa metód opísaných Slaterom a spol., J. Clin. Invest. 70, 1131 (1982).

Podobne výsledky sa môžu dosiahnuť použitím testovacích modelov novej zlúčeniny porovnateľného typu, napr. in vitro, alebo použitím testovacích zvierat infikovaných vírusovými kmeňmi rezistentnými proti liekom a vírusovými kmeňmi senzitívnymi na lieky, bakteriálnymi kmeňmi rezistentnými na antibiotiká (napr. penicilín) a bakteriálnymi kmeňmi senzitívnymi na antibiotiká, plesňovými kmeňmi antimykoticky rezistentnými a senzitívnymi, ako aj protozoálnymi kmeňmi rezistentnými na lieky, napr. Plasmodiálnymi kmeňmi, napríklad prirodzene sa vyskytujúcimi podkmeňmi Plasmodium falciparum, ktoré majú získanú rezistenciu na chemoterapeutiká, antimalarické lieky.

9. Zosilnenie steroidov

Schopnosť novej zlúčeniny viazať makrofilín ju tiež robí užitočnou pre zosilňovanie účinku kortikosteroidov. Kombinovaná liečba zlúčeninou podľa vynálezu a kortikosteroidom, takým ako dexametazón, má za následok veľmi zvýšenú účinnosť steroidu. Môže sa to demonštrovať testom reportérového génu pomocou chloramfenikol acetyltransferázy vírusu nádoru myšej prsnej žľazy (MMTVCAT), napr. ako je opísaný v Ning at al., J. Biol. Chem. (1993) 268, 6073. Tento synergický účinok umožňuje znížiť dávky kortikosteroidov, čím sa zníži riziko vedľajších účinkov v niektorých prípadoch.

10. Inhibícia faktorov Mip a faktorov podobných Mip

Nová zlúčenina ďalej viaže a blokuje množstvo faktorov Mip (potenciátor infekčnosti makrofágu) a faktorov podobných Mip, ktoré sú štruktúrne podobné s makrofilínom. Faktory Mip a im podobné faktory sú virulentné faktory produkované širokou paletou patogénov, vrátane tých z rodu Chlamidia, napr. Chlamidia trachomatis, Neisseria, napr. Neisseria meningitidis, a Legionella, napr. Legionella pneumophilia, a tiež obligátne parazitickými členmi radu Rickettsiales. Tieto faktory majú rozhodujúcu úlohu pri vývine intracelulámej infekcie. Účinnosť novej zlúčeniny pri znížení infekčnosti patogénov, ktoré produkujú faktory Mip alebo im podobné faktory, sa môže znázorniť porovnaním infekčnosti patogénov v bunkovej kultúre v prítomnosti alebo v neprítomnosti makrolidov, napr. použitím metód opísaných v Lundmose a spol., Mol. Mikrobiol. (1993), 7, 777.

Nová zlúčenina je tiež užitočná v testoch na zisťovanie prítomnosti alebo množstva zlúčenín viažucich makrofilín, napr. v konkurenčných testoch na diagnostické alebo skriningové účely. Predmetom vynálezu je teda tiež použitie novej zlúčeniny ako skriningového nástroja na zistenie prítomnosti zlúčenín viažucich makrofilín v testovanom roztoku, napr. krvi, krvnom sére alebo testovacej živnej pôde, ktoré sa majú skontrolovať. Výhodne sa nová zlúčenina imobilizuje v mikrotitračných jamkách a potom sa nechá naviazať v prítomnosti alebo neprítomnosti testovaného roztoku na značený makrofilín-12 (FKBP-12). Alternatívne sa v mikrotitračných jamkách imobilizuje FKBP-12 a nechá sa viazať v prítomnosti a neprítomnosti testovacieho roztoku na novú zlúčeninu, ktorá sa značila, napríklad fluórom, enzymaticky alebo rádioaktívnym izotopom, napríklad na novú zlúčeninu, ktorá je O-substituovaná na C-40 značiacou skupinou. Doštičky sa premyjú a odmeria sa množstvo viazanej značenej zlúčeniny. Množstvo látky viažucej makrofilín v testovanom roztoku je zhruba nepriamo úmerné množstvu viazanej značenej zlúčeniny. Na kvantitatívnu analýzu sa zostrojí štandardná väzbová krivka s použitím známych koncentrácií zlúčeniny viazanej na makrofilín.

b) 40-O-(2-Hydroxy)etylrapamycín

K miešanému, chladenému (0 °C) roztoku 4,5 g (4,2 mmol) 40-O-(2-(/erc-butyldimetylsilyl)oxy)etylrapamycínu v 20 ml mctanolu sa pridajú 2 ml IN HC1. Tento roztok sa mieša 2 hodiny a zneutralizuje sa vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného. Zmes sa extrahuje tromi dielmi etylacetátu. Organický roztok sa premyje vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného a soľankou, vysuší sa nad bezvodným síranom sodným, prefiltruje sa a zahustí. Po vyčistení stĺpcovou chromatografiou na silikagéli (etylacetát) sa získa zlúčenina uvedená v nadpise ako biela pevná látka:

'H NMR (CDC1₃) ô 0,72 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s),3,13 (5H, s a m), 3,52-3,91 (8H, m);

MS (FAB) m/z 980 ([M+Na]⁺), 926 ([M-OCHjf), 908 ([M-(OCH3+H2O)]⁺), 890 ([M-(OCH3+2H₂O)]⁺), 876 ([M-(2CH3OH+OH)]⁺), 858 ([M-(OCH3+CH₃OH+2H₂O)]⁺). MBA (rel. IC50) 2,2

IL-6 dep. prol. (rel. 1C50) 2,8 MLR (rel. IC50) 3,4

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1.40-O-(2-Hydroxy)etylrapamycín vzorca

Príklady uskutočnenia vynálezu

V nasledujúcich príkladoch sa uvádzajú charakteristické spektroskopické údaje na uľahčenie identifikácie. Piky, ktoré sa významne nelíšia od rapamycínu, nie sú zahrnuté. Biologické údaje sú vyjadrené ako relatívne IC₅₀ v porovnaní s rapamycínom v prípade testov zmiešanej lymfocytovej reakcie (MLR) a proliferácie závislej od IL-6 /IL-6 dep. prol.) a v porovnaní s FK-506 v teste na viazanie makrofilínu (MBA). Vyššie IC₅₀ koreluje s nižšou väzobnou afinitou.

Príklad 1

40-O-(2-Hydroxy)etylrapamycín

a) 40-O-(2-(Zerc-Butyldimetylsilyl)oxy)etylrapamycín

Roztok 9,14 g (10 mmol) rapamycínu a 4,7 ml (40 mmol) 2,6-lutidínu v 30 ml toluénu sa zohreje na 60 °C a pridá sa roztok 6,17 g (20 mmol) 2-(terc-butyldimetylsilyljoxyetyltriflátu a 2,35 ml (20 mmol) 2,6-lutidínu v 20 ml toluénu. Zmes sa mieša 1,5-hodiny. Potom sa v intervale 1,5-hodiny pridajú dve dávky roztoku 3,08 g (10 mmol) triflátu a 1,2 ml (10 mmol) 2,6-lutidínu v 10 ml toluénu. Po pridaní poslednej dávky sa pokračuje 2 hodiny v miešaní pri 60 °C a výsledná hnedá suspenzia sa prefiltruje. Filtrát sa zriedi etylacetátom a premyje sa vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného a soľankou. Organický roztok sa vysuší nad bezvodným síranom sodným, prefiltruje sa a odparí. Zvyšok sa vyčistí stĺpcovou chromatografiou na silikagéli (40 : 60 hexán-etylacetát), čím sa získa 40-O-(2-(/erc-butyldimetylsilyl)oxy)etylrapamycín ako biela pevná látka:

'H NMR (CDClj) ô 0,06 (6H, s), 0,72 (1H dd), 0,90 (9H, s), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s), 3,02 (1H, m), 3,63 (3H, m), 3,72 (3H, m);

MS (FAB) m/z 1094 f[M-Na]), 1022 ([M-(OCH₃+H₂O)] ý.

(I)
2. 40-O-(2-Hydroxy)etylrapamycín na použitie ako liečivo.
3. Farmaceutická kompozícia obsahujúca 40-0-(2-hydroxyjetylrapamycín spolu s farmaceutický prijateľným riedidlom alebo nosičom.
4. Použitie 40-O-(2-hydroxy)etylrapamycínu na prípravu liečiva na liečenie alebo prevenciu odmietnutia aloštepu.
5. Použitie 40-O-(2-hydroxy)etylrapamycínu na prípravu liečiva na liečenie alebo prevenciu ktoréhokoľvek z nasledovných stavov:

(i) autoimúnneho ochorenia, (ii) ochorenia štep verzus hostiteľ, (iii) astmy (iv) viacliekovej rezistencie, (v) tumorov alebo hyperproliferatívnych porúch, alebo (vi) hubových infekcii, (vii) zápalu, (viii) infekcie patogénmi s Mip alebo Mip-podobnými faktormi, alebo (ix) nadbytku makrofllín-viažucich imunosupresív.
6. Použitie 40-O-(2-hydroxy)etylrapamycínu na prípravu liečiva na použitie spolu s imunosupresívnym liečivom.
7. Použitie 40-O-(2-hydroxy)etylrapamycínu na prípravu liečiva na použitie v kombinácii s Ciclosporinom, FK5

-506, kortikosteroidmi alebo imunosupresívnou monoklonálnou protilátkou.
8. Použitie podľa nároku 7, kde imunosupresívna monokionálna protilátka je monoklonálna protilátka na CD3, CD4, CD25, CD28 alebo CD45.
9. Použitie 40-O-(2-hydroxy)etylrapamycínu na prípravu liečiva na použitie v kombinácii s imunomodulačnou zlúčeninou.
10. Použitie 40-0-(2-hydroxyjetylrapamycínu na prípravu liečiva na použitie spoločne s proti 1 zápalovým činidlom alebo protiinfekčným činidlom.