ES2225919T3 - Derivados de rapamicina y su uso, en particular como inmunosupresores. - Google Patents

Abstract

SE HA HALLADO QUE LOS NUEVOS DERIVADOS DE LA RAPAMICINA DE FORMULA I POSEEN UTILIDAD FARMACEUTICA, PARTICULARMENTE COMO INMUNOSUPRESORES.

Description

Derivados de rapamicina y su uso, en particular como inmunosupresores.

Esta invención comprende nuevos derivados alquilados de rapamicina que tienen utilidad farmacéutica, especialmente como inmunosupresores.

La rapamicina es un antibiótico macrólido conocido producido por Streptomyces hygroscopicus, que tiene la estructura representada en la Fórmula A:

1

Véase, por ejemplo, McAlpine, J.B., y otros, J. Antibiotics (1991) 44: 688; Schreiber, S.L. y otros, J. Am. Chem. Soc. (1991) 113: 7433; Patente US No. 3.929.992. La rapamicina es un inmunosupresor extremadamente potente y también se ha demostrado que tiene actividad antitumoral y antifúngica. Su utilidad como un producto farmacéutico, sin embargo, está restringida por su biodisponibilidad muy baja y variable así como por su alta toxicidad. Por otra parte, la rapamicina es altamente insoluble, haciendo difícil la formulación de composiciones galénicas estables.

Se ha descubierto ahora de manera sorprendente que ciertos nuevos derivados de rapamicina (los Nuevos Compuestos) presentan un perfil farmacológico mejorado con respecto a la rapamicina, exhiben una mayor estabilidad y biodisponibilidad y permiten una mayor facilidad a la hora de producir formulaciones galénicas. Los Nuevos Compuestos son derivados alquilados de rapamicina que tienen la estructura de Fórmula I:

2

en donde

X es (H,H) u O;

Y es (H, OH) u O;

R^{1} y R^{2} se eligen independientemente entre H, alquilo, tioalquilo, arilaquilo, hidroxialquilo, dihidroxialquilo, hidroxialquilarilalquilo, dihidroxialquilarilalquilo, alcoxialquilo, aciloxialquilo, aminoalquilo, alquilaminoalquilo, alcoxicarbonilaminoalquilo, acilaminoalquilo, arilsulfonamidoalquilo, alilo, dihidroxialquilalilo, dioxolanilalilo, carbalcoxialquilo y (R^{3})_{3}Si en donde cada R^{3} se elige independientemente entre H, metilo, etilo, isopropilo, t-butilo y fenilo; en donde "alq-" o "alquilo" se refiere a alquilo C_{1-6}, ramificado o lineal, preferentemente alquilo C_{1-3}, en donde la cadena carbonada puede estar interrumpida opcionalmente por un enlace éter (-O-); y

R^{4} es metilo, o bien R^{4} y R^{1} forman juntos un grupo alquileno C_{2-6};

siempre que R^{1} y R^{2} no sean ambos H; y

siempre que cuando R^{1} sea (R^{3})_{3}Si o carbalcoxialquilo, X e Y no son ambos O.

Los Nuevos Compuestos preferidos incluyen los siguientes:

1. 40-O-bencil-rapamicina

2. 40-O-(4'-hidroximetil)bencil-rapamicina

3. 40-O-[4'-(1,2-dihidroxietil)]bencil-rapamicina

4. 40-O-alil-rapamicina

5. 40-O-[3'-(2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4(S)-il)-prop-2'-en-1'-il]-rapamicina

6. (2'E,4'S)-40-O-(4',5'-dihdiroxipent-2'-en-1'-il)-rapamicina

7. 40-O-(2-hidroxi)etoxicarbonilmetil-rapamicina

8. 40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina

9. 40-O-(3-hidroxi)propil-rapamicina

10. 40-O-(6-hidroxi)hexil-rapamicina

11. 40-O-[2-(2-hidroxi)etoxi]etil-rapamicina

12. 40-O-[(3S)-2,2-dimetildioxolan-3-il]metil-rapamicina

13. 40-O-[(2S)-2,3-dihidroxiprop-1-il]-rapamicina

14. 40-O-(2-acetoxi)etil-rapamicina

15. 40-O-(2-nicotinoiloxi)etil-rapamicina

16. 40-O-[2-(N-morfolino)acetoxi]etil-rapamicina

17. 40-O-(2-N-imidazolilacetoxi)etil-rapamicina

18. 40-O-[2-(N-metil-N'-piperazinil)acetoxi]etil-rapamicina

19. 39-O-desmetil-39,40-O,O-etilen-rapamicina

20. (26R)-26-dihidro-40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina

21. 28-O-metil-rapamicina

22. 40-O-(2-aminoetil)-rapamicina

23. 40-O-(2-acetaminoetil)-rapamicina

24. 40-O-(2-nicotinamidoetil)-rapamicina

25. 40-O-(2-(N-metil-imdazo-2'0-ilcarboxamido)etil)-rapamicina

26. 40-O-(2-etoxicarbonilaminoetil)-rapamicina

27. 40-O-(2-tolilsulfoniamidoetil)-rapamicina

28. 40-O-[2-(4',5'-dicarboetoxi-1',2',3'-triazol-1'-il)-etil]-rapamicina.

Los Nuevos Compuestos para uso inmunosupresivo son preferentemente las rapamicinas 40-O-sustituidas en donde X e Y son ambos O, R^{2} es H, R^{4} es metilo y R^{1} es distinto de H; con suma preferencia, en donde R^{1} se elige entre hidroxialquilo, hidroxialcoxialquilo, acilaminoalquilo y aminoalquilo, en especial 40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina, 40-O-(3-hidroxi)propil-rapamicina, 40-O-[2-(2-hidroxi)etoxi]etil-rapamicina y 40-O-(2-acetamidnoetil)-rapamicina.

Con preferencia, la O-sustitución en C40 o la O,O-disustitución en C28 y C40 se efectúa de acuerdo con el siguiente procedimiento general: se hace reaccionar rapamicina (o dihidro- o deoxo-rapamicina) con un radical orgánico enlazado a un grupo saliente (por ejemplo, RX en donde R es el radical orgánico, por ejemplo, una mitad alquilo, alilo o bencilo, que se desea como el O-sustituyente, y X es el grupo saliente, por ejemplo, CCl_{3}C(NH)O o CF_{3}SO_{3}) bajo condiciones de reacción adecuadas, preferentemente bajo condiciones ácidas o neutras, por ejemplo, en presencia de un ácido tal como ácido trifluormetanosulfónico, ácido canforsulfónico, ácido p-toluenosulfónico o sus respectivas sales de piridinio o piridinio sustituido cuando X es CCl_{3}C(NH)O o en presencia de una base tal como piridina, una piridina sustituida, diisopropiletilamina o pentametilpiperidina cuando X es CF_{3}SO_{3}. Las O-sustituciones en C28 únicamente, se llevan a cabo de la misma manera, pero con la protección previa en C40. Son posibles otras modificaciones. Por ejemplo, cuando el sustituyente es alilo, el doble enlace monosustituido, aislado, de la mitad alilo es altamente propenso a una modificación adicional.

Los compuestos de 9-deoxo-rapamicina se obtienen preferentemente por reducción de una rapamicina empleando sulfuro de hidrógeno, por reacción de rapamicina con diselenuro de difenilo y tributilfosfina o por otra reacción de reducción adecuada.

Las 26-dihidro-rapamicina se obtienen preferentemente por reducción de rapamicinas o 9-deoxo-rapamicinas desde ceto a hidroxi en C26 mediante una reacción de reducción suave, tal como una reacción de reducción con borohidruro.

Los Nuevos Compuestos son particularmente útiles para los siguientes estados:

a) El tratamiento y la prevención del rechazo de trasplantes de órganos o tejidos, por ejemplo para el tratamiento de receptores de trasplantes, por ejemplo, de corazón, pulmón, corazón-pulmón combinados, hígado, riñón, pancreáticos, de piel o corneales. Los Nuevos Compuestos también están indicados para el tratamiento y la prevención de la enfermedad del injerto -versus- hospedante, tal como después del trasplante de médula ósea.

b) El tratamiento y la prevención de una enfermedad autoinmune y de estados inflamatorios, en particular estados inflamatorios con una etiología que incluye una componente autoinmune tal como artritis (por ejemplo, artritis reumatoide, artritis crónica progrediente y artritis deformante) y enfermedades reumáticas. Enfermedades autoinmunes específicas para las que pueden emplearse los compuestos de la invención incluyen trastornos hematológicos autoinmunes (incluyendo, por ejemplo, anemia hemolítica, anemia aplástica, anemia de glóbulos rojos pura y trombocitopenia idiopática), lupus eritematoso sistémico, policondritis, esclerodoma, granulomatosis de Wegener, dermatomiositis, hepatitis activa crónica, miastenia grave, psoriasis, síndrome de Steven-Johnson, esprúe idiopático, enfermedad inflamatoria autoinmune del intestino (incluyendo, por ejemplo, colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn), oftalmopatía endocrina, enfermedad de Graves, sarcoidosis, esclerosis múltiple, cirrosis biliar primaria, diabetes juvenil (diabetes mellitus tipo I), uveitis (anterior y posterior), queratoconjuntivitis seca y queratoconjuntivitis vernal, fibrosis pulmonar intersticial, artritis psoriática, glomerulonefritis (con y sin síndrome nefrótico, por ejemplo, incluyendo síndrome nefrótico idiopático o nefropatía de cambio mínimo) y dermatomiositis juvenil.

c) El tratamiento y la prevención del asma;

d) El tratamiento de la resistencia a múltiples fármacos (MDR). Los Nuevos Compuestos suprimen glicoproteínas P (Pgp), que son las moléculas de transporte de membrana asociadas con la MDR. La MDR es particularmente problemática en pacientes con cáncer y pacientes con SIDA que no responderán a la quimioterapia convencional debido a que la medicación es bombeada fuera de las células por Pgp. Los Nuevos Compuestos son por lo tanto útiles para mejorar la eficacia de otros agentes quimioterapéuticos en el tratamiento y el control de estados resistentes a múltiples fármacos tales como cáncer resistente a múltiples fármacos o SIDA resistente a múltiples fármacos.

e) El tratamiento de trastornos proliferativos, por ejemplo tumores, trastorno hiperproliferativo de la piel y similares.

f) El tratamiento de infecciones fúngicas.

g) El tratamiento y la prevención de la inflamación, especialmente al potenciar la acción de los esteroides.

h) El tratamiento y la prevención de la infección, especialmente infección por patógenos que tienen factores Mip o similares a Mip.

i) El tratamiento de sobredosis de FK-506, rapamicina, Nuevos Compuestos inmunosupresores y otros inmunosupresores que se unen a macrofilina.

La invención proporciona así los Nuevos Compuestos descritos aquí, para usarse como nuevos compuestos intermedios o como productos farmacéuticos, métodos para tratar o prevenir los trastornos descritos anteriormente administrando una cantidad eficaz de un Nuevo Compuesto a un paciente que necesite del mismo, el uso de un Nuevo Compuesto en la producción de un medicamento para el tratamiento o la prevención de los trastornos descritos anteriormente, y composiciones farmacéuticas que comprenden un Nuevo Compuesto en combinación o asociación con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

La mayoría de los Nuevos Compuestos aquí descritos son altamente inmunosupresores, especialmente aquellos Nuevos Compuestos que están O-sustituidos en C40, y estos Nuevos Compuestos son particularmente útiles en las indicaciones a y b, pero no en la indicación i. Aquellos Nuevos Compuestos que son menos inmunosupresores, especialmente los que están O-sustituidos en C28 únicamente, resultan particularmente útiles en las indicaciones h e i, pero son menos preferidos para las indicaciones a o b.

Los Nuevos Compuestos se utilizan mediante la administración de una dosis farmacéuticamente eficaz en forma farmacéuticamente aceptable a un sujeto que necesite de tratamiento. Las dosificaciones apropiadas de los Nuevos Compuestos variarán por supuesto, por ejemplo, dependiendo del estado que ha de tratarse (por ejemplo, del tipo de enfermedad o la naturaleza de la resistencia), del efecto deseado y del modo de administración.

En general, sin embargo, se obtienen resultados satisfactorios con la administración oral en dosificaciones del orden de 0,05 a 5 o hasta 10 mg/kg/día, por ejemplo del orden de 0,1 a 2 o hasta 7,5 mg/kg/día administrados una vez, o, en dosis divididas, de 2 a 4 veces al día, o con la administración parenteral, por ejemplo intravenosa, por ejemplo mediante goteo o infusión i.v., en dosificaciones del orden de 0,01 a 2,5 hasta 5 mg/kg/día, por ejemplo del orden de 0,05 ó 0,1 hasta 1,0 mg/kg/día. Las dosificaciones diarias adecuadas para los pacientes son así del orden de 500 mg por vía oral, por ejemplo del orden de 5 a 100 mg por vía oral, o del orden de 0,5 a 125 hasta 200 mg i.v., por ejemplo del orden de 2,5 a 50 mg i.v.

Alternativamente e incluso preferiblemente, la dosificación se dispone de una manera específica para el paciente para proporcionar niveles sanguíneos mínimos predeterminados, por ejemplo, según se determina mediante la técnica de RIA. Así, la dosificación del paciente puede ajustarse a fin de alcanzar niveles sanguíneos mínimos regulares en marcha, según se miden por RIA, del orden de 50 ó 150 hasta 500 ó 1000 mg/ml, es decir análogamente a los métodos de dosificación empleados actualmente para terapia inmunosupresora con ciclosporinas.

Los Nuevos Compuestos pueden administrarse como el único ingrediente activo o junto con otros fármacos. Por ejemplo, en aplicaciones inmunosupresoras tales como la prevención y el tratamiento de la enfermedad del injerto -versus- hospedante, el rechazo de trasplantes o una enfermedad autoinmune, los Nuevos Compuestos pueden usarse en combinación con Ciclosporina, FK-506 o sus derivados inmunosupresores; corticosteroides; azatiopreno; anticuerpos monoclonales inmunosupresores, por ejemplo, anticuerpos monoclonales a CD3, CD4, CD25, CD28 o CD45; y/u otros compuestos inmunomoduladores. Para aplicaciones antiinflamatorias, los Nuevos Compuestos también pueden usarse junto con agentes antiinflamatorios, por ejemplo corticosteroides. Para aplicaciones antiinfectivas, los Nuevos Compuestos pueden usarse en combinación con otros agentes antiinfectivos, por ejemplo fármacos antivirales o antibióticos.

Los Nuevos Compuestos se administran mediante cualquier vía convencional, en particular enteralmente, por ejemplo oralmente, por ejemplo en forma de soluciones para beber, comprimidos o cápsulas o parenteralmente, por ejemplo en forma de soluciones o suspensiones inyectables. Las formas de dosificación unitaria adecuadas para la administración oral comprenden, por ejemplo, de 1 a 50 mg de un compuesto de la invención, habitualmente de 1 a 10 mg. Las composiciones farmacéuticas que comprenden los Nuevos Compuestos pueden prepararse análogamente a las composiciones farmacéuticas que comprenden rapamicina, por ejemplo, según se describe en EP A 0 041 795, lo que será evidente para un experto en la materia.

La actividad farmacológica de los Nuevos Compuestos se demuestra, por ejemplo, en las siguientes pruebas:

1. Reacción de linfocitos mixtos (MLR)

La Reacción de Linfocitos Mixtos se desarrolló originalmente en relación con aloinjertos, para determinar la compatibilidad tisular entre donantes y receptores potenciales de órganos, y es uno de los modelos mejor establecidos de reacción inmunitaria in vitro. Una MLR modélica de múridos, por ejemplo, como la descrita por T. Meo en "Immunological Methods", L. Lefkovits y B. Peris, Eds., Academic Press, N.Y. pp. 227-239 (1979), se usa para demostrar el efecto inmunosupresor de los Nuevos Compuestos. Se co-incuban células de bazo (0,5 x 10^{6}) de ratones Balb/c (hembra, 8-10 semanas) durante 5 días con 0,5 x 10^{6} células de bazo irradiadas (2000 rads) o tratadas con mitomicina C de ratones CBA (hembra, 8-10 semanas). Las células alogeneicas irradiadas inducen una respuesta proliferativa en las células de bazo Balb/c que puede medirse mediante la incorporación de un precursor marcado en el DNA. Puesto que las células estimuladoras se irradian (o se tratan con mitomicina C) no responden a las células Balb/c con proliferación sino que retienen su antigenicidad. El efecto antiproliferativo de los Nuevos Compuestos sobre las células Balb/c se mide a diversas diluciones y se calcula la concentración que da como resultado una inhibición de 50% de la proliferación celular (IC_{50}). La capacidad inhibidora de la muestra de ensayo se puede comparar con rapamicina y expresarse como una IC_{50} relativa (es decir, IC_{50} de la muestra de ensayo/IC_{50} de rapamicina).

2. Proliferación mediada por IL-6

La capacidad de los Nuevos Compuestos para interferir con rutas de señalización asociadas con factores de crecimiento se determina usando una línea celular de hibridoma de ratón dependiente de interleuquina 6 (IL-6). El ensayo se realiza en placas de microvaloración de 96 pocillos. Se cultivan 5000 células/pocillo en medio libre de suero (según se describe por M.H. Schreier y R. Tees en Immunological Methods, I. Lefkovits y B. Pernis, eds., Academic Press 1981, Vol. II, pp. 263-275), complementado con 1 ng de IL-6 recombinante/ml. Después de una incubación de 66 horas en ausencia o presencia de una muestra de prueba, las células se someten a impulsos con 1 \muCi de (3-H)-timidina/pocillo durante otras 6 horas, se recogen y se cuentan mediante centelleo de líquidos. La incorporación de (3-H)-timidina en el DNA se correlaciona con el incremento en el número de células y es así una medida de la proliferación celular. Una serie de dilución de la muestra de prueba permite el cálculo de la concentración que da como resultado 50% de inhibición de la proliferación celular (IC_{50}). La capacidad inhibidora de la muestra de ensayo se puede comparar con rapamicina y expresarse como una IC_{50} relativa (es decir, IC_{50} de la muestra de ensayo/IC_{50} de rapamicina).

3. Ensayo de unión a macrofilina

Se sabe que tanto la rapamicina como el imunosupresor estructuralmente relacionado FK-506 se unen in vivo a macrofilina-12 (también conocida como proteína que se une a FK-506, o FKPB-12) y se cree que esta unión esta relacionada con la actividad inmunosupresora de estos compuestos. Los Nuevos Compuestos también se unen fuertemente a macrofilina-12, como se demuestra en un ensayo de unión competitiva.

En este ensayo, se usa FK-506 acoplado a BSA para revestir pocillos de microvaloración. Se deja que macrofilina-12 humana recombinante biotinilada (biot-MAP) se una en presencia o ausencia de una muestra de prueba al FK-506 inmovilizado. Después de lavar (para retirar macrofilina unida no específicamente), se determina la biot-MAP unida mediante incubación con un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina, seguido por lavado y adición posterior de fosfato de p-nitrofenilo como un sustrato. La lectura es la DO a 405 nm. La unión de una muestra de prueba a biot-MAP da como resultado una disminución en la cantidad de biot-MAP unida al FK-506 y así una disminución en la DO405. Una serie de dilución de la muestra de prueba permite la determinación de la concentración que da como resultado 50% de inhibición de la unión de biot-MAP al FK-506 inmovilizado (IC_{50}). La capacidad inhibidora de una muestra de ensayo se compara con la IC_{50} de FK-506 libre como referencia y se expresa como una IC_{50} relativa (es decir, IC_{50} de la muestra de ensayo/IC_{50} de FK-506 libre).

4. Reacción de Injerto -versus- Hospedante (GvH) Localizada

La eficacia in vivo de los Nuevos Compuestos se demuestra en un modelo animal adecuado, según se describe, por ejemplo, en Ford y otros, TRANSPLANTATION 10 (1970) 258. Se inyectan subcutáneamente células de bazo (1 x 10^{7}) de ratas Wistar/Furth (WF) hembra de 6 semanas de edad el día 0 en la pata posterior izquierda de ratas (F344 x WF)F_{1} hembra que pesaban aproximadamente 100 g. Los animales se tratan durante 4 días consecutivos y los nódulos linfáticos poplíteos se extirpan y se pesan el día 7. La diferencia de peso entre los dos nódulos linfáticos se toma como el parámetro para evaluar la reacción.

5. Reacción de Aloinjerto de Riñón en Rata

Un riñón de una rata Fisher 344 hembra se transplanta en el vaso renal de una rata receptora WF nefrectomizada unilateralmente (costado izquierdo) usando una anastomosis de extremo a extremo. La anastomosis uretérica también es de extremo a extremo. El tratamiento comienza el día del trasplante y se continúa durante 14 días. Una nefrectomía contralateral se realiza siete días después del trasplante, dejando que el receptor cuente con en el comportamiento del riñón donante. La supervivencia del receptor del injerto se toma como el parámetro para un injerto funcional.

6. Encefalomielitis Alérgica Inducida Experimentalmente (EAE) en Ratas

La eficacia de los Nuevos Compuestos en la EAE se mide, por ejemplo, mediante el procedimiento descrito en Levine & Wenk, AMER J PATH 47 (1965) 61; McFarlin y otros, J IMMUNOL 113 (1974) 712; Borel, TRANSPLANT. & CLIN. IMMUNOL 13 (1981) 3. La EAE es un modelo ampliamente aceptado para la esclerosis múltiple. Se inyectan ratas Wistar macho en las patas traseras con una mezcla de médula espinal bovina y adyuvante completo de Freund. Los síntomas de la enfermedad (parálisis de la cola y ambas patas traseras) se desarrollan habitualmente en 16 días. Se registran el número de animales enfermos así como el tiempo de comienzo de la enfermedad.

7. Artritis Provocada por Adyuvante de Freund

La eficacia contra la artritis inducida experimentalmente se muestra usando el procedimiento descrito, por ejemplo, en Winter & Nuss, ARTHRITIS & RHEUMATISM 9 (1966) 394; Billingham & Davies, HANDBOOK OF EXPERIMENTAL PHARMACOL (Vane & Ferreira Eds, Springer-Verlag, Berlín) 50/II (1979) 108-144. Se inyectan i.c. ratas OFA y Wistar (macho o hembra, 150 g de peso corporal) en la base de la cola o en la pata trasera con 0,1 ml de aceite mineral que contiene 0,6 mg de Mycobacterium smegmatis destruidas térmicamente y liofilizadas. En el modelo de artritis en desarrollo, el tratamiento se comienza inmediatamente después de la inyección del adyuvante (días 1-18); en el tratamiento modélico de artritis establecida se comienza el día 14, cuando la inflamación secundaria está bien desarrollada (días 14-20). Al final del experimento, la hinchazón de las articulaciones se mide por medio de un microcalibre. ED_{50} es la dosis oral en mg/kg que reduce la hinchazón (primaria o secundaria) hasta la mitad de la de los controles.

8. Actividad Antitumoral y de MDR

La actividad antitumoral de los Nuevos Compuestos y su capacidad para mejorar el comportamiento de agentes antitumorales aliviando la resistencia a múltiples fármacos se demuestra, por ejemplo, mediante la administración de un agente anticancerígeno, por ejemplo, colchicina o etopósido, a células resistentes a múltiples fármacos y células sensibles a fármacos in vitro o a animales que tienen tumores o infecciones resistentes a múltiples fármacos o sensibles a fármacos, con o sin la coadministración de los Nuevos Compuestos que han de probarse, y mediante la administración del Nuevo Compuesto solo.

Tal prueba in vitro se realiza empleando cualquier línea celular resistente a los fármacos y línea celular de control (parenteral) apropiadas, generadas, por ejemplo, según se describe por Ling y otros, J. Cell. Physiol. 83, 103-116 (1974) y Bech-Hansen y otros, J. Cell Physiol. 88, 23-32 (1976). Clones particulares elegidos son la línea CHR resistente a múltiples fármacos (por ejemplo, resistente a la colchicina) (subclón C5S3.2) y la línea sensible parental AUX B1 (subclón AB1 S11).

La actividad antitumoral y anti-MDR in vivo se muestra, por ejemplo, en ratones inyectados con células cancerígenas resistentes a múltiples fármacos y sensibles a fármacos. Se desarrollan sublíneas de carcinoma de ascitis de Ehrlich (EA) resistentes a una sustancia farmacológica, DR, VC, AM, ET, TE o CC, mediante transferencia secuencial de células de EA a generaciones posteriores de ratones huésped BALB/c de acuerdo con los métodos descritos por Slater y otros, J. Clin. Invest., 70, 1131 (1982).

Pueden obtenerse resultados equivalentes empleando los modelos de prueba de los Nuevos Compuestos de diseño comparable, por ejemplo in vitro, o empleando animales de prueba infectados con cepas virales resistentes a los fármacos y sensibles a los fármacos, cepas bacterianas resistentes y sensibles a antibióticos (por ejemplo, penicilina), cepas fúngicas resistentes y sensibles a los antimicóticos, así como cepas protozoarias resistentes a los fármacos, por ejemplo cepas de plasmodios, por ejemplo subcepas presentes en la naturaleza de Plasmodium falciparum que exhiben resistencia adquirida a fármacos antimaláricos quimioterapéuticos.

9. Unión de FKBP

Algunos de los Nuevos Compuestos no son inmunosupresores, particularmente aquellos que están O-sustituidos en C28 únicamente, tal como 28-O-metil-rapamicina. Esto se puede demostrar en ensayos in vitro estándar en comparación con FK506 y rapamicina. Se sabe que FK506, por ejemplo, es un inhibidor potente de la transcripción de IL-2, como puede demostrarse en un ensayo de genes informadores de IL-2. La rapamicina, aunque no es activa en el ensayo de genes informadores de IL-2, inhibe fuertemente la proliferación de células T dependiente de IL-6. Ambos compuestos son inhibidores muy potentes de la reacción de linfocitos mixtos. Igualmente, no pudo demostrase capacidad inmunosupresora en los modelos in vivo 1-7 anteriores. Sin embargo, incluso aquellos Nuevos Compuestos que no son inmunosupresores, se unen a macrofilina, lo cual confiere ciertas utilidades en donde la ausencia de capacidad inmunosupresora constituye una ventaja.

Aquellos Nuevos Compuestos que se unen fuertemente a macrofilina y que no son por sí mismos inmunosupresores se pueden emplear en el tratamiento de sobredosis de inmunosupresores que se unen a macrofilina, tales como FK506, rapamicina y los Nuevos Compuestos inmunosupresores.

10. Potenciación de esteroides

La actividad de unión a macrofilina de los Nuevos Compuestos también los hace útiles para mejorar o potenciar la acción de corticosteroides. El tratamiento combinado con los compuestos de la invención y un corticosteroide, tal como dexametasona, da como resultado una actividad esteroidea muy mejorada. Esto puede observarse, por ejemplo, en el ensayo del gen informador de virus de tumor mamario de múrido-cloranfenicol acetiltransferasa (MMTV-CAT), por ejemplo, según se describe en Ning y otros, J. Biol. Chem. (1993) 268: 6073. Este efecto sinérgico permite dosis reducidas de corticosteroides, reduciendo de ese modo el riesgo de efectos secundarios en algunos casos.

11. Inhibición de factor Mip y similar a Mip

Adicionalmente, los Nuevos Compuestos se unen a y bloquean una variedad de factores Mip (potenciadores de la infectividad de macrófagos) y similares a Mip, que son estructuralmente similares a la macrofilina. Los factores Mip y similares a Mip son factores de virulencia producidospor una amplia variedad de patógenos, incluyendo aquéllos de los géneros Chlamidia, por ejemplo, Chlamidia trachomatis; Neisseria, por ejemplo, Neisseria meningitidis; y Legionella, por ejemplo, Legionella pneumophilia; y también por los miembros parásitos obligatorios del orden Rickettsia. Estos factores juegan un papel crítico en el establecimiento de la infección intracelular. La eficacia de los Nuevos Compuestos para reducir la infectividad de patógenos que producen factores Mip y similares a Mip puede mostrarse comparando la infectividad de los patógenos en cultivo celular en presencia y ausencia de los macrólidos, por ejemplo, usando los métodos descritos en Lundemose y otros, Mol. Microbiol. (1993) 7: 777. Los compuestos no inmunosupresores de la invención se prefieren para utilizarse en esta indicación dado que los mismos no son inmunosupresores, con lo que de este modo no comprometen a las defensas inmunológicas naturales del cuerpo contra los patógenos.

Los Nuevos Compuestos también son útiles en ensayos para detectar la presencia o la cantidad de compuestos que se unen a macrofilina, por ejemplo, en ensayos competitivos para propósitos de diagnóstico o rastreo. Así, en otra modalidad, la invención proporciona el uso de los Nuevos Compuestos como una herramienta de rastreo para determinar la presencia de compuestos que se unen a macrofilina en una solución de prueba, por ejemplo, sangre, suero sanguíneo, o caldo de prueba que ha de rastrearse. Preferiblemente, un Nuevo Compuesto se inmoviliza en pocillos de microvaloración y a continuación se deja que se una en presencia y ausencia de una solución de prueba a macrofilina-12 (FKBP-12) marcada. Alternativamente, la FKBP-12 se inmoviliza en pocillos de microvaloración y se deja unir en presencia o ausencia de una solución de prueba a un Nuevo Compuesto que se ha marcado, por ejemplo fluoromarcado, marcado enzimáticamente o radiomarcado, por ejemplo un Nuevo Compuesto que ha sido O-sustituido en C40 y/o C28 con un grupo de marcaje. Las placas se lavan y se mide la cantidad de compuesto marcado unido. La cantidad de sustancia que se une a macrofilina en la solución de prueba es aproximadamente inversamente proporcional a la cantidad de compuesto marcado unido. Para el análisis cuantitativo, se elabora una curva de unión estándar usando concentraciones conocidas de compuesto que se une a macrofilina.

Ejemplos

En los siguientes ejemplos, se ofrecen datos espectroscópicos característicos para facilitar la identificación. No se incluyen los picos que no difieren de manera importante respecto de rapamicina. Los datos biológicos se expresan como una IC_{50} relativa, en comparación con rapamicina en el caso de las pruebas o ensayos de reacción de linfocitos mixtos (MLR) y de proliferación dependiente de IL-6 (prol. dep. IL-6), y en comparación con FK-506 en la prueba de unión a macrofilina (MBA). Una IC_{50} más alta está correlacionada con una afinidad de unión más baja.

Ejemplo 1 40-O-bencil-rapamicina

A una solución agitada de 183 mg (0,200 mmol) de rapamicina en 2,1 ml de ciclohexano-cloruro de metileno 2:1 se añaden 75 \mul (0,402 mmol) de bencil-tricloroacetimidato, seguido por 2,6 \mul (29 \mumol, 15 mol%) de ácido trifluormetanosulfónico, tras lo cual la mezcla vira inmediatamente a color amarillo. Después de 3 horas, la mezcla se diluye con acetato de etilo y se enfría rápidamente con bicarbonato sódico acuoso al 10%. Las capas se separan y la capa acuosa se extrae dos veces con acetato de etilo. La solución orgánica combinada se lava con bicarbonato sódico acuoso al 10%, se seca sobre sulfato sódico anhidro, se filtra y se concentra bajo presión reducida. El residuo se purifica por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano-acetato de etilo 50:50) para proporcionar 40-O-bencil-rapamicina como un sólido amorfo blanco: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 0,73 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,73 (3H, s), 3,12 (4H, s y m), 3,33 (3H, s), 3,49 (3H; s), 4,15 (1H, bd), 4,65 (1H, d), 4,71 (1H, d), 7,22-7,38 (5H, m); MS (FAB) m/z 1026 ([M+Na]^{+}), 972 ([M-OCH_{3}]^{+}), 954 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O)]^{+}).

MBA (IC_{50} rel.)	1,8
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	10
MLR (IC_{50} rel.)	110

Ejemplo 2 40-O-(4'-hidroximetil)bencil-rapamicina a) 40-O-[4'-(t-butildimetilsilil)oximetil]bencil-rapamicina

A una solución agitada, enfriada (-78ºC) de 345 \mul (2,0 mmol) de anhídrido tríflico en 5 ml de cloruro de metileno se añade una solución de 504 mg (2,0 mmol) de alcohol 4-(t-butildimetilsilil)oximetil-bencílico y 820 mg (4,0 mmol) de 2,6-di-t-butil-4-metilpiridina en 5 ml de cloruro de metileno. La mezcla resultante se calienta a -20ºC y se continua la agitación a esa temperatura durante 0,5 horas. La mezcla se enfría entonces de nuevo a -78ºC y se añade una solución de 914 mg (1,0 mmol) de rapamicina en 5 ml de cloruro de metileno. Esta mezcla se deja calentar a temperatura ambiente durante la noche y luego se enfría rápidamente con bicarbonato sódico acuoso al 10%. Las capas se separan y la capa acuosa se extrae con acetato de etilo. La solución orgánica combinada se lava con salmuera saturada, se seca sobre sulfato sódico, se filtra bajo presión reducida y se concentra. El residuo se purifica por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano-acetato de etilo 50:50) para proporcionar 40-O-[4'-(t-butildimetilsilil)oximetil]bencil-rapamicina como una espuma blanca: MS (FAB) m/z 1170 ([M+Na]^{+}), 1098 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O)]^{+}).

b) 40-O-(4'-hidroximetil)bencil-rapamicina

A una solución agitada, enfriada (0ºC) de 98 mg (0,093 mmol) del compuesto obtenido en el ejemplo 2 en 2 ml de acetonitrilo se añaden 0,2 ml de HF-piridina. La mezcla resultante se agita durante 2 horas y se enfría rápidamente con bicarbonato sódico acuoso, tras lo cual se extrae con acetato de etilo. La solución orgánica se lava con salmuera, se seca sobre sulfato sódico, se filtra y se concentra. El residuo se purifica por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano-acetato de etilo 20:80) para proporcionar el compuesto del título como una espuma blanca: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 0,73 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s), 3,22 (1H, m), 4,67 (4H, m), 7,35 (4H, m); MS (FAB) m/z 1056

\hbox{([M+Na] ^{+} )}

, 1002 ([M-OCH_{3}]^{+}), 984 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O)]^{+}), 966 ([M-(OCH_{3}+2H_{2}O)]^{+}), 934 ([M-(OCH_{3}+CH_{3}OH+2H_{2}O)]^{+}).

MBA (IC_{50} rel.)	2,7
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	3,9
MLR (IC_{50} rel.)	3

Ejemplo 3 40-O-[4'-(1,2-dihidroxietil)bencil-rapamicina a) 40-O-[4'-(2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-il)bencil-rapamicina

En 10 ml de ciclohexano-cloruro de metileno 1:1 se disuelven 452 mg (1,24 mmol) de 4-(2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-il)bencil-tricloroacetimidato, seguido por 0,14 ml (0,64 mmol) de 2,6-di-t-butilpiridina y 56 \mul (0,64 mmol) de ácido trifluormetanosulfónico. A esta mezcla se añade una solución de 587 mg (0,64 mmol) de rapamicina en 2 ml de cloruro de metileno. La mezcla de reacción se agita durante la noche a temperatura ambiente y se enfría rápidamente con bicarbonato sódico acuoso. Las capas se separan y la capa acuosa se extrae dos veces con acetato de etilo. La solución orgánica combinada se lava con salmuera saturada, se seca sobre sulfato sódico anhidro, se filtra y se concentra. El residuo se purifica por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano-acetato de etilo 50:50) para dar 40-O-[4'-(2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-il)bencil-rapamicina como un sólido amorfo, blanco: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 0,73 (1H, dd), 1,48 (3H, s), 1,55 (3H, s), 1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s), 3,67 (3H, m), 4,28 (1H, dd), 4,62 (1H, d), 4,69 (1H, d), 5,06 (1H, dd), 7,33 (4H, m); MS (FAB) m/z 1126 ([M+Na]^{+}), 1072 ([M-OCH_{3}]^{+}), 1054 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O)]^{+}), 1014 ([M-(OCH_{3}+CH_{3}COCH_{3})]^{+}), 996 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O+CH_{3}COCH_{3})]^{+}), 978 ([M-(OCH_{3}+2H_{2}O+CH_{3}COCH_{3})]^{+}).

b) 40-O-[4'-(1,2-dihidroxietil)]bencil-rapamicina

A una solución de 90,7 mg (0,08 mmol) de 40-O-[4'-(2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-il)]bencil-rapamicina en 4 ml de metanol se añade 1 ml de HCl acuoso 1 N. Después de 2 horas, la mezcla se enfría rápidamente con bicarbonato sódico acuoso y se extrae dos veces con acetato de etilo. La solución orgánica se lava con salmuera, se seca sobre sulfato sódico anhidro y se concentra. El residuo se purifica por cromatografía en columna sobre gel de sílice (acetato de etilo) y el compuesto del título se obtiene como una espuma blanca: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 0,73 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s), 3,70 (4H, m), 4,63 (1H, d), 4,69 (1H, d), 4,80 (1H, dd), 7,33 (4H, m); MS (FAB) m/z 1086

\hbox{([M+Na] ^{+} )}

, 1032 ([M-OCH_{3}]^{+}), 1014 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O)]^{+}), 996 ([M-(OCH_{3}+2H_{2}O)]^{+}).

MBA (IC_{50} rel.)	0,92
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	10,5
MLR (IC_{50} rel.)	22

Ejemplo 4 40-O-alil-rapamicina

A una solución agitada, enfriada (-78ºC) de 0,33 ml (2,01 mmol) de anhídrido tríflico en 10 ml de cloruro de metileno se añade lentamente una solución de 0,14 ml (2,06 mmol) de alcohol alílico y 0,42 g (2,04 mmol) de 2,6-di-t-butil-4-metilpiridina en 5 ml de cloruro de metileno. La solución verdosa resultante se agita durante 1,5 horas y se añade una solución de 915 mg (1,00 mmol) de rapamicina y 0,42 g (2,04 mmol) de 2,6-di-t-butil-4-metilpiridina en 5 ml de cloruro de metileno. Se continua la agitación durante 0,5 horas a -78ºC y luego la mezcla se calienta a temperatura ambiente. Después de 1 hora más, la mezcla se enfría rápidamente con bicarbonato sódico acuoso y se separan las capas. La capa acuosa se extrae dos veces con acetato de etilo. La solución orgánica combinada se lava con bicarbonato sódico acuoso y salmuera, se seca sobre sulfato sódico anhidro, se filtra y se concentra. El aceite verde resultante se purifica por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano-acetato de etilo 60:40) para proporcionar el compuesto del título como un sólido amorfo, incoloro: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 0,72 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s), 3,05 (1H, m), 4,13 (2H, bd), 5,14 (2H, m), 5,27 (2H, m), 5,92 (2H, m); MS (FAB) m/z 976 ([M+Na]^{+}), 922 ([M-OCH_{3}]^{+}), 904 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O)]^{+}), 886 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O)]^{+}), 872 ([M-(2CH_{3}OH+OH)]^{+}), 854 ([M-(OCH_{3}+CH_{3}H+2H_{2}O)]^{+}).

MBA (IC_{50} rel.)	1
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	8
MLR (IC_{50} rel.)	260

Ejemplo 5 40-O-[3'-(2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4(S)-il)-prop-2'-en-1'-il]-rapamicina

A una solución agitada, enfriada (-78ºC) de 0,64 g (4,00 mmol) de E-(4S)-4,5-O,O-isopropiliden-pent-2-en-1,4,5-triol y 1,26 g (6,00 mmol) de 2,6-di-t-butil-4-metilpiridina en 20 ml de cloruro de metileno se añaden 0,82 ml (5,00 mmol) de anhídrido tríflico. La mezcla resultante se agita a esta temperatura durante 2 horas y se añade una solución de 1,82 g (2,00 mmol) de rapamicina y 1,26 g (6,00 mmol) de 2,6-di-t-butil-4-metilpiridina en 5 ml de cloruro de metileno. La mezcla se deja calentar gradualmente a temperatura ambiente durante la noche y luego se enfría rápidamente con bicarbonato sódico acuoso. Las capas se separan y la capa acuosa se extrae tres veces con acetato de etilo. La solución orgánica se lava con bicarbonato sódico acuoso y salmuera, se seca sobre sulfato sódico anhidro, se filtra y se concentra. El residuo se purifica por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano-acetato de etilo 40:60) para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 0,72 (1H, dd), 1,38 (3H, s), 1,42 (3H, s), 1,65 (3H, s), 1,73 (3H, s), 3,06 (1H, m), 3,58 (2H, m), 4,08 (1H, dd), 4,13 (2H, m), 4,52 (1H, bdd), 5,72 (1H, m), 5,88 (1H, m); MS (FAB) m/z 1076 ([M+Na]^{+}), 1022 ([M-OCH_{3}]^{+}), 1004 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O)]^{+}), 964 ([M-(OCH_{3}+CH_{3}COCH_{3})]^{+}), 946 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O+CH_{3}COCH_{3})]^{+}), 946 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O+CH_{3}COCH_{3})]^{+}).

MBA (IC_{50} rel.)	0,64
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	11
MLR (IC_{50} rel.)	8

Ejemplo 6 (2'-E,4'S)-40-O-(4',5'-dihidroxipent-2'-en-1'-il)-rapamicina

Las condiciones descritas en el ejemplo 3, etapa b) aplicadas a los compuestos obtenidos en el ejemplo anterior, seguido por purificación a través de cromatografía en columna sobre gel de sílice (acetato de etilo-metanol 95:5) proporcionan el compuesto del título como una espuma blanca: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 0,68 (1H, dd), 3,04 (1H, m), 4,18 (5H, m), 5,75 (1H, dd), 5,88 (1H, m); MS (FAB) m/z 1036 ([M+Na]^{+}), 1013 (M^{+}), 995 ([M-H_{2}O]^{+}), 982 ([M-OCH_{3}]^{+}), 964 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O)]^{+}), 946 ([M-(OCH_{3}+2H_{2}O)]^{+}), 832 ([M-(2CH_{3}OH+OH)]^{+}), 914 ([M-(OCH_{3}+CH_{3}OH+H_{2}O)]^{+}).

MBA (IC_{50} rel.)	1,7
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	12
MLR (IC_{50} rel.)	3,5

Ejemplo 7 40-O-(2-hidroxi)etoxicarbonilmetil-rapamicina a) 40-O-[2-(t-butildimetilsilil)oxi]etoxicarbonilmetil-rapamicina

A una solución agitada de 2,74 g (3,00 mmol) de rapamicina y 30 mg (0,06 mmol) de tetraacetato de dirrodio dihidratado en 30 ml de cloruro de metileno se añade una solución de 0,38 ml (3,60 mmol) de 2-(t-butildimetilsilil)oxietil-diazoacetato en 10 ml de cloruro de metileno durante 5 horas. Finalizada la adición, se continúa la agitación durante 1 hora más y luego se enfría la mezcla de reacción rápidamente con HCl acuoso 1 N. Las capas se separan y la capa acuosa se extrae con acetato de etilo. La solución orgánica combinada se lava con bicarbonato sódico acuoso y salmuera, se seca sobre sulfato sódico anhidro, se filtra y se concentra. El residuo se purifica por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano-acetato de etilo 40:60) para proporcionar 40-O-[2-(t-butildimetilsilil)oxi]etoxicarbonilmetil-rapamicina: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 0,06 (6H, s), 0,68 (1H, dd), 0,88 (9H, s), 1,64 (3H, s), 1,73 (3H, s), 3,12 (5H, s y m), 3,81 (2H, dd), 4,19 (2H, dd), 4,32 (2H, s); MS (FAB) m/z 1152 ([M+Na]^{+}), 1080 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O)]^{+}).

b) 40-O-(2-hidroxi)etoxicarbonilmetil-rapamicina

A una solución agitada, enfriada (0ºC) de 81 mg (0,07 mmol) de 40-O-[2-(t-butildimetilsilil)oxi]etoxicarbonilmetil-rapamicina en 1,5 ml de acetonitrilo se añaden 0,15 ml de HF-piridina. Después de 2 horas, la reacción se enfría rápidamente con bicarbonato sódico acuoso. La mezcla se extrae con acetato de etilo. La solución orgánica se lava con salmuera, se seca sobre sulfato sódico anhidro, se filtra y se concentra. El residuo se purifica por PTLC (acetato de etilo) para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 0,70 (1H, dd), 1,654 (3H, s), 1,75 (3H, s), 3,13 (5H, s y m), 3,85 (3H, m), 4,25 (5H, m); MS (FAB) m/z 1038 ([M+Na]^{+}), 984

\hbox{([M-OCH _{3} ] ^{+} ),}

966 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O)]^{+}), 948 ([M-(OCH_{3}+2H_{2}O)]^{+}).

MBA (IC_{50} rel.)	4
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	9,7
MLR (IC_{50} rel.)	2,1

Ejemplo 8 40-O-(2-hidroxi-etil-rapamicina a) 40-O-[2-(t-butildimetilsilil)oxi]etil-rapamicina

Una solución de 9,14 g (10 mmol) de rapamicina y 4,70 ml (40 mmol) de 2,6-lutidina en 30 ml de tolueno se calienta a 60ºC y se añade una solución de 6,17 g (20 mmol) de 2-(t-butildimetilsilil)oxietil-triflato y 2,35 ml (20 mmol) de 2,6-lutidina en 20 ml de tolueno. Esta mezcla se agita durante 1,5 horas. Se añaden entonces, en un intervalo de 1,5 horas, dos lotes de una solución de 3,08 g (10 mmol) de triflato y 1,2 ml (10 mmol) de 2,6-lutidina en 10 ml de tolueno. Después de la adición del último lote, se continúa la agitación a 60ºC durante 2 horas y la suspensión de color marrón resultante se filtra. El filtrado se diluye con acetato de etilo y se lava con bicarbonato sódico acuoso y salmuera. La solución orgánica se seca sobre sulfato sódico anhidro, se filtra y se concentra. El residuo se purifica por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano-acetato de etilo 40:60) para proporcionar 40-O-[2-(t-butildimetilsilil)oxi]etil-rapamicina como un sólido blanco: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 0,06 (6H, s), 0,72 (1H, dd), 0,90 (9H, s), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s), 3,02 (1H, m), 3,63 (3H, m), 3,72 (3H, m); MS (FAB) m/z 1094 ([M+Na]^{+}), 1022 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O)]^{+}).

b) 40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina

A una solución agitada, enfriada (0ºC) de 4,5 g (4,2 mmol) de 40-O-[2-(t-butildimetilsilil)oxi]etil-rapamicina en 20 ml de metanol se añaden 2 ml de HCl 1 N. Esta solución se agita durante 2 horas y se neutraliza con bicarbonato sódico acuoso. La mezcla se extrae con tres porciones de acetato de etilo. La solución orgánica se lava con bicarbonato sódico acuoso y salmuera, se seca sobre sulfato sódico anhidro, se filtra y se concentra. La purificación por cromatografía en columna sobre gel de sílice (acetato de etilo) proporciona el compuesto del título como un sólido blanco: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 0,72 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s), 3,13 (5H, s y m), 3,52-3,91 (8H, m); MS (FAB) m/z 980

\hbox{([M+Na] ^{+} ),}

926 ([M-OCH_{3}]^{+}), 908 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O)]^{+}), 890 ([M-(OCH_{3}+2H_{2}O)]^{+}), 876 ([M-(2CH_{3}OH+OH)]^{+}), 858 ([M-(OCH_{3}+CH_{3}OH+2H_{2}O)]^{+}).

MBA (IC_{50} rel.)	2,2
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	2,8
MLR (IC_{50} rel.)	3,4

Ejemplo 9 40-O-(3-hidroxi)propil-rapamicina a) 40-O-[3-(t-butildimetilsilil)oxi]propil-rapamicina

El mismo procedimiento que el descrito en el ejemplo 8, etapa a) empleando 3-(t-butildimetilsilil)oxiprop-1-il-triflato proporciona 40-O-[3-(t-butildimetilsilil)oxi]propil-rapamicina: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 0,05 (6H, s), 0,72 (1H, dd), 0,90 (9H, s), 1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s), 1,77 (2H, m), 3,03 (1H, m), 3,52-3,73 (7H, m); MS (FAB) m/z 1108 ([M+Na]^{+}), 1036 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O)]^{+}).

b) 40-O-(3-hidroxi)propil-rapamicina

El tratamiento del compuesto obtenido en la etapa a) en las condiciones descritas en el ejemplo 8, etapa b) proporciona el compuesto del título: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 0,72 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s), 1,80 (2H, m), 3,05 (1H, m), 3,55-3,91 (8H, m); MS (FAB) m/z 994 ([M+Na]^{+}), 940 ([M-OCH_{3}]^{+}), 922 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O)]^{+}), 904 ([M-(OCH_{3}+2H_{2}O)]^{+}), 872 ([M-(OCH_{3}+CH_{3}OH+2H_{2}O)]^{+}).

MBA (IC_{50} rel.)	1,6
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	2,7
MLR (IC_{50} rel.)	11

Ejemplo 10 40-O-(6-hidroxi)hexil-rapamicina a) 40-O-[6-(t-butildimetilsilil)oxi]hexil-rapamicina

El mismo procedimiento que el descrito en el ejemplo 8, etapa a) empleando 6-(t-butildimetilsilil)oxihex-1-il-triflato proporciona 40-O-[6-(t-butildimetilsilil)oxi]hexil-rapamicina: MS (FAB) m/z 1150 ([M+Na]^{+}).

b) 40-O-(6-hidroxi)hexil-rapamicina

El tratamiento del compuesto obtenido en la etapa a) en las condiciones descritas en el ejemplo 8, etapa b) proporciona el compuesto del título: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 0,72 (1H, dd), 1,38 (2H, m); 1,57 (4H, m), 1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s), 3,02 (1H, m), 3,49-3,72 (8H, m); MS (FAB) m/z 1036 ([M+Na]^{+}), 982 ([M-OCH_{3}]^{+}), 964 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O)]^{+}), 946 ([M-(OCH_{3}+2H_{2}O)]^{+}), 914 ([M-(OCH_{3}+CH_{3}OH+2H_{2}O)]^{+}).

MBA (IC_{50} rel.)	0,8
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	8,5
MLR (IC_{50} rel.)	18

Ejemplo 11 40-O-[2-(2-hidroxi)etoxi]etil-rapamicina a) 40-O-[2-(t-butildimetilsilil)oxietoxi]etil-rapamicina

El mismo procedimiento que el descrito en el ejemplo 8, etapa a) empleando 2-[2-(t-butildimetilsilil)oxietoxi]etil-triflato proporciona 40-O-[2-(t-butildimetilsilil)oxietoxi]etil-rapamicina: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 0,06 (6H, s), 0,71 (1H, dd), 0,88 (9H, s), 1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s), 3,07 (1H, m), 3,51-3,79 (11H, m); MS (FAB) m/z 1138

\hbox{([M+Na] ^{+} ),}

1115 (M^{+}), 1097 ([M-H_{2}O)]^{+}), 1084 ([M-OCH_{3}]^{+}), 1066 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O)]^{+}), 1048 ([M-(OCH_{3}+2H_{2}O)]^{+}), 1034 ([M-(2CH_{3}OH+OH)]^{+}), 1016 ([M-(OCH_{3}+CH_{3}OH+2H_{2}O)]^{+}). b) 40-O-[2-(2-hidroxi)etoxi]etil-rapamicina

El tratamiento del compuesto obtenido en la etapa a) en las condiciones descritas en el ejemplo 8, etapa b) proporciona el compuesto del título: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 0,72 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s), 3,05 (1H, m); 3,51-3,77 (11H, m); MS (FAB) m/z 1024 ([M+Na]^{+}), 1001 (M^{+}), 983 ([M-H_{2}O)]^{+}), 970 ([M-OCH_{3}]^{+}), 952 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O)]^{+}), 934 ([M-(OCH_{3}+2H_{2}O)]^{+}), 920 ([M-(2CH_{3}OH+OH)]^{+}), 902 ([M-(OCH_{3}+CH_{3}OH+2H_{2}O)]^{+}).

MBA (IC_{50} rel.)	1,2
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	3,2
MLR (IC_{50} rel.)	2

Ejemplo 12 40-O-[(3S)-2,2-dimetildioxolan-3-il]metil-rapamicina

El mismo procedimiento que el descrito en el ejemplo 8, etapa a) empleando el triflato de glicerol acetonido proporciona el compuesto del título: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 0,72 (1H, dd), 1,36 (3H, s), 1,42 (3H, s), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s), 3,06 (1H, m), 3,55 (2H, m), 3,69 (3H, m), 4,06 (1H, dd), 4,26 (1H, m); MS (FAB) m/z 1050 ([M+Na]^{+}), 996 ([M-OCH_{3}]^{+}), 978 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O)]^{+}), 960 ([M-(OCH_{3}+2H_{2}O)]^{+}).

MBA (IC_{50} rel.)	0,9
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	8
MLR (IC_{50} rel.)	290

Ejemplo 13 40-O-[(2S)-2,3-dihidroxiprop-1-il]-rapamicina

El tratamiento del compuesto obtenido en el ejemplo anterior en las condiciones descritas en el ejemplo 3 proporciona el compuesto del título: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 0,72 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H; s), 3,07 (1H, m), 3,68 (8H, m); MS (FAB) m/z 1010 ([M+Na]^{+}), 956 ([M-OCH_{3}]^{+}), 938 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O)]^{+}), 920 ([M-(OCH_{3}+2H_{2}O)]^{+}), 888 ([M-(OCH_{3}+CH_{3}OH+2H_{2}O)]^{+}).

MBA (IC_{50} rel.)	0,67
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	9
MLR (IC_{50} rel.)	10

Ejemplo 14 40-O-(2-acetoxi)etil-rapamicina

A una solución agitada, enfriada (0ºC) de 53 mg (0,055 mmol) de 40-O-hidroxietil-rapamicina en 2 ml de cloruro de metileno se añaden 0,2 ml de piridina seguido por 0,02 ml (0,281 mmol) de cloruro de acetilo. La mezcla se agita durante 3 horas y se diluye con acetato de etilo y luego se lava con bicarbonato sódico acuoso, con HCl 1 N frío y de nuevo con bicarbonato sódico acuoso. La solución orgánica se seca sobre sulfato sódico anhidro, se filtra y se concentra. El residuo se purifica por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano-acetato de etilo 30:70) para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 0,72 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s), 2,08 (3H, s), 3,07 (1H, m), 3,78 (2H, dd), 4,20 (2H, dd); MS (FAB) m/z 1022 ([M+Na]^{+}), 999 (M^{+}), 982 ([M-OH)]^{+}), 968 ([M-OCH_{3}]^{+}), 950 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O)]^{+}), 932 ([M-(OCH_{3}+2H_{2}O)]^{+}), 918 ([M-(2CH_{3}OH+OH)]^{+}), 900 ([M-(OCH_{3}+CH_{3}OH+2H_{2}O)]^{+}).

MBA (IC_{50} rel.)	2
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	7,6
MLR (IC_{50} rel.)	3,6

Ejemplo 15 40-O-(2-nicotinoiloxi)etil-rapamicina

El mismo procedimiento que el descrito en el ejemplo anterior empleando hidrocloruro de cloruro de nicotinoilo proporciona el compuesto del título: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 0,72 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H; s), 3,07 (1H, m); 3,94 (2H, dd), 4,49 (2H, t), 7,39 (1H; dd), 8,31 (1H, ddd), 8,78 (1H, ddd), 9,24 (1H, dd); MS (FAB) m/z 1085 ([M+Na]^{+}), 1063 ([M+H]^{+}), 1045 ([M-OH)]^{+}), 1031 ([M-OCH_{3}]^{+}), 1013 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O)]^{+}).

MBA (IC_{50} rel.)	1,1
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	6,9
MLR (IC_{50} rel.)	5

Ejemplo 16 40-O-[2-(N-morfolino)acetoxi]etil-rapamicina a) 40-O-(2-bromoacetoxi)etil-rapamicina

El mismo procedimiento que el descrito en el ejemplo 14 empleando cloruro de bromoacetilo proporciona 40-O-(2-bromoacetoxi)etil-rapamicina: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 0,72 (1H, dd), 1,67 (3H, s), 1,76 (3H, s), 3,03 (1H; m), 3,82 (2H, m), 3,87 (2H, s), 4,31 (2H, m); MS (FAB) m/z 1100, 1102 ([M+Na]^{+}), 1077 (M^{+}), 1061 ([M-H_{2}O)]^{+}), 1046, 1048 ([M-OCH_{3}]^{+}), 1028, 1030 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O)]^{+}), 1012 ([M-(OCH_{3}+2H_{2}O)]^{+}), 996 ([M-(2CH_{3}OH+OH)]^{+}), 980 ([M-(OCH_{3}+CH_{3}OH+2H_{2}O)]^{+}).

b) 40-O-[2-(N-morfolino)acetoxi]etil-rapamicina

A una solución agitada, enfriada (-45ºC) de 54 mg (0,05 mmol) de 40-O-(2-acetoxi)etil-rapamicina en 0,5 ml de DMF se añade una solución de 0,022 ml (0,25 mmol) de morfolina en 0,2 ml de DMF y la mezcla resultante se agita a esa temperatura durante 1 hora y luego se trata con bicarbonato sódico acuoso. Esta mezcla se extrae tres veces con acetato de etilo. La solución orgánica se lava con salmuera, se seca sobre sulfato sódico anhidro, se filtra y se concentra. El residuo se purifica por cromatografía en columna sobre gel de sílice (acetato de etilo-metanol 95:5) para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco amorfo: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 0,72 (1H; dd), 1,67 (3H, s); 1,76 (3H, s), 2,60 (3H, m), 3,07 (1H, m), 3,24 (2H, s), 3,78 (8H; m), 4,27 (2H, t); MS (FAB) m/z 1107 ([M+Na]^{+}), 1085 ([M+H)]^{+}), 1067 ([M-OH]^{+}), 1053 ([M-OCH_{3}]^{+}), 1035 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O)]^{+}).

MBA (IC_{50} rel.)	1,3
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	4
MLR (IC_{50} rel.)	3,5

Ejemplo 17 40-O-(2-N-imidazolilacetoxi)etil-rapamicina

El mismo procedimiento que el descrito en el ejemplo 16, etapa b) empleando imidazol proporciona el compuesto del título: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 0,72 (1H, dd), 1,67 (3H, s), 1,78 (3H; s), 3,06 (1H, m), 3,80 (2H, m), 4,32 (2H, m), 4,73 (2H, s), 6,97 (1H, dd), 7,09 (1H, dd), 7,52 (1H, dd); MS (FAB) m/z 1066 ([M+H]^{+}), 1048 ([M-OH)]^{+}), 1034 ([M-OCH_{3}]^{+}), 1016 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O)]^{+}).

MBA (IC_{50} rel.)	1
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	7,6
MLR (IC_{50} rel.)	3,4

Ejemplo 18 40-O-[2-(N-metil-N'-pieprazinil)acetoxi]etil-rapamicina

El mismo procedimiento que el descrito en el ejemplo 16, etapa b) empleando N-metilpiperazina proporciona el compuesto del título: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 0,72 (1H, dd), 1,67 (3H, s), 1,77 (3H, s), 2,78 (4H; s y m), 3,02 (4H, bs), 3,08 (1H, m), 3,32 (2; s), 3,80 (2H, dd), 4,27 (2H, t); MS (FAB) m/z 1098 ([M+H]^{+}), 1066 ([M-OCH_{3}]^{+}).

MBA (IC_{50} rel.)	2,6
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	10,3
MLR (IC_{50} rel.)	5

Ejemplo 19 39-O-desmetil-39,40-O,O-etilen-rapamicina

A una solución agitada, enfriada (-20ºC) de 48 mg (0,05 mmol) de 40-O-hidroxietil-rapamicina y 0,023 ml (0,20 mmol) de 2,6-lutidina en 0,5 ml de cloruro de metileno se añaden 0,008 ml (0,05 mmol) de anhídrido tríflico. La mezcla se agita a esta temperatura durante 2 horas, tras lo cual se deja calentar a temperatura ambiente y se agita durante 1 hora más. La reacción se enfría rápidamente con bicarbonato sódico acuoso y la mezcla resultante se extrae con tres porciones de acetato de etilo. La solución orgánica se lava con salmuera, se seca sobre sulfato sódico anhidro, se filtra y se concentra. El residuo se purifica por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano-acetato de etilo 30:70) para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 1,66 (3H, s), 1,75 (3H, s), 3,14 (3H, s), 3,35 (3H, s), 3,76 (4H, s); MS (FAB) m/z 948 ([M+Na]^{+}), 925 (M^{+}), 908 ([M-OH)]^{+}), 894 ([M-OCH_{3}]^{+}), 876 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O)]^{+}), 858 ([M-(OCH_{3}+2H_{2}O)]^{+}), 844 ([M-(2CH_{3}OH+OH)]^{+}), 826 ([M-(OCH_{3}+CH_{3}OH+2H_{2}O)]^{+}).

MBA (IC_{50} rel.)	1,6
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	22,9
MLR (IC_{50} rel.)	16

Ejemplo 20 (26R)-26-dihidro-40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina a) (26R)-26-dihidro-40-O-[2-(t-burildimetilsililoxi)]etil-rapamicina

En 4,5 ml de acetonitrilo-ácido acético 2:1 se disuelven 315 mg (1,2 mmol de triacetoxiborohidruro de tetrametilamonio. La solución resultante se agita durante 1 hora a temperatura ambiente y se enfría a -15ºC, tras lo cual se añaden 161 mg (0,15 mmol) de 40-O-[2-(t-butildimetilsilil)oxi]etil-rapamicina. La mezcla resultante se agita a la misma temperatura durante la noche y se enfría rápidamente por adición de bicarbonato sódico acuoso. La mezcla se extrae con tres porciones de acetato de etilo. La solución orgánica se lava con bicarbonato sódico acuoso, con dos porciones de sal de Rochelle acuosa al 30% y salmuera, se seca sobre sulfato sódico anhidro, se filtra y se concentra. El residuo se purifica por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano-acetato de etilo 40:60) para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 0,06 (6H, s), 0,73 (1H, dd), 0,90 (9H, s), 1,64 (3H, s), 1,67 (3H, s), 3,02 (1H, m), 3,15 (1H, m), 3,64 (3H, m), 3,71 (2H, dd), 3,91 (1H, s); MS (FAB) m/z 1096 ([M+Na]^{+}), 1041 ([M-HOCH_{3}]^{+}), 1024 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O)]^{+}), 1006 ([M-(OCH_{3}+2H_{2}O)]^{+}), 974 ([M-(OCH_{3}+CH_{3}OH+2H_{2}O)]^{+}).

b) (26R)-26-dihidro-40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina

El tratamiento del compuesto obtenido en la etapa a) en las condiciones descritas en el ejemplo 8, etapa b) proporciona el compuesto del título: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 0,75 (1H, dd), 1,66 (3H, s), 1,70 (3H, s), 3,18 (1H, m), 3,52-3,84 (7H, m); MS (FAB) m/z 982 ([M+Na]^{+}), 928 ([M-OCH_{3}]^{+}), 910 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O)]^{+}), 892 ([M-(OCH_{3}+2H_{2}O)]^{+}).

MBA (IC_{50} rel.)	3,9
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	53
MLR (IC_{50} rel.)	18

Ejemplo 21 28-O-metil-rapamicina

A una solución agitada de 103 mg (0,1 mmol) de 40-O-TBS-rapamicina (obtenida por sililación de rapamicina con 1 equivalente de TBS-triflato en cloruro de metileno en presencia de 2 equivalentes de 2,6-glutidina a 0ºC) en 0,5 ml de cloruro de metileno, se añaden 85,8 mg (0,40 mmol) de esponja protónica seguido por 44 mg (0,30 mmol) de tetrafluorborato de trimetiloxonio. La mezcla homogénea de color marrón resultante se agita durante la noche, se enfría rápidamente con bicarbonato sódico acuoso y se extrae con acetato de etilo. La solución orgánica se lava con 1 N HCl, bicarbonato sódico acuoso y salmuera, tras lo cual se seca sobre sulfato sódico anhidro, se filtra y se concentra. El residuo se purifica por cromatografía en columna sobre gel de sílice (hexano-acetato de etilo 60:40) para proporcionar 40-O-t-butildimetilsilil-28-O-metil-rapamicina. Este último compuesto es desililado en las condiciones descritas en el ejemplo 10, etapa b) para proporcionar, después de PTLC (acetato de etilo) el compuesto del título como un sólido blanco: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 0,70 (1H, dd), 1,68 (6H, 2s), 2,95 (1H, m), 3,13 (3H, s), 3,14 (3H, s), 3,28 (3H, s), 3,41 (3H, s); MS (FAB) m/z 950 ([M+Na]^{+}), 927 (M^{+}), 909 ([M-H_{2}O)]^{+}), 896 ([M-OCH_{3}]^{+}), 878 ([M-(OCH_{3}+H_{2}O)]^{+}), 864 ([M-(OCH_{3}+CH_{3}OH)]^{+}), 846 ([M-(2CH_{3}OH+OH)]^{+}), 832 ([M-(OCH_{3}+2CH_{3}OH)]^{+}), 814 ([M-(3CH_{3}OH+OH)]^{+}).

MBA (IC_{50} rel.)	1,58
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	1240
MLR (IC_{50} rel.)	1300

Ejemplo 22 40-O-(2-aminoetil)-rapamicina a) 40-O-(2-bromoetil)-rapamicina

Una solución de 914 mg de rapamicina en 5 ml de tolueno conteniendo 0,64 ml de 2,6-lutidina y 1,28 g de triflato de 2-bromoetilo, se calienta a 65ºC durante 18 horas. La mezcla de reacción se enfría entonces a temperatura ambiente, se vierte en 20 ml de solución saturada de bicarbonato y se extrae con 3 x 20 ml de acetato de etilo. Las fases orgánicas se secan sobre carbonato sódico y el disolvente se separa a presión reducida en un evaporador rotativo. El residuo se cromatografía sobre 100 g de gel de sílice, eluyendo con hexano/acetato de etilo 3/2 para proporcionar 40-O-(2-bromoetil)-rapamicina como un sólido amorfo: MS (FAB) m/z 1044 y 1042 (100%, M+Na); 972 y 970 (55%, M-(MeOH+H_{2}O)).

H NMR (CDCl_{3}) d: 0,72 (1H; q, J=12 Hz); 3,13 (3H, s); 3,33 (3H, s); 3,45 (3H, s); 3,9 (4H, m); 4,78 (1H, s).

b) 40-O-(2-azidoetil)-rapamicina

Una solución de 2,4 g de 40-O-(2-bromoetil)-rapamicina en 40 ml de DMF se trata con 0,19 g de azida sódica a temperatura ambiente. Después de 2 horas, la mezcla se vierte en 100 ml de bicarbonato sódico saturado y se extrae con 3 x 100 ml de acetato de etilo. Las fases orgánicas se combinan, tras lo cual se seca sobre sulfato sódico y se separa el disolvente bajo presión reducida. El producto en bruto se purifica por cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con hexano/acetato de etilo para proporcionar 40-O-(2-azidoetil)-rapamicina: MS (FAB): 1005 (100%, M+Na); 951 (24%, M-MeOH); 933 (57%, M-(MeOH+H_{2}O).

c) 40-O-(2-aminoetil)-rapamicina

A una solución de 230 mg de 40-O-(azidoetil)-rapamicina en 3 ml de THF/agua 5/1 a temperatura ambiente, se añaden 307 mg de trifenilfosfina. La mezcla de reacción se vuelve amarilla. Después de 7 horas, la mezcla de reacción se carga sobre x g de gel de sílice y se cromatografía con acetato de etilo/metanol/ácido acético 50/50/0,5 para proporcionar el producto del título en forma de su acetato: MS (FAB) m/z 979 (45%, M+Na); 957 (100%, MH); 925 (63%, M-MeOH); 907 (25%, M-(MeOH+H_{2}O)

MBA (IC_{50} rel.)	0,7
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	10

Ejemplo 23 40-O-(2-acetaminoetil)-rapamicina

A una solución de 101 mg del acetato de 40-O-(2-aminoetil)-rapamicina en 2 ml de THF se añaden 0,02 ml de piridina y 0,07 ml de cloruro de acetilo. La mezcla de reacción se mantiene a temperatura ambiente durante 18 horas y luego se vierte en 7 ml de bicarbonato sódico saturado. La fase acuosa se extrae tres veces con 5 ml de acetato de etilo, se combinan las fases orgánicas y luego se seca sobre sulfato sódico. Se evapora el disolvente y el residuo se cromatografía sobre 10 g de gel de sílice eluyendo primero con acetato de etilo seguido por acetato de etilo/metanol/ácido acético 50/50/0,5 para proporcionar el producto del título: MS (FAB) m/z 1021 (20%, M+Na); 967 (28%, M-MeOH); 949 (100%, M-(MeOH+H_{2}O)

H-NMR (CDCl_{3}) d: 0,71 (1H, q, J=12 Hz); 1,98 (3H, s); 3,13 (3H, s); 3,34 (3H, s); 3,44 (3H, s); 4,75 (1H, s)

MBA (IC_{50} rel.)	1,1
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	2,3

Ejemplo 24 40-O-(2-nicotinamidoetil)-rapamicina

Se disuelven 101 mg de acetato de 40-(2-aminoetil)-rapamicina en 5 ml de acetato de etilo y se extrae dos veces con bicarbonato sódico saturado. La fase orgánica se seca sobre sulfato sódico y se evapora el disolvente. El residuo se disuelve en 2 ml de THF y se trata con 22 mg de DCC y 15 ml de ácido nicotínico. Después de 15 horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se evapora y el residuo se cromatografía sobre gel de sílice, eluyendo con acetato de etilo seguido por acetato de etilo/metanol 9/1, para proporcionar el producto del título: MS (FAB) m/z 1084 (80%, M+Na), 1062 (40%, MH); 1038 (100%, M-MeOH); 1012 (50%, M-(MeOH+H_{2}O)

H-NMR (CDCl_{3}) d: 0,72 (1H, q, J=12 Hz); 3,13 (3H, s); 3,33 (3H, s); 3,37 (3H, s); 7,39 (1H, dd: J=6 Hz, J=8 Hz); 8,19 (1H, d, J=8 Hz); 8,75 (1H, d, J=6 Hz); 9,04 (1H, s ancho)

MBA (IC_{50} rel.)	1,2
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	2,8

Ejemplo 25 40-O-(2-N-metil-imidazo-2'-ilcarboxamido)etil)-rapamicina

A una solución de 30 mg de ácido N-metilimidazol-2-carboxílico en 1 ml de DMF se añaden 58 mg de DCC y 58 mg de HOBT. Después de 2 horas, se añaden 150 mg de 40-O-(2-aminoetil)-rapamicina y la mezcla de reacción se agita durante 18 horas a temperatura ambiente. La suspensión se filtra luego, se diluye el filtrado con 5 ml de acetato de etilo y se lava con 2 x 2 ml de una solución acuosa saturada de bicarbonato. La fase orgánica se seca sobre sulfato sódico y el disolvente se evapora bajo presión reducida. El residuo se cromatografía sobre 10 g de gel de sílice, eluyendo con hexano/acetato de etilo 1/4 y luego con acetato de etilo, para proporcionar el producto del título: MS (FAB) m/z 1087 (36%, M+Na), 1065 (57%, MH); 1033 (100%, M-MeOH); 1015 (46%, M-(MeOH+H_{2}O)

H-NMR (CDCl_{3}) d: 0,72 (1H, q, J=12 Hz); 3,13 (3H, s); 3,33 (3H, s); 3,46 (3H, s); 4,03 (3H, s); 6,93 (1H, s ancho); 6,98 (1H, s ancho); 7,78 (1H, m)

MBA (IC_{50} rel.)	1,1
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	7

Ejemplo 26 40-O-(2-etoxicarbonilaminoetil)-rapamicina

Una solución de 200 mg de 40-O-(2-azidoetil)-rapamicina en 3 ml de THF/agua 5/1 se trata con 267 mg de trifenilfosfina durante 7 horas a temperatura ambiente. Se añaden luego 0,4 ml de piridina seguido por 194 \mul de cloroformiato de etilo. Después de 2 horas, la mezcla de reacción se vierte en 5 ml de acetato de etilo y se lava sucesivamente con 10 ml de bicarbonato sódico saturado, 5 ml de agua y 5 ml de ácido cítrico al 10%. La fase orgánica se seca sobre sulfato sódico y se evapora el disolvente. El residuo se cromatografía sobre 20 g de gel de sílice, eluyendo con acetato de etilo seguido por acetato de etilo/metanol 9/1, para proporcionar el producto del título: MS (FAB) m/z 1051 (35%, M+Na), 997 (30%, M-MeOH); 979 (100%, M-(MeOH+H_{2}O)

H-NMR (CDCl_{3}) d: 0,71 (1H, q, J=12 Hz); 1,24 (3H, t, J=8 Hz); 3,13 (3H, s); 3,34 (3H, s); 3,43 (3H, s); 4,10 (2H, q, J=8 Hz); 5,48 (1H, m)

MBA (IC_{50} rel.)	1,1
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	1,7

Ejemplo 27 40-O-(2-tolilsulfonamidoetil)-rapamicina

Una solución de 200 mg de 40-O-(2-aminoetil)-rapamicina en 3 ml de THF se trata con 0,4 ml de piridina y 390 mg de cloruro de tosilo y la mezcla de reacción se agita durante 12 horas a temperatura ambiente. La solución se vierte entonces en 5 ml de solución saturada de bicarbonato y la fase acuosa se extrae con 2 x 5 ml de acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se lavan con 5 ml de ácido cítrico al 10% y 5 ml de agua. Después de secar sobre sulfato sódico, el disolvente se evapora y el residuo se cromatografía sobre 20 g de gel de sílice, eluyendo con hexano/acetato de etilo 1/1 para proporcionar el producto del título como una espuma blanca: MS (FAB) m/z 1133 (100%, M+Na), 1075 (25%, M-MeOH); 1061 (85%, M-(MeOH+H_{2}O)

H-NMR (CDCl_{3}) d: 0,68 (1H, q, J=12 Hz); 2,43 (3H, s); 3,13 (3H, s); 3,35 (3H, s); 3,41 (3H, s); 4,76 (1H, s); 5,85 (1H, t, J=6 Hz); 7,30 (2H, d, J=8 Hz); 7,75 (2H, d, J=8 Hz).

MBA (IC_{50} rel.)	15,9
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	14

Ejemplo 28 40-O-[2-(4',5'-dicarboetoxi-1',2',3'-triazol-1'-il)-etil]-rapamicina

Se suspenden 98 mg de 40-O-(2-azidoetil)-rapamicina y 32 mg de dicarboxilato de dietilacetileno en 0,5 ml de tolueno y se calienta a 65ºC durante 5 horas. La mezcla de reacción se enfría luego a temperatura ambiente, y se carga sobre 10 g de gel de sílice y se eluye con hexano/acetato de etilo 1/1 para proporcionar el producto del título: MS (FAB) m/z 1175 (20%, M+Na), 1121 (15%, M-MeOH); 1003 (60%, M-(MeOH+H_{2}O)

H-NMR (CDCl_{3}) d: 0,62 (1H, q, J=12 Hz); 1,40 (3H, t, J=8 Hz); 1,42 (3H, t, J=8 Hz); 3,13 (3H, s); 3,25 (3H, s); 3,33 (3H, s)

MBA (IC_{50} rel.)	2,7
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	12

Los ejemplos anteriores se pueden realizar también empleando, como material de partida, 9-deoxo-rapamicina, 26-dihidro-rapamicina o 9-deoxo-, 26-dihidro-rapamicina, en lugar de rapamicina. Alternativamente, y con preferencia, como se describe, por ejemplo en el ejemplo 20, los compuestos de rapamicina de los ejemplos anteriores pueden ser hidrogenados o reducidos, empleando grupos protectores adecuados, cuando ello sea necesario. Se ofrecen los siguientes nuevos métodos para reducir el ceto en C9 o hidrogenar el ceto en C26:

Ejemplo 29 Separación de ceto en C9

Se pasa una corriente de sulfuro de hidrógeno a temperatura ambiente a través de una solución agitada de 3,2 g (3,5 mmol) de rapamicina en 50 ml de piridina y 2,5 ml de DMF. La solución vira desde incolora a amarilla. Después de 2 horas, se detiene la introducción de sulfuro de hidrógeno y se continúa la agitación durante 5 días, en cuyo tiempo la solución vira gradualmente a color naranja. Los análisis TLC y HPLC verifican un consumo completo del material de partida y la presencia de un solo compuesto nuevo. La solución se purga con nitrógeno durante 1 hora y se concentra bajo presión reducida. El residuo se recibe en acetato de etilo, se lava con solución fría de 1 N HCl (3x), solución saturada de bicarbonato sódico y salmuera saturada. La capa orgánica se seca sobre sulfato sódico anhidro, se filtra y se concentra bajo presión reducida. El residuo se recibe en éter y el azufre precipitado se separa por filtración. La concentración de la solución etérea seguido por cromatografía en columna sobre gel de sílice (10:4:1 CH_{2}Cl_{2}/i-Pr_{2}O/MeOH) proporciona 9-deoxo-rapamicina como una espuma incolora. La identidad del producto se confirma por espectroscopía de resonancia magnética nuclear (NMR), espectrometría de masas (MS) y/o espectroscopía infrarroja (IR). Se comprueba que la 9-deoxo-rapamicina exhibe los siguientes datos físicos característicos: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 1,61 (3H, d, J=1 Hz, C17-CH_{3}), 1,76 (3H, d, J=1,2 Hz, C29-CH_{3}), 2,42 (1H, d, J=14,5 Hz, H-9), 2,74 (1H; d, J=14,5 Hz, H-9), 3,13 (3H, s, C16-OCH_{3}), 3,5 (3H, s, C27-OCH_{3}), 3,40 (3H, s, C39-OCH_{3}, 5,40 (1H, d, J=10 Hz, H-30), 5,57 (1H, dd, J_{1}=8,6 Hz, J_{2}=15 Hz, H-22), 5,96 (1H, d, J=9 Hz, H-18), 6,09 (1H, d, J)1,7 Hz, 10-OH), 6,15 (1H, dd, J_{1}=10 Hz, J_{2}=15 Hz, H-21), 6,37 (1H, dd, J_{1}=1,5 Hz, J_{2}=5 Hz, H-19), 6,38 (1H, J=9,5 Hz, H-20).

^{13}C NMR (DCDl_{3}\delta 38,5 (C-9), 98,0 (C-10), 170,7 (C-1); 173,0 (C-8), 208,8 (C-32), 216,9 (C-26).

MS (FAB) m/z 922 ([M+Na]^{+}), 899 (M^{+}), 881 ([M-H_{2}O)]^{+}), 868 ([M-OCH_{3}]^{+}), 850 ([M-(H_{2}O+OCH_{3})]^{+}).

IR (picos principales)(cm^{-1}) 987, 1086, 1193, 1453, 16165, 1717, 1739, 3443.

MBA (IC_{50} rel.)	1
MLR (IC_{50} rel.)	14
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	9

Ejemplo 30 Dihidrogenación de ceto en C26

A una solución agitada de 421 mg (1,6 mmol) de triacetoxiborohidruro de tetrametilamonio en 2 ml de acetonitrilo se añaden 2 ml de ácido acético. La mezcla resultante se agita durante 30 minutos a temperatura ambiente y se enfría a -35ºC. A esta temperatura, se añade una solución de 180 mg (0,2 mmol) de 9-deoxo-rapamicina en 1 ml de acetonitrilo y la mezcla resultante se deja en agitación durante 24 horas. La mezcla se enfría rápidamente con una solución saturada de tartrato sódico-potásico y se deja calentar a temperatura ambiente. Se continúa la agitación hasta que ambas capas son transparentes y se añade acetato de etilo. Las capas se separan y la capa acuosa se extrae dos veces con acetato de etilo. La solución orgánica resultante se lava una vez con una solución de bicarbonato sódico al 10% y dos veces con salmuera saturada, tras lo cual se seca sobre sulfato sódico anhidro, se filtra y se concentra bajo presión reducida. El residuo se purifica por cromatografía en columna sobre gel de sílice (AcOEt-hexano 90:10). Dado que el material de partida es en este caso 9-deoxo-rapamicina, el compuesto final es 9-deoxo-rapamicina, la 26-dihidro-rapamicina se produce como una espuma incolora, que tiene los siguientes datos espectroscópicos característicos: ^{1}H NMR (CDCl_{3}) (isómero principal) \delta 9 (3H, d, J=6,9 Hz, CHCH_{3}), 0,93 (3H, d, J=6,9 Hz, CHCH_{3}), 1,00 (3H, d, J=6,9 Hz, CHCH_{3}), 1,07 (3H, d, J=6,9 Hz, CHCH_{3}), 1,17 (3H, d, J=6,9 Hz, CHCH_{3}), 1,61 (3H, d, J=1 Hz, C17-CH_{3}), 1,73 (3H, d, J=1,2 Hz, C29-CH_{3}), 2,43 (1H, dd, J=4,1 y 16,0 Hz, H-33), 2,46 (1H, d, J=13,8 Hz, H-9), 2,58 (1H; m, H-25), 2,77 (1H, d, J=13,8 Hz, H-9), 2,82 (1H, dd, J=8,3 y 16,0 Hz, H-33), 3,17 (1H, dd, J=4,1 y 9,2 Hz, H-27), 3,61 (2H, m, H-14 y H28), 5,19 (1H, ddd, J=4,1, 4,6 y 8,3 Hz, H-34), 5,49 (1H, d ancho, J=5,0 Hz, H-2), 5,56 (1H, d, J=9,1 Hz, H-30), 5,75 (1H, dd, J=6,9 y 14,7 Hz, H-22), 5,76 (1H, s, 10-OH), 5,99 (1H, d ancho, J=9,2 Hz, H-18), 6,10 (1H, m, H-21), 6,36 (2H, M; H-19 y H-20);

MS (FAB) m/z 924 ([M+Na]^{+}), 852 ([M-(H_{2}O+CH_{3}O)]^{+}).

IR (picos principales)(cm^{-1}) 987, 1086, 1193, 1453, 16165, 1717, 1739, 3443.

MBA (IC_{50} rel.)	47
MLR (IC_{50} rel.)	134
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	78

La 26-dihidro-rapamicina se prepara de la misma manera, empleando rapamicina en lugar de 9-deoxo-rapamicina. Este producto tiene los siguientes datos espectroscópicos característicos:

^{13}C-NMR (CDCl_{3}) (isómero principal) d = 208,3 (C-32); 194,0 (C-9); 169,3 (C-1); 166,6 (C-8); 140,9 (C-22); 136,5 (C-29); 136,2 (C-17); 133-5 (C-20); 129,1 (C-21); 128,7 (C-18); 126,2 (C-30); 125,3 (C-19); 98,6 (C-10); 84,4 (C-39); 83,9 (C-16); 81,6 (C-27); 75,4 (C-34); 74,3 (C-28); 73,9 (C-40); 72,9 (C-26); 67,4 (C-14); 59,1 (27-OCH_{3}); 56,6 (39-OCH_{3}); 55,9 (16-OCH_{3}); 51-3 (C-2); 46,8 (C-31); 44,3 (C-6); 40,4 (C-33); 40,4 (C-25); 39,5 (C-24); 38,8 (C-15); 38,0 (C-36); 34,3 (C-23); 34,2 (C-38); 33,5 (C-11); 33,3 (C-37); 33,2 (C-35); 31,5 (C-42); 31,3 (C-41); 30,9 (C-13); 27,1 (C-12); 27,0 (C-3); 25,2 (C-5); 21,4 (23-CH_{3}); 20,78 (C-4); 17,3 (11-CH_{3}); 16,1 (31-CH_{3}); 15,9 (35-CH_{3}); 14,4 (25-CH_{3}); 14,2 (29-CH_{3}); 10,3 (17-CH_{3}).

MS (FAB) m/z: 884 (M-OCH_{3}, 35%); 866 (M-[OCH_{3}+H_{2}O], 100%); 848 (M-[OCH_{3}+2H_{2}O], 40%).

MBA (IC_{50} rel.)	1,7
MLR (IC_{50} rel.)	1
prol. dep. IL-6 (IC_{50} rel.)	7,5

Claims (5)

1. Uso de 40-O-(2-hidroxietil)-rapamicina en la preparación de un medicamento para utilizarse junto con un fármaco inmunosupresor.

2. Uso de 40-O-(2-hidroxietil)-rapamicina en la preparación de un medicamento para utilizarse en combinación con Ciclosporina, FK-506, corticosteroides o un anticuerpo monoclonal inmunosupresor.

3. Uso según la reivindicación 2 en donde el anticuerpo monoclonal inmunosupresor es un anticuerpo monoclonal a CD3, CD4, CD25, CD28 o CD45.

4. Uso de 40-O-(2-hidroxietil)-rapamicina en la preparación de un medicamento para utilizarse en combinación con un compuesto inmunomodulador.

5. Uso de 40-O-(2-hidroxietil)-rapamicina en la preparación de un medicamento para utilizarse junto con un agente anti-inflamatorio o un agente anti-infeccioso.