RU2705001C2 - Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека в одногормональные инсулинположительные клетки - Google Patents

Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека в одногормональные инсулинположительные клетки Download PDF

Info

Publication number
RU2705001C2
RU2705001C2 RU2018132199A RU2018132199A RU2705001C2 RU 2705001 C2 RU2705001 C2 RU 2705001C2 RU 2018132199 A RU2018132199 A RU 2018132199A RU 2018132199 A RU2018132199 A RU 2018132199A RU 2705001 C2 RU2705001 C2 RU 2705001C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cells
stage
expression
pancreatic
days
Prior art date
Application number
RU2018132199A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2018132199A (ru
RU2018132199A3 (ru
Inventor
Алиреза РЕЗАНИА
Original Assignee
Янссен Байотек, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Янссен Байотек, Инк. filed Critical Янссен Байотек, Инк.
Publication of RU2018132199A publication Critical patent/RU2018132199A/ru
Publication of RU2018132199A3 publication Critical patent/RU2018132199A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2705001C2 publication Critical patent/RU2705001C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/117—Keratinocyte growth factors (KGF-1, i.e. FGF-7; KGF-2, i.e. FGF-12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/19—Growth and differentiation factors [GDF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/41—Hedgehog proteins; Cyclopamine (inhibitor)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению одногормональных инсулинположительных клеток. Способ, за исключением способа, в котором клетки поджелудочной железы передней кишки и клетки энтодермы поджелудочной железы получены с использованием человеческих эмбрионов, включает дифференцировку клеток поджелудочной железы передней кишки, экспрессирующих PDX-1 и NKX6.1, в клетки энтодермы поджелудочной железы путем обработки клеток поджелудочной железы передней кишки, экспрессирующих PDX-1 и NKX6.1, ингибитором shh, низкой дозой ретиноевой кислоты и аскорбиновой кислотой. Затем осуществляют дифференцировку клеток энтодермы поджелудочной железы в одногормональные эндокринные клетки поджелудочной железы в среде, дополненной ингибитором shh, низкой дозой ретиноевой кислоты и аскорбиновой кислотой. Изобретение позволяет расширить арсенал технических средств. 15 з.п. ф-лы, 22 ил., 8 табл., 8 пр.

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА СМЕЖНУЮ ЗАЯВКУ
Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной патентной заявки США, серийный номер 61/579351, поданной 22 декабря 2011 г., которая включена в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.
ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к области дифференцировки клеток. Более конкретно, настоящее изобретение относится к одногормональным инсулинпродуцирующим клеткам, дифференцированным из плюрипотентных стволовых клеток с использованием определенных условий на каждой стадии поэтапной дифференцировки. Более 10% дифференцированных инсулинпродуцирующих клеток из группы экспрессируют маркеры, характерные для одногормональных бета-клеток поджелудочной железы.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Последние достижения в области заместительной клеточной терапии для лечения сахарного диабета 1-го типа и нехватка островков Лангерганса для трансплантации заставили обратить внимание на разработку источников инсулинпродуцирующих клеток, или β-клеток, подходящих для трансплантации. Одним из подходов является формирование функциональных β-клеток из плюрипотентных стволовых клеток, таких как, например, эмбриональные стволовые клетки.
При эмбриональном развитии позвоночных плюрипотентные клетки дают начало группе клеток, содержащих три зародышевых листка (эктодерму, мезодерму и эндодерму), в ходе процесса, именуемого гаструляцией. Ткани, такие как ткань щитовидной железы, вилочковой железы, поджелудочной железы, кишечника и печени, будут развиваться из энтодермы через промежуточную стадию. Промежуточной стадией в этом процессе является формирование дефинитивной энтодермы. Дефинитивные клетки энтодермы экспрессируют ряд маркеров, таких как HNF3beta, GATA4, MIXL1, CXCR4 и SOX17.
К концу гаструляции энтодерма разделяется на передний и задний отделы, которые могут быть распознаны по экспрессии целого ряда факторов, однозначно выделяющих переднюю, среднюю и заднюю области энтодермы. Например, Hhex и Sox2 идентифицируют переднюю область, в то время как Cdx1, 2 и 4 идентифицируют заднюю половину энтодермы.
Миграция ткани энтодермы приближает энтодерму как можно ближе к различным мезодермальным тканям, которые способствуют регионализации кишечной трубки. Это достигается за счет целого ряда секретируемых факторов, таких как FGFs, Wnts, TGF-Bs, ретиноевой кислоты (RA), лигандов BMP и их антагонистов. Например, FGF4 и BMP способствуют экспрессии Cdx2 в предполагаемой энтодерме задней кишки и подавляют экспрессию передних генов Hhex и SOX2 (Development 2000, 127:1563-1567). Было продемонстрировано, что сигнализация WNT также действует параллельно с сигнализацией FGF, способствуя развитию задней кишки и препятствуя зачаткам передней кишки (Development 2007, 134:2207-2217). Наконец, ретиноевая кислота, секретируемая мезенхимой, регулирует границу между передней и задней кишкой (Curr Biol 2002, 12:1215-1220).
Уровень экспрессии специфических факторов транскрипции может использоваться для определения типа ткани. Во время преобразования дефинитивной энтодермы в примитивную кишечную трубку кишечная трубка становится разделенной на широкие отделы, которые можно наблюдать на молекулярном уровне с помощью ограниченных паттернов экспрессии генов. Например, регионализованный отдел поджелудочной железы в кишечной трубке демонстрирует очень высокую экспрессию PDX-1 и очень низкую экспрессию CDX2 и SOX2. Аналогично, наличие высоких уровней Foxe1 свидетельствует о ткани пищевода; в легочной ткани высок уровень экспрессии NKX2.1; в ткани желудка высок уровень экспрессии SOX2/Odd1 (OSR1); уровень экспрессии PROX1/Hhex/AFP высок в ткани печени; SOX17 имеет высокий уровень экспрессии в тканях желчного тракта; высок уровень экспрессии PDX1, NKX6.1/PTf1a и NKX2.2 в ткани поджелудочной железы; а уровень экспрессии CDX2 высок в ткани кишечника. Сводка, приведенная выше, взята из Dev Dyn 2009, 238:29-42 и Annu Rev Cell Dev Biol 2009, 25:221-251.
Формирование поджелудочной железы происходит в результате дифференцировки дефинитивной энтодермы в энтодерму поджелудочной железы (Annu Rev Cell Dev Biol 2009, 25:221-251; Dev Dyn 2009, 238:29-42). Дорсальный и вентральный отделы поджелудочной железы формируются из эпителия передней кишки. Передняя кишка также дает начало формирования пищевода, трахеи, легких, щитовидной железы, желудка, печени, поджелудочной железы и системы желчных протоков.
Клетки энтодермы поджелудочной железы экспрессируют панкрео-дуоденальный, содержащий гомеобокс ген PDX1. При отсутствии Pdx1 развитие поджелудочной железы не идет дальше формирования вентрального и дорсального зачатков. Таким образом, экспрессия PDX1 характеризует критическую стадию органогенеза поджелудочной железы. Зрелая поджелудочная железа содержит, помимо других типов клеток, экзокринную ткань и эндокринную ткань. Экзокринная и эндокринная ткани образуются при дифференцировке панкреатической эндодермы.
D'Amour и др. описывает производство обогащенных культур дефинитивной энтодермы, полученной из эмбриональных стволовых клеток человека в присутствии высокой концентрации активина и низкой концентрации сыворотки (Nature Biotechnol 2005, 23:1534-1541; патент США № 7704738). Трансплантация этих клеток под капсулу почки у мышей приводила к дифференцировке в более зрелые клетки с характеристиками ткани энтодермы (патент США № 7704738). Клетки дефинитивной энтодермы, полученные из эмбриональных стволовых клеток человека, могут быть далее дифференцированы в PDX1-позитивные клетки после добавления FGF-10 и ретиноевой кислоты (патентная публикация США № 2005/0266554A1). Последующая трансплантация этих клеток-предшественников поджелудочной железы под капсулу почки у мышей с иммунодефицитом приводила к формированию функциональных эндокринных клеток поджелудочной железы после этапа созревания в течение 3-4 месяцев (патент США № 7993920 и 7534608).
Fisk и др. сообщают о системе получения клеток панкреатических островков из эмбриональных стволовых клеток человека (патент США № 7033831). В данном случае процесс дифференцировки был разделен на три стадии. Эмбриональные стволовые клетки человека сначала были дифференцированы в энтодерму при помощи сочетания бутирата натрия и активина A (патент США № 7326572). Затем клетки культивировали с антагонистами BMP, такими как Noggin, в сочетании с EGF или бета-целлюлином для генерирования PDX1-позитивных клеток. Окончательная дифференцировка запускалась никотинамидом.
Ингибиторы в виде небольших молекул также использовались для индуцирования предшественников эндокринных клеток поджелудочной железы. Например, ингибиторы в виде небольших молекул рецепторов TGF-B и рецепторов BMP (Development 2011, 138:861-871; Diabetes 2011, 60:239-247) использовались для значительного увеличения количества получаемых эндокринных клеток поджелудочной железы. Кроме того, активирующие молекулы небольших размеров также использовались для генерирования клеток дефинитивной энтодермы или клеток-предшественников поджелудочной железы (Curr Opin Cell Biol 2009, 21:727-732; Nature Chem Biol 2009, 5:258-265).
Предыдущие попытки индуцирования предшественников клеток поджелудочной железы из эмбриональных стволовых клеток человека выявили важность совместной экспрессии PDX-1 и NKX6.1 для корректной идентификации энтодермы поджелудочной железы. Тем не менее, хотя исследования в данной области определили, что в группе клеток с положительной экспрессией PDX-1 и NKX6.1 экспрессия CDX2 невелика или отсутствует, предыдущие отчеты не смогли дать ответ на вопрос о наличии маркеров непосредственно перед развивающейся поджелудочной железой. SOX2, который является маркером передней энтодермы, не экспрессируется во взрослых островках и экспрессируется на очень низком уровне в развивающейся поджелудочной железе (Diabetes 2005, 54:3402-4309). Напротив, некоторые из примеров в данной заявке описывают группы клеток, в которых по меньшей мере 30% клеток энтодермы поджелудочной железы, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека, положительны по экспрессии PDX-1 и NKX6.1 и отрицательны по экспрессии CDX2 и SOX2.
Все предыдущие попытки создания функциональных бета-клеток поджелудочной железы не привели к генерированию клеток с характеристиками зрелых бета-клеток. Отличительные особенности зрелых бета-клеток включают в себя экспрессию гормона инсулина, корректную переработку проинсулина в инсулин и С-пептид, сильную экспрессию PDX-1 и NKX6.1, соответствующее выделение инсулина в ответ на глюкозу, экспрессию транспортеров глюкозы и сильную экспрессию глюкокиназы. Все предшествующие отчеты сообщали об эндокринных клетках, которые производят два или более гормона поджелудочной железы. Например, D'Amour и др. (Nature Biotech 2006, 24:1392-1401) сообщают о получении группы клеток, содержащих ~10% инсулинположительных клеток и ~20% эндокринных клеток по измерению синаптофизином. Подобные сообщения других (Cell Res 2009, 19:429-438; Stem Cells 2007, 25:1940-1953; Diabetes Obes Metab 2008, 10:186-194) также продемонстрировали дифференцировку плюрипотентных клеток в нефункциональные инсулинположительные клетки. Действительно, недавние исследования определенно установили, что трансплантация полигормональных клеток у мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (ТКИД) не привела к образованию функциональных бета-клеток (Diabetes 2011, 60:239-247; Nature Biotech 2011, 29:750-756). В то время как в поджелудочной железе плода человека часть (~10-20%) эндокринных клеток является полигормональными клетками, полигормональные клетки исчезают и отсутствуют в поджелудочной железе взрослого человека (Histochem Cell Biol 1999, 112:147-153; J Histochem Cytochem 2009, 57:811-824).
По мере совершенствования растущей отрасли регенеративной медицины способ получения окончательно дифференцированных и надлежащим образом регулируемых эндокринных клеток поджелудочной железы становится весьма востребованным. Мы демонстрируем в настоящем документе, что при соответствующем и определенном воздействии на условия развития культуры клеток и точных сроках добавления активаторов/ингибиторов различных путей развития эмбриональные стволовые клетки человека могут быть дифференцированы in vitro в функционирующие бета-клетки поджелудочной железы. В частности, точный момент ингибирования BMP с использованием градиента ретиноевой кислоты наряду с использованием витамина C подтвердил свою эффективность при получении одногормональных эндокринных клеток поджелудочной железы.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение обеспечивает создание группы клеток линии дифференцировки энтодермы поджелудочной железы, полученной in vitro путем поэтапной дифференцировки плюрипотентных клеток. Среда, используемая на каждой стадии дифференцировки, дополняется глюкозой. В некоторых вариантах осуществления на каждой стадии дифференцировки клетки культивируются в среде, содержащей от 5 до 20 мМ глюкозы.
В некоторых вариантах осуществления дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток генерирует группы клеток энтодермы поджелудочной железы, где больше 10% клеток в дифференцированной группе экспрессируют маркеры, характерные для одногормональных бета-клеток поджелудочной железы.
В некоторых вариантах осуществления дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток генерирует группу клеток энтодермы поджелудочной железы, где более 30% дифференцированной группы положительны по экспрессии PDX-1 и NKX6.1, но в то же время отрицательны по экспрессии CDX2 и SOX2.
В некоторых вариантах осуществления поэтапная дифференцировка содержит культивирование недифференцированных эмбриональных стволовых клеток человека в среде, дополненной лигандом TGF-B. В некоторых вариантах осуществления поэтапная дифференцировка содержит культивирование недифференцированных эмбриональных стволовых клеток человека в среде, дополненной активатором WNT. В некоторых вариантах осуществления поэтапная дифференцировка содержит культивирование дефинитивных клеток энтодермы в среде, далее дополненной лигандом FGF. В некоторых вариантах осуществления поэтапная дифференцировка содержит культивирование клеток кишечной трубки в среде, далее дополненной ингибитором shh, лигандом FGF, активатором PKC, лигандом TGF-B, ретиноидом и градиентом ингибитора BMP. В некоторых вариантах осуществления поэтапная дифференцировка содержит культивирование задних клеток переднего кишечника в среде, далее дополненной активатором PKC, ингибитором shh, ретиноидом и ингибитором BMP. В некоторых вариантах осуществления поэтапная дифференцировка содержит культивирование клеток в среде, далее дополненной аскорбиновой кислотой.
В варианте осуществления изобретение обеспечивает способ in vitro для поэтапной дифференцировки плюрипотентных клеток в группу линии дифференцировки клеток энтодермы поджелудочной железы, которая содержит культивирование клеток на каждой стадии дифференцировки в среде, содержащей от 5 до 20 мМ глюкозы. В некоторых вариантах осуществления способ in vitro для поэтапной дифференцировки плюрипотентных клеток дополнительно содержит дифференцировку плюрипотентных клеток в клетки дефинитивной энтодермы (DE) путем культивирования плюрипотентных клеток в среде, дополненной лигандом TGF-B и активатором WNT. В некоторых вариантах осуществления способ in vitro поэтапной дифференцировки плюрипотентных клеток дополнительно содержит дифференцировку клеток DE в клетки кишечной трубки путем культивирования клеток DE в среде, дополненной лигандом FGF. В некоторых вариантах осуществления способ in vitro поэтапной дифференцировки плюрипотентных клеток дополнительно содержит дифференцировку клеток кишечной трубки в задние клетки энтодермы передней кишки путем культивирования клеток кишечной трубки в среде, дополненной ингибитором shh, лигандом FGF, активатором PKC, лигандом TGF-B, ретиноидом и ингибитором BMP. В некоторых вариантах осуществления способ in vitro поэтапной дифференцировки плюрипотентных клеток дополнительно содержит дифференцировку клеток кишечной трубки в задние клетки энтодермы передней кишки путем культивирования клеток кишечной трубки в среде, дополненной ингибитором shh, лигандом FGF, активатором PKC, лигандом TGF-B, ретиноидом и ингибитором BMP. В некоторых вариантах осуществления способ in vitro поэтапной дифференцировки плюрипотентных клеток дополнительно содержит дифференцировку задних клеток энтодермы передней кишки в клетки поджелудочной железы передней кишки путем культивирования задних клеток энтодермы передней кишки в среде, дополненной активатором PKC, ингибитором shh, ретиноидом и ингибитором BMP. В некоторых вариантах осуществления способ in vitro поэтапной дифференцировки плюрипотентных клеток дополнительно содержит дифференцировку клеток поджелудочной железы передней кишки в клетки энтодермы поджелудочной железы путем культивирования поджелудочной железы передней кишки в среде, дополненной ингибитором shh, ингибитором TGF-B и ретиноидом. В некоторых вариантах осуществления способ in vitro поэтапной дифференцировки плюрипотентных клеток дополнительно содержит дифференцировку клеток энтодермы поджелудочной железы в группу бета-клеток поджелудочной железы.
В варианте осуществления по меньшей мере на одной стадии способа in vitro поэтапной дифференцировки плюрипотентных клеток среда далее дополняется аскорбиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления более 10% клеток в дифференцированной группе являются одногормональными инсулинположительными клетками. В некоторых вариантах осуществления более 30% клеток энтодермы поджелудочной железы в культуре, полученной способами данного изобретения, являются PDX-1+, NKX6.1+, SOX2- и CDX2-.
В варианте осуществления изобретение относится к способу in vitro дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека в бета-клетки поджелудочной железы и содержит: а) культивирование недифференцированных эмбриональных стволовых клеток человека в среде, дополненной глюкозой, лигандом TGF-B и активатором WNT, для генерирования группы клеток дефинитивной энтодермы (DE); b) культивирование клеток DE в среде, дополненной глюкозой и лигандом FGF, для генерирования группы клеток кишечной трубки; c) культивирование клеток кишечной трубки в среде, дополненной глюкозой, ингибитором shh, лигандом FGF, активатором PKC, лигандом TGF-B, ретиноидом и градиентом ингибитора BMP, для генерирования группы задних клеток энтодермы передней кишки, экспрессирующих PDX-1 и SOX2; d) культивирование клеток передней кишки в среде, дополненной глюкозой, активатором PKC, ингибитором shh, ретиноидом и ингибитором BMP, для генерирования группы клеток передней кишки поджелудочной железы, экспрессирующих PDX-1 и NKX6.1 и экспрессирующих более низкий уровень SOX2 по сравнению с задними клетками передней кишки; e) культивирование клеток поджелудочной железы передней кишки в среде, дополненной глюкозой, ингибитором shh, ингибитором TGF-B и ретиноидом, для получения группы клеток энтодермы поджелудочной железы, экспрессирующих PDX-1, более высокий уровень NKX6.1 и более низкий уровень SOX2 по сравнению с клетками поджелудочной железы передней кишки; f) дифференцировка клеток энтодермы поджелудочной железы в группу бета-клеток поджелудочной железы. В некоторых вариантах осуществления группа бета-клеток поджелудочной железы, полученная способами данного изобретения, является PDX-1+, NKX6.1+, SOX2- и CDX2-. В некоторых вариантах осуществления среда по меньшей мере в одном этапе способа поэтапной дифференцировки далее дополняется аскорбиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления бета-клетки поджелудочной железы, полученные способами данного изобретения, являются одногормональными инсулин-продуцирующими клетками, у которых также NKX6.1+ и PDX-1+.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
Фиг. 1A-1G содержат гистограмму профилей экспрессии FACS следующих маркеров в S3, день 2 для клеток, дифференцирующихся согласно примеру 1. Фиг. 1A: изотипный контроль; фиг. 1В: хромогранин; фиг. 1C: KI-67; фиг. 1D: NKX6.1; фиг. 1E: SOX2; фиг. 1F: CDX2; фиг. 1G: PDX-1. На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера.
На фиг. 2А-2G показаны профили экспрессии гистограммы FACS следующих маркеров в клетках, дифференцированных согласно примеру 1 и собранных в S4, день 2. Фиг. 2A: изотипный контроль; фиг. 2B: хромогранин; фиг. 2C: KI-67; фиг. 2D: NKX6.1; фиг. 2E: SOX2; фиг. 2F: CDX2; фиг. 2G: PDX-1. На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера.
На фиг. 3А-3G показаны профили экспрессии гистограммы FACS следующих маркеров в клетках, дифференцированных согласно примеру 1 и собранных в S5, день 2. Фиг. 3A: изотипный контроль; фиг. 3B: хромогранин; фиг. 3C: KI-67; фиг. 3D: NKX6.1; фиг. 3E: SOX2; фиг. 3F: CDX2; фиг. 3G: PDX-1. На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера.
На фиг. 4А-4G показаны профили экспрессии гистограммы FACS следующих маркеров в клетках, дифференцированных согласно примеру 1 и собранных в S5, день 7. Фиг. 4A: изотипный контроль; фиг. 4B: хромогранин; фиг. 4C: KI-67; фиг. 4D: NKX6.1; фиг. 4E: SOX2; фиг. 4F: CDX2; фиг. 4G: PDX-1. На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера.
На фиг. 5А-5С изображены профили экспрессии гистограммы FACS следующих маркеров в клетках, дифференцированных согласно примеру 1 и полученных в клетках, собранных в S5, день 2. Фиг. 5A: хромогранин (ось y) и CDX2 (ось x); фиг. 5B: хромогранин (ось y) и SOX2 (ось x); фиг. 5C: хромогранин (ось y) и NKX6.1 (ось x). На каждой гистограмме показан процент совместной экспрессии для каждого графика.
На фиг. 6A-6Т показаны данные анализов ПЦР в реальном времени относительно экспрессии следующих генов в клетках эмбриональных стволовых клеток линии H1 человека, дифференцированных согласно примеру 1 и собранных в S2, S3, S4 и S5. Фиг. 6A: CDX2; фиг. 6B: CD142; фиг. 6C: FOXE1; фиг. 6D: HNF4-alpha; фиг. 6E: NKX2.1; фиг. 6F: NKX2.2; фиг. 6G: NKX6.1; фиг. 6H: OSR1; фиг. 6I: PDX-1; фиг. 6J: PROX1; фиг. 6K: PTF1a; фиг. 6L: SOX17; фиг. 6M: SOX2; фиг. 6N: инсулин; фиг. 6O: ZIC1; фиг. 6P: хромогранин; фиг. 6Q: глюкагон; фиг. 6R: Ngn3; фиг. 6S: NeuroD; фиг. 6T: соматостатин.
На фиг. 7A-7G показаны данные анализов ПЦР в реальном времени относительно экспрессии следующих генов в клетках линии Н1, дифференцированных согласно примеру 2 и собранных в день 3 S2, S3 или S4. Фиг. 7A: NKX6.1; фиг. 7B: PDX-1; фиг. 7C: хромогранин; фиг. 7D: NGN3; фиг. 7E: CDX2; фиг. 7F: альбумин; фиг. 7G: SOX2.
На фиг. 8A-8G показаны данные анализов ПЦР в реальном времени относительно экспрессии следующих маркеров в клетках H1, дифференцированных согласно примеру 3 и собранных в S2, S3, S4 или S5. Фиг. 8A: NKX6.1; фиг. 8B: PDX-1; фиг. 8C: NGN3; фиг. 8D: NeuroD; фиг. 8E: хромогранин; фиг. 8F: CDX2; фиг. 8G: SOX2.
На фиг. 9A-9Н показаны данные анализов ПЦР в реальном времени относительно экспрессии следующих маркеров в клетках H1, дифференцированных согласно примеру 4 и собранных в день 4 S3 и S4. Фиг. 9A: NKX6.1; фиг. 9B: PDX-1; фиг. 9C: хромогранин; фиг. 9D: NGN3; фиг. 9E: NeuroD; фиг. 9F: CDX2; фиг. 9G: альбумин; фиг. 9H: SOX2.
На фиг. 10A-10Н показаны данные анализов ПЦР в реальном времени относительно экспрессии следующих генов в клетках эмбриональных стволовых клеток линии H1 человека, дифференцированных согласно примеру 5 и собранных на этапе 4. Фиг. 10A: NKX6.1; фиг. 10B: PDX-1; фиг. 10C: хромогранин; фиг. 10D: NGN3; фиг. 10E: NeuroD; фиг. 10F: CDX2; фиг. 10G: альбумин; фиг. 10H: SOX2.
На фиг. 11A-11Н показаны данные анализов ПЦР в реальном времени относительно экспрессии следующих генов в клетках эмбриональных стволовых клеток линии H1 человека, дифференцированных согласно примеру 6 и собранных в день 3 S3 или S6. Фиг. 11A: NKX6.1; фиг. 11B: PDX-1; фиг. 11C: хромогранин; фиг. 11D: NGN3; фиг. 11E: NeuroD; фиг. 11F: CDX2; фиг. 11G: альбумин; фиг. 11H: SOX2.
На фиг. 12A-12G показаны данные анализов ПЦР в реальном времени относительно экспрессии следующих генов в клетках эмбриональных стволовых клеток линии H1 человека, дифференцированных согласно примеру 7 и собранных в день 3 S3, S4 или S5. Фиг. 12A: NKX6.1; фиг. 12B: PDX-1; фиг. 12C: хромогранин; фиг. 12D: NGN3; фиг. 12E: NeuroD; фиг. 12F: CDX2; фиг. 12G: SOX2.
На фиг. 13A-13G показаны данные анализов ПЦР в реальном времени относительно экспрессии следующих генов в клетках эмбриональных стволовых клеток линии H1 человека, дифференцированных согласно примеру 8 и собранных в S3, S4, S5 или S6. Фиг. 13A: NKX6.1; фиг. 13B: PDX-1; фиг. 13C: хромогранин; фиг. 13D: NGN3; фиг. 13E: NeuroD; фиг. 13F: CDX2; фиг. 13G: SOX2.
Фиг. 14A-14Р содержат гистограмму профилей экспрессии FACS следующих маркеров в S3, день 4 для клеток, дифференцирующихся согласно примеру 9. Фиг. 14A: изотипный контроль; фиг. 14B: хромогранин; фиг. 14C: KI-67; фиг. 14D: NKX6.1; фиг. 14E: SOX2; фиг. 14F: HNF3B; фиг. 14G: CDX2; фиг. 14H: PDX-1. На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера.
Фиг. 15A-15G содержат гистограмму профилей экспрессии FACS следующих маркеров в S4, день 2 для клеток, дифференцирующихся согласно примеру 9. Фиг. 15A: изотипный контроль; фиг.15B: NKX6.1; фиг. 15C: KI-67; фиг. 15D: хромогранин; фиг. 15E: SOX2; фиг. 15F CDX2; фиг. 15G: PDX-1. На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера.
Фиг. 16A-16F содержат гистограмму профилей экспрессии FACS следующих маркеров в S4, день 4 для клеток, дифференцирующихся согласно примеру 9. Фиг. 16A: изотипный контроль; фиг. 16B: NKX6.1; фиг. 16C: хромогранин; фиг. 16D: SOX2; фиг. 16E: CDX2; фиг. 16F: PDX-1. На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера.
На фиг. 17A-17J показаны данные анализов ПЦР в реальном времени относительно экспрессии следующих генов в клетках эмбриональных стволовых клеток линии H1 человека, дифференцированных согласно примеру 9 и собранных в S1D3, S2D3, S3D4, S4D2 и S4D4. Фиг. 17A: CDX2; фиг. 17B: HHex; фиг. 17C: FOXE1; фиг. 17D: IPF1 (PDX-1); фиг. 17E: NKX2.1; фиг. 17F: NKX2.2; фиг. 17G: NKX6.1; фиг. 17H: PROX1; фиг. 17I: SOX2; фиг. 17J: SOX9.
Фиг. 18A-18G содержат гистограмму профилей экспрессии FACS следующих маркеров в S3, день 3 для клеток, дифференцирующихся согласно примеру 10. Фиг. 18A: изотипный контроль; фиг. 18B: NKX6.1; фиг. 18C: хромогранин; фиг. 18D: SOX2; фиг. 18E: CDX2; фиг. 18F: KI-67; фиг. 18G: PDX-1. На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера.
Фиг. 19A-19G показывают FACS-гистограмму профилей экспрессии следующих маркеров на этапе S4, день 5 у клеток, дифференцированных согласно примеру 10. Фиг. 19A: изотипный контроль; фиг. 19B: NKX6.1; фиг. 19C: хромогранин; фиг. 19D: SOX2; фиг. 19E: CDX2; фиг. 19F: KI-67; фиг. 19G: PDX-1. На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера.
На фиг. 20A-20J показаны данные анализов ПЦР в реальном времени относительно экспрессии следующих генов в клетках эмбриональных стволовых клеток линии H1 человека, дифференцированных согласно примеру 11. Фиг. 20A: соматостатин; фиг. 20B: PDX1; фиг. 20C: Pax6; фиг. 20D: Pax4; фиг. 20E: NKX6.1; фиг. 20F: NGN3; фиг. 20G: глюкагон; фиг. 20H: NeuroD; фиг. 20I: инсулин; фиг. 20J: хромогранин.
На фиг. 21A-21J показаны данные анализов ПЦР в реальном времени относительно экспрессии следующих генов в клетках эмбриональных стволовых клеток линии H1 человека, дифференцированных согласно примеру 12 и собранных в S4, день 2, S5, день 2 и S5, день 9. Фиг. 21A: соматостатин; фиг. 21B: PDX1; фиг. 21C: Pax6; фиг. 21D: Pax4; фиг. 21E: NKX6.1; фиг. 21F: NGN3; фиг. 21G: NeuroD; фиг. 21H: инсулин; фиг. 21I: глюкагон; фиг. 21J: хромогранин.
На фиг. 22A-22L показаны данные анализов ПЦР в реальном времени относительно экспрессии следующих генов в клетках эмбриональных стволовых клеток линии H1, дифференцированных согласно примеру 13 и собранных на S5, день 3. Фиг. 22A: Pax4; фиг. 22B: Pax6; фиг. 22C: PDX1; фиг. 22D: PTF1a; фиг. 22E: глюкагон; фиг. 22F: инсулин; фиг. 22G: NeuroD; фиг. 22H: ngn3; фиг. 22I: Zic1; фиг. 22J: CDX2; фиг. 22K: альбумин; фиг. 22L: NKX6.1.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Для ясности описания, а не для ограничения изобретения, подробное описание изобретения разделено на следующие подразделы, описывающие или иллюстрирующие определенные особенности, варианты осуществления или области применения настоящего изобретения.
Определения
Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяемые как обладающие способностью на одноклеточном уровне к самообновлению и дифференцировке. Стволовые клетки могут производить клетки-потомки, включая самообновляющиеся прогениторные клетки, необновляющиеся прогениторные клетки и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются своей способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных линий из множества зародышевых листков (энтодермы, мезодермы и эктодермы). Стволовые клетки также дают начало тканям множества зародышевых листков после трансплантации и вносят значительный вклад в образование большинства, если не всех тканей после инъекции в бластоцисты.
Стволовые клетки классифицируют по потенциалу развития: (1) тотипотентные, то есть способные преобразоваться в любой из эмбриональных и внеэмбриональных типов клеток; (2) плюрипотентные, то есть способные преобразоваться во все типы эмбриональных клеток; (3) мультипотентные, то есть способные преобразоваться во множество клеточных линий, но в рамках одной ткани, органа или физиологической системы (например, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) могут порождать ГСК (самообновление), олигопотентные ограниченные клетки-предшественники крови и все типы клеток и элементов (например, тромбоциты), являющиеся стандартными составляющими крови); (4) олигопотентные, то есть способные преобразоваться в более ограниченное подмножество клеточных линий, чем мультипотентные стволовые клетки; и (5) унипотентные, то есть способные преобразоваться в единственную клеточную линию (например, сперматогенные стволовые клетки).
Дифференцировка представляет собой процесс, при помощи которого неспециализированная («некоммитированная») или менее специализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, например нервной или мышечной клетки. Дифференцированная клетка или клетка, индуцированная дифференцировкой, представляет собой клетку, взятую на более специализированном («коммитированном») этапе линии развития клетки. Термин «коммитированный» в применении к процессу дифференцировки относится к клетке, которая прошла по пути дифференцировки до того этапа, на котором при нормальных условиях она продолжит дифференцироваться в клетку заданного типа или подмножества типов клеток и при этом не может в нормальных условиях дифференцироваться в клетку другого типа или возвращаться к клетке менее дифференцированного типа. Дедифференцировка относится к процессу, в ходе которого клетка возвращается на менее специализированный (или коммитированный) этап линии развития клетки. Используемый в настоящей заявке термин «линия дифференцировки клетки» определяет наследственность клетки, то есть определяет, из какой клетки произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. В клеточной линии дифференцировки клетка помещается в наследственную схему развития и дифференцировки. Маркером, специфичным для линии дифференцировки, называется характерная особенность, специфически ассоциированная с фенотипом клеток конкретной линии дифференцировки, которая может использоваться для оценки дифференцировки некоммитированных клеток в клетки данной линии дифференцировки.
Используемый в настоящей заявке термин «маркеры» означает молекулы нуклеиновых кислот или полипептидов с дифференциальной экспрессией в интересующих клетках. В данном контексте под дифференциальной экспрессией подразумевается повышение уровня экспрессии для положительного маркера и понижение уровня экспрессии для отрицательного маркера. Поддающийся обнаружению уровень маркерной нуклеиновой кислоты или полипептида в интересующих клетках оказывается значительно выше или ниже по сравнению с другими клетками, что позволяет идентифицировать интересующую клетку и отличить ее от других клеток с помощью любого из множества известных в данной области способов.
В настоящем документе клетка «положительна по» заданному маркеру или «положительна», если заданный маркер обнаруживается в клетке. Аналогично клетка «отрицательна по» заданному маркеру или «отрицательна», если заданный маркер не обнаруживается в клетке.
В настоящем документе «этап 1» и «S1» используются взаимозаменяемо для обозначения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для дефинитивной энтодермы (DE).
«Сформированная энтодерма», как используется в настоящем документе, относится к клеткам, которые несут в себе характеристики клеток, появившиеся из эпибласта во время гаструляции, и которые формируют желудочно-кишечный тракт и его производные. Клетки дефинитивной энтодермы экспрессируют по меньшей мере один из следующих маркеров: HNF3 beta, GATA4, SOX17, CXCR4, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99 и MIXL1.
Выражение «кишечная трубка» в настоящем документе относится к клеткам, полученным из дефинитивной эндодермы, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: HNF3-beta, HNF1-beta или HNF4-alpha. Клетки кишечной трубки могут дать начало всем энтодермальным органам, таким как легкие, печень, поджелудочная железа, желудок и кишечник.
Используемые в настоящем документе взаимозаменяемые выражения «этап 2» и «S2» обозначают клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для примитивной кишечной трубки.
«Энтодерма передней кишки» относится к клеткам энтодермы, которые дают начало пищеводу, легких, желудка, печени, поджелудочной железы, желчного пузыря и части двенадцатиперстной кишки.
«Задняя часть передней кишки» относится к клеткам энтодермы, которые могут дать начало задней части желудка, поджелудочной железы, печени и части двенадцатиперстной кишки.
«Энтодерма средней кишки» относится к клеткам энтодермы, которые могут дать начало кишечнику, частям двенадцатиперстной кишки, аппендикса и восходящей ободочной кишки.
«Энтодерма задней кишки» относится к клеткам энтодермы, которые могут дать начало дистальной трети поперечной ободочной кишки, нисходящей ободочной кишки, сигмовидной кишки и прямой кишки.
Как «этап 3», так и «S3» используются взаимозаменяемо для обозначения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для энтодермы передней кишки. «Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии передней кишки», как используется в настоящем документе, относятся к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX-1, FOXA2, CDX2, SOX2 и HNF4-альфа.
Используемые в настоящем документе взаимозаменяемо «этап 4» и «S4» обозначают клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для предшественника передней кишки поджелудочной железы. Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии предшественника передней кишки поджелудочной железы, как используется в настоящем документе, относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX-1, NKX6.1, HNF6, FOXA2, PTF1a, Prox1 и HNF4-альфа.
В настоящем документе выражения «этап 5» и «S5» используются взаимозаменяемо для обозначения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток энтодермы поджелудочной железы и предшественников эндокринной поджелудочной железы. Выражение «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии энтодермы поджелудочной железы» в настоящем документе относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX1, NKX6.1, HNF1 beta, PTF1 alpha, HNF6, HNF4 alpha, SOX9, HB9 или PROX1. Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии энтодермы поджелудочной железы, не экспрессируют существенно CDX2 или SOX2.
В настоящем документе выражения «этап 6» и «S6» используются взаимозаменяемо для обозначения клеток, обогащенных клетками эндокринной поджелудочной железы.
«Панкреатической эндокринной клеткой», или «клеткой, экспрессирующей гормон поджелудочной железы», или «клеткой, экспрессирующей характеристики эндокринной линии поджелудочной железы» в настоящем документе называется клетка, способная экспрессировать по меньшей мере один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин, грелин и полипептид поджелудочной железы.
Выражение «клетка-предшественник эндокринной поджелудочной железы» или «прогениторная эндокринной поджелудочной железы» относится к клеткам энтодермы поджелудочной железы, обладающим возможностью стать клеткой поджелудочной железы, экспрессирующей гормон. Такая клетка может экспрессировать по меньшей мере один из следующих маркеров: NGN3, NKX2.2, NeuroD, ISL-1, Pax4, Pax6 или ARX.
Выражение «функциональная бета-клетка поджелудочной железы» в настоящем документе относится к одногормональной инсулинположительной клетке, имеющей возможность реагировать на глюкозу и положительной по PDX-1 и NKX6.1.
Используются в настоящем документе взаимозаменяемо «d1», «d 1» и «день 1»; «d2», «d 2» и «день 2»; «d3», «d 3» и «день 3» и так далее. Эти сочетания цифр и букв указывают день инкубации на различных этапах во время поэтапного протокола дифференцировки по данной заявке.
«Аскорбиновая кислота» и «витамин С» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к важному питательному веществу для человека и других видов животных.
«Глюкоза» и «D-глюкоза» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к декстрозе, сахару, обычно встречающемуся в природе.
Клетка, «положительная» по определенному маркеру или обозначаемая как маркер «+» (т.е. PDX-1+), представляет собой клетку, в которой обнаруживается данный маркер. Клетка, «отрицательная» по определенному маркеру или обозначаемая как маркер «-» (т.е. NKX6.1-), представляет собой клетку, в которой маркер не обнаруживается способами, изложенными в данном описании.
В данной заявке «хромогранин» и «CHGN» используются взаимозаменяемо для обозначения гена, кодирующего кислотный секреторный гликопротеин хромогранин.
Используются взаимозаменяемо в настоящем документе выражения «NeuroD» и «NeuroD1», обозначающие белок, экспрессируемый в клетках-прогениторах эндокринной поджелудочной железы, и ген, кодирующий его.
Используются взаимозаменяемо в настоящем документе выражения «LDN» и «LDN-193189», обозначающие ингибитор рецептора BMP, выпускаемый Stemgent, Калифорния, США.
Выделение, размножение и культивирование полипотентных стволовых клеток
Плюрипотентные стволовые клетки могут экспрессировать один или более стадийно-специфичных эмбриональных антигенов (SSEA) 3 и 4, а также маркеры, определяемые антителами, обозначенными как Tra-1-60 и Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282:1145, 1998). Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток in vitro приводит к потере экспрессии SSEA-4, Tra-1-60 и Tra-1-81. Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки, как правило, имеют щелочно-фосфатазную активность, которую можно обнаружить путем обработки клеток 4%-м параформальдегидом, а затем выращивая с Vector Red в качестве субстрата, как описано производителем (Vector Laboratories, штат Калифорния, США). Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки также, как правило, экспрессируют OCT4 и TERT, определяемые с помощью ПЦР в реальном времени.
Другим желательным фенотипическим свойством выращенных плюрипотентных стволовых клеток является потенциал дифференцировки в клетки всех трех зародышевых листков: в эндодермальные, мезодермальные и эктодермальные ткани. Плюрипотентность стволовых клеток может быть подтверждена, например, путем инъекции клеток мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), обработкой всех образующихся тератом 4%-м раствором параформальдегида, а затем гистологическим исследованием на наличие типов клеток из трех зародышевых листков. В качестве альтернативы плюрипотентность можно определить по созданию эмбриоидных телец и анализа их на предмет присутствия маркеров, ассоциирующихся с тремя зародышевыми листками.
Выращенные линии плюрипотентных стволовых клеток могут быть кариотипированы с применением стандартного способа окрашивания с использованием красителя Гимза (G-banding) и сравнения с опубликованными кариотипами соответствующих видов приматов. Желательно получить клетки, имеющие «нормальный кариотип», т.е. эуплоидные клетки, в которых все человеческие хромосомы присутствуют и не имеют видимых изменений. Плюрипотентные клетки могут быть легко размножены в культуре путем использования различных питательных слоев или с помощью сосудов, покрытых белковой матрицей. Кроме того, химически определенные поверхности в сочетании с определенными средами, такими как среды mTesr™ 1 (StemCell Technologies, Ванкувер, Канада), могут использоваться для обычного накопления клеток. Плюрипотентные клетки могут быть легко удалены из чашек с культурой при помощи ферментативной, механической обработки или с использованием различных кальцийхелатирующих агентов, таких как EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота). Кроме того, плюрипотентные клетки могут быть накоплены в суспензии в отсутствии каких-либо матричных белков или питательного слоя.
Источники плюрипотентных стволовых клеток
Среди типов плюрипотентных стволовых клеток, которые могут использоваться, могут быть устойчивые линии плюрипотентных клеток, полученных из тканей, образующихся после беременности, в том числе преэмбриональная ткань (такая как, например, бластоцист), эмбриональная ткань или ткань плода, взятая в любой момент во время беременности, как правило, но не обязательно перед сроком приблизительно от 10 до 12 недель беременности. Неограничивающими примерами являются устойчивые линии эмбриональных стволовых клеток человека (ЭСК) или эмбриональные зародышевые клетки человека, такие как, например, эмбриональные стволовые клетки человека линий H1, H7 и H9 (WiCell Research Institute, Мэдисон, Висконсин, США). Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки, взятые из популяции плюрипотентных стволовых клеток, уже культивированных в отсутствие питающих клеток. Также пригодными являются индуцибельные плюрипотентные клетки (IPS) или перепрограммированные плюрипотентные клетки, которые могут быть получены из взрослых соматических клеток с помощью принудительной экспрессии ряда факторов, относящихся к плюрипотентным транскрипционным факторам, таким как OCT4, Nanog, Sox2, KLF4 и ZFP42 (Annu Rev Genomics Hum Genet, 2011, 12:165-185). Эмбриональные стволовые клетки человека, используемые в способах данного изобретения, также могут быть подготовлены, как описано Thomson и др. (патент U.S. № 5843780; Science, 1998, 282:1145; Curr. Top. Dev. Biol., 1998, 38:133; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1995: 92:7844).
Формирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, из плюрипотентных стволовых клеток
Характеристики плюрипотентных стволовых клеток хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных характеристик плюрипотентных стволовых клеток. К маркерам плюрипотентных стволовых клеток относится, например, экспрессия одного или нескольких следующих маркеров: ABCG2, CRIPTO, FOXD3, Connexin43, Connexin45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81.
К плюрипотентным стволовым клеткам, которые могут использоваться в настоящем изобретении, относятся, например, человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H9 (код NIH: WA09), человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H1 (код NIH: WA01), человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H7 (код NIH: WA07) и человеческие эмбриональные стволовые клетки линии SA002 (Cellartis, Швеция). Также для использования в рамках настоящего изобретения подходят клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров, характерных для плюрипотентных клеток: ABCG2, cripto, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81.
Маркеры, характерные для сформированной линии энтодермы, выбираются из группы, содержащей SOX17, GATA4, HNF3 beta, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-подобный гомеобоксовый белок, FGF4, CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 и Otx2. Подходит для использования в настоящем изобретении клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии сформированной эндодермы. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, представляет собой клетку-предшественник первичной полоски. В другом аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, представляет собой мезэндодермальную клетку. В другом аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, представляет собой клетку сформированной эндодермы.
Маркеры характерные для линии энтодермы поджелудочной железы, выбираются из группы, содержащей PDX1, NKX6.1, HNF1 beta, PTF1 alpha, HNF6, HNF4 alpha, SOX9, HB9 и PROX1. Подходит для использования в настоящем изобретении клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии панкреатической эндодермы. В одном из аспектов данного изобретения экспрессируемые клеткой маркеры, характерные для линейки панкреатической энтодермы, представляют собой клетки панкреатической энтодермы, в которых экспрессия PDX-1 и NKX6.1 значительно превышает экспрессию CDX2 и SOX2.
Маркеры, характерные для линии эндокринной поджелудочной железы, выбираются из группы, состоящей из NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, ARX, NKX2.2 и PAX6. В одном варианте осуществления панкреатическая эндокринная клетка способна к экспрессии по меньшей мере одного из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид. Соответствующей целям настоящего изобретения является клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, представляет собой панкреатическую эндокринную клетку. Панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую клетку, экспрессирующую гормоны. В альтернативном варианте осуществления панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую клетку, секретирующую гормоны.
В одном аспекте настоящего изобретения панкреатическая эндокринная клетка представляет собой клетку с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцировки β-клеток. Клетка с экспрессией маркеров, характерных для линии β-клеток, экспрессирует PDX1 и по меньшей мере один из следующих транскрипционных факторов: NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3 beta, MAFA, PAX4 и PAX6. В одном аспекте настоящего изобретения клетка с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцировки β-клеток, представляет собой β-клетку.
Настоящее изобретение описывает способ in vitro и группу клеток, обладающую возможностью генерировать одногормональные инсулинположительные клетки, которые также являются PDX-1- и NKX6.1-положительными. Способ, используемый в настоящем изобретении, включает в себя ряд этапов, которые поэтапно направляют дифференцировку плюрипотентных клеток человека в одногормональные клетки при помощи следующих промежуточных этапов:
а) получение клеток дефинитивной энтодермы (DE) из недифференцированных эмбриональных стволовых клеток человека, содержащее культивирование плюрипотентных клеток в среде, содержащей глюкозу, лиганд TGF-B и активатор WNT;
b) дифференцировка клеток DE в клетки кишечной трубки, содержащая культивирование клеток DE в среде, содержащей глюкозу, витамин С и лиганд FGF;
c) дифференцировка клеток кишечной трубки в клетки энтодермы задней части передней кишки, экспрессирующие PDX-1 и SOX2. Данная дифференцировка достигается путем культивирования клеток кишечной трубки в присутствии ингибитора shh, ингибитора BMP, лиганда TGF-B, лиганда FGF, ретиноевой кислоты, витамина С и активатора PKC;
d) дифференцировка клеток задней части передней кишки в клетки передней кишки поджелудочной железы, экспрессирующие PDX-1 и NKX6.1 и экспрессирующие более низкий уровень SOX2 по сравнению с клетками задней части передней кишки. Данная дифференцировка достигается путем культивирования клеток задней части передней кишки в присутствии ингибитора shh, ингибитора BMP, малой дозы ретиноевой кислоты, витамина С и активатора PKC;
е) дифференцировка клеток передней кишки поджелудочной железы в клетки энтодермы поджелудочной железы, экспрессирующие PDX-1, более высокий уровень NKX6.1 и более низкий уровень SOX2 по сравнению с клетками передней кишки поджелудочной железы. Дифференцировка достигается путем культивирования клеток передней кишки поджелудочной железы в среде, дополненной ингибитором shh, ингибитором TGF-B, малой дозы ретиноевой кислоты и витамина С;
f) дифференцировка клеток энтодермы поджелудочной железы в клетки-предшественники эндокринной поджелудочной железы и далее в одногормональные эндокринные клетки поджелудочной железы. Дифференцировка достигается путем культивирования клеток энтодермы поджелудочной железы в среде, обогащенной ингибитором shh, малой дозой ретиноевой кислоты и витамином С.
В варианте осуществления клетки на всех стадиях поэтапной дифференцировки культивируются в составе среды, содержащем менее 25 мМ глюкозы. В некоторых вариантах осуществления концентрация глюкозы находится в диапазоне от около 8 до около 20 мМ глюкозы.
В некоторых вариантах осуществления составы среды, используемой для генерирования клеток стадии кишечной трубки и всех последующих стадий, содержат аскорбиновую кислоту (также известную как витамин С). В варианте осуществления концентрация аскорбиновой кислоты составляет от около 0,01 до около 1 мМ. В варианте осуществления концентрация аскорбиновой кислоты составляет от около 0,1 до около 0,5 мМ.
Настоящее изобретение, кроме того, иллюстрируется среди прочих следующими примерами.
Пример 1
Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека из клеток линии H1 в клетки-предшественники эндокринной поджелудочной железы в отсутствии сыворотки плода коровы; модуляция BMP/TGF-B-путей дифференцировки приводит к улучшению производства группы клеток энтодермы поджелудочной железы и снижает процент содержания группы клеток SOX2+
Этот пример был приведен, чтобы показать, что культуры энтодермы поджелудочной железы могут быть получены с весьма высокими уровнями экспрессии PDX-1 и NKX6.1, которые имеют при этом низкий уровень экспрессии CDX2 и SOX2.
Клетки эмбриональных стволовых клеток человека линии H1 (hESC H1) были собраны после нескольких пересевов (пересевы 40-52) и были посеяны как единичные клетки при плотности 100 000 клеток/см2 на покрытых MATRIGEL™ (разведение 1:30; BD Biosciences, Нью-Джерси, США) чашках в средах mTeSR®1 (StemCell Technologies, Ванкувер, Канада), дополненных 10 мкМ Y27632 (Rock inhibitor, номер по каталогу Y0503, SigmaAldrich, Монтана, США). Спустя 48 часов после посева культур были промыты и инкубированы в неполном солевом растворе PBS (фосфат-буферном солевом растворе без Mg или Ca) в течение приблизительно 30 секунд. Культуры были дифференцированы в линию эндокринной поджелудочной железы следующим образом.
a. Этап 1 (сформированная энтодерма (DE) - 3 дня). Клетки были культивированы на протяжении 1 дня в среде стадии 1: среда MCDB-131 (номер по каталогу 10372-019, Invitrogen, Калифорния, США), дополненная 0,1% не содержащего жирных кислот BSA (номер по каталогу 68700, Proliant, IA, США), бикарбоната натрия 0,0012 г/мл (номер по каталогу S3187, SigmaAldrich, MO, США), 1X GlutaMax™ (номер по каталогу 35050-079, Invitrogen), 5 мM D-глюкозы (номер по каталогу G8769, SigmaAldrich, MO, США), содержащие 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems, Миннесота, США) и 1 мкM состава MCX (ингибитор GSK3B, 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазотерацикло[19.3.1.1~2,6~.1~8, 12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонен-16-он, заявка на патент США, серийный номер 12/494789; включено в настоящий документ путем ссылки в полном объеме). Клетки затем культивировали на протяжении 1 дня в среде MCDB-131, обогащенной 0,1% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 100 нМ состава MCX. Клетки затем культивировали на протяжении 1 дня в среде MCDB-131, к которой было добавлено 0,1% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b. Этап 2 (первичная кишечная трубка - 2 дня). Клетки этапа 1 обрабатывались два дня средой MCDB-131, обогащенной 0,1% не содержащего жирных кислот BSA, бикарбонатом натрия 0,0012 г/мл, 1X GlutaMax ™, 5 мМ D-глюкозы и 25 нг/мл FGF7.
c. Этап 3 (передняя кишка - 2 дня). Клетки этапа 2 были культивированы на протяжении 1 дня в среде стадии 3: среда MCDB-131, дополненная разбавленным 1:200 ITS-X (Invitrogen), 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, бикарбоната натрия 0,0015 г/мл, 2% не содержащего жирных кислот BSA, 25 нг/мл FGF7, 10 нг/мл активина A (R&D systems), 0,25 мкМ SANT-1 (ингибитор shh, SigmaAldrich), 1 мкM ретиноевой кислоты (RА) (SigmaAldrich) и 200 нМ TPB (активатора PKC; номер по каталогу 565740; EMD, Нью-Джерси, США), содержащего 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; номер по каталогу 04-0019; Stemgent, Калифорния, США). Затем клетки культивировали в течение еще одного дня в среде этапа 3 с добавлением 10 нМ LDN-193189.
D. Этап 4 (панкреатическая клетка-предшественница передней кишки - 2 дня). Клетки этапа 3 были культивированы в течение двух дней в среде MCDB-131, обогащенной разведенной 1:200 ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, бикарбонатом натрия 0,0015 г/мл, 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,25 мкМ SANT-1, 50 нМ RА, 200 нМ TPB и 50 нМ LDN-193189.
E. Этап 5 (панкреатическая энтодерма, 2-7 дней). Клетки этапа 4 были культивированы в течение 2-7 дней в среде MCDB-131, обогащенной разведенной 1:200 ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, бикарбонатом натрия 0,0015 г/мл, 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,25 мкМ SANT-1 и 50 нМ RА.
На указанных этапах образцы были собраны и проанализированы с помощью ПЦР в реальном времени, иммуногистохимически или флуоресцентно-активированной сортировкой клеток (FACS).
Для анализа FACS клетки, полученные из hESC, были выпущены в суспензию отдельных клеток путем инкубации в TrypLE Express (номер по каталогу 12604, Invitrogen) при 37°C в течение 3-5 минут. Клетки были затем промыты дважды в окрашивающем буферном растворе (PBS, содержащий 0,2% свободного от жирных кислот BSA) (номер по каталогу 554657, BD Biosciences, Нью-Джерси, США). Для окрашивания внутриклеточных антител клетки сначала инкубировали в течение 20 минут при температуре 4°C зеленым флуоресцентным красителем клеток ЖИВОЙ/МЕРТВЫЙ (Invitrogen, номер по каталогу L23101), чтобы дать возможность разделить живые/мертвые клетки во время анализа, за которым следовала одна промывка в холодном PBS. Клетки были обработаны в 250 мкл буферного раствора Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, номер по каталогу 554722) в течение 20 минут при температуре 4°C, за которой следовало две промывки в буферном растворе BD Perm/Wash (BD Biosciences, номер по каталогу 554723). Клетки были повторно взвешены до состояния суспензии в 100 мкл окрашивающего/блокирующего раствора, состоящего из буферного раствора Perm/Wash, дополненного 2% нормальной сыворотки (из соответствующих видов вторичных антител). Клетки затем инкубировали в течение 30 минут при температуре 4°C первичными антителами в эмпирически предварительно определенных разведениях, за которым следовало две промывки в буферном растворе Perm/Wash. Наконец, клетки инкубировали с соответствующими вторичными антителами в течение 30 минут при температуре 4°C, за которым следовало две промывки буферным раствором Perm/Wash перед анализами на BD FACS Canto II.
Были использованы следующие разведения первичных антител: кроличий антиинсулин (1:100; номер по каталогу C27C9; Cell Signaling, Mассачусетс, США), мышиный антиинсулин (1:100; номер по каталогу ab6999, Abcam, Массачусетс, США), мышиный антиглюкагон (1:1250; номер по каталогу G2654; Sigma-Aldrich), кроличий антисинаптофизин (1:100; номер по каталогу A0010, Dako, Калифорния, США), кроличий антихромогранин А (1:800; Dako), мышиный анти-NKX6.1 (1:50; DSHB, Университет штата Айова, Айова, США), мышиный анти-CDX2 (1:250; Invitrogen), козий анти-NeuroD (1:500; R&D Systems), мышиный анти-SOX2 (BD, Калифорния, США), мышиный анти-NKX2.2 (DSHB), мышиный анти-Pax6 (BD, Калифорния, США), мышиный анти-PDX-1 (BD, Калифорния, США). Вторичные антитела использовались в следующих разведениях: козий антимышиный Alexa 647 (1:500; Invitrogen), козий антикроличий PE (1:200; Invitrogen), ослиный антикозий (1:800; Invitrogen). Пробы инкубировали в течение 30 минут при 4°С после добавления вторичных антител с последующим заключительным промыванием в буферном растворе Perm/Wash. Клетки анализировали на BD FACS Canto II с использованием программного обеспечения BD FACS Diva с получением по меньшей мере 30 000 событий.
На фиг. 1A-1G изображены профили экспрессии гистограмм FACS изотипного контроля (фиг. 1А), хромогранина (фиг. 1В), клеток KI-67 (фиг. 1С), NKX6.1 (фиг. 1D), SOX2 (фиг. 1E), CDX2 (фиг. 1F), PDX-1 (фиг. 1С), дифференцированных в соответствии с примером 1 и проанализированных на S3, день 2. На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера. На 2-й день этапа 3 более 95% клеток были положительными по экспрессии PDX-1 (фиг. 1G) и около 60% клеток в группе были положительными по экспрессии SOX2 (фиг. 1E), в то время как менее 10% клеток были положительными по экспрессии CDX2 (фиг. 1F) или NKX6.1 (фиг. 1D) или хромогранина (фиг. 1В). Значительный процент клеток на этапе 3 был в активном клеточном цикле, как показывает высокий процент клеток, положительных по KI-67 (фиг. 1C).
На фиг. 2A-2G изображены профили экспрессии изотипного контроля (фиг. 2А), хромогранина (фиг. 2В), клеток KI-67 (фиг. 2С), NKX6.1 (фиг. 2D), SOX2 (фиг. 2E), CDX2 (фиг. 2F), PDX-1 (фиг. 2G) согласно определению окрашиванием FACS, клеток, дифференцированных в соответствии с примером 1 и собранных в день 2 на S4. На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера. Аналогично этапу 3 более 95% клеток были положительны по экспрессии PDX-1 (фиг. 2G), в то время как около 10% клеток были положительны по экспрессии CDX2 (фиг. 2F) и около 40% клеток были положительны по экспрессии NKX6.1 (фиг. 2D). Около 45% клеток были положительны по экспрессии SOX2 (фиг. 2Е), снижение с 60% на S3. Экспрессия хромогранина была равна приблизительно 3% (фиг. 2В). Значительный процент клеток на этапе 4 был в активном клеточном цикле, как показывает высокий процент клеток, положительных по KI-67 (фиг. 2C).
Фиг. 3А-3G иллюстрируют относительные профили экспрессии, определенные анализами клеток FACS, полученных на 2-й день этапа 5 в соответствии с протоколом дифференцировки, описанным в настоящем примере. Фиг. 3A: изотипный контроль; фиг. 3B: хромогранин; фиг. 3C: KI-67; фиг. 3D: NKX6.1; фиг. 3E: SOX2; фиг. 3F: CDX2; фиг. 3G: PDX-1. На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера. Аналогично этапам 3 и 4 более 95% клеток были положительны по экспрессии PDX-1, в то время как около 10% клеток были положительны по экспрессии CDX2 и около 67% клеток были положительны по экспрессии NKX6.1. Экспрессия SOX2 в приблизительно 50% была ниже по сравнению с этапом 3, но аналогична его экспрессии на S4.
На фиг. 4А-4G изображена экспрессия PDX-1 (фиг. 4G), NKX6.1 (фиг. 4D), CDX2 (фиг. 4F), SOX2 (фиг. 4E), Ki-67 (маркер распространения, фиг. 4С) и хромогранина (панэндокринный маркер, фиг. 4В) по измерению путем FACS-окрашивания клеток, собранных и проанализированных на 7-й день этапа 5 дифференцировки в соответствии с протоколом, описанным в настоящем примере. Как и на этапе 3 и 4, >90% клеток были положительными по экспрессии PDX-1, в то время как экспрессия CDX2 была менее 10%, а экспрессия NKX6.1 значительно возросла до >70%, при этом экспрессия SOX2 резко снизилась до около 2%.
Кроме того, большинство клеток, экспрессирующих SOX2, CDX2 и NKX6.1, были отрицательными по экспрессии хромогранина (см. фиг. 5А-5С). Таким образом, культуры S5, полученные в соответствии с протоколом, описанным в настоящем примере, позволяют получить группу клеток, в которой по меньшей мере 50% клеток экспрессируют PDX-1 и NKX6.1, проявляя при этом отрицательность по CDX-2, SOX2 и хромогранину. В таблице I дана сводка процента экспрессии различных маркеров энтодермы на этапах с S3 по S5.
Таблица I
Средняя экспрессия маркеров энтодермы на этапах от S3 до S5
Итого* % PDX-1+ % PDX-1+ и SOX2+ % PDX-1+ NKX6.1+ и SOX2- % PDX-1+ CDX2+ % PDX-1+ NKX6.1+ SOX2+
Стадия 3
2 дня		 7 96 60 0 <5 0
Стадия 4
2 дня		 9 97 45 ~40 <5 <5
Стадия 5
2 дня		 11 95 50 ~42 <10 <25
Стадия 5
7 дней		 16 92 <2 ~70 <5 <2
*Общее количество дней с начала дифференцировки.
На фиг. 6А-6T изображены профили экспрессии мРНК, измеренные с помощью ПЦР в реальном времени для клеток на S2, S3, S4 и S5, дифференцированных в соответствии с протоколом, изложенным в настоящем примере, и отраженных в отчете как обладающих многократным изменением экспрессии по сравнению с недифференцированными клетками H1. На этапе 3 была очень низкая экспрессия маркеров передней части передней кишки, таких как FOXe1 (фиг. 6C) и NKX2.1 (фиг. 6E). Тем не менее на стадии 3 SOX2 (фиг. 6M) и OSR1 (фиг. 6H), которые являются маркерами участка желудка на кишечной трубке, значительно повысили степень своего регулирования, а их экспрессия снизилась на этапах S4-S5. Маркеры энтодермы поджелудочной железы, такие как PTF1a (фиг. 6К), NKX6.1 (фиг. 6G) и PDX-1 (фиг. 6I), достигли максимальных уровней экспрессии на этапе культуры S5, день 2. Данные ПЦР свидетельствуют, что на стадии 3 клетки выходят из группы PDX-1+ SOX2+, становясь PDX-1+ NKX6.1+ SOX2- CDX2- на этапах S4-S5. (См. фиг. 6I, 6G, 6M и 6A.) Экспрессия эндокринных маркеров (хромогранин, инсулин, глюкагон и соматостатин) достигла максимального уровня экспрессии в конце этапа S5. Экспрессия маркеров предшественников эндокринной поджелудочной железы, NKX2.2, NeuroD и NGN3, достигла максимального уровня экспрессии на этапах S4-S5. Экспрессия маркеров других линий дифференцировки, таких как ZIC1 и SOX17, оставалась на низком уровне на этапах S4-S5.
В заключение клетки на этапе 5, день 2, которые были дифференцированы в соответствии с протоколом, изложенным в настоящем примере, экспрессируют низкие уровни CDX2 и SOX2, сохраняя высокий уровень экспрессии NKX6.1 и PDX-1. Считается, что уникальное сочетание своевременного ингибирования BMP, использование малых доз кислоты RА на этапах S4-S5, использование высокого содержания глюкозы на этапах S1-S2 позволяют получить группу клеток, описанных в примере 1.
Пример 2
Влияние ингибирования BMP и активации PKC на экспрессию SOX2 на этапах S3-S4
Протокол, изложенный в данном примере, был реализован с целью выяснить влияние ингибирования BMP, добавления FGF7 вместе с активацией PKC на экспрессию SOX2 на этапах S3-S4.
Клетки эмбриональных стволовых клеток человека линии Н1 были собраны после нескольких пересевов (пересевы 40-52) и были посеяны как единичные клетки при плотности 100 000 клеток/см2 на покрытых MATRIGEL™ (разведение 1:30) чашках в среде mTesr™1, обогащенной 10 мкМ Y27632. Через 48 часов после посева культуры были дифференцированы в клетки эндокринной линии поджелудочной железы следующим образом.
a. Этап 1 (сформированная энтодерма (DE) - 3 дня). Перед началом DE культуры промыли и инкубировали неполным раствором PBS (без Mg или Ca) в течение 30 секунд с последующим добавлением сред этапа 1. Эмбриональные стволовые клетки человека, культивируемые в чашках, покрытых MATRIGEL™, обрабатывали средой MCDB-131, обогащенной 0,1% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™ и 2,5 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 1,5 мкM состава MCX (ингибитора GSK3B) в течение одного дня. Клетки затем обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% не содержащего жирных кислот BSA, бикарбонатом натрия 0,0012 г/мл, 1X GlutaMax™, 2,5 мМ глюкозы и 100 нг/мл GDF8 в дни 2-3.
b. Этап 2 (первичная кишечная трубка - 3 дня). Клетки этапа 1 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% не содержащего жирных кислот BSA, бикарбонатом натрия 0,0012 г/мл, 1X GlutaMax ™, 2,5 мМ D-глюкозы и 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней.
c. Этап 3 (передняя кишка - 3 дня). Клетки этапа 2 обрабатывали средой MCDB131, обогащенной ITs-X в разведении 1:200, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,25 мкM SANT-1, 20 нг/мл активина A, 2 мкM кислоты RА в присутствии или отсутствии 50 нг/мл FGF7, 50 или 200 нМ LDN-193189 и/или 200 нМ TPB. Клетки инкубировали в течение трех дней в среде с использованием сочетаний, перечисленных в таблице II ниже.
Таблица II
Этап 3. Обработки
Обработка AA FGF7 LDN-193189 SANT Отталкивающий агент (ОА) TPB
1 + + 200 нМ+ + + -
2 + + - + + -
3 + - - + + -
4 + + - + + +
5 + - - + + +
6 + + 50 нм + + -
D. Этап 4 (панкреатическая клетка-предшественница передней кишки - 3 дня). Клетки этапа 3 обрабатывали средой MCDB131, обогащенной разбавленным 1:200 ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1x GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,25 мкM SANT-1, 200 нМ TPB, 400 нМ LDN-193189, 2 мкM ингибитора ALk5 (SD-208, описанного в Molecular Pharmacology 2007, 72:152-161) и 100 нМ ингибитора CYP26A (N-{4-[2-этил-1-(1H-1,2,4-триазол-1-ил)бутил]фенил}-1,3-бензотиазол-2-амин, Janssen, Бельгия) в течение трех дней.
мРНК была собрана на этапах S2-S4 при всех перечисленных выше условиях и проанализирована с помощью ПЦР в реальном времени. Контрольные условия на этапе S3 относятся к культурам, где FGF7, АА, SANT, RА и 200 нМ LDN-193189 были использованы в концентрациях, перечисленных на этапе свыше. Как видно по данным ПЦР, приведенным на фиг. 7А-7G, удаление LDN-193189 на этапе S3 привело к значительному снижению эндокринных маркеров, таких как NGN3 (фиг. 7D), и панэндокринного маркера, такого как хромогранин (см. фиг. 7С). Добавление активатора PKC и удаление LDN-193189 на этапе S3 еще больше понизило эндокринные маркеры при одновременном повышении экспрессии NKX6.1 (см. фиг. 7A-7G). Кроме того, добавление 50 нМ LDN-193189 было так же эффективно, как и 200 нМ LDN-193189, для индукции эндокринных маркеров (хромогранин и NGN3). Удаление LDN-193189 и добавление TPB на этапе S3 повысило экспрессию CDX2 (фиг. 7Е) и альбумина (фиг. 7F), подавляя экспрессию SOX2 (фиг. 7G). Кроме того, удаление как FGF7, так и LDN-193189 значительно усилило экспрессию SOX2 (фиг. 7G) и ослабило экспрессию альбумина (фиг. 7F) по сравнению с культурами, где LDN-193189 был удален, а FGF7 был сохранен. Эти данные показывают, что точная модуляция ингибирования BMP, активация FGF и активация PKC могут позволить получить отдел энтодермы, который богат PDX-1 и NKX6.1, но имеет низкий CDX2, SOX2 и альбумин. Наконец, устойчивое ингибирование BMP на этапах S3-S4 усилило экспрессию проэндокринных генов и повысило регулируемость экспрессии SOX2. Это указывает на то, что ингибирование BMP требуется подбирать точно, чтобы увеличить гены эндокринной поджелудочной железы, в то же время не повышая регуляции экспрессии SOX2, которая отсутствует или низка при развитии поджелудочной железы, но присутствует в органах передней части энтодермы передней кишки, таких как желудок.
Пример 3
Раннее ингибирование BMP на этапе передней кишки требуется для последующего индуцирования эндокринных маркеров
Этот пример показывает, что раннее ингибирование сигнализации BMP на этапе S3 требуется для последующего индуцирования эндокринных маркеров. В то же время устойчивое ингибирование BMP на этапе 3 также приводит к сильной экспрессии SOX2. Чтобы получить как высокую экспрессию эндокринных маркеров, так и низкую экспрессию SOX2, потребовался градиент ингибирования BMP для индуцирования пропанкреатических эндокринных маркеров при одновременной низкой экспрессии SXO2 и CDX2.
Клетки эмбриональных стволовых клеток человека линии Н1 различных пересевов (пересевы 40-52) были посеяны как единичные клетки при плотности 100 000 клеток/см2 на покрытых MATRIGEL™ (разведение 1:30) чашках в среде mTesr™1, обогащенной 10 мкМ Y27632. Через сорок восемь часов после посева культуры были дифференцированы в клетки линии панкреатических эндокринных клеток следующим образом.
a. Этап 1 (сформированная энтодерма (DE) - 4 дня). Перед началом DE клетки были промыты и инкубированы с помощью неполного PBS (без Mg или Ca) в течение 30 секунд, после чего была проведена инкубация в среде S1. Человеческие эмбриональные стволовые клетки, культивированные как отдельные клетки на чашках, покрытых средой MATRIGEL™, в течение одного дня обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 2,5 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8, 1,5 мкM смеси MCX (ингибитор GSK3B). Затем клетки в течение двух дней обрабатывались (дни 2-4) средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 2,5 мМ глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b. Этап 2 (первичная кишечная трубка - 3 дня). Клетки этапа 1 обрабатывались в течение трех дней средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 2,5 мМ D-глюкозы и 50 нг/мл FGF7.
c. Этап 3 (передняя кишка - 3 дня). Клетки этапа 2 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 мкM SANT-1, 20 нг/мл активина A, 2 мкM RA, 50 нг/мл FGF7, 100 нМ LDN-193189 (только в день 1 или только в течение этапа 3) и 200 нМ TPB. У некоторых культур LDN-193189 был удален из этапа 3.
D. Этап 4 (панкреатическая клетка-предшественница передней кишки - 3 дня). Клетки этапа 3 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 мкM SANT-1, 100 нМ TPB, 200 нМ LDN-193189, 2 мкM ингибитора ALk5 и 100 нМ ингибитора CYP26A в течение трех дней.
E. Этап 5 (панкреатическая энтодерма/эндокрин - 4 дня). Клетки этапа 4 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 200 нМ LDN-193189 и 2 мкM ALk5 в течение четырех дней.
Как показывают результаты ПЦР на фиг. 8A-8G, удаление LDN-193189 (ингибитора BMP) из этапа 3 отменяет экспрессию проэндокринных генов NGN3 (фиг. 8C); NeuroD (фиг. 8D); хромогранин (фиг. 8E) на этапах 4 и 5. Тем не менее экспрессия PDX-1 (фиг. 8B) и NKX6.1 (фиг. 8A) незначительно снижается по сравнению с NGN3 и NeuroD на этапах 4 и 5. Также полное удаление LDN-193189 на этапе 3 приводит к значительному увеличению экспрессии CDX2 (фиг. 7F). Добавление LDN-193189 в течение первого дня этапа 3, после чего он удаляется в день 2-3 этапа 3, значительно повышает экспрессию NGN3 и NeuroD, в то же время уменьшая экспрессию CDX2 и SOX2 на этапе 4. Культуры, в которых LDN-193189 был сохранен в течение этапа 3, показали очень высокую экспрессию SOX2 (фиг. 8G) при S3-S4. Эти данные показывают, что ингибирование BMP в день 1 этапа 3 достаточно для запуска панкреатических эндокринных маркеров, в то же время подавляя экспрессию SOX2 и CDX2.
Подводя итоги, ингибирование BMP требуется в день 1 этапа 3, чтобы вызвать образование эндокринных клеток-предшественников на этапах 4 и 5 и поддерживать экспрессию PDX-1 и NKX6.1, в то же время подавляя экспрессию SOX2. Также добавление PKC активатора на этапе 3 также повышает экспрессию PDX-1 и NKX6.1.
Пример 4
Ингибирование BMP сигнализации в день 1 этапа 3 достаточно для генерирования панкреатических клеток-предшественниц на этапе 4, тогда как ингибирование BMP-сигнализации в последний день этапа 3 приводит к значительно меньшей экспрессии эндокринных маркеров
Этот пример показывает, что раннее ингибирование BMP сигнализации на этапе 3 обеспечивает индукцию маркеров панкреатических эндокринных клеток-предшественниц, при этом ингибирование BMP сигнализации позднее на этапе 3 значительно уменьшает уровень экспрессии маркеров эндокринных клеток-предшественниц на этапе 4.
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 в различных каналах (от канала 40 до канала 52) были посеяны как отдельные клетки с плотностью 100 000 клеток/см2 на покрытых MATRIGEL™ (1:30 раствор) чашках в среде mTesr™1, обогащенной 10 мкM Y27632. Через сорок восемь часов после посева культуры были дифференцированы в клетки линии панкреатических эндокринных клеток следующим образом.
a. Этап 1 (сформированная энтодерма (DE) - 4 дня). Перед началом DE культуры были промыты и инкубированы при помощи неполной PBS (без Mg или Ca) в течение 30 секунд, после чего произошло добавление среды этапа 1. Человеческие эмбриональные стволовые клетки, культивированные как отдельные клетки на чашках, покрытых средой MATRIGEL™, обрабатывались в течение одного дня средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 2,5 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 1,5 мкM смеси MCX (ингибитор GSK3B). Затем клетки обрабатывались в течение трех дней средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 2,5 мМ глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b. Этап 2 (первичная кишечная трубка - 3 дня). Клетки этапа 1 обрабатывались в течение трех дней MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 2,5 мМ D-глюкозы и 50 нг/мл FGF7.
c. Этап 3 (передняя кишка - 3 дня). Клетки этапа 2 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 мкM SANT-1, 50 нг/мл FGF7, 2 мкM RA и сочетаниями, указанными в таблице III ниже, в течение трех дней.
Таблица III
Этап 3. Обработки
20 нг/мл AA LDN-193189 1 мкM ингибитор Alk5 (смесь SCIO) TPB
A S3D1
D2-3		 +
+		 -
-		 -
-		 +200 нМ
+200 нМ
B D1
D2-3		 -
+		 +100 нМ
-		 + 1 мкM
-		 -
+ 200 нМ
C D1
D2-3		 -
+		 +100 нМ
-		 + 1 мкM
-		 +100 нМ
+200 нМ
D D1
D2-3		 -
+		 +100 нМ
-		 + 1 мкM
-		 + 200 нМ
+200 нМ
E D1
D2-3		 +
+		 -
+ 100 нМ (только в день 3)		 -
-		 + 100 нМ
+ 100 нМ
D. Этап 4 (панкреатическая клетка-предшественница передней кишки - 3 дня). Клетки этапа 3 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 мкM SANT-1, 100 нМ TPB, 200 нМ LDN-193189, 2 мкM ингибитора ALk5 и 100 нМ ингибитора CYP26A в течение трех дней.
Фиг. 9A-9H показывают профиль экспрессии генов панкреатической энтодермы, эндокринной клетки-предшественницы и маркеров энтодермы передней кишки для сочетаний условий культивирования, указанных выше. В соответствии с предыдущим примером блокирование BMP процесса в первый день этапа 3 очень важно для последующей индукции эндокринной программы, как показывают измерения экспрессии панэндокринного маркера, хромогранина. (См. фиг. 9C.) Тем не менее добавление ингибитора BMP в первый день этапа 3 запускает экспрессию эндокринных маркеров на последующих этапах. Также добавление ингибитора BMP в первый день этапа 3 уменьшает экспрессию маркера передней кишки SOX2 на этапах 3-4 (фиг. 9H). Тем не менее добавление ингибитора BMP только в последний день этапа 3 показало значительно большую экспрессию SOX2 в конце этапа 3 по сравнению с клетками, обработанными ингибитором BMP только в первый день этапа 3. Уровни экспрессии, показанные на фиг. 9A-9H, относятся к уровням экспрессии в недифференцированных клетках H1, которые имеют очень высокий уровень экспрессии SOX2. Кроме того, что он является маркером переднего отдела передней кишка, SOX2 - это хорошо известный фактор транскрипции, который важен для поддержания плюрипотентности клетки ES. Этот пример также поддерживает предыдущие результаты, указывающие на чувствительность культуры этапа 3 к длительности и кинетике BMP-сигнализации и последующему влиянию на панкреатическую эндокринную индукцию и экспрессию SOX2.
Пример 5
Оптимальная доза ингибирования BMP на этапе панкреатической передней кишки (этап 4)
Предыдущий пример показал оптимальную длительность ингибирования BMP на этапе 3. Этот пример устанавливает оптимальную дозу ингибитора BMP в среде S4.
Клетки линии эмбриональных стволовых клеток человека H1 от различных пересевов (пересевы 40-52) были посеяны как отдельные клетки с плотностью 100 000 клеток/см2 на покрытых MATRIGEL™ (1:30 раствор) чашках в среде mTesr™1 и 10 мкM Y27632. Через сорок восемь часов после посева культуры были дифференцированы в линию панкреатических эндокринных клеток следующим образом.
a. Этап 1 (сформированная энтодерма (DE) - 4 дня). Перед началом DE культуры были промыты и инкубированы при помощи неполной PBS (без Mg или Ca) в течение 30 секунд, после чего произошло добавление среды этапа 1. Человеческие эмбриональные стволовые клетки, культивированные как отдельные клетки на чашках, покрытых средой MATRIGEL™, обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 2,5 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 1 мкM смеси MCX (ингибитора GSK3B) в течение одного дня. Затем клетки были обработаны средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 2,5 мМ глюкозы и 100 нг/мл GDF8 в течение дней 2-4.
b. Этап 2 (первичная кишечная трубка - 3 дня). Клетки этапа 1 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 2,5 мМ D-глюкозы и 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней.
c. Этап 3 (передняя кишка - 4 дня). Клетки этапа 2 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 мкM SANT-1, 50 нг/мл FGF7A, 2 мкM RA, 20 нг/мл активина А, 100 нМ LDN-193189 и 100 нМ TPB в течение 1 дня. Затем клетки были культивированы в среде MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 мкM SANT-1, 50 нг/мл FGF7, 2 мкM RA, 20 нг/мл активина A и 100 нМ TPB в течение трех дней.
D. Этап 4 (панкреатическая клетка-предшественница передней кишки - 4 дня). Клетки этапа 3 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной раствором ITS-X 1:200, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 200 нМ LDN-193189-193189, 2 мкM ингибитора ALk5, 100 нМ ингибитора CYP26A и концентрациями LDN-193189, указанными в таблице IV (ниже) в течение дней 1-4 этапа 4.
Таблица IV
Концентрации LDN-193189, использованные в S4
Условие A Условие B Условие C Условие D Условие E
S4D1 100 нм 50 нм 10 нм 10 нм 10 нм
S4D2 50 нм 10 нм 50 нм 10 нм 10 нм
S4D3 10 нм 10 нм 100 нм 50 нм 10 нм
S4D4 10 нм 10 нм 100 нм 50 нм 10 нм
D. Этап 5 (панкреатическая энтодерма/эндокринная клетка-предшественница - 3 дня). Клетки этапа 4 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 50 нМ LDN-193189 и 1 мкM ингибитора ALk5 в течение трех дней.
Результаты анализов ПЦР в реальном времени для клеток, собранных после вышеуказанной обработки, показаны на фиг. 10A-10H. Эта фигура показывает, что добавление 50 или 100 нМ LDN-193189 в день 1, 2, 3 или 4 на этапе S4 может продлить экспрессию эндокринных маркеров, в то же время поддерживая низкую экспрессию SOX2 на этапах S4-S5. (См. фиг. 10A-10H.)
Пример 6
Оптимальная доза ингибирования BMP в передней кишке этапа (этап 3)
Этот пример устанавливает оптимальную дозу ингибирования BMP на этапе 3 и последующие влияния на эндокринные маркеры на этапе 6.
Клетки эмбриональных стволовых клеток человека линии Н1 различных пересевов (пересевы 40-52) были посеяны как единичные клетки при плотности 100 000 клеток/см2 на покрытых MATRIGEL™ (разведение 1:30) чашках в среде mTesr™1, обогащенной 10 мкМ Y27632. Через сорок восемь часов после посева культуры были дифференцированы в клетки линии панкреатических эндокринных клеток следующим образом.
a. Этап 1 (сформированная энтодерма (DE) - 4 дня). Перед началом DE культуры были промыты и инкубированы при помощи неполной PBS (без Mg или Ca) в течение 30 секунд, после чего произошло добавление среды этапа 1. Человеческие эмбриональные стволовые клетки, культивированные как отдельные клетки на чашках, покрытых средой MATRIGEL™, обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 2,5 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 1,5 мкM смеси MCX (ингибитора GSK3B) в течение одного дня. Затем клетки были обработаны средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 2,5 мМ глюкозы и 100 нг/мл GDF8 в течение дней 2-4.
b. Этап 2 (первичная кишечная трубка - 3 дня). Клетки этапа 1 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 2,5 мМ D-глюкозы и 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней.
c. Этап 3 (передняя кишка - 3 дня). Клетки этапа 3 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 мкM SANT-1, 50 нг/мл FGF7, 2 мкM RA, 20 нг/мл активина A, 100 нМ TPB и 10-50 нМ LDN-193189 в течение одного дня. Затем клетки были обработаны средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 мкM SANT-1, 50 нг/мл FGF7, 2 мкM RA, 20 нг/мл активина A и 100 нМ TPB в течение двух дней.
D. Этап 4 (панкреатическая клетка-предшественница передней кишки - 3 дня). Клетки этапа 3 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 20 нМ LDN-193189; 2 мкM ингибитора ALk5; 100 нМ ингибитора CYP26 A и 100 нМ TPB в течение трех дней.
E. Этап 5 (панкреатическая энтодерма/эндокринная клетка-предшественница - 3 дня). Клетки этапа 4 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X; 2,5 мМ глюкозы; 1X GlutaMax™; 0,0015 г/мл бикарбоната натрия; 2% BSA без жирных кислот; ±25 нМ LDN-193189 и/или 2 мкM ингибитора ALk5 в течение трех дней.
F. Этап 6 (образование панкреатического эндокринного гормона - 3 дня). Клетки этапа 5 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X; 2,5 мМ глюкозы; 1X GlutaMax™; 0,0015 г/мл бикарбоната натрия; 2% BSA без жирных кислот в течение трех дней.
Фиг. 11A-11H показывают, что необходимо низкое либо умеренное ингибирование BMP в первый день этапа 3, чтобы запустить экспрессию эндокринных маркеров, в то же время поддерживая низкую экспрессию SOX2. Также ингибирование BMP на этапе 5 при увеличении эндокринных маркеров также привело к повышению экспрессии SOX2.
Данные в этом примере также подтверждают результаты, представленные в предыдущих примерах. Данные подтверждают, что точная модуляция BMP процесса на этапах 3-5 необходима для индукции панкреатических эндокринных маркеров, в то же время подавляет экспрессию SOX2.
Пример 7
Оптимальное окно для ингибирования BMP на этапе S3 (этап передней кишки)
Этот пример устанавливает оптимальное окно времени на этапе 3 для ингибирования BMP сигнализации, в то же время сохраняя эндокринную индукцию на последующих этапах и уменьшая экспрессию SOX2.
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 на различных этапах (пересевы 40-52) были посеяны как отдельные клетки с плотностью 100 000 клеток/см2 на покрытых MATRIGEL™ (1:30 раствор) чашках в среде mTesr™1 и 10 мкM Y27632. Через сорок восемь часов после посева культуры были дифференцированы в линию панкреатических эндокринных клеток следующим образом.
a. Этап 1 (сформированная энтодерма (DE) - 4 дня). Перед началом DE культуры были промыты и инкубированы при помощи неполной PBS (без Mg или Ca) в течение 30 секунд, после чего произошло добавление среды этапа 1. Человеческие эмбриональные стволовые клетки, культивированные как отдельные клетки на чашках, покрытых средой MATRIGEL™, обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 2,5 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 1,5 мкM смеси MCX в течение одного дня. Затем клетки были обработаны средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 2,5 мМ глюкозы и 100 нг/мл GDF8 в течение дней 2-4.
b. Этап 2 (первичная кишечная трубка - 3 дня). Клетки этапа 1 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 2,5 мМ D-глюкозы и 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней.
c. Этап 3 (передняя кишка - 3 дня). Клетки этапа 2 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 мкM SANT-1, 50 нг/мл FGF7, 2 мкM RA, 20 нг/мл активина A и 100 нМ TPB, содержащего 100 нМ LDN-193189, только в течение первых 2 часов, 6 часов или 24 часов этапа 3.
D. Этап 4 (панкреатическая клетка-предшественница передней кишки - 3 дня). Клетки этапа 3 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 25 нМ LDN-193189, 2 мкM ингибитора ALk5, 100 нМ ингибитора CYP26 A и 100 нМ TPB в течение трех дней.
E. Этап 5 (панкреатическая энтодерма/эндокринная клетка-предшественница - 3 дня). Клетки этапа 4 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот и 2 мкM ингибитора ALk5 в течение трех дней.
Фиг. 12A-12G показывают анализы ПЦР в реальном времени для данных, собранных в этом примере. Обработка на этапе 3 в течение по меньшей мере 2 часов при помощи ингибитора BMP может запустить экспрессию проэндокринных факторов транскрипции, таких как Ngn3 (фиг. 12D) и NeuroD (фиг. 12E), в то же время поддерживая очень низкую экспрессию SOX2 (фиг. 12G), и значительно повышает экспрессию NKX6.1 (фиг. 12A) и PDX-1 (фиг. 12B) на этапах S4-S5. Тем не менее на этапе 5 в день 3 экспрессия CDX2 была выше у клеток, обработанных в течение 2-6 часов ингибитором BMP, чем у клеток, обработанных ингибитором в течение 24 часов (фиг. 12F).
Данные из этого примера указывают на то, что 24-часовое ингибирование BMP процесса оптимально для поддержания низкого уровня экспрессии CDX2 и экспрессии SOX2 и для инициирования эндокринной дифференцировки, в то время как поддерживается высокая экспрессия маркеров панкреатической энтодермы.
Пример 8
Оптимальная продолжительность этапа 3 (этап передней кишки) и этапа 4 (этап панкреатической клетки-предшественницы передней кишки)
Этот пример был проведен, чтобы определить оптимальную продолжительность этапов S3 и S4 при пошаговой дифференцировки плюрипотентных клеток до популяции клеток линии панкреатических эндокринных клеток.
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 от различных пересевов (пересевы 40-52) были посеяны как отдельные клетки с плотностью 100 000 клеток/см2 на чашках, покрытых MATRIGEL™ (раствор 1:30), в среде mTesr™1, обогащенной 10 мкM Y27632. Через сорок восемь часов после посева культуры были дифференцированы в линию панкреатических эндокринных клеток следующим образом.
a. Этап 1 (сформированная энтодерма (DE) - 4 дня). Перед началом DE культуры были промыты и инкубированы при помощи неполной PBS (без Mg или Ca) в течение 30 секунд, после чего произошло добавление среды этапа 1. Человеческие эмбриональные стволовые клетки, культивированные как отдельные клетки на чашках, покрытых средой MATRIGEL™, обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™; 2,5 мМ D-глюкозы; 100 нг/мл GDF8 и 1,5 мкM смеси MCX (ингибитор GSK3B) в течение одного дня. Затем клетки были обработаны средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот; 0,0012 г/мл бикарбоната натрия; 1X GlutaMax™; 2,5 мМ глюкозы и 100 нг/мл GDF8 в течение дней 2-4.
b. Этап 2 (первичная кишечная трубка - 2 дня). Клетки этапа 1 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 2,5 мМ D-глюкозы и 50 нг/мл FGF7 в течение двух дней.
c. Этап 3 (передняя кишка - 2-3 дня). Клетки этапа 2 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 мкM SANT-1, 50 нг/мл FGF7, 2 мкM RA, 20 нг/мл активина A и 100 нМ TPB, содержащего 100 нМ LDN-193189, в течение одного дня. Затем клетки были обработаны средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 мкM SANT-1, 50 нг/мл FGF7, 2 мкM RA, 20 нг/мл активина A и 100 нМ TPB.
D. Этап 4 (панкреатическая клетка-предшественница передней кишки - 2-3 дня). Клетки этапа 3 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 25 нМ LDN-193189, 100 нМ ингибитора CYP26 A и 100 нМ TPB от двух до трех дней.
E. Этап 5 (панкреатическая энтодерма/эндокринный прекурсор - 2 дня). Клетки этапа 4 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот и 1 мкM ингибитора ALk5 в течение двух дней.
F. Этап 6 (панкреатический эндокринный прекурсор/гормон - 2 дня). Клетки этапа 5 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия и 2% BSA без жирных кислот в течение двух дней.
Данные из анализов ПЦР образцов в реальном времени, собранные на этапе 3, 4, 5 или 6, показаны на фиг. 13A-13G. Эти данные показывают, что увеличение S3 и S4 до трех дней увеличивает экспрессию NKX6.1 по сравнению с культурой, имеющей двухдневный S3 и S4 (фиг. 13A). Клетки, обработанные в течение трех дней на этапе 3, показывают уменьшение экспрессии проэндокринных маркеров по сравнению с культурами, где длительность S3 и S4 составляет только двух дней (фиг. 13D и 13E). Также увеличение этапа 4 до трех дней значительно увеличило экспрессию SOX2 (фиг. 13G).
Данные, полученные в этом примере, соответствуют данным, полученным в предыдущих примерах, относительно того, что продленное ингибирование BMP смещает клетки передней кишки в сторону популяции с высоким SOX2. На основании данных из этого примера и предыдущих примеров можно сделать вывод, что оптимальная продолжительность этапа 3 и этапа 4 составляет два дня. Идеальный протокол приведет к дифференцированным клеткам с высокими уровнями экспрессии проэндокринных маркеров, высокой экспрессией NKX6.1, низкой экспрессией CDX2 и низкой экспрессией SOX2.
Пример 9
Длительное воздействие ингибированием BMP при наличии высокой глюкозы и добавление B27 значительно увеличивают экспрессию SOX2 на этапе S3 и S4
Этот протокол был проведен для определения факторов, влияющих на экспрессию SOX2 на этапе S3 и S4 при пошаговой дифференцировке плюрипотентных клеток в производящие гормон клетки.
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 были культивированы на покрытых MATRIGEL™ (раствор 1:30) чашках в среде mTesr™1 до ~70% слияния и были дифференцированы следующим образом.
a. Недифференцированные клетки были культивированы в среде RPMI (инвитроген), обогащенной 0,2% FBS; 100 нг/мл активина A; 20 нг/мл WNT-3a в течение одного дня. Затем клетки были обработаны средой RPMI, обогащенной 0,5% FBS; 100 нг/мл активина A в течение еще двух дней (этап 1).
b. Клетки этапа 1 обрабатывались средой DMEM/F12, обогащенной 2% FBS; 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней (этап 2).
c. Клетки этапа 2 были культивированы в DMEM-высокоглюкозной среде, обогащенной 1% B27; 0,25 мкM SANT-1; 2 мкM RA; 100 нг/мл Noggin (R & D systems, Миннесота, США) в течение четырех дней (этап 3).
D. Клетки этапа 3 обрабатывались DMEM-высокоглюкозной средой, обогащенной 1% B27; 100 нг/мл Noggin; 1 мкM ингибитора ALk5 II (Axxora, Калифорния, США); 50 нМ TPB в течение четырех дней (этап 4).
Фиг. 14A-14H показывают FACS-гистограммы для клеток, собранных на этапе 3, день 4, полученные для следующих маркеров: изотипный контроль (фиг. 14A), хромогранин (фиг. 14B), KI-67 (фиг. 14C), NKX6.1 (фиг. 14D), SOX2 (фиг. 14E), HNF3B (фиг. 14F), CDX2 (фиг. 14G), PDX-1 (фиг. 14H). На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера. Большинство клеток на этапе 3 были положительны по экспрессии PDX-1 (фиг. 14H) и HNF3B (фиг. 14F), отрицательны по экспрессии NKX6.1 (фиг. 14D) и показали низкую экспрессию хромогранина (фиг. 14B) и CDX2 (фиг. 14G). Тем не менее более 90% клеток также были сильно положительны на SOX2 (фиг. 14E). Это показывает, что на этапе 3 большинство клеток были положительны на PDX-1 и SOX2 и отрицательны на NKX6.1, что указывает на создание энтодермной популяции в соответствии с популяцией передней кишки, расположенной спереди от домена PDX-1 поджелудочной железы.
Также процент клеток, которые были SOX2+ на этапе 3 в популяции клеток, созданной с помощью протокола, приведенного в этом примере, был значительно выше, чем процент клеток, которые были SOX2+ в популяции клеток, созданной с помощью протокола, приведенного в примере 1. Эту разницу можно объяснить длительным воздействием антагониста BMP, Noggin, нехваткой FGF7 и активатора PKC в культурной среде на этапе 3 этого примера.
Фиг. 15A-15G показывают FACS-гистограмму профилей экспрессии следующих маркеров на этапе S4, день 2 у клеток, дифференцированных согласно примеру 9. Фиг. 15A: изотипный контроль, фиг. 15B: NKX6.1, фиг. 15C: KI-67, фиг. 15D: хромогранин, фиг. 15E: SOX2, фиг. 15F: CDX2, фиг. 15G: PDX-1. На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера.
Фиг. 16A-16F содержат гистограмму профилей экспрессии FACS следующих маркеров в S4, день 4 для клеток, дифференцирующихся согласно примеру 9. Фиг. 16A: изотипный контроль, фиг. 16B: NKX6.1, фиг. 16C: хромогранин, фиг. 16D: SOX2, фиг. 16E: CDX2, фиг. 16F: PDX-1. На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера.
Таблица V ниже обобщает данные, полученные для% экспрессии маркеров энтодермы на этапе S3 и S4 у клеток, дифференцированных согласно протоколу, приведенному в этом примере.
Таблица V
% экспрессии маркеров энтодермы на этапе S3-S4
Стадия
(сутки)		 Общее число дней с начала дифференцировки % PDX-1+ % PDX-1+ SOX2+ % PDX-1+ NKX6.1+ SOX2- % PDX-1+ CDX2+ % PDX-1+ NKX6.1+ SOX2+
Стадия 3
4 суток		 10 дней 95 92 <1 <5 <1
Стадия 4
2 дня		 12 суток 85 83 <1 ~6 ~30
Стадия 4
4 суток		 14 дней 95 75 <5 ~7 ~50
Фиг. 17A-17J показывают результаты анализов ПЦР в реальном времени экспрессии следующих генов у клеток линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных согласно примеру 9. Фиг. 17A: CDX2, фиг. 17B: HHex, фиг. 17C: FOXE1, фиг. 17D: IPF1 (PDX-1), фиг. 17E: NKX2.1, фиг. 17F: NKX2.2, фиг. 17G: NKX6.1, фиг. 17H: PROX1, фиг. 17I: SOX2, фиг. 17J: SOX9.
Как показано на фиг. 14-17 и в таблице V, на день 2-4 этапа 4 было значительное увеличение экспрессии NKX6.1, в то время как оставалась высокой экспрессия PDX-1. Несмотря на то что экспрессия SOX2 уменьшилась с этапа 3 до этапа 4, ~75% клеток оставались SOX2+. Так же как на фиг. 5, клетки CDX2+, SOX2+ и NKX6.1+ были взаимно исключающими из популяции хромогранина. Это подразумевает, что популяция клеток этапа 4 дня 4, полученная с помощью протокола, приведенного в примере 9, имеет хромогранин-отрицательную фракцию ~50% NKX6.1+ SOX2+ PDX-1+ CDX2-. Это отличается от клеточной популяции, полученной в примере 1, которая имеет 40-70% PDX-1+ NKX6.1+ SOX2-, CDX2-, хромогранин-отрицательную фракцию и 2-25% PDX-1+ NKX6.1+ SOX2+ на этапе S4-S5. Очевидно, что клетки, полученные с помощью протокола в примере 1, имеют гораздо больший процент панкреатической энтодермы, так как определено, что популяция имеет PDX-1+ и NXK6.1+ и в то же время малый или отрицательный SOX2 и CDX2 по сравнению с клетками, полученными в примере 9.
Данные, полученные в этом примере, подтверждают, что длительное воздействие ингибированием BMP при наличии высокой глюкозы и добавления B27 значительно увеличивает экспрессию SOX2 на этапе дифференцировки 3 и 4.
Пример 10
Ранее опубликованный протокол приводит к образованию значительного числа SOX2+ популяции на этапе 3-4
Kroon et al. опубликовали протокол для приготовления клеток линии панкреатической энтодермы из человеческих эмбриональных стволовых клеток (Nature Biotech 2008, 26: 443-452, далее указываемый как Kroon). В представленном здесь примере человеческие эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы по протоколу Kroon и проверены на экспрессию маркеров, характерных для разных этапов дифференцировки.
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1 были посеяны на чашках, покрытых MATRIGEL™ (раствор 1:30), культивированы в среде mTesr™1 до ~70% слияния и дифференцированы с помощью ранее опубликованного протокола Kroon следующим образом.
a. Недифференцированные клетки были подвергнуты воздействию среды RPMI, обогащенной 0,2% FBS, 100 нг/мл активина A, 20 нг/мл WNT-3a в течение одного дня, после чего были обработаны средой RPMI, обогащенной 0,5% FBS, 100 нг/мл активина A в течение еще двух дней (этап 1).
b. Клетки этапа 1 были подвергнуты воздействию среды RPMI, обогащенной 2% FBS, 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней (этап 2).
c. Клетки этапа 2 обрабатывались DMEM-высокоглюкозной средой, обогащенной 1% B27, 0,25 мкM SANT-1, 2 мкM RA, 50 нг/мл Noggin (R & D systems, Миннесота) в течение трех дней (этап 3).
d. Клетки этапа 3 были культивированы в DMEM-высокоглюкозной среде, обогащенной 1% B27, в течение трех дней (этап 4).
e. Клетки этапа 4 были соскоблены со стенок и ресуспензированы как кластеры в DMEM-высокоглюкозной среде, обогащенной 1% B27, в течение двух дней.
Фиг. 18A-18G показывают FACS-гистограмму профилей экспрессии следующих маркеров на этапе S3, день 3 у клеток, дифференцированных согласно примеру 10: изотипный контроль (фиг. 18A), NKX6.1 (фиг. 18B), хромогранин (фиг. 18C), SOX2 (фиг. 18D), CDX2 (фиг. 18E), KI-67 (фиг. 18F), PDX-1 (фиг. 18G). На каждой гистограмме показан процент экспрессии для каждого маркера.
Фиг. 19A-19G показывают FACS-гистограмму профилей экспрессии следующих маркеров на этапе S4, день 5 у клеток, дифференцированных согласно примеру 10: изотипный контроль (фиг. 19A), NKX6.1 (фиг. 19B), хромогранин (фиг. 19C), SOX2 (фиг. 19D), CDX2 (фиг. 19E), KI-67 (фиг. 19F), PDX-1 (фиг. 19G). Процентная экспрессия для каждого маркера показана на каждой гистограмме.
Как показано на фиг. 18 и 19, к концу этапа 4 (день 5) кластеры клеток в суспензии были ~20% NKX6.1+ PDX-1+ SOX2- и ~20% PDX-1+ NKX6.1+ SOX2+. Эти результаты показывают, что значительная фракция популяции клеток на этапе 4, полученных согласно примеру 10, которые были NKX6.1+, также были SOX2+.
Таблица VI, приведенная ниже, обобщает процент маркеров энтодермы на этапе S3-S4 у клеток, полученных в этом примере.
Таблица VI
Экспрессия маркеров энтодермы на этапе S3-S4 у клеток, дифференцированных согласно Kroon
Стадия
(сутки)		 Общее число дней с начала дифференцировки % PDX-1+ % PDX-1+ SOX2+ % PDX-1+ NKX6.1+ SOX2- % PDX-1+ CDX2+ % PDX-1+ NKX6,1+ SOX2+
Стадия 3
3 дня		 9 суток 75 75 <1 <2 <1
Стадия 4
5 суток*		 14 дней 89 52 ~20 ~10 ~20
*Последние два дня в суспензионной культуре
Пример 11
Добавление аскорбиновой кислоты приводит к значительному уменьшению числа полигормональных клеток и параллельному увеличению числа одногормональных инсулинположительных клеток
Было проверено влияние аскорбиновой кислоты на экспрессию маркеров при дифференцировке плюрипотентных клеток в производящие гормон клетки. Клетки были культивированы в среде, обогащенной глюкозой на каждой стадии дифференцировки и обогащенной аскорбиновой кислотой на образовании этапов 3, 4 и 5 следующим образом.
Клетки линии эмбриональных стволовых клеток человека H1 от различных пересевов (пересевы 40-52) были посеяны как отдельные клетки с плотностью 100 000 клеток/см2 на чашках, покрытых средой MATRIGEL™ (раствор 1:30), в среде mTesr™1 и 10 мкM Y27632. Через сорок восемь часов после посева культуры были дифференцированы в линию панкреатических эндокринных клеток следующим образом.
a. Этап 1 (сформированная энтодерма (DE) - 3 дня). Перед началом DE культуры были промыты и инкубированы при помощи неполной PBS (без Mg или Ca) в течение 30 секунд, после чего произошло добавление среды этапа 1. Человеческие эмбриональные стволовые клетки, культивированные как отдельные клетки на чашках, покрытых средой MATRIGEL™, обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 5 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 1 мкM смеси MCX (ингибитор GSK3B) в течение одного дня. Затем клетки были обработаны средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 5 мМ глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 100 нМ смеси MCX в течение второго дня, после чего были еще день выдержаны в среде MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 5 мМ глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b. Этап 2 (первичная кишечная трубка - 2 дня). Клетки этапа 1 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 5 мМ D-глюкозы и 25 нг/мл FGF7 в течение двух дней.
c. Этап 3 (передняя кишка - 2 дня). Клетки этапа 2 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 нг/мл активина A, 25 нг/мл FGF7, 0,25 мкM SANT-1, 1мкM RA, 200 нМ TPB (активатор PKC), 100 нМ LDN-193189 (ингибитор BMP-рецептора) в течение одного дня. Затем клетки были обработаны средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 нг/мл активина A, 25 нг/мл FGF7, 0,25 мкM SANT-1, 1мкM RA, 200 нМ TPB (активатор PKC), 10 нМ LDN-193189 в течение еще одного дня. Некоторые культуры обрабатывались 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (номер по каталогу A4544, Sigma, Миссури, США) в течение этапа 3.
D. Этап 4 (панкреатическая клетка-предшественница передней кишки - 2 дня). Клетки этапа 3 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 мкM SANT-1, 50 нМ RA, 200 нМ TPB, 50 нМ LDN-193189, с или без 0,25 мМ аскорбиновой кислоты в течение двух дней.
E. Этап 5 (панкреатическая энтодерма, 2-7 дней). Клетки этапа 4 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 мкM SANT-1, 50 нМ RA, с или без 0,25 мМ аскорбиновой кислоты в течение 2-7 дней.
Фиг. 20A-20J показывают анализы ПЦР экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных согласно примеру 11, в реальном времени. Фиг. 20A: соматостатин, фиг. 20B: PDX1, фиг. 20C: Pax6, фиг. 20D: Pax4, фиг. 20E: NKX6.1, фиг. 20F: NGN3, фиг. 20G: глюкагон, фиг. 20H: NeuroD, фиг. 20I: инсулин, фиг. 20J: хромогранин. Эта фигура показывает, что добавление аскорбиновой кислоты на этапе 3 или на этапе 3 и 4 значительно уменьшает экспрессию соматостатина и глюкагона на этапе 4-5, в то же время увеличивая экспрессию инсулина (см. фиг. 20A, 20G и 20I). Также на этапе 4-5 экспрессия маркеров панкреатической энтодермы, таких как PDX-1 и NKX6.1, незначительно изменилась при добавлении 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (см. фиг. 20B и 20D). На этапе 4-5 экспрессия Pax6 уменьшилась, а экспрессия Pax4 осталась прежней (см. фиг. 20C и 20D). В конце этапа 5 культуры, обработанные ± аскорбиновой кислотой на этапе S3-S5, были иммуногистохимически окрашены антителами к гормонам инсулину, глюкагону и соматостатину. Таблица VII обобщает средний процент инсулин-, глюкагон- и соматостатин-положительных клеток и полигормональных клеток (экспрессия еще двух гормонов в одной клетке).
Таблица VII
Экспрессия гормонов как процент от общего числа гормонов
Обработка % единичный гормональный инсулин + % глюкагон + плюс % соматостатин + % полигормональный
Контроль 16 83 50
+ аскорбиновая кислота на этапе S3-S4 55 44 36
Пример 12
Оптимальная доза аскорбиновой кислоты на этапе 3
Этот пример был проведен, чтобы определить оптимальную дозу аскорбиновой кислоты, которую нужно использовать для генерирования инсулин-положительных клеток, которые являются одногормональными, PDX-1-положительными и NKX6.1-положительными.
Клетки линии эмбриональных стволовых клеток человека H1 от различных пересевов (пересевы 40-52) были посеяны как отдельные клетки с плотностью 100 000 клеток/см2 на чашках, покрытых средой MATRIGEL™ (раствор 1:30), в среде mTesr™1 и 10 мкM Y27632. Через сорок восемь часов после посева культуры были дифференцированы в линию панкреатических эндокринных клеток следующим образом.
a. Этап 1 (сформированная энтодерма (DE) - 3 дня). Перед началом DE культуры были промыты и инкубированы при помощи неполной PBS (без Mg или Ca) в течение 30 секунд, после чего произошло добавление среды этапа 1. Человеческие эмбриональные стволовые клетки, культивированные как отдельные клетки на чашках, покрытых средой MATRIGEL™, обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 5 мМ D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8 плюс 1 мкM смеси MCX (ингибитор GSK3B) в течение одного дня. Затем клетки были обработаны средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 5 мМ глюкозы и 100 нг/мл GDF8 плюс 100 нМ смеси MCX в течение второго дня, после чего еще один день в среде MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 5 мМ глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b. Этап 2 (первичная кишечная трубка - 2 дня). Клетки этапа 1 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 5 мМ D-глюкозы, с добавлением или без добавления 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и 25 нг/мл FGF7 в течение двух дней.
c. Этап 3 (передняя кишка - 2 дня). Клетки этапа 2 обрабатывались средой MCDB131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 нг/мл активина A, 25 нг/мл FGF7, 0,25 мкM SANT-1, ±0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 1 мкM RA, 200 нМ TPB, 100 нМ LDN-193189 в течение дня 1, после чего были обработаны средой MCDB131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 нг/мл активина A, 25 нг/мл FGF7, 0,25 мкM SANT-1, ±0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 1 мкM RA, 200 нМ TPB, 10 нМ LDN-193189 в течение еще одного дня.
d. Этап 4 (панкреатическая клетка-предшественница передней кишки - 2 дня). Клетки этапа 3 обрабатывались средой MCDB131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 мкM SANT-1, 50 нM RА, 200 нМ TPB, 50 нМ LDN-193189, с добавлением или без добавления 0,25-1 мМ аскорбиновой кислоты в течение двух дней.
е. Этап 5 (панкреатическая энтодерма, 2-9 дней). Клетки этапа 4 обрабатывались средой MCDB131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 мкM SANT-1, 50 нМ RA, с добавлением или без добавления 0,25 мМ аскорбиновой кислоты в течение 2-9 дней.
Фиг. 21A-21J показывают данные анализов ПЦР экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных согласно примеру 12, в реальном времени. Фиг. 21A: соматостатин, фиг. 21B: PDX1, фиг. 21C: Pax6, фиг. 21D: Pax4, фиг. 21E: NKX6.1, фиг. 21F: NGN3, фиг. 21G: NeuroD, фиг. 21H: инсулин, фиг. 21I: глюкагон, фиг. 21J: хромогранин. В соответствии с данными из примера 10 добавление аскорбиновой кислоты на этапе 2-4 значительно уменьшило экспрессию соматостатина, глюкагона и Pax6, в то же время сохраняя экспрессию инсулина и Pax4 на этапе 5. Также было незначительное преимущество использования на этапе S4 0,5-1 мМ аскорбиновой кислоты по сравнению с 0,25 мМ аскорбиновой кислоты. И наконец, добавление аскорбиновой кислоты на этапе 2 также оказалось эффективным для уменьшения экспрессии глюкагона и соматостатина на этапе S3-5, в то же время сохраняя экспрессию инсулина. Таким образом, аскорбиновая кислота выступает как специфичный для этапа способ регулирования экспрессии единичных гормональных клеток. Добавление аскорбиновой кислоты важно на ранних этапах протокола дифференцировки, причем на более поздних этапах она не показала себя такой же эффективной в плане уменьшения числа полигормональных клеток.
Пример 13
Сочетание ретиноевой кислоты и аскорбиновой кислоты необходимо для генерирования единичных гормональных инсулин-положительных клеток
Этот пример был проведен, чтобы дать представление о требованиях к генерированию единичных гормональных инсулин-положительных клеток при дифференцировке плюрипотентных клеток.
Клетки линии эмбриональных стволовых клеток человека H1 от различных пересевов (пересевы 40-52) были посеяны как отдельные клетки с плотностью 100 000 клеток/см2 на чашках, покрытых средой MATRIGEL™ (раствор 1:30), в среде mTesr™1 и 10 мкM Y27632. Через сорок восемь часов после посева культуры были дифференцированы в линию панкреатических эндокринных клеток следующим образом.
a. Этап 1 (сформированная энтодерма (DE) - 3 дня). Перед началом DE культуры были промыты и инкубированы при помощи неполной PBS (без Mg или Ca) в течение 30 секунд, после чего произошло добавление среды этапа 1. Человеческие эмбриональные стволовые клетки, культивированные как отдельные клетки на чашках, покрытых средой MATRIGEL™, обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 5 мМ D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8, 1 мкM смеси MCX (ингибитор GSK3B) в течение одного дня. Затем клетки были обработаны средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, бикарбоната натрия, GlutaMax™, дополнительными 5 мМ глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 100 нМ смеси MCX в течение второго дня, после чего еще день обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 5 мМ глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b. Этап 2 (первичная кишечная трубка - 2 дня). Клетки обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 0,1% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и 25 нг/мл FGF7 в течение двух дней.
c. Этап 3 (передняя кишка - 2 дня). Клетки обрабатывались средой MCDB131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 нг/мл активина A, 25 нг/мл FGF7, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 0,25 мкM SANT-1, 1 мкM RA, 200 нМ TPB, 100 нМ LDN-193189 в течение дня 1, после чего обрабатывались tMCDB131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 нг/мл активина A, 25 нг/мл FGF7, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 0,25 мкM SANT-1, 1 мкM RA, 200 нМ TPB, 10 нМ LDN-193189 в течение еще одного дня.
d. Этап 4 (панкреатическая клетка-предшественница передней кишки - 2 дня). Клетки обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 мкM SANT-1, 50 нМ RA, 200 нМ TPB, 50 нМ LDN-193189, 0,1 мМ аскорбиновой кислоты в течение двух дней.
е. Этап 5 (панкреатическая энтодерма, 3 дня). Клетки обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 2,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот и следующими культурными условиями в течение 3 дней:
• +0,1 мМ аскорбиновой кислоты;
• 0,1 мМ аскорбиновой кислоты + 50 нМ RA;
• 0,1 мМ аскорбиновой кислоты + 50 нМ RA + 0,25 мкM SANT-1;
• 0,1 мМ аскорбиновой кислоты + 50 нМ RA + 0,25 мкM SANT-1+ 50 нМ LDN-193189;
• 0,1 мМ аскорбиновой кислоты + 50 нМ RA + 0,25 мкM SANT-1+ 1 мкM Alk5 инг;
• 0,1 мМ аскорбиновой кислоты + 50 нМ RA + 0,25 мкM SANT-1+ 1 мкM Alk5 инг + 50 нМ LDN-193189.
Фиг. 22A-22L показывают данные анализов ПЦР экспрессии Pax4 в реальном времени (фиг. 22A); Pax6 (фиг. 22B); PDX1 (фиг. 22C); PTF1a (фиг. 22D); глюкагон (фиг. 22E); инсулин (фиг. 22F); NeuroD (фиг. 22G); ngn3 (фиг. 22H); Zic1 (фиг. 22I); CDX2 (фиг. 22J); альбумин (фиг. 22K); NKX6.1 (фиг. 22L) в клетках линии эмбриональных стволовых клеток H1, дифференцированных согласно примеру 13 и собранных на этапе S5 в день 3.
В конце этапа 5 культуры, обработанные вышеуказанными сочетаниями реагентов, были окрашены методами иммуногистохимии для проверки наличия гормонов инсулина, глюкагона и соматостатина. Таблица VIII показывает средний процент инсулин-, глюкагон- и соматостатин-положительных клеток и полигормональных клеток (экспрессия еще двух гормонов в одной клетке).
Как показано на фиг. 22 и в таблице VIII ниже, добавление малой дозы ретиноевой кислоты плюс аскорбиновой кислоты на этапе 5 значительно уменьшает общее число гормон-положительных клеток, в то же время увеличивая процент единичных гормональных инсулин-положительных клеток по сравнению с культурами, обработанными только витамином C на этапе S5. Также сочетание ретиноевой кислоты, аскорбиновой кислоты, ингибитора гена sonic hedgehog и ингибитора ALk5 также увеличивает число единичных гормональных инсулин-положительных клеток по сравнению с культурами, обработанными только аскорбиновой кислотой (витамином C). Эти данные показывают, что необходима уникальная комбинация факторов для генерирования единичных гормональных инсулин-положительных клеток.
Таблица VIII
Экспрессия гормонов как процент от общего числа гормонов на этапе S5 в день 3
Обработка на этапе S5 % единичный гормональный инсулин + % глюкагон +
Плюс % соматостатин +		 % полигормональные
+витамин C 12 44 44
+ RA + витамин C 27 26 43
RA + витамин C + Alk5 инг + Shh инг 44 21 34

Claims (19)

1. Способ получения одногормональных инсулинположительных клеток, включающий:
(a) дифференцировку клеток поджелудочной железы передней кишки, экспрессирующих PDX-1 и NKX6.1, в клетки энтодермы поджелудочной железы путем обработки клеток поджелудочной железы передней кишки, экспрессирующих PDX-1 и NKX6.1, ингибитором shh, низкой дозой ретиноевой кислоты и аскорбиновой кислотой; и
(b) дифференцировку клеток энтодермы поджелудочной железы в одногормональные эндокринные клетки поджелудочной железы в среде, дополненной ингибитором shh, низкой дозой ретиноевой кислоты и аскорбиновой кислотой,
за исключением способа, в котором клетки поджелудочной железы передней кишки и клетки энтодермы поджелудочной железы получены с использованием человеческих эмбрионов.
2. Способ по п.1, в котором клетки энтодермы поджелудочной железы экспрессируют PDX-1, более высокий уровень NKX6.1 и более низкий уровень SOX2 по сравнению с клетками поджелудочной железы передней кишки.
3. Способ по п.1, в котором стадия (а) дополнительно включает обработку активатором PKC и ингибитором рецептора BMP.
4. Способ по п.3, в котором активатор PKC представляет собой TPB.
5. Способ по п. 3 или 4, в котором ингибитор BMP представляет собой LDN-193189.
6. Способ по п.3, в котором стадия (а) включает обработку с использованием 0,25 мкМ SANT-1, 200 нМ TPB, 50 нМ ретиноевой кислоты, 200 нМ TPB, 50 нМ LDN-193189 и 0,1 мМ аскорбиновой кислоты.
7. Способ по п.1, в котором стадия (b) дополнительно включает обработку ингибитором ALK5.
8. Способ по п.7, в котором ингибитор ALK5 представляет собой ингибитор ALK5 II.
9. Способ по п.7, в котором ингибитор ALK5 представляет собой SD208.
10. Способ по п.7, в котором стадия (b) включает обработку с использованием 0,1 мМ аскорбиновой кислоты, 50 нМ ретиноевой кислоты, 0,25 мкМ SANT-1 и 1 мкМ ингибитора Alk5.
11. Способ по любому из пп. 1, 3 или 7, где ингибитор shh на стадии (a), (b) или (a) и (b) представляет собой SANT-1.
12. Способ по любому из пп. 1, 3 или 7, где способ на стадии (a), (b) или (a) и (b) включает обработку с использованием от 0,01 мМ до 1 мМ аскорбиновой кислоты.
13. Способ по любому из пп.1, 3 или 7, где способ на стадии (a), (b) или (a) и (b) включает обработку с использованием от 0,1 мМ до 0,5 мМ аскорбиновой кислоты.
14. Способ по любому из пп.1, 3 или 7, где способ на стадии (a), (b) или (a) и (b) включает обработку в среде, содержащей менее 25 мМ глюкозы.
15. Способ по п.14, в котором концентрация глюкозы находится в диапазоне от 8 мМ до 20 мМ глюкозы.
16. Способ по любому из пп. 1-15, в котором клетки поджелудочной железы передней кишки представляют собой клетки поджелудочной железы передней кишки человека.
RU2018132199A 2011-12-22 2012-12-07 Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека в одногормональные инсулинположительные клетки RU2705001C2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161579351P 2011-12-22 2011-12-22
US61/579,351 2011-12-22

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2014130042A Division RU2668798C2 (ru) 2011-12-22 2012-12-07 Способы in vitro пошаговой дифференцировки полюрипотентных клеток

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2018132199A RU2018132199A (ru) 2018-10-31
RU2018132199A3 RU2018132199A3 (ru) 2019-05-24
RU2705001C2 true RU2705001C2 (ru) 2019-11-01

Family

ID=48669355

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2014130042A RU2668798C2 (ru) 2011-12-22 2012-12-07 Способы in vitro пошаговой дифференцировки полюрипотентных клеток
RU2018132199A RU2705001C2 (ru) 2011-12-22 2012-12-07 Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека в одногормональные инсулинположительные клетки

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2014130042A RU2668798C2 (ru) 2011-12-22 2012-12-07 Способы in vitro пошаговой дифференцировки полюрипотентных клеток

Country Status (15)

Country Link
US (4) US9388386B2 (ru)
EP (1) EP2794857A4 (ru)
JP (4) JP6441080B2 (ru)
KR (2) KR102203056B1 (ru)
CN (1) CN105143446B (ru)
AR (1) AR089426A1 (ru)
AU (3) AU2012355698B2 (ru)
BR (1) BR112014015417A8 (ru)
CA (1) CA2860107C (ru)
HK (1) HK1203552A1 (ru)
MX (1) MX2014007744A (ru)
PH (1) PH12014501429A1 (ru)
RU (2) RU2668798C2 (ru)
SG (2) SG10201608914WA (ru)
WO (1) WO2013095953A1 (ru)

Families Citing this family (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9080145B2 (en) 2007-07-01 2015-07-14 Lifescan Corporation Single pluripotent stem cell culture
EP2185693B1 (en) 2007-07-31 2019-07-03 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
US9062290B2 (en) 2007-11-27 2015-06-23 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
MX2010009251A (es) 2008-02-21 2010-11-25 Centocor Ortho Biotech Inc Metodos, placas de superficie modificada y composiciones para la fijacion, el cultivo y el desprendimiento celular.
ES2697798T3 (es) 2008-06-30 2019-01-28 Janssen Biotech Inc Diferenciación de células madre pluripotentes
CA2742268C (en) 2008-10-31 2020-02-18 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage
CN102333862B (zh) * 2008-10-31 2018-04-27 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞向胰腺内分泌谱系的分化
AU2009316580B2 (en) 2008-11-20 2016-04-14 Janssen Biotech, Inc. Pluripotent stem cell culture on micro-carriers
CA2744227C (en) 2008-11-20 2018-10-02 Centocor Ortho Biotech Inc. Methods and compositions for cell attachment and cultivation on planar substrates
KR20170118969A (ko) 2009-07-20 2017-10-25 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 분화
WO2011079017A2 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
SG10201501503VA (en) 2010-03-01 2015-04-29 Janssen Biotech Inc Methods for purifying cells derived from pluripotent stem cells
RU2663339C1 (ru) 2010-05-12 2018-08-03 Янссен Байотек, Инк. Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека
EP2611910B1 (en) 2010-08-31 2018-01-17 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
EP3372672A1 (en) 2010-08-31 2018-09-12 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
JP6441080B2 (ja) * 2011-12-22 2018-12-19 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 単一ホルモンのインスリン陽性細胞へのヒト胚性幹細胞の分化
CA2866590A1 (en) 2012-03-07 2013-09-12 Janssen Biotech, Inc. Defined media for expansion and maintenance of pluripotent stem cells
EP2859091B1 (en) 2012-06-08 2018-08-29 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells
WO2014105543A1 (en) 2012-12-31 2014-07-03 Janssen Biotech, Inc. Culturing of human embryonic stem cells at the air-liquid interface for differentiation into pancreatic endocrine cells
US10370644B2 (en) * 2012-12-31 2019-08-06 Janssen Biotech, Inc. Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom
RU2684215C2 (ru) 2012-12-31 2019-04-04 Янссен Байотек, Инк. Способ получения панкреатических эндокринных клеток (варианты) и способ увеличения выхода бета-клеток
MX2015008619A (es) 2012-12-31 2016-01-12 Janssen Biotech Inc Suspension y agrupamiento de celulas humanas pluripotentes para la diferenciacion a celulas endocrinas pancreaticas.
US8859286B2 (en) 2013-03-14 2014-10-14 Viacyte, Inc. In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells
DE202014011287U1 (de) 2013-06-11 2019-02-06 The President And Fellows Of Harvard College SC-ß Zellen und Zusammensetzungen zur Erzeugung der Zellen
AU2014324901A1 (en) 2013-09-25 2016-05-19 Axcella Health Inc. Compositions and formulations for prevention and treatment of diabetes and obesity, and methods of production and use thereof in glucose and caloric control
EP3063268A4 (en) * 2013-11-01 2017-11-29 Janssen Biotech, Inc. Suspension and clustering of human pluripotent stem cells for differentiation into pancreatic endocrine cells
JP6588969B2 (ja) 2014-05-16 2019-10-09 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 膵内分泌細胞内のｍａｆａ発現を強化するための小分子の使用
US10457916B2 (en) 2014-05-20 2019-10-29 Tokyo Institute Of Technology Method for inducing differentiation of insulin-producing cells
EP3147353B1 (en) * 2014-05-21 2022-03-30 Kyoto University Method for producing pancreatic blast cells and pancreatic disease treatment agent containing pancreatic blast cells
CN107075471A (zh) * 2014-10-08 2017-08-18 新加坡科技研究局 将干细胞分化为肝细胞谱系的方法
WO2016100898A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 President And Fellows Of Harvard College Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived b cells and uses thereof
CN107614678B (zh) 2014-12-18 2021-04-30 哈佛学院校长同事会 干细胞来源的β细胞的产生方法及其使用方法
EP3234110B1 (en) 2014-12-18 2024-02-28 President and Fellows of Harvard College METHODS FOR GENERATING STEM CELL-DERIVED ß CELLS AND USES THEREOF
US20160175363A1 (en) * 2014-12-18 2016-06-23 President And Fellows Of Harvard College Methods for generating stem cell-derived beta cells and uses thereof
RU2017125728A (ru) * 2014-12-19 2019-01-22 Янссен Байотек, Инк. Культивирование плюрипотентных стволовых клеток в суспензии
MA45479A (fr) 2016-04-14 2019-02-20 Janssen Biotech Inc Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen
MA45502A (fr) * 2016-06-21 2019-04-24 Janssen Biotech Inc Génération de cellules bêta fonctionnelles dérivées de cellules souches pluripotentes humaines ayant une respiration mitochondriale glucose-dépendante et une réponse en sécrétion d'insuline en deux phases
AU2018370029A1 (en) * 2017-11-15 2020-07-02 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Islet cell manufacturing compositions and methods of use
EP3790589A4 (en) * 2018-05-07 2022-03-02 President and Fellows of Harvard College STEM CELL-DERIVED ALPHA CELLS AND METHODS OF GENERATION THEREOF
WO2020033879A1 (en) 2018-08-10 2020-02-13 Semma Therapeutics, Inc. Stem cell derived islet differentiation
US10724052B2 (en) 2018-09-07 2020-07-28 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
CN109749986B (zh) * 2019-03-13 2021-04-02 武汉大学 一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法
JP2020146301A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146312A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146305A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146307A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146304A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146308A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146297A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146302A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146298A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146314A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146317A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146311A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146313A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146300A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146306A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146310A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146318A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146309A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146315A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146303A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146299A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
EP3976237A1 (en) 2019-05-31 2022-04-06 W.L. Gore & Associates Inc. Cell encapsulation devices with controlled oxygen diffusion distances
EP3975926A1 (en) 2019-05-31 2022-04-06 W.L. Gore & Associates, Inc. A biocompatible membrane composite
EP3976236A1 (en) 2019-05-31 2022-04-06 W.L. Gore & Associates Inc. A biocompatible membrane composite
WO2020243665A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 W. L. Gore & Associates, Inc. A biocompatible membrane composite
CA3150235A1 (en) 2019-09-05 2021-03-11 Alireza Rezania UNIVERSAL DONOR CELLS
CN114364791A (zh) 2019-09-05 2022-04-15 克里斯珀医疗股份公司 通用供体细胞
CA3158631A1 (en) * 2019-10-21 2021-04-29 Orizuru Therapeutics, Inc. Growth inhibitor
CN112251396B (zh) * 2020-10-09 2022-08-16 北京呈诺医学科技有限公司 培养基及其应用与诱导性多能干细胞向胰岛分化的方法
EP4271796A1 (en) 2020-12-31 2023-11-08 CRISPR Therapeutics AG Universal donor cells
CN113234664A (zh) * 2021-05-11 2021-08-10 澳门大学 一种胰腺祖细胞的制备方法及其应用
US20230377685A1 (en) 2022-04-15 2023-11-23 Aspen Neuroscience, Inc. Methods of classifying the differentiation state of cells and related compositions of differentiated cells
CN114836369B (zh) * 2022-05-20 2023-01-17 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 一种诱导性多能干细胞向胰岛分化的方法及其在治疗i型糖尿病中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009018453A1 (en) * 2007-07-31 2009-02-05 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
WO2010051213A1 (en) * 2008-10-31 2010-05-06 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage
WO2011143299A2 (en) * 2010-05-12 2011-11-17 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of human embryonic stem cells

Family Cites Families (277)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3209652A (en) 1961-03-30 1965-10-05 Burgsmueller Karl Thread whirling method
AT326803B (de) 1968-08-26 1975-12-29 Binder Fa G Maschenware sowie verfahren zur herstellung derselben
US3935067A (en) 1974-11-22 1976-01-27 Wyo-Ben Products, Inc. Inorganic support for culture media
CA1201400A (en) 1982-04-16 1986-03-04 Joel L. Williams Chemically specific surfaces for influencing cell activity during culture
US4499802A (en) 1982-09-29 1985-02-19 Container Graphics Corporation Rotary cutting die with scrap ejection
US4537773A (en) 1983-12-05 1985-08-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company α-Aminoboronic acid derivatives
US4557264A (en) 1984-04-09 1985-12-10 Ethicon Inc. Surgical filament from polypropylene blended with polyethylene
US5215893A (en) 1985-10-03 1993-06-01 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US5089396A (en) 1985-10-03 1992-02-18 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US4737578A (en) 1986-02-10 1988-04-12 The Salk Institute For Biological Studies Human inhibin
US5863531A (en) 1986-04-18 1999-01-26 Advanced Tissue Sciences, Inc. In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework
US5759830A (en) 1986-11-20 1998-06-02 Massachusetts Institute Of Technology Three-dimensional fibrous scaffold containing attached cells for producing vascularized tissue in vivo
CA1340581C (en) 1986-11-20 1999-06-08 Joseph P. Vacanti Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices
US5567612A (en) 1986-11-20 1996-10-22 Massachusetts Institute Of Technology Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making
NZ229354A (en) 1988-07-01 1990-09-26 Becton Dickinson Co Treating polymer surfaces with a gas plasma and then applying a layer of endothelial cells to the surface
EP0363125A3 (en) 1988-10-03 1990-08-16 Hana Biologics Inc. Proliferated pancreatic endocrine cell product and process
SU1767433A1 (ru) 1989-11-27 1992-10-07 Пермский государственный медицинский институт Способ определени инсулинорезистентности имунного генеза у больных сахарным диабетом I типа
US5837539A (en) 1990-11-16 1998-11-17 Osiris Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells
KR100249937B1 (ko) 1991-04-25 2000-04-01 나가야마 오사무 인간 인터루킨-6 수용체에 대한 재구성 인간 항체
US5449383A (en) 1992-03-18 1995-09-12 Chatelier; Ronald C. Cell growth substrates
GB9206861D0 (en) 1992-03-28 1992-05-13 Univ Manchester Wound healing and treatment of fibrotic disorders
CA2114282A1 (en) 1993-01-28 1994-07-29 Lothar Schilder Multi-layered implant
JP3525221B2 (ja) 1993-02-17 2004-05-10 味の素株式会社 免疫抑制剤
WO1994023572A1 (en) 1993-04-08 1994-10-27 Human Cell Cultures, Inc. Cell culturing method and medium
US5523226A (en) * 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
GB9310557D0 (en) 1993-05-21 1993-07-07 Smithkline Beecham Plc Novel process and apparatus
TW257671B (ru) 1993-11-19 1995-09-21 Ciba Geigy
US6001647A (en) 1994-04-28 1999-12-14 Ixion Biotechnology, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof
US5834308A (en) 1994-04-28 1998-11-10 University Of Florida Research Foundation, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans
US6703017B1 (en) 1994-04-28 2004-03-09 Ixion Biotechnology, Inc. Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures
US6083903A (en) 1994-10-28 2000-07-04 Leukosite, Inc. Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses
WO1996020728A1 (fr) 1994-12-29 1996-07-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Potentialisateur d'agent antitumoral comprenant un antagoniste de l'interleukine 6
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
US5718922A (en) 1995-05-31 1998-02-17 Schepens Eye Research Institute, Inc. Intravitreal microsphere drug delivery and method of preparation
US5908782A (en) 1995-06-05 1999-06-01 Osiris Therapeutics, Inc. Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells
US5681561A (en) 1995-06-07 1997-10-28 Life Medical Sciences, Inc. Compositions and methods for improving autologous fat grafting
WO1998030679A1 (en) 1997-01-10 1998-07-16 Life Technologies, Inc. Embryonic stem cell serum replacement
KR100568438B1 (ko) 1997-04-24 2006-04-07 오르토-맥네일 파마슈티칼, 인코퍼레이티드 염증성 질환의 치료에 유용한 치환된 이미다졸, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
AU8476698A (en) 1997-07-03 1999-01-25 Osiris Therapeutics, Inc. Human mesenchymal stem cells from peripheral blood
EP1538206B1 (en) 1997-09-16 2010-03-24 Centocor, Inc. Method for the complete chemical synthesis and assembly of genes and genomes
US6670127B2 (en) 1997-09-16 2003-12-30 Egea Biosciences, Inc. Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide
AU1197699A (en) 1997-10-23 1999-05-10 Geron Corporation Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells
US6372779B1 (en) 1997-12-29 2002-04-16 Ortho Pharmaceutical Corporation Anti-inflammatory compounds
ATE316795T1 (de) 1998-03-18 2006-02-15 Osiris Therapeutics Inc Mesenchymale stammzellen für die prävention und behandlung von immunantworten bei transplantationen
MY132496A (en) 1998-05-11 2007-10-31 Vertex Pharma Inhibitors of p38
US6413773B1 (en) 1998-06-01 2002-07-02 The Regents Of The University Of California Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors as stimulators of endocrine differentiation
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US7410798B2 (en) 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
US6610540B1 (en) 1998-11-18 2003-08-26 California Institute Of Technology Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells
US6413556B1 (en) 1999-01-08 2002-07-02 Sky High, Llc Aqueous anti-apoptotic compositions
CA2359159A1 (en) 1999-01-21 2000-07-27 Vitro Diagnostics, Inc. Immortalized cell lines and methods of making the same
EP1155114B1 (en) 1999-02-11 2007-11-14 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Avian pluripotent embryonic germ cell line
US6815203B1 (en) 1999-06-23 2004-11-09 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods of making pancreatic islet cells
US6333029B1 (en) 1999-06-30 2001-12-25 Ethicon, Inc. Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue
US6306424B1 (en) 1999-06-30 2001-10-23 Ethicon, Inc. Foam composite for the repair or regeneration of tissue
WO2001023528A1 (en) 1999-09-27 2001-04-05 University Of Florida Research Foundation Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures
US6685936B2 (en) 1999-10-12 2004-02-03 Osiris Therapeutics, Inc. Suppressor cells induced by culture with mesenchymal stem cells for treatment of immune responses in transplantation
US20030082155A1 (en) 1999-12-06 2003-05-01 Habener Joel F. Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus
US6753153B2 (en) 1999-12-13 2004-06-22 The Scripps Research Institute Markers for identification and isolation of pancreatic islet α and β progenitors
US7439064B2 (en) 2000-03-09 2008-10-21 Wicell Research Institute, Inc. Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium
US7005252B1 (en) 2000-03-09 2006-02-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Serum free cultivation of primate embryonic stem cells
US6436704B1 (en) 2000-04-10 2002-08-20 Raven Biotechnologies, Inc. Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof
US6458589B1 (en) 2000-04-27 2002-10-01 Geron Corporation Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells
CN1449439A (zh) 2000-06-26 2003-10-15 株式会社雷诺再生医学研究所 细胞级分包括能分化为神经细胞的细胞
KR100850812B1 (ko) 2000-10-23 2008-08-06 스미스클라인 비참 코포레이션 신규 화합물
DK1362047T3 (da) 2000-12-08 2006-09-04 Ortho Mcneil Pharm Inc Indazolylsubstituerede pyrrolinforbindelser som kinaseinhibitorer
JP2004526676A (ja) 2000-12-08 2004-09-02 オーソ−マクニール・フアーマシユーチカル・インコーポレーテツド キナーゼ阻害剤として有用な大員複素環式化合物
US6599323B2 (en) 2000-12-21 2003-07-29 Ethicon, Inc. Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use
JP2005503759A (ja) 2001-01-24 2005-02-10 アメリカ合衆国 幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化方法
DK1355910T3 (da) 2001-01-25 2011-06-27 Us Of America Represented By The Secretary Dept Of Health And Human Services Formulering af borsyreforbindelser
US6656488B2 (en) 2001-04-11 2003-12-02 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Bioabsorbable bag containing bioabsorbable materials of different bioabsorption rates for tissue engineering
EP1379626A2 (en) 2001-04-19 2004-01-14 DeveloGen Aktiengesellschaft für entwicklungsbiologische Forschung A method for differentiating stem cells into insulin-producing cells
JP4296781B2 (ja) 2001-04-24 2009-07-15 味の素株式会社 幹細胞及びその分離方法
CA2447015A1 (en) 2001-05-15 2002-11-21 Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences Insulin producing cells derived from human embryonic stem cells
US6626950B2 (en) 2001-06-28 2003-09-30 Ethicon, Inc. Composite scaffold with post anchor for the repair and regeneration of tissue
KR100418195B1 (ko) 2001-07-05 2004-02-11 주식회사 우리기술 전력케이블의 다중절연진단장치 및 그 방법
GB0117583D0 (en) 2001-07-19 2001-09-12 Astrazeneca Ab Novel compounds
WO2003014313A2 (en) 2001-08-06 2003-02-20 Bresagen, Ltd. Alternative compositions and methods for the culture of stem cells
US6617152B2 (en) 2001-09-04 2003-09-09 Corning Inc Method for creating a cell growth surface on a polymeric substrate
EP1298201A1 (en) 2001-09-27 2003-04-02 Cardion AG Process for the production of cells exhibiting an islet-beta-cell-like state
WO2003033697A1 (en) 2001-10-18 2003-04-24 Ixion Biotechnology, Inc. Conversion of liver stem and progenitor cells to pancreatic functional cells
EP1442115B9 (en) 2001-11-15 2009-12-16 Children's Medical Center Corporation Methods of isolation, expansion and differentiation of fetal stem cells from chorionic villus, amniotic fluid, and placenta and therapeutic uses thereof
KR20120003961A (ko) 2001-12-07 2012-01-11 사이토리 테라퓨틱스, 인크. 처리된 리포애스퍼레이트 세포로 환자를 치료하기 위한 시스템 및 방법
EP2264146A1 (en) 2001-12-07 2010-12-22 Geron Corporation Islet cells from human embryonic stem cells
AU2002218893A1 (en) 2001-12-21 2003-07-09 Thromb-X Nv Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability
JP2005512593A (ja) 2001-12-28 2005-05-12 セルアーティス アーベー 多能性のヒト胚盤胞由来幹細胞株の樹立方法
US20030162290A1 (en) 2002-01-25 2003-08-28 Kazutomo Inoue Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells
US20030180268A1 (en) 2002-02-05 2003-09-25 Anthony Atala Tissue engineered construct for supplementing or replacing a damaged organ
JPWO2003087349A1 (ja) 2002-04-17 2005-08-18 大塚製薬株式会社 間葉系細胞から膵β細胞を形成する方法
US20040161419A1 (en) 2002-04-19 2004-08-19 Strom Stephen C. Placental stem cells and uses thereof
DE60319364T2 (de) 2002-05-08 2009-02-19 Janssen Pharmaceutica N.V. Substituierte pyrroline als kinase inhibitoren
US20060003446A1 (en) 2002-05-17 2006-01-05 Gordon Keller Mesoderm and definitive endoderm cell populations
JP2006512046A (ja) 2002-05-28 2006-04-13 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー ｉｎｖｉｔｒｏにおけるヒト膵臓腺房細胞の増殖およびインスリン産生細胞への分化転換のための方法
BR0311821A (pt) 2002-06-05 2005-04-05 Janssen Pharmaceutica Nv Derivados de bisindolil-maleimid como inibidores de cinase
GB0212976D0 (en) 2002-06-06 2002-07-17 Tonejet Corp Pty Ltd Ejection method and apparatus
CN1171991C (zh) 2002-07-08 2004-10-20 徐如祥 人神经干细胞的培养方法
US6877147B2 (en) 2002-07-22 2005-04-05 Broadcom Corporation Technique to assess timing delay by use of layout quality analyzer comparison
US7838290B2 (en) 2002-07-25 2010-11-23 The Scripps Research Institute Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith
EP1539930A4 (en) 2002-07-29 2006-08-09 Es Cell Int Pte Ltd METHOD IN MULTIPLE STAGES OF DIFFERENTIATION OF POSITIVE INSULIN-SENSITIVE CELLS, GLUCOSE
US20040063204A1 (en) 2002-08-14 2004-04-01 Lijun Yang Bone marrow cell differentiation
EP1539928A4 (en) 2002-09-06 2006-09-06 Amcyte Inc POSIOTIVE PANCREATIC ENDOCRINE PROGENITOR CELLS CD56 IN ADULT HUMAN BEINGS
US9969977B2 (en) 2002-09-20 2018-05-15 Garnet Biotherapeutics Cell populations which co-express CD49c and CD90
US20040062753A1 (en) 2002-09-27 2004-04-01 Alireza Rezania Composite scaffolds seeded with mammalian cells
AU2003285172A1 (en) 2002-11-08 2004-06-03 The Johns Hopkins University Human embryonic stem cell cultures, and compositions and methods for growing same
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
EP1567639A4 (en) 2002-12-05 2005-12-21 Technion Res & Dev Foundation CULTURE OF HUMAN PANCREATIC ISLANDS AND USES THEREOF
JP4613069B2 (ja) 2002-12-16 2011-01-12 テクニオン リサーチ アンド ディベロップメント ファウンデーション リミテッド 支持細胞非含有、異種非含有のヒト胚性幹細胞の調製方法およびこれらを使用して調製された幹細胞培養物
US20050118148A1 (en) 2002-12-20 2005-06-02 Roland Stein Compositions and methods related to mammalian Maf-A
RU2359671C2 (ru) 2003-01-29 2009-06-27 Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед Способ получения препарата с покрытием
KR101114808B1 (ko) 2003-01-29 2012-02-15 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 피복 제제의 제조법
US20070154981A1 (en) 2003-02-14 2007-07-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Insulin-producing cells derived from stem cells
US20070155661A1 (en) 2003-02-14 2007-07-05 The Board Of Trustees Of The Leland Standord Junior University Methods and compositions for modulating the development of stem cells
CA2520861A1 (en) 2003-03-27 2004-10-14 Ixion Biotechnology, Inc. Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway
WO2004090110A2 (en) 2003-03-31 2004-10-21 Bresagen Inc. Compositions and methods for the control, differentiation and/or manipulation of pluripotent cells through a gamma-secretase signaling pathway
US20090203141A1 (en) 2003-05-15 2009-08-13 Shi-Lung Lin Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant RNA agents
EP1641914B1 (en) 2003-06-27 2016-07-20 DePuy Synthes Products, Inc. Postpartum cells derived from placental tissue, and methods of making and using the same
IL161903A0 (en) 2003-07-17 2005-11-20 Gamida Cell Ltd Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs
ITRM20030395A1 (it) 2003-08-12 2005-02-13 Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz Terreno di coltura per il mantenimento, la proliferazione e il differenziamento di cellule di mammifero.
US7569385B2 (en) 2003-08-14 2009-08-04 The Regents Of The University Of California Multipotent amniotic fetal stem cells
US7157275B2 (en) 2003-08-15 2007-01-02 Becton, Dickinson And Company Peptides for enhanced cell attachment and growth
AU2004269395A1 (en) 2003-08-27 2005-03-10 Stemcells California, Inc. Enriched pancreatic stem cell and progenitor cell populations, and methods for identifying, isolating and enriching for these populations
JP2007515433A (ja) 2003-12-17 2007-06-14 アラーガン　インコーポレイテッド Ｃｙｐ２６ａおよびｃｙｐ２６ｂの選択的阻害剤を使用するレチノイド反応性障害の処置方法
GB0329498D0 (en) 2003-12-19 2004-01-28 Novartis Ag Organic compounds
US20060030042A1 (en) 2003-12-19 2006-02-09 Ali Brivanlou Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime
US7704738B2 (en) 2003-12-23 2010-04-27 Cythera, Inc. Definitive endoderm
CN112813019A (zh) 2003-12-23 2021-05-18 维亚希特公司 定形内胚层
US20050266554A1 (en) 2004-04-27 2005-12-01 D Amour Kevin A PDX1 expressing endoderm
US7625753B2 (en) 2003-12-23 2009-12-01 Cythera, Inc. Expansion of definitive endoderm cells
US7541185B2 (en) 2003-12-23 2009-06-02 Cythera, Inc. Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm
WO2005065354A2 (en) 2003-12-31 2005-07-21 The Burnham Institute Defined media for pluripotent stem cell culture
TWI334443B (en) 2003-12-31 2010-12-11 Ind Tech Res Inst Method of single cell culture of undifferentiated human embryonic stem cells
US7794704B2 (en) 2004-01-23 2010-09-14 Advanced Cell Technology, Inc. Methods for producing enriched populations of human retinal pigment epithelium cells for treatment of retinal degeneration
WO2005071066A1 (en) 2004-01-23 2005-08-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for preparing pancreatic insulin secreting cells
GB2441530B (en) 2004-02-12 2009-09-23 Univ Newcastle Stem Cells
WO2005080598A1 (ja) 2004-02-19 2005-09-01 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. 体細胞核初期化物質のスクリーニング方法
AU2005221095A1 (en) 2004-03-09 2005-09-22 John J. O'neil Methods for generating insulin-producing cells
CN1950498A (zh) 2004-03-10 2007-04-18 加利福尼亚大学董事会 培养胚胎干细胞的组合物和方法
KR101178786B1 (ko) 2004-03-23 2012-09-07 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 다능성 줄기세포의 증식 방법
WO2005097980A2 (en) 2004-03-26 2005-10-20 Geron Corporation New protocols for making hepatocytes from embryonic stem cells
WO2005097977A2 (en) 2004-04-01 2005-10-20 Wisconsin Alumni Research Foundation Differentiation of stem cells to endoderm and pancreatic lineage
JP4926946B2 (ja) 2004-04-27 2012-05-09 ヴィアサイト，インコーポレイテッド Ｐｄｘ１発現性内胚葉
JP5687816B2 (ja) 2004-07-09 2015-03-25 ヴィアサイト，インコーポレイテッド 胚体内胚葉を分化させるための因子を同定する方法
JP5102030B2 (ja) 2004-08-13 2012-12-19 ユニバーシティ・オブ・ジョージア・リサーチ・ファウンデイション・インコーポレイテッド ヒト胚性幹細胞における自己再生および分化のための組成物および方法
US20080268533A1 (en) 2004-08-25 2008-10-30 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Methods and Compositions Utilizing Myc and Gsk3Beta to Manipulate the Pluripotency of Embryonic Stem Cells
DE102004043256B4 (de) 2004-09-07 2013-09-19 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension
ES2383813T3 (es) 2004-09-08 2012-06-26 Wisconsin Alumni Research Foundation Método de cultivo y cultivo de células madre embrionarias
MX2007002389A (es) 2004-09-08 2009-02-12 Wisconsin Alumni Res Found Cultivo de celulas progenitoras embrionarias humanas.
AU2006208944A1 (en) 2005-01-28 2006-08-03 Imperial College Innovations Limited Methods for embryonic stem cell culture
AU2006210955A1 (en) 2005-01-31 2006-08-10 Es Cell International Pte Ltd. Directed differentiation of embryonic stem cells and uses thereof
WO2006088867A2 (en) 2005-02-15 2006-08-24 Medistem Laboratories, Incorporated Method for expansion of stem cells
ES2627419T3 (es) 2005-03-04 2017-07-28 Lifescan, Inc. Células estromales adultas derivadas del páncreas
GB0505970D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Univ Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitor, and uses thereof
CA2602684C (en) 2005-03-31 2014-07-22 Stemnion, Inc. Amnion-derived cell compositions, methods of making and uses thereof
CN100425694C (zh) 2005-04-15 2008-10-15 北京大学 诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法
EP1876893B1 (en) 2005-04-15 2012-04-11 Geron Corporation Cancer treatment by combined inhibition of proteasome and telomerase activities
JP4913730B2 (ja) * 2005-04-26 2012-04-11 一人 里村 膵臓β細胞再生方法および装置
EP1874367B1 (en) 2005-04-26 2011-07-06 Arhus Universitet Biocompatible material for surgical implants and cell guiding tissue culture surfaces
JP5092124B2 (ja) 2005-05-24 2012-12-05 国立大学法人 熊本大学 Ｅｓ細胞の分化誘導方法
AU2006202209B2 (en) 2005-05-27 2011-04-14 Lifescan, Inc. Amniotic fluid derived cells
MX2007015610A (es) 2005-06-10 2008-02-21 Irm Llc Compuestos que mantienen la fluripotencia de las celulas totipotentes embrionarias.
WO2006138433A2 (en) 2005-06-14 2006-12-28 The Regents Of The University Of California Induction of cell differentiation by class i bhlh polypeptides
EP1931764A1 (en) 2005-06-21 2008-06-18 GE Healthcare Bio-Sciences AB Method for cell culture
AU2006262369B2 (en) 2005-06-22 2012-07-05 Asterias Biotherapeutics, Inc. Suspension culture of human embryonic stem cells
NZ564179A (en) 2005-06-30 2010-09-30 Janssen Pharmaceutica Nv Cyclic anilino - pyridinotriazines as GSK-3 inhibitors
US20080194021A1 (en) 2005-07-29 2008-08-14 Mays Robert W Use of a Gsk-3 Inhibitor to Maintain Potency of Culture Cells
CA2616863A1 (en) 2005-07-29 2007-02-01 Australian Stem Cell Centre Limited Compositions and methods for growth of pluripotent cells
WO2007025234A2 (en) 2005-08-26 2007-03-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Generation of pancreatic endocrine cells from primary duct cell cultures and methods of use for treatment of diabetes
US8476070B2 (en) 2005-08-29 2013-07-02 Technion Research & Development Foundation Limited Media for culturing stem cells
KR20080056181A (ko) 2005-09-02 2008-06-20 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치 전구세포주의 유도 방법
GB2444686B (en) 2005-09-12 2010-08-25 Es Cell Int Pte Ltd Differentiation of pluripotent stem cells using p38 MAPK inhibitors or prostaglandins
US20100322906A1 (en) 2005-10-05 2010-12-23 Osaka University Method for Obtaining Pancreatic Endocrine Cells From Adipose Tissue-Origin Cells
CN101310012B (zh) 2005-10-14 2012-05-09 明尼苏达大学董事会 非胚胎干细胞分化成具有胰腺表型的细胞
US7732202B2 (en) 2005-10-21 2010-06-08 International Stem Cell Corporation Oxygen tension for the parthenogenic activation of human oocytes for the production of human embryonic stem cells
US20070122905A1 (en) 2005-10-27 2007-05-31 D Amour Kevin A PDX1-expressing dorsal and ventral foregut endoderm
EP2206724A1 (en) 2005-12-13 2010-07-14 Kyoto University Nuclear reprogramming factor
WO2007082963A1 (es) 2006-01-18 2007-07-26 Fundación Instituto Valenciano De Infertilidad Líneas de células madre embrionarias humanas y métodos para usar las mismas
EP1994141B1 (en) 2006-02-23 2017-11-15 ViaCyte, Inc. Compositions and methods useful for culturing differentiable cells
WO2007103282A2 (en) 2006-03-02 2007-09-13 Cythera, Inc. Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production
US7695965B2 (en) 2006-03-02 2010-04-13 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
CA2650812C (en) 2006-04-28 2017-12-12 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
US8741643B2 (en) 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage
US20070259423A1 (en) 2006-05-02 2007-11-08 Jon Odorico Method of differentiating stem cells into cells of the endoderm and pancreatic lineage
US8685730B2 (en) 2006-05-02 2014-04-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods and devices for differentiating pluripotent stem cells into cells of the pancreatic lineage
WO2007136673A2 (en) 2006-05-19 2007-11-29 Medistem Laboratories, Inc. Treatment of disc degenerative disease and compositions for same
WO2007139929A2 (en) 2006-05-25 2007-12-06 The Burnham Institute For Medical Research Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells
AU2007254766A1 (en) 2006-06-02 2007-12-13 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Pancreatic and liver endoderm cells and tissue by differentiation of definitive endoderm cells obtained from human embryonic stems
CN101541953A (zh) 2006-06-02 2009-09-23 佐治亚大学研究基金会 通过从人胚胎干细胞获得的定形内胚层细胞的分化得到胰和肝内胚层细胞及组织
US8415153B2 (en) 2006-06-19 2013-04-09 Geron Corporation Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells
CN100494359C (zh) 2006-06-23 2009-06-03 中日友好医院 神经干细胞三维立体培养体外扩增的方法
EP2046946B8 (en) 2006-06-26 2017-01-25 Lifescan, Inc. Pluripotent stem cell culture
US20080003676A1 (en) 2006-06-26 2008-01-03 Millipore Corporation Growth of embryonic stem cells
US8968994B2 (en) 2006-07-06 2015-03-03 Jeremy Micah Crook Method for stem cell culture and cells derived therefrom
AU2007277364B2 (en) 2006-07-26 2010-08-12 Viacyte, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
ES2704401T3 (es) 2006-08-02 2019-03-18 Technion Res & Dev Foundation Métodos de expansión de células madre embrionarias en un cultivo en suspensión
KR101331510B1 (ko) 2006-08-30 2013-11-20 재단법인서울대학교산학협력재단 저농도의 포도당을 함유하는 인간 배아줄기세포용 배지조성물 및 이를 이용한 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린생산 세포 또는 세포괴로 분화시키는 방법, 그리고그로부터 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴
JP2008099662A (ja) 2006-09-22 2008-05-01 Institute Of Physical & Chemical Research 幹細胞の培養方法
US20080091234A1 (en) 2006-09-26 2008-04-17 Kladakis Stephanie M Method for modifying a medical implant surface for promoting tissue growth
US20100323442A1 (en) 2006-10-17 2010-12-23 Emmanuel Edward Baetge Modulation of the phosphatidylinositol-3-kinase pathway in the differentiation of human embryonic stem cells
MX2009004096A (es) 2006-10-17 2009-06-16 Stiefel Laboratories Metabolitos de talarozol.
CA2666789C (en) 2006-10-18 2016-11-22 Yong Zhao Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use
US20110151554A1 (en) 2006-11-09 2011-06-23 Akira Yuo Method for culturing and subculturing primate embryonic stem cell, as well as method for inducing differentiation thereof
US8217027B2 (en) 2006-12-21 2012-07-10 Abbott Laboratories Sphingosine-1-phosphate receptor agonist and antagonist compounds
TW200836749A (en) 2007-01-09 2008-09-16 Vioquest Pharmaceuticals Inc Compositions including triciribine and bortezomib and derivatives thereof and methods of use thereof
CN103627671A (zh) 2007-01-30 2014-03-12 佐治亚大学研究基金会 产生中内胚层细胞及多能游走细胞的方法与细胞群及用途
GB0703188D0 (en) 2007-02-19 2007-03-28 Roger Land Building Large scale production of stem cells
US20090053182A1 (en) 2007-05-25 2009-02-26 Medistem Laboratories, Inc. Endometrial stem cells and methods of making and using same
CA2691793A1 (en) 2007-06-29 2009-01-08 Cellular Dynamics International, Inc. Automated method and apparatus for embryonic stem cell culture
CN101978044B (zh) 2007-07-01 2017-10-24 生命扫描有限公司 单个多能干细胞培养
EP3957716A1 (en) 2007-07-18 2022-02-23 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
EP2185691B1 (en) 2007-07-31 2018-03-14 Lifescan, Inc. Pluripotent stem cell differentiation by using human feeder cells
KR101544498B1 (ko) 2007-08-24 2015-08-17 스티칭 허트 네덜란드 칸커 인스티튜트 종양성 질환의 치료를 위한 조성물
US20110151447A1 (en) 2007-11-06 2011-06-23 Children's Medical Center Corporation Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells from non-embryonic human cells
US9062290B2 (en) * 2007-11-27 2015-06-23 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
SG154367A1 (en) 2008-01-31 2009-08-28 Es Cell Int Pte Ltd Method of differentiating stem cells
WO2009096049A1 (ja) 2008-02-01 2009-08-06 Kyoto University 人工多能性幹細胞由来分化細胞
EP2250252A2 (en) 2008-02-11 2010-11-17 Cambridge Enterprise Limited Improved reprogramming of mammalian cells, and the cells obtained
MX2010009251A (es) 2008-02-21 2010-11-25 Centocor Ortho Biotech Inc Metodos, placas de superficie modificada y composiciones para la fijacion, el cultivo y el desprendimiento celular.
JPWO2009110215A1 (ja) 2008-03-03 2011-07-14 独立行政法人科学技術振興機構 繊毛細胞の分化誘導方法
EP2479260B1 (en) 2008-03-17 2016-01-06 Agency For Science, Technology And Research Microcarriers for stem cell culture
RU2359030C1 (ru) 2008-03-19 2009-06-20 Общество С Ограниченной Ответственностью "Лаборатория Клеточных Технологий" Способ получения эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека (варианты)
DK2283117T3 (da) 2008-04-21 2014-01-20 Viacyte Inc Fremgangsmåde til oprensning af pancreatiske endodermceller afledt fra humane embryoniske stamceller
US8338170B2 (en) 2008-04-21 2012-12-25 Viacyte, Inc. Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
WO2009132083A2 (en) 2008-04-22 2009-10-29 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for promoting the generation of pdx1+ pancreatic cells
US8623648B2 (en) 2008-04-24 2014-01-07 Janssen Biotech, Inc. Treatment of pluripotent cells
US7939322B2 (en) 2008-04-24 2011-05-10 Centocor Ortho Biotech Inc. Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm
EP2294187A2 (en) 2008-05-21 2011-03-16 BioE LLC Differentiation of multi-lineage progenitor cells to pancreatic cells
US20090298178A1 (en) 2008-06-03 2009-12-03 D Amour Kevin Allen Growth factors for production of definitive endoderm
WO2009154606A1 (en) 2008-06-03 2009-12-23 Cythera, Inc. Growth factors for production of definitive endoderm
ES2697798T3 (es) 2008-06-30 2019-01-28 Janssen Biotech Inc Diferenciación de células madre pluripotentes
DE102008032236A1 (de) 2008-06-30 2010-04-01 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit adipozytärem, chondrozytärem und pankreatischem Differenzierungspotential
US20100028307A1 (en) 2008-07-31 2010-02-04 O'neil John J Pluripotent stem cell differentiation
WO2010022395A2 (en) 2008-08-22 2010-02-25 President And Fellows Of Harvard College Methods of reprogramming cells
EP2334804B1 (en) 2008-10-07 2013-12-04 True North Therapeutics, Inc. Co-culture compositions and methods
CA2742268C (en) 2008-10-31 2020-02-18 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage
US8008075B2 (en) 2008-11-04 2011-08-30 Viacyte, Inc. Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof
CA2742583C (en) 2008-11-04 2022-09-27 Viacyte, Inc. Stem cell aggregate suspension compositions and methods for differentiation thereof
JP2012508584A (ja) 2008-11-14 2012-04-12 ヴィアサイト，インコーポレイテッド ヒト多能性幹細胞由来膵臓細胞のカプセル化
AU2009316580B2 (en) 2008-11-20 2016-04-14 Janssen Biotech, Inc. Pluripotent stem cell culture on micro-carriers
WO2010063848A1 (en) 2008-12-05 2010-06-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method and medium for neural differentiation of pluripotent cells
EP2456858B1 (en) 2009-07-20 2018-08-29 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
GB2485113B (en) 2009-07-20 2016-12-28 Janssen Biotech Inc Differentiation of human embryonic stem cells into cells of the pancreatic endoderm lineage
KR20170118969A (ko) 2009-07-20 2017-10-25 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 분화
KR101755214B1 (ko) 2009-08-12 2017-07-07 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 만능줄기세포의 신경전구세포로의 분화 유도 방법
KR101861584B1 (ko) 2009-10-29 2018-05-28 얀센 바이오테크 인코포레이티드 만능 줄기 세포
EP3633025B1 (en) 2009-11-12 2022-09-14 Technion Research & Development Foundation Ltd. Culture media, cell cultures and methods of culturing pluripotent stem cells in an undifferentiated state
FI20096288A0 (fi) 2009-12-04 2009-12-04 Kristiina Rajala Formulations and methods for culturing stem cells
PL2516626T3 (pl) 2009-12-23 2017-10-31 Janssen Biotech Inc Różnicowanie ludzkich zarodkowych komórek macierzystych
WO2011079017A2 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
US8932853B2 (en) 2009-12-29 2015-01-13 Takeda Pharmaceutical Company Limited Method for manufacturing pancreatic-hormone-producing cells
TR201000243A2 (tr) 2010-01-13 2010-06-21 Akdeni̇z Ahmet Mile açılan kama kanalını ölçmeye ve kontrol etmeye yarayan ölçüm cihazı
JP5812492B2 (ja) 2010-02-03 2015-11-11 国立研究開発法人国立がん研究センター 誘導肝幹細胞及びその製造方法、並びに、該細胞の応用
SG10201501503VA (en) * 2010-03-01 2015-04-29 Janssen Biotech Inc Methods for purifying cells derived from pluripotent stem cells
SG10201501513TA (en) 2010-03-02 2015-04-29 Univ Singapore Culture additives to boost stem cell proliferation and differentiation response
JP5909482B2 (ja) 2010-03-31 2016-04-26 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート 細胞の再プログラム
JP2013524836A (ja) 2010-04-25 2013-06-20 マウント・シナイ・スクール・オブ・メディスン 多能性細胞からの前部前腸内胚葉の生成
JP5936134B2 (ja) 2010-06-15 2016-06-15 国立大学法人京都大学 ヒト人工多能性幹細胞の選択方法
US9085757B2 (en) 2010-06-17 2015-07-21 Regents Of The University Of Minnesota Production of insulin producing cells
KR101829488B1 (ko) 2010-08-05 2018-02-14 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 인간 다분화능 세포 배양을 위한 단순화된 기본 배지
KR101877077B1 (ko) 2010-08-09 2018-07-10 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 췌호르몬-생성 세포의 제조 방법
EP2611910B1 (en) 2010-08-31 2018-01-17 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
BR112013004614A2 (pt) 2010-08-31 2024-01-16 Janssen Biotech Inc Diferenciação de células-tronco pluripotentes
MY177150A (en) 2011-02-28 2020-09-08 Stempeutics Res Malaysia Sdn Bhd Isolation and expansion of adult stem cells, their therapeutic composition and uses thereof
US20130274184A1 (en) 2011-10-11 2013-10-17 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Er stress relievers in beta cell protection
WO2013056072A1 (en) 2011-10-13 2013-04-18 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells
US9670463B2 (en) 2011-10-14 2017-06-06 Children's Medical Center Corporation Inhibition and enhancement of reprogramming by chromatin modifying enzymes
JP6441080B2 (ja) 2011-12-22 2018-12-19 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 単一ホルモンのインスリン陽性細胞へのヒト胚性幹細胞の分化
US9092957B2 (en) 2011-12-22 2015-07-28 Intel Corporation Always-available embedded theft reaction subsystem
US10519422B2 (en) 2012-02-29 2019-12-31 Riken Method of producing human retinal pigment epithelial cells
EP2859091B1 (en) 2012-06-08 2018-08-29 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells
JP6470687B2 (ja) 2012-09-03 2019-02-13 ノヴォ ノルディスク アー／エス 小分子を用いた多能性幹細胞からの膵臓内胚葉の作製
RU2684215C2 (ru) 2012-12-31 2019-04-04 Янссен Байотек, Инк. Способ получения панкреатических эндокринных клеток (варианты) и способ увеличения выхода бета-клеток
WO2014105543A1 (en) 2012-12-31 2014-07-03 Janssen Biotech, Inc. Culturing of human embryonic stem cells at the air-liquid interface for differentiation into pancreatic endocrine cells
WO2014127164A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 Allergan, Inc. Substituted dihydropyrazoles as sphingosine receptor modulators
US8859286B2 (en) 2013-03-14 2014-10-14 Viacyte, Inc. In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells
AU2014239954B2 (en) 2013-03-15 2020-07-16 The Jackson Laboratory Isolation of non-embryonic stem cells and uses thereof
DE202014011287U1 (de) 2013-06-11 2019-02-06 The President And Fellows Of Harvard College SC-ß Zellen und Zusammensetzungen zur Erzeugung der Zellen
CN108699515A (zh) 2016-02-24 2018-10-23 诺和诺德股份有限公司 由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性β细胞

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009018453A1 (en) * 2007-07-31 2009-02-05 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
WO2010051213A1 (en) * 2008-10-31 2010-05-06 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage
WO2011143299A2 (en) * 2010-05-12 2011-11-17 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of human embryonic stem cells

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ГИЛБЕРТ С. Биология развития: В 3-х т. Т.1: Пер. с англ. - М.: Мир, 1993. - 228 с. *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2794857A1 (en) 2014-10-29
US10358628B2 (en) 2019-07-23
RU2668798C2 (ru) 2018-10-02
JP2015503331A (ja) 2015-02-02
JP7191925B2 (ja) 2022-12-19
AU2012355698A1 (en) 2014-07-10
BR112014015417A8 (pt) 2017-07-04
JP6851358B2 (ja) 2021-03-31
AU2021221411B2 (en) 2024-03-07
SG10201608914WA (en) 2016-12-29
KR102090751B1 (ko) 2020-03-19
RU2014130042A (ru) 2016-02-20
RU2018132199A (ru) 2018-10-31
CA2860107A1 (en) 2013-06-27
US20150353895A1 (en) 2015-12-10
US9388386B2 (en) 2016-07-12
JP2021052789A (ja) 2021-04-08
WO2013095953A1 (en) 2013-06-27
AU2019201293B2 (en) 2021-05-27
HK1203552A1 (en) 2015-10-30
AU2019201293A1 (en) 2019-03-14
KR20140103179A (ko) 2014-08-25
US20190292523A1 (en) 2019-09-26
JP2023025204A (ja) 2023-02-21
AU2012355698B2 (en) 2018-11-29
AR089426A1 (es) 2014-08-20
SG11201403473QA (en) 2014-10-30
US11377640B2 (en) 2022-07-05
US20220275340A1 (en) 2022-09-01
EP2794857A4 (en) 2015-07-08
BR112014015417A2 (pt) 2017-06-13
CA2860107C (en) 2021-06-01
AU2021221411A1 (en) 2021-09-16
JP2019047810A (ja) 2019-03-28
PH12014501429A1 (en) 2014-09-22
JP6441080B2 (ja) 2018-12-19
MX2014007744A (es) 2015-01-12
KR102203056B1 (ko) 2021-01-14
KR20200030133A (ko) 2020-03-19
CN105143446A (zh) 2015-12-09
RU2018132199A3 (ru) 2019-05-24
CN105143446B (zh) 2020-11-03
US20130189777A1 (en) 2013-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2705001C2 (ru) Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека в одногормональные инсулинположительные клетки
JP7278990B2 (ja) Ｈｂ９調節物を用いたヒト胚性幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化
RU2668814C2 (ru) Способы продуцирования клеток дефинитивной энтодермы и панкреатической энтодермы