CN103627671A - 产生中内胚层细胞及多能游走细胞的方法与细胞群及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及由灵长类多能干细胞（pPSCs）产生早期中胚层细胞，以及中胚层细胞分化的新方法、制备能够分化成中胚层或内胚层细胞系的多能游走细胞（MMC）、从pPSCs产生中内胚层细胞的方法、产生定义的定形内胚层细胞的方法、产生多能游走细胞的方法、产生中胚层前体细胞（IMPs）的方法和制备用于心血管疾病的治疗的药物中的用途。MMC是稳定和健康的，能够传代至少20次（可能无限地），并可以经冷冻后复苏、再扩增和分化为多种细胞系。因此，它们是储存稳定的。产生这些细胞的方法针对从胚泡（blastocycts）产生多能细胞类型（MMC），从而不用经过典型的人胚胎干细胞状态即可产生治疗上有用的细胞类型。

Description

产生中内胚层细胞及多能游走细胞的方法与细胞群及用途
本申请为申请日为2008年1月30日、申请号为200880009636.5、名称为“用于产生内胚层和中胚层细胞系及多能游走细胞（MMC）的早期中胚层细胞即稳定的中内胚层细胞群”的中国发明专利申请的分案申请。 
技术领域
本发明涉及由灵长类多能干细胞（pPSCs）（尤其是包括人胚胎干细胞（hESCs））产生早期中胚层细胞，以及中胚层细胞分化的新方法。所述这些方法可以产生关键的多能前体，该多能前体具有形成心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞系的潜能。这些方法可以用于包括BG01和BG02在内的所有的人胚胎干细胞（hESC）系。 
本发明还涉及能够分化为中胚层或内胚层细胞系的稳定多能游走细胞（MMC）的产生。MMCs可以传代至少20次（可能无限地），并可以经冷冻后复苏、再扩增和分化为多种细胞系。产生所述这些细胞的方法针对从胚泡（blastocycts）产生多能细胞类型（MMC），从而不用经过典型的hESC状态即可产生治疗上有用的细胞类型。 
本发明还涉及从灵长类多能干细胞（pPSCs）（尤其是hESCs）产生中内胚层细胞的方法、产生定义的定形内胚层细胞的方法、产生多能游走细胞（MMCs）的方法、产生中胚层前体细胞（IMPs）的方法和心血管疾病的细胞治疗。 
本申请要求2007年1月30日提交的在先申请US60/898,204和2007年9月19日提交的在先申请US60/994,354的优先权，这两个申请都以其整体在此引入作为参考。 
背景技术
人胚胎干细胞（hESCs）（hESCs的标记包括SSEA3、SSEA4、TRA-1-60抗原、TRA-1-81抗原、Nanog、Oct4）为一种多能细胞群，能分化成衍生自所有三个胚层和胚外细胞系的细胞。hESC的此种特性使其在细胞治疗（例如糖尿病、心脏病、神经退化性疾病）、药物开发和建立发育模型方面具有重要的意义。 
在小鼠中已鉴定了其它的多能细胞类型。原始的外胚层样（EPL;Rathjen等人,1999,J.Cell Sci）细胞由mESC形成并具有去分化成为mESC的能力。最近，鉴定了一种新的小鼠细胞—植入后外胚层干细胞（EpiSC;Tesar等人,Nature448:196-202;2007），该细胞与hESC（Nanog+、Sox2+、Oct4+）具有相同的特性。所有这些小鼠的多能细胞类型能够在体外或畸胎瘤测定中产生三个胚胎干细胞层。 
外胚层干细胞（EpiScs）和诱导的多能干细胞（iPS）符合广义的多能细胞类别，并且在概念上，本申请描述的技术可以应用于这些和其它多能细胞类型（即灵长类多能细胞）。EpiSc外胚层干细胞从植入后早期的胚胎中分离，该细胞表达Oct4并具有多能性（Tesar等人,Nature,VoI448.p.19612July2007）。由成人皮肤成纤维细胞、或其它成体细胞通过反转录病毒转导4个基因（c-myc、Klf4、Sox2、Oct4）而去分化变回多能状态，形成诱导的多能干细胞（iPS细胞）（Takahashi和Yamanaka,Cell126,663-676,August25,2006）。 
发展其它非ESC的自我更新的多能干细胞将有助于改善发育模型，促进向成体细胞的定向分化，并且比传统方法更有效且更经济。 
附图说明
图1：在确定培养基中的基质胶（matrigel）上生长的BG02hESCs细胞 的放大倍数10×、20×、40×的明视场图（bright field picture）。 
图2：显示了外胚层、中胚层、内胚层和胚外细胞系的可能的hESC细胞命运的示意图。 
图3：显示了导致形成T+中内胚层细胞的分化途径的示意图，其中，所述T+中内胚层细胞可以进一步分化为中胚层细胞（Meso）或定形的内胚层细胞（DE）。 
图4：显示了在确定的培养基中并向BG01hESCs中加入Wnt3a的条件下中内胚层细胞的形成。（A）在加入Wnt3a（25ng/ml）后3天的时期内，对Nanog、T、Eomes和MixLl转录本的Q-PCR分析。（B）用Wnt3a（25ng/ml）处理细胞2天（48小时）时细胞的免疫染色，图中柱状板块显示未处理（hESCs）的和处理的（+Wnt3a）样品中的E-钙粘蛋白（cadherin）、Nanog、T、β-连环蛋白（catenin）和Snail的染色。 
图5：显示了在存在典型的Wnt信号及缺失TGFβ信号的条件下形成中内胚层细胞的模型。 
图6：在确定培养基中的基质胶上生长的BG02hESCs，用BIO处理48小时后中内胚层细胞的形成。免疫染色显示了在未处理的hESCs和BIO处理的细胞中的T、Nanog、E-钙粘蛋白和Snail的染色。用DAPI染色DNA。（B）用BIO处理hESCs48小时后，对Nanog、T、MixL1转录本的Q-PCR分析。 
图7：将生长在MEF-CM中的基质胶上的经胰酶传代的BG01hESCs用BIO（2μM）处理4天。用（A）T探针和（B）E-钙粘蛋白、Oct4探针对细胞进行免疫染色。图中也显示了合并的图像。使用DAPI来检测DNA。 
图8：将生长在MEF-CM中的基质胶上的经胶原酶传代的BG01hESCs用BIO（2μM）处理4天。用（A）E-钙粘蛋白探针和（B）T和Nanog探针对细胞进行免疫染色。图中也显示了合并的图像。使用DAPI来检测DNA。 
图9：在存在BIO和SB431542的条件下的中内胚层细胞的形成。用BIO（2μM）和SB431542（20μM）处理8天的hESCs细胞的Q-PCR分析。图中显示了Nanog、T、Sox17、CXCR4、FoxF1和PDGFRα的信号水平，其中，图9A显示了Nanog、T和Sox17的信号水平，图9B显示了CXCR4、FoxF1和PDGFRα的信号水平。 
图10：显示用BMP4和Wnt3a/BIO处理hESCs后，通过中内胚层中间态（mesendoderm intermediate）形成中胚层细胞的示意图。 
图11：用Wnt3a（25ng/ml）和BMP4（100ng/ml）处理10天后，hESCs分化成Isl1+多能祖细胞（IMP）。图中显示了T、Sox17、PDGFRα、KDR、Isl1、Tbx20、GATA4、VE-钙粘蛋白和cTNT的转录本分析，其中，图11A显示了T、Sox17和PDGFRα的转录本分析，图11B显示了KDR、Isl1和Tbx20的转录本分析，图11C显示了GATA4、VE-钙粘蛋白和cTNT的转录本分析。 
图12：用Wnt3a（25ng/ml）和BMP4（100ng/ml）处理144小时后，hESCs经过T+状态的转变。图中显示了T的免疫染色。用DAPI来表示DNA。合并代表DAPI/T的分层染色（staining superimposed）。 
图13：用Wnt3a（25ng/ml）和BMP4（100ng/ml）处理144小时后，hESCs分化为Isl1+状态。图中显示了Isl1、Nanog、Nkx2.5和Tbx20的免疫染色。用DAPI来表示DNA。合并代表使用Nanog/Isll或Nkx2.5/Tbx20的DAPI染色。 
图14：hESCs（BG02）和在所示时间点用Wnt3a（25ng/ml）、BMP4（100ng/ml）处理的细胞的明视场图。图中标出了图像的放大倍数。 
图15：表示hESCs向中内胚层细胞（MesEnd）和随后的中胚层细胞（Meso）分化的途径的示意图。第一个步骤涉及用Wnt3a/BIO处理1-3天，然后用BMP4另外处理2-4天。 
图16：用BIO（2μM）和BMP4（100ng/ml）处理5天的hESCs的明视场图。此情况下，hESCs生长在MEF-CM中的基质胶上。图中标出了放大倍数。 
图17：用BIO（2μM）和BMP4（100ng/ml）处理hESCs（BG02）6天后，Isl1+多能祖细胞（IMPs）的产生。Q-PCR分析显示该时期内Oct4、Nanog、Lefty A、T、MixLl、Goosecoid、Sox17、CXCR4、FoxF1、PDGFRα、PDGFRβ、GATA4、Tbx20和Isl1的转录本水平，其中，图17A显示了Q-PCR分析显示该时期内Oct4、Nanog和Lefty A的转录本水平，图17B显示了Q-PCR分析显示该时期内T、MixLl和GSC的转录本水平，图17C显示了Q-PCR分析显示该时期内Sox17、CXCR4和FoxF1的转录本水平，图17D显示了Q-PCR分析显示该时期内PDGFRα、PDGFRβ和GATA4的转录本水平，图17E显示了Q-PCR分析显示该时期内Tbx20和Isl1的转录本水平。 
图18：显示hESC分化成中内胚层细胞和随后分化成中胚层细胞的途径的示意图。在存在TGFβ抑制剂（例如SB431542）、及Wnt3a/BIO和BMP4（1-4天）的条件下，hESCs分化成中内胚层细胞。显示了在存在Wnt3a/BIO和BMP42-4天的条件下，中内胚层细胞分化成中胚层细胞。 
图19：显示hESC分化成中内胚层细胞和随后分化成中胚层细胞的途径的示意图。在存在TGFβ抑制剂（例如SB431542）、及Wnt3a/BIO（1-4天）的条件下，hESCs分化成中内胚层细胞。在存在BMP42-4天的条件下，中内胚层细胞分化成中胚层细胞。 
图20：在含Wnt3a（25ng/ml）、BMP4（100ng/ml）的培养基中的基质胶上培养6天，hESCs分化成IMPs。在第6天，细胞以1:5的比例传代，然后铺种（plated）在含相同浓度的Wnt3a和BMP4的确定培养基中的基质胶上再生长10天。将细胞进行平滑肌标记Calponin（一种钙结合蛋白）、平滑肌肌动蛋白（SMA）、平滑肌肌球蛋白重链（SM-MHC）和Caldesmin（钙调素结合蛋白）的免疫染色。用DAPI来染色DNA。 
图21：从Isl1+多能祖细胞（IMPs）产生心肌细胞和内皮细胞。用三种不同方法处理细胞6天以产生IMPs。处理1：开始的24小时hESCs在含有活化素A（100ng/ml）的确定培养基中生长，在含有Wnt3a（25ng/ml）的确定培养基中生长1-4天，在含有BMP4（100ng/ml）的确定培养基中生长2-6天。处理2：hESCs在无IGF-I、Heregulin和EGF2但含有Wnt3a（25ng/ml）的确定培养基中生长1-2天，在含有BMP4（100ng/ml）的确定培养基中生长2-6天。然后细胞在确定培养基中再生长14天。对心脏α肌动蛋白/ACTC1、cTNT、CD31/PECAM1和CDH5/VE-钙粘蛋白标记进行Q-PCR分析。 
图22：显示hESCs经中内胚层细胞（MesEnd）的中间态分化成定形的 内胚层细胞（DE）的示意图。在确定培养基中的hESCs用TGFβ抑制剂（例如SB431542）、Wnt3a/BIO处理1-3天，然后换成含有高水平活化素A（100ng/ml）但不含IGF-I和Heregulin的确定培养基再培养1-3天。 
图23：显示hESCs经中内胚层细胞（MesEnd）的中间态分化成定形内胚层细胞（DE）的示意图。在确定培养基中的hESCs在含有高水平活化素A（100ng/ml）但不含IGF-I和Heregulin的条件下用BIO处理3-5天。 
图24：显示hESCs经中内胚层细胞（MesEnd）中间状态分化成定形内胚层细胞（DE）的示意图。在确定培养基中的hESCs在含有低水平活化素A（10ng/ml）但不含IGF-I和Heregulin的条件下用BIO处理3-5天。 
图25：向在确定培养基中的基质胶上生长的hESCs（BG02）中加入BIO（2μM）和SB431542（20μM）处理4天，然后在含有高水平活化素A（100ng/ml）但不含Heregulin和IGF-I的条件下再处理4天，形成定形内胚层细胞（DE）。图中显示了Nanog、T、Sox17、CXCR4、FoxF1和PDGFRα转录本的Q-PCR分析，其中，图25A显示了Nanog和T转录本的Q-PCR分析，图25B显示了Sox17和CXCR4转录本的Q-PCR分析，图25C显示 了FoxF1和PDGFRα转录本的Q-PCR分析。 
图26：用BIO（2μM）和SB431542（20μM）处理hESCs（BG02）8天，多能间充质细胞（MMCs）的形成。图中显示了Nanog、T、Sox17、CXCR4、FoxF1和PDGFRα转录本水平的Q-PCR分析，图26A显示了Nanog、T和Sox17转录本水平的Q-PCR分析，图26B显示了CXCR4、FoxF1和PDGFRα转录本水平的Q-PCR分析。 
图27：用BIO（2μM）和SB431542（20μM）处理hESCs（BG02）4天后，多能间充质细胞（MMCs）的形成。图中显示了（A）T、（B）Oct4和Nanog、及（C）E-钙粘蛋白的免疫染色。用DAPI染色DNA。 
图28：多能间充质细胞（MMCs）在含有BIO（2μM）和SB431542（20μM）的确定培养基中连续生长10代。每5天用AccutaseTM（Innovative Cell Technologies）以1:5的比例对细胞进行传代。Q-PCR分析显示在不同代的细胞和hESCs（BG01）中的Nanog、T、Eomes、FoxF1、Sox17和Fgf5的转录本水平。 
图29：衍生自BG02hESCs的多能间充质细胞（MMCs）生长到第7代时，显示没有表达多能hESC标记，例如E-钙粘蛋白、Nanog和Oct4。DAPI染色表示DNA。图中显示了DAPI与Nanog或E-钙粘蛋白/Oct4合并图像。 
图30：（A）衍生自BG02hESCs的多能间充质细胞（MMCs）在含有BIO（2μM）和SB431542（20μM）的确定培养基中生长20代的明视场图。图中显示了铺种后3天（低密度）的细胞和铺种后6天（高密度）的细胞。图中标出了图像的放大倍数。（B）将从BG02hESCs产生的第14代MMCs冷冻储存、解冻并在前述条件下重新铺种以维持MMCs。图中显示了冷冻储存前的MMCs（第14代）和复苏的MMCs的明视场图。（C）用APC缀合的抗CXCR4抗体对第14代MMCs进行染色，然后进行FACS（荧光活性细胞分选）分析。用FACS回收的CXCR4+细胞在标准MMC培养条件下铺种，图中显示了分选后5天的明视场图像。 
图31：在确定培养基中生长的hESCs（BG02）和在含有BIO（2μM）和SB431542（20μM）的确定培养基中生长的多能间充质细胞（MMCs）的SSEA3和SSEA4细胞表面标记的分析。图中标出了MMC的代数。图中显示了流式细胞术分析，其中MMCs和hESCs用SSEA3和SSEA4的抗体染色。IC表示抗体的同种型对照，其中，图31A显示了BG02和MMC P0的SSEA3和SSEA4细胞表面标记的分析，图31B显示了MMC P4和MMC P13的SSEA3和SSEA4细胞表面标记的分析，图31C显示了MMC P19的SSEA3和SSEA4细胞表面标记的分析。 
图32：多能间充质细胞（MMCs）在添加BIO（2μM）和SB431542（20μM）的确定培养基中生长6代。然后将MMCs平铺在无IGF-I和Heregulin但含有高水平活化素A（100ng/ml）的确定培养基中的基质胶上，培养4天。Q-PCR分析显示Nanog、T、Fgf5、Eomes、Sox17和CXCR4的转录本水平。 
图33：显示从hESCs和它们能够分化成的可能的细胞类型形成多能间充质细胞（MMCs）的示意图。 
发明内容
第一方面，本发明涉及产生中内胚层细胞群的新方法，该方法包括：将灵长类多能干细胞（pPSCs）（尤其是hESCs）暴露于含有有效量的至少一种GSK（优选GSK3）抑制剂（例如BIO）、或包括Wnt蛋白（Wingless蛋白，例如Wnt3a；和其它蛋白）或相关蛋白在内的相关化合物（如此处另外描述的）的分化培养基中，持续足够的时间（通常约18小时到约72小时或更长），以产生中内胚层细胞群，该中内胚层细胞群可以分离并传代、储存（冷冻储存）或进一步分化（如下所述）以产生中胚层（Isl+）前体细胞。 
第二方面，本发明涉及产生中胚层（Isl+）细胞群的新方法，该方法包括：将pPSCs（尤其是hESCs）暴露于含有有效量的至少一种GSK（优选GSK3）抑制剂（例如BIO）、或包括Wnt蛋白（Wingless蛋白，例如Wnt3a，和其它蛋白）或相关蛋白在内的相关化合物（如此处另外描述的）的分化培养基中，持续足够的时间（通常约18小时到约36小时，优选约1-2天），以产生中内胚层细胞群，可以任选地将该中内胚层细胞群分离，并且随后将第一个步骤中产生的所述中内胚层细胞群暴露于含有效量的GSK抑制剂（例如BIO）、或包括Wnt蛋白（Wingless蛋白，例如Wnt3a，和其它蛋白）或相关蛋白在内的相关化合物（如此处另外描述的）以及含有效量的骨形成蛋白（BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7）的分化培养基中，持续足够的时间（通常约2-9天、约3-6天、约3-5天、约72-132小时、约120-130小时），以产生中胚层Isl1+细胞（胰岛1心血管祖细胞）。此处应当注意，在特定实施方式中，GSK抑制剂可以从分化培养基中除去，从而可以在不存在GSK抑制剂的条件下使用有效量的BMP使中内胚层细胞分化成中胚层细胞。 
分离的中内胚层细胞能够进一步分化成中胚层Isl1+细胞，该中胚层Isl1+细胞具有分化形成心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞系或形成内胚层细胞的潜能。形成中内胚层细胞或中胚层Isl1+细胞的基本方法实际上对于所有pPSCs都适用，尤其包括hESC细胞系，包括BG01和BG02细胞系和其 它细胞系。 
可以使用本领域的标准方法将中胚层（Isl+）细胞分化成心肌细胞（心脏肌肉细胞）。所述心肌细胞可以用于治疗心血管疾病，包括心肌梗塞（梗塞的心脏）和其它心血管疾病。 
通过将中胚层（Isl+）细胞在含有效浓度的GSK抑制剂（优选Wnt3a）以及骨形成蛋白（BMP4）的细胞分化培养基中，每5-6天传代一次，也可以将该中胚层（Isl+）细胞分化成血管平滑肌细胞。通过本发明产生的所述血管平滑肌细胞可以用于治疗缺血性血管病症和修复血管。 
在可选实施方式中，本发明涉及多能间充质游走细胞（也称为多能游走细胞或MMCs）的稳定细胞群的产生。在本发明的这一方面，pPSCs（尤其是hESCs）在分化培养基中生长，该分化培养基含有有效量的GSK抑制剂（优选包括BIO在内的GSK3抑制剂或如此处另外描述的包括Wingless蛋白在内的相关GSK3抑制剂，例如Wnt3a）和有效量的活化素（Activin）A抑制剂（拮抗剂），例如SB-431542（Sigma）、卵泡抑素（follistatin）、卵泡抑素（follistatin）基因相关的蛋白（FGRP,购自R and D Systems）、BMP和活化素膜结合抑制因子（BAMBI）、抗BAMBI（单克隆抗体）、Smad7（Mothers Against Decapentaplegic同源物7)、TGF RI抑制剂（Calbiochem），和/或骨形成蛋白拮抗剂（BMP拮抗剂），例如Noggin、Sclerostin、Gremlin（Dmr gremlin）和子宫致敏相关基因1蛋白（USAG-1、SOSTl1）等等。在本发明的这一方面，通过将pPSCs（尤其是hESCs）暴露于此处另外描述的分化培养基来有效地产生新的多能游走细胞，所述分化培养基中含有GSK抑制剂和活化素A抑制剂和/或BMP抑制剂，持续时间为约3-12天、约4-9天、约5-8天、约6-8天、约7天。所述多能游走细胞是稳定的MMCs，可以收集并储存（冷冻储存）该细胞，或传代多次（传代至少20次到无限次）。所述细胞可以自我更新。这些MMCs是多能的，并可以用此处另外描述的 技术使这些细胞进一步分化成许多成熟细胞群，包括内胚层细胞和/或中胚层细胞。也可以从内细胞团阶段的胚胎或胎儿组织中分离MMCs。 
本发明还涉及分离的多能游走细胞（MMCs）群，该多能游走细胞（MMCs）群是多能的和自我更新的。这些细胞可以长期生长（经过许多代）同时保持它们的标记谱，并表现为自我更新。这些细胞可以分化成多种细胞类型，包括内胚层细胞和中胚层细胞，因此这些细胞是多能的。因此这些细胞具有显著的发育可塑性。然而，基于标记谱，这些细胞不是人胚胎干细胞（hESCs）。这代表衍生自hESCs的替代多能细胞的一个实例。分离并储存（冷冻储存）这些细胞。 
根据本发明的多能游走细胞（MMCs）具有以下特征： 
-它们是多能的和自我更新的； 
-它们可以分化成多种细胞类型，包括内胚层细胞和中胚层细胞； 
-它们是动态细胞，可以在MMCs（E-钙粘蛋白-、Oct4-、Nanog-、SSEA3-、CXCR4+）和可选细胞类型之间交替，所述所述可选细胞类型的E-钙粘蛋白+、Oct4+、Nanog+、SSEA3-、CXCR4+（高密度（上皮层）），具有显著的发育可塑性； 
-基于标记谱，这些细胞不是hESCs。 
根据本发明的MMCs是稳定的，可以传代至少20次而不影响细胞系的生存能力，并且可以用本领域内众所周知的标准冷冻储存技术进行储存。根据本发明的MMCs可以储存、搬运和在遥远的地点（相对于最初产生细胞的地点）使用。 
具体实施方式
下面的术语用于描述本发明。 
除非特别注释，此处所用的术语应理解为相关领域内的普通技术人员所 常规使用的意义。除了下面提供的术语的定义，对于分子生物学中通用术语的定义可以在Rieger等人,1991Glossary of genetics:classical and molecular,5th Ed.,Berlin:Springer-Verlag;and in Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等人,Eds.,Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc.and John Wiley&Sons,Inc.,(1998Supplement)中找到。应当理解，在说明书和权利要求书中使用的“一个”指一个或多个，应依据其上下文来理解。因此，例如“一个细胞”可以指至少一个细胞。 
通过参考下面详细描述的本发明优选实施方式和本说明书中包括的实施例，可以更容易地理解本发明。然而，在公开和描述本发明之前，应当理解本发明不受限于特定条件或特定方法等，当然这些条件和方法可以变化，并且其中的许多改变和变化对于本领域的技术人员是显而易见的。 
培养细胞、分离细胞的标准技术，以及相关的克隆、DNA分离、扩增和纯化，涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切酶等的酶反应，以及多种分离技术都是本领域技术人员熟知和常用的技术。许多标准技术在Sambrook等,1989Molecular Cloning,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory,Plainview,New York;Maniatis等,1982Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,Plainview,New York;Wu(Ed.)1993Meth.Enzymol.218,Part I;Wu(Ed.)1979Meth.Enzymol.68;Wu等,(Eds.)1983Meth.Enzymol.100and101;Grossman and Moldave(Eds.)1980Meth.Enzymol.65;Miller(ed.)1972Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York;Old and Primrose,1981Principles of Gene Manipulation,University of California Press,Berkeley;Schleif and Wensink,1982Practical Methods in Molecular Biology;Glover(Ed.)1985DNA Cloning Vol.I and II,IRL Press,Oxford,UK;Hames and Higgins(Eds.)1985Nucleic Acid Hybridization,IRL Press,Oxford,UK;and Setlow and Hollaender1979Genetic Engineering:Principles and Methods,VoIs.1-4,Plenum Press, New York中有描述。所应用的缩写和命名法是本领域内标准的，并在此处引用的那些专业文献中常用。 
“人胚胎干细胞”或hESCs是“灵长类多能干细胞”的子集，术语“灵长类多能干细胞”由受精后任意时间的胚胎前、胚胎或胎儿组织中衍生，其特征在于，根据本领域公认的标准测试（例如在8-12周大的严重综合免疫缺陷（SCID）小鼠中形成畸胎瘤的能力），该细胞在合适条件下能够产生衍生自3个胚层细胞（内胚层细胞、中胚层细胞和外胚层细胞）的几种不同细胞类型的后代。该术语包括多种已建立的干细胞系，以及从来源组织中以所述方法获得的多能细胞。 
多能或pPS细胞（pPSCs）的定义中包括多种类型的胚胎细胞，尤其包括人胚胎干细胞（hESCs），如Thomson等人（Science282:1145,1998）的描述；也包括其它灵长类的胚胎干细胞，例如恒河猴干细胞（Thomson等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA92:7844,1995）。其它类型的多能细胞也包括在该术语中。人多能干细胞包括从人脐带或胎盘血以及人胎盘组织获得的干细胞。也包括能够产生衍生自所有3个胚层细胞的后代的任意灵长类来源的细胞，不论它们是否来源于胚胎组织、胎儿或其它来源。所述pPS细胞优选不来源于恶性细胞。它最好（但通常不必需）是正常核型的细胞。 
当细胞群中基本比例的干细胞和它们的衍生细胞呈现未分化细胞的形态学特征时，将pPS细胞培养物描述为“未分化的”，所述形态学特征使它们与胚胎或成体来源的分化细胞清楚地区分开。本领域技术人员可以容易地识别未分化的pPS细胞，该细胞在二维显微镜观察下典型显示为具有高核/质比和突出的核的细胞集落。应当理解细胞群中的未分化的细胞集落通常被附近的分化细胞所围绕。 
多能干细胞可以表达一个或多个阶段特异性胚胎抗原（SSEA）3和4，以及用指定的Tra-1-60和Tra-1-81抗体可检测到的标记（Thomson等人, Science282:1145,1998）。多能干细胞的体外分化会导致失去SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81的表达（如果存在），并增加SSEA-1的表达。未分化的多能干细胞典型地具有碱性磷酸酶活性，可以通过用4%的多聚甲醛固定细胞，然后根据制造商的描述用Vector Red作为底物显影（Vector Laboratories,Burlingame Calif.）来检测碱性磷酸酶活性。用RT-PCR检测可知，未分化的多能干细胞也典型地表达Oct-4和TERT。 
传代的多能干细胞的另一种期望的表型具有能够分化成所有3个胚层（内胚层、中胚层和外胚层）的细胞的潜能。可以通过例如向严重综合免疫缺陷（SCID）的小鼠中注射多能干细胞，用4%多聚甲醛固定形成的畸胎瘤，然后检测它们的来源于3个胚层的细胞类型的组织学证据，来确定该多能干细胞的多能性。可替代地，可以通过形成类胚体并评价所述类胚体中存在的3个胚层细胞相关的标记来确定多能性。 
使用标准G-条带技术并与公布的灵长类物种的相应核型比较，来确定传代的多能干细胞系的核型。希望获得具有“正常核型”的细胞，“正常核型”指细胞是整倍体，其中所有人染色体都存在并没有显著改变。 
可以使用的多能干细胞的类型包括已建立的从妊娠后形成的组织中衍生的多能干细胞系，所述组织包括在妊娠期间的任意时间获取的胚胎前组织（例如囊胚）、胚胎组织或胎儿组织，典型地（但不必需）是在怀孕的前10-12周。非限制性实例是已建立的人胚胎干细胞系或人胚胎干细胞，例如人胚胎干细胞系WA01、WA07和WA099（WiCell）。也预期在所述细胞的初始建立或稳定化的过程中使用本发明公开的内容，此种情况下，来源细胞可以是直接从来源组织中获取的灵长类多能细胞。从已经在不存在饲养细胞的条件下培养的多能干细胞群中获取的细胞也是合适的。突变的人胚胎干细胞系例如BG01v（BresaGen、Athens、Ga.），以及正常人胚胎干细胞系例如WA01、WA07、WA09（WiCell）和BG01、BG02（BresaGen、Athens、Ga.）也是 合适的。 
外胚层干细胞（EpiScs）和诱导的多能干细胞（iPS）属于广义的多能细胞，在概念上，本发明描述的技术可以应用于这些和其它多能干细胞类型（即灵长类多能细胞）。上述EpiScs从早期的植入后期胚胎（early post-implantation stage embryos）中分离。这些细胞表达Oct4，并且是多能的。（见Tesar等人,Nature,VoI448,p.19612July2007）。通过反转录病毒转导4个基因（c-myc、Klf4、Sox2、Oct4），使成体细胞去分化回到多能性状态而产生iPS细胞。（见Takahashi和Yamanaka,Cell126,663-676,August25,2006）。 
人胚胎干细胞可以通过本发明描述的方法以及本领域的（例如Thomson等人描述的）方法来制备。（美国专利No.5,843,780；Science282:1145,1998;Curr.Top.Dev.Biol.38:133ff.,1998;Proa Natl.Acad.ScL U.S.A.92:7844,1995）。 
术语“胚胎干细胞”指从多能细胞，优选为灵长类（包括人）的从囊胚期胚胎分离的多能细胞。人胚胎干细胞指来源于人的干细胞，该细胞优选用于本发明的涉及人类治疗或诊断的方面。人胚胎干细胞表达下面的表型标记： 
SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、CD9、碱性磷酸酶、Oct4、Nanog、Rex1、Sox2和TERT。（见Ginis等人，Dev.Biol，269(2)，360-380(2004)；Draper等人，J.Anal，200(Pt.3)，249-258，(2002)；Carpenter等人CloningStemCells，5(1)，79-88(2003)；Cooper等人J.Anat.，200(Pt.3)，259-265(2002)；Oka等人，MoI.Biol.Cell，13(4)，1274-81(2002)；和Carpenter等人，Dev.Dyn.，229(2)，243-258(2004)）。可以在本发明的方法中使用任选的灵长类多能干细胞（pPSCs）（尤其包括人胚胎干细胞）来产生根据本发明的中内胚层细胞、中胚层Isl1+细胞和多能游走细胞（MMCs），用于本发明 的优选pPSCs包括人胚胎干细胞（包括来源于BG01和BG02细胞系的人胚胎干细胞）以及许多其它可获得的干细胞系。 
术语“分化”用来描述非特异的（“非定形的”）或特异性较小的使细胞获得更具特异性的细胞特征的过程，所述更具特异性的细胞，例如多能游走细胞、中内胚层细胞、中胚层细胞、神经细胞、肌细胞或其它细胞。术语“分化的”包括多能干细胞（包括hESC）变为包括祖细胞在内的更具特异性的中间细胞的过程，以及更具特异性的中间细胞（MMC、中内胚层细胞或中胚层细胞）变为甚至具有更高特异性的细胞的过程。分化的细胞或分化诱导的细胞是在细胞系中占有更特异性（定形的）位置的细胞。当应用于分化过程中时，术语“定形的”指在分化途径中处于一点的细胞，在该点上，在正常情况下细胞可以继续分化成为特异性细胞类型或细胞类型子集，并在正常情况下所述细胞不能分化成不同细胞类型或恢复为低分化的细胞类型。“去分化”指细胞恢复到细胞世系（lineage）中低特异性的（或定形的）位置。此处所用的细胞世系定义为细胞的遗传，即来源于哪种细胞和可以产生什么细胞。按细胞世系，确定细胞在发育和分化的遗传图中的位置。世系特异性标记指特异性相关于目标细胞世系表型的特征，并且可以用于评价不定形的细胞向目标细胞系的分化。 
术语“多能游走细胞”、“多能间充质细胞”或“MMC”可互换使用，指根据本发明产生的一个或多个细胞。MMCs是动态多能细胞，其特征是E-钙粘蛋白-、Oct4-、Nanog-、SSEA3-、CXCR4+，它们的基质密度低，可以游走。它们可以稳定储存，并可以传代许多代仍可保持存活。它们具有显著的发育可塑性。基于标记谱，它们不是hESCs。 
根据本发明的MMCs可以在存在有效量的GSK抑制剂和活化素A抑制剂的条件下稳定储存。BMP抑制剂（例如Noggin）也可以与GSK抑制剂和活化素A抑制剂组合使用。这些细胞可以分化成中胚层细胞或定形内胚 层细胞，及许多其它细胞。 
根据本发明的多能间充质细胞（MMC）具有一个或多个（至少4个、至少5个、至少6个、至少10个、优选所有的）以下特征： 
·可以作为稳定细胞群培养至少20代 
·当细胞以低密度铺种时表现为间充质细胞，在高密度培养时生长成片层 
·能够从包括BG01、BG02、WA09在内的hESC细胞系中产生 
·MMCs能够用标准方法冷冻和低温保存 
·MMCs能够从低温保存中恢复（recovered after cryogenic storage）、复苏（recovered）和分化 
·MMCs能够以高铺种效率传代（高于50%的铺种效率-50%的传代细胞成功接种并存活） 
·在它们的细胞表面没有SSEA3和SSEA4抗原 
·不表达hESC标记，例如Oct4、Nanog 
·MMCs的表面能够表达CXCR4 
·MMCs能够高水平地表达的以下转录本：Zic1、HoxA9、HoxD4、HoxA5、HoxC10、HoxD3、Pax6、N-CAM、CXCR4 
·MMCs不是中内胚层细胞，因为它们不表达T/鼠短尾突变体表型（brachyury）或Eomesodermin 
·E-钙粘蛋白阴性 
·MMCs不表达能够被Q-PCR分析检测到的水平的Sox17、Isl1、Musashi、巢蛋白（Nestin） 
·在传代过程中保持正常核型 
·呈现游走、间充质表型 
·具有多能分化能力（包括中胚层细胞、内胚层细胞） 
·当注射到SCID小鼠中时不形成畸胎瘤 
·能够从内细胞系胚胎（inner cell mass embryos）和胎儿组织中分离 
-对MMC基因表达谱更完整的描述见微阵列数据 
此处所用术语“中胚层（Isl1+）细胞”、中胚层衍生的Isl1+多能祖细胞或“IMP”可互换使用，描述根据本发明的方法从pPSCs（尤其是hESCs）、中内胚层细胞或MMCs产生的中胚层Isl1+细胞。 
中胚层（Isl1+）细胞（胰岛1+多能祖细胞或IMPs）具有以下特征： 
·表达Isl1、Tbx20、Nkx2.5、Fgf10、GATA4、KDR（Flk1）、FoxF1、PDGFRα 
·核型正常 
·不表达Oct4、Nanog、T、Eomesodermin 
·能够分化为心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞 
对形成的IMPs进行微阵列分析。hESCs在添加有Wnt3a（25ng/ml）和BMP4（100ng/ml）的确定培养基中培养6天。在0、24小时、48小时、72小时、96小时、144小时取样品提取mRNA，随后进行微阵列分析。该微阵列分析在本文件附件的表中概括。（IMP微阵列） 
此处所用术语“分化培养基”、“细胞分化培养基”、“培养基”、“基本细胞培养基”、“基本细胞培养基”、或“基本培养基”、或“稳定培养基”是同义的，用来描述细胞生长培养基，hESCs、间充质细胞、中胚层细胞或多能游走细胞（MMCs）在其中（依赖于所用的附加组分）产生、生长/培养或分化成更成熟的细胞。本领域公知，所述分化培养基至少是添加有一种或多种任选的组分的极限必需培养基，例如包括成纤维生长因子（FGF）在内的生长因子、抗坏血酸、葡萄糖、非必需氨基酸、盐（包括微量元素）、谷氨酰胺、胰岛素（指出且不排除）、活化素A、转铁蛋白、β巯基乙醇、和此处另外说明的其它本领域众所周知的试剂。优选培养基包括含有1-20%（优选 约2-10%）胎牛血清的基本细胞培养基、或（优选）不含胎牛血清和KSR但包括牛血清白蛋白（约1-5%，优选约2%）的确定培养基。优选的分化培养基是无血清的确定培养基。在特定实施方式中，产生了MMCs，并使用活化素A抑制剂，可以从培养基中除去或基本除去活化素A。 
可以任选加入到根据本发明的培养基中的其它试剂包括：例如烟酰胺、TGF-β家族成员（包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3、活化素A、Nodal）、血清白蛋白、成纤维细胞生长因子家族成员、血小板衍生生长因子-AA和血小板衍生生长因子-BB、富含血小板的血浆、胰岛素生长因子（IGF-I、II）、生长分化因子（GDF-5、GDF-6、GDF-8、GDF-10、GDF-11）、类胰高血糖素肽-I和II（GLP-I和GLP-II）、GLP-1和GLP-2的模拟体、Exendin-4、甲状旁腺激素、胰岛素、孕酮、抗蛋白酶肽（aprotinin）、氢化可的松（hydrocortisone）、乙醇胺、表皮生长因子（EGF）、胃泌素I和II、铜螯合剂（例如三乙撑五胺）、毛喉素（forskolin）、丁酸钠、β纤维素、ITS、Noggin、轴突生长因子、Nodal、丙戊酸（valporic acid）、曲古抑菌素（trichostatin）A、丁酸钠、肝细胞生长因子（HGF）、鞘氨醇-1、VEGF、MG132（EMD,CA）、N2和B27补充物（Gibco,CA）、甾体生物碱（steroid alkaloid）（例如环巴胺（cyclopamine(EMD,CA)））、角化细胞生长因子（KGF）、Dickkopf蛋白家族、牛垂体提取物（bovine pituitary extract）、胰岛新生相关蛋白（INGAP）、IHH蛋白（Indian hedgehog）、SHH蛋白（sonic hedgehog）、蛋白酶体抑制剂、Notch途径抑制剂、SHH蛋白抑制剂、Heregulin、或它们的组合，或其它成分。如果包括这些成分，则包括有效量的各种成分。 
作为又一个实例，合适的培养基可以由下述组分制成：例如达尔伯克改良的伊格尔（Dulbecco′s改良Eagle′s）培养基（DMEM），Gibco#11965-092；敲除的达尔伯克改良的伊格尔（Dulbecco′s改良Eagle′s）培养基（KODMEM），Gibco#10829-018；Ham′s F12/50%DMEM基本培养基；200mM L-谷氨酰胺，Gibco#15039-027；非必需氨基酸溶液，Gibco11140-050；β-巯基乙醇，Sigma#M7522；人重组基本成纤维细胞生长因子（bFGF），Gibco#13256-029。在本发明中使用的培养基的优选实施方式在此处另外描述。 
本发明中用于pPSCs（尤其是hESCs）生长/培养和用于细胞分化的特别优选的分化培养基是DMEM/F12（50:50），该培养基含有约2%的前白蛋白（白蛋白；维孔/血清学）、1×青霉素/链球菌抗生素（Pen/Strep）、1×NEAA、1×微量元素A、B、C（Mediatech）、抗坏血酸（10-100ng/ml，约25-65ng/ml，约50ng/ml）、约0.1mM（0.025-0.5mM）β-巯基乙醇（Gibco）、（约2-10ng/ml、约5-9ng/ml、约8ng/ml）bFGF（Sigma）、200ng/ml（5-500ng/ml）LR-IGF（指IGF-I；JRH Biosciences）、10ng/ml活化素A（约1ng/ml到不超过约20ng/ml)和l0ng/ml（约l-20ng/ml或更多）的Heregulin。值得注意的是，产生多能游走细胞（MMCs）和中内胚层细胞不需要活化素A或活化素A信号，但是尤其在产生中胚层（Isl+）细胞时需要包括活化素A或活化素A信号（当包括时，优选包括低浓度的、通常低于约20ng/ml的活化素A）。相反，在产生定形内胚层细胞时使用约20-100ng/ml或更多的活化素A或“高浓度活化素A”。或者，也可以使用与DMED/F12的组成成分相似的小鼠胚胎成纤维细胞-条件培养基（MEF-CM）来传代hESC，并产生根据本发明的中内胚层细胞、中胚层细胞（中胚层Isl1+细胞）和多能游走细胞（MMCs）。 
本发明中所用的分化培养基是可商购的，并且可以补充可商购的成分，可商购指可从Invitrogen Corp.（GIBCO）、Cell Applications,Inc.和Biological Industries、Beth HaEmek、Israel、以及包括Calbiochem在内的许多其它商业来源获得。在优选实施方式中，在培养干细胞的细胞培养基中加入至少一种分化试剂（例如成纤维细胞生长因子（FGF）、LR-IGF（胰岛素类生长因子类似物）和Heregulin）（优选所有三种因子以有效量加入），在该培养基中干细胞分化成多能游走细胞、中内胚层细胞或中胚层细胞（或甚至从MMCs 分化成定形内胚层细胞）。本领域的普通技术人员能够容易地改良所述细胞培养基以产生任选的一个或多个依据本发明的靶细胞。细胞分化培养基与基本细胞培养基本质上是同意的，但是在文中用于分化过程，并且包括使细胞分化成其它细胞的细胞分化试剂。稳定培养基是在分化步骤之前或之后使用的基本细胞培养基，其作用是使细胞系稳定以进一步利用。培养基与稳定培养基基本相同，但是指在分化前生长或培养多能或其它细胞系的培养基。一般而言，此处所用的细胞分化培养基和稳定培养基可以包括与基本细胞培养基相似的组成成分，但是在用于不同的上下文中可以包括稍微不同的组成成分以影响使用培养基的预期结果。对于MMCs的情况，尤其是储存稳定的MMCs，如本发明中另外公开的，在细胞培养基中包括有效量的活化素A信号抑制剂与有效量的GSK抑制剂，用来分化和稳定MMCs，即防止它们进一步分化并使该细胞群储存稳定。为此目的，BMP抑制剂可以与活化素A抑制剂和GSK抑制剂结合使用。 
也可以在饲养细胞层上培养多能干细胞，该饲养细胞以本领域描述的多种方式支持多能干细胞。或者，在基本无饲养细胞的培养***中培养多能干细胞，但是该***仍然支持多能干细胞的增殖并使多能干细胞基本不分化。使用条件培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞条件下的生长，而使其不分化，该条件培养基是先前培养过另一种细胞类型的培养基。或者，使用化学上的确定培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞条件下的生长，而使其不分化。这些方法是本领域众所周知的。在本发明的优选方面，细胞在无饲养细胞的培养基中生长。 
本领域内熟知在饲养细胞层上培养细胞的方法。例如Reubinoff等人（Nature Biotechnology18:399-404(2000)）和Thompson等人（Science6Nov.1998:Vol.282.no.5391,pp.1145-1147）公开的用小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞层来培养来自人囊胚的多能干细胞系。Richards等人（Stem Cells21: 546-556,2003）评价了11个不同的人类成体、胎儿和新生儿饲养细胞层的支持人多能干细胞培养的能力。Richards等人描述了：“在成体皮肤成纤维细胞饲养细胞上培养的人胚胎干细胞系维持人胚胎干细胞的形态和多能性”。US20020072117公开了产生能支持灵长类多能干细胞在无饲养细胞条件下生长的培养基的细胞系。所述细胞系为获自胚胎组织或从胚胎干细胞分化的间充质细胞和成纤维细胞类细胞系。US20020072117还公开了所述细胞系用于灵长类饲养细胞层的用途。在另一个实例中，Wang等人（Stem Cells23:1221-1227,2005）公开了人多能干细胞在人胚胎干细胞衍生的饲养细胞层上长期生长的方法。在另一个实例中，Stojkovic等人（Stem Cells200523:306-314,2005）公开了人胚胎干细胞自发分化衍生的饲养细胞***。在又一个实例中，Miyamoto等人（+22:433-440,2004）公开了从人胎盘获得的饲养细胞来源。Amit等人（Biol.Reprod68:2150-2156,2003）公开了人***衍生的饲养细胞层。在另一个实例中，Inzunza等人（Stem Cells23:544-549,2005）公开了来自人出生后***成纤维细胞的饲养细胞层。 
本领域内熟知在培养基（尤其是无饲养细胞培养基）中培养pPSCs的方法。美国专利No.6,642,048公开了支持灵长类多能干细胞（pPS）在无饲养细胞条件下培养的培养基，以及用于产生此类培养基的细胞系。美国专利No.6,642,048描述了：“本发明包括获自胚胎组织或从胚胎干细胞分化的间充质细胞和成纤维细胞类细胞系。本发明描述和说明了得到此类细胞系的方法、加工培养基的方法、以及用条件培养基培养干细胞的方法。”在另一个实例中，WO2005014799公开了用于哺乳动物细胞的维持、增殖和分化的条件培养基。在另一个实例中，Xu等人（Stem Cells22:972-980,2004）公开了获自人胚胎干细胞衍生物的条件培养基，该人胚胎干细胞衍生物通常被修饰而过表达人端粒末端转移酶反转录酶。在另一个实例中，US20070010011公开了用于维持多能干细胞的化学上确定的培养基。 
一种可选的培养***使用补充生长因子的无血清培养基，所述生长因子能够促进胚胎干细胞的增殖。例如，Cheon等人（BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870,Oct.19,2005）公开了无饲养细胞、无血清培养***，其中在无限制血清替换（SR）培养基中维持胚胎干细胞，所述SR培养基中补充了能起动干细胞自我更新的不同生长因子。在另一个实例中，Levenstein等人（Stem Cells24:568-574,2006）公开了在缺少成纤维细胞或条件培养基中长期培养人胚胎干细胞的方法，所用的培养基中补充了bFGF。在另一个实例中，US20050148070公开了在无血清、无成纤维细胞饲养细胞的确定培养基中培养人胚胎干细胞的方法，该方法包括：在含有白蛋白、氨基酸、维生素、矿物质、至少一种转铁蛋白或转铁蛋白替代物、至少一种胰岛素或胰岛素替代物的培养基中培养干细胞，该培养基基本不含哺乳动物胎血清，并含有能激活成纤维细胞生长因子信号受体的至少约100ng/ml的成纤维细胞生长因子，其中所述生长因子的来源是除成纤维细胞饲养层以外的其它部分，该培养基在没有饲养细胞或条件培养基的条件下，能够支持干细胞在未分化状态的增殖。 
US20050233446公开了一种用于培养干细胞的确定培养基，所述干细胞包括未分化的灵长类原始干细胞。在溶液中，与培养的干细胞相比，所述培养基基本为等渗的。在给定的培养中，特定培养基包括基本培养基和支持灵长类干细胞在基本未分化状态下的生长所必需的一定量的bFGF、胰岛素和抗坏血酸。在又一个实例中，WO2005065354公开了一种确定成分的且等渗的培养基，该培养基基本无饲养细胞且无血清，该培养基包括：a.基本培养基；b.支持哺乳动物干细胞在基本未分化状态下生长的足够量的bFGF；c.支持哺乳动物干细胞在基本未分化状态下生长的足够量的的胰岛素；以及d.支持哺乳动物干细胞在基本未分化状态下生长的足够量的抗坏血酸。 
在另外一个实例中，WO2005086845公开了维持未分化的干细胞的方 法，该方法包括：将干细胞暴露于足够量的转化生长因子-β（TGFβ）家族蛋白的成员、成纤维细胞生长因子（FGF）家族蛋白的成员或烟酰胺（NIC），以使细胞在未分化状态下维持足够的时间以达到所期望的结果。 
细胞优选在细胞支持物或基质上生长，生长成为附着的单层，而不是类胚体或悬浮液。在本发明中，优选使用基质胶（Matrigel）作为细胞支持物。细胞支持物优选包括至少一种分化蛋白质。术语“分化蛋白质”或“基质蛋白质”用来描述可以用来培养细胞和/或促进胚胎干细胞或中内胚层细胞、中胚层细胞或多能游走细胞（MMC）的分化（也优选附着）的蛋白质。本发明中优选的分化蛋白质包括：例如细胞外基质蛋白，该细胞外基质蛋白为在细胞外基质中发现的蛋白质，例如核纤层蛋白（laminin）、结合腕蛋白（tenascin）、凝血酶敏感素（thrombospondin）和它们的混合物，这些蛋白质能促进生长，并含有与表皮生长因子（EGF）具有同源性的结构域，它们具有促进生长和分化的活性。本发明中使用的其它分化蛋白质包括：例如胶原蛋白、纤连蛋白、Vibronectin、聚赖氨酸（polylysine）、聚鸟氨酸（polyornithine）、以及它们的混合物。另外，也可以使用凝胶和其它材料，例如含有有效浓度的一种或几种这些胚胎干细胞分化蛋白质的其它凝胶的甲基纤维素。包括这些分化蛋白质的分化蛋白质或材料的实例包括例如BDCell-TakTM细胞和组织粘合剂、BDTMFIBROGEN人重组胶原蛋白I、BDTMFIBROGEN人重组胶原蛋白III、BD MatrigelTM基底膜基质、BD MatrigelTM高浓度（HC）基底膜基质、BDTMPuraMatrixTM肽水凝胶、胶原蛋白I、高浓度（HC）胶原蛋白、胶原蛋白II（牛的）、胶原蛋白III、胶原蛋白IV、胶原蛋白V和胶原蛋白VI等等。本发明中优选使用的材料包括MatrigelTM和GeltrexTM。 
含有一种或几种分化蛋白质或基质蛋白质的优选组分/材料是BDMatrigelTM基底膜基质。它是从Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤中 提取的溶化的基底膜制剂，小鼠肉瘤是富含ECM蛋白质的肿瘤。该基底膜基质的主要组成是核纤层蛋白，还有胶原蛋白IV、硫酸乙酰肝素、蛋白聚糖、内功素（entactin）和巢蛋白（nidogen）。 
多能干细胞优选铺种在分化蛋白质或基质蛋白质上。在存在能够促进细胞存活、增殖和保持所希望特征的培养基时，所述多能干细胞可以合适的分布状态铺种在基质上。注意接种的分布有益于所有这些特征，并且这些特征可以容易地被本领域技术人员所确定。 
此处所用的术语“激活”指标记（例如Isl）的表达增加，或指Isl或血细胞、血管细胞（内皮细胞）、肾细胞、骨和肌肉细胞相关的标记的活性上调。这些细胞可用于治疗心脏病、肾退化、骨和血管退化的修复。 
当用于指细胞、细胞系、细胞培养物或细胞群时，此处所用术语“分离的”指基本上从细胞的天然来源分离，从而使所述细胞、细胞系、细胞培养物或细胞群能在体外培养。另外，术语“分离”用来指从两个或两个以上的细胞群中物理选择一个或多个细胞，其中，基于细胞形态和/或多种标记的表达来筛选细胞。 
此处所用术语“表达”指细胞中多核苷酸的转录或多肽（包括标记）的翻译，以使表达所述分子的细胞与不表达该分子的细胞相比具有可检测量的较高的分子水平。测量分子表达的方法是本领域内普通技术人员所熟知的，包括（但不限于）Northern印迹、RT-PCR、原位杂交、Western印迹和免疫染色。 
此处所用术语“标记”描述了能够在目标细胞中差异性表达的核酸或多肽分子，本文中，差异性表达指阳性标记水平增加和阴性标记水平降低。在目标细胞中的可检测的标记核酸或多肽的水平要比在其它细胞中的水平足够的更高或更低，从而可以用任选的本领域已知的多种方法从其它细胞中鉴别和区分出目标细胞。 
此处所用术语“接触”（即将细胞与化合物接触）预期包括将化合物和细胞在体外共同孵育（例如向培养的细胞中加入化合物）。术语“接触”不包括能够在天然情况下出现的细胞在体内暴露于分化试剂（即可能作为自然生理过程的结果而出现的暴露）的情况。此处另外描述的将细胞与分化培养基和一种或多种生长因子（BMP或其它）和抑制因子（GSK、活化素A（信号）或BMP（信号）的抑制剂）接触的步骤可以通过任选的合适的方式来引导。例如，可以在附着培养或悬浮培养的条件下处理所述细胞，所述附着培养中细胞可以作为附着层、类胚体，优选使用附着层，因为附着层能提供有效的分化过程，该过程通常提供分化为90%或更多的靶细胞群（中内胚层细胞、中胚层细胞或多能游走细胞）。应当理解与所述分化试剂接触的细胞可以进一步地被其它细胞分化环境所处理，以使细胞稳定，或进一步分化细胞，例如产生胰岛细胞。 
对于从中内胚层细胞和/或MMCs产生定形的内胚层细胞的情况，细胞在此处另外公开的含有效量的活化素A（约20-100ng/ml或更多）和任选含有的有效量的PI3激酶信号抑制剂的培养基中分化。应当注意，除使用活化素A外还可以使用一种或多种的Nodal、TGFβ或其它TGF成员，或用它们来代替活化素A。同时，除使用PD激酶抑制剂外也可以从分化培养基中除去影响/促进PB激酶信号的因子（例如IGF-I和Heregulin），或用所述因子代替PD激酶抑制剂。 
此处所用术语“分化试剂”指能够诱导包括hESC’s、中内胚层细胞、多能游走细胞（MMCs）或Isl1+多能祖细胞（EVIPs）在内的细胞部分地或最终地分化的任意的化合物或分子，其中所述分化至少部分是由于GSK的抑制、包括骨形成蛋白（BMP-2、BMP-4、BMP-6或BMP-7）（例如，在hESCs向中内胚层细胞或中胚层Isl1+细胞的分化过程中），或者是由于GSK的抑制和抑制活化素A和/或抑制骨形成蛋白，以产生多能游走细胞（MMCs）， 或者是由于添加活化素A以产生内胚层细胞。所述分化试剂可以是如下所述，但该术语并不限于此。 
此处所用术语“分化试剂”的范围包括天然的或合成的分子或呈现相似生物学活性的分子。 
术语“有效”用来描述本文中的化合物或组合物所用的或所含有的成分的量，以该量使用一定时间足以产生预期的效果。例如，分化试剂的有效量是与其它成分组合使用时能够在分化培养基中产生所希望的分化细胞的量。 
术语“骨形成蛋白”或BMP用来描述在本发明中使用的一种分化试剂，与此处另外描述的其它成分组合可以使hESCs细胞或中内胚层细胞分化成中胚层Isl1+细胞。可以使用有效量的BMP-2、BMP-4、BMP-6或BMP-7（优选BMP-2或BMP-4）中的任意一种，来辅助分化过程。BMP的使用量为约1-500ng/ml、约25-500ng/ml、约25-250ng/ml、约50-150ng/ml、约75-125ng/ml、约100ng/ml。 
术语“GSK抑制剂”用来描述能够抑制GSK（尤其是GSK3，包括GSK3α或GSK3β）的化合物。优选的用于本发明的GSK抑制剂的实例包括以下物质（都可从Calbiochem购得）中的一种或几种： 
BIO（2′Z，3′E）-6-溴靛玉红（Bromoindirubin）-3′-肟（oxime）（GSK3抑制剂IX）； 
BIO-丙酮肟（2′Z，3′E）-6-溴靛玉红-3′-丙酮肟（acetoxime）（GSK3抑制剂X)； 
（5-甲基-1H-吡唑-3-基）-（2-苯基喹唑啉（phenylquinazolin）-4-基）胺（GSK3-抑制剂XIII）； 
吡啶并咔唑（Pyridocarbazole）-环戊二烯基钌（cyclopenadienylruthenium）复合物（GSK3抑制剂XV)； 
TDZD-84-苯甲基-2-甲基-1,2,4-噻二唑（thiadiazolidine）-3,5-二酮 （GSK3β抑制剂I）； 
2-硫代（3-碘苯甲基）-5-（1-吡啶基）-[1,3,4]-恶二唑（oxadiazole）（GSK3β抑制剂II）； 
OTDZT2,4-二苯甲基-5-氧化噻二唑（oxothiadiazolidine）-3-硫酮（GSK3β抑制剂III）； 
α-4-二溴苯乙酮（Dibromoacetophenone）（GSK3β抑制剂VII）； 
AR-A014418N-（4-甲氧苯甲基）-N′-（5-硝基-1,3-噻唑-2-基）尿素（GSK-3β抑制剂VIII）； 
3-（l-（3-羟丙基）-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基]-4-吡嗪（pyrazin）-2-基-吡咯（pyrrole）-2,5-二酮（GSK-3β抑制剂XI）； 
TWS119吡咯嘧啶（pyrrolopyrimidine）化合物（GSK3β抑制剂XII）； 
L803H-KEAPPAPPQSpP-NH2和它的肉豆蔻酰（Myristoylated）形式（GSK3β抑制剂XIII）；和 
2-氯-1-（4,5-二溴-噻吩-2-基）-乙酮（ethanone）（GSK3β抑制剂VI）。 
另外，许多Wingless蛋白或Wnt蛋白与GSK抑制剂（特别是根据本发明的GSK抑制剂）的功能相似。因此，它们包括在术语GSK抑制剂的范围内。可以用于本发明的Wnt蛋白的实例包括Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt10、Wnt14、Wnt14b、Wnt15和Wnt16，以及其它Wnt蛋白中的一种或几种。优选使用Wnt3a。 
优选用于本发明的GSK抑制剂包括BIO（GSK-3IX）和Wnt3a。 
GSK抑制剂可用于本发明涉及的中内胚层细胞、中胚层细胞、多能游走细胞（MMCs）和甚至定形内胚层细胞的所有方面。当使用这些GSK抑制剂时，以有效量使用，浓度（依赖于所用抑制剂的分子量）为约0.001-100μM或更多、约0.05-75μM、约0.1-50μM、约0.25-35μM、约0.5-25μM。在使用BIO的情况下，该GSK抑制剂在分化培养基中的使用量为约0.05-50μM、 约0.1-10μM、约0.5-5μM、约1-3μM。当使用Wnt蛋白时，Wnt的使用量为约1-100ng/ml、约5-50ng/ml、约10-35ng/ml、约20-30ng/ml、约25ng/ml。 
术语“活化素A抑制剂”用来描述任选加入到分化培养基中用来抑制活化素A在分化过程中的作用的化合物或成分，当使用该活化素A抑制剂时会从hESCs产生多能游走细胞（MMCs）。为了从hESCs产生MMCs，所述化试剂包括有效量的GSK抑制剂（优选GSK3抑制剂例如BIO，或其它GSK3抑制剂）和活化素A抑制剂，以及加入或不加骨形成蛋白（BMP）抑制剂。 
本发明中使用的活化素A抑制剂的实例包括：例如SB-431542（Sigma）、卵泡抑素（follistatin）、卵泡抑素基因相关的蛋白（FGRP，获自R和DSystems）、BMP和活化素的膜结合抑制剂（BAMBI）、抗-BAMBI（单克隆抗体）、Smad7（Mothers Against Decapentaplegic Homolog7）和TGF RI抑制剂（Calbiochem）等等。本发明中使用的活化素A抑制剂的有效量，通常为约0.001-100μM或更多、约0.05-75μM、约0.1-50μM、约0.25-35μM、约0.5-25μM。 
术语“骨形成蛋白抑制剂”或“BMP抑制剂”用来描述以有效量加入到分化培养基中用来抑制骨形成蛋白在hESCs分化成多能游走细胞（MMCs）过程中的作用的化合物或成分。BMP抑制剂的实例包括：例如Noggin、Sclerostin、Gremlin（Drm/Gremlin）和USAG-I等等。BMP抑制剂以有效量使用，通常（依赖于所用抑制剂的分子量和效力）的范围为约0.01-500ng/ml或更多、约0.1-350ng/ml、约0.5-250ng/ml、约1-500ng/ml、约5-250ng/ml、约50-150ng/ml、约75-125ng/ml、约100ng/ml。 
术语“PI3-激酶途径抑制剂”或“PI3-激酶信号抑制剂”指任意可以降低PI3-激酶或者在与抑制剂接触的细胞中的至少一种PI3-激酶的下游分子的活性的分子或化合物。这些抑制剂是用来从根据本发明的中内胚层细胞和/ 或多能游走细胞制备定形内胚层细胞的优选抑制剂。该术语包括能降低内源PI3-激酶的合成和表达的化合物，例如PI3-激酶拮抗剂、PI3-激酶信号级联转导拮抗剂，还包括能够降低内源PB-激酶释放的化合物，以及能够抑制PI3-激酶活性的激活剂的化合物。在上述特定实施方式中，所述抑制剂选自由雷怕霉素（Rapamycin）、LY294002、渥曼青霉素（wortmannin）、氯化锂、Akt抑制剂I、Akt抑制剂II（SH-5）、Akt抑制剂III（SH-6）、NL-71-101和上述的混合物组成的组中。Akt抑制剂I、Akt抑制剂II、Akt III和NL-71-101可从Calbiochem商购获得。在其它实施方式中，所述抑制剂选自由雷怕霉素（Rapamycin）、LY294002组成的组中。在进一步优选实施方式中，所述抑制剂包括LY294002。在另一实施方式中，所述抑制剂可以用于引发所希望的分化效果。最终结果是产生基本量的内胚层细胞，该内胚层细胞可以用于产生胰腺内胚层细胞和/或肝内胚层细胞，如我们在国际申请NO.PCT/US2007/01313（申请日2007年6月4日，公开号WO2008/???）中所公开的，其全文在此处引入作为参考。 
当用于指细胞、细胞系、细胞培养物或细胞群时，此处所用术语“分离的”指基本上从细胞的天然来源分离，从而使所述细胞、细胞系、细胞培养物或细胞群能在体外培养。或者，依赖于上下文，所述术语“分离的”指从分化培养基和培养瓶中分离的细胞群，以使该细胞群可以被储存（低温贮藏）。另外，术语“分离”用来指从两个或两个以上的细胞群中物理选择一个或多个细胞，其中，基于细胞形态和/或多种标记的表达来筛选细胞。 
术语“传代”用来描述将细胞分开并将它们转移到新的培养瓶中以进一步生长/再生长的过程。优选的根据本发明的贴壁细胞（或甚至是类胚体）可以使用酶（AccutaseTM或胶原酶）来传代、人工传代（机械的，例如用刮铲或其它柔软的机械器具或装置）和其它非酶方法（例如细胞分散缓冲液）。 
此处所用术语“接触”（即将hESC、中内胚层细胞、中胚层细胞或多能 游走细胞与化合物接触）包括将所述化合物和所述细胞在体外共同孵育（例如在细胞培养物中添加所述化合物）。术语“接触”不包括细胞在体内暴露于天然存在的生长因子和/或其它分化试剂或抑制剂（即暴露于那些可能作为天然生理过程出现的物质）的情况。将细胞与本发明的分化培养基中的生长因子和/或抑制剂接触的步骤可以通过任何合适的方法引导。例如，可以作为类胚体而在附着培养中处理细胞、或在悬浮培养中处理细胞。应当理解的是，与分化试剂和/或抑制剂接触的细胞还可以用其它的细胞分化环境处理，以稳定该细胞，或使该细胞进一步分化，例如产生定形内胚层细胞、血液细胞、血管细胞（内皮细胞）、肾细胞、骨和肌肉细胞（包括心肌细胞）。这些细胞可以用作再生药物用于治疗心脏疾病、肾退化、骨和血管退化的修复。 
申请人已经证明，结合使用有效量的GSK抑制剂（特别是BIO）和有效量的骨形成蛋白（BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7）来培养hESCs会产生中胚层细胞（Isl1+）。 
本发明提供包括分离的分化哺乳动物细胞群的组合物，该分化哺乳动物细胞群具体为人中内胚层细胞、中胚层（Isl1+）细胞和/或多能游走细胞（MMCs），其中，所述细胞是从hESCs（对于中胚层（Isl1+）细胞的情况，是从中内胚层细胞中得到的）中在体外分化得到的，并且其中多于约30%的细胞能够表达中内胚层细胞、中胚层（Isl1+）细胞或MMCs的标记。在本发明的一个实施方式中，多于约35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、67%、70%、72%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、90%或多于90%的细胞是中内胚层细胞。优选地，所述组合物中包括至少50%（甚至70-80%或更多）的能够表达Pdx1和/或Isl1的细胞的细胞群。中内胚层细胞能够表达CD48、Eomesodermin（EOMES）、T/鼠短尾突变体表型(Brachyury)、Wnt3a和GSC标记中的一种或几种。 
本发明还包括含有分离的中胚层Isl1+、Nkx2.5、Tbx20、Fgf10细胞群 的组合物，其中，所述细胞是在体外培养产生的，并且所述细胞中多于约35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、67%、70%、72%、74%、75%、76%、77%、78%、79%或甚至80%或90%或90+%的细胞是中胚层（Isl1+）细胞。 
本发明还包括含有分离的多能游走细胞群的组合物，其中，所述细胞是在体外培养产生的，并且所述细胞中多于约35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、67%、70%、72%、74%、75%、76%、77%、78%、79%或甚至80%或90%或90+%的细胞是MMCs。 
本发明还包括使hESCs分化成中内胚层细胞的方法，该方法包括（a）提供hESCs，和（b）将该hESCs与有效量的GSK（优选GSK3）抑制剂在细胞分化培养基中接触，以产生中内胚层细胞，以及（c）任选地，分离所述中内胚层细胞。为了产生中内胚层细胞，hESCs在上述条件下分化约18-72小时，优选约1-2天。 
本发明还包括使hESCs分化成中胚层（Isl1+）细胞的方法，该方法包括（a）提供hESCs；和（b）将该hESCs与有效量的GSK抑制剂在细胞分化培养基中接触约18-72小时，优选约1-2天；然后，（c）将从步骤（b）获得的所述细胞与有效量的骨形成蛋白（BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7）和任选的此处另外描述的GSK抑制剂在细胞分化培养基中接触约2-9天、约3-5天、约72-132小时、约120-130小时，以产生中胚层（Isl1+）细胞；以及，任选地，收集所述中胚层（Isl1+）细胞，储存（冷冻储存）所述中胚层细胞和进一步分化所述中胚层细胞以产生心肌细胞和平滑肌组织、内皮细胞系或内胚层细胞。应当注意在步骤c中，并不必需包括GSK抑制剂，但是优选包括。 
本发明还包括将中内胚层细胞分化成中胚层（Isl1+）细胞的方法，该方法包括（a）提供中内胚层细胞；（b）将该中内胚层细胞与有效量的骨形成 蛋白（BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7）和任选的GSK抑制剂在细胞分化培养基中接触约2-9天、约3-6天、约3-5天、约72-132小时、约120-130小时，以产生中胚层（Isl1+）细胞；以及，任选地，收集所述中胚层（Isl1+）细胞，储存（冷冻储存）所述中胚层细胞和进一步分化所述中胚层细胞以产生心肌和平滑肌组织、内皮细胞系或内胚层细胞。应当任选地和优选地包括GSK抑制剂。 
本发明还涉及将hESCs分化成多能游走细胞（MMCs）的方法，该方法包括（a）提供hESCs，和（b）将该hESCs与有效量的GSK抑制剂以及有效量的活化素A抑制剂和/或BMP抑制剂接触约4-12天、约4-9天、约5-8天、约6-8天、约7天。可以将得到的MMCs收集和储存（冷冻储存），或传代多次以产生稳定的能自我更新的MMCs。这些MMCs可以用此处另外描述的技术进一步分化成许多成熟的细胞群，包括内胚层细胞和/或中胚层细胞。使用从中内胚层细胞产生中胚层（Isl1+）细胞的常用方法可以利用MMCs产生中胚层（Isl1+）细胞。在该方法中，MMCs在组合有效量的BMP或任选的GSK抑制剂（同时除去用于产生MMCs的活化素A和/或BMP的抑制剂）的细胞分化培养基中生长约2-12天、3-9天、4-8天等等。MMCs也可以用于产生此处另外描述的定形的内胚层细胞。 
在将MMCs进一步分化成中胚层细胞群和/或定形的内胚层细胞群的过程中，除去了所用的活化素A抑制剂和将hESCs分化成MMCs所用的BMP抑制剂，并且MMCs在能够产生中胚层Isl1+细胞的条件（有效量的BMP，例如BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7和任选的GSK抑制剂例如BIO或Wnt3a）下生长、或在能够产生定形的内胚层细胞的条件（有效量的活化素A或等同化合物（Nodal、TGFβ、或其它TGFβ成员）和任选的PI3K抑制剂和/或排除IGF-I成员和/或Heregulin）下生长、或在其它能够得到中胚层细胞或定形的内胚层细胞群的条件下生长。从hESCs产生定形的内胚层细胞的 方法和条件可以用于从MMCs产生定形内胚层细胞，这些方法和条件在例如PCT/US2007/013137、公布号WO2008/???中公开，相关部分在此引用作为参考。 
另外，任选地，当PI3K抑制剂存在于具有添加成分的细胞分化培养基（优选DMEM/F12）中时，可以使用活化素A使根据本发明的MMCs分化成定形的内胚层细胞群。应当注意，可以使用Nodal、TGFβ、或其它TGFβ成员代替活化素A，或同时使用。同时，从分化培养基中除去影响/促进包括IGF-I和Heregulin在内的PD激酶信号的因子，也可以用来替代PB激酶抑制剂，或同时使用。 
可以在产生所述定形的内胚层细胞后，将其分离并储存，或者可以用来产生胰腺内胚层细胞和/或胰腺β细胞。再将定形的内胚层细胞暴露于DMEM/F12中一天或更多天（优选两天），从中分离出胰腺内胚层细胞，该DMEM在存在约0.05-25μg/ml、或0.1-2μg/ml浓度的视黄酸和Fgf10（25ng/ml、约1-75ng/ml、约5-50ng/ml、约15-35ng/ml、约20-30ng/ml）的情况下可任选地含有的FCS（优选约10%）。所述胰腺内胚层细胞可以用有效浓度的视黄酸（按上述浓度）和Fgf10处理多天（约10-24天）使其进一步分化成胰腺β细胞，从而提供胰腺β细胞。 
从定形的内胚层细胞可以产生肝内胚层细胞，通过在缺乏视黄酸但含有效量的成纤维细胞生长因子（Fgf10）的条件下培养定形的内胚层细胞至少约2天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约8天、至少约10天、约10-24天，使其分化产生肝内胚层细胞而不产生胰腺内胚层细胞，并任选地分离该肝内胚层细胞以进一步使用。 
在本发明中，在分化之前，中内胚层细胞、中胚层细胞（Isl1+）或MMCs、pPSCs（尤其是hESCs）在细胞分化培养基中生长/培养，并在其中与此处另外描述的合适的分化试剂/抑制剂接触。预期所述hESCs通过与分化培养基 中的分化试剂/抑制剂接触而分化，相应地产生此处另外所述的中内胚层细胞、中胚层细胞（Isl1+）或MMCs。在一个实施方式中，在细胞与基本细胞培养基中的分化试剂相接触之前，将细胞分散成基本上为单细胞的培养物。优选细胞以附着单层生长，以使细胞与分化试剂/抑制剂有效地接触，且附着细胞层可以用蛋白酶来分散，所述蛋白酶例如但不限于AccutaseTM。在一个实施方式中，所述细胞在铺种约12小时-10天或更长时间、约12-72小时、约24-72小时、约18-36小时或此处另外描述的时间之后，将细胞与分化试剂/抑制剂接触。在一个实施方式中，所述细胞与此处另外描述的分化试剂/抑制剂接触多于约18小时、多于约24小时、多于约48小时、多于约72小时、多于约96小时、多于约150小时、多于约136-152小时、多于约144小时或此处另外描述的时间。在将细胞暴露于含分化试剂/抑制剂的细胞培养基后，可以直接分离（以AccutaseTM处理）所获得的细胞（通常是附着单层或者类胚体），然后再传代以再生细胞群，或者将该细胞进一步分化成另外的细胞群。 
在特定实施方式中，要进一步分化的hESCs、中胚层细胞、中胚层（Isl1+）细胞或MMCs铺种的浓度为小于约2.5×106个细胞/35毫米培养盘、至少约2.5×104个细胞/35毫米培养盘、约2.5×105-2x106个细胞/35毫米培养盘、约5×105-2x106个细胞/35毫米培养盘、小于约2×106个细胞/35毫米培养盘、或密度大于4×105个细胞/35毫米培养盘。在特定优选方面，所述要分化的细胞的铺种浓度为约7.5×10个细胞/35毫米培养盘。 
在作为本发明的特定实施方式的第一个步骤的从hESCs产生中内胚层细胞、中胚层（Isl1+）细胞或MMCs的过程中，本发明还包括组合物在培养细胞以产生hESCs的附着单层中的用途。所述hESCs在确定成分的细胞培养基（无血清或KSR）中在细胞支持物（优选基质胶）上以附着单层生长。所述细胞培养基中，除此处另外描述的典型成分以外，还优选含有有效量的 下述成分的一种或几种：抗坏血酸、转铁蛋白、β-巯基乙醇（Gibco）、成纤维细胞生长因子（FGF）、LR-IGF、活化素A和Heregulin，并优选含有所有这些成分。用于起始细胞群分化的hESCs附着单层细胞（或类胚体）生长的所述细胞培养基，可以在本领域教导的范围内变化。 
然后将上述产生的hESCs平铺于细胞支持物上，并在含有有效量的分化试剂和/或抑制剂的分化培养基（此处另外描述）中进行分化。所述细胞优选以附着单层生长。对于中内胚层细胞的情况，将hESCs与含有效量的此处另外描述的GSK抑制剂（优选BIO或Wnt3a）的分化培养基中接触一段合适的时间（如此处另外描述的约18-72小时），以产生中内胚层细胞群。对于中胚层细胞的情况，将hESCs与含有效量的此处另外描述的GSK抑制剂（优选BIO或Wnt3a）以及骨形成蛋白（BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7）的分化培养基接触一段合适的时间，以产生中胚层（Isl1+）细胞群（较长时间分化，约5-10天、约4-8天、约5-7天、约6天、约140-150小时）。 
在另外实施方式中，所述细胞培养基可以是条件培养基（MEF-CM）。所述条件培养基从饲养层获得。期望的饲养层可以包括成纤维细胞，且在一个实施方式中，饲养层包括胚胎成纤维细胞。优选所述培养基不含饲养细胞。 
在特别优选的实施方式中，用于产生中内胚层细胞、中胚层（Isl1+）细胞或MMCs的所述分化培养基包括：DMEM/F12（50/50）、约2%的Probumin（白蛋白）、抗体（1x青霉素/链球菌抗生素（Pen/Strep）1xNEAA）、微量元素A、B、C（例如1x，来自Mediatech）、抗坏血酸（例如约50μg/ml）、转铁蛋白（例如约10μg/ml）、β-巯基乙醇（约0.1mM）、bFGF（例如约8ng/ml）、LR-IGF（例如约200ng/ml）、活化素A（例如约10ng/ml）和Heregulin（例如约10ng/ml）。应注意，在用于产生多能游走细胞（MMCs）时，应除去活化素A和Heregulin。当然，在本领域内上述成分中的一种或几种可以不加入到分化培养基中，但是本发明中优选使用全部组分。 
本发明的细胞也可能用于生物测定，以鉴别影响（促进、抑制或影响）细胞分化的分子。本发明的细胞分化中的第一步骤为研究上皮向间充质转变提供了很大的可能性，尤其在癌症的发展中肿瘤转移的部分。因此，根据本发明的方法和细胞群为在分子水平理解EMT和鉴别新的药物靶以及在促进EMT的条件下（BIO）筛选阻断EMT的小分子提供了优越的***。考虑到细胞可以在96/384孔培养板中生长，可以容易地进行快速药物筛选，用来鉴别阻断或抑制EMT的可能分子，以及显示可能的有价值的抗癌剂。 
关于MMCs，它是生长于确定培养基中具有多能分化能力的稳定的细胞群。在能够促进或抑制分化或促进和特异性分化为一种细胞系或另外细胞系的分子的筛选中，这些细胞特别有用。 
治疗 
在此描述的细胞群和/或方法可以为与所述细胞有关的疾病和/或状态的处理提供有益的治疗。 
一方面，本发明提供了对患有心血管疾病的患者进行治疗的方法。该方法包括：培养多能干细胞，在体外使所述多能干细胞分化成心血管肌肉细胞（心肌细胞），以及向需要的患者体内植入有效量的心血管肌肉细胞。选择性地，所述对患有心血管疾病（包括梗塞）的患者进行治疗的方法包括：向需要治疗的患者的心脏组织内施以有效量的中胚层（Isl1+）细胞。 
另一方面，本发明提供了对需要治疗的患者的受损的或局部缺血的血管组织（血管）进行治疗的方法，其中，该方法包括：向待修复的血管施以有效量的中胚层（Isl1+）细胞。在一个替换性实施方式中，通过使细胞在细胞分化培养基中传代至少5-6天，使中胚层（Isl1+）细胞分化成平滑肌细胞，所述细胞分化培养基含有有效量的GSK抑制剂（优选为Wnt3a）和BMP（BMP4），并将由此获得的平滑肌细胞施予（植入）至患者体内结构性血管损伤的位点以对其进行治疗/修复。 
另一方面，本发明提供了对患有1型糖尿病或具有发展成1型糖尿病危险的患者进行治疗的方法。这种方法包括：培养多能干细胞；使所述多能干细胞在体外分化成β-细胞系；以及将所述β-细胞系的细胞植入到所述患者体内。 
本发明的另一方面提供了对患有2型糖尿病或具有发展成2型糖尿病危险的患者进行治疗的方法。这种方法包括：培养多能干细胞；使所述多能干细胞在体外分化成β-细胞系；以及将所述β-细胞系的细胞植入到所述患者体内。 
如果合适，还可以使用能够使植入的细胞易于存活并行使其功能的药物制剂或生物活性剂以对所述患者进行治疗。例如，这些药物制剂可以包括：胰岛素；转化生长因子-β（TGF-β）家族成员（TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3）；骨形成蛋白（BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-11、BMP-12和BMP-13）；成纤维细胞生长因子-1和成纤维细胞生长因子-2；血小板衍生生长因子-AA和血小板衍生生长因子-BB；富含血小板浆液；胰岛素生长因子（IGF-I、IGF-II）；生长分化因子（GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-10、GDF-15）；血管内皮细胞生长因子（VEGF）；多效生长因子（pleiotrophin）；内皮素；以及其它因子。其它的药物化合物可以包括：例如，烟酰胺；胰高血糖素样肽-I（GLP-1）和胰高血糖素样肽-II（GLP-2）；GLP-1和GLP-2的模拟体（mimetibody）；Exendin-4（肠促胰岛素类似物）；维甲酸；甲状腺激素；促***原活化蛋白激酶（MAPK）抑制因子，如美国公开申请2004/0209901和美国公开申请2004/0132729中公开的化合物。 
在被移植到接受者体内之前，所述多能干细胞可以分化成产胰岛素的细胞。在一个具体的实施方式中，在被移植到接受者体内之前，所述多能干细胞全部分化成β-细胞。选择性地，所述多能干细胞可以以未分化的或部分分化的状态而移植入接受者体内。在所述接受者体内还可以发生进一步的分 化。 
中胚层（Isl1+）细胞和/或心肌细胞可以以分散的细胞状态被植入，或者形成能够被直接注入到心脏或肝门静脉的簇。可替换地，特定的内胚层细胞、胰内胚层细胞、或β-细胞可以以分散的细胞状态被植入，或者形成能够被注入到肝门静脉的簇。选择性地，提供的细胞可以位于生物相容性的可降解聚合物载体或多孔的不可降解的设备中，或者所述细胞也可以被包埋，以保护其免受宿主的免疫应答的影响，并且能够植入到接受者体内的合适位点处。所述植入的位点包括：心脏、肝脏、胰脏（natural pancreas）、肾囊（renal subcapsular space）、网膜、腹膜、浆膜下层空间（subserosal space）、肠道、胃部、或皮下袋（subcutaneous pocket）。 
为了进一步促进植入细胞的分化、存活或活性，可以在植入所述细胞之前、同时或之后施以另外的因子（例如，生长因子、抗氧化剂、免疫抑制剂或抗炎药物）。在具体的实施方式中，使用了生长因子使植入的细胞在体内进行分化。这些因子可以由内源细胞分泌并在原位暴露于植入的细胞。通过内源地和外源地施以各种组合的本领域公知的生长因子，而诱导植入的细胞进行分化。 
用于移植的细胞的量取决于多种不同的因素，包括患者的状况以及对治疗的反应，可以由本领域的技术人员来决定。 
另一方面，本发明提供了对患有心血管疾病或糖尿病的或具有发展成心血管疾病或糖尿病危险的患者进行治疗的方法。这种方法包括：培养多能干细胞；使所述多能干细胞在体外分化成心肌细胞系或β-细胞；以及将得到的细胞合并入三维载体中。在植入到患者体内之前，所述细胞在体外可以维持在所述载体上。选择性地，含有所述细胞的载体可以被直接植入到患者体内而无需额外的体外培养。任选地，所述载体可以具有至少一种能够使移植的细胞易于存活以及行使其功能的药物制剂，在其他方面，所述载体也可以用 于治疗糖尿病、或者心血管的疾病或功能障碍。 
适用于本发明目的的所述载体的材料包括：用于组织修复的组织模板（tissue template）、导管（conduits）、屏障（barriers）和容器（reservoirs）。特别地，在体外和体内用于重建或再生生物组织以及递送用于诱导组织生长的趋化剂（chemotactic agents）的泡沫状、海绵状、凝胶状、水凝胶状、织物状和非织物结构的合成材料和天然材料，均适用于实施本发明的方法。例如，见以下专利中公开的材料：美国专利No.5,770,417、美国专利No.6,022,743、美国专利No.5,567,612、美国专利No.5,759,830、美国专利No.6,626,950、美国专利No.6,534,084、美国专利No.6,306,424、美国专利No.6,365,149、美国专利No.6,599,323、美国专利No.6,656,488、美国公开申请2004/0062753A1、美国专利No.4,557,264以及美国专利No.6,333,029。 
为了形成具有药物制剂的载体，在形成所述载体之前，可以将所述药物制剂与聚合物溶液混合。选择性地，优选在药学上可接受的载体的存在下，将所述药物制剂涂敷在预制的载体上。所述药物制剂可以以液体、固体粉末或其它合适的物理形式存在。选择性地，可以在所述载体中加入辅料，以改变所述药物制剂的释放速度。在一个替换性实施方式中，所述载体与至少一种药物化合物（抗炎化合物）相结合，例如，美国专利No.6,509,369中公开的化合物。 
所述载体可以与至少一种药物化合物（抗细胞凋亡的化合物）相结合，例如，美国专利No.6,793,945中公开的化合物。所述载体可以与至少一种药物化合物（抑制纤维化的化合物）相结合，例如，美国专利No.6,331,298中公开的化合物。所述载体可以与至少一种药物化合物（能够促进血管生成的化合物）相结合，例如，美国公开申请2004/0220393和美国公开申请2004/0209901中公开的化合物。所述载体可以与至少一种药物化合物（免疫抑制剂化合物）相结合，例如，美国公开申请2004/0171623中公开的化合物。 
所述载体可以与至少一种药物化合物（生长因子）相结合，例如，TGF-β家族成员（TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3）；骨形成蛋白（BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-11、BMP-12和BMP-13）；成纤维细胞生长因子-1和成纤维细胞生长因子-2；血小板衍生生长因子-AA和血小板衍生生长因子-BB；富含血小板浆液；胰岛素生长因子（IGF-I、IGF-II）；生长分化因子（GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-10、GDF-15）；血管内皮细胞生长因子（VEGF）；多效生长因子（pleiotrophin）；内皮素；及其它因子。其它的药物化合物可以包括，例如，烟酰胺；缺氧诱导因子1-α；胰高血糖素样肽-I（GLP-1）和胰高血糖素样肽-II（GLP-2）；GLP-1和GLP-2的模拟体（mimetibody）；Exendin-4（肠促胰岛素类似物）；Nodal；Noggin；神经生长因子（NGF）；维甲酸；甲状腺激素；腱糖蛋白-C；弹性蛋白原；凝血酵素衍生肽；Cathelicidins（一种抗菌肽）；防御素；层粘连蛋白；含有粘附细胞外基质蛋白的细胞结合结构域和肝素结合结构域的生物肽，例如，纤维连接蛋白和玻璃体结合蛋白；促***原活化蛋白激酶（MAPK）抑制因子，如美国公开申请2004/0209901和美国公开申请2004/0132729中公开的化合物。 
本发明的细胞向支架的结合可以通过简单地将细胞沉积在所述支架上来实现。通过简单地扩散，所述细胞能够进入到支架中（J.Pediatr.Surg.23(1Pt2):3-9(1988)）。发展了多种其它的方法来增强细胞接种的效率。例如，可以在将软骨细胞接种至聚羟基乙酸的过程中使用转瓶（spinner flask）（Biotechnol.Prog.14(2):193-202(1998)）。接种细胞的其它方法是通过离心，离心对接种的细胞产生最小的压力并且提高了接种的效率。例如，Yang等公开的一种细胞接种方法涉及到了离心细胞的固定化作用（CCI）（J.Biomed.Mater.Res.55(3):379-86(2001)）。 
通过参考以下对本发明的优选实施方式和此处包括的实施例的详细描 述，可以更好地理解本发明。然而，在公开和描述这些组合物和方法之前，应该理解的是，本发明并不限制于这些具体的核酸、具体的多肽、具体的细胞型、具体的宿主细胞、具体的条件或具体的方法等等，各种修改和改进对本领域技术人员来说是显而易见的。 
实施例 
提供以下实施例，以更加详细地描述本发明。应该注意的是，以下实施例并不视为以任何方式对本发明进行限制。 
所有的实施例均可使用（但不限制于）多种人胚胎干细胞系（hESC），包括：BG01、BG02、WA09。 
实施例1：人胚胎干细胞的培养 
（a）人胚胎干细胞 
人胚胎干细胞（hESCs；图1）分离自囊胚期的内细胞系（ICM）或植入前晚期胚胎（late pre-implantation embryos）。它们作为发育生物学的实验工具的能力来源于它们具有能够自我更新的能力以及能够分化成三个胚胎胚层（外胚层、内胚层和中胚层）和对特定的信号具有应答的胚外细胞系（图2）的能力。由于人胚胎干细胞（hESCs）的性质和行为概括了多个胚胎过程，因此它们可以用于了解多能干细胞在外胚层的发育以及在原肠形成期（gastrulation）分化成胚层的机制。它们还可以作为生成治疗上有用的细胞型的材料来源。 
（b）培养hESC的方法 
方法：表达包括如POU结构域转录因子Oct4在内的标记的hESCs优选在小鼠胚胎饲养条件培养基MEF-CM中或在确定培养基中使用基质胶作为生长基质（例如）生长。每个60mm的培养皿典型铺种1-1.5×106个细胞。 细胞以1：4至1：10的比例每4-5天传代一次。 
（i）小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基（MEF-CM） 
在Fgf2的存在下，hESCs可以在基质胶（BD生物科学；优选1：20至1：200的稀释）或能够用于支撑hESC在小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基中的维持的其它基质中生长（McLean et al.Stem Cells25:29）。细胞可以通过包括酶法（胰酶、AccutaseTM、胶原蛋白酶）、人工传代法（机械的）以及非酶法在内的多种方法进行传代。每个60mm的培养皿典型铺种1.5×106个细胞。细胞以1：4至1：10的比例每4-5天传代一次。 
（ii）确定的条件（DC） 
（a）用于hESCs的常规培养的确定培养基为购自Invitrogen的StemPro
Figure BDA00003743510000421
（Wang et al.,Blood110:4111）。除了AccutaseTM用于以单细胞悬液传代细胞以外，根据制造商推荐的方法使用该培养基。当我们需要改变培养基的组成以进行分化实验时，我们自己常规地制备了这种制剂。下文概括了这种制剂并且该制剂有能力使hESCc维持在多能性状态（pluripotent state）。以下确定的无血清培养基条件工作良好，但并不限制于这种特定的制剂，可以包括无饲养条件下的培养（feeder-free culture）：DMEM:F12（Gibco），2%BSA（血清，#82-047-3），1×青霉素/链球菌抗生素（Pen/Strep）（Gibco），1×非必需氨基酸（Gibco），1×微量元素A、B和C（Cellgro；#99-182-Cl，#99-176-Cl，#99-175-Cl），50μg/ml的抗坏血酸（Sigma，#A4034），10ug/ml的转铁蛋白（Gibco，#11107-018），0.1nMβ-巯基乙醇，8ng/ml的Fgf2（Sigma，#F0291），200ng/ml的LR-IGF（JRH Biosciences，#85580），10ng/ml活化素A（R&DSystems，#338-AC），10ng/ml的Heregulin-β（Peprotech;#100-03）。 
（b）根据制造商推荐的方法，还可以在另外的可商购的确定培养基制剂（例如，mTeSRl（BD/Stem Cell Technologies;Ludwig et al,Nat Biotechnol.24:185））中培养hESCs。可以将AccutaseTM传代与该培养基结合使用。 
c．hESCs的分化能力 
hESCs具有分化成三个胚胎胚层细胞（外胚层细胞、内胚层细胞和中胚层细胞）的每个胚层细胞和另外的胚外细胞系（图2）的能力。因此，它们是产生多种不同的在治疗上有用的细胞型的起始点。 
实施例2：产生中内胚层细胞的方法 
hESCs向中胚层细胞和内胚层细胞的分化涉及通过加入诱导分化的因子（例如Wnt3a和GSK抑制剂）（图3）而使细胞经过T+/Brachyury+中内胚层细胞的中间细胞型转变。 
（a）使用Wnt从hESCs产生中内胚层细胞 
该方法涉及通过加入典型的Wnt信号分子Wnt3a，以使hESCs分化为中内胚层细胞。 
（a-i）在含有少量活化素A的培养基中使用Wnt3a产生中内胚层细胞 
hESCs（BG01）以实施例1的特定条件于确定培养基中铺种。16-24小时以后，向培养物中加入人Wnt3a（25ng/ml；R&D Systems）。Q-PCR分析显示在48小时时Nanog转录本的量降低；在第1-2天期间T、Eomes和MixL1的mRNA水平提高，然后在第5天降低（图4A）。 
使用免疫染色确定48小时后的E-钙粘蛋白和Nanog的下调。在这一时间范围内，β-连环蛋白（catenin）和Snail在细胞核内累积，并且T/brachyury水平增加（图4B）。结合Q-PCR数据，这些结果表明Wnt3a引起了hESCs向中内胚层细胞分化，包括上皮向间充质的转变。 
（a-ii）在缺乏活化素A信号的条件下使用Wnt3a来产生中内胚层细胞 
通过在补充有SB431542（20μM）的确定培养基中添加Wnt3a（25ng/ml），使hESCs分化成中内胚层细胞。因为hESC分化成中内胚层细胞并不需要活化素A信号，但是依赖于典型的Wnt信号途径的激活（图5），因此该方法 是可行的。 
（a-iii）在不含活化素A的培养基中使用Wnt3a来产生中内胚层细胞 
通过在确定培养基或缺乏活化素A的MEF-CM中添加Wnt3a（25ng/ml），使hESCs分化成中内胚层细胞。因为hESC分化成中内胚层细胞并不需要活化素A信号，但是依赖于典型的Wnt信号途径的激活（图5），因此该方法是可行的。 
（a-iv）在缺乏活化素A信号和存在SB431542的条件下使用Wnt3a来产生中内胚层细胞 
通过在缺乏活化素A和存在活化素A信号抑制剂SB431542的确定培养基中添加Wnt3a（25ng/ml），使hESCs分化成中内胚层细胞。因为hESC分化成中内胚层细胞并不需要活化素A信号，因此该方法是可行的。 
（b）使用GSK抑制剂从hESCs产生中内胚层细胞 
该方法涉及通过添加GSK抑制剂BIO（（2′Z，3′E）-6-溴靛玉红-3′-肟，GSK3抑制剂IX，Calbiochem）使hESCs分化成中内胚层细胞。 
（b-i）在确定培养基中使用BIO从hESCs产生中内胚层细胞 
hESCs（BG01）以实施例1的特定条件于确定培养基中铺种。16-24小时以后，向培养物中加入BIO（2μM）。Q-PCR分析显示在48小时时Nanog转录本的量降低；在开始的24小时T和MixL1的mRNA水平提高，然后降低（图6）。使用免疫染色确定48小时后的E-钙粘蛋白和Nanog下调。在这一时间范围内，Snail在细胞核内累积并且T/brachyury水平增加（图6）。结合Q-PCR数据，这些结果表明BIO引起hESCs向中内胚层细胞分化，涉及上皮向间充质的转变。 
（b-ii）向在MEF-CM中生长的hESCs中添加GSK抑制剂BIO 
hESCs（BG02）于MEF-CM中生长在覆盖基质胶的培养皿上，第4天在添加BIO（2μM）的MEF-CM中传代。第一个实验显示以胰酶进行细胞 传代。在该实验中，BIO处理引起Oct4和E-钙粘蛋白的下调，和T/Brachyury的上调（图7A、图7B）。这表明BIO处理促进上皮向间充质转变和分化为中内胚层细胞。第二个实验与第一个实验类似，向在MEF-CM中培养的hESCs加入BIO，这个实验以胶原蛋白酶传代。BIO处理引起Nanog和E-钙粘蛋白的下调，和T/Brachyury的上调（图8A、图8B）。这些结果再一次表明通过BIO抑制GSK会引起中内胚层细胞的分化和与上皮向间充质转变相关。 
（b-iii）通过添加GSK抑制剂（BIO和SB431542）使细胞分化成中内胚层细胞 
将在确定培养基中生长于基质胶上的hESCs（BG02）以AccutaseTM传代到补充BIO（2μM）和SB431542（20μM）的确定培养基中。使用Q-PCR分析来监测这些细胞在8天时间内的分化。该数据显示BIO/SB431542处理在24-48小时内引起Nanog转录本的量降低，表示失去了多能性（图9）。24小时以后，T/Brachyury转录本水平显著增加并在该时间段内保持。中胚层细胞的标记（FoxF1、PDGFRα）和内胚层细胞的标记（Swx17、CXCR4）在这段时间内没有显著改变（图9）。这些结果表明由于SB431542的抑制作用使活化素A信号缺失的情况下，BIO可以促进hESCs分化成中内胚层细胞。 
（b-iv）在缺乏活化素A的培养基中通过以GSK抑制剂处理使hESCs分化成中内胚层细胞 
向在MEF-CM中或缺乏活化素A的确定培养基中生长的hESCs加入BIO，使hESCs分化成中内胚层细胞。这基于我们先前的研究，该研究显示中内胚层细胞分化依赖于活化素A信号，并且在MEF-CM和确定培养基中BIO可以促进EMT/中内胚层细胞的分化（图5）。 
（b-v）在含高浓度活化素A的培养基中通过GSK抑制剂的处理使 hESCs分化成中内胚层细胞 
向在MEF-CM中或含高水平活化素A（100ng/ml）的确定培养基中生长的hESCs加入BIO，使hESCs分化成中内胚层细胞。这基于我们先前的研究，该研究显示中内胚层细胞的分化依赖于活化素A信号，并且在MEF-CM和确定培养基中BIO可以促进EMT/中内胚层细胞的分化。 
实施例3：产生中胚层衍生的Isl1+多能祖细胞（IMPs）的方法 
该实施例描述产生中胚层衍生的Isl1+多能祖细胞（IMPs）细胞型的方法，该细胞型具有分化成心肌细胞、平滑肌细胞或内皮细胞的能力。该细胞型经过中内胚层细胞状态然后到中胚层细胞的途径分化（图10）。 
（a）向hESC培养物中加入Wnt3a和BMP4以产生ISl1+多能祖细胞（IMP） 
在StemPro
Figure BDA00003743510000461
确定培养基中生长的BG02hESCs以AccutaseTM传代，除培养基中补充BMP4（100ng/ml，R&D Systems）和人Wnt3a（R&D Systems）以外，如实施例1中所述铺种在覆盖基质胶的培养皿中（每个60mm培养皿接种1.0×106个细胞）。每天更换培养基。在240小时（10天）内进行Q-PCR分析以评价分化。该分析显示中内胚层细胞的标记（如T）在处理后24小时提高，之后降低（图11）。在处理24小时后，指示中胚层细胞分化的转录本标记显著上调（Isl1、PDGFRα、KDR、Tbx20、GATA4）（图11）。 
免疫染色揭示，在处理后的24-96小时内多数细胞为T染色阳性，而到144小时此种细胞数减少（图12）。在以BMP4和Wnt3a处理6天（144小时）后，多于90%的细胞为Nkx2.5、Isl1和Tbx20染色阳性（图13）。此种基因表达谱表示第二心脏部位（secondary heart field）的多能Isl1+祖细胞（Laugwitz等，Development135：1933-205）。分化成Isl1+细胞伴随着不同的细胞形态改变（图14）。 
（b）通过在第1-3天添加Wnt3a随后添加BMP4以产生Isl1+多能祖细胞（IMP） 
在MEF-CM或确定培养基中生长的hESCs，开始的1-3天以Wnt3a处理，随后添加BMP4再处理2-4天，以产生Isl1+中胚层细胞（图15）。 
（c）向MEF-CM中的hESCs添加BMP4和GSK抑制剂（如BIO）以产生Isl1+多能祖细胞（IMP） 
在MEF-CM中生长于基质胶上的BG02hESCs以胰酶传代，以每个60mm培养皿接种1.5×106个细胞的密度接种回补充BIO（2μM）和BMP4（100ng/ml）的MEF-CM中的基质胶上。每天更换培养基。在240小时（10天）内进行Q-PCR分析以评价分化。与hESCs（图1）相比，处理的细胞发生了指示分化的形态学变化（图16）。对转录本水平的Q-PCR分析显示hESC标记（如Nanog、Oct4、Lefyt A）在处理后48小时降低，而中内胚层细胞标记（T、MixL1）在48小时达到峰值然后在96小时下降。当中内胚层细胞标记水平降低时，早期中胚层细胞标记（FoxF1、GATA4、Isl、Tbx20、PDGFRα、PDGFRβ）从24-48小时开始升高（图17）。这些标记表示IMPs形成。 
（d）向确定培养基中培养的hESCs添加BMP4和GSK抑制剂（如BIO）以产生Isl1+多能祖细胞（IMP） 
通过向确定培养基中培养的hESCs添加BMP4和BIO，使hESCs分化成Isl1+祖细胞（IMP）。以BMP4和BIO处理6天（图10）。 
（d）通过添加GSK抑制剂（如BIO）处理1-3天，随后添加BMP4以产生Isl1+多能祖细胞 
在MEF-CM中或确定培养基中生长的hESCs，添加GSK抑制剂（如BIO）处理1-3天，随后添加BMP4再处理2-4天，以从hESCs产生Isl1+中胚层细胞（图15）。 
（e）向hESC培养物中加入Wnt3a、BMP4和TGFβ抑制剂（如SB431542）以产生ISl1+多能祖细胞（IMP） 
在MEF-CM中或确定培养基中生长的hESCs，添加Wnt3a、BMP4和TGFβ抑制剂（如SB431542）处理1-4天，随后除去TGFβ抑制剂并以Wnt3a和BMP4继续培养2-4天，以从hESCs产生Isl1+中胚层细胞（图18）。 
（f）通过在添加Wnt3a和TGFβ抑制剂（如SB431542）处理1-4天，随后添加BMP4再培养2-4天以产生Isl1+多能祖细胞 
在MEF-CM中或确定培养基中生长的hESCs，添加Wnt3a和TGFβ抑制剂（如SB431542）处理1-4天，随后添加BMP4再培养2-4天，以从hESCs产生Isl1+中胚层细胞（图19）。 
（g）通过添加Wnt3a和SB431542处理1-3天随后添加BMP4再培养2-4天以产生Isl1+多能祖细胞 
在MEF-CM中或确定培养基中生长的hESCs，添加Wnt3a和SB431542处理1-3天，随后添加BMP4再培养2-4天，以从hESCs产生Isl1+中胚层细胞。 
实施例4：IMPs可以分化成心脏细胞系、内皮细胞、心肌细胞和平滑肌细胞 
（a）从IMPs产生平滑肌细胞 
hESCs在存在Wnt3a（25ng/ml）和BMP4（100ng/ml）的确定培养基中生长6天。将该细胞以1:4-1:6的比例分种到相同培养基中再培养4天。然后将该细胞固定并进行平滑肌标记（肌动蛋白、Calponin（一种钙结合蛋白）、Caldesmin（一种钙调素结合蛋白）和SM-MHC）的染色（图20）。多数细胞都能够染上这些平滑肌标记。 
（b）从IMPs产生心肌细胞和内皮细胞 
通过三种不同的处理产生IMPs。处理1：hESCs在开始的24小时在含活化素A（100ng/ml）的确定培养基中生长，在含Wnt3a（25ng/ml）的确定培养基中生长1-4天，在含BMP4（100ng/ml）的确定培养基中生长2-6天。处理2：hESCs（BG02）在含Wnt3a（25ng/ml）而除去IGF-I、Heregulin和FGF2的确定培养基中生长1-4天，在含BMP4（100ng/ml）的确定培养基中生长2-6天。处理3：hESCs在开始的24小时在含活化素A（100ng/ml）的确定培养基中生长，在含Wnt3a（25ng/ml）的确定培养基中生长1-2天，在在含BMP4（10ng/ml）的确定培养基中生长2-6天。在第6天末，将所述细胞置于确定培养基中再培养14天。收集细胞然后进行Q-PCR分析，结果显示处理2产生内皮细胞标记（CD31/Pecam1和CDH5/VE-钙粘蛋白），且处理3产生心肌细胞标记（ACTC/心肌α肌动蛋白、和cTNT）（图21）。这些结果显示IMP细胞可以分化成心肌细胞和内皮细胞。 
实施例5：中胚层衍生的Isl1+多能祖细胞（IMP）的组合特征 
胰岛1+多能祖细胞（IMPs）具有下述特征： 
·表达IsIl、Tbx20、Nkx2.5、Fgf10、GATA4、KDR（Flk1）、FoxF1、PDGFRα 
·核型正常 
·不表达Oct4、Nanog、T、Eomesodermin 
·可以分化成心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞 
·当注射到SCID小鼠的后肢肌肉中时不形成畸胎瘤 
对形成的IMPs进行微阵列分析。hESCs在加入Wnt3a（25ng/ml）和BMP4（100ng/ml）的确定培养基中培养6天。在0、24小时、48小时、72小时、96小时、144小时取样品提取mRNA，随后进行微阵列分析。该微阵列分析在本文件附件的表中概括。（IMP微阵列） 
实施例6：IMP细胞可以用于心血管疾病的细胞治疗；心脏和脉管 
由于IMP细胞具有分化成含心脏脉管细胞的主要细胞系，因此IMP细胞可以用于细胞治疗。例如当它们通过本领域技术人员植入后，可以用于损伤心肌的再生。通过本领域技术人员植入后，它们也可以用于修复损伤的脉管。 
实施例7：产生定形内胚层细胞（DE）的方法 
（a）用Wnt和TGFβ抑制剂（如SB431542）和随后用高浓度活化素A处理hESC以产生DE 
向确定hESC培养基中添加Wnt和SB431542处理1-3天，随后除去Wnt和SB431542以及IGF-I和Heregulin，添加高浓度活化素（50-100ng/ml）再处理1-3天，以形成DE。可以将hESC传代到覆盖基质胶的培养皿或等同物上（图22）。 
（b）用GSK抑制剂（BIO）和高浓度活化素A处理hESC以产生DE 
向hESC确定培养基（无IGF-I和Heregulin）中添加BIO（2μM）和高浓度活化素（50-100ng/ml）处理3-5天（图23）。可以将hESC传代到覆盖基质胶的培养皿或等同物上。 
（c）用BIO和低浓度活化素A（10ng/ml）处理hESC以形成DE 
向hESC确定培养基（无IGF-I和Heregulin）中添加BIO（2-5μM）处理3-5天（图24）。可以将hESC传代到覆盖基质胶的培养皿或等同物上。 
（d）通过添加BIO处理1-3天随后添加活化素A处理1-3天以从hESC形成DE 
向hESC确定培养基中添加BIO（2μM）处理1-3天以达到中内胚层细胞的阶段，随后除去BIO以及IGF-I和Heregulin并添加活化素A处理1-3 天（图22）。可以将hESC传代到覆盖基质胶的培养皿或等同物上。 
（e）通过添加BIO和SB431542处理1-4天随后添加活化素A处理1-3天以产生DE 
取hESC在存在BIO（2μM）和SB431542（20μM）的确定培养基中生长4天。然后将细胞分为1-4份在同样培养基或无IGF-I和Heregulin并添加活化素A（100ng/ml）的培养基中再生长4天（图22）。每2天直到8天取样品（BG02）进行Q-PCR分析。第一个步骤中BIO/SB431542使细胞在开始的2天分化为T/brachrury阳性、Nanog、Sox17和CXCR4阴性细胞。该细胞类型在BIO/SB431542存在的条件下维持。当将所述细胞转到添加活化素A（100ng/ml）的确定培养基（无IGF-I和Heregulin）中时，它们进一步分化成DE，证据为DE标记Sox17和CXCR4的上调，并缺乏中胚层细胞标记FoxF1（图25）。可以将hESC传代到覆盖基质胶的培养皿或等同物上。 
实施例8：产生多能间充质细胞（MMCs）的方法 
在StemPro
Figure BDA00003743510000511
确定培养基中生长的BG02hESCs以AccutaseTM传代，除培养基中补充BIO（2μM）和SB431542（20μM；Sigma）以外，如实施例1中所述铺种在覆盖基质胶的培养皿中（每个60mm培养皿接种1.0×106个细胞）。每天更换培养基，每5-6天以AccutaseTM传代，每次传代以1:5-1:10的比例分种细胞。当在这样的条件下培养是，在第一代（P0）多能标记Nanog降低和T转录本水平升高，而Sox7、FoxF1、CXCR4和PDGFRα持续低水平（图26）。以BIO和SB431542处理4天以后，～90%的细胞染色为+ve，表明它们在某些点上经中内胚层细胞阶段转变（图27A）。免疫染色表明，在此期间，Oct4和E-cad（E-钙粘蛋白）显著下调（图27B、图27C）。E-钙粘蛋白的小时表示细胞经历了上皮向间充质的转变，与中内胚层细胞的分化一致。对于持续传代的情况，在P1-P10期间T表达降低（用过Q-PCR测 定），并且多能标记Nanog不再出现（图28）。这种结果通过免疫染色进行证实，其中P7细胞不表达Nanog、Oct4或E-钙粘蛋白，这与hESCs相反（图29）。在此时间段内，中胚层细胞和内胚层细胞的标记不增加。为了确立BIO/SB431542处理的细胞的命运，将它们在相同的条件下持续传代，发现它们在20代内维持有力的增殖活性并保持形态（图30A）。将MMCs用标准方法冷冻，并以大于10%的铺盘率（plating efficiency）复苏。冷冻过的MMCs的生长特征和形态与冷冻前的MMCs不同（图30B）。 
在从BG02hESCs产生的MMCs中，使用CXCR4抗体来富集CXCR4+细胞群，证明所述MMCS可以用荧光活性细胞分选（FACS）来选出、重新铺种和扩增（图30C）。 
流式细胞计数分析表明以BIO/SB431542处理的hESCs丢失细胞表面标记SSEA3和SSEA4，表明从多能hESC状态的分化途径（图31）。从P0-P19维持的处理的细胞持续缺乏SSEA3和SSEA4（图31）。因此，由这一标准说明处理的细胞不是hESCs。 
尽管在P0-P3细胞（例如）中检测中胚层细胞和内胚层细胞标记的出现，但是没有观测到分化到中胚层和内胚层细胞系的信号，表明BIO/SB431542处理在中胚层和内胚层细胞系的标记出现之前使所述细胞的发育阶段停滞。认为这些处理的细胞是前中胚层细胞和前内胚层细胞，而不再是hESCs。这增加了这些细胞在除去BIO/SB431542和添加细胞分化因子后保留多能分化能力的可能性。为了测试在含BIO/SB431542的培养基中，所述细胞可以进一步分化成内胚层细胞的可能性，将细胞在BIO/SB431542中培养6代，然后除去培养基中的BIO/SB431542以及IGF-I和Heregulin（PI3K活性的两个激活因子），并补充活化素A到100ng/ml。这些是迟迟hESCs分化成定形的内胚层细胞的条件。在改变内胚层细胞的分化条件后4天内，观测到Sox17和CXCR4转录本的量增加，而Nanog、T和Eomesodermin转录本维持低水 平（图32）。这些结果表明在BIO/SB431542中传代的细胞保持产生内胚层细胞的潜能，并且当在合适条件下培养时能被诱导向内胚层细胞分化。如果将BIO/SB431542处理的细胞暴露于合适的特异因子，所述细胞也能分化成中胚层细胞和可能的其它细胞系（外胚层细胞）。例如，如果除去培养基中的BIO/SB431542并添加BMP4，BIO/SB431542处理的细胞可以转变为中胚层细胞。 
以BIO/SB431542处理hESCs会导致产生具有稳定特征的自我更新的细胞群，该细胞群可以分化成内胚层细胞和可能分化为中胚层细胞。由于这种间充质特性，该细胞类型被称为多能间充质细胞（MMC）（图33）。 
实施例9：多能间充质细胞（MMCs）的组合特征 
所述多能间充质细胞（MMC）具有以下特征： 
·能够作为稳定细胞群培养至少20代 
·当细胞以低密度铺种时表现为间充质细胞，在高密度培养时生长成片层 
·能够从包括BG01、BG02、WA09在内的hESC细胞系中产生 
·MMCs能够用标准方法冷冻和低温保存 
·MMCs能够从低温保存中恢复（recovered after cryogenic storage）、复苏（recovered）和分化 
·MMCs能够以高铺种效率传代 
·在它们的细胞表面没有SSEA3和SSEA4抗原 
·不表达hESC标记，例如Oct4、Nanog 
·MMCs的表面能够表达CXCR4 
·MMCs能够表达高水平的以下转录本：Zicl、HoxA9、HoxD4、HoxC6、N-CAM 
·MMCs不是中内胚层细胞，因为它们不表达T/鼠短尾突变体表型（brachyury）或Eomesodermin 
·E-钙粘蛋白阴性 
·MMCs不表达高水平的Sox17、Isl1、Musashi、巢蛋白（Nestin） 
·在传代过程中保持正常核型 
·呈现游走、间充质表型 
·具有多能分化能力（包括中胚层细胞、内胚层细胞） 
·当注射到SCID小鼠中时不形成畸胎瘤 
-对MMC基因表达谱更完整的描述见微阵列数据 

Claims (84)

1.一种使灵长类多能干细胞分化成中内胚层细胞的方法，该方法包括（a）提供灵长类多能干细胞，和（b）将该灵长类多能干细胞与有效量的GSK抑制剂在细胞分化培养基中接触至少约18小时，以产生中内胚层细胞，和（c）任选地，分离所述中内胚层细胞，其中，灵长类多能干细胞来自WA01、WA07、WA099、BG01、BG02或iPS细胞系。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述灵长类多能干细胞为人胚胎干细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述GSK抑制剂选自由下列物质所组成的组中：
BIO（2′Z，3′E）-6-溴靛玉红-3′-肟（GSK3抑制剂IX）；
BIO-丙酮肟（2′Z，3′E）-6-溴靛玉红-3′-丙酮肟（GSK3抑制剂X)；
（5-甲基-1H-吡唑-3-基）-（2-苯基喹唑啉-4-基）胺（GSK3-抑制剂XIII）；
吡啶并咔唑-环戊二烯基钌复合物（GSK3抑制剂XV)；
TDZD-84-苯甲基-2-甲基-1,2,4-噻二唑-3,5-二酮（GSK3β抑制剂I）；
2-硫代（3-碘苯甲基）-5-（1-吡啶基）-[1,3,4]-恶二唑（GSK3β抑制剂II）；
OTDZT2,4-二苯甲基-5-氧化噻二唑-3-硫酮（GSK3β抑制剂III）；
α-4-二溴苯乙酮（GSK3β抑制剂VII）；
AR-A014418N-（4-甲氧基苯甲基）-N′-（5-硝基-1,3-噻唑-2-基）尿素（GSK-3β抑制剂VIII）；
3-（l-（3-羟丙基）-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基]-4-吡嗪-2-基-吡咯-2,5-二酮（GSK-3β抑制剂XI）；
TWS119吡咯嘧啶化合物（GSK3β抑制剂XII）；
L803H-KEAPPAPPQSpP-NH2或它的肉豆蔻酰形式（GSK3β抑制剂XIII）；
2-氯-1-（4,5-二溴-噻吩-2-基）-乙酮（GSK3β抑制剂VI）；以及
它们的混合物。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述GSK抑制剂是Wnt蛋白。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述Wnt蛋白选自由Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt10、Wnt14、Wnt14b、Wnt15、Wnt16和它们的混合物所组成的组中。
6.根据权利要求1-3中的任意一项所述的方法，其中，所述GSK抑制剂为BIO（2′Z，3′E）-6-溴靛玉红-3′-肟（GSK3抑制剂IX）。
7.根据权利要求1-2和4-5中的任意一项所述的方法，其中，所述Wnt蛋白为Wnt3a。
8.根据权利要求1-7中的任意一项所述的方法，其中，所述接触的步骤的时间范围为约18-72小时。
9.根据权利要求1-8中的任意一项所述的方法，其中，所述细胞分化培养基至少为添加有一种或多种任选成分的极限必需培养基，所述任选成分选自由生长因子、抗坏血酸、葡萄糖、非必需氨基酸、包括微量元素在内的盐、谷氨酰胺、胰岛素、活化素A、转铁蛋白、以及β巯基乙醇所组成的组中。
10.根据权利要求1-9中的任意一项所述的方法，其中，所述细胞分化培养基选自由达尔伯克改良的伊格尔培养基（DMEM）、敲除的达尔伯克改良的伊格尔培养基（KO DMEM）、Ham′s F12/DMEM基本培养基（50:50）所组成的组中，所述Ham′s F12/DMEM基本培养基中还含有白蛋白、抗生素、微量矿物质、抗坏血酸、β-巯基乙醇、成纤维细胞生长因子、和***类似物。
11.根据权利要求1-9中的任意一项所述的方法，其中，所述细胞分化培养基为含有有效量的前白蛋白、青霉素/链球菌抗生素、非必需氨基酸、微量矿物质、抗坏血酸、β-巯基乙醇、成纤维细胞生长因子、***类似物、活化素A和Heregulin的DMEM/F12（50:50）。
12.一种使灵长类多能干细胞分化成中胚层（Isl1+）细胞的方法，该方法包括（a）提供灵长类多能干细胞；（b）将该灵长类多能干细胞与有效量的GSK抑制剂在细胞分化培养基中接触至少约18小时，以产生中内胚层细胞；和（c）将从步骤（b）获得的所述细胞与有效量的骨形成蛋白和任选的GSK抑制剂接触至少约2天，以产生所述中胚层细胞；和（d）任选地，分离所述中胚层细胞，其中，灵长类多能干细胞来自WA01、WA07、WA099、BG01、BG02或iPS细胞系。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述灵长类多能干细胞为人胚胎干细胞。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中，所述GSK抑制剂选自由下列物质所组成的组中：
BIO（2′Z，3′E）-6-溴靛玉红-3′-肟（GSK3抑制剂IX）；
BIO-丙酮肟（2′Z，3′E）-6-溴靛玉红-3′-丙酮肟（GSK3抑制剂X)；
（5-甲基-1H-吡唑-3-基）-（2-苯基喹唑啉-4-基）胺（GSK3-抑制剂XIII）；
吡啶并咔唑-环戊二烯基钌复合物（GSK3抑制剂XV)；
TDZD-84-苯甲基-2-甲基-1,2,4-噻二唑-3,5-二酮（GSK3β抑制剂I）；
2-硫代（3-碘苯甲基）-5-（1-吡啶基）-[1,3,4]-恶二唑（GSK3β抑制剂II）；
OTDZT2,4-二苯甲基-5-氧化噻二唑-3-硫酮（GSK3β抑制剂III）；
α-4-二溴苯乙酮（GSK3β抑制剂VII）；
AR-A014418N-（4-甲氧苯甲基）-N′-（5-硝基-1,3-噻唑-2-基）尿素（GSK-3β抑制剂VIII）；
3-（l-（3-羟丙基）-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基]-4-吡嗪-2-基-吡咯-2,5-二酮（GSK-3β抑制剂XI）；
TWS119吡咯嘧啶化合物（GSK3β抑制剂XII）；
L803H-KEAPPAPPQSpP-NH2或它的肉豆蔻酰形式（GSK3β抑制剂XIII）；
2-氯-1-（4,5-二溴-噻吩-2-基）-乙酮（GSK3β抑制剂VI）；以及
它们的混合物。
15.根据权利要求12或13所述的方法，其中，所述GSK抑制剂是Wnt蛋白。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述Wnt蛋白选自由Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt10、Wnt14、Wnt14b、Wnt15、Wnt16和它们的混合物所组成的组中。
17.根据权利要求12-14中的任意一项所述的方法，其中，所述GSK抑制剂为BIO（2′Z，3′E）-6-溴靛玉红-3′-肟（GSK3抑制剂IX）。
18.根据权利要求12-13和16-17中的任意一项所述的方法，其中，所述Wnt蛋白为Wnt3a。
19.根据权利要求12-18中的任意一项所述的方法，其中，所述接触的步骤（b）的时间范围为约18-72小时。
20.根据权利要求12-19中的任意一项所述的方法，其中，所述骨形成蛋白选自由BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7和它们的混合物所组成的组中。
21.根据权利要求12-20中的任意一项所述的方法，其中，所述接触的步骤（c）的时间范围为约3-9天。
22.根据权利要求12-21中的任意一项所述的方法，其中，所述细胞分化培养基至少为添加有一种或多种任选成分的极限必需培养基，所述任选成分选自由生长因子、抗坏血酸、葡萄糖、非必需氨基酸、包括微量元素在内的盐、谷氨酰胺、胰岛素、活化素A、转铁蛋白、以及β巯基乙醇所组成的组中。
23.根据权利要求12-21中的任意一项所述的方法，其中，所述细胞分化培养基选自由达尔伯克改良的伊格尔培养基（DMEM）、敲除的达尔伯克改良的伊格尔培养基（KO DMEM）、Ham′s F12/DMEM基本培养基（50:50）所组成的组中，所述Ham′s F12/DMEM基本培养基中还包括白蛋白、抗生素、微量矿物质、抗坏血酸、β-巯基乙醇、成纤维细胞生长因子、以及***类似物。
24.根据权利要求12-21中的任意一项所述的方法，其中，所述细胞分化培养基为含有有效量的前白蛋白、青霉素/链球菌抗生素、非必需氨基酸、微量矿物质、抗坏血酸、β-巯基乙醇、成纤维细胞生长因子、***类似物、活化素A和Heregulin的DMEM/F12（50:50）。
25.一种产生多能游走细胞（MMCs）的方法，该方法包括（a）提供灵长类多能干细胞；和（b）将该灵长类多能干细胞与有效量的GSK抑制剂在组合有至少一种添加试剂的细胞分化培养基中接触至少约3天，以产生多能游走细胞，其中，所述添加试剂选自由活化素A信号抑制剂、骨形成蛋白抑制剂和它们的混合物所组成的组中；和（d）任选地，分离所述多能游走细胞，其中，灵长类多能干细胞来自WA01、WA07、WA099、BG01、BG02或iPS细胞系。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述灵长类多能干细胞为人胚胎干细胞。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其中，所述GSK抑制剂选自由下列物质所组成的组中：
BIO（2′Z，3′E）-6-溴靛玉红-3′-肟（GSK3抑制剂IX）；
BIO-丙酮肟（2′Z，3′E）-6-溴靛玉红-3′-丙酮肟（GSK3抑制剂X)；
（5-甲基-1H-吡唑-3-基）-（2-苯基喹唑啉-4-基）胺（GSK3-抑制剂XIII）；
吡啶并咔唑-环戊二烯基钌复合物（GSK3抑制剂XV)；
TDZD-84-苯甲基-2-甲基-1,2,4-噻二唑-3,5-二酮（GSK3β抑制剂I）；
2-硫代（3-碘苯甲基）-5-（1-吡啶基）-[1,3,4]-恶二唑（GSK3β抑制剂II）；
OTDZT2,4-二苯甲基-5-氧化噻二唑-3-硫酮（GSK3β抑制剂III）；
α-4-二溴苯乙酮（GSK3β抑制剂VII）；
AR-A014418N-（4-甲氧苯甲基）-N′-（5-硝基-1,3-噻唑-2-基）尿素（GSK-3β抑制剂VIII）；
3-（l-（3-羟丙基）-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基]-4-吡嗪-2-基-吡咯-2,5-二酮（GSK-3β抑制剂XI）；
TWS119吡咯嘧啶化合物（GSK3β抑制剂XII）；
L803H-KEAPPAPPQSpP-NH2或它的肉豆蔻酰形式（GSK3β抑制剂XIII）；
2-氯-1-（4,5-二溴-噻吩-2-基）-乙酮（GSK3β抑制剂VI）；以及
它们的混合物。
28.根据权利要求25或26所述的方法，其中，所述GSK抑制剂是Wnt蛋白。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述Wnt蛋白选自由Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt10、Wnt14、Wnt14b、Wnt15、Wnt16和它们的混合物所组成的组中。
30.根据权利要求25-27中的任意一项所述的方法，其中，所述GSK抑制剂为BIO（2′Z，3′E）-6-溴靛玉红-3′-肟（GSK3抑制剂IX）。
31.根据权利要求25-26和28-29中的任意一项所述的方法，其中，所述Wnt蛋白为Wnt3a。
32.根据权利要求25-31中的任意一项所述的方法，其中，所述接触的步骤（b）的时间范围为约4-12天。
33.根据权利要求25-32中的任意一项所述的方法，其中，所述活化素A信号抑制剂选自由SB-431542、卵泡抑素、卵泡抑素基因相关的蛋白、骨形成蛋白和活化素的膜结合抑制因子、抗BAMBI的单克隆抗体、Smad7（Mothers Against Decapentaplegic同源物7)、TGF RI抑制剂和它们的混合物所组成的组中。
34.根据权利要求25-33中的任意一项所述的方法，其中，所述骨形成蛋白抑制剂选自由Noggin、硬骨素、Gremlin（Drm/Gremlin）、USAG-1和它们的混合物所组成的组中。
35.根据权利要求25-34中的任意一项所述的方法，其中，所述接触的步骤（b）的时间范围为约4-9天。
36.根据权利要求25-35中的任意一项所述的方法，其中，所述细胞分化培养基至少为添加有一种或几种任选成分的极限必需培养基，所述任选成分选自由生长因子、抗坏血酸、葡萄糖、非必需氨基酸、包括微量元素在内的盐、谷氨酰胺、胰岛素、活化素A、转铁蛋白、以及β巯基乙醇所组成的组中。
37.根据权利要求25-36中的任意一项所述的方法，其中，所述细胞分化培养基选自由达尔伯克改良的伊格尔培养基（DMEM）、敲除的达尔伯克改良的伊格尔培养基（KO DMEM）、Ham′s F12/DMEM基本培养基（50:50）所组成的组中，所述Ham′s F12/DMEM基本培养基中还包括白蛋白、抗生素、微量矿物质、抗坏血酸、β-巯基乙醇、成纤维细胞生长因子、以及***类似物。
38.根据权利要求25-37中的任意一项所述的方法，其中，所述细胞分化培养基为含有有效量的前白蛋白、青霉素/链球菌抗生素、非必需氨基酸、微量矿物质、抗坏血酸、β-巯基乙醇、成纤维细胞生长因子、***类似物、活化素A和Heregulin的DMEM/F12（50:50）。
39.一种由多能游走细胞产生中胚层（ISl1+）细胞的方法，该方法包括（a）提供多能游走细胞群；和（b）将该多能游走细胞与有效量的骨形成因子和任选组合的GSK抑制剂在细胞分化培养基中接触至少约2天，以产生中胚层（ISl1+）细胞；和（c）任选地，分离所述中胚层（ISl1+）细胞，其中，多能游走细胞由WA01、WA07、WA099、BG01、BG02或iPS细胞产生。
40.根据权利要求39所述的方法，其中，所述细胞分化培养基不含有活化素A抑制剂和骨形成蛋白抑制剂。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中，所述多能游走细胞从与细胞分化培养基接触的人胚胎干细胞中获得，所述细胞分化培养基含有有效量的GSK抑制剂并组合了活化素A抑制剂和/或骨形成蛋白抑制剂。
42.根据权利要求39-41中的任意一项所述的方法，其中，所述GSK抑制剂选自由下列物质所组成的组中：
BIO（2′Z，3′E）-6-溴靛玉红-3′-肟（GSK3抑制剂IX）；
BIO-丙酮肟（2′Z，3′E）-6-溴靛玉红-3′-丙酮肟（GSK3抑制剂X)；
（5-甲基-1H-吡唑-3-基）-（2-苯基喹唑啉-4-基）胺（GSK3-抑制剂XIII）；
吡啶并咔唑-环戊二烯基钌复合物（GSK3抑制剂XV)；
TDZD-84-苯甲基-2-甲基-1,2,4-噻二唑-3,5-二酮（GSK3β抑制剂I）；
2-硫代（3-碘苯甲基）-5-（1-吡啶基）-[1,3,4]-恶二唑（GSK3β抑制剂II）；
OTDZT2,4-二苯甲基-5-氧化噻二唑-3-硫酮（GSK3β抑制剂III）；
α-4-二溴苯乙酮（GSK3β抑制剂VII）；
AR-A014418N-（4-甲氧苯甲基）-N′-（5-硝基-1,3-噻唑-2-基）尿素（GSK-3β抑制剂VIII）；
3-（l-（3-羟丙基）-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基]-4-吡嗪-2-基-吡咯-2,5-二酮（GSK-3β抑制剂XI）；
TWS119吡咯嘧啶化合物（GSK3β抑制剂XII）；
L803H-KEAPPAPPQSpP-NH2或它的肉豆蔻酰形式（GSK3β抑制剂XIII）；
2-氯-1-（4,5-二溴-噻吩-2-基）-乙酮（GSK3β抑制剂VI）；和
它们的混合物。
43.根据权利要求39-41中的任意一项所述的方法，其中，所述GSK抑制剂是Wnt蛋白。
44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述Wnt蛋白选自由Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt10、Wnt14、Wnt14b、Wnt15、Wnt16和它们的混合物所组成的组中。
45.根据权利39-42中的任意一项所述的方法，其中，所述GSK抑制剂为BIO（2′Z，3′E）-6-溴靛玉红-3′-肟（GSK3抑制剂IX）。
46.根据权利要求39-40和43-44中的任意一项所述的方法，其中，所述Wnt蛋白为Wnt3a。
47.根据权利要求39-46中的任意一项所述的方法，其中，所述接触的步骤的时间范围为约3-9天。
48.根据权利要求39-47中的任意一项所述的方法，其中，所述接触的步骤的时间范围为约4-7天。
49.根据权利要求39-47中的任意一项所述的方法，其中，所述细胞分化培养基至少为添加有一种或几种任选成分的极限必需培养基，所述任选成分选自由生长因子、抗坏血酸、葡萄糖、非必需氨基酸、包括微量元素在内的盐、谷氨酰胺、胰岛素、活化素A、转铁蛋白、以及β巯基乙醇所组成的组中。
50.根据权利要求39-47中的任意一项所述的方法，其中，所述细胞分化培养基选自由达尔伯克改良的伊格尔培养基（DMEM）、敲除的达尔伯克改良的伊格尔培养基（KO DMEM）、Ham′s F12/DMEM基本培养基（50:50）所组成的组中，所述Ham′s F12/DMEM基本培养基中还包括白蛋白、抗生素、微量矿物质、抗坏血酸、β-巯基乙醇、成纤维细胞生长因子、以及***类似物。
51.根据权利要求39-47中的任意一项所述的方法，其中，所述细胞分化培养基为含有有效量的前白蛋白、青霉素/链球菌抗生素、非必需氨基酸、微量矿物质、抗坏血酸、β-巯基乙醇、成纤维细胞生长因子、***类似物、活化素A和Heregulin的DMEM/F12（50:50）。
52.一种由多能游走细胞产生定形内胚层细胞的方法，该方法包括（a）提供多能游走细胞群；（b）将所述多能游走细胞与有效量的活化素A和任选的PI3激酶信号抑制剂接触至少约2天，以产生定形内胚层细胞；和（c）任选地分离所述定形内胚层细胞，其中，多能游走细胞由WA01、WA07、WA099、BG01、BG02或iPS细胞产生。
53.根据权利要求52所述的方法，其中，所述接触的步骤的时间范围为约4-5天。
54.根据权利要求52或53所述的方法，其中，所述PI3激酶信号抑制剂选自由雷怕霉素、LY294002、渥曼青霉素、氯化锂、Akt抑制剂I、Akt抑制剂II（SH-5）、Akt抑制剂III（SH-6）、NL-71-101和它们的混合物所组成的组中。
55.一种由多能游走细胞产生胰腺内胚层细胞的方法，该方法包括（a）提供多能游走细胞群；（b）将该多能游走细胞与有效量的活化素A和任选的PI3激酶信号抑制剂在细胞分化培养基中接触至少约2天，以产生定形内胚层细胞；（c）任选地分离所述定形内胚层细胞；（d）将所述定形内胚层细胞与有效量的视黄酸和FGF10在细胞分化培养基中接触至少约24小时，以产生胰腺内胚层细胞；和（e）任选地分离所述胰腺内胚层细胞，其中，多能游走细胞由WA01、WA07、WA099、BG01、BG02或iPS细胞产生。
56.根据权利要求55所述的方法，其中，通过将所述胰腺内胚层细胞暴露于含有有效量的视黄酸和FGF10的细胞分化培养基中约10-24天，以使所述胰腺内胚层细胞进一步分化成胰腺β细胞，以及任选地分离所述胰腺β细胞。
57.根据权利要求55所述的方法，其中，通过将所述胰腺内胚层细胞暴露于含有有效量FGF10而不含视黄酸的细胞分化培养基中至少约2天，以使所述胰腺内胚层细胞进一步分化成肝内胚层细胞，以及任选地分离所述肝内胚层细胞。
58.根据权利要求57所述的方法，其中，所述暴露的步骤的时间范围为约10-24天。
59.根据权利要求57-58中的任意一项所述的方法，其中，所述PI3激酶信号抑制剂选自由雷怕霉素、LY294002、渥曼青霉素、氯化锂、Akt抑制剂I、Akt抑制剂II（SH-5）、Akt抑制剂III（SH-6）、NL-71-101和它们的混合物所组成的组中。
60.一种多能游走细胞群，该多能游走细胞群具有至少4种以下特征：
a）该细胞能够作为稳定细胞群培养至少10代；
b）当该细胞以低密度铺种时表现为间充质细胞，在高密度培养时生长成片层；
c）该细胞能够从包括BG01、BG02、WA09在内的人胚胎干细胞细胞系中产生；
d）该细胞能够用标准方法冷冻和低温保存；
e）该细胞能够在低温保存后恢复、复苏和分化；
f）该细胞能够以高铺种效率传代；
g）该细胞在细胞表面没有SSEA3和SSEA4抗原；
h）该细胞不表达人胚胎干细胞标记Oct4或Nanog；
i）该细胞的表面能够表达CXCR4；
j）该细胞能够高水平地表达以下转录本：Zic1、Sox1、Sox2、HoxA9、HoxD4、HoxA5、HoxC10、HoxD3、Pax6、N-CAM、CXCR4；
k）该细胞不是中内胚层细胞，但是它们表达T/鼠短尾突变体表型或Eomesodermin；
l）该细胞为E-钙粘蛋白阴性；
m）该细胞不表达能够被Q-PCR分析检测到的水平的Sox17、Isl1、Musashi、巢蛋白；
n）该细胞在传代过程中保持正常核型；
o）该细胞呈现游走、间充质表型；
p）该细胞具有多能分化能力（包括中胚层细胞、内胚层细胞）；
q）当该细胞注射到严重综合免疫缺陷小鼠中时不形成畸胎瘤，
其中，多能游走细胞由WA01、WA07、WA099、BG01、BG02或iPS细胞产生。
61.一种通过权利要求25-38中的任意一项所述的方法产生的多能游走细胞群，该多能游走细胞群具有以下特征：
a）该细胞是多能的和自我更新的；
b）该细胞能够分化成包括内胚层细胞和中胚层细胞在内的多种细胞类型；
c）该细胞是动态细胞，能够在多能游走细胞（E-钙粘蛋白-、Oct4-、Nanog-、SSEA3-、CXCR4+）和可选细胞类型之间交替，所述可选细胞类型的E-钙粘蛋白+、Oct4+、Nanog+、SSEA3-、CXCR4+（高密度（上皮层））具有显著的发育可塑性；
d）基于标记谱，该细胞不是人胚胎干细胞。
62.冷冻保存的多能游走细胞群。
63.一种通过根据权利要求25-38中的任意一项所述的方法产生的冷冻保存的多能游走细胞群。
64.一种主要包括分离的中胚层（Isl1+）细胞（中胚层衍生的Isl1+多能祖细胞）的细胞群，该细胞群具有以下特征：
a）该细胞群表达Isl1、Tbx20、Nkx2.5、Fgf10、GATA4、KDR（Flk1）、FoxF1、PDGFRα；
b）该细胞群的核型正常；
c）该细胞群不表达Oct4、Nanog、T、Eomesodermin；
d）该细胞群能够分化为心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞。
65.一种通过权利要求12-24和39-51中的任意一项所述的方法获得的分离的中胚层（Isl+）细胞群，该细胞群具有以下特征：
a）该细胞群表达Isl1、Tbx20、Nkx2.5、Fgf10、GATA4、KDR（Flk1）、FoxF1、PDGFRα；
b）该细胞群的核型正常；
c）该细胞群不表达Oct4、Nanog、T、Eomesodermin；
d）该细胞群能够分化为心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞。
66.一种冷冻保存的中胚层（Isl+）细胞群，该细胞群是通过权利要求12-24和39-51中的任意一项所述的方法获得的。
67.一种心肌细胞群，该心肌细胞群是通过将根据权利要求12-24和39-51中的任意一项所述的方法获得的中胚层（Isl+）细胞分化而获得的。
68.中胚层（Isl+）细胞或心肌细胞在制备用于治疗心肌梗塞的药物中的用途。
69.根据权利要求68所述的用途，其中，所述药物直接施用于患者的心脏。
70.中胚层（Isl+）细胞在制备用于治疗损伤或萎缩的血管组织的药物中的用途，其中，所述药物施用于需要修复的血管处。
71.平滑肌细胞在制备用于治疗损伤或萎缩的血管组织的药物中的用途，通过将所述药物施用于所述损伤或萎缩的血管组织处，其中，通过将中胚层（Isl+）细胞与有效量的GSK抑制剂和BMP在分化培养基中接触至少约4天，而使所述中胚层（Isl+）细胞分化成平滑肌细胞，以产生平滑肌细胞；分离所述平滑肌细胞。
72.根据权利要求71所述的用途，其中，所述接触的步骤的时间范围为5-6天。
73.一种由灵长类多能干细胞产生Isl1+中胚层细胞的方法，该方法包括将所述灵长类多能干细胞在含有有效量的GSK抑制剂与有效量的骨形成蛋白的分化培养基中培养，并任选地，分离所述Isl1+中胚层细胞。
74.根据权利要求73所述的方法，其中，所述灵长类多能干细胞为人胚胎干细胞（hESCs）。
75.根据权利要求73所述的方法，其中，所述灵长类多能干细胞为诱导的人多能干细胞。
76.根据权利要求73所述的方法，其中，所述GSK抑制剂选自由下列物质所组成的组中：
BIO(2′Z，3′E)-6-溴靛玉红-3′-肟（GSK3抑制剂IX）；
BIO-丙酮肟（2′Z，3′E）-6-溴靛玉红-3′-丙酮肟（GSK3抑制剂X)；
（5-甲基-1H-吡唑-3-基）-（2-苯基喹唑啉-4-基）胺（GSK3-抑制剂XIII）；
吡啶并咔唑-环戊二烯基钌复合物（GSK3抑制剂XV)；
TDZD-84-苯甲基-2-甲基-1,2,4-噻二唑-3,5-二酮（GSK3β抑制剂I）；
2-硫代（3-碘苯甲基）-5-（1-吡啶基）-[1,3,4]-恶二唑（GSK3β抑制剂II）；
OTDZT2,4-二苯甲基-5-氧化噻二唑-3-硫酮（GSK3β抑制剂III）；
α-4-二溴苯乙酮（GSK3β抑制剂VII）；
AR-A014418N-（4-甲氧基苯甲基）-N′-（5-硝基-1,3-噻唑-2-基）尿素（GSK-3β抑制剂VIII）；
3-（l-（3-羟丙基）-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基]-4-吡嗪-2-基-吡咯-2,5-二酮（GSK-3β抑制剂XI）；
TWS119吡咯嘧啶化合物（GSK3β抑制剂XII）；
L803H-KEAPPAPPQSpP-NH2或它的肉豆蔻酰形式（GSK3β抑制剂XIII）；
2-氯-1-（4,5-二溴-噻吩-2-基）-乙酮（GSK3β抑制剂VI）；以及
它们的混合物。
77.根据权利要求73所述的方法，其中，所述GSK抑制剂是Wnt蛋白。
78.根据权利要求76所述的方法，其中，所述Wnt蛋白选自由Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt10、Wnt14、Wnt14b、Wnt15、Wnt16和它们的混合物所组成的组中。
79.根据权利要求73所述的方法，其中，所述GSK抑制剂为BIO(2′Z，3′E)-6-溴靛玉红-3′-肟（GSK3抑制剂IX）。
80.根据权利要求77所述的方法，其中，所述Wnt蛋白为Wnt3a。
81.根据权利要求73所述的方法，其中，所述骨形成蛋白选自由BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7和它们的混合物所组成的组中。
82.根据权利要求73所述的方法，其中，所述分化培养基至少为添加有一种或多种任选成分的极限必需培养基，所述任选成分选自由生长因子、抗坏血酸、葡萄糖、非必需氨基酸、包括微量元素在内的盐、谷氨酰胺、胰岛素、活化素A、转铁蛋白以及β巯基乙醇所组成的组中。
83.根据权利要求73所述的方法，其中，所述细胞分化培养基选自由达尔伯克改良的伊格尔培养基（DMEM）、敲除的达尔伯克改良的伊格尔培养基（KO DMEM）、Ham′s F12/DMEM基本培养基（50:50）所组成的组中，所述Ham′s F12/DMEM基本培养基中还包括白蛋白、抗生素、微量矿物质、抗坏血酸、β-巯基乙醇、成纤维细胞生长因子（FGF）以及***类似物（LR-IGF）。
84.根据权利要求73所述的方法，其中，所述细胞分化培养基为含有有效量的前白蛋白、青霉素/链球菌抗生素、非必需氨基酸、微量矿物质、抗坏血酸、β-巯基乙醇、成纤维细胞生长因子（FGF）、***类似物（LR-IGF）、活化素A和Heregulin的DMEM/F12（50:50）。
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