PT828837E - Gene quimérico compreendendo uma sequência de adn de um gene de hidróxi-fenil piruvato diosigenase e obtenção de plantas contendo um gene de hidróxi-fenil piruvato dioxigenase tolerantes a determinados herbicidas - Google Patents

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Descrição "Gene quimérico compreendendo uma sequência de ADN de rim gene de hidróxi-fenil piruvato dioxigenase e obtenção de plantas contendo um gene de hidróxi-fenil-piruvato dioxigenase tolerantes a determinados herbicidas" A presente invenção diz respeito a um gene quimérico contendo um gene de hidróxi-fenil piruvato dioxigenase (HPPD), como sequência de codificação e sua utilização para a obtenção de plantas resistentes a determinados herbicidas.

Conhecem-se determinados herbicidas tais como os isoxazoles descritos em particular nas patentes de invenção francesas 95 06800 e 95 13570 e particularmente o isoxaflutole, herbicida selectivo do milho, os dicetonitrilos, tais como aqueles descritos nos pedidos de patente europeia de invenção 0 496 630, 0496 631, em particular a 2-ciano-3-ciclopropil-l-(2-SO2 CH3- 4-CF3 fenil) propano -1,3-diona e a 2-ciano -3-ciclopropil -1-(2-SO CH3 -2,3 CI2 fenil) propano- 1,3-diona, as tricetonas descritas nos pedidos de patente europeia de invenção 0 625 505 e 0 625 508, em particular a sulcotriona. No entanto, nenhum gene de tolerância a tais herbicidas foi descrito. A hidróxi-fenil piruvato dioxigenase é uma enzima que catalisa a reacção de transformação do para-hidróxi-fenil-piruvato em homogentisato.

Além disso a . sequência de aminoácidos da hidróxi-fenil-piruvato dioxigenase proveniente da Pseudomonas sp. P. J. 874 foi descrita sem que. exista uma descrição do seu papel na tolerância das plantas aos herbicidas (Ruetschi et col: Eur. J. Biochem. 205, 459-466, 1992). Este documento não dá a descrição do gene que codifica para esta proteína. 2

Foi agora descoberta sequência de um gene deste tipo e que uma tal sequência podia, uma vez incorporada nas células vegetais fornecer uma· sobre-expressão e uma activação da HPPD nas plantas conferindo a estas últimas uma tolerância interessante a determinados herbicidas recentes, tais como aos da família dos isoxazoles ou à das tricetonas.

Mais particularmente, esta sequência pode ser de origem bacteriana, tal como em particular do género Pseudomonas, ou ainda de origem vegetal, tal como em particular das plantas monocotiledóneas ou dicotiledóneas, em particular de Arabidopsis ou de umbelifera como por exemplo a cenoura (Daucus carotta). Ela pode ser nativa ou selvagem, ou eventualmente mutada mantendo fundamentalmente uma propriedade de tolerância herbicida contra os inibidores da HPPD, tais como os herbicidas da família dos isoxazoles ou das tricetonas.

Os genes que codificam para a HPPD podem ser isolados de acordo com o processo seguinte: -escolhe-se como iniciadores alguns oligonucleótidos originários da sequência de aminoácidos de uma HPPD,

-a partir destes iniciadores, sintetiza-se fragmentos de amplificação por PCR -isola-se o gene por criação e rastreio de um banco genómico - efectua-se a clonagem do gene.

De preferência utiliza-se os iniciadores provenientes da sequência de HPPD de uma bactéria do género Pseudomonas. De maneira particularmente preferida eles são provenientes da Pseudomonas fluorescens. A invenção tem ainda como objectivo a utilização de um gene que codifica para a HPPD num processo para a transformação das plantas, como gene marcador, ou como 3 sequência de codificação que permite conferir à planta uma tolerância a determinados herbicidas. Pode igualmente ser utilizado em associação com outros genes marcadores e/ ou sequência codificadora para uma propriedade agronómica. 0 gene codificador pode ser de qualquer origem, nativa, ou selvagem, ou eventualmente mutado mantendo fundamentalmente uma propriedade de tolerância herbicida contra os inibidores de HPPD, tais como os herbicidas da familia dos isoxazoles ou das tricetonas. Como sequência codificadora pode-se em particular utilizar aquela de acordo com a invenção, tal como descrito abaixo. A transformação das células vegetais pode ser efectuada através de qualquer meio conhecido adequado. Uma série de métodos consistem em bombardear as células, ou os protoplastos com partículas às quais estão ligadas as sequências de ADN.

Uma outra série de métodos consiste em utilizar como meio de transferência para a planta um gene quimérico inserido num plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens ou Ri de Agrobacterium rhizogenes. A presente invenção tem como objectivo um gene quimérico compreendendo no sentido da transcrição pelo menos uma sequência de regulação promotora, uma sequência' peptidica de trânsito de um gene vegetal que codifica para uma enzima de localização plastidial entre a sequência de regulação promotora e. a sequência codificadora, uma sequência heteróloga codificadora que exprime a de hidróxi-fenil-piruvato dioxigenase e pelo menos uma sequência reguladora de terminação, ou de poliadenilação.

Como sequência de regulação promotora pode-se utilizar qualquer sequência promotora de um gene que se exprime naturalmente nas plantas em particular um promotor de origem bacteríana, virai, ou vegetal, tal'como por exemplo, aquele de um gene de uma pequena sub-unidade de ribulose- 4 biscarboxilase (RuBisCO), ou de aquela de um gene de tubulina α (pedido de patente europeia EP n° 0 652 286), ou ainda de um gene de virus de planta, tal como por exemplo aquele do mosaico da couve flor (CAMV 19S ou 35S), mas pode ser utilizado qualquer promotor adequado conhecido. De preferência recorre-se a uma sequência de regulação promotora que favorece a sobre-expressão da sequência codificadora, tal como por exemplo aquela que compreende pelo menos um promotor de histona, tal como descrito no pedido de patente europeia de invenção EP 0507698.

De acordo com a invenção pode-se igualmente utilizar em associação com a sequência de regulação promotora outras sequências de regulação que se encontram situadas entre o promotor e a sequência de codificação, tais como os activadores de transcrição "enhancer", como por exemplo o activador de tradução do virus etch do tabaco (TEV) descrito no pedido de patente de invenção WO87/07644. Os péptidosde trânsito são ou simples, ou duplos e neste caso eventualmente separados por uma sequência intermediária, isto é compreendendo no sentido da transcrição, uma sequência que codifica para um péptido de trânsito de um gene vegetal que codifica para um enzima de localização plastidial, depois uma sequência que codifica para um segundo péptido de trânsito de um gene vegetal que codifica para uma enzima de localização plastidial constituída por uma parte de sequência da parte madura N terminal de um gene vegetal que codifica para uma enzima de localização plastidial, tais como a descrita no pedido de patente europeia de. invenção EP n° 0 508 909.

Como sequência de regulação de terminação, ou de poliadenilação pode-se utilizar toda a sequência correspondente de origem bacteriana, como por exemplo o terminador nos de Agrobacterium tumefaciens, ou ainda de 5 origem vegetal, como por exemplo um terminador de histona, tal como descrito no pedido de patente europeia de invenção EP n° 0 6333317. A presente invenção tem ainda como objectivo as células vegetais de plantas monocotiledóneas ou dicotiledóneas, em particular das culturas transformadas de acordo com um dos processos descritos acima e contendo no seu genoma uma quantidade eficaz de um gene que exprime a hidróxi-fenil piruvato dioxigenase (HPPD) . Observou-se que as plantas transformadas desta forma apresentam uma tolerância importante em relação a determinados herbicidas recentes, tais como os isoxazoles descritos em particular nos pedidos de patente francesas de invenção 9506800 e 9513570 e em particular de 4-[4-CF3-2-(metilsulfonil) benzoil] -5-ciclopropil isoxazole, e particularmente o isoxaflutole, herbicida selectivo do milho, os dicetonitrilos, tais como aqueles descritos nos pedidos de patente europeias de invenção 0 439 630, 0 496 631, em particular a 2-ciano-3-ciclopropil-l-(2-SO2 CH3-4-CF3 fenil) propano 1,3-diona e a 2-ciano-3-ciclopropil-l-(2-SO2 CH3-4-2,3 Cl2 fenil) propano 1,3-diona, as tricetonas descritas nos pedidos de patentes europeias de invenção 0 625 505 e 0 625 508, em particular a sulcotriona. A invenção tem finalmente como objectivo um processo de remoção de ervas, em particular de culturas com o auxilio de um herbicida deste tipo caracterizado por se aplicar este herbicida sobre plantas transformadas de acordo com a invenção tanto antes da sementeira como na pré-emergência, ou na pós-emergência da cultura. A invenção tem ainda como objectivo a utilização do gene de HPPD como gene marcador ao longo do ciclo "transformação-regeneração" de uma espécie, vegetal e selecção em relação ao herbicida acima. 6

Os diferentes aspectos da invenção serão melhor compreendidos com o auxílio dos exemplos experimentais abaixo.

Exemplo 1: Isolamento do gene de HPPD de P. fluorescens A32. A partir da sequência de aminoácidos de HPPD de Pseudomonas sp. P.J. 874 (publicado por Ruetschi U. et al. 1992. Eur. J. Biochem. 205: 459-466), deduz-se a diferença de diferentes oligonucleótidos para amplificar por PCR uma parte da sequência que codifica para a HPPD de P. fluorescens A32 (isolada por McKellar, R. C. 1982. J. Appl. Bacteriol. 53:305-316). Um fragmento de amplificação de gene desta HPPD foi utilizado para rastrear um banco genómico parcial de P. fluorescens A32 e deste modo isolar o gene que codifica para esta enzima. A) Preparação do ADN genómico de P. fluorescens A32. A bactéria foi cultivada em 40 ml de meio mínimo M63 (KH2PO4 -13,6 g/1, (NH4)2S04 2 g/1, MgS04 0,2 g/1, FeS04 0,005 g/1 de pH 7 mais L-tirosina 10 mM como única fonte de carbono) a 28°C durante 48 horas.

Após lavagem as células são novamente colocadas em 1 ml de tampão de lise (tris HC1 100 mM pH 8,3, NaCl 1,4 M e EDTA 10 mM) são incubadas durante 10 minutos a 65°C. Após um tratamento de fenol/ clorofórmio (24/1) e um tratamento com clorofórmio, os ácidos nucleicos são precipitados por adição de um volume de isopropanol depois novamente colocadas em 300 μΐ de água estéril e tratadas com RNAse 10 pg/ ml final. O ADN é de novo tratado com fenol/ clorofórmio, e clorofórmio e novamente precipitado por adição de 1/10 de volume de acetato de sódio 3 M pH 5 e 2 7 volumes de etanol. O ADN é de seguida colocado em água estéril e doseado. B} Escolha dos oligonucleótidos e sínteses. A partir dos aminoácidos de HPPD de Pseudomonas sp. P.J. 874 foram escolhidos cinco oligonucleótidos , dois dirigidos no sentido NH2 terminal da proteína em direcção ao COOH terminal da proteína e três dirigidos no sentido inverso (ver Figura 1) . A escolha foi ditada pelas duas regras seguintes: uma extremidade 3' do oligonucleótido estávelr isto é pelo menos duas bases sem ambiguidade, uma degenerescência o mais fraca possível.

Os oligonucleótidos escolhidos possuem as sequências seguintes: P1: 5TA(Cn)GA{G/A)AA{C7T)CC1ATGGG3’ P2: 5’ GA( G/A) AC] GGICCIAT G GA3' P3: 5' AA(C/TtTGCATI A{G/A) (G^A}AA{C/T} TC(G/T) TC 3’ P4: 5’AAÍGC1 AC(GM)TG(C/T)TG(T/G/A)ÁTICOS8 P5: 5'GC(G/T}TT(A/'G}AA(A/G) TTICC{C/T; TC1CC31

Foram sintetizados no sintetizador "Cyclone mais DNA Synthesizer" de marca MILLIPORE.

Com estes cinco oligonucleótidos por PCR os fragmentos de amplificação que se deverá obter teoricamente de acordo com a SEQ ID N° 1 possuem os tamanhos seguintes: com os iniciadores PI e P3 —> cerca de 690 pb com os iniciadores PI e P4 -> cerca de 720 pb com os iniciadores Pl e P5 —> cerca de 1000 pb com os iniciadores P2 e P3 —> cerca de 390 pb. com os iniciadores P2 e P4 —» cerca de 420 pb 8 com os iniciadores P2 e P4 -> cerca de 700 pb C) Amplificação de uma parte codificadora de HPPD de P. fluorescens A32.

As amplificações foram efectuadas num aparelho PCR PERKIN ELMER 9600 com a Taq polimerase PERKIN ELMER com o seu tampão nas condições padrão, isto é para 50 μΐ de reacção existem 200 μΐ de dNTP, 20 μΜ de iniciadores, 2,5 unidades de Taq polimerase e 2,5 μ9 de ADN de P. fluorescens A32. O programa de amplificação utilizado é de 5 min a 95°C depois 35 ciclos < 45 s a 95°C, 45 s a 49°C, 1 min a 72°C > seguidos de 5 min a 72 °C.

Nestas condições todos os fragmentos dè amplificação obtidos possuem um tamanho compatível com os tamanhos teóricos dados acima, o que é umã boa indicação da especificidade das amplificações.

Os fragmentos de amplificações obtidos com os grupos de iniciadores P1/P4, P1/P5 e P2/P4. são ligados no pBSIISK(-) ' após digestão deste plasmideo por Eco RV e tratamento na transferase terminal na presença de ddTTP como descrito em HOLTON T. A e GRAHM M. W. 1991. N. A. R VOL-19, N° 5 P1156.

Um clone de cada um dos três tipos é sequenciado parcialmente; isto permite confirmar que se amplificou bem nos três casos uma parte da região que codifica para HPPD de P. fluorescens A32. O fragmento P1/P4 é mantido como sonda para rastrear um banco genómico parcial de P. fluorescens A32 e isolar o gene completo de HPPD. C) Isolamento do gene 9

Por Southern mostra-se que um fragmento de 7 kb após digestão de ADN de P. fluorescens A32 pelo enzima de restrição BamHI hibridiza-se com a sonda HPPD P1/P4. Efectuou-se então uma digestão de 400 μg de ADN de P. fluorescen A32 com o enzima de. restrição BamHI e purificou-se em gel de agarose os fragmentos de ADN com cerca de 7 kpb.

Estes fragmentos são ligados no pBSII SK(-), este mesmo digerido pelo Bam Hl e desfosforilado pelo tratamento com fosfatase alcalina. Após transformação na E. coli DHIOb, o banco genómico parcial é rastreado com a sonda HPPD P1/P4.

Foi isolado um clone positivo e designado como pRP A. O seu mapa simplificado é dado na figura 2. Neste mapa indica-se a posição da parte, codificadora do gene de HPPD. Ela é composta por 1077 nucleótidos que codificam para 358 aminoácidos (ver SEQ ID n° 1). A HPPD de P. fluorescens A32 apresenta uma boa homologia em aminoácidos com aqueles da Pseudomonas sp. estirpe P. J. 874 existe de facto 92% de identidade entre estas duas proteínas (ver figura 3).

Exemplo 2: Construção de dois genes quiméricos

Para conferir a tolerância das plantas aos herbicidas que inibem a HPPD constroi-se dois genes· quiméricos: 0 primeiro consiste em colocar a parte que codifica para o gene de HPPD de P. fluorescens A32 sob o controlo do promotor de histona duplo (pedido de patente europeia de invenção N° 0 507 698) seguido do enhancer da tradução do vírus etch do tabaco (TEV) (pRTL-GUS (Carrington e Freed, 1990; J. Virol. 64: 1590-1597)) com o terminador do gene da nopalina sintase. A HPPD estará então localizada no citoplasma. 10 O segundo será idêntico ao primeiro neste, antes de entrar o activador de tradução TEV e a parte que codifica para a HPPD intercala-se o péptido de trânsito optimizado (OTP) (pedido de patente europeia de invenção EP n° 0 508 909). A HPPD estará então localizada no cloroplasto. A) Construção do vector pRPA-RD-153: pRPA-RD-11 Um derivado de pBS-II SK(-) (Stratagene catalog #212206) contendo o local de. poliadenilação da nopalina sintase (NOS poliA) (pedido de patente europeia de invenção EP n° 0 652 286) é clonado entre os locais Kpnl e Sall. O local Kpnl é transformado num local Notl por tratamento com a T4 ADN polimerase I na presença de 150 μιη de desoxinucleótidos trifosfatos e depois ligado com um linker Notl (Stratagene catalog # 1029). Deste modo obtém-se uma cassette de clonagem NOS poliA. -pRPA-RD-127: Um derivado de pRPA-BL-466 (pedido de patente europeia de invenção EP n° 0 337 899) clonado em pRPA-RD-11 criando uma cassette de expressão do gene oxi e contendo o promotor da pequena subunidade da ribulosebiscarboxilase: "promotor (SSU) - gene oxi - NOS poliA".

Para criar este plasmideo, pRPA-BL-488 foi digerido com Xbal e HindIII para isolar um fragmento de 1,9 kpb contendo o promotor SSU e o gene oxi que foi ligado no plasmideo pRPA-RD-11 digeridos com as enzimas compatíveis. -pRPA-RD-132: é um derivado de pRPA-BL-488 (pedido de patente europeia de invenção EP n° 0 507 698) clonado em pRPA-RD-127 com a criação de uma cassette de expressão do gene oxi com o promotor histona dupla: 11 "promotor histona dupla - gene oxi - NOS poliA"

Para fabricar este plásmídeo, pRPA-BL-466 foi digerido por HindIII, tratado pelo Klenow e depois novamente digerido com Ncol. 0 fragmento de 1,35 kpb purificado contendo o promotor de histona dupla H3A74 8. é ligado com o plásmídeo pRPA-RD-127 que foi digerido por Xbal, tratado pelo Klenow e novamente digerido por Ncol. - pRPA-RD-153: é um derivado de pRPA-RD-132 contendo o activador de tradução do vírus etch do tabaco (TEV). PRTL-GUS (Carrington e Freed, 1990; J. Virol. 64: 1590-1597) é digerido com Ncol e ECORI e o fragmento de 150 pb é ligado no pRPA-RD-132 digerido com as mesmas enzimas. Assim, criou-se uma cassette de expressão contendo o promotor: "promotor de histona dupla - TEV- gene oxi -NOS poliA" B) Construção do vector pRPA-RD-185: pUCl9/GECA: Um derivado de pUC-19· (Gibco catalog # 15364-011) contendo numerosos locais de clonagem. pUC-19 é digerido com EcoRI e ligado com o linker oligonucleótido 1:

Linker t: AATTGGGCCA GTCAGGCCGT TTAAÀCCCTA GGGGGCCOG

CCCGGT CAGTCCGGCA AATTTGGGAT CCCCCGGGC TTAA 0 clone seleccionado contém um local EcoRI seguido de um polilinker que contém os locais seguintes: EcoRI, Apalr Avrll, Pmel, Sfil, Saci, Kpnl, Smal, BamHI, Xbal, Sall, PstI, Sphl e HindIII. pRPA-RD-185: é um derivado de pUC19/GECA contendo um polilinker modificado. pUC19/GECA é digerido por HindIII e ligado com o linker 2 oligonucleótido: 12

Linker2: AGCTTTrAAT TAAGGCGCGC CCTCGAGCCT GGTTCAGGG

AAATTA ATTCCGCGCG GGAGCTCGGA CCAAGTCCC TCGA 0 clone seleccionado contém um local HindiII no meio do polilinker que contém agora os locais seguintes:

EcoRI, Apal, Avrll, Pmel, Sfil, Saci, Kpnl, Smal, BamHI, Xbal, Sall, Pstl, Sphl, HindIIIj· Paclf Asei Xhol e EcoNI. C) Construção do vector pRP T: -pRP 0: um derivado de pRPA-RD-153 contendo uma cassette de expressão de HPPD, promotor de histona dupla -TEV - gene HPPD- terminador Nos. Para fabricar pRP 0, pRPA-RD153 é dirigido por Hind III, tratado pelo Klenow, depois novamente digerida por Ncol para retirar o gene oxi e o substituir pelo gene HPPD saldo do plasmídeo pRP A por digestão BstEII, tratamento pelo Klenow e novamente digestão por Ncol. -pRP R: para obter o plasmídeo pRPO foi dirigido por Pvull e Saci, o gene quimera foi purificado e depois ligado no próprio pRPA-RD-185 digerido por Pvull e Saci. -pRP T: foi obtido por ligação do gene quimérico saído de pRP R após digestão por Saci e HindIII no plasmídeo pRPA-BL 150 alfa 2 digerido pelas mesmas enzimas (pedido de patente europeia, de invenção EP n° 0 508 909). 0 gene quimérico do vector pRP T tem então a estrutura seguinte:

Promotor de TEV Região que Terminador histona dupla codifica para nos a HPDD

D) Construção do vector pRP V 13 -pRP P: é um derivado de pRPA-RD-7 (pedido de patente europeia de invenção EP n° 0 652 286) contendo o péptido de trânsito optimizado seguido do gene de HPPD. Foi obtido por ligação da parte que codifica para a HPPD saída de pRP A por digestão de BstEII e Ncol, tratamento pelo Klenow e do próprio plasmídeo pRPA-RD-7 digerido por Sphl e Accl e tratado pela ADN polimerase T4. -pRP Q: um derivado de pRPA-RD-153 contendo uma cassette de expressão de HPPD, promotor de histona dupla- TEV- OTP-gene de HPPD- terminador Nos. Para o construir o plasmídeo pRPA-RD-153 é digerido por Sal I, tratado pelo Klenow e depois novamente digerido por Ncol para retirar o gene oxi e o substituir pelo gene HPPD saído do plasma pRP P por digestão de BstEII, tratamento pelo Klenow e nova digestão por Ncol. -pRP Ξ: para o obter, o plasmídeo pRP Q. foi digerido por Pvull e Saci para sair o gene quimérico que foi ligado no próprio pRPA-RD-185 digerido por Pvull e Saci. -pRP V: foi obtido por ligação do gene quimérico saído de pRP S após digestão por Saci e Hind III no plasmídeo pRPA-BL 150 alfa2 (pedido de patente europeia de invenção EP n° 0 508 909). O gene quimérico do vector pRP Q possui então a· estrutura seguinte:

Promotor de TEV OTP Região que Terminador histona codifica para a nos dupla HPDD

Exemplo 3: Transformação do tabaco industrial PBD6 14

Para determinar a eficácia destes dois genes quiméricos, estes foram transferidos para o tabaco industrial PBD6 de acordo com os processos de transformação e de regeneração já descritos no pedido de patente europeia de invenção EP n° 0 508 909. 1) ' Transformação: 0 vector é introduzido na estirpe não oncogénica de Agrobacterium EHA 101 , (Hood et al, 198 7) portadora do cosmídeo pTVK291 (Komari et al. 1986). A técnica de transformação encontra-se baseada no procedimento de Horsh R. Et al. (1985) Science, 227, 1229-1231. 2) Regeneração A regeneração do tabaco. PBD6 (proveniente de SETTA França) a partir de explantes foliares é realizada num meio de base Murashige e Skoog (MS) compreendendo 30 g/1 de sacarose, assim como 200 pg/ml de canamicina. Os explantes foliares são retirados de plantas em estufa ou in vitro e transformados de acordo com a técnica dos discos foliares (Science 1985, vol. 227, p. 1229-1231) em três etapas sucessivas: a primeira compreende a indução de rebentos num meio MS aditivado com 30 g/1 de sacarose contendo 0,05 mg/1 de ácido naftilacético (ANA) e 2 mg/ml de benzilaminopurina (BAP) durante 15 dias. Os rebentos formados ao longo desta etapa são de seguida desenvolvidos por cultura ém meio MS aditivado com 30 g/1 de sacarose, mas não contendo hormona, durante 10 dias. Depois retira-se os rebentos desenvolvidos e .efectua-se o seu cultivo em meio de enraizamento MS com metade do teor em sais, vitaminas e açúcares e não contendo hormona. No final de cerca de 15 dias os rebentos enraizados são transferidos para a terra. 15

Exemplo 4: Medida da tolerância do tabaco ao 4-F4-CF3-2- (metilsulf oni-l)_benzoil]_-5-ciclopropil] isoxazol: tratamento de pós-emergência

Ao sair do in vitzo, as plântulas de tabaco transformadas foram climatizadas em estufa (60% de humidade relativa; temperatura 20°C durante a noite e 23°C durante o dia) durante cinco semanas e depois tratadas com 4-[4-CF3-2-(metilsulfonil) benzoil] -5-ciclopropil] isoxazol. O tabaco de controlo não transformado e tratado com 4-[4-CF3-2-(metilsulfonil) benzoil] -5-ciclopropil] isoxazol com doses que vão desde 50 a 400 g/ha desenvolve em cerca de 72 horas cloroses que se intensificam para evoluir no sentido de necroses muito pronunciadas numa semana (cobrindo cerca de 80% de folhas terminais).

Após transformação este mesmo tabaco que expressa em excesso a HPPD de P. fluorescens está muito bem protegido contra um tratamento com 4-[4-CF3-2-(metilsulfonil) benzoil] -5-ciclopropil] isoxazol na dose de 400 g/ha.

Se a enzima é expressa em excesso no citoplasma, isto é se a transformação foi feita com o gene transportado pelo vector pRP T, então a planta apresenta cloroses muito ligeiras todas localizadas nas folhas intermédias.

Se a . enzima expressa em excesso estiver no cloroplasto, isto é se a transformação for feita com o gene transportado pelo vector pRP V, então a planta encontra-se perfeitamente protegida e não apresenta nenhuns sintomas.

Exemplo 5: Medida da tolerância do tabaco ao 4~r4-CF3-2- (metilsulfoil)_benzoil]_-5-ciclopropil]_isoxazol: tratamento na pré-emergência a) teste in vitro: 16

Utiliza-se sementes de tabaco colhidas a partir de plantas resultantes do ciclo "transformação -regeneração" resistentes a um tratamento foliar de isoxaflutole com uma dose de 40Q g/h descritas nos exemplos 1 a 3.

Estas sementes foram semeadas em caixas contendo fitagar a 10 g/1 e.isoxaflutole em diferentes concentrações que vão de 0 a 1 mg/1. A geminação foi então realizada a seguir a 25°C com um fotoperiodo de 12 horas de luz/ 12 horas de obscuridade.

De acordo com· este protocolo as sementes de tabaco selvagens foram postas a germinar, assim como as sementes dos dois tipos de tabaco transgénicos, isto e tabacos CY, com a localização de HP.PD no citoplasma e os tabacos CO com a localização da HPPD no cloroplasto.

As medidas de resistência são efectuadas visualmente entre 2 a 3 semanas após a sementeira.

Os resultados encontram-se resumidos no quadro abaixo.

Concentração em isoxaflutole Tabaco selvagem Tabaco CY Tabaco CO 0 mg/1 100% das sementes . germinam sem sintomas 100% das sementes germinam. sem sintomas' 100% das sementes germinam sem sintomas 0,05 mg/1 20% das sementes germinam e apresentam sintomas 75% das sementes germinam sem sintomas0 75% das sementes germinam* sem sintomas0 (continuação)

Concentração em isoxaflutole Tabaco selvagem Tabaco CY Tabaco CO 0,1 mg/1 Não há germinação 75% das sementes germinam* sem sintomas0 75% das sementes* germinam* sem sintomas0 0,5 mg/1 Não há 75% das 75% das 17 germinação sementes sementes germinam sem germinam sem sintomas Ό sintomas0 1 mg/1 Não há 75% das 75% das germinação sementes sementes germinam sem germinam sem sintomas O sintomas0 ° Os sintomas que apresentam as plântulas ao longo da germinação são deformações dós cotilédones mais ou menos importantes e sobretudo um branqueamento dos tecidos normalmente fotosintéticos e por isso verdes. *75% das sementes germinam, uma vez que foram semeados grãos gerados pela autofecundação das plantas mono-loccus que saem do ciclo "transformação-regeneração" que não transportam por isso o gene da tolerância em mais do que um cromossoma.

Operando da mesma maneira que no produto n° 51 da patente de invenção americana 4 780 127 com os produtos seguintes obtém-se os mesmos resultados a uma concentração de 0 mg/ml e 0,1 mg/ml no tabaco selvagem e no tabaco CO. b) Teste em estufa

Opera-se como no exemplo 4 com excepção de que o tratamento é efectuado na pré-emergência, 24 horas antes da sementeira. A sementeira selvagem é efectuada normalmente. Nestas.condições observa-se que nas sementeiras de controlo não tratadas não há germinação para qualquer dose de herbicida pelo menos igual a 10 g/ha. Pelo contrário, os tabacos CY não apresentam nenhum sintoma, tal como definido no parágrafo a) até 100 g/ha inclusive. Do. mesmo modo os tabacos CO não apresentam nenhum sintoma, tal como definido no parágrafo a) até 200 g/ha inclusive.

Estes resultados mostram claramente que o gene da HPPD de P.fluorescens confere uma tolerância ao tabaco contra os 18 tratamentos em pré-emergência com o isoxaflutole. Esta tolerância é melhor se a proteína se encontrar localizada no cloroplasto em vez de no citoplasma.

Exemplo 6:

Com o objectivo de estudar se o gene de HPDD da Pseudoinonas fluorescens pode ser utilizado como gene marcador ao longo do ciclo "transformação -regeneração" de uma espécie vegetal, o tabaco foi transformado com o gene de HPPD e as plantas transformadas foram obtidas após a selecção com isoxaflutole.

Material e métodos e resultados O gene quimérico pRP V descrito abaixo é transferido para o tabaco industrial PBD6 de acordo com os procedimentos de transformação e de regeneração já descritos no pedido de patente europeia de invenção EP n° 0 508 909. O gene quimérico do vector pRP V possui a estrutura seguinte:

Promotor de TEV OTP Região que Terminador histona codifica para a nos dupla HPDD 1) Transformação : 0 vector é introduzido na estirpe não oncogénica de Agrobacterium EHA 101 (Hood et al., 1987) portadora do cosmídeo pTVK 291 (Komari et al., 1986) . A técnica de transformação encontra-se baseada no procedimento de Horsh et al. (1985) . 19 2) Regeneração: A regeneração do tabaco PBD6 (proveniência SEITA França) a partir de explantes foliares é realizada num meio de base Murashige e Skoog (MS) compreendendo 30g/l de sacarose, tal como 350 mg/1 de cefotaxime e 1 mg/1 de isoxaflutole. Os explantes foliares são retirados das plantas em estufa, ou in vitro e transformados de acordo com a técnica dos discos foliares (Science 1985, vol. ' 227, p. 1229-1231) em três etapas sucessivas: compreendendo a primeira a indução de rebentos num meio MS aditivado com 30 g/1 de sacarose contendo 0,05 mg/1 de ácido naftilacético (ANA) e 2 mg/1 de benzilaminopurina (BAP) durante 15 dias e lmg/1 de isoxaflutole. Os rebentos verdes formados ao longo desta etapa são a seguir desenvolvidos por. cultura num meio MS aditivado de 30 g/1 de sacarose e de 1 mg/1 de isoxaflutole, mas não contendo a hormona durante 10 dias. Depois os rebentos desenvolvidos são retirados e cultivam-se num meio de enraizamento MS com metade, do teor em sais, vitaminas e açúcares e 1 mg/1 de isoxaflutole e não contendo hormona. No final de cerca de 15 dias os rebentos enraizados são transferidos para a terra.

Todas as plantas obtidas de acordo com este protocolo são analisadas por PCR com os iniciadores específicos de HPPD de P. fluorescens. Esta análise PCR permitiu confirmar que todas as plântulas obtidas deste modo integraram bem o gene de HPPD:

Concluindo, este ensaio confirma que o gene de HPPD pode ser utilizado como gene marcador e que associado a este gene o isoxaflutole pode ser um bom agente de selecção.

Exemplos 7 e 8: Isolamento do gene de HPPD de Arabidopsis e do gene de HPPD de cenoura (Daucus carotta) 20 a) Construção de bancos de cADN,

Os mARNs extraídos de plantas novas de Arabidopsis thaliana, e de mARNs extraídos de células de cenouras em cultura serviram para construir dois bancos de cADN no vector Uni Zap™ XR comercializado pela empresa Stratagen seguindo o protocolo preconizado por esta sociedade.

b) Rastreio dos bancos de cADN

Estes dois bancos foram rastreados com o auxílio de uma sonda correspondente a um cADN de Arabidopsis thaliana de largura parcial, obtida através do Arabidopsis Biological Resource Center (Ohio, EUA) e inventariado: EST clone N° 91B13T7. Este clone é constituído por cerca de 500 pares de bases em que apenas 228 tinham sido sequenciadas pelo MSU-DOE .Plant Research Laboratory no âmbito da sequenciaçao aleatória dos cADN de Arabidopsis thaliana. Nós. sequenciámos completamente os 500 pares de bases antes.de utilizar este clone para pesquisar nos bancos de cADN de Arabidopsis thaliana e de cenoura com o auxílio da técnica clássica de hibridação de placas (referência ?). c) Foi obtido um cADN de Arabidopsis thaliana (SEQ ID N° 2) correspondente a 1338 pares de bases. Este cADN possui um codão de iniciação da tradução na posição 25 e um codão de terminação da tradução na posição 1336. Este cADN está então completo e codifica para uma proteína de 445 aminoácidos. c) Foi obtido um cADN de cenoura (Daucus carotta) (SEQ ID N° 3) correspondente a 1329 pares de bases. Este cADN possui um codão de começo da iniciação da tradução na posição 1 e um codão de terminação da tradução na 21 posição 1329. Este cADN encontra-se então completo e codifica para uma proteína de 442 aminoácidos.

As sequências ilustradas são as seguintes: SEQ ID N° 1 Sequência do gene da HPPD da Pseudomonas fluorescens A32. SEQ ID N° 2

Sequência de cADN de HPPD de Arabidopsis thaliana SEQ ID N° 3

Sequência de cADN de HPPD de Daucus carotta

As figuras seguintes são fornecidas a titulo indicativo para ilustrar a invenção. A Figura 1 representa a sequência proteica de HPPD da estirpe de Pseudomonas sp. P. J. 874 e a sequência nucleótidica teórica da parte codificadora correspondente; os cinco oligonucleótidos escolhidos' para efectuar a amplificação de uma parte desta região codificadora encontram-se simbolizadas pelas cinco setas. A Figura 2 representa a cartografia do plasmídeo com o fragmento de ADN genómico de 7 kb contendo o gene de - HPPD de P. fluorescens A32. A Figura 3 compara as sequências de aminoácidos da HPPD da P. fluorescens A32 e da HPPD da estirpe de Pseudomonas sp. P.J. 874 (apenas são indicados os aminoácidos divergentes entre as duas sequências), assim como a sequência consensual.

Listagem das Sequências (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Sailland, Alain 22

Rolland, Anne Matringe, Michel Pallett, Kenneth E

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: SEQUÊNCIA DE ADN DE UM GENE DA HIDRÓXI-FENIL-PIRUVATO DIOXIGENASE E OBTENÇÃO DE PLANTAS CONTENDO ESTE GENE DA HIDRÓXI-FENIL PIRUVATO DIOXIGENASE, RESISTENTES A DETERMINADOS HERBICIDAS (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 3 (iv) MORADA PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: François Chretien (B) RUA: 14-20 rue Pierre BAIZET (C }CIDADE: Lyon Cedex 09 (E) PAÍS: França (F) ZIP: 69263

(v) FORMA A SER LIDA PELO COMPUTADOR (A) ' TIPO DE MEIO: Floppy disk

(B) COMPUTADOR: IBM PC COMPATÍVEL

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Release # 1.0, Versão #125 (vi) . DADOS DO PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: FR PH95033 (B) DATA DO REGISTO: 02-Jun-1995 (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO SOBRE O AGENTE DE PROPRIEDADE INDUSTRIAL (A) NOME: Chrétien, François (ÍX) INFORMAÇÃO SOBRE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 72-29-26-42 23 (B) TELEFAX: 72-29-28-43 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1077 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C }TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: Não (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Pseudomonas fluorescens (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:l:

ArGOCMATt TATACGAAAA CCCAATGCOC CTGATCGGCT TTGAATTCAT CGAATTACCG 60

"“T2AC" GGAGC23ATC TTCGAGATCA TGGGCTTCAC CAAAOTCGCC ICO

ACC=AC£GT7 CCAAGAACGT GCACCTGTAC CGCCAGdvCG AGATCAACCT GftTCCTCAAC ISO AAC3A5CCCA ACAGCA-CC-C CTCCTACITT GCGGCCGAAC ACGGCCCGtC SGTCTGCGGC 240 ATGGCOTTCC ccctgaagca. ctcocaaaao gcctacaacc gcgccctsga actcggcgcc 300 CAGCCGArCC ATATTGACAC CGGGCCGATG GAATTGAACC TGCC&ÕCGAI CAAGGGCATC 360

GGCSGCOCGC CGTTCTACCT GATCGACCGT TTCGGCGAM GCAaO“COAX CTACaACAIC 42Q GACITCGTGT ACCTCGftftGG tGTGGMCOC AATCCGGXC5 GTGCASGÍCT CAAfcSTCATC 480 GACCACCTGA CCCACAACGT CTATCCCGGC CGCATGGTCT ACTSGGCCAA CTTCTACGAG 640 AAftTTOTTCA ACTTCCCTTGA ASCGCGTXAC TTCSATÍlTCA AGGGCGAGTA CACCGGCCTG 600 ACTTCCAAGG CCAIGASTGC GCCGGACGGC ATCAlCCGCA TCCCGCTOAA CGAAGAGTCG £60 TCCAAGGGCG CGGGGCAGAT CGAAGAGTTC CTGftTCCAGT TCAACSGCSA AGGCATCCAG 720 CACGTGGCGT TCCTCACCGA CGACCISGTC AAGACCTGGG ACGCGTTGAA CAAAATCGGC 780 ATGCGCTTCA TGACCGCGCC GCCAGACACT TATTACGAAA TGCTCGAA55 CCGCCTGCCT 840 GACCACGGCS AGCCGGIGGA TCAACTGCAG GCACGCGGIA TCCÍGCTGGA CGGAICTTCC 800 GTGSlASCCG ACAAACGCCT GCTSCTGCAfi ATCTTCICGG AAACCCTGAT GGGCCCGGTG 960 TTCTTCGAAX TCATCCAGCG CAAGGGCGAC GAXGGSTTTS GCGAGGGCM. CTTCWlGGCG 1020 CTCTTCGAGT CCATCGAACC TGACCAGCTG CGTCGTGGTG TATTGACCGC CSITTAA 1077 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 2: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1338 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C )TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear

<ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: Não (v) FONTE ORIGINAL: (2) ORGANISMO: Ãrabidopsis thaliana (B) ESTIRPE: Columbia (2) FASE DE DESENVOLVIMENTO: jovem planta verde '(vi) ORIGEM IMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: Uni zap XR STRATAGENE (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:2: 25 ATGGGCCACC AAAACGCCGC CGTTTCAGAG AAXCAAAACC ATGATGACGG CGCTGCGTCG 60 TCGCCGGGAX TCAAGCTCGT CGGATTTTCC AAGTTCGTAA GAAAGAAICC AAAGTCTGAT 120

GAGTTCTGGT GCGGCGACGC AACCAACGTC AGATTCICCG CCAAATCCGA TCTTTCCACC ACCTCCGGTG ACCTCCSATT CCTTTTCACT GAGATTAAAC CGACAACCAC AGCTTCTATC TTCTTCICIT CACATGGTCT CGGTGTTAGA TCAGCTTTCT CCRTCAGTGT AGCTAATGGC AAIGAAGCAG TTACGATCGC TGAGGTTAAA AGTTACAAAG CAGAAGAIAC CGAAAAATCC GAXGCGTCGT CGTTCCCATT GGATTATGGT GTTCCTGAGC TXGGTCCGGC TTTAACTTAT GCAGAGtTCA CAGCAGACGA CGtTGGAACC GCTAGCAAXG ATGAAATGGT TCTTCTACCG AAGAGTCAGA TTCAGACGTA TTTGGAACAT CTGATGAGTG AAGACATATT CAGGACCCTG GGATTCGACT TCATGCCTTC TCCTCCGCCT GGCGACGTGC TCAGCGAIGA TCAGATCAAS AGAGAXSATC AAGGGACGTT GCTTCAAAXC ATATTTATAG AGAIAATCCA GAGAGTAGGA TACCAKAGXG GAGGAIGTGG TGGTTTTGGC ATTGAAGAAT ACGAAAAGAC TCTT5AAGGC 180 240 300 360 420 460 540 600 660 720 780 840 800 360 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1338 aaattcaagg ttaagcgçtt ccatcacatc

GCTCGtCGCT TCtCCTGGGG TCTGGGGATG 33AAACAT5G TTCACCCCTC TTACCTACTC ."tc-ttact cTcarrcTCT ccccgccgga

-CAAGTTTCG ATCACCGCTC TTGTCGTTCC GCCSTTGCGA TTGAAGTAGA AGACGCAGAG GCTATTCCTT CGSCGOCTCC TATCGTCCTC CÍA7ACGGCG ATGTTGTTCT CCGATATGTT GAATTCTTGC CAGGGTTCGA. GCGtGTAGAG ATCCGGCGGC TTGACCACGC CGTGGGAAAC GTAGCGGGGT TCACTGGTTT TCACCftATTC GCCGAGAGCG GTTTAAATTC AGCGGTCCTG AITAACGAGC CAGTGCACGG AACAAAGAGG AACGAAGGCG CAGGCCTAGA ACAICTGGCT AGAGAGATGA GGAAGAGGAG CAGTA3TGSA. ACTTACTACC AGAATCTCAA GAAACGGGTC GAGTGTGAGG AAITAGGGAT TCTTGTAGftC TTCACAAAAC GACEAGGTGA CAGGCCGACS TGCATGATGA AAE&2G3U3GA AGGGAAGGCT AAAGGCAATT TCTCTGAGCT CITCAAGTCC AAACAGTTAG TGGGATGA (2} INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 3: {i} CARACTERÍSTI.CAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1329 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C )TIP0 DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: Não (vi) FONTE ORIGINAL: 26 (A) ORGANISMO: Daucus carota {D} FASE DE DESENVOLVIMENTO: células em suspensão (vi) ORIGEM IMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: Uni zap XR STRATAGENE (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA ID N°:3:

KrSGGGAAAA AACAA.TC5CA AGCIGÍAATT CTCTUAAGCA. ATTCRXCAAA CRCCTCTCCT 60

GCAACATTCA AGCTGGTCGG TTTCAACAAC TTCGTCCGCS CCAACSCCAA GTCCSA7CAC 12 C TTC3CCGTGA. ftGCGGTKCA CCACATXSftC· TXCTGGTGCG GCGACSCCftC CAACACGTCG 130 CGGCGGTTCT CGTCUGGCCT CGGCATGCCT- TTGGTGGCGA AATCSGAICT CTCTAClGttA 240 AACTCTSTTC AÇGCTTCTTA TCTTGTTCGC TCGGCGAATC TCACTTTCGT CTTCACCGCT 300 CCTTACTCTC CGTCCACGAC CftCTTCCTCT GGTTCAGCTG CCATCCCGTC TTTttCGeCA 360 ' TCMGTÍXTC ACTCTrrtGC GGCCftAACAC GGCCTTGCTG TTCGGGCTAT TGCTCTTGAA 420 GTTGCTGACG TGGCTGCTGC GTTTGAGGCC AGTGTTGCGC GXGGGGCCAG GCCGGCTTCG 400 SCTCCTGTTG AAXTGGACGA CCAGGCGTGG TXÇGÇJGAGG TGGACTTSTA CGGASATGTG 540 GTCTTGAGGT ΤΤσΤΤΛ5ΓΤΤ TGGGAGGGAG· GACGGTTTGX TXTXGCCTGG ATTCGAGGCG 600 GTGGAGGGGA CGGCGTCGTT TCCGGATTXG GAITATGGAA. TTAEAAGACT TGATCAXGCG 6S0 GTUGGGAATG TXACCGAGXT CGOCCCriTG GTGGAGTATA TTAÍAGGGTT IACQGGSTTT 720 CATGAÃTITG CGGAGTTTAC ASCGGASGM GTGGGGACTT TGGAGAGTGG GTTGAATTCG 700 GTQJfGTTGG CGftATARTGA. 53AGATGGTT CTGTTGCCXT TGAATGAGCC TGTGTATGGG 840 ACCAAGAGGA AGASICAGAT ACAGACTTAC TTGGAGCACA ATGSAGCGGC TGGAGTGCAG 900 CATXTGGCTT 7AGTGAGTSA SGftTATTCTÍ AGGACnTTAA GGGAGATSAG GAAGAGGftGT 960 TGCCTIGGTG CTTTTGAGrr TATGCCTTCG CCftCCSCCTA. CGXATTACAA GAR.TTTGAAG 1020 AATAGGGTCG GGGATGTGTT GAGlSAlGAP. CAUAICAAGG AGTGTGAASA TTTGGGGATT 1090 TTGGTGGA.TA GGGftIGKTCA G©STACAIT& CnCAAAJCT TTACCAAGCC TGTAC5GTGAC 1140 AGGCCTACCT TATTCATAGA GATCATTCAG ACGGTAGGOT' GCATÕCTCAA &SAUCAXGCA 1200 GGGCAGMGT ACCAGAAGGG CGGGTGCGGA GGACTTGGGA AGGGGAACTX CTCAGASOG 1280 TICAAGTCCA TCGAAGAATA TGAAAAAACA CTTGAASCTA AACRAATCAC T5GATCTGC7 132 D GCTGCATGA 1329

Lisboa, 3 de Abril de 2008

Claims (30)

1 Reivindicações 1. Gene quimérico compreendendo no sentido da transcrição.: -pelo menos uma sequência de regulação promotora originária de um gene que se exprime naturalmente nas plantas, -uma sequência de péptido de.trânsito de um gene vegetal que codifica para uma enzima de localização plastidial entre a sequência de regulação promotora e a sequência codificadora, -uma sequência codificadora heteróloga, -pelo menos uma sequência de regulação terminai ou de poliadenilação, caracterizado por a sequência codificadora heteróloga ser a sequência codificadora de um gene que exprime uma-hidróxi-fenil piruvato dioxigenase (HPPD).

2. Gene quimérico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequência codificadora ser de origem bacteriana ou vegetal.

.3. Gene quimérico de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a sequência codificadora ter origem na Pseudomonas sp.

4. Gene quimérico de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a sequência codificadora ter origem na Pseudomonas fluorescens. 2

5. Gene quimérico de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a sequência codificadora estar representada pela SEQ ID N° 1,

6. Gene quimérico de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a sequência codificadora ser de origem vegetal.

7. Gene quimérico de acordo com· a reivindicação 6, caracterizado por a sequência codificadora, ter origem na Ãrãbidopsis.

8. Gene quimérico de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a sequência codificadora estar representada pela SEQ ID N° 2;.

9. Gene quimérico de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a sequência de codificação ter origem numa umbelifera..

- 10. Gene quimérico de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a sequência codificadora ter origem na cenoura {Daucus carotta)

• 11. Gene quimérico. de acordo com < a reivindicação 10, caracterizado por a sequência codificadora estar representada pela SEQ ID N° 3.

12. Gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por a sequência da regulação promotora favorecer a sobre-expressão da sequência codificadora. 3

13. Gene quimérico de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a sequência de regulação promotora compreender pelo menos um promotor de histona.

14. Gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado por compreender entre a sequência de regulação promotora, e a sequência codificadora um péptido de trânsito optimizado compreendendo no sentido da transcrição uma sequência codificadora para um péptido de trânsito de um gene vegetal que codifica para uma enzima de localização plastidial, uma parte da sequência da parte madura N terminal de um gene vegetal que codifica para uma enzima de localização plastidial, depois uma sequência codificadora., para um segundo péptido de .-trânsito de um gene vegetal que codifica para um enzima de localização plastidial.

15. Gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por compreender uma sequência de um actívador de transcrição (enhancer) entre a sequência de regulação . promotora e a sequência codificadora.

16. Vector utilizável para' a transformação genética das plantas, caracterizado por compreender um gene quimérico de acordo com qualquer, uma das reivindicações 1 a 15.

17. Célula vegetal, caracterizada por compreender um gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15,

18. Planta, caracterizada por ser regenerada a partir de células de acordo com a reivindicação 17. 4

19. Planta, caracterizada por compreender no seu genoma uma quantidade eficaz de um gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15.

20. Planta de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 ou 19, caracterizada por pertencer à família das dicotiledóneas.

21. Planta de acordo com qualquer uma das reivindicações 18, ou 19, caracterizada por pertencer à família das monocotiledóneas.

22. Processo de transformação de plantas para as tornar tolerantes aos inibidores de HPPD, caracterizado por se introduzir numa célula vegetal um gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15.

23. Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por a transferência ser efectuada com Agrobacterium tumefaciens, ou Agrobacterium rhizogenes.

24. Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por a transferência ser efectuada por adição por bombardeamento com. o auxilio de partículas carregadas de ADN.

25. Processo de transformação de plantas, caracterizado por se introduzir na célula vegetal um gene de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 como marcador de selecção.

26. Processo de tratamento herbicida selectivo de plantas, caracterizado por se aplicar um inibidor de HPPD 5 a uma planta transformada compreendendo as células de acordo com a reivindicação 17.

27. Processo de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por as plantas serem plantas de acordo com as reivindicações 18 a 21.

28. Processo de acordo com qualquer . uma das reivindicações 26 ou 27, caracterizado por as plantas serem, obtidas através do processo de acordo com as reivindicações- 22 a 24.

29. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 28, caracterizado por o inibidor de HPPD ser um isoxazole, um dicetonitrilo, uma tricetona, ou a sulcotriona.

30. Processo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por o isoxazole ser. o 4-[4-CF3-2-(metilsulfoil)benzoil]-5-ciclopropil isoxazole. Lisboa, 3 de Abril de 2008