JP4365025B2 - コメアクチンの第1のイントロンに結合したトウモロコシh3c4プロモーター、前記プロモーターを含むキメラ遺伝子及び形質転換植物 - Google Patents
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Description
本発明は着目タンパク質をコードする調節配列に異種の配列を単子葉植物細胞で発現させる新規5’調節配列に関する。本発明は更に前記調節配列と、着目タンパク質をコードする異種配列と、単子葉植物細胞で着目タンパク質を発現させる3’調節配列を含むキメラ遺伝子にも関し、更に前記キメラ遺伝子と、植物細胞及び植物の形質転換に必要な手段を含む形質転換単子葉植物にも関する。
【0002】
植物で着目タンパク質をコードする配列を発現させる種々のプロモーターが公知であり、文献に記載されており、遺伝子工学により改変した植物の商業規模の開発が既に可能になっている。このようなプロモーターとしては植物で天然に発現される遺伝子のプロモーター配列、特に細菌、ウイルス又は植物起源のプロモーターが挙げられ、例えばリブロースビスリン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼの小サブユニットの遺伝子(US4,962,028)や、例えばカリフラワーモザイクの遺伝子(US5,352,605)等の植物ウイルス遺伝子のプロモーターが挙げられる。植物で異種遺伝子を発現させるプロモーターは特に以下の特許及び特許出願に記載されている。US5,086,169、EP0353908、US5,139,954、US5,378,619、US5,563,328、US5,589,583、US5,633,363、US5,633,439、US5,633,440、US5,633,447、US5,633,618、US5,639,948及びUS5,639,952。
【0003】
しかし、これらのプロモーターの所定のもの、より特定的には植物起源のプロモーターは単子葉植物で非機能的である。
【0004】
トウモロコシ等の単子葉植物では非機能的であるが、タバコ、セイヨウアブラナ又はダイズ等の双子葉植物で異種遺伝子を発現させるために特に有効なプロモーターとしては、例えば特許出願EP0507698に記載されているArabidopsis種のヒストンプロモーターが公知である。
【0005】
コメアクチンプロモーターは単子葉植物で異種遺伝子を発現させることが知られているプロモーターである(US5,641,876)。しかし、単子葉植物で異種配列を発現させるために機能的な新規5’調節配列を同定するという問題が残っている。
【0006】
本発明は単子葉植物細胞で異種遺伝子を発現させる5’調節エレメントである新規DNA配列に関し、前記DNA配列は、転写方向に向かってトウモロコシH3C4プロモーターの配列の機能的フラグメントである第1のDNA配列と、コメアクチンの第1のイントロンの配列の機能的フラグメントである第2のDNA配列を含む。
【0007】
トウモロコシH3C4プロモーターの配列は特にBrignonら(Plant.Mol.Biol.,22:1007−1015,1993)により記載されている。これはトウモロコシのヒストンH3C4をコードする配列のATGに対して−7〜−1029位の塩基に対応する約1kbのトウモロコシH3C4プロモーターのAluIフラグメントである。
【0008】
コメアクチンの第1のイントロンの配列は特にUS5,641,876に記載されている。
【0009】
機能的フラグメントとは、本発明によると、トウモロコシH3C4プロモーターの配列又はコメアクチンの第1のイントロンの配列に由来し、元の配列の機能を再現する任意DNA配列を意味する。
【0010】
本発明の1実施態様によると、トウモロコシH3C4プロモーターの配列の機能的フラグメントは配列番号1により表されるDNA配列又は前記配列の相同配列を含む。トウモロコシH3C4プロモーターの配列の機能的フラグメントは配列番号1により表されるDNA配列から構成されることが好ましい。
【0011】
本発明の1実施態様によると、コメアクチンの第1のイントロンの機能的フラグメントは配列番号2により表されるDNA配列又は前記配列の相同配列を含む。コメアクチンの第1のイントロンの機能的フラグメントは配列番号2により表されるDNA配列から構成されることが好ましい。
【0012】
本発明の5’調節エレメントであるDNA配列は、第1のDNA配列と第2のDNA配列の間に一般に本発明の配列の構築に必要な中性DNAフラグメントを更に含んでいてもよい。このようなフラグメントとしては、30塩基対まで、好ましくは20塩基対までを含むDNAフラグメントが挙げられる。中性DNAフラグメントとは、本発明によると、本発明の配列の第1及び第2のDNA配列の夫々の機能を実質的に変えないDNAフラグメントを意味する。
【0013】
本発明の好適実施態様によると、本発明のDNA配列は配列番号3により表されるDNA配列又は前記配列の相同配列を含む。本発明の配列は配列番号3により表されるDNA配列から構成されることがより好ましい。
【0014】
「相同」とは、本発明によると、配列番号1、2又は3により表される基準DNA配列の機能を再現しながら、前記配列に対して1個以上の配列改変をもつDNA配列を意味する。これらの改変は通常の突然変異技術又はハイブリダイゼーションによる前記配列の製造で使用可能な合成オリゴヌクレオチドを選択することにより得られる。相同度は基準配列に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%であると有利である。
【0015】
本発明はコーディング配列と、単子葉植物細胞で機能することが可能な5’及び3’位異種調節エレメントを含むキメラ遺伝子(又は発現カセット)にも関し、5’調節エレメントは上記に定義した本発明のDNA配列を含む。
【0016】
「植物細胞」とは、本発明によると、単子葉植物に由来し、カルス等の未分化組織、胚等の分化組織、単子葉植物部分、単子葉植物又は種子を構成することができる任意細胞を意味する。
【0017】
「単子葉植物」とは、本発明によると、光合成が可能な任意分化多細胞生物、より特定的には例えばコムギ、オオムギ、エンバク、コメ、トウモロコシ、モロコシ、サトウキビ等の動物又はヒト食用又は非食用栽培植物を意味する。
【0018】
本発明によると、本発明のプロモーター調節配列と共に、プロモーターとコーディング配列の間に配置された他の調節配列も使用してもよく、このような配列は1本鎖又は2本鎖のトランジットペプチドをコードし、場合によっては中間配列により分離され、即ち出願EP0508909に記載されているように、プラスチド局在酵素をコードする植物遺伝子のトランジットペプチドをコードする配列と、プラスチド局在酵素をコードする植物遺伝子のN末端成熟部分の配列の一部と、プラスチド局在酵素をコードする植物遺伝子のN末端成熟部分の配列の一部から構成されるプラスチド局在酵素をコードする植物遺伝子の第2のトランジットペプチドをコードする配列を転写方向に向かって順次含む。トランジットペプチドとしては、Cornelissenらにより記載されているタバコのPR−1a遺伝子のシグナルペプチドも挙げることができる。
【0019】
終結調節又はポリアデニル化配列としては、例えばAgrobacterium tumefaciensのnosターミネーター等の細菌起源又は例えば出願EP0633317に記載されているようなヒストンターミネーター等の植物起源の対応する任意配列を使用することができる。
【0020】
本発明のキメラ遺伝子のコーディング配列は、植物細胞又は単子葉植物で発現させることが所望される着目タンパク質をコードする任意配列を含むことができる。
【0021】
このような配列としては、形質転換単子葉植物に新規農学的性質を付与する遺伝子や、形質転換単子葉植物の農学的品質を改良する遺伝子等の選択マーカーをコードする遺伝子が挙げられる。
【0022】
選択マーカーをコードする遺伝子としては、抗生物質耐性遺伝子、除草剤(ビアラフォス、グリホセート又はイソキサゾール)耐性遺伝子、GUS酵素等の容易に同定可能な酵素をコードする遺伝子、色素をコードする遺伝子又は形質転換細胞における色素生産を調節する酵素を挙げることができる。このような選択マーカー遺伝子は特に特許出願WO91/02071及びWO95/06128に記載されている。
【0023】
形質転換単子葉植物に新規農学的性質を付与する遺伝子としては、所定の除草剤に対する耐性を付与する遺伝子、所定の昆虫に対する耐性を付与する遺伝子、所定の疾病に対する耐性を付与する遺伝子等を挙げることができる。このような遺伝子は特に特許出願WO91/02071及びWO95/06128に記載されている。
【0024】
終結調節又はポリアデニル化配列としては、例えばAgrobacterium tumefaciensのnosターミネーター等の細菌起源又は例えば出願EP0633317に記載されているようなヒストンターミネーター等の植物起源の対応する任意配列を使用することができる。
【0025】
本発明は植物細胞及び形質転換単子葉植物に所定の除草剤に対する耐性を付与する遺伝子を発現させるのに特に適している。所定の除草剤に対する耐性を付与する遺伝子としては、ビアラフォスに対する耐性を付与するBar遺伝子、グリホセートとその塩等のEPSPSを標的とする除草剤に対する耐性を付与する適当なEPSPSをコードする遺伝子(US4,535,060、US4,769,061、US5,094,945、US4,940,835、US5,188,642、US4,971,908、US5,145,783、US5,310,667、US5,312,910、US5,627,061、US5,633,435、FR2736926)、グリホセートオキシドレダクターゼをコードする遺伝子(US5,463,175)、又はイソキサゾール、特にイソキサフトール(FR95 06800、FR95 13570)、ジケトニトリル(EP496630、EP496631)又はトリケトン、特にスルコトリオン(EP625505、EP625508、US5,506,195)等のHPPDを標的とする除草剤に対する耐性を付与するHPPDをコードする遺伝子を挙げることができる。このようなHPPDを標的とする除草剤に対する耐性を付与するHPPDをコードする遺伝子は、参考資料としてその開示内容を本明細書の一部とする特許出願WO96/38567及び1997年11月7日付けで出願された未公開特許出願FR97 14264に記載されている。
【0026】
EPSPSを標的とする除草剤に対する耐性を付与する適当なEPSPSをコードする遺伝子としては、特許出願FR2736926に記載されている102と106の2つの突然変異をもつ植物、特にトウモロコシのEPSPSをコードする遺伝子(以下、二重突然変異EPSPSと言う)、又は特許US5,633,435の配列番号2及び3により表されるAgrobacteriumから単離されたEPSPSをコードする遺伝子(以下、CP4と言う)が特に挙げられる。
【0027】
HPPDを標的とする除草剤に対する耐性を付与するHPPDをコードする遺伝子としては、特許出願WO96/38567に記載されているPseudomonasのHPPD及びArabidopsisのHPPDが特に挙げられる。
【0028】
EPSPS又はHPPD、より特定的には上記遺伝子をコードする遺伝子の場合には、これらの酵素をコードする配列の前にトランジットペプチド、特に参考資料としてその開示内容を本明細書の一部とする特許US5,510,471又はUS5,633,448に記載されている最適化トランジットペプチドと呼ばれるトランジットペプチドをコードする配列を配置すると有利である。
【0029】
本発明の好適実施態様によると、本発明のキメラ遺伝子は転写方向に向かって3’調節配列に機能的に結合したトランジットペプチド/着目タンパク質融合タンパク質をコードする配列に機能的に結合した上記に定義したような本発明の5’調節配列を含み、キメラ遺伝子の各エレメントは上記に定義した通りであり、着目タンパク質は好ましくは所定の除草剤に対する耐性を付与する酵素、より好ましくは上記に定義したEPSPS又はHPPD型酵素である。
【0030】
トランジットペプチド/EPSPS、より特定的にはOTP/二重突然変異EPSPS融合タンパク質をコードする配列は特に特許US4,940,835、US5,633,448及びFR2736926に記載されている。
【0031】
OTP/CP4融合タンパク質については、当業者は特許US5,633,435に記載されているCP4をコードする配列を利用し、特許US4,940,835、US5,633,448及びFR2736926又は下記実施例に記載する操作方法に従って対応する遺伝子を構築することができる。本発明は転写方向に向かって3’調節配列に機能的に結合したOTP/CP4融合タンパク質をコードする配列に機能的に結合しており、植物細胞で異種遺伝子の発現を確保するのに適した5’調節配列を含むキメラ遺伝子にも関する。5’調節エレメントは上記に定義した本発明の5’調節エレメントだけでなく、当業者に公知又は今後公知となる単子葉又は双子葉植物細胞で異種遺伝子を発現させるのに適した全調節エレメント、特に上記調節エレメントを含む。
【0032】
トランジットペプチド/HPPD融合タンパク質をコードする配列は特許出願WO96/38567に記載されている。
【0033】
本発明は更に、植物細胞又は単子葉植物の形質転換用クローニング又は発現ベクターにも関し、植物細胞及び形質転換植物は上記に定義したようなキメラ遺伝子を少なくとも1個含む。本発明のベクターは上記キメラ遺伝子以外に少なくとも1個の複製起点を含む。このベクターは本発明のキメラ遺伝子の導入により形質転換されたプラスミド、コスミド、バクテリオファージ又はウイルスから構成することができる。このような植物細胞又は単子葉植物の形質転換用ベクターは当業者に周知であり、文献に広く記載されている。本発明の植物細胞又は植物の形質転換用ベクターはプラスミドが好ましい。
【0034】
本発明は更に、少なくとも1個の核酸フラグメント又は上記に定義したようなキメラ遺伝子の組み込みによる植物細胞の形質転換方法にも関し、形質転換は本発明のベクターを用いて任意の適当な公知手段により得られる。
【0035】
このような方法としては、DNA配列を結合した粒子を細胞又は細胞組織に打ち込む方法がある。また、Agrobacterium tumefaciensのTi又はAgrobacterium rhizogenesのRiプラスミドに挿入したキメラ遺伝子を植物導入手段として使用する方法もある。更に、マイクロインジェクションやエレクトロポレーション等の方法を使用してもよいし、PEGによる直接沈殿を利用してもよい。
【0036】
当業者は植物細胞又は植物に種類に応じて適当な方法を選択できる。
【0037】
本発明は更に、少なくとも1個の本発明の上記キメラ遺伝子を含む形質転換植物細胞又は植物にも関する。
【0038】
本発明は更に、形質転換細胞を含む植物、特に形質転換細胞から再生された植物に関する。再生は種の種類に依存する任意の適当な方法により得られる。
【0039】
植物細胞の形質転換及び単子葉植物の再生方法については、特にその開示内容を参考資料として本明細書の一部とするGordon−Kamm,W.J.ら(Transformation of Maize Cells and Regeneration of Fertile Transgenic Plants,The Plant Cell,vol.2,603−618,July 1990)と以下の特許及び特許出願:US5,177,010、、US5,187,073、EP267,159、EP604662、EP672752、US4,945,050、US5,036,006、US5,100,792、US5,371,014、US5,478,744、US5,484,956、US5,508,468、US5,538,877、US5,554,798、US5,489,520、US5,510,318、US5,204,253、US5,405,765、EP442174、EP486233、EP486234、EP539563、EP674725、WO91/02071及びWO95/06128を挙げることができる。
【0040】
本発明は更に上記再生植物の栽培及び/又は交配により得られる形質転換植物と、形質転換植物の種子にも関する。
【0041】
本発明のキメラ遺伝子が特定除草剤に対する耐性を付与する酵素をコードする配列を含む場合には、本発明は本発明の前記キメラ遺伝子で形質転換した種子又は植物を含む圃場の表面における雑草の駆除方法にも関し、前記方法は前記特定除草剤に対する耐性を付与する酵素をコードする前記配列を含む本発明のキメラ遺伝子で形質転換した種子又は植物を実質的に変化させずに、前記雑草に対して毒性用量の前記特定除草剤を圃場の前記表面に施用することからなる。
【0042】
本発明は更に上記特定除草剤に対する耐性を付与する酵素をコードする配列を含む本発明のキメラ遺伝子で本発明により形質転換した植物の栽培方法にも関し、前記方法は、前記植物の栽培に適した圃場の表面に前記形質転換植物の種子を播き、前記形質転換種子又は植物を実質的に変化させずに、雑草が存在している場合には雑草に対して毒性用量の前記特定除草剤を前記圃場の前記表面に施用した後、植物が所望成熟度に達したら栽培植物を収穫し、場合により収穫した植物から種子を分離することからなる。
【0043】
上記2種の方法において、特定除草剤の施用は本発明によると栽培物の播種前、発芽前及び発芽後にいずれに実施してもよい。
【0044】
除草剤耐性酵素は適当なEPSPSが有利であり、その場合には、除草剤はグリホセート又はその塩であり、あるいは酵素はHPPSであり、除草剤はイソキサゾール、特にイソキサフトール、ジケトニトリル又はトリケトン、特にスルコトリオンから選択される。
【0045】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、これにより発明の範囲を制限するものではない。
【0046】
1.HPPDをコードする配列をもつキメラ遺伝子の構築:
下記プラスミドを作製し、Mc Elroy D.ら(Plant Molecular Biology 15:257−268(1990))により記載されているライスアクチン遺伝子の第1のイントロン(ActI)の非翻訳5’領域に結合したトウモロコシヒストンH3C4プロモーターを含む発現カセットを構築してPseudomonas FluorescensのOTP−HPPD遺伝子を発現させる。
【0047】
pRPA−RD−195
プラスミドpRPA−RD−195は改変多重クローニング部位を含むプラスミドpUC−19の誘導体である。下記相補的オリゴヌクレオチド1及び2を65℃で5分間ハイブリダイズした後、30分間かけて30℃までゆっくりと冷却する。
【0048】
オリゴ4: 5’AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC GAGCTCGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC 3’
オリゴ5: 5’CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT GCATGCCTGC AGGTCGACTC TAGAGG 3’
【0049】
ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを大腸菌のDNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントで2本鎖にし、製造業者(New England Biolabs)により推奨されている標準条件を使用して各オリゴの3’末端を伸長する。得られた2本鎖オリゴを次に、予め制限酵素EcoRI及びHindIIIで消化し、大腸菌のDNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントで平滑末端にしておいたプラスミドpUC−19に連結する。こうして、Agrobacterium tumefaciensのプラスミドベクターに発現カセットを導入し易くするように多重クローニング部位を含むクローニングベクターが得られる(図1)。
【0050】
pRPA−RD−2010:
プラスミドpRPA−RD−195へのpRPA−RD−159の「H4A748プロモーター−OTP−二重突然変異EPSPS遺伝子」配列の挿入。
【0051】
プラスミドpRPA−RD−195を制限酵素SacIで消化し、子牛腸アルカリホスファターゼ(New England Biolabs)で脱リン酸化する。(FR2736926に記載されている)プラスミドpRPA−RD−173を制限酵素SacIで消化し、EPSPS遺伝子を含むDNAフラグメントを精製し、先に作製したプラスミドpRPA−RD−195に連結する。得られたクローンは二重突然変異EPSPS遺伝子の両側に複数の固有制限部位を含む。
【0052】
pRPA−RD−1002
単子葉植物で使用するための発現カセットOTP−HPPDの構築。プラスミドpRP−Pは特許出願WO96/38567に記載されているように、Pseudomonas fluorescensのHPPDに結合した最適化トランジットペプチド(OTP)と、ノパリンシンターゼのポリアデニル化部位を順次含む。プラスミドpRP−Pのエレメントは以下の通りである。
【0053】
−特許US5,510,471及びUS5,633,448に記載されている最適化トランジットペプチド(OTP)。このOTPはHelianthus annusのリブロース1,5−ビスリン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(Waksman G.ら,1987.Nucleics acids Res.15:7181)の小サブユニットのトランジットペプチドの171bpと、Zea maysのリブロース1,5−ビスリン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(Lebrunら,1987,Nucleics acids Res.15:4360)の小サブユニットの成熟部分の66bpと、Zea maysのリブロース1,5−ビスリン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(Lebrunら,1987,Nucleics acids Res.15:4360)の小サブユニットのトランジットペプチドの150bpから順次構成される。従って、全体で387bpである。
【0054】
−特許出願WO96/38567に記載されているPseudomonas fluorescensのHPPDのコーディング領域。
−ノパリンシンターゼ(nos)の遺伝子のターミネーター(pTi37から単離したnos遺伝子のポリアデニル化ゾーン,250bp;Bevan M.ら,Nucleics Acids Res.11:369−385)。
【0055】
プラスミドpRP−Pを制限酵素BstEIIで消化し、大腸菌のDNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントで処理してフラグメントを平滑末端にした後、制限酵素NcoIで消化する。約1.5kbのコーディング領域OTP−HPPDを含むDNAフラグメントが得られ、これを精製する。先に得られたプラスミドpRPA−RD−2010を制限酵素BlpIで消化し、大腸菌のDNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントで処理して平滑末端フラグメントを得た後、制限酵素NcoIで消化する。プラスミドベクター配列、非翻訳5’領域に結合したH3C4プロモーター及びコメアクチン遺伝子の第1のイントロンを含むDNAフラグメントが得られ、これを精製し、NOSポリアデニル化部位を精製する。2つの精製DNAフラグメントを連結し、非翻訳5’領域に結合したトウモロコシヒストンH3C4プロモーター(Brignonら)とコメアクチン遺伝子の第1のイントロン(ActI)(Act1 5’UTR+イントロン1)を含む発現カセットOTP−HPPDを生成し、NOSポリアデニル化部位(NOSポリA)を含むコーディング領域OTP−HPPDの発現を制御する(図2)。
【0056】
2.二重突然変異EPSPSをコードする配列をもつキメラ遺伝子の構築:
pRPA−RD−1010:
単子葉植物で使用するための発現カセットOTP−二重突然変異EPSPSの構築。
【0057】
プラスミドpRPA−RD−109は非翻訳5’領域に結合したトウモロコシヒストンH3C4プロモーター(Brignonら)とMc Elroy D.ら(Plant Molecular Biology 15:257−268,1990)に記載されているコメアクチン遺伝子の第1のイントロン(ActI)により制御される大腸菌のβ−グルクロニダーゼ遺伝子(GUS)を含む。このプラスミドの模式図を図3に示す。プラスミドpRPA−RD−109を制限酵素NcoI及びEcoRIで消化し、ベクター配列とGUS遺伝子とNOSポリアデニル化部位を含む大きいDNAフラグメント(約5kb)を精製する。プラスミドpRPA−RD−2010を制限酵素NcoI及びEcoRIで消化し、非翻訳5’領域に結合したH3C4プロモーターとコメアクチン遺伝子の第1のイントロン(ActI)を含むDNAフラグメント(約1.6kb)を精製する。2つの精製DNAフラグメントを連結し、非翻訳5’領域に結合したトウモロコシヒストンH3C4プロモーター(Brignonら)とコメアクチン遺伝子の第1のイントロン(ActI)を含む発現カセットOTP−二重突然変異EPSPSを生成し、NOSポリアデニル化部位を含むコーディング領域OTP−二重突然変異EPSPSの発現を制御する。
【0058】
3.ホスフィノトリシン耐性キメラ遺伝子(bar遺伝子)の構築:
bar遺伝子によりコードされるホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(PAT)は除草剤ホスフィノトリシン(PPT)を不活化させる酵素である。PPTはグルタミン合成を阻害し、細胞に迅速なアンモニア蓄積を誘発し、死をもたらす(Tachibanaら,1986)。
【0059】
選択物質としてのホスフィノトリシンに対する耐性を導入するために使用したプラスミドは、Promega Corp.から市販されているアンピシリン耐性遺伝子を含む2462bpのベクターpSP72(Genbank/DDBJデータベース登録番号X65332)にキメラ遺伝子pDM302を挿入することにより得られる。
【0060】
4700bpのプラスミドpDM302はCao,J.ら,Plant Cell Report 11:586−591(1992)に記載されている。
【0061】
このプラスミドの各エレメントは以下の通りである。
【0062】
−Mc Elroy D.ら,Plant Molecular Biology 15:257−268(1990)に記載されているコメアクチン遺伝子の840bpから構成されるプロモーター。
【0063】
−80bpから構成されるコメアクチン遺伝子の第1のエキソン。
−450bpから構成されるコメアクチン遺伝子の第1のイントロン。
−White J.ら,Nuc.Acids res.18:1862(1990)により記載されているプラスミドpIJ41404から切り出した600bpのbar遺伝子のコーディング領域。
【0064】
−ノパリンシンターゼ(nos)の遺伝子のターミネーター(pTi37から単離したnos遺伝子のポリアデニル化ゾーン,250bp;Bevan M.ら,Nucleics Acids Res.11:369−385)。
【0065】
4.トウモロコシ細胞の形質転換:
粒子射撃法を使用して遺伝子構築物を導入する。プラスミドをQiagenカラムで精製し、Klein法(Nature 327:70−73,1987)によりM10タングステン粒子上に共沈殿させる。
【0066】
次に、金属粒子とプラスミドpRPA−RD−1002と上記実施例3のプラスミドの混合物をGordon−Kamm,W.J.ら(Transformation of Maize Cells and Regeneration of Fertile Transgenic Plants,The Plant Cell,vol.2,603−618,July 1990)により記載されているプロトコールに従ってトウモロコシ胚形成細胞に打ち込む。
【0067】
5.再生及び選択物質としてのbar遺伝子の利用
打ち込んだカルスを緑色セクターが出現するまでグルホシネート上で選択する。次に、グルホシネート耐性陽性カルスを体細胞胚に成長させた後、Gordon−Kamm,W.J.ら(Transformation of Maize Cells and Regeneration of Fertile Transgenic Plants,The Plant Cell,vol.2,603−618,July 1990)により記載されている操作条件に従って発芽を助長する条件下におく。幼植物を温室に移し、種子を生産する。
【0068】
6.形質転換植物の子孫の分析:
上記のようにして得られた形質転換植物はイソキサフトール等のイソキサゾールに対する耐性を付与するOTP/HPPDをコードする異種遺伝子を含む部分トランスジェニックであると予想される。これらの形質転換植物は花粉を放出し、非トランスジェニック野生トウモロコシの胚珠を受精させた。得られた種子をイソキサフトール処理後に砂上で選択する。
【0069】
選択プロトコールは以下の通りである。
【0070】
フォンテーヌブロー砂800mlを15×20cm寸法の舟形容器に入れる。次に、これらの舟形容器に散水し、水1リットル当たりQuinoligo(La Quinoleine)5mlから構成される栄養溶液を加えることにより水和状態に保つ。舟形容器にトウモロコシ種子20個を播いた後、1ha当たり活性物質100g(舟形容器当たり活性物質300μg)の割合でイソキサフトールで噴霧処理する。その後、舟形容器を温室で栽培する。播種から14日後に植物毒性を調べる。上記条件によると、非形質転換植物は100%の植物毒性を示すが、形質転換植物は植物毒性を示さない。
【0071】
本発明により形質転換したトウモロコシの子孫20個と、コメアクチンの第1のイントロンをコードする配列をトウモロコシadh Iイントロンをコードする配列で置換した対応遺伝子で形質転換したトウモロコシの子孫20個を使用して比較試験を行った。1ha当たり活性物質200g(舟形容器当たり活性物質600μg)の割合で非常に高用量のイソキサフトールの噴霧処理後に次の結果が得られる。
【0072】
本発明のコメアクチンイントロン:20個中8個が耐性。
トウモロコシadh Iイントロン:20個中3個が耐性。
【0073】
上記結果から明らかなように、トウモロコシH3C4プロモーターを本発明のコメアクチンの第1のイントロンと結合すると、同一のトウモロコシH3C4プロモーターを従来技術の別のイントロンと結合した場合に比較して、形質転換単子葉植物における着目タンパク質の発現が実質的に改善される。
【図面の簡単な説明】
【図1】 プラスミドpRPA−RD−195の模式図である。
【図2】 プラスミドpRPA−RD−1002の模式図である。
【図3】 プラスミドpRPA−RD−109の模式図である。
【配列表】
Claims (28)
- 単子葉植物細胞で異種遺伝子を発現させる5’調節エレメントであるDNAであって、
転写方向に向かって
配列番号1により表されるDNA配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、トウモロコシH3C4プロモーターと同等の機能を有する配列からなる第1のDNA配列と、
配列番号2により表されるDNA配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、コメアクチンの第1のイントロンと同等の機能を有する配列からなる第2のDNA配列
を含むことを特徴とする前記DNA。 - 第1のDNA配列が配列番号1により表されるDNA配列から構成されることを特徴とする請求項1に記載のDNA。
- 第2のDNA配列が配列番号2により表されるDNA配列から構成されることを特徴とする請求項1または2に記載のDNA。
- 第1のDNA配列と第2のDNA配列の間に中性DNAフラグメントを含むことを特徴とする請求項1から3のいずれか一項に記載のDNA。
- 単子葉植物細胞で異種遺伝子を発現させる5’調節エレメントであるDNAであって、配列番号3により表されるDNA配列又は前記配列と少なくとも90%の配列同一性を有する相同配列を含むことを特徴とする前記DNA。
- 配列番号3により表されるDNA配列から構成されることを特徴とする請求項5に記載のDNA。
- コーディング配列と、単子葉植物細胞又は単子葉植物で機能することが可能な5’及び3’位異種調節エレメントを含むキメラ遺伝子であって、5’調節エレメントが請求項1から6のいずれか一項に記載のDNAを含むことを特徴とする前記キメラ遺伝子。
- コーディング配列が選択マーカーをコードする遺伝子、形質転換単子葉植物に新規農学的性質を付与する遺伝子、及び形質転換単子葉植物の農学的品質を改良する遺伝子から選択されることを特徴とする請求項7に記載のキメラ遺伝子。
- 形質転換単子葉植物に新規農学的性質を付与する遺伝子が、所定の除草剤に対する耐性を付与する遺伝子、所定の昆虫に対する耐性を付与する遺伝子、及び所定の疾病に対する耐性を付与する遺伝子から選択されることを特徴とする請求項8に記載のキメラ遺伝子。
- 所定の除草剤に対する耐性を付与する遺伝子が、ビアラフォスに対する耐性を付与するBar遺伝子、EPSPSを標的とする除草剤に対する耐性を付与する適当なEPSPSをコードする遺伝子、グリホセートオキシドレダクターゼをコードする遺伝子、及びHPPDを標的とする除草剤に対する耐性を付与するHPPDをコードする遺伝子から選択されることを特徴とする請求項9に記載のキメラ遺伝子。
- 所定の除草剤に対する耐性を付与する遺伝子が、EPSPSをコードする遺伝子及びHPPDをコードする遺伝子から選択されることを特徴とする請求項10に記載のキメラ遺伝子。
- EPSPSをコードする遺伝子が二重突然変異EPSPS及びCP4から選択されることを特徴とする請求項11に記載のキメラ遺伝子であって、二重突然変異EPSPSは、102と106の2つの突然変異を有し、かつ、EPSPS活性を有するEPSPSである前記キメラ遺伝子。
- EPSPS又はHPPDをコードする配列の前にトランジットペプチドをコードする配列を含むことを特徴とする請求項11又は12に記載のキメラ遺伝子。
- 前記トランジットペプチドが最適化トランジットペプチドであることを特徴とする請求項13に記載のキメラ遺伝子であって、最適化トランジットペプチドは、転写方向に向かって、プラスチド局在酵素をコードする植物遺伝子のトランジットペプチドをコードする配列と、プラスチド局在酵素をコードする植物遺伝子のN末端成熟部分の配列の一部と、プラスチド局在酵素をコードする植物遺伝子の第2のトランジットペプチドをコードする配列を含むものである前記キメラ遺伝子。
- 転写方向に向かって3’調節配列に機能的に結合したトランジットペプチド/着目タンパク質融合タンパク質をコードする配列に機能的に結合した請求項1から6のいずれか一項に記載の5’調節配列を含むことを特徴とする前記キメラ遺伝子。
- 着目タンパク質が請求項10から12のいずれか一項に記載の所定の除草剤に対する耐性を付与する酵素であることを特徴とする請求項15に記載のキメラ遺伝子。
- トランジットペプチド/着目タンパク質融合タンパク質をコードする配列が、OTP/二重突然変異EPSPS融合タンパク質をコードする配列及びOTP/CP4融合タンパク質をコードする配列から選択されることを特徴とする請求項15に記載のキメラ遺伝子であって、二重突然変異EPSPSは、102と106の2つの突然変異を有し、かつ、EPSPS活性を有するEPSPSである前記キメラ遺伝子。
- 請求項7から17のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子以外に少なくとも1個の複製起点を含むことを特徴とする植物細胞又は植物の形質転換用クローニング又は発現ベクター。
- プラスミドであることを特徴とする請求項18に記載のベクター。
- 請求項7から17のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子を組み込むことを特徴とする植物細胞の形質転換方法。
- 請求項7から17のいずれか一項に記載の少なくとも1個のキメラ遺伝子を含むことを特徴とする植物細胞。
- 請求項21に記載の細胞を含むことを特徴とする形質転換植物。
- 請求項21に記載の細胞から再生されることを特徴とする請求項22に記載の形質転換植物。
- 請求項22又は23に記載の形質転換植物の栽培及び/又は交配により得られることを特徴とする請求項22に記載の形質転換植物。
- 請求項22から24のいずれか一項に記載の形質転換植物の種子。
- 特定除草剤に対する耐性を付与する酵素をコードする配列を含むキメラ遺伝子で形質転換した種子又は植物を含む圃場の表面における雑草の駆除方法であって、前記キメラ遺伝子で形質転換した種子又は植物を実質的に変化させずに、前記雑草に対して毒性用量の前記特定除草剤を圃場の前記表面に施用することからなり、前記キメラ遺伝子が請求項10から17のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子であることを特徴とする前記方法。
- 請求項10から17のいずれか一項に記載の特定除草剤に対する耐性を付与する酵素をコードする配列を含むキメラ遺伝子で形質転換した植物の栽培方法であって、前記形質転換植物の栽培に適した圃場の表面に前記形質転換植物の種子を播き、前記形質転換種子又は植物を実質的に変化させずに、雑草が存在している場合には雑草に対して毒性用量の前記特定除草剤を前記圃場の前記表面に施用した後、植物が所望成熟度に達したら栽培植物を収穫し、場合により収穫した植物から種子を分離することを特徴とする前記方法。
- 栽培物の播種前、発芽前又は発芽後に特定除草剤を施用することを特徴とする請求項27に記載の方法。
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