BR112019018175A2

BR112019018175A2 - molécula, célula, planta, sementes, polipeptídeos recombinantes, método para produzir um polipeptídeo, planta, método para controlar ervas, uso do ácido nucleico e produto de utilidade

Info

Publication number: BR112019018175A2
Application number: BR112019018175A
Authority: BR
Inventors: Laber Bernd; Thies Christina; Weber Ernst; Poree Fabien; Lange Gudrun; Balven-Ross Heike; Tebbe Jan; Dubald Manuel; LINKA Marc; Strerath Michael; Pawlowski Nikolaus; Wobst Nina; Geske Sandra; Coco Wayne
Original assignee: BASF Agricultural Solutions Seed US LLC
Priority date: 2017-03-07
Filing date: 2018-03-01
Publication date: 2020-04-07
Also published as: US11180770B2; US20200063155A1; CA3055389A1

Abstract

na presente invenção, são descritos polipeptídeos de hppd e plantas que os contêm, mostrando uma tolerância total contra um ou mais herbicida (s) inibidor (es) de hppd pertencentes a várias classes químicas. foi concebido um conjunto de polipeptídeos de hppd mutantes que têm ou não uma afinidade significativamente reduzida a herbicidas inibidores de hppd e, ao mesmo tempo, a taxa de dissociação dos inibidores de hppd do polipeptídeo de hppd mutante é aumentada a tal ponto que os inibidores de hppd não atuam mais como inibidores lentos ou de ligação lenta, de ligação forte, mas, em vez disso, tornaram-se inibidores completamente reversíveis. em particular, são proporcionados polinucleotídeos isolados que codificam polipeptídeos de hppd mutantes que conferem tolerância a herbicidas inibidores de hppd pertencentes a várias classes químicas. além disso, são abrangidas sequências de aminoácidos que correspondem aos polinucleotídeos.

Description

“MOLÉCULA, CÉLULA, PLANTA, SEMENTES, POLIPEPTÍDEOS RECOMBINANTES, MÉTODO PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO, PLANTA, MÉTODO PARA CONTROLAR ERVAS, USO DO ÁCIDO NUCLEICO E PRODUTO DE UTILIDADE” Campo da Invenção [001] Esta invenção refere-se à biologia molecular de plantas, particularmente novos polipeptídeos de HPPD que conferem tolerância melhorada aos herbicidas inibidores de HPPD.

Antecedentes da Invenção [002] As 4-hidróxifenilpiruvato dioxigenases (HPPDs) são enzimas que catalisam a reação em que o para-hidroxifenilpiruvato (abreviado aqui como HPP), um produto de degradação de tirosina, é transformado em homogentisate (abreviado aqui como HGA), o precursor em plantas de tocoferol e plastoquinona (Crouch NP et al. (1997), Tetrahedron, 53, 20, 69937010, Fritze et al. (2004), Plant Physiology 134: 1388 -1400). O tocoferol atua como um antioxidante associado à membrana. A plastoquinona, em primeiro lugar, atua como um transportador de elétrons entre PSII e o complexo citocromo b6/f e, em segundo lugar, é um cofator redox para a fitoeno dessaturase, envolvido na biossíntese de carotenoides.

[003] Até agora, mais de 1000 sequências de ácidos nucleicos de vários organismos presentes no banco de dados NCBI foram anotadas como codificando para uma proteína putativa com um domínio HPPD. Mas para a maioria delas, não foi comprovado que a proteína teria uma atividade enzimática HPPD, nem em um ensaio in vitro, nem em uma abordagem na planta, nem que tal proteína HPPD pode conferir tolerância aos herbicidas inibidores de HPPD quando expressada em uma planta. Várias proteínas HPPD e suas sequências primárias foram descritas no estado da técnica, em particular as proteínas HPPD de bactérias, como Pseudomonas (Rüetschi et

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2/114 al., Eur. J. Biochem., 205, 459-466, 1992, WO 96/38567), Kordia (WO 2011/076889) Synechococcus (WO 2011/076877), Acidobacterium e Mucilaginibacter (WO 2015/022634), Rhodococcus (WO 2011/076892), de protistas, como Blepharisma (WO 2011/076882), de euryarchaeota, como Picrophilus (WO 2011/076885), de algas, como Chlamydomonas reinhardtii (ES2275365; WO 2011 /145015), Scenedesmus (WO 2015/022634), de plantas, como Arabidopsis (WO 96/38567, GENBANK® AF047834), cenoura (WO 96/38567, GENBANK® 87257), Avena sativa (WO 2002/046387, WO 2011/068567), trigo (WO 2002/046387), Brachiaria platyphylla (WO 2002/046387), Cenchrus echinatus (WO 2002/046387), Lolium rigidum (WO 2002/046387), Festuca arundinacea (WO 2002/046387), Setaria faberi (WO 2002/046387), Eleusine indica (WO 2002/046387), Sorgo (WO 2002046387, WO 2012/021785), milho (WO 2012/021785), Coptis japonica (WO 2006/132270), Lemna (WO 2015/022634) ou de mamíferos, como rato ou porco ou de fungos, como Coccicoides (GENBANK® COITRP).

[004] A inibição da HPPD leva ao desacoplamento da fotossíntese, à deficiência em pigmentos acessórios de coleta de luz e, o mais importante, à destruição de clorofila por radiação UV e espécies reativas de oxigênio (branqueamento) devido à falta de fotoproteção normalmente fornecida por carotenoides (Norris et al. (1995), Plant Cell 7: 2139-2149). Ο branqueamento de tecidos fotossinteticamente ativos leva à inibição do crescimento e à morte das plantas.

[005] Algumas moléculas que inibem HPPD (doravante denominadas herbicidas inibidores de HPPD) e que inibem a transformação da HPP em HGA enquanto se ligam de forma específica à enzima, provaram ser herbicidas muito eficazes.

[006] Atualmente, a maioria dos herbicidas inibidores de HPPD comercialmente disponíveis pertence a uma dessas famílias químicas,

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3/114 conforme listado abaixo:

1) tricetonas, por exemplo, benzobiciclon [ou seja, 3-[2- cloro -4(metilsulfonil) benzoil] -4- (fenilsulfanil) biciclo [3.2.1] oct -3- en- 2- ona]; sulcotriona [ou seja, 2-[2- cloro -4- (metilsulfonil) benzoil] -1,3ciclohexanediona], mesotriona [ou seja, 2-[4- (metilsulfonil) -2- nitrobenzoil] 1,3- ciclohexanediona] (abreviado aqui como MST); tembotriona [ou seja, 2-[2cloro -4- (metilsulfonil) -3- [(2,2,2,-trifluoroetóxi)metil]benzoil] -1,3ciclohexanediona]; tefuriltriona [ou seja, 2-[2- cloro -4- (metilsulfonil) -3- [[(tetrahidro -2- furanil)metóxi]metil]benzoil] -1,3- ciclohexanediona]]; biciclopirona [ou seja, 4-hidróxi -3- [[2-[(2- metóxi etóxi)metil]- 6- (trifluorometil) -3piridinil]carbonil]biciclo [3.2.1] oct -3- en- 2- ona]; fenquinotriona [ou seja, 2-[[8cloro-3,4-di-hidro -4- (4- metóxifenil) -3- oxo -2- quinoxalinil]carbonil] -1,3ciclohexanediona], e como descrito em WO 2007/088876, WO 2009/016841, WO 2010/089993, WO 2010/116122, WO 2012/002096, WO 2011/31658, WO 2012/136703, JP2013040141, WO 2013/080484, WO 2014/014904, WO 2014/031971, US 20140106968;

2) dicetonitrilas, por exemplo, 2- ciano -3- ciclopropil -1- (2metilsulfonil -4- trifluorometilfenil) -propano -1,3- diona e 2- ciano -1- [4(metilsulfonil) -2- trifluorometilfenil] -3- (1- metilciclopropil) propano -1,3- diona;

3) isoxazois, por exemplo, isoxaflutol [ou seja, (5- ciclopropil -4isoxazolil) [2- (metilsulfonil) -4- (trifluorometil) fenil] metanona]. Nas plantas, o isoxaflutol (aqui abreviado como IFT) é rapidamente metabilizado em DKN, um composto de dicetonitrila que apresenta a propriedade inibitória de HPPD;

4) hidróxipirazois, por exemplo, pirazoxifen [ou seja, 2-[[4- (2,4diclorobenzoil) -1,3- dimetil -1H-pirazol -5- il]oxi] -1- feniletanona]; benzofenap [ou seja 2-[[4- (2,4-dicloro -3- metilbenzoil) -1,3- dimetil -1H-pirazol -5- il]oxi] -1(4- metilfenil)etanona]; pirazolinato [ou seja, (2,4- diclorofenil)[1,3- dimetil -5[[(4- metilfenil)sulfonil]oxi] -1H- pirazol -4- il]metanona]; pirassulfotol [ou seja, (5-

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4/114 hidróxi -1,3- dimetil -1H-pirazol -4- il)[2- (metilsulfonil) -4(trifluorometil)fenil]metanona]; topramezona [ou seja, [3- (4,5- di-hidro -3isoxazolil) -2- metil -4- (metilsulfonil)fenil](5- hidróxi -1- metil -1H-pirazol -4il)metanona]; tolpiralato [ou seja, 1 -[[1 -etil -4- [3- (2- metóxi etóxi) -2- metil -4(metilsulfonil) benzoil] -1H-pirazol -5- il]oxi]etil metil carbonato];

5) N- (1,2,5- oxadiazol -3- II) benzamidas como descrito em WO

2011/035874 e WO 2012/123416, WO 2012/123409, EP 2562174, WO 2013/064459, WO 2013/087577, WO 2013/124238, WO 2013/124228,WO

2013/164333, WO 2013/037342, WO 2014/053473, WO 2014/086737,WO

2015/007662, WO 2015/007632, WO 2015/007633 e como descrito em WO 2013/072300, WO 2013/072402, WO 2013/072450, WO 2014/184014,WO

2014/184019, WO 2014/184058, WO 2014/192936, WO 2015/052152,WO

2015/052178 e N- (1,3,4- oxadiazol -2- II) benzamidas, como descrito em WO 2012/126932 e EP 2562174, WO 2013/064459, WO 2013/087577, WO 2013/124238, WO 2013/124228, WO 2013/124245, WO 2013/164333, WO 2013/037342, WO 2014/1053473, WO 2014/086737, WO 2015/007662, WO 2015/007632, WO 2015/007633; por exemplo, 2- metil -N- (5- metil -1,3,4oxadiazol -2- II) -3- (metilsulfonil) -4- (trifluorometil) benzamida; 2- cloro -N- (5metil -1,3,4- oxadiazol -2- II) -3- (metilsulfonil) -4- (trifluorometil) benzamida; 2cloro -3- (etilsulfonil) -N- (5- metil -1,3,4- oxadiazol -2- II) -4- (trifluorometil) benzamida;

6) N- (tetrazol -5- II) - ou N- (triazol -5- II) arilcarboxamidas como descrito em WO 2012/028579 e WO 2012/123409, WO 2013/017559, EP 2562174, WO 2013/064459, WO 2013/064457, WO 2013/087577, WO 2013/104705, WO 2013/124238, WO 2013/124228, WO 2013/124245,WO

2013/164331, WO 2013/164333, WO 2013/174843, WO 2013/037342,WO

2014/053473, WO 2014/086737, WO 2015/007662, WO 2015/007632,WO

2015/007633; por exemplo, 2- cloro -3- etóxi -4- (metilsulfonil) -N- (1- metil-1HPetição 870190085376, de 30/08/2019, pág. 382/508

5/114 tetrazol -5- il) benzamida; 4- (difluorometil) -2- metóxi -3- (metilsulfonil) -N- (1metil -1H- tetrazol -5- il) benzamida; 2- cloro-3- (metilsulfanil) -N- (1- metil -1Htetrazol -5- il) -4- (trifluorometil) benzamida (aqui também denominado “Composto 1”); 2- (metóximetil) -3- (metilsulfinil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il)

-4- (trifluorometil) benzamida e conforme descrito em WO 2013/072528, WO

2013/076315, WO

2013/139760, WO

2014/184015, WO

2014/184074, WO

2015/052173;

2013/076316, WO

2013/144231, WO

2014/184016, WO

2014/192936, WO

2013/083859, WO

2014/126070, WO

2014/184017, WO

2015/022284, WO

2013/092834, WO

2014/135654, WO

2014/184073, WO

2015/052153, WO

7) derivados piridazinona, conforme descrito em WO 2013/050421 e WO 2013/083774, WO 2014/154828, WO 2014/154882;

8) derivados de oxoprazina conforme descrito em WO 2013/054495;

9) N- (triazol -2- il) arilcarboxamidas como descrito em WO 2013/144234, WO 2015/007564;

10) triazinonas como descrito em WO 2014/154829; e

11) pirazolonas como descrito em EP 2881387 e EP 2881388.

[007] Esses herbicidas inibidores de HPPD podem ser usados contra ervas daninhas de gramíneas e/ ou de folhas largas no campo de plantas de cultivo que apresentam tolerância metabólica, como milho (Zea mays), arroz (Oryza Sativa) e trigo (Triticum aestivum) nos quais são rapidamente degradados (Schulz et al. (1993), FEBS letters, 318, 162 -166; Mitchell et al. (2001), Pest Management Science, Vol 57, 120 -128; Garcia et al. (2000), Biochem., 39, 7501-7507; Pallett et al. (2001), Pest Management Science, Vol 57, 133 -142). Para ampliar o escopo de uso desses herbicidas inibidores de HPPD, vários esforços foram desenvolvidos para conferir às plantas, particularmente plantas sem ou com uma tolerância metabólica de

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6/114 baixo desempenho, um nível de tolerância aceitável em condições de campo agronômico.

[008] Além da tentativa de contornar a produção de homogentisate mediada por HPPD (US 6.812.010), foi realizada a superexpressão da enzima sensível de modo a produzir quantidades da enzima alvo na planta que sejam suficientes em relação ao herbicida (WO 96/38567). A superexpressão de polipeptídeos de HPPD resultou em melhor tolerância de pré- emergência ao derivado de dicetonitrila (abreviado aqui como DKN) de IFT, mas o nível de tolerância não foi suficiente para tolerância ao tratamento pós-emergência (Matringe et al. (2005), Pest Management Science 61: 269-276).

[009] Uma terceira estratégia foi mutar o polipeptídeo de HPPD de modo a obter uma enzima alvo que, embora mantendo suas propriedades de catalisar a transformação da HPP em HGA, seja menos sensível aos inibidores de HPPD que o polipeptídeo de HPPD nativa antes da mutação.

[010] Esta estratégia foi aplicada com êxito para a produção de plantas tolerantes a 2- ciano -3- ciclopropil -1- (2- metilsulfonil -4trifluorometilfenil) -propano -1,3- diona e a 2- ciano -1- [4- (metilsulfonil) -2trifluorometilfenil] -3- (1- metilciclopropil) propano -1,3- diona (EP 496630), dois herbicidas inibidores de HPPD pertencentes à família de dicetonitrilas (WO 99/24585). Pro215Leu, Gly336Glu, Gly336lle e mais particularmente Gly336Trp (posições do aminoácido mutado são indicadas com referência ao polipeptídeo de HPPD Pseudomonas fluorescens do tipo selvagem correspondendo à SEQ ID NO: 1 da presente invenção) foram identificadas como mutações que são responsáveis pela maior tolerância ao tratamento com esses herbicidas de dicetonitrila.

[011] Bem recentemente, a introdução do gene de HPPD Pseudomonas fluorescens no genoma plastidial da planta de fumo e da soja se

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7/114 mostrou ser mais eficiente do que a transformação nuclear, conferindo tolerância à aplicação pós-emergência de IFT (Dufurmantel et al. (2007), Plant Biotechnol J.5(1): 118-33).

[012] No documento WO 2004/024928, os inventores procuraram aumentar a biossíntese de prenilquinona (por exemplo, síntese de plastoquinona, tocoferois) nas células das plantas aumentando o fluxo do precursor de HPP nas células dessas plantas. Isso foi feito conectando a síntese do referido precursor à via “chiquimato” por superexpressão de uma enzima prefenato- desidrogenase (PDH). Eles também observaram que a transformação de plantas com um gene que codifica uma enzima PDH e um gene que codifica uma enzima HPPD permite aumentar a tolerância das referidas plantas aos herbicidas inibidores de HPPD.

[013] No documento WO 2009/144079, foram divulgadas sequências de ácido nucleico que codificam uma hidroxifenilpiruvato dioxigenase (HPPD) com mutações específicas na posição 336 da proteína HPPD Pseudomonas fluorescens e sua utilização para a obtenção de plantas que são tolerantes aos herbicidas inibidores de HPPD.

[014] No documento WO 2002/046387, foram identificados vários domínios de polipeptídeos de HPPD originários de plantas que podem ser relevantes para conferir tolerância a vários herbicidas de inibidores de HPPD, mas não foram demonstrados dados nem em plantas nem bioquímicos para confirmar o impacto das funções de domínio descritas.

[015] No documento WO 2008/150473, a combinação de dois mecanismos de tolerância distintos - uma codificação do gene Avena sativa modificado para uma enzima HPPD mutante e uma mono- oxigenase de milho CYP450 (gene nsf1) - foi exemplificada para obter uma tolerância melhorada aos herbicidas inibidores de HPPD, mas não foi divulgado nenhum dado que demonstrasse os efeitos sinérgicos com base na combinação de ambas as

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8/114 proteínas.

[016] Além disso, é divulgado um método para gerar plantas tolerantes aos herbicidas inibidores de HPPD por superexpressão não apenas de um gene que codifica para uma HPPD tolerante, como, por exemplo, de Avena sativa (US 2011/0173718) ou Arabidopsis (WO 2013/064964, WO 2014/177999), mas também em combinação com vários genes de plantas que codificam para uma proteína HST (homogentisate solanesiltransferase). No entanto, o nível de tolerância a alguns herbicidas inibidores de HPPD selecionados foi bastante limitado.

[017] No documento WO 2011/094199 e US 2011/0185444, avaliou-se a tolerância de várias centenas de linhagens de tipo selvagem de soja ao IFT de inibidor de HPPD. Pouquíssimas linhagens apresentaram nível razoável de tolerância aos herbicidas. O QTL (locus de traço quantitativo) putativo responsável pela tolerância foi identificado. Nesta região do genoma, um gene que codifica para um transportador ABC foi identificado como sendo a principal característica responsável pela melhor tolerância ao herbicida inibidor de HPPD observado. No entanto, as plantas transgênicas que expressam os genes identificados não apresentaram qualquer melhora na tolerância aos herbicidas inibidores da HPPD testados.

[018] Nos documentos WO 2010/085705 e US 2014/0053295, foram revelados vários mutantes do polipeptídeo Avena sativa HPPD. No documento WO 2010/085705 foi mostrado que algumas das variantes apresentaram tolerância melhorada in vitro à tricetona Mesotriona (abreviada aqui como MST), no entanto, apenas alguns poucos mutantes foram expressos em plantas de planta de fumo. Além disso, nenhuma das plantas de planta de fumo que expressam esses mutantes apresentou tolerância melhorada ao MST ou IFT em comparação com as plantas de planta de fumo que expressam o gene da Avena sativa HPPD de tipo selvagem. No documento US

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2014/0053295, alguns mutantes Avena sativa HPPD foram expressados em plantas de soja e possuíam um bom nível de tolerância a MST como conhecido em plantas que expressam o gene da Avena sativa HPPD de tipo selvagem. Contudo, outros herbicidas, como a tembotriona ou IFT, induziram danos muito maiores às folhas nestas plantas de soja.

[019] O documento US 2012/0042413 descreve polipeptídeos de HPPD de milho mutantes com atividade de HPPD, mas também mostrando uma certa insensibilidade a pelo menos um herbicida inibidor de HPPD e sugere ainda um determinado conjunto de mutações em diferentes posições de polipeptídeos de HPPD e, finalmente, revela dados bioquímicos, bem como níveis de tolerância de plantas contendo alguns desses polipeptídeos de HPPD que sofreram mutação. No documento EP 2453012, vários mutantes de polipeptídeos de HPPD foram descritos; no entanto, a tolerância melhorada dos mutantes descritos não foi demonstrada na planta contra vários herbicidas inibidores de HPPD.

[020] No documento WO 2014/043435, moléculas de ácido nucleico recombinantes que codificam os polipeptídeos de HPPD de Pseudomonas spp. constituídos por uma sequência de aminoácidos que compreende uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1; ou uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; ou uma serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma treonina na posição de aminoácidos que corresponde a posição de aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1 e uma glutamina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1;

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10/114 ou um triptofano na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 188 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; ou uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1 e um ácido glutâmico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; ou uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, um triptofano na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1 e uma glutamina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1 foram descritas.

[021] No documento WO 2015/135881, moléculas de ácido nucleico recombinantes que codificam os polipeptídeos de HPPD de Pseudomonas spp. consistindo em uma sequência de aminoácidos que compreende uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, e uma fenilalanina ou tirosina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; e, opcionalmente, uma ou mais substituições adicionais nas posições de aminoácidos que correspondem às posições de aminoácidos 188, 189, 200, 215, 226, 339 e 340 da SEQ ID NO: 1, foram descritas.

[022] Os herbicidas inibidores de HPPD atualmente descritos e parcialmente comercializados atual como inibidores lentos ou de ligação lenta ou ligação forte (consulte Morrison (1982) Trends Biochem. Sei. 7, 102 -105). Esses inibidores se ligam lentamente (ou seja, eles têm taxas lentas de associação, kon), mas não de maneira covalente ao polipeptídeo de HPPD (ou seja, eles produzem inibição dependente do tempo) e são liberados muito

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11/114 lentamente (ou seja, têm taxas excepcionalmente lentas de dissociação, koff) devido à interação excessivamente forte com a enzima. Esses inibidores se ligam tão fortemente que as titulações estequiométricas com a enzima são possíveis.

[023] Tornou-se cada vez mais reconhecido que os inibidores lentos ou de ligação lenta e de ligação forte não são apenas inibidores de HPPD potentes e extraordinários, mas, além disso, têm características que os tornam agroquimicamente atraentes para o controle de ervas daninhas. A taxa de dissociação lenta aumenta a eficácia do inibidor até tal ponto que, idealmente, apenas uma molécula inibidora por sítio ativo do polipeptídeo de HPPD é suficiente para inibir completamente a atividade e para manter esse nível de inibição durante um longo período mesmo na ausência de moléculas inibidoras livres na célula vegetal. Isso se traduz em baixas taxas de aplicação desses inibidores para controlar ervas daninhas indesejadas em áreas de cultivo.

[024] As propriedades de inibidores lentos ou de ligação lenta e de ligação forte são vantajosas quando se alcança a inibição de HPPD e a atividade herbicida é o objetivo. No entanto, essas propriedades são uma grande desvantagem quando os polipeptídeos de HPPD tolerantes a esses inibidores devem ser inventados. As mutações no polipeptídeo de HPPD que reduzem apenas a afinidade do inibidor para a enzima (ki) não superam completamente a inibição de HPPD uma vez que a ligação do inibidor e a inibição do polipeptídeo de HPPD podem ainda ocorrer e, portanto, o nível de inibição alcançado é mantido por um longo período, mesmo na ausência de inibidor livre na célula vegetal. Além disso, os herbicidas inibidores de HPPD, em parte, comercialmente disponíveis pertencem às classes químicas estruturalmente diversas, como as tricetonas, os dicetonitrilas, os isoxazois, os hidroxipirazois, as N- (1,2,5- oxadiazol -3- il) benzamidas, a N- (1,3,4- oxadiazol

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-2- il) benzamidas, as N- (tetrazol -5- il) - ou N- (triazol -5- il) arilcarboxamidas, os derivados de piridazinona, os derivados de oxoprazina, as N- (triazol -2- il), as triazinonas e as pirazolonas. Os polipeptídeos de HPPD de última geração descritos atualmente demonstram uma variação bastante limitada de tolerância a herbicidas inibidores de HPPD estruturalmente diversos.

[025] Devido às propriedades cinéticas descritas acima de todos os herbicidas inibidores de HPPD atualmente descritos e parcialmente comercializados, até agora, não foram publicadas plantas tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD com tolerância total contra herbicidas inibidores de HPPD, apesar dos muitos esforços para gerá-los.

Descrição Resumida da Invenção [026] Na presente invenção, são descritos polipeptídeos de HPPD e plantas que os contêm, mostrando uma tolerância total contra um ou mais herbicida (s) inibidor (es) de HPPD pertencentes a várias classes químicas. Verificou-se que, para gerar esses polipeptídeos de HPPD com tolerância máxima e ampla contra várias classes de herbicidas inibidores de HPPD, é importante reduzir a afinidade do polipeptídeo de HPPD (ki) em relação ao (s) respectivo (s) herbicida (s) inibidor(es) de HPPD e simultaneamente asseguram uma taxa de dissociação melhorada (koff) de um inibidor lento, de ligação lenta ou de ligação forte, como é conhecido nos polipeptídeos de HPPD de tipo selvagem e vários polipeptídeos de HPPD mutantes para alcançar um alto nível de tolerância ao inibidor.

[027] Na presente invenção, este objetivo foi alcançado por meio do desenvolvimento de um conjunto de polipeptídeos de HPPD, que têm ou não têm ou apenas uma afinidade significativamente reduzida para herbicidas de inibidor de HPPD e, ao mesmo tempo, a taxa de dissociação dos herbicidas inibidores de HPPD da enzima é aumentada a tal ponto que os herbicidas inibidores de HPPD já não atuam como inibidores lentos ou de ligação lenta ou

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13/114 de ligação forte, mas, em vez disso, tornaram-se inibidores completamente reversíveis.

[028] Na presente invenção, são fornecidas composições e métodos para a obtenção de um novo conjunto de polipeptídeos de HPPD possuindo as características antes mencionadas (ou seja, nenhuma ou apenas uma afinidade significativamente reduzida para herbicidas inibidores de HPPD, aumento da taxa de dissociação dos herbicidas inibidores de HPPD da enzima, os herbicidas inibidores de HPPD não atuam mais como inibidores lentos ou de ligação lenta, de ligação forte mas se tornaram inibidores completamente reversíveis). As composições incluem polipeptídeos de HPPD e moléculas de ácido nucleico isoladas, recombinantes ou quiméricas que codificam esses polipeptídeos de HPPD, vetores e células hospedeiras compreendendo as moléculas de ácido nucleico. As composições também incluem os anticorpos para esses polipeptídeos. As sequências de nucleotídeos podem ser usadas em construtos de DNA ou cassetes de expressão para transformação e expressão em organismos, incluindo microrganismos e plantas. As sequências de nucleotídeos podem ser sequências sintéticas que foram projetadas para expressão em um organismo, incluindo, mas não limitado a um microrganismo ou uma planta.

[029] As composições incluem moléculas de ácido nucleico que codificam polipeptídeos de HPPD tolerantes a herbicidas, incluindo moléculas de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo de HPPD possuindo (a) uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 268 da SEQ ID NO: 1, (b) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, (c) uma histidina ou um ácido aspártico na posição que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1 e (d) uma serina na posição que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1 e em que o referido polipeptídeo de

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HPPD é tolerante a um ou mais herbicida (s) inibidor (es) de HPPD e, opcionalmente, uma ou mais substituições de aminoácidos adicionais nas posições que correspondem às posições de aminoácidos 213, 215, 270, 315, 340, 344, 345 da SEQ ID NO: 1, incluindo os polipeptídeos de HPPD estabelecidos em qualquer um das SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 71, bem como seus fragmentos.

[030] As composições também compreendem plantas transformadas, células vegetais, tecidos e sementes que são tolerantes aos herbicidas do inibidor de HPPD pela introdução da sequência de ácido nucleico da invenção no genoma das plantas, células vegetais, tecidos e sementes. A introdução da sequência permite que os herbicidas inibidores da HPPD sejam aplicados às plantas para eliminar de forma seletiva as ervas daninhas sensíveis aos inibidores de HPPD ou outras plantas não transformadas, mas não o organismo transformado. As sequências podem ser adicionalmente utilizadas como um marcador para seleção de células vegetais crescendo na presença de um ou mais herbicida (s) inibidor (es) de HPPD.

[031] São também fornecidos métodos para identificar polipeptídeos de HPPD com atividade de tolerância ao herbicida inibidor de HPPD.

[032] As composições e os métodos da invenção são úteis para a produção de organismos com maior tolerância aos herbicidas inibidores de HPPD. Esses organismos e composições que compreendem os organismos são desejáveis para fins agrícolas. As plantas ou sementes que compreendem a sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de HPPD de acordo com a invenção podem ser cultivadas em um campo e colhidas para obter um produto vegetal. As composições da invenção também são úteis para detectar a presença de polipeptídeos tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD ou ácidos nucleicos em produtos ou organismos.

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Breve Descrição das Figuras [033] A Figura 1 mostra um esquema simplista do ensaio de atividade de HPPD acoplada utilizado na presente invenção para determinar a atividade enzimática dos polipeptídeos de HPPD exemplares.

[034] A Figura 2 mostra mudanças cinéticas exemplificativas na absorbância a 320 nm (Abs320) em amostras de extratos brutos de polipeptídeos de HPPD de tipo selvagem e polipeptídeo de HPPD knock-out observado com 200 μΜ de HPP e 0,4 ou 13 μΜ do Composto 1 (2- cloro -3(metilsulfanil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) -4- (trifluorometil) benzamida) de acordo com o Exemplo 3 no ensaio de atividade de HPPD acoplado. O polipeptídeo de HPPD knock-out foi obtido trocando-se uma histidina por uma alanina na posição de aminoácidos que corresponde à posição 162 da SEQ ID NO: 1. Essa posição é bem conhecida pela sua importância devido ao seu envolvimento na ligação coordenada do átomo de ferro no sítio ativo do polipeptídeo de HPPD (Serre et al. (1999), Structure, 7, 977-988).

Descrição Detalhada Da Invenção [035] As presentes invenções serão agora descritas mais completamente a seguir com referência aos desenhos anexos, nos quais algumas, mas não todas as formas de realização da invenção são apresentadas. De fato, estas invenções podem ser incorporadas em muitas formas diferentes e não devem ser interpretadas como limitadas às formas de realização aqui apresentadas; em vez disso, estas formas de realização são fornecidas de modo que esta divulgação satisfaça os requisitos legais aplicáveis. Números semelhantes referem-se a elementos semelhantes por toda parte.

[036] Diversas modificações e outras formas de realização das invenções aqui apresentadas serão lembradas a um técnico no assunto a que essas invenções pertencem, tendo o benefício dos ensinamentos apresentados

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16/114 nas descrições anteriores e nos desenhos associados. Portanto, deve ser entendido que as invenções não devem ser limitadas às formas de realização específicas divulgadas e que modificações e outras formas de realização devem ser incluídas no escopo das reivindicações anexas. Embora termos específicos sejam empregados aqui, eles são usados em um sentido genérico e descritivo apenas, e não para fins de limitação.

Visão Geral [037] Vários esforços têm sido desenvolvidos para conferir às plantas um nível agronomicamente aceitável de tolerância a uma ampla gama de herbicidas inibidores de HPPD, incluindo a contornar a produção mediada por HPPD de homogentisato (US 6 812 010), superexpressar a enzima sensível de modo a produzir quantidades da enzima alvo na planta que são suficientes em relação ao herbicida (WO 96/38567), e mutar a HPPD de modo a obter uma enzima alvo que, embora mantendo as suas propriedades de catalisar a transformação de HPP em homogentisato, é menos sensível aos inibidores de HPPD do que a HPPD nativa antes da mutação.

[038] Apesar destes êxitos obtidos para o desenvolvimento de plantas que mostram tolerância a vários herbicidas inibidores da HPPD descritos acima, ainda é necessário desenvolver e/ ou melhorar a tolerância das plantas a herbicidas inibidores de HPPD mais novos ou a vários herbicidas inibidores de HPPD diferentes pertencentes a várias classes químicas, particularmente herbicidas inibidores de HPPD pertencentes às classes de tricetonas (por exemplo, benzobiciclon, sulcotriona mesotriona, tembotriona, tefuriltriona, biciclopirona, fenquinotriona), dicetonitrilas, isoxazois (por exemplo, isoxaflutol), hidroxipirazois (por exemplo, pirazoxifeno, benzofenap, pirazolinato, pirassulfotol, topramezona, tolpiroralato), N- (1,2,5- oxadiazol -3- il) benzamidas, N- (1,3,4- oxadiazol -2- il) benzamidas (por exemplo, 2- metil -N(5- metil -1,3,4- oxadiazol -2- il) -3- (metilsulfonil) -4- (trifluorometil) benzamida,

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N- (tetrazol -5- II) - ou N- (triazol -5- II) arilcarboxamidas (por exemplo, 2- cloro 3- etóxi -4- (metilsulfonil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- II) benzamida),4(difluorometil) -2- metóxi -3- (metilsulfonil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- II) benzamida); 2- cloro -3- (metilsulfanil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- II) -4(trifluorometil) benzamida (doravante também denominado “Composto 1”); 2(metóximetil) -3- (metilsulfinil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- II) -4- (trifluorometil) benzamida, derivados de piridazinona, derivados de oxoprazina, tricetonas, N(triazol -2- II) arilcarboxamidas, triazinonas e pirazolonas.

[039] Assim, a presente invenção proporciona composições e métodos melhorados para regular a tolerância ao herbicida inibidor de HPPD. Os herbicidas inibidores de HPPD, como os da classe de tricetonas (por exemplo, benzobiciclon, sulcotriona mesotriona, tembotriona, tefuriltriona, biciclopirona, fenquinotriona), dicetonitrilas, isoxazois (por exemplo, isoxaflutol), hidroxipirazois (por exemplo, pirazoxifeno, benzofenap, pirazolinato, pirassulfotol, topramezona, tolpiralato), N- (1,2,5- oxadiazol -3- II) benzamidas, N- (1,3,4- oxadiazol -2- II) benzamidas (por exemplo, 2- metil -N- (5- metil 1,3,4- oxadiazol -2- II) -3- (metilsulfonil) -4- (trifluorometil) benzamida, N(tetrazol -5- II) - ou N- (triazol -5- II) arilcarboxamidas (por exemplo, 2- cloro -3etóxi -4- (metilsulfonil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- II) benzamida, 4(difluorometil) -2- metóxi -3- (metilsulfonil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- II) benzamida; 2- cloro -3- (metilsulfanil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- II) -4(trifluorometil) benzamida (daqui em diante também denominado “Composto 1”); 2- (metóximetil) -3- (metilsulfinil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- II) -4(trifluorometil) benzamida, derivados de piridazinona, derivados de oxoprazina, N- (triazol- 2-il) arilcarboxamidas, triazinonas e pirazolonas têm uma excelente atividade herbicida contra um amplo espectro de plantas prejudiciais anuais monocotiledônicas e dicotiledônicas economicamente importantes. As substâncias ativas também atuam eficientemente em plantas daninhas perenes

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18/114 que produzem rebentos de rizomas, estoques de madeira ou outros órgãos perenes e que são difíceis de controlar. No sentido da presente invenção, “herbicida” é entendido como sendo uma substância ativa como herbicida por si só ou uma substância que é combinada com um aditivo que altera sua eficácia, como, por exemplo, um agente que aumenta sua atividade (agente sinérgico) ou que limita a sua atividade (um protetor de fitotoxicidade). O herbicida pode ainda compreender adjuvantes ou veículos sólidos ou líquidos que são normalmente utilizados em tecnologia de formulações (por exemplo, substâncias minerais naturais ou regeneradas, solventes, dispersantes, agentes umectantes, agentes de adesividade, emulsionantes, agentes promotores de crescimento e assim por diante), bem como um ou mais herbicidas adicionais e/ ou um ou mais pesticidas (por exemplo, inseticidas, virucidas, microbicidas, amebicidas, pesticidas, fungicidas, bactericidas, nematocidas, moluscicidas e assim por diante).

[040] Os métodos envolvem organismos de transformação com sequências de nucleotídeos que codificam um gene de tolerância ao herbicida inibidor de HPPD da invenção ou, de outro modo, a introdução desses genes de tolerância ao herbicida inibidor de HPPD em organismos que não os contenham (por exemplo, por cruzamento, fusão celular ou por cruzamento de organismos contendo um herbicida inibidor de HPPD introduzido gene de tolerância da invenção com organismos que não o contêm e obtenção de progênies contendo esse gene). As sequências de nucleotídeos da invenção são úteis para a preparação de plantas que mostram tolerância aumentada aos herbicidas inibidores de HPPD, particularmente aumento da tolerância aos herbicidas inibidores de HPPD da classe de tricetonas (de preferência benzobiciclon, sulcotriona, mesotriona, tembotriona, tefuriltriona, biciclopirona ou fenquinotriona), dicetonitrilas, isoxazois (de preferência isoxaflutol), hidroxipirazois (de preferência pirazoxifeno, benzofenap, pirazolinato,

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19/114 pirazulfato, topramezona ou tolpiralato), N- (1,2,5- oxadiazol -3- il) benzamidas, N- (1,3,4 - oxadiazol -2- il) benzamidas (de forma preferencial 2- metil- N- (5metil -1,3,4- oxadiazol -2- il) -3- (metilsulfoniI) -4- (trifluorometiI) benzamida, N(tetrazol -5- il) - ou N- (triazol -5- il) arilcarboxamidas (de forma preferencial, 2cloro -3- etóxi -4- (metilsulfonil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) benzamida, 4(difluorometil) -2- metóxi -3- (metilsulfonil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) benzamida; 2- cloro-3- (metilsulfanil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) -4(trifluorometil) benzamida (daqui em diante também denominado “Composto 1”); 2- (metóximetil) -3- (metilsulfinil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) -4(trifluorometil) benzamida, derivados de piridazinona, derivados de oxoprazina, N- (triazol -2- il) arilcarboxamidas, triazinonas e pirazolonas.

[041] A expressão do gene de tolerância ao herbicida inibidor de HPPD da invenção também pode resultar em tolerância em relação aos herbicidas derivados de cumarona” (descritos nos documentos WO 2009/090401, WO 2009/090402, WO 2008/071918, WO 2008/009908). A este respeito, qualquer um dos genes de tolerância ao herbicida inibidor de HPPD da invenção também pode ser expresso em uma planta expressando também um gene de homogentisato solanesiltransferase (HST) quimérico ou um gene HST mutado como descrito em WO 2011/ 145015, WO 2013/064987, WO 2013/064964, ou WO 2010/029311, para obter plantas tolerantes a herbicidas inibidores de HST. Como aqui utilizado, um “herbicida derivado de cumarona” ou “herbicida inibidor de HST” abrange compostos que se enquadram na nomenclatura IUPAC de 5H-tiopirano[4,3-b] piridin-8-ol, 5H-tiopirano[3,4b]pirazin-8-ol, oxatiino[5,6-b]piridin-4-ol e oxatino [5,6-b]pirazin-4-ol.

[042] Assim, através do gene de “tolerância ao herbicida inibidor de HPPD” da invenção, pretende-se um gene que codifica um polipeptídeo que confere a uma célula ou organismo a capacidade de tolerar uma concentração mais elevada de um herbicida inibidor de HPPD do que essa célula ou

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20/114 organismo que não expressa a proteína, ou tolerar uma certa concentração de um herbicida inibidor de HPPD por mais tempo do que essa célula ou organismo que não expressa a proteína, ou que confere a uma célula ou organismo a capacidade de realizar fotossíntese, crescer e/ ou reproduzir com menos inibição de crescimento ou dano observada do que tal célula ou organismo que não expressa tal proteína.

[043] Um polipeptídeo de tolerância a herbicidas inibidores de HPPD compreende um polipeptídeo que confere a uma célula ou organismo a capacidade de tolerar uma maior concentração de herbicidas inibidores de HPPD do que a célula ou organismo que não expressa a proteína ou tolerar uma certa concentração de herbicidas inibidores de HPPD por um período mais longo do que essa célula ou organismo que não expressa o polipeptídeo ou que confere a uma célula ou organismo a capacidade de realizar a fotossíntese, crescer e/ ou reproduzir com menos danos ou inibição de crescimento observada do que essa célula ou organismo que não expressa esse polipeptídeo.

[044] O termo polipeptídeo compreende proteínas, como enzimas, anticorpos e polipeptídeos de comprimento médio e peptídeos curtos até um comprimento de sequência de aminoácidos inferior a dez.

[045] O termo enzima significa na presente invenção qualquer polipeptídeo que catalisa a reação na qual o para- hidroxifenilpiruvato é transformado em homogentisato. Inclui enzimas que ocorrem naturalmente, bem como variantes enzimáticas e seus derivados. Também compreende qualquer fragmento de tal enzima e variantes criadas por inserção, deleção, recombinação e/ ou qualquer outro método, que leva a enzimas que diferem em sua sequência de aminoácidos da enzima que ocorre naturalmente ou das variantes enzimáticas. Também compreende moléculas de proteína com modificações pós-translacionais e/ ou químicas, por exemplo, glicosilação,

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21/114 carboxilação gama e acetilação, qualquer complexo molecular ou proteína de fusão compreendendo uma das proteínas acima mencionadas.

[046] Os termos variante de polipeptídeo ou polipeptídeo mutante significam qualquer molécula de polipeptídeo obtida por mutagênese, de preferência por mutagênese dirigida ou aleatoriamente com uma sequência de aminoácidos alterada em comparação com a respectiva sequência de tipo selvagem. Por tolerar, tolerância ou resistente entende-se sobreviver a uma aplicação específica de herbicida inibidor de HPPD, ou a capacidade de realizar funções celulares essenciais como fotossíntese, síntese de proteínas ou respiração e reprodução de uma maneira que não seja prontamente discernível de células ou organismos não tratados, ou a capacidade de não ter diferença significativa no rendimento ou mesmo rendimento melhorado para plantas tratadas com herbicida inibidor de HPPD em comparação com essas plantas não tratadas com esse herbicida (mas onde as ervas daninhas foram removidas ou impedidas por um mecanismo diferente da aplicação do herbicida inibidor de HPPD, tal como os métodos descritos em WO 2011/100302, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade).

[047] Além de conferir uma tolerância de herbicida inibidor de HPPD celular, as sequências de ácido nucleico de HPPD da invenção codificam polipeptídeos com atividade de HPPD, ou seja, catalisando a reação na qual o para-hidroxifenilpiruvato (HPP) é transformado em homogentisato. A atividade catalítica de um polipeptídeo de HPPD pode ser definida por vários métodos bem conhecidos na técnica. Os documentos WO 2009/144079 e WO 2014/043435 descrevem vários métodos de triagem adequados.

[048] A atividade enzimática dos polipeptídeos de HPPD pode ser medida por qualquer método que permita medir a diminuição da quantidade dos substratos de HPP ou 02 ou medir o acúmulo de qualquer um dos produtos derivados da reação enzimática, ou seja, homogentisato ou CO2. Em

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22/114 particular, a atividade de HPPD pode ser medida por meio do método descrito em WO 2009/144079; Garcia et al. (1997), Biochem. J. 325, 761-769; Garcia et al. (1999), Plant Physiol. 119, 1507 -1516; ou em WO 2012/021785, que estão incorporados aqui por referência.

[049] Para os propósitos da presente invenção, um polipeptídeo de HPPD de referência (ou gene HPPD que codifica esse polipeptídeo) é qualquer polipeptídeo de HPPD ou ácido nucleico com o qual o polipeptídeo de HPPD ou ácido nucleico de HPPD da invenção está sendo comparado. Para fins de descrição dos polipeptídeos de HPPD da presente invenção, os termos proteína e polipeptídeo são utilizados de forma intercambiável. Este polipeptídeo de HPPD de referência pode ser uma HPPD nativa de plantas, bactérias ou animais ou pode ser um polipeptídeo de HPPD que sofreu mutação que é conhecido na técnica, como os mutantes PÍP215L e PÍG336F descritos em WO 2009/144079 ou pode ser qualquer uma das proteínas PfHPPDevo33, PfHPPDevo36, PfHPPDevo37, PfHPPDevo40 ou PfHPPDevo41 de WO 2014/043435; PfHPPDevo41 é apresentado no presente requerimento como SEQ ID NO: 2. Esse polipeptídeo de HPPD de referência pode ser usado para determinar se o polipeptídeo de HPPD ou o ácido nucleico da invenção possui uma propriedade particular de interesse (por exemplo, tolerância ao herbicida inibidor de HPPD ou atividade enzimática do polipeptídeo de HPPD melhorada, comparável ou diminuída, expressão melhorada, comparável ou diminuída em uma célula hospedeira, estabilidade da proteína melhorada, comparável ou diminuída e similares).

[050] Em várias formas de realização aqui contidas, o polipeptídeo tolerante a herbicidas inibidores de HPPD codificado por um ácido nucleico (incluindo genes isolados, recombinantes e quiméricos dos mesmos, vetores, células hospedeiras, plantas, partes de plantas e sementes compreendendo os polipeptídeos de ácido nucleico, HPPD e suas

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23/114 composições codificadas pelo ácido nucleico, bem como os métodos de utilização do polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico para aumentar a tolerância de uma planta aos herbicidas inibidores de HPPD, particularmente aumento da tolerância aos herbicidas inibidores de HPPD da classe de tricetonas (de forma preferencial benzobiciclon, sulcotriona, mesotriona, tembotriona, tefuriltriona, biciclopirona, fenquinotriona), dicetonitrilas, isoxazois (de forma preferencial isoxaflutol), hidroxipirazois (de forma preferencial pirazoxifeno, benzofenap, pirazolinato, pirassulfotol, topramezona, tolpiralato), N- (1,2,5- oxadiazol -3- il) benzamidas, N- (1,3,4- oxadiazol -2- il) benzamidas (de forma preferencial 2- metil -N- (5- metil -1,3,4- oxadiazol -2- il) -3(metilsulfonil) -4- (trifluorometil) benzamida, N- (tetrazol -5- il) - ou N- (triazol -5il) arilcarboxamidas (de forma preferencial, 2- cloro -3- etóxi -4- (metilsulfonil) N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) benzamida, 4- (difluorometil) -2- metóxi -3(metilsulfonil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) benzamida; 2- cloro -3(metilsulfanil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) -4- (trifluorometil) benzamida (daqui em diante também denominado “Composto 1”); 2- (metóximetil) -3(metilsulfinil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) -4- (trifluorometil) benzamida), derivados de piridazinona, derivados de oxoprazina, N- (triazol- 2-il) arilcarboxamidas, triazinonas e pirazolonas) tem (a) uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 268 da SEQ ID NO: 1, (b) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1 (c) uma histidina ou um ácido aspártico na posição que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1 e (d) uma serina na posição que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1 e em que o referido polipeptídeo de HPPD é tolerante a um ou mais herbicida (s) inibidor (es) de HPPD e, opcionalmente, uma ou mais outras substituições de aminoácidos nas posições que correspondem às posições de aminoácidos 213, 215, 270, 315, 340, 344, 345 da SEQ ID NO: 1, incluindo os

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24/114 polipeptídeos de HPPD estabelecidas em qualquer das SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 71. Por correspondente entende-se a posição de nucleotídeo ou aminoácido em relação a essa posição na SEQ ID NO: 1 quando duas (ou mais) sequências são alinhadas usando algoritmos de alinhamento padrão. O termo posição em um polinucleotídeo ou polipeptídeo refere-se a bases simples específicas ou aminoácidos na sequência do polinucleotídeo ou polipeptídeo, respectivamente. O termo sítio em um polinucleotídeo ou polipeptídeo refere-se a uma determinada posição ou região na sequência do polinucleotídeo ou polipeptídeo, respectivamente. O termo polinucleotídeo corresponde a qualquer material genético de qualquer comprimento e qualquer sequência, que inclua moléculas de DNA e RNA de cadeia simples e de cadeia dupla, incluindo elementos reguladores, genes estruturais, grupos de genes, plasmídeos, genomas integrais e seus fragmentos.

[051] Em uma forma de realização, o polipeptídeo de HPPD da presente invenção (incluindo a sequência de nucleotídeos que o codifica e seus genes recombinantes e quiméricos, vetores, células hospedeiras, plantas, partes de plantas e sementes compreendendo a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de HPPD da invenção) consiste em uma sequência de aminoácidos que compreende:

a) uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 268 da SEQ ID NO: 1,

b) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1,

c) uma histidina ou um ácido aspártico na posição que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1 e

d) uma serina na posição que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1, e em que o referido polipeptídeo de HPPD é tolerante a um ou mais herbicida (s) inibidor (es) de HPPD.

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25/114 [052] Em outra forma de realização, o polipeptídeo de HPPD da presente invenção (incluindo a sequência de nucleotídeos que o codifica e seus genes recombinantes e quiméricos, vetores, células hospedeiras, plantas, partes de plantas e sementes compreendendo a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de HPPD da invenção) sendo tolerante a um ou mais herbicida (s) inibidor (es) da HPPD consiste em uma sequência de aminoácidos que compreende (a) uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 268 da SEQ ID NO: 1, (b) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, (c) uma histidina ou um ácido aspártico na posição que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1 e (d) uma serina na posição que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1, e que compreende ainda

i. uma lisina ou leucina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 213 da SEQ ID NO: 1; e / ou ii. uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 215 da SEQ ID NO: 1; e / ou iii. uma arginina, asparagina, leucina, ácido glutâmico, prolina ou serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 270 da SEQ ID NO: 1; e/ou iv. uma arginina, lisina, glutamina, metionina ou histidina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 315 da SEQ ID NO: 1; e/ou

v. uma arginina, glutamina, metionina, ácido glutâmico, glicina, leucina ou valina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; e / ou vi. uma glutamina, prolina ou arginina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 344 da SEQ ID NO: 1; e

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26/114

I ou vii. uma lisina, arginina, metionina, alanina ou valina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1.

[053] Em outra forma de realização, o polipeptídeo de HPPD da presente invenção (incluindo a sequência de nucleotídeos que o codifica e seus genes recombinantes e quiméricos, vetores, células hospedeiras, plantas, partes de plantas e sementes compreendendo a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de HPPD da invenção) sendo tolerante a um ou mais herbicida (s) inibidor (es) de HPPD consiste em uma sequência de aminoácidos que compreende:

d) uma serina na posição que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1, e que compreende ainda

i. uma leucina ou lisina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 213 da SEQ ID NO: 1; e/ ou ii. uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 215 da SEQ ID NO: 1; e / ou iii. uma asparagina, ácido glutâmico ou serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 270 da SEQ ID NO: 1; e/ ou iv. uma arginina, lisina, glutamina ou metionina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 315 da SEQ ID NO: 1;

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27/114 e/ ou

v. uma arginina ou valina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; e/ ou vi. uma glutamina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 344 da SEQ ID NO: 1; e/ ou vii. uma lisina, valina ou metionina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1.

[054] Em outra forma de realização, o polipeptídeo de HPPD da presente invenção (incluindo a sequência de nucleotídeos que o codifica e seus genes recombinantes e quiméricos, vetores, células hospedeiras, plantas, partes de plantas e sementes compreendendo a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de HPPD da invenção) sendo tolerante a um ou mais herbicida (s) inibidor (es) de HPPD consiste em uma sequência de aminoácidos que compreende:

d) uma serina na posição que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1 e que compreende ainda

i. uma lisina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 213 da SEQ ID NO: 1; e/ ou ii. uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 215 da SEQ ID NO: 1; e/ ou iii. uma asparagina, ácido glutâmico na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 270 da SEQ ID NO: 1; e/ ou

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28/114 iv. uma arginina, lisina, glutamina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 315 da SEQ ID NO: 1; e/ ou

[055] Em outra forma de realização, o polipeptídeo de HPPD da presente invenção (incluindo a sequência de nucleotídeos que o codifica e seus genes recombinantes e quiméricos, vetores, células hospedeiras, plantas, partes de plantas e sementes compreendendo a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de HPPD da invenção) sendo tolerante a um ou mais herbicida (s) inibidor (es) de HPPD consiste em uma sequência de aminoácidos que compreende:

c) uma histidina na posição que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1 e

i. uma lisina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 213 da SEQ ID NO: 1; e/ ou ii. uma asparagina, ácido glutâmico ou serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 270 da SEQ ID NO: 1, e/ ou

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29/114 iii. uma arginina, lisina, glutamina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 315 da SEQ ID NO: 1; e/ ou iv. uma valina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; e/ ou

v. uma glutamina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 344 da SEQ ID NO: 1; e/ ou vi. uma valina, lisina ou metionina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1.

[056] Em outra forma de realização, o polipeptídeo de HPPD da presente invenção (incluindo a sequência de nucleotídeos que o codifica e seus genes recombinantes e quiméricos, vetores, células hospedeiras, plantas, partes de plantas e sementes compreendendo a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de HPPD da invenção) sendo tolerante a um ou mais herbicida (s) inibidor (es) de HPPD consiste em uma sequência de aminoácidos que compreende:

(a) uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 268 da SEQ ID NO: 1, (b) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, (c) uma histidina ou um ácido aspártico na posição que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, e (d) uma serina na posição que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1, e que compreende ainda

i. uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 215 da SEQ ID NO: 1 e / ou ii. uma asparagina, ácido glutâmico ou serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 270 da SEQ ID NO: 1; e / ou

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30/114 iii. uma arginina, glutamina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 315 da SEQ ID NO: 1; e/ ou iv. uma valina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1, e / ou

v. uma glutamina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 344 da SEQ ID NO: 1 e / ou vi. uma lisina, valina ou metionina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1.

[057] Em outra forma de realização, o polipeptídeo de HPPD da presente invenção (incluindo a sequência de nucleotídeos que o codifica e seus genes recombinantes e quiméricos, vetores, células hospedeiras, plantas, partes de plantas e sementes compreendendo a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de HPPD da invenção) sendo tolerante a um ou mais herbicida (s) inibidor (es) de HPPD consiste em uma sequência de aminoácidos que compreende:

(a) uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 268 da SEQ ID NO: 1, (b) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, (c) uma histidina na posição que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, e (d) uma serina na posição que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1, e que compreende ainda

i. uma asparagina ou serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 270 da SEQ ID NO: 1;

ii. uma arginina ou glutamina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 315 da SEQ ID NO: 1;

iii. uma valina na posição de aminoácido que corresponde à

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31/114 posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1;

iv. uma glutamina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 344 da SEQ ID NO: 1, e

v. uma valina, lisina ou metionina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1.

[058] Em outra forma de realização, o polipeptídeo de HPPD da presente invenção (incluindo a sequência de nucleotídeos que o codifica e seus genes recombinantes e quiméricos, vetores, células hospedeiras, plantas, partes de plantas e sementes compreendendo a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de HPPD da invenção) sendo tolerante a um ou mais herbicida (s) inibidor (es) de HPPD consiste em uma sequência de aminoácidos que compreende:

(a) uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 268 da SEQ ID NO: 1, (b) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, (c) um ácido aspártico na posição que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1 e (d) uma serina na posição que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1, e que compreende ainda

i. uma serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 270 da SEQ ID NO: 1, ii. uma valina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1;

iii. uma glutamina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 344 da SEQ ID NO: 1, e iv. uma metionina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1.

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32/114 [059] Em outra forma de realização, o polipeptídeo de HPPD da presente invenção (incluindo a sequência de nucleotídeos que o codifica e seus genes recombinantes e quiméricos, vetores, células hospedeiras, plantas, partes de plantas e sementes compreendendo a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de HPPD da invenção) sendo tolerante a um ou mais herbicida (s) inibidor (es) de HPPD consiste em uma sequência de aminoácidos que compreende:

(a) uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 268 da SEQ ID NO: 1, (b) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, (c) um ácido aspártico na posição que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, e (d) uma serina na posição que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1, e que compreende ainda

i. uma asparagina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 270 da SEQ ID NO: 1, ii. uma valina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1;

[060] A Tabela 1 resume as respectivas posições de aminoácido em comparação com o polipeptídeo de HPPD Pseudomonas fluorescens de tipo selvagem (SEQ ID NO: 1) onde as variantes do polipeptídeo de HPPD de acordo com a invenção compreende três ou mais substituições de aminoácido. Se explicitamente apresentado de outra forma as trocas nas posições de

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33/114 aminoácidos relevantes serão sempre referidas ao polipeptídeo de HPPD Pseudomonas fluorescens do tipo selvagem correspondente à SEQ ID NO: 1.

Tabela 1: Visão geral das trocas de aminoácidos de exemplo relativas ao

POLIPEPTÍDEO DE HPPD CORRESPONDENTE À SEQ IP NO: 1

Posição de aminoácido relativa à SEQ ID NO: 1	Trocas de aminoácidos de exemplo
213	L, K
215	A
268	A
270	R, N, L, E, P, S
315	R, K, Q, Μ, H
335	P
336	D, H
337	S
340	G, R, E, V, Q, M, L
344	Q, P, R
345	V, K, M, R, A

[061] Os aminoácidos são referidos aqui com o nome do aminoácido, a abreviação de três letras ou a abreviação de uma única letra. A tabela abaixo fornece uma lista de aminoácidos padrões juntamente com as respectivas abreviações.

Alanina	A	Ala
Cisteína	C	Cys
Ácido aspártico	D	Asp
Ácido glutâmico	E	Glu
Fenilalanina	F	Phe
Glicina	G	Gly
Histidina	H	His
Isoleucina	I	lie
Lisina	K	Lys
Leucina	L	Leu
Metionina	M	Met
Asparagina	N	Asn
Prolina	P	Pro
Glutamina	Q	Gin
Arginina	R	Arg
Serina	S	Ser
Treonina	T	Thr

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Valina V Vai

Triptofan W Trp

Tirosina Y Tyr

Cisteína C Cys [062] Um técnico no assunto sabe muito bem que o código genético é degenerado, ou seja, mais do que um tripleto de códon pode codificar para o mesmo aminoácido. Portanto, as sequências de aminoácidos aqui proporcionadas, podem ser geradas por sequências alternativas que utilizam códons diferentes para codificar a mesma sequência de aminoácidos.

[063] Em outra forma de realização, os polipeptídeos de HPPD de acordo com a invenção têm pelo menos 53%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos aqui apresentada como SEQ ID NO: 1.

[064] Exemplos de sequências de HPPD que podem ser modificadas de acordo com a presente invenção incluem as de bactérias, particularmente do tipo Pseudomonas spp., mais particularmente de Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas testosteroni (Comamonas testosteroni).

[065] Para os propósitos da presente invenção, o polipeptídeo de HPPD da invenção também pode compreender modificações adicionais, por exemplo, em que alguns aminoácidos (por exemplo, 1 a 17 aminoácidos) foram substituídos, adicionados ou eliminados para fins de clonagem, para fazer uma fusão peptídica de trânsito, e semelhantes, que retém a atividade de HPPD, ou seja, a propriedade de catalisar a conversão de para- hidroxifenilpiruvato em homogentisato ou pode ser qualquer polipeptídeo de HPPD que possa ser ainda melhorado. Por exemplo, o polipeptídeo de HPPD que pode ser ainda

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35/114 melhorado pelas modificações aqui descritas pode ser o HPPD variante derivado de Pseudomonas fluorescens exposto aqui como qualquer uma das SEQ ID NOs:2a71.

[066] Em uma forma de realização preferencial, os polipeptídeos de HPPD de acordo com a presente invenção e que são tolerantes a um ou mais herbicida (s) inibidor (es) de HPPD são equivalentes à SEQ ID NO: 1 (Pseudomonas fluorescens) além dos aminoácidos substituídos de acordo com a presente invenção, ou seja, o respectivo polipeptídeo de HPPD é idêntico à SEQ ID NO: 1 mas tendo

d) uma serina na posição que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1.

[067] Em outra forma de realização preferencial, os polipeptídeos de HPPD de acordo com a presente invenção que são tolerantes a um ou mais herbicida (s) inibidor (es) de HPPD são equivalentes à SEQ ID NO: 1 (Pseudomonas fluorescens) ao lado dos aminoácidos que são substituídos de acordo com a presente invenção, ou seja, o respectivo polipeptídeo de HPPD é idêntico à SEQ ID NO: 1, mas tendo uma ou mais trocas de aminoácidos na respectiva posição de aminoácido de acordo com a Tabela 1 acima, com a condição de que exista uma alanina na posição 268 da SEQ ID NO: 1, exista uma prolina na posição 335 da SEQ ID NO: 1, exista uma histidina ou um ácido aspártico na posição 336 da SEQ ID NO: 1 e exista uma serina na posição 337 da SEQ ID NO: 1.

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36/114 [068] Em uma outra forma de realização preferencial, os polipeptídeos de HPPD de acordo com a presente invenção sendo tolerantes a um ou mais herbicida (s) inibidor (es) de HPPD são equivalentes à SEQ ID NO: 1 (Pseudomonas fluorescens) ao lado dos aminoácidos que são substituídos de acordo com a presente invenção, ou seja, o respectivo polipeptídeo de HPPD é idêntico à SEQ ID NO: 1, mas tendo trocas de aminoácidos nas respectivas posições de aminoácidos como definido na Tabela 2 (abaixo).

[069] Em algumas formas de realização, a sequência de nucleotídeos da invenção (incluindo genes isolados, recombinantes e quiméricos, vetores, células hospedeiras, plantas, partes de plantas e sementes compreendendo a sequência de ácido nucleico, as sequências de aminoácidos e suas composições codificadas pela sequência de ácido nucleico, bem como métodos de utilização da sequência de ácido nucleico para aumentar a tolerância de uma planta aos herbicidas inibidores de HPPD, particularmente aumento da tolerância aos herbicidas inibidores de HPPD da classe de tricetonas (de forma preferencial benzobiciclon, sulcotriona, mesotriona, tembotriona, tefuriltriona, biciclopirona, fenquinotriona), dicetonitrilas, isoxazois (de forma preferencial isoxaflutol), hidroxipirazois (de forma preferencial pirazoxifeno, benzofenap, pirazolinato, pirassulfotol, topramezona, tolpiralato), N- (1,2,5- oxadiazol -3- il) benzamidas, N- (1,3,4oxadiazol -2- il) benzamidas (de forma preferencial 2- metil -N- (5- metil -1,3,4oxadiazol -2- il) -3- (metilsulfonil) -4- (trifluorometil) benzamida, N- (tetrazol -5il) - ou N- (triazol -5- il) arilcarboxamidas (de forma preferencial, 2- cloro -3etóxi -4- (metilsulfonil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) benzamida, 4(difluorometil) -2- metóxi -3- (metilsulfonil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) benzamida; 2- cloro -3- (metilsulfanil) -N- (1- metil-1H- tetrazol -5- il) -4(trifluorometil) benzamida (daqui em diante também denominado “Composto 1”); 2- (metoximetil) -3- (metilsulfinil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) -4

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37/114 (trifluorometil) benzamida, derivados de piridazinona, derivados de oxoprazina, N- (triazol -2- il) arilcarboxamidas, triazinonas e pirazolonas codificam a sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer urn das SEQ ID NOs: 2 a 71 e fragmentos e suas variantes que codificam um polipeptídeo de tolerância a herbicidas inibidores de HPPD.

A. Métodos para Medir a Tolerância ao Inibidor de HPPD [070] Qualquer método adequado para medir a tolerância a herbicidas inibidores de HPPD pode ser usado para avaliar os polipeptídeos de HPPD da invenção. A tolerância pode ser medida monitorando a capacidade de uma célula ou organismo de sobreviver a uma aplicação específica de herbicida inibidor de HPPD, ou a capacidade de realizar funções celulares essenciais como fotossíntese, síntese proteica ou respiração e reprodução de uma maneira que não seja prontamente discernível das células ou organismos não tratados, ou a capacidade de não ter diferenças significativas no rendimento ou mesmo rendimento melhorado para plantas tratadas com herbicida inibidor de HPPD em comparação com essas plantas não tratadas com esse herbicida (mas onde as ervas daninhas foram removidas ou impedidas por um mecanismo diferente da aplicação do herbicida inibidor de HPPD). Em algumas formas de realização, a tolerância pode ser medida de acordo com um fenótipo indicador visível da célula ou organismo transformado com um ácido nucleico compreendendo o gene que codifica para o respectivo polipeptídeo de HPPD, ou em um ensaio in vitro do polipeptídeo de HPPD, na presença de diferentes concentrações dos vários herbicidas inibidores da HPPD. Respostas à dose e mudanças relativas nas respostas à dose associadas a estes fenótipos indicadores (formação de cor castanha, inibição do crescimento, branqueamento, efeito herbicida etc.) são convenientemente expressas em termos, por exemplo, de valores GR50 (concentração para 50% de redução do crescimento) ou MIC (concentração inibitória mínima) em que

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38/114 aumentos nos valores correspondem a aumentos na tolerância inerente ao polipeptídeo de HPPD expressado, da maneira normal, com base em danos às plantas, sintomas de branqueamento meristemáticos etc. em uma faixa de diferentes concentrações de herbicidas. Esses dados podem ser expressos em termos de, por exemplo, valores de GR50 derivados de curvas de dose/ resposta com “dose” plotada no eixo x e “porcentagem de morte”, “efeito herbicida”, “número de plantas verdes emergentes” etc. plotado no eixo y, onde os valores aumentados de GR50 correspondem a níveis aumentados de tolerância inerente ao polipeptídeo de HPPD expressado. Os herbicidas podem ser aplicados adequadamente pré-emergência ou pós-emergência [071] Em várias formas de realização, o nível de tolerância do ácido nucleico ou gene que codifica um polipeptídeo de HPPD de acordo com a invenção ou o polipeptídeo de HPPD da invenção pode ser triado por transgênese, regeneração, reprodução e teste por pulverização de uma planta de teste tal como planta de fumo ou uma planta de cultura, como soja, milho ou algodoeiro. De acordo com os resultados obtidos por tal triagem, essas plantas são mais tolerantes, desejavelmente tolerantes a pelo menos 2 vezes a dose normal recomendada para aplicações de campo, ainda de forma mais preferencial tolerante até 4 vezes a dose normal recomendada para aplicações de campo, a herbicidas inibidores de HPPD (por exemplo, herbicidas inibidores de HPPD da classe de tricetonas (de preferência benzobiciclon, sulcotriona, mesotriona, tembotriona, tefuriltriona, biciclopirona, fenquinotriona), dicetonitrilas, isoxazois (de preferência isoxaflutol), hidroxipirazois (de preferência pirazoxifeno, benzofenap, pirazolinato, pirassulfotol, topramezona, tolpiraxato), N- (1,2,5- oxadiazol -3- il) benzamidas, N- (1,3,4- oxadiazol -2- il) benzamidas (de preferência 2- metil -N- (5- metil -1, 3,4- oxadiazol -2- il) -3(metilsulfonil) -4- (trifluorometil) benzamida, N- (tetrazol- 5-il) - ou N- (triazol -5il) arilcarboxamidas (de forma preferencial, 2- cloro -3- etóxi -4- (metilsulfonil)

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N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) benzamida, 4- (difluorometil) -2- metóxi -3(metilsulfonil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) benzamida; 2- cloro -3(metilsulfanil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) -4- (trifluorometil) benzamida (daqui em diante também denominado “Composto 1”); 2- (metoximetil) -3(metilsulfinil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) -4- (trifluorometil) benzamida, derivados de piridazinona, derivados de oxoprazina, N- (triazol -2- il) arilcarboxamidas, triazinonas e pirazolonas do que as plantas que não contêm nenhum gene exógeno que codifica um polipeptídeo de HPPD ou do que plantas que contenham um gene que compreende um polipeptídeo de HPPD de referência que codifica o DNA, por exemplo, um DNA que codifica HPPD de Pseudomonas fluorescens, sob o controle do mesmo promotor que o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de HPPD da presente invenção. Portanto, a expressão capaz de aumentar a tolerância de uma planta a pelo menos um herbicida que atua na HPPD denota uma tolerância da planta que expressa a HPPD da invenção para pelo menos 1x, 2x ou 3x ou 4x ou mais a dose de campo normal do herbicida inibidor de HPPD em comparação com uma planta que apenas expressa sua HPPD endógena ou uma planta que expressa um polipeptídeo de HPPD de referência. A esse respeito, a expressão herbicida que atua na HPPD não se limita a substâncias que são conhecidas e/ ou utilizadas como herbicidas, mas a quaisquer substâncias que inibam a atividade catalítica de polipeptídeos de HPPD.

[072] A expressão tolerância a herbicidas, tolerância ao inibidor ou insensibilidade ao inibidor significa também a capacidade de uma enzima realizar sua respectiva reação catalítica na presença de um inibidor/herbicida ou após exposição a um inibidor/herbicida. A tolerância ao herbicida das enzimas, ou seja, sua capacidade de resistir ao efeito inibidor do herbicida, pode ser expressada de forma qualitativa e quantitativa. Qualitativamente, as enzimas que toleram diferentes entidades ou mesmo

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40/114 diferentes classes de inibidores têm uma alta tolerância e vice-versa. Em termos quantitativos, a tolerância de uma enzima em comparação com um herbicida pode ser expressa como a atividade residual ou reatividade residual observada em uma amostra desta enzima calculada como proporção de atividades (k_app, medida cinética) ou rotatividade total do substrato (mudança de sinal, medição de ponto final) na ausência e presença de um inibidor (Bergmeyer, HU: Methods of enzimatic analysis, 1974). Em várias formas de realização, para a determinação da atividade residual, a constante cinética aparente (k_app) da conversão de substrato determinada pode ser medida como alterações cinéticas na absorvência a 320 nm em um ensaio acoplado, desde que o homogentisato (HGA) formado por HPPD a partir de HPP seja convertido diretamente na molécula absorvente de maleilacetoacetato (MAA) por meio de uma segunda enzima homogentisato dioxigenase (HGD), aplicada em excesso uniformemente em todos os ensaios. A proporção k_cat/kM de uma atividade enzimática é proporcional à constante cinética k_app aparente e é proporcional a k_cat/kM *[E] ([E] = concentração de enzima). Um inibidor competitivo exibe um aumento aparente em kM e, dessa forma, uma diminuição recíproca em k_app a concentrações de substrato sem saturação. Como ambas as medições k_app na presença e na ausência do inibidor são realizadas pelo uso de amostra de enzima idêntica, bruta ou purificada e, dessa forma, na mesma concentração de enzima, os eliminados da concentração de enzima do cálculo de atividade residual e a proporção de k_app indicam diretamente a mudança de kM devido à inibição. Deve-se notar que este conceito se aplica aos pares enzima/inibidor que interagem de maneira de “inibição competitiva”, provavelmente correta para quase todas as variantes de polipeptídeos e inibidores descritos. O ki constante de inibição para uma enzima e o respectivo inibidor descreve a resistência de ligação do inibidor a essa enzima. Uma tolerância maior é dada para proporções de 1,5, 2, 3, 4, 5,

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7, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 ou superior e comparada com uma sequência de HPPD de referência em presença ou ausência de qualquer respectivo herbicida inibidor de HPPD.

[073] Um tipo de ensaio específico, embora não limitative, que pode ser utilizado para avaliar as sequências do polipeptídeo de HPPD da invenção é um ensaio colorimétrico (como descrito, por exemplo, consulte US 6.768.044). Neste ensaio, por exemplo, as células de E. coli contendo o vetor pSE420-HPPDx (HPPDx significa qualquer codificação genética para um polipeptídeo de HPPD putativo; o vetor básico pSE420 foi obtido de Invitrogen Karlsruhe, Alemanha) ou uma versão modificada de pSE420 (pSE420 (RI)NX) HPPDx estão produzindo pigmentos solúveis semelhantes a melanina a partir do catabolismo de tirosina quando o polipeptídeo de HPPD sobre-expressado está ativo. Esses pigmentos semelhantes a melanina são ensaiados em uma cultura líquida ou aplicando cultura de E. coli em ágar sólido do tipo líquido LB. Após 16 horas a 8 dias a 20-30 ^SC, o meio de cultura ou os poços de ágar que foram inoculados com uma cultura de E. coli contendo o vetor vazio pSE420 não alteram a cor do meio ou aqueles que foram semeados com uma cultura de E. coli contendo um vetor pSE420-HPPDx contendo um gene que codifica para uma HPPD inativa também não altera a cor do meio, enquanto os poços inoculados com uma cultura de E. coli contendo o vetor pSE420-HPPDx que codifica para uma HPPD ativa são acastanhadas. Na presença de um herbicida inibidor de HPPD, esta produção de pigmento pode ser inibida e a cultura não alterará a cor do meio, a menos que um polipeptídeo de HPPD tolerante a herbicidas inibidores HPPD seja expressado e ativo. Foi demonstrado anteriormente que este teste reflete a atividade de HPPD e a tolerância ao herbicida inibidor de HPPD, independentemente da origem dessa atividade, e permite a identificação de atividades de HPPD (US 6.768.044), ou seja, em um nível qualitativo.

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B. Métodos de Introdução de Mutações em Sequências de HPPD [074] Nos polipeptídeos de HPPD que sofreram mutação codificados pelo ácido nucleico da invenção, pelo menos três aminoácidos foram substituídos como definido acima.

[075] A substituição pode ser efetuada na sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de HPPD de referência como definida acima por qualquer meio que seja apropriado para substituir, na referida sequência, o códon que codifica o aminoácido a ser substituído com o códon que corresponde ao aminoácido que o substituirá, sendo os referidos códons amplamente descritos na literatura e bem conhecidos do técnico no assunto.

[076] Vários métodos biológicos moleculares podem ser usados para alcançar essa substituição. Um método útil para preparar uma sequência de ácido nucleico mutada de acordo com a invenção e a proteína correspondente compreende a realização de mutagênese sítio-dirigida em códons codificando um ou mais aminoácidos que são previamente selecionados. Os métodos para obter estas mutações sítio-dirigida são bem conhecidos do técnico no assunto e amplamente descritos na literatura (em particular: Directed Mutagenesis: A Practical Approach, 1991, editado por M.J. McPHERSON, IRL PRESS), ou são métodos para os quais é possível empregar kits comerciais (por exemplo, o kit de mutagênese por clareamento QUIKCHANGE™ da Qiagen ou Stratagene). Após a mutagênese sítio-dirigida, é útil selecionar as células que contêm uma HPPD mutada que é menos sensível a um inibidor de HPPD utilizando um auxiliar de triagem apropriado. Métodos de triagem apropriados para conseguir isto foram descritos acima.

[077] Como alternativa, uma sequência de DNA que codifica o polipeptídeo de HPPD de referência pode ser modificada in silico para codificar um polipeptídeo de HPPD possuindo uma ou mais das substituições aqui citadas e depois sintetizado novamente. Este método também é bem

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43/114 conhecido na técnica, descrito na literatura. A sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de HPPD que sofreu mutação pode ser introduzida em uma célula hospedeira como descrito neste documento.

C. Polinucleotídeos Isolados e suas Variantes e Fragmentos [078] Em algumas formas de realização, a presente invenção compreende polinucleotídeos isolados ou recombinantes. O termo polinucleotídeo corresponde a qualquer material genético de qualquer comprimento e qualquer sequência, que inclua moléculas de DNA e RNA de cadeia simples e de cadeia dupla, incluindo elementos reguladores, genes estruturais, grupos de genes, plasmídeos, genomas integrais e seus fragmentos. Um polinucleotídeo ou polipeptídeo/proteína recombinante ou sua porção biologicamente ativa, como aqui definido, não está mais presente no organismo nativo original, tal como quando contido em uma célula hospedeira heteróloga ou em uma célula vegetal, semente ou planta transgênica. Em uma forma de realização, um polinucleotídeo recombinante está livre de sequências (por exemplo, sequências codificadoras ou reguladoras de proteína) que flanqueiam naturalmente o ácido nucleico (ou seja, sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucleico) no DNA genômico de o organismo do qual o polinucleotídeo é derivado. O termo recombinante engloba polinucleotídeos ou polipeptídeos que foram manipulados em relação ao polinucleotídeo ou polipeptídeo nativo, de forma que o polinucleotídeo ou o polinucleotídeo difere (por exemplo, na composição ou estrutura química) do que está ocorrendo na natureza. Em outra forma de realização, um polinucleotídeo recombinante está livre de sequências internas (ou seja, introns) que ocorrem naturalmente no DNA genômico do organismo a partir do qual o polinucleotídeo é derivado. Um exemplo típico desse polinucleotídeo é o chamado DNA complementar (cDNA). Por exemplo, em várias formas de realização, o polinucleotídeo de codificação de tolerância a

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44/114 herbicidas inibidores de HPPD isolado pode conter menos de cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de sequência de nucleotídeos que flanqueia naturalmente o polinucleotídeo em DNA genômico da célula a partir da qual o polinucleotídeo é derivado. As moléculas de ácido nucleico da invenção incluem aquelas que codificam a HPPD da invenção. Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucleico da invenção está ligada de forma operacional a um promotor capaz de direcionar a expressão da molécula de ácido nucleico em uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula hospedeira da planta ou uma célula hospedeira bacteriana).

[079] A presente invenção contempla ainda variantes e fragmentos de exemplo de qualquer sequência de ácido nucleico que codifique as sequências de aminoácidos apresentadas em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2 a 71. Um fragmento de um polinucleotídeo pode codificar uma porção biologicamente ativa de um polinucleotídeo, ou pode ser um fragmento que pode ser utilizado como uma sonda de hibridização ou iniciador de PCR utilizando métodos aqui descritos. Os polinucleotídeos que são fragmentos de um polinucleotídeo compreendem pelo menos cerca de 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 nucleotídeos contíguos ou até o número de nucleotídeos presentes em um polinucleotídeo completo aqui divulgado dependendo do uso pretendido (por exemplo, um ácido nucleico de HPPD aqui descrito). Por nucleotídeos contíguos entendem-se os resíduos de nucleotídeos imediatamente adjacentes entre si.

[080] Os fragmentos dos polinucleotídeos da presente invenção de forma geral codificarão fragmentos de polipeptídeos que reterão a atividade biológica da proteína de tolerância ao herbicida inibidor de HPPD de comprimento completo; ou seja, atividade de tolerância ao herbicida. Por retém a atividade de tolerância ao herbicida entende-se que o fragmento

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45/114 tenha pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 110%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, pelo menos cerca de 300% ou mais da atividade de tolerância ao herbicida da proteína de tolerância ao herbicida inibidor de HPPD completo aqui revelado como SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 71. Os métodos para medir a atividade de tolerância ao herbicida são bem conhecidos na técnica e aqui são descritos métodos de exemplo. Em um exemplo não limitativo, um fragmento da invenção será tolerante à mesma dose de um herbicida inibidor de HPPD, ou tolerante a uma dose de 1x, 2x, 3x, 4x ou mais de um herbicida inibidor de HPPD ou os fragmentos serão como ou mais tolerante com base em ki entre o fragmento e SEQ ID NOs: 2 a 71.

[081] Um fragmento de um polinucleotídeo que codifica uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo da invenção codificará pelo menos cerca de 150, 175, 200, 250, 300, 350 aminoácidos contíguos ou até o número total de aminoácidos presentes em um polipeptídeo completo da invenção. Em um exemplo não limitativo, um fragmento de um polinucleotídeo que codifica uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo de HPPD tendo (a) uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 268 da SEQ ID NO: 1, (b) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1 e (c) uma histidina ou um ácido aspártico na posição que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1 e (d) uma serina na posição que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1 e, opcionalmente, uma ou mais substituições de aminoácidos adicionais nas posições que correspondem às posições de aminoácidos 213, 215, 270, 315, 340, 344, 345 da SEQ ID NO: 1, incluindo o polipeptídeo de HPPD apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2 a 71.

[082] A invenção também abrange polinucleotídeo variantes

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46/114 conforme descrito supra. “Variantes” do polinucleotídeo também incluem aquelas sequências que codificam a HPPD da invenção, mas que diferem moderadamente devido à degenerescência do código genético, bem como aquelas que são suficientemente idênticas. As variantes da presente invenção reterão a atividade do polipeptídeo de HPPD e a tolerância ao herbicida inibidor de HPPD. O termo suficientemente idêntico destina-se a uma sequência polipeptídica ou polinucleotídica que tenha pelo menos cerca de 53%, pelo menos cerca de 60% ou 65% de identidade de sequência, cerca de 70% ou 75% de identidade de sequência, cerca de 80% ou 85% de identidade de sequência, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência em comparação com uma sequência de referência usando um dos programas de alinhamento usando parâmetros padrão. Um técnico no assunto reconhecerá que estes valores podem ser apropriadamente ajustados para determinar a identidade correspondente de polipeptídeos codificados por dois polinucleotídeos levando em consideração a degenerescência de códons, a similaridade de aminoácidos, o posicionamento do quadro de leitura e semelhantes.

[083] Os genes bacterianos possuem, muitas vezes, múltiplos códons de iniciação de metionina nas proximidades do início do quadro de leitura aberto. Muitas vezes, o início da tradução em um ou mais desses códons de iniciação levará à geração de uma proteína funcional. Estes códons de iniciação podem incluir códons ATG. No entanto, bactérias tais como Bacillus sp. também reconhecem o códon GTG como um códon de iniciação e as proteínas que iniciam a tradução nos códons GTG contêm uma metionina no primeiro aminoácido. Além disso, não é frequentemente determinado a priori quais destes códons são utilizados naturalmente na bactéria. Assim, entendese que o uso de um dos códons alternativos de metionina pode levar à geração de variantes que conferem tolerância ao herbicida. Estas proteínas de

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47/114 tolerância a herbicidas estão abrangidas na presente invenção e podem ser utilizadas nos métodos da presente invenção. Variantes alélicas de ocorrência natural podem ser identificadas com o uso de técnicas bem conhecidas de biologia molecular, tais como reação em cadeia da polimerase (PCR) e técnicas de hibridização, conforme descrito abaixo. Os polinucleotídeos variantes incluem também polinucleotídeos derivados sinteticamente que foram gerados, por exemplo, utilizando estratégias de mutagênese sítio-dirigida ou outras, mas que ainda codificam o polipeptídeo que possui a atividade biológica desejada.

[084] O técnico no assunto perceberá ainda que as mudanças podem ser introduzidas por uma mutação adicional dos polinucleotídeos da invenção, levando a mudanças adicionais na sequência de aminoácidos dos polipeptídeos codificados, sem alterar a atividade biológica dos polipeptídeos. Assim, os polinucleotídeos isolados variantes podem ser criados por introdução de uma ou mais substituições, adições ou deleções de nucleotídeos adicionais no polinucleotídeo correspondente que codifica a HPPD da invenção, de forma que 3-5, 1 -7, 1-9,1 -11,1-13,1 -15 ou 1 -17 substituições, adições ou deleções de aminoácidos ou 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 17 substituições, adições ou deleções de aminoácidos, sejam introduzidas no polipeptídeo codificado. Outras mutações podem ser introduzidas por técnicas padrão, como mutagênese sítio-dirigida e mutagênese mediada por PCR ou técnicas de embaralhamento genético. Esses polinucleotídeos variantes também são abrangidos pela presente invenção.

[085] Os polinucleotídeos variantes podem ser produzidos através da introdução aleatória de mutações ao longo de toda ou parte da sequência codificadora, tal como por mutagênese por saturação ou mutagênese permutacional, e os mutantes resultantes podem ser triados quanto à capacidade de conferir atividade de tolerância a herbicida para

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48/114 identificar mutantes que retêm atividade.

[086] Métodos adicionais para gerar variantes incluem submeter uma célula que expressa uma proteína aqui descrita (ou sua biblioteca) a uma condição específica que cria um estresse para a atividade da proteína. As condições específicas podem incluir (mas não se limitando a) mudanças na temperatura, alterações no pH, alterações nas concentrações de substratos ou inibidores e alterações na composição do tampão ou suas concentrações. A biblioteca de proteínas pode ser submetida a essas condições durante o tempo de expressão da proteína (por exemplo, em E. coli ou outro hospedeiro) ou após a criação de um extrato de proteína ou após a purificação da proteína.

[087] A atividade funcional ou enzimática da biblioteca de proteína que foi submetida a uma condição de estresse pode então ser comparada com a proteína de referência para identificar proteínas com propriedades melhoradas. Essa comparação de atividade pode ser realizada como parte de uma triagem de crescimento ou, de forma alternativa, como parte de um ensaio enzimático que quantifica a atividade da proteína. As propriedades que podem ser identificadas como melhoradas podem incluir tolerância ao herbicida inibidor de HPPD, alterações nas constantes cinéticas (incluindo KM, Ki, kcat), estabilidade da proteína, termoestabilidade da proteica ou temperatura da proteína e pH ideal.

D. Proteínas Isoladas e suas Variantes e Fragmentos [088] Os polipeptídeos de tolerância a herbicidas estão também abrangidos na presente invenção. Um polipeptídeo de tolerância a herbicida inclui preparações de polipeptídeos possuindo menos de cerca de 30%, 20%, 10% ou 5% (em peso seco) de polipeptídeo de tolerância não herbicida (também aqui referido como uma “proteína contaminante”). Na presente invenção, “proteína de tolerância a herbicida” é um polipeptídeo de HPPD aqui divulgado. Fragmentos, porções biologicamente ativas, e suas variantes

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49/114 também são fornecidos e podem ser usados para praticar os métodos da presente invenção.

[089] “Fragmentos” ou “porções biologicamente ativas” incluem fragmentos polipeptídicos compreendendo uma porção de uma sequência de aminoácidos que codifica uma proteína de tolerância a herbicidas e que retém a atividade de tolerância a herbicidas. Uma porção biologicamente ativa de uma proteína de tolerância a herbicida pode ser um polipeptídeo que tem, por exemplo, 10, 25, 50, 100 ou mais aminoácidos de comprimento. Tais porções biologicamente ativas podem ser preparadas por técnicas recombinantes e avaliadas quanto à atividade de tolerância a herbicidas.

[090] Por variantes entende-se proteínas ou polipeptídeos que têm uma sequência de aminoácidos que seja pelo menos cerca de 53%, 60%, 65%, cerca de 70%, 75%, cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticos a quaisquer das SEQ ID NOs: 2 a 71 de exemplo, em que a referida variante possui atividade do polipeptídeo de HPPD e tolerância ao herbicida inibidor de HPPD. Um técnico no assunto reconhecerá que estes valores podem ser apropriadamente ajustados para determinar a identidade correspondente de polipeptídeos codificados por dois polinucleotídeos levando em consideração a degenerescência de códons, a similaridade de aminoácidos, o posicionamento do quadro de leitura e semelhantes.

[091] Por exemplo, substituições de aminoácidos conservatives podem ser feitas em um ou mais resíduos de aminoácidos não essenciais. Um resíduo de aminoácido “não essencial” é um resíduo que pode ser alterado a partir da sequência de referência de um polipeptídeo sem alterar a atividade biológica, enquanto um resíduo de aminoácido “essencial” é necessário para a atividade biológica. Uma “substituição de aminoácidos conservative” é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido

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50/114 com uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). As substituições de aminoácidos podem ser feitas em regiões não conservadas que retêm a função. Em geral, tais substituições não seriam feitas para resíduos de aminoácidos conservados, ou para resíduos de aminoácidos que residem dentro de um motivo conservado, onde tais resíduos são essenciais para a atividade polipeptídica. No entanto, um técnico no assunto compreenderá que variantes funcionais podem ter pequenas alterações conservadas ou não conservadas nos resíduos conservados.

[092] Anticorpos para a HPPD da presente invenção, ou para variantes ou fragmentos da mesma, são também abrangidos. Os métodos para a produção de anticorpos são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Patente US 4 196 265).

[093] Assim, um aspecto da invenção refere-se a anticorpos, moléculas de ligação ao antígeno de cadeia simples ou outras proteínas que se ligam especificamente a uma ou mais das moléculas proteicas ou peptídicas da invenção e seus homólogos, fusões ou fragmentos. Em uma forma de realização particularmente preferida, o anticorpo liga-se especificamente a uma proteína possuindo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2

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51/114 a SEQ ID NO: 71 ou seu fragmento.

[094] Os anticorpos da invenção podem ser utilizados para detectar quantitativa ou qualitativamente as moléculas proteicas ou peptídicas da invenção ou para detectar modificações pós-tradução das proteínas. Como aqui utilizado, um anticorpo ou peptídeo é dito “ligar-se especificamente” a uma molécula proteica ou peptídica da invenção se essa ligação não for competitivamente inibida pela presença de moléculas não relacionadas.

E. Empilhamento de Genes [095] Na produção comercial de culturas, é desejável eliminar plantas indesejáveis (ou seja, “ervas daninhas”) sob gestão pesticida fiável de um campo de plantas de cultura. Um tratamento ideal seria aquele que podería ser aplicado a um campo inteiro, mas que eliminaria apenas as plantas indesejáveis, deixando inalteradas as plantas de cultura. Um desses sistemas de tratamento envolvería o uso de plantas de cultura que são tolerantes a um herbicida, de modo que quando o herbicida é pulverizado em um campo de plantas de cultura tolerantes a herbicidas, as plantas de cultura continuariam a crescer enquanto as ervas daninhas não tolerantes a herbicidas seriam mortas ou gravemente danificadas. Idealmente, esses sistemas de tratamento tirariam proveito de propriedades herbicidas variadas, de modo que o controle de ervas daninhas pudesse fornecer a melhor combinação possível de flexibilidade e economia. Por exemplo, os herbicidas individuais têm longevidades diferentes no campo, e alguns herbicidas persistem e são eficazes por um tempo relativamente longo após serem aplicados a um campo, enquanto outros herbicidas são rapidamente decompostos em outros compostos e/ ou compostos não ativos. Um sistema de tratamento ideal permitiría o uso de diferentes herbicidas para que os produtores pudessem adaptar a escolha de herbicidas para uma situação particular.

[096] Embora várias plantas de culturas tolerantes a herbicidas

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52/114 estejam atualmente comercialmente disponíveis, um problema que surgiu para muitos herbicidas comerciais e combinações herbicidas/ culturas é que os herbicidas individuais normalmente têm um espectro incompleto de atividade contra espécies comuns de ervas daninhas. Para a maioria dos herbicidas individuais em uso há algum tempo, populações de espécies e biótipos de ervas daninhas resistentes a herbicidas tornaram-se mais prevalentes (ver, por exemplo, Tranel e Wright (2002) Weed Science 50: 700-712; Owen e Zelaya (2005) Pest Manag. Sci. 61: 301-311). As plantas transgênicas que são tolerantes a mais do que um herbicida foram descritas (ver, por exemplo, WO 2005/012515). No entanto, melhorias em todos os aspectos da produção agrícola, opções de controle de ervas daninhas, extensão do controle residual de ervas daninhas e melhoria no rendimento das culturas estão continuamente em demanda.

[097] A sequência de nucleotídeos ou proteína HPPD da invenção é vantajosamente combinada em plantas com outros genes que codificam proteínas ou RNAs que conferem propriedades agronômicas úteis a essas plantas. Entre os genes que codificam proteínas ou RNAs que conferem propriedades agronômicas úteis nas plantas transformadas, pode-se mencionar as sequências de DNA que codificam proteínas que conferem tolerância a um ou mais herbicidas que, de acordo com sua estrutura química, diferem dos herbicidas inibidores de HPPD, e outros que conferem tolerância a certos insetos, aqueles que conferem tolerância a certas doenças, DNAs que codificam RNAs que fornecem controle de nematóides ou insetos, e assim por diante. Tais genes são descritos, em particular, nos Pedidos de Patente PCT publicados WO 91/02071 e WO 95/06128 e nas Patentes US 7 923 602 e Publicação do Pedido de Patente US 20100166723, cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

[098] Entre as sequências de DNA que codificam proteínas que

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53/114 conferem tolerância a certos herbicidas nas células vegetais e plantas transformadas, pode-se mencionar um gene bar ou PAT ou o gene de Streptomyces coelicolor descrito em WO 2009/152359 que confere tolerância a herbicidas glufosinato, um gene codificando uma EPSPS adequada que confere tolerância aos herbicidas tendo EPSPS como alvo, tal como glifosato e seus sais (US 4 535 060, US 4 769 061, US 5 094 945, US 4 940 835, US 5 188 642, US 4 971 908, US 5 145 783, US 5 310 667, US 5 312 910, US 5 627 061, US 5 633 435), um gene que codifica a glifosato-n-acetiltransferase (por exemplo, US 8 222 489, US 8 088 972, US 8 044 261, US 8 021 857, US 8 008 547, US 7 999 152, US 7 998 703, US 7 863 503, US 7 714 188, US 7 709 702, US 7 666 644, US 7 666 643, US 7 531 339, US 7 527 955 e US 7 405 074), ou um gene que codifica a glifosato oxidoredutase (por exemplo, US 5 463 175).

[099] Entre as sequências de DNA que codificam uma EPSPS adequada que confere tolerância aos herbicidas que têm EPSPS como alvo, será mencionado mais particularmente o gene que codifica a EPSPS de uma planta, em particular a EPSPS de milho, particularmente a EPSPS de milho que compreende duas mutações, particularmente uma mutação na posição de aminoácido 102 e uma mutação na posição de aminoácido 106 (WO 2004/074443), e que está descrito no Pedido de Patente US 6566587, daqui em diante denominada EPSPS de milho duplo mutante ou 2mEPSPS, ou o gene que codifica uma EPSPS isolada de Agrobacterium e que é descrito pela sequência ID NO: 2 e sequência ID NO: 3 da Patente US 5 633 435, também denominada CP4.

[0100] Entre as sequências de DNA que codificam uma EPSPS adequada que confere tolerância aos herbicidas que têm EPSPS como alvo, será feita menção mais particularmente ao gene que codifica uma EPSPS GRG23 de Arthrobacter globiformis, mas também aos mutantes GRG23 ACE1, GRG23 ACE2 ou GRG23 ACE3, particularmente os mutantes ou variantes de

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GRG23 como descrito em WO 2008/100353, como GRG23(ace3)R173K da SEQ ID NO: 29 em WO 2008/100353.

[0101] No caso das sequências de DNA que codificam EPSPS, e mais particularmente que codificam os genes acima, a sequência que codifica estas enzimas é vantajosamente precedida por uma sequência que codifica um peptídeo de trânsito, em particular o “peptídeo de trânsito otimizado” descrito na patente US 5 510 471 ou US 5 633 448.

[0102] Características de tolerância a herbicidas exemplificativas que podem ser combinadas com a sequência de ácidos nucleicos da invenção incluem ainda pelo menos um inibidor de ALS (acetolactato sintase) (WO 2007/024782); um gene ALS/AHAS de Arabidopsis mutado (Patente US 6 855 533); genes que codificam 2,4-D-monooxigenases que conferem tolerância ao 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) por metabolização (Patente US 6 153 401); e genes que codificam Dicamba monooxigenases conferindo tolerância ao dicamba (ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzóico) por metabolização (US 2008/0119361 e US 2008/0120739).

[0103] Em várias formas de realização, a HPPD da invenção é empilhada com um ou mais genes tolerantes a herbicidas, incluindo um ou mais genes tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD adicionais, e/ ou um ou mais genes tolerantes a glifosato e/ ou glufosinato. Em uma forma de realização, a HPPD da invenção é combinada com 2mEPSPS e bar.

[0104] Entre as sequências de DNA que codificam proteínas relativas a propriedades de tolerância a insetos, será feita menção mais particularmente às proteínas Bt amplamente descritas na literatura e bem conhecidas dos técnicos no assunto. Também será feita menção a proteínas extraídas de bactérias como Photorhabdus (WO 97/17432 e WO 98/08932).

[0105] Entre essas sequências de DNA que codificam proteínas de interesse que conferem novas propriedades de tolerância a insetos, será

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55/114 mencionada mais particularmente as proteínas Bt Cry ou VIP, amplamente descritas na literatura e bem conhecidas dos técnicos no assunto. Estas incluem a proteína Cry1 F ou híbridos derivados de uma proteína Cry1 F (por exemplo, as proteínas híbridas Cry1A-Cry1F descritas em US 6 326 169; US 6 281 016; US 6 218 188 ou fragmentos tóxicos das mesmas), as proteínas do tipo Cry1A ou fragmentos tóxicos das mesmas, de preferência os proteína CrylAc ou híbridos derivados da proteína CrylAC (por exemplo, a proteína híbrida Cry1 Ab-Cry1 Ac descrita em US 5 880 275) ou a proteína Cry1 Ab ou Bt2 ou fragmentos inseticidas das mesmas, como descrito em EP 451878, as proteínas Cry2Ae, Cry2Af ou Cry2Ag, como descrito em WO 02/057664, ou fragmentos tóxicos das mesmas, a proteína Cry1A.1O5 descrita no documento WO 2007/140256 (SEQ ID NO: 7) ou um fragmento tóxico da mesma, a proteína VIP3Aa19 de número de acesso NCBI ABG20428, a proteína VIP3Aa20 de número de acesso NCBI ABG20429 (SEQ ID NO: 2 em WO 2007/142840), as proteínas VIP3A produzidas nos eventos de algodoeiro COT202 ou COT203 (WO 2005/054479 e WO 2005/054480, respectivamente), as proteínas Cry como descritas em WO 01/47952, a proteína VIP3Aa ou um fragmento tóxico da mesma como descrito em Estruch et al. (1996), Proc Natl Acad Sei EUA 28; 93(11): 5389-94 e US 6 291 156, as proteínas inseticidas das cepas de espécies de Xenorhabdus (como descrito em WO 98/50427), Serratia (particularmente de S. entomophila) ou Photorhabdus, tais como proteínas Tc de Photorhabdus, como descrito em WO 98/08932 (por exemplo, Waterfield et al., 2001, Appl Environ Microbiol. 67(11):5017-24; FfrenchConstant e Bowen, 2000, Cell Mol Life Sci.; 57(5): 828-33). Além disso, quaisquer variantes ou mutantes de qualquer uma dessas proteínas que diferem em alguns (1-10, preferencialmente 1-5) aminoácidos de qualquer uma das sequências acima, particularmente a sequência de fragmento tóxico da mesma, ou que são fundidos a um peptídeo de trânsito, tal como um peptídeo

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56/114 de trânsito plastidial ou outra proteína ou peptídeo, está incluído aqui.

[0106] Em várias formas de realização, a sequência HPPD da invenção pode ser combinada em plantas com um ou mais genes que conferem uma característica desejável, tal como tolerância a herbicidas, tolerância a insetos, tolerância à seca, controle de nematóides, eficiência no uso de água, eficiência no uso de nitrogênio, valor nutricional aprimorado, resistência a doenças, fotossíntese aprimorada, qualidade de fibra aprimorada, tolerância ao estresse, reprodução aprimorada e assim por diante.

[0107] Eventos transgênicos particularmente úteis que podem ser combinados com os genes da presente invenção em plantas da mesma espécie (por exemplo, cruzando ou transformando novamente uma planta contendo outro evento transgênico com um gene quimérico da invenção) incluem o Evento 531/ PV-GHBK04 (algodoeiro, controle de insetos, descritos em WO 2002/040677), Evento 1143 -14A (algodoeiro, controle de insetos, não depositado, descrito em WO 2006/128569); Evento 1143-51B (algodoeiro, controle de insetos, não depositado, descrito em WO 2006/128570); Evento 1445 (algodoeiro, tolerância ao herbicida, não depositado, descrito em US -A 2002 -120964 ou WO 2002/034946; Evento 17053 (arroz, tolerância ao herbicida, depositado como PTA-9843, descrito em WO 2010/117737); Evento 17314 (arroz, tolerância ao herbicida, depositado como PTA-9844, descrito em WO 2010/117735); Evento 281-24-236 (algodoeiro, controle de insetos tolerância ao herbicida, depositado como PTA-6233, descrito em WO 2005/103266 ou US -A 2005-216969); Evento 3006-210-23 (algodoeiro, controle de insetos - tolerância ao herbicida, depositado como PTA-6233, descrito em US -A 2007 -143876 ou WO 2005/103266); Evento 3272 (milho, característica de qualidade, depositado como PTA-9972, descrito em WO 2006/098952 ou US -A 2006-230473); Evento 33391 (trigo, tolerância ao herbicida, depositado como PTA-2347, descrito em WO 2002/027004), Evento

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40416 (milho, controle de insetos - tolerância ao herbicida, depositado como ATCC PTA- 11508, descrito em WO 11/075593); Evento 43A47 (milho, controle de insetos - tolerância ao herbicida, depositado como ATCC PTA- 11509, descrito em WO 2011/075595); Evento 5307 (milho, controle de insetos, depositado como ATCC PTA-9561, descrito em WO 2010/077816); Evento ASR-368 (agróstis, tolerância ao herbicida, depositado como ATCC PTA-4816, descrito em US -A 2006162007 ou WO 2004/053062); Evento B16 (milho, tolerância ao herbicida, não depositado, descrito em US -A 2003 -126634); Evento BPS- CV127-9 (soja, tolerância ao herbicida, depositado como NCIMB No. 41603, descrito em WO 2010/080829); Evento BLR1 (colza, restauração da esterilidade de machos, depositado como NCIMB 41193, descrito em WO 2005/074671); Evento CE43-67B (algodoeiro, controle de insetos, depositado como DSM ACC2724, descrito em US -A 2009-217423 ou WO 2006/128573); Evento CE44-69D (algodoeiro, controle de insetos, não depositado, descrito em US -A 20100024077); Evento CE44-69D (algodoeiro, controle de insetos, não depositado, descrito em WO 2006/128571); Evento CE46-02A (algodoeiro, controle de insetos, não depositado, descrito em WO 2006/128572); Evento COT102 (algodoeiro, controle de insetos, não depositado, descrito em US -A 2006 -130175 ou WO 2004/039986); Evento COT202 (algodoeiro, controle de insetos, não depositado, descrito em US -A 2007-067868 ou WO 2005/054479); Evento COT203 (algodoeiro, controle de insetos, não depositado, descrito em WO 2005/054480); Evento DAS21606-3 / 1606 (soja, tolerância ao herbicida, depositado como PTA -11028, descrito em WO 2012/033794), Evento DAS40278 (milho, tolerância ao herbicida, depositado como ATCC PTA -10244, descrito em WO 2011/022469); Evento DAS-44406-6 / pDAB8264.44.06.1 (soja, tolerância ao herbicida, depositado como PTA 11336, descrito em WO 2012/075426), Evento DAS -14536-7 /pDAB8291.45.36.2 (soja, tolerância ao herbicida, depositado como PTA

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11335, descrito em WO 2012/075429), Evento DAS-59122-7 (milho, controle de insetos - tolerância ao herbicida, depositado como ATCC PTA 11384 , descrito em US -A 2006-070139); Evento DAS-59132 (milho, controle de insetos - tolerância ao herbicida, não depositado, descrito em WO 2009/100188); Evento DAS68416 (soja, tolerância ao herbicida, depositado como ATCC PTA -10442, descrito em WO 2011/066384 ou WO 2011/066360); Evento DP-098140-6 (milho, tolerância ao herbicida, depositado como ATCC PTA-8296, descrito em US -A 2009 -137395 ou WO 08/112019); Evento DP305423 -1 (soja, característica de qualidade, não depositado, descrito em US A 2008-312082 ou WO 2008/054747); Evento DP-32138 -1 (milho, sistema de hibridização, depositado como ATCC PTA-9158, descrito em US -A 20090210970 ou WO 2009/103049); Evento DP-356043-5 (soja, tolerância ao herbicida, depositado como ATCC PTA-8287, descrito em US -A 2010-0184079 ou WO 2008/002872); Evento EE -1 (beringela, controle de insetos, não depositado, descrito em WO 07/091277); Evento FI117 (milho, tolerância ao herbicida, depositado como ATCC 209031, descrito em US -A 2006-059581 ou WO 98/044140); Evento FG72 (soja, tolerância ao herbicida, depositado como PTA- 11041, descrito em WO 2011/063413), Evento GA21 (milho, tolerância ao herbicida, depositado como ATCC 209033, descrito em US -A 2005-086719 ou WO 98/044140); Evento GG25 (milho, tolerância ao herbicida, depositado como ATCC 209032, descrito em US -A 2005 -188434 ou WO 98/044140); Evento GHB119 (algodoeiro, controle de insetos - tolerância ao herbicida, depositado como ATCC PTA-8398, descrito em WO 2008/151780); Evento GHB614 (algodoeiro, tolerância ao herbicida, depositado como ATCC PTA6878, descrito em US -A 2010-050282 ou WO 2007/017186); Evento GJ11 (milho, tolerância ao herbicida, depositado como ATCC 209030, descrito em US -A 2005 -188434 ou WO 98/044140); Evento GM RZ13 (beterraba, resistência a vírus, depositado como NCIMB-41601, descrito em WO

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2010/076212); Evento H7 -1 (beterraba, tolerância ao herbicida, depositado como NCIMB 41158 ou NCIMB 41159, descrito em US -A 2004 -172669 ou WO 2004/074492); Evento JOPLIN1 (trigo, tolerância à doença, não depositado, descrito em US -A 2008-064032); Evento LL27 (soja, tolerância ao herbicida, depositado como NCIMB41658, descrito em WO 2006/108674 ou US -A 2008-320616); Evento LL55 (soja, tolerância ao herbicida, depositado como NCIMB 41660, descrito em WO 2006/108675 ou US -A 2008 -196127); Evento LLcotton25 (algodoeiro, tolerância ao herbicida, depositado como ATCC PTA3343, descrito em WO 2003/013224 ou US -A 2003-097687); Evento LLRICE06 (arroz, tolerância ao herbicida, depositado como ATCC 203353, descrito em US 6,468,747 ou WO 2000/026345); Evento LLRice62 ( arroz, tolerância ao herbicida, depositado como ATCC 203352, descrito em WO 2000/026345), Evento LLRICE601 (arroz, tolerância ao herbicida, depositado como ATCC PTA-2600, descrito em US -A 20082289060 ou WO 2000/026356); Evento LY038 (milho, característica de qualidade, depositado como ATCC PTA-5623, descrito em US -A 2007-028322 ou WO 2005/061720); Evento MIR162 (milho, controle de insetos, depositado como PTA-8166, descrito em US -A 2009-300784 ou WO 2007/142840); Evento MIR604 (milho, controle de insetos, não depositado, descrito em US -A 2008 -167456 ou WO 2005/103301); Evento MON15985 (algodoeiro, controle de insetos, depositado como ATCC PTA-2516, descrito em US -A 2004-250317 ou WO 2002/100163); Evento MON810 (milho, controle de insetos, não depositado, descrito em US -A 2002 -102582); Evento MON863 (milho, controle de insetos, depositado como ATCC PTA-2605, descrito em WO 2004/011601 ou US -A 2006-095986); Evento MON87427 (milho, controle de polinização, depositado como ATCC PTA-7899, descrito em WO 2011/062904); Evento MON87460 (milho, tolerância ao estresse, depositado como ATCC PTA-8910, descrito em WO 2009/111263 ou US -A 2011-0138504); Evento MON87701 (soja, controle de

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60/114 insetos, depositado como ATCC PTA-8194, descrito em US -A 2009 -130071 ou WO 2009/064652); Evento MON87705 (soja, característica de qualidade tolerância ao herbicida, depositado como ATCC PTA-9241, descrito em US -A 2010-0080887 ou WO 2010/037016); Evento MON87708 (soja, tolerância ao herbicida, depositado como ATCC PTA-9670, descrito em WO 2011/034704); Evento MON87712 (soja, rendimento, depositado como PTA -10296, descrito em WO 2012/051199), Evento MON87754 (soja, característica de qualidade, depositado como ATCC PTA-9385, descrito em WO 2010/024976); Evento MON87769 (soja, característica de qualidade, depositado como ATCC PTA8911, descrito em US -A 2011-0067141 ou WO 2009/102873); Evento MON88017 (milho, controle de insetos - tolerância ao herbicida, depositado como ATCC PTA-5582, descrito em US -A 2008-028482 ou WO 2005/059103); Evento MON88913 (algodoeiro, tolerância ao herbicida, depositado como ATCC PTA-4854, descrito em WO 2004/072235 ou US -A 2006-059590); Evento MON88302 (colza, tolerância ao herbicida, depositado como PTA 10955, descrito em WO 2011/153186), Evento MON88701 (algodoeiro, tolerância ao herbicida, depositado como PTA -11754, descrito em WO 2012/134808), Evento MON89034 (milho, controle de insetos, depositado como ATCC PTA-7455, descrito em WO 2007/140256 ou US -A 2008-260932); Evento MON89788 (soja, tolerância ao herbicida, depositado como ATCC PTA6708, descrito em US -A 2006-282915 ou WO 2006/130436); Evento MS11 (colza, controle de polinização - tolerância ao herbicida, depositado como ATCC PTA-850 ou PTA- 2485, descrito em WO 2001/031042); Evento MS8 (colza, controle de polinização - tolerância ao herbicida, depositado como ATCC PTA- 730, descrito em WO 2001/041558 ou US -A 2003 -188347); Evento NK603 (milho, tolerância ao herbicida, depositado como ATCC PTA2478, descrito em US -A 2007-292854); Evento PE-7 (arroz, controle de insetos, não depositado, descrito em WO 2008/114282); Evento RF3 (colza,

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61/114 controle de polinização - tolerância ao herbicida, depositado como ATCC PTA730, descrito em WO 2001/041558 ou US -A 2003 -188347); Evento RT73 (colza, tolerância ao herbicida, não depositado, descrito em WO 2002/036831 ou US -A 2008-070260); Evento SYHT0H2 / SYN-000H2-5 (soja, tolerância ao herbicida, depositado como PTA -11226, descrito em WO 2012/082548), Evento T227 -1 (beterraba, tolerância ao herbicida, não depositado, descrito em WO 2002/44407 ou US -A 2009-265817); Evento T25 (milho, tolerância ao herbicida, não depositado, descrito em US -A 2001-029014 ou WO 2001/051654); Evento T304-40 (algodoeiro, controle de insetos - tolerância ao herbicida, depositado como ATCC PTA-8171, descrito em US -A 2010-077501 ou WO 2008/122406); Evento T342 -142 (algodoeiro, controle de insetos, não depositado, descrito em WO 2006/128568); Evento TC1507 (milho, controle de insetos - tolerância ao herbicida, não depositado, descrito em US -A 2005039226 ou WO 2004/099447); Evento VIP1034 (milho, controle de insetos tolerância ao herbicida, depositado como ATCC PTA-3925., descrito em WO 2003/052073), Evento 32316 (milho, controle de insetos-tolerância ao herbicida, depositado como PTA -11507, descrito em WO 2011/084632), Evento 4114 (milho, controle de insetos-tolerância ao herbicida, depositado como PTA -11506, descrito em WO 2011/084621), evento EE-GM3 / FG72 (soja, tolerância ao herbicida, número de acesso ATCC PTA -11041) opcionalmente empilhado com o evento EE-GM1/LL27 ou evento EEGM2/LL55 (WO 2011/063413 A2), evento DAS-68416-4 (soja, tolerância a herbicidas, número de acesso ATCC PTA-10442, WO 2011/066360 A1), evento DAS-68416-4 (soja, tolerância a herbicidas, número de acesso ATCC PTA-10442, WO 2011/066384 A1), evento DP-040416-8 (milho, controle de inseto, número de acesso ATCC PTA-11508, WO 2011/075593 A1), evento DP-043A47-3 (milho, controle de insetos, número de acesso ATCC PTA-11509, WO 2011/075595 A1), evento DP-004114-3 (milho, controle de inseto, número

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62/114 de acesso ATCC PTA-11506, WO 2011/084621 A1), evento DP-032316-8 (milho, controle de inseto, número de acesso ATCC PTA-11507, WO 2011/ 084632 A1), evento MON-88302-9 (colza, tolerância a herbicidas, número de acesso ATCC PTA-10955, WO 2011/153186 A1), evento DAS-21606-3 (soja, tolerância a herbicidas, número de acesso ATCC PTA-11028, WO 2012/ 033794 A2), evento MON-87712-4 (soja, característica de qualidade, número de acesso ATCC PTA-10296, WO 2012/051199 A2), evento DAS-44406-6 (soja, tolerância a herbicidas empilhados, número de acesso ATCC PTA11336, WO 2012/075426 A1), evento DAS-14536-7 (soja, tolerância a herbicidas empilhados, número de acesso ATCC PTA-11335, WO 2012/075429 A1), evento SYN-000H2-5 (soja, tolerância a herbicida, número de acesso ATCC PTA-11226, WO 2012/082548 A2), evento DP-061061-7 (colza, tolerância a herbicida, nenhum número de depósito disponível, WO 2012071039 A1), evento DP-073496-4 (colza, tolerância a herbicidas, nenhum número de depósito disponível, US 2012131692), evento 8264.44.06.1 (soja tolerância a herbicidas empilhados, número de acesso ATCC PTA-11336, WO 2012075426 A2), evento 8291.45.36.2 (soja, tolerância a herbicidas empilhados, número de acesso PTA-11335, WO 2012075429 A2), evento SYHT0H2 (soja, número de acesso ATCC PTA-11226, WO 2012/082548 A2), evento MON88701 (algodoeiro, número de acesso ATCC PTA-11754, WO 2012/134808 A1), evento KK179-2 (alfafa, número de acesso ATCC PTA11833, WO 2013003558 A1), evento pDAB8264.42.32.1 (soja, tolerância a herbicidas empilhados, número de acesso ATCC PTA-11993, WO 2013/010094 A1), evento MZDT09Y (milho, número de acesso ATCC PTA 13025, WO 2013/012775 A1), evento 4114 (milho, controle de insetos, número de acesso ATCC PTA -11506) WO 2013/14901, evento MON87411 (milho, número de acesso ATCC PTA -12669) WO 2013/169923, evento A26-5 (algodoeiro, controle de insetos) WO 2013/170398, evento A2-6 (algodoeiro,

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63/114 controle de insetos ) WO 2013/170399, evento 9582.816.15.1 (Soja, controle de insetos, tolerância a herbicidas), número de acesso ATCC PTA -12588) WO 2014/004458, evento 33121 (milho, controle de insetos, tolerância a herbicidas, número de acesso ATCC PTA -13392) WO 2014/116854, evento 32218 (milho, controle de insetos, tolerância a herbicidas, número de acesso ATCC PTA 13391) WO 2014/116989, evento SPT-7R-949D SPT-7R -1425D (Esterilidade de arroz macho) WO 2014/154115, evento MON87751 (Soja, número de acesso ATCC PYA -120166) WO 2014/201235, evento Pp009-401 Pp009-415 Pp009-469 (Turfgrass, ATCC Complemento N° PTA -120354, PTA -120353, PTA -120355) WO 2015/006774, evento Bs2-X5 (Tomate, ATCC) WO 2015/017637, evento MON87403 (milho, rendimento do grão, número de acesso ATCC PTA -13584 WO 2015/053998, evento 32218 (milho, controle de insetos, número de acesso ATCC PTA -13391) WO 2015/112182.

F. CONSTRUCTOS DE POLINUCLEOTÍDEO [0108] Os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos de HPPD da presente invenção podem ser modificados para obter ou melhorar a expressão em células vegetais. Os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos aqui identificados podem ser fornecidos em cassetes de expressão para expressão na planta de interesse. Um “cassete de expressão vegetal” inclui um construto de DNA, incluindo um construto de DNA recombinante, que é capaz de resultar na expressão de um polinucleotídeo em uma célula vegetal. O cassete pode incluir na direção de transcrição 5'-3', uma região de iniciação transcricional (isto é, promotor, particularmente um promotor heterólogo) operacionalmente ligada a um ou mais polinucleotídeos de interesse e/ ou uma região de terminação de tradução e transcrição (isto é, região de terminação) funcional nas plantas. O cassete pode conter adicionalmente pelo menos um polinucleotídeo adicional a ser introduzido no organismo, como um gene marcador selecionável. Alternativamente, o(s)

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64/114 polinucleotídeo(s) adicional(ais) pode(m) ser fornecido(s) em múltiplos cassetes de expressão. Tal cassete de expressão é fornecido com uma pluralidade de sítios de restrição para inserção do(s) polinucleotídeo(s) para estar sob a regulação transcricional das regiões reguladoras.

[0109] Em uma outra forma de realização, a presente invenção refere-se a um gene quimérico compreendendo uma sequência codificadora compreendendo o ácido nucleico heterólogo da invenção operacionalmente ligado a um promotor expressável em plantas e opcionalmente uma região de terminação de transcrição e de poliadenilação. “Heterólogo” geralmente se refere ao polinucleotídeo ou polipeptídeo que não é endógeno à célula ou não é endógeno à localização no genoma nativo em que está presente, e foi adicionado à célula por infecção, transfecção, microinjeção, eletroporação, microprojeção e assim por diante. Por ‘Operacionalmente ligado” entende-se uma ligação funcional entre dois polinucleotídeos. Por exemplo, quando um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência de DNA, a sequência do promotor inicia e medeia a transcrição da sequência de DNA. Reconhece-se que os polinucleotídeos ligados operacionalmente podem ou não ser contíguos e, quando usados para referenciar a união de duas regiões codificadoras de polipeptídeos, os polipeptídeos são expressos no mesmo quadro de leitura.

[0110] O promotor pode ser qualquer sequência polinucleotídica que mostre atividade transcricional nas células vegetais, partes de plantas ou plantas escolhidas. O promotor pode ser nativo ou análogo, ou exógeno ou heterólogo, ao hospedeiro vegetal e/ ou à sequência de DNA da invenção. Quando o promotor é “nativo” ou “análogo” ao hospedeiro vegetal, entende-se que o promotor é encontrado na planta nativa na qual o promotor é introduzido. Quando o promotor é “exógeno” ou “heterólogo” à sequência de DNA da invenção, entende-se que o promotor não é o promotor nativo ou de ocorrência natural para a sequência de DNA operacionalmente ligada da invenção. O

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65/114 promotor pode ser induzível ou constitutivo. Pode ser de ocorrência natural, pode ser composto por porções de vários promotores de ocorrência natural, ou pode ser parcial ou totalmente sintético. A orientação para o projeto de promotores é proporcionada por estudos de estrutura de promotores, tais como os de Harley e Reynolds (1987) Nucleic Acids Res. 15: 2343-2361. Além disso, a localização do promotor em relação ao início da transcrição pode ser otimizada. Ver, por exemplo, Roberts et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76: 760-764. Muitos promotores adequados para utilização em plantas são bem conhecidos na técnica.

[0111] Por exemplo, promotores constitutivos adequados para utilização em plantas incluem: os promotores de vírus de plantas, tais como o promotor de caulimovírus de listra clorótica do amendoim (PCISV) (Patente US 5 850 019); o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812); o promotor 35S descrito em Kay et al. (1987) Science 236: 1299 -1302; promotores dos genes da metiltransferase do vírus Chlorella (Patente US 5 563 328) e do promotor transcrito completo do vírus do mosaico da escrofulária (FMV) (Patente US 5 378 619); os promotores de genes como actina de arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171 e Patente US 5 641 876); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689) e Grefen et al. (2010) Plant J, 64: 355-365; pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appt. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730 e a Patente US 5 510 474); histona H3 de milho (Lepetit et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 231:276285 e Atanassova et al. (1992) Plant J. 2(3): 291-300); Brassica napus ALS3 (pedido PCT WO 97/41228); um gene da subunidade pequena de ribulose-biscarboxilase/ oxigenase (RuBisCO) vegetal; o circovirus (AU 689 311) ou o virus do mosaico da veia da mandioca (CsVMV, US 7 053 205); e promotores de vários genes de Agrobacterium (Ver as Patentes US 4 771 002; US 5 102 796;

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US 5 182 200; e US 5 428 147).

[0112] Os promotores induzíveis adequados para utilização em plantas incluem: o promotor do sistema ACE1 que responde ao cobre (Mett et al. (1993) PNAS 90:4567-4571); o promotor do gene In2 do milho que responde aos protetores de fitotoxicidade herbicidas benzenossulfonamida (Hershey et al. (1991) Mol. Gen. Genetics 227:229-237 e Gatz et al. (1994) Mol. Gen. Genetics 243:32-38); e o promotor do repressor Tet de Tn10 (Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237). Outro promotor induzível para uso em plantas é aquele que responde a um agente indutor ao qual as plantas normalmente não respondem. Um promotor induzível exemplificativo deste tipo é o promotor induzível de um gene do hormônio esteróide, cuja atividade transcricional é induzida por um hormônio glucocorticoesteróide (Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:10421) ou a recente aplicação de um ativador de transcrição quimérico, XVE, para utilização em um sistema de expressão de planta induzível baseado em receptores de estrogênio ativado por estradiol (Zuo et al. (2000) Plant J., 24:265-273). Outros promotores induzíveis para utilização em plantas são descritos em EP 332104, PCT WO 93/21334 e PCT WO 97/06269 que são aqui incorporados por referência na sua totalidade. Promotores compostos de porções de outros promotores e promotores parcialmente ou totalmente sintéticos também podem ser usados. Veja, por exemplo, Ni et al. (1995) Plant J. 7:661-676 e PCT WO 95/14098 descrevendo tais promotores para uso em plantas.

[0113] Em uma forma de realização desta invenção, uma sequência de promotor específica para regiões ou tecidos particulares de plantas pode ser usada para expressar as proteínas HPPD da invenção, tal como promotores específicos para sementes (Datla, R. et al., 1997, Biotechnology Ann. Rev. 3, 269-296), especialmente o promotor de napina (EP 255 378 A1), o promotor de faseolina, o promotor de glutenina, o promotor de

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67/114 heliantinin (WO 92/17580), o promotor de albumina (WO 98/45460), o promotor de oleosina (WO 98/45461), o promotor SAT1 ou o promotor SAT3 (PCT/ US 98/06978).

[0114]Também se pode usar um promotor induzível escolhido vantajosamente dentre fenilalanina amônia-liase (PAL), HMG-CoA redutase (HMG), quitinase, glucanase, inibidor de proteinase (PI), gene da família PR1, promotores da nopalina sintase (nos) e vspB (US 5 670 349, Tabela 3), o promotor HMG2 (US 5 670 349), o promotor de beta-galactosidase de maçã (ABG1) e o promotor de aminociclopropano-carboxilato sintase de maçã (ACC sintase) (WO 98/45445). Múltiplos promotores podem ser utilizados nos construtos da invenção, incluindo em sucessão.

[0115] O promotor pode incluir, ou ser modificado para incluir, um ou mais elementos intensificadores. Em algumas formas de realização, o promotor pode incluir uma pluralidade de elementos intensificadores. Os promotores que contêm elementos intensificadores proporcionam níveis mais elevados de transcrição em comparação com promotores que não os incluem. Elementos intensificadores adequados para uso em plantas incluem o elemento intensificador PCISV (Patente US 5 850 019), o elemento intensificador CaMV 35S (Patentes US 5 106 739 e 5 164 316) e o elemento intensificador de FMV (Maiti et al. (1997) Transgenic Res. 6:143-156); ο ativador de tradução do vírus do mosaico da planta de fumo (TMV) descrito no Pedido de patente WO 87/07644, ou do vírus do tabaco etch (TEV) descrito por Carrington & Freed 1990, J. Virol. 64: 1590-1597, por exemplo, ou introns tais como o íntron adh1 do milho ou íntron 1 da actina de arroz. Ver também PCT WO 96/23898, WO 2012/021794, WO 2012/021797, WO 2011/084370 e WO 2011/028914.

[0116] Muitas vezes, esses construtos podem conter regiões não traduzidas de 5' e 3'. Tais construtos podem conter uma “sequência sinal” ou

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68/114 “sequência líder” para facilitar o transporte co-traducional ou pós-traducional do peptídeo de interesse para certas estruturas intracelulares, como o cloroplasto (ou outro plastídio), retículo endoplasmático ou aparelho de Golgi, ou ser secretado. Por exemplo, o construto pode ser projetado para conter um peptídeo sinal para facilitar a transferência do peptídeo para o retículo endoplasmático. Por “sequência sinal” entende-se uma sequência que é conhecida ou suspeita de resultar no transporte peptídico co-traducional ou pós-traducional através da membrana celular. Nos eucariotos, isso normalmente envolve secreção no aparelho de Golgi, com alguma glicosilação resultante. Por “sequência líder” entende-se qualquer sequência que, quando traduzida, resulta em uma sequência de aminoácidos suficiente para desencadear o transporte co-traducional da cadeia peptídica para uma organela subcelular. Assim, isto inclui sequências líder dirigidas ao transporte e/ ou glicosilação por passagem para o retículo endoplasmático, passagem para vacúolos, plastídios incluindo cloroplastos, mitocôndrias e assim por diante. Também pode ser preferível projetar o cassete de expressão da planta para conter um íntron, de modo que o processamento de mRNA do íntron seja necessário para expressão.

[0117] Por “região 3’ não traduzida” entende-se um polinucleotídeo localizado a jusante de uma sequência de codificação. As sequências sinal de poliadenilação e outras sequências que codificam sinais reguladores capazes de afetar a adição de tratos de ácido poliadenílico à extremidade 3' do precursor de mRNA são regiões 3' não traduzidas. Por “região 5' não traduzida” entende-se um polinucleotídeo localizado a montante de uma sequência de codificação.

[0118] Outros elementos não traduzidos a montante ou a jusante incluem intensificadores. Intensificadores são polinucleotídeos que agem para aumentar a expressão de uma região promotora. Os intensificadores são bem

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69/114 conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados à região intensificadora de SV40 e o elemento intensificador 35S.

[0119] A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação da transcrição, pode ser nativa com a sequência da presente invenção ou pode ser derivada de outra fonte. As regiões de terminação convenientes estão disponíveis no plasmídeo Ti de A. tumefaciens, como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Veja também Guerineau et al. (1991) Mol. Gen Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe etal. (1990) Gene 91: 151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891-7903; Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 9627-9639; e Pedido de Patente Européia EP 0 633 317 A1.

[0120] Em um aspecto da invenção, as sequências de DNA sintéticas são projetadas para urn dado polipeptídeo, tal como os polipeptídeos da invenção. A expressão do quadro de leitura aberto da sequência de DNA sintética em uma célula resulta na produção do polipeptídeo da invenção. As sequências de DNA sintético podem ser úteis para simplesmente remover sítios de endonucleases de restrição indesejados, facilitar estratégias de clonagem de DNA, alterar ou remover qualquer tendência de códon em potencial, alterar ou melhorar o conteúdo de GC, remover ou alterar quadros de leitura alternados e/ ou alterar ou remover sítios de reconhecimento de união de íntron/ éxon, sítios de poliadenilação, sequências Shine-Delgarno, elementos promotores indesejados e similares que podem estar presentes em uma sequência de DNA nativa. Também é possível que sequências de DNA sintéticas possam ser utilizadas para introduzir outras melhorias em uma sequência de DNA, tal como introdução de uma sequência de introns, criação de uma sequência de DNA que é expressa como uma fusão de proteínas a sequências de direcionamento de organelas, como peptídeos de trânsito de

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70/114 cloroplastos, peptídeos de direcionamento de apoplastos/ vacuolares ou sequências de peptídeos que resultam na retenção do peptídeo resultante no retículo endoplasmático. Os genes sintéticos também podem ser sintetizados usando códons preferidos por células hospedeiras para melhor expressão, ou podem ser sintetizados usando códons a uma frequência de uso de códons preferida por hospedeiro. Ver, por exemplo, Campbell e Gowri (1990) Plant Physiol. 92: 1-11; Patentes US 6 320 100; US 6 075 185; US 5 380 831; e US 5 436 391, pedidos de patente publicados US 20040005600 e 20010003849, e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, aqui incorporados por referência.

[0121] Em uma forma de realização, os polinucleotídeos de interesse são direcionados para o cloroplasto para expressão. Desta maneira, quando o polinucleotídeo de interesse não for inserido diretamente no cloroplasto, o cassete de expressão conterá adicionalmente um polinucleotídeo que codifica um peptídeo de trânsito para direcionar o nucleotídeo de interesse aos cloroplastos. Tais peptídeos de trânsito são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; e Shah etal. (1986) Science 233:478-481.

[0122] Os polinucleotídeos de interesse a serem direcionados para o cloroplasto podem ser otimizados para expressão no cloroplasto para explicar diferenças no uso de códons entre o núcleo da planta e esta organela. Deste modo, os polinucleotídeos de interesse podem ser sintetizados utilizando códon preferidos de cloroplastos. Ver, por exemplo, Patente US 5 380 831, aqui incorporada por referência.

[0123] Este cassete de expressão vegetal pode ser inserido em um vetor de transformação de planta. Por “vetor de transformação” entende-se

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71/114 uma molécula de DNA que permite a transformação de uma célula. Tal molécula pode consistir em um ou mais cassetes de expressão, e pode ser organizada em mais de uma molécula de DNA de vetor. Por exemplo, vetores binários são vetores de transformação de plantas que utilizam dois vetores de DNA não contíguos para codificar todas as funções necessárias de ação cis e trans para transformação de células vegetais (Hellens e Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). “Vetor” refere-se a um construto polinucleotídico projetado para transferência entre diferentes células hospedeiras. “Vetor de expressão” refere-se a um vetor que possui a capacidade de incorporar, integrar e expressar sequências de DNA ou fragmentos heterólogos em uma célula exógena.

[0124] O vetor de transformação de plantas compreende um ou mais vetores de DNA para alcançar a transformação da planta. Por exemplo, é uma prática comum na técnica utilizar vetores de transformação de plantas que compreendem mais de um segmento de DNA contíguo. Estes vetores são frequentemente referidos na técnica como vetores binários. Vetores binários bem como vetores com plasmídeos auxiliares são mais frequentemente utilizados para transformação mediada por Agrobacterium, em que o tamanho e complexidade dos segmentos de DNA necessários para conseguir uma transformação eficiente são bastante grandes e é vantajoso separar funções em moléculas de DNA separadas. Os vetores binários tipicamente contêm um vetor plasmídeo que contém as sequências de ação cis necessárias para a transferência de T-DNA (tal como borda esquerda e borda direita), um marcador selecionável que é projetado para ser capaz de expressão em uma célula vegetal e um “polinucleotídeo de interesse” (um polinucleotídeo projetado para ser capaz de expressão em uma célula vegetal para a qual a geração de plantas transgênicas é desejada). Também presentes neste vetor plasmídeo estão sequências necessárias para replicação bacteriana. As

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72/114 sequências de ação cis são dispostas de um modo para permitir uma transferência eficiente para as células vegetais e a expressão nas mesmas. Por exemplo, a sequência do marcador selecionável e a sequência de interesse estão localizadas entre as bordas esquerda e direita. Muitas vezes, um segundo vetor plasmídeo contém os fatores que atuam em trans que medeiam a transferência de T-DNA de Agrobacterium para células vegetais. Este plasmídeo contém frequentemente as funções de virulência (genes Vir) que permitem a infecção de células vegetais por Agrobacterium e transferência de DNA por divagem em sequências de fronteira e transferência de DNA mediada por vírus, como é entendido na técnica (Hellens e Mullineaux (2000) Trends in Plant Science, 5:446-451). Vários tipos de cepas de Agrobacterium (por exemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) podem ser utilizados para transformação de plantas. O segundo vetor plasmídeo não é necessário para a introdução de polinucleotídeos nas plantas por outros métodos, tais como microprojeção, microinjeção, eletroporação, polietilenoglicol, etc.

G. Transformação de Plantas [0125] Os métodos da invenção envolvem a introdução de um construto de nucleotídeos em uma planta. Por “introdução” pretende-se apresentar à planta o construto de nucleotídeos de tal maneira que o construto tenha acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos da invenção não requerem a utilização de um método específico para a introdução de um construto de nucleotídeos em uma planta, apenas que o construto de nucleotídeos obtenha acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Os métodos para introduzir construtos de nucleotídeos nas plantas são conhecidos na técnica incluindo, mas não limitados a métodos de transformação estáveis, métodos de transformação transientes e métodos mediados por vírus. Ver, por exemplo, os métodos para transformar células vegetais e plantas em regeneração descritos em: US 4.459.355, US 4.536.475,

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US 5.464.763, US 5.177.010, US 5.187.073, EP 267.159 A1, EP 604 662 A1, EP 672 752 A1, US 4.945.050, US 5.036.006, US 5.100.792, US 5,371,014, US 5.478.744, US 5.179.022, US 5.565.346, US 5,484,956, US 5.508.468, US 5.538.877, US 5.554.798, US 5,489,520, US 5.510.318, US 5.204.253, US 5.405.765, EP 442 174 A1, EP 486 233 A1, EP 486 234 A1, EP 539 563 A1,

EP 674 725	A1,	WO	91/02071, WO	95/06128,	WO 2011/095460,	WO
2012/006439	A2,	WO	2012/006443	A2, WO	2012/015039 A1,	WO
2012/019660	A1,	WO	2012/021494	A1, WO	2012/064827 A1,	WO
2012/075562	A1,	WO	2012/077664	A1, WO	2012/083137 A1,	WO
2012/084962	A1,	WO	2012/092577	A1, WO	2012/109947 A1,	WO
2012/129443	A2,	WO	2012/138629	A2, WO	2012/139416 A1,	WO
2012/149011	A1,	WO	2013/014585	A1, WO	2013/025670 A1,	WO
2013/033308	A2,	WO	2013/066007	A1, WO	2013/077420 A1,	WO
2013/090734	A1,	WO	2013/149726	A1, WO	2013/180311 A1,	WO
2014/029044	A1,	WO	2014/029045	A1, WO	2014/062036 A1,	WO
2014/065857	A1,	WO	2014/100234	A1, WO	2014/100406 A1,	WO
2014/123208	A1,	WO	2014/143304	A1, WO	2014/144513 A2,	WO
2014/157541	A1,	WO	2014/200842	A2, WO	2015/051083 A1,	WO
2015/077620	A1,	WO	2015/085990	A1, WO	2015/099674 A1,	WO

2015/118640 A1, WO 2015/119166 A1, cada uma das quais é aqui incorporada por referência, particularmente em relação aos métodos de transformação descritos.

[0126] Em geral, os métodos de transformação de plantas envolvem a transferência de DNA heterólogo em células vegetais alvo (por exemplo, embriões imaturos ou matures, culturas em suspensão, calos indiferenciados, protoplastos etc.), seguido pela aplicação de um nível limiar máximo de seleção apropriada (dependendo do gene marcador selecionável) para recuperar as células vegetais transformadas de um grupo de massa

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74/114 celular não transformada. Os explantes são tipicamente transferidos para um novo suprimento do mesmo meio e cultivados rotineiramente. Posteriormente, as células transformadas são diferenciadas em brotos após a colocação no meio de regeneração suplementado com um nível limiar máximo de agente de seleção. Os brotos são então transferidos para um meio de enraizamento seletivo para recuperar brotos ou plântulas enraizadas. A plântula transgênica cresce então em plantas maduras e produz sementes férteis (por exemplo, Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 745-750). Os explantes são tipicamente transferidos para um novo suprimento do mesmo meio e cultivados rotineiramente. Uma descrição geral das técnicas e métodos para gerar plantas transgênicas é encontrada em Ayres e Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 e Bommineni e Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Uma vez que o material transformado contém muitas células; as células transformadas e as células não transformadas estão presentes em qualquer pedaço de calo ou tecido ou grupo de células alvo sujeitos. A capacidade de matar células não transformadas e permitir a proliferação de células transformadas resulta em culturas de plantas transformadas. Frequentemente, a capacidade de remover células não transformadas é uma limitação à recuperação rápida de células vegetais transformadas e à geração bem-sucedida de plantas transgênicas. Métodos moleculares e bioquímicos podem ser usados para confirmar a presença do gene heterólogo integrado de interesse no genoma da planta transgênica.

[0127] A geração de plantas transgênicas pode ser realizada por um de vários métodos, incluindo, mas não limitados a, introdução de DNA heterólogo por Agrobacterium em células vegetais (transformação mediada por Agrobacterium), bombardeamento de células vegetais com DNA exógeno heterólogo aderido a partículas e vários outros métodos mediados diretamente sem partículas (por exemplo, Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282;

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Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750; Ayres e Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239; Bommineni e Jauhar (1997) Maydica 42:107-120) para transferir DNA.

[0128] Os métodos para transformação de cloroplastos são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:8526-8530; Svab e Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:913-917; Svab e Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. O método baseia-se na entrega de armas de partículas de DNA contendo um marcador selecionável e direcionamento do DNA para o genoma plastidial por meio de recombinação homóloga. Além disso, a transformação plastidial pode ser realizada por transativação de um transgene silencioso que possui plastídio por expressão preferida por tecido de uma polimerase de RNA codificada por nuclear e direcionada a plastídio. Tal sistema foi relatado em McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:7301-7305.

[0129] As células vegetais que foram transformadas podem ser cultivadas em plantas de acordo com formas convencionais. Veja, por exemplo, McCormick etal. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas podem então ser cultivadas e polinizadas com a mesma cepa transformada ou com diferentes cepas, e o híbrido resultante tendo expressão constitutiva da característica fenotípica desejada identificada. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada seja mantida e herdada de maneira estável e, em seguida, as sementes colhidas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada tenha sido alcançada. Dessa maneira, a presente invenção fornece sementes transformadas (também denominadas “sementes transgênicas”) com um construto de nucleotídeos da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, incorporado de maneira estável em seu genoma. Em várias formas de realização, a semente pode ser revestida com pelo menos um

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76/114 fungicida e/ ou pelo menos um inseticida, pelo menos um herbicida e/ ou pelo menos um protetor de fitotoxicidade ou qualquer combinação dos mesmos.

H. Avaliação da Transformação de Plantas [0130] Após a introdução do DNA exógeno heterólogo nas células vegetais, a transformação ou integração do gene heterólogo no genoma da planta é confirmada por vários métodos, tais como a análise de ácidos nucléicos, proteínas e metabolitos associados ao gene integrado.

[0131] A análise por PCR é um método rápido para fazer a triagem de células, tecidos ou brotos transformados quanto à presença de genes incorporados no estágio anterior antes da transplantação no solo (Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)). A PCR é realizada utilizando iniciadores oligonucleotídicos específicos para o gene de interesse ou base do vetor de Agrobacterium, etc.

[0132] A transformação de plantas pode ser confirmada por análise por Southern blot de DNA genômico (Sambrook e Russell (2001) supra). Em geral, o DNA total é extraído do transformante, digerido com enzimas de restrição apropriadas, fracionado em um gel de agarose e transferido para uma membrana de nitrocelulose ou nylon. A membrana ou “mancha” pode então ser sondada com, por exemplo, fragmento de DNA alvo radiomarcado com ³²P para confirmar a integração do gene introduzido no genoma da planta de acordo com técnicas padrão (Sambrook e Russell, 2001, supra).

[0133] Na análise Northern, o RNA é isolado de tecidos específicos de transformante, fracionado em um gel de formaldeído-agarose e transferido para um filtro de náilon de acordo com procedimentos padrão que são rotineiramente utilizados na técnica (Sambrook e Russell (2001) supra). A expressão de RNA codificado por sequências de nucleotídeos da invenção é

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77/114 testada por hibridização do filtro com uma sonda radioativa derivada por métodos conhecidos na técnica (Sambrook e Russell (2001) supra). O RNA também pode ser detectado e/ ou quantificado usando PCR de transcriptase reversa como é conhecida na técnica (por exemplo, Green e Sambrook (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Woodbury, NY).

[0134] Western blot, ELISA, testes de fluxo lateral e ensaios bioquímicos e similares podem ser realizados nas plantas transgênicas para determinar a presença de proteína codificada pelo gene de tolerância a herbicidas por procedimentos padrão (Sambrook e Russell (2001) supra) usando anticorpos que se ligam a um ou mais epítopos presentes na proteína de tolerância a herbicidas.

[0135] Em um aspecto da invenção, os genes da HPPD aqui descritos são úteis como marcadores para avaliar a transformação de células bacterianas ou vegetais.

I. Use como Marcador para Transformação [0136] A invenção também se refere ao uso, em um método para transformar plantas, de um ácido nucleico que codifica uma HPPD de acordo com a invenção como um gene marcador ou como uma sequência de codificação que possibilita conferir à planta a tolerância a herbicidas que são inibidores de HPPD, e ao uso de um ou mais inibidores de HPPD em plantas compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma HPPD de acordo com a invenção. Ver, por exemplo, a Patente US 6 791 014, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[0137] Nessa forma de realização, um inibidor de HPPD pode ser introduzido no meio de cultura das células vegetais competentes, de modo a branquear as referidas células antes da etapa de transformação. As células competentes branqueadas são então transformadas com o gene de tolerância

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78/114 aos inibidores da HPPD, como um marcador de seleção, e as células transformadas que integraram o referido marcador de seleção em seu genoma tornam-se verdes, permitindo sua seleção. Tal processo torna possível diminuir o tempo necessário para selecionar as células transformadas.

[0138] Assim, uma forma de realização da presente invenção consiste em um método para transformar células vegetais por introdução de um gene heterólogo nas referidas células vegetais com um gene para tolerância a inibidores de HPPD como marcadores de seleção, em que o método compreende preparar e cultivar células vegetais competentes capazes de receber o gene heterólogo em um meio adequado e a introduzir uma quantidade adequada de inibidor de HPPD no meio de cultura adequado das células vegetais competentes. As células competentes são então transformadas com o gene heterólogo e o marcador de seleção, e as células transformadas compreendendo o gene heterólogo são cultivadas em um meio adequado e os transformantes selecionados a partir dele. As células transformadas podem então ser regeneradas em uma planta transformada fértil.

J. Plantas e Partes de Planta [0139] Por “planta” entende-se plantas inteiras, órgãos vegetais (por exemplo, folhas, caules, raízes etc.), sementes, células vegetais, propágulos, embriões e progênie dos mesmos. As células vegetais podem ser diferenciadas ou indiferenciadas (por exemplo, calos, células de cultura de suspensão, protoplastos, células foliares, células de raiz, células de floema, pólen). A presente invenção pode ser utilizada para a introdução de polinucleotídeos em qualquer espécie de planta, incluindo, mas não se limitando a monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos de plantas de interesse incluem, mas não estão limitados a milho (maize), sorgo, trigo, girassol, tomateiro, crucíferas, pimenteira, batata, algodoeiro, arroz, soja,

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79/114 beterraba sacarina, cana de açúcar, planta de fumo, cevada e colza, Brassica sp., alfafa, centeio, painço, cártamo, amendoim, batata doce, mandioca, café, coco, abacaxi, árvores cítricas, cacau, arbusto, banana, abacateiro, figueira, goiabeira, mangueira, oliveira, mamoeiro, cajueiro, macadâmia, amendoeira, aveia, hortaliças, plantas ornamentais e coníferas.

[0140] As hortaliças incluem, mas não estão limitadas a tomates, alface, feijões verdes, feijões de lima, ervilhas e membros do gênero Curcumis tais como pepino, cantalupo e melão almiscarado. As plantas ornamentais incluem, mas não estão limitadas a azálea, hortênsia, hibisco, rosas, tulipas, narcisos silvestres, petúnias, cravo, poinsetia e crisântemo. As plantas de culturas também são de interesse, incluindo, por exemplo, milho, sorgo, trigo, girassol, tomateiro, crucíferas, pimenteira, batata, algodoeiro, arroz, soja, beterraba sacarina, cana de açúcar, planta de fumo, cevada, colza etc.

[0141] Esta invenção é adequada para qualquer membro da família de plantas monocotiledôneas incluindo, mas não limitado a milho, arroz, cevada, aveia, trigo, sorgo, centeio, cana de açúcar, abacaxi, inhame, cebola, banana, coco e tâmaras.

K. Métodos para Aumentar o Rendimento da Planta [0142] Métodos para aumentar o rendimento da planta são fornecidos. Os métodos compreendem o fornecimento de uma planta compreendendo, ou introduzindo em uma planta ou célula vegetal, um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma HPPD da invenção, cultivando a planta ou uma semente da mesma em um campo e produzindo uma colheita a partir das referidas plantas ou sementes. Conforme aqui definido, o “rendimento” da planta refere-se à qualidade e/ ou quantidade de biomassa produzida pela planta. Por “biomassa” entende-se qualquer produto vegetal medido. Um aumento na produção de biomassa é qualquer melhoria no rendimento do produto vegetal medido. O

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80/114 aumento do rendimento da planta tem várias aplicações comerciais. Por exemplo, o aumento da biomassa das folhas das plantas pode aumentar o rendimento de vegetais folhosos para consumo humano ou animal. Além disso, o aumento da biomassa foliar pode ser usado para aumentar a produção de produtos farmacêuticos ou industriais derivados de plantas. Um aumento no rendimento pode compreender qualquer aumento estatisticamente significativo, incluindo, mas não limitado a, pelo menos um aumento de 1%, pelo menos um aumento de 3%, pelo menos um aumento de 5%, pelo menos um aumento de 10%, pelo menos um aumento de 20%, pelo menos um 30%, pelo menos um 50%, pelo menos um 70%, pelo menos um 100% ou um aumento maior.

[0143] Em métodos específicos, a planta que compreende uma sequência de HPPD da invenção é tratada com uma concentração efetiva de um herbicida inibidor de HPPD, tal como um ou mais herbicida (s) inibidor (es) de HPPD selecionados a partir do grupo que consiste em herbicidas inibidores de HPPD da classe de tricetonas (de preferência, isoxaflutol), hidroxipirazois (de preferência pirazoxifeno, benzofenap, pirazolinato, pirassulfotol, topramezona, tolpiralato), N- (1,2,5-di-hidroxipirazol), hidroxipirazois (de forma preferencial pirazoxifeno, benzofenap, pirazolinato, pirazolazol, oxadiazol -3- il) benzamidas, N- (1,3,4- oxadiazol -2- il) benzamidas (de preferência 2- metil -N(5- metil -1,3,4- oxadiazol -2- il) 3- (metilsulfonil) -4- (trifluorometil) benzamida, N- (tetrazol -5- il) - ou N- (triazol -5- il) arilcarboxamidas (de forma preferencial, 2- cloro -3- etóxi -4- (metilsulfonil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) benzamida, 4(difluorometil) -2- metóxi -3- (metilsulfonil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) benzamida; 2- cloro-3- (metilsulfanil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) -4(trifluorometil) benzamida (daqui em diante também denominado “Composto 1”); 2- (metóximetil) -3- (metilsulfinil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) -4(trifluorometil) benzamida, derivados de piridazinona, derivados de oxoprazina, N- (triazol -2- il) arilcarboxamidas, triazinonas e pirazolonas, onde a aplicação

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81/114 de herbicida resulta em maior rendimento vegetal.

[0144] Também são fornecidos métodos para conferir tolerância a herbicidas a uma planta ou parte dela. Nesses métodos, uma sequência de nucleotídeos que codifica uma HPPD da invenção é introduzida na planta, em que a expressão do polinucleotídeo resulta na tolerância ao herbicida inibidor de HPPD. As plantas produzidas por esse método podem ser tratadas com uma concentração eficaz de um herbicida (como um ou mais herbicida (s) inibidor (es) de HPPD selecionados do grupo que consiste em herbicidas inibidores de HPPD da classe de tricetonas (de preferência benzobiciclon, sulcotriona, mesotriona, tembotriona tefuriltriona, biciclopirona, fenquinotriona), dicetonitrilas, isoxazois (de preferência isoxaflutol), hidroxipirazois (de preferência pirazoxifeno, benzofenap, pirazolinato, piraisolfotol, topramezona, tolpiralato), N- (1,2,5- oxadiazol -3- il) benzamidas, N(1,3,4- oxadiazol -2- il) benzamidas (de forma preferencial 2- metil -N- (5- metil 1,3,4- oxadiazol -2- il) -3- (metilsulfonil) -4- (trifluorometil) benzamida, N- (tetrazol -5il) - ou N- (triazol -5- il) arilcarboxamidas (de forma preferencial, 2- cloro -3- etóxi -4(metilsulfonil) -N- (1 - metil -1H- tetrazol -5- il) benzamida, 4- (difluorometil) -2- metóxi -3- (metilsulfonil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) benzamida; 2- cloro -3(metilsulfanil) -N- (1 - metil -1H- tetrazol -5- il) -4- (trifluorometil) benzamida (daqui em diante também denominado “Composto 1”); 2- (metóximetil) -3- (metilsulfinil) -N- (1metil -1H- tetrazol -5- il) -4- (trifluorometil) benzamida, derivados de piridazinona derivados de oxoprazina, N- (triazol -2- il) arilcarboxamidas, triazinonas e pirazolonas e apresentam uma maior tolerância ao herbicida. Uma concentração eficaz de um herbicida neste aplicativo é uma quantidade suficiente para retardar ou parar o crescimento de plantas ou partes de plantas que não são naturalmente tolerantes ou tornadas tolerantes ao herbicida.

L. Métodos de Controle de Ervas Daninhas em um Campo [0145] A presente invenção, portanto, também se refere a um método para controlar plantas indesejadas ou para regular o crescimento de

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82/114 plantas em culturas de plantas que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de HPPD de acordo com a invenção, em que um ou mais herbicida (s) inibidor (es) de HPPD, por exemplo, um ou mais herbicida (s) inibidor (es) de HPPD selecionados da classe de tricetonas (de preferência benzobiciclon, sulcotriona, mesotriona, tembotriona, tefuriltriona, biciclopirona, fenquinotriona), dicetonitrilas, isoxazois (de preferência isoxaflutol), hidroxipirazois (de preferência pirazoxifeno, benzofenap, pirazolinato, pirassulfotol, topramezona, tolpiralato), N- (1,2,5oxadiazol -3- il) benzamidas, N- (1,3,4- oxadiazol -2- il) benzamidas (de forma preferencial 2- metil -N- (5- metil -1,3, 4- oxadiazol -2- il) -3- (metilsulfonil) -4(trifluorometil) benzamida, N- (tetrazol -5- il) - ou N- (triazol -5- il) arilcarboxamidas (de forma preferencial, 2- cloro -3- etóxi -4- (metilsulfonil) -N(1- metil -1H- tetrazol -5- il) benzamida, 4- (difluorometil) -2- metóxi -3(metilsulfonil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) benzamida; 2- cloro -3(metilsulfanil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) -4- (trifluorometil) benzamida (daqui em diante também denominado “Composto”); derivados de 2(metóximetil) -3- (metilsulfinil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) -4- (trifluorometil) benzamida-piridazinona, derivados de oxoprazina, N- (triazol -2- il) arilcarboxamidas, triazinonas e pirazolonas, são aplicados às plantas (por exemplo, plantas daninhas, tais como ervas daninhas monocotiledôneas ou dicotiledôneas ou plantas de cultura indesejadas), às sementes (por exemplo, grãos, sementes ou propágulos vegetativos, tais como tubérculos ou partes de broto com germes) ou a área em que as plantas crescem (por exemplo, a área cultivada). Neste contexto, uma concentração eficaz de um ou mais herbicida (s) inibidor (es) de HPPD, por exemplo, um ou mais herbicida (s) inibidor (es) de HPPD selecionados do grupo que consiste em herbicidas inibidores de HPPD da classe de tricetonas (de preferência benzobiciclon, sulcotriona, mesotriona, tembotriona tefuriltriona, biciclopirona, fenquinotriona),

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83/114 dicetonitrilas, isoxazois (de preferência isoxaflutol), hidroxipirazois (de preferência pirazoxifeno, benzofenap, pirazolinato, pirassulfotol, topramezona, tolpiralato), N- (1,2,5- oxadiazol -3- il) benzamidas, N- (1,3,4- oxadiazol -2- il) benzamidas (de forma preferencial 2- metil -N- (5- metil -1,3,4- oxadiazol -2- il) 3- (metilsulfonil) -4- (trifluorometil) benzamida, N- (tetrazol -5- il) - ou N- (triazol 5- il) arilcarboxamidas (de forma preferencial, 2- cloro -3- etóxi -4- (metilsulfonil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) benzamida, 4- (difluorometil) -2- metóxi -3(metilsulfonil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) benzamida; 2- cloro -3(metilsulfanil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) -4- (trifluorometil) benzamida (daqui em diante também denominado “Composto 1”); 2- (metóximetil) -3(metilsulfinil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) -4- (trifluorometil) benzamida, derivados de piridazinona, derivados de oxoprazina, N- (triazol- 2-il) arilcarboxamidas, triazinonas e pirazolonas, podem ser aplicados, por exemplo, pré-plantio (se apropriado também por incorporação no solo), pré-emergência ou pós-emergência, e pode ser combinada com a aplicação de outros herbicidas para os quais a cultura é naturalmente tolerante, ou aos quais é resistente através da expressão de um ou mais outros transgenes de resistência a herbicidas. Ver, por exemplo, a publicação de pedido de patente US No. 2004/0058427 e publicação de pedido PCT No. WO 98/20144. Por “concentração eficaz” entende-se a concentração que controla o crescimento ou disseminação de ervas daninhas ou outras plantas não transformadas sem afetar significativamente a planta ou semente de planta tolerante a inibidores de HPPD. Os técnicos no assunto entendem que a aplicação de herbicidas pode assumir muitas formas diferentes e pode ocorrer em muitos momentos diferentes antes e/ ou durante todo o processo de plantio e crescimento das sementes. A aplicação “pré-emergente” refere-se a um herbicida que é aplicado a uma área de interesse (por exemplo, um campo ou área de cultivo) antes de uma planta emergir visivelmente do solo. A aplicação “pós-emergente”

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84/114 refere-se a um herbicida que é aplicado a uma área após uma planta emergir visivelmente do solo. Em alguns casos, os termos “pré-emergente” e “pósemergente” são usados com referência a uma erva daninha em uma área de interesse e, em alguns casos, esses termos são usados com referência a uma planta de cultura em uma área de interesse. Quando usados com referência a uma erva daninha, esses termos podem se aplicar a um tipo particular de erva daninha ou espécie de erva daninha que está presente ou acredita-se estar presente na área de interesse. “Incorporação pré-planta” de um herbicida envolve a incorporação de compostos no solo antes do plantio.

[0146] Assim, a presente invenção compreende um método de controle de ervas daninhas em um campo que consiste no plantio de uma planta ou sua semente em um campo compreendendo um polipeptídeo de HPPD da presente invenção e aplicando a referida planta ou área envolvendo a referida planta uma concentração efetiva de um ou mais herbicida (s) inibidor (es) de HPPD.

[0147] Em uma forma de realização desta invenção, um campo a ser plantado com plantas (como plantas de soja, algodoeiro, milho ou trigo, por exemplo) contendo uma sequência de nucleotídeos HPPD da invenção, pode ser tratado com um herbicida inibidor de HPPD, como isoxaflutol (IFT), antes que as plantas sejam plantadas ou as sementes sejam semeadas, o que limpa o campo de ervas daninhas que são mortas pelo herbicida inibidor de HPPD, permitindo práticas de plantio direto, seguido de plantio ou semeadura das plantas nesse mesmo campo pré-tratado mais tarde (aplicação de manejo usando um herbicida inibidor de HPPD). A atividade residual do IFT também protegerá as plantas emergentes e crescentes da concorrência por ervas daninhas nos estágios iniciais de crescimento. Uma vez que as plantas atingem um certo tamanho, e as ervas daninhas tendem a reaparecer, glufosinato ou glifosato, ou um herbicida inibidor de HPPD ou uma mistura de um herbicida

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85/114 inibidor de HPPD com outro herbicida, como o glifosato, pode ser aplicado como herbicida pós-emergente na parte superior das plantas, quando essas plantas são tolerantes aos referidos herbicidas.

[0148] Em outra forma de realização desta invenção, um campo em que as sementes contendo uma sequência de nucleotídeos HPPD da invenção foram semeadas, podem ser tratadas com um herbicida inibidor de HPPD, como IFT, antes de as plantas emergirem, mas depois que as sementes são semeadas (o campo pode ser tornado isento de erva daninha antes da semeadura usando outros meios, práticas de preparo de solo tipicamente convencional, como aração, aração de aiveca ou preparação de cama de semente), onde a atividade residual manterá o campo livre de ervas mortas pelo herbicida para que as plantas emergentes e em crescimento não tenham competição de ervas daninhas (aplicação pré-emergência de um herbicida inibidor de HPPD). Uma vez que as plantas atingem um certo tamanho, e as ervas daninhas tendem a reaparecer, glufosinato ou glifosato, ou um herbicida inibidor de HPPD ou uma mistura de um herbicida inibidor de HPPD com outro herbicida, como o glifosato, pode ser aplicado como herbicida pós-emergente na parte superior das plantas, quando essas plantas são tolerantes aos referidos herbicidas.

[0149] Em outra forma de realização desta invenção, as plantas que contêm uma sequência de nucleotídeos HPPD da invenção, podem ser tratadas com um herbicida inibidor de HPPD, sobre a parte superior das plantas que emergiram das sementes que foram semeadas, o que limpa as ervas do campo mortas pelo herbicida inibidor de HPPD, que pode ser junto com (por exemplo, em uma mistura de tanque de pulverização), seguido ou precedido por um tratamento com glifosato ou glufosinato como herbicida pósemergente no topo das plantas (aplicação pós-emergência de um herbicida inibidor de HPPD (com ou sem glifosato)), quando essas plantas são tolerantes

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86/114 a tais herbicidas.

[0150] Exemplos de representantes individuais das ervas daninhas monocotiledôneas e dicotiledôneas que podem ser controladas com um herbicida inibidor de HPPD incluem:

[0151] Plantas daninhas monocotiledôneas dos gêneros: Aegilops, Agropyron, Agrostis, Alopecurus, Apera, Avena, Brachiaria, Bromus, Cenchrus, Commelina, Cynodon, Cyperus, Dactyloctenium, Digitaria, Echinochloa, Eleocharis, Eleusine, Eragrostis, Eriochloa, Festuca, Fimbristylis, Heteranthera, Imperata, Ischaemum, Leptochloa, Lolium, Monochoria, Panicum, Paspalum, Phalaris, Phleum, Poa, Rottboellia, Sagittaria, Scirpus, Setaria, Sorghum.

[0152] Ervas daninhas dicotiledôneas dos gêneros: Abutilon, Amaranthus, Ambrosia, Anoda, Anthemis, Aphanes, Artemisia, Atriplex, Bellis, Bidens, Capsella, Carduus, Cassia, Centaurea, Chenopodium, Cirsium, Convolvulus, Datura, Desmodium, Emex, Erysimum, Euphorbia, Galeopsis, Galinsoga, Galium, Hibiscus, Ipomoea, Kochia, Lamium, Lepidium, Lindernia, Matricaria, Mentha, Mercurialis, Mullugo, Myosotis, Papaver, Pharbitis, Plantago, Polygonum, Portulaca, Ranunculus, Raphanus, Rorippa, Rotala, Rumex, Salsola, Senecio, Sesbania, Sida, Sinapis, Solanum, Sonchus, Sphenoclea, Stellaria, Taraxacum, Thlaspi, Trifolium, Urtica, Veronica, Viola, Xanthium.

[0153]Os herbicidas inibidores de HPPD são úteis na presente invenção, incluindo mas não se limitando a herbicidas inibidores de HPPD da classe de tricetonas (de preferência benzobiciclon, sulcotriona, mesotriona, tembotriona, tefuriltriona, biciclopirona, fenquinotriona), dicetonitrilas, isoxazois (de preferência isoxaflutol), hidroxipirazois (de forma preferencial pirazoxifeno, benzofenap, pirazolinato, pirazulotozol, topramezona, tolpiralato), N- (1,2,5oxadiazol -3- il) benzamidas, N- (1,3,4- oxadiazol -2- il) benzamidas (de forma preferencial 2- metil -N- (5- metil -1,3,4- oxadiazol -2- il) -3- (metilsulfonil) -4

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87/114 (trifluorometil) benzamida, N- (tetrazol -5- il) - ou N- (triazol -5- il) arilcarboxamidas (de forma preferencial, 2- cloro -3- etóxi -4- (metilsulfonil) -N(1- metil -1H- tetrazol -5- il) benzamida, 4- (difluorometil) -2- metóxi -3(metilsulfonil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) benzamida; 2- cloro-3(metilsulfanil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) -4- (trifluorometil) benzamida (daqui em diante também denominado “Composto 1”); 2- (metóximetil) -3(metilsulfinil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) -4- (trifluorometil) benzamida, derivados de piridazinona, derivados de oxoprazina, N- (triazol -2- il) arilcarboxamidas, triazinonas e pirazolonas, podem ser formulados de várias maneiras, dependendo dos parâmetros biológicos e/ ou físico-químicos prevalecentes. Exemplos de possíveis formulações são: pós molháveis (WP), pós solúveis em água (SP), concentrados solúveis em água, concentrados emulsificáveis (EC), emulsões (EW), tais como emulsões óleo em água e água em óleo, soluções pulverizáveis, concentrados de suspensão (SC), dispersões à base de óleo ou água, soluções miscíveis em óleo, suspensões de cápsulas (CS), poeiras (DP), produtos para tratamento de sementes, grânulos para aplicação por semeadura à mão e no solo, grânulos (GR) na forma de microgrânulos, grânulos de pulverização, grânulos revestidos e grânulos de adsorção, grânulos dispersíveis em água (WG), grânulos solúveis em água (SG), formulações ULV, microcápsulas e ceras.

[0154] Estes tipos individuais de formulação são conhecidos em princípio e são descritos, por exemplo, em: Winnacker Küchler, “Chemische Technologie [Tecnologia Química], volume 7, C. Hanser Verlag Munich, 4^a Ed. 1986; Wade van Valkenburg, “Pesticide Formulations, Marcel Dekker, Nova York, 1973; K. Martens, “Spray Drying” Handbook, 3^a Ed. 1979, G. Goodwin Ltd. London.

[0155] Os auxiliares de formulação necessários, tais como materiais inertes, tensoativos, solventes e outros aditivos, também são

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88/114 conhecidos e são descritos, por exemplo, em: Watkins, “Handbook of Insecticide Dust Diluents and Carriers, 2^a Ed., Darland Books, Caldwell N.J., H.v. Olphen, “Introduction to Clay Colloid Chemistry”; 2^a Ed., J. Wiley & Sons, N.Y.; C. Marsden, “Solvents Guide”; 2^a Ed., Interscience, N.Y. 1963; “Detergents and Emulsifiers Annual’ de McCutcheon, MC Publ. Corp., Ridgewood N.J.; Sisley e Wood, “Encyclopedia of Surface Active Agents, Chem. Publ. Co. Inc., N.Y. 1964; Schõnfeldt, “Grenzflachenaktive Ãthylenoxidaddukte [Adutos de óxido de etileno com interface ativa], Wiss. Verlagsgesell., Stuttgart, 1976; Winnacker Küchler, “Chemische Technologie [Tecnologia Química], volume 7, C. Hanser Verlag Munich, 4^a Ed. 1986.

[0156] Com base nessas formulações, também é possível preparar combinações com outras substâncias ativas como pesticidas, como, por exemplo, inseticidas, acaricidas, herbicidas, fungicidas e com protetores de fitotoxicidade, fertilizantes e/ ou reguladores de crescimento, por exemplo, na forma de mistura pronta ou uma mistura de tanque.

M. Métodos de Introdução de Gene da Invenção em Outra Planta [0157] Também são aqui fornecidos métodos para introduzir a sequência de nucleotídeos de HPPD da invenção em outra planta. A sequência de nucleotídeos de HPPD da invenção, ou um fragmento da mesma, pode ser introduzida em uma segunda planta por seleção recorrente, retrocruzamento, seleção genealógica, seleção de linhagem, seleção em massa, seleção por mutação e/ ou seleção aprimorada com marcador genético.

[0158] Assim, em uma forma de realização, os métodos da invenção compreendem cruzar uma primeira planta compreendendo uma sequência de nucleotídeos de HPPD da invenção com uma segunda planta para produzir plantas de progênie de F1 e selecionar plantas de progênie de F1 que são tolerantes a um herbicida inibidor de HPPD ou que compreendem a sequência de nucleotídeos de HPPD da invenção. Os métodos podem

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89/114 compreender ainda o cruzamento das plantas de progênie selecionadas com a primeira planta que compreende a sequência de nucleotídeos HPPD da invenção para produzir plantas de progênies de retrocruzamento e a seleção de plantas de progênies de retrocruzamento que são tolerantes a um herbicida inibidor de HPPD ou que compreendem a sequência de nucleotídeos de HPPD da invenção. Métodos para avaliar a tolerância a herbicida inibidor de HPPD são fornecidos em outras partes deste documento. Os métodos podem ainda compreender a repetição dessas etapas uma ou mais vezes seguidas para produzir segundas ou superiores plantas de progênies de retrocruzamento selecionadas que são tolerantes a um herbicida inibidor de HPPD ou que compreendem a sequência de nucleotídeos de HPPD da invenção.

[0159] Qualquer método de criação envolvendo seleção de plantas para o fenótipo desejado pode ser utilizado no método da presente invenção. Em algumas formas de realização, as plantas F1 podem ser autopolinizadas para produzir uma geração F2 de segregação. Plantas individuais podem então ser selecionadas que representam o fenótipo desejado (por exemplo, tolerância a herbicida inibidor de HPPD) em cada geração (F3, F4, F5, etc.) até que as características sejam homozigotas ou fixadas em uma população de criação.

[0160] A segunda planta pode ser uma planta com uma característica desejada, tal como tolerância a herbicidas, tolerância a insetos, tolerância à seca, controle de nematóides, eficiência no uso de água, eficiência no uso de nitrogênio, valor nutricional aprimorado, resistência a doenças, fotossíntese aprimorada, qualidade de fibra aprimorada, tolerância ao estresse, reprodução aprimorada e assim por diante. A segunda planta pode ser um evento de elite, como descrito em outras partes deste documento.

[0161] Em várias formas de realização, partes de plantas (plantas inteiras, órgãos de plantas (por exemplo, folhas, caules, raízes etc.), sementes, células vegetais, propágulos, embriões e assim por diante) podem ser colhidos

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90/114 a partir do cruzamento resultante e propagadas ou coletadas para uso a jusante (como alimentos, rações, biocombustível, óleo, flor de farinha, farinha etc.).

N. Métodos de Obtenção de um Produto Vegetal [0162] A presente invenção também se refere a um processo para obter um produto de utilidade, compreendendo colher e/ ou moer os grãos de uma cultura compreendendo uma sequência de HPPD da invenção para obter o produto de utilidade. Produtos e/ ou composições de importância agronômica e comercial da matéria, incluindo, entre outros, ração animal, artigos de utilidade e produtos e subprodutos vegetais, que são destinados para uso como alimento para consumo humano ou para uso em composições e produtos de utilidade que são destinados ao consumo humano, particularmente produtos desvitalizados de sementes/ grãos, incluindo produtos (semi-)processados produzidos a partir desses grãos/ sementes, em que o referido produto é ou compreende sementes ou grãos inteiros ou processados, ração animal, flor de farinha de milho ou de soja, farinha de milho ou de soja, milho, amido de milho, farinha de soja, flor de farinha de soja, flocos, concentrado de proteína de soja, isolados de proteína de soja, concentrado de proteína de soja texturizado, cosméticos, produtos para cuidado dos cabelos, manteiga de noz de soja, natto, tempeh, proteína de soja hidrolisada, nata sintética, creme culinário, lecitina, soja integral comestível (crua, torrada ou como edamame), iogurte de soja, queijo de soja, tofu, yuba, bem como grãos cozidos, refinados, cozidos no vapor, assados ou cozidos ligeiramente, e assim por diante, devem estar dentro do escopo da presente invenção se esses produtos e composições de matéria contiverem quantidades detectáveis das sequências de nucleotídeos e/ ou aminoácidos aqui indicadas como sendo diagnosticas para qualquer planta que contenha essas sequências de nucleotídeos.

[0163] Os seguintes exemplos são apresentados a título ilustrativo

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91/114 e não a título de limitação.

Experimental

Visão geral [0164] Exemplo 1: Criação de polipeptídeos de HPPD que sofreram mutação por mutagênese sítio-dirigida.

[0165] Exemplo 2: Clonagem, expressão e purificação de polipeptídeos de HPPD recombinantes de tipo selvagem e mutante.

[0166] Exemplo 3: Ensaio enzimático de HPPD para analisar polipeptídeos de HPPD mutantes com tolerância melhorada ao herbicida inibidor de HPPD.

[0167] Exemplo 4: Melhoria da tolerância a herbicidas mediada pela troca de resíduos em polipeptídeos de HPPD.

[0168] Exemplo 5: Transformação de soja e tolerância das plantas de soja T0.

[0169] Exemplo 6: Estabelecimento e seleção de plantas de algodoeiro T0.

[0170] Exemplo 7: Transformação de células vegetais de milho por transformação mediada por Agrobacterium.

Exemplo 1. Criação de polipeptídeos de HPPD que sofreram mutação por MUTAGÊNESE SÍTIO-DIRIGIDA [0171] A sequência de nucleotídeos de HPPD de Pseudomonas fluorescens (SEQ ID NO: 72) como descrito em WO 2009/144079 que codifica o polipeptídeo de HPPD correspondente à SEQ ID NO: 1 foi clonada de acordo com métodos bem conhecidos na técnica e como descrito em WO 2014/043435. Mutagênese subsequente sítio-saturada, mutagênese sítiodirigida e variantes combinatórias com uma ou mais mutações da sequência que codifica o ácido nucleico do polipeptídeo PfHPPD de tipo selvagem que codifica o polipeptídeo de HPPD recombinante correspondente à SEQ ID NO: 1

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92/114 foram realizadas utilizando tecnologias convencionais com base em PCR bem conhecidas na técnica (e como descrito de igual modo em WO 2014/043435). Todos os clones mutantes concebidos e sintetizados foram confirmados por sequenciação de DNA utilizando oligonucleotídeos específicos do plasmídeo. A Tabela 2, abaixo, resume os exemplos de polipeptídeos de HPPD mutantes (SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 71).

Tabela 2: Visão geral de trocas exemplares de aminoácidos que

CORRESPONDEM À POSIÇÃO DE AMINOÁCIDO NA SEQ IP NO: 1

Posição de aminoácido em relação ao polipeptídeo de HPPD da SEQ ID NO: 1

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Posição de aminoácido em relação ao polipeptídeo de HPPD da SEQ ID NO: 1

SE Q ID NO:

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Posição de aminoácido em relação ao polipeptídeo de HPPD da SEQ ID NO: 1

SE Q ID NO:

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V

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95/114

Posição de aminoácido em relação ao polipeptídeo de HPPD da SEQ ID NO: 1

SE Q ID NO:

213

215

268

270

315

335

336

337

339

340

344

345

59

A

S

P

D

S

V

Q

K

60

A

s

P

D

S

V

K

61

A

s

P

H

s

V

62

A

s

P

H

s

V

M

63

K

A

s

P

H

s

V

Q

64

A

s

P

H

s

V

Q

M

65

A

s

R

P

H

s

V

M

66

K

A

s

P

H

s

V

Q

M

67

K

A

s

R

P

H

s

V

Q

M

68

A

s

Q

P

H

s

V

Q

M

69

A

s

R

P

H

s

V

Q

M

70

K

A

s

Q

P

H

s

V

Q

M

71

L

P

F

E

[0172] Para maior clareza, as células vazias na respectiva posição de aminoácido na SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 71 são definidas como idênticas aos aminoácidos que correspondem à SEQ ID NO: 1, destacando apenas as trocas nos polipeptídeos de HPPD mutantes. Os polipeptídeos de HPPD mutantes aqui representados são exemplos como uma forma de ilustração, não como limitação.

Exemplo 2: Clonagem, expressão e purificação de polipeptídeos de HPPD RECOMBINANTES DE TIPO SELVAGEM E MUTANTE [0173] Todas as sequências de codificação de ácido nucleico

Petição 870190085376, de 30/08/2019, pág. 473/508

96/114 resultantes de HPPD de tipo selvagem e mutante que codificam o polipeptídeo de HPPD recombinante foram clonadas, produzidas e purificadas utilizando métodos bem conhecidos na técnica (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a. ed., CSH Laboratory Press, 2001, Cold Spring Harbor, NY). Todas as sequências de codificação de ácido nucleico resultantes foram clonadas em pSE420(RI)NX fundido com uma marcação N- terminal His (codificando a sequência de aminoácidos M1- A2-H3-H4-H5-H6-H7-H8-) como descrito em WO 2014/043435, e foram expressadas no grupo BL21 de Escherichia coli (DE3) (New England Biolabs, Frankfurt, Alemanha). Por clareza, todas as posições listadas com as respectivas trocas de aminoácidos de polipeptídeos de HPPD mutantes nas Tabelas 1 a 5 que correspondem a SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 71 na presente invenção, referem-se à sequência de aminoácidos de HPPD do tipo selvagem nativo sem a marcação N- terminal His correspondente à SEQ ID NO: 1.

[0174] Para a geração de amostras de polipeptídeos de HPPD purificados, as células foram cultivadas durante 3 h a 37 ^SC em 5 ml de meio LB contendo 100 pg/ml de ampicilina em um frasco agitador de 50 ml a 140 rpm. Um ml desta cultura inicial foi usado como inóculo para a cultura de expressão. As células foram cultivadas durante cerca de 3 h a 37 ^SC em 100 ml de meio LB contendo 100 pg/ml de ampicilina e Hepes a 150 mM (Merck, Darmstadt, Alemanha) em um em um frasco agitador de 500 ml a 120 rpm. A uma OD600 de cerca de 0,6, adicionou-se IPTG (Roth, Karlsruhe, Alemanha) a uma concentração de 0,4 mM. Após um cultivo adicional durante 60 minutos a 37 ^SC, a temperatura foi reduzida para 28 ^SC e o crescimento continuou durante mais 18 h a 140 rpm. As células foram obtidas por centrifugação a 4 ^SC, foram armazenados 3200 g durante 30 min em tubos Falcon de 50 ml e péletes celulares a -80 ^SC. As células foram lisadas e a proteína marcada his foi purificada de acordo com o protocolo do fabricante do kit Ni-NTA Fast Start

Petição 870190085376, de 30/08/2019, pág. 474/508

97/114 usado (Qiagen, Hilden, Alemanha) com as seguintes adaptações para aumento do rendimento: células de cultura de 50 ml foram lisadas em 4 ml e sobrenadante de lisado foi gerado por centrifugação durante 15 min a 18000 g. A quantidade de matriz nas colunas foi aumentada pela adição de 1 ml de NiNTA Superflow (Qiagen, Hilden, Alemanha) cada e amplamente retamponado em Tris 20 mM (pH 7,6) (Merck, Darmstadt, Alemanha). O sobrenadante de lisado foi aplicado e a proteína marcada com His foi ligada à matriz Ni-NTA por incubação durante 1 h a 4 ^SC.

[0175] As amostras de proteína resultantes foram novamente tamponadas em Tris 20 mM, Glicerol a 20% (pH 7,8) (Sigma- Aldrich, St. Louis, EUA) por utilização de colunas de dessalinização Zeba ™ Spin, 7K MWCO, 10 mL (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA) e analisada quanto à concentração e a pureza de proteína por Abs280 (NANODROP 8000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA) e SDS-PAGE. As concentrações de proteínas purificadas estavam de forma geral na gama de 0,6 - 4,6 mg/ml por uma pureza estimada de cerca de 90%.

[0176] Para a geração de extrato de polipeptídeo de HPPD em placas de microtitulação (MTP) para a determinação da atividade residual em ensaios de inibição, as células foram cultivadas em 40 ou 150 pL de meio LB contendo 1% de glicose (Merck, Darmstadt, Alemanha) e 100 pg/ml de ampicilina em uma placa padrão de 96 poços (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA) incubadas durante cerca de 18 h em uma incubadora de umidade a 37 °C. Foram adicionados 30 pL desta cultura inicial a 600 pL de meio LB contendo 100 pg/ml de ampicilina e Hepes 150 mM (Merck, Darmstadt, Alemanha) como inóculo para a cultura de expressão em placas de 96 poços (poços profundos de 2 ml, HJ Bioanalytik, Erkelenz, Alemanha). As placas foram seladas por uma folha de alumínio e as células foram incubadas durante 5 h a 37 ^SC em um agitador de placas a 750 rpm. A expressão foi

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98/114 induzida pela adição de IPTG em uma concentração final de 1 mM seguida por incubação selada adicional durante cerca de 18 h a 30 ^SC em um agitador de placas a 750 rpm.

[0177] As células foram obtidas por centrifugação a 4 ^SC, 2500 g durante 15 min descartando-se o sobrenadante. Os grânulos de células foram armazenados a -80 °C e lisados em 250 pL 1x BugBuster® (Merck, Darmstadt, Alemanha) em 140 mM Tris (pH 7,8), com 1: 25000 BNase® diluído (Qiagen, Hilden, Alemanha) por incubação das células ressuspensas durante 30 min a 4 ^SC e 1000 rpm. Os lisados foram clarificados por centrifugação durante 15 minutos a 4 °C, 2500 g e 150 pL de sobrenadante foram transferidos em placas padrão de 96 poços (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA) para teste posterior em quadrupletos.

Exemplo 3: Ensaio enzimático de HPPD para analisar polipeptídeos de HPPD MUTANTES COM TOLERÂNCIA MELHORADA AO HERBICIDA INIBIDOR DE HPPD [0178] A atividade de polipeptídeos de HPPD foi determinada na ausência ou presença de inibidores de HPPD utilizando o ensaio de atividade de HPPD acoplada (Figura 1).

[0179] Para a determinação da atividade residual, a constante cinética aparente (kapp) da conversão de substrato determinada foi medida como alterações cinéticas na absorvência a 320 nm em um ensaio acoplado, desde que o homogentisato (HGA) formado por HPPD a partir de HPP seja convertido diretamente na molécula absorvente de maleilacetoacetato (MAA) por meio de uma segunda enzima homogentisato dioxigenase (HGD), aplicada em excesso uniformemente em todos os ensaios (Ver a Figura 1). As medições foram realizadas em 384 placas de microtitulação (Greiner Bio- one GmbH, Frickenhausen, Alemanha) por leitores de placas (Tecan infinito M1000 ou M1000PRQ, Tecan, Mannedorf, Suíça). A proporção kcat/kM de uma atividade enzimática é proporcional à constante cinética kapp aparente e é proporcional

Petição 870190085376, de 30/08/2019, pág. 476/508

99/114 a kcat/kM *[E] ([E] = concentração de enzima). Um inibidor competitivo exibe um aumento aparente em kM e, dessa forma, uma diminuição recíproca em kapp a concentrações de substrato sem saturação. Como ambas as medições kapp na presença e na ausência do inibidor foram realizadas pelo uso de amostra de enzima idêntica, bruta ou purificada e, dessa forma, na mesma concentração de enzima, os eliminados da concentração de enzima do cálculo de atividade residual e a proporção de kapp indicam diretamente a mudança de kM devido à inibição. Destaca-se que este conceito aplica-se a pares de enzimas/inibidores que interagem de uma maneira de inibição competitiva, provavelmente correto para quase todas as variantes e inibidores de polipeptídeos aqui descritos, mas com certeza não em relação ao polipeptídeo de tipo selvagem, que é inibido de forma irreversível (para comparação, consulte WO 2014/043435, Figura 2). Consequentemente, as atividades residuais do polipeptídeo de HPPD de tipo selvagem referentes à inibição competitiva e aos valores de ki não podem ser calculados corretamente.

[0180] A solução do ensaio utilizada para a determinação de atividades residuais em amostras de polipeptídeo de HPPD bruto era composta de fosfato de sódio 200 mM (Merck, Darmstadt, Alemanha, pH 7,0), MgCI2 5 mM (Merck, Darmstadt, Alemanha), ascorbato 20 mM (Sigma-Aldrich , St. Louis, EUA), DTT 1 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA), 0,1% de F-68 Pluorônico (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA), FeSO4 a 40 μΜ (Sigma-Aldrich, St Louis, EUA), cerca de 8 mg/ml de HGD purificado e 500 μΜ de HPP de uma solução estoque 1 M em DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) e equilibrada durante 20 min a gelo. Para cada amostra de polipeptídeo de HPPD, dois ensaios foram realizados em quadrupletos, pelo que 5 pL de amostra de polipeptídeo de HPPD foram misturados primeiro com 5 pL de tampão (1x BugBuster® (Merck, Darmstadt, Alemanha); em 140 mM Tris, pH 7,8, com 1: 2500 BNase® diluído; Qiagen, Hilden, Alemanha)) ou 5 pL de inibidor diluído

Petição 870190085376, de 30/08/2019, pág. 477/508

100/114 no mesmo tampão a partir de uma solução de reserva de 0,1 M em DMSO (200 μΜ resultando em 15, 50 e 60 μΜ na amostra de polipeptídeo/inibidor de HPPD) na referência e ensaio de inibição, respectivamente, e subsequentemente com 10 pL de solução de ensaio. A alteração na absorbância a 320 nm foi seguida em intervalos de 1 min por 30 min. Os valores de kapp foram calculados como inclinação de sinal ao longo do tempo na fase inicial da reação cinética, de forma geral durante os primeiros 5-10 minutos das medidas. Além disso e de acordo com a atividade residual calculada, a conversão total, ou seja, a mudança absoluta no sinal, no período de 30 min foi monitorada como medida de modificação, e uma reatividade residual foi calculada dividindo-se a mudança de sinal na presença de inibidor pela mudança de sinal na amostra de referência sem inibidor.

[0181] As soluções de ensaio utilizadas para a determinação dos valores de ki foram compostas da mesma forma contendo seis concentrações diferentes de substrato de HPP (0 - 1350 μΜ) para cada uma das quatro concentrações de inibidor testadas. Os inibidores foram diluídos em 140 mM Tris, F-68 Pluorônico a 0,05% (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) e aplicados em concentrações adotadas para os respectivos pares de polipeptídeos/inibidores HPPD para gerar dados dinâmicos; de forma geral, suas concentrações na amostra de polipeptídeo/inibidor de HPPD estavam na faixa de 0 a 0,001 M.

Exemplo 4: Melhoria da tolerância a herbicidas mediada pela troca de RESÍDUOS EM POLIPEPTÍDEOS DE HPPD.

[0182] Quando a tolerância dos polipeptídeos de HPPD mutantes foi determinada contra um herbicida inibidor de HPPD, tornou-se evidente que algumas das novas formas de realização desta invenção não são apenas significativamente melhoradas em comparação com HPPD de referência de tipo selvagem (SEQ ID NO: 1), mas também inesperadamente melhores do que os polipeptídeos de HPPD mutantes do estado da técnica (como, por

Petição 870190085376, de 30/08/2019, pág. 478/508

101/114 exemplo, aqueles que estão sendo divulgados em WO 2014/043435) com SEQ ID NO: 2 na presente invenção como exemplo.

[0183] Conforme apresentado na Tabela 3, os polipeptídeos de HPPD mutantes do estado da técnica (WO 2014/043435) que correspondem à SEQ ID NO: 2 na presente invenção contêm trocas de resíduo na posição 335, 336, 339 e 340.

[0184] Com base no polipeptídeo de HPPD mutante compreendendo 268 (P=>A), 335 (E=>P), 336 (G=>D/H), 337 (N=>S), a introdução de outras trocas de resíduo nas posições 213, 215, 270, 315, 340,

344 e/ ou 345 polipeptídeos de HPPD mutantes gerados mostrando tolerância fortemente melhorada exemplificativa (Tabela 3), referentes a inibidores de HPPD aplicados.

[0185] Consequentemente, geramos e avaliamos novos polipeptídeos de HPPD mutantes por trocas combinadas de resíduos na posição 268 (prolina => alanina), 335 (ácido glutâmico => prolina), 336 (glicina => ácido aspártico/histidina), 337 (asparagina => serina) e, opcionalmente, compreendendo ainda trocas na posição 213, 215, 270, 315, 340, 344 e/ ou

345 (Tabelas 3 e 4), que exibem rotatividade melhorada, maior rotatividade residual e maiores valores de ki e, portanto, uma tolerância significativamente mais elevada aos herbicidas. O nível de melhoria pode diferir em relação aos polipeptídeos de HPPD empregados neste ensaio, com um nível de até 25 vezes, em comparação com a SEQ ID NO: 2 (Tabela 4).

[0186] A análise do curso temporal da inibição contra a classe química de herbicida inibidor de HPPD revelou que os herbicidas inibidores de HPPD parecem ser inibidores reversíveis contra os novos polipeptídeos de HPPD mutantes, em contraste com a característica do inibidor de ligação lenta e forte do polipeptídeo de HPPD do tipo selvagem correspondente à SEQ ID NO: 1 (Ver a Figura 2). Esses comportamentos fornecem um potencial melhor

Petição 870190085376, de 30/08/2019, pág. 479/508

102/114 e versátil para tolerâncias em plantas de culturas a herbicidas inibidores de HPPD.

[0187] Para uma elevada atividade residual na presença de herbicidas inibidores de HPPD, as posições descritas e as mudanças de resíduos são destacadas na Tabela 1 em relação à posição de aminoácido no polipeptídeo de HPPD correspondente à SEQ ID NO: 1 na presente invenção são mostradas como importantes.

Tabela 3: Tolerância de polipeptídeos de HPPD mutantes contra DIFERENTES HERBICIDAS INIBIDORES DE HPPD PERTENCENTES A DIVERSAS CLASSES QUÍMICAS [0188] Rotatividade na ausência de Composto 1 e rotatividade residual na presença de Composto 1 de acordo com o Exemplo 3 a elevada concentração de substrato e 100 μΜ de inibidor. A rotatividade foi medida como alterações cinéticas na absorbância (OD) a 320 nm no ensaio acoplado.

SEQ ID NO:

d

cc <£ C\

c r*. c\

d

ΙΓ d n

<£ d d

r*. d d

σ d d

c d

d

Rotatividade

Rotatividade residual

Rotatividade Residual [%]

1

R

P

T

E

G

N

K

A

s

1

0,203

0,021

2

P

W

A

Q

0,060

0,026

3

A

P

D

S

V

0,096

0,061

64%

4

G

P

D

S

V

0,126

0,055

44%

5

P

D

S

V

0,157

0,059

38%

6

A

N

P

D

S

V

0,165

0,082

50%

7

G

N

P

D

S

V

0,149

0,063

42%

8

N

P

D

s

V

0,107

0,054

50%

9

A

P

D

s

V

0,102

0,053

52%

Petição 870190085376, de 30/08/2019, pág. 480/508

103/114

SEQ ID NO:

Cl

cc <£ c\

c Γ*. c\

m

σ: Cl

<£ Cl Cl

Γ*. σ: ci

σ ci σ:

c Μ

Cl

m ci

Rotatividade

Rotatividade residual

Rotatividade Residual [%]

10

G

P

D

S

V

0,125

0,070

56%

11

P

D

S

V

0,160

0,071

44%

12

A

N

P

D

S

V

0,115

0,058

50%

13

G

N

P

D

S

V

0,024

n,d,

14

N

P

D

S

V

0,188

0,062

33%

15

R

N

P

D

S

V

0,040

0,030

16

S

N

P

D

S

V

0,181

0,083

46%

17

A

E

P

D

S

V

0,138

0,081

59%

18

E

P

D

S

V

0,134

0,057

43%

19

R

E

P

D

S

V

0,141

0,063

45%

20

S

E

P

D

S

V

0,199

0,105

53%

21

A

P

D

S

V

Q

V

0,157

0,080

51%

22

G

P

D

S

V

Q

V

0,132

0,062

47%

23

P

D

S

V

Q

V

0,193

0,076

39%

24

A

P

H

S

V

0,271

0,105

39%

25

G

P

H

S

V

0,215

0,083

39%

26

P

H

S

V

0,279

0,077

28%

27

A

N

P

H

S

V

0,266

0,101

38%

28

G

N

P

H

s

V

0,204

0,088

43%

29

N

P

H

s

V

0,289

0,084

29%

30

A

P

H

s

V

0,311

0,149

48%

31

G

P

H

s

V

0,268

0,098

37%

32

P

H

s

V

0,326

0,128

39%

Petição 870190085376, de 30/08/2019, pág. 481/508

104/114

SEQ ID NO:

Cl

cc <£ c\

c fs C\

m

σ: Cl

<£ Cl Cl

|s. cr ci

σ ci σ:

c Μ

Cl

m ci

Rotatividade

Rotatividade residual

Rotatividade Residual [%]

33

A

N

P

H

S

V

0,189

0,087

46%

34

G

N

P

H

S

V

0,243

0,113

47%

35

N

P

H

S

V

0,036

0,023

36

R

N

P

H

S

V

0,108

0,066

61%

37

S

N

P

H

S

V

0,096

0,048

50%

38

A

E

P

H

S

V

0,286

0,129

45%

39

G

E

P

H

S

V

0,244

0,097

40%

40

G

E

P

D

S

V

0,134

0,073

54%

41

R

E

P

H

S

V

0,280

0,105

38%

42

S

E

P

H

s

V

0,278

0,111

40%

43

A

E

P

H

s

V

Q

V

0,190

0,110

58%

44

G

E

P

H

s

V

Q

V

0,036

n,d,

45

A

N

P

H

s

V

Q

V

0,214

0,121

57%

46

G

N

P

H

s

V

Q

V

0,179

0,098

55%

47

A

N

P

H

s

V

Q

M

0,314

0,166

53%

48

G

N

P

H

s

V

Q

M

0,225

0,117

52%

49

N

P

H

s

V

Q

M

0,316

0,103

33%

50

S

N

P

H

s

V

Q

M

0,315

0,138

44%

51

A

N

P

D

s

V

K

0,131

0,074

56%

52

A

N

P

D

s

V

Q

0,189

0,088

47%

53

A

N

P

D

s

V

Q

V

0,199

0,107

54%

54

A

N

P

D

s

V

Q

K

0,089

0,059

66%

55

A

N

P

H

s

V

K

0,189

0,095

50%

Petição 870190085376, de 30/08/2019, pág. 482/508

105/114

SEQ ID NO:

d

cc <£ C\

c r*. c\

d

ΙΓ d n

<£ d d

r*. d d

σ d d

c d

d

Rotatividade

Rotatividade residual

Rotatividade Residual [%]

56

A

N

P

H

S

V

Q

0,152

0,086

57%

57

A

N

P

H

S

V

Q

K

0,167

0,099

59%

58

A

S

P

D

s

V

0,144

0,065

45%

59

A

S

P

D

s

V

Q

K

0,131

0,074

56%

60

A

S

P

D

s

V

K

0,103

0,046

45%

61

A

S

P

H

s

V

0,229

0,091

40%

62

A

S

P

H

s

V

M

0,308

0,115

37%

63

K

A

S

P

H

s

V

Q

0,23

0,156

68%

64

A

S

P

H

s

V

Q

M

0,242

0,114

47%

65

A

S

R

P

H

s

V

M

0,327

0,177

54%

66

K

A

S

P

H

s

V

Q

M

0,336

0,187

56%

67

K

A

S

R

P

H

s

V

Q

M

0,335

0,215

64%

68

A

S

Q

P

H

s

V

Q

M

0,346

0,223

64%

69

A

S

R

P

H

s

V

Q

M

0,36

0,237

66%

70

K

A

S

Q

P

H

s

V

Q

M

0,338

0,240

71%

71

L

P

F

E

0,044

0,022

[0189] A rotatividade residual foi determinada de acordo com ο

Exemplo 3, medindo a mudança total de sinal, na presença e ausência do Composto 1 (2-cloro-3- (metilsulfanil) -N- (1- metil-1H- tetrazol -5- II) - 4(trifluorometil) benzamida). Para cada polipeptídeo de HPPD mutante, a mudança total no sinal sem herbicidas inibidores de HPPD serviu para a normalização da mudança total de sinal na presença do herbicida. Os “valores para a rotatividade resumidos nas respectiva tabela são médias das medidas

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106/114 em quádruplos com um desvio padrão médio de 5%. Para maior clareza, as células vazias na respectiva posição de aminoácido da SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 71 são definidas como idênticas aos aminoácidos que correspondem à SEQ ID NO: 1, destacando apenas as trocas na variante do polipeptídeo de HPPD.

[0190] Na dada concentração de inibidor de 100 μΜ do Composto 1 no ensaio, a HPPD de referência de tipo selvagem (SEQ ID NO: 1) e também os polipeptídeos de HPPD mutantes do estado da técnica (como, por exemplo, aqueles divulgados em WO 2014/043435) com a SEQ ID NO: 2, ou o polipeptídeo de HPPD mutante (como, por exemplo, os divulgados no documento WO 2015/135881) com a SEQ ID NO: 71 nesta invenção como exemplo, não exibem alterações cinéticas significativas na absorbância a 320 nm (Abs320) no ensaio de atividade de HPPD acoplada em comparação com os valores medidos com o polipeptídeo de HPPD knock-out. O valor para o polipeptídeo de HPPD knock-out sem inibidor foi de 0,021 (alterações na absorbância a 320 nm) e os valores dos polipeptídeos de HPPD que correspondem a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 71 foram 0,021, 0,026 e 0,022 na concentração de inibidor de 100 μΜ, respectivamente.

[0191] O polipeptídeo de HPPD knockout foi obtido trocando uma histidina por uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 162 da SEQ ID NO: 1. Esta posição é bem conhecida por sua importância devido ao seu envolvimento na ligação coordenada do átomo de ferro no sítio ativo do polipeptídeo de HPPD (Serre et al. (1999), Structure, 7, 977-988).

[0192] O polipeptídeo de HPPD mutante correspondente à SEQ ID NO: 3 com trocas de aminoácidos nas posições 268, 335, 336, 337 e 340 em relação ao polipeptídeo de HPPD de acordo com a SEQ ID NO: 1, exibe na presença do inibidor da HPPD testado uma melhora em relação às

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107/114 rotatividades residuais (Tabela 3) versus o polipeptídeo de HPPD de tipo selvagem (SEQ ID NO: 1), mas também versus os polipeptídeos de HPPD mutantes do estado da técnica (WO 2014/043435 e WO 2015/ 135881) correspondentes a SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 71 nesta invenção. A SEQ ID NO: 6, que difere apenas nas posições 270 do polipeptídeo de HPPD de acordo com a SEQ ID NO: 3, exibe um aumento na rotatividade absoluta e na rotatividade residual absoluta na presença do inibidor da HPPD Composto 1 (Tabela 3).

[0193] Iniciando a partir da SEQ ID NO: 26 e introduzindo uma alanina na posição de aminoácido 268, correspondente à SEQ ID NO: 1, produzindo a SEQ ID NO: 24, exibe um aumento na rotatividade residual na presença do inibidor da HPPD Composto 1 (Tabela 3).

[0194] Começando pela SEQ ID NO: 49 com trocas de aminoácidos nas posições 270, 335, 336, 337, 340, 344 e 345 em relação ao polipeptídeo de HPPD de acordo com a SEQ ID NO: 1 e introduzindo uma alanina na posição de aminoácido 268 (SEQ ID NO: 47), exibe um aumento significativo na rotatividade residual na presença do inibidor da HPPD Composto 1 (Tabela 3).

[0195] A introdução e combinação de trocas mencionadas acima nas posições 268, 270, 335, 336, 337, 340, 344, 345 demonstrando a importância das trocas combinatórias de resíduos nas posições de aminoácidos divulgadas.

[0196]Outras melhorias na tolerância ao inibidor de HPPD são aparentes em variantes com trocas de resíduos nas posições de aminoácidos divulgadas 213, 215 e 315. Polipeptídeos de HPPD mutantes exemplificativos SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 e SEQ ID NO: 70 têm trocas combinatórias de resíduos adicionais na posição 213 e/ ou 315 em comparação com o polipeptídeo de HPPD mutante SEQ ID NO: 64.

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108/114

Essas alterações aumentam significativamente a rotatividade e a rotatividade residual na presença do inibidor da HPPD Composto 1 (Tabela 3).

Tabela 4: Avaliação da tolerância de polipeptídeos de HPPD que sofreram

MUTAÇÃO CONTRA HERBICIDA INIBIDOR DE HPPD COMPOSTO 1 PERTENCENTES A VÁRIAS CLASSES QUÍMICAS PELA DETERMINAÇÃO DOS VALORES DE Kl

Posição de aminoácido relativa ao polipeptídeo de HPPD da SEQ ID NO: 1

SEQ ID NO:

CO CM

m CM

¢0 CO CM

o CM

m CO

m CO CO

CO CO CO

CO CO

O) CO CO

o CO

m CO

Composto 1 ki [μΜ]

1

R

P

T

E

G

N

K

A

s

I

-

2

P

W

A

Q

1

47

A

N

P

H

S

V

Q

M

25

63

K

A

S

P

H

S

V

Q

24

68

A

S

Q

P

H

S

V

Q

M

28

70

K

A

S

Q

P

H

S

V

Q

M

22

[0197] Para maior clareza, as células vazias na respectiva posição de aminoácido em SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 71 são definidas como idênticas aos aminoácidos que correspondem à SEQ ID NO: 1, destacando apenas as trocas nos polipeptídeos de HPPD mutantes. Os polipeptídeos de HPPD mutantes aqui representados são exemplos como uma forma de ilustração, não como limitação.

[0198] Os dados foram obtidos medindo-se as taxas de reação inicial com concentrações crescentes de Composto 1 (2- cloro -3- (metilsulfanil) -N- (1- metil -1H- tetrazol -5- il) -4- (trifluorometil) benzamida). De forma geral, foram aplicadas seis concentrações diferentes de substrato de HPP (0 - 1350 μΜ) e quatro diferentes concentrações do respectivo inibidor. As concentrações

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109/114 de inibidor foram adotadas para os respectivos pares de polipeptídeos/inibidores de HPPD para gerar dados dinâmicos, ou seja, as variantes com menor tolerância foram analisadas em uma gama de concentrações inferiores de inibidor e foram utilizadas concentrações até 1000 μΜ para variantes com tolerância máxima. GraphPad Prism (versão 6.00 para Windows, GraphPad Software, La Jolla, Califórnia, EUA) foi usado para análise de dados e montagem de constantes cinéticas aplicando restrições de acordo com um modo de inibição competitiva. Onde ocorreram valores atípicos óbvios, ou as atividades obtidas em concentrações de substratos muito altas não obedeceram à matemática subjacente ao modo de inibição competitiva, os valores respectivos foram excluídos do ajuste.

Exemplo 5: Transformação de soja e tolerância das plantas de soja T0 [0199] A transformação da soja foi conseguida com o uso de métodos bem conhecidos na técnica, como o descrito utilizando-se os explantes de meia semente de soja de transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens usando essencialmente o método descrito por Paz et al. (2006), Plant cell Rep. 25: 206. Os transformantes foram identificados com o uso de herbicida inibidor de HPPD com “tembotriona” como marcador de seleção. A aparência de brotos verdes foi observada e documentada como um indicador de tolerância ao herbicida inibidor de HPP com tembotriona. Os brotos transgênicos tolerantes mostraram enverdecimento normal comparável aos brotos de soja de tipo selvagem não tratadas com o herbicida inibidor de HPP com tembotriona, enquanto os brotos de soja do tipo selvagem tratados com a mesma quantidade de herbicida inibidor de HPPD com tembotriona foram totalmente branqueados. Isto indicou que a presença do respectivo polipeptídeo de HPPD permitiu a tolerância aos herbicidas inibidores de HPPD, como tembotriona.

[0200] Os brotos verdes tolerantes foram transferidos para meios de enraizamento ou enxertados. As plântulas enraizadas foram transferidas para a

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110/114 estufa após um período de aclimatação. As plantas que contêm o transgene foram então pulverizadas com herbicidas inibidores de HPPD, como, por exemplo, com mesotriona a uma taxa de 300 a 600 g Al/ha, ou com o Composto 1 (2- cloro -3(metilsulfanil) -N- (1 - metil -1H- tetrazol -5- il) -4- (trifluorometil) benzamida) a uma taxa de 150 g -300 g Al/ha suplementado com sulfato de amônio e óleo de colza em éster metílico. Cinco a dez dias após a aplicação, os sintomas decorrentes da aplicação do herbicida foram avaliados e comparados aos sintomas observados em plantas de tipo selvagem nas mesmas condições. Por exemplo, as plantas de soja TO com um cassete de expressão da planta, que inclui um polipeptídeo de HPPD tolerante ao inibidor de HPPD da presente invenção, foram testadas em relação à tolerância do Composto 1.

[0201] Ensaios anteriores de estufa com as plantas transgênicas, os transformantes de soja foram analisados rotineiramente para a expressão e presença de transgenes usando o método de detecção de proteína ELISA (Ver a descrição detalhada nos itens D e H). Apenas as plantas que se recuperaram no meio de seleção e com uma expressão de proteína de transgene HPPD detectável foram utilizadas para a análise de tolerância ao herbicida. Um pulverizador DeVries Tracker foi calibrado antes de cada pulverização. A formulação química utilizada para o Composto 1 foi complementada com sulfato de amônio e óleo de colza metilado. Os testes de pulverização foram conduzidos com uma concentração, o que equivale a 300 gramas de Al por hectare (300 g Al/ha).

[0202] Em ensaios de estufa, eventos de soja T0 independentes contendo um polipeptídeo de HPPD mutante exemplificado foram pulverizados com o herbicida inibidor de HPPD Composto 1 (2- cloro -3- (metilsulfanil) -N- (1- metil 1H- tetrazol -5- il) -4- (trifluorometil) benzamida) com uma taxa de 300 gramas Al/ha, suplementado com sulfato de amônio e óleo de colza com éster metílico. Cinco dias após a aplicação, a área danificada da folha devido ao herbicida inibidor de HPPD é classificada em uma escala de 0 (sem danos) a 100 (branqueamento completo).

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111/114

Sob essas condições, as plantas de tipo selvagem foram completamente branqueadas e suas pontuações de dano estavam entre de 95 -100.

[0203] A Tabela 5 apresenta a distribuição dos dados de pontuação de dano de herbicida inibidor de HPPD como percentil para polipeptídeos tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD mutantes exemplares (SEQ ID NOs). Os percentis normalizam as classificações da pontuação de dano de uma planta individual em uma população. O valor do percentil 25 é a pontuação de dano em que 25% dos eventos de soja na população dada apresentaram pontuações de dano menores e 75% maiores. A média é o percentil 50. Metade dos valores apresentou maiores pontuações de dano; metade apresentou menores pontuações de dano. O valor do percentil 75 e 90 é a pontuação de danos onde 75% e 90% dos eventos de soja apresentaram menor pontuação de dano, respectivamente. A diferença entre o percentil 75 e 25 é chamada de intervalo interquartil e um marcador para quantificar a dispersão na população. Todos os construtos tinham apenas uma única inserção de cassete no genoma da soja.

[0204] Na Tabela 5, todas as variantes de polipeptídeo de HPPD de exemplo são melhor em todas as análises de percentil do que o polipeptídeo de HPPD mutante do estado da técnica (WO 2014/043435) correspondente à SEQ ID NO: 2 na presente invenção. A pontuação do polipeptídeo de HPPD mutante do estado da técnica (WO 2014/043435) correspondente à SEQ ID NO: 2 na presente invenção está listada na linha inferior da Tabela 5.

Tabela 5: Avaliação do dano da área foliar de eventos transgênicos de SOJA T0 CINCO DIAS APÓS A APLICAÇÃO DO COMPOSTO 1 A UMA TAXA DE 300 G AI/ha por distribuição de percentil.

Eventos de soja T0 expressando polipeptídeo de	Número total de eventos independentes pulverizados	25^e	Mediana	75^e	Intervalo interquartil	90⁹
SEQ ID NO: 47	57	5,0	15,0	15,0	10,0	51,0
SEQ ID NO: 66	11	5,0	10,0	25,0	20,0	41,0

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112/114

Eventos de soja T0 expressando polipeptídeo de	Número total de eventos independentes pulverizados	25^e	Mediana	75^e	Intervalo interquartil	90⁹
SEQ ID NO: 68	14	5,0	10,0	16,3	11,3	20,0
SEQ ID NO: 69	11	20,0	20,0	25,0	5,0	42,0
SEQ ID NO: 70	9	10,0	15,0	25,0	15,0	35,0
SEQ ID NO: 2	75	15,0	20,0	45,0	30,0	87,0

Exemplo 6: Estabelecimento e seleção de plantas de algodoeiro TO [0205] A transformação de algodoeiro é conseguida com métodos bem conhecidos na técnica, método especialmente preferencial no descrito na publicação de patente PCT WO 00/71733. As plantas regeneradas são transferidas para a estufa. Após um período de aclimatação, as plantas suficientemente cultivadas são pulverizadas com herbicidas inibidores de HPPD, como, por exemplo a tembotriona equivalente a 100 ou 200 gAI/ha complementado com sulfato de amônio e óleo de colza com éster metílico. Sete dias após a aplicação da pulverização, os sintomas decorrentes do tratamento com o herbicida inibidor de HPPD são avaliados e comparados aos sintomas observados em plantas de algodoeiro do tipo selvagem submetidas ao mesmo tratamento nas mesmas condições.

Exemplo 7: Transformação de células vegetais de milho por TRANSFORMAÇÃO MEDIADA POR AGROBACTERIUM [0206] A construção do cassete de expressão da planta para uma expressão estável na planta de milho e a transformação de milho são bem conhecidos na técnica e, neste exemplo particular, os métodos foram descritos e utilizados a partir de WO 2014/043435 e WO 2008/100353. As sequências polinucleotídicas que codificam os polipeptídeos de HPPD mutantes nesta aplicação são empilhadas com uma sequência polinucleotídica que codifica uma variante de proteína EP SPS para conferir tolerância a herbicidas, que visam o EP SPS. O gene EP SPS foi isolado e sofreu mutação a partir de

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Arthrobacter globiformis (WO 2008/100353) e unido na estrutura a uma sequência de péptido de trânsito para guiar a translocação da proteína traduzida para o cloroplasto. A expressão estável é conseguida com um promotor ubíquo (promotor Ubiquitina 4 da cana-de-açúcar, Patente U.S. 6.638.766) e uma sequência de terminação 35S do Vírus do Mosaico da Couve-Flor, que é clonada com fluxos ascendentes e descendentes do gene EP SPS, respectivamente.

[0207] O polipeptídeo de HPPD mutante correspondente será clonado com o mesmo promotor, peptídeo de trânsito de cloroplasto e sequência de terminação como descrito para o cassete de expressão do gene EP SPS. As sequências de codificação para ambos os genes são otimizadas por códon para a expressão de milho. Na transformação de milho, as espigas são mais bem colhidas 8 a 12 dias após a polinização. Os embriões são isolados das espigas e os embriões de 0,8 a 1,5 mm de tamanho são preferidos para serem utilizados em transformação. Os embriões são plaqueados com o escutelo lateralmente para cima em um meio de incubação adequado e incubados durante a noite a 25 ^SC no escuro.

[0208] No entanto, não é necessário per se incubar os embriões durante a noite. Os embriões são postos em contato com um grupo de Agrobacterium contendo os vetores apropriados possuindo uma sequência de nucleótidos da presente invenção para a transferência mediada por plasmídeo Ti durante cerca de 5 -10 min e depois são colocadas em placas em meios de cocultivo durante cerca de 3 dias (25 ^SC no escuro). Após o cocultivo, os explantes são transferidos para meios do período de recuperação durante cerca de cinco dias (a 25 ^SC no escuro). Os explantes são incubados em meios de seleção com glifosato por até oito semanas, dependendo da natureza e características da seleção particular utilizada. Após o período de seleção, o calo resultante é transferido para meios de maturação embrionária, até que a

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114/114 formação de embriões somáticos maduros seja observada. Os embriões somáticos maduros resultantes são então colocados sob pouca luz, e o processo de regeneração é iniciado como conhecido na técnica. Os brotos resultantes têm o enraizamento permitido em meios de enraizamento, e as plantas resultantes são transferidas para potes de viveiro e propagadas como plantas transgênicas. As plantas são rotineiramente analisadas quanto à expressão e presença dos transgenes usando o método de detecção de proteína ELISA. Apenas as plantas que se recuperaram no meio de seleção e com uma expressão de proteína de transgene HPPD detectável são utilizadas para a análise de tolerância ao herbicida.

[0209] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados no relatório descritivo são indicativos do nível de habilidade dos técnicos no assunto aos quais esta invenção se refere. Todas as publicações e pedidos de patente são aqui incorporados por referência na mesma medida como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse, especificamente e individualmente, indicado para ser incorporado por referência.

[0210] Embora a invenção acima tenha sido descrita em alguns detalhes a título de ilustração e exemplo para fins de clareza de compreensão, será óbvio que certas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims

Reivindicações

1. MOLÉCULA de ácido nucleico recombinante, caracterizada por codificar um polipeptídeo de 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase (HPPD) que consiste em uma sequência de aminoácidos compreendendo (a) uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 268 da SEQ ID NO: 1, (b) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, (c) uma histidina ou um ácido aspártico na posição que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1 e (d) uma serina na posição que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1 e em que o referido polipeptídeo de HPPD é tolerante a um ou mais herbicidas inibidores de HPPD.
2. MOLÉCULA de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo referido polipeptídeo de HPPD codificado consistir em uma sequência de aminoácidos compreendendo ainda:

i. uma lisina ou leucina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 213 da SEQ ID NO: 1; e/ ou ii. uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 215 da SEQ ID NO: 1; e/ ou iii. uma arginina, asparagina, leucina, ácido glutâmico, prolina ou serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 270 da SEQ ID NO: 1; e/ ou iv. uma arginina, lisina, glutamina, metionina ou histidina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 315 da SEQ ID NO: 1; e/ou

v. uma arginina, glutamina, metionina, ácido glutâmico, glicina, leucina ou valina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; e/ ou vi. uma glutamina, prolina ou arginina na posição de aminoácido

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2/11 que corresponde à posição de aminoácido 344 da SEQ ID NO: 1; e/ ou vii. uma lisina, arginina, metionina, alanina ou valina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1, e em que o referido polipeptídeo de HPPD é tolerante a um ou mais herbicidas inibidores de HPPD.
3. MOLÉCULA de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo referido polipeptídeo de HPPD codificado consistir em uma sequência de aminoácidos compreendendo ainda:

i. uma leucina ou lisina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 213 da SEQ ID NO: 1; e/ ou ii. uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 215 da SEQ ID NO: 1; e/ ou iii. uma asparagina, ácido glutâmico ou serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 270 da SEQ ID NO: 1; e/ ou iv. uma arginina, lisina, glutamina ou metionina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 315 da SEQ ID NO: 1; e/ ou

v. uma arginina ou valina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; e/ ou vi. uma glutamina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 344 da SEQ ID NO: 1; e/ ou vii. uma lisina, valina ou metionina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1 e em que o referido polipeptídeo de HPPD é tolerante a um ou mais herbicidas inibidores de HPPD.
4. MOLÉCULA de ácido nucleico recombinante, de acordo

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3/11 com a reivindicação 1, caracterizada pelo referido polipeptídeo de HPPD codificado consistir em uma sequência de aminoácidos compreendendo ainda:

i. uma lisina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 213 da SEQ ID NO: 1; e/ ou ii. uma asparagina, ácido glutâmico ou serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 270 da SEQ ID NO: 1; e/ ou iii. uma arginina, lisina, glutamina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 315 da SEQ ID NO: 1; e/ ou iv. uma arginina ou valina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; e/ ou

v. uma glutamina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 344 da SEQ ID NO: 1; e/ ou vi. uma lisina, valina ou metionina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1.

e em que o referido polipeptídeo de HPPD é tolerante a um ou mais herbicidas inibidores de HPPD.
5. MOLÉCULA de ácido nucleico recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo referido polipeptídeo de HPPD codificado compreender uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 53% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1.
6. MOLÉCULA de ácido nucleico recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por sua sequência de nucleotídeos ser uma sequência sintética que foi projetada para expressão em uma planta.
7. MOLÉCULA de ácido nucleico recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por sua sequência

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4/11 de nucleotídeos estar operacionalmente ligada a um promotor capaz de dirigir a expressão da sequência de nucleotídeos em uma célula vegetal.
8. MOLÉCULA de ácido nucleico recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo referido herbicida inibidor de HPPD ser selecionado a partir do grupo que consiste em tricetonas, dicetonitrilas, isoxazóis, hidroxipirazóis, N-(1,2,5-oxadiazol-3il)benzamidas, N-(1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamidas, N-(tetrazol-5-il)- ou N(triazol-5-il)arilcarboxamidas, derivados de piridazinona, derivados de oxoprazina, N-(triazol-2-il)arilcarboxamidas, triazinonas, pirazolonas.
9. MOLÉCULA de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo referido herbicida inibidor de HPPD ser selecionado a partir do grupo que consiste em benzobiciclon, sulcotriona, mesotriona, tembotriona, tefuriltriona, biciclopirona, fenquinotriona, isoxaflutol, dicetonitrila, pirazoxifen, benzofenap, pirazolinato, pirassulfotol, topramezona, tolpiralato, 2-metil-N-(5-metil-1,3,4-oxadiazol-2-il)-3-(metilsulfonil) -4(trifluorometil)benzamida, 2-cloro-3-etoxi-4-(metilsulfonil)-N-(1 -metil-1 Htetrazol-5-il)benzamida, 4-(difluorometil)-2-metoxi-3-(metilsulfonil)-N-(1 -metil-1 H -tetrazol-5-il)benzamida, 2-cloro-3-(metilsulfanil)-N-(1 -metil-1 H-tetrazol-5-il)-4(trifluorometil)-benzamida e 2-(metoximetil)-3-(metilsulfinil)-N-(1 -metil-1 Htetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida.
10. CÉLULA hospedeira, caracterizada por conter a molécula de ácido nucleico recombinante conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
11. CÉLULA hospedeira, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por ser uma célula hospedeira bacteriana.
12. CÉLULA hospedeira, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por ser uma célula vegetal.
13. PLANTA transgênica, caracterizada por compreender a

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5/11 molécula de ácido nucleico recombinante conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
14. PLANTA, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pela referida planta ser selecionada a partir do grupo que consiste em milho, sorgo, trigo, girassol, tomateiro, crucíferas, pimenteira, batata, algodoeiro, arroz, soja, beterraba sacarina, cana de açúcar, planta de fumo, cevada e colza.
15. SEMENTE transgênica, caracterizada por compreender a molécula de ácido nucleico recombinante conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
16. POLIPEPTÍDEO RECOMBINANTE, caracterizado por compreender um polipeptídeo de HPPD, em que o referido polipeptídeo de HPPD é tolerante a um ou mais herbicidas inibidores de HPPD e em que o referido polipeptídeo de HPPD compreende (a) uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 268 da SEQ ID NO: 1, (b) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, (c) uma histidina ou um ácido aspártico na posição que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1 e (d) uma serina na posição que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1.
17. POLIPEPTÍDEO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo referido polipeptídeo de HPPD compreender ainda:

i. uma lisina ou leucina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 213 da SEQ ID NO: 1; el ou ii. uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 215 da SEQ ID NO: 1; el ou iii. uma arginina, asparagina, leucina, ácido glutâmico, prolina ou

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6/11 serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 270 da SEQ ID NO: 1; e/ou iv. uma arginina, lisina, glutamina, metionina ou histidina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 315 da SEQ ID NO: 1; e/ou

v. uma arginina, glutamina, metionina, ácido glutâmico, glicina, leucina ou valina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; e/ ou vi. uma glutamina, prolina ou arginina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 344 da SEQ ID NO: 1; e/ ou vii. uma lisina, arginina, metionina, alanina ou valina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1, e em que o referido polipeptídeo de HPPD é tolerante a um ou mais herbicidas inibidores de HPPD.
18. POLIPEPTÍDEO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo referido polipeptídeo de HPPD compreender ainda:

i. uma leucina ou lisina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 213 da SEQ ID NO: 1; e/ ou ii. uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 215 da SEQ ID NO: 1; e/ ou iii. uma asparagina, ácido glutâmico ou serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 270 da SEQ ID NO: 1; e/ ou iv. uma arginina, lisina, glutamina ou metionina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 315 da SEQ ID NO: 1; e/ ou

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v. uma valina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; e/ ou vi. uma glutamina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 344 da SEQ ID NO: 1; e/ ou vii. uma lisina, valina ou metionina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1, e em que o referido polipeptídeo de HPPD é tolerante a um ou mais herbicidas inibidores de HPPD.
19. POLIPEPTÍDEO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo referido polipeptídeo de HPPD compreender ainda:

i. uma lisina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 213 da SEQ ID NO: 1; e/ ou ii. uma asparagina, ácido glutâmico ou serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 270 da SEQ ID NO: 1; e/ ou iii. uma arginina, lisina, glutamina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 315 da SEQ ID NO: 1; e/ ou iv. uma valina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; e/ ou

v. uma glutamina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 344 da SEQ ID NO: 1; e/ ou vi. uma lisina, valina ou metionina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1, e em que o referido polipeptídeo de HPPD é tolerante a um ou mais herbicidas inibidores de HPPD.
20. POLIPEPTÍDEO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo referido polipeptídeo de HPPD

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8/11 compreender ainda:

i. uma asparagina, ácido glutâmico ou serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 270 da SEQ ID NO: 1; e/ ou ii. uma arginina, lisina, glutamina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 315 da SEQ ID NO: 1; e/ ou iii. uma valina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; e/ ou iv. uma glutamina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 344 da SEQ ID NO: 1; e/ ou

v. uma lisina, valina ou metionina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1, e em que o referido polipeptídeo de HPPD é tolerante a um ou mais herbicidas inibidores de HPPD.
21. POLIPEPTÍDEO RECOMBINANTE, caracterizado por compreender um polipeptídeo de HPPD, em que o referido polipeptídeo de HPPD é tolerante a um ou mais herbicidas inibidores de HPPD e em que a referida proteína HPPD compreende uma alanina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 268 da SEQ ID NO: 1, uma asparagina ou serina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 270 da SEQ ID NO: 1, uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma histidina ou um ácido aspártico na posição que corresponde à posição de aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição que corresponde à posição de aminoácido 337 da SEQ ID NO: 1, uma valina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1, uma glutamina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 344 da SEQ ID NO: 1 e uma valina ou metionina ou lisina na posição de aminoácido que

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9/11 corresponde à posição de aminoácido 345 da SEQ ID NO: 1.
22. POLIPEPTÍDEO RECOMBINANTE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 21, caracterizado pelo referido polipeptídeo de HPPD compreender uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 53% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1.
23. POLIPEPTÍDEO RECOMBINANTE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 21, caracterizado pelo referido herbicida inibidor de HPPD ser selecionado a partir do grupo que consiste em tricetonas, dicetonitrilas, isoxazóis, hidroxipirazóis, N-(1,2,5-oxadiazol-3-il)benzamidas, N(1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamidas, N-(tetrazol-5-il)- ou N-(triazol-5-il) arilcarboxamidas, derivados de piridazinona, derivados de oxoprazina, N(triazol-2-il)arilcarboxamidas, triazinonas e pirazolonas.
24. POLIPEPTÍDEO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo referido herbicida inibidor de HPPD ser selecionado a partir do grupo que consiste em benzobiciclon, sulcotriona, mesotriona, tembotriona, tefuriltriona, biciclopirona, fenquinotriona, isoxaflutol, dicetonitrila, pirazoxifen, benzofenap, pirazolinato, pirassulfotol, topramezona, tolpiralato, 2-metil-N-(5-metil-1,3,4-oxadiazol-2-il)-3-(metilsulfonil)-4-(trifluoro metil)benzamida, 2-cloro-3-etoxi-4-(metilsulfonil)-N-(1 -metil-1 H-tetrazol-5-i I) benzamida, 4-(difluorometil)-2-metoxi-3-(metilsulfonil)-N-(1 -metil-1 H-tetrazol-5il)benzamida, 2-cloro-3-(metilsulfanil)-N-(1 -metil-1 H-tetrazol-5-i l)-4-(trif luoro metil)-benzamida e 2-(metoximetil)-3-(metilsulfinil)-N-(1 -metil-1 H-tetrazol-5-il)-4(trifluorometil)benzamida.
25. MÉTODO PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO com atividade de tolerância a herbicida inibidor de HPPD, caracterizado por compreender cultivar a célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 10, sob condições em que uma molécula de ácido nucleico que codifica o

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10/11 polipeptídeo é expressa.
26. PLANTA, caracterizada por possuir, estavelmente incorporado no seu genoma, um construto de DNA, em que o referido construto compreende um promotor operacionalmente ligado ao ácido nucleico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
27. PLANTA, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pela referida planta ser selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula vegetal, um tecido vegetal e uma semente de planta.
28. PLANTA, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pela referida planta ser selecionada a partir do grupo que consiste em milho, sorgo, trigo, girassol, tomateiro, crucíferas, pimenteira, batata, algodoeiro, arroz, soja, beterraba sacarina, cana de açúcar, planta de fumo, cevada e colza.
29. SEMENTE transgênica, caracterizada por ser da planta, conforme definida na reivindicação 25, possuindo o construto de DNA incorporado de maneira estável em seu genoma, em que o referido construto de DNA compreende um promotor operacionalmente ligado ao ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
30. MÉTODO PARA CONTROLAR ERVAS daninhas em um campo, caracterizado por compreender plantar a planta, conforme definida na reivindicação 25, ou uma semente da mesma em um campo e aplicar ao referido campo uma concentração eficaz de um herbicida inibidor de HPPD.
31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo referido herbicida inibidor de HPPD ser selecionado a partir do grupo que consiste em tricetonas, dicetonitrilas, isoxazóis, hidroxipirazóis, N-(1,2,5oxadiazol-3-il)benzamidas, N-(1,3,4-oxadiazol-2-il)benzamidas, N-(tetrazol-5-il)ou N-(triazol-5-il)arilcarboxamidas, derivados de piridazinona, derivados de oxoprazina, N-(triazol-2-il)arilcarboxamidas, triazinonas e pirazolonas.

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32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo referido herbicida inibidor de HPPD ser selecionado a partir do grupo que consiste em benzobiciclon, sulcotriona, mesotriona, tembotriona, tefuriltriona, biciclopirona, fenquinotriona, isoxaflutol, dicetonitrila, pirazoxifen, benzofenap, pirazolinato, pirassulfotol, topramezona, tolpiralato, 2-metil-N-(5-metil-1,3,4oxadiazol-2-il)-3-(metilsulfonil)-4-(trifluorometil)benzamida, 2-cloro-3-etoxi-4(metilsulf oni I)-N-( 1 -metil-1 H-tetrazol-5-il)benzamida, 4-(difluorometil)-2-metoxi3-(metilsulfon il)-N-(1 -metil-1 H-tetrazol-5-il)benzamida, 2-cloro-3-(metilsulfanil)N-(1 -metil-1 H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)-benzamida e 2-(metoximetil)-3(metilsulfinil)-N-(l -metil-1 H-tetrazol-5-il)-4-(trifluorometil)benzamida.
33. USO DO ÁCIDO NUCLEICO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por ser para tornar uma planta tolerante a um ou mais herbicidas inibidores de HPPD.
34. PRODUTO DE UTILIDADE, caracterizado por compreender a molécula de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou o polipeptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 16 a 21, em que o referido produto é selecionado a partir do grupo que consiste em sementes ou grãos inteiros ou processados, ração animal, flor de farinha de milho ou de soja, farinha de milho ou de soja, amido de milho, farinha de soja, flor de farinha de soja, flocos, concentrado de proteína de soja, isolados de proteína de soja, concentrado de proteína de soja texturizado, cosméticos, produtos para cuidado dos cabelos, manteiga de noz de soja, natto, tempeh, proteína de soja hidrolisada, nata sintética, creme culinário, lecitina, soja integral comestível, iogurte de soja, queijo de soja, tofu, yuba e grãos cozidos, refinados, cozidos no vapor, assados ou cozidos ligeiramente.