PT2417983E - Composição multivalente de conjugado de polissacarídeo pneumocócico-proteína - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"COMPOSIÇÃO MULTIVALENTE DE CONJUGADO DE POLISSACARÍDEO PNEUMOCÓCICO-PROTEÍNA"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito genericamente ao campo da medicina, e especificamente à microbiologia, imunologia, vacinas e à prevenção da infecção por um agente patogénico bacteriano através de imunização.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 Streptococcus pneumoniae é uma causa principal de meningite, pneumonia e doença invasiva grave em bebés e crianças pequenas em todo o mundo. As vacinas polissacaridicas multivalentes pneumocócicas foram licenciadas há muitos anos, e provaram-se úteis na prevenção de doença pneumocócica em adultos idosos e pacientes de alto risco. No entanto, bebés e crianças pequenas respondem mal à maioria dos polissacarídeos pneumocócicos. A vacina pneumocócica conjugada 7-valente (7vPnC, Prevnar®) foi a primeira do seu tipo que demonstrou ser altamente imunogénica e eficaz contra a doença invasiva e a otite média em bebés e crianças pequenas. Esta vacina está agora aprovada em muitos países ao redor do mundo. Prevnar contém os polissacarídeos capsulares dos serotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F, cada um conjugado com uma proteína transportadora designada CRMi97 . Prevnar abrange aproximadamente 80-90%, 60-80% e 40-80% da doença pneumocócica invasiva (DPI), nos EUA, Europa e outras regiões do mundo, respectivamente [1,2]. Dados de vigilância, obtidos nos anos a seguir à introdução de Prevnar, demonstraram claramente, como esperado, uma redução da doença pneumocócica invasiva em crianças americanas (FIG. 1) [3,4]. 2 A vigilância de DPI conduzida em bebés americanos antes da introdução de Prevnar demonstrou que uma porção significativa da doença devida aos serogrupos 6 e 19 era devida aos serotipos 6A (aproximadamente um terço) e 19A (aproximadamente um quarto) [5,6]. A vigilância da doença pneumocócica invasiva realizada nos EUA após o

licenciamento de Prevnar sugere que uma grande carga de doença ainda é atribuível aos serotipos 6A e 19A (FIG. 1) [3] . Além disso, estes dois serotipos representam mais casos de doença invasiva do que os serotipos 1, 3, 5 e 7F combinados (8,2 vs. 3,3 casos por 100.000 crianças com 2 anos ou menos) . Além disso, os serotipos 6A e 19A estão associados a taxas elevadas de resistência aos antibióticos (FIG. 2) [7,8,9] . Embora seja possível que a proteção cruzada de serogrupo resultasse numa diminuição de doença do serotipo 6A e 19A, à medida que mais crianças são imunizadas, há evidência que sugere que haverá um limite para o declínio, e permanecerá uma carga significativa da doença devida a estes serotipos (veja-se abaixo).

Dado o peso e a importância relativa da doença pneumocócica invasiva devida aos serotipos 1, 3, 5, 6A, 7F e 19A, adicionar estes serotipos à formulação de Prevnar aumentaria a cobertura da doença invasiva para > 90% nos EUA e na Europa, e tão alto quanto 70%-80% na Ásia e América Latina. Esta vacina expandiria significativamente a cobertura para além da de Prevnar, e daria cobertura para 6A e 19A, que é independente das limitações de proteção cruzada de serogrupo. WO 2006/110381 e US 2006228380 divulgam, inter alia, um método para a produção de conjugado de polissacarídeo do serotipo 3 de Streptococcus pneumoniae ligado covalentemente a uma proteína transportadora, envolvendo um passo de oxidação usando periodato de sódio. 3

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente divulgação fornece geralmente uma composição imunogénica multivalente compreendendo 13 conjugados de polissacarídeo - proteína distintos, em que cada um dos conjugados contém um polissacarídeo capsular de um serotipo diferente de Streptococcus pneumoniae conjugado com uma proteína transportadora, juntamente com um veículo fisiologicamente aceitável. Opcionalmente é incluído na formulação um adjuvante, tal como um adjuvante à base de alumínio. Mais especificamente, a presente divulgação fornece uma composição de conjugado pneumocócico 13-valente (13vPnC), compreendendo os sete serotipos na vacina 7vPnC (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F) além de seis serotipos adicionais (1, 3, 5, 6A, 7F e 19A) . A presente divulgação também fornece uma composição imunogénica multivalente, em que os polissacarídeos capsulares são de serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F de Streptococcus pneumoniae, e a proteína transportadora é CRMi97. A presente divulgação fornece ainda uma composição imunogénica multivalente, em que os polissacarídeos capsulares são de serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9v, 14, 18C, 19A, 19F e 23F de Streptococcus pneumoniae, a proteína transportadora é CRM197, e o adjuvante é um adjuvante à base de alumínio, tais como fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio. Numa realização específica da invenção, o adjuvante é fosfato de alumínio. A presente divulgação também fornece uma composição imunogénica multivalente, compreendendo conjugados de polissacarídeos - proteína juntamente com um veículo fisiologicamente aceitável, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo capsular de um serotipo diferente de Streptococcus pneumoniae conjugado com uma proteína transportadora, e os polissacarídeos capsulares 4 são preparados de serotipo 3 e pelo menos um serotipo adicional.

Numa realização desta composição imunogénica multivalente, o serotipo adicional é selecionado do grupo consistindo de serotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F. Numa outra realização, a proteína transportadora é CRMi97. Em ainda outra realização, a composição compreende um adjuvante, tal como um adjuvante à base de alumínio, selecionado de entre o fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio. Numa realização particular, o adjuvante é fosfato de alumínio. A presente divulgação também fornece uma composição imunogénica multivalente, compreendendo conjugados de polissacarídeos - proteína, juntamente com um veículo fisiologicamente aceitável, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo capsular de um serotipo diferente de Streptococcus pneumoniae conjugado com uma proteína transportadora, e os polissacarídeos capsulares são preparados de serotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F e pelo menos um serotipo adicional.

Numa realização desta composição imunogénica multivalente, o serotipo adicional é selecionado do grupo consistindo de serotipos 1, 3, 5, 6A, 7F, e 19A. Numa outra realização, a proteína transportadora é CRM197. Em ainda outra realização, a composição compreende um adjuvante, tal como um adjuvante à base de alumínio, selecionado de entre o fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio Numa realização particular, o adjuvante é fosfato de alumínio. A presente divulgação também fornece um método para induzir uma resposta imune a um conjugado de polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae, compreendendo a administração a um humano de uma guantidade imunologicamente eficaz de qualquer uma das composições imunogénicas que acabamos de descrever. 5 A presente divulgação fornece ainda que qualquer das composições imunogénicas administradas é uma dose única de 0,5 ml formulada para conter: 2 μρ de cada sacarideo, excepto para 6B, a 4 \x,q, aproximadamente 2 9 μρ de proteína transportadora CRMi97, 0,125 mg de adjuvante de alumínio elementar (0,5 mg fosfato de alumínio), e cloreto de sódio e tampão de sucinato de sódio como excipientes. São também fornecidos métodos para preparar um conjugado imunogénico compreendendo polissacarídeo serotipo 3 de Streptococcus pneumoniae (Pn 3) ligado covalentemente a uma proteína transportadora. Numa realização, o método compreende (i) a reacção de polissacarídeo Pn 3 purificado com um ácido suave, resultando num polissacarídeo Pn 3 hidrolisado, (ii) a reacção do polissacarídeo Pn 3 hidrolisado com um agente oxidante na presença de 3 catiões bivalentes, resultando num polissacarídeo Pn 3 activado, (iii) a mistura do polissacarídeo Pn 3 activado com uma proteína transportadora, (iv) a reacção da mistura de polissacarídeo Pn 3 activado e proteína transportadora com um agente redutor, resultando num conjugado de polissacarídeo Pn 3:proteína transportadora, e (v) capeamento de aldeídos que não reagiram presentes no conjugado de polissacarídeo Pn 3:proteína transportadora, resultando num conjugado imunogénico compreendendo polissacarídeo Pn 3 de Streptococcus pneumoniae covalentemente ligado a uma proteína transportadora.

Numa realização adicional, o método compreende (i) a reacção do polissacarídeo Pn 3 purificado com ácido acético, resultando num polissacarídeo Pn 3 hidrolisado, (ii) a reacção do polissacarídeo Pn 3 hidrolisado com ácido periódico, na presença de MgCl2, resultando num polissacarídeo Pn 3 activado, (iii) a purificação do polissacarídeo Pn 3 activado, (iv) a mistura do polissacarídeo Pn 3 activado com uma proteína transportadora, (v) co-liofilização da mistura do 6 polissacarídeo Pn 3 activado e proteína transportadora, (vi) a reacção do co-liofilizado de polissacarídeo Pn 3 activado e proteína transportadora com cianoborohidreto de sódio, resultando num conjugado polissacarídeo Pn 3:proteína transportadora, e (vii) capeamento de aldeídos que não reagiram presentes no conjugado polissacarídeo Pn 3:proteína transportadora com borohidreto de sódio, resultando num conjugado imunogénico compreendendo polissacarídeo Pn 3 de Streptococcus pneumoniae ligado covalentemente a uma proteína transportadora. É também fornecido um método para preparar um polissacarídeo Pn 3 activado de Streptococcus pneumoniae. 0 método compreende (i) a reacção do polissacarídeo Pn 3 purificado com um ácido suave, resultando num polissacarídeo Pn 3 hidrolisado, e (ii) a reacção do polissacarídeo Pn 3 hidrolisado com um agente oxidante na presença de catiões bivalentes, resultando num polissacarídeo Pn 3 activado.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS FIG. 1 mostra as variações nas taxas de DPI por serotipo, em crianças americanas <2 anos de idade, desde o inicio (1998/1999) até 2001. FIG. 2 mostra a distribuição de isolados pneumocócicos com resistência à penicilina (PCN) em crianças <5 anos de idade (1998). FIG. 3 mostra as curvas de distribuição cumulativa reversa (CDCR) de resultados após terceira dose de OPA, do ensaio D118-P16 Prevnar.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Inclusão de Serotipos Prevnar 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F

Dados de vigilância DPI entre 1995-1998 estimam que os sete serotipos em Prevnar foram responsáveis por cerca de 82% de DPI em crianças <2 anos de idade [5] . No norte da Califórnia, o local do ensaio de eficácia, os serotipos Prevnar foram responsáveis por 90% de todos os casos de DPI 7

em bebés e crianças pequenas [10]. Desde a introdução da vacina Prevnar em 2000, tem havido uma diminuição significativa nas taxas totais de DPI devido a uma diminuição na doença devido aos serotipos da vacina [3,4]. Portanto, não há nenhuma justificação neste momento para remover qualquer dos serotipos Prevnar da próxima geração de vacinas conjugadas pneumocócicas, mas em vez disso, adicionar serotipos para obter uma cobertura mais ampla. Inclusão dos Serotipos 1, 3, 5 e 7F

Nos EUA, a taxa de DPI causada pelo serotipo 1 em crianças com idade inferior a 5 anos é <2%, aproximadamente a mesma que para cada um dos tipos 3 e 7F [1,6] . Os serotipos 1 e 5 são responsáveis por taxas mais altas de DPI em populações americanas de alto risco para doença pneumocócica invasiva. Especificamente, o serotipo 1 causa 3,5% de DPI em crianças nativas do Alasca <2 anos de idade, e 18% em crianças de 2-4 anos de idade [11] . Tanto o serotipo 1 como o serotipo 5, causam significativamente doença noutras partes do mundo, e em populações indígenas nos países desenvolvidos [12,13,14]. O serotipo 1 pode também ser associado a doença mais grave em comparação com outros serotipos pneumocócicos [15]. Esta observação é baseada na diferença nas taxas de identificação de casos entre os EUA e a Europa, e a diferença associada na prática médica. No geral, a incidência de DPI é menor na Europa do que os EUA. No entanto, a percentagem de DPI causada pelo serotipo 1 na Europa é desproporcionadamente maior do que nos EUA (6-7%, vs. 1-2%, respectivamente). Na Europa, as culturas de sangue são obtidas predominantemente de crianças hospitalizadas. Nos EUA, é uma prática médica de rotina obter culturas de sangue em ambiente ambulatório de crianças com febre ^ 39 °C, e contagens elevadas de células brancas do sangue. Dada a diferença na prática médica, é postulado que a menor percentagem de doença causada pelo serotipo 1 nos EUA pode estar diluída por taxas mais elevadas de outros serotipos que causam doença mais branda, enquanto que a maior percentagem na Europa reflecte doença mais grave. Além disso, estudos de seroepidemiologia de crianças com pneumonia complicada demonstram que o serotipo 1 é desproporcionalmente representado [16,17,18]. Isto sugere que a inclusão do serotipo 1 pode reduzir a quantidade de doença pneumocócica grave, bem como, contribuir para a redução total na doença pneumocócica invasiva. A adição dos serotipos 3 e 7F irá aumentar a cobertura contra a DPI na maioria das áreas do mundo por aproximadamente 3% -7%, e na Ásia por cerca de 9%. Assim, uma vacina 11-valente cobriria 50% na Ásia, e cerca de 80% de DPI em todas as outras regiões [1,2]. Estes serotipos também são importantes no que diz respeito à cobertura de otite média [19]. Num estudo multinacional de serotipos pneumocócicos causadores de otite média, Hausdorff e colaboradores descobriram que o serotipo 3 era no geral o 8o isolado de líquido do ouvido médio mais comum [20] . O serotipo 3 era responsável por até 8,7% dos serotipos pneumocócicos associados com otite média. Assim, a importância dos tipos 3 e 7F na otite média, bem como na DPI, garante a sua inclusão numa vacina conjugada pneumocócica.

No entanto, têm sido infrutíferas as tentativas para produzir uma vacina conjugada pneumocócica multivalente, que apresente imunogenicidade significativa com respeito aos polissacarídeos serotipo 3. Por exemplo, num estudo da imunogenicidade e segurança de uma vacina conjugada de proteína D pneumocócica 11 - valente (11-Pn-PD), não foi observado efeito de iniciação para o serotipo 3 em crianças que receberam três doses da vacina, seguido por uma dose de reforço da mesma vacina ou de uma vacina de polissacarídeo pneumocócico (Nurkka et al. (2004) Ped. Inf. Dis. J., 9 23:1008-1014). Noutro estudo, os resultados do ensaio opsonofagocítico (OPA) de bebés que receberam doses de 11-Pn-PD, não conseguiram demonstrar as respostas de anticorpos para o serotipo 3, em níveis comparáveis aos de outros serotipos testados (Gatchalian et al., 17a Reunião

Anual da Eur. Soc. Paed: Inf. Dis. (ESPID) , Póster N° 4, PIA Sessão de Póster 1, Istambul, Turquia, 27 de Março de 2001) . Ainda noutro estudo, que avaliou a eficácia de um 11-Pn-PD na prevenção de otite média aguda, a vacina não forneceu proteção contra episódios causados pelo serotipo 3 (Prymula et al. (2006) Lancet, 367:740-748). Por conseguinte, uma vacina conjugada pneumocócica compreendendo polissacáridos capsulares de serotipo 3, e capaz de provocar uma resposta imunogénica para os polissacarídeos serotipo 3, fornece uma melhoria significativa sobre o estado actual da tecnologia.

Inclusão dos Serotipos 6A e 19A

a. Epidemiologia dos Serotipos 6A e 19A

Os dados de vigilância na literatura sugerem que os serotipos 6A e 19A são responsáveis por mais doença pneumocócica invasiva em crianças americanas <2 anos de idade, do que os serotipos 1, 3, 5 e 7F combinados (FIG. 1) [1,5]. Além disso, estes serotipos estão normalmente associados a resistência aos antibióticos (FIG. 2) , e desempenham um papel importante na otite média [6,19,20]. Não está clara a capacidade da actual vacina Prevnar para proteger contra a doença devido a 6A e 19A. A lógica para a inclusão de componentes 6A e 19A numa vacina 13vPnC é discutida abaixo.

b. Respostas a 6A e 19A induzidas por Polissacarídeos 68 e 19F

As vacinas não conjugadas de polissacarídeos pneumocócicos licenciadas (para uso em pessoas de pelo menos dois anos de idade) continham polissacarídeos capsulares 6A ou 6B, mas não ambos [21] . Os dados de 10 imunogenicidade gerados no momento da formulação da vacina de polissacarídeo pneumocócico 23 - valente demonstraram que uma vacina monovalente 6B induzia anticorpo em ambas as cápsulas 6A e 6B. Os dados de vários ensaios que avaliaram as respostas IgG e ensaio opsonofagocitico (OPA) numa variedade de populações com polissacarídeo livre e com vacinas conjugadas pneumocócicas sugeriram que as respostas IgG para 6A são induzidas por antígenos 6B, mas as respostas são geralmente mais baixas, e a actividade OPA com organismos 6A é diferente do que com organismos 6B [22,23,24,25]. Além disso, os indivíduos que respondem com anticorpo 6B elevado podem ter pouca ou nenhuma actividade contra 6A.

Em contraste com a composição química dos polissacarídeos capsulares 6A e 6B onde existe um grau elevado de semelhança, as cápsulas 19A e 19F são bastante diferentes, devido à presença de duas cadeias laterais adicionais no polissacarídeo 19A. Não surpreendentemente, as respostas imunitárias medidas em voluntários humanos imunizados com a vacina de polissacarídeo 19F, mostraram que as respostas à 19F foram induzidas em 80% dos indivíduos, mas apenas 20% dos indivíduos tiveram uma resposta à 19A [26] . Os baixos níveis de respostas de reactividade cruzada IgG e OPA para serotipo 19A após a imunização com polissacarídeo 19F foram também documentados em ensaios com vacinas conjugadas [24,26].

Os dados internos das respostas de reactividade cruzada OPA para 6A e 19A têm sido gerados do ensaio ponte 7vPnC (D118-P16), realizado em bebés americanos (FIG. 3) . Estes estudos são consistentes com os resultados de outros, e demonstram a indução de reactividade cruzada do anticorpo funcional para o polissacarídeo 6A após a imunização com o polissacarídeo 6B, embora a um nível inferior, e muito pouco anticorpo funcional para 19A após a imunização com 19F. 11

Impacto da Imunização de 6B e 19F em 6A e 19A em Modelos Animais

Os modelos animais têm sido usados para avaliar o potencial de protecção cruzada com a imunização de polissacarideo. Num modelo de otite média desenvolvido por Giebink e colaboradores, foram imunizadas chinchilas com uma vacina conjugada de uma proteína de membrana externa (PME) de polissacarideo tetravalente (contendo sacarídeos 6B, 14, 19F, 23F) ou placebo [27]. Neste ensaio, parecia haver alguma protecção cruzada para 6A, no entanto esta não alcançou significância estatística, e o nível de proteção foi menor do que com 6B contra a otite média. Neste mesmo modelo, houve 100% de protecção contra a otite média 19F, mas apenas 17% de proteção contra a otite média 19A.

Saeland e colaboradores usaram soros de bebés imunizados com uma vacina conjugada tétano pneumocócica 8-valente (contendo 6B e 19F), para imunizar passivamente ratinhos antes de um desafio intranasal com organismos 6A, num modelo de infecção pulmonar [28]. Das 59 amostras de soro, 53% protegeram os ratinhos contra bacteremia com 6B, e 37% protegeram contra 6A. Aos ratinhos imunizados passivamente com soro de bebés imunizados com quatro doses de uma vacina conjugada pneumocócica 11-valente (contendo 19F conjugado com o toxóide do tétano) foi dado um desafio intranasal com organismos 19A no mesmo modelo [29]. De 100 ratinhos imunizados passivamente e depois desafiados, 60 ratinhos não tinham organismos 19A detectados no tecido pulmonar, enquanto que os organismos foram identificados em todos os ratinhos que receberam placebo salino. No entanto, a imunização passiva não protegeu contra o desafio com organismos 19F neste modelo, portanto, a relevância do modelo para o serogrupo 19 é questionável. Em geral, estes modelos fornecem evidência de algum impacto biológico da imunização 6B em organismos 6A, embora o efeito sobre o serotipo heterólogo não tenha sido tão grande como o 12 observado com o serotipo homólogo. 0 impacto da imunização 19F em organismos 19A não é bem compreendido a partir destes modelos.

Impacto da Imunização de Conjugados Polissacarídeos 6B e 19F em Doença 6A e 19A em Ensaios de Eficácia/Efectividade

0 número de casos de doença devido aos serotipos 6B, 6A, 19F e 19A em ensaios de eficácia de 7vPnC e 9vPnC (7vPnC mais os serotipos 1 e 5) é observado no Quadro 1 [30,10,31]. Os números de casos de doença invasiva são pequenos demais para permitir tirar quaisquer conclusões para os serotipos 6A e 19A. No entanto, o ensaio Finlandês de otite média gerou um grande número de isolados pneumocócicos [32]. Na análise por protocolo o 7vPnC foi 84% (95% IC 62%, 93%) eficaz contra a otite média devida ao serotipo 6B, e 57% (95% IC 24%, 76%) eficaz contra a otite média devida ao serotipo 6A (Quadro 1) . Em contraste, a eficácia especifica de serotipo com 7vPnC não foi demonstrada para a otite média, quer devido a 19F ou 19A. Quadro 1. Casos de Doença Pneumocócica Devida aos Serotipos 6B, 6A, 19F, e 19A em Ensaios de Eficácia com as vacinas

7vPnC e 9vPnC 6B 6A 19F 19A PnC Contr. PnC Contr. PnC Contr. PnC Contr. Ensaio de Eficácia Kaiser- 7vPnC (ITT) 1 7 0 1 2* 13 0 1 Ensaio de Eficácia Navajo-7vPnC (ITT) 0 5 1 0 1 1 1 0 13 6B 6A 19F 19A PnC Contr. PnC Contr. PnC Contr. PnC Contr. Ensaio de Eficácia Sul -Africano-9vPnC HIV (-) (ITT) 1 2 1 0 0 1 3 1 Ensaio de Eficácia Sul -Africano-9vPnC HIV (+) (ITT) 1 7 3 10 2 3 2 3 Ensaio Finlandês de Otite Média-7vPnC (PP) 9* 56 19* 45 43 58 17 26 Eficácia demonstrada estatisticamente significativa Das referências 30, 10 e 33, e de comunicações pessoais Contr = controlo ITT = análise de intenção de tratamento PP = análise por protocolo

Também estão disponíveis dados de vigilância DPI pós-comercialização de um estudo de caso controlo, realizado pelos Centros de Controlo de Doenças, para avaliar a eficácia de Prevnar [33]. Foram identificados nos laboratórios de vigilância, casos de doença pneumocócica invasiva ocorrendo em crianças de 3 a 23 meses de idade, e emparelhados com três casos de controlo, por idade e código postal. Após obtenção do consentimento, a história médica e de imunização (os indivíduos foram considerados imunizados se tivessem recebido pelo menos uma dose de Prevnar) foi 14 obtida dos pais e fornecedores de serviços médicos, para casos e controlos. Os resultados preliminares foram apresentados na reunião ICAAC de 2003, e um sumário dos resultados para doença causada por 6B, 19F, 19A e 6A é apresentado no Quadro 2. Estes dados indicam que Prevnar é capaz de prevenir a doença devido a 6A, embora a um nível que pode ser um pouco menor do que a doença de serotipo 6B. Estes dados também indicam que a protecção cruzada para a doença invasiva devido a 19A é limitada.

Quadro 2. Resultados preliminares de um Ensaio de Caso Controlo Realizado pelo CDC (apresentado em ICAAC, 2003)

Serotipo Conjuntos Informativos, n * VE (95% IC) Tipo de Vacina, Todos 115 94 (87, 97) Relacionado de Vacina, Todos 36 70 (38, 86) Tipo de Não -Vacina, Todos 43 -4 (-106, 48) 6B 27 94 (72, 99) 19F 19 73 (16, 92) 6A 15 87 (53, 97) 19A 16 40 (-87, 80) Eficácia da vacina comparando vacinados 1 dose) vs. não vacinados, e ajustando para condições subjacentes Referência 40 e comunicação pessoal/confidencial

Uma análise publicada [3] da utilização de Prevnar também indicou que os serotipos 6B e 19F conferiam uma redução moderada da DPI causada pelos serotipos 6A e 19A 15 entre crianças menores de dois anos de idade (Quadro 1 em [3]). As taxas de doença entre adultos não imunizados causada pelos serotipos 6A, 9A, 9D, 9N, 18A, 18B, 18F, 19A, 19B, 19C, 23A e 23B ("todos os serotipos relacionados com a vacina") foram de alguma forma reduzidas (Quadro 2 em [3]). Estes dados estabelecem que a imunidade colectiva da utilização de Prevnar em crianças com menos de dois anos de idade foi modesta para os serotipos 6A e 19A, e proporciona uma base para a inclusão dos serotipos 6A e 19A na vacina 13vPnC desta invenção.

Conclusão para a adição de 6A e 19A

Os dados de vigilância pós-comercialização e os resultados do estudo de caso controlo observados na FIG. 1 e no Quadro 2 com a vacina 7vPnC sugerem que, consistente com a outra informação sobre respostas imunitárias e desempenho nos modelos animais descritos anteriormente, pode haver alguma protecção cruzada contra a doença 6A, mas em menor grau do que a doença 6B. Além disso, parece que a protecção contra 19A é limitada. Portanto, uma vacina 137vPnC contendo os serotipos 6A e 19A, proporciona uma cobertura que não é dependente das limitações da protecção cruzada de serogrupo pelos serotipos 6B e 19F. A presente divulgação fornece uma composição imunogénica multivalente compreendendo 13 conjugados de polissacarideo - proteina distintos, em que cada um dos conjugados contém um polissacarideo capsular diferente conjugado com uma proteína transportadora, e em que os polissacarídeos capsulares são preparados de serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F de Streptococcus pneumoniae, juntamente com um veículo fisiologicamente aceitável. Uma proteína transportadora tal é o toxóide diftérico designado CRMi97. A composição imunogénica pode compreender ainda um adjuvante, tal como um adjuvante à base de alumínio, tais como fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio. 16

Os polissacarídeos capsulares são preparados por técnicas padrão conhecidas dos peritos na tecnologia. Na presente divulgação os polissacarídeos capsulares são preparados de serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F de Streptococcus pneumoniae. Estes conjugados pneumocócicos são preparados por processos separados, e formulados numa formulação de dosagem única. Por exemplo, numa realização, cada serotipo de polissacarídeo pneumocócico é cultivado num meio à base de soja. Os polissacarídeos individuais são então purificados por centrifugação, precipitação, ultrafiltração, e cromatografia em coluna. Os polissacarídeos purificados são quimicamente activados para tornar os sacarídeos capazes de reagir com a proteína transportadora.

Uma vez activado, cada polissacarídeo capsular é separadamente conjugado com uma proteína transportadora, para formar um glicoconjugado. Numa realização, cada polissacarídeo capsular é conjugado com a mesma proteína transportadora. Nesta realização, a conjugação é feita por aminação redutora. A activação química dos polissacarídeos e subsequente conjugação com a proteína transportadora são alcançadas através de meios convencionais. Veja-se, por exemplo, Patentes US N° 4.673.574 e 4.902.506 [34,35].

Proteínas transportadoras são de preferência proteínas que são não-tóxicas e não-reatogénicas e obtidas em quantidade suficiente e pureza. Proteínas transportadoras devem ser passíveis de procedimentos de conjugação padrão. Numa realização específica da presente invenção, é usado CRMi97 como a proteína transportadora. CRMi97 (Wyeth, Sanford, NC) é uma variante não- tóxica (isto é, toxóide) da toxina da difteria isolada de culturas de estirpe C7 de Corynebacterium diphtheria (β19 7), crescidas em casaminoácidos e meio com base em extracto de levedura. CRMi97 é purificado por ultraf iltração, 17 precipitação com sulfato de amónia, e cromatografia de permuta iónica. Alternativamente, CRMi97 é preparado de forma recombinante de acordo com a Patente US N° 5.614.382. São também adequados para utilização como proteínas transportadoras outros toxóides de difteria.

Outras proteínas transportadoras adequadas incluem toxinas bacterianas inactivadas, tais como o toxóide do tétano, toxóide pertussis, toxóide da cólera (por exemplo, como descrito no Pedido de Patente Internacional W02004/083251 [38]), E. coli LT, E. Coli ST, e exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa. Podem também ser usadas proteínas de membrana exterior bacterianas, tais como complexo c da membrana externa (OMPC), porinas, proteínas de liqação à transferrina, pneumolisina, proteína A da superfície pneumocócica (PspA), proteína de adesina pneumocócica (PsaA), peptidase C5a do Grupo A ou Grupo B streptococcus, ou proteína D de Haemophilus influenzae. Podem também ser usadas outras proteínas como proteínas transportadoras, tais como ovalbumina, hemocianina de lapa (KLH), albumina de soro bovino (BSA) ou derivado de proteína purificada tuberculina (PPD).

Após a conjugação do polissacarídeo capsular com a proteína transportadora, os conjugados de polissacarídeo-proteína são purificados (enriquecidos com respeito à quantidade de conjugado de polissacarídeo-proteína) por uma variedade de técnicas. Estas técnicas incluem operações de concentração/diafiltração, precipitação/eluição, cromatografia em coluna, e filtração de profundidade. Veja-se exemplos abaixo.

Depois dos glicoconjugados individuais serem purificados, são compostos para formular a composição imunogénica da presente invenção que pode ser usada como uma vacina. A formulação da composição imunogénica da presente invenção pode ser realizada utilizando métodos reconhecidos pela tecnologia. Por exemplo, os 13 conjugados 18 pneumocócicos individuais podem ser formulados com um veiculo fisiologicamente aceitável para preparar a composição. Exemplos de tais veículos incluem, mas não estão limitados a, água, tampão salino, polióis (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol líquido) e as soluções de dextrose.

Em certas realizações, a composição imunogénica irá compreender um ou mais adjuvantes. Tal como aqui definido, um "adjuvante" é uma substância que serve para aumentar a imunogenicidade de uma composição imunogénica desta divulgação. Assim, os adjuvantes são frequentemente utilizados para estimular a resposta imunitária, e são bem conhecidos do perito na tecnologia. Os adjuvantes adequados para melhorar a eficácia da composição incluem, mas não estão limitados a: (1) sais de alumínio (alúmen), tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio, etc.; (2) as formulações de emulsão óleo-em-água (com ou sem outros agentes imunoestimulantes específicos, tais como péptidos muramilo (definidos abaixo) ou componentes da parede celular bacteriana), tais como, por exemplo, (a) MF 5 9 (Publ. PCT N° WO 90/14837), contendo 5% de Esqualeno, 0,5% de Tween 80, e 0,5% de Span 85 (opcionalmente contendo várias quantidades de MTP-PE (veja-se abaixo, embora não necessário) ) formulado em partículas submicrónicas, utilizando um microfluidizador, tal como o microfluidizador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA) , (b) SAF, contendo 10% de Esqualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero plurónico bloqueado L121, e thr-MDP (veja-se abaixo) quer microfluidizado numa emulsão submicrónica ou agitados, para gerar uma emulsão de maior tamanho de partícula, e (c) Sistema adjuvante Ribi™ (RAS), (Corixa, Hamilton, MT) contendo 2% de Esqualeno, 0,2% de Tween 80, e um ou mais componentes da parede celular bacteriana do grupo 19 consistindo de 3-0-deailatado monofosforil lipídeo A (MPL™) descrito na Patente US N° 4.912.094 (Corixa), dimicolato de trealose (TDM), e esqueleto da parede celular (CWS), de preferência MPL + CWS (Detox™); (3) podem ser usados adjuvantes saponina, tais como Quil A ou STIMULON™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (Patente US N° 5.057.540) ou partículas geradas daí, tais como ISCOMs (complexos imunoestimulantes) ; (4) lipopolissacarídeos bacterianos, análogos de lípido A sintético, tais como compostos de fosfato de aminoalquil glucosamina (AGP), ou seus derivados ou seus análogos, que estão disponíveis de Corixa, e que são descritos na Patente US N° 6.113.918; um AGP tal é o 2-[ (R)-3-Tetradecanoiloxitetradecanoilamino] etil 2-Deoxi-4-0-fosfono-3-Ο-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)-3 tetradecanoiloxitetradecanoilamino]-b-D-glucopiranósido, o qual é também conhecido como 529 (anteriormente conhecido como RC529), que é formulado como uma forma aquosa ou como uma emulsão estável, polinucleótidos sintéticos tais como oligonucleótidos contendo motivo(s) CpG (Patente US N° 6.207.646); (5) citocinas, tais como interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, etc.), interferões (por exemplo, interferão gama), factor estimulante de colónias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), factor estimulador de colónias de macrófagos (M-CSF), factor de necrose tumoral (TNF), moléculas co- estimulatórias B7-1 e B7-2, etc.; (6) mutantes descontaminados de uma toxina bacteriana ADP-ribosilação, tais como uma toxina da cólera (CT), quer sob uma forma natural ou mutante, por exemplo, onde o ácido glutâmico na posição do aminoácido 29 é substituído por outro aminoácido, de preferência uma histidina, de acordo com a aplicação de patente internacional publicada número 20 WO 00/18434 (veja-se também WO 02/098368 e WO 02/098369), uma toxina pertussis (PT), ou uma toxina termo-lábil de E. coli (LT), particularmente LT-K63, LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129 (veja-se, por exemplo, WO 93/13302 e WO 92/19265); e (7) outras substâncias que actuam como agentes imunoestimulantes para aumentar a eficácia da composição. Péptidos muramilo incluem, mas não estão limitados a, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanina-2-(1'-2 ' dipalmitoil - sn-glicero - 3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc..

As formulações de vacina da presente divulgação podem ser usadas para proteger ou tratar um humano susceptível a infecções pneumocócicas, por meio da administração da vacina através de uma via sistémica ou da mucosa. Estas administrações podem incluir a injecção através da via intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea, ou por administração via mucosa para as vias orais/digestivas, respiratórias ou genito-urinárias. Numa realização, é usada a administração intranasal para o tratamento de pneumonia ou otite media (como nasofaringe de pneumococos pode ser mais eficazmente impedida, atenuando assim a infecção, na sua fase inicial). A quantidade de conjugado em cada dose de vacina é seleccionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotectora, sem significativos efeitos adversos. Tal quantidade pode variar dependendo do serotipo pneumocócico. Geralmente, cada dose compreenderá 0,1 a 100 μρ de polissacarideo, particularmente 0,1 a 10 μρ, e mais particularmente 1 a 5 μρ.

Quantidades óptimas de componentes para uma vacina especifica podem ser determinadas por estudos padrão, envolvendo a observação de respostas imunitárias adequadas nos indivíduos. Após uma vacinação inicial, os indivíduos 21 podem receber uma ou várias imunizações de reforço adequadamente espaçadas.

Numa realização especifica, a vacina 13vPnC é uma formulação liquida estéril de polissacarideos capsulares pneumocócicos de serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F individualmente conjugados com CRMi97. Cada dose de 0,5 ml é formulada para conter: 2 μg de cada sacarideo, excepto para 6B, a 4 μρ, aproximadamente 29 μρ de proteína transportadora CRMi97, 0,125 mg de adjuvante de alumínio elementar (0,5 mg de fosfato de alumínio), e cloreto de sódio e tampão de sucinato de sódio como excipientes. O líquido é introduzido em seringas de dose única, sem conservante. Após agitação, a vacina é uma suspensão homogénea branca, pronta para administração intramuscular. A escolha do nível de dose para a vacina 137vPnC é semelhante ao da vacina 7vPnC comercializada (Prevnar). O nível de dose de 2 μρ de sacarideo foi seleccionado para todos os serotipos, excepto para 6B, que é a 4 μρ por dose. A vacina 7vPnC mostrou segurança desejável, imunogenicidade e eficácia contra DPI no nível de dose de 2 μρ de sacarideo para os serotipos 4, 9V, 14, 18C, 19F e 23F, e na dose de 4 μg para 6B. O programa de imunização pode seguir aquele designado para a vacina 7vPnC. Por exemplo, o programa de rotina para bebés e crianças jovens contra a doença invasiva causada por S. pneumoniae, devido aos serotipos incluídos na vacina 13vPnC, é aos 2, 4, 6 e 12-15 meses de idade. As composições desta divulgação são também adequadas para utilização com crianças mais velhas, adolescentes e adultos.

As composições desta divulgação podem ainda incluir um ou mais antigénios adicionais, para uso contra a otite média causada por infecção com outras bactérias. Tais bactérias incluem Haemophilus influenza não-tipável, 22

Moraxella catarrhalis (anteriormente conhecida como Branhamella catarrhalis) e Alloiococcus otitidis.

Exemplos de antigénios de Haemophilus influenzae não-tipável adequados para inclusão, incluem a proteína P4, também conhecida como proteína "e" (Patente US N° 5.601.831; Pedido de Patente Internacional WO03/078453) , a proteína P6, também conhecida como a proteína PAL ou a PBOMP-1 (Patente US N° 5.110.908; Pedido de Patente Internacional WO0100790), a proteína P5 (Patente Reeditada US N° 37.741), a proteína de adesão e penetração de Haemophilus (Patentes US Nos 6.245.337 e 6.676.948), a proteína adesina LKP tip (Patente US N° 5.643.725) e a proteína NucA (Patente US N° 6.221.365).

Exemplos de antigénios Moraxella catarrhalis adequados para inclusão, incluem a proteína UspA2 (Patentes US Nos 5.552.146, 6.310.190), a proteína CD (Patente US N° 5.725.862), a proteína E (Patente US N° 5.948.412) e a proteína da membrana externa de 74 quilodalton (Patente US N° 6.899.885).

Exemplos de antigénios Alloiococcus otitidis adequados para a inclusão, incluem aqueles identificados no Pedido de Patente Internacional W003/048304.

As composições desta divulgação podem também incluir uma ou mais proteínas de Streptococcus pneumoniae. Exemplos de proteínas de Streptococcus pneumoniae adequadas para inclusão, incluem aquelas identificadas no Pedido de Patente Internacional WO02/083855, bem como as descritas no Pedido de Patente Internacional W002/053761.

As composições desta divulgação podem ainda incluir uma ou mais proteínas de Neisseria meningitidis tipo B. Exemplos de proteínas de Neisseria meningitidis tipo B adequadas para inclusão, incluem aquelas identificadas nos Pedidos de Patente Internacionais WO03/063766, W02004/094596, WOOl/85772, WO02/16612 e WOOl/87939. 23

Activação do Polissacarídeo serotipo 3 de S. pneumoniae para Conjugação

Foi eficazmente utilizada a oxidação parcial de hidratos de carbono em polissacarídeos para gerar grupos aldeído, que são depois acoplados aos resíduos de lisina de proteínas transportadoras, para gerar conjugados imunogénicos (por exemplo, composições, tais como vacinas, úteis para a estimulação ou indução de uma resposta imunitária específica num vertebrado). Para muitas aplicações, o propósito geral do agente oxidante periodato de sódio, fornece oxidação eficaz de hidratos de carbono em polissacarídeos antes da conjugação com proteínas transportadoras. No entanto, a oxidação directa do polissacarídeo Pn 3 com periodato de sódio pode resultar em polissacarídeo degradado, com poucos aldeídos restantes presentes. Um procedimento alternativo de oxidação incorpora ácido periódico, na presença de catiões bivalentes (por exemplo, Mg2+ ou Ca2+ e fornece oxidação eficaz do polissacarídeo Pn 3 (Quadro 3).

Quadro 3: Dados de Oxidação de Pn 3 usando Ácido

Periódico/MgCl2

Identificação da Amostra Quantidade de Ácido Periódico (meq) ** Oxidação (horas) Temp (°C) DO #*** Kd # (CL4B) PP3* Nativo 0 - 4 O o 0,048 PP3 Oxidado 0,2 16 25 5, 8 0,24 PP3 Oxidado 0,2 72 4 9, 0 0,1 PP3 Oxidado 1 16 4 13,2 0,24 PP3 Oxidado 1 16 25 4,1 0,24 PP3 Oxidado 1 72 4 7, 9 0,29 PP3: Polissacarídeo tipo 3 Pneumo nativo 24 24 Identificação Quantidade de Oxidação Temp DO Kd # da Amostra Ácido (horas) (°C) j| * * * # (CL4B) Periódico (meq) **

Meq: equivalentes mole DO: grau de oxidação A fim de reduzir a viscosidade e as questões de filtração associadas, o polissacarideo Pn 3 é primeiro submetido a hidrólise/despolimerização usando um ácido suave, tal como ácido acético, ácido cítrico ou ácido carbónico. Oxidação parcial para produzir polissacarideo Pn 3 "activado" é levada a cabo após hidrólise/despolimerização, usando quantidades controladas de um agente oxidante. Pode ser usado qualquer agente oxidante selectivo que oxide um grupo hidroxilo terminal a um aldeído, incluindo oxidases de açúcar específicas (por exemplo, periodato de sódio ou potássio, ou ácido periódico). Como discutido acima, um agente oxidante preferido é ácido periódico, na presença de catiões bivalentes. O polissacarideo Pn 3 activado é então opcionalmente purificado (por exemplo, por diafiltração versus tampão salino). 0 polissacarideo Pn 3 activado pode ser combinado com uma proteína transportadora. Proteínas transportadoras são escolhidas para aumentar a imunogenicidade da ligação de polissacarideo Pn 3, e/ou para obter anticorpos contra a proteína transportadora que sejam diagnosticamente, analiticamente e/ou terapeuticamente benéficos. A ligação covalente de uma molécula antigénica (por exemplo, um polissacarideo) a um transportador, confere imunogenicidade melhorada e dependência de células T (Pozsgay et al. (1999) PNAS, 96:5194-97; Lee et al. (1976) J. Immunol., 116:1711-18; Dintzis et al. (1976) PNAS, 73:3671-75). Como aqui descrito, proteínas transportadoras úteis incluem toxinas 25 bacterianas inactivadas, tais como o toxóide do tétano, toxóide pertussis, toxóide da cólera (por exemplo, como descrito no Pedido de Patente Internacional W02004/083251), E. coli LT, E. Coli ST, e exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa. Podem também ser usadas proteínas de membrana externa bacteriana, tais como complexo c da membrana externa, porinas, proteínas de ligação à transferrina, pneumolisina, proteína A da superfície pneumocócica, proteína de adesina pneumocócica, peptidase C5a do Grupo A ou Grupo B streptococcus, ou proteína D de Haemophilus influenzae. Podem também ser usadas como proteínas transportadoras outras proteínas, tais como ovalbumina, hemocianina de lapa, albumina de soro bovino ou derivado de proteína purificada tuberculina. Uma proteína transportadora preferida é a toxina da difteria mutada CRM197. Na sequência da mistura com a proteína transportadora, a mistura polissacarídeo Pn 3 activado/proteína transportadora é opcionalmente congelada (por exemplo, congelada em casca) e co-liofilizada. A conjugação é levada a cabo reagindo a mistura polissacarídeo Pn 3 activado/proteína transportadora com um agente redutor, tal como cianoborohidreto de sódio. Os aldeídos que não reagiram são então capeados, por meio de redução de borohidreto de sódio. 0 conjugado é purificado (por exemplo, por diafiltração versus tampão fosfato, seguido por tampão salino), dando um concentrado de lote final do glicoconjugado em tampão salino. A divulgação acima descreve geralmente a presente invenção. Uma compreensão mais completa pode ser obtida por referência aos seguintes exemplos específicos. Estes exemplos são descritos apenas para fins de ilustração, e não se destinam a limitar o âmbito da invenção.

Exemplos Exemplo 1 26

Preparação de Polissacarídeo Capsular Serotipo 1 de S. pneumoniae

Preparação de Bancos Celulares Mestres e de Trabalho 0 serotipo 1 de S. pneumoniae foi obtido a partir da Colecção Americana de Culturas Tipo, ATCC, estirpe 6301. Foram criadas várias gerações de estoques de sementes a fim de expandir a estirpe, e remover componentes de origem animal (gerações Fl, F2 e F3). Foram produzidas duas gerações adicionais de estoques de sementes. A primeira geração adicional foi feita a partir de um frasco F3, e a geração subsequente foi feita a partir de um frasco da primeira geração adicional. Frascos de sementes foram armazenados congelados (<-70 °C) , com glicerol sintético como criopreservante. Para além de frascos congelados, foram preparados frascos liofilizados para a geração F4. Para a preparação de banco celular, todas as culturas foram cultivadas num meio à base de soja. Antes da congelação, as células foram concentradas por centrifugação, foi removido o meio gasto, e aglomerados de células foram ressuspendidos em meio fresco contendo um criopreservante, tal como glicerol sintético.

Fermentação e Colheita

Foram utilizadas culturas do banco celular de trabalho para inocular frascos de sementes, contendo um meio à base de soja. Os frascos foram incubados a 36 °C ± 2 °C, sem agitação, até que as exigências de crescimento foram atingidas. Foi utilizado um frasco de sementes para inocular um fermentador de sementes, contendo um meio à base de soja. Foi mantido um pH de cerca de 7,0 com uma solução estéril de carbonato de sódio. Depois de atingida a densidade óptica alvo, o fermentador de sementes foi utilizado para inocular o fermentador de produção, contendo meio à base de soja. O pH foi mantido com uma solução estéril de carbonato de sódio. A fermentação foi terminada após a cessação do crescimento, ou quando foi atingido o 27 volume de trabalho do fermentador. Foi adicionada à cultura uma quantidade apropriada de deoxicolato de sódio estéril a 12% para lisar as células bacterianas, e libertar polissacarideos associados às células. Após a lise, foram arrefecidos os conteúdos do fermentador. 0 pH do caldo de cultura lisada foi ajustado para aproximadamente pH 6,6 com ácido acético. 0 lisado foi clarificado por centrifugação de fluxo continuo, seguido por filtração profunda e microfiltração 0,45 μπι.

Num processo alternativo, o pH da fermentação de cerca de 7,0 foi mantido com NaOH 3N. Depois da densidade óptica alvo ser atingida, o fermentador de sementes foi utilizado para inocular o fermentador de produção, contendo meio à base de soja. O pH foi mantido com NaOH 3N. A fermentação foi terminada após a cessação do crescimento ou quando foi atingido o volume de trabalho do fermentador. Foi adicionada à cultura uma quantidade apropriada de deoxicolato de sódio estéril a 12% para obter uma concentração de 0,12% no caldo, para lisar as células bacterianas e libertar polissacarideos associados às células. Após a lise, os conteúdos do fermentador foram mantidos, com agitação, durante um intervalo de tempo compreendido entre 8 e 24 horas, a uma temperatura entre 7 °C e 13 °C, para assegurar que tinha ocorrido uma completa lise celular e libertação de polissacarideo. A agitação durante este período de espera impediu o sedimento do lisado de assentar sobre as paredes do fermentador e na sonda de pH, permitindo assim que a integridade da sonda de pH se mantivesse. Em seguida, foi ajustado o pH do caldo de cultura lisada, para aproximadamente pH 5,0 com 50% de ácido acético. Depois de um tempo de espera sem agitação, durante um intervalo de tempo entre 12 e 24 horas, a uma temperatura entre 15 °C e 25 °C, uma porção significativa das proteínas solúveis anteriores saiu da solução como um precipitado sólido, com pouca perda ou degradação do 28 polissacarídeo, que permaneceu em solução. A solução com o precipitado foi então clarificada por centrifugação de fluxo continuo, seguida por filtração profunda e microfiltração 0,45 |im.

Purificação A purificação do polissacarídeo pneumocócico consistiu em várias operações de concentração/diafiltração, precipitação/eluição, cromatografia em coluna, e passos de filtração profunda. Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que especificado em contrário. O caldo clarificado do fermentador das culturas do serotipo 1 de S. pneumoniae foi concentrado e diafiltrado usando um filtro de 100 kDa MWCO (peso molecular de corte quilodalton). A diafiltração foi atingida utilizando tampão fosfato de sódio a pH neutro. A diafiltração removeu os componentes de baixo peso molecular do meio, dos biopolímeros de maior peso molecular, tais como ácido nucleico, proteína e polissacarídeos. O polissacarídeo foi precipitado da solução concentrada e diafiltrada, por adição de brometo de amónio hexadeciltrimetil (HB) de uma solução estoque, para dar uma concentração final de HB 1% (p/v). O precipitado de polissacarídeo/HB foi capturado num filtro de profundidade, e o filtrado foi descartado. O polissacarídeo precipitado foi ressolubilizado e eluído por recirculação de uma solução de cloreto de sódio através do filtro de profundidade contendo o precipitado. Os filtros foram então lavados com solução de cloreto de sódio adicional.

Foi adicionado iodeto de sódio (Nal) à solução de polissacarídeo, de uma solução estoque de Nal, para atingir uma concentração final de 0,5% para precipitar HB. O precipitado foi removido por filtração profunda. O filtrado contém o polissacarídeo alvo. O recipiente de precipitação 29 e o filtro foram lavados com uma solução de NaCl/Nal, e o liquido da lavagem foi combinado com a solução de polissacarideo parcialmente purificada. 0 filtro foi descartado. 0 polissacarideo foi então filtrado através de um filtro de 0,2 μιη. A solução de polissacarideo foi concentrada num ultrafiltro de 30 kDa MWCO, e diafiltrada com uma solução de cloreto de sódio. A solução de polissacarideo parcialmente purificada, foi ainda purificada por filtração através de um filtro de profundidade, impregnado com carvão activado. Após filtração, o filtro de carvão foi lavado com uma solução de cloreto de sódio. O liquido da lavagem foi combinado com a solução de polissacarideo, que é então filtrada através de um filtro de 0,2 μιη. A solução de polissacarideo foi concentrada num ultrafiltro de 30 kDa MWCO e ajustada com um tampão fosfato de sódio 1M, para atingir uma concentração final de fosfato de sódio 0,025 Μ. O pH foi verificado e ajustado para 7,0 ± 0,2. A coluna de cerâmica de hidroxiapatite (HA) foi equilibrada com tampão fosfato de sódio contendo cloreto de sódio, para se obter a condutividade apropriada (<15 με). A solução de polissacarideo foi então carregada na coluna. Sob estas condições, as impurezas ligam-se à resina e recupera-se o polissacarideo no fluxo através da coluna. A solução de polissacarideo foi filtrada através de filtros em linha de 0.2 μιη, localizados antes e depois da coluna. A solução de polissacarideo foi concentrada utilizando um filtro de 30 kDa MWCO. O concentrado foi então diafiltrado com água para injecção (API). A solução de polissacarideo diafiltrada, foi filtrada através de um filtro de membrana de 0,2 μιη em garrafas de polipropileno. Foram removidas amostras para o teste de 30 aprovação, e o polissacarídeo purificado foi armazenado congelado a -25 °C ± 5 °C.

Caracterização

Os dados de 1H-RMN foram consistentes com a estrutura química pela atribuição de sinais atribuídos aos protões da molécula de polissacarídeo. O espectro de 1H-RMN mostrou uma série de sinais bem definidos (protões do grupo metilo) para a quantificação do grupo funcional O-acetil no polissacarídeo. A identidade do polissacarídeo monovalente foi confirmada por imunoelectroforese em contracorrente utilizando anti-soros específicos.

Para calcular o peso molecular foi usada a cromatografia de filtração em gel de alto desempenho acoplada com detectores de índice de refracção e espalhamento multiangular de luz a laser (MALLS), em conjunto com a concentração da amostra. Foi usado meio de cromatografia de exclusão por tamanho (CL-4B) para determinar o perfil da distribuição relativa de tamanho molecular do polissacarídeo.

Exemplo 2

Preparação do Conjugado de Sacarideo Pneumocócico Serotipo 1 -CRM197

Activação e Conjugação

Foram descongelados recipientes de polissacarídeo purificado e combinados num recipiente de reacção. Foi adicionado ao recipiente, carbonato de sódio 0,2 M, pH 9,0 para desacetilação parcial (hidrólise) durante 3 horas a 50 °C. A reacção foi arrefecida até 20 °C, e a neutralização foi realizada por ácido acético 0,2 M. Foi feita a oxidação na presença de periodato de sódio por incubação a 2-8 °C, e a mistura foi agitada durante 15-21 horas. A mistura de reacção de activação foi concentrada e diafiltrada lOx com NaCl 0,9%, utilizando uma membrana 30 K MWCO. O retentado foi filtrado 0,2 μιη. O sacarideo activado 31 foi enchido em garrafas de vidro de liofilização de 100 ml, e congelado em casca a -75 °C, e liofilizado. "Congelação em casca" é um método para a preparação de amostras para liofilização (secagem por congelação). Os frascos são automaticamente girados por rolos motorizados, num banho refrigerado contendo álcool ou qualquer outro liquido apropriado. Uma fina camada de produto é uniformemente congelada em torno da "casca" interior do frasco, permitindo que um maior volume de material seja processado de forma segura, durante cada execução de secagem por congelação. Estas unidades automáticas, refrigeradas proporcionam um meio simples e eficaz de pré-congelamento de muitos frascos ao mesmo tempo, produzindo os revestimentos desejados dentro, e fornecendo área de superfície suficiente para uma eficiente secagem por congelação.

Garrafas de material liofilizado foram levadas até temperatura ambiente, e este foi ressuspendido numa solução de CRM197 numa razão de sacarídeo/proteína de 2:1. Foi adicionado à mistura de sacarídeo/proteína tampão fosfato de sódio 1M, a uma força iónica final de 0,2 M e um pH de 7,5, em seguida, foi adicionado cianoborohidreto de sódio. A reacção foi incubada a 23 °C durante 18 horas, seguida por uma segunda incubação a 37 °C durante 72 horas. Após as incubações em cianoborohidreto, a mistura de reacção foi diluída com solução salina fria, seguida pela adição de carbonato de sódio 1M, para ajustar a mistura de reacção a pH 9,0. Os aldeídos que não reagiram foram extintos por adição de borohidreto de sódio, por incubação a 23 °C durante 3-6 horas. A mistura de reacção foi diluída duas vezes com solução salina, e transferida através de um pré-filtro 0,45-5 μιη para um recipiente de retentato. A mistura de reacção é diafiltrada 30x com tampão fosfato 0,15 M, pH 6, 32 e 20x com solução salina. 0 retentato foi filtrado através de um filtro de 0,2 μιη. A solução de conjugado foi diluida para um alvo de 0,5 mg/ml em 0,9% de solução salina, e em seguida, esterilmente filtrada para recipientes de caldo final concentrado (CFC) numa hotte de Classe 100. 0 conjugado foi armazenado a 2-8 °C.

Caracterização

Foi usado meio de cromatografia de exclusão por tamanho (CL-4B) para determinar o perfil da distribuição relativa de tamanho molecular do polissacarideo. A identidade do conjugado foi confirmada pelo ensaio "slot-blot" utilizando anti-soros específicos.

As concentrações de sacarídeo e proteína foram determinadas pelos ensaios de ácido urónico e de Lowry, respectivamente. A razão de sacarídeo para proteína no complexo conjugado covalentemente ligado foi obtida pelo cálculo:

Razão = μρ/ml sacarídeo μρ/πιΐ proteína O conteúdo O-acetil foi medido pelo método de Hestrin (Hestrin et. al. , J. Biol. Chem. 1949, 180, p. 249). A razão de concentração de O-acetil para concentração total de sacarídeo deu μιηοίβε de O-acetil por mg de sacarídeo. Exemplo 3

Preparação de Polissacarideo Capsular Serotipo 3 de S. pneumoniae

Preparação de Bancos Celulares Mestres e de Trabalho O serotipo 3 de S. pneumoniae foi obtido do Dr. Robert Austrian, Universidade da Pensilvânia, Filadélfia, Pensilvânia. Veja-se o Exemplo 1 para a preparação do sistema de banco celular.

Fermentação e Colheita

Foram usadas culturas do banco celular de trabalho para inocular garrafas semente, contendo meio à base de 33 soja. As garrafas foram incubadas a 36 °C ± 2 °C sem agitação, até gue as exigências de crescimento foram atingidas. Uma garrafa de sementes foi utilizada para inocular um fermentador de sementes contendo meio à base de soja. Foi mantido um pH de cerca de 7,0 com uma solução estéril de carbonato de sódio. Depois de atingida a densidade óptica alvo, o fermentador de sementes foi utilizado para inocular um fermentador de sementes intermédio. Depois de atingida a densidade óptica alvo, o fermentador de sementes intermédio foi usado para inocular o fermentador de produção. O pH foi mantido com uma solução estéril de carbonato de sódio. A fermentação foi terminada após o volume de trabalho do fermentador ter sido atingido. Foi adicionada à cultura uma guantidade apropriada de desoxicolato de sódio estéril a 12%, para lisar as células bacterianas e libertar os polissacarideos associados às células. Após a lise, foram arrefecidos os conteúdos do fermentador. O pH do caldo de cultura lisada foi ajustado para aproximadamente pH 6,6 com ácido acético. O lisado foi clarificado por centrifugação de fluxo contínuo, seguido por filtração profunda e microfiltração 0,45 μιη.

Purificação A purificação do polissacarideo pneumocócico consistiu em várias operações de concentração/diafiltração, precipitação/eluição, cromatografia em coluna, e passos de filtração profunda. Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que especificado em contrário. O caldo clarificado do fermentador das culturas do serotipo 3 de S. pneumoniae foi concentrado e diafiltrado usando um filtro de 100 kDa MWCO. A diafiltração foi atingida utilizando tampão fosfato de sódio a pH neutro. A diafiltração removeu os componentes de baixo peso molecular do meio, dos biopolímeros de maior peso molecular, tais como ácido nucleico, proteína e polissacarideo. 34

Antes da adição de brometo de amónio hexadeciltrimetil (HB), foi adicionado um volume calculado de uma solução estoque de NaCl à solução de polissacarídeo concentrado e diafiltrado, para dar uma concentração final de 0,25 M de NaCl. O polissacarídeo foi então precipitado por adição de HB a partir de uma solução estoque, para dar uma concentração final de HB 1% (p/v). O precipitado de polissacarideo/HB foi capturado num filtro de profundidade, e o filtrado foi descartado. O precipitado de polissacarídeo foi resolubilizado e eluído por recirculação uma solução de cloreto de sódio através do filtro de profundidade contendo o precipitado. Os filtros foram então lavados com solução de cloreto de sódio adicional.

Foi adicionado à solução de polissacarídeo iodeto de sódio (Nal) a partir de uma solução estoque de Nal, para atingir uma concentração final de 0,5% para precipitar HB. 0 precipitado foi removido por filtração profunda. O filtrado continha o polissacarídeo alvo. O recipiente de precipitação e o filtro foram lavados com uma solução de NaCl/Nal, e o líquido da lavagem foi combinado com a solução de polissacarídeo parcialmente purificado. O filtro foi descartado. O polissacarídeo foi então filtrado através de um filtro de 0,2 μιτι. A solução de polissacarídeo foi concentrada num ultrafiltro de 30 kDa MWCO, e diafiltrada com uma solução de cloreto de sódio. A solução de polissacarídeo parcialmente purificada foi ainda purificada por filtração, através de um filtro de profundidade impregnado com carvão activado. Após filtração, o filtro de carvão foi lavado com uma solução de cloreto de sódio. O líquido da lavagem foi combinado com a solução de polissacarídeo, que foi então filtrada através de um filtro de 0,2 μιτι. A solução de polissacarídeo foi concentrada num ultrafiltro de 30 kDa MWCO, e ajustada com um tampão 35 fosfato de sódio 1M para atingir uma concentração final de 0,025 M de fosfato de sódio. O pH foi verificado e ajustado para 7,0 ± 0,2. A coluna de cerâmica de hidroxiapatite (HA) foi equilibrada com tampão fosfato de sódio contendo cloreto de sódio, para se obter a condutividade apropriada (15 μΞ). A solução de polissacarideo foi então carregada na coluna. Sob estas condições, as impurezas ligam-se à resina e recupera-se o polissacarideo no fluxo através da coluna. O polissacarideo foi lavado através da coluna com tampão, e foi filtrado através de um filtro 0,2 μιη. A solução de polissacarideo foi concentrada utilizando um filtro de 30 kDa MWCO. O concentrado foi então diafiltrado com API. A solução de polissacarideo diafiltrada, foi filtrada através de um filtro de membrana de 0,2 μιη para recipientes de aço inoxidável. Foram removidas amostras para o teste de aprovação, e o polissacarideo purificado foi armazenado congelado a -25 °C ± 5 °C.

Caracterização

Os dados de 1H-RMN foram consistentes com a estrutura química pela atribuição de sinais atribuídos aos protões da molécula de polissacarideo. A identidade do polissacarideo monovalente foi confirmada por imunoelectroforese em contracorrente utilizando anti-soros específicos.

Para calcular o peso molecular foi usada cromatografia de filtração em gel de alto desempenho, acoplada com detectores de índice de refracção e espalhamento multiangular de luz a laser (MALLS), em conjunto com a concentração da amostra.

Foi usado meio de cromatografia de exclusão por tamanho (CL-4B) para determinar o perfil da distribuição relativa de tamanho molecular do polissacarideo.

Exemplo 4 36

Preparação do Conjugado de Sacarídeo Pneumocócico Serotipo 3 —CRM197

Activação e Conjugação

Foram descongelados recipientes de sacarídeo serotipo 3 purificado e combinados num recipiente de reacção. Foram adicionados ao recipiente API e ácido acético 2M, para uma concentração final de sacarídeo de 0,2 M e 2mg/ml. A temperatura da solução foi aumentada para 85 °C durante uma hora, para hidrolisar o polissacarídeo. A reacção foi arrefecida até d 25 °C, e foi adicionado cloreto de magnésio 1M para uma concentração final de 0,1 M. Foi realizada oxidação na presença de periodato de sódio por incubação durante 16-24 horas a 23 °C. A mistura de reacção de activação foi concentrada e diafiltrada lOx com API, utilizando uma membrana de 100 K MWCO. 0 retentato foi filtrado através de um filtro de 0,2 μιη.

Para a composição, foi adicionado fosfato de sódio 0,2 M, pH 7,0, ao sacarídeo activado, para uma concentração final de 10 mM e um pH de 6,0-6,5. Foi misturada proteína transportadora CRM197 com a solução de sacarídeo, a um razão de 2g de sacarídeo por 1 g de CRMi97. A solução combinada de sacarídeo/proteína foi enchida em garrafas de vidro de liofilização de 100 ml, com um enchimento alvo de 50 ml, congelada em escudo a -75 °C, e liofilizada.

Garrafas de material co-liofilizado sacarídeo/proteína foram levadas até à temperatura ambiente, e este foi ressuspendido em tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,0, para uma concentração final de sacarídeo de 20 mg/ml. 0 pH foi ajustado para 6,5, e em seguida foi adicionado 0,5 equivalente molar de cianoborohidreto de sódio. A reacção foi incubada a 37 °C durante 48 horas. Após a incubação com cianoborohidreto, a mistura de reacção foi diluída com tampão frio de sucinato 5 mM/salino 0,9%. Os aldeídos que não reagiram foram extinguidos pela adição de borohidreto 37 de sódio, e incubação a 23 °C durante 3-6 horas. A mistura de reacção foi transferida através de um pré-filtro de 0,45-5 μιη para um recipiente de retentato. A mistura de reacção foi diafiltrada 30x com tampão fosfato 0,1 M (pH 9), 20x com tampão fosfato 0,15 M (pH 6), e 20x com sucinato 5 mM/salino 0,9%. 0 retentato foi filtrado através de um filtro de 0,2-μιη. A solução de conjugado foi diluída para um alvo de 0,5 mg/ml de sacarídeo, e em seguida esterilmente filtrada para recipientes CFC numa hotte de Classe 100. O conjugado foi armazenado a 2-8 °C.

Caracterização

Foi usado meio de cromatografia de exclusão por tamanho (CL-4B) para determinar o perfil da distribuição relativa de tamanho molecular do conjugado. A identidade do conjugado foi confirmada pelo ensaio slot-blot utilizando anti-soros específicos.

As concentrações de sacarídeo e proteína foram respectivamente determinadas pelos ensaios de Anthrone e Lowry. A razão de sacarídeo para proteína no complexo conjugado covalentemente ligado foi obtida pelo cálculo:

Razão = μρ/ιηΐ sacarídeo μρ/ιηΐ proteína

Exemplo 5

Preparação de Polissacarídeo Capsular Serotipo 5 de S. pneumoniae O serotipo 5 de S. pneumoniae foi obtido do Dr. Gerald Schiffman, da Universidade Estatal de Nova Iorque, Brooklyn, Nova Iorque. Veja-se o Exemplo 1 para a preparação do sistema de banco celular. Veja-se o Exemplo 1 para a fermentação, colheita, purificação e caracterização do polissacarídeo.

Processo de Fermentação Alternativo

Foram usadas culturas do banco celular de trabalho para inocular garrafas de sementes contendo um meio à base 38 de soja e uma solução estéril de NaHC03 10 mM. As garrafas foram incubadas a 36 °C ± 2 °C, sem agitação, até gue as exigências de crescimento foram atingidas. Foi utilizada uma garrafa de sementes para inocular um fermentador de sementes, contendo meio à base de soja e uma solução estéril de NaHC03 10 mM. Foi mantido um pH de cerca de 7,0 com NaOH 3N. Após atingida a densidade óptica alvo, o fermentador de sementes foi utilizado para inocular o fermentador de produção contendo meio à base de soja com uma concentração de NaHC03 10 mM. O pH foi mantido com NaOH 3N. A fermentação foi terminada após a cessação de crescimento ou quando o volume de trabalho do fermentador foi atingido. Foi adicionada à cultura uma quantidade apropriada de desoxicolato de sódio estéril a 12% para obter uma concentração de 0,12% no caldo, para lisar as células bacterianas e libertar polissacarideos associados às células. Após a lise, os conteúdos do fermentador foram mantidos com agitação durante um intervalo de tempo entre 8 e 24 horas, a uma temperatura entre 7 °C e 13 °C, para assegurar que tinha ocorrido uma lise celular completa e libertação de polissacarideo. A agitação durante este período de espera preveniu o sedimento de lisado de assentar sobre as paredes do fermentador e da sonda de pH, permitindo assim que seja mantida a integridade da sonda de pH. Em seguida, o pH do caldo de cultura lisada foi ajustado para aproximadamente pH 4,5 com 50% de ácido acético. Depois de um tempo de espera sem agitação, durante um intervalo de tempo entre 12 e 24 horas, a uma temperatura entre 15 °C e 25 °C, uma porção significativa das proteínas solúveis anteriores saiu da solução como um precipitado sólido, com pouca perda ou degradação do polissacarideo, que permaneceu em solução. A solução com o precipitado foi então clarificada por centrifugação de fluxo contínuo, seguida por filtração profunda e microfiltração 0,45 μιη. 39

Exemplo 6

Preparação do Conjugado de Sacarídeo Pneumocócico Serotipo 5 -CRM197

Activação e Conjugação

Foram descongelados recipientes de sacarídeo serotipo 5 e combinados num vaso de reacção. Foi adicionado ao recipiente acetato de sódio 0,1 M, pH 4,7, seguido de oxidação na presença de periodato de sódio por incubação durante 16-22 horas a 23 °C. A mistura de reacção de activação foi concentrada e diafiltrada lOx com API, utilizando uma membrana de 100K MWCO. O retentato foi filtrado através de um filtro de 0,2 μπι. 0 sacarídeo serotipo 5 activado foi combinado com CRM197 numa razão de 0,8:1. A solução combinada de sacarídeo/proteína foi enchida em garrafas de vidro de liofilização de 100 ml (alvo de enchimento de 50 ml), congelada em escudo a -75 °C, e co-liofilizada.

Garrafas de material co-liofilizado foram levadas a temperatura ambiente, e este foi ressuspendido em fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,5, e foi adicionado cianoborohidreto de sódio. A reacção foi incubada a 30 °C durante 72 horas, seguida por uma segunda adição de cianoborohidreto, e incubação a 30 °C durante 20-28 horas.

Após as incubações em cianoborohidreto a mistura de reacção foi diluída duas vezes com solução salina, e transferida através de um pré-filtro de 0,45-5 μιτι para um vaso de retentato. A mistura de reacção foi diafiltrada 30x com tampão fosfato 0,01 M, pH 8, 20x com tampão fosfato 0,15 M, pH 6, e 20x com solução salina. O retentato foi filtrado através de um filtro de 0,2 μιη. A solução de conjugado foi diluída para um alvo de 0,5 mg/ml de sacarídeo, e em seguida, esterilmente filtrada para recipientes de CFC numa hotte de Classe 100. O conjugado foi armazenado a 2-8 °C. 40

Veja-se o Exemplo 2 para a caracterização do conjugado.

Exemplo 7

Preparação de Polissacarideo Capsular Serotipo 6A de S. pneumonlae O serotipo 6A de S. pneumoniae foi obtido do Dr. Gerald Schiffman, da Universidade Estatal de Nova Iorque, Brooklyn, Nova Iorque. Veja-se o Exemplo 1 para a preparação do sistema de banco celular. Veja-se o Exemplo 1 para a fermentação, colheita e purificação do polissacarideo, excepto que durante a purificação, é omitido o passo de concentração com 30 kDa MWCO, antes do passo de cromatografia.

Exemplo 8

Preparação do Conjugado de Sacarideo Pneumocócico Serotipo 6A -CRM197

Activação e Conjugação

0 polissacarideo serotipo 6A é um polímero de elevado peso molecular que teve de ser reduzido em tamanho antes da oxidação. Foram descongelados recipientes de sacarideo serotipo 6A, e combinados num vaso de reacção. Foi adicionado ao recipiente ácido acético 2 M para uma concentração final de 0,1 M para a hidrólise, durante 1,5 horas a 60 °C. A reacção foi arrefecida a 23 °C, e foi realizada neutralização através do ajuste da mistura de reacção com NaOH 1 M até pH 6. Foi realizada a oxidação na presença de periodato de sódio por incubação a 23 °C durante 14-22 horas. A mistura de reacção de activação foi concentrada e diafiltrada lOx com API, utilizando uma membrana de 100 K MWCO. O retentato foi filtrado através de um filtro de 0,2 μπι. O Serotipo 6A foi combinado com sacarose, e enchido em garrafas de vidro de liofilização de 100 ml (alvo de 41 enchimento de 50 ml) e congelado em escudo a -75 °C e liofilizado.

Garrafas de material liofilizado foram levadas a temperatura ambiente, e este foi ressuspendido em dimetilsulfóxido (DMSO) a uma razão de sacarídeo/proteína de 1:1. Após a adição de cianoborohidreto de sódio, a mistura de reacção foi incubada a 23 °C durante 18 horas. Após a incubação em cianoborohidreto, a mistura de reacção foi diluida com solução salina fria. Os aldeídos que não reagiram foram extintos por adição de borohidreto de sódio, por incubação a 23 °C durante 3-20 horas. A mistura de reacção diluída foi transferida através de um pré-filtro de 5 μιτι para um recipiente de retentato. A mistura de reacção foi diafiltrada lOx com NaCl 0,9% e 30x com sucinato tamponado com NaCl. O retentato foi filtrado através de um filtro de 0,2 μπι. A solução de conjugado foi diluída para um alvo de 0,5 mg/ml de sacarídeo, e em seguida esterilmente filtrada para recipientes CFC numa hotte de Classe 100. O conjugado foi armazenado a 2-8 °C.

Veja-se o Exemplo 2 para a caracterização do conjugado. Exemplo 9

Preparação de Polissacarideo Capsular Serotipo 7F de S. pneumoniae O serotipo 7F de S. pneumoniae foi obtido do Dr. Gerald Schiffman, da Universidade Estatal de Nova Iorque,

Brooklyn, Nova Iorque. Veja- -se o Exemplo 3 para a preparação do sistema de banco celular, e para a fermentação e colheita do polissacarideo. Veja-se o processo alternativo descrito no Exemplo 1 para um processo alternativo de fermentação e colheita.

Purificação A purificação do polissacarideo pneumocócico consistiu em várias operações de concentração/diafiltração, precipitação/eluição, cromatografia em coluna, e passos de 42 filtração profunda. Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que especificado em contrário. 0 caldo clarificado do fermentador das culturas do serotipo 7F de S. pneumoniae foi concentrado e diafiltrado usando um filtro de 100 kDa MWCO. A diafiltração foi atingida utilizando tampão fosfato de sódio a pH neutro. A diafiltração removeu os componentes do meio de baixo peso molecular dos biopolimeros de maior peso molecular, tais como ácido nucleico, proteína e polissacarídeo. O serotipo 7F não forma um precipitado com HB. Em vez disso, as impurezas foram precipitadas da solução concentrada e diafiltrada, adicionando o HB de uma solução estoque, para uma concentração final de HB a 1%. 0 precipitado foi capturado num filtro de profundidade, e o filtro foi descartado. O polissacarídeo foi contido no filtrado.

Foi adicionado iodeto de sódio (Nal) à solução de polissacarídeo, a partir de uma solução estoque de Nal, para atingir uma concentração final de 0,5% para precipitar HB. 0 precipitado foi removido por filtração profunda. O filtrado continha o polissacarídeo alvo. O recipiente de precipitação e o filtro foram lavados com uma solução de NaCl/Nal, e o líquido das lavagens foi combinado com a solução de polissacarídeo parcialmente purificada. 0 filtro foi descartado. O polissacarídeo foi então filtrado através de um filtro de 0,2 μιη. A solução de polissacarídeo foi concentrada num ultrafiltro de 30 kDa MWCO, e diafiltrada com uma solução de cloreto de sódio. A solução de polissacarídeo parcialmente purificada foi ainda purificada por filtração, através de um filtro de profundidade impregnado com carvão activado. Após filtração, o filtro de carvão foi lavado com uma solução de cloreto de sódio. O líquido da lavagem foi combinado com a 43 solução de polissacarídeo, que foi então filtrada através de um filtro de 0,2 μιη. A solução de polissacarídeo foi concentrada num ultrafiltro de 30 kDa MWCO, e ajustada com um tampão fosfato de sódio 1 M para atingir uma concentração final de fosfato de sódio 0,025 M. 0 pH foi verificado e ajustado para 7,0 ± 0,2. A coluna de cerâmica de hidroxiapatite (HA) foi equilibrada com tampão fosfato de sódio contendo cloreto de sódio, para se obter a condutividade apropriada (15 με) . A solução de polissacarídeo foi então carregada na coluna. Sob estas condições, as impurezas ligam-se à resina e recupera-se o polissacarídeo no fluxo através da coluna. O polissacarídeo foi lavado através da coluna com tampão, e foi filtrado através de um filtro de 0,2 μιη. A solução de polissacarídeo foi concentrada utilizando um filtro de 30 kDa MWCO. 0 concentrado foi então diafiltrado com API. A solução de polissacarídeo diafiltrada foi filtrada através de um filtro de membrana de 0,2 μιη para recipientes de aço inoxidável. Foram removidas amostras para o teste de aprovação, e o polissacarídeo purificado foi armazenado a 2 °C-8 °C.

Veja-se o Exemplo 3 para a caracterização do polissacarídeo.

Exemplo 10

Preparação do Conjugado de Sacarídeo Pneumocócico Serotipo 7F —CRM197

Activação e Conjugação

Foi realizada oxidação na presença de periodato de sódio por incubação durante 16-24 horas a 23 °C. A mistura de reacção de activação foi concentrada e diafiltrada lOx com NaOAc 10 mM, pH 4,5, utilizando uma membrana de 100 K MWCO. O retentato foi filtrado através de um filtro de 0,2 μιη. 44 0 serotipo 7F foi enchido em garrafas de vidro de liofilização de 100 ml (alvo de enchimento de 50 ml) e congelado em escudo a -75 °C e liofilizado.

Garrafas de serotipo 7F e CRMi97 liofilizados foram levadas a temperatura ambiente, e este foi ressuspendido em DMSO numa razão de sacarídeo/proteína de 1,5:1. Após a adição de cianoborohidreto de sódio, a reacção foi incubada a 23 °C durante 8-10 horas. Os aldeídos gue não reagiram foram extinguidos pela adição de borohidreto de sódio, por incubação a 23 °C durante 16 horas. A mistura de reacção foi diluída 10 vezes com solução salina fria, e transferida através de um pré-filtro de 5 μιη para um recipiente de retentato. A mistura de reacção foi diafiltrada lOx com solução salina a 0,9% e 30x com solução salina tamponada com sucinato. O retentato foi filtrado através de um filtro de 0,2 μιτι. A solução de conjugado foi diluída para um alvo de 0,5 mg/ml de sacarídeo em 0,9% de solução salina, e em seguida, esterilmente filtrada para recipientes CFC numa hotte de Classe 100. O conjugado foi armazenado a 2-8 °C.

Veja-se o Exemplo 4 para a caracterização do conjugado.

Exemplo 11

Preparação de Polissacarideo Capsular Serotipo 19A de S. pneumoniae O serotipo 19A de S. pneumoniae foi obtido do Dr. Gerald Schiffman, da Universidade Estatal de Nova Iorque, Brooklyn, Nova Iorque. Veja-se Exemplo 1 para a preparação do sistema de banco celular. Veja-se Exemplo 7 para a fermentação, colheita e purificação do polissacarideo. Veja-se Exemplo 3 para a caracterização.

Exemplo 12

Preparação do Conjugado de Sacarídeo Pneumocócico Serotipo 19A -CRM197

Activação e Conjugação 45

Foram descongelados os recipientes de sacarídeo serotipo 19A e combinados num recipiente de reacção. Foi adicionado acetato de sódio a 10 mM (pH 5,0), e a oxidação foi realizada na presença de periodato de sódio por incubação durante 16-24 horas a 23 °C. A mistura de reacção de activação foi concentrada e diafiltrada lOx com acetato a 10 mM, pH 5,0, utilizando uma membrana de 100 K MWCO. O retentato foi filtrado através de um filtro de 0,2 μπι. O sacarídeo activado foi combinado com sacarose, seguido pela adição de CRM197. A mistura de sacarídeo serotipo 19A activado e CRM197 (razão de 0,8:1) foi enchida em garrafas de vidro de liofilização de 100 ml (alvo de enchimento de 50 ml) e congelada em escudo a -75 °C e liofilizada.

Garrafas de material liofilizado foram levadas a temperatura ambiente, e este foi ressuspendido em DMSO. Foi adicionado à mistura de sacarídeo/proteína, cianoborohidreto de sódio (100 mg/ml). A reacção foi incubada a 23 0 C durante 15 horas. Após a incubação em cianoborohidreto, os aldeídos que não reagiram foram extinguidos pela adição de borohidreto de sódio, por incubação a 23 °C durante 3-20 horas. A mistura de reacção foi diluída 10 vezes com solução salina fria, e transferida através de um pré-filtro de 5 μιη para um recipiente de retentato. A mistura de reacção foi diafiltrada lOx com NaCl a 0,9%, filtrada 0,45-μιη, e 30x com diafiltração utilizando sucinato 5 mM/tampão de NaCl 0,9%, pH 6. O retentato foi filtrado através de um filtro de 0,2 μπι. A solução de conjugado foi diluída para um alvo de 0,5 mg/ml, utilizando sucinato 5 mM/solução salina 0.9%, e em seguida, esterilmente filtrada para recipientes CFC numa hotte de Classe 100. O conjugado foi armazenado a 2-8 °C. Veja-se Exemplo 4 para caracterização do conjugado. 46

Exemplo 13

Preparação de Polissacarideo Capsular Serotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F de S. pneumoniae

Preparação da Cultura Semente de S. Pneumoniae

Os serotipos 4, 6B, 9V, 18C, 19F e 23F de S. pneumoniae foram obtidos do Dr. Gerald Schiffman, da Universidade Estatal de Nova Iorque, Brooklyn, Nova Iorque. 0 serotipo 14 de S. pneumoniae foi obtido da ATCC, estirpe 6314.

Foram usados separadamente, um frasco de cada um dos serotipos desejados de Streptococcus pneumoniae para iniciar um lote de fermentação. Duas garrafas contendo um meio à base de soja e vermelho de fenol foram ajustadas para uma gama de pH de 7,4 ± 0,2 usando carbonato de sódio, e foi então adicionado às garrafas um volume necessário de uma solução de dextrose a 50%/sulfato de magnésio a 1%. As duas garrafas foram inoculadas com quantidades diferentes de semente. As garrafas foram incubadas a 36 ° ± 2 °C até que o meio se tornou amarelo. Após a incubação, foram removidas amostras de cada frasco e testadas para densidade óptica (DO) (0,3 a 0,9) e pH (4,6 a 5,5). Uma das duas garrafas foi seleccionada para a inoculação do fermentador de sementes.

Foi transferido meio à base de soja para o fermentador de sementes e esterilizado. Em seguida, foi adicionado ao fermentador um volume de uma solução de dextrose a 50%/sulfato de magnésio a 1%. Foram monitorizados e controlados o pH e a agitação do fermentador de sementes (pH 6,7 a 7,4). A temperatura foi mantida a 36 ° ± 2 °C. O inoculo semente (garrafa) foi assepticamente ligado ao fermentador de sementes, e o inoculo foi transferido. O fermentador foi mantido em controlo do pH, e foram periodicamente removidas e testadas amostras para DO e pH. Quando a densidade óptica desejada de 0,5 a 600 nm foi 47 atingida, o fermentador intermédio foi inoculado com o caldo de fermentação do fermentador de sementes.

Foi transferido meio à base de soja para o fermentador intermédio e esterilizado. Em seguida, foi adicionado ao fermentador um volume de uma solução de dextrose a 50%/sulfato de magnésio a 1%. Foram monitorizados e controlados o pH e a agitação do fermentador intermédio (pH 6,7 a 7,4) . A temperatura foi mantida a 36 ° ± 2 °C. Os conteúdos do fermentador de sementes foram transferidos para o fermentador intermédio. 0 fermentador foi mantido em controlo do pH, e foram periodicamente removidas e testadas amostras para DO e pH. Quando a densidade óptica desejada de 0,5 a 600 nm foi atingida, o fermentador de produção foi inoculado com o caldo de fermentação do fermentador intermédio.

Foi transferido meio à base de soja para o fermentador de produção e esterilizado. Em seguida, foi adicionado ao fermentador um volume de uma solução de dextrose a 50%/sulfato de magnésio a 1%. Foram monitorizados e controlados o pH e a agitação do fermentador de produção (pH 6,7 a 7,4). A temperatura foi mantida a 36 0 ± 2 °C. O fermentador foi mantido em controlo do pH, e foram periodicamente removidas e testadas amostras para DO e pH, até a fermentação ser completa.

Foi adicionado deoxicolato de sódio ao fermentador para uma concentração final de aproximadamente 0,12% p/v. A cultura foi misturada durante um mínimo de trinta minutos, e o ponto de ajuste da temperatura foi reduzido para 10 °C. A cultura foi incubada durante a noite, e após confirmação da inactivação, o pH da cultura foi ajustado para entre 6,4 e 6,8, como necessário, com ácido acético a 50%. A temperatura do fermentador foi aumentada para 20 ° ± 5 °C, e os conteúdos foram transferidos para o tanque de espera de clarificação. 48

Os conteúdos do tanque de espera de clarificação (incluindo os detritos celulares) foram processados através de uma centrífuga, a uma taxa de fluxo entre 25 e 600 litros por hora (excepto o serotipo 4, em que os detritos celulares foram descartados, e a taxa de fluxo apertada para entre 25 e 250 litros por hora). Foram removidas amostras do sobrenadante e testadas para DO. A DO desejada durante a centrifugação foi ^ 0,15.

Inicialmente, o sobrenadante foi recirculado através de um conjunto de filtros de profundidade até que foi atingida uma DO de 0,05 ± 0,03. Em seguida, o sobrenadante foi passado através do conjunto de filtros de profundidade, e através de um filtro de membrana de 0,45 μιη para o tanque de espera do filtrado.

Subsequentemente, o produto foi transferido através de tubos fechados para a área de purificação, para o processamento.

Todas as operações anteriores (centrifugação, filtração e transferência) foram realizadas entre 10 °C a 30 °C.

Veja-se o processo alternativo descrito no Exemplo 1, para processos alternativos de fermentação e colheita para os serotipos 4 e 6B.

Purificação A purificação de cada polissacarídeo pneumocócico consistiu em várias operações de concentração/diafiltração, precipitação/eluição, cromatografia em coluna, e passos de filtração profunda. Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que especificado em contrário. O caldo clarificado do fermentador das culturas do serotipo desejado de S. pneumoniae foi concentrado e diafiltrado usando um filtro de 100 kDa MWCO. A diafiltração foi atingida utilizando tampão fosfato de sódio a pH < 9,0. A diafiltração removeu os componentes do 49 meio de baixo peso molecular dos biopolímeros de maior peso molecular, tais como ácido nucleico, proteina e polissacarideo. 0 polissacarideo foi precipitado da solução concentrada e diafiltrada por adição de HB a partir de uma solução estoque, para dar uma concentração final de HB a 1% (p/v) (excepto o Serotipo 23F, que tinha uma concentração final de 2,5%). 0 precipitado de polissacarídeo/HB foi capturado num filtro de profundidade, e o filtrado foi descartado. (Nota: 0 serotipo 14 não precipita, por conseguinte, o filtrado foi retido.) 0 polissacarideo precipitado foi resolubilizado e eluido por recirculação de uma solução de cloreto de sódio através do filtro de profundidade contendo o precipitado. Os filtros foram então lavados com solução adicional de cloreto de sódio.

Foi adicionado iodeto de sódio (Nal) à solução de polissacarideo, a partir de uma solução estoque de Nal, para atingir uma concentração final de 0,5% para precipitar HB (excepto para o Serotipo 6B, que tinha uma concentração final de 0,25%). O precipitado foi removido por filtração profunda. O filtrado continha o polissacarideo alvo. O filtro foi descartado. O polissacarideo foi então filtrado através de um filtro de 0,2 μιτι. A solução de polissacarideo foi concentrada num ultrafiltro de 30 kDa MWCO, e diafiltrada com uma solução de cloreto de sódio. A solução de polissacarideo parcialmente purificada foi ainda purificada por filtração através de um filtro de profundidade impregnado com carvão activado. Após filtração, o filtro de carvão foi lavado com uma solução de cloreto de sódio. O liquido da lavagem foi combinado com a solução de polissacarideo, que foi então filtrada através de um filtro de 0,2 μιτι. A solução de polissacarideo foi concentrada num ultrafiltro de 30 kDa MWCO, e o filtro foi lavado com uma 50 solução de cloreto de sódio. O pH foi verificado e ajustado para 7,0 ± 0,3. A coluna de cerâmica de hidroxiapatite (HA) foi equilibrada com tampão fosfato de sódio contendo cloreto de sódio, até o pH ser 7,0 ± 0,3 e a condutividade 26 ± 4 με. A solução de polissacarideo foi então carregada na coluna.

Sob estas condições, as impurezas ligam-se à resina e recupera-se o polissacarideo no fluxo através da coluna. A solução de polissacarideo foi filtrada através de um filtro de 0.2 μιη. A solução de polissacarideo foi concentrada utilizando um filtro de 30 kDa MWCO. O concentrado foi então diafiltrado com API até a condutividade ser < 15 με. A solução de polissacarideo diafiltrada, foi filtrada através de um filtro de membrana de 0,2 μιτι para recipientes de carga, e armazenada a 2 °C-8 °C.

Exemplo 14

Preparação dos Conjugados de Sacarídeo Pneumocócico-CRMig? para os Serotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F

Processo de activação

Os sacarideos de serotipos diferentes seguem diferentes caminhos para activação (hidrólise ou nenhuma hidrólise antes da activação) e conjugação (reacções aquosas ou DMSO), como descrito neste exemplo. O polissacarideo foi transferido dos recipientes de carga para o recipiente do reactor. O polissacarideo foi então diluído em API e fosfato de sódio, para uma gama de concentração final de 1,6-2,4 mg/ml.

Passo 1

Para os serotipos 6B, 9V, 14, 19F e 23F o pH foi ajustado para pH 6,0 ± 0,3.

Para o serotipo 4, foi adicionado ácido clorídrico (concentração final de 0,01 M de ácido), e a solução foi incubada durante 25-35 minutos, a 45 0 ± 2 °C. A hidrólise foi parada por arrefecimento a 21-25 °C, e por adição de 51 fosfato de sódio a 1 M para um alvo de pH 6,7 ± 0,2. Foi feito um teste de processo para confirmar um nivel apropriado de depiruvilação.

Para o serotipo 18C, foi adicionado ácido acético glacial (concentração final de 0,2 M de ácido), e a solução foi incubada durante 205-215 minutos a 94 0 ± 2 °C. A temperatura foi então reduzida para 21-25 °C, e foi adicionado fosfato de sódio a 1-2 M, para um alvo de pH 6,8 ± 0,2.

Passo 2: Reacção de Periodato

Os equivalentes molares de periodato de sódio necessários para a activação do sacarideo pneumocócico foram determinados utilizando o conteúdo total de sacarideo (excepto para o serotipo 4) . Para o serotipo 4, foi usada uma razão de 0,8-1,2 moles de periodato de sódio por mole de sacarideo. Com agitação cuidadosa, a reacção de oxidação foi deixada prosseguir entre 16 a 20 horas, a 21-25 °C para todos os serotipos, excepto o 19F para o qual a temperatura foi < 15 °C.

Passo 3: Ultra filtração O sacarideo oxidado foi concentrado e diafiltrado com AP I (0,01 M de tampão fosfato de sódio pH 6,0 para o serotipo 19F) num ultrafiltro de 100 kDa MWCO (ultrafiltro de 5 kDa para 18C). O permeado foi descartado, e o retentato foi filtrado através de um filtro de 0,22 μιη. Passo 4: Liofilização

Para os serotipos 4, 9V e 14 o sacarideo concentrado foi misturado com a proteína transportadora CRM197, enchido para garrafas de vidro, congelado em escudo e armazenado a ^ -65A °C. O concentrado congelado de sacarídeo-CRM197 foi liofilizado, e em seguida armazenado a 25 0 ± 5 °C.

Para os serotipos 6B, 19F e 23F, foi adicionada uma quantidade especificada de sacarose, a qual foi calculada para atingir uma concentração de sacarose de 5% ± 3% na mistura conjugada de reacção. O serotipo 18C não exigiu a 52 adição de sacarose. 0 sacarídeo concentrado foi então enchido para garrafas de vidro, congelado em escudo e armazenado a ^ -65A 0 C. 0 sacarideo concentrado congelado foi liofilizado, e em seguida armazenado a -25 0 ± 5 °C. Processo de Conjugação

Foram usados dois processos de conjugação: conjugação aquosa para os serotipos 4, 9V, 14 e 18C, e conjugação DMSO para os serotipos 6B, 19F e 23F.

Conjugação Aquosa Passo 1: Dissolução

Para os serotipos 4, 9V e 14, a mistura de sacarídeo -CRM197 liofilizada e activada foi descongelada e equilibrada à temperatura ambiente. 0 sacarídeo-CRM197 liofilizado e activado foi então reconstituído em tampão fosfato de sódio 0,1 M a uma razão típica de: • 1 L de tampão por 16 - 24 g de sacarídeo para os

serotipos 4 e 9V • 1 L de tampão por 6 - 10 g de sacarídeo para o serotipo 14 A mistura de reacção foi incubada a 37 ° ± 2 °C até à dissolução total para o serotipo 9V, e a 23 0 ± 2 °C para os serotipos 4 e 14.

Para o serotipo 18C, o sacarideo liofilizado foi reconstituído numa solução de CRM197 em fosfato de sódio dibásico 1M, a uma razão típica de 0,11 L de fosfato de sódio por 1 L de solução CRMi97. A mistura de reacção (8-12 g/L de concentração de sacarídeo) foi incubada a 23 0 ± 2 °C até à dissolução total.

Nesta fase, o pH foi testado como um controlo de processo.

Passo 2: Reacção de Conjugação

Para os serotipos 4 e 9V, a reacção de conjugação foi iniciada pela adição da solução de cianoborohidreto de sódio (100 mg/ml), para atingir 1,0-1,4 moles de 53 cianoborohidreto de sódio por mole de sacarídeo. A mistura de reacção foi incubada durante 44-52 horas a 37 0 ± 2 °C. A temperatura foi então reduzida para 23 0 ± 2 °C, e foi adicionado ao reactor cloreto de sódio a 0,9%. Foi adicionada uma solução de borohidreto de sódio (100 mg/ml) para atingir 1,8-2,2 equivalentes molares de borohidreto de sódio por mole de sacarídeo. A mistura foi incubada durante 3-6 horas a 23 0 ±2 °C. A mistura foi diluída com cloreto de sódio a 0,9%, e o reactor foi lavado. A mistura de conjugação diluída foi filtrada usando um pré-filtro de 1,2 μιη para um recipiente de espera.

Para os serotipos 14 e 18C, a reacção de conjugação foi iniciada pela adição da solução de cianoborohidreto (100 mg/ml), para atingir 1,0-1,4 moles de cianoborohidreto de sódio por mole de sacarídeo. A mistura de reacção foi incubada durante 12-24 horas a 23 0 ±2 °C. A temperatura foi aumentada para 37 0 ± 2 °C, e a reacção foi incubada durante 72 - 96 horas. A temperatura foi então reduzida para 23 0 ± 2 °C e foi adicionado ao reactor cloreto de sódio a 0,9%. Foi adicionada uma solução de borohidreto de sódio (100 mg/ml) para atingir 1,8-2,2 equivalentes molares de borohidreto de sódio por mole de sacarídeo. A mistura foi incubada durante 3-6 horas a 23 0 ±2 °C. A mistura foi diluída com cloreto de sódio a 0, 9%, e o reactor foi lavado. A mistura de conjugação diluída foi então filtrada usando um pré-filtro de 1,2 μιη para um recipiente de espera.

Passo 3: Ultra filtração a 100 kDa A mistura de conjugação diluída foi concentrada e diafiltrada num ultrafiltro de 100 kDa MWCO, quer com um mínimo de 15 volumes (serotipo 4) ou 40 volumes (serotipos 9V, 14 e 18C) de cloreto de sódio a 0,9%. O permeado foi descartado.

Para o serotipo 4, o retentato foi filtrado através de um filtro de 0,45 μιη. 54

Neste passo foi realizado um controlo de processo (teor de sacarídeo).

Passo 4: Purificação em Coluna de HA

Este passo foi apenas realizado para o conjugado do serotipo 4. A coluna de HA foi primeiro neutralizada usando tampão fosfato de sódio 0,5 M (pH 7,0 ± 0,3), e em seguida equilibrada com cloreto de sódio a 0,9%. O retentato filtrado (serotipo 4) foi carregado na coluna a uma taxa de fluxo de 1,0 Umin. A coluna foi lavada com cloreto de sódio a 0,9% a uma taxa de fluxo <2,0 Umin. O produto foi então eluido com tampão fosfato de sódio 0,5 M a uma taxa de fluxo < 2,0 Umin. A fracção HA foi então concentrada e diafiltrada numa membrana de 100 kDa MWCO, com um mínimo de 2 0 volumes de cloreto de sódio a 0,9%. O permeado foi descartado.

Passo 5: Filtração Estéril 0 retentato após a diafiltração a 100 kDa MWCO foi filtrado através de um filtro de 0,22 μιη. Foram realizados controlos de processo (teor de sacarídeo, proteína livre, sacarídeo livre e cianeto) sobre o produto filtrado. Foram realizados controlos de processo no retentato filtrado para determinar se era necessário concentração, diafiltração e/ou diluição adicionais para cumprir os objectivos CFC. Estes, e testes adicionais foram repetidos em amostras CFC.

Como necessário, o conjugado filtrado foi diluído com cloreto de sódio a 0,9%, a fim de obter uma concentração final inferior a 0,55 g/L. Foram realizados nesta fase testes de libertação para o conteúdo de sacarídeo, conteúdo de proteína e razão sacarídeo:proteína.

Finalmente, o conjugado foi filtrado (0,22 μιη) e enchido em recipientes de aço inoxidável de 10 L a uma quantidade típica de 2,64 g/recipiente. Nesta fase, foram realizados como controlos de processo, rendimento, conteúdo de sacarídeo, conteúdo de proteína, pH, razão 55 sacarídeo:proteína e conteúdo de lisina. Foram realizados nesta fase, testes de libertação (aparência, proteína livre, sacarídeo livre, endotoxina, determinação de tamanho molecular, cianeto residual, identidade de sacarídeo, identidade de CRMi97) .

Conjugação de DMSO Passo I: Dissolução

Os sacarídeos liofilizados e activados dos serotipos 6B, 19F, 23F e a proteína transportadora liofilizada CRMi97 foram equilibrados à temperatura ambiente e reconstituídos em DMSO. A concentração de dissolução tipicamente variou de 2-3 gramas de sacarídeo (2-2,5 g de proteína) por litro de DMSO.

Passo II: Reacção de Conjugação 0 sacarídeo activado e a proteína transportadora CRM197 foram misturados durante 60-75 minutos a 23 ° ± 2 °C, a uma gama de razão de 0,6 g-1,0 g sacarídeo/g CRM197 para os serotipos 6B e 19F ou 1,2 a 1,8 g de sacarídeo/g CRMi97 para o serotipo 23F. A reacção de conjugação foi iniciada pela adição da solução de cianoborohidreto de sódio (100 mg/ml), numa razão de 0,8-1,2 equivalentes molares de cianoborohidreto de sódio para uma mole de sacarídeo activado. Foi adicionada API à mistura de reacção para um alvo de 1% (v/v), e a mistura foi incubada durante mais de 40 horas a 23 0 ± 2 °C.

Foram adicionados à reacção solução borohidreto de sódio, 100 mg/ml (tipicamente 1,8-2,2 equivalentes molares de borohidreto de sódio por mole de sacarídeo activado) e API (alvo 5% v/v) , e a mistura foi incubada durante 3-6 horas a 23 ° ±2 °C. Este procedimento reduziu quaisquer aldeídos que não reagiram presentes nos sacarídeos. Em seguida a mistura de reacção foi transferida para um tanque de diluição contendo cloreto de sódio a 0,9% a < 15 °C. Passo III: Ultra filtração a 100 kDa 56 A mistura diluída de conjugado foi filtrada através de um filtro de 1,2 μιη, e concentrada e diafiltrada numa membrana de 100 kDa MWCO, com um mínimo de 15 volumes de cloreto de sódio 0,9% (foi utilizado tampão fosfato de sódio 0,01 M/NaCl 0,05 M para o serotipo 23F) . 0 permeado foi descartado. 0 retentato foi filtrado através de um filtro de 0,45 μιη. Foi tomada nesta fase uma amostra em processo do conteúdo de sacarídeo.

Passo IV: Purificação em Coluna DEAE

Este passo só foi realizado para o serotipo 23F. A coluna de DEAE foi equilibrada com tampão fosfato de sódio 0,01 M/cloreto de sódio 0,05 Μ. O retentato filtrado (serotipo 23F), foi carregado na coluna e lavado com tampão fosfato de sódio 0,01 M/cloreto de sódio 0,05 Μ. A coluna foi então lavada com tampão fosfato de sódio 0,01 M/NaCl 0.9%. O produto foi então eluído com tampão fosfato de sódio 0,01 M/cloreto de sódio 0,5 M.

Passo V: Ultra filtração a 100 kDa O retentato do 6B e 19F foi concentrado e diafiltrado com pelo menos 30 volumes de cloreto de sódio a 0,9%. O permeado foi descartado. O eluato do serotipo 23F foi concentrado e diafiltrado com um mínimo de 20 volumes de cloreto de sódio a 0,9%. O permeado foi descartado.

Passo VI: Filtração Estéril

Após a diafiltração a 100 kDa MWCO o retentato foi filtrado através de um filtro de 0,22 μιη. Foram realizados controlos de processo (conteúdo de sacarídeo, proteína livre, sacarídeo livre, DMSO residual e cianeto residual) no produto filtrado. Foram realizados controlos de processo no retentato filtrado para determinar se eram necessárias concentração, diafiltração e/ou diluição adicionais para cumprir os objectivos CFC. Estes, e testes adicionais foram repetidos em amostras CFC. 57

Como necessário, o conjugado filtrado foi diluído com cloreto de sódio a 0,9%, para obter uma concentração final inferior a 0,55 g/L. Foram realizados nesta fase testes de libertação para o conteúdo de sacarídeo, conteúdo de proteína e razão de sacarídeo:proteína.

Finalmente, o conjugado foi filtrado (0,22 μιη) e enchido em recipientes de aço inoxidável de 10 L a uma quantidade de 2,64 g/recipiente. Nesta fase, foram realizados como controlos de processo, rendimento, conteúdo de sacarídeo, conteúdo de proteína, pH, razão sacarídeo:proteína e conteúdo de lisina. Foram realizados nesta fase, testes de libertação (aparência, proteína livre, sacarídeo livre, endotoxina, determinação de tamanho molecular, cianeto residual, DMSO residual, identidade de sacarídeo, identidade de CRM197) .

Exemplo 15

Formulação de uma Vacina Conjugada Pneumocócica Multivalente

Os concentrados do agregado final dos 13 conjugados contêm 0,85% de cloreto de sódio. Os concentrados do agregado do tipo 3, 6A, 7F e 19A também contêm tampão de sucinato de sódio 5 mM, a pH 5,8. Os volumes necessários de concentrados de agregado foram calculados com base no volume do lote, e das concentrações de agregados de sacarídeos. Depois de adicionados 80% do cloreto de sódio a 0,85% (soro fisiológico) e a quantidade necessária de tampão de sucinato, ao recipiente de formulação pré-rotulado, foram adicionados concentrados de agregado. A preparação foi então esterilmente filtrada através de uma membrana de 0,22 μιη para um segundo recipiente usando uma unidade de filtros de membrana Millipore Durapore. O primeiro recipiente foi lavado com os restantes 20% de cloreto de sódio a 0,85%, e a solução foi passada através do mesmo filtro e recolhida no segundo recipiente. O agregado formulado foi misturado suavemente durante e após 58 a adição de fosfato de alumínio agregado. 0 pH foi verificado e ajustado se necessário. 0 produto agregado formulado foi armazenado a 2-8 °C. 0 produto agregado formulado foi enchido para seringas de vidro de borosilicato Tipo 1 obtidas de Becton Dickinson. A vacina foi monitorizada a intervalos regulares para turvação, para garantir a uniformidade da operação de enchimento. A vacina cheia (Produto Final) foi armazenada a 2-8 °C.

Exemplo 16

Imunogenicidade da Vacina Conjugada 13 - Valente

Até à data, os estudos pré-clínicos realizados na vacina 13vPnC têm sido em coelhos. Os estudos # HT01-0021 e # HT01-0036 foram concebidos para examinar de forma independente o efeito da conjugação guímica de polissacarídeos capsulares (PSs) de S. pneumoniae a CRM197, e o efeito do adjuvante de fosfato de alumínio (A1P04) na resposta imunitária à vacina 13vPnC em coelhos. Estes efeitos foram caracterizados por antigénio específico de ELISA para as concentrações séricas de IgG, e ensaio opsonofagocítico (OPA) para a função de anticorpos.

Estudo # HT01-0021 0 estudo # HT01-0021 examinou a capacidade da vacina 13vPnC com o adjuvante A1P04 de originar respostas imunitárias serotipo - específicas de vacina. Os serotipos pneumocócicos representados na vacina 13vPnC incluem os tipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F.

Os objectivos secundários incluíram a avaliação da cinética e duração da resposta dos anticorpos. Coelhos brancos da Nova Zelândia foram imunizados por via intramuscular na semana 0 e na semana 2, com a dose humana clínica planeada de cada polissacarídeo (2 μρ de cada PS, excepto 4 \iq de 6B) formulado com ou sem A1P04 (100 μρ/άοεε) . Os soros foram recolhidos em vários pontos temporais. Foi medido por 59 ELISA o serotipo IgG específico, e avaliado por OPA a actividade funcional. 0 Quadro 4 mostra o título médio geométrico (TMG) obtido em conjuntos de amostras de soro, na sequência de duas doses da vacina 137vPnC. Uma razão dos TMGs de IgG foi utilizada para comparar as respostas da semana 4 à semana 0. Estes dados demonstram que a inclusão de A1P04 na formulação de 137vPnC originou níveis mais elevados de anticorpo IgG, em comparação com a mesma vacina sem adjuvante. Embora as respostas dos anticorpos tenham sido maiores quando foi incluído A1P04 na formulação, estes aumentos não foram estatisticamente significativos.

As respostas de anticorpos funcionais foram também avaliadas em coelhos após a imunização com as duas formulações de 13vPnC (Quadro 5) . Ao comparar as formulações de vacinas com ou sem adjuvante, foram observados TMGs OPA superiores no grupo de tratamento vacina 13vPnC + A1P04. Foram detectados títulos OPA nos conjuntos de soro da semana 4 para todos os serotipos da vacina em ambos os grupos. Para a maioria dos serotipos, os títulos OPA medidos na semana 4 eram pelo menos 4 vezes mais elevados do que aqueles na semana 0 (início).

Foram avaliadas as respostas cinéticas para cada um dos serotipos da vacina 13vPnC a partir dos conjuntos de soro de ambos os grupos de tratamento. Foram medidos os títulos de IgG para cada serotipo a partir de sangue retirado na semana 0 e nas semanas 1, 2, 3, 4, 8, 12, 26 e 39 e depois comparados. Com a excepção do serotipo 1, as respostas de anticorpos em animais que receberam a vacina com adjuvante foram superiores aos que receberam vacina sem adjuvante, e atingiu um máximo na semana 2 do esquema de vacinação (dados não mostrados).

No geral, os dados indicam que a vacina 13vPnC formulada com fosfato de alumínio é imunogénica em coelhos, originando respostas de anticorpos significativas aos 60 polissacarídeos capsulares pneumocócicos contidos na vacina, e estas respostas estão associadas com actividade funcional. As respostas observadas para os sete principais serotipos após a imunização com 13vPnC + AIPO4, são consistentes com as respostas históricas de coelhos para a formulação heptavalente. Os TMGs de conjuntos de soros consistiam de volumes iguais de soro de cada coelho individual dentro de um grupo b. Estatisticamente diferentes (p = 0 022) do grupo de tratamento sem ALPO4 Quadro 4. Respostas Imunitárias IgG de Coelhos (TMGs) Após Imunização com Duas Doses do Glicoconjugado Pneumocócico 13 - valente

Diluído com ALP04a 13vPnCa 13vPnC + ALPQ4a Serotip Seman Seman Razã Seman Semana Razã Seman Semana Razã O a 0 a 4 0 Sem 4: Se m 0 a 0 4 (95% IC) 0 Sem 4: Se m 0 a 0 4 (95% IC) 0 Sem 4 : Se m 0 1 < 100 < 100 1, 0 50 5.926 (2.758 12.733) 119 50 11.091 (5.327 23.093) 222 3 < 100 < 100 1,0 50 6.647 (2.773 15.932) 133 58 16.443 (7.096 38.106) 284 4 < 100 < 100 1, 0 50 13.554 (8.031 22.875) 271 50 29.183 (15.342 55.508) 584 5 134 < 100 0,4 50 5.859 (2.450 14.009) 117 50 16.714 (6.959 40.140) 334 6A 141 < 100 0,4 74 22.415 303 83 63.734 768 61

Diluído com ALP04a 13vPnCa 13vPnC + ALP04a Serot ip o Seman a 0 Seman a 4 Razã o Sem 4 : Se m 0 Seman a 0 Semana 4 (95% IC) Razã o Sem 4 : Se m 0 Seman a 0 Semana 4 (95% IC) Razã o Sem 4 : Se m 0 (11.987 (21.141 41.914) 192.146 ) 6B < 100 < 100 1, 0 57 8.108 (3.564 142 54 23.505 (11.286 435 18.444) 48.955) 7F 3.859 579 0,2 171 43.591 (26.931 444 143 84.888 (46.445 496 70.557) 155.151 ) 9V 289 995 3, 4 205 15.780 (7.193 125 208 43,331b (23.256 217 34.616) 71.510) 14 437 177 0, 4 61 6.906 (3.416 113 70 16.076 (9.649 322 13.962) 26.785) 18C < 100 < 100 1, 0 50 21.283 (15.770 426 50 35.040 (24.708 701 28.725) 49.692) 19A < 100 < 100 1, 0 121 113.599 (54.518 236.707 939 144 280.976 (119.58 7 - 660.167 1, 95 1 62 Diluído com ALP04a 13vPnCa 13vPnC + ALP04a Serot ip Seman Seman Razã Seman Semana Razã Seman Semana Razã O a 0 a 4 O a 0 4 (95% O a 0 4 (95% O Sem IC) Sem IC) Sem 4: Se 4: Se 4: Se m 0 m 0 m 0 ) ) 19F < 100 < 100 1,0 50 14.365 287 50 24.912 498 (7.346 (9.243 28.090) 67.141) 23F < 100 < 100 1,0 50 5.323 106 50 15.041 301 (1.894 (4.711 14.962) 48.018) a. TMGs do conjunto de soros consistia em volume igual de soro de cada coelho individual dentro de um grupo b. Estatisticamente diferente ( o=0 022) do grupo de tratamento sem ALPO 4

Quadro 5. TMGs OPA de S. Pneumoniae para Conjuntos de Soros de Coelhos NZW Após Imunização com Duas Doses de __Glicoconjugado Pneumocócico 13 - valente_ 13vPnCa 13vPnC + ALP04a Serotipo Semana 0 Semana 4 Razao Sem 4:Sem 0 Semana 0 Semana 4 Razão Sem 4:Sem 0 1 < 8 64 16 < 8 64 16 3 < 8 8 2 < 8 16 4 4 < 8 16 4 < 8 32 8 5 < 8 128 32 < 8 512 128 6A 8 128 16 8 512 6 4 63 13vPnCa 13vPnC + ALP04a Serotipo Semana 0 Semana 4 Razão Sem 4:Sem 0 Semana 0 Semana 4 Razão Sem 4:Sem 0 6B < 8 256 64 8 1.024 128 7F 8 64 8 8 128 16 9V 8 64 8 8 128 16 14 16 32 2 16 32 2 18C 8 256 32 < 8 256 6 4 19A < 8 256 64 < 8 1.024 256 19F < 8 128 32 < 8 512 128 23F 8 64 8 < 8 256 64 A. Conjuntos consistindo em volume igual de soro de coelhos individuais dentro do grupo de tratamento (n = 12)_

Estudo # HT01-0036 0 estudo # HT01-0036 comparou respostas imunitárias de coelho aos polissacarídeos (PSs) contidos na vacina, após imunização com a vacina 13vPnC com ou sem a conjugação com a proteína CRM197. Coelhos brancos da Nova Zelândia foram imunizados por via intramuscular na semana 0 e na semana 2, com uma dose de 2,2 μρ de cada PS (excepto 4,4 μρ de 6B) . Os animais receberam uma das três preparações de vacina: (a) 13vPnC (PS directamente conjugado com CRMi97) , (b) 13vPnPS (PS livre) ou (c) 13vPnPS + CRM197 (PS livre misturado com CRMi97) . Todas as preparações de vacina continham como adjuvante A1P04 a 125 μρ/dose.

Foram avaliadas as respostas imunitárias serotipo -especificas para todas as preparações de vacinas numa ELISA de IgG e OPA mediada por complemento medindo anticorpo funcional. As respostas imunitárias foram comparadas entre os grupos de tratamento. 0 Quadro 6 apresenta os dados TMG obtidos dos sangramentos da semana 4 analisados em ELISAs de antigénios específicos de IgG. Análises adicionais mostram a razão dos valores TMG na semana 4 para a semana 0. Os dados indicam que a preparação da vacina conjugada origina maiores títulos séricos de IgG do que a vacina PS livre ou PS livre + CRM197. Com a excepção do tipo 14 de S. pneumoniae, a vacina 13vPnC foi capaz de induzir anticorpos funcionais para as estirpes representativas de S. pneumoniae numa OPA (Quadro 7). Após duas imunizações quer com a vacina 13vPnPS ou 13vPnPS + CRM197, nenhuma podia induzir títulos OPA > 8 vezes na semana 4 em relação à semana 0, para 10 dos 13 serotipos medidos (Quadro 7).

Em conclusão, estes resultados indicam que a conjugação dos polissacarídeos da vacina pneumocócica 13-valente produz títulos mais altos de soro de IgG, e maior actividade de anticorpo funcional no geral do que observados com polissacarídeo livre sozinho ou misturado com CRM197 não conjugada. 65

Quadro 6. Respostas IgG de Coelho (TMGs) a PnPS por ELISA Após Imunização com Duas Doses de Glicoconjugado Pneumocócico 13 - valente 13vPnPS (PS livre) 13vPnPS = CRM197 (PS misturado com CRM197) 13vPnC Serot ip Seman Seman Razã Seman Seman Razã Seman Semana Razão O a 0 a 4 O a 0 a 4 O a 0 4 Sem (95% Sem (95% Sem (95% 4 : Sem IC) 4 : Se IC) 4 : Se IC) 0 m 0 m 0 1 378 2.290 5, 8 395 1.959 5, 0 472 35.970 76,2 (843 (809 (29.130 5.790 ) 4.739 ) 44.417) 3 57 240 4,2 89 163 1, 8 50 10.414 208,3 (64 - (74 - (10.414 908) 358) - 16.676) 4 50 379 7, 6 50 607 12,1 50 12.890 257,8 (150 (313 (9.117 959) 1.178 ) 18.224) 5 343 226 4, 5 50 321 6, 4 50 35.264 705, 3 (113 (147 (24.467 450) 701) 50.824) 6A 154 466 3, 0 98 210 2, 1 163 234.245 1.437, (316 (95 - (167.15 1 - 464) 2 - 688) 328.283 ) 66 13vPnPS (PS livre) 13vPnPS = CRM197 (PS misturado com CRM197) 13vPnC Serot ip Seman Seman Razã Seman Seman Razã Seman Semana Razão O a 0 a 4 O a 0 a 4 O a 0 4 Sem (95% Sem (95% Sem (95% 4 : Sem IC) 4 : Se IC) 4 : Se IC) 0 m 0 m 0 6B 63 727 11, 6 62 745 12,0 131 33.599 256, 5 (384 (384 (22.934 1.375 ) 1.440 ) 49.222) 7F 50 61 1,2 50 72 1, 4 50 35.702 714, 0 (39 - (47 - (24.350 95) 111) - 52.347) 9V 50 104 2, 1 55 169 3, 0 50 50.033 1.000, (48 - (74 - (34.765 7 195) 390) - 72.007) 14 66 298 4, 5 50 195 3, 9 50 20.121 402,4 (117 (71 - (12.087 - 535) - 757) 32.138) 18C 89 1.555 17,5 66 761 11,5 101 71.451 707, 4 (655 (300 (32.745 3.688 ) 1 . 935 ) 124.641 ) 19A 50 89 1, 8 50 80 1, 6 50 23.485 469,7 (44 - (39 - (12.857 179) 163) - 42.723) 67 13vPnPS (PS livre) 13vPnPS = CRMiçjv (PS misturado com CRMlq7) 13vPnC Serot ip Seman Seman Razã Seman Seman Razã Seman Semana Razão O a 0 a 4 O a 0 a 4 O a 0 4 Sem (95% Sem (95% Sem (95% 4 : Sem IC) 4 : Se IC) 4 : Se IC) 0 m 0 m 0 19F 61 1.362 22,3 61 991 16, 3 67 19.358 288.9 (559 (370 (12.553 3.317 ) 2.654 ) 33.173) 23F 73 1.085 14, 9 121 638 5,3 68 45.972 676, 1 (487 (311 (25.134 2.420 ) 1.311 ) 84.089)

Quadro 7. Títulos OPA de S. Pneumoniae para Conjuntos de Soros de Coelho Após Imunização com Duas Doses de Vacinas

Pneumocócias 13-valente Títulos OPA Sem 13vPnPS (PS 13vPnPS + 13vPnC tratamento livre) CRMi97 (PS livre misturado com CRMi97) Serotipo Semana 0a Semana Razão Semana Razão Semana Razão 4 Sem 4 Sem 4 Sem 4: Sem 4: Sem 4 : Sem 0 0 0 1 4 16 4 16 4 8 32 3 4 4 1 4 1 4 8 4 4 4 1 4 1 4 64 5 4 32 8 16 4 16 64 68 Títulos OPA Sem 13vPnPS (PS 13vPnPS + 13vPnC tratamento livre) CRMi 97 (PS livre misturado com CRMi97) Serotipo Semana 0a Semana Razão Semana Razão Semana Razão 4 Sem 4 Sem 4 Sem 4: Sem 4: Sem 4: Sem 0 0 0 6A 8 64 8 32 4 32 664 6B 8 64 8 32 4 32 32 7F 16 32 2 16 1 16 16 9V 16 16 1 32 2 32 8 14 16 16 1 16 1 16 2 18C 4 16 4 16 4 8 64 19A 8 8 1 8 1 16 64 19F 4 4 1 4 1 8 64 23F 16 32 2 16 1 32 32 a: Usado como valores da semana 0 para todos os grupos

Exemplo 17

Processo Alternativo para a Conjugação de Sacarídeo Pneumocócico Serotipo 3 - CRMi97

Foram descongelados recipientes de polissacarídeo purificado e combinados num recipiente de reacção, e aquecidos a uma temperatura de 85 °C. Quando a temperatura da mistura atingiu aproximadamente 35 °C durante a rampa de subida de temperatura, foi adicionado ácido acético 2M, para atingir uma concentração de 0,1 M de ácido acético. Quando a temperatura da mistura atingiu 85 °C, foi mantida a esta temperatura durante 1 hora para atingir hidrólise/despolimerização. O polissacarídeo hidrolisado/despolimerizado foi arrefecido a 23 °C, e foi

adicionado MgCl2 1M para atingir uma concentração de 0,1 M 69 de MgCl2. A oxidação foi realizada utilizando 1-1,25 equivalentes molares de ácido periódico, adicionado como uma solução de 50 mg/ml em API. A mistura foi incubada a 23 °C durante 16-24 horas. A mistura de reacção foi purificada por diafiltração contra volumes lOx de API utilizando uma membrana de polietersulfona (PES) de 100K MWCO. O polissacarideo activado purificado foi ajustado para um pH de 6, 0 usando tampão fosfato 0,2 M (pH 7,0), combinado com CRMi97 a uma razão de polissacarideo/proteína de 2:1, congelado em escudo a -75 °C, e co-liofilizado por 71 horas. Após a co-liofilização, a mistura de polissacarideo/CRM197 foi armazenada a 25 0 ± 5 °C até conjugação. Para a conjugação, a mistura de polissacarídeo/CRM197 co-liofilizada foi dissolvida em tampão fosfato 0,1 M a uma concentração de 20 mg/ml de polissacarideo, e o pH foi ajustado para 6,2 com uma combinação de tampão fosfato a 0,2 M, pH 4,6, e NaOH 1 M, seguido pela adição de 0,5 equivalentes molares de cianoborohidreto de sódio como uma solução de 100 mg/ml em tampão fosfato 0,15 M, pH 7,5. A mistura de reacção foi agitada e incubada a 37 °C durante 44 horas. Após a incubação em cianoborohidreto, a mistura de reacção foi diluida lx com 0,9% de solução salina fria (2-8 °C), seguido pela adição de 1 equivalente molar de borohidreto de sódio como uma solução de 100 mg/ml em API, para capear aldeídos não reagidos a 23 °C durante 3-6 horas. A mistura de reacção foi transferida através de um pré-filtro de 0,45 - 5 μιη para um recipiente de retentato, e em seguida purificada por diafiltração utilizando uma membrana de celulose regenerada de 100 K MWCO. A mistura de reacção foi então diafiltrada 30x contra tampão fosfato 0,1 M, pH 9,0, e 20x contra tampão fosfato 0,15 M, pH 6,0. Uma diafiltração 20x final foi realizada contra sucinato a 5 mM/solução salina a 0,9%, pH 6,0. O conjugado diafiltrado foi filtrado através de um filtro de 0,2 μιη, e ensaiado 70 para conteúdo de sacarídeo. Com base na análise de sacarídeo, a solução de conjugado foi diluída com sucinato a 5 mM/solução salina a 0.9%, pH 6,0, para um alvo de 0,5 mg/ml e novamente esterilmente filtrada (0,2 |im) para dar o conjugado concentrado do lote final. O conjugado foi armazenado a 2-8 °C.

Veja-se Exemplo 4 para a caracterização do conjugado. Deve ser entendido que a discussão e os exemplos anteriores apresentam apenas uma descrição detalhada de certas realizações.

REFERÊNCIAS 1. Hausdorff WP, Bryant J, Paradiso PR, Siber GR. Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I. Clin Infect Dis 2000; 30:100-21. 2. Hausdorff WP, Bryant J, Kloek C, Paradiso PR, Siber GR.

The contribution of specific pneumococcal serogroups to different disease manifestations: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I. Clin Infect Dis 2000; 30:122-40. 3. Whitney CG, Farley MM, Hadler J, et al. Decline in invasive pneumococcal disease after the introduction of protein-polysaccharide conjugate vaccine. New Engl J Med 2003; 348 (18) :1737-46. 4. Black S, Shinefield H, Hansen J, et al. Postlicensure evaluation of the effectiveness of seven valent pneumococcal conjugate vaccine. Pediatr Infect Dis J 2001; 20;1105-7. 5. Robinson KA, Baughman W, Rothrock G, et al. Epidemiology of invasive Streptococcus pneumoniae infections in the United States, 1995-1998: Opportunities for prevention in the conjugate vaccine era. JAMA 2001; 285:1729-35.

6. Butler J, Breiman R, Lipman H, et al. Serotype distribution of Streptococcus pneumoniae infections among preschool children in the United States, 1978-1994. J 71

Infect Dis 1995; 171:885-9. 7. Whitney CG, Farley MM, Hadler J, et al. Increasing prevalence of multidrug-resistant Streptococcus pneumonia in the United States. N Engl J Med 2000; 343:1917-24. 8. Hofmann J, Cetron MS, Farley MM, et at. The prevalence of drug-resistant Streptococcus pneumoniae in Atlanta. N Engl J Med 1995; 333:481-6. 9. Joloba ML, Windau A, Bajaksouzian S, Appelbaum PC Hausdorff WP, Jacobs MR. Pneumococcal conjugate vaccine serotypes of Streptococcus pneumoniae isolates and the antimicrobial susceptibility of such isolates in children with otitis media. Clin Infect Dis 2001; 33:1489-94. 10. Black S, Shinefield H, Fireman B, et al. Efficacy, safety, and immunogenicity of heptavalent pneumococcal conjugate vaccine in children. Pediatr Infect Dis J 2000; 19:187-95. 11. Rudolph KM, Parkinson AJ, Reasonover AL, Bulkow LR, Parks DJ, Butler JC. Serotype distribution and antimicrobial resistance patterns of invasive isolates of Streptococcus pneumoniae: Alaska, 1991-1998. J Infect Dis 2000; 182:490-6. 12. Sniadack DH, Schwartz B, Lipman H, et al. Potential interventions for the prevention of childhood pneumonia: geographic and temporal differences in serotype and serogroup distribution of sterile site pneumococcal isolates from children: implications for vaccine strategies. Pediatr Infect Dis J 1995; 14:503-10. 13. Fagan RL, Hanna JN, Messer RD, Brookes DL, Murphy DM. The epidemiology of invasive pneumococcal disease in children in Far North Queensland. J. Paediatr Child Health 2001; 37:571-5. 14. Kertesz DA, Di Fabio JL, de Cunto Brandileone MC, et al. Invasive Streptococcus pneumoniae infection in Latin American children: results of the Pan American Health Organization Surveillance Study. Clin Infect Dis 1998; 26: 72 1355-61. 15. Hausdorff W, Siber G, Paradiso P. Geographical differences in invasive pneumococcal disease rates and serotype frequency in young children. Lancet 2001; 357:950-52. 16. Buckingham SC, King MD, Miller ML. Incidence and etiologies of complicated parapneumonic effusions in children, 1996 to 2001. Pediatr Infect Dis J 2003; 22:499-504. 17. Byington C, Spencer L, Johnson T, et al. An epidemiological investigation of a sustained high rate of pediatric parapneumonic empyema: risk factors and microbiological associations. Clin Infect Dis 2002; 34:434-40. 18. Tan T, Mason E, Wald E, et al. Clinicai characteristics with complicated pneumonia caused by Streptococcus pneumoniae. Pediatrics 2002; 110:1-6. 19. Block SL, Hedrick J, Harrison CJ, et ai. Pneumococcal serotypes from acute otitis media in rural Kentucky. Pediatr Infect Dis J 2002; 21:859-65. 20. Hausdorff WP, Yothers G, Dagan R, et al. Multinational study of pneumococcal serotypes causing acute otitis media in children. Pediatr Infect Dis J 2002; 21:1008-16. 21. Robbins JB, Austrian R, Lee CJ, et al. Considerations for formulating the second-generation pneumococcal capsular polysaccharide vaccine with emphasis on the cross-reactive types within groups. J Infect Dis 1983; 148: 1136-59. 22. Nahm MH, Olander JV, Magyarlaki M. Identification of cross-reactive antibodies with low opsonophagocytic activity for Streptococcus pneumoniae. J Infect Dis 1997; 176:698-703. 23. Yu X, Gray B, Chang S, Ward JI, Edwards KM, Nahm MH. Immunity to cross-reactive serotypes induced by pneumococcal conjugate vaccines in infants. J Infect Dis 1999; 180:1569-76. 73 24. Vakevainen M, Eklund C, Eskola J, Kayhty H. Cross-reactivity of antibodies to type 6B and 6A polysaccharides of Streptococcus pneumoniae, evoked by pneumococcal conjugate vaccines, in infants. J Infect Dis 2001; 184: 789-93. 25. Ekstrom N, Kilpi T, Lahdenkari M, Lehtonen H, Ahman H, Kayhty, H. Immune response to cross-reacting pneumococcal serotypes 6A/6B and 19A/19F in the FinOM vaccine trial, Third World of Congress of Pediatric Infectious Diseases, Santiago, Chile, November 19-23, 2003. 26. Penn RL, Lewin EB, Douglas RG, Jr., Schiffman G, Lee CJ, Robbins JB. Antibody responses in adult volunteers to pneumococcal polysaccharide types 19F and 19A administered singly and in combination. Infect Immun 1982; 36:1261-2. 27. Giebink GS, Meier JD, Quartey MK, Liebeler CL, Le CT. Immunogenicity and efficacy of Streptococcus pneumonia polysaccharide-protein conjugate vaccines against homologous and heterologous serotypes in the chinchilla otitis media model. J Infect Dis 1996; 173:119-27. 28. Saeland E, Jakobsen H, Ingolfsdottir G, Sigurdardottir ST, Jonsdottir I. Serum samples from infants vaccinated with a pneumococcal conjugate vaccine, PncT, protect mice against invasive infection caused by Streptococcus pneumoniae serotypes 6A and 6B. J Infect Dis 2001; 183:253- 60. 29. Jakobsen H, Sigurdsson VD, Sigurdardottir S, Schulz D,

Jonsdottir I. Pneumococcal serotype 19F conjugate vaccine induces cross-protective immunity in serotype 19A in a murine pneumococcal pneumonia model. Infect Immun 2003; 71:2956-9. 30. Klugman KP, Madhi SA, Huebner RE, Kohberger R, Mbelle N, Pierce N. A trial of a 9-valent pneumococcal conjugate vaccine in children with and those without HIV infection. N Engl J Med 2003; 349:1341-8. 74 31. 0'Brien KL, Moulton LH, Reid R, et al. Efficacy and safety of seven-valent conjugate pneumococcal vaccine in American Indian children: group randomised trial. Lancet 2003; 362:355-61. 32. Eskola J, Kilpi T, Palmu A, et ai. Efficacy of a pneumococcal conjugate vaccine against acute otitis media. N Engl J Med 2001: 344:403-9. 33. Pilishvili T, Farley M, Vazquez M, Reingold A, Nyquist A, et ai. Effectiveness of heptavalent pneumococcal conjugate vaccine in children. Abst G-1079, ICAAC, Chicago, IL, 2003. 34. Patente US n° 4,673,574. 35. Patente US n° 4,902,506.

Aspectos particulares descritos no presente documento são expostos nos seguintes parágrafos numerados: 1. Um método para preparar um conjugado imunogénico que compreende polissacarideo serotipo 3 de Streptococcus pneumoniae ligado covalentemente a uma proteína transportadora, o método que compreende: (a) a recção do polissacarideo serotipo 3 purificado com um ácido suave que resulta num polissacarideo serotipo 3 hidrolisado; (b) a recção do polissacarideo serotipo 3 hidrolisado com um agente oxidante na presença de catiões bivalentes que resulta num polissacarideo serotipo 3 activado; (c) a mistura do polissacarideo serotipo 3 activado com uma proteína transportadora; (d) a reacção da mistura de polissacarideo serotipo 3 activado e proteína transportadora com um agente de redução que resulta num conjugado de polissacarideo serotipo 3:proteína transportadora; e (e) o capeamento do aldeídos que não reagiram presentes no conjugado de polissacarideo serotipo 3:proteína transportadora que resulta num conjugado imunogénico que 75 compreende Streptococcus pneumoniae polissacarídeo serotipo 3 ligado covalentemente a uma proteína transportadora. 2. 0 método de acordo com o parágrafo 1, que compreende ainda purificar o polissacarídeo serotipo 3 activado antes da mistura com a proteína transportadora. 3. 0 método de acordo com o parágrafo 1, que compreende ainda co-liofilizar a mistura de polissacarídeo serotipo 3 activado e proteína transportadora antes da reacção com o agente de redução. 4. 0 método de acordo com o parágrafo 1, que compreende ainda purificar o conjugado imunogénico. 5. 0 método de acordo com o parágrafo 1, em que o ácido suave é ácido acético. 6. 0 método de acordo com o parágrafo 1, em que o agente oxidante é ácido periódico e os catiões bivalentes são

Mg2+. 7. 0 método de acordo com o parágrafo 1, em que a proteína transportadora é CRM197. 8. 0 método de acordo com o parágrafo 1, em que o agente de redução é cianoborohidreto de sódio. 9. 0 método de acordo com o parágrafo 1, em que o capeamento dos aldeídos não reagidos compreende a reacção do conjugado de polissacarídeo serotipo 3:proteína transportadora com borohidreto de sódio. 10. Um método para preparar um conjugado imunogénico que compreende polissacarídeo serotipo 3 de Streptococcus pneumoniae ligado covalentemente a uma proteína transportadora, o método que compreende: (a) a reacção do polissacarídeo serotipo 3 purificado com ácido acético que resulta num polissacarídeo serotipo 3 hidrolisado; (b) a reacção do polissacarídeo serotipo 3 hidrolisado com ácido periódico na presença de MgC12 que resulta num polissacarídeo serotipo 3 activado; (c) a purificação do polissacarídeo serotipo 3 activado; 76 (d) a mistura do polissacarídeo serotipo 3 activado com uma proteína transportadora; (e) a co-liofilização da mistura de polissacarídeo serotipo 3 activado e proteína transportadora; (f) a reacção do polissacarídeo serotipo 3 activado e da proteína transportadora co-liofolizados com cianoboro-hidreto de sódio que resulta num conjugado de polissacarídeo serotipo 3:proteína transportadora; e (g) o capeamento de aldeídos não reagidos no conjugado de polissacarídeo serotipo 3:proteína transportadora com boro-hidreto de sódio que resulta num conjugado imunogénico que compreende polissacarídeo serotipo 3 de Streptococcus pneumoniae ligado covalentemente a uma proteína transportadora. 11. 0 método de acordo com o parágrafo 10, que compreende ainda purificar o conjugado imunogénico. 12. 0 método de acordo com o parágrafo 10, em que a proteína transportadora é CRM197. 13. Um método para preparar um polissacarídeo serotipo 3 activado de Streptococcus pneumoniae, o método que compreende: (a) a reacção do polissacarídeo serotipo 3 purificado com um ácido suave que resulta num polissacarídeo serotipo 3 hidrolisado; e (b) a reacção do polissacarídeo serotipo 3 hidrolisado com um agente oxidante na presença de catiões bivalentes que resulta num polissacarídeo serotipo 3 activado. 14. 0 método de acordo com o parágrafo 13, que compreende ainda purificar o polissacarídeo serotipo 3 activado após a oxidação. 15. 0 método de acordo com o parágrafo 13, em que o ácido suave é ácido acético. 16. O método de acordo com o parágrafo 13, em que o agente oxidante é ácido periódico e os catiões bivalentes são Mg2+. 77

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente Europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente citados na descrição • WO 2006110381 A [0005] • US 2006228380 A [0005] • US 4673574 A [0038] [0235] • US 4902506 A [0038] [0235] • US 5614382 A [0040] • WO 2004083251 A [0041] [0060] • WO 9014837 A [0044] • US 4912094 A [0044] • US 5057540 A [0044] • US 6113918 A [0044] • US 6207646 B [0044] • WO 0018434 A [0044] • WO 02098368 A [0044] • WO 02098369 A [0044] • WO 9313302 A [0044] • WO 9219265 A [0044] • US 5601831 A [0053] • WO 03078453 A [0053] • US 5110908 A [0053] • WO 0100790 A [0053] • US 37741 A [0053] • US 6245337 B [0053] • US 6676948 B [0053] • US 5643725 A [0053] • US 6221365 B [0053] • US 5552146 A [0054] 78 • US 6310190 B [0054] • US 5725862 A [0054] • US 5948412 A [0054] • US 6899885 B [0054] • WO 03048304 A [0055] • WO 02083855 A [0056] • WO 02053761 A [0056] • WO 03063766 A [0057] • WO 2004094596 A [0057] • WO 0185772 A [0057] • WO 0216612 A [0057] • WO 0187939 A [0057]

Literatura não relacionada com patentes, citada na descrição • NURKKA et al. Ped. Inf. Dis. J., 2004, vol. 23, 1008-1014 [0024] • GATCHALIAN et al. 17th Annual Meeting of the Eur. Soc. Paed: Inf. Dis. (ESPID, 27 March 2001 [0024] • PRYMULA et al. Lancet, 2006, vol. 367, 740-748 [0024] • POZSGAY et al. PNAS, 1999, vol. 96, 5194-97 [0060] • LEE et al. J. Immunol., 1976, vol. 116, 1711-18 [0060] • DINTZIS et al. PNAS, 1976, vol. 73, 3671-75 [0060] • HAUSDORFF WP ; BRYANT J ; PARADISO PR ; SIBER GR. Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I. Clin Infect Dis, 2000, vol. 30, 100-21 [0235] • HAUSDORFF WP ; BRYANT J ; KLOEK C ; PAR-ADISO PR ; SIBER GR. The contribution of specific pneumococcal serogroups to different disease manifestations: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I. Clin Infect Dis, 2000, vol. 30, 122-40 [0235] • WHITNEY CG ; FARLEY MM ; HADLER J et al. Decline in invasive pneumococcal disease after the introduction of 79 protein-polysaccharide conjugate vaccine. New Engl J Med, 2003, vol. 348 (18), 1737-46 [0235] • BLACK S ; SHINEFIELD H ; HANSEN J et al. Postli-censure evaluation of the effectiveness of seven valent pneumococcal conjugate vaccine. Pediatr Infect Dis J, 2001, vol. 20, 1105-7 [0235] • ROBINSON KA ; BAUGHMAN W ; ROTHROCK G et al. Epidemiology of invasive Streptococcus pneu-moniae infections in the United States, 1995-1998:

Opportunities for prevention in the conjugate vaccine era. JAMA, 2001, vol. 285, 1729-35 [0235] • BUTLER J ; BREIMAN R ; LIPMAN H et al. Sero-type distribution of Streptococcus pneumoniae infections among preschool children in the United States, 1978-1994. J Infect Dis, 1995, vol. 171, 885-9 [0235] • WHITNEY CG ; FARLEY MM ; HADLER J et al. Increasing prevalence of multidrug-resistant Streptococcus pneumoniae in the United States. N Engl J Med, 2000, vol. 343, 1917-24 [0235] • HOFMANN J ; CETRON MS ; FARLEY MM. The prevalence of drug-resistant Streptococcus pneumo-niae in Atlanta. N Engl J Med, 1995, vol. 333, 481-6 [0235] • JOLOBA ML ; WINDAU A ; BAJAKSOUZIAN S ; APPELBAUM PC ; HAUSDORFF WP ; JACOBS MR. Pneumococcal conjugate vaccine serotypes of Streptococcus pneumoniae isolates and the antimicrobial susceptibility of such isolates in children with otitis media. Clin Infect Dis, 2001, vol. 33, 1489-94 [0235] • BLACK S ; SHINEFIELD H ; FIREMAN B et al. Efficacy, safety, and immunogenicity of heptavalent pneumococcal conjugate vaccine in children. Pediatr Infect Dis J, 2000, vol. 19, 187-95 [0235] • RUDOLPH KM ; PARKINSON AJ ; REASONOVER AL ; BULKOW LR ; PARKS DJ ; BUTLER JC. Se-rotype distribution and antimicrobial resistance pat-tenrs of invasive isolates 80 of Streptococcus pneumo-niae: Alaska, 1991-1998. J Infect Dis, 2000, vol. 182, 490-6 [0235] • SNIADACK DH ; SCHWARTZ B ; LIPMAN H et al. Potential interventions for the prevention of childhood pneumonia: geographic and temporal differences in serotype and serogroup distribution of sterile site pneumococcal isolates from children: implications for vaccine strategies. Pediatr Infect Dis J, 1995, vol. 14, 503-10 [0235]

• FAGAN RL ; HANNA JN ; MESSER RD ; BROOKES DL ; MURPHY DM. The epidemiology of invasive pneumococcal disease in children in Far North Queensland. J. Paediatr Child Health, 2001, vol. 37, 571-5 [0235] • KERTESZ DA ; Dl FABIO JL ; DE CUNTO BRAN-DILEONE MC et al. Invasive Streptococcus pneu-moniae infection in Latin American children: results of the Pan American Health Organization Surveillance Study. Clin Infect Dis, 1998, vol. 26, 1355-61 [0235] • HAUSDORFF W ; SIBER G ; PARADISO P. Geographical differences in invasive pneumococcal disease rates and serotype frequency in young children. Lancet, 2001, vol. 357, 950-52 [0235] • BUCKINGHAM SC ; KING MD ; MILLER ML. Incidence and etiologies of complicated parapneumonic effusions in children, 1996 to 2001. Pediatr Infect Dis J, 2003, vol. 22, 499-504 [0235] • BYINGTON C ; SPENCER L ; JOHNSON T et al. An epidemiological investigation of a sustained high rate of pediatric parapneumonic empyema: risk factors and microbiological associations. Clin Infect Dis, 2000, vol. 34, 434-40 [0235] • TAN T ; MASON E ; WALD E et al. Clinicai charac-teristics with complicated pneumonia caused by Streptococcus pneumoniae. Pediatrics, 2002, vol. 110, 1-6 [0235] 81 • BLOCK SL ; HEDRICK J ; HARRISON CJ et al. Pneumococcal serotypes from acute otitis media in rural Kentucky. Pediatr Infect Dis J, 2002, vol. 21, 859-65 [0235] • HAUSDORFF WP ; YOTHERS G ; DAGAN R et al. Multinational study of pneumococcal serotypes causing acute otitis media in children. Pediatr Infect Dis J, 2002, vol. 21, 1008-16 [0235] • ROBBINS JB ; AUSTRIAN R ; LEE CJ et al. Considerations for formulating the second-generation pneumococcal capsular polysaccharide vaccine with emphasis on the cross-reactive types within groups. J Infect Dis, 1983, vol. 148, 1136-59 [0235] • NAHM MH ; OLANDER JV ; MAGYARLAKI M. Identification of cross-reactive antibodies with low op-sonophagocytic activity for Streptococcus pneumo-niae. J Infect Dis, 1997, vol. 176, 698-703 [0235] • YU X ; GRAY B ; CHANG S ; WARD JI ; EDWARDS KM ; NAHM MH. Immunity to cross-reactive sero-types induced by pneumococcal conjugate vaccines in infants. J Infect Dis, 1999, vol. 180, 1569-76 [0235] • VAKEVAINEN M ; EKLUND C ; ESKOLA J ; KAY-HTY H. Cross-reactivity of antibodies to type 6B and 6A polysaccharides of Streptococcus pneumoniae, evoked by pneumococcal conjugate vaccines, in infants. J Infect Dis, 2001, vol. 184, 789-93 [0235] • EKSTROM N ; KILPI T ; LAHDENKARI M ; LEHTO-NEN H ; AHMAN Η ; KAYHTY, H. Immune response to cross-reacting pneumococcal serotypes 6A/6B and 19A/19F in the FinOM vaccine trial. Third World of Congress of Pediatric Infectious Diseases, 19 November 2003 [0235] • PENN RL ; LEWIN EB ; DOUGLAS RG, JR. ; SCHIFFMAN G ; LEE CJ ; ROBBINS JB. Antibody responses in adult volunteers to pneumococcal polysaccharide types 19F and 19A administered singly and in combination. Infect Immun, 1982, vol. 36, 1261-2 [0235] 82

• GIEBINK GS ; MEIER JD ; QUARTEY MK ; LIEBE-LER CL ; LE CT. Immunogenicity and efficacy of Streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugate vaccines against homologous and heter-ologous serotypes in the chinchilla otitis media model. J Infect Dis, 1996, vol. 173, 119-27 [0235] • SAELAND E ; JAKOBSEN H ; INGOLFSDOTTIR G ; SIGURDARDOTTIR ST ; JONSDOTTIR I. Serum samples from infants vaccinated with a pneumo-coccal conjugate vaccine, PncT, protect mice against invasive infection caused by Streptococcus pneumo-niae serotypes 6A and 6B. J Infect Dis, 2001, vol. 183, 253-60 [0235] • JAKOBSEN H ; SIGURDSSON VD ; SIGURDAR—DOTTIR S ; SCHULZ D ; JONSDOTTIR I. Pneumo-coccal serotype 19F conjugate vaccine induces cross-protective immunity in serotype 19A in a murine pneumococcal pneumonia model. Infect Immun, 2003, vol. 71, 2956-9 [0235] • KLUGMAN KP ; MADHI SA ; HUEBNER RE ; KO—HBERGER R ; MBELLE N ; PIERCE N. A trial of a 9-valent pneumococcal conjugate vaccine in children with and those without HIV infection. N Engl J Med, 2003, vol. 349, 1341-8 [0235] • 0'BRIEN KL ; MOULTON LH ; REID R et al. Efficacy and safety of seven-valent conjugate pneumo-coccal vaccine in American Indian children: group randomised trial. Lancet, 2003, vol. 362, 355-61 [0235] • ESKOLA J ; KILPI T ; PALMU A et al. Efficacy of a pneumococcal conjugate vaccine against acute otitis media. N Engl J Med, 2001, vol. 344, 403-9 [0235] • PILISHVILI T ; FARLEY M ; VAZQUEZ M ; REIN-GOLD A ; NYQUIST A et al. Effectiveness of hep-tavalent pneumococcal conjugate vaccine in children. Abst G-1079, 2003 [0235]

Claims (10)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um processo para preparar uma composição imunogénica multivalente que compreende 13 conjugados de polissacarídeo-proteína distintos juntamente com um veiculo fisiologicamente aceitável, em que cada um dos conjugados contém um polissacarideo capsular diferente conjugado a uma proteína transportadora, e em que os polissacarídeos capsulares são preparados a partir dos serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F de Streptococcus pneumoniae, em que o dito conjugado de polissacarideo serotipo 3-proteína é feito de acordo com um método que compreende: (a) a reacção do polissacarideo serotipo 3 purificado com um ácido suave que resulta num polissacarideo serotipo 3 hidrolisado; (b) a reacção do polissacarideo serotipo 3 hidrolisado com um agente oxidante na presença de catiões bivalentes que resulta num polissacarideo serotipo 3 activado em que o agente oxidante é ácido periódico e os catiões bivalentes são Mg2+ ou Ca2+; (c) a mistura do polissacarideo serotipo 3 activado com uma proteína transportadora; (d) a reacção da mistura de polissacarideo serotipo 3 activado e proteína transportadora com um agente de redução que resulta num conjugado de polissacarideo serotipo 3:proteína transportadora; e uma (e) o capeamento dos aldeídos que não reagiram presentes no conjugado de polissacarideo serotipo 3:proteína transportadora que resulta num conjugado imunogénico que compreende polissacarideo de serotipo 3 de Streptococcus pneumoniae ligado covalentemente a uma proteína transportadora; 2 e em que após a purificação dos glicocon jugados individuais, estes são misturados para formular a composição imunogénica.

2. 0 processo de acordo com a reivindicação 1, que compreende ainda purificar o polissacarídeo serotipo 3 activado antes de o misturar com a proteína transportadora.

3. 0 processo de acordo com a reivindicação 1, que compreende ainda co-liofilizar a mistura de polissacarídeo serotipo 3 activado e proteína transportadora antes da reacção com o agente de redução.

4. 0 processo de acordo com a reivindicação 1, em que o ácido suave é ácido acético.

5. 0 processo de acordo com a reivindicação 1, em que o agente de redução é cianoborohidreto de sódio.

6. 0 processo de acordo com a reivindicação 1, em que o capeamento de aldeídos que não reagiram compreende a reacção do conjugado de polissacarídeo serotipo 3: proteína transportadora com borohidreto de sódio.

7. Um processo para preparar uma composição imunogénica multivalente que compreende 13 conjugados de polissacarídeo-proteína distintos juntamente com um veículo fisiologicamente aceitável, em que cada um dos conjugados contém um polissacarídeo capsular diferente conjugado a uma proteína transportadora, e em que os polissacarídeos capsulares são preparados a partir dos serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F de Streptococcus pneumoniae, em que o dito conjugado de polissacarídeo serotipo 3- proteína é feito de acordo com um método que compreende: 3 (a) a reacção do polissacarídeo serotipo 3 purificado com ácido acético que resulta num polissacarídeo serotipo 3 hidrolisado; (b) a reacção do polissacarídeo serotipo 3 hidrolisado com ácido periódico na presença de MgCl2 que resulta num polissacarídeo serotipo 3 activado; (c) a purificação do polissacarídeo serotipo 3 activado; (d) a mistura do polissacarídeo serotipo 3 activado com uma proteína transportadora; (e) a co-liofilização da mistura de polissacarídeo serotipo 3 activado e proteína transportadora; (f) a reacção do polissacarídeo serotipo 3 activado e proteína transportadora co-liofilizados com cianoboro-hidreto de sódio que resulta num conjugado de polissacarídeo serotipo 3:proteína transportadora; e (g) o capeamento dos aldeídos que não reagiram presentes no conjugado de polissacarídeo serotipo 3:proteína transportadora com borohidreto de sódio que resulta num conjugado imunogénico que compreende polissacarídeo de serotipo 3 de Streptococcus pneumoniae ligado covalentemente a uma proteína transportadora; e em que após a purificação dos glicocon jugados individuais, estes são misturados para formular a composição imunogénica.

8. 0 processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 em que CRMi97 é usado como a proteína transportadora.

9. 0 processo de acordo com a reivindicação 8 em que a dita composição imunogénica multivalente compreende ainda um adjuvante.

10. 0 processo de acordo com a reivindicação 9, em que o adjuvante é um adjuvante à base de alumínio. 4 11. 0 processo de acordo com a reivindicação 10, em que o adjuvante é selecionado a partir do grupo que consiste em fosfato de aluminio, sulfato de aluminio e hidróxido de alumínio.