CN102462839B - 多糖结合疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种多糖结合疫苗，包含细菌多糖与载体蛋白的化学偶联物，所述载体蛋白为细菌粘膜侵袭相关蛋白，如大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位、空肠弯曲菌鞭毛分泌蛋白A1、空肠弯曲菌鞭毛分泌蛋白A2、肺炎球菌表面蛋白、肺炎球菌表面黏附素。本发明还涉及该多糖结合疫苗的制备方法。本发明所述的多糖结合疫苗可以在不添加其它任何外源性蛋白的前提下，实现多糖结合疫苗的粘膜投递，这种免疫途径将使疫苗的使用更加高效、便捷和安全。

Description

多糖结合疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及疫苗领域，更具体而言，本发明涉及多糖结合疫苗及其制备方法。

背景技术

细菌的荚膜多糖是一种重要的保护性抗原。用化学方法纯化的细菌荚膜多糖组分疫苗来预防传染病，是疫苗发展史上的重要举措之一，其中已在全世界范围内广泛应用的多糖疫苗有流行性脑膜炎球菌的A、C、Y和W135等4价多糖疫苗，以及肺炎双球菌23价多糖疫苗。但多糖疫苗存在很大的局限性，在2岁以下婴幼儿中的免疫原性差，不能诱导有效地免疫保护。用细菌的多糖(PS)与蛋白载体通过化学方法制备的疫苗，称之为结合疫苗(conjugatevaccine)。Goebel和Avery早于1929年就首次成功地用化学方法将肺炎球菌的第3型荚膜多糖共价结合至蛋白载体上去制备成多糖-蛋白结合疫苗。这种具有胸腺依赖性(T-dependent，TD)的蛋白载体可将胸腺非依赖性(T-independent，TI)的多糖抗原转变成胸腺依赖性的抗原，从而启动T辅助淋巴细胞产生一系列的免疫增强效应。

自第一个多糖结合疫苗-b型嗜血流感杆菌结合疫苗(Hib)于1987年经美国食品和药物管理署(FDA)批准投入临床应用以来，各种多糖蛋白结合疫苗的研究发展迅速，已成为当今疫苗研究领域的热点之一。目前的结合疫苗主要有流感嗜血杆菌结合疫苗、肺炎球菌结合疫苗、脑膜炎球菌结合疫苗、痢疾杆菌结合疫苗、伤寒Vi结合疫苗、乙型溶血性链球菌结合疫苗等。

大多数的多糖结合疫苗主要以破伤风类毒素(TT)和白喉内毒素的脱毒突变体(CRM197)作为载体，种类比较单一，会造成多糖抗体应答低下的现象，这是由于结合疫苗中相同的载体蛋白只能与同一辅助性T细胞(Th)竞争性结合，从而使每种多糖抗原最终激活的B细胞数量减少，多糖特异性的抗体水平下降。载体的多样化可以使上述问题得到改善，其原因可能是用不同载体蛋白结合同一种多糖时激活的Th细胞克隆数要多于单一载体蛋白的Th细胞克隆数，可产生更高水平的特异性抗体。同时，结合疫苗可同时产生针对多糖和蛋白载体的免疫应答，为多联疫苗的开发提供了思路。结合疫苗还具有载体蛋白效应，在接种结合疫苗时，载体蛋白能产生类似佐剂的作用。因此，对载体蛋白的研究和开发势在必行。

许多研究者致力于开发粘膜投递型疫苗，这种投递途径与大多数病原体的自然感染途径相同，而且粘膜投递途径简单、安全，避免了注射疫苗所需的严格标准，有利于开展大规模人群的免疫接种。许多研究表明，相对于在自然感染中通过粘膜途径感染的一些病原体而言，通过粘膜途径对机体进行疫苗免疫，机体所产生的免疫保护是最有效的。它既能产生机体粘膜***的局部免疫保护反应，又能产生全身性的免疫反应来预防疾病的发生。因此，开发粘膜投递型疫苗具有一定的科学性和必要性。

有研究表明，以TT为载体蛋白的C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗通过滴鼻免疫小鼠，诱发了较好的粘膜免疫应答。有的研究者将不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)来源的寡糖类物质与TT结合后，滴鼻免疫小鼠，结果产生了较好的体液免疫和细胞免疫应答。因此，TT可以作为粘膜投递型多糖蛋白结合疫苗的蛋白载体。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)为代表的一些病原菌蛋白成分是近年来研究较多的一类粘膜佐剂。研究表明，流感病毒亚单位抗原或白喉类毒素(DT)与LTB形成疫苗，共同鼻内免疫小鼠后，血清中产生了高滴度的特异性IgG抗体，口腔、***分泌物中和肺部表面产生了中等水平的粘膜IgA抗体。

目前研究的C群脑膜炎球菌多糖结合物主要以TT或CRM197为载体，大肠杆菌不耐热肠毒素LT-K63只是作为佐剂来增强结合物的免疫原性。目前尚未见到以此类蛋白为载体蛋白的细菌多糖结合物。因此，目前要研究同时具有保护性抗原和佐剂功能的多糖载体蛋白、进而改善和延伸现有多糖结合疫苗的功能正日益成为热点。以这类蛋白为载体的多糖蛋白结合疫苗具有重要的实际应用意义和广阔的市场前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种多糖结合疫苗。

本发明的目的还在于提供该多糖结合疫苗的制备方法。

为了实现本发明的目的，本发明提供一种多糖结合疫苗，包含细菌多糖与载体蛋白的化学偶联物，其中所述载体蛋白为细菌粘膜侵袭相关蛋白。

优选地，所述载体蛋白选自大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)、空肠弯曲菌鞭毛分泌蛋白A1(FspA1)、空肠弯曲菌鞭毛分泌蛋白A2(FspA2)、肺炎球菌表面蛋白(PspA)和肺炎球菌表面黏附素(PsaA)。

优选地，所述细菌多糖选自脑膜炎球菌多糖、嗜血流感杆菌多糖和肺炎球菌多糖。

优选地，所述细菌多糖为脑膜炎球菌多糖，并且所述载体蛋白为大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位。

本发明的疫苗可以是本发明方法直接制备得到的液体制剂的形式，也可以是将该液体通过浓缩得到的浓缩液形式，或是通过干燥(例如)冷冻干燥后得到的冻干粉剂形式。

优选地，所述多糖结合疫苗为液体制剂，该液体制剂中还包含有未与所述载体蛋白结合的游离细菌多糖，并且在所述液体制剂中，总细菌多糖的含量为30-800μg/ml，载体蛋白的含量为30-900μg/ml，以及总细菌多糖和载体蛋白之间的重量比为0.3-3。

优选地，在本发明所述疫苗中，未与所述载体蛋白结合的游离细菌多糖的含量低于30％。

优选地，所述多糖结合疫苗的液体制剂形式是通过注射或粘膜投递的方式来施用的。

本发明还提供一种多糖结合疫苗的制备方法，该方法包括：

1)提供细菌多糖；

2)提供载体蛋白；

3)使所述细菌多糖和所述载体蛋白化学偶联；

其中，所述载体蛋白为细菌粘膜侵袭相关蛋白。

优选地，所述载体蛋白选自大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)、空肠弯曲菌鞭毛分泌蛋白A1(FspA1)、空肠弯曲菌鞭毛分泌蛋白A2(FspA2)、肺炎球菌表面蛋白(PspA)和肺炎球菌表面黏附素(PsaA)。

优选地，所述细菌多糖选自脑膜炎球菌多糖、嗜血流感杆菌多糖和肺炎球菌多糖。

在本发明中，可利用基因工程方法体外重组表达载体蛋白，包括(例如)：大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)、空肠弯曲菌鞭毛分泌蛋白A1(FspA1)、空肠弯曲菌鞭毛分泌蛋白A2(FspA2)、肺炎球菌表面蛋白(PspA)和肺炎球菌表面黏附素(PsaA)，并将载体蛋白与多糖抗原进行化学偶联制备成多糖蛋白偶联物。本发明人发现，这种偶联物可以作为预防多糖和蛋白所对应的病原体的疫苗。由于这些载体蛋白分别是大肠杆菌、空肠弯曲菌和肺炎球菌的保护性抗原成分，它既是一种保护性抗原又是较强的粘膜佐剂，因此，如果将这些蛋白作为多糖结合疫苗的载体蛋白，可以使传统的多糖结合疫苗改型为粘膜投递型疫苗。而且载体多样化可以解决多价多糖结合疫苗中载体单一造成的抗体应答低下现象和载体蛋白的毒性蓄积现象。不仅如此，以这些蛋白为载体的多糖结合疫苗提供了针对产毒性大肠杆菌、空肠弯曲菌以及肺炎球菌的交叉免疫保护反应。

附图说明

图1为重组质粒pET42b+LTB构建示意图(LTB：LTB基因；NdeI：NdeI酶切位点；AvrII：AvrII酶切位点)；

图2为重组质粒pET30a+fspA1构建示意图(fspA1：fspA1基因；NdeI：NdeI酶切位点；SacI：SacI酶切位点)；

图3为重组质粒pET30a+pspA构建示意图(pspA：pspA基因；NdeI：NdeI酶切位点；SacI：SacI酶切位点)。

具体实施方式

以下结合附图通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

本发明所使用的培养基可通过如下方法制备：

LB液体培养基：胰化蛋白胨(bacto-tryptone，OXOID公司)10g，酵母提取物(bacto-yeastextract，OXOID公司)5g，NaCl10g，加蒸馏水溶解，定容至1000ml，高压灭菌(0.12Mpa，115℃，20分钟)后4℃保存备用。

LB液体培养基(Kana+)：胰化蛋白胨(bacto-tryptone，OXOID公司)10g，酵母提取物(bacto-yeastextract，OXOID公司)5g，NaCl10g，加蒸馏水溶解，定容至1000ml，高压灭菌(0.12Mpa，115℃，20分钟)，等到温度降到50℃时，加入卡那霉素(Kana)至终浓度为30ug/ml，4℃保存备用。

LB固体培养基(Kana+)：在100ml上述LB液体培养基中加入1.5g琼脂，高压灭菌(0.12Mpa，115℃，20分钟)，等到温度降到50℃时，加入卡那霉素(Kana)至终浓度为30ug/ml，铺板，4℃保存备用。

实施例1

下面以大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)与C群流行性脑膜炎球菌多糖(GCMP)的结合为例，来对本发明进行详细说明。

(一)、重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(rLTB)的克隆和表达1)LTB基因的合成与表达载体的构建

LTB基因序列选自于GENBANK，序列号为GI：157021177。按照大肠杆菌密码子使用频率表(参考文献：Maloy，S.，V.Stewart，andR.Taylor.1996.Geneticanalysisofpathogenicbacteria.ColdSpringHarborLaboratoryPress，NY.)优化此序列，在序列C末端加上6个组氨酸标签和终止密码子，然后在序列两端分别加上NdeI、AvrII酶切位点。

人工合成上述LTB基因，然后用NdeI、AvrII双酶切LTB和pET42b(购自Novagen)，再将双酶切LTB后的目的片段和pET42b载体连接，构建成重组质粒pET42b+LTB，如图1所示。全基因合成及上述构建工作由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

2)重组载体的酶切鉴定

将步骤1)获得的重组质粒pET42b+LTB转化到大肠杆菌DH5α中，并将转化子接种到LB固体培养基(Kana+)平板上，从中挑取生长状态良好的菌落，接于LB液体培养基(Kana+)中，于37℃摇床、230rpm过夜培养。提取质粒，进行NdeI、AvrII双酶切，经琼脂糖凝胶电泳分析证明，在相应的位置上有LTB目的基因片段和pET42b载体片段，条带大小与预期一致。

3)目的蛋白LTB的表达

将步骤1)获得的重组质粒pET42b+LTB转化至大肠杆菌BL21中，在237rpm、37℃培养箱中培养至OD值为1.0时，加入终浓度为1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，诱导表达2-4小时(参考文献：《分子克隆试验指南》第三版(上、下册)(美)J.萨姆布鲁克，黄培堂，科学出版社，2002)。

经SDS-PAGE检测(参考文献：《分子克隆试验指南》，出处同上)和Westernblot鉴定(参考文献：《分子克隆试验指南》，出处同上)证明，上述大肠杆菌BL21的表达产物为LTB，且可与LTB的单克隆抗体(购自HyTest公司)特异性结合，与预期结果相符。

(二)、rLTB的纯化

将上述诱导表达后的大肠杆菌BL21离心(5000rpm，10分钟)，弃上清，将菌体用20mM、pH7.0的磷酸缓冲液(磷酸二氢钠-磷酸氢二钠)清洗一次，再用上述20mM、pH7.0的磷酸缓冲液重悬，用超声破碎仪破碎。破碎完全后离心(11000rpm，40分钟)，收集上清，用CM-FF阳离子交换柱(购自GEHEALTHY)纯化，收集在洗脱液为0.17mol/LNaCl时的洗脱峰，得到纯化后的本发明目的蛋白rLTB。

(三)、rLTB与GCMP的化学偶联

将上述纯化所得蛋白rLTB在4℃下透析48小时后，过滤除菌，于4℃保存备用。取2.5mlGCMP(天坛生物制品股份有限公司馈赠)(约10mg)，加入等质量的CNBr，搅拌进行反应，并用0.1MNaOH维持pH10.8，在高pH条件下，CNBr与多糖糖链上的羟基反应生成氰酸酯。在上述反应进行10分钟后，加入己二酰肼(ADH)70mg，用0.1MNaOH维持pH8.5，于4℃反应过夜，使ADH与氰酸酯反应形成异脲键，生成GCMP-ADH酰肼类衍生物。然后将反应混合物装入透析袋，于0.2MNaCl中透析48小时，除去未反应的CNBr、ADH或反应中间物。然后用盐酸调节透析物的pH值至5.7，加入上述制得的载体蛋白rLTB，使透析物(多糖)与rLTB的质量相等，再加入终浓度0.1MEDAC(碳二亚胺)，用盐酸维持pH5.7，于2-8℃搅拌透析2天，使载体蛋白的羧基与GCMP-ADH酰肼类衍生物的氨基发生缩合反应，生成GCMP-ADH-载体蛋白，然后收取透析物。

在上述氰酸酯与ADH反应透析48h后，用TNBS比色法检测衍生物中ADH的含量，可以反映多糖平均修饰度，检测结果为0.8-1.5％(重量比)。

(四)、rLTB与GCMP的结合物的纯化

将步骤(三)得到的反应产物于10kD超滤管(Millipore)中超滤浓缩，再用0.45μm滤膜过滤，用Sephorose4FF凝胶柱纯化，使用0.2MNaCl为洗脱剂，收集外水体积处的洗脱峰，得到本发明GCMP-rLTB结合物溶液。对GCMP-rLTB结合物进行定性检测和定量检测，其中根据在分子筛外水体积处280nm波长处有、无吸收峰来对GCMP-rLTB结合物进行定性检测，如有吸收峰则表明载体蛋白与多糖生成了结合物，反之则说明没有多糖蛋白结合物生成。对结合物中多糖和蛋白质含量的检测采用《中华人民共和国药典》第三部(2010年版，国家药典委员会编，中国医药科技出版社)所记载的方法。所述定性检测和定量检测的结果为：在分子筛外水体积处280nm波长处有吸收峰，蛋白含量：246.5μg/ml，总多糖含量：640.1μg/ml，游离多糖含量：15.1μg/ml，多糖/蛋白(重量比)：2.5。

(五)、GCMP-rLTB结合物的免疫效果

1.试验药品：通过上述方法制备的GCMP-rLTB结合物，以及GCMP-TT(北京生物制品研究所细菌研究室馈赠)、GAMP-TT+GCMP-TT(北京生物制品研究所细菌研究室馈赠)、GCMP(天坛生物制品股份有限公司馈赠)，并配制成具有试验所需总多糖含量的液体制剂。

2.试验动物：BALB/c小鼠，24只，雌性，6周龄，体重18-20g，购自天坛生物公司，在天坛生物公司动物房饲养。

3.动物分组：将BALB/c小鼠随机每6只分为一组。

4.免疫方式：

滴鼻组34μl/只，含总多糖为10μg或20ug，从小鼠鼻孔缓慢滴入，注意勿流入口腔及肺；

腹腔注射组100μl/只，含总多糖10μg或20ug；

一共免疫4次，第0、14、21天免疫，第三次免疫后1周即第21天用含2％皂苷PBS(pH7.4)冲洗小鼠***/口腔/肺/小肠并收集冲洗液后，在小鼠眼球处取血约500μl作检测。末次免疫后1周即第28天以同样的方法收集冲洗液后，摘眼球取血拉颈处死小鼠。

5.检测方法：

小鼠***/口腔/肺/小肠冲洗物中抗多糖IgA的ELISA测定：以每孔100μl稀释液(含总多糖10μg)包被96孔酶标板4℃过夜后，37℃封闭3h，以1∶32起始稀释小鼠***/口腔/肺/小肠冲洗液后，再进行倍比稀释，以每孔100μl加入孔中，置于37℃培养箱1h；加入以1∶2000稀释的羊抗鼠IgA100μl/孔，置于37℃培养箱1h后显色并用酶标仪读数。

小鼠血液中抗多糖IgG的ELISA测定：以每孔100μl稀释液(含总多糖10μg)包被酶标板4℃过夜后，37℃封闭3h，以1∶100起始稀释离心后的血清，再进行倍比稀释，以每孔100μl加入孔中，置于37℃1h；加入以1∶5000稀释的羊抗鼠IgG100μl/孔，置于37℃培养箱1h后显色并用酶标仪读数。

小鼠小肠/肺冲洗物中抗LTBIgA的ELISA测定：将LTB蛋白(购自Sigma公司)以10ug/ml的浓度包被酶标板(每孔100μl)4℃过夜后，37℃封闭3h，以1∶10起倍比稀释小肠/肺冲洗物，以每孔100μl加入孔中，37℃孵育1h；加入以1∶2000稀释的羊抗鼠IgA，置于37℃培养箱1h后显色并用酶标仪读数。

小鼠血液中抗LTBIgG的ELISA测定：将LTB蛋白(购自Sigma公司)以10ug/ml的浓度包被酶标板(每孔100μl)4℃过夜后，37℃封闭3h，以1∶40起倍比稀释血清，以每孔100μl加入孔中，置于37℃1h；加入以1∶5000稀释的羊抗鼠IgG，置于37℃培养箱1h后显色并用酶标仪读数。

6.试验结果：

A.GCMP特异性血清和粘膜免疫应答水平

试验1.滴鼻免疫时GCMP-rLTB特异性血清和粘膜免疫应答水平以及与GCMP-TT免疫应答水平的比较

试验结果见表1。从表1中可以看出，通过使用含总多糖为10μg或20ug的GCMP-rLTB滴鼻免疫小鼠，在第四次免疫后1周即28天，小鼠***冲洗物中多糖抗体滴度都明显高于第三次免疫后1周即第21天冲洗物中多糖抗体滴度(P＜0.01)；血液中多糖抗体滴度也都明显高于第三次免疫后1周血液中抗体滴度(P＜0.01)；并且在第四次免疫后1周即28天，小鼠口腔冲洗物和肺冲洗物中也都表现出一定量的多糖抗体滴度。

此外，GCMP-rLTB滴鼻组和GCMP-TT滴鼻组相比，小鼠***/口腔/肺冲洗物中的抗多糖IgA和血液中的抗多糖IgG的抗体滴度都有显著性差异(P＜0.05)。此结果说明LTB和TT两种载体蛋白在和GCMP的偶联效果上，前者优于后者。

表1GCMP-rLTB结合物、GCMP-TT的免疫效果评价数据(GMT为几何均数)

试验2.GCMP-rLTB、GCMP-TT和GCMP通过不同免疫途径产生的特异性血清免疫应答水平的比较

(1).GCMP-rLTB和GCMP-TT通过腹腔注射途径产生的特异性血清免疫应答水平的比较

通过使用GCMP-TT和含总多糖为10μg的GCMP-rLTB腹腔注射免疫小鼠，在第四次免疫后1周即28天，检测小鼠血液中抗多糖IgG，试验结果见表2。从表2中可以看出，GCMP-rLTB腹腔注射组和GCMP-TT腹腔注射组相比，特异性血清GCMPIgG抗体水平有显著性差异(P＜0.05)，前者产生的抗体水平约为后者的5.5倍。此结果说明rLTB和TT两种蛋白载体在和GCMP的偶联效果上，前者优于后者。由于取材方法的原因，GCMP-TT腹腔注射组没能在肺和肠检测到IgA抗体。

表2GCMP-rLTB结合物、GCMP-TT的免疫效果评价数据(GMT为几何均数)

(2).GCMP-rLTB腹腔注射组和GCMP-rLTB滴鼻组产生的免疫应答水平的比较

通过使用含总多糖为10μg的GCMP-rLTB分别通过腹腔注射和滴鼻免疫小鼠，在第四次免疫后1周即28天，检测小鼠血液中抗多糖IgG、小肠冲洗物IgA和肺冲洗物IgA，试验结果见表2。从表2中可以看出，GCMP-rLTB腹腔注射组和GCMP-rLTB滴鼻组二者相比，血清特异性GCMPIgG抗体水平无显著性差异，但是后者产生的抗体水平约为前者的2.5倍，肺冲洗物和小肠冲洗物中的IgA抗体水平无显著性差异，但滴鼻组的抗体水平仍高于注射组，该结果表明rLTB同时发挥了载体和粘膜佐剂的功能。

(3).GCMP和GCMP-rLTB通过腹腔注射途径产生的免疫应答水平比较

通过使用GCMP和含总多糖为10μg的GCMP-rLTB腹腔注射免疫小鼠，在第四次免疫后1周即28天，检测小鼠血液中抗多糖IgG、小肠冲洗物IgA和肺冲洗物IgA，试验结果见表2。从表2中可以看出，通过使用GCMP-rLTB进行免疫，所产生的血清特异性IgG抗体水平、肺冲洗物和小肠冲洗物中的IgA抗体水平都与单纯GCMP相比有显著性差异(P＜0.05)，该结果表明LTB有作为多糖结合疫苗新型载体的巨大潜力。

(4).GAMP-TT+GCMP-TT和GAMP-TT+GCMP-rLTB通过腹腔注射途径产生的免疫应答水平比较

通过使用GAMP-TT+GCMP-TT和GAMP-TT+GCMP-rLTB(含总多糖为10μg)腹腔注射免疫小鼠，在第四次免疫后1周即28天，检测小鼠血液中GAMP-IgG和GCMP-IgG，试验结果见表3。从表3中可以看出，两组的血清特异性GCMPIgG抗体水平有显著性差异(P＜0.05)，后者的抗体水平约为前者的30倍，血清特异性GAMPIgG抗体水平有显著性差异(P＜0.05)，后者的抗体水平约为前者的3.6倍，该结果表明多价多糖结合疫苗中同时选用不同蛋白作为载体的免疫效果更优于单一蛋白载体。

表3A、C群多糖结合物腹腔注射免疫后多糖特异性血清IgG水平(GMT为几何均数)

B.LTB特异性血清和粘膜免疫应答水平

试验结果见表4。从表4中可以看出，通过使用含总多糖为10μg的GCMP-rLTB经滴鼻或腹腔注射免疫小鼠，在第四次免疫后1周即28天，在小鼠的血清中产生相对高水平的抗LTB的IgG抗体，在小肠的粘膜组织(小肠冲洗物、肺冲洗物)中产生相对较低的抗LTB的IgA抗体。并且腹腔注射组与滴鼻组比较，血清和粘膜特异性抗体水平均有显著性差异(P＜0.05)，但注射组产生的血清抗体水平高于滴鼻组，而滴鼻组产生的粘膜抗体水平高于注射组，说明rLTB通过粘膜投递能够产生较好的粘膜免疫应答。

表4LTB特异性血清和粘膜免疫应答水平(GMT为几何均数)

实施例2

下面以空肠弯曲菌鞭毛分泌蛋白A1(FspA1)与A群流行性脑膜炎球多糖(GAMP)的结合为例，来对本发明进行详细说明。

(一)、FspA1的克隆和表达

1)FspA1基因的合成与表达载体的构建

FspA1基因序列选自于GENBANK，序列号为GI：116292639。按照大肠杆菌密码子使用频率表(参考文献：Maloy，S.，V.Stewart，andR.Taylor.1996.Geneticanalysisofpathogenicbacteria.ColdSpringHarborLaboratoryPress，NY.)优化此序列，在序列C末端加上6个组氨酸标签和终止密码子，然后在序列两端分别加上NdeI、SacI酶切位点。

人工合成上述FspA1基因，然后用NdeI、SacI双酶切FspA1和pET30a(购自Novagen)，再将双酶切FspA1后的目的片段和pET30a大片段连接，构建成重组质粒pET30a+FspA1，如图2所示。全基因合成及上述构建工作由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

2)重组载体的酶切鉴定

将步骤1)获得的重组质粒pET30a+FspA1转化到大肠杆菌BL21中，并将转化子接种到LB固体培养基(Kana+)平板上，从中挑取生长状态良好的菌落，接于LB液体培养基(Kana+)中，于37℃摇床、230rpm过夜培养。提取质粒，进行NdeI、SacI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳分析证明，在相应的位置上有FspA1基因片段和pET30a+质粒，与预期一致。

3)目的蛋白PspA的表达

将步骤1)获得的重组质粒pET30a+FspA1转化至大肠杆菌BL21中，在237rpm、37℃培养箱中培养至OD值为1.0时，加入终浓度为1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，诱导表达2-4小时(参考文献：《分子克隆试验指南》，出处同上)。

经SDS-PAGE检测(参考文献：《分子克隆试验指南》，出处同上)和Westernblot鉴定(参考文献：《分子克隆试验指南》，出处同上)证明，上述大肠杆菌BL21的表达产物为FspA1，且带有组氨酸标签，可与组氨酸抗体特异性结合，与预期结果相符。

(二)、FspA1的纯化

将上述诱导表达后的大肠杆菌BL21离心(5000rpm，10分钟)，弃上清，将菌体用20mM、pH7.5的磷酸缓冲液(磷酸二氢钠-磷酸氢二钠)清洗一次，再用上述20mM、pH7.5的磷酸缓冲液重悬，用超声破碎仪破碎。破碎完全后再次离心(11000rpm，40分钟)，收集上清，用HisTrapFF柱(购自GEHEALTHY)纯化，收集在洗脱液为0.250M咪唑、0.5MNaCl、20mMPB时的洗脱峰，得到纯化后的本发明目的蛋白FspA1。

(三)、FspA1与GAMP的偶联

将上述纯化所得蛋白FspA1在4℃下透析48小时后，过滤除菌，于4℃保存备用。取2.5mlGCMP(天坛生物制品股份有限公司馈赠)(约10mg)，加入等质量的CNBr，搅拌进行反应，并用0.1MNaOH维持pH10.5，在高pH条件下，CNBr与多糖糖链上的羟基反应生成氰酸酯。在上述反应进行10分钟后，加入己二酰肼(ADH)70mg，用0.1MNaOH维持pH8.5，于4℃反应过夜，使ADH与氰酸酯反应形成异脲键，生成GCMP-ADH酰肼类衍生物。然后将反应混合物装入透析袋，于0.2MNaCl中透析48小时，除去未反应的CNBr、ADH或反应中间物。然后用盐酸调节透析物的pH值至6.7，加入上述制得的载体蛋白FspA1，使透析物(多糖)与FspA1的质量相等，再加入终浓度0.1MEDAC(碳二亚胺)，用盐酸维持pH5.5，反应3小时，使载体蛋白的羧基与GCMP-ADH酰肼类衍生物的氨基发生缩合反应，生成GCMP-ADH-载体蛋白，然后收取透析物。

在上述氰酸酯与ADH反应透析48h后，用TNBS比色法检测衍生物中ADH的含量，可以反映多糖平均修饰度，检测结果为0.8-1.5％(重量比)。

(四)、FspA1与GAMP的结合物的纯化

将步骤(三)得到的反应产物于0.2MNaCl超滤管中超滤5-7次，再用0.45μm滤膜过滤，用Sephorose4FF凝胶柱纯化，使用0.2MNaCl为洗脱剂，收集外水体积处的洗脱峰，得到本发明GAMP-FspA1结合物溶液。对GCMP-FspA1结合物进行定性检测和定量检测，方法同实施例1，结果为：在分子筛外水体积处280nm波长处有吸收峰，蛋白含量868.21μg/ml；总多糖含量301.8568μg/ml；游离多糖含量16.05％；多糖/蛋白(重量比)0.348。

(五)、偶联物的免疫效果评价

1.试验药品：通过上述方法制备的GAMP-FspA1结合物，并配制成具有试验所需总多糖含量的液体制剂。

2.试验动物：同实施例1。

3.动物分组：将24只BALB/c小鼠随机分为4组(每组6只)：生理盐水滴鼻组、生理盐水腹腔注射组、FspA1-GAMP结合物滴鼻组、FspA1-GAMP结合物腹腔注射组。

4.免疫方式：

滴鼻组34μl/只，含总多糖为10μg，从小鼠鼻孔缓慢滴入，注意勿流入口腔及肺；

腹腔注射组100μl/只，含总多糖10μg；

生理盐水滴鼻组与腹腔注射组各分别滴入34μl与注射入100μl生理盐水。

一共免疫4次，第0、14、21天免疫，第三次免疫后1周即第21天用含2％皂苷的PBS(pH7.4)冲洗小鼠***并收集冲洗液后，在小鼠眼球处取血约500μl作检测。末次免疫后1周即第28天以同样的方法收集冲洗液后，摘眼球取血拉颈处死小鼠。

5.检测方法：

小鼠***冲洗物中抗多糖IgA的ELISA测定：同实施例1。

小鼠血液中抗多糖IgG的ELISA测定：同实施例1。

6.试验结果：

试验结果见表5。从表5中可以看出，在第四次免疫后1周即28天，小鼠***冲洗物中多糖抗体滴度明显高于第三次免疫后1周即第21天冲洗物中多糖抗体滴度(P＜0.01)；血液中多糖抗体滴度也明显高于第三次免疫后1周血液中抗体滴度(P＜0.01)；生理盐水滴鼻组、生理盐水腹腔注射组的抗体滴度值为零。该结果说明用FspA1可以作为粘膜免疫的多糖结合疫苗较好的载体。此外，有文献报道空肠弯曲菌鞭毛分泌蛋白A对不同的血清型的空肠弯曲菌具有一定的免疫保护力，可以作为空肠弯曲菌疫苗的一种候选蛋白。以FspA1为载体的粘膜免疫的流脑多糖结合疫苗，既可产生抗流脑多糖的抗体，也可产生一定的抗空肠弯曲菌的保护性抗体。

实施例3

下面以肺炎球菌表面膜蛋白A(PspA)和A群流行性脑膜炎球多糖(GAMP)的结合为例，来对本发明进行详细说明。

(一)、重组PspA的克隆和表达

1)PspA基因的合成与表达载体的构建

PspA基因序列选自于GENBANK，序列号为GI：193804931。按照大肠杆菌密码子使用频率表(参考文献：Maloy，S.，V.Stewart，andR.Taylor.1996.Geneticanalysisofpathogenicbacteria.ColdSpringHarborLaboratoryPress，NY.)优化此序列，在序列C末端加上6个组氨酸标签和终止密码子，然后在序列两端分别加上NdeI、SacI酶切位点。

人工合成上述PspA基因，然后用NdeI、SacI双酶切PspA和pET30a(购自Novagen)，再将双酶切PspA后的目的片段和pET30a大片段连接，构建成重组质粒pET30a+PspA，如图3所示。全基因合成及上述构建工作由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

2)重组载体的酶切鉴定

将步骤1)获得的重组质粒pET30a+PspA转化到大肠杆菌BL21中，并将转化子接种到LB固体培养基(Kana+)平板上，从中挑取生长状态良好的菌落，接于LB液体培养基(Kana+)中，于37℃摇床、230rpm过夜培养。提取质粒，进行NdeI、SacI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳分析证明，在相应的位置上有PspA基因片段和pET30a+质粒，与预期一致。

3)目的蛋白PspA的表达

将步骤1)获得的重组质粒pET30a+PspA转化至大肠杆菌BL21中，在237rpm、37℃培养箱中培养至OD值为1.0时，加入终浓度为1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，诱导表达2-4小时(参考文献：《分子克隆试验指南》，出处同上)。

经SDS-PAGE检测(参考文献：《分子克隆试验指南》，出处同上)和Westernblot鉴定(参考文献：《分子克隆试验指南》，出处同上)证明，上述大肠杆菌BL21的表达产物为PspA，且带有组氨酸标签，可与组氨酸抗体特异性结合，与预期结果相符。

(二)、PspA的纯化

将上述诱导表达后的大肠杆菌BL21离心(5000rpm，10分钟)，弃上清，将菌体用20mM、pH7.5的磷酸缓冲液(磷酸二氢钠-磷酸氢二钠)清洗一次，再用上述20mM、pH7.5的磷酸缓冲液重悬，用超声破碎仪破碎。破碎完全后再次离心(11000rpm，40分钟)，收集上清，用HisTrapFF柱(购自GEHEALTHY)纯化，收集在洗脱液为0.050M咪唑、0.5MNaCl、20mMPB时的洗脱峰，得到纯化后的本发明目的蛋白PspA。

(三)、PspA与GAMP的偶联

将上述纯化所得蛋白PspA在4℃下透析48小时后，过滤除菌，于4℃保存备用。取2.5mlGCMP(天坛生物制品股份有限公司馈赠)(约10mg)，加入等质量的CNBr，搅拌进行反应，并用0.1MNaOH维持pH10.5，在高pH条件下，CNBr与多糖糖链上的羟基反应生成氰酸酯。在上述反应进行10分钟后，加入己二酰肼(ADH)70mg，用0.1MNaOH维持pH8.5，于4℃反应过夜，使ADH与氰酸酯反应形成异脲键，生成GCMP-ADH酰肼类衍生物。然后将反应混合物装入透析袋，于0.2MNaCl中透析48小时，除去未反应的CNBr、ADH或反应中间物。然后用盐酸调节透析物的pH值至6.7，加入上述制得的载体蛋白PspA，使透析物(多糖)与PspA的质量相等，再加入终浓度0.1MEDAC(碳二亚胺)，用盐酸维持pH6.0-6.3，反应3小时，使载体蛋白的羧基与GCMP-ADH酰肼类衍生物的氨基发生缩合反应，生成GCMP-ADH-载体蛋白，然后收取透析物。

在上述氰酸酯与ADH反应透析48h后，用TNBS比色法检测衍生物中ADH的含量，可以反映多糖平均修饰度，检测结果为0.8-1.5％(重量比)。

(四)、PspA与A群流脑多糖(GAMP)的结合物的纯化

将步骤三得到的反应产物于10kD超滤管中超滤浓缩，再用0.45μm滤膜过滤，用Sephorose4FF凝胶柱纯化，使用0.2MNaCl为洗脱剂，收集外水体积处的洗脱峰，得到本发明GAMP-PspA结合物。对GCMP-PspA结合物进行定性检测和定量检测，方法同实施例1，结果为：在分子筛外水体积处280nm波长处有吸收峰，蛋白含量433.08μg/ml；总多糖含量372.45μg/ml；游离多糖含量11.91％；多糖/蛋白(重量比)0.86。

(五)、偶联物的免疫效果评价

1.试验药品：通过上述方法制备的GAMP-PspA结合物，并配制成具有试验所需总多糖含量的液体制剂。

2.试验动物：同实施例1。

3.动物分组：将24只BALB/c小鼠随机分为4组(每组6只)：生理盐水滴鼻组、生理盐水腹腔注射组、PspA-GAMP结合物滴鼻组、PspA-GAMP结合物腹腔注射组。

4.免疫方式：同实施例2。

5.检测方法：同实施例2。

6.试验结果：

试验结果见表5。从表5中可以看出，第四次免疫后1周即28天，小鼠***冲洗物中多糖抗体滴度明显高于第三次免疫后1周即第21天冲洗物中多糖抗体的滴度(P＜0.01)，血清中多糖抗体滴度也明显高于第三次免疫后1周血液中抗体滴度(P＜0.01)；生理盐水滴鼻组、生理盐水腹腔注射组的抗体滴度值为零。该结果说明用肺炎球菌外膜蛋白A可以作为多糖结合疫苗较好的载体。此外，有文献报道肺炎球菌表面膜蛋白对不同血清型的肺炎球菌具有一定的免疫保护力，可以作为肺炎球菌疫苗的一种候选蛋白。以此种蛋白作为载体的粘膜投递型流脑多糖结合疫苗，可以产生抗流脑多糖的抗体，也可以产生对抗肺炎球菌的一定的保护性抗体。

表5FspA1-GAMP与PspA-GAMP免疫效果评价数据

此外，空肠弯曲菌鞭毛分泌蛋白A2与空肠弯曲菌鞭毛分泌蛋白A1在氨基酸序列上具有44％的同源性，两者的保护力有一定的不同，与空肠弯曲菌的运动粘附与侵袭有关，在不同血清型间也有一定的交叉保护力，同样也可以作为粘膜免疫的流脑结合疫苗的载体，作用与实例2相同。肺炎球菌表面粘附素A(PsaA)为一种粘附因子，属ABC型转运蛋白，不同血清型间有交叉保护，有报道用PsaA抗体鼻内免疫可降低肺炎球菌在鼻咽部的定植，可在粘膜部位产生一定的保护性抗体，以肺炎球菌鞭毛粘附素A作为载体的粘膜投递型的流脑多糖结合疫苗既可产生较高抗流脑多糖的抗体，也能够产生对肺炎球菌的一定的保护性抗体。

Claims (6)

1.一种多糖结合疫苗，其特征在于，包含细菌多糖与载体蛋白的化学偶联物，其中所述载体蛋白为细菌粘膜侵袭相关蛋白，

其中，所述载体蛋白选自大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位、空肠弯曲菌鞭毛分泌蛋白A1或空肠弯曲菌鞭毛分泌蛋白A2；

其中，所述细菌多糖选自脑膜炎球菌多糖；

其中，所述多糖结合疫苗为液体制剂，该液体制剂中还包含有未与所述载体蛋白结合的游离细菌多糖，并且在所述液体制剂中，总细菌多糖的含量为30-800μg/ml，载体蛋白的含量为30-900μg/ml，以及总细菌多糖和载体蛋白之间的重量比为0.3-3。

2.根据权利要求1所述的多糖结合疫苗，其特征在于，所述细菌多糖为脑膜炎球菌多糖，并且所述载体蛋白为大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位。

3.根据权利要求1所述的多糖结合疫苗，其特征在于，在所述疫苗中，所述的未与所述载体蛋白结合的游离细菌多糖的含量低于30％。

4.根据权利要求1所述的多糖结合疫苗，其特征在于，所述多糖结合疫苗是通过注射或粘膜投递的方式来施用的。

5.一种权利要求1所述的多糖结合疫苗的制备方法，该方法包括：

1)提供所述的细菌多糖；

2)提供所述的载体蛋白；和

3)使所述细菌多糖和所述载体蛋白化学偶联。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述载体蛋白选自大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位；所述细菌多糖选自脑膜炎球菌多糖。