KR100981471B1 - 효소 활성이 감소된 형별불능 헤모필러스 인플루엔자의ｐ4 변형 단백질 - Google Patents

Abstract

감소된 효소 활성을 나타내고 야생형 P4 단백질에 대한 항체를 유도하고(하거나) 형별불능 H.인플루엔자(NTHi)에 대하여 양호한 살균 활성을 보유하는 P4 변형 단백질은 인체용 면역원성 조성물에 활성 성분으로서 유용하다. 이 단백질의 사용방법 및 이 단백질을 다른 항원과 함께 함유하는 조성물도 제공한다.

헤모필러스 인플루엔자, Ｐ4 단백질, 면역원성 조성물, 변형체, 살균, 항체

Description

효소 활성이 감소된 형별불능 헤모필러스 인플루엔자의 Ｐ4 변형 단백질{MUTANTS OF THE P4 PROTEIN OF NONTYPABLE HAEMOPHILUS INFLUENZAE WITH REDUCED ENZYMATIC ACTIVITY}

본 발명은 일반적으로 면역원성 조성물, 보다 상세하게는 중이염에 대한 면역원성 조성물에 관한 것이다.

형별불능 헤모필러스 인플루엔자(NTHi)는 폐렴, 중이염, 부비강염 및 성인의 급성 발열 기관기관지염을 비롯하여 인간에게 질병을 유발하는 병원균이다. 이 박테리아는 흔히 아동과 유아의 중이염을 일으키는 병인 인자이다. NTHi에 의한 감염은 균주 특이적 면역성만을 부여하기 때문에 인간은 반복적으로 감염될 수 있다. 실제로, 이 박테리아에 의한 대부분의 만성 질환은 아동에게 나타나는 반복적 중이염으로서, 계속된 항생제 치료 또는 귀에 삽입 배농관 시술 등을 비롯한 치료를 필요로 한다.

형별가능한 H.인플루엔자 균주(공지된 협막을 특징으로 하는 균주)를 치료하는데 유용한 면역원성 조성물은 NTHi를 치료하는 데에는 전혀 효과가 없다. 즉, NTHi에 의해 유발된 감염을 예방하는데 유용한 것으로 추정되는 성분을 규명하기 위하여 상당한 연구가 수행되었다. 인간의 중이염 발생을 억제하는 후보 성분의 연 구 중에서, NTHi의 단백질 4(P4; 예전에는 "외막 단백질 e"라고 명명함)라는 박테리아 지단백질이 인간 중에서 박테리아에 대한 살균 항체를 유도해내는 성질로 인하여 바람직한 성분으로서 동정된 바 있다. P4는 NTHi의 다른 외막 단백질에 대한 항체와 상승작용하는 살균 항체를 유도해내는 것으로 밝혀졌다. 이 때문에, 이 단백질은 보다 강력한 살균 반응을 유도하기 위해 다른 외막 단백질과 함께 사용되기도 하였다.

P4를 암호화하는 hel 유전자는 H.인플루엔자의 균주 내 및 균주 간에 항원 보존성이 있는 유전자이다. 예컨대, 본원에 참고인용된 미국 특허 제5,780,601호; 제5,955,580호; 및 제5,601,831호와 유럽특허 EP 0606921 및 EO 0462210을 참조할 수 있다. hel 유전자 서열(서열번호 1)과 암호된 274 아미노산의 프리단백질(preprotein) 서열(서열번호 2)은 NCBI 데이터베이스로부터 기탁번호 M68502호서 입수용이하며 문헌[Green, B.A., et al., 1991 Infect. Immun., 59(9): 3191-3198]에서 확인된 것이다. NTHi의 성숙한 P4는 254 아미노산 길이의 지질화된 단백질(서열번호 3)로서 서열번호 1의 뉴클레오타이드 209 내지 970에 의해 암호화된다. 가공되지 않은 274 아미노산의 프리-P4 단백질은 지방산 아실화 부위를 나타내는 20개 아미노산 시그널 펩타이드(서열번호 2, 아미노산 1 내지 20)를 보유하며, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 149 내지 970에 의해 암호화되고, 이 중의 뉴클레오타이드 149 내지 208은 시그널 또는 리더 펩타이드를 암호화한다.

헤모필러스의 P4 단백질의 기능은 본래 헤민 수송으로 추정되었었다(Reidl,J. and J.J.Mekalanos. 1996 J.Exp.Med., 183:621-629.5). 하지만, P4 단백 질은 후에 외막 효소, 즉 박테리아 산 포스파타제인 것으로 발견되었다(Reilly, T.J. et al., 1999 J.Bacteriol., 181: 6797-805). 이 분야의 보다 최근 연구에서는 P4 단백질의 진정한 기능과 관련한 실험을 통해 다른 의견이 제시되고 있다(Kemmer, G. et al, 2001 J. Bacteriol., 183: 3974-3981; Reidl, J. et al, 2000 Mol. Microbiol., 35: 1573-81; Reilly, T. , and A. Smith, 1999 Prot. Exp. Purif., 17: 401-409; REILLY, T. J. et al, 1999. J. Bacteriol., 181: 6797-805; and Reilly, T.J. et al, 2001 FEBS Lett., 494: 19-23).

효소 단백질로서의 P4는 인간의 면역원성 조성물의 성분으로서의 유용성 여부에 대하여 지대한 관심을 불러일으켰다. 이 단백질은 효소적으로 활성이지만, 그 생체내 기질은 완전히 해명되지 않았다. 인간에게 투여했을 때 야생형 P4는 알려진 유해 효과를 갖고 있지 않지만, 인간에게 투여하기 위한 면역원성 조성물로 사용하고자 하는 경우에는 효소적 활성 단백질 보다는 효소적 비활성 단백질 또는 감소된 활성의 단백질이 바람직한 것으로 일반적으로 인식되고 있다. 효소적 활성 단백질은 그 효소 활성이 항체 유도 외에 면역화된 인체 내에서 예상치 못한 불필요한 반응을 유발할 수 있기 때문에 면역원성 성분으로서 사용하기에는 바람직하지 않다.

전술한 간행물과 특허에 일반적으로 기술된 P4 단백질 단편이나 변형 "돌연변이체" P4 서열은 면역원성 조성물의 가장 중요한 특성인 면역원성에 대해서는 규명되어 있지 않으며, 돌연변이가 면역원성에 미치는 효과에 대해서도 전혀 교시하는 바가 없다. 또한, 효소 활성에 영향을 미치는 변화가 면역원능에도 영향을 미치는 지에 대해서도 전혀 암시된 바가 없다. 따라서, 이러한 종래 기술을 통해서는 면역원성 조성물의 성분으로서 P4 단백질의 돌연변이체를 선발할 수 있는 어떠한 교시도 전혀 얻지 못한다.

따라서, 당해 기술분야에서는 인간에 대한 면역원성 조성물에 안전하게 사용할 수 있는, 야생형 단백질과 면역학적으로는 동등하지만 효소 활성은 감소된 NTHi P4 변형 단백질을 함유하는 치료적이며 예방적인 조성물에 대한 필요성이 계속되고 있다.

발명의 개요

제1 양태로, 본 발명은 야생형 P4 단백질에 비해 감소된 효소 활성을 보유하고 야생형 P4 단백질에 대한 항체를 유도하고(또는) NTHi에 대하여 살균 활성을 나타내는 P4 변형(돌연변이체) 단백질을 제공한다. 이 변형 단백질은 면역화된 인체 내에서 NTHi에 대한 예방적 면역반응을 유도하는데 유용하다.

제2 양태로, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 NTHi P4 변형 단백질, 약학적 허용성 담체 및 선택적으로 보조제를 함유하는 면역원성 조성물을 제공한다. 이 조성물은 다른 항원성 단백질 또는 펩타이드를 함유할 수 있고, NTHi에 대한 예방적 면역 반응을 유도하는데 유용하다.

제3 양태로, 본 발명은 본 발명의 P4 변형체를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 분리된 또는 재조합 뉴클레오타이드 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 이 분자를 숙주 세포내에서 상기 변형체의 발현을 유도하는 서열의 조절적 제어하에 함유하는 플라스미드, 재조합 바이러스 등의 벡터를 포함한다.

제4 양태로, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 뉴클레오타이드 분자가 함유된 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

제5 양태로, 본 발명은 상기 변형 단백질이나 이를 함유하는 조성물을 투여하여 NTHi에 대한 면역반응을 인체 내에서 유도하는 방법을 포함한다.

제6 양태로, 본 발명은 상기 분자를 함유하는 벡터로 형질전환, 형질감염 또는 형질도입된 숙주 세포를 이용하여 P4 변형 단백질을 재조합체 발현시키는 방법을 포함한다.

제7 양태로, 본 발명은 P4 변형 단백질을 다른 항원의 담체로서 사용하는 방법을 제공하는 것으로서, 여기서 다른 항원은 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 사카라이드, 리포폴리사카라이드, 리포올리고사카라이드 또는 리포사카라이드일 수 있다. 이 변형체 P4 단백질은 야생형 P4 단백질과 비교했을 때 감소된 효소 활성을 나타내지만, 야생형 P4 단백질에 대한 항체 유도성이나 NTHi에 대한 살균 활성을 반드시 가질 필요는 없다. 단, 이 담체용 P4 변형체 단백질은 서열번호 3의 아미노산 위치 122에 페닐알라닌을 갖지 않아야 한다.

이러한 본 발명의 양태 및 기타 다른 양태들은 이하 본 발명의 상세한 설명을 통해 당업자라면 분명하게 이해할 수 있을 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 야생형 P4 단백질에 대한 항체를 유도하고(하거나) NTHi에 대한 살균 활성을 보유하는 효소적 비활성인 P4 변형 단백질을 제공함으로써 당해 기술 분야의 요구를 충족시킨다. 이러한 P4 변형 단백질을 함유하는 조성물, 이 단백질을 암호화하는 핵산 분자 및 이러한 단백질과 핵산 분자를 사용하는 방법은 인간내에서 NTHi에 대한 면역성을 유도하는 신규 수단을 제공한다.

A. 본 발명의 변형체 P4 단백질

변형체 P4 단백질은 P4 효소 활성이 극히 낮은 수준이거나 또는 P4 효소 활성이 검출불가능한 수준인 돌연변이체 P4 단백질을 의미한다. 이러한 변형체 P4 단백질을 면역원성 조성물의 성분으로 사용하는 경우에는, 이 변형체 P4 단백질은 야생형 P4 단백질의 필요한 면역원성 성질을 보유해야 한다. 이러한 성질로는 야생형 P4에 대한 ELISA 반응성 항체의 유도 및/또는 NTHi에 대한 살균성 항체의 유도를 포함한다. 담체 단백질로서 사용하는 경우에는, 변형체 P4 단백질은 야생형 P4 단백질의 면역원성 성질을 보유할 필요는 없다.

NTHi에 대한 예방의 임상적 상관물은 공지되어 있지 않기 때문에, 면역원성 조성물에 야생형 P4 대신 돌연변이체 P4를 사용하는 방법은 이 돌연변이체가 야생형 재조합 지단백질 P4(rLP4)에 의해 유도되는 ELISA 역가 및/또는 살균 역가와 동등한 역가를 유도하는 경우에만 성공할 수 있다. 이러한 변형체 P4 단백질은 NTHi 감염의 예방에 유용한 면역원성 조성물의 바람직한 성분이다. 본 명세서에 사용된 "변형체 P4 단백질" 또는 "돌연변이체 P4 단백질"이란 용어는 야생형 P4의 효소 활성을 실질적으로 제거하지만 인체 내에서 NTHi에 대한 면역반응을 유도하는 단백질의 성질은 유지시키는 아미노산 잔기에 특정 돌연변이를 보유하는 단백질 또는 지단백질을 의미한다.

본 명세서에서 번갈아 사용되는 용어로서 "면역 반응" 또는 "면역성"이란 체액(즉, B 세포) 및/또는 세포(즉, T 세포) 반응의 유도를 의미한다. 체액 면역 반응은 숙주 내에 본 발명의 P4 단백질 변형체의 도입에 대한 응답반응으로 면역화된 동물의 혈청에서 나타나는 P4 항원 특이적 항체를 측정하여 검사하는 것이 적당하다. 하기 예시되는 일 구체예로서, 면역반응은 면역화된 동물의 혈청을 효소면역측정법(ELISA)으로 검사한다. 세포독성 T 림프구(CTL) 분석법은 면역화된 동물의 비장에서 분리한 림프구에서 나타나는 T 세포 반응을 측정하는데 이용할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 변형체 P4 단백질은 지단백질인 것으로서, 그 아미노 말단에 변형 시스테인을 함유하여, 여기에 지방산 아실화 글리세롤이 티오에스테르 결합되고 그 말단 아미노 기에 지방산이 결합되어 있는 것이다. 본 발명에 따른 P4 변형 단백질의 일 구체예에서, 리더 펩타이드는 H.인플루엔자의 야생형 P4 리더 펩타이드, 즉 서열번호 2의 아미노산 1 내지 20 이다. 하지만, 지단백질을 만들기 위해 야생형 서열 대신에 박테리아 세포에서 보여주는 지방산 아실화 부위에 특징적인 다른 펩타이드를 P4 변형 단백질에 융합시켜도 좋다. 다른 리더 펩타이드의 예로는 H.인플루엔자의 P6 단백질, 보렐리아 버그도페리(Borrelia burgdorferi)의 OspA 단백질 및 그람 양성 박테리아의 지질 시그널 펩타이드 유래의 리더 펩타이드를 포함한다.

본 발명의 다른 구체예로서, P4 변형 단백질이 담체 단백질로서 사용되는 경우에는 리더 펩타이드 없이 발현되는, 지질화되지 않은 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 2의 아미노산 1 내지 20의 리더 펩타이드가 결여되거나 또는 지 방산 아실화 부위가 결여된 리더 펩타이드와 융합시킬 수 있다.

본 명세서에서, 특정 돌연변이가 위치하는 아미노산 잔기는 야생형 P4의 프로세싱된 성숙형의 지질화된 아미노산 서열, 즉 서열번호 3에 대응하는 잔기 번호로 표시하였다.

본 발명은 야생형 P4 단백질에 비해 감소된 효소 활성을 나타내고 야생형 P4 단백질에 대한 항체를 유도하고(하거나) 형별불능 헤모필러스 인플루엔자(NTHi)에 대한 살균 활성을 보유한 NTHi의 P4 변형 단백질에 관한 것으로서, 이 P4 변형 단백질은 다음과 같은 그룹 중에서 선택되는 돌연변이를 보유한다:

(a) 야생형 P4 단백질에서는 글루타민인 서열번호 3의 아미노산 잔기 39에서의 돌연변이;

(b) 야생형 P4 단백질에서는 페닐알라닌인 서열번호 3의 아미노산 잔기 48에서의 돌연변이;

(c) 야생형 P4 단백질에서는 아스파르트산인 서열번호 3의 아미노산 잔기 64에서의 돌연변이;

(d) 야생형 P4 단백질에서는 리신인 서열번호 3의 아미노산 잔기 161에서의 돌연변이;

(e) 야생형 P4 단백질에서는 아스파라긴인 서열번호 3의 아미노산 잔기 218에서의 돌연변이;

(f) 야생형 P4 단백질에서는 알라닌이고, 돌연변이가 글루탐산, 글루타민 또는 트레오닌은 아닌 서열번호 3의 아미노산 35 및 37에서의 돌연변이;

(g) 야생형 P4 단백질에서는 아스파르트산인 서열번호 3의 아미노산 잔기 64 및 66에서의 돌연변이; 및

(h) 상기 돌연변이(a) 내지 (g) 중의 1 이상의 조합.

구체적으로, 본 발명의 구체적인 P4 변형 단백질의 제1 구체예는 야생형 P4 단백질에서는 글루타민인 서열번호 3의 아미노산 잔기 39에 돌연변이를 함유하는 단백질이다. 일 구체예로서, P4 변형 단백질은 서열번호 3의 아미노산 위치 39에 글루탐산을 함유하는 것이다. 또는, P4 변형 단백질은 서열번호 3의 아미노산 위치 39에 아스파르트산 또는 아스파라긴을 함유하는 것이다.

본 발명에 따른 P4 변형 단백질의 제2 구체예는 야생형 P4 단백질에서는 페닐알라닌인 아미노산 잔기 번호 48에 돌연변이를 함유하는 단백질이다. 이 P4 변형 단백질에서의 이 아미노산 잔기는 시스테인인 것이 적당하다. 위치 48에서 Phe 잔기 대신에 Cys 잔기로의 치환은 단백질 구조를 붕괴시킬 것으로 예상되는 비보존적 변화이다. 하지만, 이러한 P4 변형 단백질은 바람직한 항원성과 면역원성을 보유한다. 또한, 이 P4 변형 단백질은 대장균에서 hemA 돌연변이를 보충하는 성질은 결여되어 있다. [본원에 전체적으로 참고인용되는 문헌 Reilly, T.J.et al., 2001 FEBS Lett. 494:19-23 참조]. 또는, P4 변형 단백질은 서열번호 3의 아미노산 위치 48에 세린이나 기타 다른 비하전성 극성기를 보유하는 아미노산, 예컨대 글리신, 트레오닌, 타이로신, 아스파라긴 및 글루타민을 함유하기도 한다.

본 발명에 따른 P4 변형 단백질의 제3 구체예는 야생형 P4 단백질에서는 아스파르트산인 서열번호 3의 아미노산 잔기 위치 64에 돌연변이를 함유하는 것이다. 이 구체예에서, P4 변형 단백질은 잔기 64에 아스파라긴이나 글루탐산을 함유한다. 또는, 이 P4 변형 단백질은 서열번호 3의 아미노산 위치 64에 알라닌을 함유하기도 한다.

본 발명에 따른 P4 변형 단백질의 제4 구체예는 야생형 P4 단백질에서는 리신인 서열번호 3의 아미노산 잔기 위치 161에 돌연변이를 함유하는 것이다. 이 구체예에서, P4 변형 단백질은 잔기 161에 아르기닌을 함유한다.

본 발명에 따른 P4 변형 단백질의 제5 구체예는 야생형 P4 단백질에서는 아스파라긴인 서열번호 3의 아미노산 잔기 위치 218에 돌연변이를 함유하는 것이다. 이 구체예에서, P4 변형 단백질은 잔기 218에 글루타민을 함유한다. 또는, P4 변형 단백질은 서열번호 3의 아미노산 위치 218에 아스파르트산 또는 글루탐산을 함유하기도 한다.

본 발명에 따른 P4 변형 단백질의 제6 구체예는 야생형 P4 단백질에서는 알라닌인 서열번호 3의 아미노산 잔기 위치 35 및 37에 돌연변이를 함유하는 것이다. 이 구체예에서, P4 변형 단백질은 잔기 35 및 37에 아스파라긴을 함유한다. 이 P4 변형 단백질은 서열번호 3의 아미노산 위치 35 및 37에 글루탐산, 글루타민 또는 트레오닌을 함유하지 않는 것이다.

본 발명에 따른 P4 변형 단백질의 제7 구체예는 야생형 P4 단백질에서는 아스파르트산인 서열번호 3의 아미노산 잔기 위치 64 및 66에 돌연변이를 함유하는 것이다. 이 구체예에서, P4 변형 단백질은 잔기 64 및 66에 알라닌을 함유한다. 또는, P4 변형 단백질은 서열번호 3의 아미노산 위치 64 및 66에 아스파라긴 또는 글 루탐산을 함유하기도 한다.

본 발명자들은 P4 변형 단백질의 효소 활성의 제거 또는 감소가 야생형 P4에 대한 면역원성의 보존 여부와 관련하여 뚜렷한 패턴을 따르지 않는다는 사실을 확인하였다. P4 서열 내의 여러 가지 돌연변이는 효소 활성을 제거하거나 감소시킬 뿐만 아니라 변형 단백질이 높은 ELISA 역가 또는 높은 살균 역가 중 어느 하나를 유인할 수 없게 만든다. 본 발명자들은 하기 실시예에서 조사되고 확인된 각종 P4 변형 단백질들이 효소 활성과 면역원성 사이의 상관관계, 높은 ELISA 역가와 높은 살균 역가 사이의 상관관계 및 항원 구조 상의 보존적 변화에 따른 효과의 예측가능성 사이의 상관관계가 존재하지 않음을 관찰하였다.

예를 들어, P4 단백질의 효소 활성을 없애기 위한 초기 시도는 박테리아의 산 포스파타제(Thaller, M.C. et al., 1998. Prot.Sci., 7:1647-52)에 일반적인 공지의 DD 모티프(2개의 인접 또는 근접 아스파르트산 잔기), 즉 서열번호 3의 아미노산 잔기 64 및 66과 서열번호 3의 아미노산 위치 184와 185에서 이루어졌다. 즉, 위치 64 및 66에 있는 2개의 아스파르트산 대신에 2개의 알라닌을 보유한 이중 돌연변이체를 함유하거나 위치 184 및 185에 있는 2개의 아스파르트산 대신에 2개의 알라닌을 보유한 이중 돌연변이체를 함유하는 P4 변형 단백질의 효소 활성을 측정했을 때, 모두 효소적 불활성이었다.

하지만, 이 단백질들을 마우스의 면역화에 사용했을 때, 생성된 항혈청에서는 야생형 P4에 대한 낮은 ELISA 역가를 나타냈다. 이것이 이 항혈청이 상동성 단백질에 대하여 높은 역가를 나타내는 것으로 보아, 그 항체에 의해 인식되는 에피 토프의 변화 때문인 것으로 보여졌다. 이에 반해, 이 항혈청의 살균 활성을 평가한 결과, 두 변형 단백질에 대한 항혈청은 D64A, D66A 돌연변이체에서는 고도의 살균 활성을 나타내는데 반해, D184A, D185A 돌연변이체에서는 낮은 살균 활성을 보여주었다. 즉, D64A,D66A 돌연변이체는 면역원성 조성물에 포함시킬 수 있는 유용한 성분인 반면, D184,D185A 돌연변이체는 유용하지 않다. 또 다른 제안된 돌연변이체는 위치 64의 Asp 잔기가 고도 보존성의 Glu 잔기로 치환된 것으로서, 수득되는 P4 변형 단백질(D64E)은 NTHi에 대한 살균 역가는 낮지만 야생형 P4에 대해 높은 ELISA 역가를 유도해내었다. 또 다른 제안된 P4 변형 단백질은 본 발명에 따른 면역원성 조성물의 성분으로서 유용한 P4 변형 단백질의 기준을 만족시키지 않는 단백질로서, 이하 실시예에 예시되는 것이다.

본 발명에 유용한 또 다른 P4 변형 단백질은 전술한 특정 돌연변이를 하나 이상 보유하는 전장의 성숙한 254개 아미노산 지단백질, 또는 전술한 변이유발성 잔기를 함유하는 폴리펩타이드 또는 그 단편을 포함하는 것으로서, 이 단백질, 폴리펩타이드 또는 단편은 이들이 유래된 전장의 P4 변형체의 감소된 효소 활성, ELISA 및/또는 살균(BC) 활성을 보유하는 것이다.

면역학적으로 활성이고 효소적으로 불활성인 상기 P4 변형 단백질의 단편은 통상적으로 전술한 변이유발 부위를 함유하는 P4 변형 단백질의 적어도 약 25개의 인접 아미노산을 함유하는 것이다. 보다 일반적으로, P4 변형 단백질 단편은 적어도 약 100개의 인접 아미노산을 함유하는 것이다. P4 변형 단백질의 다른 단편은 적어도 약 150개의 인접 아미노산을 함유하는 것이다. P4 변형 단백질의 또 다른 구체예는 적어도 약 200개인 인접 아미노산 길이를 함유하는 것이다.

P4 변형 단백질의 단편은 NTHi에 대한 예방적 면역반응을 피검체 내에서 유도한다면 하기에 기술된 방법에 유용하게 사용될 수 있다. 이 단편으로는 P4 단백질의 카르복시 말단 영역의 절두체가 있다. 예컨대, 약 잔기 200에서 절두된 P4 변형 단백질(즉, 서열번호 3의 아미노산 1 내지 200을 함유하는 것)은 바람직한 단편이다. 이와 유사하게, 약 잔기 210, 221 또는 232에서 절두된 P4 변형 단백질은 바람직한 단편이다. 또한, 효소적으로 비활성이고, 면역학적으로 활성인 본 발명의 P4 변형체의 또 다른 단편을 선발할 수도 있다. 또한, 이 단편들은 전술한 특정 돌연변이 중 하나 이상을 함유하여도 좋다.

다른 적당한 P4 변형 단백질로는 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환기를 함유하는 것이어도 좋다. 또 다른 적당한 P4 변형 단백질로는 이 폴리펩타이드를 다른 화합물, 예컨대 폴리펩타이드의 반감기를 증가시키는 화합물(예, 폴리에틸렌 글리콜)과 융합시킨 단백질이 있다. 또 다른 적당한 P4 변형 단백질로는 이 폴리펩타이드에 추가 아미노산, 예컨대 리더 서열이나 분비 서열 또는 P4 변형 단백질의 면역원성을 향상시키는데 이용되는 서열 등을 융합시킨 단백질이 있다. 또 다른 P4 변형 단백질의 변형으로는 P4의 N 말단에 있는 시그널 서열이나 리더 서열을 전술한 바와 같이 결실시킨 단백질, 즉 서열번호 1의 뉴클레오타이드 148 내지 208에 의해 암호화되고(되거나) 면역원성에 영향을 미치지 않는 다른 영역의 결실을 포함하는 단백질이 있다. 이와 유사하게, 본 명세서에 기술된 P4 변형 단백질의 변형은 시그널 또는 리더 서열을 다른 시그널 또는 리더 서열로 치환시킨 단백질을 포함한 다. [예컨대, 본원에 참고인용된 미국 특허 제5,780,601호를 참조하라]

적당한 P4 변형 단백질의 또 다른 예로는 임의의 아미노산(예, -Gly-Ser-) 또는 다른 아미노산이나 화학적 화합물 스페이서가 단백질을 서로 결합시키거나 단백질을 담체에 결합시키기 위한 목적으로 펩타이드의 말단에 첨가되어 있는 단백질이 있다. 예를 들면, 유용한 P4 변형 단백질은 전술한 P4 변형 단백질 중 하나 이상이 담체 단백질에 커플링된 단백질일 수 있다. 또는, 유용한 P4 변형 단백질은 경우에 따라 담체 단백질에 커플링되는 복수의 P4 변형 단백질을 함유한 융합 단백질일 수 있다. 이 구체예들에서, 담체 단백질은 선택된 P4 변형 단백질의 면역원성을 향상시킬 수 있는 단백질이거나 다른 분자인 것이 바람직하다. 이러한 담체는 또한 보조 효과가 있는 크기가 보다 큰 분자일 수 있다. 통상적인 단백질 담체의 예로는 대장균 DnaK 단백질, 갈락토키나제(galK, 박테리아에서 갈락토스 대사의 제1 단계를 촉매하는 효소), 유비퀴틴, α-교배인자, β-갈락토시다제 및 인플루엔자 NS-1 단백질이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 톡소이드(즉, 자연 발생의 독소를 암호화하지만 그 독성을 없앨 수 있는 충분한 변형을 보유하는 서열), 예컨대 디프테리아 톡소이드 및 파상풍 톡소이드, 이들의 각 독소 및 이 단백질들의 임의의 변이체 형태, 예컨대 CRM₁₉₇(디프테리아 독소의 비독성 형태, 미국 특허 제5,614,382호 참조) 역시 담체로서 이용할 수 있다. 기타 다른 담체로는, 슈도모나스의 외독소 A, 대장균의 열불안정성 독소 및 로타바이러스 입자(로타바이러스와 VP6 입자 포함)가 있다. 또는, 담체 단백질이나 다른 면역원성 단백질의 단편이나 에피토프가 사용될 수도 있다. 예를 들면, 합텐을 박테리아 독소의 T 세포 에피토 프에 커플링시킬 수 있다(미국 특허 제5,785,973호 참조). 이와 유사하게, 각종 박테리아 열충격 단백질, 예컨대 마이코박테리아의 hsp-70을 사용할 수 있다. 글루타치온-S-트란스퍼라제(GST)도 또 다른 유용한 담체이다. 당업자라면 상황에 따라 사용하기에 적당한 담체를 용이하게 선택할 수 있을 것이다. 융합 단백질은 단백성 물질을 커플링하는 표준 기법에 따라 제조할 수 있다. 융합체는 하기 기술되는 바와 같이 재조합 DNA 기법으로 제조한 융합 유전자 작제물로부터 발현시킬 수 있다.

본 명세서에 기술된 다른 적당한 P4 변형 단백질은 효소 활성이 복원되지 않는 변형, 면역원성이 감소되지 않는 변형, 또는 이 두 변형의 조합을 통해 상기 구체적으로 예시한 P4 변형 단백질이나 펩타이드와 상이할 수 있다. 예를 들어, P4 변형 단백질의 1차 서열을 변화시키지만 일반적으로 그 기능은 변화시키지 않는 보존적 아미노산 변화가 이루어질 수 있다.

이러한 변화를 시행하는 경우에는, 아미노산의 수치 지수(hydropathic index)를 고려할 수 있다. 폴리펩타이드에 상호작용적 생물학적 기능을 부여하는데 있어서 아미노산의 수치 지수의 중요성은 이미 당해기술분야에 널리 알려져 있다(Kyte & Doolittle, 1982). 특정 아미노산은 유사한 수치 지수 또는 점수의 다른 아미노산으로 치환시킬 수 있으며, 그 결과 유사한 생물학적 활성의 폴리펩타이드가 얻어지는 것으로 알려져 있다. 각 아미노산에는 각 아미노산의 소수성과 하전 특성에 따라 수치 지수가 지정되어 있다. 그 수치 지수는 다음과 같다: 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).

아미노산 잔기의 상대적 수치 특성은 수득되는 폴리펩타이드의 2차 구조 및 3차 구조를 결정하며, 결과적으로 이 폴리펩타이드와 다른 분자, 예컨대 효소, 기질, 수용체, 항체, 항원 등과의 상호작용을 지정하는 것으로 사료된다. 수치 지수가 유사하여 기능적으로 동등한 폴리펩타이드가 수득되는 상호 치환가능한 아미노산은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 이와 같은 변화에서, 수치 지수가 +/- 2 범위 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, +/-1 범위 이내인 아미노산의 치환이 특히 바람직하며, +/-0.5 범위 이내인 아미노산의 치환이 보다 더 바람직하다.

또한, 유사 아미노산의 치환은 친수성에 근거하여 실시할 수 있는데, 특히 이와 같이 제조된 생물학적으로 동등한 기능성인 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 면역학적 양태에 사용하고자 하는 경우에는 친수성에 근거한 치환을 실시할 수 있다. 본원에 참고인용된 미국 특허 제4,554,101호는 폴리펩타이드의 인접 아미노산이 나타내는 친수성에 따라 좌우되는, 폴리펩타이드의 최대 국소 평균 친수성은 폴리펩타이드의 면역원성 및 항원성, 즉 폴리펩타이드의 생물학적 성질과 상호관계가 있음을 기술하고 있다.

미국 특허 제4,554,101호에 상세히 설명되어 있듯이, 아미노산 잔기에는 다음과 같은 친수성 값이 매겨져 있다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신(0); 프롤린(-0.5±1); 트레오닌(-0.4); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 이소류신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 따라서, 친수성 값이 유사한 아미노산은 상호 치환시킬 수 있으며, 그럼에도 불구하고 생물학적으로 동등한, 특히 면역학적으로 동등한 폴리펩타이드를 얻을 수 있음은 자명한 사실이다. 이러한 변화에서, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고; 특히 ±1 이내인 아미노산의 치환이 더욱 바람직하며; ±0.5 이내인 아미노산의 치환이 특히 더 바람직하다.

전술하였듯이, 아미노산 치환은 일반적으로 예를 들어 소수성, 친수성, 하전, 크기 등에 대한 아미노산 측쇄 치환기의 상대적 유사성에 근거하여 실시한다. 이와 같은 다양한 특징을 고려한 치환의 실례는 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 예컨대 아르기닌과 리신; 글루타메이트와 아스파테이트; 세린과 트레오닌; 글루타민과 아스파라긴; 발린, 류신 및 이소류신이 있다.

또한, 일반적으로 P4 변형 단백질의 1차 서열을 변화시키지 않는 변형으로는 폴리펩타이드의 생체내 또는 시험관내 화학적 유도체화, 예컨대 아세틸화, 메틸화 또는 카르복실화가 있다. 또한, 본 발명의 P4 변형 단백질에는 글리코실화 변형 단백질, 예컨대 폴리펩타이드의 합성과 프로세싱 또는 추가 프로세싱 단계에서의 폴리펩타이드의 글리코실화 패턴을 변형시켜 제조한 상기 단백질; 또는 상기 단백질을 글리코실화에 영향을 미치는 효소, 예컨대 포유동물의 글리코실화 효소 또는 탈글리코실화 효소에 노출시켜 제조한 상기 단백질도 포함된다. 또한, P4 변형 단백 질에는 포스포타이로신, 포스포세린 또는 포스포트레오닌과 같은 인산화 아미노산 잔기를 보유하는 전술한 돌연변이유발된 서열도 포함된다.

또한, P4 변형 단백질에는 단백분해성 분해에 대한 내성을 향상시키거나 가용성 성질을 최적화하기 위한 목적으로 통상적인 분자생물학적 기법을 사용하여 변형시킨 상기 서열도 포함된다. 이와 같은 P4 변형 단백질에는 자연발생의 L-아미노산 이외의 다른 잔기, 예컨대 D-아미노산이나 비자연발생의 합성 아미노산을 함유하는 서열도 포함된다. 본 발명의 P4 변형 단백질에 존재할 수 있는 기타 다른 공지의 변형에는 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 결합, 헴(heme) 부의 공유 결합, 뉴클레오타이드 또는 이의 유도체의 공유 결합, 지질 또는 이의 유도체의 공유 결합, 포스포티딜이노시톨의 공유 결합, 가교결합, 고리화, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교결합의 형성, 시스틴의 형성, 파이로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, GPI 부착기구(anchor) 형성, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백분해성 프로세싱, 프레닐화, 이성체화, 셀레노일화, 황산화, 전사-RNA를 매개로 하는 단백질에 대한 아미노산의 첨가, 예컨대 아르기닐화 및 유비퀴틴화 등이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.

B. P4 변형 단백질을 암호화하는 핵산 분자

본 발명의 다른 양태에는 특정 부위 지시성 돌연변이 또는 P4 단백질의 단편(상기 돌연변이 중 하나 이상을 추가로 함유할 수 있는 단편)을 보유하는 전술한 P4 변형 단백질을 암호화하는 분리된, 합성 또는 재조합 핵산 분자 및 서열이 포함된다.

P4 변형 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고 있는 분리된 뉴클레오타이드 분자는 바람직하게는 숙주 세포에서 P4 변형체의 발현을 유도하는 조절 서열의 제어하에 위치하는 것이 좋다. 본원에 기술하였듯이, 이와 같은 핵산 분자는 시험관내에서 P4 변형 단백질을 발현시키는데 사용하거나 인간의 생체내에서 P4 변형 단백질을 발현시키는데 사용할 수 있다.

본 명세서에 사용된 "분리된 뉴클레오타이드 분자 또는 서열"이란 용어는 천연 환경에서 그 분자 또는 서열과 결합되어 있을 수 있는 다른 생물학적 성분에 의한 오염이 없는 핵산 분절이나 단편을 의미한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 분리된 뉴클레오타이드 분자 또는 서열의 일 구체예는 자연발생 상태에서 인접해 있는 서열로부터 분리된 서열, 예컨대 일반적으로 단편에 인접해있는 서열, 즉 일 예로 자연 발생의 게놈 내에서 단편에 인접해 있는 서열을 제거한 DNA 단편이다. 또한, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 및 분자는 본 발명의 P4 변형 단백질을 암호하도록 추가 변형시킨 것이다. 즉, "분리된 핵산 분자 또는 서열"이란 용어는 천연적으로 세포 내에서 돌연변이유발되지 않은 핵산을 수반하는 다른 성분들, 예컨대 RNA, DNA 또는 단백질로부터 실질적으로 정제된 핵산 서열 또는 분자를 의미한다. 또한, 본 발명의 분리된 뉴클레오타이드 분자 또는 서열에는 다른 통상적인 방법, 예컨대 재조합법, 합성법, 예컨대 돌연변이유발법 또는 이 방법들의 조합을 통해 제조한 서열 및 분자도 포함된다. 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 및 분자는 본 명세서에 제시된 특정 뉴클레오타이드 서열만을 유일하게 제한하는 것으로 해석되어서는 안되고, 본 명세서에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 상동성(즉, 서열 동일성)을 공유 하는 모든 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

핵산이나 이의 단편을 언급할 때 사용된 "실질적 상동성" 또는 "실질적 유사성"이란 용어는 다른 핵산(또는 이의 상보성 가닥)과 적당한 뉴클레오타이드 삽입 또는 결실에 따라 적절히 정렬했을 때 적어도 약 70%의 뉴클레오타이드 염기의 뉴클레오타이드 서열 동일성이 있는 것을 나타낸다(이 때 서열 동일성은 모든 공지된 서열 동일성의 알고리듬으로 측정, 예컨대 GCG 버전6.1의 프로그램인 Fasta로 측정했을 때의 값이다). 본 명세서에 사용된 "상동성"이란 용어는 두 중합체 분자, 예컨대 두 핵산 분자(예컨대 두 DNA 분자 또는 두 RNA 분자) 또는 두 폴리펩타이드 분자 사이의 서열 유사성을 의미한다. 두 분자의 뉴클레오타이드 위치 또는 아미노산 위치에 동일한 단량체 뉴클레오타이드 또는 아미노산이 존재한다면, 예컨대, 두 DNA 분자가 각각 한 위치에 아데닌을 보유한다면 이 두 분자는 그 위치에서 상동성인 것이다. 두 서열 사이의 상동성은 정합 위치 또는 상동성 위치 수의 직접적인 함수로서, 예컨대 두 화합물 서열에서 절반의 위치(예컨대, 10개의 서브유닛 길이를 가진 중합체에서 5개 위치)가 상동성이면 두 서열은 50% 상동성이다. 90%의 위치, 예컨대 10개 중 9개가 정합성이거나 상동성이면 두 서열은 90% 상동성을 보유한다. 예를 들어, DNA 서열 3'ATTGCC5' 및 3'TATGCG5'는 50% 상동성을 보유한다. 본 명세서에 사용된 "실질적으로 상동성"이라는 용어는 DNA 또는 RNA가 목적 핵산에 대해 약 70% 상동성인, 보다 바람직하게는 약 80% 상동성인, 가장 바람직하게는 약 90% 상동성인 것을 의미한다.

또한, 본 발명은 야생형 P4 단백질에 비해 감소된 효소 활성을 나타내고 야 생형 P4 단백질에 대한 항체를 유도하고(하거나) 형별불능 헤모필러스 인플루엔자(NTHi)에 대한 살균 활성을 보유하되, 다음과 같은 그룹 중에서 선택되는 돌연변이를 보유하는 것이 특징인 NTHi의 P4 변형 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 적어도 70%, 80% 또는 90% 이상 상동성이고 하기 돌연변이 (a) 내지 (g) 중 적어도 하나의 돌연변이를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 분리된 뉴클레오타이드 분자에 관한 것이다:

(a) 야생형 P4 단백질에서는 글루타민인 서열번호 3의 아미노산 잔기 39에서의 돌연변이;

(b) 야생형 P4 단백질에서는 페닐알라닌인 서열번호 3의 아미노산 잔기 48에서의 돌연변이;

(c) 야생형 P4 단백질에서는 아스파르트산인 서열번호 3의 아미노산 잔기 64에서의 돌연변이;

(d) 야생형 P4 단백질에서는 리신인 서열번호 3의 아미노산 잔기 161에서의 돌연변이;

(e) 야생형 P4 단백질에서는 아스파라긴인 서열번호 3의 아미노산 잔기 218에서의 돌연변이;

(f) 야생형 P4 단백질에서는 알라닌이고, 돌연변이가 글루탐산, 글루타민 또는 트레오닌은 아닌 서열번호 3의 아미노산 35 및 37에서의 돌연변이;

(g) 야생형 P4 단백질에서는 아스파르트산인 서열번호 3의 아미노산 잔기 64 및 66에서의 돌연변이; 및

(h) 상기 돌연변이(a) 내지 (g) 중의 1 이상의 조합.

또한, 유전자 코드의 축퇴성에 따라 본 명세서에 기술된 P4의 돌연변이된 아미노산 잔기를 암호화하는 모든 3 뉴클레오타이드 코돈도 본 발명의 범위에 속하는 것이다.

본 명세서에서 논의한 바와 같이, P4 변형 단백질 및/또는 이를 암호화하는 DNA 서열 또는 본 명세서에 기술된 핵산 분자 또는 조성물에 유용한 다른 서열을 동정된 서열과 상동성 또는 동일성 퍼센트로 나타내는 경우에, 상동성% 또는 동일성%의 계산에 사용되는 알고리듬으로는 다음과 같은 것이 있다: 스미드-워터만 알고리듬(Smith-Waterman algorithm; J.F.Collins et al, 1988, Comput.Appl.Biosci., 4:67-72; J.F.Collins et al., Molecular Sequence Comparison and Alignment, (M.J.Bishop et al., eds.) In Practical Approach Series: Nucleic Acid and Protein Sequence Analysis XVIII, IRL Press: Oxford, England, UK(1987) pp.417) 및 BLAST 프로그램과 FASTA 프로그램(E.G.Shpaer et al., 1996, Genomics 38:179-191). 이 문헌들은 본원에 참고인용되어 있는 것이다.

본 명세서에서 두 DNA를 "작동가능하게 연결된" 것으로 기술한 표현은 1본쇄 또는 2본쇄 DNA가 두 DNA를 각각 포함하는데, 이 두 DNA가 DNA 서열 중 적어도 하나가 다른 서열에 특징을 부여하는 생리적 효과를 발휘할 수 있도록 DNA 내에 배열되어 있는 것을 의미한다.

본 발명의 P4 변형 단백질을 생산하는데 사용하거나 또는 P4 변형 단백질을 세포내에서 생체내 생산하기 위하여 투여하는데 이용하는 경우에, 각 P4 변형 단백 질을 암호화하는 서열과 필요한 조절 서열은 별도의 바이러스 또는 비바이러스 재조합 벡터(예, 바이러스를 이용하지 않고 핵산 분자를 세포내로 전달하는 방법) 내에 제공하는 것이 바람직하다. 또는, P4 변형 단백질의 이중 카피를 암호화하거나 본 발명의 여러 P4 변형 단백질을 복수개 암호화하는 2종 이상의 핵산 서열을 폴리시스트론성 전사체, 즉 복수의 유전자 산물을 발현하도록 디자인된 단분자에 제공할 수도 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 "벡터"라는 용어는 바이러스 또는 비바이러스, 예컨대 박테리아 종 유래의 DNA 분자로서, 외인성 또는 이종의 핵산 서열을 암호화하도록 디자인된 것이다. 즉, 벡터에는 통상적인 박테리아 플라스미드도 포함된다. 이와 같은 플라스미드 또는 벡터는 바이러스 또는 파지 유래의 플라스미드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 벡터에는 염색체 벡터, 에피솜 벡터 및 바이러스 유래의 벡터, 예컨대 박테리아 플라스미드, 박테리오파지, 효모 에피솜, 효모 염색체 성분 및 바이러스 유래의 벡터가 포함된다. 또한, 벡터는 이들의 조합에서 유래하는 벡터, 예컨대 플라스미드와 벡테리오파지 유전자 성분, 코스미드 및 파지미드 유래의 벡터일 수 있다. 벡터에는 또한 한 세포에서 다른 세포로 유전자를 전달하는 비복제성 바이러스도 포함된다. 또한, 이 용어는 핵산을 세포 내로 용이하게 전달하는 비플라스미드 및 비바이러스 화합물, 예컨대 폴리리신 화합물 등을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명의 핵산 분자는 P4 변형 단백질을 암호화하는 서열을 본 발명에 따른 숙주 세포로 전달하기 위한 비바이러스 벡터 또는 방법을 포함한다. 각종 비바이러 스 벡터가 당해 기술분야에 공지되어 있고, 그 예로는 플라스미드, 박테리아 벡터, 박테리오파지 벡터, "나출형" DNA 및 양이온 지질이나 중합체와 응축된 DNA가 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.

박테리아 벡터의 예로는 BCG(bacille Calmette Guerin), 살로넬라, 시겔라, 대장균 및 리스테리아 등에서 유래하는 서열이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 적합한 플라스미드 벡터로는 예컨대, pBR322, pBR325, pACYC177, pACYC184, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pR290, pK37, pKC101, pAC105, pVA51, pKH47, pUB110, pMB9, pBR325, ColE1, pSC101, pBR313, pML21, RSF2124, pCR1, RP4, pBAD18 및 pBR328이 포함된다.

적합한 유도성 대장균 발현 벡터의 예로는 pTrc(Amann et al., 1988 Gene, 69:301-315), 아라비노스 발현 벡터(예, pBAD18, Guzman et al., 1995, J.Bacteriol., 177:4121-4130) 및 pETIId(Studier et al., 1990 Methods in Enzymology, 185:60-89)가 있다. pTrc 벡터로부터의 표적 유전자 발현은 하이브리드 trp-lac 융합 프로모터로부터의 숙주 RNA 폴리머라제의 전사에 따라 좌우된다. pETIId 벡터로부터의 표적 유전자 발현은 공발현되는 바이러스 RNA 폴리머라제 T7 gn1에 의해 매개되는 T7 gn10-lac 융합 프로모터로부터의 전사에 따라 좌우된다. 이 바이러스 폴리머라제는 숙주 균주인 BL21(DE3) 또는 HMS I 74(DE3)에 의해 lacUV5 프로모터의 전사 제어하에 있는 T7 gn1 유전자를 보유하는 정주성 프로파지로부터 공급된다. pBAD 시스템은 araC 유전자에 의해 조절되는 유도성 아라비노스 프로모터에 의해 좌우된다. 이 프로모터는 아라비노스의 존재하에 유도된다.

벡터의 일 예로서, 1본쇄 또는 2본쇄 박테리오파지 벡터가 있다. 예컨대, 적합한 클로닝 벡터로는 박테리오파지 λ 벡터 시스템, λgt11, μgt, μWES.tB, Charon 4, λgt-WES-λB, Charon 28, Charon 4A, λgt-1-λBC, λgt-1-λB, M13mp7, M13mp8 또는 M13mp9 등과 같은 벡터가 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.

다른 구체예에서, 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. S. 세레비지에와 같은 효모내 발현용 벡터의 예로는 pYepSecI(Baldari et al., 1987), pMFa(Kurjan and Herskowitz, 1982), pJRY88(Schultz et al., 1987) 및 pYES2(Invitrogen Corporation, San Diego,CA)가 있다.

또는, 바큘로바이러스 발현 벡터도 사용할 수 있다. 곤충 세포(예, Sf9 또는 Sf21 세포) 배양물에서 단백질을 발현시키는데 유용한 바큘로바이러스 벡터의 예로는 pAc류(Smith et al., 1983)와 pVL류(Lucklow and Summers, 1989)가 있다.

또 다른 구체예에서, 포유동물 발현 벡터는 포유동물 세포에서의 발현 시에 사용된다. 포유동물 발현 벡터의 예로는 pCDM8(Seed, 1987) 및 pMT2PC(Kaufman et al., 1987)가 있다. 포유동물 세포에서 사용될 때, 발현 벡터의 제어 기능은 종종 바이러스 조절 인자에 의해 부여된다.

재조합 벡터의 1종류는 재조합 1본쇄 또는 2본쇄 RNA 또는 DNA 바이러스 벡터이다. 다양한 바이러스 벡터 시스템이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 벡터의 예로는 선택된 당해 핵산 조성물을 운반하거나 발현하도록 작제된 재조합 아데노바이러스 벡터, 헤르페스 단순 바이러스(HSV)계 벡터, 아데노 관련 바이러스 (AAV) 벡터, 하이브리드 아데노바이러스/AAV 벡터, 재조합 레트로바이러스 또는 렌티바이러스, 재조합 폭스바이러스 벡터, 재조합 백시니아 바이러스 벡터, SV-40 벡터, 곤충 바이러스, 예컨대 바큘로바이러스 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

이용할 수 있는 레트로바이러스 벡터로는 EP 0 415 731; 국제 특허 공개번호 WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; 및 WO 93/25234; 미국 특허 제5,219,740호; 국제 특허공개 번호 WO 93/11230 및 WO 93/10218; Vile and Hart, 1993 Cancer Res. 53:3860-3864; Vile and Hart, 1993 Cancer Res. 53:962-967; Ram et al., 1993 Cancer Res. 53:83-88; Takamiya et al., 1992 J.Neurosci.Res. 33:493-503; Baba et al., 1993 J.Neurosurg. 79:729-735; 미국 특허 제4,777,127호; GB 특허 제2,200,651호; 및 EP 0 345 242에 기술된 벡터를 포함한다. 적합한 재조합 레트로바이러스의 예로는 국제 특허 공개번호 WO 91/02805에 기술된 벡터를 포함한다.

알파바이러스계 벡터도 P4 변형 단백질을 암호화하는 핵산 분자로서 사용할 수 있다. 이와 같은 벡터는 각종 알파바이러스로부터 작제할 수 있는데, 예컨대 신드비스(Sindbis) 바이러스 벡터, 셈리키(Semliki) 삼림 바이러스(ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스 리버(Ross River) 바이러스(ATCC VR-373; ATCC VR-1246); 및 베네주엘라(Venezuela) 말 뇌염 바이러스(ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)가 있다. 이러한 벡터 시스템의 대표적 예로는 미국 특허 제5,091,309호; 제5,217,879호; 및 제5,185,440호와 국제 특허 공개번호 WO 92/10578; WO 94/21792, WO 95/27069; WO 95/27044 및 WO 95/07994에 기술된 것이 있다.

아데노바이러스 벡터의 예로는 다음과 같은 문헌에 기술된 벡터가 있다: Berkner, 1988 Biotechniques 6:616-627; Rosenfeld et al., 1991 Science 252: 431-434; 국제 특허공개번호 WO 93/19191; Kolls et al., 1994 PNAS 91:215-219; Kass-Eisler et al., 1993 PNAS 90:11498-11502; Guzman et al., 1993 Circulation 88:2838-2848; Guzman et al., 1993 Cir.Res.73: 1202-1207; Zabner et al., 1993 Cell 75: 207-216; Li et al., 1993 Hum. Gene Ther. 4:403-409; Cailaud et al., 1993 Eur.J.Neurosci. 5:1287-1291; Vincent et al., 1993 Nat. Genet. 5:130-134; Jaffe et al., 1992 Nat.Genet. 1:372-378; and Levrero et al., 1991 Gene 101:195-202. 아데노바이러스 벡터의 예로는 국제 특허 공개번호 WO94/12649; WO93/03769; WO93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO95/00655에 기술된 벡터를 포함한다. 기타 다른 아데노바이러스 벡터로는 침팬지 아데노바이러스 유래의 벡터, 예컨대 미국 특허 제6,083,716호에 기술된 벡터가 있다.

다른 바이러스 벡터로는 아데노 관련 바이러스(AAV)와 같은 파르보바이러스를 기본으로 하는 벡터가 있다. 대표적 예로는 국제특허 공개번호 WO 93/09239, Samulski et al., 1989 J.Virol. 63: 3822-3828; Mendelson et al., 1988 Virol. 166:154-165; 및 Flotte et al., 1993 PNAS 90:10613-10617에 기술된 AAV 벡터가 있다. 특히 바람직한 다른 AAV 벡터로는 AAV1계 벡터가 있으며, 이는 국제 특허 공개번호 WO 00/28061(2000.5.18)을 참조할 수 있다. 다른 바람직한 AAV 벡터로는 모의형별된 벡터, 즉 AAV 5'ITRS, 돌연변이유전자 및 AAV 3'ITRs로 이루어진 미니유전자를 AAV ITR과 이종성인 AAV 혈청형의 캡시드에 봉입시킨 벡터를 포함한다. 이 와 같이 모의형별된 AAV 벡터를 제조하는 방법은 국제 특허 공개번호 WO 01/83692에 상세히 기술되어 있다.

본 발명의 핵산 분자가 "나출형 DNA"인 일 구체예의 경우에는, 중합체, 예컨대 통상적 중합체 및 비통상적 중합체, 일 예로 특히 사이클로덱스트린 함유 중합체 및 보호적 상호작용성 비응축성 중합체와 혼합하는 것이 좋다. "나출형" DNA 및 양이온성 지질 또는 중합체와 응축된 DNA는 일반적으로 화학적 방법에 따라 세포로 전달한다. 세포 전달에 관한 다수의 화학적 방법이 당해 기술분야에 공지되어 있는데, 지질, 중합체 또는 단백질을 사용하여 DNA와 복합체를 형성하고, 경우에 따라 이 복합체를 입자로 응축시킨 다음, 세포로 전달하는 방법을 포함한다. 또 다른 비바이러스성 화학적 방법으로는 양이온을 사용하여 DNA를 응축시킨 다음, 리포좀에 넣어 본 발명에 따라 사용하는 방법이 있다. 문헌[C. Henry, 2001 Chemical and Engineering News, 79(48): 35-41] 참조.

핵산 분자는 "나출형" DNA를 직접 세포로 전달하거나(미국 특허 제5,580,859호) 또는 면역화를 촉진하는 제제, 예컨대 부피비카인 및 기타 다른 국소 마취제와 조성물로 배합하여 세포로 전달한다(미국 특허 제6,127,170호).

전술한 바이러스 및 비바이러스 벡터의 모든 성분은 의약 산업에서 입수용이하고 당해 기술분야에 공지된 성분 중에서 용이하게 선택할 수 있다. 벡터 성분과 조절 서열의 선택은 본 발명에 특별한 제한은 없다. 본 발명에 따라 P4 변형 단백질을 암호화하는 각 핵산 서열은 포유동물 세포에서 각 핵산 서열의 복제를 유도하고 산물의 생성을 유도하는 조절 서열의 제어하에 두는 것이 바람직하다. "프로모 터/조절 서열"이란 용어는 프로모터/조절 서열에 작동가능하게 결합된 핵산의 발현에 필요한 DNA 서열을 의미한다. 몇몇 경우에, 프로모터/조절 서열은 조직 특이적 방식으로 작용한다. 예를 들면, 프로모터/조절 서열은 특정 조직 형태의 세포에서만 발현을 유도할 수 있다. 어떤 경우에는, 이 서열은 핵심 프로모터 서열이고, 어떤 다른 경우에는 인헨서 서열과 조직 특이적 방식의 발현에 필요한 다른 조절 인자를 포함하기도 한다.

본 발명의 P4 변형 단백질을 암호화하는 핵산 분자 및/또는 재조합 벡터는 추가로 조절 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 이러한 조절 서열에는 P4 변형 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 포함한다. 이 프로모터/조절 서열은 암호 서열의 5' 말단에 위치하여 세포내에서 P4 변형 단백질의 발현을 유도하는 것이 바람직하다.

적합한 프로모터는 구성형 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 특이적 프로모터 등 중에서 용이하게 선택할 수 있다. 본 발명의 P4 변형 단백질을 암호화하는 핵산 분자에 이용되고 활성이 비특이적인 구성형 프로모터의 예로는 레트로바이러스 루스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 레트로바이러스 LTR 프로모터(경우에 따라 RSV 인헨서와 함께), 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(경우에 따라 CMV 인헨서와 함께)(예, Boshart et al., Cell 41:521-530(1985)), SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터 및 EF1α 프로모터(Invitrogen)가 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.

외부에서 공급된 화합물에 의해 조절되는 유도성 프로모터로는 아라비노스 프로모터, 아연-유도성 양 메탈로티오닌(MT) 프로모터, 덱사메타손(Dex) 유도성 마우스 유방암 바이러스(MMTV) 프로모터, T7 폴리머라제 프로모터 시스템(WO 98/10088); 엑디손 곤충 프로모터(No et al., 1996 Proc.Natl. Acad.Sci. USA, 93: 3346-3351), 테트라사이클린 억제성 시스템(Gossen et al., 1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89:5547-5551), 테트라사이클린 유도성 시스템(Gossen et al., 1995 Science, 268:1766-1769, 및 Harvey et al., 1998 Curr.Opin.Chem.Biol., 2:512-518), RU486 유도성 시스템(Wang et al., 1997 Nat. Biotech., 15:239-243 및 Wang et al., 1997 Gene Ther., 4:432-441) 및 라파마이신 유도성 시스템(Magari et al., 1997 J.Clin.Invest., 100:2865-2872)이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.

이러한 본 발명에 유용한 유도성 프로모터의 다른 종류로는 특정 생리적 상태, 예컨대 온도 또는 급성기에 의해 조절되거나 또는 복제성 세포에서만 조절되는 프로모터가 있다. 유용한 조직 특이적 프로모터로는 골격의 β-액틴, 미오신 경쇄 2A, 디스트로핀, 근육 크레아틴 키나제를 암호화하는 유전자 유래의 프로모터, 및 자연 발생의 프로모터 보다 높은 활성을 가진 합성 근육 프로모터가 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다(Li et al., 1999 Nat.Biotech., 17:241-245). 조직 특이적인 프로모터의 예는 간(알부민, Miyatake et al. 1997 J.Virol., 71:5124-32; B형 간염 바이러스 핵심 프로모터, Sandig et al., 1996 Gene Ther., 3: 1002-9; 알파-페토단백질(AFP), Arbuthnot et al., 1996 Hum.Gene Ther., 7:1503-14), 뼈(오스테오칼신, Stein et al., 1997 Mol.Biol.Rep., 24:185-96; 뼈 시알로단백질, Chen et al., 1996 J.Bone Miner. Res., 11:654-64), 림프구(CD2, Hansal et al., 1988 J.Immunol., 161:1063-8; 면역글로불린 중쇄; T 세포 수용체 α쇄), 신경세포(신경세포 특이적 에놀라제(NSE) 프로모터, Anderson et al., 1993 Cell.Mol.Neurobiol., 13:503-15; 신경섬유 경쇄 유전자, Piccioli et al., 1991 Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 88:5611-5; 신경세포 특이적 vgf 유전자, Piccioli et al., 1995 Neuron, 15:373-84) 등에서 알려져 있다. 이러한 상황에 유용한 공지의 프로모터의 다른 예는 국제 특허 공개번호 WO 00/55335호에 기술되어 있다.

본 발명의 핵산 서열, 분자 또는 벡터에 포함시킬 수 있는 다른 조절 서열로는 인헨서 서열, 폴리아데닐화 서열, 접목 공급체 서열과 접목 수용체 서열, 해독될 폴리펩타이드의 시작과 말단에 각각 위치한 전사 개시 부위 및 종결 부위, 전사된 영역에 존재하는 해독을 위한 리보솜 결합 부위, 에피토프 태그, 핵 국재화 서열, IRES 인자, 골드버그-호그니스(Goldberg-Hogness) "TATA" 인자, 제한 효소 절단 부위, 선택성 마커 등이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 인헨서 서열로는 예컨대 SV40 DNA의 72bp 직렬 반복서열 또는 레트로바이러스 장말단 반복서열 또는 LTR 등이 있으며, 전사 효율의 증가를 위해 사용한다. 프로모터 및 기타 다른 일반적인 벡터 인자의 선택은 통상적인 것으로서, 이러한 서열에는 본 발명에 유용한 뉴클레오타이드 분자와 벡터를 디자인하는데 이용가능한 다수의 서열이 있다.[예, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1989) 및 여기에 인용된 문헌, 예컨대 3.18 내지 3.26 및 16.17-16.27 및 Ausubel et al, Current Protocols in Molecualr Biology, John Wiley & Sons, New York(1989)]. 당업자라면 이러한 공지의 조절 서열 중에서 본 발명의 분자를 제조하는데 용이하게 선택하여 제조할 수 있을 것이다. 이러한 조절 서열의 선택은 본 발명에서 제한되지 않는다.

C. 본 발명의 P4 변형 단백질과 뉴클레오타이드 서열을 제조하는 방법

본 명세서에 개시된 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 및 P4 변형 단백질은 물론 이 뉴클레오타이드 분자 또는 P4 변형 단백질을 함유하는 조성물의 제조 또는 합성은 당업자라면 입수용이한 물질을 이용하여 용이하게 수행할 수 있는 것이다. 즉, 합성 방법은 본 발명에서 제한되지 않는다. 현재 바람직한 본 발명의 P4 변형 단백질을 암호화하는 서열의 합성예는 이하 실시예에 상세히 설명될 것이다.

본 발명의 P4 변형 단백질과 뉴클레오타이드 분자 및 서열은 화학적 합성법, 재조합 유전자조작법, 부위 지시성 돌연변이유발법 등과, 이 방법들의 조합에 의해 제조할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열/P4 변형 단백질은 다음의 문헌들에 기술된 바와 같은 공지의 화학적 합성법, 예컨대 고상 화학적 합성법 등을 이용하여 통상적인 방식으로 제조할 수 있다: Merrifield, 1963, J.Amer.Chem.Soc., 85:2149-2154; J.Stuart and J.Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, IL(1984); Matteucci et al., 1981, J.Am Chem. Soc. , 103: 3185; Alvarado- Urbina et al., 1980 Science, 214: 270; 및 Sinha, N. D. et al., 1984 NUCL. Acids Res. , 13: 4539, 등. 또한, 예컨대 PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed. , T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993; Wold, F.,"Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects", pgs. 1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed. , Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., 1990 Meth. Enzymol., 182: 626-646, and Rattan et al., 1992 Ann. N. Y. Acad. Sci., 663: 48-62를 참조할 수 있다.

또는, 본 발명의 조성물은 통상적인 분자생물학 기법인, 부위 지시성 돌연변이유발, 유전자 조작 또는 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하여, 예컨대 본 명세서에 제공된 정보를 이용하여 숙주 미생물 등에서 선택적인 다른 면역원 및 선택적인 담체 단백질과 함께 P4 변형 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 분자를 클로닝 및 발현하여 재조합 방식으로 작제할 수 있다(예컨대, Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2d Edit., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1997) 참조). P4 변형 단백질과 선택적 면역원의 암호 서열은 합성 방식으로 제조할 수 있다(W.P.C. Stemmer et al., Gene, 164:49(1995)). 또는 P4 야생형 단백질을 암호화하는 DNA는 본원에 참고인용되는 미국 특허 제5,780,601호에 기술된 바와 같이 헤모필러스 인플루엔자로부터 분리한 뒤 돌연변이유발시킬 수 있다.

일반적으로, 재조합 DNA 기법은 합성이나 분리에 의해 전술한 바와 같은 P4 변형 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 수득하는 단계 및 이 DNA 서열을 발현되는 적당한 벡터/숙주 세포 발현 시스템 내로 도입시키는 단계를 포함한다. 선택한 재 조합 벡터 내의 특정 부위에 프로모터와 다른 조절 제어 인자를 결찰시키기 위한 목적에는 발현 벡터에 DNA를 삽입하는 것과 관련하여 기술한 모든 방법을 사용할 수 있다. 본 발명의 재조합 P4 변형 단백질은 P4 리더 암호화 서열을 사용하거나 또는 리더 서열을 사용함이 없이(또는 전술한 바와 같이 지방산 아세틸화를 특정하지 않는 리더 서열을 사용하여) 각각 지질화된 단백질 또는 지질화되지 않은 단백질로서 제조할 수 있다.

본 발명의 P4 변형 단백질의 발현에는 다양한 숙주 세포-벡터 시스템을 사용할 수 있다. 합성 핵산 분자를 이용하여 본 발명의 P4 변형 단백질과 다른 조성물을 클로닝하고 발현하는 시스템에는 재조합 기술에 공지된 각종 미생물과 세포의 사용을 포함한다. 숙주 세포는 모든 생물학적 유기체, 예컨대 원핵(예, 박테리아) 세포 및 진핵 세포, 예컨대 포유동물세포, 곤충세포, 효모세포 등 중에서 선택할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 각종 방법과 조성물에 사용되는 세포는 박테리아 세포인 것이 좋다.

적합한 박테리아 세포에는 예컨대 대장균, 바실러스 및 스트렙토마이세스의 다양한 균주가 포함된다. 또한, 효모 세포, 예컨대 사카로마이세스 및 피키아와, 곤충 세포, 예컨대 Sf9과 Sf21 세포도 생산용으로 유용한 숙주 세포이다. 포유동물 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소 세포(CHO), NIH3T3, PER C6, NSO, VERO 또는 COS 세포 역시 적합한 숙주 세포이다.

벡터는 전술한 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터 중에서 하나를 선택하는 것이 가능하나, 사용되는 숙주 세포와 화합성이어야 한다. 재조합 DNA 벡터는 형질 전환, 형질도입 또는 형질감염(벡터/숙주 세포 시스템에 따라)을 통해 적당한 숙주 세포(박테리아, 바이러스, 효모, 포유동물 세포 등)로 도입시킬 수 있다. 숙주-벡터 시스템으로는 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 박테리아; 효모 벡터를 함유하는 효모와 같은 미생물; 바이러스(예, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스 등)로 감염된 포유동물 세포 시스템; 및 바이러스(예, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충세포 시스템이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

기타 다른 적합한 숙주 세포 및 형질전환, 배양, 증폭, 선별 및 산물 생산 및 정제에 대한 방법은 공지 기술을 참조하여 당업자라면 선택할 수 있을 것이다. [특히, 예컨대, Gething and Sambrook, 1981 Nature, 293:620-625 참조].

일반적으로, 숙주세포는 발현에 충분한 시간동안 배양 조건하에 유지시키는 것이 적당하다. 배양 조건은 당해 기술분야에 공지된 것으로서, 이온 조성과 농도, 온도, pH 등을 포함한다. 일반적으로, 형질감염된 세포는 배양 조건하에 배양 배지 내에서 유지시키는 것이 좋다. 각종 세포 종류에 적합한 배지는 당해 기술분야에 공지되어 있다. 바람직한 구체예로서, 온도는 약 20℃ 내지 약 50℃, 보다 바람직하게는 약 30℃ 내지 약 40℃, 보다 더 바람직하게는 약 37℃가 적당하다.

pH는 바람직하게는 약 6.0 내지 약 8.0이고, 보다 바람직하게는 약 6.8 내지 약 7.8 범위이며, 가장 바람직하게는 약 7.4이다. 삼투압은 바람직하게는 약 200 밀리오스몰/L(mosm/L) 내지 약 400 mosm/L, 보다 바람직하게는 약 290 mosm/L 내지 약 310 mosm/L 범위이다. 암호화된 단백질의 형질감염 및 발현에 필요한 기타 다른 생물학적 조건은 당해 기술분야에 공지되어 있다.

재조합 P4 변형 단백질은 숙주 세포 또는 이의 막에서 회수 또는 수거하거나 또는 세포가 배양된 배지로부터 회수 또는 수거한다. 회수는 재조합 P4 변형 단백질을 분리 및 정제하는 것을 포함한다. 폴리펩타이드의 분리 및 정제 기법은 당해 기술분야에 공지된 것으로서, 침전, 여과, 크로마토그래피, 전기영동 등과 같은 절차를 포함한다.

통상적인 재조합 수단으로 제조했을 때, 본 발명의 P4 변형 단백질은 통상적인 방법으로 세포나 그 배지로부터 분리 정제할 수 있는데, 그 예로는 크로마토그래피(예, 이온 교환, 친화성, 및 크기배제 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해성, 또는 기타 다른 단백질 정제의 표준 방법 등이 있다. 원핵세포로부터 이종 단백질을 정제하는 방법도 여러 가지가 있다. (미국 특허 제4,518,526호; 제4,599,197호; 및 제4,734,362호 참조). 그러나, 생산 정제된 제조물은 인간에게 유해할 수 있는 숙주의 독소가 실질적으로 없어야 한다. 특히, 대장균과 같은 그람 음성 박테리아 숙주 세포에서 발현될 때에는 정제된 펩타이드 또는 단백질에는 내독소 오염물이 실질적으로 제거되어야 한다.[예컨대, Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual., 2d Edit., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989). 참조].

본 발명의 방법과 조성물에 사용되는 P4 변형 단백질은 본 명세서에 기술된 임의의 구체적 방법으로 제조한 산물에만 제한되지 않는다. 사실상, 단백질은 상기 샘브룩 서적에 기술된 방법이나 본 명세서에서 인용된 다른 서적에 기술되어 있는 방법들로 제조할 수 있다. 이러한 용도의 단백질 조성물을 재조합 방식이나 합성 방식으로 분리 및 제조하는 기술은 당업자에게는 일반적인 것이다. 결과적으로 수득되는 조성물은 선택적인 임의의 면역원과 함께 면역원성 조성물로 제조한 다음, 하기 실시예에 기술되는 바와 같은 BC 검사와 같은 생체내 분석법으로 효능에 대해 선별할 수 있다. 또는, 전술한 바와 같이 제조한 단백질 및/또는 뉴클레오타이드 분자는 진단 분석에도 유용하게 사용할 수 있다.

D. 본 발명의 면역원성 조성물

본 발명의 P4 변형 단백질과 이를 암호화하는 핵산 분자는 다양한 면역원성 조성물로 사용하여 형별불능 H.인플루엔자에 대한 예방적 면역반응을 유도할 수 있다. 이와 같은 면역원성 조성물은 NTHi에 의해 유발되는 급성 중이염 및 기타 다른 질환에 대한 감수성을 억제 또는 감소시키는데 사용할 수 있다. 이 면역원성 조성물은 중이염에 대해 아동 또는 성인을 전신 면역화시키는데 유용하거나 또는 수축성 중이염에 걸릴 위험이 있는 아동(예컨대, 이염의 이력이 있는 아동)에게 유용할 것이다.

이러한 NTHi의 변형 P4 단백질은 이 P4 단백질을 암호화하는 hel 유전자가 H.인플루엔자 균주 내 및 균주 간에 항원 보존성이 있기 때문에 H.인플루엔자의 각종 형별가능 균주, 예컨대 H. 인플루엔자 b형에 대한 면역원성 조성물에도 사용하기에 적합하다.

이와 같은 면역원성 조성물은 1가 또는 다가 백신으로 제조할 수 있다. 이와 같은 조성물은 P4 변형 단백질을 암호화하는 핵산 분자 또는 그 단백질 자체 외에도, 다른 항원이나 이 다른 항원을 발현하는 뉴클레오타이드 분자를 함유한다. 이 와 같은 본 발명의 면역원성 조성물에 사용될 수 있는 추가 항원에는 다른 항원의 B 또는 T 세포 에피토프가 포함된다. 본 발명의 P4 변형 단백질과 함께 투여할 수 있는 상기 "다른 항원" 중에는 H.인플루엔자의 다른 항원, 예컨대 H.인플루엔자의 다른 외막 단백질(또는 이의 에피토프를 보유하는 펩타이드 또는 단백질)이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이와 같은 H.인플루엔자의 외막 단백질에는 15,000달톤의 펩티도글리칸 결합 외막 지단백질(PAL) 및 15,000 달톤의 헤모필러스 지단백질 PCP가 있다(Deich,R.A.et al. 1988 J.Bacteriol. 170(2): 489-498). "다른" 항원에는 또한 H.인플루엔자의 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드 캡슐 성분, 예컨대 폴리리보실리비톨포스페이트(PRP), 또는 H.인플루엔자 또는 다른 미생물의 리포폴리사카라이드, 리포올리고사카라이드 또는 리포사카라이드 성분이 포함될 수 있다. 본 발명의 면역원성 조성물에 포함될 수 있는 추가 "다른" 항원에는 다른 유기체(예컨대, 캡슐화 또는 비캡슐화된 박테리아, 바이러스, 진균 및 기생충)의 항원이 포함된다. 예컨데, 중이염에 관련된 다른 미생물의 항원, 예컨대, 스트렙토코커스 뉴모니아(예컨대, 비제한적으로 1 또는 그 이상의 공지된 스트렙토코커스 뉴모니아 폴리펩타이드, 리포폴리사카라이드-단백질 접합체 및 폴리사카라이드-단백질 접합체, 예를 들면 비제한적으로 현재 통용되는 23가 페렴구균 캡슐형 폴리사카라이드 백신 및 7가 폐렴구균 폴리사카라이드-단백질 접합체 백신), 스트렙토코커스 파이오제네스 그룹 A, 스타필로코커스 아우레우스, 호흡기 세포융합 바이러스 및 모라셀라 카타랄리스(예컨대, 비제한적으로 UspA1, UspA2, B1, C/D, E 및 74kDa 단백질)은 본 발명의 면역원성 조성물에 포함될 수 있다.

1. 면역원성 조성물에 유용한 P4 변형 단백질의 용도

P4 변형 단백질은 예방적 면역 반응을 유도하는 면역원성 조성물로 제조하는 것이 바람직하다. 즉, 일 구체예로서 본 발명의 면역원성 조성물은 약학적 허용성 담체에 전술한 바와 같은 1종 이상의 P4 변형 단백질을 함유하는 것이다. 이와 같은 제형에는 멸균수 또는 멸균된 등장성 식염수와 같은 약학적 허용성 담체와 혼합된 P4 변형 단백질이 포함된다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "약학적 허용성 담체"란 용어는 인간에게 투여하기에 적당한 모든 용매, 분산액, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수지연제 등을 포함하는 것을 의미한다. 적당한 담체는 당업자라면 쉽게 선택할 수 있는 것으로서, 대부분 투여 경로에 따라 취사선택되어진다.

제형에는 현탁제, 용제, 오일 또는 수성 매개체 중의 유제, 페이스트 및 이식성 지속방출형 또는 생물분해성 제형을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 제형은 추가로 1종 이상의 추가 성분, 예컨대 이에 제한되지 않는 현탁화제, 안정화제 또는 분산제 등을 함유할 수 있다. 비경구 투여용 제형의 경우에는, 활성 성분은 적당한 매개체(예, 발열원이 제거된 멸균수)로 복원한 뒤 복원된 조성물을 비경구 투여하는 것인 무수(즉, 분말 또는 과립) 형태로 제공하는 일 구체예가 있다. 다른 유용한 비경구 투여성 제형에는 미소결정형 중에, 리포좀 제제 중에, 또는 생물분해성 중합체 시스템의 일 성분으로서 활성 성분을 함유하는 것이 포함된다. 지속 방출형 또는 이식형의 조성물은 유제, 이온 교환 수지, 난용성 중합체 또는 난용성염과 같은 약학적 허용성 중합체 또는 소수성 성분을 함유할 수 있다.

본 발명의 단백질 면역원성 조성물에 사용할 수 있는 또 다른 성분으로는 보조제, 보존제, 화학적 안정화제 또는 다른 항원성 단백질이 있다. 일반적으로, 안정화제, 보조제 및 보존제는 표적 동물이나 인간 내에서 효능에 최적의 배합이 되도록 최적화한다. 적합한 보존제의 예로는 클로로부탄올, 소르브산칼륨, 소르브산, 이산화황, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀 및 파라클로로페놀이 있다. 사용할 수 있는 적합한 안정화제 성분으로는 예컨대 카스아미노산, 슈크로스, 젤라틴, 페놀 레드, N-Z 아민, 이인산일칼륨, 락토스, 락트알부민 가수분해물 및 탈지 분유 등이 있다.

면역 반응의 증강에는 통상적인 보조제를 사용할 수 있다. 이와 같은 보조제에는 특히 MPL^TM(3-O-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A; Corixa, Hamilton, MT)이 있는데, 이는 본원에 참고인용되는 미국 특허 제4,912,094호에 기술되어 있다.

또한, 본원에 참고인용된 미국 특허 제6,113,918호에 기술되고 코리사(Hamilton, MT)로부터 입수용이한 아미노알킬 글루코사민 포스페이트 화합물(AGP) 또는 이의 유도체 또는 유사체도 보조제로서 사용하기에 적합하다. 이러한 AGP 중 하나는 529(예전에는 RC529라고 불렸음)로 알려진 2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노]에틸 2-데옥시-4-O-포스포노-3-O-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일]-2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노]-b-D-글루코피라노사이드가 있다. 이 529 보조제는 수성 형태로서 또는 안정된 유제로서 제조되어 있다.

기타 다른 보조제에는 다음과 같은 것이 있다: 광유와 수성 유제, 알루미늄 염(명반), 예컨대 수산화알루미늄, 인산알루미늄 등, 암피젠(Amphigen), 아브리딘(Avridine), L121/스쿠알렌, D-락타이드-폴리락타이드/글리코사이드, 플루로닉(pluronic) 폴리올, 뮤라밀 디펩타이드, 사멸된 보르데텔라, 사포닌, 예컨대 Quil A 또는 Stimulon^TM QS-21(Antigenics, Framingham, MA.)[본원에 참고인용된 미국 특허 제5,057,540호에 기술되어 있음]; 및 이로부터 제조된 입자, 예컨대 ISCOMS(면역자극 복합체), 마이코박테리움 튜베르큘로시스, 박테리아 리포폴리사카라이드, 합성 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 CpG 모티프를 함유하는 올리고뉴클레오타이드(본원에 참고인용된 미국 특허 제6,207,646호에 기술되어 있음), 콜레라 독소(야생형 또는 돌연변이체 형태, 예컨대 본원에 참고인용된 국제특허 공개번호 WO 00/18434호에 따라 아미노산 위치 29의 글루탐산을 다른 아미노산, 바람직하게는 히스티딘으로 치환시킨 형태), 백일해 독소(PT), 또는 대장균 열불안정성 독소(LT), 구체적으로 LT-K63, LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129; 예컨대 본원에 참고인용되는 국제특허 공개번호 WO 93/13302 및 WO 92/19265호 참조. 각종 시토킨과 림포킨도 보조제로서 사용하기에 적당하다. 이러한 보조제 중 하나는 본원에 참고인용되는 미국 특허 제5,078,996호에 기술된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 가진 과립세포-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)가 있다. GM-CSF cDNA를 함유하는 플라스미드로 형질전환된 대장균은 기탁번호 39900하에 미국모식균배양수집소(ATCC)(미국 버지니아주 20110-2209, 마나사스 유니버시티 부울러바드 10801에 소재)에 기탁되어 있다. 시토킨 인터루킨-12(IL-12)는 본원에 참고인용된 미국 특허 제5,723,127호에 기술되 어 있는 또 다른 보조제이다. 기타 다른 시토킨 또는 림포킨은 면역 변조 활성이 있는 것으로 밝혀져 있으며, 그 예로는 인터루킨 1-알파, 1-베타, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17 및 18, 인터페론-알파, 베타 및 감마, 과립세포 콜로니 자극 인자 및 종양 괴사 인자 알파 및 베타가 있지만, 이에 국한되지는 않으며, 이들 모두 보조제로서 사용하기에 적당하다.

다른 적합한 보조제에는 표면 활성 물질(예, 헥사데실아민, 옥타데실아민, 옥타데실아미노산 에스테르, 리소레시틴, 디메틸-디옥타데실암모늄 브로마이드), 메톡시헥사데실글리세롤 및 플루로닉 폴리올; 폴리아민, 예, 피란, 덱스트란설페이트, 폴리 IC, 카르보폴; 펩타이드, 예, 뮤라밀 디펩타이드, 디메틸글리신, 터프트신; 유성 유제; 및 무기 젤, 예, 인산알루미늄 등과 면역 자극 복합체가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 면역원은 리포좀에 포함되거나 또는 백신 제형 용도로서 폴리사카라이드, 리포폴리사카라이드 및/또는 다른 중합체에 접합시킬 수 있다.

전술한 바와 같이, 추가 면역원성 성분으로서 전술한 1종 이상의 추가 항원이 선택적으로 포함될 수 있다. 다른 외막 단백질의 에피토프와 함께 혼합 투여하는 경우에는, P4 변형 단백질은 다른 항원과 혼합하여 별도로 투여하거나 또는 다른 H.인플루엔자 항원이나 H.인플루엔자 이외의 항원과 다중 외막 단백질 결정인자 또는 다중 항원성 결정인자를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체로서 투여할 수 있다. 예를 들면, H.인플루엔자 PAL 및 PCP 또는 이들 유래의 모든 단백질, 펩타이드 또는 에피토프는 본 발명의 P4 변형 단백질과 혼합물로서 또는 접합체나 융합체로서 투여할 수 있다.

본 발명의 P4 변형 단백질을 단독으로 또는 전술한 각종 배합물로 조제할 때, 면역원은 적당한 농도로 조정되고 임의의 적합한 보조제와 배합한다. 바람직한 일부 구체예에서 본 발명의 단백질 면역원성 조성물은 인체에 투여하기 위하여 예컨대 액제, 산제, 에어로졸, 정제, 캡슐, 장용피 정제 또는 캡슐이나 좌약 등의 형태로 제조하기도 한다.

2. 핵산 분자를 함유하는 면역원성 조성물

본 발명의 면역원성 조성물의 다른 구체예는 본 발명의 P4 변형 단백질을 암호화하는 핵산 분자와 약학적 허용성 담체를 함유한다. NTHi에 대한 면역원성 조성물에 사용하기 위한 P4 변형 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 적당한 약학적 또는 생리학적 허용성 담체, 예컨대 등장성 식염수 또는 등장성 염 용액에 함유될 수 있다. 적당한 담체는 당업자라면 잘 알고 있는 것으로서 주로 투여 경로에 따라 결정할 수 있다.

또는, 폴리뉴클레오타이드 분자로 이루어진 면역원성 조성물은 선택적으로 폴리뉴클레오타이드 촉진제 또는 "공동 제제"를 함유하는 것이 바람직한데, 그 예로는 국소 마취제, 펩타이드, 지질, 예컨대 양이온성 지질, 리포좀 또는 지질 입자, 다가양이온, 예컨대 폴리리신, 분지형 입체 다가양이온, 예컨대 덴드리머, 탄수화물, 양이온성 친양쪽성제, 세정제, 벤질암모늄 계면활성제, 또는 폴리뉴클레오타이드의 세포로의 전이를 촉진시키는 기타 다른 화합물이 있다. 이러한 본 발명에 유용한 촉진제 또는 공동 제제의 비제한적 예는 본원에 참고인용된 미국 특허 제5,593,972호; 제5,702,055호; 제5,739,118호; 제5,837,533호; 국제특허 공개번호 WO96/10038(1996.4.4); 및 국제특허 공개번호 WO94/16737(1994.8.8)에 기술되어 있다.

가장 바람직하게는, 국소 마취제가 핵산 분자와 1종 또는 그 이상의 복합체를 형성하는 양으로 제공되는 것이 좋다. 국소 마취제가 본 발명의 핵산 분자 또는 플라스미드와 혼합되는 경우에는 국소 마취제는 DNA에 채워져 균일성인 다수의 소형 복합체 또는 입자를 형성하게 된다. 즉, 본 발명의 면역원성 조성물에 대한 일 구체예에서 복합체는 국소 마취제와 본 발명의 적어도 1종의 플라스미드를 혼합하여 제조하는 것이다. 이 혼합물에서 산출되는 임의의 단일 복합체는 여러 플라스미드의 다양한 조합을 함유할 수 있다.

또는, 본 발명의 조성물의 다른 구체예로서, 모든 플라스미드가 단일 환괴 투여 형태로 투여되어야 한다면 국소 마취제는 각 플라스미드와 각각 예비혼합한 뒤, 플라스미드의 바람직한 비율이 단일 면역원성 조성물에 함유되도록 각 혼합물을 배합하여 단일 조성물을 수득할 수 있다. 또는, 국소 마취제와 각 플라스미드를 별도로 혼합하고 바람직한 비율로 별도로 투여할 수도 있다. 이하, 이러한 면역원성 조성물의 구체예를 설명하는데 사용된 "복합체" 또는 "1종 또는 그 이상의 복합체" 또는 "복합체들"이란 용어는 각 복합체가 P4 변형 단백질 암호화 플라스미드의 혼합물을 함유하는 1종 또는 그 이상의 복합체이거나 또는 각각 제조된 복합체의 혼합물(여기서 각 복합체는 단지 1종의 플라스미드만을 함유함)이거나 또는 각 복합체가 폴리시스트론성 DNA를 함유하는 하나의 복합체 또는 이 복합체들의 혼합물인 것을 의미한다.

복합체는 직경이 약 50 내지 약 150nm인 것이 바람직하다. 사용된 촉진제가 국소 마취제, 바람직하게는 부피바카인인 경우에, 그 함량은 폴리뉴클레오타이드 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.1중량% 내지 약 1.0중량% 범위인 것이 바람직하다. 본원에 참고인용된 국제특허 공개번호 WO99/21591호에서는 공동 제제로서 벤질암모늄 계면활성제를 바람직하게는 약 0.001 내지 0.03wt%의 양으로 투여하는 것을 교시하고 있다. 본 발명에 있어서, 국소 마취제의 함량은 상기 핵산 분자에 대한 비율로서, 핵산 1 내지 10 ㎍/ml에 대하여 국소 마취제 0.01 내지 2.5w/v% 이다. 또 다른 범위는 핵산 100㎍/ml 내지 1ml/ml에 대하여 국소 마취제 0.05 내지 1.25w/v% 이다.

이러한 폴리뉴클레오타이드 면역화 절차에서, 본 발명의 P4 변형 단백질은 생체내에서 일시적 체제로 발현되는 것으로서, 즉 숙주의 염색체에 유전자 물질의 삽입이나 통합은 일어나지 않는다. 따라서, 이러한 절차는 염색체에 당해 유전자 물질의 삽입이나 통합을 목표로 하는 유전자 치료와는 구별되는 것이다. 이에 따라 면역화에 의해 투여된 폴리뉴클레오타이드가 숙주 내에서 형질전환된 표현형을 발생시키지 않는지를 확인하기 위한 분석이 필요하다(미국 특허 제6,168,918호).

면역원성 조성물은 또한 조성물의 선택한 투여 방식에 적합한 다른 첨가제를 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물에는 동결건조된 폴리뉴클레오타이드가 사용될 수 있는 바, 분말, 액제 또는 현탁제 투여 형태를 제조할 수 있는 다른 약학적 허용성 부형제가 함께 사용될 수 있다. 이에 대해서는 본원에 참고인용된 서적[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Vol.2, 19th edition(1995), 예, Chapter 95 Aerosols; 및 국제 특허 공개번호 WO99/45966]을 참조할 수 있다. 이러한 조성물의 투여 경로는 필요한 경우에는 조합시킬 수도 있고 또는 조정할 수도 있다.

전술한 바와 같이, 이러한 핵산 분자 함유 면역원성 조성물은 선택적으로 1종 이상의 전술한 "추가" 항원을 암호화하는 핵산 서열을 함유할 수 있다. 예를 들어, 각 항원을 암호화하는 각 뉴클레오타이드 분자를, P4 변형 단백질을 암호화하는 서열을 함유하는 뉴클레오타이드 분자와 혼합할 수 있다. 또는, P4 변형 단백질을 암호화하는 서열을 다른 박테리아, 바이러스, 기생충 또는 진균류의 항원이나 H.인플루엔자의 다른 항원 중 1종 이상을 암호화하는 DNA 서열에 융합하여 유전자적으로 융합된(공통 펩타이드 주쇄를 공유함) 다가 항원을 작제할 수도 있다.

이러한 핵산 분자 함유 면역원성 조성물은 임의의 통상적인 투여 경로를 통해 투여하기에 적합한 첨가제를 함유할 수 있다. 바람직한 일부 구체예에서 본 발명의 면역원성 조성물은 예컨대 액제, 산제, 에어로졸, 정제, 캡슐, 장용피 정제 또는 캡슐이나 좌약의 형태로 인체에 투여할 수 있도록 제조한다.

3. 재조합 바이러스 함유 면역원성 조성물

본 발명의 또 다른 양태로서, 면역원성 조성물은 P4 변형 단백질(및/또는 임의의 추가 면역원)을 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 분자를 숙주 세포로 운반할 수 있도록 유전자 조작된 적합한 비병원성 바이러스로는 폭스바이러스, 예컨대 백시니아, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러서, 카나리폭스 바이러스, 레트로바이러스 등이 있다. 투여용인 경우에, 바이러스 는 유전자 치료에 사용되는 것 중에서 전형적인 비복제성 바이러스, 예컨대 E1 결실된 아데노바이러스인 것이 바람직하다. 예컨대, 재조합 복제 결손형 아데노바이러스는 미국 특허 제5,698,202호 등에 기술되어 있다. 이러한 비병원성 바이러스는 다양한 종류가 일반적으로 인간 유전자 치료에, 다른 백신 제제의 담체로서 사용되며, 당업자에게 공지되어 있어 선택하여 사용할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 P4 변형 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 보유하는 비복제성 바이러스는 생물학적 화합성 용액이나 약학적 허용성 전달 매개체에 현탁시킨 것이 좋다. 적합한 매개체는 멸균 식염수이다. 기타 다른 약학적 허용성 담체로 당업자에게 공지된 수성 및 비수성 등장성 멸균 주사 용제와 수성 및 비수성 멸균 현탁제도 본 목적에 이용할 수 있다.

경우에 따라, 이러한 종류의 본 발명의 면역원성 조성물에는 예컨대 전술한 바와 같은 보조제, 안정화제, pH 조정제, 보존제 등의 다른 성분을 배합할 수도 있다. 이러한 성분들은 백신 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있다.

본 발명에 따른 면역원성 조성물에 적합한 또 다른 구체예는 불활성화된 면역원성 조성물의 사용에 관한 것으로서, 이 조성물은 예컨대 목적한 P4 변형 단백질을 발현하는 다량의 재조합 바이러스를 배양물에서 증식시켜 필요한 양의 관련 항원을 수득한 뒤 통상적인 방법으로 불활성화시킨 것이다. 여러 에피토프를 발현하는 불활성화된 바이러스 혼합물은 본원에 참고인용된 미국 특허 제5,780,601호에 기술된 바와 같이 "다가" 면역원성 조성물의 제형에 사용할 수 있다. 이러한 면역원성 조성물에는 또한 전술한 바와 같은 적합한 보조제를 함유하여 항원에 대한 면 역원성 반응을 증강시킬 수도 있다.

4. 공생 박테리아 함유 면역원성 조성물

본 발명의 또 다른 양태로서, P4 변형 단백질(임의의 융합 단백질 및/또는 추가 항원을 포함하는)을 암호화하는 본 발명의 합성 핵산 분자는 비병원성 미생물에 병입시킬 수 있다. 그 결과 얻어지는 미생물은 인간 숙주에 투여하면 생체내에서 본 발명의 조성물을 발현하고 발현된 조성물을 복제하여 특정 항체 형성을 유도한다. 예를 들면, 본 발명의 P4 변형 단백질 암호 분자를 운반하는데 사용할 수 있고 환자에게 투여하기에 유용한 비병원성 공생 박테리아는 통상적인 방법을 사용하여 제조할 수 있고, 공지된 비병원성 미생물 중에서 선택할 수도 있다. 본 발명의 핵산 분자를 환자에게 생체 내로 외인적 전달(exogenous delivery)하는데 유용할 수 있는 공생 박테리아 중에는 스트렙토코커스의 각종 균주, 예컨대, S.고도니(S.gordonii) 또는 대장균, 바실러스, 스트렙토마이세스 및 사카로마이세스 등이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.

전술한 바와 같은 본 발명의 면역원성 조성물은 전술한 바와 같은 종류의 약학적 제제에 유용한 통상적인 생리학적 허용성 담체, 보조제 또는 다른 성분을 선택함에 있어 특별한 제한이 없다. 이러한 약학적 허용성 조성물을 전술한 성분들로부터 적당한 pH 등장성, 안정성 및 다른 통상적인 특성으로 제조하는 방법은 당업자에게 공지된 것이다.

E. 사용 방법

전술한 면역원성 조성물은 인간 중에서 형별불능 H.인플루엔자에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 사용할 수 있다. 이러한 방법의 일 구체예로서, 전술한 유효량의 P4 변형 단백질 면역원성 조성물을 환자에게 투여한다. P4 단백질, P4 변형체 발현 핵산 분자 또는 P4 변형체 발현 재조합 바이러스의 조성물 내 함량은 NTHi에 대한 면역 반응을 유도하기에 효과적인 양이다. 이 면역 반응은 NTHi 감염에 대하여 예방성인 것이 바람직하다.

본 발명의 면역원성 조성물의 투여 경로에는 비경구 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장 투여, 질 투여 등이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 모든 경로가 본 발명의 조성물을 투여하는데 적합하다. 적당한 경로는 사용된 면역원성 조성물의 성질과 환자의 연령, 체중, 성별 및 일반적 건강 상태 평가 및 면역원성 조성물에 존재하는 항원과 유사 요인들에 따라 담당의에 의해 선택될 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 면역원성 조성물의 적당한 "유효량" 또는 투여량의 선택은 특히 면역화된 피검체의 일반적 건강과 체중을 비롯한 피검체의 신체 상태 뿐만 아니라 사용되는 특정 면역원성 조성물에 기초하여 결정할 수 있다. 이와 같은 유효량의 선택과 상향 또는 하향 조절은 당업자에게 일반적인 일이다. 뚜렷한 부작용 없이 환자에게 면역 반응, 바람직하게는 예방적 반응을 유도하거나 또는 외인적 효과를 얻는데 필요한 활성 성분의 양은 사용된 약학적 조성물과 보조제의 선택적 존재에 따라 달라진다(단백질 함유 조성물의 경우).

일 구체예에서, 단백질 성분, 예컨대 전술한 바와 같은 P4 변형 단백질이나 융합 단백질을 함유하는 조성물의 경우에는 각 용량은 멸균 용액 1ml 당 단백질 면역원 약 1㎍ 내지 약 20mg을 함유하는 것이다. 또한, 당업자라면 다른 투여량 범위도 생각할 수 있다. 1차 용량 이후 선택적으로 필요하다면 반복 추가항원접종을 실시할 수도 있다.

다른 구체예에서, DNA 및 벡터 조성물 중의 뉴클레오타이드 분자의 양은 당업자라면 선택하고 조정할 수 있다. 일 구체예에서, 각 용량은 멸균 용액 1ml 당 면역원 암호화 핵산, 예컨대 DNA 플라스미드 약 50㎍ 내지 약 1mg을 함유할 수 있다.

본 발명의 P4 변형 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 함유하는 재조합체, 바람직하게는 복제 결손형 바이러스인 경우, "유효량"은 피검체의 목적 세포를 형질감염시키기 위한 투여 경로에서 효과적이고 선택된 유전자가 효능, 즉 예방적 면역성을 제공하기에 충분한 수준의 발현을 나타내는 재조합 바이러스의 양이다. 면역성의 수준은 필요한 경우 추가 접종의 필요성을 결정하기 위해 모니터할 수 있다. 하지만, 당업자라면 이러한 투여량을 재조합 바이러스의 본질과 면역원의 구성(즉, 재조합 바이러스가 숙주에게 전달하는 추가 P4 변형 단백질이나 "다른 항원"의 존재)에 따라 조정할 수 있음은 당연한 것이다.

환자에게 전달할 P4 변형 단백질을 발현하는 핵산 서열을 보유한 공생 박테리아의 양은 일반적으로 약 10³ 내지 약 10¹² 세포/kg 범위이다. 이 투여량은 사용되는 박테리아와, 생 박테리아에 의해 숙주에게 전달되는 추가 P4 변형 단백질 또는 "다른 항원"에 따라서 당업자에 의해 조정될 수 있다.

F. 담체 단백질로서 P4 변형체의 사용

1차 면역원으로서의 용도 외에도 P4 변형 단백질은 다른 항원의 면역원성을 부여하거나 향상시키기 위한 담체 단백질로서 사용될 수 있는데, 여기서 다른 항원은 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 사카라이드, 리포폴리사카라이드, 리포올리고사카라이드 또는 리포사카라이드일 수 있다. P4 변형 단백질은 야생형 P4 단백질에 비해 감소된 효소 활성을 보유하지만, 반드시 야생형 P4 단백질에 대한 항체를 유도하거나 NTHi에 대한 살균 활성을 나타낼 필요는 없으며, 단, P4 변형 담체 단백질에는 서열번호 3의 아미노산 위치 122에 페닐알라닌을 보유하지 않아야 한다. 예를 들면, P4 변형 단백질은 통상적 수단을 통해 폴리사카라이드 또는 리포폴리사카라이드에 화학적으로 접합되거나 또는 다른 단백질과의 융합 단백질로서 발현되는 것이다.

G. 진단 검사

본 발명의 P4 변형 단백질과 핵산 분자는 경우에 따라 면역 복합체 또는 DNA 하이브리드화의 형성을 검출할 수 있는 성분이나 검출가능한 표지에 결합되어, 각종 조직과 체액, 예컨대 혈액, 척수액, 타액 등에서 형별불능 H.인플루엔자를 검출하기 위한 검사에서 항원으로서 사용할 수 있다. 이러한 분석법 및 분석 형식은 공지된 것으로서, 미국 특허 제5,780,601호에 기술된 바와 같은 야생형 P4 시약의 사용에 대해 기술한 것과 동일한 형식일 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 P4 변형 단백질은 방사성면역분석, ELISA 분석, "샌드위치" 검사, 침강소 반응, 겔 확산 침강소 반응, 면역확산 분석, 응집 분석, 형광 면역분석법, 단백질 A 면역분석법 및 면역전기영동 분석법의 시약으로 사용할 수 있다. 본 발명의 P4 변형 단백질에는 경우에 따라 검출가능한 표지가 결합되기도 한다.

본 발명의 P4 변형 단백질을 암호화하는 핵산 분자 또는 이와 하이브리드하는 모든 뉴클레오타이드 서열은 환자의 다양한 조직이나 체액에서 형별불능 H.인플루엔자를 검출하기 위한 핵산 하이브리드화 분석에서 탐침(probe)으로서 사용할 수도 있다. 적합한 하이브리드화 분석에는 서던 블롯, 노던 블롯 및 콜로니 블롯 등이 있으며 이에 국한되는 것은 아니다. 하이브리드화의 엄중도는 분석의 필요 조건에 따라 달라질 수 있다.

적합한 검출성 표지로는 단독적으로 또는 다른 분자나 단백질과 함께 작용하여 검출가능한 신호를 직접 또는 간접적으로 제공할 수 있는 단백질이나 작은 화학 분자를 포함하며, 이에 국한되는 것은 아니다. 예컨대, 검출성 표지는 형광성 표지, 발광성 표지, 방사성표지 또는 화학발광성 표지일 수 있다. 표지는 또한 기질과 상호작용하여 검출성 신호를 나타내는 효소일 수 있다.[예컨대, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Ed., R. P. Haugland, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR (1996); U. S.특허 제4,542,104호 및 제5,272,257호 참조]. 또 다른 표지로는 녹색 형광성 단백질과 청색 형광성 단백질이 있다. 핵산 분자에 적합한 표지는 lux 유전자, 베타-락타메이스, 갈락토시다제 효소, 예컨대 베타-갈락토시다제(LacZ), 알칼리 포스파타제, 티미딘 키나제, 녹색 형광성 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제(CAT), 루시퍼라제 효소 또는 글루코나제 효소를 암호화하는 DNA 서열일 수 있다.

본 발명의 P4 변형 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및/또는 P4 변형 단백질에 결합시키기 위하여 통상적으로 이용되는 추가 마커 시스템을 임의의 수로 채택하여도 좋다. 당업자는 표지 시스템의 선택 및/또는 실행에 단지 통상적인 실험만이 필요하다는 것을 잘 알고 있다.

다음의 실시예는 본 발명에 기재한 대표적인 P4 변형 단백질의 생산 및 활성을 예시한 것이다. 제시한 실시예는 P4 변형 단백질을 암호화하는 분리된 뉴클레오타이드 분자의 작제, 숙주 세포에서의 재조합체 발현 및 이로부터의 정제를 설명하고 있다. 정제한 단백질은 민감한 비색 분석법으로 효소 활성에 대하여 분석하였다. 또한, 이 단백질을 야생형 rLP4와 함께 스위스-웹스터 마우스의 면역화에 사용하고, 그 결과 얻어지는 항혈청을 야생형 rLP4에 대한 총 IgG 항체와 NTHi에 대한 살균 활성에 대하여 분석하였다. 그 결과, 이 실시예들은 효소 활성이 결여되지만 야생형 면역원성과 기능적 항체 유도는 유지하는 P4 돌연변이체의 결정이 중요한 문제임을 입증하고 있다. 이하에 설명하는 바와 같이 작제한 돌연변이 P4 단백질 중 3가지는 바람직한 면역학적 성질을 나타내었는데, 즉 야생형 P4에 대한 높은 ELISA 역가 및 다량의 NTHi에 대한 살균 항체를 유도하였다. 당업자라면 이하 실시예에서 특정 시약과 조건이 기술되고 있지만, 이러한 시약과 조건에만 본 발명이 한정되는 것은 아님은 잘 알고 있을 것이다.

실시예 1: P4 유전자의 부위 지시성 돌연변이유발

박테리아의 산 포스파타제는 여러해 동안 충분히 연구되어, 기질 특이성, 세포의 위치 등에 따라 여러 종류로 나뉘어져 있다(Thaller,M.C. et al., 1998. Prot.Sci., 7:1647-52.9). 여러 박테리아의 산 포스파타제 사이에 고도로 보존적인 아미노산이 존재하는 영역은 효소 활성을 제거하거나 감소시키지만 보존적 변화를 수행하여 3차 구조는 유지되도록 하는 부위 지시성 돌연변이유발이 유망한 영역으로서 동정되었다.

부위 지시성 돌연변이유발은 BsmB1 부위와 아래에 기술하는 바와 같은 목적한 돌연변이를 도입시키기 위하여 합성 프라이머를 사용한 다음 야생형 P4에 대하여 수행하였다. BsmB1 분해 및 재결합을 수행한 결과 BsmB1 부위는 상실된 목적한 돌연변이 P4 서열을 수득하였다. 이러한 지질화된 돌연변이 단백질을 대장균 BLR 숙주 세포에서 발현시킨 후, 지질화된 야생형 rLP4를 정제하는데 사용된 표준 절차를 약간 변형하여 정제하였다.

구체적으로, 산 포스파타제 활성에 야생형 P4 단백질 중의 2개의 아스파르트산 잔기가 중요한 역할을 한다는 자료에 근거하여 2개의 아스파르트산 부위 지시성 돌연변이체를 작제하였다. 서열번호 3의 Asp64 및 Asp66 위치에 있는 아미노산 잔기를 Ala64 및 Ala66A로 변화시켜 P4-351이라는 돌연변이체를 작제하였다. 또한, 서열번호 3의 야생형 Asp184와 Asp185를 Ala184와 Ala185로 돌연변이시킨, P4-D184A,D185A라는 돌연변이체도 작제하였다. 또 다른 돌연변이체로서, 서열번호 3의 아미노산 잔기 35 및 37을 부위 지시성 돌연변이유발로 처리하여 알라닌 잔기가 글루탐산(A35G,A37G), 트레오닌(A35T,A37T), 아스파라긴(A35D,A37D) 또는 글루타민 (A35Q,A37Q)으로 변화한 4개의 단백질을 수득하였다. 이러한 돌연변이체는 Asp에서 Ala으로의 변화 이외의 다른 영역의 변화가 단백질 분자의 구조 붕괴를 더 줄임으로써 야생형 P4에 대한 보다 양호한 면역원성을 산출할 수 있는지를 측정하기 위한 것이다.

또한, P4 단백질에 다음과 같은 단일 돌연변이를 수행하여 P4 변형 단백질 N218Q, K161Q, D64E, Y122F, D64N, D64E 및 Q39E를 수득하였다. 또한, 위치 48의 Phe 잔기를 Cys 잔기로 변화시켰다. 이 잔기는 헤민 결합 도메인으로 추정되는 위치에 존재하기 때문에 돌연변이유발을 위해 선택하였다.

이러한 다양한 돌연변이체로부터 돌연변이 단백질이 발현 생산되었고, 표 1에 요약하였다.

표 1

P4 돌연변이체의 변형 단백질 및 돌연변이

F48C 및 D64A,D66A를 제외한 모든 부위 지시성 돌연변이체는, 야생형 형별불능 H.인플루엔자(NTHi) P4 유전자(Green, B. A., et al., 1991. Infect.Immun., 59:3191-3198)를 아라비노스 프로모터의 제어하에 함유하는 pBAD18Cam 발현 벡터인 플라스미드 pLP339로부터 수득하였다. 돌연변이 단백질 D64A,D66A 및 F48C는 플라스미드 pHel3으로부터 수득하였다(Reilly et al., 1999. 상기 문헌 참조).

대부분의 부위 지시성 돌연변이 단백질은 QuickChange 돌연변이유발 키트(Stratagene)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 작제하였다. P4 돌연변이를 작제하는데 사용한 프라이머는 하기 표 2에 제시하였다. 본 실험에 사용한 올리고뉴클레오타이드 프라이머(상기 인용된 Reilly et al., 1999에서 사용된 것은 제외)는 β-시아노에틸포스포아미다이트 화합물을 사용하여 PerSeptive Biosystems 올리고뉴클 레오타이드 합성기(Applied Biosystems, Foster City, CA)로 합성하였다.

표 2

hel 유전자의 부위 지시성 돌연변이유발에 사용한 프라이머

일부 P4 돌연변이체 생산에는 BsmBI 무봉합 클로닝을 사용하였다. P4 유전자 섹션은 플라스미드 pLP339로부터 폴리머라제 연쇄반응(PCR)(PE2400 thermal cycler, Applied Biosystems, Foster City, CA)으로 증폭시켰다. 먼저, BsmBI 부위와 목적한 돌연변이를 함유하는 프라이머를 적당한 벡터 프라이머와 쌍을 형성시킨 다음, 상기 P4 유전자 섹션의 증폭에 사용하였다. 또한, BsmBI 부위를 함유하는 제 2 프라이머를 적당한 벡터 프라이머와 쌍을 형성시킨 다음 P4 유전자의 나머지 섹션을 증폭시키는데 사용하였다. P4 유전자의 각 섹션을 연결한 뒤 pCR2.1-TOPO(Invitrogen)에 클로닝하였다.

형질전환체는 PCR로 삽입체 존재를 선별하고 서열분석하여 확인하였다. 정확한 클론을 BsmBI 및 SacI 또는 SphI(New England Biolabs에서 제공한 제한 효소)로 제한분해하고 삽입체를 저융점 아가로스 겔로 정제하였다. 겔 정제된 단편을 BsmBI 부위에 무봉합적으로 연결시켰다.

pCR2.1-TOPO에 클로닝된 돌연변이 P4 유전자는, SacI-SphI 부위를 이용하여 F48C 유전자를 제외한 돌연변이 P4 단백질을 발현시키기 위해 pBAD18Cam(Invitrogen)에 서브클로닝하였다. F48C 서열은 Nhe-SacI 부위를 사용하여 pBAD18Cam에 서브클로닝하였다.

실시예 2: 지질화된 재조합 돌연변이체 P4 단백질의 발현

이와 같은 돌연변이체 P4 단백질을 함유하는 플라스미드를 이용하여 대장균 균주 BLR을 형질전환시켜 모든 돌연변이체 P4 단백질을 내부적으로 재조합 발현시켰다. 그 다음 P4 유전자의 서열분석을 통해 클론을 확인하였다. 적당한 플라스미드를 함유하는 BLR의 철야 배양물을 0.05% 글루코스와 30㎍/ml 클로람페니콜을 함유하는 NaPO₄로 완충화된 Hy-Soy 배지에서 37℃, 호기조건하에 증식시켰다. 글루코스를 뺀 동일 배지를 주입한 플라스크에는 철야 배양물의 1:20 희석물을 접종하고 OD₆₀₀이 약 2.0에 도달할 때까지 호기 조건하에 37℃에서 배양하였다. 그 다음, 박 테리아를 0.5% 아라비노스로 유도하고 3시간 동안 항온배양하였다. 10,000xg, 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 박테리아 세포를 수거하고 세포 펠릿을 PBS로 1회 세척하였다. 세포를 재펠릿화하여 -20℃에 동결보관하였다. 12% 겔을 이용한 SDS-PAGE로 전세포 용균물을 분석하여 P4 단백질의 발현을 조사하였다.

실시예 3: 지질화된 재조합체 P4 및 돌연변이체의 정제

P4 돌연변이체 단백질은 다음과 같이 정제하였다: 상기 대장균 세포를 저장성(低張性) 완충액(10mM HEPES-NaOH, pH 7.4, 1mM Na₂EDTA)에 현탁하고, 이 세포 현탁액을 고압(약 18,000 psi)하에 마이크로플루다이저를 통해 통과시켜 용균시켰다. 이 용균물을 베크만(Beckman) 45Ti 로터로 10℃, 300,000xg에서 1시간 동안 초원심분리하여 막을 수득하였다. 이 막을 10mM HEPES-NaOH(pH 7.4), 1mM MgCl₂ 중의 1%(w/v) 트리톤 X-100과 50mM Tris-HCl(pH 8), 5mM Na₂EDTA 중의 1%(w/v) Zwittergent 3-12로 연속 추출하여 내막과 외막을 별도로 각각 용해시켰다. rLP4 또는 돌연변이체 단백질은 쯔비터전트 3-12 추출물에 용해되었다.

이 목적 단백질은 직렬의 이온 교환 컬럼(DEAE와 SP-세파로스) 상에서 분별 정제하였다. rLP4 단백질은 SP-세파로스로부터 0 내지 0.2M 염 구배에서 제1형과 제2형으로 표시한 2개의 피크로 용출되었다. 제2형은 10mM Na 포스페이트, pH 7.1, 150mM NaCl, 1% 쯔비터전트 3-12 완충액에서 서서히 동결시킨 다음 Tris-EDTA-쯔비터전트 3-12 완충액(pH 8)으로 투석시킨 결과 제1형으로 전환되었다. 전환된 제1형은 SP-세파로스 컬럼을 통해 추가 정제하였다. rLP4 돌연변이체의 정제에는 돌연변 이가 단백질의 pI를 감소시키는 경우를 제외하고는 야생형 단백질과 동일한 방법을 사용하였다. pI를 감소시키는 경우에는, 추출 후 직렬 컬럼 단계 이전에 완충액을 10mM HePES-NaOH, pH 7.4, 1mM Na₂EDTA, 1%(w/v) 쯔비터전트 3-12로 변화시켰다. 이 완충액은 또한 SP-세파로스 컬럼으로부터의 용출에도 사용하였다. 대부분의 rLP4 돌연변이체는 하나의 단백질 피크에서 용출되었다. 단백질은 비신코닌산 분석법을 사용하여 제조자의 지시(Pierce)에 따라 분석하였다.

실시예 4: 포스파타제 활성 분석

정제한 P4 돌연변이체 단백질의 효소 활성은 민감한 유동상 분석법으로 조사하였다. rLP4의 포스포모노에스테라제 활성은 실질적으로 리일리(Reilly) 등의 문헌(상기 인용 문헌, 1999)에 기술된 바와 같은 비색 분석법으로 야생형 rLP4와 비교하여 측정하였다. 이 분석법의 완충액에 1%(w/v) Triton X100을 첨가하여 rLP4의 활성을 향상시켰다. 생산된 p-니트로페놀의 함량(nmol)은 410nm에서의 흡광도를 p-니트로페놀 표준 곡선에서의 흡광도와 비교하여 결정하였다. 효소 활성 1 유닛은 37℃에서 1분 당 기질 1μmol을 산물로 전환시키는데 필요한 활성의 양으로 정의하였다. 비활성은 단백질 1mg 당 효소 유닛(unit)의 수로 정의하였다. 또한 결과는 야생형 활성의 비율(%)로 표현하였고, 하기 표 3에 제시하였다.

표 3

rLP 돌연변이체의 비활성(pNPP 분석법)

박테리아 산 포스파타제들 중에서 보존적인 것으로 선발된 P4의 특정 잔기에 대해 실시된 Y122F 돌연변이를 제외한 모든 변화는 P4의 효소 활성을 거의 완전히 제거하였다. 시험된 나머지 돌연변이체 중에서 Q39E 돌연변이체만이 야생형 활성(3.3%) 중 1% 보다 많은 활성을 보유하였고, 2중 돌연변이체는 검출가능한 활성을 나타내지 않았다.

이러한 결과는 박테리아 산 포스파타제 중에서 보존되는 P4 영역 내의 하전과 3차 구조가 효소 기능에 중요한 역할을 하는 것임을 시사한다. Asp 잔기의 Glu 잔기로의 변화와 같은 보존적 변화일지라도, 변화가 보존적 Asp 잔기에 이루어진 경우에는 효소 활성이 거의 완전히 제거되었다.

본 발명자들은 Y122F 및 Q39E 돌연변이체를 제외하고는 효소 활성이 부분적으로 감소된 돌연변이체를 검출하지 못했다. 사실상 모든 돌연변이가 활성을 거의 완전히 제거하였다. 또한, F48을 시스테인이나 세린 잔기로 변화시키는 돌연변이도 효소 활성을 감소시켰다.

실시예 5: 지질화된 RLP4 돌연변이체 단백질에 대한 항혈청 생산

돌연변이체 P4 단백질을 그 다음 모노클론 항체(Mab)와의 반응성과 야생형 P4에 대한 고도 역가의 생물학적 활성 항혈청을 유도하는 능력에 대해 분석하였다,

A. 면역화 절차

식염수 또는 PBS에 100㎍ MPL^TM 보조제와 혼합한 야생형 또는 돌연변이체 P4 단백질 15㎍을 스위스 웹스터 암컷 마우스(6 내지 8주령)에게 피하주사하여 면역화시켰다. 상기 주사 조성물에는 보존제로서 0.01% 티메로살을 첨가하였다. 4주 간격으로 면역화를 2회 수행한 다음, 마지막으로 6주째 혈액을 채취하였다. 0주 및 6주째 혈청을 개별적으로 또는 푸울로서 ELISA 분석법으로 분석하고 푸울의 살균 활성도 분석하였다.

B. 효소 결합된 면역흡착 분석법(ELISA)

항 P4(야생형 및 돌연변이체) 항체는 다음과 같이 측정하였다. PBS에 희석시킨 1㎍/ml 야생형 P4 또는 12㎍/ml 돌연변이체 P4를 평판에 코팅하였다. 90분/37℃ 항온처리 후, 평판을 다음 날까지 4℃에 보관하였다. 돌연변이체 P4 코팅된 평판은 탈지분유로 차단시켰다. 세척 후, 최종 농도 1:50 내지 1:5,467,500이 되게 PBS/0.05% Tween 20으로 연속 희석한 혈청 100㎕ 일정량을 각 웰에 첨가하고 실온 에서 2시간 동안 항온처리하였다. 평판을 세척하고 2차 항체(PBS/0.05% Tween20으로 1:5,000의 비율로 희석한 알칼리 포스파타제 결합된 염소 항마우스 IgG) 100㎕를 첨가한 뒤 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다.

세척 후, 결합된 항체는 디에탄올아민에 1mg/ml의 농도로 희석한 기질 pNPP(p-니트로페놀 포스페이트)로 검출하였다. 1시간 후, 황색도를 650nm 대조값과 함께 405nm에서 판독하였다. 각 반응은 2반복으로 수행하였고, 그 결과를 평균하였다. 혈청의 항 P4 역가는 4-매개변수 곡선에서 0.1의 흡광도를 제공하는 혈청의 희석율로 계산하였다.

C. 전세포 ELISA

NTHi 균주 P860295는 초콜릿 아가 평판에서 6시간 동안 증식시킨 후 PBS에 수거하였다. 세포 현탁액을 620nm에서 측정한 O.D.값이 0.2가 되도록 희석하고, 75㎕씩 NUNC polysorb 평판에 분배하였다. 평판을 37℃에서 하룻밤 동안 건조시키고 사용할 때까지 실온에서 보관하였다. 평판을 PBS/5% 탈지분유로 차단하고 세척한 다음, 100㎕ 희석 혈청(최종 농도가 1:36,450 또는 1:1,093,500이 되게 PBS/0.1% Tween 20/5% 탈지분유로 연속 희석한 것)을 첨가하였다. 1시간/37℃ 항온처리한 후, 평판을 세척하고 100㎕ 2차 항체(PBS/0.1% Tween 20/5% 탈지분유로 1:5,000 비율로 희석한 알칼리 포스파타제 접합된 염소 항마우스 IgG)와 37℃에서 추가 1시간 동안 항온처리했다.

평판을 다시 세척하고, 결합된 항체는 디에탄올아민에 1mg/ml의 농도로 희석한 기질 pNPP(p-니트로페놀 포스페이트)로 검출하였다. 1시간 후, 황색도를 650nm 대조값과 함께 405nm에서 판독하였다. 각 반응은 2반복으로 수행하였고, 그 결과를 평균하였다. 혈청의 항-전세포 역가는 4-매개변수 곡선에서 0.1의 흡광도를 제공하는 혈청의 희석율로 계산하였다.

표 4는 비보존적 돌연변이를 함유하는 효소적으로 비활성인 P4 돌연변이체, P4-D184A,D185A 및 P4-D64A,D66A에 대한 ELISA 결과를 예시한 것이다. 이 ELISA 데이터는 이들 부위가 효소적 활성에 관여하고 면역반응에 중요한 것임을 입증하고 있다. 이러한 돌연변이체 단백질에 대하여 만들어진 항체는 천연 P4 또는 야생형 rLP4 중 어느 하나 보다도 돌연변이체 P4 단백질이 야생형 rLP4에 대하여 유의적으로 더 낮은 항체 역가를 유도해내는 것으로 관찰되었다.

표 4

초기 P4 돌연변이체에 대해 지향성인 혈청의 GMT ELISA 역가

면역원	단백질 용량 (㎍)	보조제 (㎍MPL)	야생형 rLP4에 대한 ELISA 역가
			면역전 (푸울 데이터)	1차 면역후	2차 면역후
헤모필러스 P4	5	25	82	175,211	1,459,564
rLP4 야생형	5	25	65	67,077	988,942
rLP4-D184A, D185A	5	25	<50	2,684	139,033
rLP4-D64A, D66A	5	25	<50	261	46,916

P4 돌연변이체 단백질 (A35G,A37G), (A35T,A37T), (A35D,A37D) 또는 (A35Q,A37Q)에 대한 ELISA 분석 결과는 표 5에 기록하였다. 전술한 바와 같이, 이 단백질들을 암호화하는 돌연변이된 유전자를 rLP4에 대해 사용된 아라비노스 발현 벡터(pBAD18cam)에 삽입하고, 대장균 BLR에서 발현시킨 뒤 정제하여 마우스 면역화 에 사용하였다. 마우스 면역화는 0주 및 4주째 5㎍의 적당한 P4 단백질 + MPL을 사용하여 실시하였다. 6주째 동물의 혈액을 채취하였다. 표 5의 데이터는 6주째 채혈한 5마리 마우스의 혈액 푸울로부터 수득한 것이다. 상동성 돌연변이체 P4 단백질 및 야생형 P4 각각에 대한 ELISA 항체 역가는 각 항혈청에 대하여 측정하였다. 이 표에서 ND는 데이터가 없음을 의미한다.

상기 각 돌연변이체 단백질은 자신(상동성 단백질)에 대하여 지향성인 항체를 양호한 수준으로 유도해내었다. 하지만, 야생형 rLP4에 대해서는 상기와 유사한 수준의 항체를 유도해내는 단백질은 없었다. 이 결과는 이 돌연변이체 P4 단백질들이 양호한 면역원이 아닐 것이라는 가능성을 줄여주는 것이다. 상동성 단백질에 대한 상기 단백질들의 역가는 이 실험모델에서 지질화된 P4에 대하여 예상한 정상적인 범위 내에 속하는 것이었다.

표 5

rLP4 돌연변이체 단백질에 대한 rLP4 돌연변이체 마우스의 ELISA 반응

D. 살균성 분석

살균성 항체 분석은 NTHi에 대한 항체의 기능성을 측정하는 척도로서 상기 인용된 그린 등의 문헌(1991)을 통해 종래 개시된 바와 같이 수행하였다. 간략히 설명하면, NTHi 균주 P860295를 BHI-XV 브로쓰에서 37℃하에 하룻밤 동안 증식시켰다. 철야 배양물을 분광계(Klett-Sumerson)로 660nm에서 측정했을 때 BHI-XV 브로쓰에서 30 클레츠(Kletts)의 광학밀도가 되게 희석하였다. 이 배양물을 37℃에서 중간 대수기까지 항온배양하고 PCM(약 1 내지 2x10⁵ cfu/ml)으로 1:15,000 비율로 희석하였다. 항P4 마우스 혈청은 55℃에서 30분 동안 가열하여 보체 활성을 제거하였다. 이 혈청을 그 다음 0.15mM CaCl₂와 0.5mM MgCl₂을 함유하는 인산염 완충 식염 수(PCM)로 연속 희석하였다.

그 다음, 로체스터 대학에서 제공받은 인간 보체를 NTHi P860295(Green, B.A. et al., 1990 Infect. Immun., 58:3272-3278)에 흡착시켰다. 96웰 미량역가 평판에서 30㎕ PCM, 5㎕ 희석된 마우스 항혈청, 10㎕ 희석된 NTHi 및 5㎕ 흡착된 인간 보체를 혼합하고 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 이 반응물에 200㎕ PCM을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 각 웰로부터 50㎕를 취하여 BHI-XV 아가 상에 2반복으로 접종하고 37℃에서 30분 동안 항온배양하였다. 콜로니를 계수하여 살균 역가(항체를 함유하지 않는 분석 대조군과 비교했을 때 적어도 50%의 박테리아를 사멸시킬 수 있는 항혈청의 최고 희석율의 역수)를 측정하였다.

표 6에는 P4-D184A,D185A 및 P4-D64A,D66A에 대하여 만들어진 항혈청의 BC 역가를 제시하였다. 측정된 역가들은 분석 오차 범위내에서 rLP4에 의해 유도된 역가와 동등한 수준인 것으로 관찰되었다(하기 표 6). 이 돌연변이체들의 BC 역가와 ELISA 역가 사이에 상관관계는 없었다.

표 6

돌연변이체 및 야생형 P4에 대한 항혈청의 살균 활성

혈청a/	채혈	NTHi P860295에 대한 BC 역가
항-천연 P4	2차 면역후	160
항-야생형 rLP4	2차 면역후	>320
항-rLP4-D184A,D185A	2차 면역후	80
항-rLP4-D64A,D66A	2차 면역후	>320
면역전 푸울	면역전	<20
항-P860295 전세포	3차 면역후	>320
면역전 푸울	면역전	<20
a/ 10마리 마우스 유래의 혈청 푸울

표 7에는 2중 돌연변이체 단백질, (A35G,A37G), (A35T,A37T), (A35D,A37D) 또는 (A35Q,A37Q)로 면역화한 마우스 혈청에 대한 BC 분석 결과를 제시하였다. 이 살균 항체 역가는 야생형 P4에 대한 ELISA 역가와 상관관계가 없었다. 예를 들어, rLP4 A35N,A37N 돌연변이체는 야생형 rLP4에 대한 높은 ELISA 역가는 유도하지 못하지만, NTHi에 대한 양호한 살균 항체 역가는 유도했다. 따라서, 이 돌연변이체들은 면역원성 또는 백신 조성물로는 바람직하지 못한 것으로 간주되었다. 또한, 항-rLP4 혈청은 대부분의 돌연변이체에 대하여 그다지 강하게 반응하지 않았는데, 이는 효소적 활성 부위가 면역우성임을 시사하는 것 같다.

표 7

항-rLP4 및 항-P4 돌연변이체 혈청의 ELISA 및 BC 역가

표 8에는 대장균 BLR 세포에서 정제하고 효소 활성에 대해 조사한, 단일 돌연변이, N218Q, K161R, D64E, Y122F, D64N, D64E, F48C 및 Q39E를 가진 지질화된 단백질의 BC 분석 결과를 기록하였다. 이 단백질들을 사용하여 마우스를 면역화한 결과, 3개의 돌연변이체는 높은 ELISA 역가와 높은 BC 역가를 복합적으로 나타내지만 효소 활성은 측정 불가능한 것으로 보였다. 이러한 돌연변이체는 F48C, N218Q 및 Q39E 돌연변이이다(표 7 및 표 8). 이 돌연변이체 P4 단백질은 야생형 P4에 대한 ELISA 역가를 야생형 P4와 동등 수준으로 나타내었지만, NTHi에 대한 살균 역가는 높은 수준으로 나타냈다.

표 8

돌연변이체 P4 단백질의 ELISA 및 BC 역가

실시예 6: P4 절두형 돌연변이체

야생형 서열의 C 말단에 존재하는 다양한 지점에서 절단한 4가지 P4 변형 단백질을 작제하였다. 절두 돌연변이체는 pLP339 중의 hel 유전자를 PCR하여 작제하였다. 간략히 설명하면, 5' 말단에 SphI 부위를 가지며 hel 유전자의 5' 프라임 말 단 및 리보솜 결합 부위와 상동성인 프라이머를 합성하였다. 3' 프라이머는 표시한 절두 지점 다음의 잔기를 종결 코돈으로 변화시키고 프라이머의 3' 말단은 hel 유전자와 상동성으로 합성하였다. 제2 프라이머의 5' 말단에는 SacI 부위를 첨가하였다. PCR 산물을 pCR2.1-TOPO(Invitrogen)에 클로닝하고 SphI-SacI로 절단하였다. hel 유전자 단편을 정제하고 동일 효소로 절단한 pBAD18Cam에 연결시켰다. 양성 클론을 동정하고 발현을 검사하였다. 모든 작제물은 지질화된 절두형 P4 단백질을 대장균 BLR에서 발현하였다.

구체적으로, 잔기 200에서 절두된 P4 변형 단백질(즉, 서열번호 3의 아미노산 1 내지 200 함유)과 잔기 210, 221 및 232에서 절두된 P4 변형 단백질이 제조되었다. 실시예 4에 전술한 프로토콜을 사용하여 각 단편의 포스파타제 활성을 분석하였다. 그 결과, 4개의 단편 모두 검출가능한 효소 활성을 나타내지 않았다.

다음으로, 절두형 P4 단백질 5㎍을 MPL^TM 25㎍과 혼합하여 투여하는 것을 제외하고는 실시예 5A의 프로토콜에 따라 스위스 웹스터 마우스를 면역화하였다. 실시예 5의 프로토콜에 따라 제조한 4가지 절두형 P4 단편의 ELISA 결과를 야생형 rLP4와 비교하여 표 9에 예시하였다. "rLP4-232"라는 범례는 재조합체 P4가 서열번호 3의 아미노산 232에서 절두된 것임을 나타내며, 다른 것도 이와 같다. ELISA 데이터는 4가지 절두형 돌연변이체 모두가 유용한 역가 수준을 유도해낸다는 것을 입증하였다.

표 9

스위스 웹스터 마우스의 P4 절두형 돌연변이체의 항-rLP4 ELISA 역가

면역원	0주	4주	6주
rLP4/MPLTM	53	155,797	1,477,755
RPL4-232/MPLTM	<50	31,611	664,876
RPL4-221/MPLTM	53	31,032	506,025
RPL4-210/MPLTM	<50	66,125	888,795
RPL4-200/MPLTM	62	11,936	631,073

다음으로, 실시예 5D의 프로토콜에 따라 2가지 살균 분석을 수행하였다. 1차 분석에서는 아미노산 210에서 절두한 P4 단백질을 야생형 rLP4 및 전술한 각종 P4 변형체와 비교하였으며, 각 배합물은 P4 단백질 15㎍과 MPL^TM 100㎍을 혼합하여 사용하였고, 마지막 그룹에는 이전 연구에서 사용한 rLP4 단백질 5㎍만을 양성대조군으로서 사용하였다. 표 10에 제시한 살균 분석 데이터는 아미노산 210에서 절두된 P4 단백질이 기준값 보다 통계학적으로 유의적인 살균성 항체 역가를 유도한다는 것을 나타내었다. 이 실험에서 80 또는 그 이상의 BC₅₀ 역가는 기준값(<20)과 유의적으로 상이한 값으로 간주하였다. 여기서 보체는 흡착된 인간 UR8-96을 사용하였다.

표 10

돌연변이체, 절두체 및 야생형 P4에 대한 항혈청의 살균 활성

2차 분석으로, 아미노산 200, 210, 221 및 232에서 절두한 P4 단백질을 야생형 rLP4 및 전술한 각종 P4 변형체와 비교하였으며, 각 배합물은 P4 단백질 5㎍과 MPL^TM 25㎍(최적이하량)을 혼합하여 사용하였고, 마지막 그룹에는 이전 연구에서 사용한 rLP4 단백질 5㎍과 MPL^TM 100㎍을 양성대조군으로서 사용하였다. 표 11에 제시한 살균 분석 데이터는 아미노산 221 및 232에서 절두된 P4 단백질이 소량의 MPL^TM에서도 기준값 보다 통계학적으로 유의적인 살균성 항체 역가를 유도한다는 것을 나타내었다. 이 실험에서 80 또는 그 이상의 BC₅₀ 역가는 0주째와 유의적으로 상이한 값으로 간주하였다. 여기서 보체는 흡착된 인간 UR8-97을 사용하였다.

표 11

돌연변이체, 절두체 및 야생형 P4에 대한 항혈청의 살균 활성

요약해보면, 제안된 P4 돌연변이의 결과는 살균 활성과 ELISA 역가의 차이가 살균 활성에 필요한 부위와 효소적 활성에 필수적인 부위가 상이함을 의미할 수 있음을 시사하는 것이다.

본 명세서에 인용된 모든 공개문헌은 본원에 참고인용된 것이다. 이상 본 발명은 특히 바람직한 구체예를 예로 들어 설명하였지만, 본 발명의 취지를 벗어나지 않는 범위내에서 다양한 변형이 이루어질 수 있음은 자명한 것이다. 이러한 변형은 첨부되는 청구의 범위 영역내에 속하는 것이다.

<110> Wyeth Holdings Corporation The Curators of the University of Missouri Green, Bruce A. Ziotnick, Gary W. Fletcher, Leah D. Smith, Arnold L. Reilly, Thomas J. <120> Mutants of the P4 Protein of Nontypable Haemophilus Influenzae With Reduced Enzymatic Activity <130> AM100935PCT <150> US 60/364,688 <151> 2002-03-15 <160> 29 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1143 <212> DNA <213> hel gene of a bacterium H. influenzae <400> 1 gaattcttaa aaggaataaa ataatttcta ttataaccgt aggtagttta tttacggtta 60 ttaatgccat ctatgatgaa aaacactttt caattgaaaa gtgtttttca gaaagactta 120 ctataccctg aatgaatagg aacataatat gaaaacaacg ttaaaaatga ccgcacttgc 180 ggctctttct gcttttgttt tagctggctg tggttcacac caaatgaaat cagaagaaca 240 tgcaaatatg caattacaac aacaagcggt gcttggatta aactggatgc aagattctgg 300 cgaatataaa gcattagctt atcaagcgta caatgcggca aaagttgcat ttgatcacgc 360 aaaagtggca aaaggtaaga aaaaagcggt tgtggctgat ttagatgaaa ctatgttaga 420 caacagccct tatgctggct ggcaagttca aaataacaaa ccattcgatg gtaaagattg 480 gactcgttgg gtagacgcac gtcaatctcg tgccgttccg ggtgcggtag aatttaataa 540 ttatgtaaac agccacaacg gtaaagtgtt ctacgtaaca aaccgcaaag acagcactga 600 aaaatcaggc actatcgatg atatgaaacg cttaggtttc aatggcgtgg aagaatctgc 660 attttatttg aaaaaagaca aatcagctaa agcggctcgt tttgcagaaa ttgaaaaaca 720 aggctatgaa atcgtacttt atgtaggtga taacttagat gacttcggta ataccgtata 780 tggcaaatta aacgctgacc gccgtgcatt cgttgatcaa aaccaaggca aatttggtaa 840 aactttcatc atgttaccta acgcaaacta cggtggctgg gaaggcggtt tagctgaagg 900 gtatttcaaa aaagatacac aaggccaaat caaagctcgt ttagatgcag tacaagcttg 960 ggatggtaaa taattttcca ttaaaaagat cgatttaaat atcgattttg aaaatttaat 1020 tgaggggcta agctcagttt ttactggctt agctttttca ttttcagtca ctcaagtatc 1080 atcattacta catctgagtt tgctatgatg ttgcagcttc aaatgatcaa gtagagaatg 1140 acc 1143 <210> 2 <211> 274 <212> PRT <213> hel gene of a bacterium H. influenzae <400> 2 Met Lys Thr Thr Leu Lys Met Thr Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ala Phe 1 5 10 15 Val Leu Ala Gly Cys Gly Ser His Gln Met Lys Ser Glu Glu His Ala 20 25 30 Asn Met Gln Leu Gln Gln Gln Ala Val Leu Gly Leu Asn Trp Met Gln 35 40 45 Asp Ser Gly Glu Tyr Lys Ala Leu Ala Tyr Gln Ala Tyr Asn Ala Ala 50 55 60 Lys Val Ala Phe Asp His Ala Lys Val Ala Lys Gly Lys Lys Lys Ala 65 70 75 80 Val Val Ala Asp Leu Asp Glu Thr Met Leu Asp Asn Ser Pro Tyr Ala 85 90 95 Gly Trp Gln Val Gln Asn Asn Lys Pro Phe Asp Gly Lys Asp Trp Thr 100 105 110 Arg Trp Val Asp Ala Arg Gln Ser Arg Ala Val Pro Gly Ala Val Glu 115 120 125 Phe Asn Asn Tyr Val Asn Ser His Asn Gly Lys Val Phe Tyr Val Thr 130 135 140 Asn Arg Lys Asp Ser Thr Glu Lys Ser Gly Thr Ile Asp Asp Met Lys 145 150 155 160 Arg Leu Gly Phe Asn Gly Val Glu Glu Ser Ala Phe Tyr Leu Lys Lys 165 170 175 Asp Lys Ser Ala Lys Ala Ala Arg Phe Ala Glu Ile Glu Lys Gln Gly 180 185 190 Tyr Glu Ile Val Leu Tyr Val Gly Asp Asn Leu Asp Asp Phe Gly Asn 195 200 205 Thr Val Tyr Gly Lys Leu Asn Ala Asp Arg Arg Ala Phe Val Asp Gln 210 215 220 Asn Gln Gly Lys Phe Gly Lys Thr Phe Ile Met Leu Pro Asn Ala Asn 225 230 235 240 Tyr Gly Gly Trp Glu Gly Gly Leu Ala Glu Gly Tyr Phe Lys Lys Asp 245 250 255 Thr Gln Gly Gln Ile Lys Ala Arg Leu Asp Ala Val Gln Ala Trp Asp 260 265 270 Gly Lys <210> 3 <211> 254 <212> PRT <213> hel gene of a bacterium H. influenzae <400> 3 Cys Gly Ser His Gln Met Lys Ser Glu Glu His Ala Asn Met Gln Leu 1 5 10 15 Gln Gln Gln Ala Val Leu Gly Leu Asn Trp Met Gln Asp Ser Gly Glu 20 25 30 Tyr Lys Ala Leu Ala Tyr Gln Ala Tyr Asn Ala Ala Lys Val Ala Phe 35 40 45 Asp His Ala Lys Val Ala Lys Gly Lys Lys Lys Ala Val Val Ala Asp 50 55 60 Leu Asp Glu Thr Met Leu Asp Asn Ser Pro Tyr Ala Gly Trp Gln Val 65 70 75 80 Gln Asn Asn Lys Pro Phe Asp Gly Lys Asp Trp Thr Arg Trp Val Asp 85 90 95 Ala Arg Gln Ser Arg Ala Val Pro Gly Ala Val Glu Phe Asn Asn Tyr 100 105 110 Val Asn Ser His Asn Gly Lys Val Phe Tyr Val Thr Asn Arg Lys Asp 115 120 125 Ser Thr Glu Lys Ser Gly Thr Ile Asp Asp Met Lys Arg Leu Gly Phe 130 135 140 Asn Gly Val Glu Glu Ser Ala Phe Tyr Leu Lys Lys Asp Lys Ser Ala 145 150 155 160 Lys Ala Ala Arg Phe Ala Glu Ile Glu Lys Gln Gly Tyr Glu Ile Val 165 170 175 Leu Tyr Val Gly Asp Asn Leu Asp Asp Phe Gly Asn Thr Val Tyr Gly 180 185 190 Lys Leu Asn Ala Asp Arg Arg Ala Phe Val Asp Gln Asn Gln Gly Lys 195 200 205 Phe Gly Lys Thr Phe Ile Met Leu Pro Asn Ala Asn Tyr Gly Gly Trp 210 215 220 Glu Gly Gly Leu Ala Glu Gly Tyr Phe Lys Lys Asp Thr Gln Gly Gln 225 230 235 240 Ile Lys Ala Arg Leu Asp Ala Val Gln Ala Trp Asp Gly Lys 245 250 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 4 gcaaaagttg catgcgatca cgcaaaag 28 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 5 cttttgcgtg atcgcatgca acttttgc 28 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 6 gcggttgtgg ctgctttagc tgaaactatg ttag 34 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 7 ctaacatagt ttcagctaaa gcagccacaa ccgc 34 <210> 8 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 8 gcgcgtctct tgcattttat ttgaaaaaag acaaatcagc tagagcggct c 51 <210> 9 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 9 gcgcgtctcg tgcagattct tccacgccat tgaaacc 37 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 10 gcgcgtctct gctgggaagg cggtttagct gaag 34 <210> 11 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 11 gcgcgtctcg cagccaccgt agtttgcttg aggtaacatg atgaaag 47 <210> 12 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 12 gcgcgtctct ggtaagaaaa aagcggttgt ggctaattta gatg 44 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 13 gcgcgtctcg taccttttgc cacttttgcg tg 32 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 14 gcgcgtctcg taccttttgc cacttttgcg tg 32 <210> 15 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 15 gcgcgtctct ggtaagaaaa aagcggttgt ggctgaatta gatg 44 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 16 cgccgtctcg ctgccttcgg taataccgta tatggc 36 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 17 cgccgtctcg gcagctaagt tatcacctac ataaagtacg 40 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 18 cgccgtctct tagaatatca agcgtacaat gcggc 35 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 19 ccgcgtctca tctaattctt tatattcgcc agaatcttgc 40 <210> 20 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 20 gcccgtctcc cttaaactat caagcgtaca atgcggc 37 <210> 21 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 21 gcccgtctcc taagttttta tattcgccag aatcttgc 38 <210> 22 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 22 ccgcgtctca ttacaatatc aagcgtacaa tgcggc 36 <210> 23 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 23 gcccgtctcg gtaattgttt atattcgcca gaatcttgc 39 <210> 24 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 24 cggcgtctcc attaacttat caagcgtaca atgcggc 37 <210> 25 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 25 cggcgtctcc taatgtttta tattcgccag aatcttgc 38 <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 26 gcattagctt atgaagcgta caatgcgg 28 <210> 27 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 27 ccgcattgta cgcttcataa gctaatgc 28 <210> 28 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 28 cggtaaagtg ttctttgtaa caaaccgc 28 <210> 29 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 29 gcggtttgtt acaaagaaca ctttaccg 28

Claims (61)

1. 야생형 P4 단백질에 비해 감소된 효소 활성을 나타내는 형별불능 헤모필러스 인플루엔자(NTHi)의 P4 변형 단백질 및 약학적 허용성 담체를 포함하는, 야생형 P4 단백질에 대한 항체(이 항체는 NTHi에 대한 살균 활성을 보유함) 유도 면역원성 조성물로서,

   이 P4 변형 단백질은 다음과 같은 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 치환 돌연변이를 보유하는 것이 특징인 면역원성 조성물:

   (a) 야생형 P4 단백질에서는 글루타민인 서열번호 3의 아미노산 잔기 39에서의 치환;

   (b) 야생형 P4 단백질에서는 아스파라긴인 서열번호 3의 아미노산 잔기 218에서의 치환; 및

   (c) 상기 치환 (a) 및 (b)의 조합.
2. 제1항에 있어서, P4 변형 단백질이 다음과 같은 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함하는 것이 특징인 면역원성 조성물:

   (a) 서열번호 3의 아미노산 잔기 39에서 글루탐산, 아스파르트산 또는 아스파라긴으로의 치환;

   (b) 서열번호 3의 아미노산 잔기 218에서 글루타민, 아스파르트산 또는 글루탐산으로의 치환; 및

   (c) 상기 치환 (a) 및 (b)의 조합.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 변형 단백질이 지질화된 것인 면역원성 조성물.
4. 제3항에 있어서, P4 변형 단백질의 N-말단에 리더 펩타이드가 융합되어 있는 것이 특징인 면역원성 조성물.
5. 제4항에 있어서, 리더 펩타이드가 서열번호 2의 아미노산 1 내지 20인 것이 특징인 면역원성 조성물.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 변형 단백질이 지질화되어 있지 않은 것인 면역원성 조성물.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 변형 단백질이 담체 단백질과 구조적으로(in frame) 융합된 것이 특징인 면역원성 조성물.
8. 제7항에 있어서, 담체 단백질이 대장균 DnaK 단백질, GST 단백질, 마이코박테리아 열충격 단백질 70, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 갈락토키나제, 유비퀴틴, α-교배 인자, β-갈락토시다제 및 인플루엔자 NS-1 단백질로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인 면역원성 조성물.
9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 추가로 보조제를 함유하는 것이 특징인 면역원성 조성물.
10. 제1항 또는 제2항에 있어서, H.인플루엔자 유래 또는 H.인플루엔자 이외의 다른 미생물 유래의 다른 항원을 추가로 포함하는 것이 특징인 면역원성 조성물.
11. 제1항에 정의된 P4 변형 단백질을 암호화하고, 상기 P4 변형 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 90% 이상 상동성인 핵산 서열

    을 함유하는 분리된 뉴클레오타이드 분자.
12. 제11항에 있어서, 핵산 서열이 숙주 세포내에서 P4 변이체의 발현을 유도하는 조절 서열의 제어하에 있는 것이 특징인 분리된 뉴클레오타이드 분자.
13. 제12항에 있어서, 플라스미드 벡터인 것이 특징인 분리된 뉴클레오타이드 분자.
14. 제13항에 기재된 플라스미드 벡터로 형질전환, 형질감염 또는 형질도입된 숙주 세포.
15. 제11항에 기재된 뉴클레오타이드 분자와 약학적 허용성 담체를 함유하는 면역원성 조성물.
16. 삭제
17. 제14항에 기재된 숙주 세포를 배양하여 P4 변형 단백질을 생산하는 단계, 및

    이 배양물로부터 P4 변형 단백질을 회수하는 단계

    를 포함하는, P4 변형 단백질 생산방법.
18. 제1항 또는 제2항에 있어서, P4 변형 단백질이 다른 항원의 담체 단백질로서 작용하는 것인, 면역원성 조성물.
19. 제1항 또는 제2항에 있어서, P4 변형 단백질이 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 사카라이드, 리포폴리사카라이드, 리포올리고사카라이드 또는 리포사카라이드에 화학적으로 접합된 것인, 면역원성 조성물.
20. 제1항에 있어서, P4 변형 단백질이 다음과 같은 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함하는 것이 특징인 면역원성 조성물:

    (a) 서열번호 3의 아미노산 잔기 39에서 글루탐산으로의 치환;

    (b) 서열번호 3의 아미노산 잔기 218에서 글루타민으로의 치환; 및

    (c) 상기 치환 (a) 및 (b)의 조합.
21. 제1항 또는 제2항에 있어서, P4 변형 단백질이 다음과 같은 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 치환을 추가로 포함하는 것이 특징인 면역원성 조성물:

    (a) 야생형 P4 단백질에서는 페닐알라닌인 서열번호 3의 아미노산 잔기 48에서의 치환;

    (b) 야생형 P4 단백질에서는 아스파르트산인 서열번호 3의 아미노산 잔기 64에서의 치환;

    (c) 야생형 P4 단백질에서는 리신인 서열번호 3의 아미노산 잔기 161에서의 치환;

    (d) 야생형 P4 단백질에서는 알라닌이고, 치환이 글루탐산, 글루타민 또는 트레오닌은 아닌 서열번호 3의 아미노산 잔기 35 및 37에서의 치환;

    (e) 야생형 P4 단백질에서는 아스파르트산인 서열번호 3의 아미노산 잔기 64 및 66에서의 치환; 및

    (f) 상기 치환 (a) 내지 (e)의 조합.
22. 제21항에 있어서, P4 변형 단백질이 다음과 같은 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함하는 것이 특징인 면역원성 조성물:

    (a) 서열번호 3의 아미노산 잔기 48에서의 시스테인, 세린, 또는 비하전성 극성기를 보유한 아미노산으로의 치환;

    (b) 서열번호 3의 아미노산 잔기 64에서 아스파라긴, 글루탐산, 또는 알라닌으로의 치환;

    (c) 야생형 P4 단백질에서는 리신인 서열번호 3의 아미노산 잔기 161에서 아르기닌으로의 치환;

    (d) 서열번호 3의 아미노산 잔기 35 및 37에서 아스파라긴으로의 치환;

    (e) 서열번호 3의 아미노산 잔기 64 및 66에서 알라닌, 아스파라긴, 또는 글루탐산으로의 치환; 및

    (f) 상기 치환 (a) 내지 (e)의 조합.
23. 제1항 또는 제2항에 있어서, P4 변형 단백질이 절두되어 서열번호 3의 아미노산 1-200, 1-210, 1-221, 또는 1-232을 함유하는 면역원성 조성물.
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