ES2424940T3 - Composición multivalente de conjugados de polisacárido neumocócico-proteína - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de preparación de una composición inmunogénica multivalente que comprende 13 conjugados distintos de polisacárido-proteína junto con un vehículo fisiológicamente aceptable, en el que cada uno de los conjugados contiene un polisacárido capsular diferente conjugado con una proteína transportadora, y en el que los polisacáridos capsulares son preparados a partir de los serotipos 1, 3, 5, 6A, 6B, 7F, 9V,14,18C, 19A, 19F y 23F de Streptococcus pneumoniae, en el que dicho conjugado de polisacárido de serotipo 3 - proteína es fabricada de acuerdo con un procedimiento que comprende: (a) hacer reaccionar un polisacárido de serotipo 3 purificado con un ácido débil dando como resultado un polisacárido de serotipo 3 hidrolizado; (b) hacer reaccionar el polisacárido de serotipo 3 hidrolizado con un agente oxidante en presencia de cationes bivalentes dando como resultado un polisacárido de serotipo 3 activado en el que el agente oxidante es ácido peryódico y los cationes bivalentes son Mg2+ o Ca2+; (c) combinar el polisacárido de serotipo 3 activado con una proteína transportadora; (d) hacer reaccionar el polisacárido de serotipo 3 activado y la proteína transportadora combinados con un agente reductor, dando como resultado un conjugado de polisacárido de serotipo 3: proteína transportadora; y (e) proteger los aldehídos que no han reaccionado en el conjugado de polisacárido de serotipo 3: proteína transportadora dando como resultado un conjugado inmunogénico que comprende el polisacárido de serotipo 3 de Streptococcus pneumoniae unido covalentemente a una proteína transportadora; y en el que después de que los glucoconjugados son purificados, estos son combinados para formular la composición inmunogénica.

Description

Composicion multivalente de conjugados de polisacarido neumococico-proteina

Campo de la invenci6n

La presente invencion se refiere en general al campo de la medicina, y especificamente al de la microbiologia, inmunologia, vacunas y a la prevencion, por inmunizacion, de infecciones ocasionadas por un patogeno bacteriano.

Antecedentes de la invenci6n

Streptococcus pneumoniae es una causa principal de meningitis, neumonia y enfermedades invasivas graves en bebes y en ninos pequenos en todo el mundo. Las vacunas de polisacaridos neumococicos multivalentes se han autorizado durante muchos anos y han demostrado ser valiosas en la prevencion de enfermedades neumococicas en adultos de edad avanzada y en pacientes de alto riesgo. Sin embargo, los bebes y los ninos pequenos responden mal a la mayoria de los polisacaridos neumococicos. La vacuna conjugada neumococica 7-valente (7vPnC, Prevnar®) fue la primera de este tipo que demostro ser altamente inmunogenica y eficaz contra enfermedades invasivas y otitis media en bebes y en ninos pequenos. Actualmente esta vacuna esta autorizada en muchos paises en todo el mundo. Prevnar contiene los polisacaridos capsulares de los serotipos 4, 68, 9V, 14, 18C, 19C y 23F, cada uno conjugado con una proteina transportadora denominada CRM197. Prevnar protege aproximadamente el 8090%, 60-80% y 40%-80% de las enfermedades neumococicas invasivas (ENI) en los Estados Unidos, Europa y otras regiones del mundo, respectivamente [1,2]. Como se esperaba, datos de observaciones recogidos durante los anos posteriores a la introduccion de Prevnar han demostrado claramente una reduccion de enfermedades neumococicas invasivas en bebes en los Estados Unidos (FIG. 1) [3,4].

La vigilancia de ENI realizada en bebes en los Estados Unidos antes de la introduccion de Prevnar demostro que una parte significativa de enfermedades debidas a los serogrupos 6 y 19 se debia a los serotipos 6A (aproximadamente una tercera parte) y 19A (aproximadamente una cuarta parte) [5,6]. La observacion de enfermedades neumococicas invasivas realizada en los Estados Unidos despues de obtener la licencia de Prevnar sugiere que una gran carga de enfermedad todavia puede atribuirse a los serotipos 6A y 19A (FIG. 1) [3]. Ademas, estos dos serotipos representan mas casos de enfermedades invasivas que los serotipos 1, 3, 5 y 7F, combinados (8,2 frente a 3,3 casos/100.000 ninos de 2 anos y menores). Ademas, los serotipos 6A y 19A estan asociados con altos indices de resistencia a antibioticos (FIG. 2) [7, 8, 9]. Aunque a medida que se inmunizan mas ninos es posible que la proteccion cruzada de serogrupos de como resultado una disminucion de enfermedades ocasionadas por los serotipos 6A y 19A, existen pruebas que sugieren que habra un limite a la disminucion, y que permanecera una carga significativa de enfermedades debida a estos serotipos (vease mas adelante).

Dada la carga relativa y la importancia de enfermedades neumococicas invasivas debida a los serotipos 1, 3, 5, 6A, 7F y 19A, la adicion de estos serotipos a la formulacion de Prevnar aumentaria la proteccion para enfermedades invasivas a > 90% en los Estados Unidos y en Europa, y tan alta como 70%-80% en Asia y America Latina. Esta vacuna ampliaria significativamente la proteccion mas alla de Prevnar, y para los serotipos 6A y 19A proporcionaria una proteccion que no seria dependiente de las limitaciones de la proteccion cruzada de serogrupos.

Los documentos WO 2006/110381 y US 2006228380 desvelan, entre otras cosas, un procedimiento para producir un conjugado de polisacarido de serotipo 3 de Streptococcus pneumoniae unido covalentemente a una proteina transportadora que comprende una etapa de oxidacion usando peryodato de sodio.

Sumario de la invenci6n

La presente descripcion proporciona en general una composicion inmunogenica multivalente que comprende 13 conjugados distintos de polisacarido-proteina, en la que cada uno de los conjugados contiene un polisacarido capsular de un serotipo de Streptococcus pneumoniae diferente conjugado con una proteina transportadora, junto con un vehiculo fisiologicamente aceptable. Opcionalmente, en la formulacion se incluye un adyuvante, tal como un adyuvante basado en aluminio. Mas especificamente, la presente descripcion proporciona una composicion conjugada neumococica 13-valente (13vPnC) que comprende los siete serotipos (4, 68, 9V, 14, 18C y 23F) incluidos en la vacuna 7vPnC mas seis serotipos adicionales (1, 3, 5, 6A, 7F y 19A).

La presente invencion tambien proporciona una composicion inmunogenica multivalente, en la que los polisacaridos capsulares son de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 68, 7F, 9V, 14, 18C, 19A y 23F de Streptococcus pneumoniae y la proteina transportadora es CRM197.

La presente descripcion proporciona adicionalmente una composicion inmunogenica multivalente, en la que los polisacaridos capsulares son de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 68, 7F, 9v, 14, 18C, 19A y 23F de Streptococcus pneumoniae, la proteina transportadora es CRM197 y el adyuvante es un adyuvante basado en aluminio, tal como fosfato de aluminio, sulfato de aluminio e hidroxido de aluminio. En una realizacion particular de la invencion, el adyuvante es fosfato de aluminio.

La presente descripcion tambien proporciona una composicion inmunogenica multivalente, que comprende conjugados de polisacarido-proteina junto con un vehiculo fisiologicamente aceptable, en el que cada uno de los conjugados comprende un polisacarido capsular de un serotipo de Streptococcus pneumoniae diferente conjugado con una proteina transportadora, y los polisacaridos capsulares se preparan a partir del serotipo 3 y de al menos un serotipo adicional.

En una realizacion de esta composicion inmunogenica multivalente, el serotipo adicional se selecciona del grupo que consiste en los serotipos 1, 4, 5, 6A, 68, 7F, 9V, 14, 18C, 19A y 23F. En otra realizacion, la proteina transportadora es CRM197. En otra realizacion adicional, la composicion comprende un adyuvante, tal como adyuvante basado en aluminio seleccionado de fosfato de aluminio, sulfato de aluminio e hidroxido de aluminio. En una realizacion particular el adyuvante es fosfato de aluminio

La presente descripcion tambien proporciona una composicion inmunogenica multivalente, que comprende conjugados de polisacarido-proteina junto con un vehiculo fisiologicamente aceptable, en el que cada uno de los conjugados comprende un polisacarido capsular de un serotipo de Streptococcus pneumoniae diferente conjugado con una proteina transportadora, y los polisacaridos capsulares se preparan a partir de los serotipos 4, 68, 9V, 14, 18C, 19F, 23F y de al menos un serotipo adicional.

En una realizacion de esta composicion inmunogenica multivalente, el serotipo adicional se selecciona del grupo que consiste en los serotipos 1, 3, 5, 6A, 7F y 19A. En otra realizacion, la proteina transportadora es CRM197. En otra realizacion adicional, la composicion comprende un adyuvante, tal como un adyuvante basado en aluminio seleccionado de fosfato de aluminio, sulfato de aluminio e hidroxido de aluminio. En una realizacion particular, el adyuvante es fosfato de aluminio.

La presente descripcion tambien proporciona un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria contra un conjugado de polisacarido capsular de Streptococcus pneumoniae, que comprende administrar a un ser humano una cantidad inmunologicamente eficaz de cualquiera de las composiciones inmunogenicas que acaban de describirse.

La presente descripcion tambien proporciona que cualquiera de las composiciones inmunogenicas, administradas como una sola dosis de 0,5 ml, se formule para contener: 2 Ig de cada sacarido, excepto para 68 que es de 4 Ig; aproximadamente 29 Ig de proteina transportadora CRM197; 0,125 mg de adyuvante de aluminio elemental (0,5 mg de fosfato de aluminio); y tampon de cloruro de sodio y succinato de sodio como excipientes.

Tambien se proporcionan procedimientos para fabricar un conjugado inmunogenico que comprende el polisacarido de serotipo 3 (Pn 3) de Streptococcus pneumoniae unido covalentemente a una proteina transportadora. En una realizacion, el procedimiento comprende (i) hacer reaccionar el polisacarido Pn 3 purificado con un acido suave dando como resultado un polisacarido Pn 3 hidrolizado; (ii) hacer reaccionar el polisacarido Pn 3 hidrolizado con un agente oxidante en presencia de cationes bivalentes dando como resultado un polisacarido Pn 3 activado; (iii) combinar el polisacarido Pn 3 activado con una proteina transportadora; (iv) hacer reaccionar el polisacarido Pn 3 activado y la proteina transportadora combinados, con un agente reductor dando como resultado un conjugado de polisacarido Pn 3: proteina transportadora y (v) proteger los aldehidos que no han reaccionado en el conjugado de polisacarido Pn 3: proteina transportadora dando como resultado un conjugado inmunogenico que comprende el polisacarido Pn 3 de Streptococcus pneumoniae unido covalentemente a una proteina transportadora.

En una realizacion adicional, el procedimiento comprende (i) hacer reaccionar el polisacarido Pn 3 purificado con acido acetico dando como resultado un polisacarido Pn 3 hidrolizado; (ii) hacer reaccionar el polisacarido Pn 3 hidrolizado con un acido peryodico en presencia de MgCl2 dando como resultado un polisacarido Pn 3 activado; (iii) purificar el polisacarido Pn 3 activado; (iv) combinar el polisacarido Pn 3 activado con una proteina transportadora;

(v) liofilizar conjuntamente el polisacarido Pn 3 activado y la proteina transportadora combinados; (vi) hacer reaccionar el polisacarido Pn 3 activado y la proteina transportadora, liofilizados conjuntamente, con cianoborohidruro de sodio dando como resultado un conjugado de polisacarido Pn 3: proteina transportadora y (vii) proteger con borohidruro de sodio los aldehidos que no han reaccionado en el conjugado de polisacarido Pn 3: proteina transportadora dando como resultado un conjugado inmunogenico que comprende el polisacarido Pn 3 de Streptococcus pneumoniae unido covalentemente a una proteina transportadora.

Tambien se proporciona un procedimiento para fabricar un polisacarido Pn 3 de Streptococcus pneumoniae activado. El procedimiento comprende (i) hacer reaccionar el polisacarido Pn 3 purificado con un acido suave dando como resultado un polisacarido Pn 3 hidrolizado; y (ii) hacer reaccionar el polisacarido Pn 3 hidrolizado con un agente oxidante en presencia de cationes bivalentes dando como resultado un polisacarido Pn 3 activado.

Breve descripci6n de los dibujos

La FIG. 1 representa los cambios en cuanto a los indices de ENI por serotipos en ninos < de 2 anos en los Estados Unidos desde la linea base (anos 1998/1999) al ano 2001. La FIG. 2 representa la distribucion de aislados neumococicos con resistencia a penicilina (PCN) en ninos < de 5 anos (1998). La FIG. 3 representa las curvas de distribucion acumulativa inversa (CDAI) de resultados OPA (ensayo opsonofagocitico) despues de tres dosis procedentes del experimento con Prevnar D118-P16.

Descripci6n detallada de la invenci6n

Inclusion de los serotipos 4, 68, 9V, 14, 18C, 19F, 23F en Prevnar

Datos de vigilancia de la ENI entre 1995-1998 estimaron que los siete serotipos en Prevnar eran responsables de aproximadamente el 82% de ENI en ninos < 2 anos [5]. En el norte de California, el lugar donde se realizo el estudio de eficacia, los serotipos de Prevnar representaron el 90% de todos los casos de ENI en bebes y ninos pequenos [10]. Desde la introduccion de la vacuna Prevnar en el ano 2000, ha habido una disminucion significativa en los indices de ENI globales a causa de una disminucion en la enfermedad debido a los serotipos de la vacuna [3,4]. Por lo tanto, en este momento no existe justificacion para eliminar ninguno de los serotipos de Prevnar de la siguiente generacion de vacunas conjugadas neumococicas sino mas bien anadir serotipos para obtener una proteccion mas amplia.

Inclusion de los serotipos 1, 3, 5 y 7F

En los Estados Unidos, el indice de ENI causado por el serotipo 1 en ninos de menos de 5 anos es < del 2%, aproximadamente el mismo que para cada uno de los 3 tipos y 7F [1,6]. Los serotipos 1 y 5 representan los indices mas elevados de ENI en poblaciones de Estados Unidos de alto riesgo para la enfermedad neumococica invasiva. Especificamente, el serotipo 1 causa el 3,5% de ENI en ninos nativos de Alaska < 2 anos de edad, y el 18% en ninos de 2-4 anos de edad [11]. Tanto el serotipo 1 como el serotipo 5 causan de manera significativa enfermedades en otras partes del mundo y en poblaciones indigenas en paises desarrollados [12, 13, 14].

El serotipo 1 tambien puede asociarse con enfermedades mas graves en comparacion con otros serotipos neumococicos [15]. Esta observacion se basa en la diferencia en cuanto a indices de identificacion de casos entre los Estados Unidos y Europa y la diferencia asociada en la practica medica. En terminos generales, la frecuencia de ENI es menor en Europa que en los Estados Unidos. Sin embargo, el porcentaje de ENI causado por el serotipo 1 en Europa es desproporcionadamente mayor que en el de los Estados Unidos (6-7%, frente al 1-2%, respectivamente). En Europa, se obtienen cultivos de sangre predominantemente de ninos hospitalizados. En los Estados Unidos, es una practica medica habitual obtener cultivos de sangre en ambulatorios de ninos que presentan fiebre alta �39 °C y recuentos de leucocitos elevados. Dada la diferencia en la practica medica, se supone que el porcentaje mas bajo de enfermedad causada por el serotipo 1 en los Estados Unidos puede diluirse por indices mayores de otros serotipos que causan enfermedad leve, mientras que el mayor porcentaje en Europa refleja la enfermedad mas grave. Ademas, estudios seroepidemiologicos de ninos con neumonia complicada demuestran que el serotipo 1 esta desproporcionadamente representado [16, 17, 18]. Esto sugiere que la inclusion del serotipo 1 puede reducir la cantidad de enfermedades neumococicas graves, asi como a contribuir a una reduccion total en cuanto a la enfermedad neumococica invasiva.

La adicion de los serotipos 3 y 7F aumentara la proteccion contra EIN en la mayoria de las areas del mundo aproximadamente del 3% -7% y en Asia aproximadamente el 9%. Por tanto, una vacuna 11-valente protegera un 50% en Asia y aproximadamente un 80% de EIN en todas las demas regiones [1,2]. Estos serotipos tambien son importantes con respecto a la proteccion contra la otitis media [19]. Un estudio multinacional de serotipos neumococicos causantes de otitis media, Hausdorff y col descubrieron que el serotipo 3 era en general el 8° aislado liquido del oido medio mas comun [20]. El serotipo 3 representa hasta el 8,7% de los serotipos neumococicos asociados con la otitis media. Por tanto, la importancia de los tipos 3 y 7F en la otitis media, asi como en ENI, justifica su inclusion en una vacuna conjugada neumococica.

Sin embargo, intentos realizados para producir una vacuna conjugada neumococica multivalente que presente inmunogenicidad significativa con respecto a polisacaridos del serotipo 3 no han tenido exito. Por ejemplo, en un estudio de inmunogenicidad y seguridad de una vacuna conjugada con proteina D neumococica 11-valente (11-Pn-PD), no se observaron efectos destacados para el serotipo 3 en bebes que habian recibido tres dosis de la vacuna despues de una dosis de refuerzo de cualquiera de la misma vacuna o de una vacuna polisacarida neumococica (Nurkka y col (2004) Ped. Inf. Dis. J., 23:1008-1014). En otro estudio, los resultados de un ensayo opsonofagocitico (OPA) de ninos que habian recibido dosis de 11-Pn-PD no mostraron respuestas frente anticuerpos para el serotipo 3 a niveles comparables con otros serotipos ensayados (Gatchalian y col, 17th Annual Meeting of the Eur. Soc. Paed: Inf. Dis. (ESPID), Poster N° 4, P1A Poster Session 1, Estambul, Turquia, 27 de marzo 27 del 2001). En otro estudio adicional, cuando se evaluo la eficacia de una vacuna 11-Pn-PD en la prevencion de otitis media aguda, la vacuna no proporciono proteccion contra episodios causados por el serotipo 3 (Prymula y col (2006) Lancet, 367:740-748). Por consiguiente, una vacuna conjugada neumococica que comprenda polisacaridos capsulares del serotipo 3 y que sea capaz de suscitar una respuesta inmunogenica contra polisacaridos del serotipo 3 proporciona una mejora significativa sobre el estado de la tecnica existente.

Inclusion de los serotipos 6A y 19A

a. Epidemiologfa de los serotipos 6A y 19A

Los datos de observaciones descritos en la bibliografia sugieren que los serotipos 6A y 19A suponen enfermedades neumococicas mas invasivas en ninos < 2 anos en los Estados Unidos que los serotipos 1, 3, 5 y 7F combinados (FIG. 1) [1,5]. Ademas, estos serotipos se asocian normalmente con resistencia a antibioticos (FIG. 2) y desempenan una funcion importante en la otitis media [6,19,20]. La capacidad de la vacuna Prevnar actual para proteger contra enfermedades debido a 6A y 19A no esta clara. Mas adelante se analiza la razon para incluir los componentes 6A y 19A en una vacuna 13vPnC.

b. Respuestas contra los serotipos 6A y 19A inducidas por los polisacaridos 68 y 19F

Las vacunas polisacaridas neumococicas no conjugadas autorizadas (para su uso en personas de al menos dos anos de edad) poseen en su interior polisacaridos capsulares 6A o 68 pero no ambos [21]. Los datos de inmunogenicidad generados en el momento de la formulacion de la vacuna polisacarida neumococica 23-valente demostraron que una vacuna monovalente 68 inducia anticuerpos contra capsulas 6A y 68. Los datos de diversos estudios realizados que evaluan respuestas de IgG y ensayos opsonofagociticos (OPA) en una diversidad de poblaciones con polisacaridos libres y con vacunas conjugadas neumococicas sugirieren que las respuestas de IgG contra 6A estan inducidas por antigenos 68, pero las respuestas son generalmente mas bajas y la actividad OPA con organismos 6A es diferente que la de con organismos 68 [22,23,24,25]. Ademas, sujetos que responden con altas concentraciones de anticuerpos 68 pueden tener escasa actividad o ninguna contra 6A.

A diferencia de la composicion quimica de los polisacaridos capsulares 6A y 68, en la que existe un alto grado de similitud, las capsulas 19A y 19F son muy diferentes debido a la presencia de dos cadenas laterales adicionales en el polisacarido 19A. De manera no sorprendente, respuestas inmunitarias medidas en voluntarios humanos inmunizados con la vacuna polisacarida 19F demostraron que las respuestas contra 19F eran inducidas en el 80% de sujetos, pero solamente el 20% de sujetos tuvieron una respuesta contra 19A [26]. Niveles bajos de respuestas IgG y OPA de reaccion cruzada contra el serotipo 19A despues de inmunizacion con el polisacarido 19F tambien se habian documentado en estudios realizados con vacunas conjugadas [24,26].

A partir del estudio puente con 7vPnC (D118-P16) realizado en bebes en los Estados Unidos (FIG. 3) se han generado datos internos sobre respuestas OPA de reaccion cruzada contra 6A y 19A. Estos estudios coinciden con los hallazgos de otros y demuestran la induccion de anticuerpos funcionales de reaccion cruzada contra el polisacarido 6A despues de inmunizacion con el polisacarido 68, aunque a un nivel mas bajo, y muy pocos anticuerpos funcionales contra 19A despues de inmunizacion con 19F.

Impacto de inmunizacion 68 y 19F sobre 6A y 19A en modelos animales

Para evaluar la posible proteccion cruzada con inmunizacion de polisacaridos se usaron modelos animales. En un modelo de otitis media desarrollado por Giebink y col, se inmunizaron chinchillas con una vacuna conjugada de proteina de membrana externa (PME) con polisacarido tetravalente (que contenia los sacaridos 68, 14, 19F, 23F) o placebo [27]. En este estudio parecia haber alguna proteccion cruzada para 6A; sin embargo esta no alcanzo significado estadistico y el nivel de proteccion fue inferior que con 68 contra la otitis media. En este mismo modelo hubo una proteccion del 100% contra 19F en otitis media, pero solamente una proteccion del 17% contra 19A en otitis media.

Saeland y col usaron suero de bebes inmunizados con una vacuna conjugada contra el tetanos neumococica 8valente (que contenia 68 y 19F) para inmunizar pasivamente ratones antes de una exposicion intranasal con organismo 6A, en un modelo de infeccion pulmonar [28]. De las 59 muestras de suero, se protegio al 53% de los ratones contra bacteriemia con 68 y el 37% se protegio contra 6A. En el mismo modelo, a los ratones inmunizados pasivamente con suero de bebes inmunizados con cuatro dosis de una vacuna conjugada neumococica 11-valente (que contenia 19F conjugado con el toxoide tetanico) se les proporciono una exposicion intranasal con organismos 19A [29]. De 100 ratones inmunizados pasivamente y despues expuestos, 60 ratones no presentaron organismos 19A detectados en el tejido pulmonar, mientras que se identificaron organismos en el resto de ratones a los que se les habia proporcionado placebo con solucion salina. Sin embargo, la inmunizacion pasiva no protegio contra la exposicion con organismos 19F en este modelo; por lo tanto, la utilidad del modelo para el serogrupo 19 es cuestionable. En general estos modelos proporcionan pruebas de algun impacto biologico de inmunizacion 68 en organismos 6A aunque el efecto sobre el serotipo heterologo no fue tan grande como el observado con el serotipo homologo. El impacto de inmunizacion 19F sobre organismos 19A no se comprende bien en estos modelos.

Impacto de inmunizacion con conjugados polisacaridos 68 y 19F sobre enfermedades 6A y 19A en estudios de eficacialeficiencia

En la Tabla 1 se indica el numero de casos de enfermedades debidas a los serotipos 68, 6A, 19F y 19A en estudios de eficacia realizados con las vacunas 7vPnC y 9vPnC (7vPnC mas los serotipos 1 y 5) [30,10,31]. El numero de casos de enfermedades invasivas son demasiado escasos para permitir extraer cualquier conclusion para los serotipos 6A y 19A. Sin embargo, el estudio de otitis media de Finnish genero una gran cantidad de aislados neumococicos [32]. En el analisis por protocolo, la vacuna 7vPnC tuvo una eficacia del 84% (IC del 95%, 62%, 93%) contra la otitis media debido al serotipo 68 y del 57% (IC del 95%, 24%, 76%) contra la otitis media debido al serotipo 6A (Tabla 1). Por otro lado, para la otitis media, la eficacia especifica de serotipo con la vacuna 7vPnC no se demostro debido a cualquiera de 19F o 19A.

Tabla 1. Casos deenfermedades neumoc6cicas debidoa los serotipos 6B, 6A, 19F y 19A en estudiosde eficacia realizados con las vacunas 7vPnC y 9vPnC.

68

6A 19F 19A

PnC

Contr. PnC Contr. PnC Contr. PnC Contr.

Estudio de eficacia de Kaiser7vPnC (ITT)

1 7 0 1 2* 13 0 1

Estudio de eficacia de Navajo7vPnC (ITT)

0 5 1 0 1 1 1 0

Estudio de eficacia del sur de Africa9vPnC VIH (-) (ITT)

1 2 1 0 0 1 3 1

Estudio de eficacia del sur de Africa9vPnC VIH(+) (ITT)

1 7 3 10 2 3 2 3

Estudio de Otitis Media de Finnish7vPnC (PP)

9* 56 19* 45 43 58 17 26

* Eficacia estadisticamente significativa demostrada A partir de referencias 30, 10 y 33 y comunicaciones personales Contr= control ITT= analisis por intencion de tratar PP = analisis por protocolo

Para evaluar la eficacia de Prevnar [33], se dispone tambien de datos de un estudio de control de casos de

5 observacion de ENI post-venta realizado por los Centros para el Control de Enfermedades (CCE) En los laboratorios de observacion se identificaron casos de enfermedades invasivas neumococicas producidas en ninos de 3 a 23 meses de edad y coincidieron con tres casos de control por edad y codigo postal. Despues de obtener el consentimiento de los padres y de los proveedores de servicios medicos, para el estudio de casos y controles, se obtuvo el historial medico y la inmunizacion (los sujetos se consideraron inmunizados si habian recibido al menos

10 una dosis de Prevnar). Los estudios preliminares se presentaron en la reunion ICAAC 2003 y en la Tabla 2 se presenta un resumen de los hallazgos para enfermedades 68, 19F, 19A y 6A. Estos datos indican que Prevnar es capaz de prevenir enfermedades debido a 6A, aunque a un nivel que puede ser algo inferior al de enfermedades por el serotipo 68. Estos datos tambien indican que la proteccion cruzada para enfermedades invasivas debido a 19A esta limitada.

Tabla 2. Resultados preliminares de un estudio de control de casos realizado porel CCE (presentado en ICAAC, 2003)

Serotipo

Conjuntos Informativos, n EV* (IC del 95%)

Tipo de vacuna, todos

115 94 (87, 97)

Relacionado con vacuna, todos

36 70 (38, 86)

Tipo No vacuna, todos

43 -4 (-106,48)

68

27 94 (72, 99)

19F

19 73 (16,92)

6A

15 87 (53, 97)

19A

16 40 (-87, 80)

*Eficacia de la vacuna que compara vacunados (� 1 dosis) frente a no vacunados y ajustada para afecciones subyacentes Referencia 40 y comunicacion personal/confidencial

Un analisis publicado [3] del uso de Prevnar tambien indica que los serotipos 68 y 19F confieren una reduccion moderada en cuanto a ENI ocasionadas por los serotipos 6A y 19A entre ninos menores de dos anos (Tabla 1 en

5 [3]). Los indices de enfermedades entre adultos inmunizados causadas por los serotipos 6A, 9A, 9L, 9N, 18A, 188, 18F, 19A, 198, 19C, 23A y 238 ("todos los serotipos relacionados con la vacuna") se redujeron algo (Tabla 2 en [3]). Estos datos establecen que la inmunidad colectiva procedente del uso de Prevnar en ninos menores de dos anos fue modesta para los serotipos 6A y 19A y proporciona una base para la inclusion de los serotipos 6A y 19A en la vacuna 13vPnC de la presente invencion.

10 Conclusion para la adicion de 6A y 19A

Los resultados de los datos de observacion post-venta y del estudio de control de casos indicados en la FIG. 1 y en la Tabla 2 con la vacuna 7vPnC sugieren que, de acuerdo con otra informacion sobre respuestas inmunes y resultados en los modelos animales descritos anteriormente, puede existir alguna proteccion cruzada contra enfermedades por 6A, pero a un menor grado que contra enfermedades por 68. Adicionalmente, parece que la

15 proteccion contra 19A esta limitada. Por lo tanto, una vacuna 13vPnC que contenga los serotipos 6A y 19A proporciona una proteccion que no depende de las limitaciones de la proteccion cruzada de serogrupos por los serotipos 68 y 19F.

La presente descripcion proporciona una composicion inmunogenica multivalente que comprende 13 conjugados de proteina-polisacarido distintos, en el que cada uno de los conjugados contiene un polisacarido capsular diferente

20 conjugado con una proteina transportadora, y en el que los polisacaridos capsulares se preparan a partir de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 68, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F de Streptococcus pneumoniae, junto con un vehiculo fisiologicamente aceptable. Una proteina transportadora de este tipo es el toxoide difterico denominado CRM197. La composicion inmunogenica puede comprender adicionalmente un adyuvante, tal como un adyuvante basado en aluminio, tal como fosfato de aluminio, sulfato de aluminio e hidroxido de aluminio.

25 Los polisacaridos capsulares se preparan mediante tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia. En la presente descripcion los polisacaridos capsulares se preparan a partir de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 68, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F de Streptococcus pneumoniae. Estos conjugados neumococicos se preparan por procesos independientes y se formulan en una sola formulacion de dosificacion. Por ejemplo, en una realizacion, cada serotipo de polisacarido neumococico se cultiva en un medio basado en soja. Los polisacaridos individuales se

30 purifican despues mediante centrifugacion, precipitacion, ultrafiltracion y cromatografia de columna. Los polisacaridos purificados se activan quimicamente para fabricar los polisacaridos capaces de reaccionar con la proteina transportadora.

Una vez activado, cada polisacarido capsular se conjuga individualmente con una proteina transportadora para formar un glucoconjugado. En una realizacion, cada polisacarido capsular se conjuga con la misma proteina

35 transportadora. En esta realizacion, la conjugacion se efectua por aminacion reductora.

La activacion quimica de los polisacaridos y posterior conjugacion con la proteina transportadora se consigue mediante medios convencionales. Veanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 4.673.574 y 4,902,506 [34,35].

Preferentemente, las proteinas transportadoras son proteinas no-toxicas y no-reactogenicas y que pueden obtenerse con suficiente cantidad y pureza. Las proteinas transportadoras deben prestarse a procedimientos de conjugacion convencionales. En una realizacion particular de la presente invencion, como proteina transportadora se usa el toxoide difterico CRM197.

El CRM197 (Wyeth, Sanford, NC) es una variante no toxica (es decir, toxoide) de la toxina difterica aislada de cultivos de la cepa C7 de Corynebacterium difteria (1197) cultivada en un medio basado en casaminoacidos y extracto de levadura. El CRM197 se purifica mediante ultrafiltracion, precipitacion con sulfato de amonio y cromatografia de intercambio ionico. Como alternativa, el CRM197 se prepara de manera recombinante de acuerdo con la Patente de Estados Unidos N° 5.614.382. Tambien son adecuados, para su uso como proteinas transportadoras, otros toxoides diftericos.

Otras proteinas transportadoras adecuadas incluyen toxinas bacterianas inactivadas tales como el toxoide tetanico, el toxoide tosferinico, toxoide colerico (como se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO2004/083251 [38]), TL de E. coli, ST de E. coli y la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa. Tambien pueden usarse proteinas de membrana externa bacterianas tales como el complejo c de la membrana externa (CPME), porinas, proteinas de union a transferrina, pneumolisina, la proteina A de superficie neumococica (PspA), la proteina de adhesina neumococica (PsaA), la peptidasa C5a de streptococcus del grupo A o del grupo 8 o la proteina D de Haemophilus influenza. Como proteinas transportadoras, tambien pueden usarse otras proteinas, tales como ovoalbumina, hemocianina de lapa californiana (HLC), albumina de suero bovino (AS8) o derivado proteinico purificado (DPP) de tuberculina.

Despues de la conjugacion del polisacarido capsular con la proteina transportadora, los conjugados polisacaridoproteina se purifican (enriquecidos con respecto a la cantidad de conjugado polisacarido-proteina) mediante diversas tecnicas. Estas tecnicas incluyen operaciones de concentracion/diafiltracion, precipitacion/elucion, cromatografia de columna y filtracion en profundidad. Veanse los ejemplos dados mas adelante.

Despues de purificar los glucoconjugados individuales, se combinan para formular la composicion inmunogenica de la presente descripcion, que puede usarse como una vacuna. La formulacion de la composicion inmunogenica de la presente invencion puede conseguirse usando procedimientos reconocidos en la materia. Por ejemplo, para preparar la composicion, los 13 conjugados neumococicos individuales pueden formularse con un vehiculo fisiologicamente aceptable. Los ejemplos de dichos vehiculos incluyen, pero sin limitacion, agua, solucion salina tamponada, polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol liquido) y soluciones de dextrosa.

En algunas realizaciones, la composicion inmunogenica comprendera uno o mas adyuvantes. Como se define en el presente documento, un "adyuvante" es una sustancia que sirve para potenciar la inmunogenicidad de una composicion inmunogenica de la presente descripcion. Por tanto, los adyuvantes se proporcionan frecuentemente para reforzar la respuesta inmunitaria y se conocen bien por los expertos en la materia. Los adyuvantes adecuados para potenciar la eficacia de la composicion incluyen, pero sin limitacion:

(1)

sales de aluminio (alumbre), tales como hidroxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc.;

(2)

formulaciones de emulsion de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimuladores especificos tales como muramil peptidos (definidos mas adelante) o componentes de la pared celular bacteriana), tales como, por ejemplo,

(a)

MF59 (Publicacion PCT N° WO 90/14837), que contiene escualeno 5%, Tween 80 al 0,5% y Span 85 al 0,5% (conteniendo opcionalmente diversas cantidades de MTP-PE (vease mas adelante, aunque no es necesario)) formulado en particulas submicrometricas usando un microfluidizador tal como el microfluidizador modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA),

(b)

SAF, que contiene escualeno al 10%, Tween 80 al 0,4%, polimero L121 bloqueado con pluronic al 5% y thr-MDP (vease mas adelante) microfluidizado en una emulsion submicrometrica o sometido a agitacion vorticial para generar una emulsion de tamano de particula mas grande y

(c)

sistema adyuvante Ribi™ (SAR), (Corixa, Hamilton, MT) que contiene escualeno al 2%, Tween 80 al 0,2% y uno o mas de los componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforil lipido A 3-O-desacilado (MPL™) descrito en la Patente de Estados Unidos N°

4.912.094 (Corixa), dimicolato de trehalosa (DMT) y el esqueleto de la pared celular (EPC), preferentemente MPL + EPC (Detox™);

(3)

pueden usarse adyuvantes de saponina, tales como Quil A o STIMULO™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (Patente de Estados Unidos N° 5.057.540) o particulas generadas de los mismos tales como ISCOM (complejos inmunoestimulantes);

(4)

lipopolisacaridos bacterianos, analogos sinteticos del lipido A, tales como compuestos de fosfato de aminoalquil glucosamina (FAG) o derivados o analogos de los mismos, estan disponibles de Corixa y que se describen en la Patente de Estados Unidos N° 6.113.918; uno de tales FAG es 2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil-amino]etil 2-desoxi-4-O-fosfono-3-O-[(R)-3-tetradecanoil-oxitetradecanoil]-2-[(R)-3tetradecanoil-oxitetradecanoil-amino]-b-D-glucopiranosido, que tambien se conoce como 529 (normalmente

conocido como RC529), que se formula como una forma acuosa o como una emulsion estable, polinucleotidos sinteticos tales como oligonucleotidos que contienen el motivo (o los motivos) CpG (Patente de Estados Unidos N° 6.207.646);

(5)

citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, etc.), interferones (por ejemplo, gamma interferon), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos (FEC-GM), factor estimulante de colonias de macrofagos (FEC-M), factor de necrosis tumoral (FNT), moleculas coestimuladoras 87-1 y 87-2, etc.;

(6)

mutantes destoxificados de una toxina ADP- ribosilante bacteriana tal como la toxina colerica (TC) en una forma silvestre o mutante, por ejemplo, en la que el acido glutamico en la posicion 29 del aminoacido se sustituye por otro aminoacido, preferentemente una histidina, de acuerdo con la solicitud de patente internacional publicada N° WO 00/18434 (vease tambien WO 02/098368 y WO 02/098369), una toxina tosferinica (TT) o una toxina termolabil (TL) de E. coli, particularmente TL-K63, TL-R72, CT-S109, PTK9/G129 (veanse, por ejemplo, los documentos WO 93/13302 y WO 92/19265); y

(7)

otras sustancias que actuan como agentes inmunoestimuladores para potenciar la eficacia de la composicion.

Los muramil peptidos incluyen, pero sin limitacion N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetilnormuramil-L-alanina-2-(1'-2' dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxi-fosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.

Las formulaciones de vacuna de la presente descripcion pueden usarse para proteger o tratar a un ser humano susceptible a una infeccion neumococica por medio de la administracion de la vacuna mediante una via sistemica o mucosa. Esas administraciones pueden incluir inyeccion por via intramuscular, intraperitoneal, intradermica o subcutanea; o mediante administracion mucosa en el tracto oral/alimentario, respiratorio o genitourinario. En una realizacion, para el tratamiento de neumonia u otitis media se usa la administracion intranasal (ya que el transporte nasofaringeo de neumococos puede evitarse mas eficazmente, atenuando por tanto la infeccion en su estado mas precoz).

La cantidad del conjugado en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos adversos significativos. Tal cantidad puede variar dependiendo del serotipo neumococico. Generalmente, cada dosis comprendera de 0,1 a 100 Ig de polisacarido, particularmente de 0,1 a 10 Ig y mas particularmente de 1 a 5 Ig.

Las cantidades optimas de los componentes para una vacuna en particular pueden determinarse mediante estudios convencionales que implican la observacion de las respuestas inmunitarias apropiadas en sujetos. Despues de una vacunacion inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo espaciadas adecuadamente.

En una realizacion particular, la vacuna 13vPnC es una formulacion liquida esteril de polisacaridos capsulares neumococicos de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 68, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F individualmente conjugados con CRM197. Cada dosis de 0,5 ml se formula para contener: 2 Ig de cada sacarido, excepto para 68 a 4 Ig; aproximadamente 29 Ig de proteina transportadora CRM197; 0,125 mg de adyuvante de aluminio elemental (0,5 mg de fosfato de aluminio); y tampon de cloruro de sodio y de succinato de sodio como excipientes. El liquido se carga en jeringas de dosis individuales sin conservante. Despues de agitar, la vacuna es una suspension homogenea blanca lista para la administracion intramuscular.

La eleccion del nivel de dosis para la vacuna 13vPnC es similar a la de la vacuna 7vPnC comercializada (Prevnar). Para todos los serotipos, se selecciono un nivel de dosis de sacarido de 2 Ig, excepto para el 68, que fue de 4 Ig por dosis. La vacuna 7vPnC ha demostrado seguridad, inmunogenicidad y eficacia deseables contra ENI a un nivel de dosis de sacarido de 2 Ig para los serotipos 4, 9V, 14, 18C, 19F y 23F y a la dosis de 4 Ig para el serotipo 68.

El programa de inmunizacion puede seguir el disenado para la vacuna 7vPnC. Por ejemplo, el programa rutinario para bebes y ninos pequenos contra enfermedades invasivas causadas por S. pneumoniae debido a los serotipos incluidos en la vacuna 13vPnC es 2, 4, 6 y 12-15 meses de edad. Las composiciones de la presente descripcion son tambien adecuadas para su uso en ninos mayores, adolescentes y adultos.

Las composiciones de la presente descripcion tambien pueden incluir uno o mas antigenos adicionales para su uso contra la otitis media causada por infeccion con otras bacterias. Tales bacterias incluyen Haemophilus influenza, Moraxella catarrhalis (antiguamente conocida como Branhamella catarrhalis) y Alloiococcus otitidis no tipificables.

Los ejemplos de antigenos de Haemophilus influenzae no tipificable adecuados para la inclusion incluyen la proteina P4 conocida tambien como proteina "e" (Patente de Estados Unidos N° 5.601.831; Solicitud de Patente Internacional WO03/078453), la proteina P6, tambien conocida como proteina PAL o P8OMP-1 (Patente de Estados Unidos N° 5.110.908; Solicitud de Patente Internacional WO0100790), la proteina P5 (Patente de Estados Unidos reexpedida N° 37.741), la proteina de adhesion y penetracion de Haemophilus (Patente de Estados Unidos N° 6.245.337 y 6.676.948), la proteina adhesina de tipo LKP (Patente de Estados Unidos N° 5.643.725) y la proteina NucA (Patente de Estados Unidos N° 6.221.365).

Ejemplos de antigenos de Moraxella catarrhalis adecuados para la inclusion incluyen la proteina UspA2 (Patentes de Estados Unidos N° 5.552.146, 6.310.190), la proteina CD (Patente de Estados Unidos N° 5.725.862), la proteina E (Patente de Estados Unidos N° 5.948.412) y la proteina de membrana externa de 74 kilodalton (Patente de Estados Unidos N° 6.899.885).

Los ejemplos de antigenos de Alloiococcus otitidis adecuados para la inclusion incluyen los identificados en la 5 Solicitud de Patente Internacional WO03/048304.

Las composiciones de la presente descripcion tambien pueden incluir una o mas proteinas de Streptococcus pneumoniae. Ejemplos de proteinas de Streptococcus pneumoniae adecuados para la inclusion incluyen los identificados en la Solicitud de Patente Internacional WO02/083855, asi como los descritos en la Solicitud de Patente Internacional WO02/053761.

10 Las composiciones de la presente invencion pueden incluir adicionalmente una o mas proteinas de Neisseria meningitidis de tipo 8. Los ejemplos de proteinas de Neisseria meningitidis de tipo 8 adecuados para la inclusion incluyen los identificados en las Solicitudes de Patente Internacional WO03/063766, WO2004/094596, WO01/85772, WO02/16612 yWO01/87939.

Activacion del polisacarido del serotipo 3 de S. pneumoniae para la conjugacion

15 La oxidacion parcial de hidratos de carbono en polisacaridos se ha utilizado eficazmente para generar grupos aldehido que despues se acoplan a los restos de lisina de proteinas transportadoras para generar conjugados inmunogenicos (es decir, composiciones tales como vacunas, utiles para estimular o suscitar una respuesta inmunoespecifica en un vertebrado). Para muchas aplicaciones, el proposito general del peryodato de sodio como agente oxidante proporciona una oxidacion eficaz de hidratos de carbono en polisacaridos antes de la conjugacion

20 con proteinas transportadoras. Sin embargo, la oxidacion directa del polisacarido Pn 3 con peryodato de sodio puede producir polisacaridos degradados con pocos aldehidos restantes presentes. Un procedimiento de oxidacion alternativo incorpora acido peryodico en presencia de cationes bivalentes (por ejemplo, Mg2+ o Ca2+ y proporciona una oxidacion eficaz del polisacarido Pn 3 (Tabla 3).

Tabla 3: Datos de oxidaci6n de Pn 3 usando acido pery6dico/MgCl2

ID muestra

Cantidad de acido pery6dico (meq)** Oxidaci6n (horas) Temperatura (°C) GO N°*** Kd N° (CL4B)

PP3* Nativo

0 - 4 0,0 0,048

PP3* Oxidado

0,2 16 25 5,8 0,24

PP3* Oxidado

0,2 72 4 9,0 0,1

PP3* Oxidado

1 16 4 13,2 0,24

PP3* Oxidado

1 16 25 4,1 0,24

PP3* Oxidado

1 72 4 7,9 0,29

*PP3: Pneumo polisacarido nativo de tipo 3 **Meq: equivalente en moles ***GO: Grado de oxidacion

Para reducir la viscosidad y los problemas de filtracion asociados, el polisacarido Pn 3 se sometio primero a hidrolisis/despolimerizacion usando un acido suave, tal como acido acetico, acido citrico o acido carbonico. La oxidacion parcial para producir el polisacarido Pn 3 activado se realiza despues de la hidrolisis/despolimerizacion usando cantidades controladas de un agente oxidante. Puede usarse cualquier agente oxidante selectivo que oxide 30 un grupo hidroxilo terminal de un aldehido, incluyendo oxidasas de azucar especificas (por ejemplo peryodato sodico

o potasico o acido peryodico). Como se ha indicado anteriormente, un agente oxidante preferido es el acido peryodico en presencia de cationes bivalentes. Despues, el polisacarido Pn 3 activado se purifica opcionalmente (por ejemplo, mediante diafiltracion frente a solucion salina tamponada).

El polisacarido Pn 3 activado puede combinarse con una proteina transportadora. Las proteinas transportadoras se

35 seleccionan para aumentar la inmunogenicidad del polisacarido Pn 3 unido y/o suscitar anticuerpos contra la proteina transportadora que son beneficiosos desde el punto de vista del diagnostico, analitico y/o terapeutico. La union covalente de una molecula antigenica (por ejemplo, un polisacarido) a un transportador confiere inmunogenicidad potenciada y dependencia de linfocitos T (Pozsgay y col. (1999) PNAS, 96:5194-97; Lee y col. (1976) J. Immunol., 116:1711-18; Dintzis y col. (1976) PNAS, 73:3671-75). Como se describe en el presente

40 documento las proteinas transportadoras utiles incluyen toxinas bacterianas inactivadas tales como el toxoide tetanico, el toxoide tosferinico, el toxoide colerico (como se describe, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Internacional WO2004/083251), TL de E. coli, ST de E. coli y una exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa. Tambien pueden usarse proteinas de membrana externa bacterianas tales como el complejo c de la membrana externa, porinas, proteinas de union a transferrina, pneumolisina, la proteina A de superficie neumococica, la proteina de adhesina neumococica, la peptidasa C5a de streptococcus del grupo A o del grupo 8 o la proteina D de Haemophilus influenzae. Como proteinas transportadoras tambien pueden usarse otras proteinas, tales como ovoalbumina, hemocianina de lapa californiana, albumina de suero bovino o derivado proteinico purificado de tuberculina. Una proteina transportadora preferida es la toxina difterica mutada CRM197. Opcionalmente, despues de combinarse con la proteina transportadora, la mezcla de polisacarido Pn 3 activado/proteina transportadora se congela (por ejemplo, congelacion en carcasa) y se co-liofiliza.

La conjugacion se realiza haciendo reaccionar la mezcla de polisacarido Pn 3 activado/proteina transportadora con un agente reductor, tal como cianoborohidruro de sodio. Los aldehidos que no han reaccionado se protegen despues mediante reduccion con borohidruro de sodio. El conjugado se purifica (por ejemplo por diafiltracion frente a tampon fosfato seguido de solucion salina tamponada), proporcionando un concentrado en lote final del glucoconjugado en solucion salina tamponada.

La anterior descripcion describe en general la presente invencion. Puede obtenerse una mayor comprension por referencia a los siguientes ejemplos especificos. Estos ejemplos se describen unicamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar el ambito de la presente invencion.

Ejemplos

Ejemplo 1

Preparaci6n del polisacarido capsular de serotipo 1 de S. Pneumoniae

Preparacion de bancos de celulas maestro y de trabajo

El serotipo 1 de S. Pneumoniae se obtuvo de la cepa 6301 de la Coleccion de Americana de Cultivos Tipo, ATCC. Se crearon diversas generaciones de reservas de semilla para ampliar la cepa y eliminar los componentes de origen animal (generaciones F1, F2 y F3). Se produjeron dos generaciones adicionales de reservas de semilla. La primera generacion adicional se preparo a partir de un vial de F3 y la generacion posterior se fabrico a partir de un vial de la primera generacion adicional. Los viales con semilla se conservaron congelados (<-70°C) con glicerol sintetico como crioconservante. Ademas de viales congelados, se prepararon viales liofilizados para la generacion F4. Para la preparacion de banco de celulas, todos los cultivos se cultivaron en un medio basado en soja. Antes de congelar, las celulas se concentraron por centrifugacion, se elimino el medio usado y los sedimentos celulares se resuspendieron en medio reciente que contenia un criocorsenvante tal como glicerol sintetico.

Fermentacion y recogida

Para inocular frascos de semillas que contenian medio basado en soja se usaron los cultivos del banco de celulas de trabajo. Los frascos se incubaron a 36 °C ± 2 °C sin agitacion hasta alcanzar las necesidades del cultivo. Se uso un frasco de semilla para inocular un fermentador de semillas que contenia medio basado en soja. Se mantuvo un pH de aproximadamente 7,0 con solucion de carbonato de sodio esteril. Despues de alcanzar la densidad optica diana, se uso el fermentador de semillas para inocular el fermentador de produccion que contenia medio basado en soja. El pH se mantuvo con solucion de carbonato de sodio esteril. La fermentacion concluyo despues del cese del crecimiento o cuando se alcanzo el volumen de trabajo del fermentador. Al cultivo se le anadio una cantidad apropiada de desoxicolato sodico al 12% esteril para realizar la lisis de las celulas bacterianas y liberar el polisacarido asociado a las celulas. Despues de la lisis, se enfrio el contenido del fermentador. El pH del caldo de cultivo lisado se ajusto a aproximadamente 6,6 con acido acetico. El lisado se depuro por centrifugacion de flujo continuo seguido de filtracion en profundidad y microfiltracion a 0,45 Im.

En un proceso alternativo, el pH de la fermentacion de aproximadamente 7,0 se mantuvo con NaOH 3N. Despues de alcanzar la densidad optica diana, se uso el fermentador de semilla para inocular el fermentador de produccion que contenia medio basado en soja. El pH se mantuvo con NaOH 3N. La fermentacion concluyo despues del cese del crecimiento o cuando se alcanzo el volumen de trabajo del fermentador. Al cultivo se le anadio una cantidad apropiada de desoxicolato sodico al 12% esteril para obtener una concentracion al 0,12% en el caldo, para realizar la lisis de las celulas bacterianas y liberar el polisacarido asociado a las celulas. Despues de la lisis, el contenido del fermentador se mantuvo, con agitacion, durante un intervalo de tiempo entre 8 y 24 horas a una temperatura entre 7 °C y 13 °C, para garantizar que se habia producido la lisis celular por completo y la liberacion del polisacarido. La agitacion durante este periodo de mantenimiento impidio que el sedimento del lisado se asentase en las paredes del fermentador y en la sonda del pH, permitiendo de esta manera mantener la integridad de la sonda del pH. Despues, el pH del caldo de cultivo lisado se ajusto a aproximadamente un pH de 5,0 con acido acetico al 50%. Despues de un tiempo de mantenimiento sin agitacion, durante un intervalo de tiempo entre 12 y 24 horas a una temperatura entre 15 °C y 25 °C, se extrajo una parte significativa de las proteinas previamente solubles de la solucion como un precipitado solido con una pequena perdida o degradacion del polisacarido, que permanecio en solucion. Despues, la solucion con el precipitado se depuro por centrifugacion de flujo continuo seguido de filtracion en profundidad y microfiltracion a 0,45 Im.

Purificacion

La purificacion del polisacarido neumococico consistio en diversas operaciones de concentracion/diafiltracion, precipitacion/elucion, cromatografia en columna y etapas de filtracion en profundidad. Todos los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente a menos que se especifique de otra manera.

El caldo depurado de los cultivos del fermentador del serotipo 1 de S. pneumoniae se concentro y se diafiltro usando un filtro de MWCO (limite de peso molecular en kiloDalton) de 100 kDa. La diafiltracion se consiguio usando tampon de fosfato sodico a pH neutro. La diafiltracion elimino del medio los componentes de bajo peso molecular de los biopolimeros de mayor peso molecular tales como acidos nucleicos, proteinas y polisacaridos.

El polisacarido se precipito de la solucion concentrada y diafiltrada anadiendo bromuro de hexadeciltrimetilamonio (8H) procedente de una solucion de reserva para proporcionar una concentracion final de 8H al 1% (p/v). El precipitado polisacarido/8H se capturo en un filtro de profundidad y el filtrado se desecho. El precipitado con el polisacarido se volvio a disolver y se eluyo volviendo a poner en circulacion una solucion de cloruro de sodio a traves del filtro de profundidad que contenia el precipitado. Los filtros se aclararon despues con una solucion de cloruro de sodio adicional.

A la solucion con el polisacarido se le anadio yoduro de sodio (NaI) procedente de una solucion de reserva de NaI para conseguir una concentracion final del 0,5% para precipitar el 8H. El precipitado se elimino por filtracion en profundidad. El filtrado contenia el polisacarido diana. El recipiente de precipitacion y el filtro se aclararon con una solucion de NaCl/NaI y el aclarado se combino con la solucion parcialmente purificada del polisacarido. El filtro se elimino. Despues, el polisacarido se filtro a traves de un filtro de 0,2 Im.

La solucion con el polisacarido se concentro sobre un ultrafiltro de MWCO de 30 kDa y se diafiltro con una solucion de cloruro de sodio.

La solucion con el polisacarido purificado parcialmente se purifico adicionalmente por filtracion a traves de un filtro de profundidad impregnado con carbono activado. Despues de la filtracion, el filtro de carbono se aclaro con una solucion de cloruro de sodio. El aclarado se combino con la solucion con el polisacarido, que despues se filtro a traves de un filtro de 0,2 Im.

La solucion con el polisacarido se concentro sobre un ultrafiltro de MWCO de 30 kDa y se ajusto con un tampon de fosfato de sodio 1 M para conseguir una concentracion final de fosfato de sodio de 0,025 M. El pH se comprobo y se ajusto a un pH de 7,0 ± 0,2.

La columna de ceramica de hidroxiapatita (HA) se equilibro con tampon de fosfato de sodio que contenia cloruro de sodio para obtener la conductividad apropiada (<15 IS). La solucion con el polisacarido se cargo despues sobre la columna. En estas condiciones, las impurezas se unieron a la resina y el polisacarido se recupero en el flujo a traves de la columna. La solucion con el polisacarido se filtro a traves de filtros en linea de 0,2 Im situados antes y despues de la columna.

La solucion con el polisacarido se concentro usando un filtro de MWCO de 30 kDa. El concentrado de diafiltro despues con Agua Para Inyeccion (API).

La solucion diafiltrada con el polisacarido se filtro a traves de un filtro de membrana de 0,2 Im en frascos de polipropileno. Las muestras se extrajeron para el ensayo de liberacion y el polisacarido purificado se conservo congelado a -25°C ± 5°C.

Caracterizacion

Los datos de RMN-1H concordaron con la estructura quimica por cesion de senales cedidas a los protones de la molecula de polisacarido. El espectro de RMN-1H mostro una serie de senales bien resueltas (protones del grupo metilo) para la cuantificacion del grupo funcional O-acetilo en el polisacarido.

La identidad del polisacarido monovalente se confirmo por inmunoelectroforesis en contracorriente usando antisueros especificos.

Para calcular el peso molecular se uso cromatografia de filtracion en gel de alto rendimiento acoplada con detectores de indice refractario y de dispersion multiangulo de luz laser (MALLS) junto con la concentracion de la muestra.

Para perfilar la distribucion de tamano molecular relativa del polisacarido se uso medio de cromatografia de exclusion por tamano (CL-48).

Ejemplo 2

Preparaci6n del conjugado sacarido neumoc6cico de serotipo 1 -CRM197

Activacion y conjugacion

Se descongelaron envases del polisacarido purificado y se combinaron en un recipiente de reaccion. Al recipiente se

5 anadio carbonato de sodio 0,2 M, pH 9,0, para la desacetilacion parcial (hidrolisis) durante 3 horas a 50 °C. La reaccion se enfrio a 20 °C y la neutralizacion se realizo mediante acido acetico 0,2 M. La oxidacion se realizo en presencia de peryodato de sodio incubando a 2-8 °C y la mezcla se agito durante 15-21 horas.

La mezcla de la reaccion de activacion se concentro y se diafiltro 10x con NaCl al 0,9% usando una membrana de MWCO de 30 kDa. El retenido se filtro a 0,2 Im. El sacarido activado se cargo en frascos de liofilizacion de vidrio de

10 100 ml y se congelaron en carcasa a -75 °C y se liofilizaron.

La "congelacion en carcasa" es un procedimiento para preparar muestras por liofilizacion (criodesecacion). Los matraces giran automaticamente mediante rodillos accionados a motor en un lote refrigerado que contiene alcohol o cualquier liquido apropiado. Un fino recubrimiento de producto se congela homogeneamente alrededor de la "carcasa" interna de un matraz, permitiendo procesar con seguridad un mayor volumen de material durante cada

15 proceso de criodesecacion. Estas unidades refrigeradas, automatizadas proporcionan un medio simple y eficaz de congelacion previa de muchos matraces al mismo tiempo, produciendo los revestimientos deseados en su interior y proporcionando un area superficial suficiente para realizar una criodesecacion eficaz.

Los frascos de material liofilizado se llevaron a temperatura ambiente y se resuspendieron en solucion con CRM197 a una proporcion de sacarido/proteina de 2:1. A la mezcla de sacarido/proteina, se le anadio tampon de fosfato de

20 sodio 1 M a una fuerza ionica final de 0,2 M y a un pH de 7,5, despues se anadio cianobromohidruro de sodio. La reaccion se incubo a 23 °C durante 18 horas, seguido de una segunda incubacion a 37 °C durante 72 horas. Despues de las incubaciones con cianobromohidruro, la mezcla de reaccion se diluyo con solucion salina enfriada seguido de la adicion de carbonato de sodio 1 M para ajustar la mezcla de reaccion a un pH de 9,0. Los aldehidos que no reaccionaron se inactivaron por adicion de borohidruro de sodio por incubacion a 23 °C durante 3-6 horas.

25 La mezcla de reaccion se diluyo 2 veces con solucion salina y se transfirio a traves de un prefiltro de 0,45-5 Im en un recipiente de retenido. La mezcla de reaccion se diafiltro 30x con tampon fosfato 0,15 M, pH 6, y 20x con solucion salina. El retenido se filtro a traves de un filtro de 0,2 Im.

La solucion con el conjugado se diluyo en solucion salina 0,9% a una diana de 0,5 mg/ml y despues se filtro esteril dentro de envases de concentrado de volumen final (CVF) en una campana de Clase 100. El conjugado se conservo

30 a 2 - 8°C.

Caracterizacion

Para perfilar la distribucion de tamano molecular relativa del conjugado se uso medio de cromatografia de exclusion por tamano (CL-48).

La identidad del conjugado se confirmo mediante ensayo de transferencia en ranura usando antisueros especificos.

35 Las concentraciones del sacarido y de la proteina se determinaron mediante ensayos de acido urico y Lowry, respectivamente. La proporcion de sacarido con respecto a proteina en el complejo conjugado unido covalentemente se obtuvo mediante el calculo:

sacarido g/mlProporci6n = proteina g/ml

40 El contenido de O-acetilo se midio mediante el procedimiento de Hestrin (Hestrin et. al., J. 8iol. Chem. 1949, 180, pag. 249). La proporcion de concentracion de O-acetilo con respecto a concentracion de sacarido total proporciona Imoles de O-acetilo por mg de sacarido.

Ejemplo 3

Preparaci6n del polisacarido capsular de serotipo 3 de S. Pneumoniae

45 Preparacion de bancos de celulas maestro y de trabajo

El serotipo 3 de S. pneumoniae se obtuvo del Dr. Robert Austrian, Universidad de Pensilvania, Filadelfia, Pensilvania. Para la preparacion del sistema de banco de celulas vease el Ejemplo 1.

Fermentacion y recogida

Para inocular frascos de semillas que contenian medio basado en soja se usaron los cultivos del banco de celulas de trabajo. Los frascos se incubaron a 36 °C ± 2 °C sin agitacion hasta alcanzar las necesidades del cultivo. Se uso un frasco de semilla para inocular un fermentador de semillas que contenia medio basado en soja. Se mantuvo un pH de aproximadamente 7,0 con solucion de carbonato de sodio esteril. Despues de alcanzar la densidad optica diana, se uso el fermentador de semillas para inocular el fermentador de produccion que contenia medio basado en soja. El pH se mantuvo con solucion de carbonato de sodio esteril. La fermentacion concluyo despues de alcanzar el volumen de trabajo del fermentador. Al cultivo se le anadio una cantidad apropiada de desoxicolato sodico al 12% esteril para realizar la lisis de las celulas bacterianas y liberar el polisacarido asociado a las celulas. Despues de la lisis, se enfrio el contenido del fermentador. El pH del caldo de cultivo lisado se ajusto a aproximadamente 6,6 con acido acetico. El lisado se depuro por centrifugacion de flujo continuo seguido de filtracion en profundidad y microfiltracion a 0,45 Im.

Purificacion

La purificacion del polisacarido neumococico consistio en diversas operaciones de concentracion/diafiltracion, precipitacion/elucion, cromatografia en columna y etapas de filtracion en profundidad. Todos los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente a menos que se especifique de otra manera.

El caldo depurado de los cultivos del fermentador del serotipo 31 de S. pneumoniae se concentro y se diafiltro usando un filtro de MWCO de 100 kDa. La diafiltracion se consiguio usando tampon de fosfato sodico a pH neutro. La diafiltracion elimino del medio los componentes de bajo peso molecular de los biopolimeros de mayor peso molecular tales como acidos nucleicos, proteinas y polisacaridos.

Antes de la adicion de bromuro de hexadeciltrimetilamonio (8H) a la solucion del polisacarido concentrada y diafiltrada se le anadio un volumen calculado de una solucion de reserva de NaCl para proporcionar una concentracion final de NaCl 0,25 M. Despues, el polisacarido se precipito anadiendo 8H procedente de una solucion de reserva para proporcionar una concentracion final de 8H al 1% (p/v). El precipitado polisacarido/H8 se capturo sobre un filtro de profundidad y el filtrado se desecho. El precipitado con el polisacarido se volvio a disolver y se eluyo volviendo a poner en circulacion una solucion de cloruro de sodio a traves del filtro de profundidad que contenia el precipitado. Los filtros se aclararon despues con una solucion de cloruro de sodio adicional.

A la solucion con el polisacarido se le anadio yoduro de sodio (NaI) procedente de una solucion de reserva de NaI para conseguir una concentracion final del 0,5% para precipitar el 8H. El precipitado se elimino por filtracion en profundidad. El filtrado contenia el polisacarido diana. El recipiente de precipitacion y el filtro se aclararon con una solucion de NaCl/NaI y el aclarado se combino con la solucion parcialmente purificada del polisacarido. El filtro se elimino. Despues, el polisacarido se filtro a traves de un filtro de 0,2 Im.

La solucion con el polisacarido se concentro sobre un ultrafiltro de MWCO de 30 kDa y se diafiltro con una solucion de cloruro de sodio.

La solucion con el polisacarido purificado parcialmente se purifico adicionalmente por filtracion a traves de un filtro de profundidad impregnado con carbono activado. Despues de la filtracion, el filtro de carbono se aclaro con una solucion de cloruro de sodio. El aclarado se combino con la solucion con el polisacarido, que despues se filtro a traves de un filtro de 0,2 Im.

La solucion con el polisacarido se concentro sobre un ultrafiltro de MWCO de 30 kDa y se ajusto con un tampon de fosfato de sodio 1 M para conseguir una concentracion final de fosfato de sodio de 0,025 M. El pH se comprobo y se ajusto a un pH de 7,0 ± 0,2.

La columna de ceramica de hidroxiapatita (HA) se equilibro con tampon de fosfato de sodio que contenia cloruro de sodio para obtener la conductividad apropiada (15 IS). La solucion con el polisacarido se cargo despues sobre la columna. En estas condiciones, las impurezas se unieron a la resina y el polisacarido se recupero en el flujo a traves de la columna. La solucion con el polisacarido se filtro a traves de filtros en linea de 0,2 Im situados antes y despues de la columna.

La solucion con el polisacarido se concentro usando un filtro de MWCO de 30 kDa. El concentrado de diafiltro despues con API.

La solucion diafiltrada con el polisacarido se filtro a traves de un filtro de membrana de 0,2 Im en envases de acero inoxidable. Las muestras se extrajeron para el ensayo de liberacion y el polisacarido purificado se conservo congelado a -25°C ± 5°C.

Caracterizacion

Los datos de RMN-1H concordaron con la estructura quimica por cesion de senales cedidas a los protones de la molecula de polisacarido. El espectro de RMN-1H mostro una serie de senales bien resueltas (protones del grupo metilo) para la cuantificacion del grupo funcional O-acetilo en el polisacarido.

La identidad del polisacarido monovalente se confirmo por inmunoelectroforesis en contracorriente usando antisueros especificos.

Para calcular el peso molecular se uso cromatografia de filtracion en gel de alto rendimiento acoplada con detectores de indice refractario y de dispersion multiangulo de luz laser (MALLS) junto con la concentracion de la muestra.

Para perfilar la distribucion de tamano molecular relativa del polisacarido se uso medio de cromatografia de exclusion por tamano (CL-48).

Ejemplo 4

Preparaci6n del conjugado sacarido neumoc6cico de serotipo 3 -CRM197

Activacion y conjugacion

Se descongelaron envases del sacarido de serotipo 3 purificado y se combinaron en un recipiente de reaccion. Al recipiente se anadio API y acido acetico 2 M a una concentracion final de 0,2 M y 2 mg/ml de sacarido. La temperatura de la solucion se elevo a 85 °C durante una hora para hidrolizar el polisacarido. La reaccion se enfrio a : 25 °C y se anadio cloruro de magnesio 1 M a una concentracion final de 0,1 M. La oxidacion se realizo en presencia de peryodato de sodio incubando durante 16-24 horas a 23 °C.

La mezcla de la reaccion de activacion se concentro y se diafiltro 10x con API usando una membrana de MWCO de 100 K. El retenido se filtro a traves de un filtro de 0,2 Im.

Para la combinacion, al sacarido activado se le anadio fosfato sodico 0,2 M, pH 7,0 a una concentracion final de 10 mM y a un pH de 6,0-6,5. La proteina transportadora CRM197 se mezclo con la solucion de sacarido a una proporcion de 2 g de sacarido por 1 g de CRM197. La solucion combinada de sacarido/proteina se cargo en frascos de liofilizacion de vidrio de 100 ml con una carga diana de 50 ml, se congelaron en carcasa a - 75°C y se liofilizaron.

Los frascos del material sacarido/proteina co-liofilizado se llevaron a temperatura ambiente y se resuspendieron en tampon de fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,0, a una concentracion de sacarido final de 20 mg/ml. El pH se ajusto a 6,5 y despues se anadio un equivalente molar de cianoborohidruro de sodio de 0,5. La reaccion se incubo a 37 °C durante 48 horas. Despues de la incubacion con cianoborohidruro, la mezcla de reaccion se diluyo con tampon frio de succinato 5 mM/solucion salina al 0,9%. Los aldehidos que no habian reaccionado se inactivaron por la adicion de borohidruro de sodio e incubacion a 23 °C durante 3-6 horas. La mezcla de reaccion se transfirio a traves de un prefiltro de 0,45-5 Im en un recipiente de retenido.

La mezcla de reaccion se diafiltro 30x con tampon fosfato 0,1 M (pH 9), 20x con tampon fosfato 0,15 M (pH 6) y 20x con succinato 5 mM/solucion salina al 0,9%. El retenido se filtro a traves de un filtro de 0,2 Im.

La solucion con el conjugado se diluyo a una diana de sacarido de 0,5 mg/ml y despues se filtro esteril dentro de envases de CVF en una campana de Clase 100. El conjugado se conservo a 2 -8 °C.

Caracterizacion

Para perfilar la distribucion de tamano molecular relativa del conjugado se uso medio de cromatografia de exclusion por tamano (CL-48).

La identidad del conjugado se confirmo mediante ensayo de transferencia en ranura usando antisueros especificos.

Las concentraciones del sacarido y de la proteina se determinaron mediante ensayos de acido urico y Lowry, respectivamente. La proporcion de sacarido con respecto a proteina en el complejo conjugado unido covalentemente se obtuvo mediante el calculo:

sacarido g/mlProporci6n = proteina g/ml

Ejemplo 5

Preparaci6n del polisacarido capsular de serotipo 5 de S. Pneumoniae

El serotipo 5 de S. pneumoniae se obtuvo del Dr. Gerald Schiffman de la Universidad del Estado de Nueva York, 8rooklyn, Nueva York. Para la preparacion del sistema de banco de celulas, vease el Ejemplo 1. Para la fermentacion, recogida, purificacion y caracterizacion del polisacarido, vease el Ejemplo 1.

Proceso de fermentacion alternativo

Para inocular frascos de semilla que contenian un medio basado en soja y solucion de NaHCO3 esteril 10 mM, se usaron los cultivos del banco de celulas de trabajo. Los frascos se incubaron a 36 °C ± 2 °C sin agitacion hasta alcanzar las necesidades del cultivo. Se uso un frasco de semilla para inocular un fermentador de semilla que contenia medio basado en soja y una solucion de NaHCO3 esteril 10 mM. Se mantuvo un pH de aproximadamente 7,0 con NaOH 3N. Despues de alcanzar la densidad optica diana, el fermentador de semilla se uso para inocular el fermentador de produccion que contenia medio basado en soja con una concentracion de NaHCO3 10 mM. El pH se mantuvo con NaOH 3N. La fermentacion concluyo despues del cese del crecimiento o cuando se alcanzo el volumen de trabajo del fermentador. Al cultivo se le anadio una cantidad apropiada de desoxicolato sodico al 12% esteril para realizar la lisis de las celulas bacterianas y liberar el polisacarido asociado a las celulas. Despues de la lisis, el contenido del fermentador se mantuvo, con agitacion, durante un intervalo de tiempo de entre 8 y 24 horas a una temperatura entre 7°C y 13°C para garantizar que se habia producido la lisis celular completa y la liberacion del polisacarido. La agitacion durante este periodo de mantenimiento impidio que el sedimento del lisado se asentase en las paredes del fermentador y en la sonda del pH, permitiendo de esta manera mantener la integridad de la sonda del pH. Despues, el pH del caldo de cultivo lisado se ajusto a aproximadamente un pH de 4,5 con acido acetico al 50%. Despues de un tiempo de mantenimiento sin agitacion, durante un intervalo de tiempo entre 12 y 24 horas a una temperatura entre 15 °C y 25 °C, de la solucion se extrajo una parte significativa de las proteinas previamente solubles como un precipitado solido con una pequena perdida o degradacion del polisacarido, que permanecio en solucion. Despues, la solucion con el precipitado se depuro por centrifugacion de flujo continuo seguido de filtracion en profundidad y microfiltracion a 0,45 Im.

Ejemplo 6

Preparaci6n del conjugado sacarido neumoc6cico de serotipo 5 -CRM197

Activacion y conjugacion

Se descongelaron envases del sacarido de serotipo 5 y se combinaron en un recipiente de reaccion. Al recipiente se anadio acetato de sodio 0,1 M, pH 4,7 seguido de oxidacion en presencia de peryodato de sodio por incubacion durante 16-22 horas a 23 °C.

La mezcla de la reaccion de activacion se concentro y se diafiltro 10x usando API y una membrana de MWCO de 100 K. El retenido se filtro a traves de un filtro de 0,2 Im.

El sacarido del serotipo 5 activado se combino con CRM197 a una proporcion de 0,8:1. La solucion combinada de sacarido/proteina se cargo en frascos de liofilizacion de vidrio de 100 ml (carga diana 50 ml), se congelaron en carcasa a -75 °C y se co-liofilizaron.

Los frascos del material co-liofilizado se llevaron a temperatura ambiente y se resuspendieron en fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,5, y se anadio cianoborohidruro de sodio. La reaccion se incubo a 30 °C durante 72 horas, seguido de una segunda adicion de cianoborohidruro y se incubo a 30 °C durante 20-28 horas.

Despues de las incubaciones con cianoborohidruro, la mezcla de reaccion se diluyo 2 veces con solucion salina y se transfirio a traves de un prefiltro de 0,45-5 Im dentro de un recipiente de retenido. La mezcla de reaccion se diafiltro 30x con tampon fosfato 0,01 M, pH 8, 20x con tampon fosfato 0,15 M, pH 6 y 20x con solucion salina. El retenido se filtro a traves de un filtro de 0,2 Im.

La solucion con el conjugado se diluyo a una diana de sacarido de 0,5 mg/ml y despues se filtro esteril dentro de envases CVF en una campana de Clase 100. El conjugado se conservo a 2 - 8 °C.

Para la caracterizacion del conjugado, vease el Ejemplo 2.

Ejemplo 7

Preparaci6n del polisacarido capsular de serotipo 6A de S. Pneumoniae

El serotipo 6A de S. pneumoniae se obtuvo del Dr. Gerald Schiffman de la Universidad del Estado de Nueva York, 8rooklyn, Nueva York. Para la preparacion del sistema de banco de celulas, vease el Ejemplo 1. Para la fermentacion, recogida, purificacion y caracterizacion del polisacarido, vease el Ejemplo 1, excepto que durante la purificacion, se omitio la etapa de concentracion MWCO de 30 kDa, antes de la etapa de cromatografia.

Ejemplo 8

Preparaci6n del conjugado sacarido neumoc6cico de serotipo 6A - CRM197

Activacion y conjugacion

El polisacarido del serotipo 6A es un polimero de alto peso molecular cuyo tamano debe reducirse antes de realizar la oxidacion. Se descongelaron envases del sacarido del serotipo 6A y se combinaron en un recipiente de reaccion. Para la hidrolisis, al recipiente se le anadio acido acetico 2 M a una concentracion final de 0,1 M durante 1,5 horas a 60 °C. La reaccion se enfrio a 23 °C y la neutralizacion se realizo ajustando la mezcla de reaccion con NaOH 1 M a pH 6. La oxidacion en presencia de peryodato de sodio se realizo incubando a 23 °C durante 14-22 horas.

La mezcla de la reaccion de activacion se concentro y se diafiltro 10x con API usando una membrana de MWCO de 100 K. El retenido se filtro a traves de un filtro de 0,2 Im.

El serotipo 6A se combino con sacarosa y se cargo en frascos de liofilizacion de vidrio de 100 ml (carga diana 50 ml) y se congelaron en carcasa a -75 °C y se liofilizaron.

Los frascos del material liofilizado se llevaron a temperatura ambiente y se resuspendieron en dimetilsulfoxido (DMSO) a una proporcion de sacarido/proteina de 1:1. Despues de la adicion de cianoborohidruro de sodio, la mezcla de reaccion se incubo a 23 °C durante 18 horas. Despues de la incubacion con cianoborohidruro, la mezcla de reaccion se diluyo con solucion salina enfriada. Los aldehidos que no habian reaccionado se inactivaron por adicion de borohidruro de sodio incubando a 23 °C durante 3-20 horas.

La mezcla de reaccion diluida se transfirio a traves de un prefiltro de 5 Im en un recipiente de retenido. La mezcla de reaccion se diafiltro 10x con NaCl al 0,9% y 30x con NaCl tamponado con succinato. El retenido se filtro a traves de un filtro de 0,2 Im.

La solucion con el conjugado se diluyo a una diana de sacarido de 0,5 mg/ml y despues se filtro esteril dentro de envases CVF en una campana de Clase 100. El conjugado se conservo a 2 - 8 °C.

Para la caracterizacion del conjugado, vease el Ejemplo 2.

Ejemplo 9

Preparaci6n del polisacarido capsular de serotipo 7F de S. Pneumoniae

El serotipo 7F de S. pneumoniae se obtuvo del Dr. Gerald Schiffman de la Universidad del Estado de Nueva York, 8rooklyn, Nueva York. Para la preparacion del sistema de banco de celulas, vease el Ejemplo 1. Para un proceso de fermentacion y de recogida alternativos, vease el proceso alternativo descrito en el Ejemplo 1.

Purificacion

La purificacion del polisacarido neumococico consistio en diversas operaciones de concentracion/diafiltracion, precipitacion/elucion, cromatografia en columna y etapas de filtracion en profundidad. Todos los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente a menos que se especifique de otra manera.

El caldo depurado de los cultivos del fermentador del serotipo 7F de S. pneumoniae se concentro y se diafiltro usando un filtro de MWCO de 100 kDa. La diafiltracion se consiguio usando tampon de fosfato sodico a pH neutro. La diafiltracion elimino del medio los componentes de bajo peso molecular de los biopolimeros de mayor peso molecular tales como acidos nucleicos, proteinas y polisacaridos.

El serotipo 7F no forma un precipitado con el 8H. En cambio, anadiendo el 8H de una solucion de reserva a una concentracion final de 8H al 1%, se precipitaron impurezas procedentes de la solucion concentrada y diafiltrada. El precipitado se capturo sobre un filtro de profundidad y el filtro se desecho. El polisacarido estaba incluido en el filtrado.

A la solucion con el polisacarido se le anadio yoduro de sodio (NaI) procedente de una solucion de reserva de NaI para conseguir una concentracion final del 0,5% para precipitar el 8H. El precipitado se elimino por filtracion en profundidad. El filtrado contenia el polisacarido diana. El recipiente de precipitacion y el filtro se aclararon con una solucion de NaCl/NaI y los aclarados se combinaron con la solucion parcialmente purificada del polisacarido. El filtro se desecho. Despues, el polisacarido se filtro a traves de un filtro de 0,2 Im.

La solucion con el polisacarido se concentro sobre un ultrafiltro de MWCO de 30 kDa y se diafiltro con una solucion de cloruro de sodio.

La solucion con el polisacarido purificado parcialmente se purifico adicionalmente por filtracion a traves de un filtro de profundidad impregnado con carbono activado. Despues de la filtracion, el filtro de carbono se aclaro con una solucion de cloruro de sodio. El aclarado se combino con la solucion con el polisacarido, que despues se filtro a traves de un filtro de 0,2 Im.

La solucion con el polisacarido se concentro sobre un ultrafiltro de MWCO de 30 kDa y se ajusto con un tampon de fosfato de sodio 1 M para conseguir una concentracion final de fosfato de sodio de 0,025 M. El pH se comprobo y se ajusto a un pH de 7,0 ± 0,2.

La columna de ceramica de hidroxiapatita (HA) se equilibro con tampon de fosfato de sodio que contenia cloruro de sodio para obtener la conductividad apropiada (<15 IS). La solucion con el polisacarido se cargo despues sobre la columna. En estas condiciones, las impurezas se unieron a la resina y el polisacarido se recupero en el flujo a traves de la columna. La solucion con el polisacarido se filtro a traves de filtros en linea de 0,2 Im situados antes y despues de la columna.

La solucion con el polisacarido se concentro usando un filtro de MWCO de 30 kDa. El concentrado de diafiltro despues con Agua Para Inyeccion (API).

La solucion de polisacarido diafiltrada se filtro a traves de un filtro de membrana de 0,2 Im en envases de acero inoxidable. Las muestras se eliminaron para el ensayo de liberacion y el polisacarido purificado se conservo a 2 °C 8 °C.

Para la caracterizacion del polisacarido, vease el Ejemplo 3.

Ejemplo 10 Preparaci6n del conjugado sacarido neumoc6cico de serotipo 7F - CRM197

Activacion y conjugacion

La oxidacion en presencia de peryodato de sodio se realizo incubando durante 16-24 horas a 23 °C.

La mezcla de la reaccion de activacion se concentro y se diafiltro 10x con NaOAc 10 mM, pH 4,5 usando una membrana de MWCO de 100K. El retenido se filtro a traves de un filtro de 0,2 Im.

El serotipo 7F se cargo en frascos de liofilizacion de vidrio de 100 ml (carga diana 50 ml) y se congelaron en carcasa a -75 °C y se liofilizaron.

Los frascos liofilizados del serotipo 7F y CRM197 se llevaron a temperatura ambiente y se resuspendieron en DMSO a una proporcion de sacarido/proteina de 1,5:1. Despues de la adicion de cianoborohidruro de sodio, la reaccion se incubo a 23 °C durante 8-10 horas. Los aldehidos que no reaccionaron se inactivaron mediante la adicion de borohidruro de sodio incubando a 23 °C durante 16 horas.

La mezcla de reaccion se diluyo 10 veces con solucion salina enfriada y se transfirio a traves de un prefiltro de 5 Im dentro de un precipitado de retenido. La mezcla de reaccion se diafiltro 10x con solucion salina al 0,9% y 30x con solucion salina tamponada con succinato. El retenido se filtro a traves de un filtro de 0,2 Im.

La solucion con el conjugado se diluyo a una diana de sacarido de 0,5 mg/ml en solucion salina al 0,9% y despues se filtro esteril dentro de envases CVF en una campana de Clase 100. El conjugado se conservo a 2 - 8 °C.

Para la caracterizacion del conjugado, vease el Ejemplo 4.

Ejemplo 11 Preparaci6n del polisacarido capsular de serotipo 19A de S. Pneumoniae

El serotipo 19A de S. Pneumoniae se obtuvo del Dr. Gerald Schiffman de la Universidad del Estado de Nueva York, 8rooklyn, Nueva York. Para la preparacion del sistema de banco de celulas, vease el Ejemplo 1. Para la fermentacion, recogida y purificacion del polisacarido, vease el Ejemplo 7. Para la caracterizacion, vease el Ejemplo

3.

Ejemplo 12 Preparaci6n del conjugado sacarido neumoc6cico de serotipo 19A - CRM197

Activacion y conjugacion

Se descongelaron envases del sacarido de serotipo 19A y se combinaron en un recipiente de reaccion. Se anadio acetato de sodio a 10 mM (pH 5,0) y la oxidacion se realizo en presencia de peryodato de sodio incubando durante 16-24 horas a 23 °C.

La mezcla de la reaccion de activacion se concentro y se diafiltro 10x con acetato 10 mM, pH 5,0, usando una membrana de MWCO de 100 K. El retenido se filtro a traves de un filtro de 0,2 Im.

El sacarido activado se combino con sacarosa seguido de la adicion de CRM197. La mezcla de sacarido 19A activado y CRM197 (proporcion de 8:1) se cargo en frascos de liofilizacion de vidrio de 100 ml (carga diana 50 ml), se congelaron en carcasa a -75 °C y se co-liofilizaron.

Los frascos del material liofilizado se llevaron a temperatura ambiente y se resuspendieron en DMSO y a la mezcla de sacarido/proteina se le anadio cianoborohidruro de sodio (100 mg/ml) La reaccion se incubo a 23 °C durante 15 horas. Despues de la incubacion con cianoborohidruro, los aldehidos que no reaccionaron se inactivaron por adicion de borohidruro de sodio incubando a 23° C durante 3-20 horas.

La mezcla de reaccion se diluyo 10 veces con solucion salina enfriada y se transfirio a traves de un prefiltro de 5 Im dentro de un recipiente de retenido. La mezcla de reaccion se diafiltro 10x con NaCl al 0,9%, se filtro a traves de un filtro de 0,45 Im y 30x con diafiltracion usando tampon succinato 5mM/NaCl al 0,9%, pH 6. El retenido se filtro a traves de un filtro de 0,2 Im.

La solucion con el conjugado se diluyo a una diana de 0,5 mg/ml usando succinato 5mM/solucion salina al 0,9%, y despues se filtro esteril dentro de envases CVF en una campana de Clase 100. El conjugado se conservo a 2 -8 °C.

Para la caracterizacion del conjugado, vease el Ejemplo 4.

Ejemplo 13

Preparaci6n del polisacarido capsular de S. Pneumoniae de serotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y 23F

Preparacion del cultivo de semilla de S. Pneumoniae

Los serotipos 4, 68, 9V, 14, 18C, 19F y 23F de S. Pneumoniae se obtuvieron del Dr. Gerald Schiffman, Universidad del Estado de Nueva York, 8rooklyn, Nueva York. El serotipo 14 de S. Pneumoniae se obtuvo de cepa 6314 de la ATCC.

Individualmente, se uso un vial de cada uno de los serotipos deseados de Streptococcus pneumoniae para comenzar un lote de fermentacion. Dos frascos, que contenian un medio basado en soja y rojo fenol, se ajustaron a un intervalo de pH de 7,4 ± 0,2 usando carbonato de sodio y despues a los frascos se anadio el volumen necesario de una solucion de dextrosa al 50%/sulfato de magnesio al 1%. Los dos frascos se inocularon en diferentes cantidades de semilla. Los frascos se incubaron a 36 °C ± 2 °C hasta que el medio se volvio amarillo. Despues de la incubacion, las muestras se eliminaron de cada frasco y se realizaron ensayos para determinar la densidad optica (DO) (de 0,3 a 0,9) y el pH (4,6 a 5,5). Uno de los dos frascos se selecciono para la inoculacion del fermentador de semilla.

El medio basado en soja se transfirio al fermentador de semilla y se esterilizo. Despues, al fermentador se anadio un volumen de una solucion de dextrosa al 50%/sulfato de magnesio al 1%. Se superviso y se controlo el pH y la agitacion del fermentador de semilla (pH de 6,7 a 7,4). La temperatura se mantuvo a 36 °C ± 2 °C. El inoculo de semilla (frasco) se conecto asepticamente al fermentador de semilla y se transfirio el inoculo. El fermentador se mantuvo a un pH controlado y las muestras se extrajeron periodicamente y se ensayaron para determinar la DO y el pH. Cuando se alcanzo la DO deseada de 0,5 a 600 nm, el fermentador intermedio se inoculo con el caldo de fermentacion desde el fermentador de semilla.

El medio basado en soja se transfirio al fermentador intermedio y se esterilizo. Despues, al fermentador se anadio un volumen de solucion de dextrosa al 50%/sulfato de magnesio al 1%. El pH y la agitacion del fermentador intermedio se controlaron y supervisaron (pH de 6,7 a 7,4). La temperatura se mantuvo a 36°C ± 2°C. El contenido del fermentador de semillas se transfirio al fermentador intermedio. El fermentador se mantuvo en control de pH y las muestras se extrajeron periodicamente y se realizaron ensayos para determinar la DO y el pH. Cuando se alcanzo la DO deseada de 0,5 a 600 nm, el fermentador de produccion se inoculo con el caldo de fermentacion desde el fermentador intermedio.

El medio basado en soja se transfirio al fermentador de produccion y se esterilizo. Despues al fermentador se anadio un volumen de una solucion de dextrosa al 50%/sulfato de magnesio al 1%. El pH y la agitacion del fermentador intermedio se controlaron y supervisaron (pH de 6,7 a 7,4). La temperatura se mantuvo a 36 °C ± 2 °C. El contenido del fermentador de semilla se transfirio al fermentador intermedio. El fermentador se mantuvo en control de pH y las muestras se extrajeron periodicamente y se realizaron ensayos para determinar la DO y el pH, hasta que se completo la fermentacion.

Al fermentador se anadio desoxicolato de sodio a una concentracion final de aproximadamente 0,12% p/v. El cultivo se mezclo durante un minimo de treinta minutos y el valor de ajuste de la temperatura se redujo a 10 °C. El cultivo se incubo durante una noche y tras confirmarse la inactivacion, el pH del cultivo se ajusto a entre 6,6 y 6,8, si fuera necesario, con acido acetico al 50%. La temperatura del fermentador se aumento a 20 °C ± 5°C y el contenido se transfirio a un deposito de retencion de clarificacion.

El contenido del deposito de retencion de clarificacion (incluyendo los residuos celulares) se proceso a traves de una centrifugadora a un caudal entre 25 y 600 litros por hora (excepto el Serotipo 4, en el que los residuos celulares se desecharon y el caudal se estrecho a entre 25 y 250 litros por hora). Las muestras del sobrenadante se extrajeron y se realizaron ensayos para determinar la DO. La DO deseada durante la centrifugacion fue : 0,15.

Inicialmente, el sobrenadante recirculo a traves de un ensamblaje de filtro de profundidad hasta que se consiguio una DO de 0,05 ± 0,03. Despues el sobrenadante se hizo pasar a traves de un ensamblaje de filtro de profundidad y a traves de un filtro de membrana de 0,45 Im hasta el deposito de retencion de filtrado.

Posteriormente, el producto se transfirio a traves de conductos cerrados al area de purificacion para el procesamiento.

Todas las operaciones anteriores (centrifugacion, filtracion y transferencia) se realizaron entre 10 °C a 30 °C.

Para un proceso de fermentacion y de recogida alternativo para los serotipos 4 y 68, vease el proceso alternativo descrito en el Ejemplo 1.

Purificacion

La purificacion de cada polisacarido neumococico consistio en diversas operaciones de concentracion/diafiltracion, precipitacion/elucion, cromatografia en columna, y etapas de filtracion en profundidad. Todos los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente salvo que se especifique de otra manera.

El caldo depurado de los cultivos del fermentador del serotipo de S. pneumoniae deseado se concentro y se diafiltro usando un filtro de MWCO de 100 kDa. La diafiltracion se consiguio usando un tampon con fosfato de sodio a un pH < 9,0. La diafiltracion elimino del medio los componentes de bajo peso molecular de los biopolimeros de mayor peso molecular tales como acidos nucleicos, proteinas y polisacaridos.

El polisacarido se precipito de la solucion concentrada y diafiltrada anadiendo 8H de una solucion de reserva para proporcionar una concentracion final de 8H del 1% (p/v) (salvo el serotipo 23F que tuvo una concentracion final del 2,5%).El precipitado polisacarido/8H se capturo sobre un filtro de profundidad y el filtrado se desecho (Observacion: el serotipo 14 no precipita; por lo tanto el filtrado se conservo). El precipitado con el polisacarido se resolubilizo y se eluyo volviendo a hacer circular una solucion de cloruro de sodio a traves de un filtro de profundidad que contenia el precipitado. Despues los filtros se aclararon con una solucion de cloruro de sodio adicional.

Se anadio yoduro de sodio (NaI) a la solucion con el polisacarido procedente de una solucion de reserva de NaI para conseguir una concentracion final del 0,5% para precipitar el 8H (excepto para el serotipo 68, que tuvo una concentracion final del 0,25%). El precipitado se elimino por filtracion en profundidad. El filtrado contenia el polisacarido diana. El filtrado se desecho. El polisacarido se filtro despues a traves de un filtro de 0,2 Im.

La solucion con el polisacarido se concentro sobre un ultrafiltro de MWCO de 30 kDa y se diafiltro con una solucion de cloruro de sodio.

La solucion con el polisacarido parcialmente purificada se purifico adicionalmente por filtracion a traves de un filtro de profundidad impregnado con carbon activado. Despues de la filtracion, el filtro de carbon se aclaro con una solucion de cloruro de sodio. El aclarado se combino con la solucion con el polisacarido, que despues se filtro a traves de un filtro de 0,2 Im.

La solucion con el polisacarido se concentro sobre un ultrafiltro de MWCO de 30 kDa y el filtro se aclaro con una solucion de cloruro de sodio. El pH se comprobo y se ajusto a 7,0 ± 0,3.

La columna de hidroxiapatita (HA) de ceramica se equilibro con tampon fosfato de sodio que contenia cloruro de sodio hasta un pH de 7,0 ± 0,3 y la conductividad fue de 26 ± 4 IS. La solucion con el polisacarido se cargo despues sobre la columna. En estas condiciones, las impurezas unidas a la resina y el polisacarido se recuperaron en el flujo a traves de la columna. La solucion con el polisacarido se filtro a traves de un filtro de 0,2 Im.

La solucion con el polisacarido se concentro usando un filtro de MWCO de 30 kDa. El concentrado despues se diafiltro con API hasta que la conductividad fue < 15 IS.

La solucion con el polisacarido diafiltrado se filtro a traves de un filtro de membrana de 0,2 Im en envases de volumen y se conservaron a 2-8°C.

Ejemplo 14

Preparaci6n de los conjugados sacarido neumoc6cico -CRM197 para los serotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y 23F

Proceso de activacion

Como se describe en este ejemplo, los sacaridos de diferentes serotipos siguieron rutas diferentes para la activacion (hidrolisis o no hidrolisis antes de activacion) y la conjugacion (reacciones acuosas o con DMSO).

El polisacarido se transfirio desde los envases de volumen al recipiente del reactor. Despues, el polisacarido se diluyo en API y fosfato de sodio a un intervalo de concentracion final de 1,6 - 2,4 mg/ml.

Etapa 1.

Para los serotipos 68, 9V, 14, 19F y 23F, el pH se ajusto a 6,0 ± 0,3.

Para el serotipo 4, se anadio acido clorhidrico (concentracion de acido final de 0,01 M) y la solucion se incubo durante 25 -35 minutos a 45 ± 2 °C. La hidrolisis se detuvo enfriando a 21 -25 °C y anadiendo fosfato sodico 1 M a una diana de pH 6,7 ± 0,2. Se realizo un ensayo en proceso par confirmar un nivel apropiado de despiruvilacion.

Para el serotipo 18C se anadio acido acetico glacial (concentracion de acido final de 0,2 M) y la solucion se incubo durante 205 - 215 minutos a 94 ± 2 °C. Despues la temperatura disminuyo a 21 - 25 °C y se anadio fosfato sodico 1 2 M a una diana de pH 6,8 ± 0,2.

Etapa 2: Reacci6n con peryodato

Los equivalentes molares de peryodato de sodio necesarios para la activacion del sacarido neumococico se determinaron usando el contenido de sacarido total (excepto para el serotipo 4). Para el serotipo 4 se uso una proporcion de 0,8-1,2 moles de peryodato de sodio por mol de sacarido. Mezclando cuidadosamente, la reaccion de oxidacion se permitio continuar entre 16 a 20 horas a 21 -25°C para todos los serotipos excepto para el 19F para el cual la temperatura era : 15 °C.

Etapa 3: ultradiafiltraci6n

El sacarido oxidado se concentro y se diafiltro con API (tampon de fosfato de sodio 0,01 M pH 6,0 para el serotipo 19F) sobre un ultrafiltro de MWCO de 100 kDa (ultrafiltro de 5 kDa para el serotipo 18C). El filtrado se desecho y el retenido se filtro a traves de un filtro de 0,22 Im.

Etapa 4: Liofilizaci6n

Para los serotipos 4, 9V y 14 el sacarido concentrado se mezclo con proteina la transportadora CRM197, se cargo en frascos de vidrio, se congelaron en carcasa y se conservaron a : -65°C. El sacarido concentrado/CRM197 congelado se liofilizo y despues se conservo a -25 °C ± 5 °C.

Para los serotipos 68, 19F y 23F, se anadio una cantidad especifica de sacarosa que se calculo para conseguir una concentracion de sacarosa del 5% ± 3% en la mezcla de reaccion de conjugacion. El serotipo 18C no necesito la adicion de sacarosa. El sacarido concentrado se cargo despues en frascos de vidrio, se congelaron en carcasa y se conservaron a : -65°C. El sacarido concentrado congelado se liofilizo y despues se conservo a -25°C ± 5°C.

Proceso de conjugacion

Se usaron dos procesos de conjugacion: conjugacion acuosa para los serotipos 4, 9V, 14 y 18C, y conjugacion con DMSO para los serotipos 68, 19F y 23F.

Conjugacion acuosa

Etapa 1: Disoluci6n

Para los serotipos 4, 9V y 14, la mezcla sacarido activado-CRM197 liofilizada se descongelo y se equilibro a temperatura ambiente. La mezcla sacarido activado-CRM197 liofilizada se reconstituyo despues en tampon de fosfato de sodio 0,1 M a una proporcion tipica de:

•

1 l de tampon por 16 -24 g de sacarido para los serotipos 4 y 9V

•

1 l de tampon por 6 - 10 g de sacarido para el serotipo 14

La mezcla de reaccion se incubo a 37 °C ± 2 °C hasta la disolucion total para el serotipo 9V y a 23 °C ± 2 °C para los serotipos 4 y 14.

Para el serotipo 18C, el sacarido liofilizado se reconstituyo en una solucion de CRM197 en fosfato sodico dibasico 1 M a una proporcion tipica de 0,11 l de fosfato sodico por 1 l de solucion CRM197. La mezcla de reaccion (concentracion de sacarido 8-12 g/l) se incubo a 23 °C ± 2 °C hasta la disolucion total.

En esta fase, el pH se ensayo como un control de proceso interno.

Etapa 2: Reacci6n de conjugaci6n

Para los serotipos 4 y 9V la reaccion de conjugacion se inicio anadiendo la solucion de cianoborohidruro de sodio (100 mg/ml) para conseguir 1,0-1,4 moles de cianoborohidruro de sodio por mol de sacarido. La mezcla de reaccion se incubo durante 44 - 52 horas a 37 ° ± 2 °C. Despues, la temperatura se redujo a 23 ° ± 2 °C y al reactor se anadio cloruro de sodio al 0,9%. Se anadio solucion de borohidruro de sodio (100 mg/ml) para conseguir 1,8 -2,2 equivalentes molares de bromohidruro de sodio por mol de sacarido. La mezcla se incubo durante 3 -6 horas a 23 ° ± 2 °C. La mezcla se diluyo con cloruro de sodio al 0,9% y se aclaro el reactor. La mezcla de conjugacion diluida se filtro usando un prefiltro de 1,2 Im en un recipiente de retencion.

Para los serotipos 14 y 18C, la reaccion de conjugacion se inicio anadiendo la solucion de cianoborohidruro (100

5 mg/ml) para conseguir 1,0-1,4 moles de cianoborohidruro de sodio por mol de sacarido. La mezcla de reaccion se incubo durante 12 -24 horas a 23 ° ± 2 °C. La temperatura se aumento a 37 ° ± 2 °C y la reaccion se incubo durante 72 -96 horas. Despues la temperatura se redujo a 23 ° ± 2 °C y al reactor se anadio cloruro de sodio al 0,9%. Se anadio solucion de borohidruro de sodio (100 mg/ml) para conseguir 1,8 -2,2 equivalentes molares de borohidruro de sodio por mol de sacarido. La mezcla se incubo durante 3 -6 horas a 23 ° ± 2 °C. La mezcla se diluyo con cloruro

10 de sodio al 0,9% y el reactor se aclaro. La mezcla de conjugacion diluida se filtro despues usando un prefiltro de 1,2 Im en un recipiente de retencion.

Etapa 3: ultrafiltraci6n de 100 kDa

La mezcla de conjugacion diluida se concentro y se diafiltro sobre un ultrafiltro de MWCO de 100 kDa bien con un minimo de 15 volumenes (serotipo 4) o bien con 40 volumenes (serotipos 9V, 14 y 18C) de cloruro de sodio al 0,9%.

15 El filtrado se desecho. Para el serotipo 4 el retenido se filtro a traves de un filtro 0,45 Im. En esta etapa se realizo un control de proceso interno (contenido de sacarido).

Etapa 4: Purificaci6n en columna de HA.

Esta etapa solo se realizo para el conjugado del serotipo 4.

20 La columna de HA se neutralizo primero usando tampon de fosfato de sodio 0,5 M (pH 7,0 ± 0,3) y despues se equilibro con cloruro de sodio al 0,9%. El retenido filtrado (serotipo 4) se cargo sobre la columna a un caudal de 1,0 Umin. La columna se lavo con cloruro de sodio al 0,9% a un caudal de : 2,0 Umin. El producto se eluyo despues con tampon de fosfato de sodio 0,5 M a un caudal de : 2,0 Umin.

La fraccion de HA se concentro despues y se diafiltro sobre una membrana de MWCO de 100 kDa con un minimo 25 de 20 volumenes de cloruro de sodio 0,9%. El filtrado se desecho.

Etapa 5: Filtraci6n esteril.

Despues de la diafiltracion MWCO de 100 kDa el retenido se filtro a traves de un filtro de 0,22 Im. En el producto filtrado se realizaron controles de proceso interno (contenido de sacarido, proteina libre, sacarido libre y cianuro). Sobre el retenido filtrado se realizaron controles de proceso interno para determinar si para cumplir con las dianas

30 de CVF eran necesarias concentracion, diafiltracion y/o dilucion adicionales. En muestras de CVF, se repitieron estos ensayos y ensayos adicionales.

Segun sea necesario, el conjugado filtrado se diluye con cloruro de sodio al 0,9% para conseguir una concentracion final de menos de 0,55 g/l. En esta fase se realizaron ensayos de liberacion para determinar el contenido de sacarido, contenido de proteina y la proporcion de sacarido: proteina.

35 Finalmente, el conjugado se filtro (0,22 Im) y se cargo en cartuchos de acero inoxidable de 10 l a una cantidad tipica de 2,64 g/cartucho. En esta fase, como controles de proceso interno se realizo la determinacion de la produccion, contenido de sacarido, contenido de proteina, pH, proporcion de sacarido:proteina y contenido de lisina. En esta fase se realizo un ensayo de liberacion (determinacion del aspecto, proteina libre, sacarido libre, endotoxina, tamano molecular, cianuro residual, identidad del sacarido, identidad de CRM197).

40 Conjugacion con DMSO

Etapa I: Disoluci6n

Los serotipos 68, 19F, 23F del sacarido activado liofilizado y la proteina transportadora CRM197 liofilizada se equilibraron a temperatura ambiente y se reconstituyeron en DMSO. La concentracion de la disolucion tipicamente variaba de 2-3 gramos de sacarido (2-2,5 g proteina) por litro de DMSO.

45 Etapa II: Reacci6n de conjugaci6n

El sacarido activado y la proteina transportadora CRM197 se mezclaron durante 60 -75 minutos a 23 ° ± 2 °C a una proporcion en el intervalo de 0,6 g -1,0 g de sacarido/g de CRM197 para los serotipos 68 y 19F o de 1,2 a 1,8 g de sacarido/g de CRM197 para el serotipo 23F.

La reaccion de conjugacion se inicio anadiendo la solucion de cianoborohidruro de sodio (100 mg/ml) a una proporcion de 0,8 -1,2 equivalentes molares de cianoborohidruro de sodio a un mol de sacarido activado. Se anadio API a la mezcla de reaccion a una diana deL 1% (v/v) y la mezcla se incubo durante mas de 40 horas a 23 ° ± 2 °C.

A la reaccion se anadio solucion de borohidruro de sodio, 100 mg/ml (1,8 -2,2 equivalentes molares tipicos de borohidruro de sodio por mol de sacarido activado) y API (diana al 5% v/v) y la mezcla se incubo durante 3 -6 horas a 23 ° ± 2 °C. Este procedimiento redujo todos los aldehidos que no habian reaccionado presentes en los sacaridos. Despues la mezcla de reaccion se transfirio a un tanque de dilucion que contenia cloruro de sodio al 0,9% a < 15°C.

Etapa III: ultrafiltraci6n de 100 kDa

La mezcla del conjugado diluido se filtro a traves de un filtro de 1,2 Im y se concentro y se diafiltro sobre una membrana de MWCO 100 kDa con un minimo de 15 volumenes de cloruro de sodio al 0,9% (para el serotipo 23 F se uso tampon de fosfato de sodio 0,01 M/NaCl 0,05 M). El filtrado se desecho. El retenido se filtro a traves de un filtro de 0,45 Im. En esta fase se tomo una muestra para determinar el contenido de sacarido mediante un proceso interno.

Etapa I�: Purificaci6n en columna DEAE

Esta etapa solo se realizo para el serotipo 23F.

La columna DEAE se equilibro con tampon de fosfato de sodio 0,01 M/cloruro de sodio 0,5 M. El retenido filtrado (serotipo 23F) se cargo sobre la columna y se lavo con tampon fosfato de sodio 0,01 M/cloruro de sodio 0,5 M. Despues la columna se lavo con tampon de fosfato de sodio 0,01 M/NaCl al 0,9%. Despues el producto se eluyo con tampon de fosfato de sodio 0,01 M/cloruro de sodio 0,5 M.

Etapa �: ultrafiltraci6n con 100 kDa

El retenido de 68 y 19F se concentro y se diafiltro con al menos 30 volumenes de cloruro de sodio al 0,9%. El filtrado se desecho.

El eluado del serotipo 23F se concentro y se diafiltro con un minimo de 20 volumenes de cloruro de sodio al 0,9%. El filtrado se desecho.

Etapa �I: filtraci6n esteril

Despues de la diafiltracion MWCO de 100 kDa el retenido se filtro a traves de un filtro de 0,22 Im. En el producto filtrado se realizaron controles de proceso interno (contenido de sacarido, proteina libre, sacarido libre, DMSO residual y cianuro residual). Sobre el retenido filtrado se realizaron controles de proceso interno para determinar si para cumplir con las dianas de CVF eran necesarias concentracion, diafiltracion y/o dilucion adicionales. En muestras de CVF, se repitieron estos ensayos y ensayos adicionales.

Segun sea necesario, el conjugado filtrado se diluye con cloruro de sodio al 0,9% para conseguir una concentracion final de menos de 0,55 g/l. En esta fase se realizaron ensayos de liberacion para determinar el contenido de sacarido, contenido de proteina y la proporcion de sacarido: proteina.

Finalmente, el conjugado se filtro (0,22 Im) y se cargo en cartuchos de acero inoxidable de 10 l a una cantidad de 2,64 g/cartucho. En esta fase, como controles de proceso interno, se realizo la determinacion de la produccion, contenido de sacarido, contenido de proteina, pH, proporcion de sacarido:proteina y contenido de lisina. En esta fase se realizo un ensayo de liberacion (determinacion del aspecto, proteina libre, sacarido libre, endotoxina, tamano molecular, cianuro residual, DMSO residual, identidad del sacarido e identidad de CRM197).

Ejemplo 15

Formulaci6n de una vacuna conjugada neumoc6cica multivalente

Los concentrados de volumen final de los 13 conjugados contienen cloruro de sodio al 0,85%. Los concentrados de volumen del tipo 3, 6A, 7F y 19A tambien contienen tampon de succinato de sodio 5 mM a un pH de 5,8. Los volumenes necesarios de los concentrados de volumen se calcularon basandose en el volumen del lote y las concentraciones de volumen de sacarido. Despues de anadir al recipiente de formulacion, previamente etiquetado, el 80% de la (solucion salina fisiologica) de cloruro de sodio al 0,85% y la cantidad necesaria de tampon succinato, se anadieron los concentrados de volumen. Despues, la preparacion se filtro esteril a traves de una membrana de 0,22 Im en un segundo envase usando una unidad de filtro de membrana Durapore de Milipore. El primer envase se lavo con el restante 20% de cloruro de sodio al 0,85% en la disolucion se paso a traves del mismo filtro y se recogio en el segundo envase. El volumen formulado se mezclo cuidadosamente durante y despues de la adicion de fosfato de aluminio a granel. El pH se comprobo y se ajusto si fuera necesario. El producto de volumen formulado se conservo a 2-8°C.

El producto de volumen formulado se cargo en jeringas de vidrio de borosilicato de Tipo 1 obtenidas en 8ecton Dickinson. La vacuna se controlo a intervalos regulares para determinar la turbidez con objeto de garantizar la uniformidad de la operacion de carga. La vacuna cargada (Producto Final) se conservo a 2-8 °C.

Ejemplo 16

Inmunogenicidad de la vacuna conjugada 13-valente

Hasta ahora, los estudios preclinicos realizados sobre la vacuna 13vPnC se han realizado en conejos. Se disenaron los estudios N° HT01-0021 y N° HT01-0036 para examinar independientemente el efecto de la conjugacion quimica de polisacaridos capsulares (PSs) de S. pneumoniae con CRM197 y el efecto del adyuvante fosfato de aluminio (AIPO4) sobre la respuesta inmunitaria contra la vacuna 13vPnC en conejos. Estos efectos se caracterizaron por ensayo ELISA especifico de antigenos para las concentraciones de IgG en suero y para la funcion de anticuerpos por ensayo opsonofagocitico (OPA).

Estudio �� H�01�0021

El estudio N° HT01-002 examino la capacidad de la vacuna 13vPnC con el adyuvante AIPO4 para suscitar respuestas inmunitarias especificas de serotipo. Los serotipos neumococicos representados en la vacuna 13vPnC incluyen los tipos 1, 3, 4, 5, 6A, 68, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F. Objetivos secundarios incluyeron una evaluacion de la cinetica y de la duracion de la respuesta frente a los anticuerpos. Se inmunizaron conejos 8lancos de Nueva �elanda (N�) por via intramuscular la semana 0 y la semana 2 con la dosis clinica humana planificada de cada polisacarido (2 Ig de cada PS, excepto 4 Ig para el serotipo 68) formulada con o sin AIPO4 (100 Ig/dosis). Se recogieron sueros a diversos puntos de tiempo. La IgG especifica de serotipo se midio por ELISA y la actividad funcional se evaluo por OPA.

La Tabla 4 muestra la titulacion media geometrica (TMG) conseguida en muestras de suero agrupadas, despues de dos dosis de la vacuna 13vPnC. Se uso una proporcion de las TMG de IgG para comparar las respuestas de la semana 4 a la semana 0. Estos datos demuestran que la inclusion de AIPO4 en la formulacion de 13vPnC suscito niveles mas altos de anticuerpos IgG en comparacion con la misma vacuna sin adyuvante. Aunque las respuestas frente a anticuerpos fueron superiores cuando se incluyo AIPO4 en la formulacion, estos aumentos no fueron estadisticamente significativos.

Tambien se evaluaron respuestas de anticuerpos funcionales en conejos despues de inmunizacion con las dos formulaciones de 13vPnC (Tabla 5). Cuando se compararon las formulaciones de las vacunas con o sin adyuvante, mediante ensayo OPA se observaron las TMG mas elevadas en el grupo de tratamiento con la vacuna 13vPnC + AIPO4. En los dos grupos, las titulaciones mediante ensayo OPA se detectaron en los grupos de suero de la semana 4 en todos los serotipos de la vacuna. Para la mayoria de los serotipos, las titulaciones mediante ensayo OPA medidas a la semana 4 fueron al menos 4 veces mayores que las de la semana 0 (linea base).

Se evaluaron las respuestas cineticas para cada uno de los serotipos de la vacuna 13vPnC de los grupos de suero de los dos grupos de tratamiento. Las titulaciones de IgG para cada serotipo se midieron de extracciones de sangre a la semana 0 y a las semanas 1, 2, 3, 4, 8, 12, 26 y 39 y despues se compararon. Con la excepcion del serotipo 1, las respuestas de anticuerpos en animales que recibieron la vacuna con adyuvante fueron superiores a las que recibieron la vacuna sin adyuvante y alcanzaron el maximo a la semana 2 del programa de inmunizacion (datos no mostrados).

Globalmente, los datos indican que la vacuna 13vPnC formulada con fosfato de aluminio es inmunogenica en conejos, suscitando respuestas de anticuerpos sustanciales contra los polisacaridos capsulares neumococicos contenidos en la vacuna y estas respuestas estan asociadas con una actividad funcional. Las respuestas observadas para los siete serotipos nucleo despues de inmunizacion con 13vPnC + AIPO4 coincidieron con las respuestas historicas de conejos con respecto a la formulacion heptavalente.

Tabla 4: Respuestas inmunes de IgG de conejo (TGM) despu�s de inmunizaci6n con dos dosis de glucoconjugado neumoc6cico 13-valente

Diluyente con ALPO4a 13vPnC 13vPnC � ALPO4a

aSemana 4 Semana 4 Semana Semana Proporci6n Semana Proporci6n Semana Proporci6n Serotipo 0 4 Sem 4:Sem 0 0 (IC 95�) Sem 4:Sem 0 0 (IC 95�) Sem 4:Sem 0

5,926 (2,758-11,091 (5,327

1 <100 <100 1,0 50 119 50 222 2,733) 23,093)

2846,647 (2,773-16,443 (7,096

3 <100 <100 1,0 50 133 58 15,932) 38,106)

58413,554 (8,031-29,183 (15,342

4 <100 <100 1,0 50 271 50 22,875) 55,508)

3345,859 (2,450-16,714 (6,959

5 134 <100 0,4 50 117 50 14,009) 40,140)

76822,415 (11,987-63,734 (21,141

6A 141 <100 0,4 74 303 83 41,914) 192,146)

4358,108 (3,564-23,505 (11,286

6B <100 <100 1,0 57 142 54 18,444) 48,955)

49643,591 (26,931-84,888 (46,445

7F 3,859 579 0,2 171 444 143 70,557) 155,151)

15,780 (7,193-43.331b (23,256-217

9V 289 995 3,4 205 125 208 34,616) 71,510)

3226,906 (3,416-16,076 (9,649

14 437 177 0,4 61 113 70 13,962) 26,785)

70121,283 (15,770-35,040 (24,708

18C <100 <100 1,0 50 426 50 28,725) 49,692) 1.951

113,599 280,976 (119,587

19A <100 <100 1,0 121 (54,518-939 144 660,167)236,707)

49814,365 (7,346-24,912 (9,243

19F <100 <100 1,0 50 287 50 28,090) 67,141) 3015,323 (1,894-15,041 (4,711

23F <100 <100 1,0 50 106 50 14,962) 48,018)

a.

Las TMG de sueros agrupados consisten en los mismos volumenes de suero de cada conejo individual dentro de un grupo

b.

Estadisticamente diferente (p=0 022) del grupo de tratamiento sin ALPO4

Tabla 5: TMG por OPA de S. pneumoniae para grupos de suero de conejos de N� despu�s de inmunizaci6n con dos dosis de glucoconjugado neumoc6cico 13-valente

13vPnCa 13vPnC � ALPO4a

Proporci6n Proporci6n Semana 4: Semana 4: Serotipo Semana 0 Semana 4 Semana 0 Semana 0 Semana 4 Semana 0

<8 64 16 <8 64 16

3 <8 8 2 <8 164

4 <8 16 4 <8 32 8

5 <8 128 32 <8 512 128

6A 8 128 16 8 512 64 6B <8 256 64 8 1,024 128 7F 8 64 8 8 12816 9V 8 64 8 8 12816 14 1632 2 1632 2 18 C 8 256 32 <8 256 64 19A <8 256 64 <8 1,024 256 19F <8 128 32 <8 512 128 23F 8 64 8 <8 25664

A: Los grupos consisten en los mismos volumenes de suero de conejos individuales dentro de un grupo de tratamiento (n = 12)

Estudio �� H�01�0036

5 El estudio N° HT01-0036 comparo las respuestas inmunitarias de los conejos con respecto a los polisacaridos (PS) contenidos en la vacuna, despues de inmunizacion con la vacuna 13vPnC con o sin conjugacion con la proteina CRM197. Se inmunizaron conejos blancos de Nueva �elanda por via intramuscular la semana 0 y la semana 2 con una dosis de 2,2 Ig de cada PS (excepto 4,4 Ig para el serotipo 68). Los animales recibieron una de las tres preparaciones de vacuna: (a) 13vPnC (PS directamente conjugado con CRM197), (b) 13vPnPS, (sin PS) o (c)

10 13vPnPS + CRM197 (sin PS mezclado con CRM197). Todas las preparaciones de vacuna contenian AIPO4 como adyuvante a 125 Ig/dosis.

Las respuestas inmunes especificas de serotipo para todas las preparaciones de vacuna se evaluaron en un ensayo ELISA para IgG y ensayo OPA mediado por complemento para medir los anticuerpos funcionales. Las respuestas inmunes se compararon entre los grupos de tratamiento.

15 La Tabla 6 representa los datos TMG obtenidos de extracciones de sangre la semana 4 analizadas en los ensayos ELISA para IgG especificos de antigeno. Analisis adicionales muestran la proporcion de los valores TMG de la semana 4 con respecto a la semana 0. Los datos indican que la preparacion de vacuna conjugada suscita mayores titulaciones de IgG en suero que la vacuna sin PS o sin PS + CRM197. Con la excepcion del tipo 14 de S. pneumoniae, la vacuna 13vPnC fue capaz de inducir anticuerpos funcionales con respecto a las cepas

20 representativas de S. pneumoniae en un ensayo OPA (Tabla 7). Despues de dos inmunizaciones con la vacuna 13vPnPS o 13vPnPS + CRM197, ninguna pudo inducir titulaciones OPA 8 veces a la semana 4 con respecto a la semana 0 para 10 de los 13 serotipos medidos (Tabla 7).

Para concluir, estos resultados indican que la conjugacion de los polisacaridos de la vacuna neumococica 13-valente producen titulaciones de IgG en suero mas altas y en general una mayor actividad de anticuerpos funcionales que la

25 observadasolo sin polisacarido o mezcladacon CRM197 no conjugada.

Tabla 6: Respuestas IgG en conejos (TMG) para PnPS por ELISA despu�s de inmunizaci6n con dos dosis del glucoconjugado neumoc6cico 13-valente

13vPnPS (sin PS) 13vPnPS=CRM197 (PS mezclado con CRM197) 13vPnC Semana 4Proporci6n Semana 4Proporci6n Semana 4Proporci6n Serotipo Semana 0 (IC 95�) Sem.4:Sem 0 Semana 0 (IC 95�) Sem.4:Sem 0 Semana 0 (IC 95�) Sem.4:Sem 0

2,2901,95935,9701 378 5,8 395 5,0 472 76,2 (843-5,790) (809-4,739) (29,130-44,417)

24016310,4143 57 4,2 89 1,8 50 208,3 (64-908) (74-358) (10,414-16,676)

37960712,8904 50 7,6 50 12,1 50 257,8 (150-959) (313-1,178) (9,117-18,224)

22632135,2645 343 45 50 64 50 705,3 (113-450) (147-701) (24,467-50,824)

466210234,2456A 154 3,0 98 2,1 163 1,437,1 (316-688) (95-464) (167,152-328,283)

72774533,5996B 63 11,6 62 12,0 131 256,5 (384-1,375) (384-1,440) (22,934-49,222)

617235,7027F 50 1,2 50 1,4 50 714,0 (39-95) (47-111) (24,350-52,347)

10416950,0339V 50 2,1 55 3,0 50 1,000,7 (48-195) (74-390) (34,765-72,007)

29819520,12114 66 45 50 3,9 50 402,4 (117-757) (71-535) (12,087-32,138)

1,55576171,45118 C 89 17,5 66 11,5 101 707,4 (655-3,688) (300-1,935) (32,745-124,641)

898023,48519A 50 1,8 50 1,6 50 469,7 (44-179) (39-163) (12,857-42,723)

1,36299119,35819F 61 22,3 61 16,3 67 288,9 (559-3,317) (370-2,654) (12,553-33,173)

1,08563845,97223F 73 14,9 121 5,3 68 676,1 (487-2,420) (311-1,311) (25,134-84,089)

Tabla 7: Titulaciones OPA de S. pneumoniae para grupos de suero de conejo despu�s de inmunizaci6n con dos dosis de vacunas neumoc6cicas 13-valentes

Titulaciones OPA

Sin Tratamiento

13vPnPS (sin PS) 13vPnPS�CRM197 (sin PS mezclado con CRM197) 13vPnC

Serotipo

Semana 0a Semana 4 Proporci6n Sem. 4: Sem. 0 Semana 4 Proporci6n Sem. 4: Sem. 0 Semana 4 Proporci6n Sem. 4: Sem. 0

1

4 16 4 16 4 8 32

3

4 4 1 4 1 4 8

4

4

4

1 4 1 4 64

5

4 32 8 16 4 16 64

6A

8 64 8 32 4 32 664

6B

8 64 8 32 4 32 32

7F

16 32 2 16 1 16 16

9V

16 16 1 32 2 32 8

14

16 16 1 16 1 16 2

18C

4 16 4 16 4 8 64

19A

8 8 1 8 1 16 64

19F

4 4 1 4 1 8 64

23F

16 32 2 16 1 32 32

a: Usado como valores a la semana 0 para todos los grupos

Ejemplo 17

5 Procedimiento alternativo para la conjugaci6n del sacarido neumoc6cico de serotipo 3 - CRM197

Se descongelaron envases de polisacarido purificado y se combinaron en un recipiente de reaccion y se calentaron a una temperatura de 85°C. Cuando durante un incremento de temperatura, la temperatura de la mezcla alcanzo aproximadamente 35 °C, se anadio acido acetico 2 M para conseguir una concentracion de acido acetico 0,1 M. Cuando la temperatura de la mezcla alcanzo 85°C, se mantuvo a esta temperatura durante 1 hora para conseguir la 10 hidrolisis/despolimerizacion. El polisacarido hidrolizado/despolimerizado se enfrio a 23 °C y se anadio MgCl2 1 M para conseguir una concentracion de MgCl2 0,1 M. La oxidacion se realizo usando 1-1,25 equivalentes en moles de acido peryodico, anadido como una solucion de 50 mg/ml en API. La mezcla se incubo a 23 °C durante 16-24 horas.

La mezcla de reaccion se purifico por diafiltracion frente a 10x volumenes de API usando una membrana de polietersulfona (PES) MWCO de 100K. El polisacarido purificado, activado se ajusto a un pH de 6,0 usando un 15 tampon fosfato 0,2 M (pH 7,0), se combino con CRM197 a una proporcion de polisacarido/proteina de 2:1, se congelo en carcasa a -75°C y se co-liofilizo durante 71 horas. Despues de la co-liofilizacion, la mezcla de polisacarido/CRM197 se conservo a -25 ° ± de 5 °C hasta la conjugacion. Para la conjugacion, la mezcla de polisacarido/CRM197 co-liofilizada se disolvio en tampon fosfato 0,1 M a una concentracion de polisacarido de 20 mg/ml y el pH se ajusto a 6,2 con una combinacion de tampon fosfato 0,2 M, pH 4,6 y NaOH 1 M, seguido de la

20 adicion de 0,5 equivalentes en moles de cianoborohidruro de sodio como una solucion de 100 mg/ml en tampon fosfato 0,15 M, pH 7,5. La mezcla de reaccion se agito y se incubo a 37 °C durante 44 horas. Despues de la incubacion con cianoborohidruro, la mezcla de reaccion se diluyo 1x con solucion salina enfriada (2-8 °C) al 0,9% seguido de la adicion de 1 equivalente en moles de borohidruro de sodio como una solucion de 100 mg/ml en API, para proteger los aldehidos que no han reaccionado, a 23 °C durante 3-6 horas.

25 La mezcla de reaccion se transfirio a traves de un prefiltro de 0,45-5 Im dentro un recipiente de retenido y despues se purifico por diafiltracion usando una membrana de celulosa regenerada MWCO de 100K. La mezcla de reaccion se diafiltro despues 30x contra tampon fosfato 0,1 , pH 9,0 y 20x contra tampon fosfato 0,15 M, pH 6,0. Se realizo una diafiltracion final 20x contra succinato 5 mM/solucion salina al 0,9%, pH 6,0. El conjugado diafiltrado se filtro a traves de un filtro de 0,2 Im y se realizo un ensayo para determinar el contenido de sacaridos. 8asandose en el analisis de sacaridos, la solucion con el conjugado se diluyo con succinato 5 mM/solucion salina al 0,9%, pH 6,0, a una diana de 0,5 mg/ml y de nuevo se filtro esteril (0,2 Im) para conseguir el conjugado concentrado de lote final. El conjugado se conservo a 2-8 °C.

Para la caracterizacion del conjugado, vease el Ejemplo 4.

Debe entenderse que el analisis y los ejemplos anteriores presentan simplemente una descripcion detallada de algunas realizaciones.

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Patente de Estados Unidos N° 4.673.574.

35.

Patente de Estados Unidos N° 4.902.506.

En el presente documento se describen aspectos particulares expuestos en los siguientes parrafos numerados: 1. Un procedimiento de fabricacion de un conjugado inmunogenico que comprende un polisacarido de serotipo 3 de Streptococcus pneumoniae unido covalentemente a una proteina transportadora, comprendiendo el procedimiento:

(a)

hacer reaccionar un polisacarido de serotipo 3 purificado con un acido debil dando como resultado un polisacarido de serotipo 3 hidrolizado;

(b)

hacer reaccionar el polisacarido de serotipo 3 hidrolizado con un agente oxidante en presencia de cationes bivalentes dando como resultado un polisacarido de serotipo 3 activado en el que el agente oxidante es acido peryodico y los cationes bivalentes son Mg2+ o Ca2+;

(c)

combinar el polisacarido de serotipo 3 activado con una proteina transportadora;

(d)

hacer reaccionar el polisacarido de serotipo 3 activado y la proteina transportadora combinados con un agente reductor, dando como resultado un conjugado de polisacarido de serotipo 3: proteina transportadora; y

(e)

proteger los aldehidos que no han reaccionado en el conjugado de polisacarido de serotipo 3: proteina transportadora dando como resultado un conjugado inmunogenico que comprende el polisacarido de serotipo 3 de Streptococcus pneumoniae unido covalentemente a una proteina transportadora.

2.

El procedimiento del parrafo 1, que comprende adicionalmente purificar el polisacarido de serotipo 3 activado antes de combinar con la proteina transportadora.

3.

El procedimiento del parrafo 1, que comprende adicionalmente co-liofilizar el polisacarido de serotipo 3 activado y la proteina transportadora combinados antes de la reaccion con el agente reductor.

4.

El procedimiento del parrafo 1 que comprende adicionalmente purificar el conjugado inmunogenico.

5.

El procedimiento del parrafo del parrafo 1, en el que el acido debil es acido acetico.

6.

El procedimiento del parrafo 1, en el que el agente oxidante es acido peryodico y los cationes bivalentes son Mg2+

7.

El procedimiento del parrafo 1, en el que la proteina transportadora es CRM197.

8.

El procedimiento del parrafo 1, en el que el agente reductor es cianoborohidruro de sodio.

9.

El procedimiento del parrafo 1, en el que la proteccion de los aldehidos que no han reaccionado comprende hacer reaccionar el conjugado de polisacarido de serotipo 3: proteina transportadora con borohidruro de sodio.

10.

Un procedimiento de fabricacion de un conjugado inmunogenico que comprende un polisacarido de serotipo 3 de Streptococcus pneumoniae unido covalentemente a una proteina transportadora, comprendiendo el procedimiento:

(a)

hacer reaccionar un polisacarido de serotipo 3 purificado con acido acetico dando como resultado un polisacarido de serotipo 3 hidrolizado;

(b)

hacer reaccionar el polisacarido de serotipo 3 hidrolizado con acido peryodico en presencia de MgCl2 dando como resultado un polisacarido de serotipo 3 activado;

(c)

purificar el polisacarido de serotipo 3 activado;

(d)

combinar el polisacarido de serotipo 3 activado con una proteina transportadora;

(e)

co-liofilizar el polisacarido de serotipo 3 activado y la proteina transportadora combinados;

(f)

hacer reaccionar el polisacarido de serotipo 3 activado y la proteina transportadora co-liofilizados con cianoborohidruro de sodio dando como resultado un conjugado de polisacarido de serotipo 3: proteina transportadora; y

(g)

proteger los aldehidos que no han reaccionado en el conjugado de polisacarido de serotipo 3: proteina transportadora con borohidruro de sodio dando como resultado un conjugado inmunogenico que comprende el polisacarido de serotipo 3 de Streptococcus pneumoniae unido covalentemente a una proteina transportadora.

11.

El procedimiento del parrafo 10, que comprende adicionalmente purificar el conjugado inmunogenico.

12.

El procedimiento del parrafo 10, en el que la proteina transportadora es CRM197.

13.

Un procedimiento de fabricacion de un polisacarido de serotipo 3 de Streptococcus pneumoniae activado, comprendiendo el procedimiento:

(a)

hacer reaccionar el polisacarido de serotipo 3 purificado con un acido debil dando como resultado un polisacarido de serotipo 3 hidrolizado; y

(b)

hacer reaccionar el polisacarido de serotipo 3 hidrolizado con un agente oxidante en presencia de cationes bivalentes dando como resultado un polisacarido de serotipo 3 activado.

14.

El procedimiento del parrafo 13, que adicionalmente comprende purificar el polisacarido de serotipo 3 activado despues de la oxidacion.

15.

El procedimiento del parrafo 13, en el que el acido debil es acido acetico.

16.

El procedimiento del parrafo 13, en el que el agente oxidante es acido peryodico y los cationes bivalentes son Mg2+

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento de preparacion de una composicion inmunogenica multivalente que comprende 13 conjugados distintos de polisacarido-proteina junto con un vehiculo fisiologicamente aceptable, en el que cada uno de los conjugados contiene un polisacarido capsular diferente conjugado con una proteina transportadora, y en el que los polisacaridos capsulares son preparados a partir de los serotipos 1, 3, 5, 6A, 68, 7F, 9V,14,18C, 19A, 19F y 23F de Streptococcus pneumoniae, en el que dicho conjugado de polisacarido de serotipo 3 - proteina es fabricada de acuerdo con un procedimiento que comprende:

   (a)

   hacer reaccionar un polisacarido de serotipo 3 purificado con un acido debil dando como resultado un polisacarido de serotipo 3 hidrolizado;

   (b)

   hacer reaccionar el polisacarido de serotipo 3 hidrolizado con un agente oxidante en presencia de cationes bivalentes dando como resultado un polisacarido de serotipo 3 activado en el que el agente oxidante es acido peryodico y los cationes bivalentes son Mg2+ o Ca2+;

   (c)

   combinar el polisacarido de serotipo 3 activado con una proteina transportadora;

   (d)

   hacer reaccionar el polisacarido de serotipo 3 activado y la proteina transportadora combinados con un agente reductor, dando como resultado un conjugado de polisacarido de serotipo 3: proteina transportadora; y

   (e)

   proteger los aldehidos que no han reaccionado en el conjugado de polisacarido de serotipo 3: proteina transportadora dando como resultado un conjugado inmunogenico que comprende el polisacarido de serotipo 3 de Streptococcus pneumoniae unido covalentemente a una proteina transportadora;

   y en el que despues de que los glucoconjugados son purificados, estos son combinados para formular la composicion inmunogenica.

2. 2.

   El procedimiento de la reivindicacion 1, que adicionalmente comprende purificar el polisacarido de serotipo 3 activado antes de combinar con la proteina transportadora.

3. 3.

   El procedimiento de la reivindicacion 1, que adicionalmente comprende co-liofilizar el polisacarido de serotipo 3 activado y la proteina transportadora combinados antes de la reaccion con el agente reductor.

4. 4.

   El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el acido debil es acido acetico.

5. 5.

   El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el agente reductor es cianoborohidruro de sodio

6. 6.

   El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la proteccion de los aldehidos que no han reaccionado comprende hacer reaccionar el conjugado de polisacarido de serotipo 3: proteina transportadora con borohidruro de sodio.

7. 7.

   Un procedimiento de preparacion de una composicion inmunogenica multivalente que comprende 13 conjugados distintos de polisacarido-proteina junto con un vehiculo fisiologicamente aceptable, en el que cada uno de los conjugados contiene un polisacarido capsular diferente conjugado con una proteina transportadora, y en el que los polisacaridos capsulares son preparados a partir de los serotipos 1, 3, 5, 6A, 68, 7F, 9V,14,18C, 19A, 19F y 23F de Streptococcus pneumoniae, en el que dicho conjugado de polisacarido de serotipo 3 - proteina es fabricada de acuerdo con un procedimiento que comprende:

   (a)

   hacer reaccionar un polisacarido de serotipo 3 purificado con acido acetico dando como resultado un polisacarido de serotipo 3 hidrolizado;

   (b)

   hacer reaccionar el polisacarido de serotipo 3 hidrolizado con acido peryodico en presencia de MgCl2 dando como resultado un polisacarido de serotipo 3 activado;

   (c)

   purificar el polisacarido de serotipo 3 activado;

   (d)

   combinar el polisacarido de serotipo 3 activado con una proteina transportadora;

   (e)

   co-liofilizar el polisacarido de serotipo 3 activado y la proteina transportadora combinados;

   (f)

   hacer reaccionar el polisacarido de serotipo 3 activado y la proteina transportadora co-liofilizados con cianoborohidruro de sodio, dando como resultado un conjugado de polisacarido de serotipo 3: proteina transportadora; y

   (g)

   proteger los aldehidos que no han reaccionado en el conjugado de polisacarido de serotipo 3: proteina transportadora con borohidruro de sodio dando como resultado un conjugado inmunogenico que comprende el polisacarido de serotipo 3 de Streptococcus pneumoniae unido covalentemente a una proteina transportadora;

   y en el que despues de que los glucoconjugados son purificados, estos son combinados para formular la composicion inmunogenica.

8. 8.

   El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que como proteina transportadora se usa CRM197.

9. 9.

   El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que dicha composicion inmunogenica multivalente, comprende adicionalmente un adyuvante.

10. 10.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que el adyuvante es un adyuvante basado en aluminio.

11. 11.- El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 10, en el que el adyuvante es seleccionado del grupo que consiste en fosfato de aluminio, sulfato de aluminio e hidroxido de aluminio.