CN110337307A

CN110337307A - 增强肺炎链球菌多糖-蛋白缀合物的免疫原性

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Publication number: CN110337307A
Application number: CN201880013793.7A
Authority: CN
Inventors: 何健; J·E·麦克奈尔; W·J·史密斯; M·A·温特斯; J·G·乔伊斯; C·阿拜古纳瓦达纳; L·穆西; H·普贾尔; J·M·斯金纳; E·温; P·麦克休; J·M·威廉姆斯; C·兰卡斯特
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme BV
Priority date: 2017-02-24
Filing date: 2018-02-20
Publication date: 2019-10-15
Also published as: US20200054733A1; MX2019009867A; RU2019129503A3; US11090374B2; EP3589314A1; BR112019017560A2; WO2018156491A1; US20210330778A1; JP2020514326A; KR20240011879A; MX2023001948A; CA3050120A1; EP3589314A4; US20210330777A1; MX2023001947A; JP2023036953A; KR20190121330A; AU2018225099A1; RU2019129503A; US20240139303A1

Abstract

本发明提供了具有一种或多种多糖‑蛋白缀合物的免疫原性组合物，其中来自肺炎链球菌细菌荚膜的一种或多种多糖在非质子溶剂如二甲基亚砜(DMSO)中与载体蛋白缀合。本发明还提供了对肺炎球菌多糖蛋白缀合物疫苗提供增强的免疫应答的方法，其包括向人受试者施用包含在DMSO条件下制备的多糖‑蛋白缀合物的免疫原性组合物。

Description

增强肺炎链球菌多糖-蛋白缀合物的免疫原性

技术领域

本发明提供了免疫原性组合物，其包含至少一种在非质子溶剂如二甲基亚砜(DMSO)中使用还原胺化与CRM₁₉₇缀合的肺炎链球菌多糖。本发明还提供了增强具有一种或多种多糖-蛋白缀合物的免疫原性组合物的免疫原性的方法，其中使用在非质子溶剂如DMSO中进行的还原胺化将来自肺炎链球菌细菌荚膜的一种或多种多糖与载体蛋白缀合。

背景技术

肺炎链球菌是一种***，是婴幼儿中侵袭性细菌性疾病(如肺炎、菌血症、脑膜炎和中耳炎)的最常见原因。肺炎球菌用化学连接的多糖包封，其赋予血清型特异性。已有超过90种已知的肺炎球菌血清型，并且荚膜是肺炎球菌的主要毒力决定因素，因为荚膜不仅保护细菌的内表面免受补体影响，而且本身具有很差的免疫原性。多糖是T细胞非依赖性抗原，不能在MHC分子上加工或呈递以与T细胞相互作用。然而，它们可以通过另一种机制刺激免疫***，该机制涉及B细胞上表面受体的交联。

2岁以下的儿童不会对大多数多糖疫苗产生免疫反应，因此有必要通过化学缀合至蛋白质载体而使多糖具有免疫原性。将多糖(T细胞非依赖性抗原)与蛋白质(T细胞依赖性抗原)偶联，赋予多糖T细胞依赖性的性质，包括同种型转换、亲和力成熟和记忆诱导。

已经有许多缀合反应用于将多糖共价连接至蛋白质。三种较常用的方法包括：1)还原胺化，其中反应的一个组分上的醛或酮基团与另一个组分上的氨基或酰肼基团反应，并且形成的C＝N双键随后被还原剂还原为C-N单键；2)氰基化缀合，其中多糖被溴化氰(CNBr)或1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化以将氰酸酯基团引入羟基，其在加入蛋白质组分后与氨基或酰肼形成共价键；和3)碳二亚胺反应，其中碳二亚胺活化缀合反应的一个组分上的羧基，并且活化的羰基与另一组分上的氨基或酰肼基反应。这些反应也经常用于在缀合反应之前活化缀合物的组分。

还原胺化已被用于缀合肺炎链球菌多糖。参见，例如，美国专利号8,192,746，美国专利申请公开号20170021006以及国际专利申请公开号WO2011/110381和WO2015/110941。还原胺化包括两个步骤：(1)抗原的氧化，和(2)还原抗原和载体蛋白以形成缀合物。还原步骤可以在含水溶剂或非质子溶剂如DMSO中进行。参见，例如，国际专利申请公开号WO2016/113644。

发明内容

本发明提供了免疫原性组合物，其包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型1，2，3，4，5，6C，6D，7B，7C，8，9N，9V，11A，12F，14，15A，15C，16F，17F，18C，20，21，22A，23A，23B，24F，27，28A，31，34，35A，35B，35F和38中的一种或多种的多糖，其中将所述多糖缀合至所述载体蛋白的缀合反应是在非质子溶剂中。在一个实施方式中，对于具有相同血清型的组合物，与在水性条件下制备的相同的一种或多种血清型相比，在非质子溶剂中制备的一种或多种血清型具有增加的免疫原性。

本发明提供了免疫原性组合物，其包含由与载体蛋白缀合的肺炎链球菌血清型1，2，3，4，5，6C，6D，7B，7C，8，9N，9V，11A，12F，14，15A，15C，16F，17F，18C，20，21，22A，23A，23B，24F，27，28A，31，34，35A，35B，35F和38中的一种或多种制备的多糖蛋白缀合物，其中所述多糖蛋白缀合物是通过包括在非质子溶剂中将多糖与载体蛋白质缀合的步骤的方法制备的。

本发明还提供了将来自肺炎链球菌血清型1，2，3，4，5，6C，6D，7B，7C，8，9N，9V，11A，12F，14，15A，15C，16F，17F，18C，20，21，22A，23A，23B，24F，27，28A，31，34，35A，35B，35F或38的多糖缀合至载体蛋白的方法，其包括在非质子溶剂中将多糖与载体蛋白缀合的步骤。

本发明还提供用免疫原性组合物治疗受试者的方法，所述免疫原性组合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型1，2，3，4，5，6C，6D，7B，7C，8，9N，9V，11A，12F，14，15A，15C，16F，17F，18C，20，21，22A，23A，23B，24F，27，28A，31，34，35A，35B，35F或38的一种或多种多糖，其中所述多糖在非质子溶剂中与载体蛋白缀合。

在某些实施方式中，来自肺炎链球菌血清型1，3，4，5，9V，11A，12F和14中的一种或多种的多糖在非质子溶剂中与载体蛋白缀合。在某些实施方式中，来自肺炎链球菌血清型2，6C，6D，7B，7C，8，9N，15A，15C，16F，17F，20，21，22A，23A，23B，24F，27，28A，31，34，35A，35B，35F和38中的一种或多种的多糖在非质子溶剂中与载体蛋白缀合。

在某些实施方式中，来自肺炎链球菌血清型3和18C中的一种或多种的多糖在非质子溶剂中与载体蛋白缀合。在该实施方式的一个方面中，来自肺炎链球菌血清型3的多糖在非质子溶剂中与载体蛋白缀合。在该实施方式的一个方面中，来自肺炎链球菌血清型18C的多糖在非质子溶剂中与载体蛋白缀合。

在某些实施方式中，用于将多糖与载体蛋白缀合的缀合反应是还原胺化。

在某些实施方式中，非质子溶剂是DMSO。

在某些实施方式中，载体蛋白是CRM₁₉₇。

在某些实施方式中，在DMSO中制备的缀合物具有大于5.0的赖氨酸损失值。在一个方面中，在DMSO中制备的缀合物具有7.0和18.0之间的赖氨酸损失值，包括端值。

在某些实施方式中，免疫原性组合物还包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型6A，6B，7F，10A，15B，19A，19F，22F，23F和33F中的一种或多种的多糖，其中由此将多糖与载体蛋白缀合的缀合反应是在非质子溶剂中。在该实施方式的某些方面中，缀合反应是还原胺化。在某些方面中，非质子溶剂是DMSO。在某些方面中，载体蛋白是CRM₁₉₇。在一个方面中，免疫原性组合物包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型6A，6B，7F，18C，19A，19F和23F的多糖，其中由此将来自肺炎链球菌血清型6A，6B，7F，18C，19A，19F或23F的多糖与载体蛋白缀合的缀合反应是在非质子溶剂中。在某些方面中，多糖来自肺炎链球菌血清型18C，19A，19F或23F。

在某些实施方式中，本发明的免疫原性组合物还包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型1，2，3，4，5，6A，6B，6C，6D，7B，7C，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15A，15B，15C，16F，17F，18C，19A，19F，20，21，22A，22F，23A，23B，23F，24F，27，28A，31，33F，34，35A，35B，35F和38中的一种或多种的多糖，其中由此将来自肺炎链球菌血清型1，2，3，4，5，6A，6B，6C，6D，7B，7C，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15A，15B，15C，16F，17F，18C，19A，19F，20，21，22A，22F，23A，23B，23F，24F，27，28A，31，33F，34，35A，35B，35F或38的多糖与载体蛋白缀合的缀合反应是在水性溶剂中。在一个方面中，免疫原性组合物中35-100％之间的血清型是在DMSO条件下使用还原胺化制备的，并且剩余的多糖蛋白缀合物是在水性条件下制备的。

在一个具体实施方式中，本发明提供免疫原性组合物，其基本上由与CRM₁₉₇多糖缀合的来自肺炎链球菌血清型1，3，4，5，6A，6B，7F，9V，14，18C，19A，19F，22F，23F和33F的多糖组成，其中肺炎链球菌血清型6A，6B，7F，18C，19A，19F和23F的缀合反应是在DMSO条件下，且肺炎链球菌血清型1，3，4，5，9V，14，22F和33F的缀合反应是在水性溶剂中，并且任选地还包含约0.2％w/v的PS-20。

本发明还提供了在人受试者中诱导保护性免疫应答的方法，其包括施用本发明的任何免疫原性组合物。在某些实施方式中，受试者为50岁或更大和/或免疫受损的。在某些实施方式中，受试者为2岁或更小。在某些实施方式中，受试者是免疫受损的。

本发明还提供了向肺炎球菌多糖(PnP)蛋白缀合物疫苗提供增强的免疫应答的方法，其包括向动物受试者施用包含多糖-蛋白缀合物的免疫原性组合物，所述多糖-蛋白缀合物包含与一种或多种载体蛋白缀合的来自第一组的两种或更多种肺炎球菌血清型的肺炎链球菌荚膜多糖，其中来自第一组的所述两种或更多种多糖-蛋白缀合物是在二甲基亚砜(DMSO)条件下使用还原胺化制备的。在一个实施方式中，所述增强的免疫应答是相对于接受免疫原性组合物的对照动物，其中来自第一组的两种或更多种多糖-蛋白缀合物中的一种或多种是在水性条件下使用还原胺化制备的。在一个实施方式中，对照动物是小鼠。在另一个实施方式中，对照动物是人。在某些实施方式中，该方法使用肺炎球菌多糖蛋白缀合物疫苗，其包含额外的多糖-蛋白缀合物，所述缀合物包含与一种或多种载体蛋白缀合的来自第二组肺炎球菌血清型的肺炎链球菌荚膜多糖，其在水性条件下使用还原胺化制备，其中来自第二组的血清型不同于第一组中的血清型。

在某些实施方式中，该方法使用肺炎球菌多糖蛋白缀合物疫苗，其中肺炎球菌血清型选自血清型1，2，3，4，5，6A，6B，6C，6D，7B，7C，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15A，15B，15C，16F，17F，18C，19A，19F，20，21，22A，22F，23A，23B，23F，24F，27，28A，33F，34，35A，35B，35F和38。

在某些实施方式中，该方法使用肺炎球菌多糖蛋白缀合物疫苗，其中来自血清型3或18C的多糖-蛋白缀合物在DMSO条件下使用还原胺化制备。

在某些实施方式中，该方法使用肺炎球菌多糖蛋白缀合物疫苗，其中来自第一组肺炎球菌血清型的多糖-蛋白缀合物选自血清型6A，6B，7F，18C，19A，19F和23F。

在某些实施方式中，该方法使用肺炎球菌多糖蛋白缀合物疫苗，其中来自第一组肺炎球菌血清型的多糖-蛋白缀合物包含血清型6A，6B，7F，18C，19A，19F和23F，其在DMSO条件下使用还原胺化制备，并且来自第二组血清型的多糖-蛋白缀合物在水性条件下制备。

在一个具体实施方式中，该方法使用肺炎球菌多糖蛋白缀合物疫苗，其中来自血清型6A，6B，7F，18C，19A，19F和23F的多糖-蛋白缀合物在DMSO条件下使用还原胺化制备，并且来自血清型1，3，4，5，9V，14，22F和33F的多糖蛋白缀合物在水性条件下制备。

在某些实施方式中，该方法使用肺炎球菌多糖蛋白缀合物疫苗，其中在DMSO条件下使用还原胺化制备来自35-100％之间的血清型的多糖蛋白缀合物，并在水性条件下制备剩余的多糖蛋白缀合物。在一个方面中，在DMSO条件下使用还原胺化制备来自45-80％之间的血清型的多糖蛋白缀合物，并在水性条件下制备剩余的多糖蛋白缀合物。在另一方面中，在DMSO条件下使用还原胺化制备来自75-100％之间的血清型的多糖蛋白缀合物，并在水性条件下制备剩余的多糖蛋白缀合物。

在某些实施方式中，该方法使用肺炎球菌多糖蛋白缀合物疫苗，其中载体蛋白选自脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白复合物(OMPC)，破伤风类毒素，白喉类毒素，蛋白D和CRM₁₉₇。在一个方面中，载体蛋白是CRM₁₉₇。

在某些实施方式中，该方法使用肺炎球菌多糖蛋白缀合物疫苗，其中在DMSO条件下使用还原胺化制备的缀合物具有较高比例的形成的糖肽键，如通过大于5.0的蛋白质赖氨酸损失值所测量的。在该实施方式的一个方面中，在DMSO条件下使用还原胺化制备的缀合物具有7.0至18之间的赖氨酸损失值，包括端值。在另一方面中，在DMSO条件下使用还原胺化制备的缀合物具有大于9.0，9.1，9.2，9.3，9.4，9.5或10.0的赖氨酸损失值。

在另一具体实施方式中，本发明提供了一种向肺炎球菌多糖(PnP)蛋白缀合物疫苗提供增强的免疫应答的方法，所述疫苗基本上由与CRM₁₉₇多糖缀合的来自肺炎链球菌血清型1，3，4，5，6A，6B，7F，9V，14，18C，19A，19F，22F，23F和33F的多糖组成，其中该方法包括向人受试者施用包含来自第一组和第二组肺炎球菌血清型的多糖-蛋白缀合物的免疫原性组合物，其中第一组血清型由6A，6B，7F，18C，19A，19F和23F组成并在DMSO条件下使用还原胺化制备，第二组血清型由1，3，4，5，9V，14，22F和33F组成并在水性条件下制备。

在某些实施方式中，通过血清IgG或调理吞噬(opsonophagocytic)抗体几何平均滴度测量通过本发明方法产生的免疫原性组合物接种的动物中增强的免疫应答。在一个方面中，与在水性条件下制备的来自相同肺炎球菌血清型的多糖-蛋白缀合物相比，对肺炎球菌血清型的增强的免疫应答是10％或更高。在一个实施方式中，动物是小鼠。在另一个实施方式中，动物是人。

在某些实施方式中，所述方法伴随50岁或更大的人受试者使用。在某些实施方式中，所述方法伴随2岁或更小的人受试者使用。在某些实施方式中，所述方法伴随免疫受损的人受试者使用。

本发明还提供了通过还原胺化制备肺炎球菌多糖-蛋白缀合物的方法，所述方法包括：

a)使选自血清型3，6A，6B，7F，9V，14，18C，19A，19F，22F，23F和33F的肺炎链球菌多糖与一定量的氧化剂(例如高碘酸盐)反应，以形成具有0.05至0.22的活化水平的活化多糖；

b)使所述活化的多糖与载体蛋白在非质子溶剂中反应(任选地在还原剂的存在下)，以形成多糖-蛋白缀合物；

其中缀合物的赖氨酸损失值在7.0至18.0之间，包括端值。

在某些实施方式中，活化水平为0.09至0.22。

在某些实施方式中，氧化剂是高碘酸盐。

在某些实施方式中，通过用氨基硫脲衍生多糖上的醛来测量活化水平。

在某些实施方式中，还原剂是氰基硼氢化物盐，例如氰基硼氢化钠。

在某些实施方式中，载体蛋白选自破伤风类毒素，白喉类毒素和CRM₁₉₇。在一个实施方式中，载体蛋白是CRM₁₉₇。

本发明还提供了一种测定活化多糖中醛水平(即高碘酸盐活化水平)的定量方法，其包括以下步骤：

a)通过与衍生剂反应直至完成(即反应平台)，将活化多糖衍生化以形成衍生的多糖；

b)通过高效尺寸排阻色谱法分离衍生的多糖(以除去未反应的衍生剂和基质组分)；

c)量化所述衍生的多糖的UV吸光度。

衍生剂可选自氨基硫脲，氨基硫脲结构类似物，酰肼，肼，氨基脲，氨基脲结构类似物，氨氧基化合物或芳族胺。

在一个实施方式中，步骤c)中的量化是通过与衍生物标准比较。在一个实施例中，步骤c)中的量化是通过测量预定的消光系数。

附图说明

图1.通过胰蛋白酶肽图谱确定的CRM₁₉₇上不同赖氨酸位点处的缀合程度。通过胰蛋白酶消化在水溶液或DMSO中通过还原胺化制备的血清型19A Ps-CRM₁₉₇缀合物，并通过LC-UV-MS分析。将与CRM₁₉₇对照样品相比的肽信号损失针对缀合位点作图。

图2.比较在水溶液或DMSO中通过还原胺化制备的血清型3Ps-CRM₁₉₇缀合物的来自小鼠研究组的电化学发光(ECL)免疫原性结果。采用磷酸铝佐剂(APA)配制缀合物。显示了预接种(Pre)和给药3后(PD3)结果。还显示了仅APA对照的结果。

图3.比较在水溶液或DMSO中通过还原胺化制备的血清型3Ps-CRM₁₉₇缀合物的来自小鼠研究组的给药3后调理吞噬活性(OPA)结果。还显示了预接种(免疫前)和仅APA对照的OPA结果。

具体实施方式

本发明提供了包含肺炎球菌多糖-蛋白缀合物的免疫原性组合物，其中在非质子溶剂如DMSO中使用还原胺化制备来自至少一种肺炎球菌血清型的缀合物。本发明部分基于以下发现：在多糖-蛋白缀合物的还原胺化过程中使用DMSO作为溶剂导致相对于在水性条件下制备的相同缀合物的那些血清型的出乎意料地优异的稳定性和增强的免疫原性。本发明涉及DMSO溶剂通过直接消耗载体蛋白表面上的赖氨酸残基来增强多糖与蛋白质的共价结合的优点。对于大多数测试的血清型，通过在非质子溶剂中缀合，相比在水性缓冲液中可以在较低的多糖活化水平(0.05至0.22)下实现提供良好免疫原性(≥7.0)的“赖氨酸损失”。增加的共价结合直接有益于增加多糖蛋白缀合物的稳定性并增强对在DMSO中缀合的那些特定多糖抗原的免疫应答。

不受任何理论的束缚，在DMSO中制备的糖缀合物所观察到的增强的免疫原性的一种可能机制包括在载体蛋白表面上碳水化合物(荚膜多糖)和赖氨酸残基之间的连接数量增加，这将导致蛋白和多糖之间额外的连接点，以赋予肽碳水化合物键稳定性并计数化学解聚或分解。参见，例如，Hsieh，Characterization of Saccharide-CRM₁₉₇ ConjugateVaccines in Brown F，Corbel M，Griffiths E(编):Physico-Chemical Procedures forthe Characterization of Vaccines.Dev.Biol.Basel，Karger，2000，vol 103，pp.93-104。在DMSO溶剂中缀合期间产生的增加的多糖-蛋白连接的额外益处可能是将肽-碳水化合物成功呈递给T细胞的额外机会。可以理解的是，由于人群中的遗传可变性导致加载能力和灵敏度不同或与缀合至碳水化合物抗原的特定肽序列相关联，载体蛋白上的额外连接点将允许增加在APC表面成功呈递抗原的机会以允许对另外的T细胞非依赖性抗原的T细胞依赖性应答。通过在DMSO溶剂中缀合所观察到的免疫原性增加的另一种可能机制可能是由于CRM₁₉₇在有机溶剂中的变性，其暴露了用于多糖键的额外赖氨酸，从而增加了用于T细胞依赖性响应不同肽表位的APC表面上糖肽呈递的机会。参见Avci等，2011，Nature Medicine17：1602-1610。

在缀合物中产生变性CRM₁₉₇的有机溶剂中缀合的另一个益处可以是降低针对天然CRM₁₉₇表位的抗体的免疫干扰。在DMSO溶剂中缀合期间产生的增加的多糖-蛋白质连接的另一个益处可为形成更大尺寸的多糖蛋白质缀合物，导致增强的免疫原性。据信本发明的组合物在引发人类反应方面提供了显著的优点。

如实施例5中所示，如通过调理吞噬活性(OPA)所测定的，在DMSO中使用还原胺化从肺炎链球菌血清型3制备的多糖蛋白缀合物在小鼠模型中显示出增加的免疫原性(与在水中使用还原胺化制备的相同缀合物相比)。此外，如实施例6中所示，在DMSO中使用还原胺化制备的具有七种血清型的15价肺炎球菌缀合物疫苗(以及在水性溶剂中制备的另外八种)对于在DMSO中制备的所有七种血清型相比于相应的15价PCV(其中所有15种血清型均在水性溶剂中制备)倾向于在人中显示出优异的免疫原性(4种血清型的优异性具有统计学显著性)。

如实施例4中所示，针对可能的缀合位点绘制了血清型19A缀合物中CRM₁₉₇蛋白上赖氨酸位点的肽信号降低(相比于CRM₁₉₇对照)，所述位点未覆盖位于先前鉴定的常见人T细胞肽表位中的额外缀合位点(参见Raju等人，1995，Eur.J.Immunol.25:3207-3214，位于CRM₁₉₇序列的肽411-430和肽431-450中)。因此，在某些实施方式中，本发明还涉及包含一种或多种多糖-CRM₁₉₇缀合物的免疫原性组合物，其中至少一种多糖-CRM₁₉₇缀合物在非质子溶剂中制备，并且其中在非质子溶剂中制备的缀合物证明与在水溶性溶剂中制备的相同缀合物相比，CRM₁₉₇的氨基酸411-430或431-450内的赖氨酸残基更易接近。在某些实施方式中，本发明还涉及包含一种或多种多糖-CRM₁₉₇缀合物的免疫原性组合物，其中至少一种多糖-CRM₁₉₇缀合物在非质子溶剂中制备，并且其中在非质子溶剂中制备的缀合物中的CRM₁₉₇的氨基酸411-430或431-450内的一个或多个赖氨酸残基缀合超过10％。在某些实施方式中，本发明涉及增加CRM₁₉₇内(特别是CRM₁₉₇的氨基酸411-430或431-450内)赖氨酸残基的可及性的方法，其包括在非质子溶剂中将多糖与CRM₁₉₇缀合。在该实施方式的某些方面中，在非质子溶剂中制备的缀合物中CRM₁₉₇的氨基酸411-430或431-450内的一个或多个赖氨酸残基缀合超过10％。在这些实施方式中，多糖可以来自适于制备免疫原性组合物的任何生物。在某些方面中，多糖来自脑膜炎奈瑟氏球菌或肺炎链球菌。多糖可以来自这些生物的任何血清型。

如本文所用，术语“水性溶剂”或“水性条件”当与缀合(例如还原胺化)一起使用时，是指使用水作为缀合反应的溶剂。除了不存在有机溶剂之外，水可以含有缓冲剂和其他组分。

如本文所用，术语“非质子溶剂”当与缀合(例如还原胺化)一起使用时，是指使用极性非质子溶剂或极性非质子溶剂的组合作为缀合反应的溶剂。极性非质子溶剂的实例包括但不限于二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)和六甲基磷酰胺(HMPA)。非质子溶剂可以存在一些水，例如，直至1％，2％，5％，10％或20％。

如本文所用，“DMSO溶剂”和“DMSO条件”可互换使用。

如本文所用，术语“包含”当与本发明的免疫原性组合物一起使用时，是指包含任何其他组分(受到抗原混合物“由......组成”语言的限制)，例如佐剂和赋形剂。当与多价多糖-蛋白缀合物混合物一起使用时，术语“由...组成”是指具有那些特定的肺炎链球菌多糖蛋白缀合物而不是来自不同血清型的其他肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的混合物。

如本文所用，“赖氨酸损失”是指缀合期间的赖氨酸消耗，并且通过缀合物中赖氨酸的平均测量量和起始蛋白质中赖氨酸的预期量之间的差异来确定。实施例4描述了一种测定“赖氨酸损失”的方法。

如本文所用，术语“多糖”意在包括通常用于免疫和细菌疫苗领域的任何抗原糖要素(或抗原单元)，包括但不限于“糖类”、“寡糖”、“多糖”、“脂糖”、“脂寡糖(LOS)”、“脂多糖(LPS)”、“糖基化物”、“糖缀合物”等。

当提及在非质子溶剂(例如，DMSO)中制备的免疫原性组合物和在水性条件下制备的剩余的多糖蛋白缀合物中血清型的百分比时，其意在简单地指在非质子溶剂中制备的血清型的数量除以组合物中血清型的总数。

如本文所用，所有范围，例如pH、温度和浓度，均意在包括端值。例如，5.0至9.0的pH范围意在包括5.0的pH和9.0的pH。类似地，4至25℃的温度范围意在包括该范围的外限，即4℃和25℃。

多糖

可根据本发明的方法(即在非质子溶剂中的还原胺化)制备的肺炎链球菌荚膜多糖包括但不限于以下血清型：1，2，3，4，5，6A，6B，6C，6D，7B，7C，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15A，15B，15C，16F，17F，18C，19A，19F，20，21，22A，22F，23A，23B，23F，24F，27，28A，31，33F，34，35A，35B，35F和38。多糖可以以低聚糖的形式使用。这些通过纯化多糖的片段化(例如通过水解)方便地形成，通常随后纯化所需大小的片段。

在某些实施方式中，在非质子溶剂中使用还原胺化制备血清型1，2，3，4，5，6C，6D，7B，7C，8，9N，9V，11A，12F，14，15A，15C，16F，17F，18C，20，21，22A，23A，23B，24F，27，28A，31，34，35A，35B，35F和38中的一种或多种。在某些方面中，在非质子溶剂中使用还原胺化制备来自血清型1，3，4，5，9V，11A，12F和14中的一种或多种的肺炎球菌多糖。在某些方面中，在非质子溶剂中使用还原胺化制备来自血清型2，6C，6D，7B，7C，8，9N，15A，15C，16F，17F，19F，20，21，22A，23A，23B，24F，27，28A，31，34，35A，35B，35F和38中的一种或多种的肺炎球菌多糖。在某些方面中，在非质子溶剂中使用还原胺化将来自血清型3或18C中的一种或两种的肺炎球菌多糖与载体蛋白缀合。可在非质子溶剂或水性溶剂中使用还原胺化将来自多价组合物中的其他血清型的多糖缀合。也可在非质子溶剂或水性溶剂中使用其他化学将来自多价组合物中的其他血清型的多糖缀合。

来自肺炎链球菌的荚膜多糖可通过本领域技术人员已知的标准技术制备。例如，多糖可以从细菌中分离，并且可以通过已知方法将大小调整至一定程度(参见，例如，欧洲专利号EP497524和EP497525)；优选通过使用均化器完成的微流化或通过化学水解。在一个实施方式中，每种肺炎球菌多糖血清型在基于大豆的培养基中生长。然后通过标准步骤纯化个体多糖，所述步骤包括离心、沉淀和超滤。参见，例如，美国专利申请公开号2008/0286838和美国专利号5,847,112。可以使用诸如机械或化学大小调整技术调整多糖的大小以降低多糖样品中的粘度和/或改善缀合产物的过滤性。可以使用乙酸进行化学水解。机械大小调整可以使用高压均质化剪切进行。

在一些实施方式中，缀合前纯化的多糖具有5kDa和4,000kDa之间的分子量。分子量可以通过尺寸排阻色谱(SEC)与多角度光散射检测器(MALS)和折射率检测器(RI)的组合来计算。在其他此类实施方式中，多糖的分子量为10kDa和4,000kDa之间；50kDa和4,000kDa之间；50kDa和3,000kDa之间；50kDa和2,000kDa之间；50kDa和1,500kDa之间；50kDa和1,000kDa之间；50kDa和750kDa之间；50kDa和500kDa之间；100kDa和4,000kDa之间；100kDa和3,000kDa；100kDa和2,000kDa之间；100kDa和1,500kDa之间；100kDa和1,000kDa之间；100kDa和750kDa之间；100kDa和500kDa之间；100 and 400kDa之间；200kDa和4,000kDa之间；200kDa和3,000kDa之间；200kDa和2,000kDa之间；200kDa和1,500kDa之间；200kDa和1,000kDa；或200kDa和500kDa之间。

可以化学活化纯化的多糖以使糖能够与载体蛋白反应。纯化的多糖可以与接头连接。一旦被活化或连接至接头，则每个荚膜多糖分别与载体蛋白缀合以形成糖缀合物。多糖缀合物可通过已知的偶联技术制备。

多糖可以与接头偶联以形成多糖-接头中间体，其中接头的游离末端是酯基。因此，接头是其中至少一个末端是酯基的接头。选择另一末端以使其可以与多糖反应以形成多糖-接头中间体。

可以使用多糖中的伯胺基团将多糖偶联至接头。在这种情况下，接头通常在两个末端均具有酯基。这允许通过亲核酰基取代使酯基之一与多糖中的伯胺基反应来进行偶联。该反应产生多糖-接头中间体，其中多糖通过酰胺键与接头偶联。因此，接头是双功能接头，其提供用于与多糖中的伯胺基团反应的第一酯基团和用于与载体分子中的伯胺基团反应的第二酯基团。典型的接头是己二酸N-羟基琥珀酰亚胺二酯(SIDEA)。

偶联也可以间接进行，即采用另外的接头，所述接头用于在偶联至接头之前衍生化多糖。

使用多糖还原末端的羰基将多糖与另外的接头偶联。该偶联包括两个步骤：(a1)使羰基与另外的接头反应；(a2)使另外的接头的游离末端与接头反应。在这些实施方式中，另外的接头通常在两个末端具有伯胺基团，从而允许步骤(a1)通过还原胺化使伯胺基团之一与多糖中的羰基反应来进行。使用的伯胺基团与多糖中的羰基反应。酰肼或羟基氨基是合适的。相同的伯胺基团通常存在于另外的接头的两个末端。该反应产生多糖-另外的接头中间体，其中多糖通过C-N键与另外的接头偶联。

可以使用多糖中的不同基团，特别是羧基，将多糖与另外的接头偶联。该偶联包括两个步骤：(a1)使该基团与另外的接头反应；(a2)使另外的接头的游离末端与接头反应。在这种情况下，另外的接头通常在两个末端均具有伯胺基团，从而允许通过EDAC活化使伯胺基团之一与多糖中的羧基反应来进行步骤(a1)。使用的伯胺基团与多糖中的EDAC活化的羧基反应。酰肼基团是合适的。相同的伯胺基团通常存在于另外的接头的两个末端。该反应产生多糖-另外的接头中间体，其中多糖通过酰胺键与另外的接头偶联。

在一个实施方式中，多糖的化学活化以及随后通过还原胺化与载体蛋白的缀合可以通过以下中描述的手段实现：美国专利号4,365,170、4,673,574和4,902,506，美国专利申请公开号2006/0228380、2007/184072、2007/0231340和2007/0184071，以及国际专利申请公开号WO2006/110381、WO2008/079653和WO2008/143709)。该化学反应可能需要通过与任何氧化剂反应来活化肺炎球菌多糖，所述氧化剂将末端羟基氧化成醛，例如高碘酸盐(包括高碘酸钠、高碘酸钾或高碘酸)。该反应导致碳水化合物的邻位羟基的随机氧化裂解，形成反应性醛基。

在一个实施方式中，多糖与0.01至10.0，0.05至5.0，0.1至1.0，0.5至1.0，0.7至0.8，0.05至0.5，0.1至0.3摩尔当量的氧化剂反应。在一个实施方式中，多糖与约0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35，0.4，0.45，0.5，0.55，0.6，0.65，0.7，0.75，0.8，0.85，0.9，0.95摩尔当量的氧化剂反应。通常优选使用较低量的高碘酸盐进行活化，例如0.1至0.3Meq，以实现有限的多糖活化(例如，0.05至0.22或0.09至0.22摩尔醛/摩尔多糖重复单元)。如本文所用，“活化水平”是指醛的摩尔数/多糖重复单元的摩尔数。较少的多糖活化导致更多的天然样多糖，即更少的羟基转化为醛。

在另一个实施方式中，氧化反应的持续时间为1小时和50小时之间，10小时和30小时之间，15小时和20小时之间，15小时和17小时之间或约16小时。

在另一个实施方式中，氧化反应的温度保持在15℃和45℃之间，15℃和30℃之间，20℃和25℃之间。在另一个实施方式中，反应温度保持在约23℃。

与载体蛋白的偶联是通过直接胺化至蛋白质的赖氨酰基团的还原胺化。例如，通过使活化的多糖和载体蛋白的混合物与还原剂如氰基硼氢化钠在镍的存在下反应来进行缀合。缀合反应可在水溶液下或在二甲基亚砜(DMSO)的存在下进行。参见，例如，美国专利申请公开号US2015/0231270和US2011/0195086以及欧洲专利号EP 0471 177 B1。然后通过加入强还原剂如硼氢化钠将未反应的醛封端。

还原胺化包括两个步骤，(1)氧化多糖以形成反应性醛，和(2)还原在活化多糖和载体蛋白之间形成的亚胺(席夫碱)以形成稳定的胺缀合物键。在氧化之前，任选地减小多糖的大小。可以采用机械方法(例如均质化)或化学水解。可以使用乙酸进行化学水解。氧化步骤可包括与高碘酸盐的反应。为了本发明的目的，术语“高碘酸盐”包括高碘酸盐和高碘酸；该术语还包括偏高碘酸盐(IO₄ ^-)和过高碘酸盐(IO₆ ^-)，并且包括各种高碘酸盐(例如高碘酸钠和高碘酸钾)。在一个实施方式中，荚膜多糖在偏高碘酸盐的存在下氧化，优选在高碘酸钠(NaIO₄)的存在下氧化。在另一个实施方式中，荚膜多糖在过高碘酸盐的存在下氧化，优选在高碘酸的存在下氧化。

在一个实施方式中，氧化剂是稳定的硝酰基或氮氧自由基化合物，例如哌啶-N-氧基或吡咯烷-N-氧基化合物，在氧化剂的存在下选择性氧化伯羟基(如WO 2014/097099中所述)。在所述反应中，实际的氧化剂是催化循环中的N-氧代铵盐。在一个方面中，所述稳定的硝酰基或硝基氧自由基化合物是哌啶-N-氧基或吡咯烷-N-氧基化合物。在一个方面中，所述稳定的硝酰基或硝基氧自由基化合物带有TEMPO(2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基)或PROXYL(2,2,5,5-四甲基-1-吡咯烷基氧基)部分。在一个方面中，所述稳定的硝酰自由基化合物是TEMPO或其衍生物。在一个方面中，所述氧化剂是带有N-卤素部分的分子。在一个方面中，所述氧化剂选自N-氯代琥珀酰亚胺，N-溴代琥珀酰亚胺，N-碘代琥珀酰亚胺，二氯异氰尿酸，1,3,5-三氯-1,3,5-六氢化三嗪(triazinane)-2,4,6-三酮，二溴异氰尿酸，1,3,5-三溴-1,3,5-六氢化三嗪-2,4,6-三酮，二碘异氰尿酸和1,3,5-三碘-1,3,5-六氢化三嗪-2,4,6-三酮。

在某些方面中，氧化剂是2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基(TEMPO)自由基和N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)作为共氧化剂(如国际专利申请公开号WO2014/097099中所述)。因此，在一个方面中，来自肺炎链球菌的糖缀合物通过包括以下步骤的方法获得：a)糖与2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基(TEMPO)和N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)在水性溶剂中反应以生成活化的糖；和b)使活化的糖与包含一个或多个胺基的载体蛋白反应(所述方法在下文中称为“TEMPO/NCS-还原胺化”)。

任选地，通过添加猝灭剂来淬灭氧化反应。猝灭剂可选自邻位二醇，1,2-氨基醇，氨基酸，谷胱甘肽，亚硫酸盐，硫酸氢盐，连二亚硫酸盐，偏亚硫酸氢盐，硫代硫酸盐，亚磷酸盐，次磷酸盐或亚磷酸(如甘油，乙二醇，丙-1,2-二醇，丁-1,2-二醇或丁-2,3-二醇，抗坏血酸)。

缀合过程的第二步是使用还原剂还原活化多糖和载体蛋白之间的亚胺(希夫碱)键以形成稳定的缀合键(所谓的还原胺化)。适合的还原剂包括氰基硼氢化物(如氰基硼氢化钠或硼氢化钠)。在一个实施方式中，还原剂是氰基硼氢化钠。

在本发明方法的某些实施方式中，还原胺化反应在非质子溶剂(或非质子溶剂的混合物)中进行。在一个实施方式中，还原反应在DMSO或DMF(二甲基甲酰胺)溶剂中进行。如果被冻干，则DMSO或DMF溶剂可用于重构活化的多糖和载体蛋白。在一个实施方式中，非质子溶剂是DMSO。

在还原反应结束时，可能存在残留在缀合物中的未反应的醛基，其可以使用合适的封端剂封端。在一个实施方式中，该封端剂是硼氢化钠(NaBH₄)。合适的替代物包括在布朗斯台德酸或路易斯酸存在下的三乙酰氧基硼氢化钠或硼氢化钠或硼氢化锌，胺硼烷如吡啶硼烷，2-甲基吡啶硼烷，2,6-二硼烷-甲醇，二甲胺-硼烷，t-BuMe'PrN-BH₃，苄胺-BH₃或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(PEMB)或硼氢化物交换树脂。在缀合(还原反应和任选的封端)之后，可以通过本领域技术人员已知的各种技术纯化糖缀合物(对多糖-蛋白缀合物的量富集)。这些技术包括透析、浓缩/渗滤操作、切向流过滤、沉淀/洗脱、柱色谱(离子交换色谱、多模式离子交换色谱、DEAE或疏水相互作用色谱)和深度过滤。在一个实施方式中，通过渗滤或离子交换色谱或尺寸排阻色谱法纯化糖缀合物。

在非质子溶剂中使用还原胺化制备的糖缀合物通常用于多价肺炎球菌缀合物疫苗中。因此，在某些实施方式中，对于其中并非所有血清型均在非质子溶剂中制备的多价组合物，剩余血清型的还原反应在水性溶剂中进行(例如，选自PBS(磷酸盐缓冲盐水)，MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)，HEPES，(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)，Bis-tris，ADA(N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸)，PIPES(哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸))，MOPSO(3-吗啉代-2-羟基丙磺酸)，BES(N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)，MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)，DIPSO(3-双(2-羟乙基)氨基-2-羟基丙烷-1-磺酸)，MOBS(4-(N-吗啉代)丁磺酸)，HEPPSO(N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-羟基丙磺酸))，POPSO(哌嗪-1,4-双(2-羟基-3-丙磺酸))，TEA(三乙醇胺)，EPPS(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸)，Bicine或HEPB，pH值在6.0和8.5，7.0和8.0，或7.0和7.5之间)。

在一些实施方式中，本发明的糖缀合物包含分子量为10kDa和10,000kDa之间的多糖。在其他此类实施方式中，多糖的分子量为25kDa和5,000kDa之间。在其他此类实施方式中，多糖的分子量为50kDa和1,000kDa之间。在其他此类实施方式中，多糖的分子量为70kDa和900kDa之间。在其他此类实施方式中，多糖的分子量为100kDa和800kDa之间。在其他此类实施方式中，多糖的分子量为200kDa和600kDa之间。在进一步的此类实施方式中，多糖的分子量为100kDa至1000kDa；100kDa至900kDa；100kDa至800kDa；100kDa至700kDa；100kDa至600kDa；100kDa至500kDa；100kDa至400kDa；100kDa至300kDa；150kDa至1,000kDa；150kDa至900kDa；150kDa至800kDa；150kDa至700kDa；150kDa至600kDa；150kDa至500kDa；150kDa至400kDa；150kDa至300kDa；200kDa至1,000kDa；200kDa至900kDa；200kDa至800kDa；200kDa至700kDa；200kDa至600kDa；200kDa至500kDa；200kDa至400kDa；200kDa至300；250kDa至1,000kDa；250kDa至900kDa；250kDa至800kDa；250kDa至700kDa；250kDa至600kDa；250kDa至500kDa；250kDa至400kDa；250kDa至350kDa；300kDa至1,000kDa；300kDa至900kDa；300kDa至800kDa；300kDa至700kDa；300kDa至600kDa；300kDa至500kDa；300kDa至400kDa；400kDa至1,000kDa；400kDa至900kDa；400kDa至800kDa；400kDa至700kDa；400kDa至600kDa；500kDa至600kDa.

在一些实施方式中，本发明的糖缀合物具有1,000kDa和10,000kDa之间的分子量。在其他此类实施方式中，多糖的分子量为1,000kDa和7,000kDa之间。在其他此类实施方式中，多糖的分子量为1,000kDa和6,000kDa之间。

在某些实施方式中，缀合反应通过还原胺化进行，其中镍用于更高的缀合反应效率并有助于游离氰化物的去除。已知过渡金属与氰化物形成稳定的络合物，并且已知用氰基硼氢化钠改善蛋白质氨基和甲醛的还原性甲基化(S Gidley等人，Biochem J.1982，203:331-334；Jentoft等，Anal Biochem.1980，106:186-190)。通过与残留的抑制性氰化物络合，镍的添加增加了蛋白质在缀合过程中的消耗，并导致形成更大的、可能更具免疫原性的缀合物。

在氰基硼氢化钠试剂批次中起始氰化物水平的差异也导致不一致的缀合性能，导致可变的产物属性，例如缀合物大小和缀合物的Ps/CRM₁₉₇比率。镍的加入通过络合氰化物减少了缀合不一致，消除了氰基硼氢化钠批次中的差异。

合适的替代化学方法包括用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸盐(CDAP)活化糖以形成氰酸酯。因此，活化的糖可以直接或通过间隔物(接头)基团与载体蛋白上的氨基偶联。例如，间隔物可以是胱胺或半胱胺以产生硫醇化多糖，其可以通过与马来酰亚胺活化的载体蛋白(例如使用GMBS)或卤代乙酰化载体蛋白(例如使用碘乙酰亚胺[例如乙基碘乙酰亚胺HCl]或N-琥珀酰亚胺基溴乙酸盐或SIAB，或SIA，或SBAP)反应后获得的硫醚键与载体偶联。例如，氰酸酯(任选地通过CDAP化学制备)与己二胺或己二酸二酰肼(ADH)偶联，并且氨基衍生化的糖通过蛋白质载体上的羧基使用碳二亚胺(例如EDAC或EDC)化学与载体蛋白缀合。此类缀合物描述于国际专利申请公开号WO 93/15760，WO 95/08348和WO 96/29094；以及Chu等人，1983，Infect.Immunity 40:245-256。

其他合适的技术使用碳二亚胺、酰肼、活泼酯、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU。许多描述于国际专利申请公开号WO 98/42721中。缀合可以包括羰基接头，其可以通过糖的游离羟基与CDI的反应形成(参见Bethell等人，1979，J.Biol.Chem.254:2572-4；Hearn等人，1981，J.Chromatogr.218:509-18)，然后与蛋白质反应以形成氨基甲酸酯键。这可能涉及将异头末端还原成伯羟基，任选的保护/脱保护伯羟基，伯羟基与CDI反应以形成CDI氨基甲酸酯中间体并将CDI氨基甲酸酯中间体与蛋白上氨基基团偶联。

在荚膜多糖与载体蛋白缀合后，通过多种技术中的一种或多种纯化多糖-蛋白缀合物(对多糖-蛋白缀合物的量富集)。这些技术的实例是本领域技术人员公知的，包括浓缩/渗滤操作、超滤、沉淀/洗脱、柱层析和深度过滤。参见，例如，美国专利号6,146,902。

表征本发明的糖缀合物的另一种方法是通过载体蛋白(例如CRM₁₉₇)中变为与糖缀合的赖氨酸残基的数目，其可以表征为缀合的赖氨酸的范围(缀合程度)。由于与多糖的共价连接，可以通过使用本领域技术人员已知的常规方法进行氨基酸分析来获得载体蛋白的赖氨酸修饰的证据。与用于产生缀合物材料的载体蛋白起始材料相比，缀合导致回收的赖氨酸残基数量减少。在一个实施方式中，本发明的糖缀合物的缀合度为2至18之间，2和13之间，2和10之间，2和8之间，2和6之间，2和5之间，2和4之间，3和15之间，3和13之间，3和10之间，3和8之间，3和6之间，3和5之间，3和4之间，5和18之间，5和13之间，7和18之间，7和13之间，8和18之间，8和13之间，10和18之间或10和13之间。在一个实施方式中，本发明的糖缀合物的缀合度为约2，约3，约4，约5，约6，约7，约8，约9，约10，约11，约12，约13，约14或约15。在一个实施方式中，本发明的糖缀合物的缀合度在7和18之间。在一些此类实施方式中，载体蛋白是CRM₁₉₇。

本发明的糖缀合物还可以通过糖与载体蛋白的比率(重量/重量)来表征。在一些实施方式中，糖缀合物中多糖与载体蛋白的比率(w/w)为0.5和3.0之间(例如，约0.5，约0.6，约0.7，约0.8，约0.9，约1.0，约1.1，约1.2，约1.3，约1.4，约1.5，约1.6，约1.7，约1.8，约1.9，约2.0，约2.1，约2.2，约2.3，约2.4，约2.5，约2.6，约2.7，约2.8，约2.9，或约3.0)。在其他实施方式中，糖与载体蛋白的比率(w/w)为0.5和2.0之间，0.5和1.5之间，0.8和1.2之间，0.5和1.0之间，1.0和1.5之间或1.0和2.0之间。在进一步的实施方式中，糖与载体蛋白的比率(w/w)为0.8和1.2之间。在一个实施方式中，缀合物中荚膜多糖与载体蛋白的比率为0.9和1.1之间。在一些此类实施方式中，载体蛋白是CRM₁₉₇。本发明的糖缀合物和免疫原性组合物可含有游离糖，其不与载体蛋白共价缀合，但仍然存在于糖缀合物组合物中。游离糖可以与糖缀合物非共价关联(即，非共价结合、吸附或包埋于其中或其上)。

在一个实施方式中，与多糖的总量相比，糖缀合物包含少于约50％，45％，40％，35％，30％，25％，20％或15％的游离多糖。在一个实施方式中，与多糖的总量相比，糖缀合物包含少于约25％的游离多糖。在一个实施方式中，与多糖的总量相比，糖缀合物包含少于约20％的游离多糖。在一个实施方式中，与多糖的总量相比，糖缀合物包含少于约15％的游离多糖。

多价多糖-蛋白缀合物疫苗

多价肺炎球菌免疫原性组合物可包含与一种或多种载体蛋白缀合的来自选自1，2，3，4，5，6A，6B，6C，6D，7B，7C，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15A，15B，15C，16F，17F，18C，19A，19F，20，21，22A，22F，23A，23B，23F，24F，27，28A，31，33F，34，35A，35B，35F和38中的至少一种的肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，其中在非质子溶剂如DMSO中使用还原胺化制备来自至少一种血清型的多糖。本发明涉及多价肺炎球菌免疫原性组合物，其具有来自至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或25种血清型的多糖。优选地，来自特定血清型的糖不与多于一种载体蛋白缀合。

在某些实施方式中，在非质子溶剂如DMSO中使用还原胺化制备来自至少5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或25种血清型的多糖。

在某些实施方式中，在非质子溶剂中使用还原胺化制备血清型3，6A，6B，7F，18C，19A，19F或23F中的一种或多种。在该实施方式的某些方面中，在非质子溶剂中使用还原胺化制备血清型3或18C中的一种或两种。

在某些实施方式中，多价组合物中至少30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或100％的血清型是在非质子溶剂中制备的。使用替代化学和/或水性溶剂制备剩余的血清型。

在某些实施方式中，在非质子溶剂中使用还原胺化制备血清型1，2，3，4，5，6C，6D，7B，7C，8，9N，9V，11A，12F，14，15A，15C，16F，17F，18C，20，21，22A，23A，23B，24F，27，28A，31，34，35A，35B，35F和38中的一种或多种。在某些方面中，在非质子溶剂中使用还原胺化制备血清型1，3，4，5，9V，11A，12F和14中的一种或多种。在某些方面中，在非质子溶剂中使用还原胺化制备血清型2，6C，6D，7B，7C，8，9N，15A，15C，16F，17F，19F，20，21，22A，23A，23B，24F，27，28A，31，34，35B，35F和38中的一种或多种。

在一个实施方式中，多价组合物由以下组成：在非质子溶剂如DMSO中使用还原胺化制备的来自血清型6A，6B，7F，18C，19A，19F和23F的多糖，以及在水性溶剂中使用还原胺化制备的来自血清型1，3，4，5，9V，14，22F和33F的多糖。

在纯化个体糖缀合物后，将它们混合以配制本发明的免疫原性组合物。这些肺炎球菌缀合物通过单独的方法制备并大量配制成单一剂量制剂。

载体蛋白

在本发明的一个具体实施方式中，将CRM₁₉₇用作载体蛋白。CRM₁₉₇是白喉毒素的无毒变体(即，类毒素)。在一个实施方式中，其分离自在基于酪蛋白氨基酸和酵母提取物的培养基中生长的白喉棒状杆菌菌株C7(β197)的培养物。在另一个实施方式中，根据美国专利号5,614,382中描述的方法重组制备CRM₁₉₇。通常，通过超滤、硫酸铵沉淀和离子交换色谱的组合纯化CRM₁₉₇。在一些实施方式中，使用Pfenex Expression Technology^TM(Pfenex Inc.，San Diego，CA)在荧光假单胞菌中制备CRM₁₉₇。

其他合适的载体蛋白包括另外的灭活细菌毒素，例如DT(白喉类毒素)或DT的片段B(DTFB)，TT(破伤风毒素)或TT的片段C，百日咳类毒素，霍乱类毒素(例如，如国际专利申请公开号WO 2004/083251中所述)，大肠杆菌LT，大肠杆菌ST和来自铜绿假单胞菌的外毒素A。也可以使用细菌外膜蛋白如外膜复合物c(OMPC)，孔蛋白，转铁蛋白结合蛋白，肺炎球菌表面蛋白A(PspA；参见国际申请专利公开号WO 02/091998)，肺炎球菌粘附素蛋白(PsaA)，来自A组或B组链球菌的C5a肽酶，或流感嗜血杆菌蛋白D，肺炎球菌溶血素(Kuo等人，1995，Infect Immun 63；2706-13)，包括以某种方式解毒的层，例如dPLY-GMBS(参见国际专利申请公开号WO 04/081515)或dPLY-甲醛，PhtX，包括PhtA，PhtB，PhtD，PhtE和Pht蛋白的融合物，例如PhtDE融合物，PhtBE融合物(参见国际专利申请公开号WO 01/98334和WO 03/54007)。其他蛋白质，例如卵清蛋白，匙孔血蓝蛋白(KLH)，牛血清白蛋白(BSA)或结核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)，PorB(来自脑膜炎奈瑟球菌)，PD(流感嗜血杆菌蛋白D；参见例如欧洲专利号EP 0 594 610 B)或其免疫功能等同物，合成肽(参见欧洲专利号EP0378881和EP0427347)，热休克蛋白(参见国际专利申请公开号WO 93/17712和WO 94/03208)，百日咳蛋白质(参见国际专利申请公开号WO 98/58668和欧洲专利号EP0471177)，细胞因子，淋巴因子，生长因子或激素(参见国际专利申请公开号WO 91/01146)，包含多个来自各种病原体衍生抗原的人CD4+T细胞表位的人工蛋白(参见Falugi等人，2001，Eur J Immunol 31：3816-3824)，例如N19蛋白(参见Baraldoi等人，2004，Infect Immun 72：4884-7)，铁摄取蛋白质(参见国际专利申请公开号WO 01/72337)，艰难梭菌毒素A或B(参见国际专利公开号WO00/61761)和鞭毛蛋白(参见Ben-Yedidia等人，1998，Immunol Lett 64：9)也可用作载体蛋白。

其他DT突变体可用作第二载体蛋白，例如CRM₁₇₆，CRM₂₂₈，CRM₄₅(Uchida等人，1973，JBiol Chem 218：3838-3844)；CRM₉，CRM₄₅，CRM₁₀₂，CRM₁₀₃和CRM₁₀₇以及Nicholls和Youle在Genetically Engineered Toxins，Ed:Frankel，Maecel Dekker Inc，1992中描述的其他突变；美国专利号4,709,017或美国专利号4,950,740中公开的将Glu-148缺失或突变为Asp、Gln或Ser和/或将Ala 158突变为Gly以及其他突变；美国专利号5,917,017或美国专利号6,455,673中公开的Lys 516，Lys 526，Phe 530和/或Lys 534中的至少一个或多个残基的突变以及其他突变；或者美国专利号5,843,711中公开的片段。此类DT突变体也可用于制备DTFB变体，其中变体包含含有表位区域的B片段。

在使用多价疫苗的情况下，第二载体可用于多价疫苗中的一种或多种抗原。第二载体蛋白优选是无毒且无反应原性的蛋白质，并且可以足够的量和纯度获得。第二载体蛋白也与抗原(例如肺炎链球菌多糖)缀合或连接，以增强抗原的免疫原性。载体蛋白应该适合标准的缀合程序。在一个实施方式中，未与第一载体蛋白缀合的每个荚膜多糖与相同的第二载体蛋白缀合(例如，每个荚膜多糖分子与单一载体蛋白缀合)。在另一个实施方式中，未与第一载体蛋白缀合的荚膜多糖与两种或更多种载体蛋白缀合(每种荚膜多糖分子与单一载体蛋白缀合)。在此类实施方式中，相同血清型的每种荚膜多糖通常与相同的载体蛋白缀合。

药物/疫苗组合物

本发明进一步提供了包括药物、免疫原性和疫苗组合物在内的组合物，其包含、基本由以下组成、或由以下组成：任意上述多糖血清型组合以及药学上可接受的载体和佐剂。

可以使用本领域已知的方法完成本发明的多糖-蛋白缀合物的配制。例如，可以将个体肺炎球菌缀合物与生理学上可接受的载体一起配制以制备组合物。此类载体的实例包括但不限于水、缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)和右旋糖溶液。

在一个实施方式中，将疫苗组合物配制在含有氯化钠的L-组氨酸缓冲液中。

如本文所定义，“佐剂”是用于增强本发明的免疫原性组合物的免疫原性的物质。免疫佐剂可以增强对单独施用时具有弱免疫原性的抗原的免疫应答，例如，诱导无或弱抗体滴度或细胞介导的免疫应答、增加对抗原的抗体滴度、和/或降低在个体中有效实现免疫应答的抗原的剂量。因此，通常给予佐剂以增强免疫应答，并且其是技术人员所熟知的。用于增强组合物有效性的合适佐剂包括但不限于：

(1)铝盐(矾)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；

(2)水包油乳液制剂(含或不含其他特异性免疫刺激剂，如胞壁酰肽(下文定义)或细菌细胞壁成分)，例如(a)MF59(国际专利申请公开号WO 90/14837)，含有5％角鲨烯，0.5％吐温80和0.5％司盘85(任选含有不同量的MTP-PE)，使用微流化器如110Y型微流化器(Microfluidics，Newton，MA)配制成亚微米颗粒，(b)SAF，含有10％角鲨烯，0.4％吐温80，5％普朗尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP，微流化成亚微米乳液或涡旋以产生更大粒径的乳液，(c)Ribi^TM佐剂***(RAS)，(Corixa，Hamilton，MT)，含有2％角鲨烯，0.2％吐温80，和一种或多种细菌细胞壁组分，其选自描述于美国专利号4,912,094中的3-O-脱酰基单磷脂A(MPL^TM)，海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(Detox^TM)；(d)Montanide ISA；

(3)可以使用皂苷佐剂，例如Quil A或STIMULON^TM QS-21(Antigenics，Framingham，MA)(参见，例如，美国专利号5,057,540)或由其产生的颗粒，例如ISCOM(由胆固醇、皂苷、磷脂和两亲性蛋白质的组合所形成的免疫刺激复合物)和(具有与ISCOM基本相同的结构，但不含蛋白质)；

(4)细菌脂多糖，合成脂质A类似物，例如氨基烷基葡糖胺磷酸盐化合物(AGP)，或其衍生物或类似物，其可从Corixa获得，并且描述于美国专利号6,113,918中；一种这样的AGP是2-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰基]-2-[(R)-3--十四烷酰氧基十四烷酰氨基]-b-D-吡喃葡萄糖苷，其也称为529(以前称为RC529)，其配制为水性形式或稳定乳液；

(5)合成多核苷酸，例如含有CpG基序的寡核苷酸(美国专利号6,207,646)；

(6)细胞因子，如白细胞介素(如IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-12，IL-15，IL-18等)，干扰素(如γ干扰素)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，肿瘤坏死因子(TNF)，共刺激分子B7-1和B7-2等；和

(7)补体，如补体成分C3d的三聚体。

在另一个实施方式中，佐剂是2种、3种或更多种上述佐剂的混合物，例如SBAS2(还含有3-脱酰基单磷脂A和QS21的水包油乳液)。

胞壁酰肽包括但不限于N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)，N-乙酰基-去甲胞壁酰-L-丙氨酸-2-(1'-2'二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)等。

在某些实施方式中，佐剂是铝盐。铝盐佐剂可以是矾沉淀疫苗或矾吸附疫苗。铝盐佐剂是本领域熟知的，并且描述于例如Harlow,E.和D.Lane(1988；Antibodies：ALaboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory)以及Nicklas,W.(1992；Aluminumsalts.Research in Immunology 143:489-493)。铝盐包括但不限于水合氧化铝，水化氧化铝，三水合氧化铝(ATH)，铝水合物，三水合铝，Alhydrogel，Superfos，Amphogel，氢氧化铝(III)，羟基磷酸铝硫酸盐，磷酸铝佐剂(APA))，无定形氧化铝，三水合氧化铝或三羟基铝。

APA是羟基磷酸铝的水性悬浮液。通过以1：1的体积比混合氯化铝和磷酸钠以沉淀羟基磷酸铝来制备APA。在共混过程之后，用高剪切混合器将材料尺寸减小，以实现单分散的粒度分布。然后将产物用生理盐水渗滤并蒸汽灭菌。

在某些实施方式中，使用市售的Al(OH)₃(例如Alhydrogel或Superfos ofDenmark/Accurate Chemical and Scientific Co.，Westbury，NY)以50-200g蛋白质/mg氢氧化铝的比例吸附蛋白质。在另一个实施方式中，蛋白质的吸附取决于蛋白质的pI(等电点pH)和培养基的pH。具有较低pI的蛋白质比具有较高pI的蛋白质更强地吸附于带正电荷的铝离子。铝盐可以建立抗原贮库，其在2-3周的时间内缓慢释放，参与巨噬细胞的非特异性激活和补体激活，和/或刺激先天免疫机制(可能通过刺激尿酸)。参见，例如，Lambrecht等人，2009，Curr Opin Immunol 21:23。

对于除6B之外的所有血清型，通常将单价大部分水性缀合物混合在一起并稀释至目标8μg/mL，而血清型6B将稀释至目标16μg/mL。稀释后，将该批次过滤除菌，并在无菌条件下加入等体积的磷酸铝佐剂，使最终铝浓度达到250μg/mL。将佐剂化的经配制批料装入一次性0.5mL/剂量小瓶中。

在某些实施方式中，佐剂是含CpG的核苷酸序列，例如含CpG的寡核苷酸，特别是含CpG的寡脱氧核苷酸(CpG ODN)。在另一个实施方式中，佐剂是ODN 1826，其可以从ColeyPharmaceutical Group获得。

“含CpG的核苷酸”，“含CpG的寡核苷酸”，“CpG寡核苷酸”和类似术语是指长度为6-50个核苷酸的核苷酸分子，其含有未甲基化的CpG部分。参见，例如，Wang等人，2003，Vaccine 21:4297。在另一个实施方式中，意图为任何其他本领域公认的术语定义。含CpG的寡核苷酸包括使用任何合成核苷间键、修饰碱基和/或修饰糖的经修饰寡核苷酸。

使用CpG寡核苷酸的方法是本领域熟知的，并且描述于例如Sur等人，1999，JImmunol.162:6284-93；Verthelyi，2006，Methods Mol Med.127:139-58；和Yasuda等人，2006，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.23:89-110。

施用/剂量

本发明的组合物和制剂可通过经由全身或粘膜途径施用疫苗来保护或治疗易感染(例如肺炎球菌感染)的人。在一个实施方式中，本发明提供了诱导对肺炎链球菌荚膜多糖缀合物的免疫应答的方法，包括向人施用免疫有效量的本发明的免疫原性组合物。在另一个实施方式中，本发明提供了一种针对肺炎球菌感染给人接种疫苗的方法，其包括向人施用免疫有效量的本发明免疫原性组合物的步骤。

通过标准研究可以确定特定疫苗的最佳组分含量，所述研究包括在受试者中观察适当的免疫应答。例如，在另一个实施方式中，用于人疫苗接种的剂量通过从动物研究外推至人类数据来确定。在另一个实施方式中，剂量根据经验确定。我们已经证明该疫苗在婴儿恒河猴动物数据中具有免疫原性。

本发明组合物的“有效量”是指引发抗体所需的剂量，该抗体在随后的攻击过程中显著降低微生物例如肺炎链球菌感染的可能性或严重性。

本发明的方法可用于预防和/或减少由微生物例如肺炎链球菌引起的原发性临床综合征，包括侵入性感染(脑膜炎、肺炎和菌血症)和非侵入性感染(急性中耳炎和鼻窦炎)。

本发明组合物的施用可包括以下一种或多种：通过肌肉内、腹膜内、皮内或皮下途径注射；或通过粘膜施用于口腔/消化道、呼吸道或泌尿生殖道。在一个实施方式中，鼻内施用用于治疗肺炎或中耳炎(因为可以更有效地预防肺炎球菌的鼻咽携带，从而在其早期阶段减弱感染)。

选择每种疫苗剂量中的缀合物的量作为诱导免疫保护反应而无显著不利影响的量。此量可以根据肺炎球菌血清型而变化。通常，对于基于多糖的缀合物，每个剂量将包含0.1至100μg的每种多糖，特别是0.1至10μg，更特别是1至5μg。例如，每个剂量可包含100，150，200，250，300，400，500或750ng或者1，1.5，2，3，4，5，6，7，7.5，8，9，10，11，12，13，14，15，16，18，20，22，25，30，40，50，60，70，80，90或100μg。

通过标准研究可以确定特定疫苗的最佳组分含量，所述研究包括在受试者中观察适当的免疫应答。例如，在另一个实施方式中，用于人疫苗接种的剂量通过从动物研究外推至人类数据来确定。在另一个实施方式中，剂量根据经验确定。

在一个实施方式中，铝盐的剂量为10，15，20，25，30，50，70，100，125，150，200，300，500或700μg，或1，1.2，1.5，2，3，5mg或更多。在又一个实施方式中，上述铝盐的剂量是每μg重组蛋白。

根据本发明的任何方法并且在一个实施方式中，受试者是人。在某些实施方式中，人受试者是婴儿(小于1岁)、幼童(大约12至24个月)或幼儿(大约2至5岁)。在其他实施方式中，人受试者是老年受试者(例如，>50岁或>65岁)。本发明的组合物也适用于年龄较大的儿童、青少年和成人(例如，年龄18至45岁或18至65岁)。

在本发明方法的一个实施方式中，本发明的组合物作为单次接种施用。在另一个实施方式中，疫苗施用两次、三次或四次或更多次，充分间隔开。例如，组合物可以以1，2，3，4，5或6个月的间隔或其任何组合施用。免疫计划可以遵循指定用于肺炎球菌疫苗的计划。例如，针对由肺炎链球菌引起的侵袭性疾病的婴儿和幼儿的常规时间表是2，4，6和12-15月龄。因此，在一个实施方式中，在2、4、6和12-15月龄时以4剂量系列施用组合物。

本发明的组合物还可包括一种或多种来自肺炎链球菌的蛋白质。适合包含的肺炎链球菌蛋白的实例包括在国际专利申请公开号WO 02/083855和WO 02/053761中鉴定的那些。

制剂

本发明的组合物可通过本领域技术人员已知的一种或多种方法施用于受试者，例如肠胃外、经粘膜、透皮、肌肉内、静脉内、皮内、鼻内、皮下、腹膜内，并据此配制。

在一个实施方式中，通过表皮注射、肌内注射、静脉内、动脉内、皮下注射或呼吸道内粘膜注射液体制剂而施用本发明的组合物。用于注射的液体制剂包括溶液剂等。

本发明的组合物可以配制成单剂量小瓶、多剂量小瓶或预填充注射器。

在另一个实施方式中，口服施用本发明的组合物，并因此将其配制成适于口服施用的形式，即作为固体或液体制剂。固体口服制剂包括片剂、胶囊、丸剂、颗粒剂、球丸等。液体口服制剂包括溶液剂、混悬剂、分散剂、乳剂、油剂等。

用于液体制剂的药学上可接受的载体是水性或非水性溶液、悬浮液、乳液或油。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇和可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。油的实例是动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、橄榄油、向日葵油、鱼肝油、另一种海洋油，或来自奶或蛋的脂质。

药物组合物可以是等渗的、低渗的或高渗的。然而，当施用时，通常优选用于输注或注射的药物组合物基本上是等渗的。因此，为了储存，药物组合物可以优选是等渗或高渗的。如果药物组合物是高渗存储的，则可以在施用前将其稀释成为等渗溶液。

等渗剂可以是离子等渗剂，例如盐或非离子等渗剂，例如碳水化合物。离子等渗剂的实例包括但不限于NaCl，CaCl₂，KCl和MgCl₂。非离子等渗剂的实例包括但不限于甘露醇，山梨糖醇和甘油。

还优选至少一种药学上可接受的添加剂是缓冲剂。出于某些目的，例如，当药物组合物用于输注或注射时，通常希望组合物包含缓冲剂，其能够将溶液缓冲至4至10范围内的pH，例如5至9，例如6至8。

缓冲剂可以例如选自TRIS，乙酸盐，谷氨酸盐，乳酸盐，马来酸盐，酒石酸盐，磷酸盐，柠檬酸盐，碳酸盐，甘氨酸盐，组氨酸，甘氨酸，琥珀酸盐和三乙醇胺缓冲剂。

此外，缓冲剂可例如选自USP相容性缓冲剂用于肠胃外使用，特别是当药物制剂用于肠胃外使用时。例如，缓冲剂可选自一元酸如乙酸，苯甲酸，葡糖酸，甘油酸和乳酸；二元酸如乌头酸，己二酸，抗坏血酸，碳酸，谷氨酸，苹果酸，琥珀酸和酒石酸；多元酸如柠檬酸和磷酸；以及碱如氨，二乙醇胺，甘氨酸，三乙醇胺和TRIS。

肠外载体(用于皮下、静脉内、动脉内或肌内注射)包括氯化钠溶液，林格氏葡萄糖，右旋糖和氯化钠，乳酸林格氏液和固定油。静脉内载体包括液体和营养补充剂，电解质补充剂，例如基于林格氏葡萄糖的电解质补充剂等。实例是无菌液体，例如水和油，添加或不添加表面活性剂和其他药学上可接受的佐剂。通常，水，盐水，葡萄糖水溶液和相关糖溶液，二醇如丙二醇或聚乙二醇，聚山梨醇酯80(PS-80)，聚山梨醇酯20(PS-20)和泊洛沙姆188(P188)是优选的液体载体，特别用于可注射溶液。油的实例是动物、植物或合成来源的油，例如花生油，大豆油，橄榄油，向日葵油，鱼肝油，另一种海洋油，或来自奶或蛋的脂质。

本发明的制剂还可含有表面活性剂。表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，尤其是PS-20和PS-80；环氧乙烷(EO)，环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，以DOWFAX^TM商品名出售，例如线性EO/PO嵌段共聚物；可以改变重复乙氧基(氧基-1,2-乙二基)基团数的辛苯聚醇，其中辛苯聚醇-9(Triton X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)是特别感兴趣的；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬基酚乙氧基化物，如Tergitol^TM NP NP系列；源自月桂醇、十六烷醇、硬脂醇和油基醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为Brij表面活性剂)如三乙二醇单月桂醚(Brij 30)；和脱水山梨糖醇酯(通常称为SPAN)如脱水山梨糖醇三油酸酯(Span85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯。包含在乳液中的优选表面活性剂是PS-80。

可以使用表面活性剂的混合物，例如，PS-80/Span 85混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(PS-80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)的组合也是合适的。另一种有用的组合包括月桂醇聚醚9加聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。

表面活性剂的优选量(重量％)是：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(如PS-80)0.01至1％，特别是约0.1％；辛基或壬基苯氧基聚氧乙醇(如Triton X-100，或Triton系列中的其它洗涤剂)0.001至0.1％，特别是0.005至0.02％；聚氧乙烯醚(如laureth 9)0.1至20％，优选0.1至10％，特别是0.1至1％或约0.5％。

在某些实施方式中，组合物的基本组成为：组氨酸(20mM)，盐水(150mM)和0.02％PS-20或0.04％PS-80，pH 5.8，250ug/mL APA(磷酸铝佐剂)。PS-20的范围可为0.005％至0.1％(w/v)，制剂中存在PS-20或PS-80控制模拟制造过程中的聚集以及使用初级包装的运输。过程包括在组氨酸、盐水和PS-20或PS-80中组合多达24种血清型的混合物，然后将此混合材料与APA和含有或不含抗菌防腐剂的盐水混合。

表面活性剂的选择可能需要针对不同的药物产品和药物物质进行优化。对于具有15种或更多血清型的多价疫苗，优选PS-20和P188。用于制备缀合物的化学选择也可在制剂的稳定化中发挥重要作用。特别地，当用于制备多价组合物中的不同多糖蛋白缀合物的缀合反应包括水性溶剂和DMSO溶剂时，已发现特定的表面活性剂体系在稳定性方面提供显著差异。单独使用聚山梨醇酯20或使用泊洛沙姆188与多元醇的组合观察到多糖蛋白缀合物的稳定性提高。

特定洗涤剂如何保护生物治疗剂的确切机制知之甚少，无法事先预测。可能的稳定机制包括优先水合、优先排斥、生物治疗剂和表面之间的空气/液体界面竞争。表面张力和/或洗涤剂与生物治疗剂的直接结合，以掩盖用作聚集种的疏水区。

泊洛沙姆也可用于本发明的组合物中。泊洛沙姆是非离子三嵌段共聚物，其由侧接两个聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))亲水链的聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))中心疏水链组成。泊洛沙姆也以商品名而为人所知。因为聚合物嵌段的长度可以定制，所以存在许多性质稍有不同的泊洛沙姆。对于通用术语“泊洛沙姆”，这些共聚物通常命名为字母“P”(针对泊洛沙姆)，后跟三个数字，前两个数字x 100给出聚氧丙烯核心的近似分子量，最后一个数字x 10给出聚氧乙烯含量百分比(例如，P407＝聚氧丙烯分子量为4,000g/mol，聚氧乙烯含量为70％的泊洛沙姆)。对于商品名，这些共聚物的编码以字母开头，以确定其在室温下的物理形式(L＝液体，P＝糊剂，F＝薄片(固体))，然后是两位或三位数。数字标记中的第一个数字(三位数字中的两个数字)乘以300表示疏水物的近似分子量；最后一个数字x 10给出聚氧乙烯含量百分比(例如，L61＝聚氧丙烯分子量为1,800g/mol，聚氧乙烯含量为10％的)。参见美国专利号3740421。

泊洛沙姆的实例具有通式：

HO(C₂H₄O)_a(C₃H₆O)_b(C₂H₄O)_aH,

其中a和b嵌段具有以下值：

如本文所用，分子量单位为道尔顿(Da)或g/mol。

优选地，泊洛沙姆的分子量通常为1100至17,400Da，7,500至15,000Da，或7,500至10,000Da。泊洛沙姆可选自泊洛沙姆188或泊洛沙姆407。制剂中泊洛沙姆的最终浓度为0.001％-5％重量/体积，或0.025％-1％重量/体积。在某些方面中，多元醇是丙二醇，并且其终浓度为1％至20％重量/体积。在某些方面中，多元醇是聚乙二醇400，并且其终浓度为1％至20％重量/体积。

适用于本发明制剂的多元醇是聚合多元醇，特别是聚醚二醇，包括但不限于丙二醇和聚乙二醇，聚乙二醇单甲醚。丙二醇可以在约425至约2700的单体分子量范围内获得。聚乙二醇和聚乙二醇单甲醚也可在约200至约35000的分子量范围内获得，包括但不限于PEG200，PEG300，PEG400，PEG1000，PEG MME 550，PEG MME 600，PEG MME 2000，PEG MME3350和PEG MME 4000。优选的聚乙二醇是聚乙二醇400。本发明制剂中多元醇的最终浓度可以为1％至20％重量/体积或6％至20％重量/体积。

该制剂还含有pH缓冲盐水溶液。缓冲剂可以例如选自TRIS，乙酸盐，谷氨酸盐，乳酸盐，马来酸盐，酒石酸盐，磷酸盐，柠檬酸盐，碳酸盐，甘氨酸盐，组氨酸，甘氨酸，琥珀酸盐，HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)，MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)，MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)和三乙醇胺缓冲剂。缓冲剂能够将溶液缓冲至pH范围为4至10，5.2至7.5或5.8至7.0。在本发明的某些方面中，缓冲剂选自磷酸盐，琥珀酸盐，组氨酸，MES，MOPS，HEPES，乙酸盐或柠檬酸盐。此外，缓冲剂可以例如选自USP相容性缓冲剂用于肠胃外使用，特别是当药物制剂用于肠胃外使用时。缓冲剂的浓度范围为1mM至50mM或5mM至50mM。在某些方面中，缓冲剂是终浓度为5mM至50mM的组氨酸，或终浓度为1mM至10mM的琥珀酸盐。在某些方面中，组氨酸的终浓度为20mM±2mM。

虽然盐溶液(即含NaCl溶液)是优选的，但适用于制剂的其它盐包括但不限于CaCl₂，KCl和MgCl₂及其组合。可以使用非离子等渗剂，包括但不限于蔗糖，海藻糖，甘露醇，山梨糖醇和甘油代替盐。合适的盐范围包括但不限于25mM至500mM或40mM至170mM。在一个方面中，盐水是NaCl，任选以20mM至170mM的浓度存在。

在一个实施方式中，制剂包含含有氯化钠的L-组氨酸缓冲液。

在本文所述制剂的某些实施方式中，多糖-蛋白缀合物包含一种或多种与载体蛋白缀合的肺炎球菌多糖。载体蛋白可选自CRM₁₉₇，白喉毒素片段B(DTFB)，DTFBC8，白喉类毒素(DT)，破伤风类毒素(TT)，TT片段C，百日咳类毒素，霍乱类毒素，大肠杆菌LT，大肠杆菌ST，来自铜绿假单胞菌的外毒素A及其组合。在一个方面中，使用水性化学制备所有多糖-蛋白缀合物。在另一方面中，使用DMSO溶剂制备一种或多种多糖蛋白缀合物。作为一个实例，多糖-蛋白缀合物制剂可以是15价肺炎球菌缀合物(15vPnC)制剂，其中使用DMSO溶剂制备来自血清型6A，6B，7F，18C，19A，19F和23F的多糖蛋白缀合物，并使用水性溶剂制备来自血清型1，3，4，5，9V，14，22F和33F的多糖蛋白缀合物。

在另一个实施方式中，药物组合物在控释***中递送。例如，可以使用静脉内输注、透皮贴剂、脂质体或其他施用方式施用药剂。在另一个实施方式中，使用聚合物材料；例如在微球中或植入物中。

本发明的组合物还可包含一种或多种来自肺炎链球菌的蛋白质。适合包含的肺炎链球菌蛋白的实例包括在国际专利申请公开号WO 02/083855和WO 02/053761中鉴定的那些。

已经参考所附说明书和附图描述了本发明的各种实施方式，应当理解，本发明不限于那些精确的实施方式，并且本领域技术人员可以实现其中的各种变化和修改，而不脱离所附权利要求中限定的本发明的范围或精神。

以下实施例说明但不限制本发明。

实施例

实施例1：肺炎链球菌荚膜多糖的制备

培养肺炎球菌的方法是本领域熟知的。参见，例如，Chase，1967，Methods ofImmunology and Immunochemistry 1:52。制备肺炎球菌荚膜多糖的方法也是本领域熟知的。参见，例如，欧洲专利号EP0497524。肺炎球菌亚型的分离物可从美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)获得。细菌被鉴定为包膜的、非运动的、革兰氏阳性、柳叶刀形双球菌，其在血液琼脂上是α-溶血的。可以使用特定抗血清在Quelling反应的基础上区分亚型。参见，例如，美国专利号5,847,112。

代表存在的每种肺炎链球菌血清型的细胞库在冷冻小瓶中从Merck培养物保藏中心(Rahway，NJ)获得。将解冻的种子培养物转移至含有适于肺炎链球菌的预先灭菌的生长培养基的种子发酵罐中。培养物在控制温度和pH的种子发酵罐中生长。将整个体积的种子发酵罐转移至含有预先灭菌的生长培养基的生产发酵罐中。生产发酵是该过程的最终细胞生长阶段。控制温度、pH和搅拌速率。

通过添加灭活剂终止发酵过程。灭活后，将批料转移至灭活罐中，在此处将其保持在受控温度和搅拌下。使用离心和过滤的组合除去细胞碎片。将该批料超滤并渗滤。然后将该批料进行溶剂基分馏，除去杂质并回收多糖。

实施例2：在水溶液中使用还原胺化将血清型1，3，4，5，6A，6B，7F，9V，14，18C，19A，19F，22F，23F和33F缀合至CRM₁₉₇

使用常规工艺流程将不同的多糖血清型分别与纯化的CRM₁₉₇载体蛋白缀合。将多糖溶解，减少大小，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。然后在反应混合物中使用NiCl₂(2mM)将纯化的CRM₁₉₇与活化的多糖缀合，并在最终的0.2微米过滤之前通过超滤纯化得到的缀合物。将每个步骤中的若干工艺参数(例如pH、温度、浓度和时间)控制为以下部分中的血清型特异性值。

多糖大小减少和氧化

将纯化的肺炎球菌荚膜多糖粉末溶于水中，除血清型19A外的所有血清型均0.45微米过滤。除血清型19A外，所有血清型均质化以降低多糖的分子量。血清型19A由于其相对低的起始大小而未减少大小。将均化压力和通过均化器的次数控制为血清型特异性靶标(150-1000巴；4-7次通过)以实现血清型特异性分子量。将大小减少的多糖经0.2微米过滤，然后浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜针对水渗滤。

然后用乙酸钠缓冲液将多糖溶液调节至血清型特异性温度(4-22℃)和pH(4-5)，以使由于活化引起的多糖大小减少最小化。对于所有血清型(血清型4除外)，通过添加100mM偏高碘酸钠溶液开始多糖活化。加入的偏高碘酸钠的量是血清型特异性的，范围为每摩尔多糖重复单元约0.1至0.5摩尔偏高碘酸钠。偏高碘酸钠的血清型特异性电荷是为了实现多糖活化的目标水平(每摩尔多糖重复单元的摩尔醛)。对于血清型4，在加入偏高碘酸钠之前，将批料在约50℃和pH 4.1下温育以使多糖部分脱酮。

对于所有血清型(除血清型5和7F外)，使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物针对pH 6.4的10mM磷酸钾渗滤。将血清型5和7F针对10mM乙酸钠渗滤。所有血清型的超滤均在2-8℃下进行。

多糖缀合至CRM₁₉₇

根据血清型，将氧化多糖溶液与水和1.5M磷酸钾，pH 6.0或pH 7.0混合。选择的缓冲液pH用于改善缀合反应期间活化多糖的稳定性。将通过如先前描述(WO 2012/173876A1)的荧光假单胞菌中的表达获得的纯化的CRM₁₉₇经0.2微米过滤并与缓冲多糖溶液组合至多糖与CRM₁₉₇质量比为0.4-1.0w/w，具体取决于血清型。选择质量比以控制所得缀合物中多糖与CRM₁₉₇的比率。根据血清型，多糖和磷酸盐浓度是血清型特异性的，分别为3.6至10.0g/L和100至150mM。选择血清型特异性多糖浓度以控制所得缀合物的大小。然后将溶液经0.2微米过滤。使用100mM氯化镍溶液将氯化镍加入至约2mM。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)。缀合进行血清型特异性的持续时间(72至120小时)以最大化多糖和蛋白质的消耗。

用硼氢化钠还原

缀合反应后，将批料稀释至约3.5g/L的多糖浓度，冷却至2-8℃，并经1.2微米过滤。使用100kDa NMWCO切向流超滤膜将所有血清型(血清型5除外)在2-8℃下针对100mM磷酸钾，pH7.0渗滤。然后将在保留物中回收的批料稀释至约2.0g多糖/L，并通过加入1.2M碳酸氢钠，pH9.4调节pH。加入硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)。随后加入1.5M磷酸钾，pH6.0。使用100kDa NMWCO切向流超滤膜将血清型5针对300mM磷酸钾渗滤。

最终过滤和产品储存

然后将批料浓缩并使用300kDa NMWCO切向流超滤膜在4℃下针对150mM氯化钠，pH7.0中的10mM L-组氨酸渗滤。将保留物批次经0.2微米过滤。

将血清型19F缀合物在22℃温育约7天，使用100kDa NMWCO切向流超滤膜在4℃下针对150mM氯化钠，pH7.0中的10mM L-组氨酸渗滤，并经0.2微米过滤。

在150mM氯化钠，pH 7.0中用另外的10mM L-组氨酸将批料调节至多糖浓度为1.0g/L。将批料分配成等分试样并在≤-60℃下冷冻。

实施例3：在二甲基亚砜中使用还原胺化将血清型3，4，6A，6B，7F，9V，14，18C，19A，19F，22F，23F和33F缀合至CRM₁₉₇的方法

使用常规工艺流程将不同的多糖血清型3，4，6A，6B，7F，9V，14，18C，19A，19F，22F，23F和33F分别与纯化的CRM₁₉₇载体蛋白缀合。将多糖溶解，大小分级至目标分子量，化学活化并通过超滤进行缓冲液交换。将活化的多糖和纯化的CRM₁₉₇分别冻干并重新溶解在二甲基亚砜(DMSO)中。然后将再溶解的多糖和CRM₁₉₇溶液合并并如下所述进行缀合。在最终的0.2微米过滤之前，通过超滤纯化所得的缀合物。将每个步骤内的若干工艺参数(例如pH、温度、浓度和时间)控制为以下部分中的血清型特异性值。

多糖大小减少和氧化

将纯化的肺炎球菌荚膜Ps粉末溶于水中，将除血清型19A外的所有血清型经0.45微米过滤。将除血清型18C和19A外的所有血清型均质化以降低Ps的分子量。将均化压力和通过均化器的次数控制为血清型特异性靶标(150-1000巴；4-7次通过)。在≥90℃下通过酸水解使血清型18C大小减少。

将大小减少的多糖经0.2微米过滤，然后浓缩并使用10kDa NMWCO切向流超滤膜针对水渗滤。将5kDa NMWCO膜用于血清型18C。

使用10kDa NMWCO切向流超滤膜将活化产物针对10mM磷酸钾，pH 6.4渗滤，然后使用10kDa NMWCO膜针对水渗滤或透析。将5kDa NMWCO膜用于血清型18C。所有血清型的超滤或透析均在2-8℃下进行。

多糖缀合至CRM₁₉₇

使用5kDa NMWCO切向流超滤膜将通过如先前描述(WO2012/173876A1)在荧光假单胞菌中表达获得的纯化的CRM₁₉₇针对2-5mM磷酸盐，pH 7.0缓冲液进行渗滤，并经0.2微米过滤。

对于血清型3以外的血清型，将氧化多糖配制成6mg Ps/mL和5％w/v蔗糖(50mg蔗糖/mL)水溶液。对于血清型3，将氧化多糖配制成2mg Ps/mL和10％w/v蔗糖(100mg蔗糖/mL)水溶液。将蛋白质溶液配制成6mg Pr/mL，含有1％w/v蔗糖(10mg蔗糖/mL)的磷酸盐缓冲液。

将配制的Ps和CRM₁₉₇溶液分别冻干。将冻干的Ps和CRM₁₉₇材料重新溶解在DMSO中并使用混合三通进行组合。加入氰基硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元1摩尔)，并进行缀合达到血清型特异性持续时间(1至48小时)，以实现目标缀合物大小。

用硼氢化钠还原

在缀合反应后加入硼氢化钠(每摩尔多糖重复单元2摩尔)。将批料稀释到150mM氯化钠中，其含有或不含约0.025％(w/v)聚山梨醇酯20，温度约为4℃。然后加入磷酸钾缓冲液以中和pH。对于血清型3，6A，6B，7F，9V，18C，19A，19F，22F，23F和33F，将批料浓缩并在约4℃下使用30kDa NMWCO切向流超滤膜针对150mM氯化钠，有或没有25mM磷酸钾pH 7进行渗滤。

最终过滤和产品储存

将血清型3，6A，6B，7F，9V，18C，19A，22F，23F和33F浓缩并在4℃下使用300kDaNMWCO切向流超滤膜针对含有或不含有0.015％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠，pH7.0中的10mM组氨酸进行渗滤。保留物批料经0.2微米过滤。

将血清型19F温育约5天，在约4℃下使用300kDa NMWCO切向流超滤膜针对150mM氯化钠，pH 7.0中的10mM组氨酸进行渗滤，并经0.2微米过滤。

将血清型3，6A，6B，7F，9V，18C，19A，19F，22F，23F和33F用另外的150mM氯化钠，pH7.0中的10mM组氨酸稀释，分配成等分试样并在≤-60℃下冷冻。

在约4℃下使用300kDa NMWCO膜将血清型4和14针对150mM氯化钠透析，经0.2微米过滤，分配成等分试样并在≤-60℃下冷冻。

实施例4：缀合物的分析

使用HPSEC/UV/MALS/RI测定的缀合物的分子量和浓度分析

通过高效尺寸排阻色谱(HPSEC)注射和分离缀合物样品。用紫外(UV)、多角度光散射(MALS)和折射率(RI)检测器串联完成检测。使用消光系数自UV280计算蛋白质浓度。使用dn/dc因子自RI信号(由蛋白质和多糖两者贡献)去卷积多糖浓度，dn/dc因子是伴随以mL/g为单位报告的溶质浓度的变化的溶液折射率的变化。使用所测量的浓度和整个样品峰的光散射信息，通过Astra软件(Wyatt Technology Corporation，Santa Barbara，CA)计算样品的平均分子量。

多糖活化度测定

通过活化醛和载体蛋白上主要是赖氨酸残基之间的还原胺化发生缀合。以每摩尔多糖重复单元的醛摩尔数表示的活化水平对于控制缀合反应是重要的。在美国专利申请公开号2017/0021006中描述了用于测量活化程度的测定法。

开发内部测定以基于醛基(在多糖的高碘酸盐氧化期间产生)与氨基硫脲(可从商业来源获得)的反应来测量活化程度。

可以通过NMR(核磁共振)或通过将衍生的多糖与适当的参考标准进行比较和/或通过使用衍生物的消光系数来实现定量。该测定的消光系数的使用类似于其在HPSEC/UV/MALS/RI方法中的使用。

通常，可以在以下反应条件下进行测定：

时间:0.5小时-35小时(其为血清型特异性的，但是反应一直持续到完成，即在一个时间过程中的平稳期)

温度:15℃-37℃，优选约21-27℃

TSC浓度:1-5mg/mL

反应pH:pH 3-5.5，优选4.0

对于实施例4，在pH 4.0下用1.25至2.5mg/mL氨基硫脲(TSC)衍生化多糖以引入发色团(用于血清型1、5和9V的活化多糖的衍生化使用1.25mg/mL TSC)。使衍生化反应进行以达到平稳期。实际时间根据每种血清型的反应速度而变化。然后通过高效尺寸排阻色谱法将TSC-Ps自TSC和其他低分子量组分分离。通过266nm处的UV吸光度检测信号。针对Mono-TSC的标准曲线注射或直接使用预定的消光系数计算活化醛的水平。Mono-TSC是单糖的合成缩氨基硫脲衍生物。然后使用通过HPSEC/UV/MALS/RI测定法测量的Ps浓度将醛水平转化为每摩尔重复单元的醛摩尔数(Ald/RU)。

可以使用氨基硫脲结构类似物，酰肼，肼，氨基脲，氨基脲结构类似物，氨氧基化合物或芳族胺进行类似的衍生化，只要该衍生物具有显著的UV吸收。UV吸光度可以来自与衍生化剂连接的发色团，或者由于醛衍生化而产生的发色团，如氨基硫脲的情况。

测定缀合蛋白中的赖氨酸消耗量，作为多糖和载体蛋白之间共价连接数的量度

使用Waters AccQ-Tag氨基酸分析(AAA)以测量缀合物样品中的缀合程度。在Eldex工作站中使用气相酸水解水解样品，以将载体蛋白质分解成其组分氨基酸。使用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)衍生游离氨基酸。然后使用在C18柱上具有UV检测的UPLC分析衍生的样品。使用除赖氨酸之外的代表性氨基酸获得平均蛋白质浓度。缀合期间的赖氨酸消耗(即赖氨酸损失)通过缀合物中赖氨酸的平均测量量和起始蛋白中赖氨酸的预期量之间的差异来确定。

在水溶液和DMSO溶液中使用还原胺化制备的缀合物的属性

使用实施例2和3中描述的方法产生的缀合物的多糖活化和赖氨酸消耗(即，赖氨酸损失)结果列于表1中。明显区别在于DMSO中制备的缀合物(实施例3)相比在水溶液中制备的缀合物(实施例2)具有较高的赖氨酸消耗和较低的多糖活化。这表明在DMSO溶液中制备缀合物允许多糖附接至载体蛋白上的更多缀合位点，对天然多糖结构的活化或破坏较少。因此，由于在DMSO溶液中制备的缀合物中的交联比在水溶液中制备的缀合物中的交联更高，缀合物平均每个多糖重复单元含有更多的糖肽。据信糖肽是产生免疫应答的抗原结构域。因此，预期在DMSO中产生的缀合物相比在水溶液中产生的缀合物具有更高的免疫原性。

通过HPSEC UV-MALS-RI测定法测量表1中缀合物的平均分子量(Mw)。在水溶液中通过还原胺化产生的缀合物的范围为990至3410kDa。在DMSO中产生的缀合物通常较大，大小范围为1300至5822kDa。

表1:在水溶液或DMSO中使用还原胺化制备的肺炎球菌血清型3，4，6A，6B，7F，9V，14，18C，19A，19F和23F CRM₁₉₇缀合物的赖氨酸损失

CRM₁₉₇上不同位点处缀合程度的量化

多糖可以与载体蛋白的N-端的胺基或CRM₁₉₇中的39个赖氨酸残基的任何侧链缀合。CRM₁₉₇的氨基酸序列在表2中提供，其中赖氨酸(缩写为K)以下划线和粗体显示。为了定位和量化CRM₁₉₇蛋白上不同位点处的多糖缀合程度，使用LC/UV/MS肽作图方法。用胰蛋白酶一式二份消化代表性的缀合物样品(用DMSO或水溶液制备)，产生胰蛋白酶肽。然后将混合物在反相C₁₈柱上分离并通过UV和质谱仪分析。CRM₁₉₇蛋白质样品(未与多糖缀合)也作为对照同时一式三份进行处理。由于胰蛋白酶在赖氨酸和精氨酸残基的C端裂解蛋白质，因此赖氨酸残基处的缀合使得该位点具有蛋白酶抗性。通过计算与CRM₁₉₇对照相比的胰蛋白酶肽的峰强度降低来确定特定位点处的缀合程度。取决于裂解位点和序列，特定肽的信号降低可能是由于前一肽处赖氨酸的错误裂解，或肽末端赖氨酸的错误裂解，或肽序列中间的缀合。

在图1中针对可能的缀合位点绘制了与CRM₁₉₇对照相比血清型19A缀合物的肽信号降低的相对百分比。X轴中列出的赖氨酸位置是基于它们在CRM₁₉₇蛋白质序列上的顺序编号的，并且代表经分析肽的可能的缀合位点。例如，“33”表示肽信号降低是由于第33位赖氨酸的缀合；且“6，7”表示肽信号降低是由于第6位、第7位或两个赖氨酸的缀合。图1中的数据表明，与水溶液相比，在DMSO中制备的缀合物不仅每个位点处的缀合程度通常更高，而且在DMSO中还存在更多的缀合位点。那些额外的缀合位点包括第29、30、31和32位赖氨酸，其仅是位于先前鉴定的常见人T细胞肽表位中的赖氨酸(参见Raju等人，1995，Eur.J.Immunol.25:3207-3214，位于CRM₁₉₇序列的肽411-430和肽431-450中)。在测试的其他血清型中观察到类似的结果。

表2:CRM₁₉₇氨基酸序列

实施例5：比较在水溶液中与在DMSO中制备的血清型3Ps-CRM₁₉₇缀合物的小鼠免疫原性研究

所有动物实验严格按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南中的建议进行。该方案得到了机构动物护理和使用委员会(IACUC)，MRL，West Point，PA的批准。

将8周龄雌性CD1小鼠圈养在MRL，West Point，PA的动物设施中的微型隔离笼(n＝10只/笼)中。食物和水自由获取。采用如表3中所述的用磷酸铝佐剂(APA)配制的ST3-CRM₁₉₇缀合物(0.4μg ST3多糖)肌内(IM)免疫小鼠(n＝10只/组)，阴性对照动物单独接受APA。在第0、14和28天进行免疫。在第6天和第34天通过尾静脉在血清分离管(BD，Franklin Lakes，NJ)中采集血液。

表3:比较在水溶液中与在DMSO溶液中制备的血清型3Ps-CRM₁₉₇缀合物的小鼠研究组

电化学发光(ECL)免疫原性测定

如前所述并稍作修改，在96孔多重电化学发光测定中测量小鼠抗体应答。参见Marchese等人，2009，Clin Vaccine Immunol 16(3):387-96；Skinner等人，2011，Vaccine29(48):8870-6；和Caro-Aguilar等人，2017Vaccine 35(6):865-72。简而言之，在Meso-Scale Discovery板(Meso Scale Diagnostics，Rockville，MD)上测试血清孵育1小时并洗涤后，将25μl 2μg/ml Sulfo标签(Meso Scale Diagnostics，Rockville，MD)标记的山羊抗-小鼠IgG加至每个孔中。将板在室温下孵育1小时，同时摇动，然后如前所述进行处理，并在MESO Sector S600上读数。

将ECL滴度计算为对应于截断值的线性内插稀释度的倒数(预定阳性对照合并的小鼠血清的肺炎球菌多糖ECL几何平均信号)。使用ECL的对数标度和稀释度进行插值。然后通过对线性插值稀释度进行反向变换来获得滴度。基于线性外推(在对数-对数标度中)，使用完全高于截断线的样本曲线的最后3个ECL数据点的截距和斜率或使用完全低于截断线的样本曲线的前2个ECL数据点的截距和斜率，推断超出100至1,562,500的研究稀释范围的样本的滴度。然后通过线性外推稀释的反向变换来获得滴度。

调理吞噬性杀灭测定(OPA)

如前所述并稍作修改，进行肺炎球菌血清型3调理吞噬杀灭测定(OPA)(Caro-Aguilar等人，2017Vaccine 35(6):865-72；和Burton等人，2006，Clin Vaccine Immunol13(9):1004-9)。在孵育血清、细菌、补体和HL-60细胞后，将10μl调理吞噬反应转移至含有200μl/孔无菌水的Millipore 96孔滤板上的单个孔中。将板真空过滤并加入100μlToddHewett酵母提取物(THYE，Teknova)培养基。过滤介质，将湿板置于密封的塑料袋中，在27℃下过夜。然后将板滤器用100μl/孔的0.1％考马斯蓝溶液(Bio-Rad，Hercules，CA)染色。将染色剂通过板过滤，用考马斯脱色溶液(Bio-Rad)将菌落脱色，再次真空过滤直至干燥。在CTL Immunospot读数器(Shaker Heights，OH)上计数染色的细菌菌落。OPK滴度定义为与补体对照(无血清对照)孔中的平均生长相比具有至少50％杀灭的血清稀释度的倒数，并且通过其信号支持50％杀灭的连续稀释之间的线性插值来计算。

预免疫和给药3后的结果在图2和表4中针对ECL免疫原性示出，并在图3中针对OPA示出。通过使用水溶液和DMSO溶液的方法制备的两种缀合物均是免疫原性的，并且提供针对细菌的功能性杀伤活性。有趣的是，使用DMSO溶液的方法制备的缀合物相比使用水溶液制备的缀合物产生更高的ECL免疫原性和OPA应答。ECL免疫原性差异具有统计学显著性。第3组相对于第2组的GMT比为3.41(下和上95％置信区间为1.26和9.26)。

表4:比较在水溶液中与在DMSO溶液中制备的血清型3Ps-CRM₁₉₇缀合物的小鼠研究组的给药3后ECL免疫原性结果

实施例6：比较在水溶液中与在DMSO中采用还原胺化制备的肺炎球菌多糖-蛋白缀合物的成人免疫原性研究

在本实施例中描述了两种15价肺炎球菌缀合物疫苗(PCV15)在50岁或以上的健康肺炎球菌疫苗未接种成人中的免疫原性和安全性。

试验设计

进行了一项随机、多位点、双盲试验以比较单剂量的2种不同PCV15制剂(PCV15-A和PCV15-B)和Prevnar 13^TM(肺炎球菌13价缀合物疫苗[白喉CRM₁₉₇蛋白]，惠氏制药公司(辉瑞公司的子公司)，费城，PA，USA)在50岁或以上的健康状况良好(任何潜在的慢性病必须经记录处于稳定状态)的成人受试者中的安全性、耐受性和免疫原性，该试验的进行符合药物临床试验质量管理规范(Good Clinical Practices)。

招募了总共690名50岁或以上的健康的肺炎球菌疫苗未接种的个体，并将其随机分入三个不同的疫苗接种组：Prevnar 13^TM，PCV15-A和PCV15-B，比例为1：1：1。随机分组按研究入组年龄(50至64岁，65至74岁，以及≥75岁)进行分层。

PCV15含有2μg/0.5mL剂量的以下各种与CRM₁₉₇缀合的肺炎球菌多糖血清型(1，3，4，5，6A，7F，9V，14，18C，19A，19F，22F，23F，33F)，4μg/0.5mL剂量的与CRM₁₉₇缀合的血清型6B肺炎球菌多糖，125μg/0.5mL剂量的磷酸铝佐剂，20mM L-组氨酸，150mM氯化钠，pH 5.8。PCV15-A用0.2％w/v P188配制。PCV15-B用0.1％w/v PS-20配制。

对于PCV15-A，所有15种多糖血清型(1，3，4，5，6A，6B，7F，9V，14，18C，19A，19F，22F，23F和33F)如实施例2中所述的在水溶液中使用还原胺化与CRM₁₉₇缀合。这些缀合物中的一些(缀合物批号#1材料)的属性列于表1中。

PCV15-B，血清型6A，6B，7F，18C，19A，19F和23F使用实施例3中描述的DMSO中的还原胺化与CRM₁₉₇缀合。这些缀合物(缀合物批号#2材料)的属性列于表1中。剩余血清型(1，3，4，5，9V，14，22F和33F)的缀合物与PCV15-A中使用的缀合物相同。

基于累积安全性评估，两种PCV15制剂均具有与Prevnar 13^TM大致相当的安全性特征(数据未显示)。在第30天测量血清型特异性IgG GMC和OPA GMT(不包括OPA结果)。

结果

IgG几何平均浓度(GMC)和置信区间(CI)汇总在表6中。PCV15-A和PCV15-B中的血清型6A，6B，7F，18C，19A，19F和23F缀合物如上所述采用不同的缀合方法进行制备。与表4中所示的结果一致，当多糖血清型在DMSO中与CRM₁₉₇缀合时，表6中所示的每种血清型的免疫原性应答得到改善。PCV15-B中血清型18C，19A，19F和23F的GMC显著高于PCV15-A中的那些GMC(双侧α＝0.05)。这些数据有力地证明了在DMSO中缀合以改善免疫原性的优点。这一发现以前未曾证明针对肺炎球菌或其他缀合物疫苗。

表6:针对血清型6A，6B，7F，18C，19A，19F和23F的PCV15-A和PCV15-B制剂的IgG抗体应答的汇总。这些血清型的缀合物在水溶液中使用还原胺化(PCV15-A)或通过在DMSO中的还原胺化(PCV15-B)制备。

从cLDA模型获得估计的GMC，GMC比率和95％CI。

N＝随机分组并接种疫苗的受试者数量。

n＝具有有助于分析的接种后第30天血清学结果的受试者数量。

GMC＝几何平均浓度。

CI＝置信区间。

Claims

1.免疫原性组合物，其包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型1，2，3，4，5，6C，6D，7B，7C，8，9N，9V，11A，12F，14，15A，15C，16F，17F，18C，20，21，22A，23A，23B，24F，27，28A，31，34，35A，35B，35F和38中的一种或多种的多糖，其中将所述多糖缀合至所述载体蛋白的缀合反应是在非质子溶剂中。

2.权利要求1所述的免疫原性组合物，其中将来自肺炎链球菌血清型1，3，4，5，9V，11A，12F和14中的一种或多种的多糖与载体蛋白在非质子溶剂中缀合。

3.权利要求1所述的免疫原性组合物，其中将来自肺炎链球菌血清型2，6C，6D，7B，7C，8，9N，15A，15C，16F，17F，20，21，22A，23A，23B，24F，27，28A，31，34，35B，35F和38中的一种或多种的多糖与载体蛋白在非质子溶剂中缀合。

4.权利要求1所述的免疫原性组合物，其中将来自肺炎链球菌血清型3和18C中的一种或多种的多糖与载体蛋白在非质子溶剂中缀合。

5.权利要求4所述的免疫原性组合物，其中将来自肺炎链球菌血清型3的多糖与载体蛋白在非质子溶剂中缀合。

6.权利要求4所述的免疫原性组合物，其中将来自肺炎链球菌血清型18C的多糖与载体蛋白在非质子溶剂中缀合。

7.权利要求1至6中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述缀合反应是还原胺化。

8.权利要求1至7中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述非质子溶剂是二甲基亚砜(DMSO)。

9.权利要求1至8中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述载体蛋白是CRM₁₉₇。

10.权利要求8或9所述的免疫原性组合物，其中在DMSO中制备的所述缀合物具有大于5.0的赖氨酸损失值。

11.权利要求10所述的免疫原性组合物，其中在DMSO中制备的所述缀合物具有7.0至18.0之间的赖氨酸损失值，包括端值。

12.权利要求1-11中任一项所述的免疫原性组合物，其还包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型6A，6B，7F，10A，15B，19A，19F，22F，23F和33F中的一种或多种的多糖，其中将所述多糖缀合至所述载体蛋白的缀合反应是在非质子溶剂中。

13.权利要求12所述的免疫原性组合物，其中所述缀合反应是还原胺化。

14.权利要求12或13所述的免疫原性组合物，其中所述非质子溶剂是DMSO。

15.权利要求12-14中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述载体蛋白是CRM₁₉₇。

16.权利要求12-15中任一项所述的免疫原性组合物，其包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型6A，6B，7F，18C，19A，19F和23F的多糖，其中将来自肺炎链球菌血清型6A，6B，7F，18C，19A，19F和23F的所述多糖缀合至所述载体蛋白的缀合反应是在非质子溶剂中。

17.权利要求1-16中任一项所述的免疫原性组合物，其还包含与载体蛋白缀合的来自肺炎链球菌血清型1，2，3，4，5，6A，6B，6C，6D，7B，7C，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15A，15B，15C，16F，17F，18C，19A，19F，20，21，22A，22F，23A，23B，23F，24F，27，28A，31，33F，34，35A，35B，35F和38中的一种或多种的多糖，其中将来自肺炎链球菌血清型1，2，3，4，5，6A，6B，6C，6D，7B，7C，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15A，15B，15C，16F，17F，18C，19A，19F，20，21，22A，22F，23A，23B，23F，24F，27，28A，31，33F，34，35B，35F或38的所述多糖缀合至所述载体蛋白的缀合反应是在水性溶剂中。

18.权利要求17所述的免疫原性组合物，其中在DMSO条件下使用还原胺化制备35-100％之间的所述血清型，并在水性条件下制备剩余的多糖蛋白缀合物。

19.权利要求17所述的免疫原性组合物，其基本上由与CRM₁₉₇多糖缀合的来自肺炎链球菌血清型1，3，4，5，6A，6B，7F，9V，14，18C，19A，19F，22F，23F和33F的多糖组成，其中肺炎链球菌血清型6A，6B，7F，18C，19A，19F和23F的缀合反应是在非质子溶剂中，其中所述非质子溶剂是DMSO，并且肺炎链球菌血清型1，3，4，5，9V，14，22F和33F的缀合反应是在水性溶剂中，并且还包含约0.2％w/v的PS-20。

20.一种用于在人类受试者中诱导保护性免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用权利要求1-19中任一项所述的免疫原性组合物。

21.权利要求20所述的方法，其中所述受试者为50岁或更大。

22.权利要求20所述的方法，其中所述受试者是免疫受损的。

23.一种用于向肺炎球菌多糖蛋白缀合物疫苗提供增强的免疫应答的方法，其包括向动物受试者施用包含多糖-蛋白缀合物的免疫原性组合物，所述多糖-蛋白缀合物包含与一种或多种载体蛋白缀合的来自第一组的两种或更多种肺炎球菌血清型的肺炎链球菌荚膜多糖，其中来自第一组的所述两种或更多种多糖-蛋白缀合物是在二甲基亚砜(DMSO)条件下使用还原胺化制备的。

24.权利要求23所述的方法，其中所述免疫原性组合物还包含多糖-蛋白缀合物，所述多糖-蛋白缀合物包含与一种或多种载体蛋白缀合的来自第二组的两种或更多种肺炎球菌血清型的肺炎链球菌荚膜多糖，其中来自第二组的所述两种或更多种多糖-蛋白缀合物是在水性条件下使用还原胺化制备的，其中来自第二组的血清型不同于第一组中的血清型。

25.权利要求23或24所述的方法，其中所述肺炎球菌血清型选自血清型1，2，3，4，5，6A，6B，6C，6D，7B，7C，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15A，15B，15C，16F，17F，18C，19A，19F，20，21，22A，22F，23A，23B，23F，24F，27，28A，33F，34，35B，35F和38。

26.权利要求23-25中任一项所述的方法，其中在DMSO条件下使用还原胺化制备来自血清型3或18C的多糖-蛋白缀合物。

27.权利要求23-26中任一项所述的方法，其中来自第一组肺炎球菌血清型的多糖-蛋白缀合物选自血清型6A，6B，7F，18C，19A，19F和23F。

28.权利要求23-27中任一项所述的方法，其中在DMSO条件下使用还原胺化制备来自血清型6A，6B，7F，18C，19A，19F和23F的多糖-蛋白缀合物，并在水性条件下制备来自第二组血清型的多糖-蛋白缀合物。

29.权利要求28所述的方法，其中所述免疫原性组合物基本上由与CRM₁₉₇多糖缀合的来自肺炎链球菌血清型1，3，4，5，6A，6B，7F，9V，14，18C，19A，19F，22F，23F和33F的多糖组成，其中在DMSO条件下使用还原胺化制备来自血清型6A，6B，7F，18C，19A，19F和23F的多糖-蛋白缀合物，并在水性条件下制备来自血清型1，3，4，5，9V，14，22F和33F的多糖蛋白缀合物。

30.权利要求23所述的方法，其中在DMSO条件下使用还原胺化制备所述免疫原性组合物中来自35-100％之间的所述血清型的多糖蛋白缀合物，并在水性条件下制备剩余的多糖蛋白缀合物。

31.权利要求23所述的方法，其中在DMSO条件下使用还原胺化制备来自45-60％之间的所述血清型的多糖蛋白缀合物，并在水性条件下制备剩余的多糖蛋白缀合物。

32.权利要求23所述的方法，其中在DMSO条件下使用还原胺化制备来自60-100％之间的所述血清型的多糖蛋白缀合物，并在水性条件下制备剩余的多糖蛋白缀合物。

33.权利要求23-32中任一项所述的方法，其中所述载体蛋白选自外膜蛋白复合物(OMPC)，破伤风类毒素，白喉类毒素，蛋白D和CRM₁₉₇。

34.权利要求33所述的方法，其中所述载体蛋白是CRM₁₉₇。

35.权利要求23-34中任一项所述的方法，其中在DMSO条件下使用还原胺化制备的缀合物具有大于5.0的赖氨酸损失值。

36.权利要求35所述的方法，其中在DMSO条件下使用还原胺化制备的缀合物具有7.0至18之间的赖氨酸损失值，包括端值。

37.权利要求23-36中任一项所述的方法，其中所述增强的免疫应答通过几何平均滴度测量。

38.权利要求23-37中任一项所述的方法，其中与在水性条件下制备的来自相同肺炎球菌血清型的多糖-蛋白缀合物相比，对肺炎球菌血清型的增强的所述免疫应答是10％或更高。

39.权利要求23-38中任一项所述的方法，其中所述动物受试者是50岁或更大的人受试者。

40.权利要求23-38中任一项所述的方法，其中所述动物受试者是2岁或更小的人受试者。

41.权利要求23-38中任一项所述的方法，其中所述动物受试者是免疫受损的人。

42.权利要求23所述的方法，其中所述增强的免疫应答是相对于接受免疫原性组合物的对照动物测量的，其中在水性条件下使用还原胺化制备来自第一组的一种或更多种多糖-蛋白缀合物。

43.权利要求42所述的方法，其中所述对照动物是小鼠。

44.权利要求42所述的方法，其中所述对照动物是人。

45.一种通过还原胺化制备肺炎球菌多糖-蛋白缀合物的方法，所述方法包括：

a)使选自血清型3，6A，6B，7F，9V，14，18C，19A，19F，22F，23F和33F的肺炎链球菌多糖与一定量的氧化剂反应，以形成具有0.05至0.22的活化水平的活化的多糖；

b)使所述活化的多糖与载体蛋白在非质子溶剂中反应，以形成多糖-蛋白缀合物；其中所述生成的多糖-蛋白缀合物的赖氨酸损失值在7.0至18.0之间，包括端值。

46.权利要求45所述的方法，其中所述活化水平为0.09至0.22。

47.权利要求45所述的方法，其中步骤b)中的所述反应是在还原剂存在下进行的。

48.权利要求45所述的方法，其中所述载体蛋白选自破伤风类毒素、白喉类毒素、和CRM₁₉₇。

49.权利要求48所述的方法，其中所述载体蛋白选自CRM₁₉₇。

50.一种确定活化多糖中醛水平的方法，其包括以下步骤：

a)通过与衍生剂反应直至完成，将活化的多糖衍生化以形成衍生的多糖；

b)通过高效尺寸排阻色谱法分离衍生的多糖；

c)量化所述衍生的多糖的UV吸光度，

其中所述衍生剂选自氨基硫脲，氨基硫脲结构类似物，酰肼，肼，氨基脲，氨基脲结构类似物，氨氧基化合物或芳族胺。

51.权利要求50所述的方法，其中所述衍生剂为氨基硫脲。

52.权利要求50所述的方法，其中步骤c)中的所述量化是通过与衍生物标准比较。

53.权利要求50所述的方法，其中步骤c)中的所述量化是通过测量预定的消光系数。