NO328102B1

NO328102B1 - Kombinasjonsprodukt for overforing av nukleinsyre til muskel, samt anvendelse av nevnte kombinasjonsprodukt.

Info

Publication number: NO328102B1
Application number: NO19996542A
Authority: NO
Inventors: Daniel Scherman; Michel Bureau; Lluis Mir
Original assignee: Roussy Inst Gustave
Priority date: 1997-06-30
Filing date: 1999-12-29
Publication date: 2009-12-07
Also published as: AU8444798A; EP0991426B1; PL337583A1; DE69826124D1; IL133710A0; JP2002507985A; US6939862B2; HUP0004589A3; EP0991426B2; CN1261807A; KR20010020571A; DE69826124T2; ATE275423T1; CA2294793A1; NO996542D0; WO1999001158A1; BR9810369A; NO996542L; HUP0004589A1; CZ475599A3

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et kombinasjonsprodukt som overraskende er vist å resultere i bemerkelsesverdig forbedret in vivo overføring av nukleinsyrer til celler i den stripede muskel. Videre vedrører foreliggende oppfinnelse anvendelse av en nukleinsyre for fremstilling av et medikament for behandling ved genterapi, hvor elektriske pulser påsettes etter at nukleinsyren er administrert.

Overføringer av gener til en gitt celle er grunnlaget for genterapi. Imidlertid er ett av problemene å innføre tilstrekkelig mengde nukleinsyre inn i vertscellen som skal behandles. Genet av interesse må uttrykkes i transfekterte celler. En av de tilnærmelser som har blitt anvendt i den forbindelse er integreringen av nukleinsyre i virale vektorer og særlig i retrovirus, adenovirus eller adeno-assosierte virus. Disse systemer trekker fordel av cellepenetreirngsmekanismer som er utviklet av virusete så vel som deres beskyttelse mot nedbrytning. Imidlertid oppviser denne tilnærmelse problemer. Ett av problemene er en risiko for produksjon av infeksiøse virale partikler som er ømfintlige overfor disseminering i vertsorganismen og, når det gjelder retrovirale vektorer, en risiko for insertional mutagenese. Videre er innføringskapasiteten for et terapeutisk eller vaksinegen i et viralt genom begrenset.

Til slutt genereres det ofte immunresponser mot virale vektorer, noe som gjør re-administrering av viruset ineffektivt på grunn av immunklaring, og kan også resultere i inflammasjon.

En annen måte (Wolff et al., "Science", 247,1465-68,1990; Davis et al., "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 93- 7213-18, 1996; US 5 580 859 til Felgner et al.) involverer administrering i muskelen eller blodstrømmen av en nukleinsyre av plasmidtypen, eventuelt bundet til forbindelser ment for å lette dets transfeksjon, som proteiner, liposomer, ladede lipider eller kationiske polymerer som polyetylenimin, som er gode in vitro-transfeksjonsmidler (Behr et al., "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 86- 6982-6,1989; Felgner et al., "Proe. Nati. Acad. Sei. USA" 84, 7413-7,1987; Boussif et al., "Proe. Nati. Acad. Sei. USA" 92, 7297-301,1995).

Etter den første publikasjon av J.A. Wolff et al. som viser evnen for muskelvev til å inkorporere injisert DNA i form av fritt plasmid (Wolff et al. "Science", 247, 1465-1468,1990), har tallrike forfattere forsøkt å forbedre denne prosess (Manthorpe et al., 1993, "Human Gene Ther.", 4,419-431; Wolff et al., 1991, "BioTechniques", 11, 474-485). Visse trender har kommet etter disse tester, særlig:

• anvendelsen av mekaniske oppløsninger for å fremtvinge inngang for DNA i cellene ved å adsorbere DNA på kuler som så skytes mot vevet ("genpistol") (Sanders Williams et al., 1991, "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 88,2726-2730; Fynan et al., 1993, BioTechniques", 11,474-485). Disse prosesser har vist seg effektive i vaksi-neringsstrategier, men berører kun overflatevevsjiktene. Når det gjelder muskelen, ville deres anvendelse nødvendiggjøre en kirurgisk metode for å sikre tilgang til musklene fordi partiklene ikke krysser kutane vev; • injeksjon av DNA som ikke lenger er i fri plasmidform men bundet til et molekyl som kan tjene som vehikkel for å letter inngangen av kompleksene inn i cellene. De kationiske lipider som benyttes i tallrike andre transfeksjonsprosesser har til nå vist seg å være skuffende når det gjelder anvendelse i muskler, idet de som har vært prøvet har vist seg å inhibere transfeksjon (Schwartz et al., 1996, "Gene Ther.", 405-411). Det samme gjelder kationiske peptider og polymerer (Manthorpe et al., 1993, "Human Gene Ther.", 4,419-431). Det eneste tilfellet av gunstig kombinasjon synes å være polyvinylalkohol- eller polyvinylpyrrolidonblandingen med DNA. Den resulterende økning av disse kombinasjoner representerer kun en faktor på mindre enn 10 i relasjon til det nakne injiserte DNA (Mumper et al., 1996, "Pharmaceutical Research", 13, 701-709); • forbehandling av vevet som skal injiseres med oppløsninger ment for å øke DNA-diffusjonen og/eller stabiliteten (Davis et al., 1993, "Hum. Gene Ther.", 4, 151-159) eller for å favorisere inngangen av nukleinsyrer, for eksempel innføring av celle-multiplikerings- eller -regenereringsfenomet. Behandlingene har særlig angått bruken av lokale anestetika eller kardiotoksin, vasokonstirktorer, endotoksin eller andre molekyler (Manthorpe et al., 1993, "Human Gene Ther.", 4,419-431; Danko et al., 1994, "Gene Ther.", 1,114-121; Vitadello et al., 1994, "Hum. Gene Ther.", 5,11-18). Disse forbehandlingsprotokoller er vanskelig å håndtere. Bupivacain må i sær-deleshet benyttes meget nær dødelige doser for å være effektive. Preinjeksjon av hyperosmotisk sucrose, ment å øke diffusjonen, øker ikke nivået for transfeksjon i muskel (Davis et al., 1993).

Elektroporering, eller bruk av elektriske felt, for å permeabilisere celler benyttes hyppig in vitro for å fremme DNA-transfeksjon i kulturceller. Dette fenomen avhenger av å oppnå en elektrisk terskelfeltstyrke. Elektropermeabilisering ble observert ved elektriske felt med relativt høy intensitet i størrelsesorden 800 til 1200 Volt/cm for animalske celler. Denne teknikk ble også foreslått in vivo for å øke effektiviteten for antitumorale midler som bleomycin, i faste tumorer hos mennesker (US 5 468 228 i navnet L.M. Mir). Med pulser med meget kort varighet (100 mikrosekunder) er disse elektriske betingelser (800 til 1200 Volt/cm) meget godt tilpasset intracellulær overføring av små molekyler. Disse betingelser (pulser på 100 mikrosekunder) ble lagt på uten forbedringer for in vivo nukleinsyreoverføring til leveren, der felt under 1000 Volt/cm viste seg totalt ineffektive eller til og med inhibitoriske sammenlignet med DNA-injeksjon i fravær av elektriske pulser (WO 97/07826 samt Heller et al., "FEBS Letters", 389,225-8,1996).

Denne teknikk oppviser imidlertid vanskeligheter ved anvendelse in vivo, fordi administreringen av felt med slik intensitet kan provosere mer eller mindre ventede vev-lesjoner, noe som ikke representerer noe problem for behandling av cancerpasienter, men som kan representere en vesentlig mangel for friske individer eller for syke individer når nukleinsyren administreres i andre vev enn de tumorale vev.

NO994820 er en publikasjon som har tidligere prioritet en foreliggende søknad, men er gjort allment tilgjengelig etter prioritetsdagen for foreliggende søknad. I denne publikasjonen er det gjort kjent en metode for å overføre en nukleinsyre til en skjelettmuskel ved at cellene utsettes for et elektrisk felt.

I Nishi t. et al., Cancer Research Vol. 56, side 1050-1055,1996 er det omtalt en metode for effektiv in vivo gen overføring ved bruk av intra-arteriell plasmid DNA injeksjon etter in vivo elektroporering.

Selv om alle de ovenfor nevnte studier nevner behovet for høyere elektriske felt i størrelsesorden 1000 Volt/cm for å kunne være effektive in vivo, har foreliggende søkere svært uventet og meget bemerkelsesverdig vist at in v/vo-nukleinsyreoverføring til vev økes meget vesentlig uten ugunstige virkninger ved å underkaste disse vev elektriske pulser med lav intensitet, for eksempel 100 til 200 Volt/cm, men med relativt lang varighet. Videre er det funnet at den vide varierbarhet av plasmid-båret transgen-ekspresjon som observeres i den kjente teknikk ved DNA-overføring til musklene bemerkelsesverdig godt kan reduseres ved prosessen ifølge oppfinnelsen.

Således angår foreliggende oppfinnelse en kombinasjon av en nukleinsyre og unipolar-bølge elektrisk felt, med en styrke mellom 4 og 400 Volt/cm, for separat eller tidsforskutt administrering in vivo i stripede muskler og for genterapi basert på in vivo elektrotransfeksjon i stripede muskler etter administrering av nukleinsyren. Fortrinnsvis er den totale varighet over 10 msek. Antallet pulser som benyttes er for eksempel 1 til 100 000 pulser og frekvensen for pulsene mellom 0,1 og 1000 Hz. Fortrinnsvis ligger pulsfrekvensen mellom 0,2 og 100 Hz. Pulsene kan også avgis på irregulær måte og den funksjon som beskriver feltintensiteten som funksjon av tiden kan være variabel. Integralet av funksjonen som beskriver variasjonen av det elektriske felt med tiden er over 1 kV-msek/cm. I henhold til en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen er dette integralet > 5 kV-msek/cm.

I henhold til en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen ligger feltstyrken for pulsene mellom 30 og 300 Volt/cm.

De elektriske pulser er valgt blant firkantpulser, elektriske felt som genererer eksponentielle nedbrytningsbølger, oscillerende unipolare bølger av begrenset varighet, oscillerende bipolare bølger av begrenset varighet eller andre bølgeformer. I henhold til en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen er de elektriske pulser firkantbølgepulser.

Administreringen av elektriske pulser kan gjennomføres på en hvilken som helst i og for seg kjent måte, for eksempel: • system med ytre elektroder plassert på begge sider av vevet som skal behandles, særlig ikke-invasive elektroder plassert i kontakt med huden; • system av elektroder implantert i vevene;

Innenfor rammen av oppfinnelsen skal uttrykkene overføring av DNA eller nukleinsyrer ved anvendelse av en eller flere elektriske pulser samt uttrykkene elektrooverføring eller også elektrotransfeksjon, ansees som ekvivalente og de er ment å angi overføring av nukleinsyrer eller DNA ved pålegging eller nærvær av et elektrisk felt.

Da administreringen gjennomføres in vivo, er det nødvendig å kunne ty til intermediære produkter som sikrer den elektriske kontinuitet med de ytre ikke-invasive elektroder. Det kan for eksempel dreie seg om en elektrolytt i form av en gel.

Nukleinsyrene kan administreres på en hvilket som helst egnet måte, men blir fortrinnsvis injisert in vivo direkte i vevene eller administrert på en annen måte, lokalt eller systemisk, som gjør dem tilgjengelige på applikasjonssetet for det elektriske felt. Nukleinsyrene kan administreres med midler som tillater eller letter overføring som nevnt tidligere. Disse nukleinsyrer kan særlig være frie i oppløsning eller bundet til syntetiske midler eller båret av virale vektorer. De syntetiske midler kan være lipider eller polymerer som er kjent for eksperten eller også målsøkende elementer som mulig-gjør fiksering på membranen av målvevet. Blant disse elementer kan nevnes vektorer som bærer sukker, peptider, antistoffer, reseptorer og ligander.

Ifølge oppfinnelsen er det tatt sikte på at administreringen av nukleinsyrene kan skje separat eller tidsforskutt i forhold til påleggingen av det elektriske felt.

Kombinasjonsproduktet ifølge oppfinnelsen kan anvendes i genterapi, det vil si terapi der ekspresjonen av et overført gen, men også modulering eller blokkering av et gen, tillater å sikre behandlingen av en spesielle patologi.

Fortrinnsvis behandles vevcellene for å oppnå en genterapi som tillater:

• korreksjon av dysfunksjoner i cellene selv (for eksempel for behandling av sykdommer forbundet med genetiske defekter som for eksempel mucoviscidose), • beskyttelse og/eller regenerering av vaskularisering eller innervasjon av vev eller organer med trofiske, neurotrofiske og angiogene faktorer som produseres av transgenet, • transformasjon av vev til et organ som skiller ut produkter som fører til en terapeutisk effekt som produktet av genet selv (for eksempel faktorer for regulering av trombose og hemostase, trofiske faktorer, hormoner) eller som en aktiv metabolitt

syntetisert i vevet på grunn av tilførselen av det terapeutiske gen,

• en vaksine- eller immunstimulerende anvendelse.

En annen gjenstand for oppfinnelsen er assosiasjonen av elektriske pulser i et felt med preparater som inneholder nukleinsyrer formulert med henblikk på enhver administrering som tillater tilgang til vev ad topisk, kutan, oral, vaginal, parenteral, intranasal, intravenøs, intramuskulær, subkutan, intraokulær, transdermal vei eller lignende. Fortrinnsvis inneholder de farmasøytiske preparater en bærer som er farmasøytisk akseptabel for en injiserbar formulering, særlig for en injeksjon direkte i det ønskede organ, eller en hvilken som helst annen administrering. Det kan særlig dreie seg om sterile, isotoniske oppløsninger eller tørkede produkter og særlig lyofiliserte slike som ved tilsetning av sterilisert vann eller fysiologisk serum tillater konstituering av injiserbare oppløste stoffer. Nukleinsyredosene som benyttes for injeksjon samt antallet administrasjoner og volumet av injeksjonene kan tilpasses som funksjon av de forskjellige parametere og særlig som funksjon av den benyttede administreirngsmåte, den angjeldende patologi, genet som skal uttrykkes eller også den tilsiktede behandlingsvarighet.

Nukleinsyrene kan være av syntetisk eller biosyntetisk opprinnelse eller ekstrahert fra virus eller prokaryotiske celler eller eukaryotiske celler som stammer fra unicellulære organismer (for eksempel gjær) eller pluricellulære. De kan administreres helt eller delvis i forbindelse med preparater av organisk eller syntetisk opprinnelse.

Nukleinsyren kan være en deoksyribonukleinsyre eller en ribonukleinsyre. Det kan dreie seg om sekvenser av naturlig eller kunstig opprinnelse og særlig genomisk DNA, cDNA, mRNA, tRNA og rRNA, hybridsekvenser eller syntetiske eller semisyntetiske sekvenser av eventuelt modifiserte oligonukleotider. Disse nukleinsyrer kan oppnås på en hvilken som helst kjent måte og særlig ved kjemisk syntese eller ved blandede metoder som inkluderer kjemisk eller enzymatisk modifisering av sekvensene som oppnås. De kan modifiseres kjemisk.

Særlig kan nukleinsyren være en DNA eller en RNA, retning eller antiretning, eller med en katalytisk egenskap som et ribozym. Med "antiretning" menes en nukleinsyre med en sekvens som er komplementær til en målsekvens, for eksempel en mRNA-sekvens hvor man ved ekspresjon ønsker å blokkere målsekvensen ved hybridisering. Med "retning" menes en nukleinsyre som har en sekvens som er homolog eller identisk med en målsekvens, for eksempel en sekvens som binder seg til en proteintranskirpsjonsfaktor og som er involvert i ekspresjonen av et gitt gen. I henhold til en foretrukket utførelsesform omfatter nukleinsyren et gen av interesse og elementer som tillater ekspresjon av dette gen. Fortrinnsvis er nukleinsyrefragmentet i form av et plasmid.

Desoksyribonukleinsyrene kan være enkelt- eller dobbeltstrenget og det kan dreie seg om korte oligonukleotider eller om lengre sekvenser. De kan bære terapeutiske gener, sekvenser som er regulerende for transkripsjon eller replikasjon eller bindingsområder til andre cellulære bestanddeler. Innenfor rammen av oppfinnelsen menes med "terapeutiske gen" særlig et hvilket som helst gen som koder for en RNA eller for et proteinprodukt med en terapeutisk effekt. Det kodede proteinprodukt kan være et protein, et peptid, og så videre. Proteinproduktet kan være homologt overfor målcellen (det vil si et produkt som vanligvis uttrykkes i målcellen når denne ikke oppviser noen patologi). I dette tilfellet tillater den transgene ekspresjon for eksempel å bøte på en utilstrekkelig ekspresjon i cellen eller en inaktiv eller svakt aktiv ekspresjon av et protein på grunn av en modifikasjon, eller tillater også å overutrykke proteinet. Det terapeutiske gen kan også kode for en mutant av et cellulært protein med en øket stabilitet, modifisert aktivitet, og så videre. Proteinproduktet kan likeledes være heterologt vis å vis målcellen. I dette tilfellet kan det utrykte protein for eksempel komplettere eller tilveiebringe en defekt aktivitet i cellen (behandling av enzymatiske deficiter), eller tillate å kjempe mot en patologi, eller å stimulere en immunrespons.

Blant de terapeutiske produkter som ligger innenfor rammen av oppfinnelsen kan mere spesielt nevnes gener som koder for

- enzymer som a-l-antitrypsin, proteinasene (metalloproteinaser, urokinase, uPA, tPA, ....streptokinase), proteaser som spalter forløperne for å sette fri det aktive produkt (ACE, ICE,....) eller deres antagonister (TIMP-1, vevplasminogenaktivatoren-inhibitorPAI, TFPI), - blodderivater som faktorene som er involvert i koagulering; faktorene VII, VIII, IX, komplementeirngsfaktorer, trombin, - hormoner eller enzymer involvert i synteseveien for hormoner, eller faktorer involvert i kontrollen av syntesen eller ekskresjonen eller sekresjonen av hormoner som insulin, faktorer beslektet med insulin (IGF), eller veksthormon, ACTH, syntese-enzymer for kjønnshormoner, - lymfokiner og cytokiner: interleukiner, kjemokiner (CXC og CC), interferoner, TNF, TGF, kjemotaktiske faktorer eller aktivatorer som MIF, MAF, PAF, MCP-1, eotaxin,

LIF, og så videre (FR 92 03120),

- vekstfaktorer som IGF, EGF, FGF, KGF, NGF, PDGF, P1GF, HGF, proliferin,

- angiogeniske faktorer som CEGF eller FGF, angiopoietin-1 eller -2, endotelin,

- enzymer for syntese av neurotransmittere,

- trofiske faktorer og særlig neurotrofiske slike for behandling av neurodegenerative sykdommer, traumatismer som har skadet nervesystemet eller retinielle degenerenser, for eksempel medlemmer av familien neurotrofiner som NGF, BDNF, NT3, NT4/5, NT6, deres derivater og åpenbare gener, medlemmer av familiene av CNTF som CNTF, aksokin, LIF og derivater derav, IL6 og derivater derav, kardiotrofin og derivater derav, GDNF og derivater derav, medlemmer av familien av IGF som IGF-1, IFGF-2 og derivater derav, - medlemmer av familien FGF, som FGF-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9 og derivater derav, TGF(3,

- knokkelvekstfaktorer,

- hematopoietiske faktorer som erytopoietin, GM-CSF, M-CSF, LIF, og så videre,

- proteiner for cellulær arkitektur som dystrofin eller et minidystrofin (FR 91 11947), selvmordsgener (thymidinkinase, cytosindeaminase, enzymer for cytokrom P450),

gener av hemoglobin og andre proteintransportører,

- gener som tilsvarer proteiner involvert i metabolismen av lipider, av typen apolipoprotein valgt blant apolipoproteinene A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G,

H, J og apo(a), metabolismeenzymer som for eksempel lipaser, lipaselipoprotein, hepatisk lipase, kolesterollecitinacyltransferase, 7a-kolesterolhydroksylase, fosfa-tidyl-sur-fosfatase eller også proteiner for overføring av lipider som proteinet for overføring av kolesterolestere og proteinet for overføring av fosfolipider, et bindings-protein til HDL eller også en reseptor, for eksempel valgt blant reseptorer for LDL, chylomikron-remnante reseptorer og oppfangingsreseptorer, og så videre. Man kan i

tillegg tilsette leptin for behandling av fedme.

- faktorer som regulerer blodtrykket, for eksempel enzymer involvert i metabolismen av NO, angiotensin, bradykinin, vasopressing, ACE, renin, enzymer som koder for syntesemekanismer eller forstørring av prostaglandiner, tromboksan eller adenosin, adenosinreseptorer, kallikreiner og kallistatiner, ANP, ANF, diuretiske eller anti-diuretiske faktorer, faktorer involvert i syntese, metabolisme eller forstørring av

mediatorer som histamin, serotonin, katecholaminer, neuropeptider,

- anti-angiogeniske faktorer som liganden av Tie-1 og Tie-2, angiostatin, ATF-faktoren, derivater av plasminogen, endotellin, trombospondiner-1 og -2, PF-4, inter-feron-a eller -p\ interleukin-12, TNFa, reseptoren av urokinase, fitl, KDR, PAI1,

PAI2, TIMP1, prolaktinfragmentet,

- faktorer som beskytter mot apoptose som AKT-familien,

- proteiner i stand til å indusere en celledød, enten aktive i seg selv som kaspaser, eller av typen "pro-drug" som nødvendiggjør en aktivering med andre faktorer, eller proteiner som aktiverer prodrugs til et middel som provoserer en celledød, for eksempel thymidinkinase av herpesvirus, desaminasene som særlig tillater å ta sikte

på en anticancerterapi,

- proteinene involvert i inter-cellulær kontakt og adhesjon: VCAM, PECAM, ELAM,

ICAM, integriner og kateniner,

- proteiner fra den ekstracellulære matriks,

- proteiner involvert i cellemigrering,

- proteiner av typen transduksjon av signal, type FAK, MEKK, p38-kinase, tyrosin-kinaser, serin-treoninkinaser, - proteiner involvert i regulering av cellecyklusen (p21, pl6, cykliner, og så videre) samt mutante proteiner eller dominant negativt slike som blokkerer cellecyklusen og

som eventuelt kan indusere apoptose,

- transkripsjonsfaktorer: jun, fos, AP 1, p53, samt proteinene av signaleringskaskaden av p53, - proteiner med struktur av cellen, som intermediære filamenter (vimentin, desamin, keratiner), dystrofin, proteiner involvert i kontraktiliteten og kontrollen av den muskulære kontraktibilitet og særlig proteiner involvert i kalsiummetabolismen og kalsiumstrømmen i cellene (SERCA, og så videre).

I det tilfellet der proteinene virker via systemer med ligand og reseptorer, er det tatt sikte på å benytte liganden eller reseptoren (for eksempel FGF-R, VEGF-R,...). Man kan likeledes angi gener som koder for fragmenter eller mutanter av proteiner av ligander eller reseptorer, særlig de ovenfor nevnte proteiner, som oppviser enten en aktivitet som er overlegen hele proteinet eller en antagonistaktivitet, sågar også av typen "dominant negativ" i forhold til det opprinnelig protein (for eksempel fragmenter av reseptorer som inhiberer tilgjengeligheten for sirkulerende proteiner, eventuelt forbundet med sekvenser som induserer en sekresjon av disse fragmenter i forhold til en forankring i det cellulære membran, eller andre systemer for modifikasjon av den intracellulære trafikk av disse

ligand-reseptor-systemer for å unngå tilgjengeligheten for et av disse elementer), eller selv har en egenaktivitet som er distinkt fra den til det totale protein (for eksempel

ATF).

Blant de andre proteiner eller peptider som kan skilles ut av muskelen, er det viktig å understreke antistoffer, variable fragmenter av enkeltkjede-antistoffer (ScFv) eller et hvilket som helst annet antistoff-fragment som har evnen til gjenkjennelse for sin anvendelse ved immunterapien, for eksempel for behandling av infeksiøse sykdommer, tumorer, autoimmune sykdommer som plaquesklerose (antistoff-antiidiotype) samt de ScFv'er som fester seg på de proinflammatoriske cytokiner som for eksempel ILI og TNFoc for behandling av reumatoid artritt. Andre proteiner av interesse er oppløselige reseptorer, for eksempel den oppløselige CD4-reseptor eller den oppløselige reseptor av TNF for anti-HIV-terapi, TNFa-reseptor eller den oppløselige ILI-reseptor for behandling av reumatoid artritt, den oppløselige acetylcholinreseptor for behandling av myasteni; substrat- eller enzyminhibitorpeptider, eller også agonist- eller antagonist-peptider for reseptorer eller adhesjonsproteiner som for eksempel for behandling av astma, trombose, restenose, metastaser eller inflammasjon; kunstige, kimære eller avkortede proteiner. Blant hormoner av vesentlig interesse kan nevnes insulin når det gjelder diabetes, veksthormon og kalsitonin. Man kan videre nevne proteiner i stand til å indusere en antitumoral immunitet eller stimulere immunresponsen (IL2, GM-CSF, IL12, og så videre). Til slutt kan man nevne cytokinene som reduserer Tm-responsen, for eksempel IL10, IL4 og ILI 3.

De tallrike eksempler ovenfor og de som følger, illustrerer den potensielle rekkevidde av påleggingen av et felt ifølge oppfinnelsen.

Den terapeutiske nukleinsyre kan likeledes være et gen eller et antiretningssekvens hvis ekspresjon i målcellen tillater å kontrollere ekspresjonen av gener eller transkripsjonen av cellulær mRNA. Slike sekvenser kan for eksempel transkriberes i målcellen til RNA komplementær til cellulære RNA og derved blokkere traduksjonen til proteinet, i henhold til den teknikk som er beskrevet i EP 140 308. De terapeutiske gener omfatter likeledes sekvenser som koder for ribozymer og som er i stand til selektivt å destruere mål-RNA (EP 321 201).

Som antydet ovenfor kan nukleinsyren likeledes omfatte ett eller flere gener som koder for et antigenisk peptid, i stand til hos mennesker eller dyr å generere en immunrespons. Ved denne spesielle utførelsesform tillater således oppfinnelsen å realisere enten vaksiner eller immunoterapeutiske behandlinger anvendt på mennesker eller dyr, særlig mot mikroorganismer, virus eller cancere. Det kan særlig dreie seg om antigeniske peptider som er spesifikke mot Epstein-Barr-viruset, HIV-viruset, hepatitt-B-viruset (EP 185 573), pseudo-hundegalskapsviruset, "syncitia forming virus", andre virus eller også spesifikke antigener mot tumorer som MAGE-proteinene (EP 259 212), for eksempelproteinene MAGE 1, MAGE 2, eller antigener som kan stimulere en antitumoral respons som de bakterielle varmesjokkproteiner.

Fortrinnsvis omfatter nukleinsyren likeledes sekvenser som tillater og/eller favoriserer ekspresjon i vevet av det terapeutiske gen og/eller genet som koder det antigeniske

peptid. Det kan dreie seg om sekvenser som naturlig er ansvarlig for ekspresjonen av det angjeldende gen, når sekvensen er i stand til å funksjonere i den transfekterte celle. Det kan likeledes dreie seg om sekvenser av annen opprinnelse (ansvarlige for ekspresjonen av andre proteiner, eller også syntetiske). Særlig kan det dreie seg om promotersekvenser av eukaryotiske eller virale gener. For eksempel kan det dreie seg om promotersekvenser fra genomet av den celle man ønsker å transfektere. Blant de eukaryotiske promotere kan man benytte enhver promoter eller avledet sekvens som stimulerer eller reprimer transkripsjonen av et gen på eventuelt spesifikk, sterk eller svak måte. Det kan særlig dreie seg om utbikitære promotere (HPRT, vimentin, a-aktin, tubulin og så videre), promotere for terapeutiske gener (type MDR, CFTR, og så videre), vevspesifikke promotere (promotere av typen gener for desamin, myosiner, kreatinkinase, fosfoglyceratkinase) eller også promotere som responderer på en stimulus, for eksempel promotere som responderer på naturlige hormoner (reseptor for steroide hormoner, retinonsyrereseptor, og så videre) eller en promoter som reguleres av antibiotika (tetracyklin, rapamycin, og så videre), promotere som responderer på et

næringsregime som promotere som responderer på fibrater, eller andre promotere som responderer som andre molekyler av naturlig eller syntetisk opprinnelse. På samme måte kan det dreie seg om promotersekvenser som stammer fra genomet av et virus. I denne forbindelse kan man for eksempel nevne promotere av genene EIA av adenoviruset, MLP, eller promotere som stammer fra genomene av vimsete CM V, RSV, SV40, og så videre. Det kan dreie seg om induserbare eller undertrykkbare promotere. Videre kan ekspresjonssekvensene være modifisert ved addisjoner av sekvenser for aktivering eller regulering som tilsvarer en kondisjonell eller transitorisk ekspresjon, en vevspesifikk eller majoritær ekspresjon, osv.

Videre kan nukleinsyrene likeledes, særlig oppstrøms det terapeutiske gen, omfatte en signalsekvens som styrer det terapeutiske, syntetiserte produkt inn i målcellens sekre-sjonsveier. Denne signalsekvens kan være den naturlige signalsekvens for det terapeutiske produkt, men det kan likeledes dreie seg om en hvilken som helst annen funk-sjonell signalsekvens eller en kunstig signalsekvens. Nukleinsyren kan likeledes omfatte en signalsekvens som styrer det syntetiserte, terapeutiske produkt mot et spesielt rom i cellen, for eksempel peroksisomene, lysosomene og mitokondriene for behandling for eksempel av mitokondriale, genetiske sykdommer.

Andre gener av interesse er særlig beskrevet av McKusick V.A. Medelian i "Inheritance in man, catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive and X-linked pheno-types", 8. utgave, Johns Hopkins University Press (1988), og av J.B. Stanbury et al. i "The metabolic basis of inherited disease", 5. utgave, McGraw-Hill (1983). Genene av interesse dekker proteiner som er involvert i metabolismen av aminosyrer, lipider og andre cellebestanddeler.

Man kan likeledes på ikke-begrensende måte nevne gener assosiert med sykdommer i forbindelse med metabolismen av karbohydrater, for eksempel fruktose-l-fosfat-aldolase, fruktose-l,6-difosfatase, glucose-6-fosfatase, lysosomal ct-l,4-glucosidase, amylo-l,6-glucosidase, amylo-(l,4:l,6)-tranglucosidase, muskulær fosforylase, muskulær fosfofruktokinase, fosforylase-b-kinase, galactose-l-fosfat-uridyltransferase, alle enzymene av deshydrogenasepyruvatkomplekset, pyruvatkarboksylase, 2-oksoglutarat-glyoksyl asekarboksylase, D-glyceratdehydrogenase.

Man kan likeledes nevne:

- genene forbundet med sykdommer ved metabolismen av aminosyrer som for eksempel fenylalaninhydroksylase, dihydrobiopteirnsyntetase, tyrosinaminotransferase, tysosinase, , histidinase, fumarylaceto-acetase, glutationsyntease, y-glutamylcysteinsyntease, ornitin-8-aminotransferase, karbamoylfosfatsyntetase, ornitinkarbamoyltransferase, arginino-succinatsyntease, arginosuccinatlyase, arginase, L-lysin-dehydrogenase, L-lysin-keto-glutaratreduktase, valin-transaminase, leucin-isoleucin-transaminase, dekarboksylase av 2-ketosyrer med forgrenet kjede, isovaleryl-CoA-dehydrogenase, acyl-CoA-dehydrogenase, 3-hydroksy-3-metylglutaryl-CoA-lyase, acetoacetyl-CoA3-ketotiolase, propionyl-CoA-karboksylase, metylmalonyl-CoA-mutase, ATP : cobalamin-adenosyl-transferase, dihydrofolat-reduktase, metylentetrahydrofolat-reduktase, cystationin-(3-syntetase, komplekset sarkosin-deshydrogenase, proteinene tilhørende spaltingssystemet for glycin, P-alanin-transaminase, serum-karnosinase og cerebral homokarnosinase. - Gener forbundet med sykdommer i metabolismen av fett og fettsyrer som lipoprotein-lipase, apolipoprotein C-II, apolipoprotein E, andre apolipoproteiner, lecitinkolesterol-acetyltransferase, reseptoren for LDL, sterolhydroksylase av leveren, "sur fytanisk" a-hydroksylase. - Genene forbundet med lysosomale defekter som for eksempel lysosomal a-L-iduroni-dase, lysosomal iduronatsulfatase, lysosomal heparan-N-sulfatase, lysosomal N-acetyl-a-D-glucosaminidase, acetyl-CoA : lysosomal a-glucosamin-N-acetyltransferase, lysosomal N-acetyl-a-D-glucosamin-6-sulfatase, lysosomal galactosamin-6-sulfat-sulfatase, lysosomal (3-galactosidase, lysosomal arylsulfatase B, lysosomal (3-glucuro-nidase, N-acetylglucosaminylfosforotransferase, lysosomal ct-D-mannosidase, lysosomal a-neuraminidase, lysosomal aspartylglucosaminidase, lysosomal a-L-fukosidase, lysosomal sur-lipase, lysosomal sur-ceramidase, lysosomal sfingomyelinase, lysosomal glucocerebrosidase og lysosomal-galactocerebrosidase, lysosomal galactosylceramidase, lysosomal arylsulfatase A, a-galactosidase A, lysosomal sur-P-galactosidase, kjede a av lysosomal heksosaminidase A.

Man kan likeledes nevne gener assosiert med sykdommer i metabolismen av steroider og lipider, gener assosiert med metabolismus sykdommer av puriner og pyrimidiner, gener assosiert med sykdommer ved metabolismen av porfyrin og heme, gener assosiert med sykdommer ved metabolismen av bindevev, knokler samt gener forbundet med sykdommer i blodet og de hematopoietiske organer, muskler (myopati), nervesystemet (neurodegenerative sykdommer) eller sirkulasjonsapparatet (behandling av for eksempel ischemier og stenose) samt gener involvert i mitokondriale, genetiske sykdommer. Nukleinsyren kan assosieres med en hvilken som helst type vektorer eller en hvilken som helst kombinasjon av slike vektorer som tillater å forbedre overføringen av gener, som eksempler skal nevnes vektorer som virus, syntetiske eller biosyntetiske midler (for eksempel lipidiske, polypeptidiske, glucosidiske eller polymeriske), eller også eventuelt utkastede kuler. Nukleinsyrene kan også injiseres i et vev som underkastes en behandling som tar sikte på å forbedre overføringen av gener, for eksempel en behandling av farmakologisk art ved lokal eller systemisk applikasjon eller en enzymatisk, permeabiliserende (ved bruk av et overflateaktivt middel), kirurgisk, mekanisk, termisk eller fysisk behandling.

Fordelen ved anvendelsen av muskelen i genterapi ligger i tallrike faktorer:

• den bemerkelsesverdige stabilitet ved ekspresjon av transgener, flere måneder overlegen, og tillates sålede stabil og opprettholdt produksjon av et intramuskulært eller

sekretert terapeutisk protein,

• den lette tilgang til muskelvev som tillater direkte, hurtig og ufarlig administrering i et ikke-viralt organ,

• det betydelig volum av muskelmassen som tillater flere administreirngsseter,

• den sekretiske kapasitet muskelen oppviser.

Til disse fordeler kommer også den sikkerhet som gis ved lokal behandling forbundet med anvendelse av målstyrte og lokale elektriske felt.

Totaliteten av disse fordeler og sikkerheten forbundet med anvendelsen av lave felt gjør at foreliggende oppfinnelse kan anvendes på kardialmuskelen for behandling av kardio-patier, for eksempel under anvendelse av en tilpasset fibrilator. Den kan videre anvendes på behandling av restenose ved ekspresjon av gener som er inhibitorer for prolife-reringen av glattmuskelceller, for eksempel proteinet GAX.

Kombinasjonen av et lavt felt og lange administreringsvarigheter lagt særlig på muskler in vivo forbedret transfeksjonen av nukleinsyrer uten å føre til merkbar forringelser i vevet. Disse resultater forbedrer utbyttene av DNA-overføring innenfor rammen av genterapi som benytter nukleinsyrer.

Som en konsekvens tillater fordelene ved muskelvevet, for første gang, å ta sikte på ved genterapi å produsere et middel i fysiologiske og/eller terapeutiske mengder enten i muskelcellene eller sekretert i deres nærhet eller i blod- eller lymfekretsløpet. Videre tillater oppfinnelsen for første gang, en fin modulering og kontroll av den effektive mengde av transgenet som uttrykkes via muligheten for å modulere muskelvevvolumet som transfekteres, for eksempel med flere administreirngsseter, eller også muligheten for å modulere antallet, formen, overflaten og plasseringen av elektrodene. Et ytterligere kontrollelement ligger i muligheten av å modulere effektiviteten av overføringen ved å variere feltintensiteten, antallet, varigheten og frekvensen for pulsene og åpenbart, alt etter kjent teknikk, mengde og volum for administreringen av disse nukleinsyrer. Man kan således oppnå et tilsiktet transfeksjonsnivå ved produksjon eller ønsket sekresjon. Oppfinnelsen tillater til slutt en øket sikkerhet i forhold til kjemiske eller virale metoder for overføring av gener in vivo der berøring av andre organer enn målorganet ikke helt kan utelukkes og styres. Således tillater oppfinnelsen kontroll av lokaliseringen av det transfekterte muskelvev (strengt bundet til muskelvevvolumet som underkastes lokale elektriske pulser) og gir således muligheten til å vende tilbake til initialsituasjonen ved total eller partiell ablasjon av vevet når dette gjøres mulig ved den ikke-vitale karakter av dette muskelvev og ved dets kapasitet for regenerering som når det gjelder lever eller muskel. Denne store brukselastisitet tillater å optimalisere prosessen i henhold til dyreart (human- og veterinæranvendelser), det behandlede individs alder, fysiologisk og patologisk tilstand.

Oppfinnelsen tillater videre, for første gang, å transfektere store nukleinsyrer i motsetning til de virale metoder som er begrenset ved kapsidets størrelse. Denne mulighet er essensiell for overføring av meget store gener som det til dystrofien eller gener med introner og/eller store regulatorelementer, noe som er nødvendig for eksempel ved regulert fysiologisk produksjon av hormoner. Denne mulighet er vesentlig for overføring av episomer eller kunstige kromosomer av gjær eller minikromosomer.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere under henvisning til de følgende, illustrerende eksempler og under henvisning til de vedlagte figurer, der: Figur 1 viser effektene av elektriske impulser med høy feltintensitet på transfeksjonen av plasmidisk DNA pXL2774 i den kraniale tibialmuskel hos mus;

middelverdier ± SEM;

figur 2 viser effektene av elektriske impulser med midlere feltintensitet på transfeksjonen av plasmidisk DNA pXL2774 i den kraniale tibialmuskel hos mus;

middelverdier ± SEM;

figur 3 viser effektene av elektriske impulser med lav feltintensitet og forskjellige varigheter på transfeksjonen av plasmidisk DNA pXL2774 i den kraniale tibialmuskelen hos mus; middelverdier ± SEM;

figur 4 viser effektene av elektriske impulser av lav feltintensitet og forskjellige varigheter på transfeksjonen av plasmidisk DNA pXL2774 i den kraniale tibialmuskelen hos mus; middelverdier ± SEM;

figur 5 viser effektiviteten av elektrotransfeksjonen av plasmidisk DNA pXL2774 i den kraniale tibialmuskel i mus ved lave elektriske feltintensiteter;

middelverdi ± SEM;

figur 6 viser den kinetiske ekspresjon av luciferase i den kraniale tibialmuskel hos mus. Administrering av plasmidet pXL2774 med elektrooverføring (■) og uten elektrooverføring (X); midlere verdier ± SEM;

figur 7 viser ekspresjonsnivået for transgenet som funksjon av den administrerte

DNA-mengde, med elektrooverføring (O) og uten elektrooverføring ( );

figur 8 viser virkningene av forskjellige elektrodetyper på effektiviteten av

elektrooverføringen;

figur 9 viser kinetikken for serumkonsentrasjonen av sekretert alkalisk fosfatase.

Administrering av plasmid pXL3010 med elektrooverføring (■) og uten elektrooverføring (0); midlere verdier ± SEM;

figur 10 viser den kinetiske ekspresjonen av FGF1 i muskelen med elektrooverføring

(hvite histogramstolper) eller uten elektrooverføring (sorte histogramstolper);

figur 11: kart over plasmidene pXL3179 og pXL 3212;

figur 12: kart over plasmidene pXL3 3 8 8 og pXL 3 031;

figur 13: kart over plasmidene pXL3004 og pXL 3010;

figur 14: kart over plasmidene pXL3149 og pXL 3096;

figur 15: kart over plasmidene pXL3353 og pXL 3354; og

figur 16: kart over plasmid pXL3348.

Eksempel 1: Forsøk gjennomført under betingelser kjent fra teknikken, der det

elektriske felt viser seg inhiberende for transfeksjonen.

Standard elektroporeringsbetingelser slik de benyttes i den kjente teknikk og er diskutert ovenfor, er testet og har vist seg å være ineffektive eller sågar å representere en inhiberende virkning på overføringen av nukleinsyrer (plasmidisk DNA) i den stripete muskel.

Materiell og metoder - Generelle arbeidsbetingelser

I dette eksempel ble følgende produkter benyttet:

DNA pXL2774 (PCT/FR 96/01414) er et plasmidisk DNA som omfatter rapportør genet av luciferase. De andre produkter er tilgjengelige fra kommersielle leverandører:

ketamin, xylasin, fysiologisk serum (NaCl 0,9%).

Det benyttes kommersielt tilgjengelige oscilloskop og elektriske pulsgeneratorer (rek-tangulære eller kvadratiske) (Electro-pulsateur PS 15, Jouan, Frankrike). De benyttede elektroder er plateelektroder av rustfritt stål i en avstand på 5,3 mm.

Forsøkene gjennomføres på C57Bl/6-mus. Musene stammer fra forskjellige bur og fordeles tilfeldig før forsøkene ("randomisering").

Musene anestetiseres med ketamimxylazin. Plasmidoppløsningen (30 ul av 500 ug/ml 0,9% NaCl) injiseres longitudinalt gjennom huden i kranialtibialmuskelen i venstre og høyre pote ved hjelp av en Hammilton-sprøyte. De to elektroder legges i en ledende gel og den injiserte pote plasseres mellom elektrodene i kontakt med disse.

De elektriske pulser legges på loddrett på muskelaksen ved hjelp av en generator for kvadratpulser, 1 minutt etter injeksjon. Et oscilloskop tillater å kontrollere intensiteten i Volt (de antydede verdier i eksemplene er maksimale verdier), varigheten i msek og frekvensen Hz for de avgitte pulser, idet frekvensen er 1 Hz for 8 konsekutive pulser.

For å evaluere transfeksjonen til musklene blir musene avlivet 7 dager etter administrering av plasmidet. De kraniale tibialmusklene fra venstre og høyre poter taes ut, veies, bringes i lyseringsbuffer og males opp. Den oppnådde suspensjon sentrifugeres for å oppnå en klar supernatant. Måling av luciferaseaktiviteten realiseres på 10 ul supernatant ved hjelp av et kommersielt luminometer, der substratet automatisk settes til oppløsningen. Intensiteten for den luminøse reaksjon er gitt i relative lysenheter (Relative Luminescence Units = RLU) for en muskel idet man kjenner det totale suspensjonsvolum. Hver forsøksbetingelse testes på 10 punkter: 5 dyr injisert bilateralt. Statistiske sammenligninger er gjennomført ved hjelp av ikke-parametriske tester.

Resultat og diskusjon

To figurer i lineær eller logaritmiske skala viser resultatene.

I dette første forsøk har man testet virkningen av et elektrisk felt på 800 til 1200 Volt/cm, som tillater elektroporering av tumorer (Mir et al., "Eur. J. Cancer", 27, 68, 1991).

Man fastslår i henhold til figur 1 at, relativt en kontrollgruppe der DNA injiseres uten elektrisk puls: • med 8 pulser på 1200 Volt/cm og en varighet på 0,1 msek. er den midlere verdi for luciferaseaktiviteten langt lavere, • med 8 pulser på 1200 Volt/cm og et 0,1 msek, døde 3 dyr og den midlere verdi for luciferaseaktiviteten er langt lavere, • med pulser på 800 Volt/cm og 1 msek, er den midlere verdi for luciferaseaktiviteten også signifikant redusert.

Flesteparten av musklene som var underkastet innvirkning av et elektrisk felt var synlig aldret (sprø og hvitaktig utseende).

Eksempel 2: Forsøk med elektrooverføring av nukleinsyrer med moderate

elektrisk felt.

Dette forsøk gjennomføres med C57Bl/6-mus. Bortsett fra det elektriske felt for pulsene og deres varighet, er betingelsene de samme som i eksempel 1.

Resultatene er vist i figur 2. Man reproduserer resultatene fra eksempel 1, det vil si inhi-bitoreffekten for en serie på 8 pulser ved 800 Volt/cm med en varighet på 1 msek på den luciferaseaktiviteten som detekteres i muskelen. Med et felt på 600 Volt/cm observeres den samme inhibering og den samme endring av muskelvevet. I motsetning til dette og meget overraskende og bemerkelsesverdig, tillater en reduksjon av spenningen ikke lenger synlig å endre musklene og i tillegg er, ved 400 og 200 Volt/cm, nivået for transfeksjon i musklene i gjennomsnittet overlegen det som oppnås på muskler som ikke er underkastet noe felt. Det skal påpekes at i forhold til en sammenligningsgruppe (ikke underkastet elektrisk felt) blir dispersjonen av verdiene for luciferaseaktivitet redusert ved 200 Volt/cm (SEM = 20,59% av den midlere verdi mot 43,32% ved fravær av elektrisk felt (figur 2A)).

Eksempel 3: Forsøk med elektrooverføring av nukleinsyrer med pulser med lav feltstyrke som oppviser en sterk stimulering av ekspresjonen av

transgenet.

Dette forsøk gjennomføres med C57Bl/6-mus. Bortsett fra den elektriske feltstyrke for pulsene samt deres varighet og det faktum at pulsene avgis 25 sekunder etter injeksjon av DNA, er utførelsesbetingelsene som i de foregående eksempler.

Resultatene er vist i figur 3. Gjennomsnittsverdien for ekspresjonen av transgene luciferase er vesentlig øket med en impulsvarighet på 20 msek ved 100 Volt/cm og fra en pulsvarighet på 5 msek ved 200 Volt/cm.

Dette forsøk viser også klart at den midlere verdi for luciferaseaktiviteten som oppnås ved elektra transfeksjon av DNA i muskelen er en funksjon av varigheten av de elektriske pulser, når man benytter spenninger på 200 og 100 Volt/cm. Det skal videre påpekes at dispersjonen av verdiene særlig reduseres for grupper av elektrotransfekterte muskler (figur 3A). I fravær av elektriske pulser (kontroll) utgjør SEM 77,43% av den midlere verdi, mens den relative SEM for gjennomsnittet reduseres med 14% (200 Volt/cm, 5 msek), 41,27% (200 Volt/cm, 20 msek) og mellom 30 og 48% for elektro-overføring ved 100 Volt/cm for det elektriske feltet.

Under de beste betingelser ved dette forsøk forbedre ekspresjonen av transgenet med en faktor med 89,7 i forhold til kontrollen som er injisert i fravær av elektriske pulser.

Eksempel 4: Forsøk med elektrooverføring av nukleinsyrer i muskelen ved 200

Volt/cm som viser en økning av ekspresjonen av transgenet med en

faktor over 200.

Dette forsøk gjennomføres i DBA2-mus med elektriske pulser med en feltintensitet på 200 Volt/cm og variabel varighet idet de andre betingelser ved dette forsøk er som vist i eksempel 3.

Dette eksempel bekretter at ved 200 Volt/cm økes transfeksjonen av luciferaseaktivitet fra en impulsvarighet på 5 msek og så fortsetter å vokse for lengere varigheter (figurene 4 og 5). Også her observeres med elektrotransfeksjonen en reduksjon av den interindividuelle variabilitet som antydes ved SEM i forhold til den ikke-elektrotransfekterte kontroll (den relative verdi av SEM er lik 35% for kontrollen og respektivt 25, 22, 16, 18, 16 og 26% for serien av impulser på respektivt 1, 5, 10,15, 20 og 24 msek).

Ved de beste betingelser ved dette forsøk forbedres ekspresjonen av transgenet med en faktor 205 i forhold til kontrollen som er injisert i fravær av elektriske pulser. Disse resultater bekretter at elektrooverføring under betingelsene som beskrevet i disse forsøk sterkt forbedrer både effektivitet og reproduserbarhet.

Eksempel 5: Effektivitet ved elektrooverføring av nukleinsyrer som funksjon av

produktet "antall impulser x feltintensitet x varighet av hver puls".

Figur 5 eksemplifiserer betydningen av parameteren tilsvarende produktet "antall impulser x feltintensitet x varighet av hver puls". Denne parameter tilsvarer i realiteten integralet som funksjon av tiden av den funksjon som beskriver variasjonen av det elektriske felt.

Presentasjonen i figur 5 av resultatene som er oppnådd under forsøkene 2, 3 og 4 med

elektriske feltintensiteter på 200 eller 100 Volt/cm eller i fravær av elektrisk felt, viser at effektiviteten ved transfeksjonen øker som funksjon av produktet av den totale varighet av eksponeringen til det elektriske felt og feltets intensitet. En stimuleringseffekt oppnås for en verdi over 1 kV x msek/cm for produktet "elektrisk felt x total varighet av pulsene", foretrukket oppnås en stimulering for en verdi > 5 kV x msek/cm for produktet "elektrisk felt x total varighet av pulsene".

Eksempel 6: Virkningen av økningen av varigheten av de elektriske pulser.

Dette eksempel viser at man kan øke enhetslengden av pulsene godt utover de verdier som er angitt i eksempel 4.

Dette forsøk gjennomføres med C57Bl/6-mus. Det benyttede plasmid er plasmid pXL2774, den administrerte mengde DNA er 15 ug. Elektropulsatoren som benyttes for å avgi de elektriske pulser med en varighet over 20 msek er en kommersiell elektro-pulsator (Genetronics, modell T 820, USA, San Diego, CA). De elektriske pulser har variabelt antall og varighet, men en konstant feltstyrke på 200 Volt/cm; de andre betingelser i forsøket er som angitt i eksempel 1. Resultatene er oppsummert i tabell 1. Midlere verdier ± SEM for luciferaseaktiviteten i millioner RLU pr. muskel. N = 10 for hver gruppe. Elektrooverføringsbetingelser: Feltstyrke 200 Volt/cm, 8 eller 4 pulser (variabel enhetsvarighet), frekvens 1 Hz.

Man fastslår en økning av ekspresjonen av transgenet med forlengelsen av varigheten av pulsene (i det minste opptil 40 msek for en serie på 8 pulser og minst opptil 50 msek for en serie på 4 pulser med en styrke på 200 Volt/cm). Dette eksempel viser at optimum av varigheten av pulsene avhenger av antallet pulser som benyttes og at varigheten for

pulsene kan gå helt opptil 80 msek, og denne verdi er ikke-begrensende.

Eksempel 7: Effektivitet for elektrooverføringen som funksjon av antallet elektriske pulser.

Dette eksempel påviser virkningen av økningen av antallet elektriske pulser på effektiviteten av overføringen av nukleinsyrer.

Dette forsøk gjennomføres med C57Bl/6-mus. Det benyttede plasmid er plasmid pXL2774 og den administrerte mengde DNA er 15 ug. De elektriske pulser er variable i antall. Varigheten for hver puls er 20 msek. Feltstyrken er 200 Volt/cm. De andre betingelser ved dette forsøk er som beskrevet i eksempel 1. Resultatene er vist i tabell 2. Midlere verdier ± SEM av luciferaseaktiviteten i millioner RLU pr. muskel. N = 10 pr. gruppe. Betingelser: Feltstyrke 200 Volt/cm, variabelt antall pulser på 20 msek, frekvens 1 Hz.

Man observerer at ekspresjonen av luciferase øker på meget betydelig måte etter pålegging av en enkelt puls og at den fortsetter å øke som funksjon av antallet pulser. Det synes således at variasjonen av antallet pulser som avgis er et middel for å modulere effektiviteten ved overføringen av nukleinsyrer og å justere ekspresjonsnivået av transgenet.

Man bekretter likeledes en reduksjon av variabiliteten av responsen påvist ved en reduksjon av verdien av SEM i forhold til gjennomsnittet for alle grupper som underkastet elektrooverføring.

Eksempel 8: Virkning av økningen av frekvensen av elektriske pulser.

Dette eksempel viser at økningen av frekvensen av pulsene tillater på uventet måte å forbedre effektiviteten ved overføringen. På den annen side og i et klinisk perspektiv kan en økning av frekvensene forbedre pasientens komfort ved å redusere den totale behandlingsvarighet.

Dette forsøk gjennomføres med C57Bl/6-mus. Det benyttede plasmid er plasmid pXL2774 og den administrerte mengde DNA er 15 ug. Frekvensen av de elektriske pulser er variabel (fra 0,1 til 4 Hz). Varigheten av hver puls er 20 msek og feltstyrken er 200 Volt/cm, mens de andre betingelser ved dette forsøk er som beskrevet i eksempel 1. Resultatene oppsummert i tabell 3.

Midlere verdi ± SEM for luciferaseaktiviteten i millioner RLU pr. muskel. N=10 for hver gruppe; Betingelser: feltstyrke 200 Volt/cm, 8 eller 4 pulser på 20 msek, variabel frekvens.

Resultatene som oppnås i forsøk A, tabell 3, viser at de høyeste frekvenser (> 1 Hz) er mere effektive enn lavere frekvenser som tilsvarer en lengere varighet mellom to etter hverandre følgende pulser (10 sekunder ved 0,1 Hz). Effektiviteten ved transfeksjonen øker med frekvensen over spekteret av de testede verdier fra 0,1 til 4 Hz for 4 pulser og 0,1 til 3 Hz for 8 pulser.

Eksempel 9: Virkning av påleggingen av et elektrisk variabelt felt i henhold til en

eksponentielt fallende kurve som funksjon av tiden.

Dette eksempel viser virkningen av påleggingen av et elektrisk felt som varierer i henhold til en eksponentielt synkende kurve på effektiviteten av overføringen av nukleinsyrer.

Dette forsøk er gjennomført med C57B1/6 -mus.

Det benyttede plasmid er pXL3031. Plasmid pXL3031 (figur 12) er en vektor avledet fra plasmid pXL2774 (WO 97/10343) der lue-genet som koder for modifisert luciferase av Photinas pyralis (cytoplasmisk) stammer fra pGL3basic (Genbank; CVU47295) er innført under kontroll av promoteren som stammer fra det tidlige området av den humane cytomegalovirus (hCMV IE, Genbank HS5IEE) og polyadenyleirngssignalet for det sene området av virus SV40 (Genbank SV4CG). Den administrerte mengde DNA er 10 ug.

Den benyttede generator for elektriske pulser tillater å avgi pulser med en varierende feltstyrke i henhold til en eksponentielt synkende kurve som funksjon av tiden (elektro-pulsator Equibio, modell easyjectT plus, Kent, UK). Spenningen som legges på er topp-spenningen for den eksponentielle kurve. Den andre parameter som kan justeres til kapasitansen (uFarad) som tillater å variere energimengden som avgis og den eksponentielle tidskurve. Resultatene er vist i tabell 4.

Faktor for økningen av ekspresjonen (luciferaseaktivitet) oppnådd ved pålegging av en eksponentielt synkende impuls. Økningsfaktoren beregnes under henvisning til den luciferaseaktivitet som oppnås ved administrering av plasmid pXL3031 uten elektro-overføring (midlere verdier for økningsfaktoren, N = 4 til 6, pr. betingelse).

Som sammenligning er økningsfaktoren for den ekspresjon som oppnås for overføring av pXL3031 i nærvær av et elektrisk felt med kvadratpulser med feltstyrke 200 Volt/cm, 8 pulser på 20 msek ved en frekvens på 1 Hz, 44 i det samme forsøk.

Disse resultater viser at man kan benytte elektriske pulser med kvadratform eller med en eksponentielt synkende intensitet som funksjon av tiden. Videre kan i det sistnevnte tilfellet en betydelig økning av ekspresjonen oppnås for en lav feltstyrke og høy kapasitans (for eksempel 200 Volt/cm og kapasitans 3000 uFarad) eller en høy feltstyrkeverdi og

en lav kapasitans (for eksempel 400 Volt/cm og kapasitans 300 uFarad).

Eksempel 10: Effekt av kombinasjonen av en kort puls med høy spenning og flere

lange pulser med lav spenning.

Dette eksempel viser at det elektriske felt som avgis kan være en kombinasjon av minst et felt mellom 500 og 800 Volt/cm med kort varighet, for eksempel 50 til 100 usek, og minst et lavt felt (< 100 Volt/cm) med lengere varighet, for eksempel > 1 msek og sågar helt opptil 90 msek i dette forsøk.

Verdiene for de lave feltstyrker er her 80 Volt/cm, lagt på i 4 pulser med varighet 90 msek med en frekvens på 1 Hz. For dette forsøk benyttes det to elektropulsatorer. De elektriske pulser legges på med først den ene og så den andre apparatur, idet endringen skjer på mindre enn 1 sekund ved hjelp av den manuelle kommando.

Det benyttede plasmid er plasmidet pXL3031. Mengden administrert DNA er 3 ug. Verdiene for de elektriske felt er angitt i tabell 5; de andre betingelser ved dette forsøk er som angitt i eksempel 1.

Midlere verdi ± SEM for luciferaseaktiviteten i millioner RLU pr. muskel.

N= 10 muskler pr. gruppe.

Tabell 5 som oppsummerer resultatene som ble oppnådd for to serier av forsøk viser at en kort impuls med høy spenning og fire suksessive lange impulser med lav spenning forbedrer kun lite transfeksjonen i forhold til kontrollgruppen som far en injeksjon av pXL3031, men som ikke underkastes noe elektrisk felt. Det samme gjelder når pulsene med lav feltstyrke legges på før impulsen med høy feltstyrke.

I de to serier av forsøk viser på den annen side kombinasjonen av en kort puls med høy spenning, fulgt av fire suksessive lange pulser med lav spenning en vesentlig økning av effektiviteten av overføringen av DNA.

Resultatene som oppnås i eksemplene 1 og 2 har vist at 8 impulser på 600, 800 respektivt 1200 Volt med en lik varighet på 1 msek ved 1 Hz gir lesjoner og inhiberer transfeksjonen. Resultatene som oppnås i eksempel 10 viser at det under de spesielle betingelser, er mulig å anvende feltstyrker av høyere type uten at det dannes lesjoner, således kan det ved makroskopisk betraktning ikke fastslås at musklene er synlig endret. Anvendelsen av høye elektriske felt med kort varighet kombinert med lave elektriske felt med lengere varighet synes å være et supplementært middel for å modulere effektiviteten av overføringen av DNA.

Eksempel 11: Elektrooverføring med plasmider med varierende størrelse, genene under kontroll av forskjellige promotere eller med variable adresseringsseter av proteinet som uttrykkes av transgenet. ll.a - Elektrooverførine med plasmider med varierende størrelse Plasmider med varierende størrelse (2,8 Kb, 3,8 Kb, 8,6 Kb, 20 Kb og 52,5 Kb) omfattende genet som koder for luciferase, testes. Mengden plasmid som administreres er 10 \ ig pr. muskel. Et elektrisk felt med en styrke på 200 Volt/cm og 8 pulser med varighet 20 msek og med en frekvens på 2 Hz, legges på, de andre betingelser ved dette for-søk er som beskrevet i eksempel 1.

Man observerer en økning av ekspresjonen av transgenet med en faktor rundt 50 med plasmidene på 2,8 Kb og 3,8 Kb, ca. 80 når det gjelder plasmidet på 8,6 Kb og en faktor 3 til 6 med plasmidene på 20 og på 52,6 Kb.

Dette eksempel viser således muligheten for å overføre plasmider med stor størrelse, helt opptil 20 Kb og utover denne verdi.

11.b - Kontroll av signalet av luminescensen i fravær av genet som koder for luciferase Som kontroll og for å utelukke muligheten for at signalene for luminescens som observeres ved bestemmelse luciferaseaktiviteten, skyldes radikaler som produsert i vevet under den elektriske behandling, testes luciferaseaktiviteten på muskler som er behandlet med et plasmid som ikke koder for luciferase og som underkastes et elektrisk felt.

Luciferaseaktivitet i muskler injisert med forskjellige plasmider, med eller uten pålegging av elektrisk felt. Betingelser: 200 Volt/cm, 8 impulser på 20 msek, frekvens lik 1 Hz. Middelverdier ± SEM for luciferaseaktiviteten i millioner RLU pr. muskel.

Resultatene viser at basisaktiviteten for luciferase i muskler som er injisert med et plasmid som ikke koder for luciferase er helt og holdent neglisjerbar.

ll.c - Elektrooverføring av gener under kontroll av forskjellige promotere Innflytelsen av forskjellige promotere er testet ved ekspresjon av overførte gener med og uten pålegging av elektrisk felt.

Mengden plasmid som injiseres pr. muskel er 2 ug. Det elektriske felt som legges på er på 200 Volt/cm i 8 pulser med varighet 20 msek med en frekvens lik 1 Hz, idet de andre forsøksbetingelser er som beskrevet i eksempel 1. Resultatene er vist i tabell 7. Det testede plasmid er pXL3031 for konstruksjonen CMV-LUC. Konstruksjonen PGK tilsvarer erstatning av promoteren CMV med promoteren PGK i pXL3031.

Middelverdier ± SEM for luciferaseaktiviteten i RLU i millioner pr. muskel.

Disse resultater viser at når DNA overføres i nærvær av et elektrisk felt, er økningsfaktoren for ekspresjonen av transgenet sammenlignbart uansett opprinnelse eller promoterkraft.

ll.d- Elektrooverføring av gen med forskjellige adresseringsseter for proteinet som

uttrykkes av transgenet

Dette eksempel viser overføringen av gen som koder for proteiner med forskjellige cellelokaliseringer. Plasmidet pXL3031 koder for en luciferase som er syntetisert i cytosol og plasmidet pXL2774 koder for en luciferase som er adressert i peroksy-somene.

Mengden plasmid som injiseres pr. muskel er 10 ug. Det elektriske felt som legges på er 200 Volt/cm i 8 pulser på 20 msek med frekvens 1 Hz, idet de andre betingelser i dette forsøk er som beskrevet i eksempel 1. Resultatene er vist i tabell 8.

Middelverdier ± SEM for lucieferaseaktiviteten i millioner RLU.

Disse resultater viser at oppfinnelsen er anvendelig for overføring av gener som koder for proteiner med forskjellige cellulære lokaliseringer og særlig for peroksysomale proteiner eller cytosoliske proteiner.

Eksempel 12: Kinetisk og histologisk analyse av ekspresjonen av transgenet.

12.a - Kinetikken ved ekspresjonen av transgenet

Dette eksempel viser at overføringen av nukleinsyrer i nærvær av et elektrisk felt under oppfinnelsens betingelser tillater å oppnå ekspresjon av et transgen på høyt og stabilt nivå i en varighet på minst 4 måneder.

Forsøket gjennomføres med C57Bl/6-mus. Det benyttede plasmid er plasmidet pXL2774, mengden administrert DNA er 15 jag. Injeksjonen av DNA følges, eller ikke-(kontrollgruppe) av pålegging av et elektrisk felt under de følgende betingelser: Styrke 200 Volt/cm, 8 pulser på 20 msek med frekvens 1 Hz. De andre betingelser ved dette forsøk er som beskrevet i eksempel 1. Luciferaseaktiviteten bestemmes på grupper på 10 mus som avlives til forskjellige tidspunkter. Resultatene er vist i figur 6.

Man observerer for kontrollgruppen at ekspresjonen av luciferase er detekterbar fra den 3. time etter injeksjon av plasmidet og øker inntil den 3. dag, D3, for så å synke merk-bart etter 35 dager.

Man fastslår, for gruppen som er underkastet elektriske pulser, at ekspresjonen av transgenet holder seg på et nivå godt over det for kontrollgruppen. Videre, og det er bemerkelsesverdig, kan man observere at dette ekspresjonsnivå forblir høyt og konstant utover 35 dager og minst opptil 120 dager. Dette høye og varige ekspresjonsnivået for transgenet er et spesielt fordelaktig resultat når det gjelder klinisk behandling i lengere tid med terapeutiske gener.

12.b - Histologisk analyse

Et histologisk studie er gjennomført under de samme betingelser, men ved administrering av plasmidet pCOR CMV-lacZ (pXL3004) som koder for P-galactosidase med kj ernelokalisering.

Plasmidet pXL3004 (figur 13) er en vektor som stammer fra plasmid pXL2774 (WO

97/10343) der genet lacZ addert til en nukleær lokaliseringssekvens (nis) (Nouvel et al., 1994, "Virology", 204:180-189) er innført under kontroll av promoteren CMV av plasmid pCDNA3 (Invitrogen, Nederland) og polyadenyleirngssignalet av den tidlige region av viruset SV40 (Genbank SV4CG).

Dyrene avlives 7 dager etter administrering av plasmidet. Den histologiske analyse tillater å detektere celler som uttrykket P-galactosidasen og der kjernen befinner seg i snittplanet (Xgal-histokjemi).

Antallet muskelfibere som oppviser positive kjerner i det undersøkte snitt er gjennomsnittlig 76 i gruppen (n = 8) som har mottatt plasmidet pXL3004 og deretter underkastet elektriske pulser mot et gjennomsnitt på 8,5 i kontrollgruppen (n = 8) (dyr som mottok plasmidet pXL3004, men som ikke ble underkastet elektriske pulser).

Man observerer at antallet muskelfibere som uttrykker transgenet gjennomsnittlig er 9 ganger høyere i forhold til kontrollgruppen. Mesteparten av muskelfibrene er hvilende med kjerner som befinner seg i periferien. Meget sjeldne muskelfibere med kjerner i sentrum uttrykker P-galactosidase. Man observerer likeledes at langs injeksjonsveien for plasmidet, er densiteten av muskelfibere som er positive pr. overflateenhet større i gruppen som er behandlet ved elektrooverføring i forhold til kontrollgruppen.

Totaliteten av disse resultater viser at i forhold til muskler som ikke er underkastet elektriske felt, tillater elektrooverføring en klar økning av antallet muskelfibere som uttrykker transgenet samt en meget vesentlig økning av overflaten av sonen som uttrykker transgenet. Det observeres likeledes at pålegging av et elektrisk felt ikke med-fører merkbare inflammatoriske reaksjoner.

Eksempel 13: Effekten av tidspunktet for injeksjon av nukleinsyre i forhold til

pålegging av elektrisk felt.

Dette eksempel viser at nukleinsyren kan administreres minst 30 minutter og sågar minst 1 time før pålegging av det elektriske felt.

Dette forsøk gjennomføres med C57Bl/6-mus. Det benyttede plasmid er plasmid pXL2774. Den administrerte mengde DNA er 15 \ ig eller 1,5 ug. Injeksjonen av DNA følges eller følger etter pålegging av et elektrisk felt under de følgende betingelser: styrke 200 Volt/cm, 8 pulser på 20 msek med frekvens 1 Hz. De andre betingelser ved dette forsøk er som beskrevet i eksempel 1. En kontrollgruppe består av dyr som mottar en plasmidinjeksjon, men som ikke underkastes elektriske pulser. Resultatene er vist i tabell 9.

Midlere verdier ± SEM for luciferaseaktiviteten i millioner RLU pr. muskel.

N = 10 muskler pr. gruppe.

Nærværet av DNA på tidspunktet for pålegging av det elektriske felt er en betingelse for effektiviteten ved elektrooverføring. På bemerkelsesverdig måte er det observert at injeksjonen av plasmid kan gjennomføres minst 30 minutter og sågar 1 time (forsøk 4 og 5) før pålegging av et elektriske felt og dette uten merkbar modifisering av ekspresjonsnivået. Et tilsvarende resultat oppnås både med en dose på 15 ug plasmid pr. muskel og en 10 ganger svakere dose på 1,5 ug.

Disse observasjoner tillater å ta sikte på flere injeksjoner til varierende tidspunkter av det samme plasmid, eller forskjellige plasmider, i muskelen før pålegging av et elektriske felt. Det er likeledes mulig å gjennomføre flere injeksjoner i en utpekt sone av muskelen og så legge på en serie elektriske pulser på hele det injiserte området som skal behandles.

Eksempel 14: Statistisk studium over sammenhengen mellom injisert DNA-dose

og ekspresjonsnivå.

Det statistiske studium som presenteres i dette eksempel tillater å sammenligne sammenhengen mellom effekt/dose for et administrert transgen i nærvær eller fravær av et elektrisk felt. Denne studie bekrefter likeledes at oppfinnelsen betydelig reduserer variabiliteten i ekspresjonen av transgenet. 5 uker gamle C57Bl/6-mus mottok en injeksjon plasmid pXL3031 i den kraniale fibial-muskel på bilateral måte. Plasmiddosene varierte fra 0,25 til 32 p.g DNA. Hver dose testes på 10 dyr. Umiddelbart etter injeksjon av plasmidet, ble en av potene underkastet et felt på 250 Volt/cm med 4 pulser på 20 msek og en frekvens på 1 Hz.

Dyrene ble avlivet 5 dager etter behandling og transgenet søkes i vevekstrakten fra hver muskel. Resultatene i figur 7.

Sammenligningen av utviklingen av variansene som funksjon av den til gjennomsnittet for hver serie på 10 repetisjoner viser klart at fordelingen av ekspresjonen av transgenet er log-normalt. Den grafiske analyse av resultatene av figur 7, bekreftet ved beregning, viser at ekspresjonen varierer lineært med logaritmen av dosen av den injiserte DNA.

Cochran-testen viser at det eksisterer en homogenitet for variansene for hver regresjon (med og uten elektrooverføring), noe som tillater å benytte restvariansene for å gjennomføre totaliteten av beregninger.

En test på avviket fra lineariteten er ikke signifikant ved 5% risiko idet tilfellet der det har vært elektrooverføring, i motsetning til dette foreligger det et meget signifikant avvik fra lineariteten (p < 0,01), noe som gir en betydelig heterogenitet på responsene, i fravær av elektrooverføring. Restvariansene er 5 ganger lavere med elektrooverføring.

Tatt i betraktning de anslåtte verdier for restvariansen, er det mulig å benytte 5 ganger mindre dyr for å få den samme kraft i en sammenligningsprøve for transfeksjonseffek-tivitet i henhold til hvilke man eventuelt anvender elektrooverføring. For således å påvise en differanse i ekspresjonen på en faktor 2, 5 eller 10 med et konfidensintervall på P = 95%, kreves det respektivt 33,8 eller 5 dyr hvis transgenet administreres ved elektrooverføring og 165,40 eller 25 dyr i fravær av elektrooverføring. En tabell oppsummerer denne type beregning i det tilfellet det benyttes elektrooverføring.

Således tillater reduksjonen av den interindividuelle variabilitet som oppnås ved elektro-overføringen å gjennomføre nøyaktige analytiske studier på sammenligning av ekspresjon av forskjellige gener. Det autoriseres likeledes en bedre definisjon av behandlings-dosene og forhindrer risikoen forbundet med å overskride doser som er akseptable innenfor det terapeutiske vindu.

Sammenligningen for tapene som oppnås for hver regresjon er ikke signifikant. Man kan således anse at det er en parallellisme for de to regresjoner med en risiko på 5%.

Beregning av den relative kraft viser at for å nå et ekspresjonsnivå sammenlignbart med det som oppnås ved elektrooverføring, må det ved fravær av elektrooverføring injiseres rundt 250 ganger så mye DNA pr. muskel (243 ± 85; konfidensintervall P = 95%).

Beregningen av den relative kraft viser korrelativt at, for en gitt mengde DNA, ekspresjonsnivået er rundt 500 ganger høyere i nærvær av elektrooverføring sammenlignet med ekspresjonsnivået som oppnås ved fravær av elektrooverføring.

Eksempel 15: Sammenligning av forskjellige typer elektroder.

Dette eksempel har til formål å sammenligne virkningen av to typer elektroder, plateelektroder og nålelektroder, på effektiviteten av overføringen av nukleinsyrer. Nålelektrodene er likeledes testet i henhold til forskjellige implanteringsorienteringer.

Plasmid pXL2774 (150 ug) injiseres i tricepsmuskelen hos rotter. Plateelektroder anbringes som antydet i eksempel 1. Inter-elektrodeavstanden for elektrodeplaten er 1,2 cm. For nålelektroder er inter-elektrodeavstanden 0,9 cm. Nålelektrodene tvinges inn i muskelvevet en ekvivalent lengde, enten loddrett eller parallelt med fiberaksen, på begge sider av injeksjonen. Uansett elektrodetype eller orientering er betingelsene for pålegging av det elektriske felt som følger: styrke 200 Volt/cm, 8 pulser på 20 msek ved 2 Hz. Resultatene er oppsummert i figur 8.

Resultatene som oppnås viser at påleggingen av et elektriske ved hjelp av to parallelle nåler implantert i muskelen gir resultater som er sammenlignbare med det som oppnås med plateelektroder bragt i kontakt med huden som omgir muskelen. Det er likeledes vist at effektiviteten ved elektrooverføring er uavhengig av implanteringsretningen for nålelektrodene relativt aksen for muskelfibrene.

Dette eksempel viser at oppfinnelsen tillater elektrooverføring av nukleinsyrer ved hjelp av ytre eller invasive elektroder og uansett deres orientering. Anvendelsen av nålelektroder er spesielt fordelaktig for å sikre overføring av nukleinsyrer i store muskler, mens man bevarer elektriske pulser med moderat spenning (for eksempel 100 Volt med en avstand på 0,5 cm for å oppnå en elektrisk feltstyrke på 200 Volt/cm).

Eksempel 16: Effektivitet av elektrooverføringen på forskjellige muskler hos mus,

rotter, kaniner og aper.

Dette eksempel viser at elektrooverføring av nukleinsyrer kan anvendes på forskjellige typer muskler hos forskjellige mammifære specier (mus, kanin, rotte og ape).

Påleggingsbetingelsene for det elektriske felt er gitt i tabell 10A for hver specie. Resultatene er oppsummert i tabell 10A.

Tabell 10A

Specie Plasmid Elektrisk puls Kranial Gastro- Rectus Triceps Kvadn-tibial- cnemisk femons- brachn- ceps-muskel muskel muskelen muskelen muskelen Mus 10 ug 8 x 200 Volt/cm x 28 x 196 x 342 x 1121

pXL3031 20 msek, 2 Hz

Rotte 150 ug 8 x 200 Volt/cm x 31 x 160 x 13,2

pXL3031 20 msek, 2 Hz

Kanin 200 ug 4 x 200 Volt/cm x 25417 x 724 x 3595

I pXL2774 I 20 msek, 1 Hz | | | |

Økningsfaktoren for ekspresjonen av luciferase som oppnås ved elektrooverføring. Denne faktor er beregnet under henvisning til luciferaseaktiviteten som oppnås for injeksjon av plasmid pXL3031 eller pXL2774 uten elektrooverføring. Gjennomsnitt på 10 muskler pr. gruppe. Luciferaseaktiviteten bestemmes 7 dager etter administrering av plasmidet.

Elektrooverføringen er likeledes testet på aper (Macaca fascicularis). Det benyttede plasmid er plasmid pXL3179 som omfatter genet som koder vekstfaktoren av fibroblaster(FGFl eller aFGF).

Plasmid pX13179 (figur 11) er en vektor som er avledet fra plasmid pXL2774 (WO 97/10343) der genet som koder for en fusjon mellom signalpeptidet for interferonet av human fibroblastene og cDNA av FGF1 (Fibroblast Growth Factor 1) (sp-FGFl, Jouanneau et al., 1991, "PNAS", 88: 2839-2897) er innført under kontroll av promoteren som stammer fra tidlige området av human cytomegaloviruset (hCMV IE) og polyadenyleirngssignalet for det sene området av virus SV40 (Genbank SV4CG).

Nærværet av FGF1 bestemmes ved immunohistokjemi. Disse verdier indikerer antallet positive snitt 3 dager etter injeksjon intramuskulært av 500 ug plasmid pXL3179. Påleggingsbetingelsene for det elektriske felt er som følger: elektrisk feltstyrke 200 Volt/cm, 8 pulser på 20 msek av 1 Hz. Resultatene er vist i tabellen.

Bestemmelse ved immunohistokjemi av ekspresjonen av FGF1 i forskjellige apemuskler (Macaca fascicularis). Verdiene antyder antallet snitt som er positive 3 dager etter intramuskulær injeksjon av 500 ug plasmid pXL3179 som koder for FGF1 med og uten elektrooverføring.

Disse resultater viser at elektrooverføringen på merkbar måte øker ekspresjonen av et transgen, i forskjellige typer muskler, i forskjellige pattedyrspecier.

Eksempel 17: Effektivitet av elektrooverføring på diafragmamuskelen hos rotter. Muligheten for på varig og stabil måte å uttrykke gener av terapeutisk interesse direkte i diafragma er en terapeutisk vei som er spesielt interessant innenfor rammen av behandlingen av visse degenerative sykdommer som påvirker musklenes funksjonering, særlig Duchennes myopati.

Rottene anestetiseres med en blanding av largactyl og ketamin (1 mg/kg largactyl, 150 mg/kg ketamin). I disse forsøk gjøres diafragmaet tilgjengelig ved et innsnitt langs sternum. Injeksjonen gjennomføres i hemidiafragma (50 ug plasmid pX12774 i 50 ul 20 mM NaCl og 5% glucose). Elektroplatene plasseres deretter på hver side av diafragma-planet langs injeksjonsveien (inter-elektrodeavstand = 1 mm). Elektrooverførings-betingelsene er som følger: feltstyrke 160 Volt/cm eller 300 Volt/cm, 8 impulser å 20 msek, frekvens 1 Hz. Det elektriske felt legges på minst 1 minutt etter injeksjon. Dyret blir deretter sydd igjen.

Gjennomsnittsverdier ± SEM for luciferaseaktiviteten i millioner RLU pr. muskel.

N = 12 for hver gruppe.

Dette eksempel viser en signifikant forbedring av ekspresjonen av transgenet i diafragmaet etter pålegging av 8 pulser på 20 msek ved en feltstyrke på 160 Volt/cm (p < 0,003 med den ikke-parametriske Mann-Whitey-test).

Eksempel 18: Overføring av et gen som koder for sekretert alkalisk fosfatase

(SeAP) og ekspresjonskinetikken for SeAP.

Dette eksempel viser mulighetene ved oppfinnelsen for å transformere muskelen til et sekretororgan for et polypeptid av terapeutisk eller vaksinal interesse og å sikre nærværet i blodsystemet av en høy og stabil konsentrasjon av polypeptidet av interesse.

I dette eksempel blir elektrooverføringsprosessen testet på voksne mus med et plasmid som omfatter genet som koder for human placentær sekretert alkalisk fosfatase. Voksne C57B 1/6-mus mottar i kranial tibialmuskelen på unilateral måte en injeksjon av plasmid pXL3010.

Plasmidet pXL3010 (figur 13) er en vektor som er avledet fra ColEl der genet som koder for en sekretert alkalisk fosfatase som stammer fra pSEAP-basic (Clontech; Genbank: CVU09660) er innført under kontroll av CMV-promoteren fra et plasmid pCDNA3 (Invitrogen, Nederland) og polyadenyleirngssignalet av det sene området av viruset SV40 (Genbank SV4CG).

Elektrooverføringsbetingelsene er som følger: Elektrisk felt 200 Volt/cm, 8 pulser på 20 msek, frekvens 1 Hz. Det elektriske felt legges på 20 sekunder etter injeksjon. Blod-prøvene gjennomføres 7 dager senere i den retro-orbitære plexus. Konsentrasjonen av alkalisk fosfatase i serumet bestemmes ved målinger ved hjelp av en kjemiluminescens-test (Phospha-light, Tropix, Bedford, MA 01730). Injeksjonen i muskelen av et ikke-kodende plasmid (pUC19) eventuelt fulgt av pålegging av et elektrisk felt, tillater å verifisere fråværet av signaler som tilsvarer aktiviteten av endogen alkalisk fosfatase. Resultatene er oppsummert i tabell 12.

Gjennomsnittsverdi ± SEM av konsentrasjonen av alkalisk fosfatase (SeAP) i blodsystemet i ng/ml serum.

Når plasmidet pXL3010 administreres ved elektrotransfeksjon, fastslår man en økning på en faktor 140 eller 170 av konsentrasjonen av SeAP i blodet.

Injeksjonen av 400 ug plasmid (injeksjon av 100 ug DNA bilateralt i kranialtibialmuskelen og to ganger ved 30 minutters intervall før pålegging av det elektriske felt) tillater med elektrooverføring å nå en serumkonsentrasjon 2200 ng/ml alkalisk fosfatase mot 16 ng/ml i fravær av elektrooverføring.

Det skal påpekes at tilsetning av et ikke-kodende DNA (pUC19) som tillater å arbeide med en konstant DNA-mengde (10 ug total DNA pr. mus) tillater ytterligere å forbedre ekspresjonsnivået for alkalisk fosfatase for små mengder injisert plasmid pXL3010

Det oppnås en kinetisk ekspresjon av SeAP. Dosen administrerte plasmid er 15 ug pr. muskel bilateralt, altså 30 ug pr. mus. Resultatene er vist i figur 9. Man observerer 7 dager etter injeksjon en betydelig økning og varighet (minst i løpet av 2 måneder) av konsentrasjonen av detektert SeAP i blodet, når plasmidet pXL3010 administreres ved elektrooverføring.

Totaliteten av disse resultater bekrefter at overføring av nukleinsyrer i muskelen ved hjelp av oppfinnelsen tillater å gi et varig og høyt ekspresjonsnivå, både for proteinet lokalisert i muskelen og for sekreterte proteiner og det er således mulig å transformere muskelen til et sekresjonsorgan for et polypeptid av interesse.

Eksempel 19: Overføring av et gen som koder for erytropoietin (EPO).

Voksne C57Bl/6-mus mottok unilateralt i kranialtibialmuskelen en injeksjon av plasmid pXL3348. Plasmid pXL3348 (figur 16) er en vektor som stammer fra plasmid pXL2774 der det murine gen av erytropoietin (NCBI: 193086) er innført under kontroll av promoteren fra det tidlige området av den humane cytomegalovirus (hCMV IE) og polyadenyleirngssignalet av det sene området av virus SV40 (Genbank SV40CG).

Elektrooverføringsbetingelsene er som følger: feltstyrke 200 Volt/cm, 8 pulser på 20 msek, frekvens 1 Hz. Det elektriske felt legges på umiddelbart etter injeksjon av plasmidisk DNA.

Gjennomsnittsverdier ± SEM. N = 4 til 5.

Man observerer, ved elektrooverføring, en meget vesentlig økning av mengden erytropoietin i blodet på D7 og D24 for administrering av 10 fig pXL3348. Videre gir den fysiologiske virkning av erytropoietinøkningen seg utslag i en økning av hematokrit som er ganske betydelig (85%) fra dag 7, sågar også for en meget lav mengde plasmid (1 u<g>)-

Eksempel 20: Overføring av et gen som koder for vekstfaktoren av vaskulært

endotelium (VEGF).

Voksne C57B1/6- eller SCID-mus mottok i kranialtibialmuskelen på bilateral måte en injeksjon av pCOR hVEGF (pXL3212, 15 jag).

Plasmid pXL3212 (figur 11) er en vektor som stammer fra plasmidet pXL2774 (WO 97/10343) der det cDNA som koder for VEGF165 (Vascular Endothelial Growth Factor, Genbank: HUMEGFAA) er innført under kontroll av promoteren som stammer fra det tidlige området av human cytomegaloviruset (hCMV IE) og polyadenylerings-signalet av det sene området av virus SV40 (Genbank SV4CG).

Elektrooverføringsbetingelsene er som følger: Feltstyrke 250 Volt/cm, 8 pulser på 20

msek, 2 Hz frekvens. Blodprøvene gjennomføres fra den retroorbitære plexus. Prøvene gjennomføres en dag før og 7 dager etter injeksjon av plasmidet. Den immuno-enzymatiske bestemmelse av human VEGF gjennomføres ved hjelp av en Quantikine-kit (R&D System). Testen gjennomføres også med human VEGF i museserum. Resultatene er vist i tabell 14.

Serumkonsentrasjon (ng/1) av VEGF i mus C57B1/6 og SCID.

Eksempel 21: Overføring av et gen som koder for faktor IX.

Voksne C57B1/6- eller SCID-mus mottar bilateralt i kranialtibialmuskelen en injeksjon avpXL3388(15 ug).

Plasmidet pXL3388 (figur 12) er en vektor som stammer fra plasmid pXL2774 (WO 97/10343) der cDNA som koder for human faktor DC (Christmas-faktoren, Genbank: HUMFIXA) er innført under kontroll av promoteren som stammer fra det tidlige området av den humane cytomegalovirus (hCMV IE, Genbank HS5IEE) og polyadeny-leringssignalet fra det sene området av SV40-viruset (Genbank SV4CG).

Elektrooverføringsbetingelsene er som følger: elektrisk fellesstyrke 200 Volt/cm med 8 pulser på 20 msek i frekvens 2 Hz. Blodprøvene gjennomføres i den retro-orbitære plexus. Blodprøvene gjennomføres 7 dager før injeksjon av plasmidet. Resultatene er vist i tabell 15.

Plasmakonsentrasjon av faktor DC hos C57B1/6- og SCID-mus.

Human faktor DC er ikke detekterbar i blodet annet enn når plasmidet administreres under betingelsene som bestemmes av oppfinnelsen.

Eksempel 22: Overføring av et gen som koder for fibroblast-l-vekstfaktoren

(FGF1).

Voksne C57B1/6- eller SCID-mus mottok bilateralt i kranialtibialmuskelen en injeksjon av pCOR FGF1 (pXL3096,15 ug).

Plasmid pXL3096 (figur 14) er en vektor som stammer fra plasmid pXL2774 (WO 97/10343) der det er tilsatt en sekvens i stand til å danne en trippelheliks (TH, Wils et al., 1997, "Gene. Ther.", 4, 343-330) der genet som koder for en funksjon mellom signalpeptidet av interferonet av human fibroblaster og cDNA'en av FGF1 (Fibroblast Growth Factor 1) (sp-FGFl, Jouanneau et al., 1991, "PNAS", 88, 2893-2897) er innført under kontroll av promoteren som stammer fra det tidlige området av den humane cytomegalovirus (hCMV IE), fulgt av ledersekvens (transkribert, ikke tradusert) av genet TK av HSV1 og polyadenyleirngssignalet av det sene området av SV40-viruset (Genbank SV4CG).

Elektrooverføringsbetingelsene er som følger: elektrisk feltstyrke 200 Volt/cm, 8 pulser på 20 msek og med frekvens 2 Hz. FGF 1-nærværet bestemmes så immunohistokjemisk.

Resultatene for C57Bl/6-musene er vist i figur 10. Man fastslår at antallet positive fibere er helt overlegent for gruppen som er underkastet elektrisk felt i forhold til kontrollgruppen (som har mottatt en injeksjon av pXL3096, men ikke er underkastet noe elektrisk felt). Nærværet av FGF1 for kontrollgruppen er kvasi-ikke-detekterbart på dag 21 og dag 35, mens et betydelig antall positive fibere kan observeres for gruppene som er behandlet ved elektrooverføring.

Resultatene for SCID-musene er vist i tabell 16.

Ekspresjon av FGF, immunohistokjemisk studie og antall positive fibere på et muskel-snitt tatt gjennom den mediane del av muskelen.

Ekspresjonen av FGF1 som bestemt ved antallet positive fibere funnet ved immunohistokjemi, detekteres kun i musklene som er underkastet elektrisk felt. Det er verdt å merke seg at ekspresjonen av FGF1 detekteres også for en lav administrert dose plasmid (1,5 H<g>)-

Eksempel 23: Overføring av et gen som koder for den neurotrofiske faktor NT3. Oppfinnelsen anvendes på voksne C57Bl/6-mus og på Xt/pmn-småmus for overføring av genet som koder for neurotrofin 3 (NT3). pmn-musene utgjør en munn modell for amyotrofisk lateralsklerose (ALS) som karakteriseres ved en tidlig og hurtig degenerens av motoneuroner og med en midlere levetid på rundt 40 dager.

23.1 - Overføring av genet som koder for NT3 i voksne mus

5 uker gamle C57Bl/6-mus mottok unilateralt i kranialtibialmuskelen en plasmidinjeksjon av plasmidet pXL3149 (12,5 ug) omfattende genet som koder for munn neurotrofin

3 (NT3).

Plasmidet pXL3149 (figur 14) er en vektor som er avledet fra plasmid pXL2774 (WO 97/10343) der genet som koder for munn neurotrofin 3 (NT3) er innført under kontroll av promoteren fra det tidlige området av den humane cytomegalovirus (hCMV IE) og polyadenyleirngssignalet av det sene området av virus SV40 (Genbank SV4CG).

Elektrooverføringsbetingelsene er som følger: feltstyrke 250 Volt/cm, 4 pulser på 20 msek med frekvens 1 Hz. Det elektriske felt legges på umiddelbart etter injeksjon av plasmidisk DNA. Nærværet av NT3 søkes i 12000 g supernatant fra muskeloppmalt materiale i PBS-buffer, 7 dager etter behandling av musene. NT3-mengden måles ved ELISA-analyser (Kit Promega).

Gjennomsnittsverdiene (± 95% konfidensintervall) på 20 muskler er 77 ± 1 pg/muskel (administrert plasmidisk DNA uten elektrooverføring) og 2700 ± 900 pg/muskel (administrert plasmidisk DNA med elektrooverføring).

Man observerer således en økning med en faktor 55 av mengden NT3 som er produsert i muskelen når plasmid pXL3149 er overført under de betingelser som bestemmes av oppfinnelsen.

23.2 - Overføring av genet som koder for NT3 i småmus

Et sammenlignbart forsøk gjennomføres på 4 til 5 dager gamle XT pmn-heterozygotiske mus med plasmid pXL3149. De injiserte doser er 130 ug pr. dyr og injeksjonene gjennomføres som multiseteinjeksjon i forskjellige muskler på dyret (25 ug gastrocnemisk, 12,5 ug i kranialtibial).

Elektrooverføringsbetingelsene er som følger: elektrisk feltstyrke 500 Volt/cm, 4 pulser på 20 msek, frekvens 1 Hz.

Nærværet av NT3 søkes 7 dager etter administrering av plasmidet i plasma og i muskel (gastrocnemisk eller kranialtibial). En sammenligning av basalnivået av NT3 gjennom-føres ved administrering av en oppløsning på 0,9% NaCl. Mengden NT3 bestemmes ved en ELISA-analyse (Kit Promega). Resultatene er vist i tabell 17.

Gjennomsnittsverdier ± SEM av NT3-mengden (pg pr. muskel og pg/ml plasma).

Under forsøksbetingelsene observeres et basalnivå av detekteringssignalet for NT3 i den gastrocnemiske muskel og i kranialtibialmuskelen. I fravær av elektrooverføring er nivået for ekspresjonen av genet NT3 som oppnås for injeksjon av pXL3149 ikke høyere på basalnivået for detektering av NT3 i muskelen. Når plasmidet administreres ifølge oppfinnelsen fastslår man at mengden NT3 som detekteres i muskelen er øket meget signifikant. Man observerer likeledes at mengden sekretert NT3 fra muskelen og detektert i plasma er vesentlig øket under disse betingelser (økningsfaktor ca. 35).

Disse resultater viser at for en gitt mengde DNA tillater oppfinnelsen meget signifikant å øke effektiviteten ved overføring av DNA og, ikke bare i muskelen, men også i plasma, å oppnå en betydelig økning av mengden av et neurotrofin som NT3.

Eksempel 24: Overføring av genet som koder for det humane veksthormon. C57Bl/6-mus mottar unilateralt i kranialtibialmuskelen en injeksjon av plasmid pXL3353 (10 ug) eller plasmid pXL3354 (10 ug). Plasmid pXL3353 (figur 15) er en vektor som stammer fra plasmid pXL2774 der hele genet for det humane veksthormon (fragment Xbal/SphI hGH som strekker seg fra signalet for transkripsjonsbegynnelsen, setet BamHl, til 224 bp etter poly(A)-setet) er innført under kontroll av promoteren som stammer fra det tidlige området av den humane cytomegalovirus (hCMV IE) og poly-adenyleringssignalet av det sene området av virus SV40.

cDNA'et til det humane veksthormongen er oppnådd ved reverstranskripsjon av en mRNA poly(A<+>)-bank av den humane pituitærkjertelen, fulgt av PCR-forsterknings-cykler med de følgende oligonukleotider:

Oligonukleotid komplementær til området 5':

Dette oligonukleotid inneholder et Xbal-sete og kozak-sekvensen.

Oligonukleotid komplementær til området 3':

Dette oligonukleotid inneholder et NSil-sete og stoppkodonen.

Det forsterkede fragment innføres i plasmid pCR2.1 (TA Cloning kit, Invitrogen) og sekvenseres. Et fragment Xbal/Nsil på 681 bp inneholdende cDNA av hGH ligeres med fragment Xbal/Nsil av pCL3353 for å generere plasmid pXL3354 (figur 15).

Elektrooverføringsbetingelsene er som følger: Elektrisk feltstyrke 200 Volt/cm med 8 pulser på 20 msek, frekvens 1 Hz. Det elektriske felt legges på umiddelbart etter injeksjon av plasmidisk DNA. Nærværet av hGH søkes, 7 dager etter behandling av musene, i supernatanten av de oppmalt muskler i PBS-buffer, sentrifugert ved 12 000 x g. Mengden hGH måles ved en ELISA-analyse (Boehringer Manheim).

Midlere verdier ± SEM av protein hGH (pg) pr. muskel.

Disse resultater viser at elektrooverføringen tillater å oppnå en meget betydelig økning av det humane veksthormonet. Det skal påpekes at denne forsterkning likeledes observeres med plasmidet inneholdende det totale gen med alle reguleringssekvensene.

Eksempel 25: Virkning av elektrooverføring på ekspresjon av vaksinale trans-genen

Dette eksempel påviser at oppfinnelsen også kan anvendes på overføring av gener som koder for polypeptidet av vaksinal interesse.

Forsøkene gjennomføres på 9 uker gamle Balb/c-hunnmus. De benyttede elektroder er plateelektroder i rustfritt stål med avstand 5 mm. VR-HA er et plasmidisk DNA som omfatter genet av hemagglutinin av influensaviruset (stamme A/PR/8/34). VR-gB er et plasmidisk DNA som omfatter genet av glycoprotein B (gB) av den humane cytomegalovirus (stamme Towne).

Plasmidoppløsningen (50 (il av en oppløsning av 20 ug/ml eller 200 mg/ml i 0,9% NaCl) injiseres longitudinalt gjennom huden unilateralt i den kranial tibialmuskel. De elektriske pulser legges på 20 sekunder etter administrering av plasmidet, loddrett på muskelaksen ved hjelp av en kvadratpulsgenerator (feltstyrke 200 Volt/cm, 8 konsekutive pulser med varighet 20 msek og frekvens 1 Hz).

For bedømmelse av stimuleringen av immunresponsen, var immuniseringsprosessen som følger:

DO pre-immunserumprøve

Dl primo injeksjon med eller uten elektrooverføring

D2 immunserumprøve

D2 utfordringsinjeksjon med eller uten elektrooverføring

D42 immunserumprøve

D63 immunserumprøve

Blodprøvene gjennomføres i den retro-orbitale sinus. De spesifikke antistoffmengder bestemmes ved ELISA. Hver forsøkstilstand prøves på 10 dyr injisert unilateralt.

Resultatene hva angår mengdene av antistoffer rettet mot hemagglutininet av influensaviruset er vist i tabell 19A.

Mengde antistoffer rettet mot hemagglutininet av influensaviruset, oppnådd etter injeksjon av 1 eller 10 ug DNA (VR-HA) i fravær eller i nærvær av elektriske pulser. Resultatene er de geometriske gjennomsnitt av 10 dyr (8 dyr for gruppen injisert med 1 ug DNA i nærvær av elektriske pulser og prøvet D63) ± avvik. Verdien av p oppnås ved sammenligning to og to av grupper injisert i nærvær og fravær av elektriske pulser under anvendelse av Man-Whitneys ikke-parametriske test.

Disse resultater viser at mengdene av antistoff rettet mot hemagglutininet av influensaviruset økes med en faktor rundt 10 i gruppene underkastet elektriske pulser. Videre oppviser musene som mottok 1 jag DNA i nærvær av elektriske pulser en midlere mengde antistoff som er noe høyere enn den til mus som fikk 10 ug DNA i fravær av elektriske pulser.

Resultatene hva angår titeren av antistoffet mot glycoprotein B av den humane cytomegalovirus er vist i tabell 19B.

Mengder av antistoff rettet mot glycoprotein B (gB) av den humane cytomegalovirus, oppnådd etter injeksjon av 10 ug DNA (VR-gB) i fravær eller i nærvær av elektriske pulser. Resultatene er de geometriske gjennomsnittsverdier for 10 dyr (9 dyr for gruppen injisert i nærvær av elektriske pulser) ± avvik. Verdien p oppnås ved sammenligning to og to av gruppene injisert i nærvær og i fravær av elektriske pulser under anvendelse av Man-Whitneys ikke-parametriske test.

Disse resultater viser at mengdene av antistoffet rettet mot glycoprotein B av den humane cytomegalovirus økes med en faktor 4 på D42 i gruppen som er underkastet elektriske pulser. Man kan likeledes merke seg at variasjonskoeffisienten i gjennomsnitt er tre ganger lavere i dyregruppene underkastet elektriske pulser.

Claims

1. Nukleinsyre og unipolar-bølge elektrisk felt med en styrke mellom 4 og 400 Volt/cm som kombinasjonsprodukt for separat eller tidsforskutt administrering in vivo i stripede muskler og for genterapi basert på in vivo elektrotransfeksjon i stripede muskler etter administrering av nukleinsyren.

2. Kombinasjonsprodukt ifølge krav 1, karakterisert ved at feltstyrken er mellom 30 og 300 Volt/cm.

3. Kombinasjonsprodukt ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 2, karakterisert ved at den totale varighet av pålegging av det elektriske felt er over 10 msek.

4. Kombinasjonsprodukt ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at påleggingen av det elektriske felt på muskelen omfatter en eller flere pulser med regulær frekvens.

5. Kombinasjonsprodukt ifølge krav 4, karakterisert ved at påleggingen på muskelen av det elektriske felt omfatter mellom 1 og 100 000 pulser med frekvens mellom 0,1 og 1000 Hz.

6. Kombinasjonsprodukt ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at de elektriske pulser avgis irregulært i forhold til hverandre og at funksjonen som beskriver feltstyrken som funksjon av tiden for en puls, er variabel.

7. Kombinasjonsprodukt ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 6, karakterisert ved at integralet av funksjonen som beskriver variasjonen av det elektriske felt med tiden er over 1 kV x msek/cm.

8. Kombinasjonsprodukt ifølge krav 7, karakterisert ved at dette integral er > 5 kV x msek/cm.

9. Kombinasjonsprodukt ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 8, karakterisert ved at de elektriske pulser er valgt blant firkantpulser, elektriske felt som genererer eksponentielt synkende bølger, oscillerende unipolare bølger med begrenset varighet og oscillerende bipolare bølger med begrenset varighet, eller andre bølgeformer.

10. Kombinasjonsprodukt ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 9, karakterisert ved at de elektriske pulser omfatter kvadratpulser.

11. Kombinasjonsprodukt ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 10, karakterisert ved at de elektriske pulser legges på med elektroder anbragt på hver side av muskelen eller plassert i kontakt med huden.

12. Kombinasjonsprodukt ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 10, karakterisert ved at de elektriske pulser legges på med elektroder som innføres i det indre av muskelen.

13. Kombinasjonsprodukt ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 12, karakterisert ved at nukleinsyren injiseres i muskelen.

14. Kombinasjonsprodukt ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 12, karakterisert ved at nukleinsyren injiseres systemisk.

15. Kombinasjonsprodukt ifølge krav 14, karakterisert ved at nukleinsyren injiseres intra-arterielt eller intravenøst.

16. Kombinasjonsprodukt ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 12, karakterisert ved at nukleinsyre administreres topisk, kutant, oralt, vaginalt, intranasalt, subkutant eller intraokulært.

17. Kombinasjonsprodukt ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 16, karakterisert ved at nukleinsyren er til stede i et preparat som i tillegg inneholder farmasøytisk akseptable drøyemidler for de forskjellige administrerings-måter.

18. Kombinasjonsprodukt ifølge krav 17, karakterisert ved at preparatet er tilpasset parenteral administrering.

19. Kombinasjonsprodukt ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 18, karakterisert ved at nukleinsyren er en desoksyribonukleinsyre.

20. Kombinasjonsprodukt ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 18, karakterisert ved at nukleinsyren er en ribonukleinsyre.

21. Kombinasjonsprodukt ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 20, karakterisert ved at nukleinsyren er av syntetisk eller biosyntetisk opprinnelse eller ekstrahert fra et virus eller en unicellulær eller pluricellulær prokaryo-tisk eller eukaryotisk organisme.

22. Kombinasjonsprodukt ifølge krav 21, karakterisert v e d at den administrerte nukleinsyre helt eller delvis er forbundet med forbindelser fra opphavsorganismen og/eller syntesesystemet.

23. Kombinasjonsprodukt ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 22, karakterisert ved at nukleinsyren koder for en RNA eller et protein av interesse.

24. Kombinasjonsprodukt ifølge krav 23, karakterisert ved at RNA'en er en katalytisk eller antiretnings-RNA.

25. Kombinasjonsprodukt ifølge krav 23, karakterisert ved at nukleinsyren koder for et protein valgt blant enzymer, blodderivater, hormoner, lymfokiner, cytokiner, vekstfaktorer, trofiske faktorer, angiogeniske faktorer, neurotrofiske faktorer, benvekstfaktorer, hematopoietiske faktorer, koaguleringsfaktorer, antigener og proteiner involvert i aminosyremetabolismen, lipider og andre vesentlige cellebestanddeler.

26. Kombinasjonsprodukt ifølge krav 25, karakterisert ved at nukleinsyren koder for de angiogeniske faktorer VEGF og FGF, de neurotrofiske faktorer BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, FGF1, NT3, NT5, proteinet Gax, insulin for behandling av diabetes, veksthormon, a-l-antitrypsin, kalsitonin, leptin og apolipoproteinene, biosynteseenzymer for vitaminer samt hormoner og neuromediatorer.

27. Kombinasjonsprodukt ifølge krav 23, karakterisert ved at nukleinsyre koder for et antistoff, et variabelt fragment av et enkeltkjedet antistoff (ScFv) eller ethvert annet antistoff-fragment som har evnen til gjenkjennelse i et immunoterapi formål, eller koder for en oppløselig reseptor, for et agonist- eller antagonistpeptid av en reseptor eller et adhesjonsprotein, for et kunstig, kimert eller stumpt protein.

28. Kombinasjonsprodukt ifølge krav 27, karakterisert ved at nukleinsyren koder for et antiidiotype antistoff, et oppløselig fragment av reseptoren CD4 eller reseptoren av TNFa eller reseptoren av acetylcholin.

29. Kombinasjonsprodukt ifølge hvilket som helst av kravene 25 til 28, karakterisert ved at nukleinsyren koder for en forløper av et terapeutisk protein.

30. Kombinasjonsprodukt ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 29, karakterisert ved at nukleinsyren er i form av et plasmid.

31. Kombinasjonsprodukt ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 29, karakterisert ved at nukleinsyren inneholder et stort gen og/eller introner og/eller regulatorelementer med liten eller stor størrelse.

32. Kombinasjonsprodukt ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 29, karakterisert ved at nukleinsyren er en episomal DNA eller et kunstig kromosom av gjær eller bakterier eller et minikromosom.

33. Kombinasjonsprodukt ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 32, karakterisert ved at nukleinsyren inneholder sekvenser som tillater og/eller favoriserer ekspresjon av transgenet i muskelen.

34. Kombinasjonsprodukt ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 33, karakterisert ved at syren er assosiert med en hvilken som helst type vektorer eller en hvilken som helst kombinasjon av vektorer som tillater å forbedre overføringen av nukleinsyrer, som virus, syntetiske eller biosyntetiske midler eller også eventuelt propulserte kuler.

35. Kombinasjonsprodukt ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 34, karakterisert ved at muskelen underkastes en behandling som tar sikte på å forbedre overføringen av genet, en behandling av farmakologisk art ved lokal eller systemisk anvendelse eller en enzymatisk, permeabiliserende, kirurgisk, mekanisk, termisk eller fysisk behandling.

36. Kombinasjonsprodukt ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 35, karakterisert ved at den tillater å la muskelen produsere et middel i fysiologiske eller terapeutiske mengder, enten i muskelcellene eller utskilt.

37. Kombinasjonsprodukt ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 35, karakterisert ved at den tillater å modulere mengden uttrykt transgen ved å modulere volumet av transfektert muskelvev.

38. Kombinasjonsprodukt ifølge krav 37, karakterisert ved at den tillater å modulere det muskulære vewolum som er transfektert under anvendelse av multiple administreirngsseter.

39. Kombinasjonsprodukt ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 38, karakterisert ved at den tillater å modulere mengden av eksprimert transgen ved å modulere antallet, formen, overflaten, disponeringen av elektroden og ved å variere feltet, antallet, varigheten, frekvensen og formen av pulsene samt mengden administrert volum av nukleinsyren.

40. Kombinasjonsprodukt ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 39, karakterisert ved at den tillater å kontrollere lokaliseringen av vev som er transfektert ved volumet av vev som er underkastet lokale elektriske pulser.

41. Kombinasjonsprodukt ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 40, karakterisert ved at den tillater en tilbakevenden til initial situasjonen ved å oppgi sonen for transfektert vev.

42. Anvendelse av en nukleinsyre for fremstilling av et medikament for behandling ved genterapi ved kontakt mellom celler av en eller flere stripede muskler med nukleinsyren som skal overføres in vivo og etterpå pålegging på muskelen av en eller flere elektriske pulser av unipolare-bølger med intensitet mellom 4 og 400 Volt/cm.

43. Anvendelse ifølge krav 42 ved kontakt gjennomført ved direkte administrering i vevet eller topisk eller systemisk administrering.

44. Anvendelse ifølge krav 43, hvor feltstyrken er mellom 30 og 300 Volt/cm.

45. Anvendelse ifølge hvilke som helst av kravene 43 til 44 av en total påleggingstid for det elektriske felt på over 10 msek.