CN116133668A - ACE-tRNA的编码和表达 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗与过早终止密码子相关联的疾病或病症的组合物和方法。本发明的某些方面涉及多核苷酸、载体和宿主细胞，及其用途。

Description

ACE-tRNA的编码和表达

对相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年6月12日提交的美国临时申请号63/038,245的优先权，其公开内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及用于治疗与过早终止密码子(PTC)相关的病症的基于反密码子编辑的(ACE)-tRNA的药剂和方法。

背景技术

遗传密码使用4个核苷酸形成三联体“密码子”，这是DNA到蛋白质的翻译的基础。共有64个密码子，其中61个用于编码氨基酸，并且3个(TAG、TGA和TAA)编码翻译终止信号。无义突变通常通过单个核苷酸取代将氨基酸密码子改变为PTC，导致缺陷性截短蛋白质和严重形式的疾病。无义突变占所有遗传疾病的超过10％和近1,000种遗传性人病症，包括影响全球约3亿人的癌症。事实上，囊性纤维化(CF)紧随其后，约22％的所有CF患者具有“1类”PTC突变(例如，p.G542X、p.R553X和p.W1282X)，导致囊性纤维化跨膜电导调节剂(CysticFibrosis Transmembrane conductance Regulator，CFTR)的功能几乎完全丧失和严重的临床表现。由于无义相关疾病的极高患病率以及统一的机制，已共同致力于鉴定PTC疗法。氨基糖苷类(AMG)一直是这些努力的主要焦点。然而，扩大使用的耳毒性和肾毒性限制了它们在临床上的使用。目前正在研究合成AMG衍生物以减少脱靶效应；然而，它们经常遇到低通读效率。非AMG小分子(例如泰乐菌素(tylosin)、Ataluren)也被鉴定为具有低毒性的有前途的PTC通读化合物。然而，这些方法仍有许多挑战有待克服，包括通常导致在原始PTC的位点生成错义突变的近同源tRNA的***。此外，化合物中的一些在人原代细胞中具有低效率的PTC抑制，导致Ataluren未能通过3期临床试验(ACT DMD 3期临床试验，NCT01826487；ACT CF，NCT02139306)。需要用于治疗与无义突变相关的病症的治疗剂和方法。

发明概述

本发明在多个方面解决了上述需求。

在一方面，本发明提供了闭合末端、环状、非病毒和非质粒DNA分子，其包含(1)启动子和(ii)编码反密码子编辑的tRNA(ACE-tRNA)的序列。该分子可以是闭合末端DNA线(CEDT)分子或微环(MC)分子。该分子可以进一步包含选自DNA核靶向序列(DTS)、转录增强5’前导序列(TELS)和ACE-tRNA条形码编码序列(ACE-tRNA Barcoding Sequence，ABS)的一个或多个元件。5’前导序列的实例包括SEQ ID NO：306。DTS的实例包括SV40-DTS，诸如SEQID NO：307。在一些实施方案中，该分子不含任何细菌核酸序列。该分子可以包含4个或更少的CpG二核苷酸。优选地，该分子不含任何CpG二核苷酸。该分子可以是约200至约1,000bp大小，例如约500bp大小。ACE-tRNA可以是选自下组的一者：TrpTGAchr17.trna39、LeuTGAchr6.trna81、LeuTGAchr6.trna135、LeuTGAchr11.trna4、GlyTGAchr19.trna2、GlyTGAchr1.trna107、GlyTGAchr17.trna9、ArgTGAchr9.trna6/无内含子、GlnTAGchr1.trna101和GlnTAGchr6.trna175。实例包括包含SEQ ID NO：1-10的序列的RNA。其他实例包括由SEQ ID NO：11-305编码的那些。在一个实施方案中，ACE-tRNA包含(i)选自SEQ ID NO：1、4、5和8或(ii)由选自SEQ ID NO：79和94的一者编码的序列。

该分子可以用于在细胞中表达ACE-tRNA的方法。表达的ACE-tRNA具有在mRNA翻译过程中将PTC回复到氨基酸的功能。为此，该方法包括(i)使感兴趣的细胞与上述分子接触和(ii)将细胞维持在允许ACE-tRNA表达的条件下。细胞可以具有包含一个或多个PTC的突变体核酸。在这种情况下，野生型核酸编码功能齐全的多肽。利用该方法，表达的ACE-tRNA挽救一个或多个PTC，从而恢复多肽的表达或提高多肽在细胞中的功能活性。例如，多肽可以是囊性纤维化跨膜电导调节剂(CFTR)并且突变体核酸编码截短的CFTR。在一个实例中，突变体核酸具有Trp-to-Stop PTC。ACE-tRNA将Trp-to-Stop PTC翻译成Leu。在本发明的范围内的是包含上述分子中的一种或多种的宿主细胞。

上述分子可以用于治疗PTC相关病症的方法。因此，本发明还提供包含(i)分子和(ii)药学上可接受的载剂的药物配制剂。还提供了在有此需要的受试者中治疗与PTC相关联的疾病的方法。该方法包括向受试者施用上述分子或药物组合物。疾病的实例包括囊性纤维化、杜氏和贝克肌营养不良症、视网膜母细胞瘤、神经纤维瘤病、共济失调-毛细血管扩张症、泰-萨二氏病、威尔姆氏瘤、甲型血友病、乙型血友病、门克斯病、乌尔里希氏病、β-地中海贫血、2A型和3型血管性血友病、Robinow综合征、B型短指(指和掌骨的缩短)、遗传性分枝杆菌感染易感性、遗传性视网膜疾病、遗传性出血倾向、遗传性失明、先天性感觉神经性耳聋和结肠无神经节病(colonic agangliosis)以及遗传性神经发育-智力缺陷，包括感觉神经性耳聋、结肠无神经节病、周围神经病和中枢性髓鞘形成不良性脑白质营养不良、Liddle综合征、着色性干皮病、范可尼贫血、贫血、甲状腺功能减退、p53相关癌症、食管癌、骨癌、卵巢癌、肝细胞癌、乳腺癌、肝细胞癌、纤维组织细胞瘤、卵巢癌、SRY性反转、磷酸丙糖异构酶-贫血、糖尿病、佝偻病、Hurler综合征、Dravet综合征、脊髓性肌营养不良、Usher综合征、无虹膜、无脉络膜、眼部缺损、色素性视网膜炎、营养不良性大疱性表皮松解、弹性假黄瘤、Alagille综合征、Waardenburg-Shah、婴儿神经元蜡样脂褐质沉积症、胱氨酸病、X连锁肾源性尿崩症和多囊肾病。在一些实例中，该疾病是选自下组的眼病：锥体细胞营养不良、斯特格病(STGD1)、锥-杆营养不良、色素性视网膜炎(RP)、对年龄相关性黄斑变性的易感性增加、先天性静止性夜盲2(CSNB2)、先天性静止性夜盲1(CSNB1)、Best病、VMD和Leber先天性黑矇(LCA16)。

可以使用任何合适的方法，包括纳米颗粒、电穿孔、聚乙烯亚胺(PEI)、受体靶向性polyplex、脂质体或流体动力注射进行治疗方法。

本发明的一个或多个实施方案的细节在下面的描述中阐述。本发明的其他特征、目的和优点将从说明书和权利要求中显而易见。

附图说明

图1A和1B是显示非常适合于治疗性递送的两个小ACE-tRNA表达盒的图。包括内部启动子A和B框区(约76个碱基对或bp)和短5’转录增强前导序列(TELS，散列)的ACE-tRNA的整个表达盒的总长度为约125bp或更短。

图1C显示了微环和CEDT的示意图。

图2A和2B是显示ACE-tRNA表达后mRNA转录物的核糖体谱的图。(A)对于编码区域中＞5RPKM(基因的每千碱基读段/百万定位读段)和3’UTR中＞0.5RPKM的转录物，ACE tRNA阻抑物和对照之间3’UTR中核糖体足迹密度的Log2倍变化。每个点代表一个基因转录物。误差线：平均值±SD。(B)所有转录物的终止密码子周围的归一化平均核糖体足迹占有率，其中CDS是基因编码序列(每个转录物的权重相等)。(插图)(B)的放大视图。

图3为ACE-tRNA微环和闭合末端DNA线产生方案的一组照片和图。

图4A和4B是显示ACE-tRNA^Arg MC和CEDT表现出稳健的PTC抑制能力的图。(A)小至200bp的MC在稳定表达PTC报告物的HEK293细胞中表达ACE-tRNA(白色条)。(B)CEDT与PTC报告物共同递送在16HBE14o-细胞中表现出稳健的PTC抑制。

图5A、5B、5C、5D、5E、5F和5G是显示将ACE-tRNACEDT递送至CRISPR/Cas9修饰的16HBE14o-细胞显著挽救CFTR功能并抑制无义介导衰变(NMD)的照片和图。(A)在Transwells上转染的16HBE14o-细胞的代表性图像。(B)在Ussing室记录中从WT(黑色)、用空载体(红色)和500bpACE-tRNA^Arg CEDT(蓝色)转染的p.R1162X 16HBE14oe-细胞追踪的代表性Cl-短路电流。(C)平均毛喉素和IBMX以及(D)Inhb172响应显示500bp ACE-tRNA^ArgCEDT(蓝色)对CFTR功能的显著挽救。(E)在不足(30％)转染效率之后，编码ACE-tRNA^Gly(灰色线)、ACE-tRNA^Arg(绿色水平线)和ACE-tRNA^Leu(橙色垂直线)的质粒均分别显著抑制p.G542X、p.R1162X和pW1282X16HBE14o-细胞中的NMD，如通过qPCR所测量。重要的是，500bpCEDT^Arg(绿色对角线)、800bp MC^Arg(绿点)和800bp MC^Leu(橙点)均在转染48小时后对其各自CFTR PTC的基于质粒的表达给予显著且相当的挽救。所有构建体均以相等量转染。*p＜0.05；**p＜0.0001。

图6A和6B是显示将微型载体电穿孔递送到小鼠肺中导致气道上皮细胞的高效转导和PTC通读的照片和图。(A)通过电穿孔，用GFP表达载体(插图)高效转导小鼠肺气道上皮细胞。(B)NLuc-UGA PTC报告质粒与质粒ACE-tRNA^Arg、500bp CEDT^Arg、800bp MC^Leu和800bpMC^Arg的共同递送导致稳健的PTC抑制。

图7A和7B是显示5’侧翼序列调节ACE-tRNA表达的照片和图。(A)ACE-tRNA^Trp _UGA对W1282X-CFTR的抑制由人Tyr TELS增强(左图)，如在HEK293细胞中有(左图)和没有(右图)TELS的情况下，转染编码W1282X-CFTR和ACE-tRNA^Trp _UGA的cDNA后，全长CFTR蛋白的Western印迹(WB)所示。(B)TELS筛选HTC/HTS质粒的设计。

图8A、8B、8C和8D是显示ACE-tRNA质粒没有主动转运至细胞核的照片和图。(A)将ACE-tRNA质粒cDNA注射到细胞的细胞质中导致细胞质定位，而(B)核注射导致形成与转录一致的灶。(C)将SV40 DNA靶向序列添加到空质粒导致细胞质注射后4小时的核定位。(D)具有SV40 DTS的ACE-tRNA MC和CEDT的示意图。

图9是显示用于确定肺中微型载体PTC抑制的定位、效率和持久性的PTC报告质粒的图。

图10A、10B和10C是显示用于测量转录活性的ACE-tRNA条形码技术的图。(A)ACE-tRNA条形码方案(ABS)的示意图。(B)ACE-tRNA^Arg和ACE-tRNA^Tro条形码的qPCR测量。(C)ACE-tRNA^Arg _UGA和ACE-tRNA^Arg _UGA-条形码的PTC抑制活性。

图11A、11B和11C是显示用于测量转录活性的另一种ACE-tRNA条形码技术的图。(A)tis ACE-tRNA条形码方案的示意图。(B)ACE-tRNA^Arg和ACE-tRNA^Arg条形码的qRT-PCR测量。(C)ACE-tRNA^Arg和ACE-tRNA^Arg-条形码的PTC抑制活性。

图12A和12B是显示在含有溴化乙锭的1.5％琼脂糖凝胶上分辨的不同大小的ArgTGA微环连接产物和相应PCR产物的照片。

图12C和12D是显示与T5外切核酸酶一起温育并在含有溴化乙锭的1.5％琼脂糖凝胶上分辨的ArgTGA微环连接产物和PCR产物的照片。微环连接中外切核酸酶抗性产物的存在表明共价闭合微环产物的产生。

图13A、13B、13C和13D是显示了以下产物的产生的一组图和照片：(图13A)200bpCEDT产物；(图13B)400bp CEDT产物；(图13C)900bp CEDT/1x ArgTGA产物；和(图13D)900bpCEDT/4x ArgTGA产物。在用N15噬菌体端粒酶原(protelomerase，telN)消化之前，通过阴离子交换层析纯化相应PCR产物中的每一个。CEDT产物显示出对T5外切核酸酶消化的抗性，表明通过telN产生共价闭合末端。在通过限制酶Bsu36I进行内切核酸酶切割后，每个CEDT产物均容易由T5外切核酸酶降解。

图13E和13F是分别显示了850bp的1x ArgTGA微环产物和850bp的4x ArgTGA微环产物的一组图和照片，两者均显示出对T5外切核酸酶消化的抗性，表明产生了共价闭合的微环。在限制酶SmaI进行内切核酸酶切割后，每个微环产物都容易由T5外切核酸酶降解。

图14是显示ACE-tRNA作为cDNA和RNA的递送挽救了16HBE14ge-细胞中的内源性CFTR mRNA的一组图。

图15A和15B是显示用于生成荧光PTC报告物16HBE14ge-细胞系的构建体和该细胞系在PTC抑制测定中的用途的一组图。

图16A和16B是显示ACE-tRNA作为cDNA的递送挽救了16HBE14ge-细胞中的内源性CFTR mRNA的一组图。**＝p＜0.001；****＝p＜0.0001。

图17A和17B是显示MC中ACE-tRNA的递送挽救了16HBE14ge-细胞中的内源性R1162X-CFTR mRNA的一组图。

图18A和18B是显示MC中ACE-tRNA的递送挽救了具有亮氨酸的16HBE14ge-细胞中的内源性W1282X-CFTR mRNA的一组图。

图19A和19B是显示不同CEDT中ACE-tRNA的递送挽救了16HBE14ge-细胞中的内源性R1162X-CFTR mRNA的一组图。

图20是显示PB-Donkey***的开发的图。

图21A和21B是显示ACE-tRNA^Arg的稳定整合和表达挽救了R1162X 16HBE14ge-细胞中的内源性CFTR功能的一组图。

发明详述

本发明涉及ACE-tRNA、相关载体以及用于治疗与PTC或无义突变相关的病症的相关递送和用途。

所有遗传疾病中的约10％-15％是由无义突变引起的。仅在美国，就有约300万人受到影响，并且据预测，所有遗传性基因病症中的三分之一是无义相关的。这些疾病中的所有都有统一的机制，其中单个核苷酸变化将氨基酸编码密码子转换为过早终止密码子(TGA、TAG或TAA)，导致截短的蛋白质完全丧失功能或改变功能，并且通过无义介导的衰变(NMD)途径降解mRNA转录物。本文所述的DNA分子、药物配制剂、方法和细胞可以用于治疗这些疾病。

在一方面，本公开提供了闭合末端、环状、非病毒和非质粒DNA分子，其包含(1)启动子和(ii)编码反密码子编辑的tRNA(ACE-tRNA)的序列。

在一些实施方案中，该分子是闭合末端DNA线(CEDT)分子或微环(MC)分子。

在任何上述实施方案中，该分子进一步包含选自下组的一种或多种元件：DNA核靶向序列(DTS)、转录增强5’前导序列(TELS)和ACE-tRNA条形码编码序列(ABS)。

在一个实施方案中，DTS包括SV40-DTS。

在上述实施方案中的任一项中，该分子不含任何细菌核酸序列。

在上述实施方案中的任一项中，分子包含4、3、2、1或更少的CpG二核苷酸。

在一个实施方案中，该分子不含CpG二核苷酸。

在上述实施方案中的任一项中，分子的大小为约200bp至约1,000bp。

在一个实施方案中，该分子的大小为约200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、550bp、600bp、650bp、700bp、750bp、800bp、850bp、900bp、950bp或1000bp。在CEDT的一些实例中，编码ACE-tRNA的双链部分的大小例如为约200bp、400bp或900bp，但由于添加的CEDT末端，相应CEDT的大小为约260bp、456bp或956bp。在那种情况下，CEDT有时称为200bp CEDT、400bp CEDT或900bp CEDT，以指示编码ACE-tRNA的双链部分的大小。参见例如，图13和19。

在上述实施方案中的任一项中，ACE-tRNA包含(i)选自SEQ ID NO：1-10或(ii)由选自SEQ ID NO：11-305的一者编码的序列。

在一个实施方案中，ACE-tRNA包含(i)选自SEQ ID NO：1、4、5和8或(ii)由选自SEQID NO：79和94的一者编码的序列。

本公开还提供药物配制剂，其包含(i)上述实施方案中任一项的分子和(ii)药学上可接受的载剂。

本公开进一步提供了用于在细胞中表达ACE-tRNA的方法，其包括(i)使细胞与上述任何实施方案的分子接触，和(ii)将细胞维持在允许ACE-tRNA表达的条件下。

在该方法的一个实施方案中，(i)细胞具有包含一个或多个过早终止密码子(PTC)的突变体核酸，(ii)突变体核酸的野生型编码多肽，并且(iii)ACE-tRNA挽救一个或多个PTC并恢复多肽的表达。

在一个实施方案中，该多肽是囊性纤维化跨膜电导调节剂(CFTR)并且突变体核酸编码截短的CFTR。

在一个实施方案中，突变体核酸具有Trp-to-Stop PTC。

在一个实施方案中，ACE-tRNA将Trp-to-Stop PTC翻译成Leu。

本公开进一步提供了包含上述实施方案中任一项的分子的宿主细胞。

本公开进一步提供在有此需要的受试者中治疗与PTC相关联的疾病的方法，该方法包括向受试者施用上述实施方案中任一项的分子或上述药物组合物。

在一些实施方案中，疾病选自下组：囊性纤维化、杜氏和贝克肌营养不良症、视网膜母细胞瘤、神经纤维瘤病、共济失调-毛细血管扩张症、泰-萨二氏病、威尔姆氏瘤、甲型血友病、乙型血友病、门克斯病、乌尔里希氏病、β-地中海贫血、2A型和3型血管性血友病、Robinow综合征、B型短指(指和掌骨的缩短)、遗传性分枝杆菌感染易感性、遗传性视网膜疾病、遗传性出血倾向、遗传性失明、先天性感觉神经性耳聋和结肠无神经节病以及遗传性神经发育-智力缺陷，包括感觉神经性耳聋、结肠无神经节病、周围神经病和中枢性髓鞘形成不良性脑白质营养不良、Liddle综合征、着色性干皮病、范可尼贫血、贫血、甲状腺功能减退、p53相关癌症、食管癌、骨癌、卵巢癌、肝细胞癌、乳腺癌、肝细胞癌、纤维组织细胞瘤、卵巢癌、SRY性反转、磷酸丙糖异构酶-贫血、糖尿病、佝偻病、Hurler综合征、Dravet综合征、脊髓性肌营养不良、Usher综合征、无虹膜、无脉络膜、眼部缺损、色素性视网膜炎、营养不良性大疱性表皮松解、弹性假黄瘤、Alagille综合征、Waardenburg-Shah、婴儿神经元蜡样脂褐质沉积症、胱氨酸病、X连锁肾源性尿崩症、McArdle病和多囊肾病。

在一些实施方案中，疾病是选自下组的眼部遗传病：锥体营养不良、斯特格病(STGD1)、锥-杆营养不良、色素性视网膜炎(RP)、对年龄相关性黄斑变性的易感性增加、先天性静止性夜盲2(CSNB2)、先天性静止性夜盲1(CSNB1)、Best病、VMD和Leber先天性黑矇(LCA16)。

在上述治疗方法实施方案的一些实施方案中，使用纳米颗粒、电穿孔、聚乙烯亚胺(PEI)、受体靶向性polyplex、脂质体或流体动力注射进行施用。

ACE-tRNA

ACE-tRNA是工程化tRNA分子，其序列经过工程化，因此PTC可以有效地和治疗性地恢复到最初丢失的氨基酸或不同的氨基酸。此类工程化tRNA允许将引起疾病的无义密码子“重编辑”为特定氨基酸。如本文所公开的，工程化tRNA可以靶向仅一种类型的终止密码子，诸如TGA而非TAC或TAA。这些tRNA分子的小尺寸使其适合于随时表达，因为tRNA和启动子加起来可以仅有约300bp。为此，可以合成寡核苷酸以包含在人细胞中起作用的tRNA基因的结构组分。该寡核苷酸的序列可以根据已知序列进行设计，并在tRNA的反密码子区域进行取代，导致特定的tRNA识别无义或其他特定突变。ACE-tRNA的实例包括在WO2019090154、WO2019090169和Lueck，J.D.等人Nature communications 10，822，2019中描述的那些。这些文件中的每一篇的内容均通过引用并入。

通常，ACE-tRNA具有一般的四臂结构，包括T臂、D臂、反密码子臂和接受体臂(参见WO2019090169的图2)。T臂由“T茎”和“TΨC环”构成。在某些实施方案中，T茎被修饰以增加tRNA的稳定性。在某些实施方案中，ACE-tRNA具有修饰的T茎，相对于内源性T茎序列，该T茎增加生物活性以抑制终止位点。

ACE-tRNA可以用于抑制PTC。然而，PTC的有效抑制具有潜在的缺点。例如，有人担心PTC抑制策略可能会导致体内真实的天然终止密码子的通读，并且全局天然终止密码子的通读是有害的。然而，若干细胞机制可以限制正常的终止通读及其破坏性影响。更具体而言，在正常的翻译终止处经常发现多个框内终止密码子，从而增加了在存在高效PTC阻抑物的情况下翻译终止的可能性。此外，至少两种细胞机制用于鉴定和降解具有错误翻译终止的蛋白质、专门泛素连接酶和核糖体相关途径。有证据表明，基因末端处的自然终止密码子具有促进终止效率提高的周围序列景观，并且在PTC处发现的终止复合物与“真实”终止处的终止复合物不同。出乎意料的是，发现内源性终止密码子通读在动物中很常见并且无害，这表明抑制PTC是可行的治疗方法。事实上，核糖体谱分析(profiling)的初步数据表明，“真实”终止的ACE-tRNA通读并不常见(图2)。

可以根据WO2019090154、WO2019090169和Lueck，J.D.等人，Naturecommunications 10，822(2019)中描述的策略制备可用于本发明的ACE-tRNA。使用这种策略，已经建立广泛的ACE-tRNA文库，用于细胞培养物中PTC的有效挽救。以下表1是可用于本发明的ACE-tRNA的一些实例。用于抑制引起疾病的PTC的其他工程化人tRNA序列包括在WO2019090154、WO2019090169和Lueck，J.D.等人，Nature communications 10，822(2019)中描述的那些。其他实例包括由下表2中的SEQ ID NO：11-305编码的那些。在以下序列中的每一个中，对应于反密码子的三字母序列为小写形式并带下划线。

表1

表2

如本文所公开的，ACE-tRNA基因结构非常适合PTC治疗剂。tRNA基因通过2型RNA聚合酶(Pol)III识别内部启动子元件(A和B框，图1)转录成tRNA，其中侧翼为短的(＜50bp)5’侧翼区的tRNA和由一短连串的胸苷核苷酸(约4个胸苷，Ts)组成的3’转录终止元件。大多数tRNA基因的长度为72-76bp，因此整个tRNA表达盒可以仅由约125bp组成(图1)。

有多个序列元件涉及可以进行优化的ACE-tRNA的转录和翻译功能，。RNA聚合酶III利用2型基因内启动子元件(A和B框，图1A或1B)驱动真核生物中tRNA基因的表达。虽然A和B框足以用于2型启动子的功能，但tRNA的表达可以通过紧邻基因5’约50bp的序列(5’-侧翼序列)进行调节和增强。tRNA的转录由一小段胸苷核苷酸(≤4个胸苷，Ts)终止。

如本文所公开的，发明人已经利用tRNA的独特基因特征来生成小DNA载体，诸如微环(MC)和闭合末端DNA线(CEDT)，用于开发显示高效和持续抑制引起疾病的PTC的治疗剂，包括导致囊性纤维化(“CF”)的位于CFTR基因内的PTC。

这种ACE-tRNA方法相较于其他通读策略具有若干显著优势，包括(1)密码子特异性；(2)ACE-tRNA对PTC的抑制导致无缝挽救，从而使对蛋白质稳定性、折叠、运输和功能的乱真效应无效；(3)这些ACE-tRNA的体外递送导致受影响蛋白质(诸如具有p.G542X或p.W1282X CF突变的CFTR通道)的显著功能挽救。初步结果显示对内源性翻译终止密码子的抑制最小，表明对翻译组的副作用不显著。ACE-tRNA已证明对多种细胞类型中具有不同PTC位置的若干cDNA基因中的PTC抑制是高效的。由于ACE-tRNA在PTC抑制方面表现出高效率且没有已知的有害作用，因此它们可以用作治疗剂。

微型载体

本发明的一个方面涉及为了PTC治疗目的而生成和体内递送编码阻抑tRNA的小DNA微型载体。在考虑最佳治疗属性时，金标准是一次性治愈。然而，在疫苗之外，这些治愈方法很少被实现。最近，CRISPR/Cas9作为有前途的治疗方法而受到关注，因为它能够对基因组进行永久性改变。重要的是，基因组操作，包括由CRISPR/Cas9进行的操作，只能持续与修饰细胞一样长的寿命，除非靶向干细胞群。随着细胞的更替，重新递送治疗剂是必要的，并且必须考虑对治疗剂的免疫应答。因此，发明人着手设计基于ACE-tRNA平台的PTC治疗剂，其具有有限的免疫原性以允许重复递送、与靶细胞(例如，气道上皮细胞)匹配的半衰期、降低的致病性和低***性诱变能力。

在一些实施方案中，生成并使用两种小cDNA载体格式，微环(MC)和闭合末端DNA线(CEDT)，也称为DNA微串(DNA ministring)、Doggybone DNA^TM或线性共价闭合(LCC)DNA。例如，使用表达ACE-tRNA的小DNA载体(微型载体)以在细胞、小鼠和猪体内获取体内数据集，以开发无义相关病症(包括CF)的治疗。在针对具有治疗效用的DNA分子的实施方案中，DNA模板通常包含表达盒，该表达盒包含一个或多个启动子或增强子元件和编码感兴趣的RNA或蛋白质的基因或其他编码序列。

本发明的载体通常包含如上所述的表达盒，即包含以下、由或基本上由以下组成：与编码感兴趣基因或蛋白质的序列可操作地连接的真核启动子，以及任选地真核转录终止序列。任选地，表达盒可以是如下定义的最小表达盒，即缺少一个或多个通常选自下组的细菌或载体序列：(i)细菌复制起点；(ii)细菌选择标志物(通常是抗生素抗性基因)和(iii)未甲基化的CpG基序。

优选地，本发明的载体不含此类不必要的序列中的任一者。也就是说，该载体没有此类不必要的序列。此类不必要的或外来的序列(也描述为细菌或载体序列)可以包括细菌复制起点、细菌选择标志物(例如，抗生素抗性基因)和未甲基化的CpG二核苷酸。此类序列的缺失产生不含外来遗传物质的“最小”表达盒。此外，上述类型的细菌序列在一些治疗方法中可能存在问题。例如，在哺乳动物细胞内，细菌/质粒DNA可能导致克隆的基因关闭，从而无法实现感兴趣的基因或蛋白质的持续表达。此外，细菌繁殖中使用的抗生素抗性基因会对人类健康造成风险。此外，细菌质粒/载体DNA可能触发不需要的非特异性免疫应答。细菌DNA序列的特定特征是未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(通常称为CpG基序)的存在，这也可能导致非期望的免疫应答。

微环(MC)

MC是小的环状载体(＜5千碱基(kb))，其构建为仅含有用于基因表达的最小序列，通常是启动子、感兴趣的基因(GOI)和终止序列。小尺寸增加了细胞进入和细胞内运输到细胞核，这导致增加的递送和转录的生物利用度。此外，它们没有质粒中常见的细菌序列，这会降低致病性和附加型沉默以延长编码的GOI的表达。在肝脏中，已经证明MC表达GOI超过115天，并且在研究终止前表达几乎没有减少。

在小鼠中气道上皮在气管中的半衰期为6个月并且在细支气管中为17个月，在人中为50天。小DNA载体，主要是大小＞3kb的MC，可以通过多种方式在体内广泛递送，包括聚乙烯亚胺(PEI)、受体靶向性polyplex、脂质体、流体动力注射和电穿孔。编码无CpG CFTR(约7kb)的MC已通过PEI浓缩和烟雾化递送至小鼠肺部，导致递送后56天的持续表达。

闭合末端DNA线(CEDT)

如本文所用，“闭合末端DNA线”或“CEDT”是指闭合的线性DNA分子。此类闭合末端线性DNA分子可以被视为如图4B和图8D中所描述的单链环状分子。CEDT分子通常包含共价闭合末端，也称为发夹环，其中不存在互补DNA链之间的碱基配对。发夹环连接互补DNA链的末端。这种类型的结构通常在染色体的端粒末端形成，以通过将末端核苷酸隔离在闭合结构中来防止染色体DNA丢失或损坏。在本文描述的CEDT分子的某些实例中，发夹环侧接互补碱基配对DNA链，形成“doggy-bone”型结构(如图4B和8D所示)。

CEDT分子通常包含具有共价闭合末端(即发夹末端)的线性双链DNA部分。发夹连接线性双DNA链的末端，这样如果分子完全变性，就会产生单链环状DNA分子。通常，本文所述的CEDT在序列上基本上是完全互补的，尽管结构可以容忍一些微小的变化或“摆动”。因此，闭合线性DNA或CEDT在序列上可以至少75％、80％、85％、90％或95％互补，或至少96％、97％、98％、99％或100％互补。当变性时，它实际上是包含彼此相邻的正向(正义或正)和反向(反义或负)链的环状分子。这与质粒DNA或MC DNA形成对比，其中互补序列(负和正)位于单独的环状链上(图4A相较于图4B)。

由于此时施加在DNA链上的构象应力，发夹顶端(末端或转角)内的碱基可能无法形成碱基对。例如，顶端部分的顶端处至少有2个碱基对可能不会形成碱基对，但确切的构象可能会根据DNA维持的条件和发夹周围的确切序列而发生波动。因此，鉴于所涉及的结构扭曲，2个或更多个碱基可能无法成对，尽管它们具有互补性。发夹长度内非互补碱基的一些“摆动”可能不会影响结构。摆动可以是回文的中断，但序列可以保持互补。然而，优选发夹的序列是完全自互补的。

互补性描述序列中每个多核苷酸的碱基(5’到3’)如何与互补碱基形成氢键对，A到T(或U)和C到G在反平行(3’到5’)链上，可以是在相同的链(内部互补序列)上，也可以是在不同的链上。该定义适用于本发明的任何方面或实施方案。优选地，发夹中的序列90％互补，优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％、99％或100％互补。

CEDT可以包含双链序列内的任何序列，或者是天然衍生的或者是人工的。其可以包含至少一个加工酶靶序列，诸如一个、两个、三个、四个或更多个加工酶靶位点。此类靶序列允许DNA在合成后任选地进一步加工。加工酶是识别其靶位点并加工DNA的酶。加工酶靶序列可以是限制酶的靶序列。限制酶，即限制性内切核酸酶，结合靶序列并在特定点切割。加工酶靶序列可以是重组酶的靶标。重组酶定向催化短(30-40个核苷酸)靶位点序列之间的DNA交换反应，这些序列对每个重组酶具有特异性。重组酶的实例包括Cre重组酶(以loxP作为靶序列)和FLP重组酶(具有短翻转酶识别靶标(FRT)位点)。加工酶靶序列可以是位点特异性整合酶(例如phiC31整合酶)的靶标。

加工酶靶序列也可以是RNA聚合酶的靶序列，从而使CEDT成为RNA合成的模板。在这种情况下，加工酶靶向位点是启动子，优选真核启动子。为此，CEDT可以包含表达盒，其包含真核启动子、由或基本上由真核启动子组成，该真核启动子可操作地连接到封闭感兴趣的RNA(例如，tRNA)或蛋白质的序列，以及任选地真核转录终止序列。“启动子”是启动和调节多核苷酸转录的核苷酸序列。“可操作地连接”是指元件的布置，其中如此描述的元件被配置为执行它们通常的功能。因此，当存在适当的酶时，与核酸序列可操作连接的给定启动子能够影响该序列的表达。术语“可操作地连接”旨在涵盖启动子元件和感兴趣的DNA序列的任何间距或方向，其允许在转录复合物识别启动子元件时启动感兴趣的DNA序列的转录。

CEDT或MC可以是任何合适的长度。特别地，CEDT或MC可以最长达4kb。优选地，DNA模板可以是100bp至2kb、200bp至1kb、最优选地200bp至800bp。200bp或更长的MC和CEDT可以容纳多个ACE-tRNA盒拷贝。这可以允许来自每个MC和CEDT单元的更高ACE-tRNA表达。拥有来自每个微型载体的多个ACE-tRNA拷贝，允许一个微型载体在每个单元中包括一个或多个序列。例如，亮氨酸ACE-tRNA和色氨酸ACE-tRNA可以包括在一个MC或CEDT微型载体中。这两种ACE-tRNA均可以在囊性纤维化中有效挽救或抑制突变W1282X-CFTR，并显着增强抑制活性，因为它们利用不同的tRNA氨酰合成酶。

闭合的DNA分子可用作治疗剂，即可用作在体内表达基因产物的DNA药物。这是因为它们的共价闭合结构可防止外切核酸酶等酶的攻击，与具有暴露DNA末端的“开放”DNA分子相比，导致基因表达增强的稳定性和寿命。当引入宿主组织时，线性双链开放式盒已被证明在基因表达方面是低效的。这归因于细胞外空间中外切核酸酶的作用引起的盒不稳定性。

将DNA末端隔离在共价闭合结构内还有其他优势。DNA末端被阻止与基因组DNA整合，因此封闭的线性DNA分子具有更高的安全性。此外，封闭的线性结构可防止宿主细胞内DNA分子的串联，因此可以以更灵敏的方式调节基因产物的表达水平。

CEDT具有与MC相同的所有优点，但表现出具有共价闭合末端的线性DNA盒拓扑结构。由于CEDT易于生产、递送效率高、致病性低和持续表达，因此已在体内用于表达抗原以生成疫苗。CEDT相较于MC具有一些优势，因为它们可以在GMP级容易地以高丰度地完全合成制造，从而允许快速设计和制备。

可以使用本领域已知的方法制备CEDT。CEDT的无细胞产生已在US9499847、US20190185924、WO2010/086626和WO2012/017210中描述，这些通过引用并入本文。该方法涉及使用DNA模板产生两端共价闭合的线性双链DNA(闭合线性DNA)，其中DNA模板包含至少一种端粒酶原识别序列，并且使用至少一种DNA聚合酶扩增模板并使用端粒酶原加工以产生闭合的线性DNA。闭合线性DNA的闭合末端各自包括一部分端粒酶原识别序列。在所列申请中描述了闭合线性DNA作为模板的使用，此类模板的使用是有利的，因为这意味着在生产过程中浪费的试剂量最少。通过这些方法产生的CEDT分子是线性的、双链的，并且在每一端被一部分端粒酶原识别序列共价闭合。这种线性双链DNA分子可以包括一个或多个茎环基序。

如本文所公开的，在一个实例中，本公开使用电场评估了表达ACE-tRNA的微型载体(例如MC和CEDT微型载体)至肺的递送效率，以及ACE-tRNA在体外和体内对气道上皮细胞中PTC的抑制作用的有效性和持久性。利用ACE-tRNA基因的微小尺寸(约80nt)，发明人已成功生成据其所知最小的治疗性表达载体。

有了有效的ACE-tRNA文库，就可以确定最有效的体内递送方法。如本文所公开的，可以在MC和CEDT中编码ACE-tRNA^Trp _UGA、ACE-tRNA^Leu _UGA、ACE-tRNA^Gly _UGA和ACE-tRNA^Arg _UGA，以靶向三种最常见的CF无义突变(p.G542X、p.W1282X和p.R553X)。MC和CEDT技术作为可递送平台，可以与多种递送方法包括纳米颗粒、蛋白质复合物和电场配对，如此处所示。MC和CEDT微型载体具有使其对基因疗法具有吸引力的几个特征，包括：(1)显著减小的尺寸允许它们克服细胞内运输过程中的障碍，从而提高生物利用度；(2)更高的细胞进入效率；(3)具有转录活性结构；和(4)在没有基因组整合的情况下持续的转基因表达。

设计结构

微型载体序列的设计对表达效率和持久性具有重要意义。如本文所公开的，除了本文所述的tRNA表达盒之外，本发明的微型载体MC或CEDT任选地包括许多有利的元件和/或断裂。实例包括ACE-tRNA-条形码编码序列(ABS)、转录增强5’前导序列(TELS)和DNA核靶向序列(DTS)。

一个重要特征是CpG序列含量及其甲基化。DNA甲基化及其对转录的影响已得到广泛研究。甲基化的缺乏是活跃转录的先决条件，其中甲基化的CpG岛存在于非活跃的X染色体和亲本印记基因的沉默等位基因上。此外，已表明DNA的体外甲基化会抑制基因表达。因为ACE-tRNA基因非常小，平均只含有四个CpG序列，发明人已经能够将它们的微型载体设计成几乎完全没有CpG序列，以增强ACE-tRNA表达的持久性。此外，即使在500bp下，ACE-tRNA基因也只消耗总有效载荷的一小部分，留下包括3’ABS、TELS和DTS在内的选项。ABS、TELS和DTS的实现在以下实施例6和7中进行了描述。

高效抑制PTC的能力在很大程度上受PTC所在的遗传景观控制。因此，必须确定从微型载体表达的ACE-tRNA抑制靶细胞中的PTC(例如培养的人气道上皮细胞中的PTC)的效率。为此，可以使用TELS和DTS通过增加转录活性和将微型载体靶向细胞核来增强ACE-tRNA的体内表达。

TELS

增加来自微型载体的ACE-tRNA的表达可以降低递送效率对ACE-tRNA治疗效果的负担。尽管真核生物tRNA基因的转录受基因内启动子元件(A和B框)指导，但5’侧翼序列区域也显著调节tRNA转录，可能是通过与polIII转录复合物的相互作用。此类区域可用作转录增强5’前导序列(TELS)。在一些情况下，具有相同编码序列的tRNA基因具有增加或减少转录的不同的5’侧翼序列。此外，假定5’侧翼序列可调节组织表达特异性。为此，可以使用人tRNA Tyr 5’前导序列(5’-AGCGCTCCGGTTTTTCTGTGCTGAACCTCAGGGGACGCCGACACACGTACACGTC-3’，SEQ ID NO：306)作为TELS。

图7A显示包含5’前导序列可使ACE-tRNA^Trp _UGA对W1282X-CFTR的抑制活性增加5倍以上。大约416个tRNA基因已在人基因组中进行了注释(tRNAscan-SE数据库，Lowe等人，Nucleic Acids Res 25，955-964，(1997))。所有416个tRNA基因的tRNA 5’侧翼序列(1kb)都可以用作本发明的TELS。

DTS

DNA核靶向序列或DTS是DNA序列或DNA序列的重复序列，需要它来支持细胞质定位的DNA的核输入。病毒启动子或哺乳动物基因启动子中天然存在的DNA序列通过将它们掺入到可在非***细胞中表达的表达载体中，提供含有转基因的DNA的核进入。DTS的非限制性实例是来自SV40基因组的DNA序列，其含有增强子重复序列(5’-atgctttgca tacttctgcctgctggggag cctggggact ttccacaccc taactgacac acattccaca gctggttggt acctgca-3’，SEQ ID NO：307)。该SV40 DTS已被证明支持质粒DNA的序列特异性DNA核输入(例如，Dean等人，Exp.Cell Res.253：713-722，1999)。如本文所公开的，可以按照以下实施例中描述的方式获得额外的DTS。

条形码

本发明中描述的微型载体可以包括一个或多个允许直接测量ACE-tRNA转录活性的附加元件。一个实例是条形码序列。

标准RNA测序(RNA-seq)方法已用于分析mRNA、非编码RNA、微小RNA、小核/核仁RNA和rRNA¹⁶⁵。然而，tRNA是唯一一类无法实施这些标准RNA-seq方法的小细胞RNA。阻碍直接方法的重大障碍包括干扰聚合酶扩增的转录后修饰的存在，以及阻碍适体连接的稳定和广泛的二级结构。最近已经开发了几种方法来规避这些问题，但是这些方法相对复杂且成本高昂。此外，由于ACE-tRNA序列与一种或多种内源性tRNA仅相差一个核苷酸，norther印迹、微阵列和片段化RNA-seq无法辨别外源性治疗性ACE-tRNA和内源性tRNA的表达水平。最近的几项研究利用tRNA作为启动子来驱动tRNA:sgRNA(Cas9单向导RNA)融合转录物的高表达水平，然后这些转录物由内源性tRNase Z高效且精确地切割。

本发明的微型载体可以包括一个或多个ACE-tRNA-条形码编码序列或ABS。ABS可以位于编码ACE-tRNA的序列的3’或5’处，以便该载体编码ACE-tRNA和条形码的融合转录物。在一个实例中，条形码序列位于3’末端，并且微型载体编码ACE-tRNA：条形码融合转录物，其中条形码序列可以由内源性tRNase Z切割，允许qPCR量化以确定相对ACE-tRNA表达，同时提供功能齐全的ACE-tRNA(图10A)。如以下实施例11所示，发明人设计了随机的200bp条形码序列，与小鼠基因组序列没有同源性。当转染到稳定表达NLuc-UGA的16HBE14o-细胞时，ACE-tRNA_Arg ^UGA-和ACE-tRNA_Trp ^UGA-条形码表现出如qPCR所监测的稳健的表达，而非条形码化的ACE-tRNA没有给出明显的信号(图10B)。尽管在一种情况下，ACE-tRNA^Arg _UGA的抑制活性可能会因3’条形码序列的存在而受到阻碍，但ACE-tRNA活性的缺陷很可能是由于3’加工不良，这可以通过northern印迹探测条形码序列来确定。此种缺陷可以通过使用3’丁型肝炎病毒(HDV)自切割核酶来纠正，其序列也可以作为条形码或修饰后的条形码接头序列来改进3’加工。3’核酶的掺入可以导致改善的ACE-tRNA 3’加工并增加其PTC抑制活性。此外，ABS技术允许测量ACE-tRNA表达以补充NLuc PTC报告物(图9)。

在本申请的任何实施方案中，本文所述的核酸分子或载体可以任选地包含一个或多个报告分子。报告物是在细胞中的表达赋予细胞可检测的特性的分子。在各种实施方案中，报告物包括但不限于氯霉素-乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖基转移酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶、

碱性磷酸酶和荧光蛋白，包括但不限于绿色荧光蛋白(例如，GFP、TagGFP、T-Sapphire、Azami Green、Emerald、mWasabi、mClover3)、红色荧光蛋白(例如，tdTomato、mRFPl、JRed、HcRedl、AsRed2、AQ143、mCherry、mRuby3、mPlum)、黄色荧光蛋白(例如，EYFP、mBanana、mCitrine、PhiYFP、TagYFP、Topaz、Venus)、橙色荧光蛋白(例如，DsRed、Tomato、KusabriaOrange、mOrange、mTangerine、TagRFP)、青色荧光蛋白(例如，CFP、mTFPl、Cerulean、CyPet、AmCyanl)、蓝色荧光蛋白(例如，Azurite、mtagBFP2、EBFP、EBFP2、Y66H)、近红外荧光蛋白(例如，iRFP670、iRFP682、iRFP702、iRFP713和iRFP720)、红外荧光蛋白(例如，IFP1.4)和光活化荧光蛋白(例如，Kaede、Eos、IrisFP、PS-CFP)。

将编码ACE-tRNA的核酸引入细胞

外源遗传物质(例如，编码一种或多种治疗性ACE-tRNA的核酸或微型载体)可以通过遗传转移方法(例如转染或转导)在体内引入感兴趣的靶细胞，以提供遗传修饰的细胞。多种表达载体(即，用于促进外源遗传物质递送到靶细胞中的媒介物)是本领域普通技术人员已知的。如本文所用，“外源遗传物质”是指天然或合成的核酸或寡核苷酸，其在细胞中不天然存在；或者如果其天然存在于细胞中，不会被细胞转录或以生物学上显著的水平表达。因此，“外源遗传物质”包括例如可以转录成tRNA的非天然存在的核酸。

如本文所用，“细胞转染”是指细胞通过掺入添加的核酸(DNA、RNA或其杂交体)而获得新的遗传物质。因此，转染是指使用物理或化学方法将核酸引入细胞。若干转染技术是本领域普通技术人员已知的，包括：磷酸钙核酸共沉淀、磷酸锶核酸共沉淀、DEAE-右旋糖酐、电穿孔、阳离子脂质体介导的转染和钨颗粒促进的微粒轰击。相反，“细胞转导”是指使用DNA或RNA病毒将核酸转移到细胞中的过程。用于将核酸转移到细胞中的RNA病毒(即逆转录病毒)在本文中称为转导嵌合逆转录病毒。逆转录病毒中包含的外源遗传物质被掺入到转导细胞的基因组中。已用嵌合DNA病毒(例如，携带编码治疗剂的cDNA的腺病毒)转导的细胞不会将外源遗传物质掺入到其基因组中，但能够在细胞内表达保留在染色体外的外源遗传物质。

通常，外源遗传物质包括异源基因(编码治疗性RNA或蛋白质)以及控制新基因转录的启动子。启动子特征性地具有启动转录所必需的特定核苷酸序列。任选地，外源遗传物质进一步包括获得期望基因转录活性所需的额外序列(即增强子)。出于本次讨论的目的，“增强子”只是任何非翻译的DNA序列，其与编码序列相邻(顺式)工作，以改变启动子指示的基础转录水平。可以将外源遗传物质紧邻启动子下游引入细胞基因组中，以便启动子和编码序列可操作地连接，从而允许编码序列的转录。逆转录病毒表达载体可以包括外源启动子元件以控制***的外源基因的转录。此类外源性启动子包括组成型和诱导型启动子。

天然存在的组成型启动子控制基本细胞功能的表达。结果，在组成型启动子控制下的基因在所有细胞生长条件下表达。示例性组成型启动子包括编码某些组成型或“管家”功能的以下基因的启动子：次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、腺苷脱氨酶、磷酸甘油激酶(PGK)、丙酮酸激酶、磷酸甘油变位酶、肌动蛋白启动子、泛素、延伸因子-1和本领域技术人员已知的其他组成型启动子。此外，许多病毒启动子在真核细胞中具有组成型功能。这些包括SV40的早期和晚期启动子；莫洛尼白血病病毒和其他逆转录病毒的长末端重复(LTR)；以及单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子，以及其他许多病毒。因此，上述提及的组成型启动子中的任一者可以用于控制异源基因***物的转录。

在诱导型启动子控制下的基因仅表达或在诱导剂存在的情况下在更大程度上表达(例如，在金属硫蛋白启动子控制下的转录在某些金属离子存在下大大增加)。诱导型启动子包括响应元件(RE)，当它们的诱导因子结合时会刺激转录。例如，存在用于血清因子、类固醇激素、视黄酸和环AMP的RE。可以选择含有特定RE的启动子以获得可诱导的反应，在某些情况下，RE本身可以附接到不同的启动子，从而赋予重组基因可诱导性。因此，通过选择合适的启动子(组成型与诱导型；强与弱)，有可能控制治疗剂在遗传修饰的细胞中的存在和表达水平两者。如果编码治疗剂的基因在诱导型启动子的控制下，则通过将遗传修饰的细胞原位暴露于允许治疗剂转录的条件，例如通过注射控制药剂转录的诱导型启动子的特异性诱导剂，触发治疗剂的原位递送。例如，通过将遗传修饰的细胞与含有适当的(即诱导的)金属离子的溶液原位接触，可以增强遗传修饰的细胞原位表达由金属硫蛋白启动子控制下的基因编码的治疗剂。

因此，原位递送的治疗剂的量通过控制以下因素来调节：(1)用于指导***基因转录的启动子的性质，(即，启动子是组成型还是诱导型，是强还是弱)；(2)***细胞中的外源性基因的拷贝数；(3)施用于(例如，植入)患者的转导/转染细胞的数量；(4)植入物(例如移植物或封装表达***)的大小；(5)植入物的数量；(6)转导/转染细胞或植入物留在原位的时间长度；和(7)遗传修饰细胞的治疗剂的产生速率。考虑到上述公开的因素和患者的临床特征，选择和优化这些因素以递送治疗有效剂量的特定治疗剂被认为在本领域普通技术人员无需过度实验的范围内。

除了至少一个启动子和至少一个编码治疗剂的异源核酸外，表达载体还可以包括选择基因，例如新霉素抗性基因，用于促进选择已经用表达载体转染或转导的细胞。或者，用两种或更多种表达载体转染细胞，至少一个载体含有编码治疗剂的基因，另一个载体含有选择基因。合适的启动子、增强子、选择基因和/或信号序列的选择被认为在本领域普通技术人员无需过度实验的范围内。

可以将本发明的ACE-tRNA构建体***任何类型的靶细胞或宿主细胞中。在表达载体的情况下，可以通过本领域的任何方法将该载体容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞或昆虫细胞。例如，可以通过物理、化学或生物学手段将表达载体转移到宿主细胞中。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染(lipofection)、颗粒轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域众所周知的。参见，例如，Sambrook等人(2012，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory,New York)。

将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，尤其是逆转录病毒载体，已成为将基因***哺乳动物细胞(例如，人细胞)中最广泛使用的方法。其他病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见例如，美国专利号5,350,674和5,585,362。

用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散***，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的***，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体***是脂质体(例如，人工膜囊泡)。

添加DNA结合蛋白如转录因子A线粒体(TFAM)可以用于浓缩DNA和屏蔽电荷。由于尺寸小且形状紧凑，DNA：蛋白质(DNP)复合物随后可通过细胞穿透肽、PEG衍生物、脂质体或电穿孔递送至细胞。在某些情况下，DNA结合蛋白可以编码核定位信号，以主动将DNP从细胞质转运到细胞核，在此处转录DNA微型载体。

在使用非病毒递送***的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。考虑使用脂质配制剂将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一方面，核酸可以与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可以封装在脂质体的水性内部、散布在脂质体的脂质双层内、经由与脂质体和寡核苷酸缔合的连接分子附接到脂质体、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、作为混悬液包含在脂质中、包含或与胶束复合、或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体缔合组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以存在于双层结构中，作为胶束，或具有“塌陷”结构。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，其可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂肪烃及其衍生物的一类化合物，诸如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。

适用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从Sigma，St.Louis，MO获得；磷酸二鲸蜡酯(“DCP”)可以从K&K Laboratories(Plainview,NY)获得；胆固醇(“Choi”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可以从Avanti Polar Lipids，Inc.(Birmingham，AL)获得。氯仿或氯仿/甲醇中的脂质储备溶液可以在约-20℃下储存。氯仿被用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。

“脂质体”是通用术语，涵盖通过闭合的脂质双层或聚集体的生成而形成的各种单层和多层脂质媒介物。脂质体的特征在于具有带磷脂双层膜和内部水介质的囊泡结构。多层脂质体具有由水性介质分隔的多个脂质层。当磷脂混悬在过量的水溶液中时，脂质体会自发形成。脂质成分在形成闭合结构之前进行自我重排，并在脂质双层之间截留水和溶解的溶质(Ghosh等人，1991 Glycobiology 5：505-10)。然而，也涵盖在溶液中具有不同于正常囊泡结构的结构的组合物。例如，脂质可以呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了Lipofectamine-核酸复合物。

本发明的核酸分子可以经由电穿孔施用，例如通过美国专利号7,664,545中描述的方法，其内容通过引用并入本文。电穿孔可以通过美国专利号6,302,874；5,676,646；6,241,701；6,233,482；6,216,034；6,208,893；6，192,270；6，181,964；6，150,148；6，120,493；6,096,020；6,068,650；和5,702,359中描述的方法和/或设备进行，其内容通过整体引用并入本文。电穿孔可以经由微创装置进行。

微创电穿孔装置(“MID”)可以是用于将上述组合物和相关流体注射到机体组织中的装置。该装置可以包括空心针、DNA盒和流体递送装置，其中该装置适于在使用中驱动流体递送装置，以便在将针***所述机体组织期间同时(例如，自动地)将DNA注射到机体组织中。这具有在***针时逐渐注射DNA和相关液体的能力导致液体更均匀地分布在机体组织中的优点。由于注射的DNA分布在更大的区域，注射过程中的疼痛可能会减少。

MID可以在不使用针的情况下将组合物注射到组织中。MID可以以小流或射流的形式注射组合物，其力使得组合物刺穿组织表面并进入下面的组织和/或肌肉。小流或射流背后的力可以由压缩气体(例如二氧化碳)在几分之一秒内通过微孔膨胀来提供。微创电穿孔装置的实例及其使用方法描述于公布的美国专利申请号20080234655；美国专利号6,520,950；美国专利号7，171,264；美国专利号6,208,893；美国专利号6,009,347；美国专利号6，120,493；美国专利号7,245,963；美国专利号7,328,064；和美国专利号6,763,264中，其中每个的内容均通过引用并入本文。MID可以包括产生无痛刺穿组织的高速液体射流的注射器。此种无针注射器是可商购的。可在本文中使用的无针注射器的实例包括在美国专利号3,805,783；4,447,223；5,505,697；和4,342,310中描述的那些，其中每个的内容均通过引用并入本文。

可以使用无针注射器将适合直接或间接电转运形式的期望组合物引入(例如，注射)到待治疗的组织中，通常通过使组织表面与注射器接触以驱动药剂射流的递送，用足够的力使组合物渗透到组织中。例如，如果待治疗的组织是黏膜、皮肤或肌肉，则以足够的力将药剂投射到黏膜或皮肤表面，以使药剂分别穿透角质层并进入真皮层，或进入下面的组织和肌肉。

无针注射器非常适合将组合物递送到所有类型的组织，特别是皮肤和黏膜。在一些实施方案中，无针注射器可以用于将含有组合物的液体推到表面并进入受试者的皮肤或黏膜。可以使用本发明方法治疗的各种类型组织的代表性实例包括胰腺、喉、鼻咽、下咽、口咽、唇、咽喉、肺、心脏、肾、肌肉、***、结肠、***、胸腺、睾丸、皮肤、黏膜组织、卵巢、血管或其任何组合。

MID可以具有对组织进行电穿孔的针电极。通过在多电极阵列中的多对电极之间产生脉冲，例如以矩形或正方形模式设置，提供了优于在一对电极之间产生脉冲的结果。例如，在题为“Needle Electrodes for Mediated Delivery of Drugs and Genes”的美国专利号5,702,359中公开了针阵列，其中多对针可以在治疗过程中脉冲。在如同完整阐述的通过引用方式并入本文的该申请中，针以圆形阵列布置，但具有连接器和开关装置，能够在相对的针电极对之间产生脉冲。可以使用一对用于将重组表达载体递送至细胞的针状电极。此种设备和***描述于美国专利号6,763,264中，其内容通过引用并入本文。替代性地，可以使用单针装置，允许用类似于普通注射针的单针注射DNA和电穿孔，并施加比目前使用的装置递送的电压低的脉冲电压，从而减轻患者经历的电感觉。

MID可以包括一个或多个电极阵列。阵列可以包括两个或更多个相同直径或不同直径的针。针可以均匀或不均匀地间隔开。针可以在0.005英寸和0.03英寸之间，在0.01英寸和0.025英寸之间；或在0.015英寸和0.020英寸之间。针的直径可以是0.0175英寸。针可以间隔0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm或更多。

MID可以由脉冲发生器和两个或多个针组合物注射器组成，其在单个步骤中递送组合物和电穿孔脉冲。脉冲发生器可以允许经由闪存卡操作的个人计算机对脉冲和注射参数进行灵活的编程，以及电穿孔和患者数据的全面记录和存储。脉冲发生器可以在短时间内递送各种伏特脉冲。例如，脉冲发生器可以递送三个持续时间为100ms的15伏脉冲。此种MID的实例是美国专利号7,328,064中描述的ELGEN 1000***，其内容通过引用并入本文。

MID可以是CELLECTRA(INOVIO Pharmaceuticals)设备和***，其是模块化电极***，有助于将大分子(例如DNA)引入机体或植物中选定组织的细胞中。模块化电极***可以包括多个针电极；皮下注射针；提供从可编程恒流脉冲控制器到多个针电极的导电链路的电连接器；和电源。操作者可以抓住安装在支撑结构上的多个针电极并将它们牢固地***机体或植物中的选定组织中。然后经由皮下注射针将大分子递送到选定的组织中。可编程恒流脉冲控制器被激活并且恒流电脉冲被施加到多个针电极。施加的恒流电脉冲有助于将大分子引入多个电极之间的细胞中。借助恒流脉冲限制组织中的功率耗散，可最大限度地减少因细胞过热导致的细胞死亡。Cellectra设备和***描述于美国专利号7,245,963中，其内容通过引用并入本文。MID可以是ELGEN 1000***(INOVIO Pharmaceuticals)。ELGEN1000***可以包括提供空心针的装置；和流体递送装置，其中该设备适于在使用中驱动流体递送装置，以便在将针***所述机体组织期间同时(例如自动地)将流体(本文所述的组合物)注射到机体组织中。优点是能够在***针时逐渐注入流体，从而使流体更均匀地分布在机体组织中。还据信，由于注射的流体体积在更大面积上的分布，注射期间经历的疼痛减少。

此外，流体的自动注射有助于自动监测和记录注射的实际流体剂量。如果期望，该数据可以由控制单元存储以用于存档目的。

应当理解，注射速率可以是线性的或非线性的，并且注射可以在针已经穿过待治疗受试者的皮肤***并且同时它们被进一步***机体组织(如肿瘤组织、皮肤组织、肝组织、肌肉组织等)中时进行。

该设备进一步包括用于引导针***机体组织的针***装置。流体注射的速率由针***的速率控制。这具有可以控制针***和流体注射的优点，使得***速率可以根据期望与注射速率相匹配。它还使用户更容易操作该装置。如果期望，可以提供将针自动***机体组织的装置。

用户可以选择何时开始注入流体。然而，理想地，当针尖已经到达肌肉组织时开始注射，并且该设备可以包括用于传感针何时已经***到足以开始注射流体的深度的手段。这意味着当针到达期望深度(通常是肌肉组织开始的深度)时，可以提示流体注射自动开始。肌肉组织开始处的深度例如可以被认为是预设的针***深度，例如4mm的值，这将被认为足以使针穿过皮肤层。

传感手段可以包括超声探头。传感手段可以包括用于传感阻抗或电阻变化的手段。在这种情况下，该手段本身可能不会记录针在机体组织中的深度，而是适于在针从不同类型的机体组织移动到肌肉中时传感阻抗或阻力的变化。这些替代方案中的任何一个都提供了相对准确且操作简单的传感注射可能开始的手段。如果期望，可以进一步记录针的***深度，并且可以用于控制流体的注射，使得待注射的流体体积随着针***深度的记录而确定。

该装置可以进一步包括：用于支撑针的底座；以及用于在其中接收底座的外壳，其中底座相对于外壳是可移动的，使得当底座处于相对于外壳的第一向后位置时针缩回外壳内，并且当底座处于外壳内的第二向前位置时针伸出外壳。这对用户来说是有利的，因为外壳可以在患者的皮肤上排成一行，然后可以通过相对于底座移动外壳来将针***患者的皮肤中。

如上所述，期望实现受控的流体注射速率，使得流体在针***皮肤时均匀地分布在针的长度上。流体递送装置可以包括适于以受控速率注入流体的活塞驱动装置。活塞驱动装置可以例如由伺服马达启动。然而，活塞驱动装置可以通过相对于壳体在轴向方向上移动的基座来驱动。应当理解，可以提供用于流体递送的替代装置。因此，例如，可以在注射器和活塞***的位置提供可以被挤压用于以受控或非受控速率递送流体的密闭容器。

上述装置可以用于任何类型的注射。然而，预期其在电穿孔领域特别有用，因此其可以进一步包括用于向针施加电压的装置。这使得针不仅可以用于注射，还可以在电穿孔过程中用作电极。这是特别有利的，因为这意味着电场被施加到与注入流体相同的区域。传统上，电穿孔存在着问题，即很难将电极与先前注入的流体准确对齐，因此用户倾向于在较大面积上注入比所需体积更大的流体，并在更高的区域施加电场以尝试保证注入物质和电场之间的重叠。使用本发明，可以减少注入的流体体积和施加的电场的大小，同时实现电场和流体之间的良好匹配。

不管用于将外源核酸引入宿主细胞的方法如何，为了确认重组核酸序列在宿主细胞中的存在，可以进行多种测定。此类测定包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，例如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生化”测定，例如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学方法(ELISA和Western印迹)或本领域技术人员已知的其他测定。

在一个实施方案中，本发明描述了编码ACE-tRNA的MC和CEDT在人无义CF细胞培养模型中挽救CFTRmRNA表达和通道功能的有效性。例如，在将编码ACE-tRNA的MC和CEDT递送至p.G542X、p.R1 162X、p.W1282X 16HBE14oe-细胞后，通过qPCR确定从NMD中挽救的CFTRmRNA表达，并通过Ussing室记录评估CFTR功能。还公开了经由多种方式增强微型载体治疗能力，包括(1)使用转录增强5’前导序列(TELS)文库来增加ACE-tRNA表达和(2)使用DNA靶向序列文库(DTS)以增加核靶向和转录生物利用度。

因此，本发明的DNA微型载体(MC或CEDT)包含启动子和编码反密码子编辑的tRNA的核酸序列。DNA微型载体进一步包含选自TELS、DTS、ABS和报告核酸序列的一个或两个或三个或四个DNA序列。

在一个实施方案中，DNA微型载体包含启动子、编码反密码子编辑的tRNA的序列和TELS。

在一个实施方案中，DNA微型载体包含启动子、编码反密码子编辑的tRNA的序列、TELS和DTS。

在一个实施方案中，DNA微型载体包含启动子、编码反密码子编辑的tRNA的序列、TELS、DTS和ABS。

在一个实施方案中，DNA微型载体包含启动子、编码反密码子编辑的tRNA的序列、TELS、DTS、ABS和报告序列。

在本文所述的DNA微型载体中的任一者中，DNA微型载体是MC。

在本文所述的DNA微型载体中的任一者中，DNA微型载体是CEDT。

在另一个实施方案中，本发明描述了编码ACE-tRNA的质粒、MC和CEDTS在p.G542X-CFTR和p.W1282X-CFTR小鼠气道上皮细胞中的无义抑制的有效性和持久性。可以使用电场将表达ACE-tRNA的cDNA质粒、MC和CEDT递送至野生型、p.G542X-CFTR和p.W1282X-CFTR小鼠肺部。稳态CFTR mRNA表达可以通过qPCR和CFTR蛋白通过免疫荧光(IF)和Western印迹(WB)来测量。载体的细胞特异性递送可以通过解剖肺段中的荧光原位杂交(FISH)来确定。可以在单次递送后的42天内评估终点。通过随后在7天、14天和1、2、6和12个月递送PTC报告载体以及ACE-tRNA条形码序列的qPCR，可以在野生型小鼠肺中量化来自载体的ACE-tRNA表达的持久性。

在又一个实施方案中，本发明描述了在递送到其他较大实验室动物的肺部后在MC和CEDT中编码的ACE-tRNA的效率和持久性。野生型动物可以通过电场脉冲接受MC和CEDT。通过随后递送PTC报告载体和ACE-tRNA条形码序列的qPCR与荧光原位杂交(FISH)和免疫荧光(IF)配对，可以确定ACE-tRNA表达的持久性和递送的肺图谱长达6个月。

疾病状况和治疗方法

本公开的某些实施方案提供了治疗哺乳动物(诸如人)中与PTC相关的疾病或病症的方法，包括向哺乳动物施用编码本文所述的治疗剂(诸如，ACE-tRNA)的载体。本公开的某些实施方案提供了如本文所述的治疗剂或编码治疗剂的载体在制备可用于治疗哺乳动物疾病的药物中的用途。

与PTC相关的疾病或病症包括但不限于肌营养不良蛋白中的PTC引起的杜氏肌营养不良和贝克肌营养不良的变体、RBI中的PTC引起的视网膜母细胞瘤、NF1或NF2中的PTC引起的神经纤维瘤、ATM中的PTC引起的共济失调-毛细血管扩张、HEXA中的PTC引起的泰-萨二氏病、CFTR中的PTC引起的囊性纤维化、WT1中的PTC引起的威尔姆氏瘤、因子VIII中的PTC引起的甲型血友病、因子IX中的PTC引起的乙型血友病、p53中的PTC引起的p53相关癌症、门克斯病、乌尔里希氏病、β珠蛋白中的PTC引起的β-地中海贫血、Willebrand因子中的PTC引起的2A型和3型血管性血友病、Robinow综合征、B型短指(指和掌骨的缩短)、IFNGR1中的PTC引起的遗传性分枝杆菌感染易感性、CRX中的PTC引起的遗传性视网膜疾病、凝血因子X中的PTC引起的遗传性出血倾向、视紫红质中的PTC引起的遗传性失明、SOX10中的PTC引起的先天性感觉神经性耳聋和结肠无神经节病，以及SOX10中的PTC引起的遗传性神经发育-智力缺陷，包括感觉神经性耳聋、结肠无神经节病、周围神经病和中枢性髓鞘形成不良性脑白质营养不良、Liddle综合征、着色性干皮病、范可尼贫血、贫血、甲状腺功能减退、p53相关癌症(例如，p53鳞状细胞癌、p53肝细胞癌、p53卵巢癌)、食管癌、骨癌、卵巢癌、肝细胞癌、乳腺癌、肝细胞癌、纤维组织细胞瘤、卵巢癌、SRY性反转、磷酸丙糖异构酶-贫血、糖尿病和佝偻病以及许多其他疾病。本发明在一个实施方案中包括用于通过引入本发明的ACE-tRNA逆转与无义突变相关的存在的突变的影响来治疗囊性纤维化的组合物和方法。其他病症包括Hurler综合征、Dravet综合征、脊髓性肌营养不良症、Usher综合征、无虹膜、无脉络膜、眼部缺损、色素性视网膜炎、营养不良性大疱性表皮松解、弹性假黄瘤、Alagille综合征、Waardenburg-Shah、婴儿神经元蜡样脂褐质沉着症、胱氨酸病、X连锁肾源性尿崩症和多囊肾病。

可以通过本文所述的DNA分子和方法治疗的与PTC相关的疾病或病症还包括多种眼病。具有特定突变的疾病和基因的实例包括：

锥体营养不良(斯特格病(STGD1)、锥-杆营养不良、色素性视网膜炎(RP)以及对年龄相关性黄斑变性的易感性增加)：KCNV2 Glu143X；KCNV2 Glu306X；KCNV2 Gln76X；KCNV2Glul48X；CACNA2D4，Tyr802X；CACNA2D4，Arg628X；RP2，Arg120X；Rho，Ser334X；Rpe65，Arg44X；PDE6A、Lys455X；

先天性静止性夜盲2(CSNB2)：CACNA1F，Arg958X；CACNA1F，Arg830X

先天性静止性夜盲1(CSNB1)：TRPM1、Gln11X；TRPM1、Lys294X；TRPM1，Arg977X；TRPM1，Ser882X；NYX，W350X

Best病或BVMD，BEST1、Tyr29X；BEST1，Arg200X；BEST1，Ser517X

Leber先天性黑矇(LCA)：KCNJ13，Trp53X；KCNJ13，Arg166X；CEP290，Arg151X；CEP290，Gly1890X；CEP290，Lys1575X；CEP290，Arg1271X；CEP290，Arg1782X；CRB1，Cys1332X；GUCY2D，Ser448X；GUCY2D，Arg41091X；LCA5，Gln279X；RDH12，Tyr194X；RDH12，Glu275X；SPATA7，Arg108X；TULP1，Gln301X；

Usher综合征1：USH1C，Arg31X；PCDH15，Arg3X；PCDH15，Arg245X；PCDH15，Arg643X；PCDH15，Arg929X；IQCB1，Arg461X；IQCB1，Arg489X；PDE6A，Gln69X；ALMS1，Ser999X；ALMS1，Arg3804X；

无虹膜：Pax6，Gly194X

眼部缺损：Pax2，Arg139X；Lamb1，Arg524X

无脉络膜：REP1，Gln32X

根据一个方面，提供了用于在哺乳动物接受者中表达治疗剂的细胞表达***。表达***(在本文中也称为“遗传修饰的细胞”)包含细胞和用于表达治疗剂的表达载体。表达载体包括但不限于病毒、质粒和其他用于将异源遗传物质递送至细胞的媒介物。因此，本文所用的术语“表达载体”是指用于将异源遗传物质递送至细胞的媒介物。特别地，表达载体是CEDT或MC微型载体。表达载体的其他实例包括重组腺病毒、腺相关病毒或慢病毒或逆转录病毒载体。

表达载体进一步包括用于控制异源基因转录的启动子。启动子可以是诱导型启动子。该表达***适合施用于哺乳动物接受者。表达***可以包含多个非永生化遗传修饰细胞，每个细胞含有至少一个编码至少一个治疗剂的重组基因。

细胞表达***可以在体内形成。根据另一方面，提供了在体内治疗哺乳动物接受者的方法。该方法包括将用于表达异源基因产物的表达载体原位引入患者的细胞中，例如通过静脉内施用。为了在体内形成表达***，将用于表达治疗剂的表达载体在体内引入哺乳动物接受者静脉内。

根据另一方面，提供了在体内治疗哺乳动物接受者的方法。该方法包括将靶标治疗剂体内引入患者体内。用于表达异源基因的表达载体可以包括用于控制异源基因产物转录的诱导型启动子。因此，通过将细胞原位暴露于诱导异源基因转录的条件来控制治疗剂的原位递送。

本公开提供了通过向细胞或患者施用编码ACE-tRNA的表达载体来治疗受试者(例如，哺乳动物)的疾病的方法。对于基因治疗方法，分子生物学和基因疗法领域的普通技术人员将能够在无需过度实验的情况下确定本公开的新方法中使用的表达载体的合适剂量和施用途径。

在某些实施方案中，本文所述的药剂和方法可以用于治疗/管理由PTC引起的疾病。实例包括但不限于杜氏和贝克肌营养不良症、视网膜母细胞瘤、神经纤维瘤病、共济失调-毛细血管扩张症、泰-萨二氏病、威尔姆氏瘤、甲型血友病、乙型血友病、门克斯病、乌尔里希氏病、β-地中海贫血、2A型和3型血管性血友病、Robinow综合征、B型短指(指和掌骨的缩短)、遗传性分枝杆菌感染易感性、遗传性视网膜疾病、遗传性出血倾向、遗传性失明、先天性感觉神经性耳聋和结肠无神经节病以及遗传性神经发育-智力缺陷，包括感觉神经性耳聋、结肠无神经节病、周围神经病和中枢性髓鞘形成不良性脑白质营养不良、Liddle综合征、着色性干皮病、范可尼贫血、贫血、甲状腺功能减退、p53相关癌症(例如，p53鳞状细胞癌、p53肝细胞癌、p53卵巢癌)、食管癌、骨癌、卵巢癌、肝细胞癌、乳腺癌、肝细胞癌、纤维组织细胞瘤、卵巢癌、SRY性反转、磷酸丙糖异构酶-贫血、糖尿病和佝偻病。这种疗法的优势在于它提供了改进的终止密码子抑制特异性。本发明的治疗性ACE-tRNA靶向特定的终止密码子，例如TGA，从而减少与疾病无关的终止密码子的脱靶效应。本疗法的优点还在于它提供了氨基酸特异性。表达的tRNA经工程改造用于专门替换经由疾病终止密码子的***而丢失的氨基酸，从而消除对蛋白质稳定性、折叠和运输的任何乱真效应。

在某些实施方案中，本***是模块化的，因此可以针对每一种可能的疾病PTC“个性化”。例如，人基因组中有九个单独的色氨酸tRNA可被Trp合成酶识别，所有这些tRNA都抑制mRNA UGG密码子。因此，这九种Trp tRNA中的每一种都提供了密码子重新编辑耐受性(UGG→UGA)的机会。此外，鉴于它们在遗传密码中接近终止密码子，精氨酸密码子突变为PTC无义密码子在疾病中很常见。有超过三十种Arg tRNA可以测试密码子编辑耐受性和抑制功效。编码精氨酸的ACE-tRNA是治疗所有Arg-＞PTC突变的可行疗法，与基因无关。事实上，35％的LCA是由无义突变引起的，其中大部分是精氨酸终止。本发明的另一个优点是其提供了容易的表达和细胞特异性递送，因为整个***(tRNA+启动子序列)是紧凑的。

配制剂

一旦根据本发明产生的载体或另一种形式的DNA已经生成并纯化到足够的量，本发明的方法可以进一步包括其作为DNA组合物，例如治疗性DNA组合物的配制剂。治疗性DNA组合物包含上述类型的治疗性DNA分子。此类组合物可以包含治疗有效量的DNA，其形式适合通过期望途径施用，例如气雾剂、可注射组合物或适合口服、黏膜或局部施用的配制剂。

可以使用本领域技术人员可获得的标准药物配制剂化学和方法完成作为常规药物制剂的DNA的配制剂。可以使用任何药学上可接受的载剂或赋形剂。辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等，可存在于赋形剂或媒介物中。这些赋形剂、赋形剂和辅助物质通常是药剂，它们可以在没有过度毒性的情况下施用，并且在疫苗组合物的情况下不会在接受该组合物的个体中诱导免疫应答。合适的载剂可以是脂质体。

药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体，诸如水、盐水、聚乙二醇、透明质酸、甘油和乙醇。其中还可以包括药学上可接受的盐，矿物酸盐诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸盐诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。还优选的是，尽管不是必需的，制剂将含有用作稳定剂的药学上可接受的赋形剂，特别是对于肽、蛋白质或其他类似分子(如果它们包含在组合物中)。也充当肽稳定剂的合适载剂的实例包括但不限于药用级的右旋糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、葡聚糖等。其他合适的载剂包括但不限于淀粉、纤维素、磷酸钠或磷酸钙、柠檬酸、酒石酸、甘氨酸、高分子量聚乙二醇(PEG)及其组合。REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中对药学上可接受的赋形剂、媒介物和辅助物质进行了详尽的讨论，其通过引用并入本文。

可以施用本发明的药剂(例如，微型载体)以导致与遗传病(例如，囊性纤维化)相关的至少一种症状减轻。施用量根据各种因素而变化，包括但不限于所选的组合物、特定疾病、体重、身体状况和受试者的年龄，以及是否要实现预防或治疗。此类因素可以由临床医生使用动物模型或本领域熟知的其他测试***容易地确定。

本发明设想通过施用药剂例如本发明公开的ACE-tRNA或表达载体来治疗与PTC相关的疾病或病症。根据本发明的治疗剂的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如接受者的生理状况、施用的目的是治疗性还是预防性的，以及技术人员已知的其他因素。本发明药剂的施用可以在预先选择的时间段内基本上是连续的，或者可以是一系列间隔剂量。考虑了局部和全身施用。

一种或多种具有本发明治疗剂的合适的单位剂型，如下文所讨论的，可以任选地配制用于缓释(例如使用微囊化)，可以通过多种途径施用，包括胃肠外途径，包括通过静脉内和肌肉内途径，以及直接注射到患病组织中。在适当的情况下，配制剂可以方便地以离散的单位剂型存在并且可以通过制药学众所周知的任何方法来制备。此类方法可以包括将治疗剂与液体载剂、固体基质、半固体载剂、细分的固体载剂或其组合结合的步骤，然后，如果需要，将产物引入或成形为期望的递送***。

当本发明的治疗剂制备用于施用时，它们可以与药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合以形成药物配制剂或单位剂型。此类配制剂中的总活性成分占配制剂重量的0.1％至99.9％。药学上可接受的载剂可以是与配制剂的其他成分相容并且对其接受者无害的载剂、稀释剂、赋形剂和/或盐。用于施用的活性成分可以作为粉末或作为颗粒；作为溶液、混悬液或乳剂存在。

含有本发明的治疗剂的药物配制剂可以通过本领域已知的程序使用熟知且容易获得的成分来制备。本发明的治疗剂也可以配制成适于胃肠外施用，例如通过肌肉内、皮下或静脉内途径的溶液。本发明治疗剂的药物配制剂也可以采用水溶液或无水溶液或分散体的形式，或替代性地采用乳剂或混悬液的形式。

因此，治疗剂可以配制用于胃肠外施用(例如，通过注射，例如推注或连续输注)并且可以以单位剂量形式存在于安瓿、预填充注射器、小体积输注容器中或添加防腐剂的多剂量容器中。活性成分可以采用油性或水性媒介物中的混悬液、溶液或乳剂等形式，并且可以包含配制剂，例如混悬剂、稳定剂和/或分散剂。替代性地，活性成分可以是粉末形式，通过无菌分离无菌固体或通过从溶液中冻干获得，用于在使用前用合适的媒介物例如无菌、无热原的水配制。

应当理解，每种剂型的单个气雾剂剂量中所含的一种或多种活性成分的单位含量本身不需要构成治疗特定适应症或疾病的有效量，因为必要的有效量可以通过多个剂量单位的施用实现。此外，有效量可以使用小于剂型中的剂量来实现，无论是在单独地施用还是在一系列施用中。

本发明的药物配制剂可以包括作为任选成分的药学上可接受的载剂、稀释剂、增溶剂或乳化剂以及本领域熟知类型的盐。可用于本发明的药物配制剂的载剂和/或稀释剂的具体非限制性实例包括水和生理上可接受的缓冲盐溶液，例如磷酸盐缓冲盐溶液pH7.0-8.0和水

纳米颗粒组合物

在一些实施方案中，本文公开的药物组合物被配制为脂质纳米颗粒(LNP)，例如WO2020263883、WO2013123523、WO2012170930、WO2011127255和WO2008103276；和US20130171646中描述的那些，其中每个均通过整体引用并入本文。因此，本公开提供纳米颗粒组合物，其包含(i)包含递送剂的脂质组合物，和(ii)至少一个核酸，例如ACE-tRNA或编码ACE-tRNA的DNA，例如MC或CEDT。在这样的纳米颗粒组合物中，本文公开的脂质组合物可以封装核酸。

纳米颗粒组合物的尺寸通常为微米量级或更小，并且可以包括脂质双层。纳米颗粒组合物涵盖脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体(例如，脂质囊泡)和脂质复合物。例如，纳米颗粒组合物可以是具有直径为500nm或更小的脂质双层的脂质体。

纳米颗粒组合物包括例如脂质纳米颗粒、脂质体和脂质复合物。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物是包括一个或多个脂质双层的囊泡。在某些实施方案中，纳米颗粒组合物包括两个或更多个由含水隔室分隔的同心双层。脂质双层可以被功能化和/或相互交联。脂质双层可以包括一个或多个配体、蛋白质或通道。

在一个实施方案中，脂质纳米颗粒包含可电离脂质、结构脂质、磷脂和感兴趣的核酸。在一些实施方案中，LNP包含可电离脂质、PEG修饰的脂质、甾醇和结构脂质。在一些实施方案中，LNP具有约20％-60％可电离脂质：约5％-25％结构脂质：约25％-55％甾醇的摩尔比；和约0.5％-15％PEG修饰的脂质。

在一些实施方案中，LNP具有小于0.4的多分散性值。在一些实施方案中，LNP在中性pH下具有净中性电荷。在一些实施方案中，LNP具有50-150nm的平均直径。在一些实施方案中，LNP具有80-100nm的平均直径。

如本文一般定义，术语“脂质”是指具有疏水或两亲性质的小分子。脂质可以是天然存在的或合成的。脂质类别的实例包括但不限于脂肪、蜡、含甾醇的代谢物、维生素、脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、糖脂和聚酮化合物，以及异戊烯醇脂质。在一些情况下，一些脂质的两亲特性导致它们在水性介质中形成脂质体、囊泡或膜。

在一些实施方案中，脂质纳米颗粒可以包含可电离脂质。如本文所用，术语“可电离脂质”具有其在本领域中的通常含义并且可以指包含一个或多个带电部分的脂质。在一些实施方案中，可电离脂质可以带正电或带负电。可电离脂质可以带正电荷，在这种情况下，它可以称为“阳离子脂质”。在某些实施方案中，可电离脂质分子可以包含胺基，并且可以称为可电离氨基脂质。如本文所用，“带电部分”是携带形式电子电荷的化学部分，例如单价(+1或-1)、二价(+2或-2)、三价(+3或-3)等。带电部分可以是阴离子的(即带负电的)或阳离子的(即带正电的)。带正电荷的部分的实例包括胺基(例如，伯胺、仲胺和/或叔胺)、铵基、吡啶基、胍基和咪唑基。在特定实施方案中，带电部分可以包含胺基。带负电的基团或其前体的实例包括羧酸盐基、磺酸盐基、硫酸盐基、膦酸盐基、磷酸盐基、羟基等。在某些情况下，带电部分的电荷可以随环境条件而变化，例如，pH值的变化可以改变该部分的电荷，和/或导致该部分带电或不带电。通常，可以根据期望选择分子的电荷密度。

在一些实施方案中，可电离脂质是可电离氨基脂质，有时在本领域中称为“可电离阳离子脂质”，在一个实施方案中，可电离氨基脂质可以具有经由接头结构连接的带正电荷的亲水头和疏水尾。除了这些之外，可电离脂质还可以是包括环状胺基的脂质。在一个实施方案中，可电离脂质可以选自但不限于WO2013086354和WO2013116126中描述的可电离脂质；其中每个的内容均通过整体引用并入本文。在又一个实施方案中，可电离脂质可以选自但不限于美国专利号7,404,969的式CLI-CLXXXXII；其中每个均通过整体引用并入本文。

在一个实施方案中，脂质可以是可裂解的脂质，例如WO2012170889中描述的那些，其通过整体引用并入。在一个实施方案中，脂质可以通过本领域已知的方法和/或如WO2013086354中所述的方法合成，其中每个的内容均通过整体引用并入本文。

纳米颗粒组合物可以通过多种方法表征。例如，显微镜(例如，透射电子显微镜或扫描电子显微镜)可以用于检查纳米颗粒组合物的形态和尺寸分布。动态光散射或电位测定法(例如，电位滴定法)可以用于测量zeta电位。动态光散射也可以用于确定粒径。Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd，Malvern，Worcestershire，UK)等仪器也可以用于测量纳米颗粒组合物的多种特性，例如粒径、多分散指数和zeta电位。纳米颗粒的大小可以帮助对抗生物反应，例如但不限于炎症，或者可以增加多核苷酸的生物效应。如本文所用，纳米颗粒组合物上下文中的“尺寸”或“平均尺寸”是指纳米颗粒的平均直径。

在一个实施方案中，本文所述的核酸可以配制在直径为约10nm至约100nm的脂质纳米颗粒中。在一个实施方案中，纳米颗粒具有约10nm至500nm的直径。在一个实施方案中，纳米颗粒具有大于100nm的直径。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的最大尺寸为1μm或更短(例如，1μm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、175nm、150nm、125nm、100nm、75nm、50nm或更短)。

纳米颗粒组合物可以是相对均匀的。多分散性指数可以用于指示纳米颗粒组合物的均匀性，例如纳米颗粒组合物的粒度分布。小的(例如，小于0.3)多分散指数通常表示狭窄的粒度分布。纳米颗粒组合物可以具有约0至约0.25的多分散指数，例如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25。在一些实施方案中，本文公开的纳米颗粒组合物的多分散指数可以从约0.10至约0.20。

纳米颗粒组合物的zeta电位可以用于指示组合物的电动电位。例如，zeta电位可以描述纳米颗粒组合物的表面电荷。具有相对低电荷(正电荷或负电荷)的纳米颗粒组合物通常是期望的，因为更高电荷的物质可能与细胞、组织和机体中的其他元素发生不期望的相互作用。在一些实施方案中，本文公开的纳米颗粒组合物的zeta电位可以从约-10mV至约+20mV、约-10mV至约+15mV、约10mV至约+10mV、约-10mV至约+5mV、约-10mV至约0mV、约-10mV至约-5mV、约-5mV至约+20mV、约-5mV至约+15mV、约-5mV至约+10mV、约-5mV至约+5mV、约-5mV至约0mV、约0mV至约+20mV、约0mV至约+15mV、约0mV至约+10mV、约0mV至约+5mV、约+5mV至约+20mV、约+5mV至约+15mV、或约+5mV至约+10mV。

核酸/多核苷酸的术语“封装效率”描述了相对于提供的初始量，在制备后被纳米颗粒组合物封装或以其他方式与纳米颗粒组合物结合的核酸/多核苷酸的量。如本文所用，“封装”可以指完全的、基本的或部分的封闭、限制、包围或包入。封装效率期望较高(例如，接近100％)。封装效率可以例如通过比较在用一种或多种有机溶剂或去污剂破碎纳米颗粒组合物之前和之后的含有纳米颗粒组合物的溶液中的核酸/多核苷酸的量来测量。

荧光可以用于测量溶液中游离多核苷酸的量。对于本文所述的纳米颗粒组合物，核酸/多核苷酸的封装效率可以是至少50％，例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，封装效率可以是至少80％。在某些实施方案中，封装效率可以是至少90％。

本文公开的药物组合物中存在的核酸/多核苷酸的量可以取决于多种因素，例如核酸/多核苷酸的大小、期望的靶标和/或应用、或纳米颗粒组合物的其他性质以及核酸/多核苷酸的特性。例如，可用于纳米颗粒组合物的核酸/多核苷酸的量可以取决于核酸/多核苷酸的大小(表示为长度或分子量)、序列和其他特征。纳米颗粒组合物中核酸/多核苷酸的相对量也可以变化。可以根据功效和耐受性的考虑来优化本公开的脂质纳米颗粒组合物中存在的脂质组合物和核酸/多核苷酸的相对量。

除了提供纳米颗粒组合物之外，本公开还提供了产生脂质纳米颗粒的方法，包括封装多核苷酸。此类方法包括使用本文公开的药物组合物中的任一者并根据本领域已知的产生脂质纳米颗粒的方法产生脂质纳米颗粒。参见例如，Wang等人(2015)“Delivery ofoligonucleotides with lipid nanoparticles”Adv.Drug Deliv.Rev.87：68-80；Silva等人(2015)“Delivery Systems for Biopharmaceuticals.Part I：Nanoparticles andMicroparticles”Curr.Pharm.Technol.16：940-954；Naseri等人(2015)“Solid LipidNanoparticles and Nanostructured Lipid Carriers：Structure，Preparation andApplication”Adv.Pharm.Bull.5：305-13；Silva等人(2015)“Lipid nanoparticles forthe delivery of biopharmaceuticals”Curr.Pharm.Biotechnol.16：291-302，以及其中引用的参考文献。

脂质纳米颗粒配制剂通常包含一种或多种脂质。在一些实施方案中，脂质是可电离脂质(例如，可电离氨基脂质)，有时在本领域中称为“可电离阳离子脂质”。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒配制剂进一步包含其他组分，包括磷脂、结构脂质和能够减少颗粒聚集的分子，例如PEG或PEG修饰的脂质。

示例性可电离脂质包括但不限于本文公开的化合物1-342中的任一种，DLin-MC₃-DMA(MC₃)、DLin-DMA、DLenDMA、DLin-D-DMA、DLin-K-DMA、DLin-M-C2-DMA、DLin-K-DMA、DLin-KC2-DMA、DLin-KC₃-DMA、DLin-KC4-DMA、DLin-C2K-DMA、DLin-MP-DMA、DODMA、98N12-5、C₁2-200、DLin-C-DAP、DLin-DAC、DLinDAP、DLinAP、DLin-EG-DMA、DLin-2-DMAP、KL10、KL22、KL25、辛基-CLinDMA、辛基-CLinDMA(2R)、辛基-CLinDMA(2S)，及其任何组合。其他示例性可电离脂质包括(13Z，16Z)-N，N-二甲基-3-壬基二十二烷-13，16-二烯-1-胺(L608)、(20Z，23Z)-N，N-二甲基二十九烷-20，23-二烯-10-胺、(17Z，20Z)-N，N-二甲基二十六烷-17，20-二烯-9-胺、(16Z，19Z)-N5N-二甲基二十五烷-16，19-二烯-8-胺、(13Z，16Z)-N，N-二甲基二十二烷-13，16-二烯-5-胺、(12Z，15Z)-N，N-二甲基二十一烷-12，15-二烯-4-胺、(14Z，17Z)-N，N-二甲基二十三烷-14，17-二烯-6-胺、(15Z，18Z)-N，N-二甲基二十四烷-15，18-二烯-7-胺、(18Z，21Z)-N，N-二甲基二十七烷-18，21-二烯-10-胺、(15Z，18Z)-N，N-二甲基二十四烷-15，18-二烯-5-胺、(14Z，17Z)-N，N-二甲基二十三烷-14，17-二烯-4-胺、(19Z，22Z)-N，N-二甲基二十八烷-19，22-二烯-9-胺、(18Z，21Z)-N，N-二甲基二十七烷-18，21-二烯-8-胺、(17Z，20Z)-N，N-二甲基二十六烷-17，20-二烯-7-胺、(16Z，19Z)-N，N-二甲基二十五烷-16，19-二烯-6-胺、(22Z，25Z)-N，N-二甲基三十一烷-22，25-二烯-10-胺、(21Z，24Z)-N，N-二甲基三十烷-21，24-二烯-9-胺、(18Z)-N，N-二甲基二十七烷-18-烯-10-胺、(17Z)-N，N-二甲基二十六烷-17-烯-9-胺、(19Z，22Z)-N，N-二甲基二十八烷-19，22-二烯-7-胺、N，N-二甲基二十七烷-10-胺、(20Z，23Z)-N-乙基-N-甲基二十九烷-20，23-二烯-10-胺、1-[(11Z，14Z)-1-壬基二十烷-11，14-二烯-1-基]吡咯烷、(20Z)-N，N-二甲基二十七烷-20-烯-10-胺、(15Z)-N，N-二甲基二十七烷-15-烯-10-胺、(14Z)-N，N-二甲基二十九烷-14-烯-10-胺、(17Z)-N，N-二甲基二十九烷-17-烯-10-胺，(24Z)-N，N-二甲基三十三烷-24-烯-10-胺、(20Z)-N，N-二甲基二十九烷-20-烯-10-胺、(22Z)-N，N-二甲基三十一烷-22-烯-10-胺、(16Z)-N，N-二甲基二十五烷-16-烯-8-胺、(12Z，15Z)-N，N-二甲基-2-壬基二十一烷-12，15-二烯-1-胺、N，N-二甲基-1-『(1S，2R)-2-辛基环丙基]十七烷-8-胺、l-[(1S，2R)-2-己基环丙基]-N，N-二甲基十九烷-10-胺、N，N-二甲基-1-[(1S，2R)-2-辛基环丙基]十九烷-10-胺、N，N-二甲基-21-[(1S，2R)-2-辛基环丙基]二十二烷-10-胺、N，N-二甲基-1-[(1S，2S)-2-{[(1R，2R)-2-戊基环丙基]甲基}环丙基]十九烷-10-胺、N，N-二甲基-1-[(1S，2R)-2-辛基环丙基]十六烷-8-胺、N，N-二甲基-[(1R，2S)-2-十一环丙基]十四烷-5-胺、N，N-二甲基-3-{7-[(1S，2R)-2-辛基环丙基]庚基}十二烷-1-胺、1-[(1R，2S)-2-庚基环丙基]-N，N-二甲基十八烷-9-胺、1-[(1S，2R)-2-癸基环丙基]-N，N-二甲基十五烷-6-胺、N，N-二甲基-1-[(1S，2R)-2-辛基环丙基]十五烷-8-胺、R-N，N-二甲基-1-[(9Z，12Z)-十八烷-9，12-二烯-1-基氧基]-3-(辛氧基)丙-2-胺、S-N，N-二甲基-1-[(9Z，12Z)-十八烷-9，12-二烯-1-基氧基]-3-(辛氧基)丙-2-胺、1-{2-[(9Z，12Z)-十八烷-9，12-二烯-1-基氧基]-1-[(辛氧基)甲基]乙基}吡咯烷、(2S)-N，N-二甲基-1-[(9Z，12Z)-十八烷-9，12-烯-1-基氧基]-3-[(5Z)-辛烷-5-烯-1-基氧基]丙-2-胺、1-{2-[(9Z，12Z)-十八烷-9，12-烯-1-基氧基]-1-[(辛氧基)甲基]乙基}氮杂环丁烷、(2S)-1-(己氧基)-N，N-二甲基-3-[(9Z，12Z)-十八烷-9，12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、(2S)-1-(庚氧基)-N，N-二甲基-3-[(9Z，12Z)-十八烷-9，12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、N，N-二甲基-1-(壬氧基)-3-[(9Z，12Z)-十八烷-9，12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、N，N-二甲基-1-[(9Z)-十八烷-9-烯-1-基氧基]-3-(辛氧基)丙-2-胺、(2S)-N，N-二甲基-1-[(6Z，9Z，12Z)-十八烷-6，9，12-三烯-1-基氧基]-3-(辛氧基)丙-2-胺、(2S)-1-[(11Z，14Z)-二十烷-11，14-二烯-1-基氧基]-N，N-二甲基-3-(戊氧基)丙-2-胺、(2S)-1-(己氧基)-3-[(11Z，14Z)-二十烷-11，14-二烯-1-基氧基]-N，N-二甲基丙-2-胺、1-[(11Z，14Z)-二十烷-11，14-二烯-1-基氧基]-N，N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、1-[(13Z，16Z)-二十二烷-13，16-二烯-1-基氧基]-N，N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、(2S)-1-[(13Z，16Z)-二十二烷-13，16-二烯-1-基氧基]-3-(己氧基)-N，N-二甲基丙-2-胺、(2S)-1-[(13Z)-二十二烷-13-烯-1-基氧基]-3-(己氧基)-N，N-二甲基丙-2-胺、1-[(13Z)-二十二烷-13-烯-1-基氧基]-N，N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、1-[(9Z)-十六烷-9-烯-1-基氧基]-N，N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、(2R)-N，N-二甲基-H(1-甲基辛基)氧基]-3-[(9Z，12Z)-十八烷-9，12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、(2R)-1-[(3，7-二甲基辛基)氧基]-N，N-二甲基-3-[(9Z，12Z)-十八烷-9，12-二烯-1-基氧基]丙-2-胺、N，N-二甲基-1-(辛氧基)-3-({8-[(1S，2S)-2-{[(1R，2R)-2-戊基环丙基]甲基}环丙基]辛基}氧基)丙-2-胺、N，N-二甲基-1-{[8-(2-辛基环丙基)辛基]氧基}-3-(辛氧基)丙-2-胺、(11E，20Z，23Z)-N，N-二甲基二十九烷-11，20，2-三烯-10-胺，及其任何组合。

磷脂包括但不限于甘油磷脂，例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和磷脂酸。磷脂还包括神经鞘磷脂(phosphosphingolipid)，例如鞘磷脂(sphingomyelin)。在一些实施方案中，磷脂是DLPC、DMPC、DOPC、DPPC、DSPC、DUPC、18:0二醚PC、DLnPC、DAPC、DHAPC、DOPE、4ME 16:0 PE、DSPE、DLPE、DLnPE、DAPE、DHAPE、DOPG，及其任何组合。在一些实施方案中，磷脂是MPPC、MSPC、PMPC、PSPC、SMPC、SPPC、DHAPE、DOPG及其任何组合。在一些实施方案中，脂质组合物中磷脂(例如，DSPC)的量在约1mol％至约20mol％的范围内。

结构脂质包括甾醇和含有甾醇部分的脂质。在一些实施方案中，结构脂质包括胆固醇、粪甾醇(fecosterol)、谷甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜子甾醇、番茄碱(tomatidine)、番茄苷(tomatine)、乌索酸、α-生育酚及其混合物。在一些实施方案中，结构脂质是胆固醇。在一些实施方案中，脂质组合物中结构脂质(例如，胆固醇)的量在约20mol％至约60mol％的范围内。

PEG修饰的脂质包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸、PEG神经酰胺缀合物(例如PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG修饰的二烷基胺和PEG修饰的1，2-二酰氧基丙烷-3-胺。此类脂质也称为PEG化脂质。例如，PEG脂质可以是PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂质。在一些实施方案中，PEG-脂质是1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPE)、PEG-二甾基甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕榈油基、PEG-二油基、PEG-二硬脂基、PEG-二酰基甘酰胺(PEG-DAG)、PEG-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)或PEG-1，2-二肉豆蔻基氧丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。在一些实施方案中，PEG部分具有约1000、2000、5000、10,000、15,000或20,000道尔顿的大小。在一些实施方案中，脂质组合物中PEG-脂质的量在约0mol％至约5mol％的范围内。

在一些实施方案中，本文所述的LNP配制剂还可以包含渗透性增强剂分子。非限制性渗透增强剂分子描述于US20050222064中，其通过整体引用并入本文。

LNP配制剂可以进一步包含磷酸盐缀合物。磷酸盐缀合物可以增加体内循环时间和/或增加纳米颗粒的靶向递送。磷酸盐缀合物可以通过例如WO2013033438或US20130196948中描述的方法制备。LNP配制剂还可以含有聚合物缀合物(例如，水溶性缀合物)，如US20130059360、US20130196948和US20130072709中所述。每篇参考文献均通过整体引用并入本文。

LNP配制剂可以包含缀合物以增强纳米颗粒在受试者中的递送。此外，缀合物可以抑制受试者体内纳米颗粒的吞噬清除。在一些实施方案中，缀合物可以是从人膜蛋白CD47设计的“自身”肽(例如，Rodriguez等人，Science 2013339，971-975描述的“自身”颗粒，其通过整体引用并入本文)。正如Rodriguez等人所示，自身肽延迟了巨噬细胞介导的纳米颗粒清除，从而增强了纳米颗粒的递送。

LNP配制剂可以包含碳水化合物载剂。作为非限制性实例，碳水化合物载剂可以包括但不限于酸酐修饰的植物糖原或糖原型材料、植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精、酸酐修饰的植物糖原β-糊精(例如，WO2012109121，其通过整体引用并入)。

LNP配制剂可以包被有表面活性剂或聚合物以改善颗粒的递送。在一些实施方案中，LNP可以包被有亲水涂层，例如但不限于PEG涂层和/或具有中性表面电荷的涂层，如US20130183244中所述，其通过整体引用并入。

可以工程改造LNP配制剂以改变颗粒的表面特性，从而使脂质纳米颗粒可以穿透黏膜屏障，如美国专利号8,241,670或WO2013110028中所述，其中每个均通过整体引用并入本文。工程改造用于穿透黏液的LNP可以包含聚合物材料(即，聚合物核心)和/或聚合物-维生素缀合物和/或三嵌段共聚物。聚合材料可以包括但不限于聚胺、聚醚、聚酰胺、聚酯、聚氨基甲酸酯、聚脲、聚碳酸酯、聚(苯乙烯)、聚酰亚胺、聚砜、聚氨酯、聚乙炔、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚异氰酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈和聚芳酯。

工程改造用于穿透黏液的LNP还可以包括表面改变剂，例如但不限于阴离子蛋白(例如，牛血清白蛋白)、表面活性剂(例如，阳离子表面活性剂，例如二甲基双十八烷基溴化铵)、糖或糖衍生物(例如，环糊精)、核酸、聚合物(例如，肝素、聚乙二醇和泊洛沙姆)、黏液溶解剂(例如，N-乙酰半胱氨酸、艾蒿、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、clerodendrum、乙酰半胱氨酸、溴己新、羧甲司坦、依普拉酮、美司钠、氨溴索、索布瑞醇、多米奥醇、来托司坦、司替罗宁、硫普罗宁、凝溶胶蛋白、胸腺素b4链道酶alfa、奈替克新、厄多司坦)和各种DNase包括rhDNase。在一些实施方案中，黏液穿透性LNP可以是包含黏膜穿透增强涂层的低渗制剂。该配制剂对于其被递送至的上皮细胞可以是低渗的。低渗制剂的非限制性实例可见于例如WO2013110028中，其通过整体引用并入。

在一些实施方案中，本文所述的核酸可以配制用于控释和/或靶向递送。如本文所用，“控释”是指符合特定释放模式以实现治疗结果的药物组合物或化合物释放曲线。在一个实施方案中，可以将核酸封装到本文描述的和/或本领域已知的用于控释和/或靶向递送的递送剂中。如本文所用，术语“封装”是指封闭、包围或包入。由于涉及本发明的核酸的配制剂，封装可以是实质性的、完全的或部分的。术语“基本上封装”是指至少大于50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％的本发明的药物组合物或化合物可以被封闭、包围或包入递送剂内。“部分封装”是指小于10、10、20、30、4050或更少的本发明的药物组合物或化合物可以被封闭、包围或包封在递送剂内。

在一些实施方案中，核酸组合物可以配制用于持续释放。如本文所用，“持续释放”是指在特定时间段内符合释放速率的药物组合物或化合物。时间段可以包括但不限于小时、天、周、月和年。作为非限制性实例，本文所述的持续释放纳米颗粒组合物可以如WO2010075072、US20100216804、US20110217377、US20120201859和US20130150295中所公开的进行配制，其中每个均通过整体引用并入本文。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物可以被配制为靶标特异性的，例如在WO2008121949、WO2010005726、WO2010005725、WO2011084521、WO2011084518、US20100069426、US20120004293和US20100104655中描述的那些，其中每个均通过整体引用并入本文。

施用

上述治疗剂和组合物可以用于通过向有此需要的受试者施用本文所述的一种或多种组合物来治疗、免受和/或预防PTC相关疾病。

此类药剂和组合物可以以剂量和通过医学领域技术人员熟知的技术施用，同时考虑诸如特定受试者的年龄、性别、体重和状况的因素，以及施用途径。组合物剂量可以在1μg至10mg活性成分/kg体重/次之间，并且可以是20kg至10mg成分/kg体重/次。组合物可以每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用。有效治疗的组合物剂量数可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

可以防治性或治疗性地施用药剂或组合物。在治疗应用中，将药剂或组合物以足以引起治疗效果的量施用于有此需要的受试者。足以实现这一点的量被定义为“治疗有效剂量”。对该用途有效的量将取决于，例如，所施用的组合物方案的特定组成、施用方式、疾病的阶段和严重性、受试者的一般健康状况以及处方医师的判断。

药剂或组合物可以通过本领域熟知的方法施用，如Donnelly等人(Ann.Rev.Immunol.15：617-648(1997))、美国专利号5,580,859、美国专利号5,703,055和美国专利号5,679,647所述，其全部内容均通过整体引用并入本文。组合物的DNA可以与颗粒或珠复合，这些颗粒或珠可以施用于个体，例如，使用疫苗枪。本领域技术人员会知道，药学上可接受的载剂(包括生理学上可接受的化合物)的选择取决于例如表达载体的施用途径。组合物可以经由多种途径递送。典型的递送途径包括胃肠外施用，例如皮内、肌内或皮下递送。其他途径包括经口施用、鼻内和***内途径。特别是对于组合物的DNA，可以将组合物递送至个体的组织间隙(美国专利号5,580,859和5,703,055，其全部内容通过整体引用并入本文)。组合物也可以施用于肌肉，或者可以经由皮内或皮下注射，或经皮，例如通过离子电渗疗法施用。也可以采用组合物的表皮施用。表皮施用可以涉及机械或化学刺激表皮的最外层以刺激对刺激物的免疫应答(美国专利号5,679,647)。

在一个实施方案中，组合物可以被配制用于经由鼻道施用。适用于鼻腔施用的配制剂，其中载剂是固体，可以包括具有例如约10至约500微米的粒度的粗粉，粗粉以鼻吸的方式施用，即通过鼻道从靠近鼻子的粉末容器中快速吸入。配制剂可以是鼻喷雾剂、滴鼻剂或通过喷雾器的气溶胶施用。配制剂可以包括组合物的水性或油性溶液。

组合物可以是液体制剂，例如混悬液、糖浆或酏剂。组合物还可以是用于胃肠外、皮下、皮内、肌肉内或静脉内施用(例如，注射施用)的制剂，例如无菌混悬剂或乳剂。

组合物可以掺入脂质体、微球或其他聚合物基质中(美国专利号5,703,055；Gregoriadis，Liposome Technology，Vols.Ito III(第2版，1993)，其内容通过整体引用并入本文)。脂质体可以由磷脂或其他脂质组成，并且可以是无毒的、生理上可接受的和可代谢的载剂，其制备和施用相对简单。

ACE-tRNA或编码ACE-tRNA的核酸分子可以通过不同途径施用，包括经口、胃肠外、舌下、透皮、直肠、经粘膜、局部、经由吸入、经由颊施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鼻内、鞘内和关节内或其组合。对于兽医用途，组合物可以根据正常兽医实践作为合适可接受的配制剂施用。兽医可以很容易地确定最适合特定动物的给药方案和施用途径。组合物可以通过传统的注射器、无针注射装置、“微粒轰击枪”或其他物理方法例如电穿孔(“EP”)、“流体动力学方法”或超声来施用。

ACE-tRNA或编码ACE-tRNA的核酸分子可以通过若干众所周知的技术递送至哺乳动物，包括使用和不使用体内电穿孔的DNA注射、脂质体介导的、纳米颗粒促进的、重组的载体如重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组痘苗。ACE-tRNA或编码ACE-tRNA的核酸分子可以经由DNA注射和体内电穿孔进行递送。

电穿孔

经由电穿孔施用组合物可以使用电穿孔装置来完成，所述电穿孔装置可以经配置以将能量脉冲递送到哺乳动物的期望组织，所述能量脉冲有效地引起在细胞膜中形成可逆孔，并且优选地，能量脉冲是与用户输入的预设电流类似的恒定电流。电穿孔装置可以包括电穿孔组件和电极组件或手柄组件。电穿孔组件可以包括并结合电穿孔装置的各种元件中的一种或多种，包括：控制器、电流波形发生器、阻抗测试仪、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通信端口、存储器组件、电源和电源开关。电穿孔可以使用体内电穿孔装置完成，例如CELLECTRA EP***或ELGEN电穿孔器以促进质粒对细胞的转染。

电穿孔组件可以用作电穿孔装置的一个元件，而其他元件是与电穿孔组件通信的独立元件(或组件)。电穿孔组件可以用作电穿孔装置的一个以上元件，其可以与电穿孔装置的与电穿孔组件分离的另外其它元件通信。作为一个机电或机械装置的一部分存在的电穿孔装置的元件可以不受限制，因为这些元件可以用作一个装置或作为彼此通信的单独元件。电穿孔组件可以能够递送在预期组织中产生恒定电流的能量脉冲，并且包括反馈机制。电极组件可以包括具有空间排列的多个电极的电极阵列，其中电极组件接收来自电穿孔组件的能量脉冲并通过电极将其递送至期望组织。多个电极中的至少一个在递送能量脉冲期间是中性的并且测量期望组织中的阻抗并将该阻抗传送至电穿孔组件。反馈机制可以接收测量的阻抗并且可以调整由电穿孔组件递送的能量脉冲以维持恒定电流。

多个电极可以以分散模式递送能量脉冲。多个电极可以在编程序列下通过电极的控制以分散模式递送能量脉冲，并且编程序列由用户输入到电穿孔组件。编程序列可以包含按顺序递送的多个脉冲，其中多个脉冲中的每个脉冲由至少两个有源电极递送，其中一个中性电极测量阻抗，并且其中多个脉冲中的后续脉冲由至少两个有源电极中的不同一个递送，其中一个中性电极测量阻抗。

反馈机制可以由硬件或软件执行。反馈机制可以由模拟闭环电路执行。反馈每50μβ、20μβ、10μβ或1μβ发生一次，但优选是实时反馈或瞬时的(即，如通过用于确定响应时间的可用技术所确定的基本上瞬时的)。中性电极可以测量期望组织中的阻抗并将阻抗传送至反馈机制，并且反馈机制响应阻抗并调节能量脉冲以将恒定电流维持在与预设电流相似的值。反馈机制可以在能量脉冲的递送过程中连续地和瞬时地保持恒定电流。

可以促进递送本发明的组合物的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括描述于US7245963和US2005/0052630中的那些，其内容通过整体引用并入本文。本领域已知的其他电穿孔装置和电穿孔方法也可以用于促进组合物的递送。参见例如，US9452285、US7245963、US5273525、US6110161、US6958060、US6939862、US6697669、US 7328064和US2005/0052630。

定义

核酸或多核苷酸是指DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)或DNA或RNA类似物。可以从核苷酸类似物合成DNA或RNA类似物。核酸分子可以为单链或双链，但优选为双链DNA。“分离的核酸”是指其结构与任何天然存在的核酸或天然存在的基因组核酸的任何片段的结构不同的核酸。因此，该术语包括，例如，(a)DNA，其具有天然存在的基因组DNA分子的一部分序列，但其两侧没有其天然存在于的生物体的基因组中该部分分子侧翼的两个编码序列；(b)核酸，其以某种方式掺入到载体或原核生物或真核生物的基因组DNA中，使得所得分子与任何天然存在的载体或基因组DNA不同；(c)单独的分子，例如cDNA、基因组片段、聚合酶链式反应(PCR)产生的片段或限制性片段；和(d)重组核苷酸序列，其是杂合基因的一部分，即编码融合蛋白的基因的一部分。上述核酸可用于表达本发明的tRNA。为此，可以将核酸可操作地连接到合适的调节序列以生成表达载体。

载体是指能够运输与其连接的另一核酸的核酸分子。载体可能会或可能不会自主复制或整合到宿主DNA中。载体的实例包括质粒、粘粒或病毒载体。载体包括适合于在宿主细胞中表达感兴趣的核酸的形式的核酸。优选地，载体包括可操作地连接到待表达的核酸序列的一个或多个调控序列。

“调控序列”包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。调控序列包括那些指导核苷酸序列组成型表达的序列，以及组织特异性调控和/或诱导序列。表达载体的设计可以取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白质或RNA的表达水平等因素。可以将表达载体引入宿主细胞以产生感兴趣的RNA或多肽。启动子定义为指导RNA聚合酶结合DNA并启动RNA合成的DNA序列。强启动子是导致RNA以高频率启动的启动子。

“启动子”是启动和调控多核苷酸转录的核苷酸序列。启动子可以包括诱导型启动子(其中与启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调节蛋白等诱导)、阻遏型启动子(其中与启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达由分析物、辅助因子、调节蛋白等阻遏)和组成型启动子。术语“启动子”或“控制元件”旨在包括全长启动子区域和这些区域的功能性(例如，控制转录或翻译)区段。

“可操作地连接”是指元件的排列，其中如此描述的组件被配置以执行它们通常的功能。因此，当存在适当的酶时，与核酸序列可操作地连接的给定启动子能够影响该序列的表达。启动子不需要与序列相邻，只要它起到指导其表达的作用即可。因此，例如，在启动子序列和核酸序列之间可以存在***的未翻译但已转录的序列，并且启动子序列仍可被认为与编码序列“可操作地连接”。因此，术语“可操作地连接”旨在涵盖启动子元件和感兴趣的DNA序列的任何间距或方向，其允许在转录复合物识别启动子元件时启动感兴趣的DNA序列的转录。

如本文所用，“表达盒”是指能够在合适的宿主细胞中指导特定核苷酸序列表达的核酸序列，其可以包括可操作地连接至感兴趣的核苷酸序列的启动子，该启动子可操作地连接至终止信号。表达盒还可以包括正确翻译核苷酸序列所需的序列。编码区通常编码感兴趣的RNA或蛋白质。包括感兴趣的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的。表达盒也可以是天然存在的但已经以重组形式获得用于异源表达的表达盒。表达盒中核苷酸序列的表达可以处于组成型启动子的控制之下或仅当宿主细胞暴露于某些特定刺激时才启动转录的可调控型启动子的控制之下。在多细胞生物的情况下，启动子也可以对特定组织或器官或发育阶段具有特异性。在某些实施方案中，启动子是PGK、CMV、RSV、HI或U6启动子(Pol II和PolIII启动子)。

“核酸片段”是给定核酸分子的一部分。术语多核苷酸序列的“基本同一性”是指多核苷酸包含的序列与用使用标准参数描述的比对程序之一的参考序列相比，具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％，或至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％，或至少90％、91％、92％、93％或94％，或甚至至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

如本文所用，“微型载体”是指小型环状DNA载体***，例如双链环状DNA(例如，微环)或闭合线性DNA分子(例如，CEDT)，缺乏细菌复制起点和抗生素选择基因，并且具有约100bp至约5kbp的大小。其可以例如通过亲本质粒的位点特异性重组以消除重组位点之外的质粒序列来获得。其包含例如仅具有转基因表达盒的核酸分子，包括启动子和感兴趣的核酸序列，其中核酸序列可以是例如用于例如抑制PTC的ACE-tRNA，和，重要的是，没有细菌起源的序列。

术语“受试者”包括人和非人动物。优选的治疗受试者是人。如本文所用，术语“受试者”和“患者”可以互换使用，无论受试者是否已经或目前正在接受任何形式的治疗。如本文所用，术语“一名受试者”和“多名受试者”可以指任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物(例如，牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠和小鼠、非人灵长类动物(例如，猴子，如食蟹猴、黑猩猩等)和人)。在一个实施方案中，受试者是人。在另一个实施方案中，受试者是实验性非人动物或适合作为疾病模型的动物。

与PTC或无义突变相关的疾病或病症、PTC相关疾病或PTC相关疾病是指由一个或多个无义突变引起或表征的任何病症，所述一个或多个无义突变通过单个核苷酸取代将氨基酸密码子改变为PTC，导致有缺陷的截短蛋白。

如本文所用，“处理”或“治疗”是指将化合物或药剂施用于患有病症或有发生病症风险的受试者，目的是治愈、减轻、缓解、补救、延迟发作、预防或改善病症、病症的症状、继发于病症的疾病状态或病症的倾向性。术语“预防”、“防止”、“阻止”、“防治性治疗”等指的是降低没有病症或病况但有风险或易患病症或病况的受试者发生病症或病况的可能性。“改善”通常是指疾病或病症的迹象或症状的数量或严重程度的降低。

术语“预防”、“防止”和“阻止”通常是指减少受试者疾病或病症的发生。预防可以是完全的，例如受试者完全没有疾病或病症。预防也可以是部分的，使得受试者中疾病或病症的发生比没有本发明的实施方案时发生的少。“预防”疾病一般是指抑制疾病的全面发展。

术语“药物组合物”是指活性剂与惰性或活性载剂的组合，使该组合物特别适用于体内或离体诊断或治疗用途。“药学上可接受的载剂”在施用至受试者或施用于受试者后不会引起不良的生理作用。药物组合物中的载剂在与活性成分相容并且能够稳定活性成分的意义上也必须是“可接受的”。一种或多种增溶剂可以用作药物载剂以递送活性化合物。药学上可接受的载剂的实例包括但不限于生物相容性媒介物、佐剂、添加剂和稀释剂以获得可用作剂型的组合物。其他载剂的实例包括胶体氧化硅、硬脂酸镁、纤维素和十二烷基硫酸钠。

术语“约”通常是指标示数字的正负10％。例如，“约10％”可以表示9％至11％的范围，且“约1”可以表示0.9-1.1。“约”的其他含义从上下文中可以是显而易见的，如四舍五入，因此，例如“约1”也可以表示从0.5到1.4。

本文中数值范围的叙述仅旨在用作单独指代落入该范围内的每个单独数值的速记方法。除非本文另有说明，否则每个单独的值都被并入说明书中，如同其在本文中被单独引用。

实施例

实施例1 ACE-tRNA平台

使用新的高通量克隆(HTC)和筛选(HTS)方法，最近开发了包含500多个阻抑物tRNA(ACE-tRNA)的文库。在该文库中，人tRNA基因的反密码子经工程化改造以识别引起疾病的PTC密码子(UAG、UAA和UGA)。ACE-tRNA平台靶向所有可能的PTC，这些PTC是翻译密码子的一个核苷酸变化的结果(tRNA^Arg _UGA、tRNA^Gln _UAA、tRNA^Gln _UAG、tRNA^Trp _UGA、tRNA^Trp _UAG、tRNA^Glu _UAA、tRNA^Glu _UAG、tRNA^Cys _UGA、tRNA^Tyr _UAG、tRNA^Tyr _UAA、tRNA^Leu _UGA、tRNA^Leu _UAG、tRNA^Leu _UAA、tRNA^Lys _UAG、tRNA^Lys _UGA、tRNA^Ser _UGA、tRNA^Ser _UAG和tRNA^Ser _UAA)。ACE-tRNA^Gly _UGA(例如，SEQ ID NO：5)对UGA密码子具有特异性，这支持了ACE-tRNA在体内比一般靶向所有三个终止密码子的分子(例如，小分子)具有更少的脱靶效应的前提。此外，发现在HEK293细胞中温育48小时后，ACE-tRNA^Gly _UGA(例如，SEQ ID NO：5)显著优于AMG G418和庆大霉素。

进行测定以确定筛选中鉴定的ACE-tRNA是否以牺牲氨酰-tRNA合成酶的识别为代价进行功能化。具体而言，为了最有效，ACE-tRNA必须用正确的氨基酸(同源氨基酸)抑制PTC。经证实，使用高分辨率质谱法，ACE-tRNA^Gly _UGA和-tRNA^Trp _UGA的同源氨基酸均以高保真度编码，从而实现无缝PTC抑制。

还进行了测定以确定ACE-tRNA依赖性抑制“真实终止”的效率。为此，编码ACE-tRNA^Gln _UAA、ACE-tRNA^Glu _UAG、ACE-tRNA^Arg _UGA、ACE-tRNA^Gly _UGA和ACE-tRNA^Trp _UGA的cDNA质粒(例如，由SEQ ID NO：79和94编码的质粒，以及具有SEQ ID NO：8、5和1的质粒)被转染到HEK293细胞中，48小时后，对细胞RNA进行Ribo-Seq，以确定与对照相比，核糖体在ACE-tRNA存在的情况下在3’非翻译区(UTR)上的占有率是否更高(图2)。图2A显示了具有UAA(红色)、UAG(绿色)和UGA(蓝色)的个体转录物(点)的mRNA 3’UTR核糖体占有率的倍数变化。核糖体的3’UTR占有的量是微不足道的，表明ACE-tRNA没有显著抑制“真实”终止。图2B中显示的Ribo-Seq结果允许可视化3’UTR核糖体占有在所有翻译的RNA转录物上的平均位置和大小与停止/终止密码子的关系，作为ACE-tRNA“真实”终止抑制活性的结果。“锯齿”模式代表个体密码子核糖体占有。在使用ACE-tRNA^Arg _UGA终止密码子后观察到的持续锯齿模式虽然较小，但表明了框内通读。令人鼓舞的是，在HEK293细胞中转染ACE-tRNA后，ACE-tRNA对翻译终止的平均抑制很小。在转基因16HBE14o-细胞和小鼠中持续表达后，正在研究ACE-tRNA的脱靶效应。

实施例2微型DNA载体的生成

进行了测定以检查ACE-tRNA是否可以在小DNA载体中有效地编码为治疗性可递送物。

发明人首先着手确定多小的MC可以高效表达ACE-tRNA。由于ACE-tRNA表达盒为125bp，因此它是理论上可以生成的最小表达载体。然而，在未知的情况下，转录因子的空间限制和DNA的高度弯曲可能抑制ACE-tRNA的表达。此外，此类小于300bp的小MC的生成受到DNA双螺旋的固有刚性或刚度的阻碍。除非反应DNA浓度低(纳摩尔浓度)，线性DNA的连接依赖性环化导致产物主要含有线性多联体，这阻碍治疗量的生成。在体外生产中规避这些问题的操作排除了具有感兴趣的DNA序列的MC的生成，并导致劳动密集型过程和不可接受的低效率。据报道，在大肠杆菌中生成小于250bp的MC也存在问题，因为DNA刚性会导致重组效率低下。由于上面列出的技术困难，以及大多数表达盒通常大于3kb的事实，使用小于几千碱基的MC的研究很少而且相差甚远，据发明人所知，383bp和400bp是最小的已发表表达微型载体。

使用重组线粒体DNA弯曲蛋白，ARS结合因子2蛋白(Abf2p)，也称为线粒体转录因子A(TFAM，Thibault，T.等人，Nucleic Acids Res 45，e26-e26，doi：10.1093/nar/gkw1034(2017))，发明人在体外以毫克量精简了小至200bp的MC产生(图3，方法I)。在此，生产量可以很容易地扩大到生成约1.5mg，其中生产成本通过在发明人实验室中的大肠杆菌中生成和纯化重组DNA连接酶、DNA聚合酶(PHUSION)、T5外切核酸酶和TFAM蛋白而显著降低。使用这种方法，发明人生成了大小为200-1000bp的MC(图3，方法I，底部凝胶)。500bp和更大的MC使用内部生成的质粒在大肠杆菌中生成，这些质粒利用φC31依赖性重组(图3，方法II)，类似于先前发表的方法((Kay,M.A.，等人，Nat Biotechnol 28，1287-1289，doi：10.1038/nbt.1708(2010))。

使用上述方法，制备了不同大小的示例性ArgTGA(例如，编码SEQ ID NO：8)微环连接产物。大小包括约1000bp、900bp、850bp、800bp、700bp、600bp、50bp、400bp、300bp和200bp。如图12A、12B、13E和13F所示，这些ArgTGA微环连接产物和PCR产物可以在含有溴化乙锭的1.5％琼脂糖凝胶上分辨和可视化。ArgTGA微环连接产物和相应的PCR产物与T5外切核酸酶一起温育，并在含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶上分辨。微环连接中外切核酸酶抗性产物的存在表明共价闭合的微环产物的产生(图12C、12D、13E和13F)。

MC和CEDT产物可以通过使用T5外切核酸酶消化或尺寸排阻层析(图3方法I、II、III和IV，底部凝胶)从亲本质粒主链中高效纯化。使用这两种方法，发明人可以以对于该项目而言合理的成本灵活地确定他们想要生成的MC ACE-tRNA序列(对于约1.5mg的＜500bpMC约$400和对于100mg的≥500bp MC约$580)。

当CEDT的生产可以通过多种方式实现时(Wong，S.等人J Vis Exp，53177-53177，doi：10.3791/53177(2016)，Schakowski，F.等人In vivo(Athens,Greece)21，17-23(2007)，以及Heinrich，J.等人.，Journal of molecular medicine (Berlin，Germany)80，648-654，doi：10.1007/s00109-002-0362-2(2002))，发明人使用重组原核端粒酶、噬菌体N15的端粒酶原TelN进行体外方法，以减少大肠杆菌衍生的内毒素污染。作用于端粒识别位点telRL(56bp)，端粒酶原通过高效的单步酶反应将环状质粒DNA转化为线性共价闭合的哑铃形分子。当将两个TelRL位点***侧翼为感兴趣基因的表达质粒时，该感兴趣基因由TelN酶切割并连接(5’末端连接到3’末端)，产生编码感兴趣基因的线性闭合末端微型DNA线。这种简单的方法概述于图3的方法III中。重要的是，使用体外方法I和IV可以分别纯化大量不含内毒素的MC和CEDT(Butash，K.A.等人，BioTechniques 29，610-614，616，618-619，doi：10.2144/00293rr04(2000))。使用方法III，发明人可以以对该项目而言合理的成本快速生成各种ACE-tRNA序列的CEDT(对于约1.5mg的CEDT约$400和对于约100mg的CEDT约～$1000)。

图13A、13B、13C和13D显示的是四个示例性CEDT的产生，包括200bp CEDT(使用含有两个200bp背对背ArgTGACEDT区段的634bp PCR产物)、400bp CEDT(使用含有400bp CEDT区段的570bp PCR产物)、900bp CEDT(使用编码1x ArgTGA的1065bp PCR产物)和900bpCEDT(使用编码4x ArgTGA的1065bp PCR产物)。在如上所述用TelN消化之前，通过阴离子交换层析(Macchery Nagel试剂盒)纯化相应PCR产物中的每一种。一旦TelN酶连接两个侧翼TelRL位点，则四个CEDT分别为260bp、456bp、956bp和956bp。如图所示，CEDT产物显示出对T5外切核酸酶消化的抗性，表明由TelN产生共价闭合末端。然而，在由限制酶Bsu36I进行内切核酸酶切割后，每个CEDT产物都容易被T5外切核酸酶降解。

实施例3编码ACE-tRNA的MC和CEDT的PTC抑制的功效。

检查了以上实施例中描述的MC和CEDT DNA载体，以验证它们在细胞培养物和在体内的PTC抑制的有效性。简而言之，相较于基于质粒的ACE-tRNA^Arg表达(图4A，灰色条)，将等量的200-1000bp ACE-tRNA^ArgMC(SEQ ID NO：8，图4A，白色条)转染到稳定表达PTC报告物cmv-NLuc-TGA的HEK293细胞中，导致稳健PTC抑制。在此，首次显示MC支持ACE-tRNA的稳健表达和随后的PTC抑制。据发明人所知，这些是报道过的最小功能表达MC(＜383bp)的结果。

接下来，将编码ACE-tRNA^Arg(SEQ ID NO：8)的700bp和400bp CEDT载体转染到稳定表达PTC报告物cmv-NLuc-UGA的16HBE14o-细胞中(图4B)。与MC不同，虽然400bp和700bpACE-tRNA^Arg CEDT支持强烈的PTC抑制(图4B，白色条)，但它们不如基于质粒的ACE-tRNA^Arg _UGA(图4B，灰色条)有效，并且显示出显著的大小效应，其中400bp CEDT在PTC抑制方面的效果约为700bp CEDT的一半。目前不清楚载体大小的这种明显影响是由于ACE-tRNA转录的效率所致，或这种差异是由于基于转染的递送的细胞进入效率差异所致。据报道，不同拓扑结构和大小的DNA会显著影响不同载剂的递送效率。

如本文所述，通过进行基于电穿孔的200-1000bp MC和CEDT到PTC报告物16HBE14o-细胞中的递送，进行额外的测定以解决DNA大小对细胞进入的影响。通过电穿孔，预计DNA载体大小的减小会增强细胞进入，因此观察到的200-500bp CEDT的抑制活性的任何降低都可能由DNA拓扑结构赋予的低效转录来解释。

实施例4用ACE-tRNA挽救内源性CFTR PTC

大多数先前的研究都使用阻抑物tRNA来挽救由cDNA编码的PTC。虽然提供了信息，但这些研究并未提出体内遇到的所有障碍，例如肺上皮细胞中CFTR的低内源性转录、mRNA的转录后加工/调控和无义介导的衰变(NMD)。在这个实施例中，将16HBE14o-细胞、人细支气管上皮细胞系用于确定内源基因组景观中的ACE-tRNA PTC抑制活性。还使用了突变体16HBE14o-细胞，这些细胞经过CRISPR/Cas9修饰以在位置p.G542X-、p.R1162X-和p.W1282X-CFTR处怀有导致CF的PTC。这些细胞用于研究CFTR和气道上皮生物学(Cozens，A.L.等人American journal of respiratory cell and molecular biology 10，38-47(1994))。

简而言之，将WT 16HBE14o-细胞转染到具有GFP表达质粒的TRANSWELL***物上以确定转染效率。36小时后，对细胞进行成像，发现转染效率低于10％(图5A)。尽管转染效率低，但仍进行了Ussing室测量。

首先，将R1162X-CFTR HBE14o-细胞转染到具有CMV-hCFTR质粒的Transwell***物上，以确定hCFTR功能挽救的“最佳情况”。尽管表达是由强pol II启动子驱动的，但hCFTRcDNA转染在转染后第六天导致仅约4％的CFTR通道功能挽救(图5G)。接下来，使用相同的方法将ACE-tRNA^Arg(SEQ ID NO：8)500bp CEDT递送到R1162X-CFTR HBE14o-细胞中。值得注意的是，ACE-tRNA^Arg500bp CEDT导致CFTR功能的约3％挽救(图5G)，该值类似于CMV-hCFTRcDNA的总基因替换的值。

同样如图5B、C和D所示，在将ACE-tRNA^Arg _UGA500bp CEDT转染到p.R1162X-CFTR16HBE14o-细胞后六天，在添加毛喉素和IBMX(图5B和C，WT的约3％)以及Inh172的抑制(图8B和D，WT的3％)之后，发明人出乎意料地测量到CFTR功能的适度挽救(图5B，蓝线)，而空载体转染后没有可测量的CFTR功能(图5B、C&D，“R1162X+空”)。应该注意的是，据估计，只要10％-15％的CFTR功能挽救就足以逆转肺部CF症状(Amaral，M.D.Pediatric Pulmonology39，479-491，doi：10.1002/ppul.20168(2005))。

发明人接下来查看ACE-tRNA是否在转染ACE-tRNA转录物后抑制NMD。有趣的是，通过在塑料上进行转染，发现效率要高得多(约30％；图5E)。在空载体或编码ACE-tRNA的DNA载体转染后两天，对从p.G542X-(图5F，左起第二条)、p.R1162X-(图5F，左起第四、第五和第六条)p.R1162X-和p.W1282X-CFTR(图5F，右起第四条)16HBE14o-细胞分离的mRNA进行qPCR。发现CFTR mRNA的表达显著降低(WT的＜25％)。4xACE-tRNA^Gly _UGA(SEQ ID NO：5，图5F，左起第三条)和4xACE-tRNA^Arg _UGA(图5F，具有水平线的左起第五条)质粒的转染导致稳定状态CFTR mRNA水平显著增加，分别为约10％和约15％。此外，发现将ACE-tRNA^Arg _UGA 500bpCEDT和800bp MC(图5F，左起第六条和第七条)递送至p.R1162X-CFTR 16HBE14o-细胞导致与ACE-tRNA^Arg _UGA质粒类似的稳定状态CFTR mRNA的增加(约15％)。

在p.W1282X-CFTR 16HBE14o-细胞中转染4xACE-tRNA^Trp _UGA(SEQ ID NO：1)质粒不影响CFTR mRNA稳定状态表达(图5F，具有线的右起第三条)，因为ACE-tRNA^Trp _UGA是文库中功能最差的家族。先前已表明，CFTR p.W1282(p.W1282L)处的亮氨酸赋予约80％WT CFTR功能，如使用Ussing室记录所测量的(Xue，X.等人，Human molecular genetics 26，3116-3129，doi：10.1093/hmg/ddx196(2017))。由于发明人的ACE-tRNA文库本质上是按菜单点菜(a la carte)的，他们能够挑选出最好的1xACE-tRNA^Leu _UGA(SEQ ID NO：4)质粒并将其转染到p.W1282X-CFTR 16HBE24o-细胞中，这导致了CFTR mRNA稳定状态表达显著增加了约17％(图5F，具有垂直线的右起第二条)。

图5中显示的结果首次证明ACE-tRNA有力地抑制了具有引起CF的PTC的内源性CFTR mRNA的NMD，很可能是通过促进先驱轮翻译。此外，即使在Transwells中转染效率相当低，从CEDT表达的ACE-tRNA也促进了p.R1162X-CFTR 16HBE14o-细胞中内源性CFTR的功能性挽救。

实施例5 PTC的体内ACE-tRNA依赖性通读。

在这个实施例中，进行了测定以检查PTC的体内ACE-tRNA依赖性通读。

首先，在吸入后使用电场将编码CMV-GFP的cDNA质粒递送至小鼠肺部，并在3天后通过荧光显微术进行评估(图6A)。GFP表达的定量表明，基因转移的电穿孔方法非常高效，在所有细胞类型的肺中33.2％±3.5％的细胞中观察到表达(在来自多只小鼠的多个切片中为18％至52％)。重要的是，与实质相比，GFP分布似乎在气道中占优势(图6A，左插图)。

然后，进行测定以确定是否可以通过共同递送PTC抑制报告质粒pNanoLuc-UGA和编码ACE-tRNA的载体来实现高效递送。对照小鼠接受PTC报告物pNLuc-UGA质粒以确定乱真的PTC通读。电穿孔后两天，解剖肺，用盐水灌注，并在珠磨器(bead-beater)设备中用裂解缓冲液(PROMEGA)匀浆化。将裂解物高速旋转，并使用读板器分析上清液的NLuc活性。在没有ACE-tRNA载体的情况下，没有测量到明显的发光(图6B，左起第一条)。发现ACE-tRNAArg(SEQ ID NO：8)质粒(图6B，左起第二条)、500bp ACE-tRNAArg CEDT(图6B，中间条)、800bpACE-tRNALeu(SEQ ID NO：4)MC(图6B，右起第二条)和800bp ACE-tRNAArg MC(图6B，右起第一条)支持小鼠肺中的体内NLuc-PTC挽救。这些结果为(i)ACE-tRNA编码质粒、MC和CEDTS在p.G542X-CFTR和p.W1282X-CFTR小鼠气道上皮中的无义抑制的有效性和持久性，以及(ii)递送到肺部后在MC和CEDT中编码的ACE-tRNA的效率和持久性提供了原理证明。

实施例6鉴定TELS

该实施例描述了用于鉴定TELS以增强来自tRNA 5’侧翼序列的ACE-tRNA表达的测定。可以使用来自tRNA基因的tRNA 5’侧翼序列(约1kb)，诸如Lowe等人，Nucleic AcidsRes 25，955-964，doi：10.1093/nar/25.5.955(1997)中描述的416个tRNA基因的一个或多个。

每个序列都被克隆到多合一(all-in-one)的cDNA质粒中，该质粒支持高通量克隆(HTC)和在递送至哺乳动物细胞后使用发光进行的PTC抑制的定量高通量筛选(HTS)两者(图7B)。使用GOLDEN GATE克隆将1kb 5’侧翼序列作为gBlocks(整合DNA技术)以96孔格式克隆到HTC位点，并与ccdB阴性选择配对以提供约100％的克隆效率。所有克隆均通过Sanger测序确认。将TEL序列克隆到紧邻ACE-tRNA^Arg _UGA的5’(SEQ ID NO：8，图7B)，并使用读板器以96孔方式读出NLuc-UGA抑制效率，其中增加的PTC抑制表示增加的ACE-tRNA^Arg _UGA表达。在完成第一次筛选后，将前十个1kb序列分成250bp序列，以再次通过克隆gBlock序列来鉴定转录增强的起源。使用许多已开发的软件工具(Sharov,A.A.&Ko，M.S.H.DNA Research16，261-273，doi：10.1093/dnares/dsp014(2009))¹⁰⁶分析增强或抑制ACE-tRNA转录的1kb前导序列的序列基序。预计一个或多个TELS可以将ACE-tRNA的表达增强若干倍，以允许低效的递送并维持有力的PTC抑制。这项研究的结果还提供了对tRNA转录调控的深入了解。

实施例7鉴定DTS

该实施例描述了用于鉴定DTS的测定，该DTS驱动微型载体核定位。

已经鉴定了将质粒靶向到非***细胞核中的若干DNA序列。参见例如，Dean，D.A.Exp.Cell Res.230，293-302(1997)，Dean，D.A.，等人.，Exp.Cell Res.253，713-722(1999)，Vacik，J.，等人，Gene Therapy 6，1006-1014(1999)，Young，J.L.，等人，Mol.Biol.Cell 10S，443a(1999)，Langle-Rouault，F..J Virol 72，6181-6185(1998)，Mesika，A.，等人，Mol Ther 3，653-657.(2001)，Degiulio，J.V，等人，Gene Ther，doi：gt2009166[pii]10.1038/gt.2009.166(2010)，Sacramento，C.B.，等人，Brazilianjournal of medical and biological research 43，722-727(2010)，以及Cramer,F.等人.，Cancer Gene Ther 19，675-683，doi：10.1038/cgt.2012.54(2012)。这些序列的共同特征是它们含有转录因子的结合位点。有趣的是，由于其与含有核定位序列(NLS)的＞10个普遍表达的转录因子的结合，SV40增强子在所有细胞类型中都充当DTS。典型的转录因子将会被转运到细胞核中，与它的调节DNA靶序列结合并激活或抑制转录。然而，如果含有转录因子结合位点的DNA存在于细胞质中，则细胞质转录因子可能会在细胞核输入之前与该位点结合(图8)，并将DNA-蛋白质复合物转移到细胞核中。

发明人已经筛选超过60种强通用和细胞特异性启动子，发现了七个DTS。其中，两个普遍起作用，而五个结合在细胞亚群中表达的特定转录因子。已发现将DTS掺入表达质粒中增加显微注射的和转染的非***细胞中的基因表达，并且对本发明重要的作用是增加质粒的核靶向性和随后的体内基因表达。在此，发明人已经表明，编码ACE-tRNA的微型载体亲本pUC57质粒在细胞质显微注射后不会被转运到非***细胞的细胞核中。为了改善质粒核定位和随后的ACE-tRNA表达，可以将SV40 DTS包括到质粒中。

还可以进行筛选以鉴定在核靶向性方面比SV40 DTS更有效的新DTS，以改善ACE-tRNA微型载体的递送、表达和最终的无义抑制。由于首选鉴定在所有细胞类型中起作用的DTS，因此可以筛选普遍表达的启动子。许多通过微阵列、RNAseq和单细胞测序鉴定的管家基因数据库已发表在例如Curina，A.等人，Genes Dev 31，399-412，doi：10.1101/gad.293134.116(2017)，Eisenberg，E.&Levanon，E.Y.Trends Genet 19，362-365，doi：10.1016/S0168-9525(03)00140-9(2003)，以及Eisenberg，E.&Levanon，E.Y.Trends Genet29，569-574，doi：10.1016/j.tig.2013.05.010(2013)。

前20个管家基因的启动子序列可以根据已发表的序列或生物信息学分析以及从DBTSS数据集(dbtss.hgc.jp)中每个启动子的转录起始位点的鉴定来鉴定。这些启动子的大小通常在500-2000bp之间，并且可以通过PCR从人基因组DNA克隆到从CMV启动子表达GFP的报告质粒(不作为DTS发挥作用)中。该质粒还可以携带三联体形成肽核酸(PNA)的结合位点，以实现DNA的荧光标记。通过将Cy3标记的PNA杂交到质粒上的这个位点，可以生成高量子产率、荧光标记的质粒以实时跟踪核输入(Gasiorowski，J.Z.&Dean，D.Mol Ther12，460-467(2005))。

作为用Cy3-PNA直接标记质粒的替代方法，还可以进行荧光原位杂交(FISH)以可视化注入的DNA。可以在30分钟至8小时的时段内在显微注射的A549肺上皮细胞中测试DTS候选质粒的核输入活性(Dean，D.A.Exp.Cell Res.230，293-302(1997)，Dean，D.A.，等人，Exp.Cell Res.253，713-722(1999)，以及Vacik，J.，等人，Gene Therapy 6，1006-1014(1999))。尽管发明人发现SV40序列在30分钟内介导质粒核输入，但SMGA启动子需要4小时才能使质粒定位到平滑肌细胞的细胞核。这种方法可以允许人们根据核输入的速度相对于SV40 DTS将序列进行排序。也可以注射不含DTS的pUC57质粒的阴性对照和pUC57-SV40 DTS的阳性对照，以确保细胞在注射后保持活力并具有将DNA转运到细胞核中的能力。

为了测试细胞特异性，可以将含有候选DTS的质粒显微注射到多种细胞类型中，包括HEK293、原代平滑肌和内皮细胞以及人成纤维细胞。根据发明人的经验，可以预测，可以从该筛选鉴定出两到四个通用DTS。一旦确定了显示输入活性的启动子序列，就可以按照Miller，A.M.&Dean，D.A.Gene Ther 15，1107-1115(2008)，Degiulio，J.V.，等人，GeneTher 17，541-549，doi：10.1038/gt.2009.166(2010)，以及Gottfried，L.，等人，Gene Ther23，734-742，doi：10.1038/gt.2016.52(2016)中描述的方式创建有限数量的截短启动子(例如，三到四个)，以鉴定支持核靶向性的最小序列长度。接下来可以按照Dean，D.A.，等人，Gene Ther 10，1608-1615(2003)，Machado-Aranda，D.等人Am J Respir Crit CareMed 171，204-211(2005)，Mutlu，G.M.等人，Am J Respir Crit Care Med 176，582-590(2007)，Zhou，R.，等人，Gene therapy 14，775-780，doi：10.1038/sj.gt.3302936(2007)，Young,J.L.，等人，Methods Mol Biol 1121，189-204，doi.10.1007/978-1-4614-9632-8_17(2014)，以及Young，J.L.等人.，Adv Genet 89，49-88，doi：10.1016/bs.adgen.2014.10.003(2015)中描述的方式确定这些最小DTS在通过电穿孔递送到小鼠肺部并通过对于在肺的薄切片中表达的eGFP的IF量化质粒的核递送后是否也支持体内质粒核靶向性。作为对照，不携带DTS或SV40 DTS的报告质粒也被转移到小鼠肺部。

预计二到四个启动子在培养的细胞中表现出通用的DTS活性。因此，可以在小鼠(n＝6)中测试四个潜在的DTS和两个对照。也可以在雄性和雌性C57B6小鼠中分别对此进行测试，并重复该实验一次。基因转移两天后，将动物安乐死，灌注肺，在4％多聚甲醛中固定，运行通过蔗糖溶液，并包埋入OCT中进行冷冻薄切片。GFP阳性细胞与每个细胞特异性标志物一起计数，以确定每种细胞类型的GFP阳性细胞的数量。乙酰化微管蛋白(纤毛气道上皮细胞)、CCSP(棒状细胞)、Muc5AC(杯状细胞)、CD31(内皮细胞)和SMAA(平滑肌)的抗体可以用于鉴定肺细胞类型。发明人过去已使用这种方法来确定核输入的细胞特异性。然后可以将最佳序列掺入到我们的ACE-tRNA微型载体中以最大化递送和表达。重要的是，鉴定的DTS可以直接应用于所有DNA治疗方法，以增强核靶向性和治疗性转基因表达。

实施例8具有DTS和TELS的MC和CEDT

在该实施例中，进行测定以检查将DTS和TELS掺入500bp ACE-tRNA^Arg _UGA(SEQ IDNO：8)MC和CEDT是否改善核靶向性、转录和PTC抑制。

重要的是，现有的MC和CEDT技术在细胞培养物中和在体内在PTC抑制方面均是高效的(图4-7和10)。也就是说，tRNA转录因子(Pol III转录元件)在细胞质注射后没有护送ACE-tRNA^Arg MC进入细胞核(图8B)。因此，为了改善核靶向、转录和PTC抑制，生成了具有72个核苷酸的SV40 DTS和通用活性DTS的ACE-tRNA^Arg _UGA MC和CEDT。这些载体到16HBE14o-细胞的细胞质和细胞核中的注射以与本文所述相同的方式进行。

4小时后使用FISH确定DNA定位。如下所概述，还使用具有和不具有DTS的CEDT和MC与pNLuc-UGAPTC报告质粒共同电穿孔(CEDT，n＝8；CEDT-DTS，n＝8；MC，n＝8；MC-DTS，n＝8；4只雄性和4只雌性)，进行了有限的小鼠肺电穿孔研究。对SV40 DTS和4个DTS进行了测试，每个MC或CEDT总共测试5个DTS(使用96只小鼠)。据推测，添加各种DTS通过增加ACE-tRNA的核生物利用度大大增强了ACE-tRNA转录，这随后增强了PTC抑制。据预测，包含DTS修饰可以在体内电穿孔研究中导致超过2倍的PTC抑制。

实施例9微型载体抑制细胞内PTC的能力

该实施例描述了确定微型载体抑制16HBE14o细胞(p.G542X、p.R1162X和p.W1282X)中PTC的能力的研究。此处使用的递送方法是LONZA 4D-NUCLEOFECTOR^TM X***，其中解决方案“SG”和程序CM-137已经针对16HBE14o-细胞进行了优化。

通过进行125、200、300、400、500、600、700、800、900和1000bp DNA微型载体的筛选，探究载体大小对p.R1162X-CFTR 16HBE14o-细胞中ACE-tRNA CEDT和MC PTC抑制的影响。p.R1162X-CFTR功能的挽救是使用Ussing室记录(n＝4-6)和随后的qPCR分析以确定稳定状态CFTR mRNA表达(n＝4-6)来确定的。对于Ussing室记录，发明人采用补充有5mM葡萄糖的Cl-梯度(140mM Cl^-基底外侧/4.8mM Cl^-)以及随后添加阿米洛利(100μM)来阻断ENaC和DID(100μM)以阻断CaCC活性。CFTRare随后被毛喉素(10μM)和IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，100μM)激活，并被10μM Inh172抑制。CFTR活性的挽救被分析为F&I前后以及Inh172阻断前后的ΔI_Cl-，如图5B中所述。

使用最佳微型载体条件测试递送至p.W1282X 16HBE14o-细胞的编码ACE-tRNA^Leu _UGA(SEQ ID NO：4)的功能MC和CEDT。将以上实施例中鉴定的顶级DTS和TEL序列包括在最佳大小的微型载体中。预计将微型载体的PTC抑制能力提高若干倍。

实施例10 ACE-tRNA表达载体在小鼠中抑制CFTR p.G542X和p.W1282X

该实施例描述了检查ACE-tRNA编码cDNA质粒、CEDT和MC在小鼠肺中抑制CFTRp.G542X和p.W1282X的能力的研究。已生成具有p.G542X-和p.W1282X-CFTR PTC突变的小鼠模型。例如，p.G542X小鼠发表于McHugh，D.R.，等人，PloS one 13，e0199573，doi：10.1371/journal.pone.0199573(2018)中。这些p.G542X-和p.W1282X-CFTR小鼠用于研究PTC治疗剂，因为CFTR转录物的变化与人类密切相关。

利用电场(电穿孔)方法用于使用本领域已知的方法将DNA载体递送至肺。参见例如，Dean，D.A.，等人，Gene Ther 10，1608-1615(2003)，Zhou，R.&Dean，D.A.Experimentalbiology and medicine(Maywood，N.J.)232，362-369(2007)，O′Reilly，M.A.等人TheAmerican journal of pathology 181，441-451，doi：10.1016/j.ajpath.2012.05.005(2012)，Mutlu，G.M.等人，American journal of respiratory and critical caremedicine 176，582-590，doi：10.1164/rccm.200608-1246OC(2007)，Blair-Parks，K.，等人，The journal of gene medicine 4，92-100(2002)，以及Barnett，R.C.等人，Experimental biology and medicine(Maywood，N.J.)242，1345-1354，doi：10.1177/1535370217713000(2017)。此处将cDNA质粒以及500bp CEDT和MC通过电穿孔递送至3周龄(断奶)纯合子CFTR p.G542X(ACE-tRNA^Gly _UGA)和p.W1282X(ACE-tRNA^Leu _UGA)小鼠的肺部。编码加扰tRNA序列的cDNA质粒(MC和CEDT两者的2.7kb puc57亲本质粒)用作电穿孔效应和表达的ACE-tRNA对肺细胞存活力的可能效应的对照。简而言之，将盐平衡溶液中的50μl DNA(2mg/ml)吸入小鼠肺部。递送后立即使用儿科皮肤起搏器电极(MEDTRONICS)对动物施用一系列8x10毫秒方波电脉冲(200V/cm)，同时施用异氟醚。将电极放置在胸部的两侧，使用少量手术润滑剂以辅助电导。

在递送后7、14和21天(d)对小鼠进行分析。因为只有40％的纯合子p.G542X-和p.W1282X-CFTR小鼠因肠梗阻而存活到40d，该研究从大队列的小鼠(n＝12)开始以实现每组n＝6。总共至少使用384只小鼠来完成这项研究。两种性别均使用以获得足够的实验动物。在每个时间点处死小鼠，取出肺并分离成右叶和左叶。用4％多聚甲醛/30％蔗糖灌注和膨胀固定(inflation-fix)右叶，然后包埋入OCT用于冷冻切片。左叶快速冷冻用于蛋白质(Western印迹，WB)和RNA分离。左肺叶在液氮下压碎，1/8的肺粉末用于分析CFTR mRNA。将剩余的肺在含有150mM NaCl、50mM Tris pH 8.0并补充有蛋白酶抑制剂和2％CHAPS(w/v)的缓冲液中进行dounce匀浆化。使用小麦胚芽凝集素(WGA)结合的琼脂糖珠对糖基化CFTR蛋白进行亲和纯化，清洗并用200mM N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)洗脱。使用抗CFTR抗体(1∶1000；M3A7，MILLIPORE，USA)对样品进行免疫印迹。来自小鼠的肠道充当WB和qPCR分析的未处理组织对照。右叶的切片从肺的三个层面切下，代表顶部、中部和底部，并通过FISH(Cy5或Cy3)针对微型载体和DAPI进行染色(图8)。通过在连续切片中与特异性抗体共染色以确定哪些细胞被转染，来鉴定气道细胞。通过计算来自肺的每个层面的10个切片中FISH+细胞/总细胞的数量来进行定量。

用于共染色的抗体包括角蛋白5(黏膜下腺中的基底细胞)、乙酰化微管蛋白和FoxJ1(纤毛或非纤毛气道上皮细胞，取决于染色)、神经生长因子受体、角蛋白14、p63(气道基底细胞)和Muc5AC(杯状细胞)。使用小鼠单克隆CFTR-769通过免疫组织化学和免疫荧光检测CFTR。由于电穿孔在将DNA递送至气道上皮细胞方面极其高效(图6A)，发明人预测气道上皮细胞中CFTR蛋白的显著挽救(＞10％)的水平高到足以通过IF检测。

在电穿孔之前和之后立即测量小鼠亚组(n＝6)中的炎症细胞因子水平，然后在肺收获时(7天时间点)再次测量以确定治疗是否引起炎症反应。重要的是，先前显示电穿孔后猪或小鼠没有炎症反应。进行苏木精和伊红(H&E)组织学分析以检测肺形态学的变化。

实施例11 ACE-tRNAArgUGA表达载体在WT小鼠肺中的持久性

该实施例描述了确定ACE-tRNA^Arg _UGA(SEQ ID NO：8)表达质粒、CEDT和MC在WT小鼠肺中的持久性的研究。

因为极少数p.G542X-和p.W1282X-CFTR小鼠存活超过40天，可能无法确定实施例10中来自CEDT和MC的ACE-tRNA表达的完整持久性。发明人和其他人已经证明小鼠肺中的转基因表达＞6个月。因此，发明人将编码ACE-tRNA^Arg _UGA的cDNA质粒(MC和CEDT两者的2.7kbpuc57亲本质粒)、500bp CEDT和MC递送至3周龄C57B1/6雄性WT小鼠的肺部，如先前实施例10中所述，并确定它们的递送效率和持久性以及PTC抑制效率。编码加扰tRNA序列的亲本质粒用作电穿孔效应以及表达的ACE-tRNA对肺细胞存活力在7天、14天和1、2、6和12个月的可能影响的对照。

该研究从每次处理10只小鼠(5只雄性/5只雌性)开始，并且终点用于研究的这一部分，总共240只小鼠。在每个终点前三天，进行具有SV40-DTS的小的(3kb)PTC报告物cDNA质粒的后续递送用于核靶向，该质粒表达在短泛素C启动子(shUbC)的控制下的具有n端血凝素(HA)表位标签和c端FLAG表位标签的NLuc-UGA蛋白(图9)。

在所定义的终点，将肺移除并如上述进行处理用于IF和FISH分析(右叶)和蛋白质生物化学(左叶)。PTC报告质粒是多功能的，具有与微型载体完全不同的序列，并且因此可以通过co-FISH鉴定以确定质粒的共递送效率。当微型载体和PTC报告质粒共定位时，可以使用体内成像、移植肺组织的读板器测量(图6B)通过NLuc发光来确定通读效率或使用c端FLAG标签(左叶)生化地确定通读效率。NLuc蛋白的表达可以使用n端HA表位标签通过IF或WB跟踪，并且只有当PTC被抑制时才会有明显的FLAG信号。重要的是，该DNA构建体类似于我们在高通量筛选中使用以鉴定PTC抑制的最佳ACE-tRNA序列的构建体。其已被修饰以通过减少背景通读来提供高信噪比，以准确地报告真实(bone fide)的PTC抑制。

该研究在一个批次中生成了5.5g无内毒素PTC报告物cDNA质粒(ALDEVRON)，以确保此处概述的小鼠实验的可重复性。据预测，500bp微型载体的递送比3kb PTC报告质粒更高效(通过细胞的co-FISH标记确定)，因此低估了微型载体PTC抑制活性。发明人使用针对微型载体的FISH来确定每个终点处肺中微型载体存在的持久性，并且使用针对PTC报告物c端FLAG表位的发光和IF来量化抑制作用的持久性。实施例10中详述的IF抗体和技术与FISH配对用于鉴定哪些细胞类型被转导。

为了进行CFTR功能测量，如Grubb，B.R.，等人，Am J Physiol 267，C293-300，doi：10.1152/ajpcell.1994.267.1.C293(1994)，160Grubb，B.R.等人Nature 371，802-806，doi：10.1038/371802a0(1994)，以及Grubb，B.R.，等人，Am J Physiol 266，C1478-1483，doi：10.1152/ajpcell.1994.266.5.C1478(1994)中所述将气管移除并纵向一分为二。一半安装在具有2mm直径孔径室的Ussing室(PHYSIOLOGIC INSTRUMENTS)中用于分析，并按照Cooney,A.L.等人，Nucleic Acids Res 46，9591-9600，doi：10.1093/nar/gky773(2018)，Cooney,A.L.等人，JCI Insight 1，doi：10.1172/jci.insight.88730(2016)，Mall，M.，等人，Nat Med 10，487-493(2004)，以及Zhou，Z.等人J Cyst Fibros 10 Suppl 2，S172-182，doi：10.1016/S1569-1993(11)60021-0(2011)中描述的方式测量短路电流。在气管切面的基底外侧添加10μM毛喉素和100μM IBMX继而添加10μM Inh172后计算短路电流的差异，类似于图7B-D中进行的实验。使用剩余的气管部分，可以使用针对NBD2结构域的CFTR769抗体通过免疫荧光确定气道中的CFTR表达。重要的是，将肺的切除部分储存起来用于将来的RNAseq和Riboseq研究。

对于本文所述的一些实验，发明人依靠PTC抑制读板器发光测定来推断ACE-tRNA的持续表达。目标是产生允许直接测量ACE-tRNA转录活性的技术。为此，发明人设计了载体来生成ACE-tRNA：条形码融合转录物，其中条形码序列(ABS)由内源性tRNase Z切割，允许qPCR定量以确定相对ACE-tRNA表达，同时提供功能齐全的ACE-tRNA(图10A)。

发明人设计了与小鼠基因组序列没有同源性的随机的200bp条形码序列。当转染到稳定表达NLuc-UGA的16HBE14o-细胞时，ACE-tRNA^Arg _UGA-和ACE-tRNA^Trp _UGA-条形码表现出如qPCR所监测的稳健的表达，而非条形码化的ACE-tRNA没有给出明显的信号(图10B)。然而，在一种情况下，ACE-tRNA^Arg _UGA的抑制活性因3’条形码序列的存在而受阻(图10C)。ACE-tRNA活性的缺陷很可能是由于3’加工不良，这可以通过对条形码序列进行探测的northern印迹来确定。可以通过编码3’HDV自切割核酶来改进ABS技术，其序列也将充当条形码或修饰的条形码接头序列以改进3’加工。3’核酶的掺入可以改善ACE-tRNA 3’加工并增加其PTC抑制活性。此外，ABS技术允许测量ACE-tRNA表达以补充NLuc PTC报告物(图9)。

在另一个实施方案中，发明人创造了新的ACE-tRNA条形码***技术，允许高分辨率直接测量稳定状态ACE-tRNA转录活性(图11A)。由于广泛的转录后修饰和二级结构，标准的RNA-seq方法不能用tRNA实施。Zheng，G.等人，Nature Methods 12，835以及Pang等人，Wiley Interdiscip Rev RNA 5，461-480，doi：10.1002/wrna.1224(2014)。此外，ACE-tRNA序列与一种或多种内源性tRNA仅相差一个核苷酸，因此northern印迹、微阵列和片段化RNA-seq无法辨别外源性治疗性ACE-tRNA和内源性tRNA的表达水平。因此，发明人开发了条形码技术来避免这些问题，并提供对ACE-tRNA转录的可靠、直接和灵敏的qRT-PCR测量。在此，独特的3’条形码序列编码在转录后从ACE-tRNA体中高效切割自身(＞90％)的HDV核酶(drz-Bflo-2,60bp)(Webb等人，Science 326，953(2009)以及Webb等人，RNA Biol 8，719-727(2011))(图11B)。由ACE-tRNA转录驱动的HDV表达使用基于探针的qRT-PCR进行量化。重要的是，由于3’端2’，3’环磷酸基修饰，条形码化载体中表达的ACE-tRNA无法参与翻译(Schürer等人，Nucleic Acids Res 30，e56-e56，2002)，因此不会混淆PTC抑制结果。

实施例12用G418和ACE-tRNA挽救内源性CFTR PTC

在该实施例中，进行了研究以检查和比较内源性CFTR PTC使用常规PTC通读剂(即G418)和质粒中递送的ACE-tRNA的挽救。为此，使用了工程化的人细支气管上皮细胞系16HBE14ge-(Valley等人，Journal of Cystic Fibrosis，Volume 18，Issue 4，July 2019，Pages 476-483)。G418(Geneticin)是标准的PTC通读剂，通过与核糖体的解码中心相互作用并促进具有近同源tRNA的PTC抑制，从而在许多情况下掺入错误的氨基酸。由于其非特异性，G418的挽救导致从无义突变产生错义突变。相比之下，本文公开的ACE-tRNA放入了期望的氨基酸。

为了进行测定，野生型16HBE14ge-细胞或具有W1282X-CFTR或R1162X-CFTR突变的16HBE14ge-细胞(i)用100μM G418或媒介物处理，或(ii)用空质粒或编码三个ACE-tRNA(SEQ ID NO：8、4和1)：1xACE-tRNA^Arg、4xACE-tRNA^Arg、1xACE-tRNA^Leu、4xACE-tRNA^Leu、1xACE-tRNA^Trp和4xACE-tRNA^Trp的一个或四个拷贝的多种质粒以实施例4中描述的方式转染。48小时后，再测定相应的CFTR mRNA表达水平。结果显示于图14。

如图所示，从质粒编码并转染到16HBE14ge-细胞中的ACE-tRNA通过使用精氨酸和亮氨酸ACE-tRNA促进先驱轮翻译，在抑制无义介导的衰变过程方面比G418明显更有效。该数据的重要方面还在于，本文公开的平台支持点菜式PTC抑制。出乎意料的是，发现亮氨酸ACE-tRNA比色氨酸ACE-tRNA更有效地抑制W1282X。由于W1282X位置的亮氨酸支持WT水平的CFTR功能(Xu等人，Hum Mol Genet.2017Aug 15；26(16)：3116-3129)，本文所述的ACE-tRNA^Leu可用于挽救或抑制突变pfW1282X-CFTR。

由于PTC导致(a)截短的蛋白质完全丧失功能或改变功能，以及(b)通过NMD途径降解mRNA转录物，因此设计并进行了额外的测定以检查ACE-tRNA在这两个方面的影响。更具体地，生成16HBE14ge-细胞以表达PTC通读报告物piggyBac转基因，如图15A所示。由于转基因编码具有PTC的mNeonGreen(mNG)蛋白，因此ACE-tRNA对PTC的抑制可以通过基于来自表达的mNG蛋白的荧光的FAC分选来定量。为此，荧光的增加代表翻译水平上的PTC抑制。

这些细胞用100μM G418处理或以上述方式用编码4xACE-tRNA^Arg的质粒转染。然后检查细胞中表达的mNG蛋白的荧光。结果显示于图15B。如图所示，精氨酸ACE-tRNA支持稳健PTC抑制和全长mNeonGreen蛋白的生成。相比之下，G418不支持稳健PTC抑制。灰色概况是针对未处理的PB-mNeonGreen-R1162X-16HBE14ge-细胞。

实施例13用不同形式递送的ACE-tRNA挽救内源性CFTR PTC

在该实施例中，进行了测定以检查和比较使用不同形式(例如，质粒、CEDT和MC)递送的ACE-tRNA对内源性CFTR PTC的挽救。使用上述表达PTC通读报告物piggyBac转基因的16HBE14ge-细胞(图15A)。更具体地，用编码ACE-tRNA的质粒、CEDT或MC转染细胞。然后通过FACS对细胞进行分选，并从非绿色细胞和绿色细胞中分离出mRNA。靶向RT-qPCR用于量化CFTR mRNA表达。

在一些文章中，用编码ACE-tRNA^Arg和ACE-tRNA^Leu(SEQ ID NO：8和4)的质粒转染细胞。结果示显示于图16A和B中。如图16B所示，经由质粒递送的ACE-tRNA^Arg和ACE-tRNA^Leu分别从R1162X和W1282X 16HBE14ge-细胞中显著挽救了CFTR mRNA。在绿色细胞(GFP+)和非绿色细胞(GFP-)中均观察到此类CFTRmRNA挽救。非绿色细胞仍然具有CFTR mRNA表达挽救的原因是因为ACE-tRNA通过先驱轮翻译而不是显著水平的翻译有效挽救了mRNA表达。这些结果表明，NMD抑制比稳健的翻译挽救更容易实现。

在其他测定中，通过电穿孔用编码ACE-tRNA的微环转染具有R1162X-CFTR和PTC通读报告物piggyBac转基因的16HBEge-细胞。这些细胞未通过FACS分选用于mRNA表达分析，而是对整个群体进行了分析。如图17A所示，编码微环的ACE-tRNA在大多数细胞中支持稳健的mNeonGreen表达。这些结果表明表达ACE-tRNA的微环支持PTC抑制达到可以在蛋白质水平上定量的水平。这种挽救明显优于亲本质粒(大小为约7.0kb)和加扰对照。此外，编码ACE-tRNA的一个拷贝的850bp的MC(“1xACE-tRNAArg 850bp MC”)和编码ACE-tRNA的四个拷贝的850bp的MC(“4xACE-tRNAArg 850bp MC”)导致相似水平的CFTR mRNA表达(图17B)。然而，后者导致更多的mNeonGreen表达细胞(图17A，底部两小图)。这些结果表明，增加ACE-tRNA的量似乎不会增加NMD抑制，但会增加蛋白质生成。这种水平的mRNA表达挽救是前所未有的和新的。

使用具有W1282X-CFTR和PTC通读报告物piggyBac转基因的16HBEge-细胞进行进一步的测定。在这些测定中，通过电穿孔用加扰对照、编码ACE-tRNA^Leu的四个拷贝的质粒(“4xACE-tRNA^Leu亲本质粒”)，或编码ACE-tRNA^Leu的四个拷贝的850bp MC(“4xACE-tRNA^Leu850bp MC”)转染细胞。细胞未通过FACS分选用于mRNA表达分析，而是对整个群体进行了分析。如图18A所示，微环在大多数细胞中支持稳健的mNeonGreen表达，表明表达ACE-tRNA的微环支持PTC抑制达到可以在蛋白质水平定量的水平。这次挽救再次明显优于加扰对照和亲本质粒(大小为约7.0kb)。参见图18B。

进行了类似的测定以表明CEDT还支持稳健的蛋白质表达和R1162X-CFTR的挽救。更具体地，通过电穿孔用加扰对照、编码4xACE-tRNA^Arg的质粒和编码1x或4xACE-tRNA^Arg的不同大小的四个CEDT转染具有R1162X-CFTR和PTC通读报告基因piggyBac转基因的16HBEge-细胞。如图19所示，200bp、400bp和900bp的CEDT支持稳健的CFTR mRNA(图19B)和mNeonGreen蛋白表达(图19A)。它们挽救CFTR mRNA表达和mNeonGreen蛋白表达的能力不受CEDT大小的影响。

除了本质上是瞬时的转染之外，还检查了ACE-tRNA^Arg的稳定基因组整合。为此，使用PB-donkey***(图20)来生成具有ACE-tRNA^Arg编码序列的多个拷贝的载体，其两侧是转座子重复(TR)。该载体用于生成基因组DNA中稳定整合有ACE-tRNA^Arg的16HBEge-细胞。以上述方式检查这些细胞的CFTR mRNA表达和通道功能。结果显示于图21。发现稳定表达的ACE-tRNA^Arg挽救了内源性CFTR功能。使用定量PCR(qPCR)的进一步分析表明，仅16个ACE-tRNA^Arg表达盒就足以支持R1162X 16HBE14ge-细胞中的稳健CFTR功能，其水平为野生型细胞的约6-7％。

前述实施例和优选实施方案的描述应当被视为说明，而不是限制由权利要求所限定的本发明。很容易理解，在不脱离如权利要求书中所述的本发明的情况下，可以利用上述特征的多种变化和组合。此类变化不被视为背离本发明的范围，并且所有此类变化旨在包括在所附权利要求的范围内。本文引用的所有参考文献均通过整体引用并入。

Claims (22)

1.闭合末端、环状、非病毒和非质粒DNA分子，其包含(1)启动子和(ii)编码反密码子编辑的tRNA (ACE-tRNA)的序列。

2.权利要求1的分子，其中所述分子是闭合末端DNA线(CEDT)分子或微环(MC)分子。

3.权利要求1或2的分子，其中所述分子进一步包含选自DNA核靶向序列(DTS)、转录增强5’前导序列(TELS)和ACE-tRNA条形码编码序列(ABS)的一个或多个元件。

4.权利要求3的分子，其中所述DTS包含SV40-DTS。

5.权利要求1-4中任一项的分子，其中所述分子不含任何细菌核酸序列。

6.权利要求1-5中任一项的分子，其中所述分子包含4个或更少的CpG二核苷酸。

7.权利要求6的分子，其中所述分子不含CpG二核苷酸。

8.权利要求1-7中任一项的分子，其中所述分子的大小为约200至约1,000bp。

9.权利要求8的分子，其中所述分子的大小为约500bp。

10.权利要求1-9中任一项的分子，其中所述ACE-tRNA包含(i)选自SEQ ID NO:1-10或(ii)由选自SEQ ID NO:11-305的一者编码的序列。

11.权利要求10的分子，其中所述ACE-tRNA包含(i)选自SEQ ID NO:1、4、5和8或(ii)由选自SEQ ID NO:79和94的一者编码的序列。

12.药物配制剂，其包含(i)权利要求1-11中任一项的分子和(ii)药学上可接受的载剂。

13.用于在细胞中表达ACE-tRNA的方法，其包括(i)使所述细胞与权利要求1-11中任一项的分子接触，和(ii)将所述细胞维持在允许所述ACE-tRNA表达的条件下。

14.权利要求13的方法，其中(i)所述细胞具有包含一个或多个过早终止密码子(PTC)的突变体核酸，(ii)所述突变体核酸的野生型编码多肽，并且(iii)所述ACE-tRNA挽救所述一个或多个PTC并恢复所述多肽的表达。

15.权利要求14的方法，其中所述多肽是囊性纤维化跨膜电导调节剂(CFTR)并且所述突变体核酸编码截短的CFTR。

16.权利要求15的方法，其中所述突变体核酸具有Trp-to-Stop PTC。

17.权利要求16的方法，其中所述ACE-tRNA将所述Trp-to-Stop PTC翻译成Leu。

18.宿主细胞，其包含权利要求1-11中任一项的分子。

19.在有此需要的受试者中治疗与PTC相关联的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1-11中任一项的分子或权利要求12的药物组合物。

20.权利要求19的方法，其中所述疾病选自下组：囊性纤维化、杜氏和贝克肌营养不良症、视网膜母细胞瘤、神经纤维瘤病、共济失调-毛细血管扩张症、泰-萨二氏病、威尔姆氏瘤、甲型血友病、乙型血友病、门克斯病、乌尔里希氏病、β-地中海贫血、2A型和3型血管性血友病、Robinow综合征、B型短指(指和掌骨的缩短)、遗传性分枝杆菌感染易感性、遗传性视网膜疾病、遗传性出血倾向、遗传性失明、先天性感觉神经性耳聋和结肠无神经节病以及遗传性神经发育-智力缺陷，包括感觉神经性耳聋、结肠无神经节病、周围神经病和中枢性髓鞘形成不良性脑白质营养不良、Liddle综合征、着色性干皮病、范可尼贫血、贫血、甲状腺功能减退、p53相关癌症、食管癌、骨癌、卵巢癌、肝细胞癌、乳腺癌、肝细胞癌、纤维组织细胞瘤、卵巢癌、SRY性反转、磷酸丙糖异构酶-贫血、糖尿病、佝偻病、Hurler综合征、Dravet综合征、脊髓性肌营养不良、Usher综合征、无虹膜、无脉络膜、眼部缺损、色素性视网膜炎、营养不良性大疱性表皮松解、弹性假黄瘤、Alagille综合征、Waardenburg-Shah、婴儿神经元蜡样脂褐质沉积症、胱氨酸病、X连锁肾源性尿崩症、McArdle病和多囊肾病。

21.权利要求19的方法，其中所述疾病是选自下组的眼部遗传病：锥体营养不良、斯特格病(STGD1)、锥-杆营养不良、色素性视网膜炎(RP)、对年龄相关性黄斑变性的易感性增加、先天性静止性夜盲2(CSNB2)、先天性静止性夜盲1(CSNB1)、Best病、VMD和Leber先天性黑矇(LCA16)。

22.权利要求19-21中任一项的方法，其中使用纳米颗粒、电穿孔、聚乙烯亚胺(PEI)、受体靶向性polyplex、脂质体或流体动力注射进行所述施用。

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