CZ475599A3 - Použití nukleové kyseliny k výrobě léčiva pro genovou terapii, které se injikuje do příčně pruhovaného svalstva - Google Patents
Použití nukleové kyseliny k výrobě léčiva pro genovou terapii, které se injikuje do příčně pruhovaného svalstva Download PDFInfo
- Publication number
- CZ475599A3 CZ475599A3 CZ19994755A CZ475599A CZ475599A3 CZ 475599 A3 CZ475599 A3 CZ 475599A3 CZ 19994755 A CZ19994755 A CZ 19994755A CZ 475599 A CZ475599 A CZ 475599A CZ 475599 A3 CZ475599 A3 CZ 475599A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- nucleic acid
- muscle
- pulses
- composite product
- electric field
- Prior art date
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 106
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 105
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 105
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims description 6
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims abstract description 153
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims abstract description 50
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 159
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 125
- 230000005684 electric field Effects 0.000 claims description 105
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 65
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 58
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 48
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 48
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 48
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 44
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 36
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 32
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 27
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 25
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 23
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 claims description 21
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 claims description 20
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 19
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 claims description 18
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 16
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 14
- 102000003971 Fibroblast Growth Factor 1 Human genes 0.000 claims description 14
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 14
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 11
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 11
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 9
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 claims description 9
- -1 and - 1antitripsin Proteins 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 9
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims description 8
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 claims description 7
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 claims description 7
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 6
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 6
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 6
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 6
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 claims description 6
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 6
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 6
- 210000003699 striated muscle Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 claims description 6
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 claims description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 5
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 claims description 5
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 claims description 5
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 claims description 5
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 claims description 5
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 5
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 5
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 claims description 5
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 4
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 claims description 4
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 4
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 4
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 claims description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 4
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 claims description 4
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 claims description 3
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims description 3
- 108010009685 Cholinergic Receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 3
- 101000955037 Homo sapiens Homeobox protein MOX-2 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 3
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 claims description 3
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 claims description 3
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 claims description 3
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 claims description 3
- 102000034337 acetylcholine receptors Human genes 0.000 claims description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000003914 blood derivative Substances 0.000 claims description 3
- 230000008468 bone growth Effects 0.000 claims description 3
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 claims description 3
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 claims description 3
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 claims description 3
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 claims description 3
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 claims description 3
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 claims description 3
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 3
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 3
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 claims description 3
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 claims description 3
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 claims description 2
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 claims description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims 35
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 claims 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 claims 2
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 claims 2
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 claims 2
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 claims 2
- 108090000495 Glia Maturation Factor Proteins 0.000 claims 2
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 claims 2
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 claims 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 claims 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 2
- 230000001141 propulsive effect Effects 0.000 claims 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims 2
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 claims 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims 1
- 102000014187 peptide receptors Human genes 0.000 claims 1
- 108010011903 peptide receptors Proteins 0.000 claims 1
- 229940076376 protein agonist Drugs 0.000 claims 1
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 claims 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 37
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 53
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 45
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 36
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 35
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- 102000004230 Neurotrophin 3 Human genes 0.000 description 19
- 229940032018 neurotrophin 3 Drugs 0.000 description 17
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 14
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 13
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 11
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 11
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 8
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 8
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 8
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 description 8
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 8
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 6
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 6
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 6
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 6
- 244000309466 calf Species 0.000 description 6
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 6
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 6
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 5
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 5
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 5
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 4
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 4
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000021642 Muscular disease Diseases 0.000 description 4
- 201000009623 Myopathy Diseases 0.000 description 4
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 4
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 4
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 4
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 4
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 4
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 3
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 3
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 3
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 3
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 3
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 3
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 3
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 3
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 3
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 3
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 229940029303 fibroblast growth factor-1 Drugs 0.000 description 3
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 3
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 3
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 3
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 2
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 2
- 102000002045 Endothelin Human genes 0.000 description 2
- 108050009340 Endothelin Proteins 0.000 description 2
- 102100028071 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000823435 Homo sapiens Coagulation factor IX Proteins 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 2
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 2
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 2
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 2
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102100039418 Plasminogen activator inhibitor 1 Human genes 0.000 description 2
- ZGUGWUXLJSTTMA-UHFFFAOYSA-N Promazinum Chemical group C1=CC=C2N(CCCN(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 ZGUGWUXLJSTTMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010029389 Simplexvirus glycoprotein B Proteins 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 2
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 2
- 102100035071 Vimentin Human genes 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- ZUBDGKVDJUIMQQ-UBFCDGJISA-N endothelin-1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]2CSSC[C@@H](C(N[C@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2)=O)NC(=O)[C@@H](CO)NC(=O)[C@H](N)CSSC1)C1=CNC=N1 ZUBDGKVDJUIMQQ-UBFCDGJISA-N 0.000 description 2
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 229940052349 human coagulation factor ix Drugs 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 2
- XXNMUMUBMSCMEU-UHFFFAOYSA-N nonane-2,4,5,6,8-pentone Chemical compound C(CC(=O)C)(=O)C(=O)C(CC(=O)C)=O XXNMUMUBMSCMEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 210000002824 peroxisome Anatomy 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 210000003314 quadriceps muscle Anatomy 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 2
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 2
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 2
- XUFXOAAUWZOOIT-SXARVLRPSA-N (2R,3R,4R,5S,6R)-5-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-5-[[(2R,3R,4S,5S,6R)-3,4-dihydroxy-6-methyl-5-[[(1S,4R,5S,6S)-4,5,6-trihydroxy-3-(hydroxymethyl)-1-cyclohex-2-enyl]amino]-2-oxanyl]oxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-2-oxanyl]oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,4-triol Chemical compound O([C@H]1O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O)[C@H]1O)N[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)C(CO)=C1)O)C)[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O XUFXOAAUWZOOIT-SXARVLRPSA-N 0.000 description 1
- RBNPOMFGQQGHHO-UHFFFAOYSA-N -2,3-Dihydroxypropanoic acid Natural products OCC(O)C(O)=O RBNPOMFGQQGHHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LEBVLXFERQHONN-UHFFFAOYSA-N 1-butyl-N-(2,6-dimethylphenyl)piperidine-2-carboxamide Chemical compound CCCCN1CCCCC1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C LEBVLXFERQHONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RLCKHJSFHOZMDR-PWCSWUJKSA-N 3,7R,11R,15-tetramethyl-hexadecanoic acid Chemical compound CC(C)CCC[C@@H](C)CCC[C@@H](C)CCCC(C)CC(O)=O RLCKHJSFHOZMDR-PWCSWUJKSA-N 0.000 description 1
- 108010022663 7,8-dihydrobiopterin synthetase Proteins 0.000 description 1
- OYXZMSRRJOYLLO-RVOWOUOISA-N 7alpha-hydroxycholesterol Chemical compound C([C@H]1O)=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 OYXZMSRRJOYLLO-RVOWOUOISA-N 0.000 description 1
- 102000006772 Acid Ceramidase Human genes 0.000 description 1
- 108020005296 Acid Ceramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000005869 Activating Transcription Factors Human genes 0.000 description 1
- 102000002735 Acyl-CoA Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010001058 Acyl-CoA Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000009346 Adenosine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108050000203 Adenosine receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100022712 Alpha-1-antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 102100026277 Alpha-galactosidase A Human genes 0.000 description 1
- 208000029751 Amino acid metabolism disease Diseases 0.000 description 1
- 108010048154 Angiopoietin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000009088 Angiopoietin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010048036 Angiopoietin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100034608 Angiopoietin-2 Human genes 0.000 description 1
- 102400000068 Angiostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 description 1
- 102100030988 Angiotensin-converting enzyme Human genes 0.000 description 1
- 101710185050 Angiotensin-converting enzyme Proteins 0.000 description 1
- 108010064733 Angiotensins Proteins 0.000 description 1
- 102000015427 Angiotensins Human genes 0.000 description 1
- 102100029470 Apolipoprotein E Human genes 0.000 description 1
- 101710095339 Apolipoprotein E Proteins 0.000 description 1
- 102100040214 Apolipoprotein(a) Human genes 0.000 description 1
- 101710115418 Apolipoprotein(a) Proteins 0.000 description 1
- 102000053640 Argininosuccinate synthases Human genes 0.000 description 1
- 108700024106 Argininosuccinate synthases Proteins 0.000 description 1
- 102100022146 Arylsulfatase A Human genes 0.000 description 1
- 102000009133 Arylsulfatases Human genes 0.000 description 1
- 108010023546 Aspartylglucosylaminase Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 101800004538 Bradykinin Proteins 0.000 description 1
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 102000038778 CNTF family Human genes 0.000 description 1
- 108091064557 CNTF family Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016362 Catenins Human genes 0.000 description 1
- 108010067316 Catenins Proteins 0.000 description 1
- 108010036867 Cerebroside-Sulfatase Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 101000936911 Chionoecetes opilio Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase Proteins 0.000 description 1
- 102000012336 Cholesterol Ester Transfer Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061846 Cholesterol Ester Transfer Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102400000739 Corticotropin Human genes 0.000 description 1
- 101800000414 Corticotropin Proteins 0.000 description 1
- 239000000055 Corticotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 description 1
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 1
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 1
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 108010071840 Cytosol nonspecific dipeptidase Proteins 0.000 description 1
- RBNPOMFGQQGHHO-UWTATZPHSA-M D-glycerate Chemical compound OC[C@@H](O)C([O-])=O RBNPOMFGQQGHHO-UWTATZPHSA-M 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 101100481408 Danio rerio tie2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010011953 Decreased activity Diseases 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 102100023688 Eotaxin Human genes 0.000 description 1
- 101710139422 Eotaxin Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100035290 Fibroblast growth factor 13 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100028043 Fibroblast growth factor 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100028072 Fibroblast growth factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100028073 Fibroblast growth factor 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100028075 Fibroblast growth factor 6 Human genes 0.000 description 1
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 1
- 102100037680 Fibroblast growth factor 8 Human genes 0.000 description 1
- 102100037665 Fibroblast growth factor 9 Human genes 0.000 description 1
- 102100037813 Focal adhesion kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000027487 Fructose-Bisphosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010017464 Fructose-Bisphosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102100029115 Fumarylacetoacetase Human genes 0.000 description 1
- 102100028496 Galactocerebrosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010042681 Galactosylceramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000004366 Glucosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010056771 Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 108010036164 Glutathione synthase Proteins 0.000 description 1
- 102100034294 Glutathione synthetase Human genes 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH Natural products NC(N)=NCCCC(N)C(=O)N1CCCC1C(=O)N1C(C(=O)NCC(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CO)C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- 102000016871 Hexosaminidase A Human genes 0.000 description 1
- 108010053317 Hexosaminidase A Proteins 0.000 description 1
- 102000030789 Histidine Ammonia-Lyase Human genes 0.000 description 1
- 108700006308 Histidine ammonia-lyases Proteins 0.000 description 1
- 101001060280 Homo sapiens Fibroblast growth factor 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001060274 Homo sapiens Fibroblast growth factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001060267 Homo sapiens Fibroblast growth factor 5 Proteins 0.000 description 1
- 101001060265 Homo sapiens Fibroblast growth factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 101001060261 Homo sapiens Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 1
- 101001027382 Homo sapiens Fibroblast growth factor 8 Proteins 0.000 description 1
- 101001027380 Homo sapiens Fibroblast growth factor 9 Proteins 0.000 description 1
- 101000878536 Homo sapiens Focal adhesion kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001052076 Homo sapiens Maltase-glucoamylase Proteins 0.000 description 1
- 101001005728 Homo sapiens Melanoma-associated antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001005718 Homo sapiens Melanoma-associated antigen 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001057131 Homo sapiens Melanoma-associated antigen D4 Proteins 0.000 description 1
- 101001001487 Homo sapiens Phosphatidylinositol-glycan biosynthesis class F protein Proteins 0.000 description 1
- 101000595923 Homo sapiens Placenta growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101000609255 Homo sapiens Plasminogen activator inhibitor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000609261 Homo sapiens Plasminogen activator inhibitor 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 108010053927 Iduronate Sulfatase Proteins 0.000 description 1
- 102000004627 Iduronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010003381 Iduronidase Proteins 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 1
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 1
- 102000005755 Intercellular Signaling Peptides and Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010070716 Intercellular Signaling Peptides and Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102100020881 Interleukin-1 alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 1
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010013792 Isovaleryl-CoA Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102100025392 Isovaleryl-CoA dehydrogenase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 1
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 102100035792 Kininogen-1 Human genes 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- RITKHVBHSGLULN-WHFBIAKZSA-N L-gamma-glutamyl-L-cysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O RITKHVBHSGLULN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100032352 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 1
- 208000017170 Lipid metabolism disease Diseases 0.000 description 1
- 108010013563 Lipoprotein Lipase Proteins 0.000 description 1
- 102100022119 Lipoprotein lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102100024640 Low-density lipoprotein receptor Human genes 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102000001291 MAP Kinase Kinase Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108060006687 MAP kinase kinase kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 102100024295 Maltase-glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- 102000000440 Melanoma-associated antigen Human genes 0.000 description 1
- 108050008953 Melanoma-associated antigen Proteins 0.000 description 1
- 102100025050 Melanoma-associated antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100025081 Melanoma-associated antigen 2 Human genes 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 102100039364 Metalloproteinase inhibitor 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 108010030837 Methylenetetrahydrofolate Reductase (NADPH2) Proteins 0.000 description 1
- 102000005954 Methylenetetrahydrofolate Reductase (NADPH2) Human genes 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101000987583 Mus musculus Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000920670 Mus musculus Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 101000634205 Mus musculus Neurotrophin-3 Proteins 0.000 description 1
- 101100481410 Mus musculus Tek gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 description 1
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 1
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 1
- 102100021003 N(4)-(beta-N-acetylglucosaminyl)-L-asparaginase Human genes 0.000 description 1
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 1
- 101000783356 Naja sputatrix Cytotoxin Proteins 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 101000652829 Neosartorya fumigata (strain ATCC MYA-4609 / Af293 / CBS 101355 / FGSC A1100) Exo-alpha-sialidase Proteins 0.000 description 1
- 206010056677 Nerve degeneration Diseases 0.000 description 1
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 101150044441 PECAM1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010069013 Phenylalanine Hydroxylase Proteins 0.000 description 1
- 102100038223 Phenylalanine-4-hydroxylase Human genes 0.000 description 1
- 108010011964 Phosphatidylcholine-sterol O-acyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100031538 Phosphatidylcholine-sterol acyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 description 1
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 description 1
- 102000003867 Phospholipid Transfer Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000216 Phospholipid Transfer Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 241000254064 Photinus pyralis Species 0.000 description 1
- 102100035194 Placenta growth factor Human genes 0.000 description 1
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 108010022233 Plasminogen Activator Inhibitor 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 102100039419 Plasminogen activator inhibitor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100030304 Platelet factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000778 Platelet factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 101710098940 Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 108010090051 Pyruvate Dehydrogenase Complex Proteins 0.000 description 1
- 102000012751 Pyruvate Dehydrogenase Complex Human genes 0.000 description 1
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 108090000783 Renin Proteins 0.000 description 1
- 102100028255 Renin Human genes 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108010079870 Sarcosine Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000013000 Sarcosine dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 102000011971 Sphingomyelin Phosphodiesterase Human genes 0.000 description 1
- 108010061312 Sphingomyelin Phosphodiesterase Proteins 0.000 description 1
- 102000007451 Steroid Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010085012 Steroid Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000019 Sterol Esterase Human genes 0.000 description 1
- 108010055297 Sterol Esterase Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 208000002847 Surgical Wound Diseases 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 108010046722 Thrombospondin 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100036034 Thrombospondin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100029529 Thrombospondin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010031374 Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100030951 Tissue factor pathway inhibitor Human genes 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- 102000016540 Tyrosine aminotransferases Human genes 0.000 description 1
- 108010042606 Tyrosine transaminase Proteins 0.000 description 1
- 102100031358 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N Vasopressin Natural products N1C(=O)C(CC=2C=C(O)C=CC=2)NC(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CC1=CC=CC=C1 GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010004977 Vasopressins Proteins 0.000 description 1
- 102000002852 Vasopressins Human genes 0.000 description 1
- 102100037814 Vigilin Human genes 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- VRGWBRLULZUWAJ-XFFXIZSCSA-N [(2s)-2-[(1r,3z,5s,8z,12z,15s)-5,17-dihydroxy-4,8,12,15-tetramethyl-16-oxo-18-bicyclo[13.3.0]octadeca-3,8,12,17-tetraenyl]propyl] acetate Chemical compound C1\C=C(C)/CC\C=C(C)/CC[C@H](O)\C(C)=C/C[C@@H]2C([C@@H](COC(C)=O)C)=C(O)C(=O)[C@]21C VRGWBRLULZUWAJ-XFFXIZSCSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010070626 acid beta-galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UKFBFLRUSA-N alpha-D-glucosamine Chemical compound N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-UKFBFLRUSA-N 0.000 description 1
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000012086 alpha-L-Fucosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010061314 alpha-L-Fucosidase Proteins 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002686 anti-diuretic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940124538 antidiuretic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003160 antidiuretic agent Substances 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N argipressin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N1)=O)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)C1=CC=CC=C1 KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N 0.000 description 1
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 108010014210 axokine Proteins 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N bradykinin Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229960003150 bupivacaine Drugs 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 230000003913 calcium metabolism Effects 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 208000020450 carbohydrate metabolism disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002340 cardiotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000677 cardiotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003943 catecholamines Chemical class 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000005482 chemotactic factor Substances 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 229940105774 coagulation factor ix Drugs 0.000 description 1
- FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+3].N#[C-].N([C@@H]([C@]1(C)[N-]\C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C(\C)/C1=N/C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C\C1=N\C([C@H](C1(C)C)CCC(N)=O)=C/1C)[C@@H]2CC(N)=O)=C\1[C@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](N2C3=CC(C)=C(C)C=C3N=C2)O[C@@H]1CO FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229960000258 corticotropin Drugs 0.000 description 1
- IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N corticotropin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)C1=CC=C(O)C=C1 IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 229940125753 fibrate Drugs 0.000 description 1
- 108010022687 fumarylacetoacetase Proteins 0.000 description 1
- VRGWBRLULZUWAJ-UHFFFAOYSA-N fusaproliferin Natural products C1C=C(C)CCC=C(C)CCC(O)C(C)=CCC2C(C(COC(C)=O)C)=C(O)C(=O)C21C VRGWBRLULZUWAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108010014977 glycine cleavage system Proteins 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N glyoxylic acid Chemical compound OC(=O)C=O HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003163 gonadal steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 108010092427 high density lipoprotein binding protein Proteins 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 229960000027 human factor ix Drugs 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000030214 innervation Effects 0.000 description 1
- 238000002743 insertional mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 210000003963 intermediate filament Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 108010053156 lipid transfer protein Proteins 0.000 description 1
- 108010013555 lipoprotein-associated coagulation inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 230000032630 lymph circulation Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000004118 muscle contraction Effects 0.000 description 1
- 230000036473 myasthenia Effects 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000508 neurotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 102000002574 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010068338 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 229940021222 peritoneal dialysis isotonic solution Drugs 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 230000000858 peroxisomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 125000001095 phosphatidyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 150000004032 porphyrins Chemical class 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 229930185346 proliferin Natural products 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000009979 protective mechanism Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000004144 purine metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000004147 pyrimidine metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010043277 recombinant soluble CD4 Proteins 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 102000003702 retinoic acid receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000064 retinoic acid receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 1
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 1
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000010972 statistical evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000036262 stenosis Effects 0.000 description 1
- 208000037804 stenosis Diseases 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 210000001562 sternum Anatomy 0.000 description 1
- 230000037359 steroid metabolism Effects 0.000 description 1
- 208000029445 steroid metabolism disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002948 striated muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 108060007951 sulfatase Proteins 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 108010060887 thrombospondin 2 Proteins 0.000 description 1
- RZWIIPASKMUIAC-VQTJNVASSA-N thromboxane Chemical compound CCCCCCCC[C@H]1OCCC[C@@H]1CCCCCCC RZWIIPASKMUIAC-VQTJNVASSA-N 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 239000005526 vasoconstrictor agent Substances 0.000 description 1
- 229960003726 vasopressin Drugs 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
- A61N1/00—Electrotherapy; Circuits therefor
- A61N1/02—Details
- A61N1/04—Electrodes
- A61N1/0404—Electrodes for external use
- A61N1/0408—Use-related aspects
- A61N1/0412—Specially adapted for transcutaneous electroporation, e.g. including drug reservoirs
- A61N1/0416—Anode and cathode
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
- A61N1/00—Electrotherapy; Circuits therefor
- A61N1/18—Applying electric currents by contact electrodes
- A61N1/32—Applying electric currents by contact electrodes alternating or intermittent currents
- A61N1/325—Applying electric currents by contact electrodes alternating or intermittent currents for iontophoresis, i.e. transfer of media in ionic state by an electromotoric force into the body
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Radiology & Medical Imaging (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pyrrole Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Description
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká mimořádného zlepšení přenosu nukleových kyselin in vivo do buněk příčně pruhovaného svalstva, a dále se vynález týká nukleových kyselin sdružených s produkty, které umožňují zvýšit výtěžek takového přenosu, a také kombinace nukleové kyseliny a způsobu přenosu podle vynálezu pro použití v genové terapii.
Dosavadní stav techniky
Přenos genů do dané buňky je základním kamenem genové terapie. Avšak jedním z problémů je, jak vnést dostatečné množství nukleové kyseliny do buněk hostitele (příjemce), který má být léčen. A tato nukleová kyselina, obecně tedy požadovaný gen, pak musí být exprimována v transfekovaných buňkách. Jeden z přístupů používaných k tomuto účelu spočívá v tom, že se nukleová kyselina integruje do virového vektoru, zejména retroviru, adenoviru nebo adeno-asociovaného viru. Tyto systémy využívají k proniknutí do buňky výhod mechanismů, které vyvinuly viry, a také užívají jejich ochranných mechanismů proti degradaci. Avšak tento přístup má řadu nevýhod. Jednou z nich je riziko produkce infekčních virových částic schopných rozšíření v hostitelském organismu, a v případě retrovirových vektorů ještě navíc riziko inzerční mutageneze. Kromě toho inzerční kapacita virových genomů pro terapeutické nebo vakcinační geny je značně omezena.
V každém případě vývoj virových vektorů vhodných pro použití v genové terapii vyžaduje velmi složité metody pro přípravu defektních virů a komplementačních buněčných linií.
Další přístup (Wolf et al., Science 247, 1465-68, 1990; Davis et al . , Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93, 7213-18, 1996) zahrnuje podávání nukleových kyselin plazmidového typu do svalu nebo krevního oběhu, ať již nenavázaných nebo i
navázaných na sloučeniny určené k tomu, aby usnadnily transfekci, jako jsou např. proteiny, liposomy, nabité lipidy nebo kationtové polymery jako je polyetylénimin, který je
dobrým tran | sfekčním | č i n i d1em i n | vi tro | (Behr et | al. , | Proč. | ||
Nati. | Acad. | Sci . | USA | 86, 6982-6, | 19 8 9; | Felgner et | al. , | Proč. |
Nati. | Acad. | Sci . | USA | 84, 7413-7, | 198 7; | Boussif et | al. , | Proč. |
Nati. | Acad. | Sci . | USA | 92, 7297-301 | , 1995) |
Od doby původní publikace Wolffa et al. (viz výše) ukazující schopnost svalové tkáně inkorporovat DNA injikovanou ve formě volného plazmidu, se mnozí výzkumníci snažili zlepšit tento proces (Manthorpe et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 419-431; Wolff et al. , 1991, BioTechniques 11, 474-485). Na základě toho se objevily jisté trendy, zejména šlo o:
• použití mechanických prostředků k nucenému vstupu DNA do buněk tak, že se DNA adsorbuje na částice a ty se pak vstřelí do tkáně (gene gun) (Sanders Williams et al., 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 2726-2730; Fynan et al., 1993,' BioTechniques 11, 474-485), Tento způsob se ukázal účinným v očkovacích strategiích, ale zasahuje' pouze povrchové vrstvy tkání. V případě svalu by jejich použití nutně znamenalo chirurgický zákrok, aby se zajistil přístup ke svalu, neboť částice neprocházejí tkáněmi kůže, • ·· · ·· • injekci DNA, již ne však v plazmidové formě, ale ve spojení s molekulou schopnou sloužit jako nosič, usnadňující vstup komplexu do buněk. Kationtové lipidy, používané v mnohých jiných způsobech transfekce, se u svalu ukázaly být zklamáním, neboť ty, které byly dosud testované, dokonce inhibovaly transfekci (Schwartz et al. , 1996, Gene Ther., 405-411) . Totéž platí pro kationtové peptidy a polymery (Manthorpe et al. , 1993, Human Gene
Ther. 4, 419-431). Jediným případem vhodné kombinace se zdála být směs polyvinylalkoholu nebo polyvinylpyrolidonu s DNA.' Výsledný faktor zlepšení přenosu DNA u těchto kombinací je však nižší než 10 proti injekci nahé DNA (Mumper et al. , 1996, Pharmaceutical Research 13, 701-709) • ošetření tkáně, do které se má injikovat DNA předem roztokem, který má zvýšit difúzi a stabilitu DNA (Davis et al. , Hum. Gene Ther. 4, 151-159) nebo podpořit vstup nukleových kyselin, např. indukcí buněčného dělení nebo regenerace. Ošetření se týkalo především použití lokálního anestetika nebo kardiotoxinu, vazokonstriktorů, endotoxinů nebo jiných molekul -(Manthorpe et al. , 1993, Human Gene Ther. 4, 419-431; Danko e't al. , 1994, Gene Ther. 1, 114121; Vitadello et al. , 1994, Hum. Gene Ther. 5, 11-18). Tyto postupy předběžného ošetření se však obtížně provádějí. Tak konkrétně např. přípravek Bupivacaine, aby byl účinný, se musí užít v dávce velmi blízké letáiní dávce. Preinjekce hyperosmotické sacharózy, zamýšlená ke zvýšení difúze, nezvyšuje úroveň transfekce ve svalu (Davis et al., 1993).
Elektroporace nebo elektrického pole k permeabilizaci buněk se obecně využívají in vitro k podpoře transfekce DNA do buněk v kulturách. Ale dosud se mělo za to, že tento jev závisí na dosažení prahové intenzity elektrického pole, a že
elektropermeabilizace lze dosáhnout pouze při relativně vysoké intenzitě elektrického pole 800 až 1200 V/cm v případě živočišných buněk. Tyto techniky byly také navrženy pro použití in vivo, ke zvýšení účinnosti protinádorových přípravků jako je např. bleomycin, u solidních nádorů člověka (patent US 5,468,228, L.M. Mir)). S pulzy velmi krátkého trvání (100 mikrosekund) jsou tyto elektrické podmínky (800 až 1200 V/cm) velmi vhodné k intracelulárnímu přenosu malých molekul. Tyto podmínky (pulsy v délce 100 mikrosekund) byly aplikovány, aniž by se však zlepšila účinnost přenosu nukleové kyseliny do jater, přičemž pole pod 1000 V/cm se ukázalo být zcela neúčinné a dokonce inhibující ve srovnání s injekcí DNA v nepřítomnosti elektrického pole- (patentová přihláška WO 97/07826, Heller et al., FEBS Letters, 389, 225-8, 1996) .
Tento způsob má mnohé problémy, především při apUkaci in vivo, neboť aplikace elektrického pole takové intenzity může způsobovat rozsáhlé léze. Léze' v cílové tkání nejsou problémem při léčení nádorů u pacientů s rakovinou, ale představují hlavní nevýhodu u zdravých subjekt nebo i nemocných subjektů, pokud se DNA podává do tkáně jiné než nádorové, a zvláště pak do příčně pruhovaného svalstva.
Podstata vynálezu
Zatímco všechny výše citované práče zdůrazňovaly nutnost užít elektrického pole s vysokým napětím řádu 1000 V/cm, aby byly účinné in vivo, původce předkládaného vynálezu zcela neočekávaným a mimořádným způsobem ukázal, že přenos nukleových kyselin in vivo do svalů může být podstatně zlepšen, a to bez vedlejších účinků, když se sval vystaví • · φ φ · ·· φ φ • · φ · φ φ · · · ·· φ φφ φ · · · · φφφφ φ φ φ φφφ φφφ φ φ φ φφφφ φφ φφφ φφφφ φφ • φ působení elektrických pulzů nízké intenzity, např. 100 až 200 V/cm, a relativně dlouhého trvání. Kromě- toho původce zjistil, že velká variabilita exprese transgenů, ke které dochází při přenosu DNA do svalu, popisovaná v dosavadním stavu techniky, byla významně snížena při použití způsobu podle vynálezu.
Tudíž předkládaný vynález se týká způsobů přenosu nukleových kyselin in vivo do jednoho nebo několika příčně pruhovaných svalů, kdy se buňky svalu přivedou do kontaktu s nukleovou kyselinou, která má být přenesena, přímým podáním do tkáně nebo topickým či systémovým podáním, a kdy je přenos způsoben aplikací na sval jednoho nebo několika elektrických pulzů s intenzitou 1 až 800 V/cm.
Výhodně je intenzita elektrického pole je 4 až 400 V/cm a celková doba aplikace je delší než 10 milisekund (ms). Počet použitých pulzu je např. 1 az 100 000 a frekvence pulzu je 0,1 až 1000 Hz. Výhodně je frekvence pulzů 0,2 až 100 Hz.
Pulzy se mohou také aplikovat nepravidelným způsobem, přičemž funkce popisující intenzitu pole v závislosti načase je proměnlivá. Tak např. aplikované elektrické pole může být výsledekm kombinace jednoho pole s intenzitou > 400 V/cm a výhodně 500 až 800 V/cm, s krátkým trváním jednotky (<lms), následovaného jedním nebo několika pulzy nízké intenzity, např. <400 V/cm, výhodně <200 V/cm a s dlouhý trváním jednotky (>1 ms) . Integrál funkce popisující proměnlivost elektrického pole v čase je větší než 1 kV x ms/cm a v dalším provedení přesahuje nebo je roven 5 kV x ms/cm.
Ve výhodném provedení vynálezu je intenzita elektrického pole pulzů 30 až 300 V/cm.
Pulzy jsou vybrané ze skupiny obsahující pulzy tvaru obdélníkových kmitů, exponenciálně tlumených kmitů, oscilujících unipolárních ' kmitů omezeného trvání, • · · · • · · « • φ« další pulzy liv oscilujících bipolárních kmitů omezeného trvání a formy. Ve výhodném provedení vynálezu jde o obdélníkových kmitů.
Aplikaci elektrických pulzú lze provést jak způsobem odborníkovi známým, např. tak, že se užije:
• systém externích elektrod umístěných na obou stranách tkáně, která má být ovlivněna, zejména systém neinvazivních elektrod umístěných v kontaktu s kůží, • systém elektrod implantovaných do tkání, • systém elektrody/injektor, který umožňuje , simultánní podání nukleových kyselin a aplikaci elektrického pole.
V textu této přihlášky vynálezu jsou termíny přenos
DNA (nebo nukleových kyselin) aplikací jednoho nebo několika elektrických pulzů a termíny elektropřenos nebo alternativně elektrotransfekce ekvivalentní a přenos nukleové kyseliny neb DNA pomocí ap označuj i
Tikóics nebe v přítomnosti elektrického pole.
Pro aplikaci in vivo je někdy nezbytné užít prostředek, 'který zajistí elektrickou vodivost v případě neinvazivních externích elektrod. , Takovým prostředkem je např. elektrolyt ve formě gelu.
Nukleové kyseliny se podávají jakýmkoliv vhodným způsobem, ale výhodně se injikují in vivo přímo do tkáně nebo se podávají jiným způsobem, lokálním nebo systémovým, čímž se stávají dostupnými v místě aplikace elektrického pole. Nukleové kyseliny se mohou podávat společně s činidly, která umožňují nebo usnadňují přenos, jak bylo již zmíněno. Nukleové kyseliny mohou být zejména volné v roztoku, nebo navázané na syntetická činidla nebo nesené virovými vektory. Syntetická činidle mohou být lipidy nebo polymery, známé odborníkům, nebo to dokonce mohou být zaměřovači prvky, které umožňují zachycení na membráně cílové tkáně. K těmto prvkům
• ·'
patří např. vektory nesoucí cukry, peptidy, protilátky nebo receptory hormonů.
Je zřejmé, že v podmínkách podle vynálezu podávání
nukleové kyseliny předchází, je současné | nebo | následuj e |
aplikaci elektrického pole. | ||
Tudíž se předkládaný vynález také | týká | nukleových |
kyselin a elektrického pole s intenzitou | 1 až | 800 V/cm |
jakožto sdruženého (kombinovaného) produktu pro jejich současnou, samostatnou nebo střídavou aplikaci in vivo do příčně pruhovaného svalstva. Intenzita pole je výhodně 4 až 400 V/cm a výhodněji 30 až 300 V/cm.
Výhodně se vynález užívá při genové terapii svalových buněk, která umožňuje:
• korekci dysfunkcí samotných svalových buněk (například pro léčení myopatií se vztahem ke genetickým vadám), • ochranu a/nebo regeneraci vaskularizace nebo inervace svalu nebo jiných svalových tkání nebo orgánů pomocí trofických, neurotrofických nebo angiogenních faktorů produkovaných transgenem, • transformaci svalu na orgán- secernující produkty vedoucí k léčebnému účinku, jako je např. produkt genu samotného (například regulační 'faktory hemostázy a faktory ovlivňující trombózu, trofické faktory, růstové faktory, hormony jako inzulín, apod.) nebo jako je aktivní metabo.lit syntetizovaný ve svalu díky vnesenému terapeutickému genu, • aplikaci vhodnou pro vakcinaci nebo imunostimulaci.
Dalším předmětem vynálezu je kombinace elektrických pulsů určitého napětí s přípravky obsahujícími nukleové kyseliny formulovanými s ohledem na podávání, které umožňuje dosáhnout svalové tkáně aplikací topickou, perkutánní, perorální, vaginální, parenterální, intranazální, «
919 intravenózní, intramuskulární, subkutánní, . intraokulární, transdermální apod. Farmaceutické přípravky podle vynálezu výhodně obsahují farmaceuticky přijatelný nosič pro přípravek pro injekce, zejména pro přímou injekci do požadovaného orgánu nebo pro jakékoliv jiné podávání. Může obsahovat zejména sterilní izotonické roztoky nebo suché přípravky, zejména lyofilizované, které po přidání například sterilní vody nebo fyziologického roztoku, v závislosti na případu, vytvoří přípravky roztoků pro injekce. Dávky nukleových kyselin použité pro injekci, jakož i počet podávání a objem injekcí, mohou být upraveny podle .různých parametrů a obzvláště dle způsobu podávání, příslušné patologie, exprimovaného genu nebo trvání požadované léčby.
Nukleové kyseliny mohou být syntetického nebo původu, nebo extrahované z virů nebo nsbo suk3.iryotickýcL·. ' buněk pcchássjěcicb biosyntetického p r o k a r y o t i c k ý c h z jednobuněčných organismů (např. kvasinek) nebo mnohobuněčných organismů. Mohou být podávány spsojené úplně nebo částečně se složkami původních organismů a/nebo systému syntézy.
Nukleová kyselina může být deoxyribonukleová kyselina nebo ribonukleová kyselina. Může zahrnovat sekvence přirozeného původů nebo umělé sekvence a zejména genomovou mRNA, tRNA a rRNA, hybridní sekvence nebo či semisyntetické sekvence oligonukleotidů, modifikované či nikoliv. Tyto nukleové kyseliny mohou být získány jakoukoliv metodou odborníkovi známou, a to zvláště klonováním, chemickou syntézou nebo dokonce smíšenými metodami, včetně chemické nebo enzymové modifikace sekvencí získaných klonováním. Mohou být modifikovány chemicky.
Konkrétně může být nukleová kyselina DNA nebo RNA typu sense nebo antisense nebo RNA s katalytickou vlastností
DNA., cDNA, syntetické
·. · · • · ·· · jako ribozym. „Antisense RNA je nukleová kyselina, která má sekvenci komplementární k cílové sekvenci, např. mRNA sekvenci, a která hybridizací blokuje expresi cílové sekvence. „Sense označuje nukleovou kyselinu, která je sekvenčně homologická nebo která je .totožná s cílovou sekvencí jako je např. sekvence spojená s proteinovým transkripčním faktorem a zapojená do exprese daného genu. Podle jednoho výhodného provedení obsahuje nukleová kyselina požadovaný gen a prvky umožňující expresi uvedeného genu. Fragment nukleové kyseliny je výhodně ve formě plazmidu.
Decxyribonukleová kyselina může být jedno- nebo dvouvláknová, nebo může jít o krátké oligonukleotidy nebo delší sekvence. Může nést geny, sekvence regulující transkripci nebo replikaci, nebo oblasti pro vazbu s dalšími buněčnými složkami, apod. Takové geny mohou obsahovat mar ke:
ve geny.
geny, ktere produkují detekovatelnou značku pro sledování buněčné funkce, migrace nebo funkce genu, terapeutický (léčebný) ' gen, gen ochranného antigenu nebo imunogenu apod. Podle vynálezu se termín terapeutickýgen nebo též „léčebný gen týká zejména každého genu kódujícího RNA nebo proteinový produkt mající léčebný účinek. Kódovaný proteinový produkt může být protein, peptid apod. Tento proteinový produkt může být s cílovou buňkou homologní (tj. produkt, který je normálně exprimován v cílové buňce, když nevykazuje žádnou patologii). V tomto případě transgenní exprese například umožňuje překonat nepřiměřenou expresi v buňce nebo expresi proteinu, který je z důvodu modifikace inaktivní nebo málo aktivní, nebo také umožňuje uvedený protein exprimovat nadměrně. Terapeutický gen může také kódovat mutantu buněčného proteinu, která má zvýšenou stabilitu, modifikovanou stabilitu apod. Proteinový produkt může být také s cílovou buňkou heterologní. V to.mto případě ··· 10 i
·· ·· • · · · • ·· muže exprimovaný protein například doplnit nebo vnést do buňky chybějící aktivitu (léčení myopatií mebo enzymových deficitů), nebo umožní bojovat proti patologii, či stimulovat imunitní reakci, například při léčení nádorů. Může také obsahovat tzv. sebevražedný gen (thymidinkinázu viru herpes) pro léčbu rakoviny nebo restenózy.
Z léčebných produktů vhodných k použití podle vynálezu se mohou konkrétně uvést geny, které kódují:
enzymy jako α-1-antitrypsin, proteinázy , (metaloproteinázy, urokináza, uPA, tPA, streptorkínáza), proteázy štěpící prekurzory, čímž se uvolní aktivní produkty (ACE, ICE, ... ) nebo jejich antagonisté (TIMP-1, inhibitor tkáňového aktivátoru plasminogenu PAI, . TFPI), krevní deriváty jako faktory zapojené do koagulace:
faktory VII, VIII, IX, faktory komrlementu, .troiobin, hormony nebo enzymy účastnící se v biosyntéze hormonů nebo faktory podílející se na řízení syntézy nebo exkrece hormonů, jako je inzulín, faktory , příbuzné inzulínu (IGF), růstový hormon, ACTH, enzymy pro syntézu pohlavníchj hormonů, lymfckiny a cytokinv: interleukiny, chemokiny (CXC a CC), interferonv, TNF, TGF, chemotaktické faktory nebo aktivátory jako jsou MIF, MAF, PAF, MCP-1, eotaxin, LIF apod.(francouzský patent 92 03120), růstové faktory, např. IGF, EGF, FGF, KGF, NGF, PDGF, PIGF, HGF, proliferin, angiogenní faktory jako jsou VEGF nebo FGF, angiopoetin 1 nebo 2, endotelin, .
enzymy syntézy neurotransmiterů (nervových přenašečů) trofické faktory, zejména neurotrofické faktory pro léčení neurodegenerat ivní ch nemoci, poškoz.ení nervového v
> 4 » 4
9
systému způsobené úrazem nebo poraněním, nebo degradace retiny, např. členy rodiny neurotrofinů - j ako NGF, BDNF, NT3, NT4/5, NT6, jejich deriváty a příbuzné geny, členy rodiny CNTF, axokin, LIF a jeho deriváty, IL-6 a jeho deriváty, kardiotrofin a jeho deriváty, .GDNF a jeho deriváty, členy rodiny IGF, jako jsou IGF-1, ' IGF--2 a jejich deriváty,
- členy rodiny FGF, jako jsou FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9 a jejich deriváty, TGFp, růstové faktory kostí, hematopoetické faktory jako erytropoetin, GM-CSF, M-C.SF, L.IF apod., , buněčné stavební 'proteiny . jako je dystrofin- nebo minidystrofin (francouzský patent č. 91 11947) nebo sebevražedné geny (thymidinkináza, cvtosindeamináza, enzymy obsahující cytochrom P4 50) , geny hentocrlobinu nebo jiných proteinových nosičů, geny odpovídající proteinům zapojeným- do metabolismu lipidů, například apolipoproteinového 'typu vybrané z apolipoproreinů A-I, A-II, A-IV, B, C-l, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J a apo(a), a metabolíckých enzymů, jako jsou například lipoproteinová lipáza, jaterní lipáza, lecitincholesterol-acyltransferáza, 7-alfacholesterolhydrcxyláza, kyselá fosfatidylfosfatáza, nebo dokonce lipidové transferové proteiny, jako je transferový protein esterů cholesterolu, a transferový protein fosfolipidů, protein vázající HDL nebo dokonce vybraný receptor, například z receptorů LDL, chylomikronových zbytkových receptorů a scavenger .receptorů apod., dále. také leptin pro léčbu obezity, faktory regulující krevní tlak jako např. enzymy účastnici se metabolismu NO, angiotensin, bradykinin, '
0
0
0 0 • 0 »
00 • 0 0 0
00
0
0 • · · 0 • 0 vasopresin, ACE, renin, enzymy kódující ' mechanismy syntézy a uvolňování prostaglandinů, tromboxan, adenosin, adenosinové receptory, kallikreiny a kallistatiny, ANP, ANF, dinretický a. antidiuretický faktor, faktory podílekící se na syntéze, metabolismu nebo uvolňování mediátorů jako histamin, serotonin, katecholaminy, neuropeptidy,
- antiangiogenní faktory jako je např. ligand pro Tiel a Tie2, angiostatin, faktor ATF, deriváty plasminogenu, endotelin, trombospondin 1 a 2, PF-4, interferon-α a -β,
interleukin- | 1.2, TNFa, urokinázový receptor, | f i 11, | KDR, | ||
PAI1, PAI2, | TrMPl, fragment | proláklinu, | |||
faktory och | raňující proti | apoptóze | j ako | jsou f | aktor |
rodiny .AKT, | |||||
proteiny sc | hopné indukovat | buněčnou | smrt, | které | j s ou |
buďto sami | aktivní j a k o | k 3. £ p á. z y | π ok o | j sou. | t vpu |
předléku, | tj . vyžadují aktivaci jiným faktorem, | j ako |
např. proteiny, které aktivují předléky na činidla způsobující buněčnou smrt, např. ' thymidinkináza viru herpes a deaminázy, se kterými se počítá zvláště v protinádorové terapii, proteiny podílející se na kontaktu mezi buňkami a adhezi: VCAM, PECAM, ELÁM, ICAM, integriny, kateniny, proteiny extracelulární matrix, proteiny účastnící se migrace buněk, proteiny podílející se na signální trnasdukci typů jako FAK, MEKK, p38 , kináza, tyrosinkinázy, serinthreoninkinázy, >
proteiny'podílející se na regulaci buněčného cyklu (p21, pl6, cykliny apod.) a také dominantně-negativní' mutanta nebo odvozené protein, které blokují buněčný cyklus a které mohou, kde je to vhodné, indukovat apoptózu, ··. ·· • · · · • ·· • · · • · · ···· ·· •· ·· ftft • · · · · · • · · · · • · ··· · · · • · · ft··· · · ·· transkripční faktory: jun, fos, API, p53 apod. a proteiny v signální kaskádě p53, buněčné strukturní proteiny, jako jsou intermediátní filamenta (vimentin, desmin, keratiny), dystrofin, proteiny podílející se na stažení svalu a řídící stahovatelnost svalu, zejména proteiny účastnící se metabolismu kalcia a toku kalcia v buňkách (SERCA apod.)
V případě proteinů, které fungují prostřednictvím systému ligand a receptor lze předvídat použití ligand nebo receptoru (např. FGF-R, VEGF-R apod.).
Lze také uvést geny kódující fragmenty ligand nebop receptorových proteinů,- zvláště proteinů zmíněných výše, které vykazují aktivitu, která je buďto' vyšší, než aktivita proteinu plné délky, nebo jde o antagonistickou aktivitu anebo dokonce dominantně-negativní typ vzhledem k původnímu % η ί-\ i · . .1 x j U φ!
:ragmenty inhib;
proteinů v oběhu, asociované nebo jinak navázané na sekvence indukující sekreci těchto fragmentů oproti ukotvení na .buněčné membráně nebo jiné systémy pro modifikaci intracelulárního transportu v těchto systémech ligandreceptor, aby se změnila dostupnost- jednoho z prvků) nebo dokonce mají vlastní aktivitu odlišnou od aktivity původního úplného proteinu (např. ATF).
Mezi dalšími proteiny nebo peptidy, které mohou být secernovány svalem, je důležité zdůraznit protilátky, variabilní fragmenty jednořetězcových protilátek (ScFv) nebo jakýkoliv další protilátkový fragment, který má rozpoznávací funkce pro použití v imunoterapii, např. pro léčbu infekčních nemocí, nádorů a autoimunitnich chorob, jako je roztroušená skleróza (anti-idiotypové protilátky), a také ScFv', který váže protizánětlivé cytokiny jako jsou např. IL1 a TNFa. pro léčbu revmatoidní artritidy. Další vhodně proteiny jsou, aniž ·· ·· · ·· ·· ·· « · · · · · · · · ·· · • ·· · ··«·· • · ·# · ·* ··♦·«· • · · · · · · ···· ·· ······· ·· ·« by výčet byl omezující, rozpustné receptory jako například rozpustný receptor CD4 nebo rozpustný receptor TNF pro léčbu, rozpustný receptor TNFa nebo antí-HIV receptor IL1 pro léčení revmatoidní - artritidy, rozpustný rozoustný receptor acetylcholinu pro léčbu myastenie, substrátové peptidy nebo enzymové inhibitory, nebo peptidy, které jsou agonisty nebo antagonisty receptorů nebo nebo adhezivních proteinů, jako například pro léčení astmatu, trombózy, restenózy, metastáz nebo zánětů, a umělé, chimérické nebo zkrácené proteiny.
Z hormonů základního s e mu z í uvést inzulín významu v případě diabetů, růstový hormon a kalcitonin.
Je třeba také uvést proteiny indukovat protinádorovou imunitu nebo stimulovat imunitní odpověď '(.IL2, GM-CSF, IL-12 apod.) Nakonec lze zmínit cytokiny, jako IL10, IL4 a IL13, které snižují T;;; odpověď.
Četné příklady, které byly 'uvedeny i ty, které budou ještě následovat, ilustrují potenciální rozsah aplikací předkládaného vynálezu.
Terapeutické nukleové kyseliny mohou být antisense sekvence nebo geny, jejichž exprese v cílové buňce, umožní kontrolovat expresi genů nebo- transkripci buněčných mRNA. takové sekvence mohou být např. transkribovány v cílové buňce do RNA komplementární k buněčné mRNA a tak blokovat její translaci do proteinu, což je způsob popsaný v Evropském patentu č. 140 308. Terapeutické geny také mohou obsahovat sekvence kódujíc .ribozymy, které jsou schopné selektivně ničit cílové RNA. (evropský patent č. 321 201) .
Jak bylo již uvedeno výše, nukleové kyseliny mohou také obsahovat jeden nebo několik genů kódujících antigenní peptidy schopné vyvolat imunitní odpověď u člověka nebo zvířete. V takovém konkrétním provedení umožňuje vynález
4
444 4« 44 · 4 • 44
Β 4 4 4
4444 44
44
4 4 4 4
4 4 4 4
444 444
4
44 buďto produkci vakcín léčení člověka nebo mi kroorgani smúm, vir um nebo provádění imunoterapeutického zvířete, zejména účinné proti a rakovinám. zejména sem · patří antigenní peptidy specifické pro virus Ep.stein-Barrové, virus HIV, virus hepatitidy B (evropský patent č. 185 573), virus pseudorabies, „virus tvořící syncytía, další viry nebo dokonce specifické nádorové antigeny, jako jsou proteiny MÁGE (evropský patent č. 259 212), a sice MAGEl a MAGE2, nebo antigeny schopné stimulovat reakci proti nádorům, jako jsou bakteriální proteiny tepelného šoku.
Nukleová kyselina výhodně obsahuje také sekvence umožňující a/nebo napomáhající expresi léčebného genu a/nebo genu kódujícího antigenní peptid ve svalu.· Může zahrnovat sekvence, které jsou přirozeně odpovědné za expresi uvažovaného genu, když jsou tyto sekvence schopné fungovat v transřekovené buňce. Může také zahrnovat sekvence různého původu (zodpovědné za expresi jiných proteinů nebo dokonce syntetické sekvence). Může zahrnovat zejména promotorové sekvence eukaryotických nebo virových genů. Například to mohou být promotorové sekvence pocházející z genomu buňky, kterou je žádoucí transfekovat. Z eukaryotických promotorů se mohou použít jakékoliv promotory nebo z nich odvozené sekvence, které stimulují nebo reprimují transkripci genu specifickým nebo nespecifickým a slabým nebo silným způsobem. Jedná se zvláště o obecné, konstitutivní promotory promotory (gen pro HPRT, vimentin, α-aktin, tubulin atd.), promotory terapeutických genů (typu MDR nebo CTFR apod.), tkáňově specifické promotory (včetně promotorů genů desminu, myosinů, kreatinkinázy, fosfoglycerátkinázy) nebo alternativně promotory odpovídající stimuly jako jsou promotory odpovídající na přirozené hormony (jako jsou steroidní receptory, receptory kyseliny retinové)· nebo promotory • · ·* · regulované antibiotiky (tetracyklin, rapamycin apod.), promotory reagující na dietu jako jsou promotory odpovídající na fibráty, nebo další přirozené či syntetické molekuly. Mohou to' také být promotorové sekvence pocházející z genomu viru. V.této souvislosti se mohou například uvést promotory adenovirových genů EIA nebo MLP, nebo promotory odvozené z genomů virů CMV, RSV apod. Dále' mohou být tyto expresní sekvence modifikovány přidáním sekvencí pro aktivaci, regulaci, umožňujících podmíněnou, přechodnou nebo dočasnou expresi', tkáňově specifickou expresi nebo převládající expresi apod.
Kromě toho může nukleová kyselina také obsahovat, zejména nad léčebným- genem, signální sekvenci .zaměřující syntetizovaný léčebný produkt do sekreční dráhy cílové buňky. Tato signální sekvence může být přirozená signální sekvence léčebného produktu, ale může také obsahovat jakýkoliv jiný funkční signál, nebo umělou signální sekvenci. Nukleová kyselina může také obsahovat signální sekvenci směřující syntetizovaný léčebný produkt , do konkrétního buněčného kompartmentu, jako jsou například peroxisomy, lysosomy anebo mitochondrie např. pro léčení mitochondriální genetické nemoci.
Další vhodné geny popsal McKusick, V.A., (Mendelian Inheritance in Man, Catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked phenotypěs, 8. vydání, Johns Hopkins University Press, 1988) a Stanbury, J. B. et al. (The metabolic basis of inherited disease, 5. vydání, McGraw-Hill, 1983). Požadované geny pokrývají proteiny zapojené do metabolismu aminokyselin, lipidů ,a dalších buněčných složek.
Mohou se také uvést geny spojené s chorobami metabolismu sacharidů, aniž by tím byl vynález jakkoliv omezen, například fruktózo-1—fosfátaldoláza, fruktózo-1,6-difosfatáza, glukózo17 • · · · • ·'· · • · · • 9 • * ···· ·<
• β · · · · • · · · · • · · · · • · ··· ··· • · · • · · »· · ·
6-fosfatáza, lysozomální ' α-1,4-glukosidáza, glukosidáza, amyΙο—(1,4:1,6)-transglukosidáza, íc-sforyláza, svalová fosfo-fruktokináza, f osf oryláza-βkináza, galaktózo-1-fosfáturidyl-transferá.za, všechny enzymy komplexu pyruvátdehydrogenázy, ·· pyruvátkarboxyláza.,
2-oxoglutarát/glyoxylátkarboxyláza, a D-glycerátde.hydrogenáza.
amylo-1,δίνη Ιο vá
Lze uvést i další vhodné geny:
Geny spojené s nemocemi aminokyselinového metabolismu, jako například fenylalaninhvdroxyláza, dihydrobiopterinsyntetáza, tyrosinaminotransferáza, tyrosináza, histidináza, fumarylacetoacetáza, .glutathionsyntetáza, γ-glutamylcystein-syntetáza, ornithin-d-aminotransferáza, karbamoylfosfát-syntetáza, ornithinkarbamoyltransferáza, argmaza, reduktáza, 5.ΓΩ.ΪΠ á Z 3 r řetězcem';
argininosukcinát-syntetáza, arginosukcinátlyáza,
L-lysindehydro-genáza, L-lys inketoglutarátvalintransamináza, leucin/isoleucintransdekarboxyláza 2-ketokyselin s rozvětveným isovaleryl-CoAdehydrogenáza, acyl-CoAdehydrogenáza, 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAlyáza, acetoacetylCoA-3-ketothioláza, propionyl-CoA-karboxyláza, metylma 1 onyl- Co.A-mut á za, (.ATP : kobalamin) adeno.syl transf eráza, dihydrofolátreduktá za, metylentetrahydrofolátreduktáza, cvstathionin-p-syntetáza, komplex sarkosindehydrogenázy, proteiny patřící do systému štěpícího glycin, β-alanintransamináza, sérová karnosináza, a cerebrální homokarnosináza^ Geny se vztahem kyselin, jako apolipoproteín apolipoproteiny, k nemocím metabolismu tuků a například lipoproteinová mastných lipáza,
C-II, apolipoproteín E, další lecitin c h o .1 e s t e r o 1 a c e t y 11 r a n s ř e r á z a,
99
9 9 9
9 9 9
Μ ·· • ,99 • ·· • 9
9
9 9 99
9·
LBL receptor, jaterní sterolhyaroxyiáza a α-hydroxyláza kyseliny fytanové. . .
Geny se vztahem k lysozomálním deficitům, jako například lysozomální a-L-iduronidáza, lysozomální iduronátsulfatáza, lysozomální heparsn-N-sulfatáza, lysozomální N-acetyl a-D-glukózoaminidáza, lysozomální acetýl-CoA:ccglukozamin-N-acetyltransferáza, lysozomální N-acetyl-on-Dglukozamin-6-sulfatáza, lysozomální galaktózo-amin-6sulfátsulfatáza, lysozomální β-galaktosidáza, lysozomální arylsulfatáza B, lysozomální· β-glukuronidáza,
N-acet y1g1u kó z oamin y1f o s f o-1 r an s f e r é z a, 1ys oz orná1η ί a- Dmanosidáza, lysozomální α-neuraminidáza, . lysozomální aspartylglukozaminidáza, lysozomální a-L-fukosidáza, lysozomální kyselá lipáza, lysozomální kyselá ceramidáza, lysozomální sfingomyelináza, lysozomální . glukor* cjY'.
v r·. c i n a a rf a Ί. aj iz t n lysozomální galaktosyl-ceramidáza, lysozomální arylsulfatáza A, α-galaktosidáza A, lysozomální kyselá β-galaktosidáza, a řetězec lysozomální hexosaminidázy A. Mohou se také uvést, aniž by to .vynález omezovalo, geny se vztahem k onemocněním steroidního a lipidového metabolismu, geny se vztahem k onemocněním purinového a pyrimidinového metabolismu, geny se vztahem k onemocněním metabolismu porfyrinú a hernu, a geny sé vztahem k onemocněním pojivové tkáně, metabolismu svalů a kostí, a také geny se vztahem k onemocněním krve a hematopoetických orgánů, svalů (myopatie), nervového systému (neurodegenerativní choroby) nebo oběhového systému (například léčení íschémie a stenózy) a geny podílející se na genetických nemocech mitochondrií.
Ve způsobu podle vynálezu může být nukleová kyselina s jakýmkoliv ;em vekt s Kazdou lomomaci φ
• · »
φ · φ • φ « · ·· φ těchto vektorů, která umožní zlepšit genový přenos, např. (aniž by výčet byl omezující), s vektory jako jsou viry, syntetické nebo biosyntetické přípravky (např. činidla jako lipid, polypeptid, glykosid nebo polymer), či dokonce navázání na částice (perličky) nebo' propulzní částice. NukleoLvé kyseliny mohou být také injikovány do svalu, který podstoupil ošetření namířené na zlepšení genového přenosu, např. ošetření farmakologické povahy v aplikaci lokální nebo systémové, nebo ošetření enzymem, permeabilizující (použití surfaktantú), chirurgické, mechanické, tepelné nebo fyzikální ošetření.
Z-vláštni výhoda využití svalu v genové terapii spočívá v mnoha faktorech, jako je např.:
• mimořádná stabilita transgenní exprese přesahující několik měsíců, a proto umožňující stabilní a trvalou produkci intramuskulárního nebo secernovaného léčebného proteinu, • snadnost přístupu ke svalové tkáni, což umožňuje přímé, rychlé a bezpečné podání do orgánu, který není životně důležitý, • velký objem svalové hmoty, což dovoluje rozmanitá místa podávání, • široce prokázaná sekreční kapacita svalu.
K těmto výhodám lze přidat bezpečnost lokální léčby spojenou s použitím místních a cílených elektrických polí.
Vzhledem ke všem uvedeným -výhodám a také bezpečnosti, která doprovází použití slabých polí, může být tento vynález aplikován i na srdeční sval pro léčbu srdečních chorob, např. použitím vhodného defibrilátoru. Může být také použit pro léčbu restenózy pomocí exprese genů inhibujících proliferaci buněk hladkého svalstva, jako je protein GAX.
Kombinace polí nízké intenzity a dlouhotrvajícího podávání, aplikované obzvláště na svaly in vivo, zlepšují • φ «· φ φ»
Φ ΦΦ φ, «ΦΦ 9 φ φφ Φ Φ ΦΦ Φ Φ ΦΦΦΦ
Φφ ΦΦ · Φ Φ ΦΦΦΦΦΦ
ΦΦΦ Φ Φ Φ φ «ΦΦΦ ΦΦ ΦΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦ ΦΦ transfekci nukleových kyselin, aniž by způsobily významné poškození tkání. Tyto výsledky zvyšůjí účinnost přenosu DNA v genové terapii používající nukleové kyseliny.'
Výhodou svalové tkáně v kombinaci se způsobem podle vynálezu je tudíž to, že prostřednictvím genové terapie poprvé umožňuje to, že k vytvoření přípravku ve fyziologických a/nebo léčebných dávkách dochází ve svalových buňkách nebo je přípravek secernován do jejich blízkého okolí nebo systémově do krevního či lymfatického oběhu. Kromě toho vynález poprvé umožňuje jemnou modulaci a kontrolu účinného množství exprimovaného transgenů pomocí možnosti regulovat objem transfekované svalové tkáně, například počtem míst podávání nebo dokonce možností regulovat počet, tvar, povrch a uspořádání elektrod. Další kontrolní prvek vychází z možnosti regulovat účinnost transfekce kolísáním intenzity pole, počtu, trvání a frekvenci pulsů a ovšem, podle stavu techniky, množstvím a objemem podávaných nukleových kyselin. Lze tak dosáhnout vhodné úrovně transfekce a požadované úrovně produkce v tkáních nebo požadovaná sekrece. Konečně způsob zaručuje mimořádnou bezpečnost ve srovnání s chemickými nebo virovými metodami genového přenosu in vivo, při kterých nemůže být zcela vyloučeno a kontrolováno zasažení orgánů jiných než je cílový orgán. Skutečně způsob podle vynálezu umožňuje kontrolu lokalizace transfekované tkáně (naprosto jasně spojené s objemem tkáně podrobené lokálním elektrickým pulsům), a proto poskytuje i možnost návratu k výchozímu stavu tím,- že se úplně nebo částečně odstraní sval, což je možné díky tomu, že svalová tkáň obecně není vitálně důležitá a má velkou regenerační kapacitu. Velká flexibilita použití umožňuje optimalizovat způsob podle druhu zvířete (použití v humánní nebo veterinární medicíně), věku • · · · ·
• · • ftftft • ft pacienta a jeho či jejího věku nebo fyziologického a/nebo patologického stavu.
Způsob podle vynálezu dále poprvé umožňuje transfekovat nukleové- kyseliny značné velikosti, na rozdíl od virových metod, ve kterých je velikost transgenu limitována velikostí kapsidy. Tato možnost je podstatná pro přenos značně velikých genů jako je dystrofin nebo obecně geny- s introny a/nebo značně velikých regulačních prvků, které jsou nezbytné například pro fyziologicky regulovanou tvorbu hormonů. Dále je tato možnost základní pro přenos episomů nebo umělých kvasinkových chromozomů či minichromozomů.
Příklady uvedené v další části slouží k ilustraci vynálezu, aniž by vynález jakkoliv omezovaly. V příkladech jsou odkazy na následující obrázky.
Popis obrázků .
• Obr. 1: Účinek elektrických pulzů s vysokou intenzitou pole na' transfekci plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru. - .
• Obr. 2: Účinek elektrických pulzů se střední intenzitou pole na transfekci plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru.
• Obr. 3: Účinek elektrických pulzů se slabou intenzitou pole na transfekci plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ±-střední chyba průměru.
• Obr. 4: Účinek elektrických pulzů se slabou intenzitou pole a s různou délkou trvání na transfekci plazmidové DNA fc* fcfc fc • fcfcfc fcfc fc fcfc fc • fcfcfc · fcfcfc · • · fcfc • fcfcfcfc • fcfcfcfc fc fcfcfc fcfcfc • · • fcfc fcfc p'XL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru.
Obr. 5: Účinnost elektropřenosu plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši při slabé intenzitě pole, uvedena průměrná
Obr. 6: Kinetik;
svalu svalu s elektropřenoser průměrná hodnota Obr. 7: Hladina s eletropřenosem průměrná hodnota Obr. 8: Vliv elektropřenosu.
Obr. 9: Kinetika fosfatázy. Podání plazmidu pXL3010 s elektropřenosem () nebo bez elektropřenosu (♦.) , uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru.
Obr. 10: Kinetika exprese FGF1 ve' svalu s elektropřenosem (bílé sloupce) a bez elektropřenosu (černé sloupce).
hodnota ± střední chyba průměrů, i exprese luciferázy v horním holenním myši. Podání plazmidu pXL2774 i () nebo bez (X) elektropřenosu, uvedena ± střední chyba průměru.
exprese jako funkce dávky DNA podané (·) nebo bez elektropřenosu (□), uvedena ± střední chyba průměru.
různých typů elektrod na účinnost sérové koncentrace secernované alkalické
Obr. | 11 : | Mapy | plasmidů | pXL3179 | a | pXL3212. |
Obr. | 12 : | Mapy | plasmidú | pXL3388 | a | pXL3031. |
Obr. | 13 : | Mapy | plasmidů | pXL3004 | a | pXL3010. |
Obr. | 14 : | Mapy | plasmidů | pXL3149 | a | pXL3096. |
Obr. | 15: | Mapy | plasmidů | pXL3353 | a | pXL3354. |
Obr. | 16: | Mapa | plasmidu | pXL3348. |
· • 0 0 · · 00 • · 4 · · 00 « · 0 0 0 0 • 0 0 040 000
0 0 0 ••00000 00 40
Příklady provedení vynálezu
Pří klad 1
Pokusy prováděné způsobem podle dosavadního stavu techniky, kdy elektrické pole inhibuje transfekci ' Standardní podmínky elektroporace, které se užívají standardně dle dosvadního stavu techniky, ' byly vyzkoušeny a prokázalo se, že jsou neúčinné nebo' dokonce inhibují přenos nukleových kyselin (plazmidové DNA) do příčně pruhovaného svalu.
Materiály a metody, obecné podmínky pokusů
V tomto příkladu byly užity následující produkty:
DNA pXL2774 (patentová přihláška PCT/FR. 96/01414) je plazmidová DNA obsahující gen luciferázy jako reportérový gen. Ostatní použité produkty jsou běžně komerčně dostupné: ketamin, xylazin, fyziologický roztok (NaCl 0,9 %).
Byl použit běžný komerční osciloskop a generátor elektrických pulzů (obdélníkových nebo čtvercových kmitů) (Eiectropulsator PS 15, Jouan, Francie). Eletrody byly ploché elektrody z nerezové oceli vzdálené od sebe 1 až 15 mm.
Pokusy se prováděly na myších C57 Bl/6. Myši pocházející z různých klecí byly před pokusech náhodně promíchány (randomizace) .
Myši byl anestetizovány směsí ketaminu a xylazinu. Roztok plazmidu (3Ό μΐ roztoku s 500 pg/ml 0,9% NaCl) byl injikován skrz kůži podélně do horního lýtkového svalu pravé i levé končetiny pomocí stříkačky Hamilton. Elektrody byly potřeny vodivým gelem a injikovaná končetina byla pak umístěna mezi elektrody, tak aby s nimi byla v kontaktu.
φφφφ • · · φ * φ » « φ φ φ φφφ φ «φφφ · • φ φ φ «φφφ φφ φφφ φφ φφ φφφ φ φ φ φ φ φ φφφ φφφ φ α
Φ φ Φ φ
Elektrické pulzy byly aplikovány kolmo na osu svalu pomocí generátoru obdélníkových pulzů jednu minutu po injekci. Pomocí osciloskopu se sledovalo napětí ve voltech, V (hodnoty uváděné v příkladech představují maximální hodnoty), trvání pulzu v milisekundách, ms, a frekvence v hertzech, Hz, přičemž frekvence . byla 1 Hz. Bylo aplikováno 8 po sobě jdoucích pulzů.
Pro vyhodnocení transfekce svalu byly myši utraceny sedm dní po podání plazmidu. Horní lýtkový sval obou končetin byl vyjmut, zvážen, umístěn do lyzovacího pufru a rozmělněn. Suspenze byla centrifugována a byl tak získán čistý supernatant. Měření aktivity luciferázy se provádělo v 10 pil supernatantu pomocí komerčního luminometru, ve kterém se automaticky přidával k roztoku substrát. Intenzita luminiscence je uvedena v relativních jednotkách (RLU) pro sval při známém celkovém objemu suspenze (1 x 106 RLU odpovídá 30 pg luciferázy). Každý pokus byl opakován 10 x, tj . 5 zvířat bylo injikováno oboustranně. Statistické vyhodnocení bylo provedeno pomocí neparametrických testů.
Výsledky a diskuse
Výsledky jsou ilustrovány dvěma obrázky, kde je užito buďto lineární nebo logaritmické měřítko (Obr. 1).
V tomto prvním pokusu se testovaly účinky elektrického
pole 800 | až 1200 | V/cm, | což | j sou | podmínky | umožňuj ící |
elektroporaci nádorů | (Mir | et al. | . , Eur | J. Cancer 27, 68, | ||
1991) . | ||||||
Bylo | pozorováno | (viz | obr. 1 | ) , ve | srovnání | s kontrolní |
skupinou, | kde byla injikována DNA | bez eletrických | pulzů, že | |||
• s osmi | pulzy 1200 | V / cm | a délkou 0 | , 1 ms byla průměrná |
hodnota aktivity luciferázy mnohem nižší, • · « · ♦ 99 9 • 9 9 9
999 999 • s pulzy 1200 V/cm a délkou 1 ms tři zvířata uhynula a navíc průměrná aktivita luciferázy byla mnohem nižší, • s pulzy 800 V/cm a délkou 1 ms byla průměrná hodnota luciferázové aktivity také významně snížena.
Většina svalů, které byly vystaveny působení elektrického pole, byla viditelně změněna (svaly byly drobivé a bělavého vzhledu). ·
Příklad 2
Přenos nukleových kyselin pomocí elektrického pole střední intenzity
Tento pokus byl proveden na myších C57 Bl/6. Až na intenzitu elektrického pole a jeho trvání byly podmínky provádění pokusu prakticky shodné s příkladem 1.
Výsledky jsou uvedeny, na obr. 2. Opakoval se v podstatě výsledek příkladu 1, tj . inhibující účinek 8 pulzů intenzity 800 V/cm a délky 1 ms na aktivitu luciferázy detekované ve svalu. Užitím pole intenzity 600 V/cm byla zjištěna stejná inhibice a stejné změny svalové tkáně. Ale na druhé straně velmi překvapivě snižování napětí vedlo k tomu, že svalová tkáň nebyla již poškozována a při 400 a 200 V/cm byla míra transfekce svalů v průměru vyšší než u svalů bez aplikace elektrického pole. Je třeba poznamenat, že ve vztahu ke kontrolní skupině (nebyla vystavena působení elektrického pole) rozptyl hodnot luciferázové aktivity je významně snížen při 200 V/cm (střední chyba průměru je 20,59 % ve srovnání s hodnotou 43,32%· v nepřítomnosti elektrického pole, viz obr. 2A).
' φ · · · • φ φ φ φ φ φφ φ φφφ φφφ »«·· φ φ « φ · φ φ φ · « φ φφφφ φ φφφφ φ φ φφφ φφφ φφφ φφφφφ φφ φφ
Příklad 3
Pokus s přenosem nukleové kyseliny pomocí pulzů pole nízké intenzity, který ukazuje velmi vysokou stimulaci exprese transgenu
Tento pokus byl proveden na myších C57 Bl/6. Až na intenzitu elektrického pole a jeho trvání, a skutečnost, že pulzy byly aplikovány 25 vteřin po injekci DNA, byly podmínky shodné s předchozími příklady.·
Výsledky jsou uvedeny na obr. 3. Průměrné hodnoty exprese transgenu luciřerázy byly výrazně zvýšeny při trvání pulzu 20 ms při 100 V/cm a počínaje pulzy dlouhými 5 ms při 2 0 0 V/cm.
Pokus také jasně ukázal, že průměrná hodnota luciferázové aktivity získané po eletrotransfekci DNA do svalu je funkcí trvání elektrických pulzů, pokud se užije napětí 200 a 100 V/cm. Bylo také pozorováno, že rozptyl hodnot luciferázové aktivity byl významně snížen u skupiny, kde byla aplikována elektrotransfekce · (obr. 3A). V nepřítomnosti elektrického pole (kontrola) byla relativní střední chyba, průměru 77, 43 %. průměrné hodnoty, zatímco se snížila na 147 (200 V/cm, 5 ms) a na 41,27 % (200. V/cm, 20 ms) anebo na 30 až 48% při elektropřenosu v poli 100 V/cm.
V nej lepších podmínkách tohoto pokusu byl faktor zvýšení exprese transgenu 89,7 vzhledem ke kontrole injikované bez aplikace elektrických pulzů.
44
4 4
4 4
4
9
444 4
4 44 49
4 4
Příklad 4
Pokus s elektropřenosem nukleové kyseliny do svalu při 200V/cm, který ukazuje zvýšení exprese transgenu více než 200x
Tento experiment byl proveden na myších 'DBA 2 s elektrickými pulzy 200 V/cm s různou délkou. Ostatní podmínky byly shodné jako v příkladu 3.
Pokus potvrdil, že při 200 V/cm se transfekce luciferázy zvyšuje, když se zvyšuje trvání pulzu nad 5 ms (obr. 4 a 5) . Bylo zde opět pozorováno snížení vnitroskupinové variability detekované hodnotou střední chyby průměru, u skupiny s elektrotransfekcí ve srovnání s kontrolou (relativní hodnoty střední chyby průměru byly 35 %- pro kontrolu a 25, 22, 16, 18 a 26 % pro série pulzů s dobou 1, 5, 10, 15, 20 a 24 ms, v uvedeném pořadí). V optimálních podmínkách v tomto pokusu byla- zvýšena exprese transgenu 205 x vzhledem ke kontrole injikované bez elektrických pulzů. Výsledky.pokusu ukazují, že změny v době trvání pulzu jsou prostředkem -jak modulovat účinnost přenosu nukleových kyselin a jak regulovat hladinu exprese transgenu.
Příklad 5
Účinnosti elektropřenosu nukleových' kyselin je funkcí součinu počet pulzů x intenzita pole x doba trvání každého pulzu
Obr. 5 slouží za příklad důležitosti 'parametru odpovídajícího součinu počet pulzů x intenzita pole x trvání každého pulzu. Tento parametr ve skutečnosti odpovídá í«í-Z-;í.í '
4· ftft ft ft* · • ftft • ft· ftft* ftftftft ftft ftftft ftft integrálu funkce závislé na čase, která popisuje změny elektrického pole.
Data uvedená na obr. 5 byla získána v průběhu pokusů v příkladech 2, 3 a 4 s intenzitami elektrického pole
200 V/cm a 100 V/cm a bez elektrického pole. Údaje ukazují, že účinnost transfekce roste jako funkce součinu celkové doby expozice elektrickému poli a intenzity pole. Stimulujícího účinku bylo dosaženo při hodnotě parametru počet pulzů x intenzita pole x trvání každého 'pulzu přesahující 1 kV x ms/cm. Podle výhodného provedení vynálezu stimulace je dosaženo pro hodnoty součinu elektrické pole x celková doba' trvání pulzů shodné nebo vyšší než 5 kV x ms/cm.
Příklad 6
Vliv prodloužení doby elektrického pulzu
Tento příklad ilustruje fakt, že je možné prodloužit trvání jednotky pulzu ještě více než bylo zkoušeno v příkladu 4.
Pokus byl proveden s myšmi C57B1/6, použit byl plazmid pXL2774, množství podané DNA bylo 15 pg. Byl užit generátor elektrických pulzů, poskytující délku pulzů větší než 20 ms (Centronics, model T 820, Centronics, San Diego, CA), byl užit proměnlivý počet pulzů a doba pulzů, ale při konstantní intenzitě pole 200 V/cm, ostatní podmínky byly shodné jako v příkladu 1. Výsledky jsou uvedeny v tab, 1.
-- y <
φφ φ φ φ φ • φφφ φ
φφ • · · · · ·· φ · • · · · · φ Φφ φ φ φ φ φφφ φφφφφφ φ φφ φ φ φ φ φφφ φ φφ
Trvání pulzu (ms) | 0 | 1 | '5 | 10 | 20 | 30 | 40 | 50, | 60 | 80- |
Pokus A 8 pulsů | 11 ±5 | 39 ± 6 | 211 ±2 6 | 288 ±46 | 1158 ±238 | 1487 ±421 | 2386 .±278 | |||
Pokus B 4 pulsy | 11 ±5 | 26,8 + 6 | 123 ±17 | 24 6 ±32 | 575 ±88 | 704 ±130 | 3440± 1077 | |||
Pokus C 4 pulsy | 15 + 8 | 2885 ±64 4 | 2626 ±4 41 | 1258 ±309 |
Tabulka 1: Střední hodnota aktivity luciferázy v milionech relativních jednotek (RLU) na sval ± střední chyba průměru (SEM), v každé skupině N=10. Podmínky, elektropřenosu: intenzita pole 200 V/cm, 8 nebo 4 pulzy - (proměnlivé trvání jednotky), frekvence 1 Hz.
Zvýšená exprese transgenů -byla pozorována- při prodloužení trvání jednotky pulzů (na alespoň 40 ms při aplikaci série 8 pulzů nebo na alespoň 50 ms při aplikaci série 4 pulzů při intenzitě pole :200 V/cm). Tento příklad ukazuje, že optimální doba trvání pulzu závisí na počtu aplikovaných pulzů a že trvání jednotky pulzů může dosáhnout až 80 ms, přičemž touto hodnotu není omezeno.
Příklad Ί
Účinnost elektropřenosu jako funkce počtu elektrických pulzů
Tento příklad demonstruje vliv rostoucího počtu pulzů na účinnost elektropřenosu nukleových kyselin.
V pokusu byly použity myši C57B1/6, plazmid pXL2774, množství podané DNA bylo 15 pg. Proměnlivý byl počet pulzů, doba pulzu byla 20 ms, intenzita pole 200 V/cm. Ostatní podmínky pokusu byly stejné jako v příkladu 1. Výsledky jsou uvedeny v tab. 2.
• * * · » * · .
» »« • · · » · · • . · · ·· ··· *·· «
• · · * · • · • · ««
Počet pulzů | 0 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | 12 | 16 |
celkem RLU | 70 + 56 | 147 ± 26 | 281 ± 46 | 439 ± 50 | 67 8' ± 129 . | 819 . ± 73 | 929 + 169 | 890 ± 137 |
Tabulka 2: Průměrná, hodnota exprese luciferázy v milionech relativních jednotek (RLU) na sval ± střední chyba průměru (SEM), v každé skupině N=10. Podmínky elektropřenosu: intenzita pole 200 V/cm, proměnlivý počet pulzů délky 20 ms, frekvence 1 Hz.
Bylo zjištěno, že exprese luciferázy se podstatně zvyšovala počínaje aplikací jediného pulzu a pak se dále zvyšovala se zvyšujícím se počtem pulzů. Ukázalo se, že variací počtu pulzů se může modulovat účinnost přenosu nukleové kyseliny a tím regulovat hladina exprese transgenu.
Snížení variability odpovědi demonstrované snížením hodnoty střední chyby průměru relativně k hodnotě průměru se potvrdilo pro všechny skupiny, u kterých byl aplikován· elektropřenos.
Příklad 8
Vliv zvýšení frekvence elektrických puizů
Tento příklad ukazuje, že rostoucí frekvence pulzů překvapivě umožňuje zvýšit účinnost transfekce. Navíc, z hlediska klinického použití, pulzy s vyšší frekvencí zvyšují komfort pacienta tím, že se snižuje celkový čas aplikace.
V tomto pokusu byly použity myši- C 57B1/6. Použitý plazmid byl pXL2774, množství podané DNA. bylo 15 pg.
Frekvence se v pokusu měnila (od 0,1 do '4 Hz) .' Doba pulzu ·· • 1 • ·· ·· »· * · * · • · · · ··· ··*
·.
·· byla 20 ms, intenzita pole 200 V/cm. Ostatní experimentální podmínky byly stejné jako v příkladu 1. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny v tab. 3.
Frekvence (Hertz) | 0 | 0, 1 | 0,2 | 0, 5 | 1 | 2 | 3 | 4 |
Pokus A 8 pulsů | 5 ±2 | 54 ±13 | 95 ±16 | 405 ±60 | 99 6 ±156 | 152 8 ±257 | ||
Pokus B 4 pulsy | 114 ±14 | 163 ±24 | 175 ±26 | 337 ±53 | 587 ±90 | |||
Pokus C 8 pulsů | 21 ±14 | 1294 ±189 | 2141 ±387 | 3634 ±868 | 2819 ±493 | |||
Pokus D 4 pulsy | 14 51 ±228 | 1572 ±320' | 1222 ±126 | 2474 + 646 |
Tabulka 3: Průměrná hodnota aktivity luciferázy v milionech relativních jednotek (RLU) na .sval ± střední chyba průměru (SEM), N=10 v každé skupině. Podmínky elektropřenosu: intenzita pole 200 V/cm, 8 nebo 4 pulzy, délka pulzu 20 ms, proměnlivá frekvence.
Výsledky získané v pokusu A ukázaly, že vyšší frekvence (vyšší než 1 Hz) .jsou účinnější než nízké frekvence, které odpovídají delší době mezi následujícími pulzy (10 s při 0,1 Hz) . Transfekční účinnost se zvyšovala s frekvencí v testovaném rozmezí od 0,1 do 4 Hz při 4 pulzech a od 0,1 do 3 Hz při aplikaci 8 pulzů. '
Příklad 9
Vliv aplikace elektrického pole exponenciálně se zmenšujícího v závislosti na čase
Tento příklad ukazuje účinek aplikace exponenciálně se snižujícího elektrického pole na účinnost přenosu nukleových kyselin. .
44
4 4 4 • 4 4 4
444 444
4
44 ·· » 4 · 4 • 44 ·
V tomto pokusu byly užity myši C57B1/6. V pokuse byl užit plazmid pXL3031 (obr. 12), což je vektor odvozený z plazmidu pXL2774, do kterého byl vložen gen luc+ kódující modifikovanou (cytoplazmatickou) luciferázu z Photinus pyralis získanou z pGL3basic (GenBank CVU47295) pod kontrolu promotoru získaného z časného úseku cytomegaloviru (hCMV IE, GenBank HS51EE) s polyadenylační signálem z pozdního úseku viru SV40 (GenBank SV4CG). Bylo podáno 10 qg DNA.
Byl použit zdroj elektrických· pulzů, který umožňoval aplikovat (model Easyject, Equibio, Plus, Kent, UK)' pulzy elektrického pole s intenzitou měnící se podle exponenciálně klesající funkce v závislosti na čase (Equibio elektropulzátor, model Easyject Plus, Kent, UK). ' Velikost aplikovaného napětí odpovídá hodnotě napětí v maximu' exponenciály. kapacitance (
Druhým nastavitelným parametrem byla μιΤ) , která kontroluje celkové množství dodané energie. Výsledky jsou uvedeny v tab. 4.
Kap. 150qF | Kap. 300qF | Kap. 450qF | Kap. 60 0qF | Kap. 1200qF | Kap. 2400qF | Kap. 3000qF | |
40 V/cm | 1,23 | 11 | |||||
100 V/cm | 16,5 | 2, 8 | 6, 5 | 23,9 | |||
150 V/cm | 1,8 | 3,5 | 6, 1 | ||||
200 V/cm | 5, 1 | 15,8 | 18, 8 | 121,5 | 189, 7 | ||
300 V/cm | 32, 1 | 90,5 | 48, 7 | 760, 4 | 56, 2 | ||
400 V/cm | 795 | ||||||
600 V/cm | 62 | ||||||
800 V/cm | 3,1 | 1, i |
Tabulka 4: Faktor zvýšení exprese (aktivity luciferázy)po aplikaci exponenciálně se snižujících pulzů. faktor zvýšení je vypočten vzhledem ke kontrole, která byla získána injekcí plazmidu pXL3031 bez použití eléktropřenosu (uvedeny jsou průměrné hodnoty faktoru zvýšení, v každém testu bylo N =4 až N = 6.
* · · · • · · · * · · · • · · · · · • * • · · · · • · ·« • » · · · • ** • « · · • · » ···» «· ·
Pro srovnání uvádíme, že faktor zvýšení exprese pro přenos pXL3031 při aplikaci obdélníkových pulzů (intenzita 200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, s frekvencí' 1 Hz) byl v témže pokusu 4 4.
Tyto údaje ukazují, že je možné užít obdélníkové elektrické pulzy exponenciálně se snižujícího elektrického pole. Kromě toho v takovém případě bylo dosaženo podstatného zvýšení exprese při nízké intenzitě pole s vyšší kapacitanci
(např. | 200 | V/cm | a kapacitance -3000 pF) | nebo | při | vysoké |
intenzitě | pole | s nižší kapacitanci | (např. | 400 | V/cm |
a kapacitance 300 pF) .
Příklad 10
Vliv kombinace krátkého pulzu vysokého napětí a několika dlouhých pulzů nízkého napětí
Tento příklad ukazuje, že aplikované elektrické pole může být kombinace alespoň jednoho pulzu silného pole 500 až 800 V/cm po krátkou dobu, např. 50 nebo 100 ps, a alespoň jednoho pulzu slabého pole (méně než 100 V/cm) po.delší dobu, např. delší než 1 ms až do 90 ms jak bylo užito v tomto pokusu.
Slabé elektrické pole v tomto pokusu mělo intenzitu 80 V/cm a bylo aplikováno ve 4 pulzech s frekvencí 1 Hz a dobou jednoho pulzu 90 ms. Byla použita dvě komerční elektropulzni zařízení. Elektrické pulzy byly nejdříve aplikovány jedním a pak druhým zařízením,' změna se uskutečnila v době kratší než 1 vteřina pomocí manuální kontroly zařízení.
φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφ φ
φφφφ φφ φφ φ φ φ φ • φ φ φ φφφ φφφ φ φ φφ φφ
Plazmid použitý v tomto pokusu byl pXL3031. Podané množství DNA bylo 3- μμ. Byly použity proměnlivé hodnoty intenzity elektrického pole, jak jsou uvedeny v tab. 5, ostatní experimentální podmínky byly shodné s příkladem 1.
Podmínky elektrického pole | Pokus 1 (3 μμ pXL3031) | Pokus 2 (3 μ5 pXL3031) |
Kontroly (bez elektrického pole) | 320 ± 126 | 75 ± .2 7 |
Al : 500 V/cm , 1 x 0.1 ms | - | 169 ± 63 |
A3 : 800 V/cm , 1 x 0.1 ms | 416 + 143 | 272 ± 84 |
B : 80 V/cm , 4 x 90 ms, 1 Hz | 1282 + 203 | 362,21 + 85,17 |
Podmínky: Al, pak B | - | 1479 ± 276 |
Podmínky: A3, pak B | 3991 ± 418 | 1426 ± 209 |
Podmínky: B, pak A3 | - | 347 + 66 |
Tabulka 5: Střední hodnoty luciferázové aktivity ± střední chyba průměru (SEM) v milionech RLU na sval. V každé skupině N = 10.
Tabulka 5, shrnující výsledky získané ve dvou sériích experimentů, ukazuje, že aplikace krátkého vysokonapěťového pulzu, nebo 4 dlouhých nízkonapěťových po sobě následujících pulzů, jen málo zvyšuje transfekční účinnost ve srovnání s kontrolní skupinou, která dostala injekci plazmidu pXL3031 ale nebyla vystavena působení elektrického pole. Totéž platí, když se aplikují slabé pulzy před pulzem vysokého napětí.
Naproti tomu v obou sériích pokusů kombinace krátkého vysokonapěťového pulzu následovaného 4 po sobě jdoucími pulzy nízkého napětí zřetelně vedla ke zvýšení účinnosti transfekce
DNA.
Jak bylo ukázáno v příkladu 1 a 2, aplikace 8 pulzů při intenzitě 600, 800 nebo 1200 V/cm po dobu 1 ms s frekvencí 1 Hz způsobovala svalové léze a inhibovala transfekci. Výsledky získané v tomto příkladu 10 ukazují že za popsaných podmínek je možné požít vysokonapěťové pole, aniž by
9
9999
způsobilo léze. A skutečně podle makroskopické vyšetření svalů svaly nebyly nikdy viditelně poškozeny. Užití vysokonapěťové pole s krátkou dobou 'trvání v kombinaci se slabým polem delšího trvání poskytuje další prostředek pro modulaci účinnosti přenosu DNA..
Příklad 11
Elektropřenos s plazmidy různých velikostí, geny řízenými různými promotory a nebo se sekvencemi pro různá cílová místa proteinu exprimovaného transgenem
11.a - Elektropřenos plazmidů různé velikosti
Byly testovány plazmidy různých velikostí (2,8 kb, 3,8 kb, 8,6 kb, 20 kb a 52,5 kb) obsahující gen kódující luciferázu. Množství podaného plazmidu bylo 10 pg na sval. Bylo aplikováno elektrické pole s intenzitou 200 V/cm v 8 pulzech délky 20 ms· s frekvencí 2 Hz, ostatní podmínky byly shodné s příkladem 1.
Bylo pozorováno zvýšení exprese transgenu přibližně 50 x s plazmidy velikosti 2,8 a 3,8 kb, asi 80 x pro plazmid velikosti 8,6 kb a zvýšení· 3 až 6 x pro plazmidy velké 20 a 52, 6 kb.
Tento příklad demonstruje možnost přenosu plazmidů velkých 20 kb a více.
11.b - Kontrola luminiscenčního signálu v nepřítomnosti genu kódujícího luciferázu
Jako kontrola, a také pro vyloučení možnosti, že luminiscenční signál pozorovaný v testech luciferázové aktivity je výsledkem radikálů vznikajících ve tkáni vlivem • fc fcfc fcfc • fcfcfcfc fc · · ·' · • ••fc fc · • fc fcfc elektrického působení, byla aktivita luciferázy testována na svalech, do kterých byl vnesen plazmid nekódující luciferázu a pak byly podrobeny účinkům elektrického pole.
Elektropřenos | - | + |
Plazmid pXL 3004 (15 pg) | 0, 016 ± 0, 005 | 0, 015 ± 0,006 |
kódující β-galaktosidázu | (n = 6) | (n=6) |
.Plazmid pXL 2774 (15 pg) | 7,33 ± 3,5, | 491,71 ± 122,28 |
kódující luciferázu | (n = 10) | (n = 10) |
Tabulka 6: Aktivita lucifrázy ve svalech injikovaných různými plazmidy, buďto s nebo bez aplikace elektrického pole. Podmínky pokusu:, 200 V/cm, 8 pulzů délky' 20 ms, frekvence 1 Hz. průměrná hodnota ± střední chyba průměru pro luciferázovou aktivitu v milionech RLU na sval.
Výsledky ukazují, že bazální luciferázová aktivita ve svalech injikovaných plazmidem, který nekóduje luciferázu, je zcela zanedbatelná.
ll.c - Elektropřenos genů řízených různými promotory
Byl testován účinek různých promotorů na hladinu exprese přenesených genů s aplikací elektrického pole nebo bez něho.
Množství plazmidu injikované do každého svalu bylo 2 pg.
Bylo aplikováno elektrické pole s intenzitou 200 V/cm v 8 pulzech délky 20 ms s frekvencí 1 Hz, ostatní podmínky byly shodné s příkladem 1. Výsledky' jsou uvedeny v tab. 7. Testovaný plazmid byl pXL3031 s konstruktem CMV-LUC. Konstrukt PGK odpovídal tomu, že promotor CMV byl nahrazen promotorem PGK v plazmidu pXL3031.
·· ·· • · · * • ·♦ • · · • · · ···· ·· • ·· ·· ♦· ·· · · · · * · • · · · · · • · · ····#♦ • · · · φ·· ··«· ·· ··
Promotor | PGK | CMV | ||
Elektropřenos | - | + | - | + |
RLU | 8 ± 2, 8 | 1070 ± 327 | 157 ±83 | 20350± 1112 |
Faktor zesílení | x 133,7 | x 129, 3 |
Tabulka 7: Průměrné hodnoty ± střední ohýba průměru luciferázové aktivity v milionech RLU na sval.
Výsledky ukazují, že Když je DNA přenášena v přítomnosti elektrického pole, faktor zvýšení exprese transgenu je srovnatelný bez ohledu na původ a sílu promotoru.
11. d - Elektropřenos genu s různými cílovými místy proteinu exprimovaného transgenem
Tento příklad ilustruje přenos genů kódujících proteiny s různou lokalizací. Plazmid pXL3031 kóduje luciferázu syntetizovanou v cytosolu a plazmid pXL2774 kóduje luciferázu směrovanou do peroxisomú.
Množství plazmidu injikované do svalu bylo 10 pg. Byloaplikováno elektrické pole s intenzitou 200 V/cm v 8 pulzech délky 20 ms s frekvencí 1 Hz, ostatní podmínky byly shodné s příkladem 1. Výsledky jsou uvedeny v tab. 8.
pXL2774 | pXL3031 | ||
elektropřenos - | elektropřenos + | elektropřenos - | elektropřenos + |
11 ± 5 | 1158 ± 238 | 839 ± 281 | 111524 ± 16862 |
Tabulka 8: Průměrné hodnoty ± střední chyba průměru luciferázové aktivity v milionech RLU.
Výsledky ukazují, že způsob podle vynálezu je vhodný pro přenos genů, které kódují proteiny s různou buněčnou ·· ··
4 4 4
44
4 4
4 4
4444 44
44 44 44
4 4 4 4 9 4 · 9 4 4 ·
9 4 444 444
4 4 4
4 4 444 44 44 lokalizací, zvláště pak pro peroxisomální a proteiny.
cytosolické
Přiklad 12
Kinetika a histologická analýza exprese transgenu
12.a - Kinetika exprese transgenu tento příklad ukazuje, že přenos nukleových kyselin v přítomnosti elektrického pole za podmínek podle vynálezu umožňuje získat expresi, transgenu s vysokou a stabilní hladinou na dobu nejméně 4 měsíců.
V tomto pokusu byly užity myši C67B1/6. Použitý plazmid byl pXL277-4, množství podané DNA bylo 15 pg. Po injekci DNA bylo aplikováno elektrické pole (nikoliv u kontroly) následujících vlastností: 200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, frekvence 1 Hz. Ostatní podmínky byly stejné jako v příkladu 1. Aktivita luciferázy byla stanovena pro skupiny 10 myší utracených v různé době po injekci DNA. Výsledky jsou ukázány na obr. 6.
Bylo pozorováno, že exprese lucifeázy je detekovatelná od třetí hodiny po injekci plazmidu a zvyšuje se až do třetího dne ' (D3) a pak začíná klesat od 35. dne.
Bylo také pozorováno, že u skupin, kde byly aplikovány elektrické pulzy, se exprese transgenu udržovala na výrazně vyšší hladině než u kontrolní skupiny. Dále bylo pozorováno, že hladina exprese zůstala vysoká a konstantní i po 35 dnech a nejméně do 120 dnů. Tato vysoká a trvalá exprese transgenu je zvláště významná z perspektivy dlouhodobého klinického využiti terapeutických genů.
• ·
,
12.b - Histologická analýza
Histologická analýza byla provedena ve stejných podmínkách, kromě toho, že byl podán plazmid pCOR CMV-lacZ (pXL3004) kódující β-galaktosidázu s jadernou lokalizací.
Plazmid pXL3004 (viz obr. 13) je vektor získaný z plazmidů pXL2774 (viz WO 97/10343), který byl modifikován vložením genu lacZ doplněného signální sekvencí pro jadernou lokalizaci (viz Mouvel et al. , 1994, Virology 204, 180-189), pod kontrolou promotoru CMV z plazmidů pCDNA3 (Invitrogen, Holandsko) a polyadenylačního signálu časného úseku SV40 (Genbank SV4CG).
Zvířata byla utracena 7 dnů po podání plazmidů. Histologická analýza umožnila detekovat buňky exprimující β-galaktosidázu jejichž jádro leží v rovině řezu (Xgal histochemie). ' v
Počet mvofibril s pozitivním jádrem v rovině řezu byl v průměru 76 u skupiny (n = 8), která dostala plazmid pXL3004 a pak byla vstavena působení elektrických pulzů, ve srovnání s průměrem 8,5 u kontrolní skupiny (N =8), tj. zvířaty, která dostala plazmid pXL3004 ale bez aplikace elektrických pulzů.
Bylo pozorováno, že počet svalových vláken exprimujících transgen byl v průměru 9 x vyšší ve srovnání s kontrolní skupinou. Většina svalových vláken byla v klidovém stadiu s jádrem lokalizovaným periferně. Fibrily s centrálně lokalizovaným jádrem jen vzácně exprimovaly β-galaktosidázu. Bylo také pozorováno., že podél dráhy vpichu plazmidů je hustota pozitivních svalových vláken na jednotku povrchu vyšší ve skupině s elektropřenosem ve srovnání s kontrolní skupinou.
Tyto výsledku souhrnně ukazují, ve srovnání se svaly, které nebyly vystaveny elektrickému poli, že elektropřenos umožňuje výrazně zvýšit počet svalových vláken exprimujících • · transgen a také vede k výraznému zvýšení povrchu oblasti exprimující transgen. Bylo také pozorováno, že aplikace elektrického pole nevyvolává významné zánětlivé reakce.
Příklad 13
Vliv okamžiku, kdy je injikován plazmid, vzhledem k aplikaci elektrického pole
Tento příklad ilustruje skutečnost, že nukleové kyseliny mohou být podávány přinejmenším 30 minut, a dokonce přinejmenším 1 hodinu před aplikací elektrického pole.
V pokusu byly užity myši C57B1/6, použitý plazmid byl pXL2774 a množství podané DNA bylo 15 gg nebo 1,5 gg. Podání DNA. předcházela nebo následovala aplikace elektrického pole: 200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, frekvence 1 Hz. Ostatní experimentální podmínky byly stejné jako v příkladu 1. Kontrolní myši obdržely injekci plazmidu, ale nebyly vystaveny elektrickému poli. Získané výsledky jsou uvedeny v t ab. 9 .
Tabulka 9A: Injekce DNA bez aplikace elektrického pole
pokus 1 | pokus 2 | pokus 3 | pokus 4 | pokus 5 | |
pXL2774 | pXL2774 | pXL2774 | pXL2774 | pXL2774 | |
(15 gg) | (15 gg) | (1,5 gg) | (15 gg) | (1,5 gg) | |
kontrola | 7 + 4 ' | 8 + 6 | 0.4+0.2 | 22±15 | 1 + 1 |
• ·
Tabulka 9B: Injekce DNA před aplikací elektrického pole
9 9 9 ··· · · · · · ··· · ····· • · «· · 9 9. 999 99,9 • · · · · · · ···· ·· ··· ···· ·· ··
čas | pokus 1 | pokus 2 | - pokus 3 | pokus 4 | pokus 5 |
-120 minut | 20±5 | 2±1 | |||
-60 minut | 106±22 | 10 ±3 | |||
-30 minut | 303 + 36 | 237 ± 61 | 7 ± 3 | 184 ± 22 | 15 ± 4 |
-5 minut | 410 ± 7 | ||||
-60 s | 253 ± 51 | ||||
-2 0 s | 492 + 122 | 2 01 ± 4 3 | 9 + 3 | 123 ± 23 | 12. ± 2 |
Tabulka 9C: Injekce DNA po aplikaci elektrického pole
čas | pokus 1 | pokus 2 | pokus 3 | pokus 4 | pokus 5 |
+ 10 s | 7 + 7 | ||||
+2 0. s | 11 + 6 | 0,4 + 0,1 | |||
+ 60 s | 8 ± 7 | 17 ± 15 |
Tabulka 9: Průměrné hodnoty ± SEM luciferázové aktivity v milionech RLU na'sval. V každé skupině N = 10 svalů.
Přítomnost DNA v okamžiku aplikace elektrického pole je podmínkou účinné elektrotrnasfekce. Překvapivě bylo pozorováno, že injekce plazmidové DNA může být aplikována nejméně 30 minut a dokonce až jednu hodinu (pokusy 4 a 5) před aplikací elektrického pole, aniž by to výrazně ovlivnilo hladinu exprese. Podobné .výsledky byly získány jak s dávkami 15 pg plazmidu na sval tak i s 1.0 x nižšími dávkami 1, 5 pg.
Tyto výsledky umožňují představit si aplikaci několika injekcí stejného plazmidu, nebo různých plazmidů, do svalu v různých okamžicích před aplikací elektrického pole. Je také možné aplikovat několik injekcí do rozsáhlé oblasti svalu a pak aplikovat sérii elektrických pulzů na celou injikovanou oblast.
• · ·· • · · · • · · • · · • · · • € · · · · ·· ··
Příklad 14
Statistická studie závislosti mezi injikovanou dávkou DNA a hladinou exprese
Statistická analýza uvedená v tomto příkladu dovoluje srovnání závislosti účinku na dávce transgenu při aplikaci elektrického pole nebo bez něho. Tento pokus potvrdil, že elektropřenos značně snižuje variabilitu exprese transgenu.
Pět· týdnů staré myši C57B1/6 byly injikovány plazmidem pXL3031 intramuskulárně bilaterálně do horního holenního svalu. Dávky plazmidu byly v rozpětí od 0,25 do 32 pg DNA. Bezprostředně po injekci byla jedna z injikovaných končetin vystavena působení elektrického pole 250 V/cm se , 4 pulzy v délce 20 ms a frekvencí 1 Hz.
Zvířata byla utracena 5' dnů po ošetření a exprese transgenu se zkoumala ve tkáňových extraktech z každého svalu. Výsledky jsou uvedeny na obr. 7.
Porovnání změn v rozptylu jako funkce průměru pro každou sérii myší (n=10) jasně ukázalo, že rozložení exprese transgenu má logaritmicko-normální charakter. Grafická analýza výsledků na obr. 7 potvrzená výpočty ukázala, že exprese se mění lineárně s logaritmem injikované dávky DNA.
Cochranův test ukázal, že zde existuje homogenita rozptylu pro každou regresi (s elektropřenosem a bez něho), což umožnilo použití reziduálního rozptylu k provedení všech výpočtů.
Test odchylky od linearity nebyl významný v rámci 5% rizika při elektropřenosu. Naproti tomu odchylka od linearity byla vysoce významná ' (p<0,01), což ukazuje na značnou heterogenitu za podmínek bez elektropřenosu).
Reziduální rozptyl je přielektropřenosu 5x nižší.
·· »· • · · · • · · ·
Vezmeme-li v úvahu stanovené hodnoty ' reziduálního rozptylu, je možné užít 5x méně zvířat k získání stejné síly testu srovnání transfekční účinnosti s elektropřenosem a bez elektropřenosu. Tudíž pro demonstraci rozdílu v expresi charakterizovaném faktorem 2, 5 nebo 10, s 95% spolehlivostí, bylo by nutné injikovat 33, 8 nebo 5 zvířat s elektropřenosem a 165, 40 nebo 25 zvířat bez elektropřenosu. Tabulka shrnující tento typ výpočtů v případě elektropřenosu následuje.
poměr účinnosti | P = 95% | P = 90% | P = 85% | P = 75% |
2 | 33 | 28 | 24 | 19 |
5 | 8 | 7 | 6 | 6 |
10 | 5 | 5 | 4 | 4 |
Tudíž snížení interindividuální variability dosažené elektropřenosem dovoluje provádět přesné analytické studie transfekce ke srovnání exprese různých genů. Umožňuje také lepší definici léčebných dávek a také zabraňuje riziku spojenému s překročením' dávek přijatelných v terapeutickém rozmezí. ·
Výsledek testu srovnávajícího směrnice získané pro každou regresní závislost' nebyl významný. Lze tedy s 5% rizikem pokládat směrnice obou regresí za rovnoběžné.
Výpočty relativního účinku ukázaly, že k získání stejného' účinku by bylo třeba injikovat do svalu 250x více DNA ve standardních podmínkách ve srovnáním s elektropřenosem (243 ± 85, 95* interval spolehlivosti).
Tyto výsledky pomocí korelace ukazují, že při stejné dávce DNA je hladina exprese 500x při elektropřenosu ve srovnání se standardním postupem bez' elektropřenosu.
• ·· ·· ·· ··· · · ·· · • · ♦ · · · • · · ······ • · · · ·«····· ·· · · • c
Příklad 15 Srovnání různých typů elektrod
Cílem tohoto příkladu bylo· srovnání účinnosti přenosu DNA při použití dvou typů elektrod, a sice destičkových elektrod a jehlových elektrod. Kromě toho jehlové elektrody byly testovány pro různé orientace implantace.
Plazmid pXL2774 (150 pg) -byl injikován do trojhla-vého svalu potkana. Destičkové elektrody byly umístěny jak bylo popsáno v příkladu 1 se vzájemnou vzdáleností elektrod 1,2 cm. U'jehlových elektrod byla mezielektrodová vzdálenost 0,9 cm. Jehlové elektrody byly vnořeny ve stejné délce do svalové tkáně, buďto paralelně nebo kolmo k ose svalových vláken, na obou stranách místa injekce. Bez ohledu na typ a orientaci elektrod, vlastnosti elektrického pole byly následující: intenzita 200 V/cm, 8 pulzů po 20 ms, frekvence 2 Hz. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny na obr. 8.
Výsledky ukazují, že aplikace elektrického pole pomocí dvou paralelních jehel implantovaných do svalu poskytuje výsledky srovnatelné s těmi, které byly získány s destičkovými elektrodami v kontaktu s kůží obklopující sval. Bylo také ukázáno, že účinnost elektropřenosu je nezávislá na směru implantace jehlových elektrod vzhledem k ose svalových vláken. ,
Tento příklad ukázal, že způsob podle vynálezu dovoluje elektropřenos nukleových kyselin jak s vnějšími (destičkovými) tak invazivními (jehlovými) elektrodami, a to bez ohledu na orientaci vzhledem k cílové 'tkáni. Použití jehlových elektrod je zvláště výhodné pro podávání nukleové kyseliny do velkých, svalů, neboť umožni, že celkové napětí
9 «
9 pulzů není velké (např. 100 V při vzdálenosti mezi elektrodami 0,5 cm s intenzitou elektrického pole 200 V/cm).
Příklad 16
Účinnost elektropřenosu do různých svalů myši, potkana, králíka a opice
Tento příklad ilustruje fakt, . že elektropřenos nukleových kyselin se může využít u mnoha různých typů svalů různých druhů savců (myši, potkani, králíci a opice).
Podmínky aplikace elektrického pole jsou definovány v tab. 10 A u každého druhu zvířete. Výsledky tohoto pokusu jsou také uvedeny v tab. 10A.
druh | plazmid | vlastnosti elektrického pole | horní holenní sval | lýtko- vý sval | přímý stehenní sval | trej hlavy sval | čtyřhlavý sval |
myš | 10 pg pXL3031 | 8x200 V/cm 20 msec, 2 Hz | x28 | xl96 | x342 | xl21 | |
potkan | 150 pg pXL3031 | 8x200V/cm 20 msec, 2 Hz | x31 | xl60 | xl3,2 | ||
králík | 2 00 pg pXL2 7 7-4 | 4x200 V/cm 20 msec, 1 Hz | X25417 | x724 | x3595· |
Tabulka 10A: Faktor ' zvýšení hladiny exprese luciferázy využitím elektropřenosu. faktor byl, vypočten vzhledem k aktivitě luciferázy získané injekcí plazmidu pXL3031 nebo pXL2774 bez elektropřenosu. Údaje jsou. průměrné hodnoty vždy z 10 svalů v každé skupině. Aktivita luciferázy byla stanovena sedm dnů po podání plazmidu.
• ft ftft ftft • · · · · · · · · ftft · • ftft · ftft ftft · • ' ft ·· · · ft ······ • ftft ftft ftft • ftftft ftft ftftft ftftftft ftft ftft
Elektropřenos byl také testován na opicích rodu makak (Macaca fascícularis) . Použit byl plazmid pXL3179 obsahující gen kódující fibroblastový růstový faktor 1(FGF1 nebo aFGF).
Plazmid pXL3179 (Obr. 11) byl odvozen z plazmidu pXL2774 (WO97/10343) , kde byl signální peptid lidskéhofibroblastového interferonového systému fúzován s cDNA pro FGF1 (sp-FGFl, Jouanneau et al. , 1991, PNAS 88: 2893-2897), a byl vložen pod kontrolu promotoru získaného z časného úseku humánního cytomegaloviru (hCMV IE) a polyadenylačního signálu pozdního úseku viru SV40 (Genbank SV4CG)
Exprese FGF1 byla stanovena imunohistochemickým způsobem. Hodnoty ukazují počet pozitivních řezů 3' dny po intramuskulární injekci 500 gg plazmidu pXL3179. Charakteristiky aplikovaného elektrického pole byly:
200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, frekvence 1 Hz. Výsledky tohoto pokusu, jsou uvedeny následující tabulce.
sval | elektropřenos - | elektropřenos + |
trojhlavý sval | 0 | 0 |
horní holenní sval | 0 . | 30 |
dvojhlavý sval | 0 | 4 |
čtyřhlavý sval | o | 30 |
Tabulka 10B: Imunohistochemická demonstrace exprese FGF1 v různých svalech opice Macaca. fascícularis. Hodnoty ukazují počty pozitivních řezů 3 dny po intramuskulární injekci 500 gg plazmidu pXL3179 kódujícího FGF1, a to buďto s ( + ) a nebo bez (-) aplikace elektrického pole.
Výsledky ukazují, že elektropřenos významně zvyšuje expresi trnasgenu v různých typech svalů u různých druhů savců.
ftft ·· • · · · · ft ft ftft ft • ftftft ftftft
Příklad 17
Účinnost elektropřenosu do bránice potkana
Možnost dlouhotrvající a stabilní exprese terapeutického geiiu přímo v úrovni bránice je důležitým terapeutickým přístupem, který je zejména výhodný v souvislosti s léčením degeneratiyních nemocí, které ovlivňují funkci tohoto svalu, zejména Duchenneovy myopatie.
Potkani byli podrobeni anestézii směsí largactylu a ketaminu (1 mg/kg largactyl, 150 mg/kg ketamin). V tomto experimentu byla bránice obnažena řezem podél sterna. Injekce byla provedena do bránice (50. pg plazmidu pXL2774 v 50 μΐ 20mM NaCl a 5% glukózy). Destičkové elektrody pak .byly umístěny na každou stranu bránice podél dráhy injekce, (vzájemná vzdálenost elektrod byla 1 mm). Elektrické pole bylo následující: 160 V/cm nebo 300 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, frekvence 1 Hz. Elektrické pole bylo aplikováno na sval v době kratší než 1 minuta po injekci. Operační rána pak byla uzavřena.
V/cm | 0 | 160 | 300 |
celkové RLU | 48 ± 33 · | 920 ± 474 | 51 ±29 |
Tabulka 11: Hodnoty aktivity luciferázy jsou průměrné hodnoty ± střední chyba průměru (SEM) v milionech relativních jednotek (RLU) na sval, N=12 v každé skupině.
Tento příklad demonstruje významné zlepšení exprese transgenu v bránici po aplikaci 8 pulzů délky 20 ms pole s intenzitou 160 V/cm (p < 0,003, použit Mann-Whitneyův neparametrický test) .
ΦΦ » « φ φ φφ φφ ► φ φ φ
I Φ Φ φ φφφ φφφ φ φ φ φ φ φ
Příklad 18 '
Přenos genu kódujícího secernovanou alkalickou fosfatázu (SeAP) a kinetika exprese SeAP
Tento příklad ilustruje využití způsobu podle vynálezu k transformaci svalu v orgán, který exprimuje a secernuje' polypeptid, který účinkuje jako lék nebo vakcína, a také k zajištění přítomnosti tohoto polypetidu ve vysoké a stálé koncentraci v krevním oběhu.
V tomto příkladu byl způsob elektropřenosu podle vynálezu testován na dospělých myších s plazmidem obsahujícím gen, který kóduje secernovatelnou alkalickou fosfatázu z lidské placenty. Dospělé myši C57B1/6 dostaly jednostranně do jednoho horního holenního svalu injekci plazmidu pXL3010.
Plazmid pXL3010 (viz obr. 13) je vektor odvozený z ColEl, kde gen kódující secernovanou alkalickou fosfatázu (SeAP) z pSEAP-basic (Clontech, Genbank č. CVUQ9660) byl vložen pod kontrolu promotoru CMV (pCDNA3, Invitrogen, Holandsko) a polyadenylační signál pozdního úseku SV40 GenBank SV4CG).
Bylo aplikováno následující elektrické pole: intenzita elektrického pole 200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, frekvence pole bylo aplikováno 20
1Hz. Elektrické plazmidu. Krevní z retroorbitálního plexu v séru se měřila s po injekci dní později vzorky se odebíraly 7 Koncentrace alkalické fosfatázy pomocí komerčně dostupného chemiluminiscenčního testu (Phospha-light, Tropix, Bedford, MA 01730) . Několik svalů, pak vystavených působení elektrického pole nebo- bez elektrického pole, bylo injikováno plazmidem (pUC19), což umožnilo ověřit signálu odpovídajícího endogenní alkalické nekóduj icim nepřítomnost fosfatáze. Výsledky jsou uvedeny v tab. 12.
• · • · <
* · · • ·· ·· ·· • · · · · ·· « • · · · · · • · · ··· ··· • * · · ······· ·· ·«
plazmid pXL3010 59 | plazmid pUC19 59 | elektropřenos - | elektropřenos + |
0, 1 | 0 | 0.03 ±0.01 (n=5) | 123 ± 0.21 (n=10) |
0, 3 | 0 | 0.05 ± 0.02 (n=5) | 1.92 ± 0,33 (n=10) |
1 | 0 | 0.16 ±' o.04 (n-5) | 7,58 ± 1.18 (n=10) |
10 | 0 | 1.52 ± 0.59 (n=10) | 262.87 ± 54.97 (n=10) |
400 | 0 | 15.64 ±'10.77 (n=5) | 2203.11 ± 332.34 (n=5·) |
0, 1 | 9, 9 | 0.088 ± 0,015 (n=5) | 21.39 ±3.54 (n=10) |
0, 3 | 9/7 | 0.90 ± 0.49 (n=5) | 95.67 ± 16.15 (n=10) |
1 | 9 | 0.26 ± 0.09 (n=5) | 201.68 ± 32.38 (n=10) |
10 | 0 | 0.21 ± 0.05 (n=10) | 357.84 ± 77.02 (n=10) |
Tabulka 12: Průměrné hodnoty koncentrace alkalické fosfatázy (SeAP) ± SEM v oběhu vyjádřené v ng/ml séra.
Když byl plazmid pXL3010 podán elektrotransfekcí, byl pozorován faktor zvýšení' koncentrace SeAP v krvi 140 až 170.
Injekce 400 μρ plazmidu (injekce 100 gg v 54 μΐ oboustranně a dvakrát s 30 minutovým intervalem) s elektropřenosem vedla k sérové koncentraci alkalické fosfatázy 2200 ng/ml proti 16 ng/ml kontroly.
Je nutno dodat, že použití nekódující DNA (pUC19), které umožnilo pracovat s konstantním množstvím DNA (vždy celkem 10 μς DNA na myš) dále zlepšilo hladinu elektrotransfekce pro malá množství plazmidu pXL3010 (menší než 1 gg).
Kinetika exprese SeAP byla také sledována. V tomto případě byla dávka DNA 15 μρ na sval injikována’ oboustranně (30 μς na myš) . Výsledky jsou uvedeny na obr. 9. 7 dnů po transfekci byla pozorována významná a stálá hladina (alespoň po 2 měsíce) sérové koncentrace SeAP po podání pXL3010 elektropřenosem.
Tyto výsledky potvrdily, že přenos nukleové kyseliny do svalu způsobem podle vynálezu umožňuje dosáhnout vysoké
44
4 4 4
4 4 4
444 444
4
4 4 4 · ·· » 4 4« • 44 • · «
4« »444 44 a trvalé exprese, a to jak proteinů lokalizovaných ve svalu, tak i proteinů secernovaných, takže je možné přeměnit sval na orgán, který produkuje a secernuje požadovaný polypeptid.
Příklad 19
Přenos genu kódujícího erytropoetin (EPO)
Plazmid pXL3348 obsahující gen kódující erytropoetin byl injikován oboustranně do horního holenního svalu dospělých myší C57B1/6. Plazmid pXL3348 (obr. 16) je vektor odvozený z plazmidu pXL2774, do kterého byl vložen myší genu pro erytropoetin (NCBI: 193086) pod kontrolu promotoru časného úseku lidského cytomegaloviru (hCldV-IE) a polyadenylačního signálu pozdního úseku viru SV40 (Genbank SV4CG). Bylo aplikováíno elektrické pole následujících vlastností: intenzita 200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, frekvence 1 Hz. Elektrické pole bylo aplikováno bezprostředně po injekci plazmidu.
Bylo pozorováno významné zvýšení obsahu erytropoetinu v krvi 7 a 24. den (D7 a D24) po podání 10 mg pXL3348 elektropřenosem. Kromě toho, fyziologický účinek zvýšení erytropoetinu, který vedl ke zvýšení hematokritu, byl velmi vysoký (85 %) a od 7. dne byl' takový dokonce i pro velmi malá množství plazmidu (1 pg) . 51 ' · · · · • fcfc fc • fcfc • · fcfc • fcfc • fcfcfc · · • fcfc • fcfc · • · • · • fc • fcfc fcfcfcfc • fc fcfc • fcfc · • · · · • fcfc fcfcfc • . · fcfc fcfc
sérová hladina . erytropoetinu (mlU/ml) sedmý den (D7) | sérová hladina erytropoetinu (mlU/ml) čtyřiadvacátý den (D24) | |||
pla zmid | elektropřenos | elektropřenos + | elektropřenos | elektropřenos + |
pXL3348 (1 pg) | 0 | 3.0+ 1.6 | 0 | 1.12 ±0.8 |
pXL3348 (10 pg) | 0,9 ± 0,9 | 61 . 8 ± 15.8 | 0 | 74.1 ± 28.9 |
pUC19 (i pg) | 0 | 0 | ||
hematokrit % vzorky sedmého dne (D7) | hematokrit % čtyřiadvacátý den (D24) | |||
plazmid | elektropřenos | elektropřenos + | elektropřenos | elektropřenos 4“ |
PXL3348 (i Mg) | 38.5 ± 0.5 | 35.0 ± 3.6 | 50.8 ±2.3 | 81 ± 0.5 |
pXL3348 (10 pg) | 32.0 ± 3.2 | 26.0 ±4.1 | 69.0 ± 5.1 | 83.0 ± 1.0 |
pUC19 (1 pg) | 30.8 ± 2.3 | 43.2 ± 0.9 |
Tabulka 13': Průměrné hodnoty ± SEM, N=4 až 5 ve skupině.
Příklad 20 . · .
Přenos genu kódujícího vaskulární endotelový růstový faktor (VEGF)
Myším C57B1/6 nebo SCID byl injikován do horního holenního svalu oboustranně pCOR hVEGF (pXL3212, 15 pg),
Plazmid pXL3212 (obr. 11) byl odvozen z plazmidu pXL2774 (WO97/10343) vložením cDNA kódující VEGF165 (vaskulární endotelový růstový faktor, Genbank HUMEGFAA) pod kontrolou promotoru časného úseku lidského cytomegaloviru (hCMV-IE) a polyadenylačního signálu pozdního úseku z SV4O (Genbank SV4CG) .
·· . ·· • · · »· · · · ··*· ··
Elektropřenos byl proveden v následujících podmínkách: intenzita pole 250 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, frekvence 2 Hz. Krevní vzorky, byly odebrány z retroorbitálního plexu. Krev byla odebrána jeden den před a sedm dnů po injekci plazmidu. Imunoenzymatické kvantitativní stanovení lidského VEGF bylo provedeno pomocí soupravy Quantikine (R&D Systems). Byly provedeny dodatečné série lidského VEGF v myším séru. Výsledky těchto pokusů jsou uvedeny v tab. 14.
kmen myší | den | elektropřenos | lidský VEGF (ng/1) |
C57B1/6 | D-l | nedetekovatelný | |
C57B1/6 | D+7 | 4- | 393 + 110 ' |
SCID | D-l | - | nedetekovatelný |
SCID | D+7 | + | 99 ± 26 |
Tabulka 14: Hodnoty sérové· koncentrace \/EGF (ng/1) u C57B1/6· a SCID myší.
Příklad 21
Přenos genu kódujícího koagulační faktor IX
Plazmid pXL3388 (15 pg) byl injikován bilaterálně do holenního svalu myší C57B1/6 nebo SCID.
Plazmid pXL3388 viz obr. 12) je vektor odvozený z plazmidu pXL2774 (WO97/10343) vložením cDNA kódující lidský koagulační faktor IX (Christmas factor, Genbank HUMFIXA) pod kontrolou časného úseku lidského cytomegaloviru (hCMV-IE) a polyadenylačního signálu pozdního úseku z SV4O (Genbank SV4CG).
Elektropřenos byl proveden za následujících podmínek:
intenzita pole 200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, frekvence 2 Hz.
Krevní vzorky byly odebrány z retroorbitálního plexu. Vzorky ·· ·» « » « r ·· • · • · * ···· ·· * · « ·· ·· ·· ··· · · ·· · • * · · · « • · . .····· • · · · ··· ···· ·· »· se odebíraly 7 dnů po injekci plazmidu. Výsledky jsou uvedeny v tab. 15.
kmen myší | injekce | elektropřenos | lidský faktor IX (gg/1) |
C5731/6 | PXL3388 | + | 69 ± 12 |
C57B1/6 | PXL3388 | - | nedetekovatelný |
C 5 7 B1 / 6 | 0,9% NaCI | + | nedetekovatelný |
SCID | pXL3388 | + | 6 6 ± 5 |
SCID | pXL3388 | - | nedetekovatelný |
Tabulka 15: Hodnoty koncentrace faktoru IX (gg/1) v plazmě u myší C57B1/6 a SCID.
Lidský koagulační faktor IX byl detekovatelný v krvi myší pouze tehdy, když byl plazmid podán v , podmínkách a způsobem podle vynálezu.
Příklad 22
Přenos genu kódujícího' fibroblastový růstový faktor 1 (FGF1)
Do holenního svalu myší C57B1/6 nebo SCID byl bilaterálně injikován plazmid pCorCMVaFGF (pXL3096, 15 gg).
Plazmid pXL3096 (obr. 14) je vektor odvozený z plazmidu pXL2774 (WO97/10343) vložením sekvence vytvářející trojšroubovici (TH, viz Wil et al.,’1997, Gene Ther. 4: 323330) s fúzí genu kódujícícho signální peptid lidského fibroblastového interferonu a cDNA kódující FGF1 (fibroblastový růstový faktor 1, sp-FGFl, Jouanneau et al., PNAS 88: 2893-2897) pod kontrolou promotoru lidského hCMV-IE, a následované vedoucí sekvencí thymidinkinázy z HSV (transkribovanou, netranslatovanou) a polyadenylačním signálem,z SV4O.
• · ·♦ • · · · • ·· • · · · • · « • · · · · · • · ·· > ♦ · · » ♦ · · • · · · · ·
Elektropřenos byl' proveden za podmínek: intenzita pole 200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms a frekvence 2 Hz.
Přítomnost FGF1 byla detekována imunohistochemicky. Výsledky transfekce myší C57B1/6 jsou uvedeny na obr.
10. Počet pozitivních svalových vláken byl vždy zřetelně vyšší u svalů podrobených elektropřenosu než u kontrolních svalů (které obdržely pouze samotnou injekci plazmidu pXL3096). V 21. s 35. den (D21 a D35) je přítomnost FGF u kontrolních skupin prakticky nedetekovatelná, · zatímco u skupin po elektrotransfekci bylo detekováno velké množství pozitivních svalových vláken. Výsledky pro myši SC1D jsou uvedeny v tab. 16.
elektropřenos | levý horní holenní | pravý horní holenní | |
pXL3096 (15 pg) | 600 | 450 | |
700 | 3 00 | ||
PXL3096 (15 pg) | ·- | 3 | 0 |
- | 3 | 0 | |
- | 0 | 0 | |
pXL3096 (1,5 pgj | + | 80 | 70 |
+ | 20 | 35 | |
+ | 110 | 100 | |
pXL3096 (1/5 pg) | - | 0 | 0 |
- | 0 | 1 |
Tabulka 16: Exprese FGF, imunohistochemická studie a počet, pozitivních vláken v řezech ze střední části svalu..
Exprese FGF1, určená počtem pozitivních vláken imunohistochemickou metodou, byla detekována výlučně u myší, u kterých bylo aplikováno elektrické pole. Kromě toho je třeba si všimnout, že. exprese FGF1 byla detekována dokonce i při nízkých dávkách DNA.
• φ ·· ·· • · · · • · · · ·· · ··♦
• ·· · tt
Příklad 23 .
Přenos genu kódujícího neurotrofický faktor NT3
Způsob podle vynálezu byl užit u. dospělých myší (C57B1/6) a mladých myší Xt/pmn k přenosu genu kódujícího neurotrofin NT3. Myši Xt/pmn představují model amyotrofické laterální sklerózy (ALS), charakteristické časnou a rychlou degenerací motorických neuronů a průměrnou očekávanou délkou života 40 dnů.
t
23.1 - Přenos genu kódujícího NT3 do dospělých myší
Plazmid pXL3194 (12,5 pig) , který obsahuje gen kódující myší neurotrofin 3 (NT3), byl injikován oboustranně do horního holenního svalu 5 týdnů starých myší C57B1/6 nebo mláďat myši.
Plazmid pXL3194 (viz obr. 14) je vektor odvozený z plazmidu pXL2774 (WO97/10343) vložením myšího genu pro myší neurotrofin 3 (NT3, Genbank MMNT3) pod kontrolou časného úseku lidského cytomegaloviru (hCMV-IE) · a polyadenylačního signálu pozdního úseku z SV4O (Genbank SV4CG).
Bylo aplikováno elektrické pole následujících vlastností:, intenzita elektrického pole 250 V/cm, 4 pulzy délky 20 ms,' frekvence 1 Hz. Elektrické pole bylo aplikováno bezprostředně po injekci.
Přítomnost NT3 byla detekována v supernatantu připraveném centrifugací (12 000 x g) svalu rozdrceného v PBS 7 dnů po podání genu, a byla kvantifikována pomocí ELISA testu (souprava od firmy Promega).
Průměrné hodnoty vypočtené pro 20 svalů (95% interval spolehlivosti) byly 75 ± 11 pg/sval (DNA podaná bez aplikace
'9 Φ • Φ
Φ Φ Φ * Φ ·Φ
Φ Φ I φ · 4 «φφφ φφ • Φ Φ ·ΦΦ« • Φ Φ φ • Φ Φ 4 • Φ Φ 4
ΦΦΦ Φ Φ 4
Φ 4
*)Φ · φ elektropřenosu) a 2700 ± 900 ng/sval (DNA podaná s elektropřenosem).
Pokud byl plazmid pXL3149 podán v podmínkách a způsobem podle vynálezu, bylo pozoiroáno zvýšení v produkci NT3 ve svalu až 55x.
23.2 -· Přenos genu kódujícího NT3 do mláďat myší
Podobný pokus byl proveden u 4 až· 5 dnů starých heterozygotních myší Xt/pmn s plazmidem pXL3149. Byla injikována dávka 130 pg DNA na každí zvíře do různých svalů (lýtkový sval 25 pg, horní holenní sval 12,5 pg) .
Bylo aplikováno následující elektrické pole: 500 V/cm, 4 pulzy délky 20 ms, frekvence 1 Hz.
Přítomnost NT3 byla hodnocena u těchto myší sedm dnů po podání plazmidu a aplikaci elektrického pole v plazmě a ve svcilu (]ýtkovv sv3l nsk/o ΗοΣθπώί- svsT) . KontxOls bazální hladiny NT3 byla získána podáním roztoku 0,9% NaCl. NT3 byl kvantitativně stanoven pomocí ELISA soupravy (Promega). Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny v tab. 17.
0,9% NaCl | pXL3194 | |||
elektropřenos | - | + | - | ·+· |
plazma | 0 (n=2) | , 0 (n=2) | 4 6 + 10 (n=4) | 1599 ± 639 (n=4). |
lýtkový sval | 3619±10 (n=2) | 1619 ± 150 (n=2) | 3647 ± 1078 '(n=8) | 19754+3818 (n=8) |
horní holenní sval | 1415+363 (n=4) | 1453 ± 375 (n=2) | 1400 ± 155 (n=8) | 16826±3135 (n=8) |
Tabulka 17: Průměrné hodnoty NT3 ± SEM (pg/sval nebo pg/ml plazmy) . '
V experimentálních podmínkách tohoto příkladu byla detekována bazální hladina NT3 v lýtkovém a holenním svalu. Za standardních podmínek bez elektropřenosu hladina exprese
NT3 po injekci plazmidu pXL3149 nebyla vyšší bazální hladina ve svalu. Když bylo užito k přenosu způsobu podle vynálezu, bylo pozorováno zvláště velké zvýšení množství NT3 ve svalu. Bylo také výrazně ' zvýšeno množství NT3 secernované svalem a detekované v plazmě (zvýšeno 35 x).
Výsledky demonstrují, že pro dané množství DNA způsob podle vynálezu umožňuje velmi významně zvýšit účinnost přenosu a dosáhnout, a to nejen ve svalu,, ale i, v plazmě, velkého zvýšení obsahu neurotrořinů jako je NT3. ·
Příklad 24
Přenos genu kódujícího lidský růstový hormon
Plazmid pXL3353 (10 qg) nebo plazmid pXL3354 (10 qg) byl injikován jednostranně do holenního svalu myší C57B1/6. Plazmid pXL3353 (viz obr. 15) je vektor odvozený z plazmidu pXL2774 vložením genomového genu pro lidský růstový hormon (fragment hGH Xbal/Sph zasahující od iniciačního signálu transkripce až k místu BamHI 224 bp za polyadenylačním signálem) pod kontrolou časného úseku lidského cytomegaloviru (hCMV-IE) a polyadenylačního signálu pozdního úseku z SV4O (Genbank SV4CG)cDNA pro hGH byla získána reverzní transkripcí z poly(A+)mRNA knihovny z lidské hypofýzy po 30 cyklech PCR amplifikace s následujícími oligonukleotidovými primery:
Oligonukleotid komplementární k úseku 5':
5'- GGGTCTAGAGCCACCATGGCTACAGGCTCCCGGAC-3'
Tento oligonukleotid obsahuje Xbal místo si Kozákovu sekvencí.
* · ·» 9· • · · » • · · ♦ 9 · » • « · • · · · · 9
9 9 9 9
9
9 9 9
Oligonukleotid komplementární k úseku 3':
3'-GGGATGCATTTACTAGAAGCCACAGCTGCCTC-3'
Tento oligonukleotid obsahuje místo Nsil a stop-kodon.
Amplífikovaný fragment byl vložen do plazmidu pCR2.1 (souprava TA Cloning Kit, Invitrogen) a sekvencován. Fragment Xbal/Nsi velikosti 681 bp obsahující hGH cDNA byl ligován s fragmentem Xbal/Nsil z pXL3353, čímž byl vytvořen plazmid pXL3354 (obr. 15) .
Elektropřenos byl proveden za podmínek: intenzita elektrického pole 200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, frekvence 1 Hz. Elektrické pole bylo aplikováno bezprostředně po injekci plazmidové DNA. Přítomnost hGH byla hodnocena sedm dnů po injekci plazmidu v supernatantu ze svalu rozdrceného v pufru PBS po centrifugací ve 12000xg. Množství hGH bylo stanoveno ELISA testem (Boehringer Manheim).
injekce genomové hGH (pXL3353) | injekce hGH cDNA ' (pXL3354) | |||
elektro přenos | + | ~~ | + | |
horní | 87,1 | 1477,6 | 2820,0 | 15739,1 |
holenní | ±9,3 | ±67,6 | ± 487,5 | ± 915,5 |
sval | (n=10) | (n=10) | (n=10) | (n-10) |
Tabulka 18: Průměrné hodnoty exprese proteinu hGH ± SEM (pg/sval).
Tyto výsledky ukazují, že elektropřenos podle předkládaného vynálezu umožňuje mnohem vyšší expresi lidského růstového hormonu. Je třeba připomenout,' že toto zvýšení bylo pozorováno i když byl podán plazmid obsahující celý gen se všemi regulačními sekvencemi. '
9'4 9 9 • 9 9 9
9 4 • D 9 9
9 4
9449 49 • 9
9 9 9
999 999 ·
« · · ·
Příklad 25
Účinek elektropřenosu na expresi transgenu pro vakcinaci
Tento příklad ukazuje, že způsob podle předkládaného vynálezu je využitelný pro přenos genů kódujících požadované vakcinační peptidy.
Experiment byl proveden na 9 týdnů starých samicích myší Balb/c. Elektrody byly ploché elektrody z nerezové oceli vzdálené od sebe 5 mm. VR-HA je plazmidové DNA obsahující gen pro hemaglutinin z chřipkového viru (kmen A/PR/8/34). VR-gB je plazmidová DNA obsahující gen pro glykoproteín B (gB) lidského cytomegaloviru (kmen Towne).
Roztok plazmidu (50 μΐ roztoku 20 pg/ml nebo 200 pg/ml v 0,9% NaCl) byl injikován skrz kůži podélně do horního lýtkového svalu levé končetiny. Elektrické pulzy byly aplikovány kolmo na osu svalu pomocí generátoru obdélníkových pulzů 20 sekund po injekci (intenzita elektrického pole 200 \//cm, 8 po sobě jdoucích pulzů dílky 20 ms, frekvence
Hz) .
Pro hodnocení stimulace imunitní odpovědi byl použit následující imunízační protokol:
, DO byl odebrán vzorek pre-imunního séra
Dl první injekce, s elektropřenosem nebo bez D21 odebrán vzorek imunního séra
D22 zesilující injekce, s elektropřenosem nebo bez D42 odebrán vzorek imunního séra D63 odebrán vzorek imunního séra
Vzorky krevního séra byly odebírány z retroorbitálního sinusu. Množství specifických protilátek bylo . stanoveno pomocí ELISA testu. Každé experimentální podmínky byly testovány na 10 zvířatech injikovaných jednostranně.
* · · φ » « φ φ • ο φ « * · φ ···· φφ φ ·· φφφφ • · φφφφ • φφφ φ φ · φφφ φφφ * φ φ φφφφ «· «φ
Výsledky uvádějící titry protilátek proti chřipkovému hemaglutininu jsou uvedeny v tab. 19A.
elektro přenos | DO | D21 | D42 | D63 | |
VR-HA (i hg) | ~~ | <50 | 132 + 739 | 1201 ± 4380 | 1314 ±' 2481 |
VR-HA (i pg) | + | <50 | 1121 ± 12.37 | 10441 ± 7819 | 8121 ± 5619 |
(p) | (0.0135) | (0.0022) | (0.0033) | ||
VR-HA (10 pg) | <50 | 781 ± 666 | 5113 ± 16015 | 4673 + 8238 | |
VR-HA. (10pg) | + | <50 | 4153 ± 2344 | 74761 ± 89228 | 41765 ± 52361 |
(p) | (0.0002) | (0.0005) | (0.0007) |
Tabulka 19-a: Titr protilátek proti chřipkovému hemaglutininu po injekci 1 nebo 10 pg DNA (VR-HA) buďto, bez (-) a nebo s (+) aplikací elektrického pole. Tyto výsledky představují geometrický průměr ze skupin po 10 zvířatech (N=8 pro skupinu injikovanou 1 pg, exponovanou elektrickému poli a testovanou v D63) ± směrodatná odchylka. Hodnota p byla získána srovnáním vždy dvou skupin injikovaných DNA a pak buďto s aplikací elektrického pole nebo bez pomocí statistického neparametrického Mann-Whitneyova testu.
Tyto výsledky ukazují, že titr protilátek proti chřipkovému hemaglutininu výrazně vzrostl., a to asi 10 x, ve skupině, kde byly aplikovány elektrické pulzy. Takže myši, které obdržely 1 pg DNA při současné 'aplikaci elektrických pulzů měly mírně vyšší průměrný titr protilátek proti hemaglutininu než myši, které obdržely 10 pg DNA, ale nebyly podrobeny působení elektrického pole.
Výsledky ukazující protilátkovou -reakci namířenou proti
CMV glykoproteinu B jsou uvedeny v tab. 19B.
Φ» ·» • · » 4
I 4 • · * * ·
Φ Φ Φ φ • · • * Φ • Φ ΦΦΦ φ···
Φ Φ Φ · • Φ Φ . ·
Φ Φ Φ Φ
ΦΦΦ · · · • Φ • Φ β φ
elektro přenos | DO | D21 | D42 | D63 | |
VR-gB (ΙΟμςτ) | - | <50 | 73 ± 138 | 755 ± 1766 | 809 ± 1363 |
VR-gB (10pg) | + | <50 | 200 ± 119 | 3057 ± 1747 | 2112 ± 1330 |
(p) | (0.0558) | (0.0108) | (0.0479) |
Tabulka 19-b: Titr protilátek proti CMV glykoproteinu B po injekci 10 pg DNA (VR-gB) buďto bez (-) a nebo s ( + ) aplikací elektrických pulzů. Tyto výsledky představují geometrický průměr ze skupin po 10 zvířatech (N=9 pro skupiny exponované elektrickému poli) + směrodatná odchylka. Hodnota p byla získána srovnáním vždy dvou skupin injikovaných DNA a pak buďto s aplikací elektrického pole nebo bez pomocí statistického neparametrického Mann-Whitneyova testu.
Tyto výsledky ukazují, že titr anti-gB protilátek vzrostl 4 x do 42. dne (D42) ve skupině podrobené působení elektrických pulzů. Bylo také pozorováno, že koeficient rozptylu byl 3x menší u skupiny myší s aplikací elektrických pulzů.
ΜΜΜΗΜΜΙ
Claims (3)
- PATENTOVÉNÁROKY1. Použití nukleové kyseliny pro výrobu léčiva pro genovou terapii k injikování do jednoho nebo několika příčně pruhovaných svalů in vivo tak, že svalové buňky jsou přivedeny do kontaktu s nukleovou kyselinou, která má být do nich vnesena přímým podáním do tkáně nebo topickým či systémovým podáním, a že přenosu do buněk je dosažen tím, že se na sval aplikuje jeden nebo několik elektrických pulzů s intenzitou 1 až 800 V/cm.
2. Použití podle nároku 1, kdy intenzita elektrického pole je 4 až 400 V/cm. 3. Použití podle nároku 1, kdy intenzita elektrického pole je 30 až 300 V/cm. 4. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, kdy celková doba aplikace elektrického pole je delší než 10 ms.5. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kdy aplikace elektrického pole na sval obsahuje jeden nebo několik pulzů s pravidelnou frekvencí.6. Použití podle nároku 5, kdy aplikace elektrického pole na sval obsahuje 1 až 100 000 pulzů s frekvencí 0,1 až 1000 Hz.7. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kdy elektrické pulzy jsou aplikovány nepravidelně, a že funkce popisující závislost intenzity elektrického pole na čase pro jeden pulz je proměnlivá.8. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, kdy integrál funkce popisující proměnlivost elektrického pole v čase má hodnotu větší než 1 kV x ms/cm.9. Použití podle nároku 8, kdy integrál je větší než 5 kV x ms/cm.10. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, kdy elektrické pulzy jsou vybrány ze skupiny obsahující pulzy typu obdélníkových kmitů, exponenciálně tlumených kmitů, oscilujících unipolárních kmitů omezeného trvání, oscilujících bipolárních kmitů omezeného trvání a dalších forem kmitů.11. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, kdy elektrické pulzy obsahují pulzy obdélníkových kmitů.12. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11, kdy elektrické pulzy se aplikují elektrodami, které jsou umístěny buďto po straně svalu nebo v kontaktu s kůží.13. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11, kdy elektrické pulzy se aplikují elektrodami, které jsou vloženy do vnitřku svalu.14. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13, kdy nukleová kyselina se injikuje do svalu. - 4 4 9 · · « 4 · · · 4 · · ·4 4 4 4 444 4 44 ·4 4444 44 4 4444 44 44 4 • 4 4 44 4 4444 ·· 4 94 4 44 4415. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13, kdy se nukleová kyselina injikuje systémově.16. Použití podle nároku 15, kdy se nukleová kyselina injikuje intraarteriálně nebo intravenózně.17. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13, kdy se nukleová kyselina podává cestou topickou, kutánní, perorální, vaginální, intranasální, subkutánní nebo intraokulární.18. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17, kdy nukleová kyselina je obsažena v přípravku, který navíc obsahuje farmaceuticky přijatelné excipienty pro různé způsoby podávání.19. Použití podle nároku 18, kdy přípravek je vhodný pro parenterální podávání.20. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 19, kdy nukleová kyselina je deoxyribonukleová kyselina.21. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 19, kdy nukleová kyselina je ribonukleová kyselina.22. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 21, kdy nukleová kyselina je syntetického nebo biosyntetického původu, nebo je izolována z viru, z jednobuněčného nebo vícebuněčného eukaryotického organismu nebo z prokaryotického organismu.« · • · • · • ♦ • · · «· ft • ftft • · · · ·23. Použití podle nároku 22, kdy podávaná nukleová kyselina je spojena s některými nebo všemi složkami původního organismu a/nebo systému užitého pro syntézu.24. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 23, kdy nukleová kyselina kóduje požadovanou RNA nebo požadovaný protein.25. Použití podle nároku 24, kdy RNA je katalytická RNA nebo antisense RNA.26. Použití podle nároku 24, kdy nukleová kyselina kóduje protein vybraný ze skupiny obsahující enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfokiny, růstové faktory, trofické faktory, angiogenní faktory, neurotrofické faktory, růstové faktory kostí, hematopoetické faktory, koagulační faktory, antigeny a proteiny účastnící se v metabolismu aminokyselin, lipidů a dalších esenciálních složek buňky.27. Použití podle nároku 26, kdy nukleová kyselina kóduje angiogenní faktory VEGF a FGF, neurotrofické faktory BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, FGF1, NT3, NT5, protein GAX, inzulín k léčení diabetů, růstový hormon, cytokin, a-1antitripsin, kalcitonin, leptin a apolipoproteiny, enzymy biosyntézy vitamínů, hormony a neuromediátory.28. Použití podle nároku 24, kdy nukleová kyselina kóduje protilátku, variabilní fragment jednořetězcové protilátky (ScFv) nebo jakýkoliv protilátkový fragment, který má vhodnou rozpoznávací schopnost pro účely imunoterapie, nebo kóduje rozpustný receptor, peptid, který • · · • · · · · · je agonistou nebo antagonistou receptoru nebo proteinu, nebo kóduje umělý, chimérický nebo protein.adhezního zkrácený29. Použití podle nároku 28, kdy nukleová kyselina kóduje antiidiotypovou protilátku, rozpustný fragment receptoru CD4 nebo receptoru TNFa nebo acetylcholinového receptoru.30. Použití podle kteréhokoliv z nároků 26 až 29, kdy nukleová kyselina kóduje prekurzor terapeutického proteinu.31. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 30, kdy nukleová kyselina je ve formě plazmidu.32. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 30, kdy nukleová kyselina obsahuje gen velkého rozsahu a/nebo introny a/nebo regulační prvky malého nebo velkého rozsahu.33. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 30, kdy nukleová kyselina je episomální DNA nebo umělý kvasinkový chromosom nebo minichromosom.34. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 33, kdy nukleová kyselina obsahuje sekvence, které umožňují a/nebo podporují expresi transgenu ve svalu.35. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 34, kdy nukleová kyselina je spojena s jakýmkoliv typem vektoru nebo s jakoukoliv kombinací vektorů, které umožňují zlepšit přenos • 9
- 9 9 9 · 9 * · « · · « 999 9 999 9 99 *9 · «· 9 9 9 9 9999999 99 99· 9 9 nukleové kyseliny, jako jsou viry, syntetická nebo biosyntetická činidla nebo propulzní či jiné částice.36. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 35, kdy sval se podrobí ošetření, jehož cílem je zlepšit přenos genu, kteréžto ošetření je farmakologické povahy lokální nebo systémovou cestou nebo se jedná o ošetření enzymatické, permeabilizující, chirurgické, mechanické, tepelné nebo fyzikální povahy.37. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 36, které umožňuje to, aby sval produkoval činidlo ve fyziologické nebo terapeutické dávce, přičemž činidlo je buďto ve svalových buňkách nebo je secernováno.38. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 37, které umožňuje modulovat množství exprimovaného transgenu tím, že se moduluje objem svalové tkáně, která je transfekována.39. Použití podle nároku 38, které umožňuje modulovat objem svalové tkáně, která je transfekována, tím, že se užije více míst k podávání.40. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 39, které umožňuje modulovat množství exprimovaného transgenu tím, že se moduluje počet, tvar, povrch a uspořádání elektrod, a tím, že se mění intenzita, počet, trvání, frekvence a tvar pulzů, a také tím, že se mění množství a objem podávané nukleové kyseliny.• « · ♦ · ♦ ···· • · · · · · · · · · · » • · ···· · 0 · ···· · · · · · ··· · · · · » · · ·· · ·· · · · ·♦41. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 40z které umožňuje kontrolovat lokalizaci transfekované tkáně prostřednictvím objemu tkáně vystavené lokálním elektrickým pulzům.42. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 41, které umožňuje návrat do počátečního stavu tím, že se odstraní oblast transfekované tkáně.43. Nukleová kyselina a elektrické pole s intenzitou 1 až 800 V/cm, jako sdružený produkt, vyznačuj ící se tím, že je určen pro jejich samostatnou nebo časově oddělenou aplikaci in vivo do příčně pruhovaného svalu, a pro genovou terapii založenou na in vivo elektrotransfekci do příčně pruhovaného svalu následující po podání nukleové kyseliny.
44. Sdružený produkt podle nároku 43 vyzná č u j ící se tím, že intenzita elektrického pole je 4 až 400 V/cm. 45. Sdružený produkt podle nároku 43 vyzná č u j ící se tím, že intenzita elektrického pole je 3C i až 300 V/cm. 46. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 43 až45 vyznačující se tím, že celková doba aplikace elektrického pole je delší než 10 ms.47. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 43 až46 vyznačující se tím, že aplikace44 4 44 4 99 944 4 4 9 9 4 4 4 4 49 9 9 4 9 9 4 4 * 4 9 · • 4 · · ·9 4 9 4 9444 9 4 4 4 99 9 9 4 4 · · 4 4 · • 4 4 4 9 4 4 4 49 elektrického pole na sval obsahuje jeden nebo několik pulzů s pravidelnou frekvencí.48. Sdružený produkt podle nároku 47 vyznačující se tím, že aplikace elektrického pole na sval obsahuje 1 až 100 000 pulzů s frekvencí 0,1 až 1000 Hz.49. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků'43 až 46 vyznačující se tím, že elektrické pulzy jsou aplikovány nepravidelně, a že funkce popisující závislost intenzity elektrického pole na čase pro jeden pulz je proměnlivá.50. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 43 až 49 vyznačující se tím, že integrál funkce popisující proměnlivost elektrického pole v čase má hodnotu větší než 1 kV x ms/cm.51. Sdružený produkt podle nároku 50 vyznačující se tím, že integrál je větší než 5 kV x ms/cm.52. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 43 až 52 vyznačující se tím, že elektrické pulzy jsou vybrány ze skupiny obsahující pulzy typu obdélníkových kmitů, exponenciálně tlumených kmitů, oscilujících unipolárních kmitů omezeného trvání, oscilujících bipolárních kmitů omezeného trvání a dalších tvarů kmitů.ft· · ♦ · · • ftftft • · ftft ftft • ftft ftft ft53. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 43 až52 vyznačující se tím, že elektrické pulzy obsahují pulzy obdélníkových kmitů.54. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 43 až53 vyznačující se tím, že elektrické pulzy se aplikují elektrodami, které jsou umístěny buďto po straně svalu nebo v kontaktu s kůží.55. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 43 až 53 vyznačující se tím, že elektrické pulzy se aplikují elektrodami, které jsou vloženy do vnitřku svalu.56. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 43 až 55 vyznačující se tím, že nukleová kyselina se injikuje do svalu.57. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 43 až55 vyznačující se tím, že nukleová kyselina injikuje systémově. se 58. Sdružený produkt podle nároku 57 vyznačuj ící se t í m, že nukleová kyselina se injikuje intraarteriálně nebo intravenózně.59. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 43 až 55 vyznačující se tím, že nukleová kyselina se podává cestou topickou, kutánní, perorální, vaginální, intranasální, subkutánní nebo intraokulární.• Φ φ · » 9 Φ « Φ Φ Φ Φ · Φ ΦΦΦΦ φ·φΦ • Φ ΦΦΦΦ · Φ Φ ΦΦΦ· Φ Φ · · Φ • Φ φ «Φ Φ Φ Φ Φ Φ ΦΦ Φ ΦΦ Φ ΦΦ «Φ60. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 43 až 59 vyznačující se tím, že nukleová kyselina je obsažena v přípravku, který navíc obsahuje farmaceuticky přijatelné excipienty pro různé způsoby podávání.61. Sdružený produkt podle nároku 60 vyznačující se tím, že přípravek je vhodný pro parenterální podávání.62. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 43 až 61 vyznačující se tím, že nukleová kyselina je deoxyribonukleová kyselina.63. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 43 až 61 vyznačující se tím, že nukleová kyselina je ribonukleová kyselina.64. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 43 až 63 vyznačující se tím, že nukleová kyselina je syntetického nebo biosyntetického původu, nebo je izolována z viru, z jednobuněčného nebo vícebuněčného eukaryotického organismu nebo z prokaryotického organismu.65. Sdružený produkt podle nároku 64 vyznačující se tím, že podávaná nukleová kyselina je spojena s některými nebo všemi složkami původního organismu a/nebo systému užitého pro syntézu.66. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 43 až 65 vyznačující se tím, že nukleová kyselina kóduje požadovanou RNA nebo požadovaný protein.fc· fc fcfc fc fcfc fcfc • fcfc fcfcfc fcfc·· fc fcfcfc fcfcfcfc fcfcfc* • fc fcfcfcfc fcfc · fcfcfcfc fcfc fcfc fc • fcfc fcfcfc fcfcfc* • fc fc fcfc « fcfc fcfc67. Sdružený vyznačuj ící nebo antisense RNA.produkt se tím, podle že RNA je nároku 66 katalytická RNA68. Sdružený produkt podle nároku 66 vyznačující se tím, že nukleová kyselina kóduje protein vybraný ze skupiny obsahující enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfokiny, růstové faktory, trofické faktory, angiogenní faktory, neurotrofické faktory, růstové faktory kostí, hematopoetické faktory, koagulační faktory, antigeny a proteiny účastnící se v metabolismu aminokyselin, lipidů a dalších esenciálních složek buňky.69. Sdružený produkt podle nároku 68 vyznačující se tím, že nukleová kyselina kóduje angiogenní faktory VEGF a FGF, neurotrofické faktory BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, FGF1, NT3, NT5, protein GAX, inzulín k léčení diabetů, růstový hormon, cytokin, oc-1antitripsin, kalcitonin, leptin a apolipoproteiny, enzymy biosyntézy vitamínů, hormony a neuromediátory.70. Sdružený produkt podle nároku 66 vyznačující se tím, že nukleová kyselina kóduje protilátku, variabilní fragment jednořetězcové protilátky (ScFv) nebo jakýkoliv protilátkový fragment, který má vhodnou rozpoznávací schopnost pro účely imunoterapie, nebo kóduje rozpustný receptor, peptid, který je agonistou nebo antagonistou receptorů nebo adhezního proteinu, nebo kóduje umělý, chimérický nebo zkrácený protein.9 9 9 »t 9 • · · 99 9 9 9 9 9 ·9 9 99 9971. Sdružený produkt podle nároku vyznačující se tím, že nukleová kyselina kóduje antiidiotypovou protilátku, rozpustný fragment receptoru CD4 nebo receptoru TNFa nebo acetylcholinového receptoru.72. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 68 až71 vyznačující se tím, že nukleová kyselina kóduje prekurzor terapeutického proteinu.73. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 43 až72 vyznačující se tím, že nukleová kyselina je ve formě plazmidu.74. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 43 až 72 vyznačující se tím, že nukleová kyselina obsahuje gen velkého rozsahu a/nebo introny a/nebo regulační prvky malého nebo velkého rozsahu.75. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 43 až 72 vyznačující se tím, že nukleová kyselina je episomální DNA nebo umělý kvasinkový chromosom nebo minichromosom.76. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 43 až 75 vyznačující se tím, že nukleová kyselina obsahuje sekvence, které umožňují a/nebo podporují expresi transgenu ve svalu.φφφ φ* φ Φ· ·· • · φ φφφ * * · · «φφφ φφφφ φφφ* • φ φφφφ φ φ φ φφφφ » φ φ « φ φφφ φφφ φφφφ φφ φ φφ · φφ φφ77. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 43 až76 vyznačující se tím, že nukleová kyselina je spojena s jakýmkoliv typem vektoru nebo s jakoukoliv kombinací vektorů, které umožňují zlepšit přenos nukleové kyseliny, jako jsou viry, syntetická nebo biosyntetická činidla nebo propulzní či jiné částice.78. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 43 až77 vyznačující se tím, že sval se podrobí ošetření, jehož cílem je zlepšit přenos genu, kteréžto ošetření je farmakologické povahy lokální nebo systémovoucestou nebo se jedná o ošetření enzymatické, permeabilizuj ící, fyzikální povahy. chirurgické, mechanické, tepelné nebo 79. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 43 až 78 vyznačuj ící se tím, že umožňuje to, aby sval produkoval činidlo ve fyziologické nebo terapeutické dávce, přičemž činidlo je buďto ve svalových buňkách nebo je secernováno.80. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 43 až 78vyznačující se tím, že umožňuje modulovat množství exprimovaného transgenů tím, že se moduluje objem svalové tkáně, která je transfekována.81. Sdružený produkt podle nároku 80 vyznačující se tím, že umožňuje modulovat objem svalové tkáně, která je transfekována, tím, že se užije více míst k podávání.• ·9 ·9 99 9 • 9999994 99 9 99 9 9 99 999999 9 999 982. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 43 až81 vyznačuj ící se tím, že umožňuje modulovat množství exprimovaného transgenu tím, že se moduluje počet, tvar, povrch a uspořádání elektrod, a tím, že se mění intenzita, počet, trvání, frekvence a tvar pulzů, a také tím, že se mění množství a objem podávané nukleové kyseliny.83. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 43 až82 vyznačující se tím, že umožňuje kontrolovat lokalizaci transfekované tkáně prostřednictvím objemu tkáně vystavené lokálním elektrickým pulzům.84. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 43 až83 vyznačující se tím, že umožňuje návrat do počátečního stavu tím, že se odstraní oblast transfekované tkáně.85. Použití nukleové kyseliny pro výrobu léku pro genovou terapii k injikování do kosterního svalu, přičemž sval je elektricky stimulován elektrickým proudem s intenzitou pole 1 až 800 V/cm.86. Použití podle nároku 85, kdy kontakt se provádí přímým podáním do tkáně nebo topickým nebo systémovým podáním.87. Použití podle nároku 85 nebo 86, kdy pulzy jsou unipolární.88. Použití podle kteréhokoliv z nároků 85 až 87, kdy intenzita elektrického pole je 4 až 400 V/cm.ft* · ft ftft ft ftftft • ftftftft ftftft • ft ft ftft · ftft ·* • ftft ftftftft ft ftftft · ftft · ft ···«··« ftft · • · · ftftftft • · ft ftft ftft89. Použití podle kteréhokoliv z nároků 85 až 88, kdy intenzita elektrického pole je 30 až 300 V/cm.90. Použití podle kteréhokoliv z nároků 85 až 89, kdy celková doba aplikace elektrického pole je delší než 10 ms.• tt1/20Účinek elektrických pulzů s vysokou intenzitou pole na transfekci plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru (SEM).
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR9708233A FR2765242B1 (fr) | 1997-06-30 | 1997-06-30 | Amelioration du transfert d'acide nucleique dans le muscle strie et combinaison permettant la mise en oeuvre du procede |
US6748897P | 1997-12-01 | 1997-12-01 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ475599A3 true CZ475599A3 (cs) | 2000-07-12 |
CZ299473B6 CZ299473B6 (cs) | 2008-08-06 |
Family
ID=26233648
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ0475599A CZ299473B6 (cs) | 1997-06-30 | 1998-06-30 | Nukleová kyselina a elektrické pole jako sdruženýprodukt pro prenos nukleové kyseliny do bunek prícne pruhovaného svalstva |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6939862B2 (cs) |
EP (1) | EP0991426B2 (cs) |
JP (1) | JP2002507985A (cs) |
KR (1) | KR20010020571A (cs) |
CN (1) | CN1261807A (cs) |
AT (1) | ATE275423T1 (cs) |
AU (1) | AU8444798A (cs) |
BR (1) | BR9810369A (cs) |
CA (1) | CA2294793A1 (cs) |
CZ (1) | CZ299473B6 (cs) |
DE (1) | DE69826124T3 (cs) |
HU (1) | HUP0004589A3 (cs) |
IL (1) | IL133710A0 (cs) |
NO (1) | NO328102B1 (cs) |
PL (1) | PL337583A1 (cs) |
WO (1) | WO1999001158A1 (cs) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CZ299638B6 (cs) * | 1997-06-30 | 2008-10-01 | Rhone-Poulenc Rorer S. A. | Lécivo pro genovou terapii, které se vnáší do nádoru za aplikace slabého elektrického pole, a kombinovaný produkt pro genovou terapii |
Families Citing this family (130)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090239940A1 (en) * | 1997-07-22 | 2009-09-24 | Del Monte Federica | Treating heart failure and ventricular arrhythmias |
US6800484B2 (en) | 1998-06-24 | 2004-10-05 | Genetronics, Inc. | High efficiency transfection based on low electric field strength, long pulse length |
US6678556B1 (en) * | 1998-07-13 | 2004-01-13 | Genetronics, Inc. | Electrical field therapy with reduced histopathological change in muscle |
US7922709B2 (en) | 1998-07-13 | 2011-04-12 | Genetronics, Inc. | Enhanced delivery of naked DNA to skin by non-invasive in vivo electroporation |
EP1829973A3 (en) * | 1999-06-25 | 2008-01-09 | Genetronics, Inc. | High efficienty transfection based on low electric field strength, low pulse length |
WO2001068131A1 (en) | 2000-03-13 | 2001-09-20 | Cornell Research Foundation, Inc. | Blocking leukocyte emigration and inflammation by interfering with cd99/hec2 |
US7416726B2 (en) | 2000-04-13 | 2008-08-26 | The Rockefeller University | Enhancement of antibody-mediated immune responses |
AU6475901A (en) | 2000-05-22 | 2001-12-03 | Merck And Company Inc | System and method for assessing the performance of a pharmaceutical agent delivery system |
EP1353723A2 (en) | 2000-11-17 | 2003-10-22 | Gendel Limited | Ablation of cells using combined electric field and ultrasound therapy |
US6821274B2 (en) | 2001-03-07 | 2004-11-23 | Gendel Ltd. | Ultrasound therapy for selective cell ablation |
EP2402359A1 (en) | 2000-12-28 | 2012-01-04 | Wyeth LLC | Recombinant protective protein from streptococcus pneumoniae |
ATE448793T1 (de) | 2001-03-02 | 2009-12-15 | Univ Rockefeller | Rekombinante hybrid-allergenkonstrukte mit verringerter allergenität unter beibehaltung der immunogenität des natürlichen allergens |
US20040023910A1 (en) * | 2001-09-28 | 2004-02-05 | Zhiming Zhang | Use of cyr61 in the treatment and diagnosis of human uterine leiomyomas |
MX339524B (es) | 2001-10-11 | 2016-05-30 | Wyeth Corp | Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica. |
WO2003075978A2 (en) | 2002-03-07 | 2003-09-18 | Merck & Co., Inc. | Clinical syringe with electrical stimulation aspects |
JP2005526579A (ja) | 2002-05-23 | 2005-09-08 | ジェンデル・リミテッド | 焼灼デバイス |
PL210412B1 (pl) | 2002-05-24 | 2012-01-31 | Schering Corp | Izolowane przeciwciało anty-IGFR lub jego fragment, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie, kwas nukleinowy, zrekombinowany wektor, komórka gospodarza, kompleks, polipeptyd i sposób jego wytwarzania |
US7785608B2 (en) | 2002-08-30 | 2010-08-31 | Wyeth Holdings Corporation | Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease |
US7468273B2 (en) | 2003-05-01 | 2008-12-23 | Meial Limited | Canine GHRH gene, polypeptides and methods of use |
US7291604B2 (en) * | 2003-09-03 | 2007-11-06 | The General Hospital Corporation | Methods of treating restenosis |
WO2005099367A2 (en) | 2004-04-16 | 2005-10-27 | Critical Care Innovations, Inc. | Systems and methods for improving image-guided tissue ablation |
FR2880808A1 (fr) * | 2005-01-20 | 2006-07-21 | Yves Scherman | Dispositif pour l'administration de principe actif aux cellules et tissus a l'aide d'electrodes de surface non invasives |
US8101169B2 (en) * | 2005-02-23 | 2012-01-24 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Ocular gene therapy using avalanche-mediated transfection |
US7923251B2 (en) * | 2005-02-23 | 2011-04-12 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Method and apparatus for avalanche-mediated transfer of agents into cells |
CN101208104B (zh) | 2005-04-25 | 2012-10-31 | 梅瑞尔有限公司 | Nipah病毒疫苗 |
US8088382B2 (en) | 2005-07-05 | 2012-01-03 | Cornell Research Foundation, Inc. | Methods of inhibiting transendothelial migration of neutrophils and monocytes with anti-CD99L2 antibodies |
FR2889066B1 (fr) * | 2005-07-28 | 2007-11-09 | Centre Nat Rech Scient | Procede d'immunisation genetique par electrotransfert contre une toxine et antiserum susceptible d'etre obtenu par ledit procede |
US20080241184A1 (en) | 2005-08-25 | 2008-10-02 | Jules Maarten Minke | Canine influenza vaccines |
US7771995B2 (en) | 2005-11-14 | 2010-08-10 | Merial Limited | Plasmid encoding human BMP-7 |
EP3147296A1 (en) | 2005-11-14 | 2017-03-29 | Merial, Inc. | Gene therapy for renal failure |
US8613925B2 (en) | 2006-10-19 | 2013-12-24 | Csl Limited | Anti-IL-13Rα1 antibodies and their uses thereof |
ES2658239T3 (es) | 2006-10-19 | 2018-03-08 | Csl Limited | Antagonistas de anticuerpos de alta afinidad del receptor alfa 1 de interleucina-13 |
AR064642A1 (es) | 2006-12-22 | 2009-04-15 | Wyeth Corp | Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi |
BRPI0721630A2 (pt) | 2007-05-02 | 2013-10-15 | Merial Ltd | Plasmídeo de dna tendo expressão e estabilidade aperfeiçoadas |
WO2009124309A2 (en) | 2008-04-04 | 2009-10-08 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Vaccines and immunotherapeutics using il-28 and compositions and methods of using the same |
US8093043B2 (en) | 2008-06-04 | 2012-01-10 | New York University | β-TrCP1, β-TrCP2 and RSK1 or RSK2 inhibitors and methods for sensitizing target cells to apoptosis |
EP2147697A1 (en) | 2008-07-21 | 2010-01-27 | Centre National De La Recherche Scientifique-CNRS | Process and device for applying electric fields into conductive material |
EP2156860A1 (en) | 2008-08-20 | 2010-02-24 | Centre National De La Recherche Scientifique-CNRS | Method for producing insulated electrodes for applying electric fields into conductive material |
BRPI0921286B8 (pt) | 2008-11-05 | 2022-10-25 | Wyeth Llc | Composição imunogênica com múltiplos componentes para a prevenção de doença por estreptococos beta-hemolíticos (bhs). |
MX2011005604A (es) | 2008-11-28 | 2011-09-01 | Merial Ltd | Vacuna recombinante para influenza aviar y sus usos. |
EP2477659A4 (en) | 2009-09-14 | 2014-01-15 | Univ Pennsylvania | IMMUNOTHERAPEUTIC VACCINES AND AGENTS COMPRISING THE ALPHA IL-15 RECEPTOR AND / OR NUCLEIC ACID MOLECULES ENCODING THE SAME, AND METHODS OF USING THE SAME |
WO2011054011A2 (en) | 2009-11-02 | 2011-05-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Foot and mouth disease virus (fmdv) consensus proteins, coding sequences therefor and vaccines made therefrom |
MX351643B (es) | 2009-12-28 | 2017-10-23 | Merial Ltd | Antigeno ndv recombinante y usos del mismo. |
US8298820B2 (en) | 2010-01-26 | 2012-10-30 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Influenza nucleic acid molecules and vaccines made therefrom |
AU2011213559B2 (en) | 2010-02-08 | 2015-05-07 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Nucleic acid molecules encoding RANTES, and compositions comprising and methods of using the same |
US20130197612A1 (en) | 2010-02-26 | 2013-08-01 | Jack W. Lasersohn | Electromagnetic Radiation Therapy |
MA34087B1 (fr) | 2010-03-12 | 2013-03-05 | Merial Ltd | Vaccins recombinants contre le virus de la langue bleue et leurs utilisations |
PL3246044T3 (pl) | 2010-08-23 | 2021-08-23 | Wyeth Llc | Stabilne preparaty antygenów rLP2086 Neisseria meningitidis |
CA2809758C (en) | 2010-09-10 | 2021-07-13 | Wyeth Llc | Non-lipidated variants of neisseria meningitidis orf2086 antigens |
EP2621540A4 (en) | 2010-09-27 | 2014-08-27 | Univ Pennsylvania | SYNTHESIS PRODUCTS OF ANTIGEN CONSENSUS AND VACCINES MADE THEREFROM, AND METHODS OF USING THE SAME TO TREAT MALARIA |
ES2718846T3 (es) | 2010-11-12 | 2019-07-04 | Univ Pennsylvania | Antígenos de próstata consenso, molécula de ácido nucleico que los codifica y la vacuna y usos que los comprenden |
US9078878B2 (en) | 2010-12-01 | 2015-07-14 | Alderbio Holdings Llc | Anti-NGF antibodies that selectively inhibit the association of NGF with TrkA, without affecting the association of NGF with p75 |
US11214610B2 (en) | 2010-12-01 | 2022-01-04 | H. Lundbeck A/S | High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris |
AU2011336470B8 (en) | 2010-12-01 | 2017-09-14 | Alderbio Holdings Llc | Anti-NGF compositions and use thereof |
US9067988B2 (en) | 2010-12-01 | 2015-06-30 | Alderbio Holdings Llc | Methods of preventing or treating pain using anti-NGF antibodies |
US9884909B2 (en) | 2010-12-01 | 2018-02-06 | Alderbio Holdings Llc | Anti-NGF compositions and use thereof |
US9539324B2 (en) | 2010-12-01 | 2017-01-10 | Alderbio Holdings, Llc | Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions |
BR112013020070A8 (pt) | 2011-01-31 | 2019-09-03 | Univ Pennsylvania | moléculas de ácido nucleico que codificam novos antígenos de herpes, vacina compreendendo as mesmas e métodos de uso das mesmas |
CN103442732B (zh) | 2011-02-11 | 2017-04-12 | 宾夕法尼亚大学托管会 | 编码乙型肝炎病毒核心蛋白的核酸分子和包含其的疫苗 |
US9238679B2 (en) | 2011-02-11 | 2016-01-19 | The Trustees Of The University Of Pennslyvania | Nucleic acid molecule encoding hepatitis B virus core protein and surface antigen protein and vaccine comprising the same |
EP2714722B1 (en) | 2011-05-27 | 2019-09-11 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Genetic vaccines against hendra virus and nipah virus |
EP2714077B1 (en) | 2011-06-01 | 2018-02-28 | Merial, Inc. | Needle-free administration of prrsv vaccines |
KR102314421B1 (ko) | 2011-07-11 | 2021-10-19 | 이노비오 파마수티컬즈, 인크. | 교차-보호성 아레나바이러스 백신 및 이의 사용 방법 |
MX354986B (es) | 2011-12-12 | 2018-03-28 | Univ Pennsylvania | Composiciones que comprenden construcciones geneticas y vacunas de il-12 mejoradas, agentes inmunoterapeuticos y metodos para su uso. |
US9750795B2 (en) | 2011-12-12 | 2017-09-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Proteins comprising MRSA PBP2a and fragments thereof, nucleic acids encoding the same, and compositions and their use to prevent and treat MRSA infections |
US9446117B2 (en) | 2012-02-14 | 2016-09-20 | Merial, Inc. | Rotavirus subunit vaccines and methods of making and use thereof |
MX360415B (es) | 2012-02-14 | 2018-10-31 | Merial Inc | Vectores poxvirales recombinantes que expresan proteinas tanto de rabia como de ox40, y vacunas hechas a partir de los mismos. |
CN104334187B (zh) | 2012-03-09 | 2017-04-05 | 辉瑞公司 | 脑膜炎双球菌组合物及其方法 |
SA115360586B1 (ar) | 2012-03-09 | 2017-04-12 | فايزر انك | تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها |
MX355332B (es) | 2012-03-22 | 2018-04-16 | Merial Ltd | Virus de la enfermedad de marek modificado y vacunas elaboradas con el. |
JP2015514132A (ja) | 2012-04-10 | 2015-05-18 | ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア | ヒト呼吸器合胞体ウイルスコンセンサス抗原、核酸構築物、およびそれらから作製されるワクチン、ならびにその使用方法 |
KR20240010758A (ko) | 2012-04-12 | 2024-01-24 | 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 | 필로바이러스 공통 항원, 이로부터 제조된 핵산 구조체 및 백신, 및 이를 사용하는 방법 |
CN104582724A (zh) | 2012-06-13 | 2015-04-29 | 梅里亚有限公司 | 重配btv和ahsv疫苗 |
WO2015089492A2 (en) | 2013-12-13 | 2015-06-18 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Dna antibody constructs and method of using same |
BR112015013004B1 (pt) | 2012-12-13 | 2022-09-06 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Molécula de ácido nucleico isolada, proteína e seus usos, bem como composição e vacina |
WO2014107739A1 (en) | 2013-01-07 | 2014-07-10 | Eleven Biotherapeutics, Inc. | Antibodies against pcsk9 |
JP6446377B2 (ja) | 2013-03-08 | 2018-12-26 | ファイザー・インク | 免疫原性融合ポリペプチド |
KR20230062674A (ko) | 2013-03-15 | 2023-05-09 | 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 | 암 백신 및 이를 이용한 치료 방법 |
BR112015022582B1 (pt) | 2013-03-15 | 2024-01-09 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Molécula de ácido nucleico, plasmídeo, vacina, e, uso de um plasmídeo |
JP6692294B2 (ja) | 2013-07-31 | 2020-05-13 | バイオベンチャーズ・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーBioVentures, LLC | 腫瘍関連糖鎖抗原を標的として癌を治療及び予防するための組成物及び方法 |
CN105492021B (zh) | 2013-09-08 | 2018-12-04 | 辉瑞公司 | 脑膜炎奈瑟氏球菌组合物及其方法 |
MX2017007187A (es) | 2014-12-01 | 2018-01-30 | Univ Pennsylvania | Construcciones de anticuerpos de adn y metodo para utilizarlas. |
WO2016132294A1 (en) | 2015-02-19 | 2016-08-25 | Pfizer Inc. | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
CA2996143A1 (en) | 2015-08-20 | 2017-02-23 | Merial, Inc. | Fcv recombinant vaccines and uses thereof |
SI3355915T1 (sl) | 2015-09-29 | 2024-03-29 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Cepiva z virusu podobnim delcem (vlp) pasjega parvovirusa (cpv) in njihove uporabe |
MA42640B1 (fr) | 2015-11-23 | 2021-06-30 | Merial Inc | Protéines de fusion de dmdv et e2 et leurs utilisations |
TWI760322B (zh) | 2016-01-29 | 2022-04-11 | 美商百靈佳殷格翰動物保健美國有限公司 | 重組腺病毒載體裝載之fmdv疫苗及其用途 |
AU2017214656B2 (en) | 2016-02-05 | 2022-08-25 | Inovio Pharmaceuticals, Inc. | Cancer vaccines and methods of treatment using the same |
CA3020426A1 (en) | 2016-04-13 | 2017-10-19 | Synthetic Genomics, Inc. | Recombinant arterivirus replicon systems and uses thereof |
US11364310B2 (en) | 2016-10-17 | 2022-06-21 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Recombinant virus replicon systems and uses thereof |
EP3548625B1 (en) | 2016-12-05 | 2024-06-26 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for enhancing gene expression |
IL303108B1 (en) | 2017-01-31 | 2024-03-01 | Pfizer | NEISSERIA MENINGITIDIS preparations and methods therefor |
RU2751252C1 (ru) | 2017-12-13 | 2021-07-12 | Иновио Фармасьютикалз, Инк. | Мезотелин-нацеленные вакцины от рака и их применение |
BR112020011443A2 (pt) | 2017-12-13 | 2020-12-01 | Inovio Pharmaceuticals, Inc. | molécula de ácido nucleico e seu uso, vetor e seu uso, composição, proteína e vacina |
MX2020006217A (es) | 2017-12-13 | 2020-12-03 | Inovio Pharmaceuticals Inc | Vacunas de cáncer dirigidas a muc16 y sus usos. |
US11389531B2 (en) | 2017-12-19 | 2022-07-19 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Methods and apparatus for the delivery of hepatitis B virus (HBV) vaccines |
EP3727445B1 (en) | 2017-12-19 | 2023-08-16 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Hepatitis b virus (hbv) vaccines and uses thereof |
SG11202005710YA (en) | 2017-12-19 | 2020-07-29 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Co | Methods and compositions for inducing an immune response against hepatitis b virus (hbv) |
US11021692B2 (en) | 2017-12-19 | 2021-06-01 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Hepatitis B virus (HBV) vaccines and uses thereof |
EA202091516A1 (ru) | 2017-12-19 | 2020-11-03 | Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани | Способы и композиции для индукции иммунного ответа против вируса гепатита b (hbv) |
AU2019210189A1 (en) | 2018-01-19 | 2020-08-06 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Induce and enhance immune responses using recombinant replicon systems |
WO2020255009A2 (en) | 2019-06-18 | 2020-12-24 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and anti-pd-1 antibody |
WO2020255010A1 (en) | 2019-06-18 | 2020-12-24 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Combination of recombinant interleukin 12 construct and hepatitis b virus (hbv) vaccines |
CA3140690A1 (en) | 2019-06-18 | 2020-12-24 | Helen Horton | Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and dihydropyrimidine derivatives as capsid assembly modulators |
WO2020255019A1 (en) | 2019-06-18 | 2020-12-24 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and a quinazoline derivative |
WO2020255039A1 (en) | 2019-06-18 | 2020-12-24 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and quinazoline derivatives |
WO2020255038A1 (en) | 2019-06-18 | 2020-12-24 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and pyridopyrimidine derivatives |
CA3140748A1 (en) | 2019-06-18 | 2020-12-24 | Helen Horton | Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and capsid assembly modulators being sulfonamide derivatives |
WO2020255018A1 (en) | 2019-06-18 | 2020-12-24 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Hepatitis b virus (hbv) vaccines and uses thereof |
WO2020255022A1 (en) | 2019-06-18 | 2020-12-24 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and aminopyridine derivatives as hpk1 inhibitors |
WO2020255008A1 (en) | 2019-06-18 | 2020-12-24 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | COMBINATION OF HEPATITIS B VIRUS (HBV) VACCINES AND HBV-TARGETING RNAi |
US20220233684A1 (en) | 2019-06-18 | 2022-07-28 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and pd-l1 inhibitors |
WO2020255016A1 (en) | 2019-06-18 | 2020-12-24 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and dihydropyrimidine derivatives as capsid assembly modulators |
WO2020255013A1 (en) | 2019-06-18 | 2020-12-24 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and capsid assembly modulators being amide derivatives |
WO2020254876A1 (en) | 2019-06-18 | 2020-12-24 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Virus-like particle delivery of hepatitis b virus (hbv) vaccines |
WO2020255017A1 (en) | 2019-06-18 | 2020-12-24 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and dihydropyrimidine derivatives as capsid assembly modulators |
CA3141323A1 (en) | 2019-06-18 | 2020-12-24 | Helen Horton | Recombinant interleukin 12 construct and uses thereof |
EP3986562A1 (en) | 2019-06-18 | 2022-04-27 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and hbv-targeting rnai |
WO2020255035A1 (en) | 2019-06-18 | 2020-12-24 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and pyrimidine derivatives |
WO2020255021A1 (en) | 2019-06-18 | 2020-12-24 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and small molecule pdl1 or pd1 inhibitor |
WO2020255042A1 (en) | 2019-06-18 | 2020-12-24 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and a pyrimidine derivative |
KR20220041080A (ko) | 2019-06-18 | 2022-03-31 | 얀센 사이언시즈 아일랜드 언리미티드 컴퍼니 | B형 간염 바이러스(hbv) 백신 및 항-pd-1 또는 항-pc-l1 항체의 조합 |
CA3143631A1 (en) | 2019-06-20 | 2020-12-24 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Lipid nanoparticle or liposome delivery of hepatitis b virus (hbv) vaccines |
EP3986457A1 (en) | 2019-06-20 | 2022-04-27 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Carbohydrate nanocarrier delivery of hepatitis b virus (hbv) vaccines |
CN116133668A (zh) | 2020-06-12 | 2023-05-16 | 罗切斯特大学 | ACE-tRNA的编码和表达 |
EP4178613A1 (en) | 2020-07-08 | 2023-05-17 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Rna replicon vaccines against hbv |
TW202245809A (zh) | 2020-12-18 | 2022-12-01 | 美商詹森藥物公司 | 用於治療b型肝炎病毒感染之組合療法 |
JP2024501022A (ja) | 2020-12-28 | 2024-01-10 | アークトゥルス セラピューティクス, インコーポレイテッド | Hbvを標的とする転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(talen) |
WO2023150753A1 (en) | 2022-02-07 | 2023-08-10 | University Of Rochester | Optimized sequences for enhanced trna expression or/and nonsense mutation suppression |
WO2023233290A1 (en) | 2022-05-31 | 2023-12-07 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Rnai agents targeting pd-l1 |
Family Cites Families (80)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4301794A (en) | 1978-10-18 | 1981-11-24 | Robert Tapper | Method for iontophoretic treatment |
US4411657A (en) | 1980-05-19 | 1983-10-25 | Anibal Galindo | Hypodermic needle |
JPS5810066A (ja) | 1981-07-10 | 1983-01-20 | 株式会社アドバンス | イオントフオレ−ゼ用プラスタ−構造体 |
US4441972A (en) | 1983-04-08 | 1984-04-10 | D.E.P. Systems, Inc. | Apparatus for electrofusion of biological particles |
US4476004A (en) | 1983-04-08 | 1984-10-09 | D.E.P. Systems, Inc. | Apparatus for electrofusion of biological particles |
US4639244A (en) | 1983-05-03 | 1987-01-27 | Nabil I. Rizk | Implantable electrophoretic pump for ionic drugs and associated methods |
DE3317415A1 (de) | 1983-05-13 | 1984-11-15 | Kernforschungsanlage Jülich GmbH, 5170 Jülich | Kammer zur behandlung von zellen im elektrischen feld |
US4557723A (en) | 1983-08-18 | 1985-12-10 | Drug Delivery Systems Inc. | Applicator for the non-invasive transcutaneous delivery of medicament |
US4622031A (en) | 1983-08-18 | 1986-11-11 | Drug Delivery Systems Inc. | Indicator for electrophoretic transcutaneous drug delivery device |
CA1341091C (en) | 1983-10-20 | 2000-09-05 | Masayori Inouye | Regulation of gene expression by employing translational inhibition utilizaing mrna interfering complementary rna |
US4578168A (en) | 1984-07-27 | 1986-03-25 | Biotronics | Apparatus for fusing live cells with electric fields |
FR2573436B1 (fr) | 1984-11-20 | 1989-02-17 | Pasteur Institut | Adn recombinant comportant une sequence nucleotidique codant pour un polypeptide determine sous le controle d'un promoteur d'adenovirus, vecteurs contenant cet adn recombinant, cellules eucaryotes transformees par cet adn recombinant, produits d'excretion de ces cellules transformees et leurs applications, notamment a la constitution de vaccins |
US6696420B1 (en) * | 1984-11-20 | 2004-02-24 | Institut Pasteur | Adenoviral vector with a deletion in the E1A coding region expressing a hetorologous protein |
US4663292A (en) | 1984-12-21 | 1987-05-05 | Wong Daniel T | High-voltage biological macromolecule transfer and cell fusion system |
US4702732A (en) | 1984-12-24 | 1987-10-27 | Trustees Of Boston University | Electrodes, electrode assemblies, methods, and systems for tissue stimulation and transdermal delivery of pharmacologically active ligands |
AT385894B (de) | 1985-10-04 | 1988-05-25 | Basem Dr Nashef | Schlauchfoermige sonde |
US5049488A (en) | 1985-11-08 | 1991-09-17 | Genentech, Inc. | Method and nucleic acid for the preparation of lecithin:cholesterol acyltransferase |
US4695547A (en) | 1986-04-02 | 1987-09-22 | Jeffrey L. Hilliard | Probe for electrofusion, electroporation, or like procedure |
US6007806A (en) * | 1986-08-13 | 1999-12-28 | Transgene S.A. | Expression of a tumor-specific antigen by a recombinant vector virus and use thereof in preventive or curative treatment of the corresponding tumor |
FR2602790B1 (fr) | 1986-08-13 | 1990-06-01 | Transgene Sa | Expression d'un antigene specifique de tumeur par un virus vecteur recombinant et utilisation de celui-ci pour le traitement preventif ou curatif de la tumeur correspondante |
US5744133A (en) * | 1986-08-13 | 1998-04-28 | Transgene S.A. | Expression of a tumor-specific antigen by a recombinant vector virus and use thereof in preventitive or curative treatment of the corresponding tumor |
US4786277A (en) | 1986-11-21 | 1988-11-22 | Trustees Of Boston University | Electrodes, electrode assemblies, methods, and systems for tissue stimulation |
US5371003A (en) | 1987-05-05 | 1994-12-06 | Sandoz Ltd. | Electrotransformation process |
US5128257A (en) | 1987-08-31 | 1992-07-07 | Baer Bradford W | Electroporation apparatus and process |
US4970154A (en) | 1987-10-09 | 1990-11-13 | Baylor College Of Medicine | Method for inserting foreign genes into cells using pulsed radiofrequency |
KR970010758B1 (ko) | 1987-12-15 | 1997-06-30 | 진 쉬어즈 피티와이. 리미티드 | 올리고리보뉴클레오티드 화합물 |
JP2798459B2 (ja) | 1988-01-21 | 1998-09-17 | マサチユセツツ・インスチチユート・オブ・テクノロジー | エレクトロポレーションを利用した診断装置及び分子の組織内移動装置 |
US5389069A (en) | 1988-01-21 | 1995-02-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Method and apparatus for in vivo electroporation of remote cells and tissue |
US5547467A (en) | 1988-01-21 | 1996-08-20 | Massachusettes Institute Of Technology | Method for rapid temporal control of molecular transport across tissue |
US5749847A (en) | 1988-01-21 | 1998-05-12 | Massachusetts Institute Of Technology | Delivery of nucleotides into organisms by electroporation |
US5693622A (en) * | 1989-03-21 | 1997-12-02 | Vical Incorporated | Expression of exogenous polynucleotide sequences cardiac muscle of a mammal |
US5119832A (en) | 1989-07-11 | 1992-06-09 | Ravi Xavier | Epidural catheter with nerve stimulators |
US5124259A (en) | 1989-08-23 | 1992-06-23 | Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. | Method for electroporation |
US6228844B1 (en) * | 1991-11-12 | 2001-05-08 | Vical Incorporated | Stimulating vascular growth by administration of DNA sequences encoding VEGF |
US5236413B1 (en) | 1990-05-07 | 1996-06-18 | Andrew J Feiring | Method and apparatus for inducing the permeation of medication into internal tissue |
US5081990A (en) | 1990-05-11 | 1992-01-21 | New York University | Catheter for spinal epidural injection of drugs and measurement of evoked potentials |
ATE123658T1 (de) | 1990-06-15 | 1995-06-15 | Cortrak Medical Inc | Vorrichtung zur abgabe von medikamenten. |
US5499971A (en) | 1990-06-15 | 1996-03-19 | Cortrak Medical, Inc. | Method for iontophoretically delivering drug adjacent to a heart |
FR2681786A1 (fr) | 1991-09-27 | 1993-04-02 | Centre Nat Rech Scient | Vecteurs recombinants d'origine virale, leur procede d'obtention et leur utilisation pour l'expression de polypeptides dans des cellules musculaires. |
FR2688514A1 (fr) | 1992-03-16 | 1993-09-17 | Centre Nat Rech Scient | Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant. |
US5501662A (en) | 1992-05-22 | 1996-03-26 | Genetronics, Inc. | Implantable electroporation method and apparatus for drug and gene delivery |
US5814603A (en) | 1992-06-12 | 1998-09-29 | Affymax Technologies N.V. | Compounds with PTH activity |
US5607691A (en) | 1992-06-12 | 1997-03-04 | Affymax Technologies N.V. | Compositions and methods for enhanced drug delivery |
JPH063783A (ja) | 1992-06-19 | 1994-01-14 | Fuji Photo Film Co Ltd | ハロゲン化銀カラー写真感光材料 |
US5304120A (en) | 1992-07-01 | 1994-04-19 | Btx Inc. | Electroporation method and apparatus for insertion of drugs and genes into endothelial cells |
JP3099049B2 (ja) * | 1992-07-29 | 2000-10-16 | 農林水産省果樹試験場長 | 電気的細胞融合及び電気的核酸導入のための大量処理用電極 |
US5273525A (en) * | 1992-08-13 | 1993-12-28 | Btx Inc. | Injection and electroporation apparatus for drug and gene delivery |
US5688233A (en) | 1992-08-17 | 1997-11-18 | Genetronics, Inc. | Electronincorporation enhanced transdermal delivery of molecules |
US5462520A (en) | 1992-08-17 | 1995-10-31 | Genetronics, Inc. | Transsurface drug delivery by electrofusion of microbubbles to the tissue surface |
US5318514A (en) | 1992-08-17 | 1994-06-07 | Btx, Inc. | Applicator for the electroporation of drugs and genes into surface cells |
US5464386A (en) | 1992-08-17 | 1995-11-07 | Genetronics, Inc. | Transdermal drug delivery by electroincorporation of vesicles |
JP3351572B2 (ja) | 1992-10-05 | 2002-11-25 | 井上 聰一 | イオンクロマトグラフィーによる分析体の分離・分析方法、イオンクロマトグラフィー用両荷電具備固定相及び多機能液体クロマトグラフィーによる分析体の分離・分析方法 |
US5468223A (en) | 1992-11-30 | 1995-11-21 | C.N.R.S. Paris | Electrochemotherapy |
FR2703253B1 (fr) | 1993-03-30 | 1995-06-23 | Centre Nat Rech Scient | Applicateur d'impulsions electriques pour traitement de tissus biologiques. |
US5702359A (en) | 1995-06-06 | 1997-12-30 | Genetronics, Inc. | Needle electrodes for mediated delivery of drugs and genes |
US5993434A (en) * | 1993-04-01 | 1999-11-30 | Genetronics, Inc. | Method of treatment using electroporation mediated delivery of drugs and genes |
US5439440A (en) | 1993-04-01 | 1995-08-08 | Genetronics, Inc. | Electroporation system with voltage control feedback for clinical applications |
GB9317380D0 (en) * | 1993-08-20 | 1993-10-06 | Therexsys Ltd | Transfection process |
US5679647A (en) | 1993-08-26 | 1997-10-21 | The Regents Of The University Of California | Methods and devices for immunizing a host against tumor-associated antigens through administration of naked polynucleotides which encode tumor-associated antigenic peptides |
US5804566A (en) | 1993-08-26 | 1998-09-08 | The Regents Of The University Of California | Methods and devices for immunizing a host through administration of naked polynucleotides with encode allergenic peptides |
US5849719A (en) | 1993-08-26 | 1998-12-15 | The Regents Of The University Of California | Method for treating allergic lung disease |
DE4341424A1 (de) | 1993-12-04 | 1995-06-08 | Bosch Gmbh Robert | Kraftstoffeinspritzpumpe |
IL108775A (en) | 1994-02-25 | 2003-09-17 | Univ Ramot | Method for efficient incorporation of molecules into cells |
AU2947795A (en) | 1994-06-24 | 1996-01-19 | Cygnus, Inc. | Pulsatile delivery systems of biologically active agents using electro voltage pulsing for controlling membrane permeability |
US5471884A (en) | 1994-07-05 | 1995-12-05 | Motorola, Inc. | Gain-adjusting circuitry for combining two sensors to form a media isolated differential pressure sensor |
IT235163Y1 (it) | 1994-10-10 | 2000-03-31 | Ideal Standard Spa | Gruppo di tenuta per elementi maschio di stampi per la colatura di apparecchiature igienico-sanitarie |
US5641680A (en) * | 1994-11-14 | 1997-06-24 | Zhao; Xi | Gene transfer apparatus and method for using the same |
US5810762A (en) | 1995-04-10 | 1998-09-22 | Genetronics, Inc. | Electroporation system with voltage control feedback for clinical applications |
WO1997007826A1 (en) * | 1995-08-29 | 1997-03-06 | Cbr Laboratories, Inc. | In vivo electroporation of cells |
FR2738842B1 (fr) | 1995-09-15 | 1997-10-31 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Molecule d'adn circulaire a origine de replication conditionnelle, leur procede de preparation et leur utilisation en therapie genique |
US5944710A (en) | 1996-06-24 | 1999-08-31 | Genetronics, Inc. | Electroporation-mediated intravascular delivery |
US5944726A (en) | 1996-08-23 | 1999-08-31 | Scimed Life Systems, Inc. | Stent delivery system having stent securement means |
US5960974A (en) | 1996-10-03 | 1999-10-05 | Advance Engineered Products Ltd. | Intermodal bulk container |
JPH10234366A (ja) | 1997-02-26 | 1998-09-08 | Hisamitsu Pharmaceut Co Inc | エレクトロポレーション用電極及びその製法、それを用いた製剤 |
CA2285056C (en) | 1997-04-03 | 2004-12-14 | Iacob Mathiesen | Method for introducing pharmaceutical drugs and nucleic acids into skeletal muscle |
US6055453A (en) | 1997-08-01 | 2000-04-25 | Genetronics, Inc. | Apparatus for addressing needle array electrodes for electroporation therapy |
US6241701B1 (en) * | 1997-08-01 | 2001-06-05 | Genetronics, Inc. | Apparatus for electroporation mediated delivery of drugs and genes |
WO1999036563A1 (en) | 1998-01-14 | 1999-07-22 | Emed Corporation | Electrically mediated cellular expression |
EP2428249B1 (en) | 1998-07-13 | 2015-10-07 | Inovio Pharmaceuticals, Inc. | Skin and muscle-targeted gene therapy by pulsed electrical field |
US6678556B1 (en) * | 1998-07-13 | 2004-01-13 | Genetronics, Inc. | Electrical field therapy with reduced histopathological change in muscle |
-
1998
- 1998-06-30 JP JP50653099A patent/JP2002507985A/ja active Pending
- 1998-06-30 WO PCT/FR1998/001400 patent/WO1999001158A1/fr active IP Right Grant
- 1998-06-30 CZ CZ0475599A patent/CZ299473B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-06-30 DE DE69826124T patent/DE69826124T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-30 CN CN98806671A patent/CN1261807A/zh active Pending
- 1998-06-30 IL IL13371098A patent/IL133710A0/xx unknown
- 1998-06-30 AU AU84447/98A patent/AU8444798A/en not_active Abandoned
- 1998-06-30 CA CA002294793A patent/CA2294793A1/fr not_active Abandoned
- 1998-06-30 KR KR1019997012481A patent/KR20010020571A/ko not_active Application Discontinuation
- 1998-06-30 BR BR9810369-5A patent/BR9810369A/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-06-30 AT AT98935067T patent/ATE275423T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-06-30 EP EP98935067A patent/EP0991426B2/fr not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-30 HU HU0004589A patent/HUP0004589A3/hu unknown
- 1998-06-30 PL PL98337583A patent/PL337583A1/xx not_active Application Discontinuation
-
1999
- 1999-12-29 NO NO19996542A patent/NO328102B1/no not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-11-07 US US09/986,033 patent/US6939862B2/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CZ299638B6 (cs) * | 1997-06-30 | 2008-10-01 | Rhone-Poulenc Rorer S. A. | Lécivo pro genovou terapii, které se vnáší do nádoru za aplikace slabého elektrického pole, a kombinovaný produkt pro genovou terapii |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU8444798A (en) | 1999-01-25 |
EP0991426B1 (fr) | 2004-09-08 |
PL337583A1 (en) | 2000-08-28 |
DE69826124D1 (de) | 2004-10-14 |
IL133710A0 (en) | 2001-04-30 |
JP2002507985A (ja) | 2002-03-12 |
US6939862B2 (en) | 2005-09-06 |
HUP0004589A3 (en) | 2003-08-28 |
EP0991426B2 (fr) | 2007-03-28 |
CN1261807A (zh) | 2000-08-02 |
KR20010020571A (ko) | 2001-03-15 |
DE69826124T2 (de) | 2005-09-15 |
ATE275423T1 (de) | 2004-09-15 |
CA2294793A1 (fr) | 1999-01-14 |
NO996542D0 (no) | 1999-12-29 |
WO1999001158A1 (fr) | 1999-01-14 |
BR9810369A (pt) | 2000-09-05 |
NO328102B1 (no) | 2009-12-07 |
NO996542L (no) | 2000-02-17 |
HUP0004589A1 (hu) | 2001-04-28 |
DE69826124T3 (de) | 2007-10-11 |
CZ299473B6 (cs) | 2008-08-06 |
US20030073653A1 (en) | 2003-04-17 |
EP0991426A1 (fr) | 2000-04-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CZ475599A3 (cs) | Použití nukleové kyseliny k výrobě léčiva pro genovou terapii, které se injikuje do příčně pruhovaného svalstva | |
CZ475499A3 (cs) | Použití nukleové kyseliny pro výrobu léčiva pro genovou terapii, které se vnáší do buněk vícebuněčných eukaryotických organismů | |
KR20010014298A (ko) | 핵산 벡터의 생체 내 조직으로의 적정화된 전기전달 장치 | |
Dean | Nonviral gene transfer to skeletal, smooth, and cardiac muscle in living animals | |
JP2004530401A (ja) | 細胞への核酸の送達を促進する方法および成分 | |
Reed et al. | Electroporation advances in large animals | |
Preat et al. | Topical delivery of nucleic acids in the skin | |
MXPA99011444A (es) | Metodo mejorado de transferencia de acidos nucleicos enmusculo estraido y combinaciones que permienn el uso del procedimiento | |
CZ475699A3 (cs) | Systém a zařízení pro in vivo přenos nukleových kyselin do tkání | |
AU4439102A (en) | Improved method for transferring nucleic acid into the striped muscle and combination therefor | |
US20050004055A1 (en) | Increasing electro-gene transfer of nucleic acid molecules into host tissue | |
AU4576202A (en) | Improvement in the transfer of nucleic acid into the cells of pluricellular eukaryotic organisms and combination allowing the method to be carried out | |
FR2765241A1 (fr) | Amelioration du transfert d'acide nucleique dans les cellules d'organismes eucaryotes pluricellulaires et combinaison permettant la mise en oeuvre du procede | |
MXPA99011527A (en) | Device for optimized electrotransfer of nucleic acid vectors to tissues in vivo | |
FR2765242A1 (fr) | Amelioration du transfert d'acide nucleique dans le muscle strie et combinaison permettant la mise en oeuvre du procede |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
MK4A | Patent expired |
Effective date: 20180630 |