NO327499B1 - Anvendelse av en nukleinsyre for fremstilling av et medikament for behandling av kreft ved genterapi. - Google Patents

Abstract

En forbedring av overføringen in vivo til celler av pluricellulære, eukaryotiske organismer, der nukleinsyren assosieres med produkter som tillater å øke utbyttet av slik overføring, og kombinasjonen av en nukleinsyre og en overføringsprosess for anvendelse ved genterapi.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av en nukleinsyre for fremstilling av et medikament for behandling av kreft ved genterapi. Ved å bringe nevnte medikament i kontakt med tumorer, og nevnte tumorer utsettes for en eller flere elektriske pulser med en intensitet på mellom 1 og 600 Volt/cm, er det vist bemerkelsesverdig forbedring i overføring av nevnte nukleinsyre.

Overføringer av gener til en gitt celle er basisen for genterapi. Imidlertid er ett av problemene å få innført tilstrekkelig mengde nukleinsyre inn i vertscellen som skal behandles. Genet av interesse må uttrykkes i transfekterte celler. En av de tilnærmelser som er tilpasset i denne forbindelse har vært integreringen av nukleinsyre i virale vektorer og særlig i retrovirus, adenovirus eller adeno-assosierte virus. Disse systemer trekker fordel av cellepenetreringsmekanismer som er utviklet av virusene så vel som deres beskyttelse mot nedbrytning. Imidlertid oppviser denne tilnærmelse problemer. Ett er en risiko for produksjon av infektiøse virale partikler som er ømfintlige overfor disseminering i vertsorganismen og, når det gjelder retrovirale vektorer, en risiko for insertional mutagenese. Videre forblir innføringskapasiteten for et terapeutisk eller vaksinegen i et viralt genom, begrenset.

Til slutt genereres det ofte immunrespons mot virale vektorer, noe som gjør readmini-strering av viruset ineffektivt på grunn av immunklaring, og kan også resultere i inflammasjon.

En annen måte (Wolff et al, "Science", 247,1465-68,1990; Davis et al, "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 93- 7213-18,1996; US 5 580 859 til Felgner et al.) involverer administrering i muskelen eller blodstrømmen av en nukleinsyre av plasmidtypen, eventuelt bundet til forbindelser ment for å lette dets transfeksjon, som proteiner, liposomer, ladede lipider eller kationiske polymerer som polyetylenimin, som er gode in vitro-transfeksjonsmidler (Behr et al., "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 86- 6982-6,1989; Felgner et al., "Proe. Nati. Acad. Sei. USA" 84, 7413-7,1987; Boussif et al., "Proe. Nati. Acad. Sei. USA" 92, 7297-301, 1995; US 5 676 954 og EP 425 475).

Hva angår muskelen, er det efter den opprinnelige publikasjon av Wolff et al., supra, som viser kapasiteten for muskelvevet til å inkorporere DNA som injiseres i fri plasmidform, har tallrike forskere forsøkt å forbedre denne prosess (Manthorpe et al, 1993, "Human Gene Ther.", 4,419-431; Wolff et al., 1991, "BioTechniques", 11,474-485). Visse trender har kommet efter disse tester, særlig:

• anvendelsen av mekaniske oppløsninger for å fremtvinge inngang for DNA i cellene ved å adsorbere DNA på kuler som så slynges mot vevet ("genpistol") (Sanders Williams et al., 1991, "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 88,2726-2730; Fynan et al., 1993, BioTechniques", 11,474-485). Disse prosesser har vist seg effektive i vaksi-neringsstrategier, men berører kun overflatevevsjiktene. Når det gjelder muskelen, ville deres anvendelse nødvendiggjøre en kirurgisk metode for å sikre tilgang til musklene fordi partiklene krysser ikke kutane vev; • injeksjon av DNA, ikke lenger i fri plasmidform, men bundet til molekylet som kan tjene som vehikkel som letter inngangen av kompleksene inn i cellene. De kationiske lipider som benyttes i tallrike andre transfeksjonsprosesser har til nu vist seg å være skuffende når det gjelder anvendelse i musklene for disse som har vært prøvet, har vist seg å inhibere transfeksjon (Schwartz et al., 1996, "Gene Ther.", 405-411). Det samme gjelder kationiske peptider og polymerer (Manthorpe et al., 1993, "Human Gene Ther.", 4,419-431). Det eneste tilfellet av gunstig kombinasjon synes å være polyvinylalkohol- eller polyvinylpyrrolidonblandingen med DNA. Den resulterende økning av disse kombinasjoner representerer kun en faktor på mindre enn 10 i relasjon til den nakne, injiserte DNA (Mumper et al., 1996, "Pharmaceutical Research",

13, 701-709);

• forbehandling av vevet som skal injiseres med oppløsninger ment for å øke DNA-diffusjonen og/eller stabiliteten (Davis et al., 1993, "Hum. Gene Ther.", 4,151-159) eller for å favorisere inngangen av nukleinsyrer, for eksempel innføring av celle-multiplikerings- eller -regenereringsfenomet. Behandlingene har særlig angått bruken av lokale anestetika eller kardiotoksin, vasokonstirktorer, endotoksin eller andre molekyler (Manthorpe et al., 1993, "Human Gene Ther.", 4,419-431; Danko et al., 1994, "Gene Ther.", 1,114-121; Vitadello et al., 1994, "Hum. Gene Ther.", 5,11-18). Disse forbehandlingsprotokoller er vanskelig å hanskes med. Bupivacain må i

særdeleshet benyttes meget nær letale doser for å være effektive. Preinjeksjon av hyperosmotisk sucrose, ment for å øke diffusjonen, øker ikke nivået for transfeksjon i muskelen (Davis et al., 1993).

Annet vev er transfektert in vivo enten ved å benytte kun plasmidisk DNA alene eller ved binding til syntetiske vektorer (se oversikter av Cotten og Wagner (1994), "Current Opinion in Biotechnology", 4, 705; Gao og Huang (1995), "Gene Therapy", 2, 710; Ledley (1995), "Human Gene Therapy", 6,1129). De prinsipale vev som ble studert var leveren, det respiratoriske epitelium, karvegger, sentralnervesystemet og tumorer. I alle disse vev viste de transgene ekspresjonsnivåer seg for lave til å kunne anvendes ved terapeutisk anvendelse (for eksempel i leveren, Chao et al. (1996), "Human Gene Therapy", 7, 901), selv om enkelte oppmuntrende resultater i den senere tid er vist for plasmid-DNA-overføring i den vaskulære vegg (lires et al. (1996), "Human Gene Therapy", 7, 959 og 989). I hjernen er overføringseffektiviteten meget lav på samme måte som i tumorer (Schwartz et al., 1996, "Gene Therapy", 3,405; Lu et al., 1994, "Cancer Gene Therapy", 1,245; Son et al., "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 91,12669).

Elektroporering eller bruken av elektriske felt for å permeabilisere celler benyttes hyppig in vi tro for å fremme DNA-transfeksjon i kulturceller. Dette fenomen avhenger av å oppnå en elektrisk terskelfeltstyrke. Elektropermeabilisering ble observert ved elektriske felt med relativt høy intensitet i størrelsesorden 800 til 1200 Volt/cm for animalske celler. Denne teknikk ble også foreslått in vivo for å øke effektiviteten for antitumorale midler som bleomycin, i faste tumorer hos mennesker (US 5 468 228 i navnet L.M. Mir). Med pulser med meget kort varighet (100 mikrosekunder) er disse elektriske betingelser (800 til 1200 Volt/cm) meget godt tilpasset intracellulær over-føring av små molekyler. Disse betingelser (pulser på 100 mikrosekunder) ble lagt på uten forbedringer for in vivo-nukleinsyreoverføring til leveren, der felt under 1000 Volt/cm viste seg totalt ineffektive eller sogar inhibitoriske sammenlignet med DNA-injeksjon i fravær av elektriske pulser (WO 97/07826 samt Heller et al., "FEBS Letters", 389, 225-8,1996).

Denne teknikk oppviser imidlertid vanskeligheter ved anvendelse in vivo, fordi administreringen av felt med slik intensitet kan provosere mer eller mindre ventede vev-lesjoner, noe som ikke representerer noe problem for behandling av cancerpasienter, men som kan representere en vesentlig mangel for friske individer eller for syke individer når nukleinsyren administreres i andre vev enn de tumorale vev.

NO994820 er en publikasjon som har tidligere prioritet en foreliggende søknad, men er gjort allment tilgjengelig etter prioritetsdagen for foreliggende søknad. I denne publikasjonen er det gjort kjent en metode for å overføre en nukleinsyre til en skjelettmuskel ved at cellene utsettes for et elektrisk felt. Oppfinnelsen som blir beskrevet tar utgangspunkt i en feltstyrke som er lavere enn konvensjonell elektroporering, fra ca. 25 V/cm til 250 V/cm.

I Nishi t. et al., Cancer Research Vol. 56, side 1050-1055,1996 er det omtalt en metode for effektiv in vivo gen overføring ved bruk av intra-arteriell plasmid DNA injeksjon etter in vivo elektroporering.

Selv om de fleste av de ovenfor nevnte studier nevner behovet for høyere elektriske felt i størrelsesorden 1000 Volt/cm for å kunne være effektive in vivo, har foreliggende søkere svært uventet og meget bemerkelsesverdig vist at in vivo-nukleinsyreoverføring til vev økes meget vesentlig uten ugunstige virkninger ved å underkaste disse vev elektriske pulser med lav intensitet (mindre enn 600 Volt/cm), for eksempel 100 til 200 Volt/cm, men med relativt lang varighet. Videre er det funnet at den vide varierbarhet av plasmid-båret transgenekspresjon som observeres i den kjente teknikk ved DNA-overføring til musklene bemerkelsesverdig godt kan reduseres ved anvendelsen ifølge oppfinnelsen.

Således angår foreliggende oppfinnelse anvendelse av en nukleinsyre for fremstilling av et medikament for behandling av kreft ved genterapi, hvor nevnte medikament bringes i kontakt med tumorer, og nevnte tumorer utsettes for en eller flere elektriske pulser med en intensitet på mellom 1 og 600 Volt/cm.

I henhold til en foretrukken utførelsesform finner oppfinnelsen anvendelse på vev hvis celler har spesielle geometrier som for eksempel store celler og/eller langstrakte celler og/eller celler som naturlig gir en respons på virkningen av elektriske spenninger og/eller som har en spesifikk morfologi.

Fortrinnsvis ligger feltstyrken mellom 200 og 600 Volt/cm og den totale varighet over 10 msek. Antallet pulser som benyttes er for eksempel 1 til 100 000 pulser og frekvensen for pulsene mellom 0,1 og 1000 Hz. Fortrinnsvis ligger pulsfrekvensen mellom 0,2 og 100 Hz. Pulsene kan også avgis på irregulær måte og den funksjon som beskriver feltintensiteten som funksjon av tiden kan være variabel. Som et eksempel kan det avgitte elektriske felt resultere i en kombinasjon av minst et felt med en styrke > 400 Volt/cm og fortrinnsvis mellom 500 og 800 Volt/cm, en kort enhetsverdi (< 1 msek), fulgt av en eller flere pulser med lavere intensitet, for eksempel < 400 Volt/cm og fortrinnsvis < 200 Volt/cm, og en lengere varighet (>1 msek). Integralet av funksjonen som beskriver variasjonen av det elektriske felt med tiden er over 1 kV-msek/cm. I henhold til en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen er dette integralet > 5 kV-msek/cm.

I henhold til en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen er feltstyrken for pulsene rundt 500 Volt/cm (det vil si ± 10% og fortrinnsvis ± 5%).

I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen er integralet av funksjonen som beskriver variasjonen av det elektriske felt med tiden er over 1 kV x msek/cm, fortrinnsvis > 5 kV x msek/cm.

De elektriske pulser er valgt blant firkantpulser, elektriske felt som genererer eksponentielle nedbrytningsbølger, oscillerende unipolare bølger av begrenset varighet, oscillerende bipolare bølger av begrenset varighet eller andre bølgeformer. I henhold til en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen er de elektriske pulser firkantbølgepulser.

Administreringen av elektriske pulser kan gjennomføres på en hvilken som helst i og for seg kjent måte, for eksempel: • system med ytre elektroder plassert på begge sider av vevet som skal behandles, særlig ikke-invasive elektroder plassert i kontakt med huden; • system av elektroder implantert i vevene; • elektroder/injektorsystem som gjør det mulig samtidig å administrere nukleinsyrene og det elektriske felt.

Innenfor rammen av oppfinnelsen skal uttrykkene overføring av DNA eller nukleinsyrer ved anvendelse av en eller flere elektriske pulser samt uttrykkene elektrooverføring eller også elektrotransfeksjon, ansees som ekvivalente og de er ment å angi overføring av nukleinsyrer eller DNA ved pålegging eller nærvær av et elektrisk felt.

Da administreringen gjennomføres in vivo, er det nødvendig å kunne ty til intermediære produkter som sikrer den elektriske kontinuitet med de ytre, ikke-invasive elektroder. Det kan for eksempel dreie seg om en elektrolytt i form av en gel.

Nukleinsyrene kan administreres på en hvilket som helst egnet måte, men blir fortrinnsvis injisert in vivo direkte i vevene eller administrert på en annen måte, lokalt eller systemisk, som gjør dem tilgjengelige på applikasjonssetet for det elektriske felt. Nukleinsyrene kan administreres med midler som tillater eller letter overføring som nevnt tidligere. Disse nukleinsyrer kan særlig være frie i oppløsning eller bundet til syntetiske midler eller båret av virale vektorer. De syntetiske midler kan være lipider eller polymerer som er kjent for eksperten eller også målsøkende elementer som mulig-gjør fiksering på membranet av målvevet. Blant disse elementer kan nevnes vektorer som bærer sukkere, peptider, antistoffer, reseptorer og ligander.

Ifølge oppfinnelsen er det tatt sikte på at administreringen av nukleinsyrene kan skje foran, samtidig med eller følge påleggingen av det elektriske felt.

I en utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse er nevnte medikament formulert med henblikk på enhver administrering som tillater tilgang til vev slik som topisk, kutan, oral, vaginal, parenteral, intranasal, intravenøs, intramuskulær, subkutan, intraokulær, transdermal vei eller lignende. Fortrinnsvis inneholder nevnte medikament en bærer som er farmasøytisk akseptabel for en injiserbar formulering, særlig for en injeksjon direkte i det ønskede organ, eller en hvilken som helst annen administrering.

Det kan særlig dreie seg om sterile, isotoniske oppløsninger eller tørkede produkter og særlig lyofiliserte slike som ved tilsetning av sterilisert vann eller fysiologisk serum tillater konstituering av injiserbare oppløste stoffer. Nukleinsyredosene som benyttes for injeksjon samt antallet administreringer og volumet av injeksjonene kan tilpasses som funksjon av de forskjellige parametere og særlig som funksjon av den benyttede admini-streringsmåte, den angjeldende patologi, genet som skal uttrykkes eller også den til-siktede behandlingsvarighet.

Nukleinsyrene kan være av syntetisk eller biosyntetisk opprinnelse eller ekstrahert fra virus eller prokaryotiske celler eller eukaryotiske celler som stammer fra unicellulære organismer (for eksempel gjær) eller pluricellulære. De kan administreres helt eller delvis i forbindelse med preparater av organisk eller syntetisk opprinnelse.

Nukleinsyren kan være en desoksyribonukleinsyre eller en ribonukleinsyre. Det kan dreie seg om sekvenser av naturlig eller kunstig opprinnelse og særlig genomisk DNA, cDNA, mRNA, tRNA og rRNA, hybridsekvenser eller syntetiske eller semisyntetiske sekvenser av eventuelt modifiserte oligonukleotider. Disse nukleinsyrer kan oppnås på en hvilken som helst kjent måte og særlig ved avsøking av banker ved kjemisk syntese eller ved blandede metoder som inkluderer kjemisk eller enzymatisk modifisering av sekvensene som oppnås ved avsøking av bankene. De kan modifiseres kjemisk.

Særlig kan nukleinsyren være en DNA eller en RNA, retning eller antiretning, eller med en katalytisk egenskap som et ribozym. Med "antiretaing" menes en nukleinsyre med en sekvens som er komplementær til en målsekvens, for eksempel en mRNA-sekvens hvis ekspresjon man ønsker å blokkere ved hybridering på målsekvensen. Med "retning" menes en nukleinsyre som har en sekvens som er homolog eller identisk med en målsekvens, for eksempel en sekvens som binder seg til en proteintranskirpsjonsfaktor og som er implikert i ekspresjonen av et gitt gen. I henhold til en foretrukken utførelses-form omfatter nukleinsyren et gen av interesse og elementer som tillater ekspresjon av dette gen. Fortrinnsvis er nukleinsyrefragmentet i form av et plasmid.

Desoksyribonukleinsyrene kan være enkelt- eller dobbeltstrenget og det kan dreie seg om korte oligonukleotider eller om lengere sekvenser. De kan bære terapeutiske gener, sekvenser som er regulerende for transkripsjon eller replikasjon eller bindingsområder til andre cellulære bestanddeler. Innenfor rammen av oppfinnelsen menes med "terapeutiske gen" særlig et hvilket som helst gen som koder for en RNA eller for et proteinprodukt med en terapeutisk effekt. Det kodede proteinprodukt kan være et protein, et peptid, og så videre. Proteinproduktet kan være homologt overfor målcellen (det vil si et produkt som vanligvis uttrykkes i målcellen når denne ikke oppviser noen patologi). I dette tilfellet tillater den transgene ekspresjon for eksempel å bøte på en utilstrekkelig ekspresjon i cellen eller en inaktiv eller svakt aktiv ekspresjon av et protein på grunn av en modifikasjon, eller tillater også å overutrykke proteinet. Det terapeutiske gen kan også kode for en mutant av et cellulært protein med en øket stabilitet, modifisert aktivitet, og så videre. Proteinproduktet kan likeledes være heterologt vis å vis målcellen. I dette tilfellet kan det eksprimerte protein for eksempel komplettere eller tilveiebringe en defektiv aktivitet i cellen for behandling av tumorer. Det kan dreie seg om et selvmordsgen (thymidinkinase av herpes) for behandling av cancer.

Blant de terapeutiske produkter som ligger innenfor rammen av anvendelsen ifølge oppfinnelsen kan mere spesielt nevnes gener som koder for

- enzymer som a-l-antitrypsin, proteinasene (metalloproteinaser, urokinase, uPA, tPA, ....streptokinase), proteaser som spalter forløperne for å sette fri det aktive produkt (ACE, ICE ) eller deres antagonister (TIMP-1, vevplasminogenaktivatoren-inhibitor PAI, TFPI), - blodderivater som faktorene som er implikert i koagulering; faktorene VII, VHI, IX, komplementeringsfaktorer, trombin, - hormoner eller enzymer implikert i synteseveien for hormoner, eller faktorer implikert i kontrollen av syntesen eller ekskresjonen eller sekresjonen av hormoner som insulin, faktorer beslektet med insulin (IGF), eller veksthormon, ACTH, syntese-enzymer for kjønnshormoner, - lymfokiner og cytokiner: interleukiner, kjemokiner (CXC og CC), interferoner, TNF, TGF, kjemotaktiske faktorer eller aktivatorer som MIF, MAF, PAF, MCP-1, eotaxin,

LIF, og så videre (FR 92 03120),

- vekstfaktorer som IGF, EGF, FGF, KGF, NGF, PDGF, PIGF, HGF, proliferin,

- angiogeniske faktorer som CEGF eller FGF, angiopoietin-1 eller -2, endotelin,

- enzymer for syntese av neurotransmittere,

- trofiske faktorer og særlig neurotrofiske slike for behandling av neurodegenerative sykdommer, traumatismer som har skadet nervesystemet eller retinielle degenerenser, for eksempel medlemmer av familien neurotrofiner som NGF, BDNF, NT3, NT4/5, NT6, deres derivater og åpenbare gener, medlemmer av familiene av CNTF som CNTF, aksokin, LIF og derivater derav, IL6 og derivater derav, kardiotrofin og derivater derav, GDNF og derivater derav, medlemmer av familien av IGF som IGF-1, IFGF-2 og derivater derav, - medlemmer av familien FGF, som FGF-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9 og derivater derav, TGF<p>,

- knokkelvekstfaktorer,

- hematopoietiske faktorer som erytopoietin, GM-CSF, M-CSF, LIF, og så videre,

- proteiner for cellulær arkitektur som dystrofin eller et minidystrofin (FR 91 11947), selvmordsgener (thymidinkinase, cytosindeaminase, enzymer for cytokrom P450),

gener av hemoglobin og andre proteintransportører,

- gener som tilsvarer proteiner implikert i metabolismen av lipider, av typen apolipoprotein valgt blant apolipoproteinene A-I, A-H, A-IV, B, C-I, C-IL C-HI, D, E, F, G, H, J og apo(a), metabolismeenzymer som for eksempel lipaser, lipaselipoprotein, hepatisk lipase, kolesterollecitinacyltransferase, 7a-kolesterolhydroksylase, fosfa-tidyl-sur-fosfatase eller også proteiner for overføring av lipider som proteinet for overføring av kolesterolestere og proteinet for overføring av fosfolipider, et bindings-protein til HDL eller også en reseptor, for eksempel valgt blant reseptorer for LDL, chylomikron-remnante reseptorer og oppfangingsreseptorer, og så videre. Man kan i

tillegg tilsette leptin for behandling av fedme.

- faktorer som regulerer blodtrykket, for eksempel enzymer implikert i metabolismen av NO, angiotensin, bradykinin, vasopressing, ACE, renin, enzymer som koder for syntesemekanismer eller forstørring av prostaglandiner, tromboksan eller adenosin, adenosinreseptorer, kallikreiner og kallistatiner, ANP, ANF, diuretiske eller anti-diuretiske faktorer, faktorer implikert i syntese, metabolisme eller forstørring av

mediatorer som histamin, serotonin, katecholaminer, neuropeptider,

- anti-angiogeniske faktorer som liganden av Tie-1 og Tie-2, angiostatin, ATF-faktoren, derivater av plasminogen, endotellin, trombospondiner-1 og -2, PF-4, inter-feron-a eller -p, interleukin-12, TNFa, reseptoren av urokinase, fitl, KDR, PAI1,

PAI2, TIMP1, prolaktinrfagmentet,

- faktorer som beskytter mot apoptose som AKT-familien,

- proteiner i stand til å indusere en celledød, enten aktive i seg selv som kaspaser, eller av typen "pro-drug" som nødvendiggjør en aktivering med andre faktorer, eller proteiner som aktiverer prodrugs til et middel som provoserer en celledød, for eksempel thymidinkinase av herpesvirus, desaminasene som særlig tillater å ta sikte

på en anticancerterapi,

- proteinene implikert i inter-cellulær kontakt og adhesjon: VCAM, PECAM, ELAM,

ICAM, integriner og kateniner,

- proteiner fra den ekstracellulære matriks,

- proteiner implikert i cellemigrering,

- proteiner av typen transduksjon av signal, type FAK, MEKK, p38-kinase, tyrosin-kinaser, serin-treoninkinaser, - proteiner implikert i regulering av cellecyklusen (p21, p 16, cykliner, og så videre) samt mutante proteiner eller dominant negativt slike som blokkerer cellecyklusen og

som eventuelt kan indusere apoptose,

- transkripsjonsfaktorer: jun, fos, API, p53, samt proteinene av signaleringskaskaden av p53, - proteiner med struktur av cellen, som intermediære filamenter (vimentin, desamin, keratiner), dystrofin, proteiner implikert i kontraktiliteten og kontrollen av den muskulære kontraktibilitet og særlig proteiner implikert i kalsiummetabolismen og kalsiumstrømmen i cellene (SERCA, og så videre).

I det tilfellet der proteinene virker via systemer med ligand og reseptorer, er det tatt sikte på å benytte liganden eller reseptoren (for eksempel FGF-R, VEGF-R,...). Man kan likeledes angi gener som koder for fragmenter eller mutanter av proteiner av ligander eller reseptorer, særlig de ovenfor nevnte proteiner, som oppviser enten en aktivitet som er overlegen hele proteinet eller en antagonistaktivitet, sogar også av typen "dominant negativ" i forhold til det opprinnelig protein (for eksempel fragmenter av reseptorer som inhiberer disponibiliteten for sirkulerende proteiner, eventuelt forbundet med sekvenser som induserer en sekresjon av disse fragmenter i forhold til en forankring i det cellulære membran, eller andre systemer for modifikasjon av den intracellulære trafikk av disse ligand-reseptor-systemer for å omgå disponibiliteten for et av disse elementer), eller selv har en egenaktivitet som er distinkt fra den til det totale protein (for eksempel ATF).

I en utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse koder nevnte nukelinsyre for et

antistoff, et variabelt fragment av enkeltkjedet antistoff (ScFv) eller et hvilket som helst annet antistoff-fragment som har evnen til gjenkjenning i et immunoterapeutisk formål, eller koder for en oppløselig reseptor, for et peptid som er agonist eller antagonist for en

reseptor eller et adhesjonsprotein, for et kunstig, kimert eller stumpt protein. Foretrukket koder nukleinsyren for et antiidiotype antistoff, et oppløselig fragment av reseptoren CD4 eller reseptoren TNFa eller reseptoren acetylcholin.

De tallrike eksempler ovenfor og de som følger, illustrerer den potensielle rekkevidde av påleggingen av et felt ifølge oppfinnelsen.

En terapeutiske nukleinsyre kan likeledes være et gen eller et antiretningssekvens hvis ekspresjon i målcellen tillater å kontrollere ekspresjonen av gener eller transkripsjonen av cellulær mRNA. Slike sekvenser kan for eksempel transkriberes i målcellen til RNA komplementær til cellulære RNA og derved blokkere traduksjonen til proteinet, i henhold til den teknikk som er beskrevet i EP 140 308. Terapeutiske gener omfatter likeledes sekvenser som koder for ribozymer og som er i stand til selektivt å destruere mål-RNA(EP321 201).

Som antydet ovenfor kan nukleinsyren likeledes omfatte ett eller flere gener som koder for et antigenisk peptid, i stand til hos mennesker eller dyr å generere en immunrespons. Ved denne spesielle utførelsesform tillater således oppfinnelsen å realisere enten vaksiner eller immunoterapeutiske behandlinger anvendt på mennesker eller dyr, særlig mot cancere. Det kan særlig dreie seg om spesifikke antigener mot tumorer som MAGE-proteinene (EP 259 212), for eksempelproteinene MAGE 1, MAGE 2, eller antigener som kan stimulere en antitumoral respons som de bakterielle varmesjokkproteiner.

Fortrinnsvis omfatter nukleinsyren likeledes sekvenser som tillater og/eller favoriserer ekspresjon i vevet av det terapeutiske gen og/eller genet som koder det antigeniske

peptid. Det kan dreie seg om sekvenser som naturlig er ansvarlig for ekspresjonen av det angjeldende gen, når sekvensen er i stand til å funksjonere i den transfekterte celle. Det kan likeledes dreie seg om sekvenser av annen opprinnelse (ansvarlige for ekspresjonen av andre proteiner, eller også syntetiske). Særlig kan det dreie seg om promotersekvenser av eukaryotiske eller virale gener. For eksempel kan det dreie seg om promotersekvenser fra genomet av den celle man ønsker å transfektere. Blant de eukaryotiske promotere kan man benytte enhver promoter eller avledet sekvens som stimulerer eller reprimerer transkripsjonen av et gen på eventuelt spesifikk, sterk eller svak måte. Det kan særlig dreie seg om utbikitære promotere (HPRT, vimentin, a-aktin, tubulin og så videre), promotere for terapeutiske gener (type MDR, CFTR, og så videre), vevspesifikke promotere (promotere av typen gener for desamin, myosiner, kreatinkinase, fosfoglyceratkinase) eller også promotere som reponderer på en stimulus,

for eksempel promotere som reponderer på naturlige hormoner (reseptor for steroide hormoner, retinonsyrereseptor, og så videre) eller en promoter som reguleres av anti-biotika (tetracyklin, rapamycin, og så videre), promotere som reponderer på et nærings-regime som promotere som reponderer på fibrater, eller andre promotere som reponderer som andre molekyler av naturlig eller syntetisk opprinnelse. På samme måte kan det dreie seg om promotersekvenser som stammer fra genomet av en virus. I denne forbindelse kan man for eksempel nevne promotere av genene EIA av adenovirusen, MLP, eller promotere som stammer fra genomene av virusene CMV, RSV, SV40, og så videre. Det kan dreie seg om induktible eller repressible promotere. Videre kan ekspresjonssekvensene være modifisert ved addisjoner av sekvenser for aktivering eller regulering som tilsvarer en kondisjonell eller transitorisk ekspresjon, en vevspesifikk eller majoritær ekspresjon, osv.

Videre kan nukleinsyrene likeledes, særlig oppstrøms det terapeutiske gen, omfatte en signalsekvens som styrer det terapeutiske, syntetiserte produkt inn i målcellens sekre-sjonsveier. Denne signalsekvens kan være den naturlige signalsekvens for det terapeutiske produkt, men det kan likeledes dreie seg om en hvilken som helst annen funk-sjonell signalsekvens eller en kunstig signalsekvens. Nukleinsyren kan likeledes omfatte en signalsekvens som styrer det syntetiserte, terapeutiske produkt mot et spesielt rom i cellen, for eksempel peroksisomene, lysosomene og mitokondriene.

Andre gener av interesse er særlig beskrevet av McKusick V. A. Medelian i "Inheritance in man, catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive and X-linked pheno-types", 8. utgave, Johns Hopkins University Press (1988), og av J.B. Stanbury et al. i "The metabolic basis of inherited disease", 5. utgave, McGraw-Hill (1983). Genene av interesse dekker proteiner som er implikert i metabolismen av aminosyrer, lipider og andre cellebestanddeler.

Eksempler på gener assosiert med sykdommer knyttet til metabolismen av karbohydrater er, fruktose-l-fosfataldolase, fruktose-l,6-difosfatase, glucose-6-fosfatase, lysosomal a-l,4-glucosidase, amylo-l,6-glucosidase, amylo-(l,4:1,6)-tranglucosidase, muskulær fosforylase, muskulær fosfofruktokinase, fosforylase-b-kinase, galactose-l-fosfat-uridyltransferase, alle enzymene av deshydrogenasepyruvatkomplekset, pyruvatkarboksylase, 2-oksoglutarat-glyoksylasekarboksylase, D-glyceratdehydrogenase.

Man kan likeledes nevne:

- genene forbundet med sykdommer ved metabolismen av aminosyrer som for eksempel fenylalaninhydroksylase, dihydrobiopterinsyntetase, tyrosinaminotransferase, tysosinase, histidinase, fumarylaceto-acetase, glutationsyntease, y-glutamylcysteinsyntease, ornitin-5-aminotransferase, karbamoylfosfatsyntetase, ornitinkarbamoyltransferase, arginino-succinatsyntease, arginosuccinatlyase, arginase, L-lysin-dehydrogenase, L-lysin-keto-glutaratreduktase, valin-transaminase, leucin-isoleucin-transaminase, dekarboksylase av 2-ketosyrer med forgrenet kjede, isovaleryl-CoA-dehydrogenase, acyl-CoA-dehydrogenase, 3-hydroksy-3-metylglutaryl-CoA-lyase, acetoacetyl-CoA3-ketotiolase, propionyl-CoA-karboksylase, metylmalonyl-CoA-mutase, ATP : cobalamin-adenosyl-transferase, dihydrofolat-reduktase, metylentetrahydrofolat-reduktase, cystationin-P-syntetase, komplekset sarkosin-deshydrogenase, proteinene tilhørende spaltingssystemet for glycin, p-alanin-transaminase, serum-karnosinase og cerebral homokamosinase. - Gener forbundet med sykdommer i metabolismen av fett og fettsyrer som lipoprotein-lipase, apolipoprotein C-II, apolipoprotein E, andre apolipoproteiner, lecitinkolesterol-acetyltransferase, reseptoren for LDL, sterolhydroksylase av leveren, "sur fytanisk" a-hydroksylase. - Genene forbundet med lysosomale defekter som for eksempel lysosomal a-L-iduroni-dase, lysosomal iduronatsulfatase, lysosomal heparan-N-sulfatase, lysosomal N-acetyl-a-D-glucosaminidase, acetyl-CoA : lysosomal a-glucosamin-N-acetyltransferase, lysosomal N-acetyl-a-D-glucosamin-6-sulfatase, lysosomal galactosamin-6-sulfat-sulfatase, lysosomal p-galactosidase, lysosomal arylsulfatase B, lysosomal P-glucuro-nidase, N-acetylglucosaminylfosforotransferase, lysosomal a-D-mannosidase, lysosomal a-neuraminidase, lysosomal aspartylglucosaminidase, lysosomal a-L-fukosidase, lysosomal sur-lipase, lysosomal sur-ceramidase, lysosomal sfingomyelinase, lysosomal glucocerebrosidase og lysosomal-galactocerebrosidase, lysosomal galactosylceramidase, lysosomal arylsulfatase A, a-galactosidase A, lysosomal sur-P-galactosidase, kjede a av lysosomal heksosaminidase A. - Gener assosiert med sykdommer i metabolismen av steroider og lipider, gener assosiert med metabolismus sykdommer av puriner og pyrimidiner, gener assosiert med sykdommer ved metabolismen av porfyrin og heme, gener assosiert med sykdommer ved metabolismen av bindevev, knokler samt gener forbundet med sykdommer i blodet og de hematopoietiske organer, muskler (myopati), nervesystemet (neurodegenerative sykdommer) eller sirkulasjonsapparatet (behandling av for eksempel ischemier og stenose) samt gener implikert i mitokondriale, genetiske sykdommer.

Ved anvendelsen ifølge oppfinnelsen kan nukleinsyren assosieres med en hvilken som helst type vektorer eller en hvilken som helst kombinasjon av slike vektorer som tillater å forbedre overføringen av gener, som eksempler og på ikke-begrensende måte, skal nevnes vektorer som virus, syntetiske eller biosyntetiske midler (for eksempel lipidiske, polypeptidiske, glucosidiske eller polymeriske), eller også eventuelt utslyngede kuler. Nukleinsyrene kan også injiseres i et vev som underkastes en behandling som tar sikte på å forbedre overføringen av gener, for eksempel en behandling av farmakologisk art ved lokal eller systemisk applikasjon eller en enzymatisk, permeabiliserende (ved bruk av et overflateaktivt middel), kirurgisk, mekanisk, termisk eller fysisk behandling.

Fordelene ved anvendelsen av elektrooverføring ved genterapi ligger i sikkerheten forbundet med den lokale behandling knyttet til anvendelsen av lokale og målrettede elektriske felt.

Kombinasjonen av lite intense felt og lange administreirngstider anvendt på vev in vivo, forbedrer transfeksjonen av nukleinsyrene uten å føre til merkbar forringelse av vevene. Disse resultater forbedrer utbyttet av overføringen av DNA innenfor rammen av gen-terapien som anvender nukleinsyrer.

Som en konsekvens tillater anvendelsen ifølge oppfinnelsen, for første gang, å ta sikte på ved genterapi å fremstille et middel i fysiologiske og/eller terapeutiske doser enten i vev eller skilt ut i deres nærhet eller i blod- eller lymfekretsløpet. Videre tillater anvednelsen ifølge oppfinnelsen for første gang, en fin modulering og kontroll av den effektive mengde av transgenet som uttrykkes via muligheten for å modulere vev-volumet som transfekteres, for eksempel med flere administreirngsseter, eller også muligheten for å modulere antallet, formen, overflaten og plasseringen av elektrodene. Et ytterligere kontrollelement ligger i muligheten av å modulere effektiviteten av over-føringen ved å variere feltintensiteten, antallet, varigheten og frekvensen for pulsene og åpenbart, alt efter kjent teknikk, mengde og volum for administreringen av disse nukleinsyrer. Man kan således oppnå et tilsiktet transfeksjonsnivå ved produksjon eller ønsket sekresjon. Anvendelsen tillater til slutt en øket sikkerhet i forhold til kjemiske eller virale metoder for overføring av gener in vivo der berøring av andre organer enn målorganet ikke helt kan utelukkes og styres. Således tillater anvendelsen ifølge oppfinnelsen kontroll av lokaliseringen av det transfekterte vev (strengt bundet til vewolumet som underkastes lokale elektriske pulser) og gir således muligheten til å vende tilbake til initialsituasjonen ved total eller partiell ablasjon av vevet når dette gjøres mulig ved den ikke-vitale karakter av dette vev og ved dets kapasitet for regenerering som når det gjelder lever eller muskel. Denne store brukselastisitet tillater å optimalisere prosessen i henhold til dyreart (human- og veterinæranvendelser), det behandlede individs alder, fysiologisk og patologisk tilstand.

Anvendelsen ifølge oppfinnelsen tillater videre, for første gang, å transfektere store nukleinsyrer i motsetning til de virale metoder som er begrenset ved kapsidets størrelse. Denne mulighet er essensiell for overføring av meget store gener som det til dystrofien eller gener med introner og/eller store regulatorelementer, noe som er nødvendig for eksempel ved regulert fysiologisk produksjon av hormoner. Denne mulighet er vesentlig for overføring av episomer eller kunstige kromosomer av gjær eller minikromosomer.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere under henvisning til de følgende, illustrerende eksempler og under henvisning til de vedlagte figurer, der: Figur 1 viser effektene av elektriske impulser med høy feltintensitet på transfeksjonen av plasmidisk DNA pXL2774 i den kraniale tibialmuskel hos mus;

middelverdier ± SEM;

figur 2 viser effektene av elektriske impulser med midlere feltintensitet på transfeksjonen av plasmidisk DNA pXL2774 i den kraniale tibialmuskel hos mus;

middelverdier ± SEM;

figur 3 viser effektene av elektriske impulser med lav feltintensitet og forskjellige varigheter på transfeksjonen av plasmidisk DNA pXL2774 i den kraniale tibialmuskelen hos mus; middelverdier ± SEM;

figur 4 viser effektene av elektriske impulser av lav feltintensitet og forskjellige varigheter på transfeksjonen av plasmidisk DNA pXL2774 i den kraniale tibialmuskelen hos mus; middelverdier ± SEM;

figur 5 viser effektiviteten av elektrotransfeksjonen av plasmidisk DNA pXL2774 i den kraniale tibialmuskel i mus ved lave elektriske feltintensiteter;

middelverdi ± SEM; og

figur 6 viser plasmidkartet for pXL3031 og pXL3010.

Eksempel 1: Forsøk gjennomført under betingelser kjent fra teknikken, der det

elektriske felt viser seg inhiberende for transfeksjonen.

Standard elektroporeringsbetingelser slik de benyttes i den kjente teknikk og er diskutert ovenfor, er testet og har vist seg å være ineffektive eller sogar å representere en inhiberende virkning på overføringen av nukleinsyrer (plasmidisk DNA) i den strierte muskel.

Materiell og metoder - Generelle arbeidsbetingelser

I dette eksempel ble følgende produkter benyttet:

DNA pXL2774 (PCT/FR 96/01414) er et plasmidisk DNA som omfatter rapportørgenet av luciferase. De andre produkter er tilgjengelige fra kommersielle leverandører: ketamin, xylasin, fysiologisk serum (NaCl 0,9%).

Det benyttes kommersielt tilgjengelige oscilloskop og elektriske pulsgeneratorer (rek-tangulære eller kvadratiske) (Electro-pulsateur PS 15, Jouan, Frankrike). De benyttede elektroder er plateelektroder av rustfritt stål i en avstand på 5,3 mm.

Forsøkene gjennomføres på C57Bl/6-mus. Musene stammer fra forskjellige bur og fordeles tilfeldig før forsøkene ("randomisering").

Musene anestetiseres med ketamur.xylazin. Plasmidoppløsningen (30 ul av 500 ug/ml 0,9% NaCl) injiseres longitudinalt gjennom huden i kranialtibialmuskelen i venstre og høyre pote ved hjelp av en Hammilton-sprøyte. De to elektroder legges i en ledende gel og den injiserte pote plasseres mellom elektrodene i kontakt med disse.

De elektriske pulser legges på loddrett på muskelaksen ved hjelp av en generator for kvadratpulser, 1 minutt efter injeksjon. Et oscilloskop tillater å kontrollere intensiteten i Volt (de antydede verdier i eksemplene er maksimale verdier), varigheten i msek og frekvensen Hz for de avgitte pulser, idet frekvensen er 1 Hz for 8 konsekutive pulser.

For å evaluere transfeksjonen til musklene blir musene avlivet 7 dager efter administrering av plasmidet. De kraniale tibialmusklene fra venstre og høyre poter taes ut, veies, bringes i lyseringsbuffer og males opp. Den oppnådde suspensjon sentrifugeres for å oppnå en klar supernatant. Måling av luciferaseaktiviteten realiseres på 10 ul supernatant ved hjelp av et kommersielt luminometer, der substratet automatisk settes til oppløsningen. Intensiteten for den luminøse reaksjon er gitt i relative lysenheter (Relative Luminescence Units = RLU) for en muskel idet man kjenner det totale suspensjonsvolum. Hver forsøksbetingelse testes på 10 punkter: 5 dyr injisert bilateralt. Statistiske sammenligninger er gjennomført ved hjelp av ikke-parametriske tester.

Resultat og diskusjon

To figurer i lineær eller logaritmiske skala viser resultatene.

I dette første forsøk har man testet virkningen av et elektrisk felt på 800 til 1200 Volt/cm, som tillater elektroporering av tumorer (Mir et al., "Eur. J. Cancer", 27, 68, 1991).

Man fastslår i henhold til figur 1 at, relativt en kontrollgruppe der DNA injiseres uten elektrisk puls: • med 8 pulser på 1200 Volt/cm og en varighet på 0,1 msek. er den midlere verdi for luciferaseaktiviteten langt lavere, • med 8 pulser på 1200 Volt/cm og et 0,1 msek, døde 3 dyr og den midlere verdi for luciferaseaktiviteten er langt lavere, • med pulser på 800 Volt/cm og 1 msek, er den midlere verdi for luciferaseaktiviteten også signifikant redusert.

Flesteparten av musklene som var underkastet innvirkning av et elektrisk felt var synlig aldret (sprø og hvitaktig utseende).

Eksempel 2: Forsøk med elektrooverføring av nukleinsyrer med moderate

elektrisk felt.

Dette forsøk gjennomføres med C57Bl/6-mus. Bortsett fra det elektriske felt for pulsene og deres varighet, er betingelsene de samme som i eksempel 1.

Resultatene er vist i figur 2. Man reproduserer resultatene fra eksempel 1, det vil si inhi-bitoreffekten for en serie på 8 pulser ved 800 Volt/cm med en varighet på 1 msek på den luciferaseaktiviteten som detekteres i muskelen. Med et felt på 600 Volt/cm observeres den samme inhibering og den samme endring av muskelvevet. I motsetning til dette og meget overraskende og bemerkelsesverdig, tillater en reduksjon av spenningen ikke lenger synlig å endre musklene og i tillegg er, ved 400 og 200 Volt/cm, nivået for transfeksjon i musklene i gjennomsnittet overlegen det som oppnås på muskler som ikke er underkastet noe felt. Det skal påpekes at i forhold til en sammenligningsgruppe (ikke underkastet elektrisk felt) blir dispersjonen av verdiene for luciferaseaktivitet redusert ved 200 Volt/cm (SEM = 20,59% av den midlere verdi mot 43,32% ved fravær av elektrisk felt (figur 2A)).

Eksempel 3: Forsøk med elektrooverføring av nukleinsyrer med pulser med lav feltstyrke som oppviser en sterk stimulering av ekspresjonen av

transgenet.

Dette forsøk gjennomføres med C57Bl/6-mus. Bortsett fra den elektriske feltstyrke for pulsene samt deres varighet og det faktum at pulsene avgis 25 sekunder efter injeksjon av DNA, er utførelsesbetingelsene som i de foregående eksempler.

Resultatene er vist i figur 3. Gjennomsnittsverdien for ekspresjonen av transgene luciferase er vesentlig øket med en impulsvarighet på 20 msek ved 100 Volt/cm og fra en pulsvarighet på 5 msek ved 200 Volt/cm.

Dette forsøk viser også klart at den midlere verdi for luciferaseaktiviteten som oppnås ved elektrotransfeksjon av DNA i muskelen er en funksjon av varigheten av de elektriske pulser, når man benytter spenninger på 200 og 100 Volt/cm. Det skal videre påpekes at dispersjonen av verdiene særlig reduseres for grupper av elektrotransfekterte muskler (figur 3A). I fravær av elektriske pulser (kontroll) utgjør SEM 77,43% av den midlere verdi, mens den relative SEM for gjennomsnittet reduseres med 14% (200 Volt/cm, 5 msek), 41,27% (200 Volt/cm, 20 msek) og mellom 30 og 48% for elektro-overføring ved 100 Volt/cm for det elektriske feltet.

Under de beste betingelser ved dette forsøk forbedre ekspresjonen av transgenet med en faktor med 89,7 i forhold til kontrollen som er injisert i fravær av elektriske pulser.

Eksempel 4: Forsøk med elektrooverføring av nukleinsyrer i muskelen ved 200

Volt/cm som viser en økning av ekspresjonen av transgenet med en

faktor over 200.

Dette forsøk gjennomføres i DBA2-mus med elektriske pulser med en feltintensitet på 200 Volt/cm og variabel varighet idet de andre betingelser ved dette forsøk er som vist i eksempel 3.

Dette eksempel bekrefter at ved 200 Volt/cm økes transfeksjonen av luciferaseaktivitet fra en impulsvarighet på 5 msek og så fortsetter å vokse for lengere varigheter (figurene 4 og 5). Også her observeres med elektrotransfeksjonen en reduksjon av den inter-individuelle variabilitet som antydes ved SEM i forhold til den ikke-elektrotransfekterte kontroll (den relative verdi av SEM er lik 35% for kontrollen og respektivt 25,22, 16, 18,16 og 26% for serien av impulser på respektivt 1, 5,10,15, 20 og 24 msek).

Ved de beste betingelser ved dette forsøk forbedres ekspresjonen av transgenet med en faktor 205 i forhold til kontrollen som er injisert i fravær av elektriske pulser.

Eksempel 5: Effektivitet ved elektrooverføring av nukleinsyrer som funksjon av

produktet "antall impulser x feltintensitet x varighet av hver puls".

Figur 5 eksemplifiserer betydningen av parameteren tilsvarende produktet "antall impulser x feltintensitet x varighet av hver puls". Denne parameter tilsvarer i realiteten integralet som funksjon av tiden av den funksjon som beskriver variasjonen av det elektriske felt.

Presentasjonen i figur 5 av resultatene som er oppnådd under forsøkene 2, 3 og 4 med

elektriske feltintensiteter på 200 eller 100 Volt/cm eller i fravær av elektrisk felt, viser at effektiviteten ved transfeksjonen øker som funksjon av produktet av den totale varighet av eksponeringen til det elektriske felt og feltets intensitet. En stimuleringseffekt oppnås for en verdi over 1 kV x msek/cm for produktet "elektrisk felt x total varighet av pulsene". I henhold til en foretrukken fremgangsmåte oppnås en stimulering for en verdi

> 5 kV x msek/cm for produktet "elektrisk felt x total varighet av pulsene".

I de følgende eksempler blir elektrooverføring av nukleinsyrer ved hjelp av oppfinnel-sens fremgangsmåte testet på forskjellige tumorer av enten human opprinnelse implantert i nakne mus (immunodefektive) eller av murin opprinnelse implantert på C57B1/6-mus (immunokompetente).

Eksempel 6: Forsøk med elektrooverføring av nukleinsyrer i humane pulmonære

tumorer H1299.

Forsøket gjennomføres på nakne hunnmus på 18 til 20 g. Musene implanteres monolateralt med podinger av tumorene Hl299 på 20 mm<3>. Tumorene utvikles til de når et volum på 200 til 300 mm<3>. Musene fordeles som funksjon av tumorstørrelse og fordeles i homogene grupper. Musene anestetiseres med en blanding av ketamin og xylazin. Oppløsningen av plasmidet (40 ul av en oppløsning av 250 ug/ml DNA i NaCl 20 mM, 5% glucose) injiseres longitudinalt i sentrum av tumoren ved hjelp av en Hammilton-sprøyte. De laterale flater av tumoren blir omgitt av ledende gel og tumoren plasseres mellom to elektroder. Elektrodene er plateelektroder av rustfritt stål med avstandene 0,45 til 0,7 cm. Et kommersielt oscilloskop og en kommersiell elektrisk impulsgenerator (rektangulær eller kvadratisk) (Electro-pulsateur PS 15, Jouan, Frankrike) benyttes.

I dette eksempel er det benyttede plasmid pXL3031 (figur 6) som bærer genet som koder for luciferase (cytoplasmisk). Plasmid pXL3031 er en vektor som er avledet fra vektor pXL2774 (WO 97/10343) der luc+-genet som koder for modifisert luciferase av Photinus pyralis (cytoplasmisk) stammer fra pGL3bascis (Genbank; CVU47295) inn-føres under kontroll av promoteren som stammer fra det tidlige området av den humane cytomegalovirus (hCMV IE, Genbank HS51EE) og polyadenyleringssignalet av det sene området av virus SV40 (Genbank SV4CG).

De elektriske pulser legges på ved hjelp av en kvadratpulsgenerator, 20 til 30 sekunder efter injeksjon. Et oscilloskop tillater å kontrollere styrken i Volt, varigheten i milli-sekunder og frekvensen i hertz for pulsene som avgis til enten 200 eller Volt/cm ved 20 msek og 1 Hz.

For bedømmelse av den tumorale transfeksjon blir musene (10 mus pr. betingelse) eutanisert 2 dager efter injeksjon av plasmidet. Tumorene fjernes, veies og males opp i en lyseringsbuffer. Den oppnådde suspensjon sentrifugeres for å oppnå en klar supernatant. Luciferaseaktiviteten måles i 10 ul supernatant ved hjelp av et kommersielt luminometer der substratet automatisk mates til. Resultatene uttrykkes i totale RLU pr. tumor.

I dette forsøk gjennomføres det to serie forsøk for å bestemme virkningen av intensiteten av det elektriske felt på effektiviteten av transfeksjonen i humane, pulmonære tumorer Hl299.1 en første serie forsøk testes intensiteten for det elektriske felt ved 200 til 500 Volt/cm. I en andre serie forsøk varieres de elektriske feltintensiteter fra 400 til 800 Volt/cm og testes.

Virkning av elektriske pulser ved forskjellige feltintensiteter på transfeksjonen av plasmidisk DNA pXL3031 på humane tumorer H1299 (pulmonære karsinomer uten små celler); midlere verdier ± SEM for luciferaseaktiviteten i RLU pr. tumor. Betingelser: Elektrisk feltintensitet Volt/cm som angitt i tabellen, 8 pulser på 20 msek, frekvens 1 Hz.

Man fastslår i henhold til tabell 1 at relativt kontrollgruppen der DNA injiseres uten elektriske pulser øker overføringen av genet på en feltstyrke-avhengig måte fra 200 til 400 Volt/cm for å nå et platå som tilsvarer maksimaltransfeksjon, oppnådd ved 500 Volt/cm. Ved høyere spenninger (600 og 800 Volt/cm) observeres kutane eller dypere forbrenninger uten imidlertid å redusere ekspresjonen av transgenet.

Forsterkningen av overføringen av genet som oppnås ved elektrooverføring i de pulmonære tumorer Hl299 er i størrelsesorden faktor 240 til 320.

Eksempel 7: Forsøk med elektrooverføring av nukleinsyrer i humane colon-tumorer HT29.

Forsøkene gjennomføres i nakne hunnmus med kroppsvekt 18 til 20 g. Musene implanteres monolateralt med podinger av tumorer HT29 på 20 mm<3>. Tumorene far utvikle seg til de har nådd et volum på 100 til 200 mm<3>. Musene sorteres som funksjon av tumor-størrelse og fordeles i homogene grupper. Bortsett fra avstanden for de benyttede elektroder (0,45 cm) er de benyttede betingelser de samme som i eksempel 6. Resultatene fra de to uavhengige forsøksserier er oppsummert i tabell 2.

Virkning av elektriske pulser ved forskjellige feltintensiteter på transfeksjonen av plasmidisk DNA pXL3031 på humane tumorer HT29 (colonadenokarsinomer); midlere verdier ± SEM for luciferaseaktiviteten i RLU pr. tumor. Betingelser: Elektrisk feltintensitet Volt/cm som angitt i tabellen, 8 pulser på 20 msek, frekvens 1 Hz.

Sammenlignet med kontrollgruppen uten elektrooverføring tillater anvendelsen av et elektrisk felt med en styrke på 600 Volt/cm å nå en optimal transfeksjonsgrad uansett basisnivået for transfeksjon uten elektrooverføring. Transfeksjonsforbedringen er en faktor respektivt 6 til 23 større og er relativt lik ved 400 og 600 Volt/cm.

Eksempel 8: Forsøk med elektrooverføring av nukleinsyrer i murine fibrosarkomer.

Forsøket gjennomføres på C57Bl/6-mus med kroppsvekt 18 til 20 g. Musene implan-eres monolateralt med 1 x 10<6> celler LPB i 100 ul MEM-medium uten serum. Tumorene får utvikle seg for å nå et volum på 100 til 200 mm<3>. Musene sorteres som funksjon av tumorstørrelsen og fordeles i homogene grupper. Gjennomføringsbetingelsene for for-søket er som eksempel 6.

Resultatene av de to forsøksserier er vist i tabell 3.

Virkning av elektriske pulser ved forskjellige feltintensiteter på transfeksjonen av plasmidisk DNA pXL3031 på murine fibrosarkomer; midlere verdier ± SEM for luciferaseaktiviteten i RLU pr. tumor. Betingelser: Elektrisk feltintensitet Volt/cm som angitt i

tabellen, 8 pulser på 20 msek, frekvens 1 Hz.

Sammenlignet med kontrollgruppene uten elektrooverføring tillater anvendelse av et elektrisk felt med en styrke på 300 til 600 Volt/cm å forbedre genoverføringen med en faktor respektivt 30 til 70, uansett pålagt spenning.

Eksempel 9: Forsøk med elektrooverføring av nukleinsyrer i murine melanomer

Bl 6.

Forsøket gjennomføres i C57Bl/6-mus med kroppsvekt 18 til 20 g. Musene implanteres monolateralt med podinger av tumor B16 på 20 mm<3>. Tumorene får utvikle seg til de når et volum på 200 til 300 mm<3>. Musene sorteres som funksjon av tumorstørrelse og fordeles i homogene grupper.

Gjennomføringsbetingelsene for forsøket er som i eksempel 6.

Resultatene er oppsummert i tabell 4.

Virkning av elektriske pulser ved forskjellige feltintensiteter på transfeksjonen av plasmidisk DNA pXL3031 på murine melanomer Bl6; midlere verdier ± SEM for luciferaseaktiviteten i RLU pr. tumor. Betingelser: Elektrisk feltintensitet Volt/cm som angitt i tabellen, 8 pulser på 20 msek, frekvens 1 Hz.

Sammenlignet med kontrollgruppen uten elektrooverføring tillater anvendelsen av en elektrisk feltstyrke på 500 Volt/cm å forbedre overføringen av genet med en faktor 24.

Eksempel 10: Forsøk med elektrooverføring av nukleinsyrer i murine tumorer

3LL.

Forsøket gjennomføres på C57Bl/6-mus med kroppsvekt 18 til 20 g. Musene implanteres monolateral med podinger av 3LL-tumorer på 20 mm<3>.

Størrelsen av de transfekterte tumorer som oppnås 5 dager efter implantering er 30 mm<3>. Gjennomføringsbetingelsene for forsøket er som i eksempel 6. Resultatene er oppsummert i tabell 5.

Virkning av elektriske pulser ved forskjellige feltintensiteter på transfeksjonen av plasmidisk DNA pXL3031 på murine pulmonære karsinomer 3LL; midlere verdier ± SEM for luciferaseaktiviteten i RLU pr. tumor. Betingelser: Elektrisk feltintensitet Volt/cm som angitt i tabellen, 8 pulser på 20 msek, frekvens 1 Hz.

Anvendelsen av et elektrisk felt med en styrke på 500 Volt/cm tillater å øke ekspresjonen av transgenet med en faktor 3885.

Disse bemerkelsesverdige resultater må settes i relasjon til det faktum at disse tumorer er lite transfekterbare med DNA, når DNA ganske enkelt injiseres uten elektroover-føring.

Eksempel 11: Forsøk med elektrooverføring av nukleinsyrer i humane, pulmonære tumorer H1299, effekt på sekresjonen i plasma av sekret human alkalisk

fosfatase.

I dette eksempel er DNA pXL3010 (figur 6) et plasmidisk DNA som bærer genet som koder for placentært sekretert human alkalisk fosfatase.

Plasmidet pXL3010 er en vektor som er avledet fra ColEl hvori genet som koder for sekretert alkalisk fosfatase stammer fra pSEAP-basic (Clontech, Genbank: CVU09660) er innført under kontroll av promoteren CMV fra plasmidet pCDNA3 (Invitrogen, Nederland) og polyadenyleringssignalet av den sene region av virus S V40 (Genbank SV4CG).

Forsøket gjennomføres på nakne mus med vekt 18 til 20 g. Musene implanteres monolateralt med podinger av tumorer Hl299 på 20 mm<3>. Tumorene utvikles til de når et volum på 200 til 300 mm<3>. Musene oppdeles som funksjon av tumorstørrelse og fordeles i homogene lotter.

Tumorene transfekteres under realiseringsbetingelsene ifølge eksempel 6, imidlertid med en enkelt spenningsbetingelse på 500 Volt/cm, 20 msek og 1 Hz.

Doseringen av alkalisk fosfatase realiseres i plasma ved hjelp av en Phospha-light-kit (Tropix) på dag Dl, D2 og D8 efter transfeksjon med eller uten elektrooverføring. Resultatene er oppsummert i tabell 6.

Virkning av elektriske pulser med forskjellige feltstyrker på sekresjonen av et eksogent protein: human alkalisk fosfatase sekretert efter transfeksjon av plasmidisk DNA pXL3010 i humane tumorer H1299; middelverdier ± SEM for alkalisk fosfatase (ng/ml). Betingelser: elektrisk feltstyrke Volt/cm som angitt i tabellen, 8 pulser på 20 msek, frekvens 1 Hz.

Helheten av resultater som vist i tabellene 6 til 11 viser at elektrooverføring av nukleinsyrer under betingelsene ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tillater på bemerkelsesverdig måte å øke nivået for ekspresjon av transgenet i forskjellige typer tumorer. Når det gjelder et transgen som koder for et sekretert protein, tillater den intratumorale administrering av plasmidet ved elektrooverføring signifikant å øke den plasmatiske konsentrasjon av det utskilte protein.

Eksempel 12: Virkning av økningen av varigheten av de elektriske pulser.

Dette eksempel viser at man kan øke enhetsvarigheten for pulsene godt utover de verdier som er testet i eksempel 4.

Dette forsøk gjennomføres med C57Bl/6-mus. Det benyttede plasmid er plasmid pXL2774, den administrerte mengde DNA er 15 ug. Den benyttede elektropulsator for å levere de elektriske pulser med en varighet over 20 msek er en kommersiell apparatur (Genetronics, modell T 820, USA, San Diego, CA). De elektriske pulser varierer i antall og varighet, men har en konstant feltstyrke på 200 Volt/cm; de andre betingelser ved dette forsøk er som beskrevet i eksempel 1. Resultatene er oppsummert i tabell 7. Midlere verdier ± SEM for luciferaseaktiviteten i millioner RLU pr. muskel. N = 10 for hver gruppe. Elektrooverføringsbetingelser: Feltintensitet 200 Volt/cm, 8 eller 4 pulser (variabel varighetsenhet), frekvens 1 Hz.

Man fastslår en økning av ekspresjonen av transgenet med forlengelsen av enhetsvarigheten for pulsene (minst opptil 40 msek for en serie på 8 pulser og minst opptil 50 msek for en serie på 4 pulser med en styrke på 200 Volt/cm). Dette eksempel viser at optimum for varigheten av pulsene avhenger av antallet pulser som benyttes og at enhetsvarigheten for pulsene kan gå helt opptil 80 msek, idet denne varighetsverdi ikke er begrensende.

Eksempel 13: Effektivitet ved elektrooverføring som funksjon av antallet elektriske

pulser.

Dette eksempel påviser effekten ved å øke antallet elektriske pulser på effektiviteten ved overføring av nukleinsyrer.

Dette forsøk gjennomføres med C57Bl/6-mus. Det benyttede plasmid er plasmid pXL2774 og den administrerte DNA-mengde er 15 fig. De elektriske pulser varieres i antall. Varigheten av hver puls er 20 msek. Feltstyrken er 200 Volt/cm. De andre betingelser i dette forsøk er som beskrevet i eksempel 1. Resultatene er vist i tabell 8. Midlere verdier ± SEM av luciferaseaktiviteten i millioner RLU pr. muskel. N = 10 pr. gruppe. Betingelser: Feltstyrke 200 Volt/cm, variabelt antall pulser på 20 msek, frekvens 1 Hz.

Man observerer at ekspresjonen av luciferase øker meget betydelig efter pålegging av en enkelt puls og at den fortsetter å øke som funksjon av antallet pulser. Det synes som om variasjonen av antallet pulser som avgis er et middel for å modulere effektiviteten for overføringen av nukleinsyrer og å justere transgenets ekspresjonsnivå.

Man bekrefter likeledes en reduksjon av variabiliteten av responsen påvist ved reduk-sjonen av verdien av SEM i forhold til gjennomsnittet for alle grupper underkastet elektrooverføring.

Eksempel 14: Effekt av økning av frekvensen av de elektriske pulser.

Dette eksempel viser at økningen av frekvensen av pulsene på uventet måte tillater å forbedre transfeksjonseffektiviteten. På den annen side og under et klinisk perspektiv kan økningen av frekvensen forbedre pasientens komfort ved å redusere den totale behandlingstid.

Dette forsøk gjennomføres med C57Bl/6-mus. Det benyttede plasmid er plasmid pXL2774 og den administrerte mengde DNA er 15 ug. Den elektriske pulsfrekvens varieres (fra 0,1 til 4 Hz). Varigheten av hver puls er 20 msek og feltstyrken er 200 Volt/cm, mens de andre forsøksbetingelser er som beskrevet i eksempel 1. Resultatene er vist i tabell 9.

Gjennomsnittlig verdi ± SEM for luciferaseaktiviteten i millioner RLU pr. muskel. N=10 for hver gruppe; Betingelser: feltstyrke 200 Volt/cm, 8 eller 4 pulser på 20 msek, variabel frekvens.

Resultatene som oppnås under forsøk A, tabell 9, viser at de høyeste frekvenser (> 1 Hz) er mere effektive enn de lavere frekvenser som tilsvarer en lengere varighet mellom to efter hverandre følgende pulser (10 sekunder ved 0,1 Hz). Effektiviteten ved transfeksjonen øker med frekvensen over spekteret av testede verdier fra 0,1 til 4 Hz for 4 pulser og 0,1 til 3 Hz for 8 pulser.

Eksempel 15: Virkning av pålegging av et elektrisk felt, variert i henhold til en

eksponentiell reduksjon som funksjon av tiden.

Dette eksempel påviser virkningen av pålegging av et eksponentielt synkende elektrisk felt på effektiviteten ved overføring av nukleinsyrer.

Dette forsøk gjennomføres med C57Bl/6-mus.

Det benyttede plasmid er plasmid pXL3031. Plasmid pXL3031 (figur 12) er en vektor

som er avledet fra plasmid pXL2774 (WO 97/10343) der luc<+->genet koder for modifisert luciferase av Photinus pyralis (cytoplasmisk) fra pGL3basic (Genbank; CVU47295), er innført under kontroll av promoteren fra det tidlige området av den humane cytomegalovirus (hCMV IE, Genbank HS5IEE) og polyadenyleirngssignalet av det sene området av virus SV40 (Genbank SV4CG). Den administrerte mengde DNA er 10 ug.

Den elektriske pulsgenerator tillater å avgi pulser med en elektrisk feltstyrke som varierer i henhold til en eksponentiell reduksjon som funksjon av tiden (elektropulsator Equibio, modell easyject T plus, Kent, UK). Den pålagte spenning er spenningen ved toppen av den eksponentielle kurve. Den andre justerbare parameter er kapasitansen (uFarad) som tillater å variere den avgitte mengde energi og den eksponentielle tids-konstant. Resultatene er vist i tabell 10.

Faktor for økningen av ekspresjonen (luciferaseaktivitet) oppnådd ved pålegging av en puls som er eksponentielt synkende. Økningsfaktoren beregnes under henvisning til den luciferaseaktivitet som oppnås ved administrering av plasmid pXL3031 uten elektro-overføring (midlere verdi av økningsfaktoren, N = 4 til 6, pr. betingelse).

Som sammenligning er forbedringsfaktoren for den ekspresjon som oppnås for over-føring av pXL3031 i nærvær av et elektrisk felt med kvadratpulser (feltstyrke 200 Volt/cm, 8 pulser på 20 msek ved en frekvens på 1 Hz) 44 ved det samme forsøk.

Disse resultater viser at man kan benytte elektriske pulser med kvadratform eller en intensitet som synker eksponentielt med tiden. I det sistnevnte tilfellet kan man i tillegg oppnå en betydelig økning av ekspresjonen for en lav feltstyrke og en høy kapasitans (for eksempel 200 Volt/cm, kapasitans 3000 uFarad) eller en høy feltverdi og en lav kapasitans (for eksempel 400 Volt/cm, kapasitans 300 uFarad).

Eksempel 16: Virkningen av kombinasjonen av en kort puls med høy spenning og

flere lange pulser med lav spenning.

Dette eksempel viser at det elektriske felt som avgis kan være en kombinasjon av minst et felt mellom 500 og 800 Volt/cm med kort varighet, for eksempel 50 til 100 usek, og minst et svakt felt (< 100 Volt/cm) med lengere varighet, for eksempel > 1 msek og opptil 90 msek i dette forsøk.

Verdiene for det svake elektriske felt er her 80 Volt/cm, lagt på i 4 pulser med varighet på 90 msek med en frekvens på 1 Hz. For dette forsøk benyttes det to elektropulsatorer. De elektriske pulser legges på med det ene eller det andre apparat og forandringen gjennomføres i løpet av mindre enn 1 sekund ved hjelp av en manuell styring.

Det benyttede plasmid er pXL3031. Den administrerte mengde DNA er 3 jig. Verdiene for det elektriske felt er angitt i tabell 11; de andre betingelser ved dette forsøk er som beskrevet i eksempel 1.

Midlere verdier ± SEM for luciferaseaktiviteten i millioner RLU pr. muskel.

N= 10 muskler pr. gruppe.

Tabell 11 som oppsummerer de resultater som ble oppnådd for to forsøksserier viser at en kort puls med høy spenning eller fire suksessive lange pulser med lav spenning forbedrer transfeksjonen lite i forhold til en kontrollgruppe som mottar en injeksjon av pXL3031, men som ikke underkastes noe elektrisk felt. Det synes å være det samme om pulsene med lavt felt legges på før pulsene med høyt felt.

I de to serier forsøk øker imidlertid kombinasjonen av en kort puls med høy spenning, fulgt av fire suksessive lange pulser med lav spenning effektiviteten av DNA-overføring vesentlig.

De resultater som er oppnådd i forsøkene 1 og 2 viser at 8 pulser på 600, 800 eller 1200 Volt med en enhetlig varighet på 1 msek ved 1 Hz gir lesjoner og inhiberer transfeksjonen. Resultatene som oppnås i eksempel 16 viser at, under spesielle betingelser, er det mulig å benytte feltstyrker med høy spenning uten at det gir lesjoner, rent makro-skopisk er musklene aldri synlig endret. Anvendelsen av forhøyede elektriske felt med kort varighet kombinert med lave felt med lengere varighet synes å være et supplemen-tært middel for å modulere effektiviteten av overføring av DNA.

Eksempel 17: Effekt av injeksjonsøyeblikket for nukleinsyre i forhold til påleggingen av det elektriske felt.

Dette eksempel viser at nukleinsyren kan administreres minst 30 minutter og sogar minst en time før pålegging av det elektriske felt.

Dette forsøk gjennomføres med C57Bl/6-mus. Det benyttede plasmid er plasmid pXL2774. Den administrerte mengde DNA er 15 jig eller 1,5 ug. Injeksjonen av DNA følges av eller følger selv efter pålegging av et elektrisk felt under de følgende betingelser: styrke 200 Volt/cm, 8 pulser på 20 msek med frekvens 1 Hz. De andre betingelser ved dette forsøk er som beskrevet i eksempel 1. En kontrollgruppe består av dyr som mottar en plasmidinjeksjon, men som ikke underkastes elektriske pulser. Resultatene er oppsummert i tabell 12.

Midlere verdier ± SEM for luciferaseaktiviteten i millioner RLU pr. muskel.

N = 10 muskler pr. gruppe.

Nærværet av DNA på øyeblikket for pålegging av det elektriske felt er en betingelse for effektiviteten av elektrooverføringen. På bemerkelsesverdig måte observeres det at injeksjonen av plasmid kan gjennomføres opptil 30 minutter og sogar 1 time (forsøk 4 og 5) før pålegging av det elektriske felt og dette uten merkbar modifikasjon av ekspre-sjonsnivået. Et tilsvarende resultat oppnås både for en dose på 15 ug plasmid pr. muskel og en 10 ganger svakere dose på 1,5 jig.

Disse observasjoner tillater særlig å ta sikte på flere injeksjoner til variable tidspunkter av det samme plasmid, eller forskjellige plasmider, i en muskel før pålegging av det elektriske felt. Det er likeledes mulig å gjennomføre multiple injeksjoner på en utsøkt sone av muskelen og derefter legge på en serie elektriske pulser over hele det injiserte området som skal behandles.

Eksempel 18: Overføring av et gen som koder for erytropoietin (EPO).

Voksne C57Bl/6-mus får i den kraniale tibialmuskel og på unilateral måte en injeksjon av plasmid pXL3348. Plasmid pXL3348 (figur 16) er en vektor som er avledet fra plasmid pXL2774 der et muringen av erytropoietin (NCBI: 193086) er innført under kontroll av promoteren som stammer fra det tidlige området av den humane cytomegalovirus (hCMV IE) og polyadenyleringssignalet av det sene området av virus SV40 (Genbank SV4CG).

Betingelsene for elektrooverføringen er som følger: elektrisk feltstyrke 200 Volt/cm, 8 pulser på 20 msek med frekvens 1 Hz. Det elektriske felt legges på umiddelbart efter injeksjon av plasmidisk DNA.

Midlere verdier ± SEM. N = 4 til 5.

Man observerer, med elektrooverføring, en sterk økning av mengden erytropoietin i blodet på D7 og D24 for administrering av 10 ug pXL3348. Videre gir denne fysiologiske effekt med økning av erytropoietin seg utslag i en sterk økning av hematokrit (85%) fra dag 7 og dette også for en meget liten mengde plasmid (1 jig).

Eksempel 19: Virkning av elektrooverføring på ekspresjon av transgene vaksiner. Dette eksempel viser at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen også kan anvendes for overføring av gener som koder for polypeptider som kan benyttes i vaksiner.

Forsøket gjennomføres med 9 uker gamle Balb/c-hunnmus. De benyttede elektroder er plateelektroder av rustfritt stål med en avstand på 5 mm. VR-HA er et plasmidisk DNA som omfatter genet av hemagglutinin av influensavirusen (stamme A/PR/8/34). VR-gB er et plasmidisk DNA som omfatter genet av glycoprotein B (gB) av human cytomegalovirus (stamme Towne).

Oppløsningen av plasmidet (50 ul av en oppløsning av 20 jig/ml eller 200 ug/ml i 0,9% NaCl) injiseres longitudinalt gjennom huden i den kraniale tibialmuskel på unilateral måte. De elektriske pulser legges på 20 sekunder efter administrering av plasmidet, loddrett på muskelaksen, ved hjelp av en kvadratpulsgenerator (feltstyrke 200 Volt/cm, 8 konsekutive pulser med varighet 20 msek og frekvens 1 Hz).

For bedømmelse av stimuleringen av immunresponsen, ble følgende immuniserings-protokoll fulgt:

DO prøvetaking av pre-immunserum

Dl primo injeksjon med eller uten elektrooverføring

D2 prøvetaking av immunserum

D2 gjentatt injeksjon med eller uten elektrooverføring

D42 prøvetaking av immunserum

D63 prøvetaking av immunserum

Blodprøvene gjennomføres i den retro-orbitale sinus. Bestemmelsen av spesifikke antistoffer gjennomføres ved ELISA. Hver forsøksbetingelse testes på 10 dyr injisert uni-lateralt.

Resultatene hva angår mengdene antistoffer rettet mot hemagglutinin av influensavirusen er vist i tabell 14A.

Mengder av antistoffer rettet mot hemagglutinin av influensavirusen, oppnådd efter injeksjon av 1 eller 10 (Ag DNA (VR-HA) i fravær eller nærvær av elektriske pulser. Resultatene er de geometriske middelverdier for 10 dyr (8 dyr for gruppen injisert med 1 jig DNA i nærvær av elektriske pulser med prøve D63) ± SEM. Verdien av p oppnås ved sammenligning av to og to av grupper injisert i nærvær og fravær av elektriske pulser under anvendelse av Man-Whitneys ikke-parametriske test.

Disse resultater viser at mengdene av antistoff rettet mot hemagglutininet av influensavirusen økes med en faktor rundt 10 i de grupper mus som er underkastet elektriske pulser. Således oppviser musene som har mottatt 1 ug DNA i nærvær av elektriske pulser en midlere mengde antistoff som er noe høyere enn den til mus som har mottatt 10 fig DNA i fravær av elektriske pulser.

Resultatene som gjelder mengdene antistoff mot glycoprotein B (gB) av human cytomegalovirus er oppsummert i tabell 14B.

Mengder antistoff rettet mot glycoprotein B (gB) av human cytomegalovirus, oppnådd efter injeksjon av 10 fig DNA (VR-gB) i fravær eller nærvær av elektriske pulser. Resultatene er de geometriske middelverdier for 10 dyr (9 dyr for gruppen injisert i nærvær av elektriske pulser) ± SEM. Verdien av p oppnås ved sammenligning to og to av grupper injisert i nærvær og fravær av elektriske pulser under anvendelse av Man-Whitneys ikke-parametriske test.

Disse resultater viser at mengdene antistoff rettet mot glycoprotein B av human cytomegalovirus økes med en faktor 4 på D42 i gruppen mus som er underkastet elektriske pulser. Man merker seg likeledes at variasjonskoeffisienten er gjennomsnittlig tre ganger lavere i gruppen dyr underkastet elektriske pulser.

Claims (45)

1. Anvendelse av en nukleinsyre for fremstilling av et medikament for behandling av kreft ved genterapi, hvor nevnte medikament bringes i kontakt med tumorer, og nevnte tumorer utsettes for en eller flere elektriske pulser med en intensitet på mellom 1 og 600 Volt/cm.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor feltstyrken ligger mellom 200 og 600 Volt/cm.

3. Anvendelse ifølge krav 1, hvor feltstyrken er rundt 500 Volt/cm.

4. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-3, hvor den totale påføringsvarighet for det elektriske felt er over 10 msek.

5. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-4, hvor pålegging av det elektriske felt omfatter en eller flere pulser med regulær frekvens.

6. Anvendelse ifølge krav 5, hvor påleggingen av det elektriske felt omfatter mellom 1 og 100 000 pulser med frekvens mellom 0,1 og 1000 Hz.

7. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-4, hvor de elektriske pulser avgis irregulært i forhold til hverandre og at funksjonen som beskriver den elektriske feltstyrke som funksjon av tiden for en puls, er variabel.

8. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-7, hvor integralet av funksjonen som beskriver variasjonen av det elektriske felt med tiden er over 1 kV x msek/cm.

9. Anvendelse ifølge krav 8, hvor dette integral er > 5 kV x msek/cm.

10. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-9, hvor de elektriske pulser er valgt blant pulser med kvadratbølger, elektriske felt som genererer bølger som synker eksponentielt, oscillerende, unipolare bølger med begrenset varighet, oscillerende bipolare bølger med begrenset varighet eller andre bølgeformer.

11. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-10, hvor de elektriske pulser omfatter pulser med kvadratbølger.

12. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-11, hvor de elektriske pulser legges på utvendig.

13. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-11, hvor de elektriske pulser legges på innvendig i vevet.

14. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-13, hvor nukleinsyren injiseres i vevet.

15. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-13, hvor nukleinsyren injiseres systemisk.

16. Anvendelse ifølge krav 15, hvor nukleinsyren injiseres intra-arterielt eller intravenøst.

17. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-16, hvor nukleinsyren administreres topisk, kutant, oralt, vaginalt, intranasalt, intramuskulært, subkutant eller intraokulært.

18. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-16, hvor nukleinsyren er til stede i et preparat som i tillegg inneholder drøyemidler som er farmasøytisk akseptable for de forskjellige administreringsmåter.

19. Anvendelse ifølge krav 18, hvor preparatet er tilpasset parenteral administrasjon.

20. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-19, hvor nukleinsyren er en deoksyribonukleinsyre.

21. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-20, hvor nukleinsyren er en ribonukleinsyre.

22. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-20, hvor nukleinsyren er av syntetisk eller biosyntetisk opprinnelse eller ekstrahert fra en virus eller en prokaryotisk eller eukaryotisk unicellulær eller pluricellulær organisme.

23. Anvendelse ifølge krav 22, hvor den administrerte nukleinsyre er assosiert helt eller delvis til komponenter av opprinnelsesorganismen og/eller syntesesystemet.

24. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-23, hvor nukleinsyren koder for RNA eller et protein av interesse.

25. Anvendelse ifølge krav 24, hvor RNA er en katalytisk eller antiretnings-RNA.

26. Anvendelse ifølge krav 24, hvor nukleinsyren koder for et protein valgt blant enzymer, blodderivater, hormoner, lymfokiner, vekstfaktorer, trofiske faktorer, angiogeniske faktorer, neurotrofiske faktorer, henvekstfaktorer, hematopoietiske faktorer, koaguleringsfaktorer, antigener og proteiner implikert i metabolismen av aminosyre, lipider og andre vesentlige bestanddeler i cellen.

27. Anvendelse ifølge krav 26, hvor nukleinsyren koder for de angiogeniske faktorer VEGF og FGF, de neurotrofiske faktorer BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, NT3, NT5, proteinet Gax, veksthormonet, et cytokin, a-l-antitrypsin, kalsitonin, leptin og apolipoproteinet, biosynteseenzymer av vitaminer, hormoner og neuromediatorer.

28. Anvendelse ifølge krav 27, hvor nukleinsyre koder for et antistoff, et variabelt fragment av enkeltkjedet antistoff (ScFv) eller et hvilket som helst annet antistoff-fragment som har evnen til gjenkjenning i et immunoterapeutisk formål, eller koder for en oppløselig reseptor, for et peptid som er agonist eller antagonist for en reseptor eller et adhesjonsprotein, for et kunstig, kimert eller stumpt protein.

29. Anvendelse ifølge krav 27, hvor nukleinsyren koder et antiidiotype antistoff, et oppløselig fragment av reseptoren CD4 eller reseptoren TNFa eller reseptoren acetylcholin.

30. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 26-29, hvor nukleinsyren koder for en forløper for et terapeutisk protein.

31. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-30, hvor nukleinsyren foreligger i form av et plasmid.

32. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-30, hvor nukleinsyren inneholder et gen med stor størrelse og/eller introner og/eller regulatorelementer med liten eller stor størrelse.

33. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-30, hvor nukleinsyren er en episomal DNA eller et kunstig gjærkromosom eller et minikromosom.

34. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-33, hvor nukleinsyren inneholder sekvenser som tillater og/eller favoriserer ekspresjonen av transgenet i vevet.

35. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-34, hvor syren er assosiert med en hvilken som helst type vektor eller en hvilken som helst kombinasjon av vektorer som tillater å forbedre overføringen av nukleinsyre, for eksempel virus, syntetiske eller biosyntetiske midler eller også eventuelt propulserte kuler.

36. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-35, hvor vevet underkastes en behandling med sikte på å forbedre overføringen av genet, en behandling av farmakologisk art ved lokal eller systemisk applikasjon eller en enzymatisk, permeabiliserende, kirurgisk, mekanisk, termisk eller fysisk behandling.

37. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-36, hvor det ved hjelp av vevet tillater å fremstille et middel i fysiologiske eller terapeutiske mengder enten i cellene i vevet eller sekretert.

38. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-36, hvor modulering av volumet av den transfekterte celle tillater å modulere mengden transgen som uttrykkes.

39. Anvendelse ifølge krav 38, hvor volumet av det transfekterte vev tillates modulert ved å anvende multiple administreringsseter.

40. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-39, hvor mengden transgen som utrykkes tillates modulert ved å modulere antallet, formen, overflaten og disponeringen av elektrodene, ved å variere feltstyrken, antallet, varigheten og frekvensen og formen for pulsene samt mengden og volumet av nukleinsyre som administreres.

41. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-39, hvor lokaliseringen av de transfekterte vev tillates kontrollert via volumet av vev som underkastes lokale elektriske pulser.

42. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-41, hvor retur til utgangssituasjonen tillates ved å forlate sonen for transfektert vev.

43. Anvendelse ifølge krav 1, hvor medikamentet administreres direkte til cellene eller vevet eller ved topisk eller systemisk administrering.

44. Anvendelse ifølge krav 1, hvor de elektriske pulser er unipolare bølger.

45. Anvendelse ifølge krav 1, hvor feltstyrken er mellom 4 og 400 Volt/cm.