CZ475699A3 - Systém a zařízení pro in vivo přenos nukleových kyselin do tkání - Google Patents

Abstract

Řešení poskytuje systémy a zařízení, která zlepšují in vivo přenos vektorů nukleových kyselin do buněk, zejména do svalových a nádorových buněk, použitímslabého elektrického pole, čímž se zlepšuje účinnost přenosu. Zařízení poskytují napěťový gradient k migraci vektorů nukleových kyselin do buněk, aniž by došlo k poškození buněk nebo tkání. Zařízení podle vynálezujsou charakteristická uspořádáním elektrod a limity výkonu definovanými nastavenímmaximálního napětí.

Description

Předkládaný vynález se týká mimořádného zlepšení in vivo přenosu vektorů nukleových kyselin do buněk, zvláště do svalových buněk, pomocí slabého elektrického pole, čímž se zvyšuje účinnost takového přenosu. Konkrétně se vynález týká způsobů, zařízení a prostředků, které jsou určené k přenosu vektorů nukleových kyselin v genové terapii. Zařízení podle předkládaného vynálezu jsou navržena tak, že poskytují optimální gradient napětí, aby se zvýšila migrace vektorů nukleových kyselin do buněk, aniž by došlo k poškození buněk nebo tkání. Tato zařízení jsou charakteristická jedinečným uspořádáním elektrod a jedinečným limitem energie, který je definován nastavením napětí.

Dosavadní stav techniky

Přenos genů do dané buňky je základním kamenem genové terapie. Avšak . jedním z problémů je, jak vnést dostatečné množství nukleové kyseliny do hostitelské buňky, která má být léčena. Požadovaný gen musí být exprimován v transfekovaných buňkách. Jeden z přístupů používaných v této souvislosti spočívá v tom, že se nukleová kyselina integruje do virového vektoru, zejména retroviru, adenoviru nebo adeno-asociovaného viru. Tyto systémy využívají k proniknutí do buňky výhody mechanismů, které vyvinuly viry, a také jejich ochranných mechanismů proti degradaci. Avšak tento přístup je spojen • · • ·· · ♦·· • · ·· ·· s řadou problémů. Jedním z nich je riziko produkce infekčních virových částic schopných rozšíření v 'hostitelském organismu a v případě retrovirových vektorů ještě riziko inzerční mutageneze. Kromě toho inzerční kapacita terapeutických nebo vakcinačních genů ve virových genomech zůstává omezena. A také je často proti virovým vektorům vyvolána imunitní reakce, která je příčinou toho, že opakované podání viru je neúčinné z důvodu odstranění viru imunitním systémem' a může navíc vést k zánětlivé reakci.

Další přístup (Wolf et al. , Science 247, 1465-68, 1990;

Davis et al . , Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93, 7213-18, 1996;

patent US 5,580,859 (Felgner et al. ) ) zahrnuje podávání nukleových kyselin plazmidového typu do svalu nebo krevního oběhu, ať již nenavázaných nebo navázaných na sloučeniny určené k tomu, aby usnadnily transfekci, jako jsou např. proteiny, liposomy, nabité .lipidy nebo kationtové polymery jako je polyetylénimin, který je dobrým transfekčním činidlem in vitro (Behr et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA' 86, 6982-6, 1989; Felgner et al. , Proč. Nati. Acad. Sci. USA- 84, 7413-7, 1987; Boussif et al. , Proč. Nati . Acad. Sci,. USA 92, 7297301, 1995; patent US 5,676,954 a patent EP 425 475).

Pokud se týká svalů, od původní publikace Wolffa et al.

(viz výše) ukazující schopnost svalové tkáně inkorporovat DNA injikovanou ve formě volného plazmidu, se mnozí výzkumníci snažili zlepšit tento proces (Manthorpe et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 419-431; Wolff et al., 1991, BioTechnique,s 11,

474-485)'. Na základě toho se. objevily jisté trendy, zejména šlo o:

• použití mechanické síly k nucenému vstupu DNA do buněk tak, že se DNA adsorbuje na částice a ty se pak vženou do tkáně (gene gun) (Sanders Williams et aí . , 1991,

Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 2726-2730; Fynan et al.,.

• titi ti ti· ► 4 ti ti tititi ti ti 4 • 4 ti ti titi

1993, BioTechniques 11, 474-485). Tento způsob se ukázal účinným . v očkovacích strategiích, ale zasahuje pouze povrchové vrstvy tkání. V případě svalu by jejich použití nutně znamenalo chirurgický zákrok, aby se zajistil přístup ke svalu, neboť částice neprocházejí tkání kůže, injekci DNA, již ne však v plazmidové formě, ale ve spojení s molekulou schopnou ' sloužit jako nosič, usnadňující vstup komplexu do buněk. Kationtové lipidy, používané v mnohých jiných způsobech transfekce, se u svalu ukázaly být zklamáním, neboť ty, které byly dosud testované, inhibovaly transfekci (Schwartz et al., 1996,

Gene Ther.., 405-411) . Totéž platí pro kationtové peptidy a polymery (Manthorpe et al. , 1993, Human Gene Ther. 4,

419-431) . Jediným případem vhodné' kombinace se zdá být směs polyvinylalkoholu nebo polyvinylpyrolidonu s DNA. Výsledný faktor zlepšení přenosu DNA u těchto kombinací je nižší než 10 ve srovnání s injekcí nahé DNA (Mumper et al. , 1996, Pharmaceutical Research 13, 701-709) ošetření tkáně, do které se má injikovat DNA předem roztokem, který má zvýšit difúzi a stabilitu DNA (Davis et al., Hum. Gene Ther. 4, 151-159) nebo upřednostnit vstup nukleových kyselin, např. indukcí buněčného dělení nebo regenerace. Ošetření se týkalo především použití lokálního anestetika nebo kardiotoxinu, vazokonstriktorů, endotoxinů nebo jiných molekul (Manthorpe et al. , 1993,

Human Gene Ther. 4, 419-431; Danko et al.,

Ther. 1, 114-121;· Vitadello et al., 1994, Hum.

5, 11-18). Tyto postupy předběžného] ošetření se

1994, Gene Gene Ther.

však přípravek obtížně provádějí.

napr.

Tak konkrétně Bupivacaine, aby byl účinný, se musí užít v dávce velmi blízké letální dávce. Preinjekce hyperosmotické sacharózy, • ··

Φ Φ 4 4 ♦ Φ · »ΦΦφ ·φ • ΦΦΦΦ

Φ ΦΦΦΦ

Φ Φ ΦΦΦ ΦΦΦ zamýšlená ke zvýšení difúze, nezvyšuje úroveň transfekce ve svalu (Davis et al., 1993).

Jiné tkáně byly transfekovány in vivo buďto pomocí samotné plazmidové DNA nebo DNA spojené se syntetickým vektorem' (přehled viz Cotten and Wagner (1994), Current Opinion in Biotechnology 4, 705; Gao and Huang (1995), Gene

Therapy, 2, 710; Ledley (1995), Human Gene Therapy 6, 1129).

Hlavním tkáněmi, které se zkoumaly, byla játra, respirační epitel, cévní stěny, centrální nervový systém a nádory. Ve všech těchto tkáních však byla exprese transgenu nízká, takže se nepředpokládala terapeutická aplikace (v játrech např. viz Chao et al. (19%), Human Gene Therapy 7, 901), ačkoliv byly získány nějaké povzbudivé výsledky s přenosem, plazmidové DNA do cévní stěny (Iires et al., 1996, Human Gene Therapy 7, 959 and 989) . V mozku je účinnost přenosu; velmi nízká, stejně jako je tomu v nádorech ' (Schvíartz et al. 1.996. Gene Therapy

3, 405; Lu et al. , 1994, Cancer Gene Therapy 1, 245; Son et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91, 12669).

Přenos genu elektroporací a iontoforézou

Elektroporace nebo použití elektrického pole k permeabilizaci buněk se obecně využívají in vitro k podpoře transfekce DNA do buněk v kulturách dosažení prahové intenzity

Elektropermeabilizaci lze pozorovat při relativně vysoké intenzitě elektrického pole 800 až 1200’ V/cm u živočišných buněk. Tyto techniky byly také navrženy pro použití ín vivo, ke zvýšení účinnosti protinádorových přípravků jako je např. bleomycín, u solidních nádorů člověka (patent US 5,468,228, (L.M. Mír) ) . S pulzy velmi krátkého trvání (100 mikrosekund) jsou tyto elektrické podmínky (800 až 1200 V/cm) velmi vhodné k intracelulárnímu přenosu malých molekul. Tyto podmínky

Tento jev závisí na elektrického pole.

» φ · • · · • · · > · 9 · • · • β · · » · · · ι · · · • · · · · « • · ·· «· ukázalo být zcela neúčinné srovnání s injekcí DNA (pulsy v délce 100 mikorsekund) byly aplikovány, aniž by se však zlepšila účinnost přenosu nukleové kyseliny do jater, přičemž pole pod lOOOV/cm se a dokonce inhibující ve v nepřítomnosti elektrického pole (patentová přihláška WO 97/07826, Heller et al., FEBS Letters, 38-9, 225-8, 1996) .

Tento způsob však představuje problémy, především při aplikaci in vivo, neboť aplikace eletrického pole (takové intenzity může způsobovat rozsáhlé léze. Léze v cílové tkání nejsou problémem při léčení nádorů u pacientů s rakovinou, ale představují hlavní nevýhodu, pokud se DNA podává do tkáně jiné než nádorové, a zvláště pak do příčně pruhovaného svalstva.

Existují tři základní typy systémů užívaných k aplikaci elektrických pulzů pro elektroporací a iontoforézů: vnější elektrody, vnitřní (interní) elektrody (včetně katétrů) a kombinace vnější a vnitřní elektrody.

Vnější (externí) elektrody

V jednom' typu přístroje jsou elektrody z hlediska pacienta umístěny externě, viz např. US patenty č. 5 318 514 (Hofmann), č. 5 439 440 č. 5 464 386 (Hofmann), a č.' 5 019 034 (Weaver zahrnujeme do odkazů.

(Hofmann) , č. 5 462 520 (Hofmann) , č. 5688 233 (Hofmann et a i. ) et al.), jejichž popisy tímto

V případě zařízeni s externími elektrodami, tyto elektrody jsou v kontaktu s povrchovými oblastmi tkáně pacienta. Přístroj může být použit neinvazivním způsobem tak, že se elektrody aplikují na kůži pacienta,, nebo invazivním způsobem tak, že se elektrody aplikují na povrch orgánu, který byl exponován chirurgický.

Patent '514 Hofmanna popisuje přístroj, který se -užívá k implantaci makromolekul jako jsou geny, DNA nebo léčiva do • 9 Λ

99 »9 9 ·

9 »9 99 • 9 · · · • 9 ·

9 9 »9 9 9 9 předem zvolených oblastí povrchových orgánů pacienta. Součástí přístroje je hlavice, která obsahuje, v prvním provedení, zvlněný vodič, který je umístěn na elastomerů s otevřenými póry, a tyto části jsou neseny rovinným nosičem. Sousedící paralelní segmenty zvlněného vodiče slouží jako elektrody. Pro aplikaci elektrického pulsu na pacienta se hlavice přístroje umístí do kontaktu s vybranou povrchovou oblastí tkáně, čímž se vodič přivede do kontaktu s kůží i kapalné médium nesoucí makromolekuly se nanesen na kůži pacienta tím, že se tato kapalina aplikuje na elastomer, který ji vsákne nebo absorbuje. Pomocí vypínače se pak aplikuje vvsokonapěťový pulz z generátoru signálu na elektrody, čímž se vytvoří elektrické pole mezi elektrodami. Hloubka elektrického pole v kůži je úměrná velikosti mezery mezi elektrodami. Elektrické pole pak injikuje kapalinu do oblasti tkáně.

V alternativním provedení hlavice přístroje obsahuje několik jemných jehel vybíhajících obecně 'kolmo· k rovinnému nosiči. Jehly jsou uspořádány ' v řadách a' jsou střídavě napojeny k výstupu generátoru signálu tak, že každá jehla sousedí s jinou jehlou opačně polarity. Jehly proniknou povrchovými vrstvami buněk kůže a usnadní přenos elektrických pulzů do vybrané cílové oblasti.

Patent '440 Hofmanna popisuje přístroj, který obsahuje elektrody s nastavitelnou vzdáleností mezi nimi pro vytváření elektrického pole. Elektrody jsou upevněny na pohyblivém spojovacím článku, takže s nimi pohybovat k sobě a do sebe jako uživatel může snadno íelistmi svěráku. Při pouziíi se kterou se elektrodové čelisti otevřou a vybraná tkáň, na má působit, se mezi tyto elektrodové čelisti icnytí. Generátor signálu spojený s elektrodami se uvede do • · «· « · 4 · · *4

4 4 4 * · 4 · 4 4 4 4 • ·· 4 44444 •4 44 4 « 4 444444 • · 4 ' 4 4 4 4

4444 44 444 4444 44 4« činnosti vhodným vypínacím zařízením, čímž se vytvoří elektrické pole ve tkáni mezi elektrodami.

Vnitřní (interní) elektrody

Druhý typ elektropřenosového zařízení užívá implantovatelné ’ nebo inzertovatelné elektrody,- které jsou umístěny uvnitř pacienta, aby se aplikovalo elektrické pole na oblast sousedící s implantovanou/vloženou elektrodou, viz např. patenty US č. 5 304 120 (Crandell et al. ) , č. 5 507 72'4 (Hofmann et al.), č. 5 501 662 (Hofmann), č. 5 702 359 (Hofmann et al. ) a č. 5 273 525 (Hofmann), jejichž popisy tímto zahrnujeme do odkazů.

Patent Ί20 Crandella popisuje katétr, který se vsouvá do vybrané krevní cévy pacienta. Katétr obsahuje několik osově protažených, po obvodě rozmístěnýchelektrod, které se dostanou do kontaktu s vnitřní stěnou krevní cévy. Kapalné médium obsahující makromolekuly je pak .naplněno do krevní cévy v sousedství elektrod a pomocí elektrod je aplikován předem ‘definovaný elektricky signál pro elektropřenos. Elektrody s mezerou jsou buďto zvlněné nebo' paralelní proužky, do kterých se dodá elektrická energie,. aby se vytvořilo požadované elektrické pole.

Patent '724 Hofmanna je jiným příkladem přístroje pro elektropřenos typu katétru, který má samostatné oddělené elektrody umístěné vně katetru, který se vsune do krevní cévy tak, aby elektrody přišly do kontaktu s cévou, na kterou se má působit.

Patent '662 Hofmanna popisuje _: dvojici elektrod oddělených mezerou umístěných ve válcovitém dielektrickém nosiči. Elektrody jsou umístěny kolem středu krevní cévy v předem stenovené uniformní vzdálenosti od sebe navzájem a blízko středu cévy, takže krev proudící cévou prochází mezi

9 9 9 ί · · « « · · • « 9 9

9999 99 » · 9 9

999 999

9

9 9 9

Patent s dvoiitou elektrodami. Válcovitý dielektrický nosič je' chirurgicky implantován do okolí krevní cévy. Předem určený elektrický signál se aplikuje na elektrody, čímž se vytvoří elektrické pole v krvi procházející mezi elektrodami.

'525 Hofmanna popisuje injekční stříkačku· jehlou, kde jehly slouží jako elektrody k provedení elektropřenosu. Jakmile jsou jehly vbodnuty do cílové oblasti, aplikuje se elektrický signál na elektrody, aby se vytvořilo elektrické pole v cílové oblasti. Patent '359 Hofmanna popisuje také jehlovité elektrody používané k elektropřenosu.

Kombinace vnější a vnitřní elektrody

Třetí typ zařízení pro elektropřenos kombinuje rysy obou výše popsaných systémů. Tato zařízení užívají alespoň jednu interně umístěnou elektrodu a alespoň jednu externě umístěnou elektrodu k vytvoření elektrického pole v požadované oblasti tkáně, viz např. patenty US č. 5 286 254 (Shapland etal.), č. 5 439 971 (Shapland et al.), č. 5 498 238 (Shapland), č. 5 282 785 (Shapland) ač. '5 628 730 (Shpland), jejichž popisy tímto zařazujeme k odkazům.

Typicý přístroj tohoto typu je popsán např. v patentu '785 Shaplanda, kde se popisuje katétr, který má komůrku pro léčivo se stěnou pro přenos léčiva (např. z permeabilního nebo semipermeabilní materiálu, který propouští léčivo nebo jiné makromolekuly) a elektrodu umístěnou uvnitř, katétru proti propustné stěně. Druhá elektroda je umístěna na vzdáleném místě na pacientově kůži. Kapalina obsahující požadované makromolekuly se umístí do komůrky, aby se dostala do elektrického pole vytvořeného mezi dvěma elektrodami, když se do nich přivede proud. Tímto způsobem jsou makromolekuly přeneseny do cílového místa.

• « • · • · · · ·· * · 0 · 0 · . 0 0 0 ······ « · · · «»·«·»·· « · · * 0 · ·

0«·· 00 «00 «0 00 00 «· ⁹

K dalším vlastnostem zařízení popsaných ve výše zmíněných patentech patří: Obrácení polarity elektrod, aby bylo možné směrovat nadbytek makromolekul ve směru opačném než který byl použit k přenosu (např. patenty '238 a '785 Shaplanda), systémy pro synchronizaci přívodu proudu do elektrod s ventrikulární depolarizací srdce, aby se zabránilo elektricky indukované arytmii nebo, nepřirozenému srdečnímu rytmu (např. patenty US č. 5 236 413 a 5 425 703 (Feiring) ač. 5 634 899 (Shapland), a dále použití ultrazvukového piezoelektrického vysílače místo elektrod k vytvoření zvukových vln jakožto hnací síly pro přenos' makromolekul, což je systém zvaný fonoforéza (např. patenty '238 a '730 Shaplanda).

Podstata vynálezu

Zatímco všechny výše citované práce zdůrazňovaly nutnost užít elektrického pole s vysokým napětím řádu 1000 V/cm, aby byly účinné ín vivo, původce předkládaného vynálezu zcela neočekávaně ukázal, že přenos nukleových kyselin in vivo do tkání je podstatně zlepšen, a to bez vedlejších účinků, když se tkáň vystaví elektrickým pulzům nízké intenzity (méně než 600 V/cm),' např. 100 až 200 V/cm, a relativně dlouhého trvání. Kromě toho původce zjistil, že velká variabilita exprese transgenů nesených plazmidy, ke které dochází při přenosu DNA do svalu dle dosavadního stavu techniky, byla snížena při použití způsobu podle vynálezu.

Tudíž předkládaný vynález se týká způsobů a zařízeni pro přenos nukleových kyselin ín vivo do tkání, např. pruhovaného svalstva nebo nádoru, kdy se buňky nebo tkáně přivedou do kontaktu s nukleovou kyselinou, která má být přenesena přímým • « 9 9 podáním do tkáně nebo topickým či systémovým podáním, a kdy je přenos zabezpečen aplikací na tkáně jednoho nebo několika elektrických pulzů s intenzitou i až 400 V/cm pro svaly a 1 až 600 V/cm pro jiné tkáně jako např. nádory.

Tudíž předkládaný vynález poskytuje systém, jako je například zlepšený přístroj, pro in vivo přenos nukleových’ kyselin do buněk mnohobuněčných eukaryotických organizmu, kdy se buňky nebo tkáně přivedou' do kontaktu s nukleovou kyselinou, která má být přenesena přímým podáním do tkáně nebo topickým či systémovým podáním, a kdy je přenos zabezpečen aplikací na tkáně jednoho elektrických pulzů udělených přístrojem nebo' podle nastaveným na popsanou intenzitu. Konkrétně několika vynálezu int en zrna pul z y a s intenzitou 1 elektrického pole je 1 až 600 V/cm pro přenos nukleové kyseliny do nádorových buněk a 1 až 400 V/cm pro přenos nu k3 θο vé kys s1i ny do s v a.1 o vých koně k S y s t éiu (nsko pnkstnoý či zařízení) podle vynálezu obsahuje generátor elektrických pulzů (nebo obecně prostředek pro -generování elektrických pulzů), kde generátor elektrických pulzů tvoří elehtrické s dobou trvání větší než 1 ms (milisekunda) až 400 nebo 1 až 600 V/cm a s frekvencí

0,1 až 1000 Hz, a dále obsahuje elektrody připojené ke generátoru pulsů pro vytvoření elektrického pole in vivo ve tkáni v kontaktu s elektrodami.. Ve specifickém provedení generátor elektrických pulzů produkuje pulzy s intezitou 30 až 300 V/cm (pro přenos do svalu) a 400 až 600 'V/cm pro přenos do nádorových buněk nebo jiných malých buněk. V jiném specifickém provedení generátor elektrických pulzů produkuje pulzy s dobou pulzu delší než 10 ms. Ještě v dalším provedení vynálezu generátor elektrických pulzu produkuje 2 . až 1000 pulzu. :

• · • · · · · 0 0 0 0 0 0 0

00 0 ····«

0 0« 0 0 · 000 000 • 0 · 0 0 0 0

0000 00 000 0000 00 00

V systému nebo zlepšeném přístroji podle vynálezu může generátor elektrických pulzů produkovat pulzy navzáj em nepravidelné^ přičemž f unkce popisuj ící intenzitu pole v závislosti na čase je proměnlivá/ s výhradou, že systém nebo přístroj nikdy nevytvoří elektrické pole větší (nebo menší) než jsou parametry výše uvedené.. Tak např. integrál funkce popisující proměnlivost elektrického pole v čase může přesáhnout 1 kV * ms/cm a v dalším provedení přesahuje nebo je roven 5 kV * ms/cm.

Generátor elektrických pulzů (prostředek generující pulzy) může tvořit pulzy vybrané ze skupiny obsahující pulzy tvaru obdélníkových kmitů, exponenciálně tlumených kmitů, oscilujících unipolárních kmitů omezeného trvání, a oscilujících bipolárních kmitů omezného trvání. Výhodně generátor elektrických pulzů produkuje pulzy obdélníkových kmitů.

Vynález zahrnuje různé uspořádání elektrod. Tak např. elektrody mohou být externí elektrody pro umístění na tkáni, která má být ovlivněna, např. pro přenos nukleových kyselin do buněk nebo povrchových tkání subjektu. Alternativně se muže jednat o'interní elektrody nebo elektrody pronikající do tkáně, které jsou implantovatelné do tkání, na které se má působit. Takové interní elektrody mohou být jehly, nebo mohou být uspořádány jako injektorový (vstřikovací) systém, který umožňuje simultánní podání nukleových kyselin a aplikaci elektrického pole. V jiném provedení vynález poskytuje jak externí tak interní elektrodu.

Externí elektroda podle vynálezu je rozměrově upravena a tvarována tak, aby byla v kontaktu s vnější částí těla v blízkosti velkých svalu. Ve specifickém provedení je taková elektroda plochá destičková elektroda, v j iném provedení je elektroda poloválcovitá destičková elektroda.

• · • · • · · · 9 • 99 • · 9 9 •9 · · • 9 9 · *9 9

Ještě. v dalším provedení vynálezu je elektroda intraarteriální nebo intravenózní elektroda, např. flexibilní katétr upravený podle vynálezu. . '

Výhodným materiálem pro elektrody podle vynálezu je nerezová ocel.

Zlepšený přístroj podlé vynálezu lze vyrobit modifikací přístrojů dosavadního stavu techniky, zejména prostředků pro generaci elektrického pole v těchto přístrojích, tak aby se tvořilo elektrické pole podle vynálezu. Tak např..prostředky ke generování elektrických pulzů se upraví tak, aby generovaly pulzy ,1 až 400 nebo 1 až 600 V/cm tím, že se upraví jejich napěťový . výstup, aby nepřesahoval napětí odpovídající 400' nebo 600 V/cm. Ve specifickém provedení vynálezu, t.j . modifikovaném přístroji, napětí je nastaveno na konstantní napětí a elektrody jsou nastaveny na konstantní vzdálenost mezi elektrodami. Alternativně se prostředek pro generování elektrických pulzů upraví tak, aby produkoval pulzy 1 až 400 nebo 1 až 600 V/cm, tím,, že se na přístroji označí, že napětí nemá přesahovat hodnotu odpovídající 400 nebo 600 V/cm.

Takže předmětem vynálezu je poskytnout systém, nebo zlepšit existující přístroje, k dodání elektrického pole s napěťovým gradientem, šíří pulsu a počtem pulzů, které byly zjištěny jako optimální pro přenos nukleových kyselin, aniž by došlo k poškození tkání.

Zvláštním předmětem vynálezu je. poskytnout eletropřenos nukleových kyselin za jemnějších a méně poškozujících podmínek, než jaké se užívají při elektroporaci (kde napěťový gradient přesahuje 600 a obvykle dokonce 1000 V/cm).

Ještě dalším předmětem vynálezu je poskytnout mnohem účinnější systém k intracelulárnímu přenosu nukleových

4 4

44

4444 • 4 4

4

4444 · 4 kyselin, než jaké je dosahováno při slabé síle elektrického pole užívané pro iontoforézu.

A ještě dalším výhodným předmětem vynálezu je poskytnout účinný reprodukovatelný přenos nukleových kyselin do svalových buněk.

Tyto a ještě další předměty vynálezu byly získány, jak bylo výše popsáno a jak bude dále podrobněji vysvětleno pomocí příkladů provedení vynálezu a obrázků.

Popis obrázků

Obr. 1: Účinek elektrických pulzů s vysokou intenzitou pole na transfekci plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota. ± střední chyba průměru.

Obr. 2: Účinek elektrických pulzů se střední intenzitou pole na transfekci plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru.

Obr. 3: Účinek elektrických pulzů se slabou intenzitou pole na transfekci plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru. '

Obr. 4: Účinek elektrických pulzů se slabou intenzitou pole a s různou délkou trvání na transfekci plazmidové DNA PXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměrů. • · · · ♦ · · 4 • ·· • · 4 • · I ···« ·9 • · ·· · • ····

Obr. 5: Účinnost elektropřenosu plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši při slabé intenzitě pole, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru.

Obr. 6: Kinetika exprese luciřerázy v horním holenním svalu svalu myši. Podání plazmidu pXL2774 s elektropřenosem () nebo bez (X) elektropřenosu, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru.

Obr. 7: Hladina exprese jako funkce. dávky DNA podané

s eletropřenosem	(·) nebo	bez eletropřenosu (	□) , uvedena
průměrná hod	nota ±	střední c	:hyba průměru.
Obr.	8: Účinek různých typů elektrod-	na účinnost
elektropřenosu.
Obr.	9:	Kinetika	sérové koncentrace	secernované
alkalické	fosfatázy.	Podání plazmidu	pXL3010
s elektropře:	nosem	() nebo	bez elektropřenosu	(♦),uvedena
průměrná hod:	o ota ±	střední c	hýba prUměru.
Obr.	10 :	Kinetika	exprese a FGF	ve svalu
s elektropře:	nosem	(bílé sloupce) a bez eletropřenosu (černé
sloupce).
Obr. 11	: Mapy	plasmidů	pXL3179 a pXL3212.
Obr. 12	: Mapy	plasmidů	pXL3388 ;a pXL3031 .
Ob r. 13	: Mapy	plasmidů	pXL3004 a pXL3010.
Obr. 11	: M a p y	ρ1 a smidu	pXL3119 a pXL3096.

I · · φ φ « • φφ •ΦΦΦ φφ φφ φφ » φ φ φ » φ φ φ φφφ φφφ φ φ φφ φφ φφ φ

Obr. 15: Mapy plasmidů pX'L3353 a pXL3354

Obr. 16: Mapa plasmidů pXL3348.

Jak bylo již uvedeno výše, předkládaný vynález umožňuje výrazně zlepšený in vivo přenos nukleových kyselin do tkání tím,, že se na tkáň působí elektrickými pulzy nízké intenzity. Např. bylo zjištěno, že elektrické pole slabší než 600 V/cm zlepšuje přenos nukleových kyselin do nádorů a nižší než 400 V/cm, výhodně 100 až 200 V/cm pro elektrody vzdálené 0,5 až 1 cm ve svalu. Pole se aplikuje po relativně dlouhou dobu. Kromě toho původci zjistili, že velká variabilita exprese transgenů, ke které dochází při přenosu DNA do svalu dle dosavadního stavu techniky, byla snížena při použití A bylo také zjištěno, dobu, např. déle ne příkladu byla vysoká hladina exprese detekována 63 dnú.

Jak je patrné z popisu vynálezu, původci nazvali přenos nukleových kyselin do buněk in vivo za těchto podmínek el.ektropřenos, vhodnou alternativou k tomuto termínu je elektrotransfekce . Oba tyto termíny optimalizované podmínky, odlišují (užívající pole o napětí vyšším než 800 V/cm) a iontoforézy (užívající naopak velmi slabá elektrická pole).

Tudíž předkládaný vynález se týká způsobů, systémů a zařízení (přístrojů), a také sloučenin, pro in vivo přenos nukleových kyselin do tkání, zejména pruhovaného svalstva, kdy se buňky tkáně přivedou do kontaktu s nukleovou kyselinou, která má být vnesena přímým podáním do tkáně nebo způsobu podle vynálezu, přetrvává po dlouhou Ve specifickém ze exprese se tím, že obsahují od elektroporace ·

·· ·· 99

9 9 9

99

9 9

9 9

9999 99

9

9

9 9 topickým nebo systémovým podáním, a přenos se zajistí tím, že se na tkáň aplikuje jeden nebo několik elektrických pulzů s intenzitou 1 až 600 V/cm (např. pro nádorové buňky) nebo až 400 V/cm pro. svalové buňky. Předkládaný vynález' se především týká systémů (tj. Zařízení nebo přístrojů) pro elektrotransfer.

Podle výhodného provedení vynálezu se způsob podle vynálezu užije na tkáně, jejichž buňky nají zvláštní geometrii, jako jsou např. buňky velké a/nebo prodlouženého tvaru a/nebo přirozeně odpovídající na elektrické potenciály a/nebo mající speciální morfologii.

Intenzita pole je výhodně 4 až 400 V/cm pro svaly a až do 600 V/cm pro nádory, přitom.celková doba aplikace je delší než 1 ms a výhodně 10 ms. Ve specifických příkladech je celková doba ' trvání 8 ms nebo delší. V řadě příkladů, doba pulzu byla 20 ms a dokonce délka přesahující 40 ms byla zjištěna jako účinná. Použije se 1 až 1000 pulzů, výhodně až 100 pulzů a výhodněji 4 až 20 pulzů, a frekvence pulzů je 0,1 až 1000 Hz, výhodněji 0,2 až 100 Hz. Ve specifickém provedení .byly účinné frekvence 2, 3 a 4 Hz. Pulzy mohou být aplikovány také nepravidelně a funkce popisující intenzitu pole v závislosti na čase mohou být různé. Integrál funkce popisující variaci elektrického pole s časem je větší než1 kV * ms/cm. Podle výhodného provedení vynálezu je hodnota integrálu vyšší nebo rovna' 5 kV * ms /cm. Avšak je třeba poznamenat, jak je odborníkovi zřejmé, že takové funkce musí být dosaženo i při subelektroforetických hodnotách napětí popsaných výše. ·

Ve specifickém příkladu, který představuje výjimku, přístroj podle vynálezu může dodávat kombinaci alespoň jednoho vysokonapěťového pulzu ^f(vyšší než 400 V/cm a výhodně 500 až 800 í-⁷/cm) s krátkou dobou trvání (kratší než 1 ms), po • · • · · · · · • · · · · • · ·· · ·· · ·· ·Φ tlumené trvání, Podle omezeného jiné druhy kmitů.

aplikaci uchýlit kterém následuje alespoň jeden nebo několik delších pulzů (delších než 1 -ms) s mnohem slabším elektrickým polem (slabším než 200 V/cm).

Ve výhodné provedení vynálezu je intenzita pole pulzů 30 až 300 V/cm.

Elektrické pulzy j.sou vybrány z pulzů obdélníkových kmitů, elektrického pole tvořícího exponenciálně kmity, oscilující unipolární kmity oscilující bipolárni kmity a výhodného provedení vynálezu jde o pulzy obdélníkových kmitů.

Aplikaci elektrických pulzů , lze provádět jakýmkoliv způsobem známým v oboru, např.:

• systémem externích elektrod umístěných na obou stranách tkáně, na kterou se má působit, zejména neinvazivními elektrodami umístěnými v kontaktu, s kůží, • systémem elektrod implantovaných ve tkáni, • elektrodovým/injektorovým systémem, který umožňuje simultánní podání nukleových kyselin- a elektrického pole.

Pro aplikaci in vivo je někdy nezbytné se k prostředku, který zajistí elektrickou kontinuitu v případě neinvazivních externích elektrod. Takovým prostředkem je např. elektrolyt ve formě gelu. K příkladům vhodných gelů patří gely užívané v příkladech a také gely obecně užívané v lékařství ke zlepšení elektrického kontaktu pro elektrokardiografy a defibrilátory.

Nukleové kyseliny se podávají jakýmkoliv vhodným způsobem, výhodně se injikují in vivo přímo do tkáně nebo se podávají jiným způsobem, lokálním nebo systémovým, čímž se stávají dostupnými v místě aplikace elektrického pole. Nukleové kyseliny se mohou podávat společně s činidly., .která umožňují' nebo usnadňují přenos, jak jsme se již ' zmínili.

·· 9· > · · « • ··

Nukleové kyseliny mohou být zejména volné v roztoku, nebo navázané na syntetická činidla nebo nesené virovými vektory.

Syntetická činidle mohou být lipidy nebo polymery, známé odborníkům, nebo dokonce to mohou být zaměřovači prvky, které umožňují fixaci na membráně cílové tkáně. K těmto prvkům ···· ·· cukry, peptidy, protilátky, v podmínkách podle vynálezu současné nebo samozřejmě za patří např. vektory nesoucí receptory a ligandy.

Lze si představit, že podávání nukleové kyseliny předchází, je následuje aplikaci elektrického pole, předpokladu, že aplikace elektrického pole přetrvává po podání nukleové kyseliny.

Předkládaný vynález se také týká nukleových kyselin a elektrického pole s intenzitou 1 az 600 V/cm (výhodně 400 V/cm) jakožto kombinovaného produktu pro jejich simultánní, oddělenou nebo časově střídavou in vivo aplikaci do/na savčí ,buňky a zvláště pak lidské buňky. Intenzita pole je výhodně 4 až 4 00 V/cm a výhodněji 30 až 300 V/cm pro přenos do svalů. Pro přenos do nádorů a buněk s podobnými elektrorecepčními vlastnostmi je výhodné elektrické pole s intenzitou 400 až 600 V/cm, výhodněji 500 (tj. 500 ± 10%, nejvýhodněji ± 5%) V/cm. Jak je každému odborníkovi zřejmé, taková kombinace definuje strukturu nukleové kyseliny, ve které nukleová kyselina přijímá specifickou orientaci vzhledem k elektrickému poli a také specifickou sekundární a terciární strukturu v přítomnosti elektrického pole. Kromě toho, bude DNA asociována ' s extracelulárníml složkami nacházejícími se v cílové tkáni, což je podstatný rozdíl od DNA, která je podrobena elektroforéze s nízkou intenzitou pole v agarózovém gelu nebo v jiných laboratorních podmínkách.

·· ·

9999 • 9 99

9 9 9 • 9· · · • 9 9 •999 99

9 9 9

Systémy a zařízení (přístroje) pro elektropřenos

Primárními _ 'složkami jakéhokoliv elektropřenosového systému (tj . zařízení nebo přístroje, oba termíny jsou zde užívány zaměnitelně) je generátor elektrických pulzů, který je zhotoven nebo modifikován tak, aby produkoval pulzy ne vyšší než 600 V/cm a dále jsou to elektrody. Systém nebo přístroj podle vynálezu pro přenos nukleové kyseliny specificky do svalů produkuje pulzy ne větší než 400 V/cm. Přirozeně že skutečné, napětí závisí na vzdálenosti elektrod! Jak je též v oboru známo, tato vzdálenost ovlivňuje specifický odpor v cílové tkáni. Tudíž skutečné aplikované napětí bude záviset na odporu, a to tak, aby proud, a tudíž celkový výkon, zůstaly na přijatelné úrovni. Termín přijatelná úroveň znamená, tak jak je užíván v tomto textu, že celkový příkon nezpůsobí ireverzibilní poškození tkáně, a zejména nezpůsobí popáleniny. Takže ve výhodném provedení vynálezu přístroj kontroluje přijatelný proud tím, že je na pevno nastaveno napětí a vzdálenost elektrod, nebo obsahuje prostředek zpětné vazby, který zabrání aplikaci příliš vysokého napětí pro určitou vzdálenost elektrod, a tudíž nedovolí nadměrný proud. Systém podle vynálezu může obsahovat také osciloskop nebo jiné měřicí zařízení k monitorování napětí, proudu nebo obou těchto veličin/

V jednom provedení je systém podle vynálezu připraven z komerčně dostupného zařízení. Výhodně se takové zařízení modifikuje, aby vytvořilo specifické podmínky pro elektropřenos, definované zde jako optimální. V jiném provedení vynálezu je navržen a zhotoven nový přístroj k tomu, aby bylo dosaženo podmínek podle vynálezu. Specifikace modifikovaného nebo nově postaveného generátoru pulzu zahrnuje, ale neomezuje se pouze na toto, vložení mechanického nebo elektrického kontrolního zařízení ·· tititi ti ti • · ti titi ti ti • ti · »··· ·· • ti · • ti «· ·· k udržování požadovaného gradientu napětí, t j . méně než 600 nebo 400 V/cm, výhodně méně než 200 V/cm pro podávání do svalů. K mechanickým kontrolním zařízením patří např. prostředek, který zastaví zařízení, kterým se volí napětí, takže není možné vybrat napětí, které by vedlo k příliš silnému elektrickému poli. Alternativně je zařízení již tak zkonstruováno, a nebo upraveno, že vůbec není možné zvolit tak vysoké napětí. V ještě dalším provedení vynálezu přístroj obsahuje přerušovač nebo pojistku, které se rozpojí, pokud napětí (a tedy i proud) přesáhne parametry podle vynálezu. V dalším . provedení vynálezu mikroprocesorové kontrolní zařízení zabrání selekci příliš vysokého napětí. V dalším provedení vynálezu je pulzní generátor modifikován jednoduše tím, že je opatřen štítkem s návodem k použití konkrétního rozsahu napětí, které poskytuje ' elektrické pole podle vynálezu. Všechny tyto modifikace jsou v oboru rutinní záležitostí a užívají standardních mechanických a elektrických technologiích.

Jak již bylo zmíněno výše, skutečné napětí, které se aplikuje systémem podle vynálezu tak, aby bylo dosaženo síly elektrického pole, která je podle vynálezu definována jako optimální, závisí částečně na rozpětí elektrod. Pokud jsou elektrody pevně nastaveny na určitou vzájemnou vzdálenost, pak se napětí (pro definovanou tkáň, např. sval, játra, srdce nebo nádor) předem definuje jako konstantní. Avšak pokud je třeba, aby elektrody měly proměnlivou nastavitelnou

nastavovat	tak.
To	lze	st
i nebo	tak,	že

stanovit ' měřením konstantní napěťový gradient, vzdálenosti mezi elektrodami, ; obsahují také měřicí září zení,.které poskytuje údaj o jejich vzdálenosti po nasazení, a nebo obsahují automatické měřicí zařízení, které automaticky zpětnou vazbou vede pulzní

00 00 « 0 0 0 0 0

0 0 0 0

0 000 000

0 0 0 0000 00 00

0 0» • · · ·

00

0 0·

0 0 •000 00 '0 generátor, aby poskytl správné napětí (viz patent US 5439 440 (Hofmann).)

V následujících částech jsou podrobněji popsány pulzní generátory, elektrody a jiná zařízení dosavadního stavu techniky, která lze modifikovat podle vynálezu.

Pulzní generátory

Pulzní generátory (zvané též generátory napětí nebo prostředky generující pulzy nebo napětí) jsou elektrická zařízení, která produkují proud definovaného napětí, trvání pulzu, šíře pulzu, pracovního cyklu (celkový čas pulzu a klidové doby) a frekvence. Taková· zařízení jsou v oboru dobře známa a patří k nim komerčně dostupné pulzní generátory jako je např. ELECTRG CELL MANIPULÁTOR Model ECM600, pulzní generátory T800L a T820 dostupné od firmy BTX Instruments Division of Genetronics,lne., San Diego,. California, např. v patentu US 5 704 908, jehož plné znění je zahrnuto v odkazech. Alternativně může být pulzní generátorem ELECTROPULSATOR PS15 firmy Jouan, Francie, jak je popsáno v příkladech.. V jiném provedeni vynálezu je užit generátor napětí, který produkuje pulzy v jedné nebo několika formách, jak byly popsány v patentu US ' 5 634 899, který je zahrnut v odkazech. Zařízení je sestaveno tak, aby produkovalo pulzy různých tvarů, intenzity 'a trvání, např. pulz 200V/cm nebo 400 V/cm o délce 5 až 20 ms může být následován pulzem s nižší intenzitou a delší dobou trvání. Kromě toho může zařízení dodávat také iontoforetické elektrické pole v kombinaci s elektrickým polem podle vynálezu.

Pulzní generátor podle vynálezu má následující technickou specifikaci:

• generuje napěťový gradient 1 až 600 nebo ,1 až 400 V/cm, výhodně 4 až 400 V/cm a výhodněji 3 až 300 .V/cm, přičemž • · 0 0 • · 0 0 • · 0 0

000 000 • 0

0000 00 specifický gradient uvažovaný pro zařízení podle vynálezu vhodné pro elektropřenos do svalů je 100 až 200 V/cm, výhodně méně než 200 V/cm, pro elektropřenos do nádorových buněk nebo podobných buněk bylo neočekávaně zjištěno výhodné elektrické pole 400 až 600 V/cm, optimálně 500 V/cm, • pulzní frekvence 0,1 až 1000 Hz, ve specifickém provedení je frekvence 2 Hz nebo vyšší, do 10 Hz, výhodně vyšší než 1 Hz, ve výhodném provedení je frekvence 3 nebo 4 Hz, • pulzní čas (doba trvání pulzu) je delší než 1 ms, s proměnlivým pracovním časem, výhodně je čas pulzu vyšší než -5 ms, výhodněji delší než 10 ms a nejvýhodněji je delší než 20 ms,

Ve výhodném provedení pulzní generátor podle vynálezu produkuje alespoň dva, výhodně čtyři, šest nebo osm pulzů. Ale může produkovat ' také např. 8 až 1000 pulzů. Pulzní generátor by měl mít ochranu před překročením povoleného výkonu nebo automatický vypínač v případě, že pacient začíná pociťovat' nepříznivé účinky elektrického pole nebo se intenzita elektrického pole dostane mimo kontrolu. Ochrana před překročením povoleného výkonu může být buďto manuální nebo automatická nebo obou druhů.

Odborníkovi je zřejmé, že pulzy mohou být generovány externím signálem, např. jiným přístrojem,, počítačem apod. Např. pro přenos nukleové kyseliny do tkáně srdce je pulzní generátor výhodně spojen se zařízením snímajícím pacientův pulzy jsou synchronizovány se systém výhodně zahrnuje aktivní srdečního rytmu, např.

elektrokardiogram, takže srdečním tepem. Takový stimulaci pacientova kardiostimulátorem (viz patent US 5 634 899 (Shapland) • · « • · · ·· • · ·

Elektrody

Elektrody podle vynálezu vytvářejí elektrické pole ve tkáni. Jedna elektroda, katoda, je negativně nabitá, druhá elektroda, anoda, je pozitivně nabitá. Obecně, podle vynálezu, zde existuje čistý tok iontů z jedné elektrody k druhé, (tok závisí samozřejmě na čistém náboji příslušných iontů a na polarizaci elektrody). Obecně se dá' říci, že nukleové kyseliny, které nesou silný čistý negativní náboj, se pohybují směrem k anodě.

Elektroda pro použití podle vynálezu musí vést účinně elektřinu a výhodně je inertní, nereaktivní a netoxická v prostředí, kde se užívá. Konkrétně elektrody pro vnitřní použití nesmí reagovat s biologickými materiály ani v nejmenším, např. nesmí- se z elektrody uvolňovat kovové ionty, které by byly škodlivé nebo jedovaté ani nesmí docházet k oxidaci, která by snižovala účinnost elektrody. Výhodným materiálem pro elektrodu podle vynálezu je proto nerezavějífcí ocel, která je dostatečně nereaktivní, dostatečně účinná pro vedení elektřiny a dostatečně levná, aby se mohla k užít k velkovýrobě s rozumnými náklady. Vhodnější elektrody, zejména pro vnitřní použití, jsou ze zlata nebo platiny. Avšak elektrody z ušlechtilých kovů jsou velmi drahé. Cena však může být snížena tím, že se tímto drahým kovem pokryje jiný vodivý materiál. K jiným vodičům patří kovy jako např. měď, stříbro, chlorid stříbrný, cín, nikl, lithium, hliník, železo a jejich slitiny. Avšak některé materiály by se neměly vnitřně používat, např. hliník. Elektrody mohou být také vyrobeny ze zirkOnia, iridia, titanu a některých forem uhlíku.

Některé elektrody, jako např. .stříbrné a měděné, mají antibakteriální aktivitu, která může být žádoucí v případě vnitřního použití k potlačení infekce.

99 99 • 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9

9 99 9 999 · · ·

9 9 « a 99

9 « · « ···· 99

Elektrody mohou být vyrobeny v jakékoliv formě vhodné pro cílovou tkáň, včetně takových forem (aniž by výčet byl limitující) 'jako je přímý drát, spirálovitý drát (tyto formy jsou ideální pro aplikací katétrem), vodivý povrch (např. povrch katétru nebo balónkového katétru, viz např/ patent US 5 704 908, na jehož plné znění se odkazujeme), kovové pásky, jehly (sondy), uspořádané sestavy jehel, povrchové elektrody nebo jejich různé kombinace. Případná uvažovaná kombinace elektrod obsahuje: 1) katétrovou a jehlovou elektrodu, 2) katétrovou a povrchovou elektrodu a 3) jehlovou a povrchovou elektrodu. Ve specifickém provedení vynálezu je užita ' jehlová elektroda společně s injekční stříkačkou k podání DNA. Jehlová' elektroda může mít otvory po celé délce dříku, což umožňuje uvolňování nukleové kyseliny v celé délce jehlv/elektrody. Pro podávání nukleové kyseliny do velkých orgánů, zvláště velkých svalů, lze užít dvě povrchové elektrody. Povrchové- elektrody se výhodně užívají s elektrolytovým přípravkem k zajištění dobrého kontaktu a vodivosti, např. kůže, jak bylo zmíněno výše.

Ve specifickém provedení vynálezu -s jednou externí a jednou interní elektrodou, externí elektroda má několik hlav umístěných kolem vnitřní elektrody. V podstatě' obecně pro kteroukoliv konfiguraci zde popsanou jedna z elektrod může mít několik hlav.

Vynález dále zahrnuje uspořádané seskupení elektrod, kde elektrody jsou jehly s otvory po celé své délce, jehly s definovanou a kalibrovanou vodivou délkou (aby -se vytvořila reprodukovatelná konstantní vodivá, oblast ve tkáni, bez ohledu na hloubku penetrace jehly do tkáně) á elektricky izolovanou spodní a horní částí, jehly s izolovanou špičkou, aby se zabránilo vzniku elektrického oblouku ve tkáni, a také φ φ · · φ φ φ ·· ·· φ φ φ Φ ΦΦΦ Φ Φ ΦΦ 9 φφφ Φ ΦΦΦΦΦ φφφφ Φ Φ Φ ΦΦΦΦΦΦ

ΦΦΦ Φ Φ Φ Φ φφφφ «Φ ΦΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦ ΦΦ

25
j akýkoliv	druh váčku/zásobníku	obsahující	přípravek
obklopuj ící	jehlu.
Podobně	jak bylo uvedeno výše	pro jehlové	elektrody,
i destičkové	elektrody mohou mít izolované okraje.

Obecně řečeno, elektrody jsou uspořádány tak, že cílová tkáň leží přímo mezi nimi. Tímto způsobem je nukleová kyselina vystavena maximální intenzitě elektrického pole. Avšak jelikož elektrické pole se rozprostírá všude kolem elektrody, je možné využít pole generované periferně mezi elektrodami stejně jako pole generované přímo mezi elektrodami.

Modifikovaná zařízení dle dosavadního stavu techniky \7e specifickém provedení je zařízení, které má elektrody umístěné ' externě vzhledem k pacientovi (viz např. patenty US č. 5 318 514 (Hofmann), č. 5 439 440 (Hofmann), č. 5 462 520 (Hofmann), č. 5 464 386 (Hofmann), č. 5 688 233 (Hofmann et al.) ač. 5019 034 (Weaver et al.)) modifikováno podle vynálezu, tj . tak, aby dodávalo elektrické pole definovaných vlastností a podmínek, čímž je poskytnut zlepšený přístroj podle předkládaného vynálezu. Zlepšený přístroj lze užít neinvazivně tak, že se elektrody přiloží na kůži pacienta nebo invazivně. tab, že se elektrody přiloží na povrch orgánu, který byl předtím expononován chirurgicky.

Podobně zařízení pro elektropřenos, které užívá implantovatelné nebo vsunovací elektrody, které jsou uvnitř pacienta, kde vytvářejí elektrické pole v oblasti přilehlé k implantovaným/vsunutým elektrodám, zejména katétrové elektrody (viz např. patenty US 5 304 120 (Crandell et al.), 5 507 724 (Hofmannet al.), 5 501 662 (Hofmann), 5 702 359 (Hofmann et al . ) a 5 273 525 (Hofmann)), se může modifikovat • ·· · ·« podle předkládaného vynálezu, čímž vznikne zlepšený přístroj podle vynálezu.

Přirozeně, že elektropřenosové zařízení, které kombinuje rysy obou výše zmíněných systémů,' tj . užívá alespoň jednu externí elektrodu a alespoň jednu interně umístěnou elektrodu k vytvoření elektrického pole v požadované oblasti tkáně (viz např. patenty US 5 286 254 (Shapland et al.), 5 499 971 (Shapland et al . ) , 5 498 238 (Shapland et al. ) , 5 282 785 (Shapland et al.. ) a 5 628 730 (Shapland et al. ) ) , lze také modifikovat podle předkládaného vynálezu tak, že vznikne zlepšený přístroj podle vynálezu.

Genová terapie používající elektropřenosový systém Způsob podle tohoto vynálezu je použitelný pro .genovou terapii, což je terapie, ve které exprese přeneseného genu, ale také modulace nebo blokování genu, . umožňuje zajistit léčení konkrétního patologického stavu.

Buňky tkáně jsou výhodně léčeny pomocí genové terapie umožňující:

• korekci dysfunkcí samotných buněk (například pro léčení nemocí se vztahem ke genetickým vadám jako jsou například mukoviscidóza nebo muskulární dystrofie), • ochranu a/nebo regeneraci vaskularizace nebo inervace tkáni, jako jsou svaly, orgány nebo kost, pomocí trofíckých, neurotrofických, angiogenních nebo protizánětlivých faktorů produkovaných transgenem, • transformaci svalu na orgán . secernující produkty vedoucí k léčebnému účinku, jako je např. produkt genu samotného

- (například regulační faktory hemostázy a faktory ovlivňující trombózu, trofické faktory, růstové faktory, hormony jako inzulín, erytropoetin a leptán apod.) nebo jako je aktivní metabolít syntetizovaný ve- svalu po • * • · • · » a ··

• · · β * ♦ · · « · ♦ · · · přidání léčebného genu, např. pro korekci genetické nemoci sekrecí léčebného produktu, • dodávání protinádorových genů jako jsou nádorové supresory (protein retinoblastomu, p53, p71) , sebevražedné geny (např. HSV-thymidinkináza) , antiangiogenní geny (např. angiostatin, endostatin, amino koncový fragment urokinázy), blokátory buněčného cyklu, apoptotické geny (jako je ΒΑΧ), intracelulární jednořetězcové protilátky a imunostimulační geny, • vakcinaci nukleovou kyselinou nebo imunostimulačním genem.

Zvláštní výhoda použití elektropřenosu v genové terapii systémového problému expresí ve svalu spočívá v mnoha faktorech: ..

• mimořádná stabilita transgenní exprese přesahující několik měsíců, a proto umožňující stabilní a trvalou produkci intramuskulárního nebo secernovaného léčebného proteinu, • snadnost přístupu ke svalové tkáni, což umožňuje přímé, rychlé a bezpečné podání do orgánu, který není životně důležitý, • velký objem svalové hmoty, což umožňuje rozmanitá místa podávání, • prokázaná vydatná sekreční kapacita svalu.

K těmto výhodám lze přidat bezpečnost lokální léčby spojenou s použitím místních a cílených elektrických polí.

Při bezpečnosti, která doprovází použití slabých polí, může být tento vynález aplikován i na srdeční sval pro léčbu srdečních chorob, např. při použití srdečního rytmu pro .zajištění bezpečného elektropřenosu (viz patent

US 5 634 899). Může být také použit pro léčbu restenózy pomocí exprese genů 'inhibu j ící ch proliferaci buněk hladkého svalstva, jako je protein GAX.

• · * · « » · I • ·· • · a • · a <· · · ·<

• · · dávkách dochází buď nebo je přípravek

Kombinace polí nízké intenzity a dlouhotrvajícího podávání, aplikované obzvláště na tkáně in vivo, zesilují transfekci nukleových kyselin, aniž by způsobily významné poškození tkáni. Tyto výsledky zvyšují účinnost přenosu DNA v genové terapii používající nukleové kyseliny.

Výhodou vynálezu je tudíž to, že k vytvoření přípravku ve fyziologických a/nebo léčebných v tkáních nebo v jejich blízkosti, systémově secernován do krevního či lymfatického oběhu. Kromě toho vynález poprvé umožňuje jemnou modulaci a kontrolu účinného množství exprimovaného transgenů pomocí možnosti regulovat objem transfekované tkáně, například počtem míst podáváni nebo dokonce možností regulovat počet, tvar, povrch a uspořádání elektrod. Další kontrolní prvek vychází z možnosti regulovat účinnost transfekce kolísáním intenzity pole, počtu, trvání a frekvenci pulsů a ovšem, podle stavu techniky, množstvím a objemem podávaných nukleových kyselin. Konkrétní výhoda předkládaného vynálezu je vynikající křivka závislosti reakce na dávku dosažená pro přenos DNA, které nedosáhla žádná z metod dosavadního stavu techniky. Může se tak získat úroveň transfekce odpovídající úrovni produkce v tkáních nebo požadovaná sekrece. Konečně způsob zaručuje mimořádnou bezpečnost ve srovnání s chemickými nebo virovými metodami genového přenosu in vivo, při kterých nemůže být zcela vyloučeno a kontrolováno zasažení orgánů jiných než je cílový orgán. Ve skutečnosti způsob podle vynálezu umožňuje kontrolu lokalizace transfekované tkáně (naprosto jasně spojené s obj-emem tkáně podrobené lokálním elektrickým pulsům), a proto zavádí možnost suprese transgenní exprese pomocí úplné nebo částečně ablace tkáně, která je možná, protože určité tkáně nemají klíčový význam nebo mohou regenerovat, nebo platí obě možnosti, jako v případě svalu.

9 9 • · · *

9 9 9

999 999

9

9 9 9 • · • · · * • ·· • · · 9 • 99

99 9 ·♦ • 99 9 ·

• · • ·

9 99 9 9

Velká flexibilita použití umožňuje optimalizovat způsob podle druhu zvířete (použití pro veterinární účely a pro léčbu člověka), věku pacienta a jeho či jejího věku nebo fyziologického a/nebo patologického stavu.

Způsob podle vynálezu dále poprvé umožňuje transfekovat nukleové kyseliny značné, velikosti, na rozdíl od virových metod, ve kterých je velikost transgenu limitována velikostí virového genomu, který se vejde do kapsidy. Tato možnost je podstatná pro přenos značně velikých genů jako je dystrofin nebo obecně geny s introny a/nebo značně.velikých regulačních prvků, které jsou nezbytné například pro fyziologicky regulovanou tvorbu hormonů. Dále je tato možnost základní pro přenos arteficiálních kvasinkových epizomů nebo chromozomů či minichromozomů.

Dalším cílem vynálezu je spojení elektrických pulsů určitého napětí s přípravky obsahujícími nukleové kyseliny formulovanými s ohledem na podávání, což umožňuje dosáhnout tkáně aplikací topickou, perkutánní, perorální, vaginální, parenterální, intranazální, intravenózní, intramuskulární, subkutánní, intraokulární, transdermální apod. Farmaceutické přípravky vynálezu obsahují farmaceuticky přijatelný nosič pro přípravek pro injekce, zejména pro přímou injekci do požadovaného orgánu nebo pro každé jiné podávání. Může zahrnovat zejména sterilní izotónické roztoky nebo suché přípravky, zejména lyofilizované, které po přidání například sterilní vody nebo fyziologického roztoku vytvoří přípravky roztoků pro injekce. Dávky nukleových kyselin použité pro injekci, jakož i počet podávání a objem injekcí, mohou být upraveny podle různých parametrů a obzvláště dle způsobu podávání, příslušné patologie, exprimovaného genu nebo trvání požadované léčby.

0 0 0

I 0 0 0

0 0

0 0 0

0 0

1000 0·

Cílové tkáně

Původci předkládaného vynálezu zjistili, že optimální podmínky pro genový přenos podle vynálezu se liší v závislosti na cílové tkáni. Například bylo zištěno, že elektrické pole intenzity 200 V/cm značně zesiluje genový přenos do svalových buněk. Za těchto podmínek se uskuteční také významný genový přenos do nádorových buněk (ve specifických pokusech vylo pozorováno trojnásobné zvýšení genového přenosu), ale přenos genů do nádorových buněk je účinnější v elektrickém poli 400 V/cm (zvýšení účinnosti genového přenosu řádově 2 log) . V dalších pokusech bylo. pro genový přenos do nádorových buněk optimální elektrické pole o intenzitě 500 V/cm.

Proto může být podle předkládaného vynálezu vytvořen systém nebo zlepšený přístroj pro přenos nukleových kyselin do svalových buněk (a dalších velkých' buněk) a může být vyvinut systém nebo zlepšený přístroj, který má různé parametry intenzity elektrického pole pro přenos genů do nádorových buněk (a dalších malých buněk) .

Pro přenos nukleových kyselin do svalových buněk, systém nebo zařízení podle vynálezu vytváří napěťový gradient 1 až 400 V/cm, výhodně 4 až 400 V/cm, výhodněji 30 až 300 V/cm. Ve specifických provedeních je napěťový gradient 100 až 200 V/cm. Uvažuje se . zejména o sysrémech nebo přístrojích poskytujících napěťový gradient, který nepřekročí 200 V/cm.

Pro přenos nukleových kyselin do nádorových buněk vytváří systém nebo. přístroj vynálezu napěťový gradient mezi 1 a 600 V/cm, výhodně 100 až 600 V/cm, výhodněji 400 až 600 V/cm. Ve specifických provedeních je napěťový gradient 400 až 500 V/cm, a výhodně přibližně 500 V/cm. -Uvažuje se zejména o systémech nebo přístrojích poskytujících napěťový gradient, který nepřekročí 600 V/cm.

φ · φ φ φφφ φφφφ φφ φφ φφ φφφ

Nukleové kyseliny

Nukleové kyseliny mohou biosvntetického prokaryotických z jednobuněčných být syntetického nebo původu, nebo extrahované z virů nebo nebo eukaryotických buněk pocházejících organismů (např. kvasinek) nebo mnohobuněčných organismů. Mohou být podávány spojené úplně nebo částečně se složkami původních organismů a/nebo systému syntézy.

Nukleová kyselina může- být deoxyribonukleová kyselina nebo ribonukleová kyselina. Může zahrnovat sekvence přirozeného původu nebo arteřiciální sekvence a zejména genomovou DNA, cDNA, mRNA, tRNA a rRNA, hybridní sekvence nebo syntetické či semisyntetické sekvence oligonukleotidů, modifikované či nikoliv. Tyto nukleové kyseliny mohou být získány jakoukoliv metodou odborníkovi známou, a to obzvláště klonováním, chemickou syntézou nebo dokonce smíšenými metodami, včetně chemické nebo enzymové modifikace sekvencí získaných klonováním. Mohou být modifikovány chemicky.

Konkrétně může být nukleová kyselina DNA nebo RNA typu sense nebo antisense nebo RNA· s katalytickou vlastností jako ribozym. „Antisense RNA je nukleová kyselina, která má sekvenci komplementární k cílové sekvenci, např. mRNA sekvenci, a která hybridizací blokuje expresi cílové sekvence. „Sense se týká nukleové kyseliny, která, je sekvenčně homologická nebo která je totožná s cílovou sekvencí jako je např. sekvence spojená s proteinovým transkripčním faktorem a zapojená do exprese daného genu. Podle jednoho výhodného '-provedení obsahuje nukleová kyselina požadovaný gen a prvky umožňující expresi uvedeného genu. Fragment nukleové kyseliny je výhodně ve formě plazmidu.

99

Β 9 9 9

Β 9 9 9 • 99 999

9

9 9 9 >· 99 • · 9

99

9 9 9

Deoxyribonukleová kyselina může být jedno nebo dvouvláknová, jako např. krátké oligonukleotid,y nebo delší sekvence. Mohou nést geny, sekvence regulující transkripci nebo replikaci, nebo oblasti pro vazbu s dalšími buněčnými složkami, apod. Takové geny mohou obsahovat markerové geny, tj . geny, které produkují detekovatelnou značku pro sledování buněčné funkce, migrace nebo funkce genu, terapeutický (léčebný) gen, gen ochranného antigenu nebo imunogenu· apod. Podle' vynálezu se termín terapeutický gen nebo též „léčebný gen týká zejména každého genu kódujícího RNA nebo proteinový produkt mající léčebný účinek. Kódovaný proteinový produkt může být protein, peptid apod. Tento proteinový produkt může' být s cílovou buňkou homologní (tj . produkt, který je normálně exprimován v cílové buňce, když .nevykazuje žádnou patologii). V tomto případě transgenní exprese například umožňuje překonat nepřiměřenou expresi v buňce nebo expresi proteinu, který je z důvodu modifikace inaktivní nebo málo aktivní, nebo také umožňuje uvedený protein exprimovat nadměrně. Terapeutický gen může také kódovat mutantu buněčného proteinu, která má zvýšenou stabilitu, modifikovanou stabilitu apod. Proteinový produkt může být také s cílovou buňkou heterologní. V tomto případě muže exprimovaný protein například doplnit nebo vnést do buňky chybějící aktivitu (léčení myopatií nebo enzymových deficitů), nebo umožní bojovat proti patologii, či stimulovat imunitní reakci, například při léčení nádorů. Může také obsahovat tzv. sebevražedný gen (thymidinkinázu herpetického viru) pro léčbu rakoviny nebo restenózy.

Nukleová kyselina výhodně obsahuje také sekvence umožňující a/nebo napomáhající expresi léčebného genu a/nebo genu kódujícího antigenní peptid v tkáni. Může zahrnovat sekvence, které jsou přirozeně odpovědné za expresi uvažovaného genu, když jsou tyto sekvence schopné fungovat

99 » 9 9 9

I 9 9 9

999 999

9

99 ► 9 «9

9 9

99

9 · ♦ v transfekované buňce. Může také zahrnovat sekvence různého původu (zodpovědné za expresi jiných proteinů nebo dokonce syntetické sekvence). Může zahrnovat zejména promotorové sekvence eukaryotického nebo virového genu. Například může obsahovat promotorové sekvence pocházející z genomu buňky, kterou je žádoucí transfekovat. Z eukaryotických promotorů se mohou použít ·induktorové nebo .represorové sekvence pro zajištění specifické exprese genu. Mohou být použity silné •nebo slabé, konstitutivní nebo indukovatelné promotory. Ke konstitutivním promotorům patří . promotory genů pro, HPRT, vimentin, α-actin, tubulin a další promotory. Mohou být použity tkáňově specifické promotory (elongační faktor-1-α, fit, flk) . Indukovatelné promotory zahrnují promotory responzivní na hormony (jako jsou steroidní receptory kyseliny retinové) nebo promotory antibiotiky (tetracyklin, rapamycin apod.) přirozené či syntetické molekuly. Mohou také zahrnovat promotorové sekvence pocházející · z genomu viru. V této souvislosti se mohou například uvést promotory genů EIA, MLP, CMV, RSV apod. Dále mohou být tyto expresní sekvence modifikovány přidáním sekvencí pro · aktivaci, regulaci, umožňujících podmíněnou, přechodnou nebo dočasnou expresi, tkáňově specifickou expresi nebo obecnou expresi apod.

Kromě : toho může nukleová kyselina také obsahovat, zejména nad léčebným genem, signální sekvenci zaměřující syntetizovaný léčebný produkt do sekrečních vývodů cílové buňky. Tato signální sekvence může být přirozená signální sekvence léčebného produktu, ale může také obsahovat jakýkoliv jiný funkční signál, nebo arteficiální signální sekvenci. Nukleová kyselina může také obsahovat signální sekvenci směřující syntetizovaný léčebný produkt do receptory, regulované nebo další

ti ti ti ti • titi ti tititi tititi • ti konkrétního buněčného kompartmentu, jako jsou například mitochondrie pro léčení mitochondriální genetické nemoci.

Terapeutické geny a genové produkty

Z léčebných produktů podle vynálezu se mohou konkrétně uvést enzymy, proteiny krve, hormony jako je inzulín nebo růstový hormon, lymfokiny, interleukiny, faktory nekrotizující nádory (TNF) apod. ' (francouzský patent č. 92 03210), růstové faktory, např. angiogenní faktory, jako jsou VEGF nebo FGF.

Pro léčení neuropatií mohou být systémem vynálezu podávány geny kódující ' neurotransmitery (nervové přenašeče) nebo jejich prekurzory nebo enzymy, které syntetizuji neurotransmitery, trofické faktory, zejména neurotrofické faktory pro léčení neurodegenerativních nemocí, poškození nervového systému způsobené úrazem nebo poraněním, nebo degradace retiny. Například členy rodiny neurotrofických faktorů zahrnují, ale nejsou na, ně omezeny, nervový- růstový faktor (NGF), mozkový neurotrofický faktor - (BDNF), neurotrofin-3 (NT3), NT4/5, NT6 (včetně alelických variant a členů téže rodiny genů). Další neurotrofiny zahrnují členy rodiny ciliárního neurotrofického faktoru, včetně ciliárního neurotrofického faktoru (CNTF), axokinu, leukemického inhibičního faktoru, další faktory zahrnují IL-6 a příbuzné cytokiny, kardiotrofin a příbuzné geny, gliový neurotrofický faktor (GDNF) a příbuzné geny,' a členy rodiny růstového faktoru podobného inzulínu (IGF), jako jsou IGF-i, IFGF-2, členy rodiny fibroblastového růstového faktoru, jako jsou FGF1 (kyselý FGF), FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9 apod., členy rodiny nádorového růstového faktoru, jako je TGFp, HARP/pleotřopin, nebo kostní růstové faktory, hemopoetícké faktory apod.

·· • · · • ·· • · · · > · ·

I · · ·· ·· ·· • · · ► 4 9 « ·· · ···

Další vhodné geny kódují léčebně prospěšné svalové proteiny, jak secernované, tak nesecernované, jako’ je dystrofin nebo minidystrofin (francouzský patent č. 91 11947) nebo α-1-antitrypsin.

Další vhodné geny kódují faktory, zapojené do koagulace: faktory VII, VIII, IX, sebevražedné geny (thymidinkináza, cytosindeamináza), geny hemoglobinu nebo jiných proteinových nosičů. V ještě dalším provedení mohou být podávány geny odpovídající proteinům zapojeným do metabolismu lipidů, například apolipoproteinového typu vybrané z apolipoproteinů A-I, A-II, A-IV, B, C-l, C-ΙΪ, C-ΪΙΙ, D, E, F, G, H, J a apo(a), a metabolických enzymů, jako jsou například lipoproteinová lipáza, jaterní lipáza, lecitincholesterolacyltransferáza, 7-alfacholesterolhydroxyláza, kyselá f o s f 3. t i dy 1 f o s f 31 á z a. ₍ nsbo dokonce lipidové tnsnsf enové proteiny, jako je transferový protein esterů cholesterolu, a transferový protein fosfolipidů, protein vázající HDD nebo dokonce vybraný receptor, například z receptorů LDL, chylomikronových zbytkových receptorů a scavenger receptoríi apod. Dále se může přidat leptin pro léčbu obezity. Může se také přidat antionkogen p53 nebo jiné nádorové supresory, jako je HSV-tk nebo dokonce protein GAX, omezující buněčnou proliferaci ve hladkém svalstvu (léčení restenózy).

Další požadované geny zahrnují angiogenní faktory, včetně vaskulárních endotelových růstových faktorů (VEGF, ÍČEGF-2, VEGF-3, destičkové, růstové' faktory) a angiostatinu. Na druhé, straně se může provádět podávání genů kódujících inhibitory angiogeneze, zejména nádorové angiogeneze, jako jsou rozpustné receptory angiogenních faktorů, specifické inhibitory receptorů angiogenních faktorů (Tie2, urokinázový receptor, firl, KDR), protilátky (včetně j ednořetězcových •4 44 4 44 44 44 • 44 4 4 4 4 . 4 4 44 4

44 4 4444«

44 4 4 4 444444

4 4 4 4 4 4

4444 44 444 4444 44 44

Fv protilátek) proti angiogenním faktorům (např. anti-VEGF nebo anti-FGF), anti-integrinové ' protilátky, toxiny specifické pro endotelové nádory, polypeptidové inhibitory angiogeneze .(aminokoncový fragment urokinázy - ATF, angiostatin, endostatin, interferon-α nebo β, interleukin-12, destičkový faktor 4, TNFa, trombospondin, destičkový aktivační faktor (PAI)-l, PAI2, TIMP1, fragment prolaktinu apod.

Z dalších proteinů nebo peptidů, které mohou být secernovány tkání nebo toutéž tkání tvořeny, je ^; důležité zdůraznit protilátky, variabilní fragmenty jednořetězcových protilátek (ScFv) nebo jakýkoliv další protilátkový fragment, který má rozpoznávací funkce pro použití v imunoterapii, např. pro léčbu infekčních nemocí, nádorů a autoimunitních chorob, jako je inzulární skleróza ('anti-idiotypové protilátky). Další vhodně proteiny jsou, aniž by výčet byl omezující, rozpustné receptory jako například rozpustný receptor CD4 nebo rozpustný receptor TNF pro anti-HIV léčbu, rozpustný receptor TNF (zejména rozpustný receptor TNFa) pro léčbu revmatoidní artritidy a acetylcholinový rozpustný receptor pro léčbu myastenie, substrátové peptidy nebo inhibitory enzymů, nebo dokonce agonisté receptorů nebo peptidoví antagonisté nebo adhezivní proteiny, jako například pro léčení astmatu, trombózy, restenózy, metastáz nebo zánětů (například IL-4 pro zmenšení buněčné reakce Thl buněk, IL-10 a IL—13) a arteficiální, chimérické nebo zkrácené proteiny.

Z hormonů základního významu se může uvést inzulín v případě diabetů, růstový hormon a kalcitonin.

Pro zesílení protinádorové nebo protiinfekční. imunitní reakce se mohou doplnit gený kódující· imunostimulační cytokiny, včetně IL-2, IL-12, faktorů stimulujících kolonie (GM-CSF, G-CSF, M-C'SF), makrofagových zánětlivých faktorů

00 00

0 0 0 0 0

0 0 0 • 0 · ·

I · · 0

00

0 0 0

0 0 »00 0 00 • 0

0

0 0« (MIP1, MIP2), aktivačních faktorů dendritických buněk (ligand f lt3) apod.

Další vhodné geny byly popsány McKusickem, V. A.., (Mendelian Inheritance in man, catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked phenotypes, 8. vydáni, Johns Hopkins University Press, 1988) a Stanburym, j.B. et al. (The metabolic basis of inherited- disease, 5. vydání, McGraw-Hill, 1983). Požadované geny pokrývají proteiny zapojené do metabolismu aminokyselin, lipidů a dalších buněčných složek.

Mohou se také uvést geny spojené s chorobami metabolismu sacharidů, jako například fruktózo-l-fosfátaldoláza, fruktózo.-l, 6-difosfatáza, - glukózo-6-fosfatáza, íysozomální o-l, 4-glukosidáza, amylo-1,6-glukosidáza, amylo-(1,4:1,6)transglukosidáza, svalová fosforyláza, svalová ' fosfofruktokináza, fosforyláza-p-kináza, galaktózo-l-fosfáturidy1transferáza, všechny enzymy komplexu pyruvátdehydrogenázy, pyruvátkarboxyláza, 2-oxoglut.arát/glyoxylátkarboxyláza, a D-glyceroldehydrogenáza.

Mohou se také uvést: ’

- Geny spojené s nemocemi aminokyselinového metabolismu, jako například fenylalaninhydroxyláza, dihydrobiopterinsyntetáza, tvrosinaminotransferáza, tyrosináza, histidináza, fumarylacetoacetáza, glutathionsyntetáza, γ-glutamylcysteinsyntetáza, ornithín-d-aminotransferáza, karbamoylfosfátsyntetáza, ornithinkarbamoyltransferáza, argininosukcinátsyntetáza, arginosukcinátlyáza, argináza, L-lysindehydrogenáza, L-lysinketoglutarátreduktáza, valintransamináza, leucin/isoleucintransamináza, dekarboxyláza 2-ketokyselin s rozvětveným řetězcem; isovaleryl-CoAdehydrogenáza, acylCoAdehydrogenáza, 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAlyáza, acezoacetyl-CoA-3-ketothioláza, propiony1-CoA-karboxyláza, ·· ·· 99

9 9 9 9 9

9 9 9 9

9 999 99 t

9 9

9999 99 99 • · · * . · · » ·· ' 9

9 9

9999 99 (ATP:kobalamin)adenosyltransferáza, , metylentetrahyarofolátreduktáza, komplex sarkosindehydrogená zy, systému štěpícího glycin, sérová karnosináza, a metylmalonyl-CoA-mutáza, dihydrofolátreduktáza, cystathionin-p-syntetáza, do cerebrální proteiny patřící β-alanintransamináza, homokarnosináza.

- Geny se vztahem k nemocím metabolismu tuků a mastných kyselin, jako například lipoproteinová lipáza, apolipoprotein 'C~II, apolipoprotein E, další apolipoproteiny, lecitin cholesterolacetyltransferáza, LDL receptor, jaterní sterolhydroxyláza a a-hydroxyláza kyseliny řytanové.

Geny se vztahem k lysozomálním deficitům, jako například lysozomální ' a-L-iduronidáza, lysozomální iduronátsulfatáza, lysozomální heparan-N-sulřatáza, lysozomální N-acetyl a-D-glukózoaminidáza, lysozomální acetyl-CoA:a-glukozamin-N-acetyltransferáza, lysozomální

N-acetyl-a-D-glukozamin-6-sulfatáza, lysozomální galaktózoamin-6-sulfátsulfatáza, ' lysozomální . β-galaktosidáza, lysozomální arylsulfatáza B, lysozomální β-glukuronidáza, N-acetylglukózoaminvlfosfo-transferáza, lysozomální a-Dmanosidáza, lysozomální α-neuraminidáza, lysozomální lysozomální α-L-fukosidáza, lysozomální kyselá ceramidáza, lysozomální sfingomyelináza, lysozomální glukocerebrosidáza a lysozomální galakto-cerebrosidáza, lysozomální galaktosvlceramidáza, lysozomální arylsulfatáza A, a-galaktosidáza A, lysozomální kyselá β-galaktosidáza, a řetězec lysozomální hexosaminidázy A.

- Mohou se také uvést, bez omezení, geny se vztahem k onemocněním steroidního a lipidového metabolismu, geny se vztahem k onemocněním purinového ' a pyrimidinového metabolismu, geny se vztahem k onemocněním metabolismu aspartylglukozaminidáza, lysozomální kyselá lipáza, • 4

4 · 4 • · · a«i« 44

4 4

4 4 4 • · · ·

444 444

4 • 4 44 porfyrinu a hernu, a geny se vztahem k onemocněním pojivové tkáně, metabolismu svalů a kostí, a také geny se vztahem k onemocněním krve a hematopoézy, svalů (myopatie), nervového systému (neurodegenerativní choroby) nebo oběhového systému (například léčení ischémie a stenózy) .

Četné příklady uvedené výše a ty, které následují, ilustrují potenciální rozsah oblasti aplikace tohoto vynálezu. Příklady níže demonstrují expresi každého z následujících faktorů.

Elektropřenos NT3.

Mezi vysoce žádoucími geny pro elektropřenos do svalové tkáně je neurotrofin 3 (NT3). Bylo .už zjištěno, že NT3 podávaný intramuskulárně v adenovirovém vektoru nebo v nevirovém vektoru zvyšuje přežití myší pmn (Haase -et al. , Nátuře, 3, '429-436, 1997) . To je užitečný zvířecí model pro amyotrofickou laterální sklerózu (.ALS) obecně nazývanou „Lou Gehringova nemoc. Očekává se, že léčení této zrádné nemoci pomocí NT3 genové terapie bude značně .usnadněno podáváním NT3 elektrotransferem, který zajistí adekvátní, reprodukovatelnou expresi tohoto trofického faktoru.

Elektropřenos kyselého FGF nebo VEGF.

Další vysoce žádoucí gen pro elektrotransfer do svalové tkáně je kyselý FGF (aFGF, ECGF) nebo vaskulární endotelbvý. růstový .faktor (VEGF) . Bylo objeveno, že oba z nich jsou účinné v léčbě arteriálních stenozujících okluzivních onemocnění. Očekává se, že léčení tohoto onemocnění s aFGF nebo VEGF elektrotransferem zesílenou genovou terapií dále zvýší účinnost vaskulárního růstu. Rytmickou aplikací elektrického pole, zejména pomocí aktivního srdečního rytmu, bude také možná léčba ischemické choroby srdeční.

Léčebná nukleová kyselina může být také gen nebo aneisense sekvence, jejíž exprese v cílové buňce umožňuje ·· »· « · · • ·· • · • · ···· ·· • ·· ·· ·· ·· · · · ♦ · * • · · · · · • 9 9 999 999

9 9 9

999 9999 99 99 kontrolovat genovou expresi na úrovni transkripce buněčné mRNA. Takové sekvence mohou být například transkribovány do RNA komplementující buněčné mRNA cílové buňky, a,tak blokovat translaci jejich proteinů, a sice podle metody popsané v evropském patentu č. 140 308. Léčebné geny také zahrnují sekvence kódující ribozymy, které jsou schopné selektivně zničit cílové RNA (evropský patent č. 321 201).

Imunogenní geny a vakcíny

Jak bylo již uvedeno výše, nukleová kyselina může také obsahovat jeden nebo více genů kódujících imunogenní nebo antigenní peptid, který je schopný vyvolat imunitní reakci u člověka nebo u zvířete. V tomto konkrétním provedení vynález tudíž umožňuje vakcinace nebo léčení imunoterapeutiky aplikované . na člověka nebo na zvíře, zejména proti mikroorganismům, virům nebo rakovině. Obzvláště může zahrnout speciřické antigenní peptidy viru Epstein-Barrové, viru HIV, (evropský patent č. 185 573), viru tvořící syncyťia, další viry nebo dokonce specifické nádorové antigeny, jako jsou proteiny MÁGE (evropský.patent č. 259 212) nebo antigeny schopné stimulovat reakci proti nádorům, jako jsou bakteriální proteiny tepelného šoku.

viru hepatitidy B pseudorabies, „viru

Vektory

Ve způsobu podle vynálezu může být nukleová kyselina spojena s každým typem vektorů nebo s každou kombinací těchto vektorů, která umožní zesílit genový přenos, např. (aniž by výčet byl omezující), do vektorů, jako jsou viry, syntetické nebo biosyntetické přípravky (např.' lipid, polypeptid, glykosid nebo polymer), či dokonce navázání na částice, nebo propulzní částice. Nukleové kyseliny mohou být . také • «

• · · · • · · 4» injikovány do tkáně, která podstoupila ošetření namířené na zesílení genového přenosu, např. ošetření farmakologické povahy v aplikaci lokální nebo systémové, nebo ošetření enzymem, permeabilizující (použití surfaktantů), chirurgické, mechanické, tepelné nebo fyzikální ošetření.

Příklady, které následují, vynález podrobněji vysvětlují a ilustrují, aniž by ho jakkoliv omezovaly.

Příklady provedení vynálezu

Pří klad 1

Standardní podmínky elektroporace ’ ,

Byly testovány standardní podmínky elektroporace, např. podmínky popsané v patentech US 5,468,223, 5,304,120,

5,507, 724, 5,273,525, 5,318/514

5,439,440-, - 5,462,520,

5, 464,386, 5, 019,034, a 5,389,069, a mezinárodní patentové přihlášce WO 97/07826, které již byly zmíněny výše, a bylo zjištěno, že projevují velmi malou účinnost a dokonce někdy i inhibici, přenosu nukleové kyseliny (plazmidové DNA) do pruhovaného svalstva. ^: '

Materiály a metody

V tomto příkladu byly užity následující produkty:

DNA pXL2774 (patentová přihláška PCT/FR 96/01414) je plazmidová DNA obsahující gen luciferázy jako reportérový gen. Ostatní použité produkty jsou běžně komerčně dostupné: ketamin, xylazin, fyziologický roztok (NaCl 0,9 %).

Byl použit běžný komerční osciloskop a generátor elektrických pulzů (obdélníkových nebo čtvercových kmitů) (ELECTROPULSATOR PS 15, Jouan, Francie). Eletrody byly ploché elektrody z nerezové oceli vzdálené od sebe 5,3 mm. byly provedeny na myších

Pokusy pocházející z různých klecí promíchány (randomizace).

Myši byl anestetizovány

C57 Bl/6 . myši byly před pokusech náhodně směsí ketaminu xylazinu.

Roztok plazmidu (30 mg/ml v roztoku s 500 mg/ml 0,9% NaCl) byl injikován skrz kůži podélně do horního lýtkového svalu pravé i levé končetiny pomocí stříkačky Hamilton. Elektrody byly potřeny vodivým gelem a injikovaná končetina byla pak umístěna mezi elektrody, tak aby s nimi byla v kontaktu.

Elektrické pulzy byly aplikovány kolmo na osu svalu pomocí generátoru obdélníkových pulzů jednu minutu po injekci! Pomocí osciloskopu se sledovalo napětí ve voltech, V (hodnoty uváděné v příkladech představují maximální hodnoty), trvání pulzu v milisekundách, ms, a frekvenci v hertzech, Hz, přičemž frekvence byla 1 Hz. Bylo aplikováno 8 po sobě jdoucích pulzů.

Pro vyhodnocení transfekce svalu byly myši utraceny sedm dní po podání palzmidu. Horní lýtkový sval obou končetin byl vyjmut, zvážen, umístěn do lyzovacího pufru a rozmělněn. Suspenze byla centri fugována a byl tak získán čistý supernatant. Měření aktivity luciferázy se provádělo v 10 ml supematantu pomocí komerčního luminometru, ve kterém se přidával k roztoku substrát. Intenzita je uvedena v relativních jednotkách (RLU) celkový, objem suspenze. Každý pokus byl tj . 5 zvířat bylo injikováno oboustranně.

automaticky luminiscence zohledňuj ících opakován 10 x, Statistické vyhodnocení bylo provedeno pomoci neparamatrických testů, • · *· • · · • · » «

I I ··

Výsledky a diskuse

Výsledky jsou ilustrovány dvěma obrázky, kde je užito buďto lineární nebo logaritmické měřítko (Obr. 1).

V prvním pokusu se testovaly účinky elektrického pole 800 až 1200 V/cm, což jsou podmínky užívané při elektroporaci nádorů (Mir et al. , Eur. J. Cancer 27, 68, 1991, patent

US 5 468 223).

Bylo pozorováno (viz obr. 1),' ve srovnání s kontrolní skupinou, kde byla injikována DNA bez eletrických pulzů, že • s osmi pulzy 1200 V/cm a délkou 0,1 ms průměrná hodnota aktivity luciferázy byla mnohem nižší, • s pulzy 1200 ,, V/cm a délkou 1 ms tři zvířata uhynula a navíc průměrná aktivita luciferázy byla mnohem nižší, • s pulzy 800 V/cm a délkou í ms byla průměrná hodnota luciferázové aktivity také významně snížena.

Většina svalů,· které prodělaly působení elektrického pole, byla viditelně změněna (svaly byly drobivé a bělavého vzhledu).

Příklad 2

Elektropřenos nukleových kyselin

Tento pokus byl proveden na myších C57 Bl/6. Až na intenzitu elektrického pole a jeho trvání byly podmínky shodné s příkladem 1.

Výsledky jsou uvedeny na obr. 2. Byl reprodukován výsledek příkladu 1, tj . inhibující účinek 8 pulzů intenzity 800 V/cm a délky 1 ms na aktivitu luciferázy byl detekován ve svalu. S polem intenzity 600 V/cm' byla zjištěna stejná inhibice a stejné změny svalové tkáně. Ale kratší pulzy při • » « · • · · · · * • 0 · ······ • · . · · ·····« ·» · · • · • · stejném .napětí pravděpodobně alespoň zabránily poškození tkáně a zlepšily přenos DNA. Avšak velmi překvapivě snižování napětí vedlo k tomu, že svalová tkáň nebyla změněna a při 400 a 200 V/cm byla míra transfekce svalů v průměru vyšší než u svalů bez aplikace elektrického pole. Je třeba poznamenat, že ve vztahu ke kontrolní skupině (nebyla - vystavena působení elektrického pole) rozptyl hodnot luciferázové aktivity je významně snížen při 200 V/cm (střední chyba průměru je 20,59 % ve srovnání s hodnotou 43,32% v nepřítomnosti elektrického pole, viz obr. 2A).

Jak je odborníkovi zřejmé, tato data potvrzují, že přístroj pro elektropřenos dle dosavadního stavu techniky může být modifikován podle vynálezu, čímž. vznikne systém nebo přístroj podle vynálezu. Ačkoliv je modifikace' jednoduchá, výsledek je zcela neočekávaný. Systém nebo přístroj podle vynálezu poskytuje, neočekávané zlepšení jak účinnosti tak i reprodukovatelností přenosu nukleové kyseliny, jak je předvedeno pokusy s přenosem plazmídové DNA v tomto a také v následujících příkladech.

Příklad 3

Elektropřenos zvyšuje expresi transgenu

Tento pokus byl proveden na myších C57 Bl/6. Až. na intenzitu elektrického pole a jeho trvání, a skutečnost, že pulzy byly aplikovány 25 vteřin po injekci DNA, byly podmínky shodné s předchozími příklady.

Výsledky jsou uvedeny na obr. 3. Průměrné hodnoty exprese transgenu luciferázy byly výrazně zvýšeny při trvání pulzu '20 ms při 100 V/cm, počínaje pulzy s 5 ms při 200 V/cm.

• · o « t « « · » * ·· ·

Pokus ' také jasně ukázal, že průměrná hodnota luciferázové aktivity získané - po eletrotransfekci DNA do svalu je funkcí trvání elektrických pulzů, pokud se užije napětí 200 až 100 V/cm. Bylo také pozorováno, že rozptyl hodnot luciferázové aktivity byl významně snížen u skupiny, kde byla aplikována elektrotransfekce (obr. ¹ 3A) . V nepřítomnosti elektrického pole (kontrola) střední chyba průměru byla 77, 43 % průměrné hodnoty, zatímco se snížila na 14% při aplikaci pole 200 V/cm s^r dobo pulzu 5 ms a na 41,27 % při aplikaci pole 200 V/cm a době pulzu 20 ms a na 30 a 48% při elektropřenosu v poli 100 V/cm.

V nej lepších podmínkách tohoto pokusu byla zvýšena exprese transgenu o 89,7 % vzhledem ke kontrole injikované bez aplikace elektrických pulzů.

Příklad 4

Zvýšení exprese 200x

Tento experiment . byl proveden na myších DBA 2 a elektrickými pulzy 200 ’V/cm s různou délkou. Ostatní podmínky byly shodné jako v příkladu 3.

Příklad potvrdil, že při 200- V/cm se transfekce luciferázy zvyšuje, když se zvyšuje trvání pulzu nad 5 ms (obr. 4 a 5) . Bylo pozorováno snížení vnitroskupinové variability detekované hodnotou střední chyby průměru, u skupiny s elektrotransfekci ve. srovnání s kontrolou. Relativní hodnoty střední chyby průměru byly 35 % pro kontrolu a 25, 22, 16, 18 a 26 % pro série pulzů s dobou 1, 5, 10, 15, 20 a 24 ms, v uvedeném pořadí. V optimálních podmínkách v tomto pokusu byla zvýšena exprese transgenu • · » « ··

205 χ vzhledem.ke kontrole injikované bez elektrických pulzů.

Výsledky pokusu potvrdily, že elektropřenos v těchto podmínkách významně zlepšuje jak účinnost tak i reprodukovatelnost.

• Φ 99 94

4 4 4 4 9

4 4 4 9

4 449 444

4 4

4949 99 99

Příklad 5

Kvantifikace účinnosti přenosu

Obr. 5 slouží - za příklad důležitosti parametru odpovídajícího součinu počet pulzů x intenzita pole x trvání každého pulzu. Tento parametr ve skutečnosti odpovídá integrálu funkce, která popisuje změny elektrického pole v čase. .

Data uvedená na obr. 5 byla získána v průběhu pokusů v příkladech 2, 3 a 5. Byly hodnoceny intenzity elektrického pole 200 V/cma 100 V/cm a kontrola bez elektrického pole. Údaje ukazují, že účinnost transfekce roste jako funkce součinu celkové doby expozice elektrickému poli a intenzity pole. Zlepšení přenosu nukleové kyseliny bylo dosaženo při hodnotě přesahující 1 kV x ms/cm. Podle výhodného provedení vynálezu stimulace je dosaženo pro hodnoty součinu elektrické pole x celková doba trvání pulzů shodné nebo vyšší než 5 kV x ms/cm.

φφ φφ • « φ φ > φ φ φ φ · φ φ φ *

I ΦΦ φ Φ Φ

Příklad 6

Široká využitelnost elektropřenosu

Byly provedeny další pokusy, získané v příkladech 2 až 5. A podstatné zlepšení přenou genů u myší, potkana a králíka při aplikaci elektrických pulzů s nízkým napětím. Použité podmínky přitom byly dříve popsány jako neúčinné u jiných typů buněk jako jsou nádorové, kožní nebo jaterní buňky.

V tomto příkladu byly zkoumány následující parametry:

• Charakteristiky elektrického pole: napětí/cm, počet, frekvence a trvání pulzů, nej lepší podmínky pro horní lýtkový sval myši byly 200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms s fekvencí 1 až 2 Hz.

• Tvar/typ elektrod: většina pokusu byla provedena s neinvazivními destičkovými elektrodami, vhodnost jehlových elektrod byla ověřena v pokusu na králíkovi.

• Množství DNA: v podmínkách nejvhodnějších pro přenos do horního lýtkového svalu myši.

• Různé várky DNA • Různé reportérové geny: luciferáza. LacZ (myš)', FGF (potkan).

• Různé zvířecí druhy: myš, potkan, králík.

• Různá místa injekce: holenní sval, lýtkový sval, čtyřhlavý sval u myši, holeni sval u potkana, holenní, čtyřhlavý a trojhlavý sval u králíka.

• Vzdálenost místa injekce a místa pulzů.

· Načasování injekce a aplikace elektrických pulzů • Různí experimentátoři provádějící injekce a aplikace pulzů.

aby potvrdily výsledky skutečně bylo získáno • « • · · • «

Byly získány následující výsledky: :

• Významné zlepšení přenosu genu oproti samotné injekci nahé'

DNA: 5 až lOnásobné zvýšení a dokonce až lOOnásobné i vyšší zvýšení u svalů myši, 100 až ,250násobné zvýšení u potkana a 100 až 50000násobné . zvýšení u králíka, vzhledem ke kontrole.

• Významné snížení vnitroskupinového rozptylu výsledků: Elektrické pulzy se musí aplikovat po injekci DNA a dostejného místa. Vektor DNA může být podán až 30 minut před aplikací pulzů, aniž by se odpověď výrazně snížila. To dovoluje opakování několika injekcí do sousedních místpřed aplikacíjediného pulzu.

• Pokusy na myších s genem LacZ a následnou histologickou analýzou potvrdily, že postup vedl k lOx vyššímu počtu svalových vláken exprimujících gen. Údaje o expresi FGF u potkanů ukazovaly také významné zvýšení počtu exprimujících buněk.

• Pokus se secernovanou alkalickou řosfatázou, užitou jako secernovaný reportérový gen, ukázal zvýšení řádu dvou logaritmů v sekreci proteinu do séra.

• Inverzní závislost účinnosti transfekce ne velikosti: Menší plazmidy se přenášejí 's vyšší účinností, avšak zařízení pro elektropřenos výrazně zvyšuje účinnost přenosu bez ohledu na velikost DNA, čímž odstraňuje překážky dosud bránící v požití YAG, kosmidů nebo umělých chromozómů pro transfekci.

• Nezávislost na promotoru a opracování proteinu:. Účinnost eletropřenosu nezávisí žádným způsobem na promotoru transgenu, což umožňuje další stupeň kontroly genové exprese. Kromě toho ani přítomnost signálních sekvencí pro sekreci nebi jiných regulačních sekvencí či sekvencí

*

4

4444 Ι·

4 4 4 4 4 · 4 4 4

4444444 nutných pro opracování proteinového produktu neměla vliv na účinnost elektropřenosu.

Tyto pokusy ukázaly, že elektropřenos není úplně bez vedlejších účinků, ale že tyto účinky jsou minimální ve srovnání s obvyklou elektroporací. Byly zjištěny lokální zánětlivé reakce a regenerační procesy 7 dní po pulzu. Záněty však byly mírné a reverzibilní. Elektrické pulzy u myší generovaly kontrakce. U potkanů byl účinek mnohem slabší a lokalizován pouze na zadní končetiny. U králíka předběžné pokusy ukázaly, že kontrakce byly omezeny na svalové skupiny bezprostředně vystavené pulzům. Ani u potkanů ani u králíků nebyla pozorována bolestivá reakce (žádné skřeky). V průběhu probouzení s anestezie žádné' zvíře nejevilo příznaky bolesti v ošetřené končetině.

Tyto pokusy prokázaly výhodnost zařízení pro elektropřenos použitých za podmínek podle vynálezu ve smyslu zlepšení přenosu nukleových kyselin, snížení vnitroskupinového rozptylu a snížení nebo úplného odstranění nepříznivých vedlejších účinků. Další výsledky jsou podrobněji uvedeny v následujicích příkladech.

Příklad· 7

Transfekce v závislosti na trvání pulzu

Tento příklad demonstruje vliv prodlužující se délky pulzu na účinnost transfekce při elektropřenosu.

Podmínky pokusu byly stejné jako v příkladu 1 s myšmi C57B1/6, kromě toho, že byl užit generátor elektrických pulzů GENTRONICS/BTX T 820 (divize BTX,Gentronics, Sna Diego, Kalifornie). Generátor elektrických pulzů BTX umožnil • · · ·» φ · * φ • φ · φ · φ » φ · · φ φ φ φφ φ φ » φ · φ •φφφ φ φ · φφφ φφφ aplikaci obdélníkových pulzů až do délky 100 ms. Byl injikován plazmid pXL2774 (WO 97/10343) v množství 15 pg. Jak je poznamenáno u tabulky 1, při konstantním napětí a intenzitě pole 200 V/cm prodlužující se doba trvání pulzu vedla ke zvýšené účinnosti transfekce.

Tato data představují optimalizované ^: parametry pro přístroj k elektropřenosu nukleové kyseliny do svalu. Takový přístroj výhodně poskytuje pulzy v délce 20 ms nebo více, a to alespoň 4, výhodněji 8 pulzů.

Tabulka 1

Účinnost elektropřenosu v závislosti na trvání pulzu

Trvání pulzu (ms)	0	1	5	10	20	30	40	50	6.0	80
Pokus A 8 pulsů	11 ±5	39 ± 6	211 ±26	288 ±46	1158 ±238	1487 ±421	2386 ±278
Pokus B 4 pulsy	11 ±5	26,8 ± 6	123 ±17	246 ±32	575 ±88	7 04 ±13 0		34 4 0± 1077
Pokus C 4 pulsy	15 ±8						2885 ±644		2626 ±441	1258 ±3 0'9

Střední hodnota aktivity luciferázy v milionech relativních jednotek (RLU) na sval ± střední chyba průměru (SEM), N=10. . Podmínky elektropřenosu: intenzita pole 200 V/cm, frekvence 1 Hz.

Tyto údaje ukazují, že zařízení pro elektropřenos v podmínkách optimální intenzity pole popsaných v této přihlášce může zvýšit svou účinnost přenosu DNA ťím, že se prodlouží trvání pulzu. Např. prodloužení trvání pulzu na alespoň 40 ms při aplikaci série 8 pulzů nebo na 50 ms při aplikaci série 4 pulzů významně zvýšilo transfekční účinnost při 200 V/cm. Podobnou optimalizaci zařízení lze provést i pro další intenzity pole.

• 9 *

» « » 9 » 9 • 9 9

Příklad 8

Transfekce jako funkce počtu pulzů

Tento příklad demonstruje vliv rostoucího počtu pulzů na účinnost transfekce při elektropřenosu.

Pokusné podmínky byly stejné jako v příkladu 1 a byly použity myši C57B1/6. Tabulka 2 jasně ukazuje, že při intenzitě 200 V/cm s délkou pulzu 20 ms účinnost transfekce byla jasně zlepšena ve srovnání s kontrolní skupinou (bez aplikace elektrického pole)počínaje jediným pulzem ,a pak se zvyšujícím se počtem pulzů na 2, 4, 6, 8, 12 a 16, s tím, že optimum leží mezi 8 a 16 pulzy. Je třeba zdůraznit, že ve srovnání s kontrolou (0 pulzů) se u všech skupin s elektropřenosem snížil rozptyl (viz střední chyba průměru, SEM) .

Tabulka 2

Transfekční účinnost v závislosti na počtu pulzů

Počet pul zů	0	1	2	4	6	8	12	16
Průměr (x 10)	69, 57	14 7,91	281,02	438,62	678,44	818,73	929, 20	889, 75
Střední chyba průměru	80, 09	17, 76	16,38	11,44	19, 05	8, 87	18,20	15,44

Průměrná hodnota exprese luciferázy v milionech relativních jednotek (RLU) na sval ± střední chyba průměru (SEM), N=10. Podmínky elektropřenosu: intenzita pole 200 V/cm, frekvence! Hz.

Tyto údaje ukazují, že zařízení pro elektropřenos zvyšuje svou účinnost přenosu DNA s rostoucím počtem pulzů.

99

9 9 « • ·· · «

9

Při intenzitě elektrického po(Le použité v testu (200 V/cm) , optimální funkce zařízení je při 4, 8 a .ještě více pulzech.

Modifikací počtu pulzů může zařízení pro elektropřenos mo.dulovat účinnost přenosu nukleové kyseliny a tím nastavovat hladinu exprese.

• · > Φ · 9 ► · Φ ·

99Φ ··· • · • Φ ΦΦ

Příklad 9

Transfekce v závislosti na frekvenci

Tento příklad ukazuje, že rostoucí frekvence pulzů zvyšuje účinnost transfekce. Při klinickém použití, zařízení pro elektropřenos, které' aplikuje pulzy s vyšší frekvencí, zvyšuje komfort pacienta tím, _ že snižuje celkový čas aplikace elektrického pole.

Experimentální podmínky byly stejné jako v příkladu 1 a byly použity myši C 57B1/6. Byl injikován plazmid pXL2774 (15 pg) . Frekvence se v pokusu měnila od 0,1 do 4 Hz při aplikaci 8 nebo 4 pulzů v délce 20 ms při intenzitě pole 200 V/cm. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny v tabulce 3.

Tabulka 3

Transfekčni účinnost v závislosti na frekvenci

'Frekvence (Hertz)	0	0, 1	0, 2	0, 5	1	2	3	4
Pokus A 8 pulsů	5 ±2	54 ±13	95 ±16	405 ±60	99 6 ±15 6	1528 ±257
Pokus B 4 pulsy		114 ±14	163 ±24	175 ±26	' 337 ±53	5 87 ±90
Pokus C 8 pulsů	21 ±14				1294 ±189	2141 ±387	3634 ±868	2819 ±493
Pokus D 4 pulsy					1451 ±22 8	1572 ±32 0	1222 ±12 6..	2474 ±64 6

9

9 9 9

9 9 »

999 999

9 ► « • 9

9»

Průměrná hodnota aktivity luciferázy v milionech relativních jednotek (RLU) na sval ± střední chyba průměru (SEM), N=10 v každé skupině. Podmínky elektropřenosu: intenzita pole 200 V/cm, délka pulzu 20 ms.

Výsledky demonstrují, že vyšší frekvence (vyšší než 1 Hz a výhodně vyšší než 2 Hz) v testovaných podmínkách elektropřenosu zvyšuje transfekční účinnost.

Příklad 10

Elektrotransfekce s exponenciálně se snižujícím časově proměnlivým elektrickým polem

Tento příklad ukazuje účinek aplikace exponenciálně se snižujícího elektrického pole na účinnost přenosu nukleových kyselin in vivo.

V tomto pokusu byly užity myši C57B1/6. V pokuse byl užit plazmid pXL3031 (obr. 12) odvozený z plazmidu pXL2774 vložením modifikovaného genu luciferázy Photinus pyralis (pGL3, Genbanl polžka č. CVU47295) pod kontrolu bezprostředně časného' promotoru (Genbank č. HS51EE) ' cytomegaloviru (CMV-IE) s polyadenylační signálem viru SV40 (Genbank č. SV4CG). Bylo injikováno 10 pg.

Byl použit komerčně dostupný zdroj elektrických pulzů (model Easyject, Equibio, Plus, Kent, UK) a byl upraven tak, aby poskytoval pulzy exponenciálně se snižujícího a v čase proměnlivého elektrického pole. Zaznamenané napětí bylo aplikované napětí v maximu exponenciály. Druhým nastavitelným parametrem byla kapacitance (v pF) , která kontroluje celkové množství dodané energie. ^!

Tabulka 4 ukazuje, že při aplikaci exponenciálně se snižujícího elektrického pole je možné dosáhnout zřetelného

··

0 »

• 0

0

0

0

0 ··»· zvýšení exprese transgenu ve srovnání s kontrolou, kdy není aplikováno elektrické pole. Tyto výsledky byly získány pro různá napětí a pro různé energie odpovídající různým časovým konstantám exponenciálních funkcí, které lze modulovat nastavitelnou kapacitancí zařízení. Parametry získané a ověřené v tomto příkladu je možné využít pro elektropřenosové zařízení.

Tabulka 4

Transfekční účinnost (aktivita luciferázy relativně ke kontrole) při- aplikaci exponenciálně se snižujícího časově proměnlivého pole

	Kap. 150pF	Kap. 300pF	Kap. 450pF	Kap. 600pF	Kap. 1200pF	Kap. 2400pF	Kap. 3000pF
40 V/cm						1,23	11
100 V/cm				16,5	2, 8	6, 5	23, 9
150 V/cm				1,8	3, 5	6,1
200 V/cm		5,1 .		15, 8	18,8	121,5	189, 7
300 V/cm	32,1	90,5	48,7	7 60,4	56, 2
400 V/cm		795
600 V/cm	62
800 V/cm	3,1	1,1

Zvýšení hladiny exprese luciferázy relativně ke kontrole, která byla získána injekcí plazmidu pXL3031 bez použití elektropřenosu. Uvedeny jsou průměrné hodnoty zvýšení exprese, v každém testu bylo užito 4 až 6 myší.

Pro srovnání uvádíme, že při aplikaci obdélníkových pulzů při 200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms každý, s frekvencí 1 Hz, bylo dosažené zvýšení aktivity luciferázy 44.

Tyto údaje ukazují, že zařízení pro elektropřenos, které poskytuje v závislosti na čase exponenciálně se snižující elektrické . pole může vést ke zvýšení exprese při nízké intenzitě pole s vyšší kapacitancí (např. 200 V/cm a kapacitance 3000 pF).

·· ··

I · · · • ·· ··· ··· • ···· ·· 99

Příklad 11

Kombinace krátkého vysokonapěťového pulzu a několika dlouhých nízkonapěťových pulzů

Tento příklad ukazuje, že .aplikované elektrické pole může být kombinace alespoň jednoho pulzu silného pole 500 až 800 V/cm po krátkou dobu, např. 50 nebo 100 ps, a alespoň jednoho pulzu slabého pole (s intenzitou nižší než 100 V/cm) po delší dobu, např. delší než 1 ms až do 90 ms jak bylo užito v tomto pokusu. Slabé elektrické pole v tomto pokusu mělo intenzitu 80 V/cm a bylo aplikováno ve 4 pulzech s frekvencí 1 Hz a dobou jednoho pulzu 90 ms. Byla použita dvě komerční elektropulzačni zařízení (Jouan a Centronix). Přenos elektrického napětí jedním i druhým zařízením na elektrodové destičky se uskutečni.l v době kratší než 1 s po manuální úpravě operační konfigurace. Plazmid kódující luciferázu' použitý v tomto pokusu byl pXL3031 a injikované množství bylo 3 pg. Byly použity proměnlivé hodnoty intenzity elektrického pole, jak jsou uvedeny v tabulce 5. Ostatní experimentální podmínky byly stejné jako v příkladu 1.

Tabulka 5 shrnuje výsledky experimentu. Výsledky ukazují, že ve srovnání- s kontrolní skupinou (bez aplikace elektrického pole) aplikace krátkého vysokonapěťového pulzu nebo 4 dlouhých nízkonapěťových pulzů, nebo aplikace pulzu slabého elektrického pole před aplikací pulzu vysokonapěťového pulzu jen málo zvyšuje transfekční účinnost. Naproti tomu kombinace krátkého vysokonapěťového pulzu následovaného 4 pulzy pole 80V/cm délky 90 ms s frekvencí 1 Hz zřetelně vedla ke zvýšení transfekce ve srovnání • ···· s kontrolní skupinou.' Z těchto dat je zřejmé, že výhodné zřízení pro elektropřenos by mělo poskytovat sérii kratších pulzů pole s vyšší intenzitou.

Tabulka 5

Kombinace pulzů různé intenzity a délky ·· '·· • tititi · • ·· • « titi • · · ···· titi · ·· ·· • ti · ti • tititi ti· ti tititi • ti titi titi

Podmínky elektrického pole	Pokus 1 (3 pg pXL3031)	Pokus 2 (3 pg pXL3031)
Kontroly (neaplikováno elektrické pole)	320 ± 126	75 + 27
A	500 V/cm , 1 x 0.1 ms		169 ± 63
B	800 V/cm, lxO.lms	416 + 143	272 ± 84
C	80 V/cm , 4 x 90 ms, 1 Hz	,1282 ± 203	362,21 ± 85,17
Podmínky: A, následováno C	-	1479 ± 276
Podmínky: B, následováno C	3991 ± 418	1426 ± 209
Podmínky: C, následováno B	-	347 ± 66

Jak bylo ukázáno v příkladu 1, aplikace 8 pulzů při intenzitě 600, 800 nebo 1200 V/cm po dobu 1 ms s frekvencí 1 Hz způsobovala svalové léze a .inhibovala transfekci. Výsledky získané v tomto, příkladu ukazují, že za popsaných podmínek, j možné požít vysokonapěťové pole, aniž by způsobilo' léze. Skutečně makroskopické vyšetření svalů neposkytlo žádné důkazy viditelných změn. Užití vysokonapěťové pole po krátkou dobu, po které následuje slabé pole s delší dobou pulzů, poskytuje alternativní prostředek pro modulaci účinnosti přenosu DNA.

φφ ··. ♦ φφ <· φφ • · · · ·· · φ φ φφ φ • φφ · · ΦΦΦ· φφφφ · · φ ······ φφφφφ · φ φφφφ φφ ·ΦΦ φφφφ φφ φφ

Příklad 12

Kinetika exprese luciferázy ve svalu

Použití zařízení pro elektropřenos podle vynálezu dovoluje transfekci a trvalou expresi nukleových kyselin ve vysoké hladině alespoň po dobu 4 měsíců.

V tomto pokusu byly užity myši C67B1/6. Intramuskulárně byl myším injikován plazmid pXL2774 (15 pg) . Po injekci DNA bylo aplikováno elektrické pole následujících vlastností: 200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, frekvence 1 Hz. Ostatní podmínky byly. stejné jako v příkladu 1. Aktivita luciferázy byla stanovena pro skupiny 10 myší utracených v různé době po injekci DNA. Kontrolní myši nebyly exponovány elektrickému poli. Údaje na obr. 6 ukazují, že exprese lucifeázy je detekovatelná od třetí hodiny po injekci, plazmidu a zvyšuje se až do třetího dne (D3) . Exprese luciferázy začíná klesat od 35. dne. U skupin, kde bylo aplikováno elektrické pole, stojí za povšimnutí, že transfekce byla zřetelně zvýšena bez ohledu na dobu měření hladiny exprese. Rozdíl mezi kontrolou a skupinami, kde bylo aplikováno, elektrické pole, byl dokonce vyšší 121. den, neboť exprese po elektropřenosu se udržela, zatímco exprese u'kontrolních svalů poklesla. .

A ještě významnější je to, že exprese transgenu byla stabilní až do 121. Dne. Tyto výsledky jsou zvláště významné z hlediska dlouhodobého klinického využití terapeutických· genů.

·· Φ· • · · · • ·· • · · • · · ···· ·· • · • ·

Příklad 13

Histologie svalu po transfekci

Histologická analýza v průběhu kinetického experimentu potvrdila nepřítomnost kritické zánětlivé odpovědi. Byly pozorovány mírné záněty, indikované přítomností makrofágů a lymfocytů.

Histologická analýza byla potvrzena i v těchto podmínkách, kromě toho, že byl použit plazmid pXL3004 (obr. 13). Tento plazmid je plazmid pCOR (pXL2774, viz WO 97/10343) kódující β-galaktosidázu. Plazmid pXL2774 byl modifikován vložením genu lacZ modifikovaného signální sekvencí pro jadernou lokalizaci (viz Mouvel et al. , 1394, Virology 204, 180-189) řízeného promotorem CMV z-plazmidu pCDNA3 (Invitrogen, Holandsko) a polyadenylačním signálem SV40 (Genbank, č. SV4CG) . Zvířata byla utracena 7 dnů po podání plazmidu. Histologická analýza umožnila detekci buněk transfekovaných β-galaktosidázou (Xgal histochemie) a zánětlivých ohnisek barvením alumovým karmínem a charakterizací stavu svalové tkáně barvením hematoxylinemeosinem. Kontrolní myši nebyly vystaveny působení elektrického pole. Následně uvádíme přehled, rozdílů mezi svaly, které byly permabilizovány působením elektrického pole a které nebyly:

• Počet myofibril exprimujících β-galaktosidázu byl po elektropřenosu 9x vyšší (průměr 76, N=6) ve srovnání s kontrolou (průměr 8,5, N-8). Většina svalových vláken byla v klidovém stadiu s jádrem lokalizovaným periferně. Fibrily s centrálně lokalizovaným jádrem (regenerující se) jen vzácně exprimovaly β-galaktosidázu.

4 4

4·

4 4 4

4 44 4 4

4 > 4 4 4 » 4 4 4 «44 «44

4 «4 «4 infiltrátů ' (makrofágů vlákna v regeneraci, • Oblast exprese β-galaktosidázy byla 2x větší u svalu permeabilizovaného elektrickým polem (4 mm) než u kontroly, s gradientem exprese klesajícím směrem od místa injekce.

• V této studii jsme zaznamenali u elektrópermeabilizovaných svalů reverzibilní počet a lymfocytů), mnohá svalová s centralizovaným jádrem, a četná nekrotická vlákna plná fagocytujicích makrofágů. Zánětlivé, nekrotické a regenerující oblasti odpovídaly oblastem v okolí transfekovaných myofibril. Tato reakce přetrvávala až dva týdny a pak samovolně odezněla. Netransfekovaná část svalu byla po celou dobu v dobrém stavu.

• Ve svalech, které nebyly vystaveny elektrickému poli, několik nekrotických myofibril a několik regenerujících myofibril . bylo lokalizováno s několika zánětlivými ložisky.

Stručně shrnuto, tyto údaje ukazují, sice vede k pozorovatelnému zánětu, tento zánět však není významný, zvláště ve srovnání s dramatickým zvýšením účinnosti přenosu nukleové kyseliny. Kromě .toho data z kinetické studie' ukazují, že zánět sám odezněl i tehdy, když exprese transgenu zůstává stálá a vysoká.

okolí místa vpichu že elektropřenos

Příklad 14

Role času, kdy je injikován plazmid ve vztahu k času, kdy je aplikováno elektrického pole

Myši C57B1/6 byly intramuskulárně injikovány plazmidem pXL2774 (154 nebo 1,5 pg). DNA byla injikována až 120 minut

0 0 0 • 0 0 0 • 0 0 0

000 000

0

00 • 0

0 0 0 0 • 00 • · · 0

0 0 «0·· 00 0 před nebo 60 vteřin po aplikaci' elektrického pole. Doba před nebo po injekci je uvedena v tab. 6. Podmínky elektrického pole byly: 200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, frekvence 1 Hz. Kontrolní myši obdržely injekci plazmidu, ale nebyly vystaveny elektrickému poli. Ostatní experimentální podmínky byly stejné jako v příkladu 1.

Získaná data jsou uvedena v tab. 6. Injekce DNA až 1 hodinu před aplikací elektrického pole vedla ke zvýšení transfekční účinnosti, jak bylo detekováno pomocí exprese luciferázy. Stejný trend jako byl pozorován s injekcí 15 pg plazmidu na sval byl pozorován s dávkou lOx menší, tj. 1,5 pg DNA. Když byl plazmid injikován až po aplikaci elektrického pole, nebylo pozorováno žádné zvýšení transfekční účinnosti.

Tabulka 6

Účinnost elektropřenosu plazmidu injikovaného před aplikací a po aplikaci elektrického pole.

Tabulka 6A

Injekce DNA bez aplikace elektrického pole (kontrola)'

čas injekce vzhledem k aplikaci elektrického pole	pokus 1 pXL2774 (15 pg)	pokus 2 pXL2774 (15 pg)	pokus 3 pXL2774 (1,5 pg)	pokus 4 pXL2774 (15 pg)	pokus 5. pXL2774 (1,5 pg)
0	7±.4	8+6	0.4±0.2	22 + 15	1+1

«* • · ···· ·· • * ·· • · · • · ·· • ·· ·» ·· • · · · · · · • · 9 9 9 9 • 9 · 9·· 99« • 9 9 9 • 9 ·99· 99 99

Tabulka 6Β

Injekce DNA před aplikací elektrického pole'

čas	pokus 1	pokus 2	pokus 3	pokus 4	pokus 5
-120 minut				20 + 5	211
-60 minut				106122	10 13 ·
-30 minut	303 ± 36	237 ± 61	7 ± 3	184 ± 22	15 ±4
-5 minut	410 ± 7
- 60 s	253 ± 51
- 20 s	492 ± 122	201 ± 43	9 13	123 1 23	12 ±2

Tabulka 6C

Injekce DNA po aplikaci elektrického pole

čas	pokus 1	pokus 2	pokus 3	pokus 4	pokus 5
+ IO s				7 17
+ 20 s	11 ± 6	0,4 ± 0,1
+ 6 0 s	8 + 7			17 ± 15

Na rozdíl od výsledků pozorovaných v tomto pokusu, kdy injekce plazmidové DNA až jednu' hodinu před aplikací elektrického pole vedla k vysoké expresi plazmidu, různí jiní autoři pozorovali in vitro, že pro elektroporaci bylo nezbytné, aby byl plazmid přítomen v okamžiku -aplikace elektrického pole.

Příklad 15

Závislost elektropřenosu na dávce

Statistická analýza uvedená v tomto příkladu dovoluje srovnání závislosti na dávce při elektropřenosu. Tento pokus potvrdil, že použití zařízení pro elektropřenos značně snižuje rozptyl úrovně exprese plazmidu.

• · > « • ·

Pět týdnů staré myši C57Bl/6byly injikovány intramuskulárně bilaterálně do horního holenního svalu dávkou v rozpětí od 0,25 do 32 pg DNA (plazmid pCOR-pXL3031) nesoucí luciferázu jako transqen pro cytoplazmatickou expresi řízenou promotorem CMVh, ve skupině (tj . pro jednu dávku DNA), bylo vždy 10 myší. Aplikované dávky byly v rozpětí od 0,25 do 32 pg DNA. Bezprostředně po injekci byla jedna z 'injikovaných končetin vystavena působení elektrického pole 250 V/cm se 4 pulzy v délce 20 ms a frekvencí¹· 1 Hz. Zvířata byla utracena 5 dnů po ošetření a exprese transgenu se zkoumala ve tkáňových extraktech z každého svalu postupem popsaným v příkladu 1. Za těchto podmínek elektropřenosu makroskopické vyšetření svalu ukázalo jen dvě známky tepelného poškození tkáně z celkového počtu 150 svalů v pokusu.

Porovnání změn v rozptylu jako funkce průměru pro každou sérii myší (n=10) jasně ukázalo, že rozložení exprese transgenu má logaritmicko-normální charakter. Grafická analýza výsledků (obr. 7) potvrzená výpočty ukázala, že účinkem se mění lineárně s logaritmem injikované dávky DNA.

Pomocí Cochranova testu bylo možné demonstrovat, že zde existuje homogenita rozptylu pro každou regresi (s elektropřenosem a bez něho), což je skutečnost, která umožnila použití reziduálního rozptylu k provedení všech výpočtů. Rozptyl od linearity nebyl významný v rámci 5% intervalu -spolehlivosti při .elektropřenosu. Naproti tomu odchylka od linearity byla vysoce významná (p<0,01) , což ukazuje na značnou heterogenitu v účinnosti transfekce za standardních podmínek (bez elektropřenosu). Data ukazují, že reziduální rozptyl je 5x vyšší v případě bez elektropřenosu než v případě použití elektropřenosu.

44 4 44 44 4· • 4 · 4 4 4 4 4 4 · » 4 • 44 4 44444 •4 44 4 4 4444 444

4 4 4 4 4 4 •444 44 444 4444 «4 44

Vezmeme-li v úvahu stanovené ' hodnoty reziduálního rozptylu, bylo by třeba užít 5x více zvířat k získání stejné výsledného účinku v transfekční účinnosti bez elektropřenosu než s elektropřenosem. Tato analýza zcela jasně a srozumitelně demonstruje jasnou výhodnost užiti zařízení pro elektropřenos. Pro^; demonstraci rozptylu 2, -5 nebo lOx exprese transgenu s 95% spolehlivostí by bylo nutné injikovat 33, 8 nebo 5 zvířat s elektropřenosem ve srovnání se 165, 40 nebo 25 zvířaty bez elektropřenosu. Tabulka shrnující tento typ výpočtů je uvedena dále jako tab. 7.

Tabulka 7

Stanovení počtu zvířat pro statisticky významnou expresi se zařízením pro elektropřenos

poměr účinnosti	P - 95%	P - 90%	P = 85%	P = / 5%
2	33	28	24	19
5	8	7	6	. 6
7	5	5	4	4'

Tyto údaje ukazují, že technika elektropřenosu nejenže výrazně zvyšuje účinnost - transfekce, ale také významně snižuje variabilitu odpovědi. Způsob eletropřenosu a zařízení k jeho provádění dovolují přísné analytické studie transfekce tkání a také reprodukovatelný přenos terapeutických genů v rámci léčení.

Výsledek testu srovnávajícího směrnice získané pro každou regresní závislost nebyl významný. Existuje tedy 5% riziko, že směrnice obou regresí jsou rovnoběžné. Výpočty relativní mocnosti ukázaly, že k získání stejného účinku by bylo třeba injikovat do svalu 250 x více DNA ve standardních podmínkách ve srovnáním s použitím zařízení pro elektropřenos (243 85, 95% interval spolehlivosti). Tyto výsledky lze také »4 44 44

4 4 4 4

4 4 4 4

4 444 444 ) 4 4 »44 »* 44 vyjádřit jako 500 x vyšší expresi transgenu při použití zařízení k elektropřenosu při stejné dávce DNA injíkované ve srovnání se' standardní injekcí DNA.

Tento příklad ukazuje pomocí dvou plazmidů kódujících luciferázu, že je možné stanovit významnou lineární korelaci mezi dávkou injikovaného plazmidu a elektrotransfekcí. Tato korelace je mnohem méně významná bez elektropřenosu. Statistická analýza také demonstruje významné snížení rozptylu ve skupinách, kde byla užita elektrotransfekce. Takže pomocí zařízení pro elektropřenos podle vynálezu je možné .účinně a predikovatelně modulovat hladinu exprese transgenu tím, že se mění množství injikovaného plazmidu.

Příklad 16

Elektropřenos s různými elektrodami

Tento příklad srovnává účinnost přenosu DNA při aplikaci zařízení pro elektropřenos vybaveného jedním ze dvou typů elektrod, a sice ’ plochými destičkovými elektrodami a jehlovými elektrodami, kromě toho jehlové elektrody byly testovány pro různé orientace implantace.

Plazmid pXL2774 (150 pg) byl injikován do trojhlavého svalu potkana. Destičkové, elektrody byly umístěny jak bylo popsáno v příkladu 1 se vzájemnou vzdáleností elektrod 1,2 cm. U jehlových elektrod byla mezielektrodová vzdálenost 0,9 cm. Jehlové elektrody byly vnořeny ve stejné délce do svalové tkáně, buďto paralelně nebo kolmo k ose svalových vláken v okolí místa injekce. Bez ohledu na typ a orientaci elektrod, vlastnosti elektrického pole byly následující: intenzita 200 V/cm, 8 pulzů po 20 ms, frekvence 2 Hz.

* ι « ·· • · · ·

Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny v tab. 8. Data ukazují, že elektrotransfekce byla srovnatelná bez ohledu na způsob elektrického pole. Podobné hladiny transfekce byly získán s jehlovými elektrodami a destičkovými elektrodami, kromě toho účinnost elektropřenosu byla nezávislá na orientaci jehlových elektrod vzhledem k orientaci svalových vláken.

Tyto údaje ukázaly, že zařízení pro elektropřenos lze užít jak s destičkovými tak jehlovými elektrodami, a to bez ohledu na orientaci vzhledem k cílové tkáni. Použití jehlových elektrod je výhodné pro podávání nukleové kyseliny do velkých svalů, aby se zajistilo, že celkové napětí není velké, např. 100 V při umístění jehlových elektrod ve vzdálenosti 0,5 cm při intenzitě elektrického pole 200 V/cm.

Avšak destičkové elektrody,	které jsou neinvazivní,	j sou
výhodné pro	malé svaly,	např. prstů,..... pro	po	dávání
terapeuticko ýh	genů např. při	'artritidě.

Příklad 17

Elektropřenos do různých	svalů - a	druhů
Tento příklad ilustruje	fakt,	že zařízení	pro
elektropřenos se může	užít k	ovlivnění	přenosu nukleové

kyseliny do mnoha různých typů svalů různých druhů zvířat.

Zařízení pro elektropřenos bylo nastaveno k poskytnutí podmínek u každého druhu, které jsou popsány , v tab. 8. Výsledky tohoto pokusu jsou také uvedeny tab. 8.

• ·

I . · · 9

I ♦ · · ·· · ···

Tabulka 8

Zesílení transfekce nukleové kyseliny elektropřenosem · do různých svalů a různých druhů

druh	plazmid	vlastnosti elektrického pole	horní holenní sval	lýtko- vý sval	přímý stehenní sval	v ý s v a 1	čtyřhlav ý z V 5 í
myš	10 gg pXL3031	8x200 V/cm 20 msec, 2 Hz	X28	xl 9 6	x342	x!21
potkan v	150 gg pXL3031	8x200V/cm 20 msec, 2 Hz	Χ31			x'16O	xl3,2
králík	200 gg pXL2774	4x200 V/cm 20 msec, 1 Hz	X25417			x724	x3595

Relativní zvýšení hladiny exprese luciferázy použitím zařízení pro elektropřenos ve srovnání s kontrolou (žádný elektropřenos) . Údaje jsou průměrné hodnoty vždy z 10 svalů v každé skupině. Aktivita luciferázy byla stanovena sedm dnů po podání plazmidu.

Elektropřenos byl také testován na opicích rodu makak (Macaca fascícularís). Plazmid pXL3179 (Obr. 11) obsahující gen kódujíc fibroblastový růstový faktor 1 (kyselý fibroblastový růstový faktor)(FGFl nebo aFGF) byl odvozen z plazmidu pXL2774, kde byl signální peptid lidského fibroblastového interferonového systému byl fúzován s cDNA pro aFGF (sp-FGFl, Jouannu et al. , 1991, PNAS 88:.2893-2897), byl vložen pod kontrolu humánního' . promotoru CMV-IE a polyadenylační signál SV40. Exprese aFGF byla stanovena imunohistochemickým způsobem. Počet pozitivních buněk, (buněk exprimujících aFGF) byl vyhodnocen 3 dny po intramuskulární injekci 500 pg plazmidu pXL3179. Charakteristiky elektrického pole byly: 200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, frekvence . 1 Hz. U kontrol nebylo aplikováno elektrické pole (elektropřenos -) ·· • *

Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny v tab. 9. Data jasně ukazují, že exprese proteinu aFGF je detekovatelné pouze po použití se zařízením pro eletropřenos ke zvýšení účinnosti přenosu DNA do svalové tkáně. Je zajímavé, že za těchto podmínek bez elektropřenosu nebyla detekována žádná exprese.

Tabulka 9

Imunohistochemická analýza exprese aFGF v opičím svalu

	elektropřenos -	elektropřenos +
trojhlavý sval	.0	0
horní holenní	0 .	30
dvojhlavý sval	0	• 4
čtyřhlavý sval	0	30

Imunohistochemická analýza exprese aFGF v různých svalech opice. Hodnoty ukazují počty pozitivních zvířat 3 dny po intramuskulární injekci 500 pg plazmidu pXL3179 kódujícího aFGF, a to buďto s ( + ) a nebo bez (-) aplikace elektrického pole.

Příklad 18

Elektropřenos do bránice potkana

Schopnost poskytnout dlouhotrvající stabilní expresi transgenů použitím zařízení pro elektropřenos je důležitým důsledkem pro léčení degenerativních nemocí,které ovlivňují funkci bránice, zejména muskulární dystrofie.

V tomto experimentu byla bránice obnažena řezem podél sterna při anestézii (směs 1 mg/kg largactylu a 150 mg/kg ketaminu). Injekce.byla provedena do bránice (50 pg plazmidu pXL2774 v 50 pl 20mM NaCl a 5% glukózy). destičkové elektrody pak byly umístěny na každou stranu bránice kolem dráhy injekce, .přičemž vzájemná vzdálenost elektrod byla 1 cm.

Elektrické pole bylo následující: 160 V/cm nebo 300 V/cm, pulzů délky 20 ms, frekvence 1 Hz. Elektrické pole bylo aplikováno na sval v době kratší než 1 minuta po injekci.

Opraní rána pak byla uzavřena. Výsledky tohoto pokusu jsou ukázány v tab,. 10.

• · 9 · · 4 4 * · 4 4 «9 4 49 4 9 9 99 9

999 9 9999* •9 99 · 9 4 949999

4 4 · 9 99 «499 99 449 4444 94 44

Tabulka 10

Elektropřenos do bránice potkana

V/cm	0	160	300
celkové RLU	48 ± 33	92Ó ± 474	51 ± 29

Hodnoty aktivity luciferázy jsou průměrné hodnoty + střední chyba průměru (SEM) v milionech relativních jednotek (RLU) na sval, N=12 v každé skupině.

Tento příklad demonstruje významné zlepšení exprese 'transgenu v bránici po aplikaci 8 pulzů délky 20 ms pole s intenzitou 160, V/cm (p<0, 003, použit Mann-Whitneyův neparametrický test) .

Příklad 20

Elektropřenos genu pro secernovanou alkalickou fosfatázu

Tento příklad demonstruje schopnost transfekovat a exprimovat gen kódující secernovatelný protein·. Secernované proteiny se užívají např. v systémové genové terapii a pro vyvolání imunitní odpovědi (DNA vakcíny). Secernovaný gen byl nalezen v krevním oběhu ve zvýšené koncentraci a jeho přítomnost byla stabilní.

V tomto příkladu byla plazmid kódující alkalickou fosfatázu pXL3010 (obr. 13) injikován do jednoho ze dvou t · · · · ·· ·· ··

Λ ·· · «·· · - · · · · ··· · · · · · · • · · · · · · ······ • · · · · · · ««·· « · ··· ···· «» ·· horních holenních svalů dospělých myší C57B1/6. Plazmid pXL3010 byl odvozen z ColEl, kde gen kódující secernovanou alkalickou fosfatázu (SeAP) z pSEAP-basic (Clontech, Genbank č. CVU09660) byl vložen pod kontrolu promotoru CMV (pCDNA3, Invitrogen, Holandsko) a polyadenylační signál SV40. Aplikace elektrického pole byla provedena standardním způsobem, tj . 8 obdélníkových pulzů délky 20 ms, frekvencí 1Hz, 200 V/cm, aplikováno 20 s po injekci plazmidu. Měření koncentrace sérové alkalické fosfatázy v krevním séru bylo prováděno na krevních vzorcích odebíraných z oka (napíchnutím retroorbitálního plexu) 7 dní později a pomocí komerčně dostupného chemiluminiscenčního testu (Phosphaligh-t, Tropix, Bedford, Massachusetts, USA) . Několik svalů, pak vystavených působení elektrického pole nebo ne, bylo injikováno nekódujícím plazmidem (balastní DNA), což umožnilo ověřit, že není přítomna žádná alkalická fosfatáza, která by nepocházela z exprese transgenu.

Zlepšení exprese transgenu aplikací elektrického pole v podmínkách tohoto pokusu bylo zřetelné pro různá množství injikovaného plazmidu (tab. 11). Bylo možné dosáhnout vysoké koncentrace, alkalické fosfatázy v séru zvýšením množství injikovaného plazmidu. V pokusu se toto zvýšení oproti konvenční transfekci udržovalo dlouhou dobu. po injekci.

• · 9

9 9 · · · · · • ·»«·

Tabulka 11 .

Exprese SeAP ve svalu myši s elektropřenosem nebo bez

plazmid pXL3010 pg	plazmid pUCl 9 pg	elektropřenos -	elektropřenos +
0,1	0	0.03 ± 0.01, (	n=5)	123 ± 0.21 (n=10)
0, 3	0	0.05 ± 0.02 (	n=5)	1.92 ± 0,33 (n=10)
1	0	0.16 ± o.04 (	n=5)	7,58 ± 1.18 '(n=10)
10	0	1.52 ± 0.59 (	n=10)	262.87 ± 54.97 (n=10)
400	0	15.64 ±10.77	(n=5)	2203.11 ± 332.34 (n=5)
0,1	, 9, 9	0.088 ± 0,015	(n=5)	21.39 ± 3.54 (n=10)
0, 3	9,7	0.90 ± 0.49 (	n=5)	95.67 ± 16.15 (n=10)
1	9	0.26 ± 0.09 (	n=5)	201.68 ± 32.38 (n=10)
10	0	0.21 ± 0.05 (	n=10)	357.84 ± 77.02 (n=10)

V tabulce jsou uvedeny průměrné hodnoty SeAP ± SEM v ng/ml.

Injekce 400 pg plazmidu (injekce 100 pg v 54 pl oboustranně a . dvakrát s 30 minutovým intervalem) s elektropřenosem vedla k sérové koncentraci alkalické fosfatázy 2,2 pg/ml v srovnání s hodnotou 0,016 u kontroly. Kromě toho použití balastní DNA, které umožnilo pracovat s konstantním množstvím 'DNA bez ohledu na množství plazmidu (vždy celkem 10 pg DNa na myš) dále zlepšilo hladinu

elektrotransfekce	pro	malá	množství plazmidu	pXL3010
(do 1 pg) .
Kinetika exprese	SeAP	byla také sledována.	V tomto
případě byla dávka	DNA	15 pg	na sval injikována oboustranně

(30 mg na myš). Výsledky jsou uvedeny na obr. 9. 7 dnů po transfekci byla pozorována významná a stálá hladina (alespoň po 2 měsíce) sérové koncentrace SeAP jako důsledek elektropřenosu pXL3010.

Tyto výsledky potvrdily, že přenos nukleové kyseliny do svalu užitím přístroje podle vynálezu umožňuje expresi • · φ · φ φφ φφ φφ φ φφ φφφφ φ φ φφ φ φφφ φ φ φφφφ φφ φφ φ φ · φφφφφφ φφφφφ φ φ φφφφ φφ φφφφφφφ φφ φφ secernovaného transgenů ve vysoké a stabilní hladině. Takže je mo,žné využít sval jako orgán, který produkuje požadovaný secernovatelný protein, a také je možné zacílit expresi terapeutického genu, který působí přímo na sval (jako je např. gen dystrofinu nebo angiogenního faktoru).

Příklad 21

Elektropřenos genu pro erytropoetin

Tento příklad demonstruje, že terapeutický gen může být přenesen do svalu pomocí přístroje podle vynálezu a že exprese samotného genového produktu způsobí detekovatelnou a významnou fyziologickou odpověď. V tomto případě byla detekována exprese erytropoetinu a exprimovaný protein indukoval zvýšení hematokritu u příjemce.

Plazmid pXL3348 (obr. 16) obsahující gen kódující erytropoetin byl injikován oboustranně do horního holenního svalu myší C57B1/6. Plazmid pXL3348 byl odvozen z plazmidu pXL2774 vložením myšího genu pro erytropoetin (NCBI: 193086) pod kontrolu humánního promotoru CMV-IE a polyadenylačního signálu SV40. Elektrické pole (200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, frekvence 1 Hz) bylo aplikováno bezprostředně po injekci plazmidu. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny v tab. 12.

·♦.

44

9 4 4

4 9 4

949 944 ·· ·♦ • 9 9 · • ·♦

4 9 9

9 9

494 9 9 9

Tabulka 12

Exprese exytropoetinu a její účinky

	sérová hladina erytropoetlnu (mlU/ml) sedmý den (D7)	sérová hladina erytropoetinu (mlU/ml) čtyřiadvacátý den (D24)
plazmid	elektropřenos	elektropřenos -}*	elektropřenos	elektropřenos +
pXL3348 (i ůg)	0	3.0 ± 1.6	0	1.12 ± 0.8
pXL334'8 (10 pg)	0,9 ± 0,9	61.8 ± 15.8	0	74.1 ± 28.9
pUC19 (i ůg)		0		0

	zvýšení hematokritu v % sedmý den (D7)	zvýšení hematokritu v % čtyřiadvacátý den (D24)
plazmid '	elektropřenos	elektropřenos +	elektropřenos	elektropřenos +
pXL3348 (i ůg)	38.5 ± 0.5	35.0 ±3.6	50.8 ± 2.3	81 ± 0.5
pXL3348 (10 pg)	32.0 ±3.2	26.0 ± 4.1	69.0 ± 5.1	8 3.0 ±' 1.0
pUC19 (i ,pg)		30.8 ± 2.3		43.2 ± 0.9

V tabulce jsou uvedeny průměrné hodnoty ± SEM, N=4 až 5 ve skupině.

Ve 24. den po injekci (D24) 1 pg plazmidu vedle k mírnému zvýšení hematokritu u myší transfekovaných konvenčně, zatímco u myší po elektrotrasfekci bylo zvýšení hematokritu značně vysoké. S 10 pg plazmidu vzrostl hematokrit i u kontroly. U skupiny po elektrotranšfekci byl hematokrit zřetelně vyšší a s menším rozptylem. Podobné výsledky byly získány i s menším množstvím DNA (1 pg).

4

4

444

44

4 4 4 «4

4 4

4 4

4444 44

·

Příklad 22

Elektropřenos genu VEGF (vaskulárního endotelového růstového faktoru)

Myším C57B1/6 nebo SCID bylo injikováno do horního holenního svalu oboustranně 15 pg plazmidu pXL3212 (obr. 11) což je plazmid kódující VEGF, pCORhVEGF. Plazmid pXL3212 byl odvozen z plazmidu pXL2774 vložním cDNA kódující VEGF (Genbank č. HVMEGFAA) pod kontrolou lidského CMV-IE promotoru a polyadenylačního signálu z SV4O. Elektropřenos byl proveden pomocí komerčního zařízení firmy Jouan, a sice 8 pulzů délky 20 ms, pole 200 V/cm s frekvencí 2 Hz. krevní vzorky byly odebrány z retroorbitálního plexu do suchých zkumavek. Krev byla odebrány jeden den před a sedm dnů po injekci plazmidu. Imunoenzvmatické kvantitativní stanovení lidského VEGF bylo provedeno pomocí soupravy Quantikine (R&D Systems)·. Byly provedeny dodatečné série lidského VEGF v myším séru. Výsledky těchto pokusů jsou uvedeny v tab. 13.

Tabulka 13

Exprese lidského VEGF v myším séru +

kmen myší	den	metoda transfekce·	lidský VEGF (ng/1)
C57B1/6	D-l	samotná injekce	nedetekovatelný
C57B1/6	D+7	elektropřenos	393 ± 110
SCID	D-l	samotná injekce	nedetekovatelný
SCID	D+7	elektropřenos	99 ± 26

Hodnoty sérové koncentrace VEGF (ng/1) u C57B1/6 a SCID myší. Kontrolní myší sérum bylo získáno z myší jeden den před injekcí plazmidu.

00 » 0 0 « • · 0 0 • ·

000 000

Příklad 23

Elektrotransfekce genu pro koagulační faktor IX

Experimentální podmínky byly shodné s podmínkami v příkladu 22, až na to, že bylo injikováno 15 pg plazmidu pCORhFIX (pXL3388, viz obr. 12) kódujícího koagulační faktor IX, do holenního svalu myší C57B1/6 nebo SCID. Plazmid pXL3388 byl odvozen z plazmidu pXL2774 vložením cDNA kódující lidský koagulační faktor IX (Christmas fact-or, Genbank č. HUMFIXA) pod kontrolou lidského' CMV-IE promotoru a polyadenylačního signálu z SV40. Elektropřenos byl proveden za podmínek: 8 pulzů délky 20 ms, pole 200 V/cm s frekvencí 2 Hz. Hladina faktoru IX byla měřena jeden den před a. sedm dnů po injekci plazmidu. Krevní vzorky byly odebrány z retroorbitálního plexu do zkumavek obsahujících citrát trisodný, které byly uchovávány na ledu.

Následující ' tabulka (tab. 14) ukazuje, že lidský koagulační faktor. IX byl nalezen pouze v krvi myší C57B1/6 a SCID, které dostaly injekci plazmidu pXL3388 do holenního svalu a byly podrobeny aplikaci elektrického pole pomocí přístroje pro elektropřenos podle předkládaného vynálezu.

Tabulka 14

Exprese lidského koagulačního faktoru IX

kmen myší	injekce	elektropřenos	lidský faktor IX- (pg/1)
C57B1/6-	pXL3388	+	69 ± 12 .
C57B1/6	pXL3388	-	nedétekovatelný
C57B1/6	0,9% NaCl	+	nedetekovatelný
SCID	pXL3388	+	6 6 ± 5
SCID	pXL3388	-	nedetekovatelný

Hodnoty koncentrace faktoru IX (pg/l) u myší C57B1/6 a SCID.

ΦΦΦ

ΦΦΦ «ΦΦ · 99

ΦΦ 99

Φ ,Φ Φ · • · · · ·· · φφ 9 9 Φ • Φ Φ Φ

Lidský Koagulační faktor IX nebyl detekovatelný v krvi myší, na které nebylo aplikováno zařičení pro' elektropřenos podle předkládaného vynálezu.

Příklad 24

Elektropřenos genu pro kyselý fibroblastový růstový faktor (aFGF)

Experimentální podmínky byly shodné s podmínkami v příkladu 22, až na to, že bylo injikováno 15 μρ plazmidu pCorCMVaFGF (pXL3096, viz obr. 14), který kóduje FGF, do holenního svalu myší C57B1/6 nebo SCID. Plazmid pXL3096 byl odvozen z plazmidu pXL2774 vložením sekvence vytvářející trojšroubovici (TH, viz Wil et al. , 1997, gene Ther. 4: 323330) s fúzi genu kódujícícho signální peptid lidského fibroblastového interferonu a cDNA kódujícíc FGF1 (sp-FGFl, Jouanneau et al., viz výše) pod kontrolou lidského CMV-IE promotoru, a následované transkribovanou ale netranslatovanou vedoucí sekvencí thymidinkinázy z HSV a polyadenylačním signálem z SV4O. Elektropřenos byl proveden za podmínek: 8 pulzů délky 20 ms, pole 200 V/cm s frekvencí 2 Hz. Přítomnost FGF byla detekována imunohistochemicky.

Výsledky transfekce myší 'C57B1/6 jsou uvedeny na obr. 10 a výsledky na myších SCID jsou ukázány v tab. ’ 15. Počet vláken svalových exprimujících FGF v náhodně vybraných řezech byl vždy zřetelně vyšší u svalů podrobených elektropřenosu než u kontrolních svalů, které obdržely . pouze samotnou injekci plazmidu pXL3096. Exprese FGF po ' elektrotransfekci dosahuje maxima 8. den (D8) V 21. s 35. den (D21 a D35) je ·· ·· » · · · » · · · • · · · · · • ···· přítomnost FGF u 'kontrolních skupin skutečně nedetekovatelná, zatímco u skupin po elektrotransfekci byla detekována řada pozitivních svalových vláken.

Tabulka 15

Exprese aFGF u myší SCID

	elektropřenos	horní holenní levý	horní holenní pravý
pXL3096 (15 pg)	+	600	4 50
+	700	300
pXL3096(15 pg)	-	3	0
-	3	0
-	0	0
DXL3096(1,5 pg)	+	80	7 0
+	20	35.
+	110	100
pXL3096(1,5 pg)	-	0	0
-	0	1

Hodnoty uvádějí počet svalových vláken pozitivních na FGF, detekovaný imunohistochemicky, určený ve svalových řezech jednotlivých myší. Řezy byly získány ze střední části svalu.

Exprese aFGF, určená počtem pozitivních vláken imunohistochemickou metodou, byla detekována- téměř výlučně u myší, u kterých bylo aplikováno zařízení pro elektropřenos. Kromě toho, exprese aFGF byla detekována jak při vysokých tak i při nízkých dávkách DNA.

Příklad 25

Elektropřenos genu pro nurotrófický faktor 3 (NT3)

Plazmid pXL3194 (viz obr. 14), který kóduje neurotrofický faktor NT3, byl injikován oboustranně do • · · ti ti titi · • ·· • ti titi • · · • titi· ti · ·' • • ti ti · · • ti titi » titi 4 » titi 4 ti·· titi4 • 4 • ti ·· horního holenního svalu 5 týdnů starých myší C57B1/6 nebo mláďat myší Xt/pmn. Myši Xt/pmn jsou modelem amyotrofické laterální sklerózy (ALS, Lou Gehrigova nemoc), charakteristické časnou a rychlou degenerací motorických neuronů a průměrnou očekávanou délkou života 40 dnů. Plazmid pXL3194 byl odvozen z plazmidu pXL2774 vložením myšího genu pro NT3 (Genbank č. MMNT3) pod kontrolou lidského CMV-IE promotoru a polyadenylačního signálu z SV4O.

Exprese NT3 byla detekována v supernatantů připraveném centrifugací (12 000 x g) svalu rozdrceného v - PBS 7 dnů po podání genu, a byla kvantifikována pomocí ELISA testu (souprava od firmy Promega)

Myším C57B1/6 bylo injikováno 12,5 μg plazmidové DNA. Polovina myší pak byla podrobena aplikaci elektrického pole (250 V/cm, 4 pulzy délky 20 ms s frekvencí 1 Hz) bezprostředně pc inj ekci.

Příslušný

95% interval spolehlivosti vypočtený pro průměr z 20 svalů byl 77 ± 11 pg/sval u myší bez aplikace elektropřenosu a 2,7 ± 0,9 ng/sval u myší po elektropřenosu. Endogenní hladina NT3 nebyla stanovena.

Podobné údaje byly zjištěny pro expresi NT3 u 4 až 5 dnů starých heterozygotních myší Xt/pmn. Tyto. myši obdržely celkem v injekcích 130 pg DNA, na každí zvíře do různých různých svalů (lýtkový sval 25 pg, horní holenní sval

12,5 pg). Bylo aplikováno následující elektrické' pole: 500 V/cm, 4 pulzy délky 20 ms, frekvence 1 Hz) . NT3 byl detekován u těchto myší sedm dnů po podání plazmidu a aplikaci elektrického pole. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny v tab. 16.

0 0 0

000 000

0

Tabulka 16

Exprese NT3 u myší Xt/pmn

	0,9 % NaCl (kontrola)	PXL3194
elektropřenos	-	+	-	+
plazma	0 (n=2)	0 (n=2)	4 6 1 10 (n=4)	1599 1 639 (n=4)
lýtkový sval	3619110 (n=2)	1619 i 150 (n=2)	3647 i 1078 (n=8)	1975413818 (n=8)
horní holenní sval	14151363 (n=4)	1453 i 375 (n=2)	1400 i 155 (n=8)	1682613135 (n=8)

Uvedeny jsou průměrné hodnoty NT3 ± SEM (pg/sval nebo pg/ml plazmy).

V experimentálních podmínkách tohoto příkladu byla detekován a bazální hladina NT3 v lýtkovém a holenním svalu. Za standardních podmínek přenosu DNA injekce plazmidu pXL3149 zvýšila expresi NT3. Když bylo užito zařízení pro elektropřenos podle předkládaného vynálezu, bylo pozorováno zvláště velké zvýšení množství NT3 ve tkáni a v plazmě. Pro jakékoliv množství DNA, které bylo použito, použití přístroje podle vynálezu ke zvýšení transfekční účinnosti vedlo ke značnému zvýšení exprese transgenu, a to jak ve svalu tak i v plazmě. Zvýšení je zvláště důležité u exprese NT3 pro neurotrofickou genovou terapii.

Příklad 26

Elektropřenos genu pro lidský růstový hormon pg plazmidu pXL3353 (viz obr. 15) nebo 10 pg.plazmidu pXL3354 (obr. 15) bylo injikováno do holenního svalu myší C57B1/6. Plazmid pXL3353 byl odvozen z plazmidu pXL.2774 vložením genomového genu pro lidský růstový hormon (fragment

4 « 4 4 4 4 4 • 4 4 4 4

4 44*4··

4 4

4444 44 44 »4 ·» 44

4 4 4 4 • 44 • · · ·

4 4

444* ·· 4

Xbal/Sph z hGH, který- zasahuje od iniciačního signálu transkripce až k místu BamHI, které je 224 bp za polyadenylačním signálem) pod kontrolou lidského CMV-IE promotoru a polyadenylačního signálu z SV40. cDNA' pro hGH byla získána reverzní transkripcí mRNA ' z knihovny lidské hypofýzy po 30' cyklech amplifikace s následujícími oligonukleotidovými primery:

5'komplementární oligonukleotid:

5'- GGGTCTAGAGCCACCATGGCTACAGGCTCCCGGAC-3'

Tento oligonukleotid obsahuje Kozákovu Xbal sekvencí.

3'komplementární oligonukleotid:

3'-GGGATGCATTTACTAGAAGCCACAGCTGCCTC-3' '

Tento oligonukleotid obsahuje místo Nsil a stop-kodon.

Amplifikovaný fragment byl klonován do plazmidu pCR2.1 (souprava TA Cloning kit, Invitrogen) a sekvencován. Fragment Xbal/Nsi velikosti 681 bp obsahující hGH cDNA byl ligován s fragmentem Xbal/Nsil z pSL3353, 'čímž byl vytvořen plazmid pXL3354.

Elektropřenos byl proveden za podmínek: pole 200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, frekvence 1 Hz. Elektrické pole bylo aplikováno bezprostředně po injekci plazmidové DNA. Přítomnost hGH byla měřena sedm dnů po injekci plazmidu v supernatantu ze svalu rozdrceného v pufru PBS po centrifugaci ve 12000 x g. Množství hGH se stanovilo ELISA testem (Boehringer Manheim). Výsledky jsou uvedeny v tab. 17.

·· *· • · · · • ·· • · · · • · ·

9999 99

99 99 99

9 9 9 9 9 9 • · · ·· · • · · ··» ··· 9 · .. 9 9

999 9999 99 99

Tabulka 17

Exprese lidského růstového hormonu

	injekce genomové hGH (pXL3353)	injekce hGH cDNA (pXL3354)
elektro přenos		+	—	+
horní holenní sval	87, 1 ±9,3 (n=10)	1477,6 ± 67, 6 (n=10)	‘ 2820,0 ± 487,5 (n=10)	15739,1 ± 915,5 (n=10)

Jsou uvedeny průměrné hodnoty exprese hGH + SEM (pg/sval).

Tyto výsledky ukazují, že užití přístroje pro elektropřenos podle předkládaného vynálezu dovoluje mnohem vyšší expresi lidského růstového hormonu. Toto zvýšení bylo pozorováno, ať'byl' podán genomový klon nebo cDNA kódující hGH.

Příklad 27

Elektropřenos vakcinačních transgenů

Tento příklad ukazuje, že přístroj pro elektropřenos podle předkládaného vynálezu zlepšuje přenos genů pro genovou (DNA) vakcinaci. V tomto příkladu byly užity následující produkty: VR-HA, plazmidová DNA . obsahující ' gen pro hemaglutinin z chřipkového viru (kmen A/PR/8/34) mVRgBDT, obsahující gen pro glykoprotein B (gB) cytomegaloviru (kmen Towne), komerčně dostupné: ketamin,

Plazmid lidského Ostatní produkty jsou běžné xylazin, fyziologický roztok

0,9« NaCl). Experiment byl proveden na 9 týdnů starých samicích myší Balb/c. Myši . pocházej ící z různých klecí byly náhodně promíchány před pokusem (randomizace).

Byl použit komerční osciloskop a generátor elektrických pulzů (obdélníkových nebo čtvercových) Electroplulser PS15 (Jouan, Francie). Elektrody byly ploché elektrody z nerezové oceli vzdálené od sebe 5 mm. .

Myši byl anestetizovány směsí ketaminu a xylazinu. Roztok plazmidu (50 μΐ roztoku 20 pg/ml nebo 200 pg/ml v 0,9% NaCl) byl injikován skrz kůži podélně do horního lýtkového svalu levé končetiny pomocí stříkačky Hamilton. Elektrody' byly potřeny vodivým gelem a injikovaná končetina byla pak umístěna mezi elektrody, tak aby s nimi byla v kontaktu.

Elektrické pulzy byly aplikovány kolmo na osu svalu pomocí generátoru obdélníkových pulzů 20 sekund po injekci. Pomocí osciloskopu se sledovalo elektrické pole: 200 V/cm, po sobě jdoucích pulzů s frekvencí 1 Hz.

Pro hodnocení stimulace imunitní odpovědi byl použit následující imunizační protokol:

DO	->	byl odebrán vzorek pre-imunního séra
Dl	->	první injekce, s elektropřenosem nebo	bez
D21	—>	odebrán vzorek imunního séra
D22	—>	zesilující injekce, s elektropřenosem	nebo
D42	->	odebrán vzorek imunního séra
D63	—>	odebrán vzorek imunního séra

Vzorky krevního séra byly odebírány z retroorbitálního sinusu. Množství specifických protilátek bylo stanoveno pomocí ELISA testu. Každé nastavení experimentálních podmínek bylo testováno v^z 10 bodech, tj. pomocí 10 zvířat injikovaných jednostranně.

Výsledky uvádějící titry protilátek proti chřipkovému hemaglutininu jsou uvedeny v tab. 18.

• · · · » · · 0 • ·· • · 0 0 • · « »0 0 0 · · ·· ·· > · · 0 » 0 0 0 •00 000

Tabulka 18 '

Protilátková reakce na chřipkový hemaglutinin

	elektro přenos	DO	D21	D42	D63
VR-HA (i gg)	—	<50	132 ± 739	1201 ± 4380	1314 ± 2481
VR-HA (i pg)	+	<50	1121 + 1237	10441 ± 7819	8121 ± 5619
(p)			(0.0135)	(0.0022)	(0.0033)
VR-HA (10 pg)		<50	781 ± 666	5113 ± 16015	4673 ± 8238
VR-HA (10pg)	+	<50	4153 ± 2344	74761 ± 89228	41765 + 52361
(p)			(0.0002)	(0.0005)·	(0.0007)

Titr protilátek proti chřipkovému hemaglutininu po injekci 1 nebo 10 pg VR__HA DNA buďto bez (-) a nebo s ( + ) aplikací elektrického pole pomocí přístroje pro elektropřenos. tyto výsledky představují geometrický průměr ze skupin po 10 zvířatech (N=8 pro skupinu injikovanou 1 pg, exponovanou elektrickému poli a testovanou v D63) ± směrodatná odchylka. Hodnota p byla získána srovnáním vždy dvou skupin injikovaných DNA a pak buďto s aplikací elektrického pole nebo bez pomocí neparametrického MannWhitneyova statistického testu.

Tyto výsledky ukazují, že titr protilátek proti chřipkovému hemaglutininu výrazně vzrostl, a to asi 10 x, ve skupině, kde byl aplikován přístroj pro elektropřenos. A skutečně, myši, 'které obdržely pouze 1 pg DNA a pak na ně byl použit přístroj pro elektropřenos, měly vyšší titr protilátek proti hemaglutininu než myši, které obdržely 10 pg DNA, ale nebyly podrobeny působení elektrického pole.

Výsledky ukazující protilátkovou reakci namířenou proti CMV glykoproteinu B jsou uvedeny v tab. 19.

• · ♦ · β · · · · · · « • ·· · · · · · ♦ • · · · · · · ······ • · · · · · · ···· ·· ·····«· «· «·

Tabulka 19

Protilátková reakce na CMV glykoprotein B

	elektro přenos	DO	D21	D42	D63
VR-gB (10μσ)	—	<50	73 ± 138	755 ± 1766	809 ± 1363
VR-gB (10pg)	+	<50.	200 ± 119	3057 ± 1747	2112 ± 1330
(P)			(0.0558)	(0.0108)	(0.0479)

Titr protilátek proti CMV glykoproteinu B po injekci 10 pg VR-gB DNA buďto bez (-) a nebo s (+) aplikací elektrického pole pomocí přístroje pro elektropřenos. -Tyto výsledky představují geometrický průměr ze skupin po 10 zvířatech (N=9 pro skupiny exponované elektrickému poli) ± směrodatná odchylka. Hodnota p byla získána srovnáním vždy dvou skupin injikovaných DNA a pak. buďto s aplikací elektrického pole nebo bez pomocí neparametrického MannWhitneyova statistického testu.

Tyto výsledky ukazují, že titr anti-gB protilátek vzrostl asi 4 x do 42.dne .(D42) ve skupině podrobené působení elektrického pole ve srovnání s kontrolní skupinou. Kromě toho, jak již- bylo pozorováno dříve, rozptyl (směrodatná odchylka) je značně snížen u myší po aplikaci přístroje pro elektropřenos ve srovnání s myšmi bez této aplikace (kontrolní myši).

Příklad 28

Přístroj pro elektropřenos k transfekci nádorových buněk

Tento příklad ilustruje použití přístroj pro elektropřenos ke zlepšení přenosu nukleové kyseliny' do nádorové tkáně. Konkrétně, modifikací zařízení podle

444 941 • I • · · 4 předkládaného vynálezu, aby poskytl vyšší napětí, než které je výhodné pro elektropřenos nukleové kyseliny do svalu, lze dosáhnout účinného (a většiny dalších transfekce in vivo nádorových buněk druhů buněk). ' Tento příklad také demonstruje účinek elektropřenosu na různé druhy nádorů, na nahé buďto lidského původu implantovaných (imunodeficientní)' myši, nebo myšího původu implantované na C57B1/6 (imunokompetentní) myši. Účinek pulzů elektrického pole s nízkou intenzitou byl demonstrován pomocí:

a/transfekce plazmidové DNA intratumorální injekcí, b)sekrece proteinu' kódujícího transgen do plazmy po intratumorání injekci.

Materiál a metody

Nádorové štěpy byly implantovány na jednu stranu buďto nahé myši nebo myši C57B1/6 vážícíc 18 až 20 g. Nahým myším byl implantován lidský plicní karcinom (H1299) nebo adenokarcinom tlustého střeva (ΉΤ29) v objemu 20 mm³. Myším C57B1/6 byl implantován myší' fibrosarkom (LBP)' (10⁶ buněk) nebo melanom (B16) nebo plicní karcinom (3LL) v objemu 20 mm³. ,

Myši byl anestetizovány směsí ketaminu a xylazinu. Každý z plazmidů pXL3031 (cytoplazmatická luciferáza) nebo pXL3010 (secernovaná alkalická fosfatáza) byl injíkován intratumorálne po té, co nádory dosáhly očekávané cílové velikosti. Roztok plazmidu (40 μΐ roztoku 250 pg/ml ve 20mM NaCl a 5% glukóze) byl injíkován. do středu nádoru pomocí stříkačky Hamilton. laterální povrch nádoru byl potřen vodivým gelem a nádor byl umístěn mezi elektrody. Elektrické pulzy byly aplikovány pomocí generátoru obdélníkových pulzů 20 až 30 sekund po injekci. Pomocí osciloskopu se sledovaly • · · · φφφφ * ·· « • »· · · · φ · · •ΦΦΦ φ φ φ φφφ φφφ

Φφφ · φ φ φ φφφφ · · φφφφφφφ φ α φφ parametry . elektrické pole: 200 až 800 V/cm, délka pulzu 20 ms, frekvence 1 Hz.

Byl použit komerční osciloskop a generátor elektrických pulzů (obdélníkových nebo čtvercových) Electropulser PS15 (Jouan, Francie). ' Elektrody byly destičkové elektrody z nerezové oceli vzdálené od sebe 0,45 až 0/7 cm.

Pro vyhodnocení transfekce nádoru luciferázou byly myši (zpravidla 10 v jedné pokusné skupině, ale závisí to na podmínkách) utraceny 2 .dny po podání plazmidu. Nádory byly vyjmuty, zváženy, a rozdrceny v lyzovacím pufru. Suspenze byla centrifugována a byl tak' získán čistý supernatant. měření aktivity luciferázy se provádělo v 10 μΐ supernatantu pomocí komerčního luminometru, ve kterém se automaticky přidával k roztoku substrát. Intenzita ' luminiscence . je uvedena v relativních jednotkách (RLU) na nádor.

Plazmatická hladina secernované alkalické fosfatázy (SeAP) byla měřena jak bylo již popsáno v příkladu 20, a sice 1., 2. a 8. den (Dl, D2 a D8) po injekci DNA.

Výsledky a diskuse Elektropřenos do lidského plicního karcinomu.

V prvním pokusu byly výsledky získané v podmínkách stejných jako pro elektropřenos genu do svalu, tj. elektrické pole 200 V/cm, 8 pulzů, frekvence 1 Hz, porovnány s výsledky získanými při vyšším napětí v rozmezí 300 až 500 V/cm. Cílem druhého pokusu bylo stanovit optimální napětí , které je třeba použít k dosažení maximální transfekce, a to v rozmezí 400. až 300 V/cm. Výsledky jsou uvedeny v tab. 20.

• ·

I « • · > · · 4

949 999 • · · · • 4444

Tabulka 20

Elektropřenos do lidského plicního karcinomu

RLU/nádor
	pokus 1	pokus 2
V/cm	průměr	SEM	průměr	SEM
0	32 807 758	6 790 565	44 723 317	. 10 163 3
200	129 744 454	39 119 425 '
300	585 033 '326	134 810 534
400	5 266 632 45	1 473 785 460	8 488 242 519	3- 881 .651 201
500			14 201 644 540	6 162 551 269
60 0			7 401 041 930	5 323 128 047
8 00			11 884 115 963	4 048 340 474

Plazmid pXL3031 byl injikován do plicního karcinomu

H1299, který dosáhločekávané cílové velikosti 200 až 300 mm³ u samic nahých myší. Jsou uvedeny hodnoty exprese luciferázy se střední chybou průměru (SEM).

V tabulce 20 je patrné, ze srovnání s kontrolní skupinou, kde byla DNA injikována bez následné aplikace elektrického pole, že:

• přenos genu je zlepšen způsobem, který je závislý, na použitém napětí od 200 do 400 V/cm dokud není dosaženo stálé hodnoty (plata) odpovídající získané maximální transfekci, které bylo dosaženo počínaje 500 V/cm, • při vyšších napětích (600 a 800 V/cm) došlo k popáleninám kůže nebo i k hlubším popáleninám, avšak exprese transgenu nebyla snížena, • zesílení přenosu genu elektropřenosovým pří.strojem bylo 240x až 320x.

Eletropřenos do lidského adenokarcinomu tlustého střeva·

Výsledky těchto dvou pokusů jsou uvedeny v tab. 21. Ve srovnání . s kontrolními skupinami bez elektropřenosu se ukazuje, že aplikace elektrického pole s intenzitou 600 V/cm umožňuje dosáhnout optimální míry -transfekce bez ohledu na • 9

9 9 • 99 9

9

9

9

999 9999 míru transfekce prováděnou bez elektropřenosu. Transfekce byla zesílena 6x až 23x a byla obdobná při intenzitě 400 a 600 V/cm.

Tabulka 21

Elektropřenos do lidského adenokarcinomu tlustého střeva

RLU/nádor
	pokus	1	pokus	2
V/cm	průměr	SEM	průměr	SEM
0	4 043 062	1 827 237	634, 999 -	338 311
400	16 037 136	5 420 572 .
500	14 Ό96 640	7 629 212	5' 537 359	3 571 433
600	24 223 872	9 217 062	14 607, 850	6 392 841

Plazmid pXL3031 byl injikován do lidského adenokarcinomu tlustého střeva HT29, který dosáhl očekávané, cílové velikosti 100 až 200 u samic nahých myší. Jsou uvedeny průměrné hodnoty exprese luciferázy se střední chybou průměru (SEM). Vzdálenost mezi elektrodami byla 0,45 cm.

Elektropřenos do myšího fibrosarkomu

Výsledky těchto dvou pokusů jsou uvedeny v tab. 21. Ve srovnání s kontrolními skupinami- bez . elektropřenosu se ukazuje, že aplikace elektrického pole ^: s intenzitou 300 až 600 V/cm umožňuje zesílení transfekce 30x až 70x bez ohledu na použité napětí.

Tabulka 22

Elektropřenos do myšího fibrosarkomu

RLU/nádor
	pokus 1	pokus 2
V/cm	průměr	SEM	průměr	SEM
0	581 270	348 645	394 922	129 395
300	26 296 355	14 811 826	11 579 942	4 615 332
400	42 498 832	31 152 744	10 431 574	3 495 118
500	16 966 612	12 754 188	6 034 954	1 818 465
600			10 952 214	7 093 932

• · · · • · · · • ·· • · · • · · • · · · * · • · · • · · • ··· • · ·· ·· • · ·

Plazmid pXL3031 byl injikován do myšího fibrosarkomu LPB, který dosáhl očekávané cílové velikosti 100 až 200 u samic myší C57B1/6. .Jsou uvedeny průměrné hodnoty exprese luciferázy se střední chybou průměru .(SEM) .

Elektropřenos do myšího melanomu

Výsledky jsou uvedeny v tab. 22.

s kontrolními skupinami bez elektropřenosu aplikace elektrického pole s intenzitou 500 zesílení transfekce až 24x.

Ve srovnání se ' ukazuj e, že V/cm umožňuje

Tabulka 23

Elektropřenos do myšího melanomu

RLU/nádor
V/cm	průměr	SEM
0	1 318 740	667 588
3 00	14 275 486	7 625 262
500	32 249 218	12 605 041
600	-17 215 505	6 241 666

Plazmid pXL3031 byl injikován do myšího melanomu B-16, který dosáhl očekávané cílové velikosti 200 až 300 mm³ u samic myší C57B1/6. Jsou uvedeny průměrné hodnoty exprese luciferázy se střední chybou průměru (SEM).

Elektropřenos

Výsledky do myšího plicního karcinomu tohoto pokusu jsou uvedeny v tab. 24.

Tabulka 24 Elektropřenos do myšího plicního karcinomu

RLU/nádor
V/cm	průměr	SEM
0	121 080	37 3 -22
300	3 715 877	2 936 873
500	470 499 612	237 588 443
600	53 275 350	23 857 181

• · ·

Plazmid pXL3031 byl injikován do myšího- 'plicního karcinomu 3LL, který dosáhl po pěti dnech očekávané cílové velikosti 30 mm3 u samic myší C57B1/6. Jsou uvedeny průměrné hodnoty exprese luciferázy se střední chybou průměru (SEM).

Aplikace elektrického pole s intenzitou 500 V/cm umožňuje optimálně zlepšuje přenos genu '3885x. Tyto výsledky jsou působivé zejména proto, že tyto nádory osou velmi obtížně transfekovatelné nahou DNA v podmínkách bez elektropřenosu ve srovnání s jinými testovanými nádory.

Elektropřenos -secernovatelného transgenu do lidshého plicního karcinomu.

Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny v tab. 25.

Tabulka 25

Elektropřenos secernovatelného transgenu do lidského plicního karcinomu

	plazmatická hlaains	i alkalické fosfatázy
čas vyhodnocení	0 V/cm (průměr + SEM)	500 V/cm (průměr ± SEM)
Dl	1, 42 ± 0,07	8, 90 ± 1,74
D2	1,4 0 + 0, 01	9,04 + 1,55
D3	1,31 ± 0, 01	1,67 ± 0,12

Plazmid pXL3010 (exprimující SeAP) byl injikován do lidského plicního karcinomuH1299, který dosáhl očekávané cílové velikosti 200 až 300 mm3 u samic nahých myší. Jsou uvedeny průměrné hodnoty exprese luciferázy se střední chybou průměru (SEM). Bylo aplikováno elektrické pole s intenzitov 500 V/cm a hladina SeAP byla detekována 1, 2 a 8 dnů po injekci plazmidu.

Výsledky tohoto pokusu demonstrují dramatické přechodnézvýšení SeAP v plazmě po transfekci nádorových buněk pomocí elektropřenosu. Lze očekávat, že podání- imunostimulačních genu, jako je např·. GM-CSF nebo IL-2, povede k produkci • Φ » φ φ φ » φ φ φ φφφ φφφ φ φ φφ φφ φ φ · φ účinného množství cytokinů. Navíc tyto údaje, v kombinaci s údaji o expresi luciferázy, vedou k předpokladu, že podání secernovaného cytokinů se sebevražedným genem, jako je thymidinkináza z HSV, povede k významnému protinádorovému účinku. Alternativně -data o SeAP přepokládají, že transfekce anti-angiogenního genu, jako je např. aminokoncový fragment nebo angiostatin elektropřenosu by protinádorovou terapií.

Uvedená data dále demonstrují, elektropřenos terapeutických genů do poskytuje optimální elektrické pole s intenzitou 400' až 600 V/cm, s optimem 500 V/cm ± 10 % (tj. 450 až 550 V/cm)A (nebo mohla že urokinázy (ATF) prostřednictvím endostatin), být účinnou přístroj pro nádorových buněk

Předkládaný vynález není nijak omezen uvedenými příklady provedení vynálezu. Odborníkovi jsou zřejmé četné další modifikace na základě popisu a obrázků zde uvedených. Tyto modifikace také spadají do předmětu vynálezu, definovaného následujícími patentovými nároky.

Je třeba zdůraznit, že všechny údaje o velikosti nukleových kyselin nebo proteinů co. do počtu baží či aminokyselin, a také uváděné molekulové hmotnosti pro nukleové kyseliny či polypeptidy, jsou jen přibližné a mají jen popisný ilustrativní chrakter.

Popisy v citovaných publikacích jsou plně zahrnuty v odkazech.

Claims (9)

1. Systém pro in vivo přenos nukleových kyselin do buněk mnohobuněčných vyznačuj ící eukaryotických organismu tím, že buňky tkáně jsou přivedeny do kontaktu s nukleovou kyselinou, - která má být do nich vnesena, přímým topickým nebo systémovým podáním do tkáně, a že přenos do buněk je zajištěn tím, že se na tkáň aplikuje jeden nebo několik elektrických pulzů- s intenzitou 1 až 600 V/cm, přičemž systém obsahuj e: '

   a) generátor elektrických pulzů, který produkuje pulzy s dobou pulzu delší než 1 ms, intenzitou 1 až 600 V/cm a frekvencí 0,1 až 1000 Hz, a

   b) elektrody připojené ke generátoru elektrických pulzů pro vytvoření elektrického pole ve tkáni, která je v kontaktu s elektrodami. ·

   Systém podle nároku 1 vyznačuj ící se tím, že generátor elektrických pulzů zvoří pulzy s intenzitou 1 až 400 V/cm.

   Systém podle nároku Ivyznačující se tím, že generátor elektrických pulzů tvoří pulzy s intenzitou 30 až- 300 V/cm.

   Systém podle nároku Ivyznačující setím, že generátor elektrických pulzů tvoří pulzy s dobou trvání delší než 10 ms.

   • ΦΦΦ · ·· • φ φ φ - · · · · φ φ · φ •ΦΦ φ φφφφφ φφ φφφ φ φ φφφφφφ φφφ φ φ φ φ φφφφ φφ φφφ φφφφ φφ φφ

   5. Systém podle nároku lvyznačující se tím, že generátor elektrických pulzů tvoří 2 až 1000 pulzů.

   6. Systém podle nároku lv y zn a č u jí c i. se· t i m, že generátor elektrických pulzů tvoří nepravidelné pulzy, přičemž funkce popisující závislost intenzity pole na čase je proměnlivá.

   Systém podle nároku 6vyznačující že integrál 'funkce popisující proměnlivost pole v čase přesahuje hodnotu 1 kV * ms/cm.

   se tím, elektrického

   Systém podle nároku 7 vyznačuj ící s e.

   t i m, že integrál je roven nebo je větší než 5 kV * ms/cm.

   9. Systém podře nároku 1 v y z n a č u j i c i s e tím, že generátor elektrických pulzů tvoří pulzy vybrané ze skupiny obsahující pulzy typu obdélníkových kmitů, exponenciálně tlumených kmitů, oscilujících unipolárních kmitů omezeného trvání a oscilujících bipolárních kmitů omezeného trvání.

   10. Systém podle nároku lvyznačuj i c i se tvoří tím, pulzy že generátor elektrických obdélníkových kmitů. pulzů 11 . Systém podle nároku 1 v y z n a č že elektroda je vnější elektroda na kterou se má působit. u j i c i se pro umístění na t i m, tkáni,

   • 9 ti 9

   99 ti 99 titi 99

   9 9 99 9 9 9 9 9 9

   99 9 9 9 9 9 9

   9 99 9 9 ti ti····· ·· · · titi ·· ··« ···· titi titi

   12. Systém podle nároku lvyznačující se tím, že elektroda je vnitřní elektroda implantovatelná do tkáně, na kterou se má působit.

   13. Systém podle nároku lvyznačující se t í m, že jedna elektroda je vnější elektroda pro umístění na tkáni, na kterou se má působit, a druhá elektroda je vnitřní·elektroda implantovatelná do tkáně, na kterou se má působit.

   14. Systém podle nároku 13 v y z n a č u j í c í s e t í m, že vnější elektroda má takový tvar a rozměry, aby byla v kontaktu s vnější částí těla subjektu v blízkosti velkých svalů.

   15. Systém podle nároku 14 v y z n a t í m, že elektroda je plochá destičková elektroda

   Systém podle nároku 14 vyznačující' se tím, že elektroda je poloválcovitá destičková elektroda.

   17. Systém podle nároku lvyznačující se tím, že elektroda je intraarteriální nebo intravenózní elektroda.

   18. Systém podle nároku 12 vyznačující se tím, že vnitřní elektroda je injektorový systém, který umožňuje současně podávat nukleové kyseliny a .aplikovat elektrické pole.

   φφ • φ · φφ ·· φφ • ΦΦΦ ···· ΦΦΦ· • φφ φ ΦΦΦΦΦ φ φ φφ φφ φ ΦΦΦ··· φφφ φ φ · · φφφφ φφ ··· Φ·Φ· ·· ··

   19. ' Systém podle nároku 18 vyznačující se tím, že elektroda je vnější elektroda pro umístění na tkáni, na kterou se má působit.

   20. Systém podle nároku 1 v y z n a č u j í c í se tím, že elektroda je elektroda z nerezavějící oceli.

   21. Zlepšené zařízení pro in vivo přenos nukleových kyselin do buněk mnohobuněčných eukaryotických organismů, které obsahuje, prostředek pro vytváření elektrických, pulzů spojený s elektrodami pro vytváření elektrického pole in vivo ve tkáni, vyznačující se tí m, 'že zlepšení obsahuje takovou úpravu ' prostředku pro vytváření elektrických pulzů, že tvoří pulzy s dobou trvání delší než 1 ms, intenzitou 1 až 600 V/cm a frekvencí 0,1 až 1000 Hz. .

   22. Zařízení podle nároku 21 vyznačující' se t. í m, že prostředek pro vytváření elektrických pulzů tvoří pulzy s intenzitou 1 až 400 V/cm.

   23. Zařízení podle nároku 21 vyznač u jící s e tím, že jeto flexibilní katétr.

   24. Zařízení podle nároku 21 vyzná č u j í c í se t í m, že je to zařízení pro vnesení nukleových kyselin do tkání pomocí elektrody pronikaj ící do tkáně.

   25. Zařízení podle nároku 24 vyznačující tím, že elektroda pronikající do tkáně je jehla.

   ···<

   '26. Zařízení podle nároku 21 vyznačující se tím, že je to zařízení pro vnesení nukleových kyselin do buněk povrchových tkání subjektu.
2. 2-7. Zařízení podle nároku 21 v y z n a č u j í c i se tím, že prostředek pro vytváření', elektrických pulzů je upraven tak, aby tvořil pulzy 1 až 600 V/cm, a to tím, že napěťový výstup je modifikován tak, aby nepřesáhl napětí odpovídající 600 V/cm.

   28. Zařízení podle nároku 27 vyznačující se t í m, že napětí' je nastaveno na konstantní hodnotu napětí a elektrody jsou nastaveny na konstantní vzájemnou vzdálenost.

   29. Zařízeni podle nároku 21 v y z n a č -u j i c 1 se tím, že prostředek pro vytváření elektrických pulzů je upraven tak, aby tvořil pulzy 1 až 600 V/cm, a to tím, že se zařízení označí tak, aby se nepřesahovalo napětí odpovídající 600 V/cm.

   30. Zařízení podle nároku 21 vyznačující se tím, že prostředek pro vytváření elektrických pulzů tvoří pulzy s intenzitou 30 až 300 V/cm.

   31. Zařízení podle nároku 21 vyznačující se tím, že prostředek pro vytváření elektrických pulzů tvoří pulzy s intenzitou 400 až 600 V/cm.

   32. Zařízení podle' nároku 21 vyznačující se tím, že prostředek pro vytváření elektrických pulzů tvoří pulzy s dobou pulzu delší než 10 ms.

   00 00 • 0 · 0 • 00

   0 0 0 ·

   0 0 0

   0000 00

   33. Zařízení podle nároku 21 vyznačpjící se tím, že. prostředek pro vytváření elektrických pulzů tvoří 2 až 1000 pulzů.

   34. Zařízení podle nároku 21 vyznačující se tím, že prostředek pro vytváření elektrických pulzů tvoří nepravidelné pulzy, přičemž funkce popisující závislost intenzity pole načase je proměnlivá.

   35. Zařízení podle nároku 21 vyznačující se t í m, že prostředek pro vytváření elektrických pulzů tvoří pulzy vybrané ze skupiny obsahující pulzy typu obdélníkových kmitů, exponenciálně tlumených kmitů, oscilujících unipolárních kmitů omezeného trvání a oscilujících bipolárních kmitů omezeného trvání.

   36. Zařízeni podle nároku 21 vyznačujme! se tím, že prostředek pro vytváření elektrických pulzů tvoří pulzy obdélníkových kmitů.

   37. Zařízení podle nároku 21 vyznačuj í c í tím, že elektroda je z nerezavějící oceli.

   • 9 · 9 9 9 9 · / • · , · · · · · ·

   9 9 9 9 9 9 • 9 9 999 999

   1/20

   Účinek elektrických pulzů s vysokou intenzitou pole na transfekci plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru (SEM).

   o o*
3. 3 N ι—I

   Λ

   Ή

   -S s

   -P ~ N rt ffi «—s r-4

   Ή

   O tí

   Φ

   (1) Λ! r-1 (1) 0 U Λ »W '<D ω Λ! 0 •3 •H N μ rd +j 3 Λ! & OJ r-1 00 w

   Obr. la • ··

   TV w- qq ' Λ Λ · « • · · · • · · · • · · · • · · · · · · • · « · · · ' 2/20

   Účinek elektrických pulzů s vysokou intenzitou pole na transfekci plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru (SEM).

   ίϊΙΗ θΛθ2[-[θο

   Elektrické pole (V/cm) a trvání pulzu v (ms) (8 pulzů s frekvencí 1 Hz)

   Obr. lb • 9 •99 9 99999

   99 99 9 9 9 999999

   9 9 9 9 9 9 9

   9999 99 999 9·99 9 « 99

   3/20

   Účinek elektrických pulzů se střední intenzitou pole na transfekci plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru (SEM).

   Elektrické pole (V/cm) a trvání pulzu (ras)

   Obr. 2a
4. 4/20 ··

   I « 0· ·· 00 0 0 0 0

   0 0 0 ·

   0 000 000

   0 0

   0 0 0 0

   Účinek elektrických pulzů se střední intenzitou pole na transfekci plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru (SEM).

   Elektrické pole (V/cm) a trváni pulzu v (ms) (8 pulzů s frekvenci 1 Hz)

   Obr. 2b
5. 5/20 « « · · • · · · · • · ·

   9 9 9 9

   9 9 9

   9 99 9 99 · « · • · · · • · 9 ·

   99 9 999

   9 9

   9 · 9 9

   Účinek elektrických pulzů se slabou intenzitou pole na transfekci plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru (SEM).

   (I)

   O •rl

   G &

   •P '(0

   O •rl •rl

   P

   Π) o

   t-1

   -< -4 ·< Φ ·<

   o

   8 § § § § § § § § § § § 8 S §82” mn ©λο^τθο

   Elektrické pole (V/cm) a trvání pulzu (ms) (8 pulzů s frekvencí 1 Hz)

   Obr.3a • · 9

   9 9 ·

   999 999 • · 9

   9 9 9 ·
6. 6/20

   (0 3 3 r-d * Φ i—1 > w £ H cn o a 0 Λ 3 3 3 Ή 3 >φ o 3 4-» Φ ρ Ή N ι—1 O a 3 Λ (0 Φ +J o £ 3 X! 43 Ή Ή U 3 3 Ή 3 O (3 O 43 u X) Φ (ti O >3 i—1 u 44 ω 'S' W φ r~- +1 r- w Csl (0 31 44 X O »3 a 3 N u i—1 O 3 z 43 a Q >3 'Φ 3 λ > 3 o O >Φ '>1 u οΠ 44 Ή υ β 3 •rd N a 3 3 44 r-d (0 44 a 3 Φ Φ i—1 •H τ) Φ υ φ 44 > φ 3 44 m φ ω ·». 3 3 •rd •rd (ti >w >u 3 >1 o 44 β

   Elektrické pole (V/cm) a trváni pulzu v (ms) (8 pulzů s frekvenci 1 Hz)

   Obr. 3b
7. 7/20 • · «· · · · ..

   • ·· · «·« . · «· · ··· · · ··» < · . · . · · «··«.» • · · · · . · «... ·· ... «··· > ·.

   Φ r-ι tο rΟ, CM Ω X a

   Φ

   Ο

   4->

   ♦Η

   Ν

   Φ φ

   +J φ

   ρ ο Λ Φ ι—ι w á

   Ω ,φ > Ο Ό •Η g Ν Φ ι—I a

   •Η υ

   Φ a

   +1 φ

   4-1 ο

   α

   τ) ο

   γΦ ,φ φ

   ρ >φ υ

   a φ

   φ φ

   Ό

   Φ >

   Φ

   φ φ Φ Φ •Η Φ )φ Ρ >1 •φ 4-) g Ν <—1 Φ a Φ Φ Ή φ a φ > 2 Η ω Φ 0 •Η Φ w -—- Φ 'Φ Λ λ > ο Φ 3 υ >, Ρ 4-) Λ Ή Ρ >φ -Ρ η Λί Φ g υ •γΗ Φ 0 Φ Φ Γ“Η Ρ 'Φ φ Λ4 a Λ! 4-) r—1 ο φ Λ 0 Λί Φ 'Φ Ό Λ •1 «—1 Φ Φ Ο ο X! >, XI υ •Η Φ ,ρ Ρ Ν Φ Ή Φ * °Φ Ρ Φ tn 0 Φ Φ Ρ ο Λ Ό Φ Ή ω >Ρ Μ >υ ο 4-) Ω Φ Ό Φ •

   4444 4
8. 8 8 8 8 8 8 8 8

   8 8 8 8 § ⁵ '

   8 8 « ”

   Ν ι—I 3 &

   Ή

   C '(β >

   Ρ

   -Ρ

   Ν ιβ a e

   ϋ Ή > ^ϋ > α ~ Q) >

   Φ Λ! r-Η φ Ο Ρ CL <Ρ ,φ tli Λ!

   Ο «3 •Η Ν Ρ γΗ •Ρ 3 Λί Λ Φ η ω W

   Obr. 4a

   4 ·

   8/20

   44 4 · 4 44 44

   4444 444· 4«··

   444 4 4 4444

   44 44 4 4 4 444444

   4 4 4 4 4 4 4

   4444 44 «444444 4· 44

   Účinek elektrických pulzů se slabou intenzitou pole a s různou délkou trváni na transfekci plazmidové DNA pXL2774 do horního holenniho svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru (SEM).

   Elektrické pole (V/cm) a trváni pulzu v (ms) (8 pulzů s frekvenci 1 Hz)

   Obr. 4b • · · 0 0 0
9. 9/20

   Účinnost elektropřenosu plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši při slabé intenzitě pole, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru (SEM).

   relativní exprese luciferázy vztažená k průměrné hodnotě kontrolní skupiny (samotná DNA), která byla standardizovaná na 1