CZ299473B6 - Nukleová kyselina a elektrické pole jako sdruženýprodukt pro prenos nukleové kyseliny do bunek prícne pruhovaného svalstva - Google Patents

Abstract

Predkládané rešení se týká mimorádného zlepšení in vivo prenosu nukleových kyselin do bunek prícne pruhovaného svalstva. Predmetem rešení je nukleovákyselina a elektrické pole s intenzitou 1 až 800 V/cm, jako sdružený produkt, který je urcen pro jejich samostatnou nebo casove oddelenou aplikaci invivo do prícne pruhovaného svalu a pro genovou terapii založenou na in vivo elektrotransfekci do prícne pruhovaného svalu následující po podání nukleové kyseliny, kdy celková doba aplikace elektrického pole je delší než 10 ms. Rešení je využitelné pri genové terapii.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká mimořádného zlepšení in vivo přenosu nukleových kyselin do buněk příčně pruhovaného svalstva. Konkrétně se vynález týká nukleové kyseliny a elektrického pole s intenzitou 1 až 800 V/cm jako sdruženého produktu, který je určen pro jejich samostatnou ío nebo časově oddělenou aplikaci in vivo do příčně pruhovaného svalu a pro genovou terapii založenou na in vivo elektrotransfekci do příčně pruhovaného svalu následující po podání nukleové kyseliny, kdy celková doba aplikace elektrického poleje delší než 10 ms. Vynález je využitelný v genové terapii.

Dosavadní stav techniky

Přenos genů do dané buňky je základním kamenem genové terapie. Avšak jedním z problémů je, jak vnést dostatečné množství nukleové kyseliny do buněk hostitele (příjemce), který má být léčen. A tato nukleová kyselina, obecně tedy požadovaný gen, pak musí být exprimována v transfekovaných buňkách. Jeden z přístupů používaných k tomuto účelu spočívá v tom, že se nukleová kyselina integruje do virového vektoru, zejména retroviru, adenoviru nebo adeno-asociovaného viru. Tyto systémy využívají k proniknutí do buňky výhod mechanismů, které vyvinuly viry, a také užívají jejich ochranných mechanismů proti degradaci. Avšak tento přístup má řadu nevý25 hod. Jednou z nich je riziko produkce infekčních virových částic schopných rozšíření v hostitelském organismu, a v případě retrovirových vektorů ještě navíc riziko inzerční mutageneze. Kromě toho inzerční kapacita virových genomů pro terapeutické nebo vakcinační geny je značně omezena.

V každém případě vývoj virových vektorů vhodných pro použití v genové terapii vyžaduje velmi složité metody pro přípravu defektních virů a komplementačních buněčných linií.

Další přístup (Wolf et al., Science 247, 1 465-68, 1990; Davis et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93, 7 213-18, 1996) zahrnuje podávání nukleových kyselin plazmidového typu do svalu nebo krevního oběhu, ať již nenavázaných nebonavázaných na sloučeniny určené ktomu, aby usnadnily transfekci, jako jsou např. proteiny, líposomy, nabité lipidy nebo kationtové polymery jako je polyetylénimin, který je dobrým transfekčním činidlem in vitro (Behr et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 6 982-6, 1989; Felgner et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84, 7 413-7, 1987; Boussif et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92, 7 297-301, 1995).

Od doby původní publikace Wolffa et al. (viz výše) schopnost svalové tkáně inkorporovat DNA injikovanou ve formě volného plazmidu, se mnozí výzkumníci snažili zlepšit tento proces (Manthorpe et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 419—431; Wolff et al., 1991, BioTechniques 11, 474-485). Na základě toho se objevily jisté trendy, zejména šlo o:

· použití mechanických prostředků k nucenému vstupu DNA do buněk tak, že se DNA adsorbuje na částice a ty se pak „vstřelí“ do tkáně („gene gun“) (Sanders Williams et al., 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 2 726-2 730; Fynan et al., 1993, BioTechniques 11, 474485). Tento způsob se ukázal účinným v očkovacích strategiích, ale zasahuje pouze povrchové vrstvy tkání. V případě svalu by jejich použití nutně znamenalo chirurgický zákrok, aby se zajistil přístup ke svalu, neboť částice neprocházejí tkáněmi kůže, • injekci DNA, již ne však v plazmidové formě, ale ve spojení s molekulou schopnou sloužit jako nosič, usnadňující vstup komplexu do buněk. Kationtové lipidy, používané v mnohých způsobech transfekce, se u svalu ukázaly být zklamáním, neboť ty, které byly dosud testované, do konce inhibovaly transfekci (Schwartz et al., 1996, Gene Ther., 405—411).

-1 CZ 299473 B6

Totéž platí pro kationtové peptidy a polymery (Manthorpe et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 419—431). Jediným případem vhodné kombinace se zdála být směs polyvinylalkoholu nebo polyvinylpyrolidonu s DNA. Výsledný faktor zlepšení přenosu DNA u těchto kombinací je však nižší než 10 proti injekci „nahé“ DNA (Mumper et al., 1996, Pharmaceutical

Research 13, 701-709) • ošetření tkáně, do které se má injikovat DNA předem roztokem, který má zvýšit difúzi a stabilitu DNA (Davis et al„ Hum. Gene Ther. 4, 151-159) nebo podpořit vstup nukleových kyselin, např. indukcí buněčného dělení nebo regenerace. Ošetření se týkalo především použití lokálního anestetika nebo kardiotoxinu, vazokonstriktorů, endotoxinů nebo jiných ío molekul (Manthorpe et al„ 1993, Human Gene Ther. 4, 419-431; Danko et al., 1994, Gene

Ther. 1,114-121; Vitadello et al., 1994 , Hum. Gene Ther. 5 , 1 l-18).Tyto postupy předběžného ošetření se však obtížně provádějí. Tak konkrétně např. přípravek Bupivacaine, aby byl účinný, se musí užít v dávce velmi blízké letální dávce. Preinjekce hyperosmotické sacharózy, zamýšlená ke zvýšení difúze, nezvyšuje úroveň transfekce ve svalu (Davis et al., 1993).

Elektroporace nebo elektrického pole k permeabilizaci buněk se obecně využívají in vitro k podpoře transfekce DNA do buněk v kulturách. Ale dosud se mělo za to, že tento jev závisí na dosažení prahové intenzity elektrického pole, a že elektropermeabilizace lze dosáhnout pouze při relativně vysoké intenzitě elektrického pole 800 až 1200 V/cm v případě živočišných buněk. Tyto techniky byly také navrženy pro použití in vivo, ke zvýšení účinnosti protinádorových přípravků jako je např. bleomycin, u solidních nádorů člověka (patent US 5 468 228, L.M. Mir). S pulzy velmi krátkého trvání (100 mikrosekund) jsou tyto elektrické podmínky (800 až 1200 V/cm) velmi vhodné k intracelulámímu přenosu malých molekul. Tyto podmínky (pulzy v délce 100 mikrosekund) byly aplikovány, aniž by se však zlepšila účinnost přenosu nukleové kyseliny do jater, přičemž pole pod 1000 V/cm se ukázalo být zcela neúčinné a dokonce inhibující ve srovnání s injekcí DNA v nepřítomnosti elektrického pole (patentová přihláška WO 97/07826, Heller et al„ FEBS Letters, 389, 225-8, 1996).

Tento způsob má mnohé problémy, především při aplikaci in vivo, neboť aplikace elektrického pole takové intenzity může způsobovat rozsáhlé léze. Léze v cílové tkání nejsou problémem při léčení nádorů u pacientů s rakovinou, ale představují hlavní nevýhodou u zdravých subjektů nebo i nemocných subjektů, pokud se DNA podává do tkáně jiné než nádorové, a zvláště pak do příčně pruhovaného svalstva.

Podstata vynálezu

Zatímco všechny výše citované práce zdůrazňovaly nutnost užít elektrického pole s vysokým napětím řádu 1000 V/cm, aby byly účinné in vivo, původce předkládaného vynálezu zcela neoče40 kávaným a mimořádným způsobem ukázal, že přenos nukleových kyselin in vivo do svalů může být podstatně zlepšen, a to bez vedlejších účinků, když se sval vystaví působení elektrických pulzů nízké intenzity, např. 100 až 200 V/cm, a relativně dlouhého trvání. Kromě toho původce zjistil, že velká variabilita exprese transgenů, ke které dochází při přenosu DNA do svalu, popisovaná v dosavadním stavu techniky, byla významně snížena při použití způsobu podle vynálezu.

Tudíž předkládaný vynález se týká způsobů přenosu nukleových kyselin in vivo do jednoho nebo několika příčně pruhovaných svalů, kdy se buňky svalu přivedou do kontaktu s nukleovou kyselinou, která má být přenesena, přímým podáním do tkáně nebo topickým či systémovým podáním, a kdy je přenos způsoben aplikací na sval jednoho nebo několika elektrických pulzů s intenzitou 1 až 800 V/cm.

Výhodně je intenzita elektrického pole je 4 až 400 V/cm a celková-doba aplikace je delší než 10 milisekund (ms). Počet použitých pulzů je např. 1 až 100 000 a frekvence pulzů je 0,1 až 1000 Hz. Výhodně je frekvence pulzů 0,2 až 100 Hz.

-2CZ 299473 B6

Pulzy se mohou také aplikovat nepravidelným způsobem, přičemž funkce popisující intenzitu pole v závislosti na čase je proměnlivá. Tak např. aplikované elektrické pole může být výsledkem kombinace jednoho pole s intenzitou > 400 V/cm a výhodné 500 až 800 V/cm, s krátkým trváním jednotky (<1 ms), následovaného jedním nebo několika pulzy nízké intenzity, např. < 400 V/cm, výhodně < 200 V/cm a s dlouhý trváním integrál funkce popisující proměnlivost jednotky (>1 ms) elektrického pole v čase je větší než 1 kV x ms/cm a v dalším provedení přesahuje nebo je roven 5 kV x ms/cm.

io Ve výhodném provedení vynálezu je intenzita elektrického pole pulzů 30 až 300 V/cm.

Pulzy jsou vybrané ze skupiny obsahující pulzy tvaru obdélníkových kmitů, exponenciálně tlumených kmitů, oscilujících unipolámích kmitů omezeného trvání oscilujících bipolárních kmitů omezeného trvání a další formy. Ve výhodném provedení vynálezu jde o pulzy obdélníkových kmitů.

Aplikací elektrických pulzů lze provést jakýmkoliv způsobem odborníkovi známým, např. tak, že se užije:

• systém externích elektrod umístěných na obou stranách tkáně, která má být ovlivněna, zejména systém neinvazivních elektrod umístěných v kontaktu s kůží, · systém elektrod implantovaných do tkání, • systém elektrody/injektor, který umožňuje simultánní podání nukleových kyselin a aplikaci elektrického pole.

V textu této přihlášky vynálezu jsou termíny „přenos DNA (nebo nukleových kyselin) aplikací jednoho nebo několika elektrických pulzů“ a termíny „elektropřenos“ nebo alternativně „elektrotransfekce“ ekvivalentní a označují přenos nukleové kyseliny neb DNA pomocí aplikace nebo v přítomnosti elektrického pole.

Pro aplikaci in vivo']Q někdy nezbytné užít prostředek, který zajistí elektrickou vodivost v případě neinvazivních externích elektrod. Takovým prostředkem je např. elektrolyt ve formě gelu.

Nukleové kyseliny se podávají jakýmkoliv způsobem, ale výhodně se injikují in vivo přímo do tkáně nebo se podávají jiným způsobem, lokálním nebo systémovým, čímž se stávají dostupnými v místě aplikace elektrického pole. Nukleové kyseliny se mohou podávat společně s činidly, která umožňují nebo usnadňují přenos, jak bylo již zmíněno. Nukleové kyseliny mohou být zejména volné v roztoku, nebo navázané na syntetická činidla nebo nesené virovými vektory. Syntetická činidla mohou být lipidy nebo polymery, známé odborníkům, nebo to dokonce mohou být zaměřovači prvky, které umožňují zachycení na membráně cílové tkáně. K těmto prvkům patří např. vektory nesoucí cukry, peptidy, protilátky nebo receptory hormonů.

Je zřejmé, že v podmínkách podle vynálezu podávání nukleové kyseliny předchází, je současné nebo následuje aplikaci elektrického pole.

Tudíž se předkládaný vynález také týká nukleových kyselin a elektrického pole s intenzitou 1 až

8 00 V/cm jakožto sdruženého (kombinovaného) produktu pro jejich současnou, samostatnou nebo střídavou aplikaci in vivo do příčně pruhovaného svalstva. Intenzita pole je výhodně 4 až 400 V/cm a výhodněji 30 až 300 V/cm.

Výhodně se vynález užívá při genové terapii svalových buněk, která umožňuje:

· korekci dysfunkcí samotných svalových buněk (například pro léčení myopatií se vztahem ke genetickým vadám),

-3CZ 299473 B6 • ochranu a/nebo regeneraci vaskularizace nebo inervace svalu nebo jiných svalových tkání nebo orgánů pomocí trofíckých, neurotrofických nebo angiogenních faktorů produkovaných transgenem, • transformaci svalu na orgán secemující produkty vedoucí k léčebnému účinku, jako je např.

produkt genu samotného (například regulační faktory hemostázy a faktory ovlivňující trombózu, trofícké faktory, růstové faktory, hormony jako inzulín, apod.) nebo jako je aktivní metabolit syntetizovaný ve svalu díky vnesenému terapeutickému genu, • aplikaci vhodnou pro vakcinaci nebo imunostimulaci.

Dalším předmětem vynálezu je kombinace elektrických pulzů určitého napětí s přípravky obsahujícími nukleové kyseliny formulovanými s ohledem na podávání, které umožňuje dosáhnout svalové tkáně aplikací topickou, perkutánní, perorální, vaginální, parenterální, intranazální, intravenózní, intramuskulámí, subkutánní, intraokulámí, transdermální apod. Farmaceutické přípravky podle vynálezu výhodně obsahují farmaceuticky přijatelný nosič pro přípravek pro injekce, zejména pro přímou injekci do požadovaného orgánu nebo pro jakékoliv jiné podávání. Může obsahovat zejména sterilní izotonické roztoky nebo suché přípravky, zejména lyofilizované, které po přidání například sterilní vody nebo fyziologického roztoku, v závislosti na případu, vytvoří přípravky roztoků pro injekce. Dávky nukleových kyselin použité pro injekci, jakož i počet podávání a objem injekcí, mohou být upraveny podle různých parametrů a obzvláště dle způsobu.

podávání, příslušné patologie, exprimovaného genu nebo trvání požadované léčby.

Nukleové kyseliny mohou být syntetického nebo biosyntetického původu, nebo extrahované z virů nebo prokaryotických nebo eukaryotických buněk pocházejících z jednobuněčných organismů (např. kvasinek) nebo mnohobuněčných organismů. Mohou být podávány spojené úplně nebo částečně se složkami původních organismů a/nebo systému syntézy.

Nukleová kyselina může být deoxyribonukleová kyselina nebo ribonukleová kyselina. Může zahrnovat sekvence přirozeného původu nebo umělé sekvence a zejména genomovou DNA, cDNA, mRNA, tRNA a rRNA, hybridní sekvence nebo syntetické či semisyntetické sekvence oligonukleotidů, modifikované či nikoliv. Tyto nukleové kyseliny mohou být získány jakoukoliv metodou odborníkovi známou, a to zvláště klonováním, chemickou syntézou nebo dokonce smíšenými metodami, včetně chemické nebo enzymové modifikace sekvencí získaných klonováním. Mohou být modifikovány chemicky.

Konkrétně může být nukleová kyselina DNA nebo RNA typu „sense“ nebo „antisense“ nebo RNA s katalytickou vlastností jako ribozym. „Antisense RNA“ je nukleová kyselina, která má sekvenci komplementární k cílové sekvenci, např. mRNA sekvenci, a která hybridizací blokuje expresi cílové sekvence. „Sense“ označuje nukleovou kyselinu, sekvenčně homologická nebo která je totožná která s cílovou sekvencí jako je např. sekvence spojená s proteinovým trans40 kripčním faktorem a zapojená do exprese daného genu. Podle jednoho výhodného provedení obsahuje nukleová kyselina požadovaný gen a prvky umožňující expresi uvedeného genu. Fragment nukleové kyseliny je výhodně ve formě plazmidu.

Deoxyribonukleová kyselina může být jedno- nebo dvouvláknová, nebo může jít o krátké oligo45 nukleotidy nebo delší sekvence. Může nést geny, sekvence regulující transkripci nebo replikaci, nebo oblasti pro vazbu s dalšími buněčnými složkami, apod. Takové geny mohou obsahovat markerové geny, tj. geny, které produkují detekovatelnou značku pro sledování buněčné funkce, migrace nebo funkce genu, terapeutický (léčebný) gen, gen ochranného antigenu nebo imunogenu apod. Podle vynálezu se termín „terapeutický gen“ nebo též „léčebný gen“ týká zejména každého genu kódujícího RNA nebo proteinový produkt mající léčebný účinek. Kódovaný proteinový produkt může být protein, peptid apod. Tento proteinový produkt může být s cílovou buňkou homologní (tj. produkt, který je normálně exprimován v cílové buňce, když nevykazuje žádnou patologii). V tomto případě transgenní exprese například umožňuje překonat nepřiměřenou expresi v buňce nebo expresi proteinu, který je z důvodu modifikace inaktivní nebo málo

-4CZ 299473 B6 aktivní, nebo také umožňuje uvedený protein exprimovat nadměrně. Terapeutický gen může také kódovat mutantu buněčného proteinu, která má zvýšenou stabilitu, modifikovanou stabilitu apod. Proteinový produkt může být také s cílovou buňkou heterclogní. V tomto případě může exprimovaný protein například doplnit nebo vnést do buňky chybějící aktivitu (léčení myopatií nebo enzymových deficitů), nebo umožní bojovat proti patologii, či stimulovat imunitní reakci, například při léčení nádorů. Může také obsahovat tzv. sebevražedný gen (thymidinkinázu viru herpes) pro léčbu rakoviny nebo restenózy.

Z léčebných produktů vhodných k použití podle vynálezu se mohou konkrétně uvést geny, které kódují:

- enzymy jako α-1-antitrypsin, proteinázy (metaloproteinázy, urokináza, uPA, tPA, ... streptorkináza), proteázy štěpící prekurzory, čímž se aktivní produkty (ACE, ICE, ...) nebo jejich antagonisté (TIMP-1, inhibitor tkáňového aktivátoru plasminogenu PAI, TFPI),

- krevní deriváty jako faktory zapojené do koagulace: faktory VII, VIII, IX, faktory komplementu, trombin,

- hormony nebo enzymy účastnící se v biosyntéze hormonů nebo faktory podílející se na řízení syntézy nebo exkrece hormonů, jako je inzulín, faktory příbuzné inzulínu (IGF), růstový hormon, ACTH, enzymy pro syntézu pohlavních hormonů,

- lymfokiny a cytokiny: interleukiny, chemokiny (CXC a CC), interferony, TNF, TGF, chemotaktické faktory nebo aktivátory jako jsou MIF, MAF, PAF, MCP-1, eotaxin, LIF apod. (franzouzský patent 92 03120),

- růstové faktory, např. IGF, EGF, FGF, KGF, NGF, PDGF, PIGF, HGF, proliferin,

- angiogenní faktory jako jsou VEGF nebo FGF, angiopoetin 1 nebo 2, endotelin,

- enzymy syntézy neurotransmiterů (nervových přenašečů)

- trofické faktory, zejména neurotrofické faktory pro léčení neurodegenerativních nemocí, poškození nervového systému způsobené úrazem nebo poraněním, nebo degradace retiny, např. členy rodiny neurotrofinů jako NGF, BDNF, NT3, NT4/5, NT6, jejich deriváty a příbuzné geny, členy rodiny CNTF, axokin, LIF a jeho deriváty, IL-6 a jeho deriváty, kardiotrofin a jeho deriváty, GDNF a jeho deriváty, členy rodiny IGF, jako jsou IGF-1,

IGF-2 ajejich deriváty,

- členy rodiny FGF, jako jsou FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9 a jejich deriváty, TGFP,

- růstové faktory kostí, hematopoetické faktory jako erytropoetin, GM-CSF, M-CSF, LIF apod.,

- buněčné stavební proteiny jako dystrofin nebo minidystrofin (francouzský patent 91 11947) nebo sebevražedné geny (thymidinkináza, cytosindeamináza, enzymy obsahující cytochrom. P450), geny hemoglobinu nebo jiných proteinových nosičů,

- geny odpovídající proteinům zapojeným do metabolismu lipidů, například apolipoproteinového typu vybrané z apolipoproteinů A-I, A-Π, A-IV, B, C-l, C—II, C—III, D, E, F, G, H, J a apo (a), a metabolických enzymů, jako jsou například lipoproteinová lipáza, jatemí lipáza, lecitincholesterol-acyltransferáza, 7-alfacholesterolhydroxyláza, kyselá fosfatidylfosfatáza, nebo dokonce lipidové transferové proteiny, jako je transferový protein esterů cholesterolu, a transferový protein fosfolipidů, protein vázající HDL nebo dokonce vybraný receptor, například z receptorů LDL, chylomikronových zbytkových receptorů a „scavenger“ recepto45 rů apod., dále také leptin pro léčbu obezity,

- faktory regulující krevní tlak jako např. enzymy účastnící se metabolismu NO, angiotensin, bradykinin, vasopresin, ACE, renin, enzymy kódující mechanismy syntézy a uvolňování prostaglandinů, tromboxan, adenosin, adenosinové receptory, kallikreiny a kallistatiny,

-5 CZ 299473 B6

ANP, ANF diuretický a antidiuretický faktor, faktory podílející se na syntéze, metabolismu nebo uvolňování jako histamin, serotonin, katecholaminy, neuropeptidy,

- antiangiogenní faktory jako je např. ligand pro Tiel a Tie2, angiostatin, faktor ATF, deriváty plasminogenu, endotelin, trombospondin 1 a 2, PF-4, interferon-α a β, interleukin-12,

TNFa, urokinázový receptor, fltl, KDR, PAI1, PA12, TIMP1, fragment prolaktinu,

- faktory ochraňující proti apoptóze jako jsou faktor rodiny AKT,

- proteiny schopné indukovat buněčnou smrt, které jsou buďto, sami aktivní jako kaspázy, nebojsou typu „předléku“ tj. vyžadují aktivaci jiným faktorem, jako proteiny, které aktivují předléky na činidla způsobující buněčnou smrt, se např. thymidinkináza viru herpes ío deaminázy, se kterými se počítá zvláště v protinádorové terapii,

- proteiny podílející se na kontaktu mezi buňkami a adhezi: VCAM, PECAM, ELÁM, ICAM, integriny, kateniny,

- proteiny extracelulámí matrix,

- proteiny účastnící se migrace buněk,

- proteiny podílející se na signální transdukci typů jako FAK, MEKK, p38 kináza, tyrosinkinázy, serinthreoninkinázy,

- proteiny podílející se na regulaci buněčného cyklu (p21, pl6, cykliny apod.) a také dominantně-negativní mutanta nebo odvozené protein, které blokují buněčný cyklus a které mohou, kde je to vhodné, indukovat apoptózu,

- transkripční faktory: jun, fos, API, p53 apod. a proteiny v signální kaskádě p53,

- buněčné strukturní proteiny, jako jsou intermediátní filamenta (vimentin, desmin, keratiny), dystrofín, proteiny podílející se na stažení svalu a řídící stahovatelnost svalu, zejména proteiny účastnící se metabolismu kalcia a toku kalcia v buňkách (SERCA apod.).

V případě proteinů, které fungují prostřednictvím systému ligand a receptor lze předvídat použití ligand nebo receptoru (např. FGF-R, VEGF-R apod.).

Lze také uvést geny kódující fragmenty ligand nebo receptorových proteinů, zvláště proteinů zmíněných výše, které vykazují aktivitu, která je buďto vyšší, než aktivita proteinu plné délky, nebo jde o antagonistickou aktivitu anebo dokonce „dominantně-negativní“ typ vzhledem k původnímu proteinu (např. receptorové fragmenty inhibují dostupnost proteinů v oběhu, asociované nebo jinak navázané na sekvence indukující sekreci těchto fragmentů oproti ukotvení na buněčné membráně nebo jiné systémy pro modifikaci intracelulámího transportu v těchto systémech ligand-receptor, aby se změnila dostupnost jednoho z prvků) nebo dokonce mají vlastní aktivitu odlišnou od aktivity původního úplného proteinu (např. ATF).

Mezi dalšími proteiny nebo peptidy, které mohou být secemovány svalem, důležité zdůraznit protilátky, variabilní fragmenty jednořetězcových protilátek (ScFv) nebo jakýkoliv další protilátkový fragment, který má rozpoznávací funkce pro použití v imunoterapii, např. pro léčbu infekčních nemocí, nádorů a autoimunitních chorob, jako je roztroušená skleróza (anti-idiotypové protilátky), a také ScFv', který váže protizánětlivé cytokiny jako jsou např. IL1 a TNFa pro léčbu revmatoidní artritidy. Další vhodně proteiny jsou, aniž by výčet byl omezující, rozpustné receptory jako například rozpustný receptor CD4 nebo rozpustný receptor TNF pro anti-HIV léčbu, rozpustný receptor TNFa nebo rozpustný receptor IL1 pro léčení revmatoidní artritidy, rozpustný receptor acetylcholinu pro léčbu myastenie, substrátové peptidy nebo enzymové inhibitory, nebo peptidy, které jsou agonisty nebo antagonisty receptorů nebo adhezivních proteinů, jako například pro léčení astmatu, trombózy, restenózy, metastáz nebo zánětů, a umělé, chimérické nebo zkrácené proteiny.

-6CZ 299473 B6

Z hormonů základního významu se může uvést inzulín v případě diabetů, růstový hormon a kalcitonin.

Je třeba také uvést proteiny indukovat protinádorovou imunitu nebo stimulovat imunitní odpověď (IL2, GM-CSF, IL-12 apod.) Nakoneclze zmínit cytokiny, jako IL10, IL4 a IL13, které snižují

T_Hi odpověď.

Četné příklady, které byly uvedeny i ty, které budou ještě následovat, ilustrují potenciální rozsah aplikací předkládaného vynálezu.

Terapeutické nukleové kyseliny mohou být antisense sekvence nebo geny, jejichž exprese v cílové buňce umožní kontrolovat expresi genů nebo transkripci buněčných mRNA. Takové sekvence mohou být např. transkribovány v cílové buňce do RNA komplementární k buněčné mRNA a tak blokovat její translaci do proteinu, což je způsob popsaný v Evropském patentu 140 308. Terapeutické geny také mohou obsahovat sekvence kódujíc ribozymy, které jsou schopné selektivně ničit cílové RNA (evropský patent 321 201).

Jak bylo již uvedeno výše, nukleové kyseliny mohou také obsahovat jeden nebo několik genů kódujících antigenní peptidy schopné vyvolat imunitní odpověď u člověka nebo zvířete. V takovém konkrétním provedení umožňuje vynález buďto produkci vakcín, nebo provádění imunoterapeutického léčení člověka nebo zvířete, zejména účinné proti mikroorganismům, virům a rakovinám. Zejména sem patří antigenní peptidy specifické pro virus Epstein-Barrové, virus

HIV, virus hepatitidy B (evropský patent 185 573), virus pseudorabies, „virus tvořící syncytia“, další viry nebo dokonce specifické nádorové antigeny, jako jsou proteiny MÁGE (evropský patent 259 212), a sice MAGE1 a MAGE2, nebo antigeny schopné stimulovat reakci proti nádorům, jako jsou bakteriální proteiny tepelného šoku.

Nukleová kyselina výhodně obsahuje také sekvence umožňující a/nebo napomáhající expresi léčebného genu a/nebo genu kódujícího antigenní peptid ve svalu. Může zahrnovat sekvence, které jsou přirozeně odpovědné za expresi uvažovaného genu, když jsou tyto sekvence schopné fungovat v transfekované buňce. Může také zahrnovat sekvence různého původu (zodpovědné za expresi jiných proteinů nebo dokonce syntetické sekvence). Může zahrnovat zejména promoto30 rové sekvence eukaryotických nebo virových genů. Například to mohou být promotorové sekvence pocházející z genomu buňky, kterou je žádoucí transfekovat z eukaryotických promotorů se mohou použít jakékoliv promotory nebo z nich odvozené sekvence, které stimulují nebo reprimují transkripci genu specifickým nebo nespecifickým a slabým nebo silným způsobem. Jedná se zvláště o obecné, konstitutivní promotory promotory (gen pro HPRT, vimentin, α-aktin, tubulin atd.), promotory terapeutických genů (typu MDR nebo CTFR apod.), tkáňově specifické promotory (včetně promotorů genů desminu, myosinů, kreatinkinázy, fosfoglycerátkinázy) nebo alternativně promotory odpovídající stimuly jako jsou promotory odpovídající na přirozené hormony (jako jsou steroidní receptory, receptory kyseliny retinové) nebo promotory regulované antibiotiky (tetracyklin, rapamycin apod. ), promotory reagující na dietu jako jsou promotory odpovídající na fibráty, nebo další přirozené či syntetické molekuly. Mohou to také být promotorové sekvence pocházející z genomu viru. V této souvislosti se mohou například uvést promotory adenovirových genů EIA nebo MLP, nebo promotory odvozené z genomu virů CMV, RSV apod. Dále mohou být tyto expresní sekvence modifikovány přidáním sekvencí pro aktivaci, regulaci, umožňujících podmíněnou, přechodnou nebo dočasnou expresi, tkáňově specifickou expresi nebo převládající expresi apod.

Kromě toho může nukleová kyselina také obsahovat, zejména nad léčebným genem, signální sekvenci zaměřující syntetizovaný léčebný produkt do sekreční dráhy cílové buňky. Tato signální sekvence může být přirozená signální sekvence léčebného produktu, ale může také obsahovat jakýkoliv jiný funkční signál, nebo umělou signální sekvenci. Nukleová kyselina může také obsahovat signální sekvenci směřující syntetizovaný léčebný produkt do konkrétního buněčného kompartmentu, jako jsou například peroxisomy, lysosomy anebo mitochondrie např. pro léčení mitochondriální genetické nemoci.

-7CZ 299473 B6

Další vhodné geny popsal McKusick, V.A., (Mendelian Inheritance in Man, Catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked phenotypes, 8. vydání, Johns Hopkins University Press, 1988) a Stanbury, J. B. et al. (The metabolic basis of inherited disease,

5. vydání, McGraw-Hill, 1983). Požadované geny pokrývají proteiny zapojené do metabolismu aminokyselin, lipidů a dalších buněčných složek.

Mohou se také uvést geny spojené s chorobami metabolismu sacharidů, aniž by tím byl vynález jakkoliv omezen, například fruktózo-l-fosfátaldoláza, fruktózo-l,6-difosfatáza, glukózo-6-fosio fatáza, lysozomální a-l,4-glukosidáza, amylo-l,6-glukosidáza, amylo-( 1,4:1,6)-transglukosidáza, svalová fosforyláza, svalová fosfo-fruktokináza, fosforyláza-p-kináza, galektózo-l-fosfáturidyl-transferáza, všechny enzymy komplexu pyruvátdehydrogenázy, pyruvátkarboxyláza,

2-oxoglutarát/glyoxylátkarboxyláza, a D-glycerátdehydrogenáza.

Lze uvést i další vhodné geny:

- Geny spojené s nemocemi aminokyselinového metabolismu, jako například fenylalaninhydroxyláza, dihydrobiopterinsyntetáza, tyrosinaminotransferáza, tyrosináza, histidináza, fumarylacetoacetáza, glutathionsyntetáza, γ-glutamylcystein-syntetáza, omithin-d-aminotransferáza, karbamoylfosfát-syntetáza, omithinkarbamoyltransferáza, argininosukcinát20 syntetáza, arginosukcinátlyáza, argináza, L-lysindehydro-genáza, L-lysinketoglutarátreduktáza, valintransamináza, leucin/isoleucintransamináza, dekarboxyláza 2-ketokyselin s rozvětvěným řetězcem; isovaleryl-CoAdehydrogenáza, acyl-CoAdehydrogenáza, 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAlyáza, acetoacetyl-CoA-3-ketothioláza, propionyl-CoAkerboxyláza, metyl-malonyl-CoA-mutáza, (ATP:kobalamin)adenosyltransferáza, dihydro25 folátreduktáza, metylentetrahydrofolátreduktáza, cystathionin-p-syntetáza, komplex sarkosindehydrogenázy, proteiny patřící do systému štěpícího glycin, P-alanintransamináza, sérová kamosináza, a cerebrální homokamosináza,

- Geny se vztahem k nemocím metabolismu tuků a mastných kyselin, jako například lipoproteinová lipáza, apolipoprotein C—II, apolipoprotein E, další apolipoproteiny, lecitin cholesterolacetyltransferáza, LDL receptor, jatemí sterolhydroxyláza a a-hydroxyláza kyseliny fýtanové.

- Geny se vztahem k lysozomálním deficitům, jako například lysozomální a-L-iduronidáza, lysozomální iduronátsulfatáza, lysozomální heparan-N-sulfatáza, lysozomální N-acetyl a-D-glukózoaminidáza, lysozomální acetyl-CoA:cc-glukozamin-N-acetyl transferáza, lysozomální N-acetyl-a-D-glukozamin-6-sulfatáza, lysozomální galaktózo-amin-6-sulfátsulfatáza, lysozomální P-galaktosidáza, lysozomální arylsulfatáza B, lysozomální P-glukuronidáza, N-acetylglukózoaminylfosfo-transferáza, lysozomální α-D-manosidáza, lysozomální α-neuraminidáza, lysozomální aspartylglukozaminidáza, lysozamální a-L-fukosidáza, lysozomální kyselá lipáza, lysozomální kyselá ceramidáza, lysozomální sfingo40 myelináza, lysozomální glukocerebrosidáza a lysozomální galakto-cerebrosidáza, lysozomální galaktosyl-ceramidáza, lysozomální arylsulfatáza A, α-galaktosidáza A, lysozomální kyselá P-galaktosidáza, a řetězec lysozomální hexosaminidázy A.

- Mohou se také uvést, aniž by to vynález omezovalo, geny se vztahem k onemocněním steroidního a lipidového metabolismu, geny se vztahem k onemocněním metabolismu porfy45 rinů a hernu, a geny se vztahem k onemocnění pojivové tkáně, metabolismu svalů a kostí, a také geny se vztahem k onemocněním krve a hematopoetických orgánů, svalů (myopatie), nervového systému(neurodegenerativní choroby) nebo oběhového systému (například léčení ischémie a stenózy) a geny podílející se na genetických nemocech mitochondrií.

Ve způsobu podle vynálezu může být nukleová kyselina spojena sjakýmkoliv typem vektoru nebo s každou kombinací těchto vektorů, která umožní zlepšit genový přenos, např. (aniž by výčet byl omezující), s vektory jako jsou viry, syntetické nebo biosyntetické přípravky (např.

-8CZ 299473 B6 činidla jako lipid, polypeptid, glykosid nebo polymer), či dokonce navázání na částice (perličky) nebo propulzní částice. Nukleové kyseliny mohou být také injikovány do svalu, který podstoupil ošetření namířené na zlepšení genového přenosu, např. ošetření farmakologické povahy v aplikaci lokální nebo systémové, nebo ošetření enzymem, permeabilizující (použití surfaktantů), chirurgické, mechanické, tepelné nebo fyzikální ošetření.

Zvláštní výhoda využití svalu v genové terapii spočívá v mnoha faktorech, jako je např.:

• mimořádná stabilita transgenní exprese přesahující několik měsíců, a proto umožňující stabilní a trvalou produkci intramuskulámího nebo secemovaného léčebného proteinu, · snadnost přístupu ke svalové tkáni, což umožňuje přímé, rychlé a bezpečné podání do orgánu, který není životně • velký objem svalové hmoty, což dovoluje rozmanitá místa podávání, • široce prokázaná sekreční kapacita svalu.

K těmto výhodám lze přidat bezpečnost lokální léčby spojenou s použitím místních a cílených elektrických polí.

Vzhledem ke všem uvedeným výhodám a také bezpečnosti, která doprovází použití slabých polí, může být tento vynález aplikován i na srdeční sval pro léčbu srdečních chorob, např. použitím vhodného defibrilátoru. Může být také použit pro léčbu restenózy pomocí exprese genů inhibujících proliferaci buněk hladkého svalstva, jako je protein GAX.

Kombinace polí nízké intenzity a dlouhotrvajícího podávání, aplikované obzvláště na svaly in vivo, zlepšují transfekci nukleových kyselin, aniž by způsobily významné poškození tkání. Tyto výsledky zvyšují účinnost přenosu DNA v genové terapii používající nukleové kyseliny.

Výhodou svalové tkáně v kombinaci se způsobem podle vynálezu je tudíž to, že prostřednictvím genové terapie poprvé umožňuje to, že k vytvoření přípravku ve fyziologických a/nebo léčebných dávkách dochází ve svalových buňkách nebo je přípravek secemován do jejich blízkého okolí nebo systémově do krevního či lymfatického oběhu. Kromě toho vynález poprvé umožňuje jemnou modulaci a kontrolu účinného množství exprimovaného transgenu pomocí možnosti regulovat objem transfekované svalové tkáně, například počtem míst podávání nebo dokonce možností regulovat počet, tvar, povrch a uspořádání elektrod. Další kontrolní prvek vychází z možnosti regulovat účinnost transfekce kolísáním intenzity pole, počtu, trvání a frekvenci pulzů a ovšem, podle stavu techniky, množstvím a objemem podávaných nukleových kyselin. Lze tak dosáhnout vhodné úrovně transfekce a požadované úrovně produkce v tkáních nebo požadovaná sekrece. Konečně způsob zaručuje mimořádnou bezpečnost ve srovnání s chemickými nebo virovými metodami genového přenosu in vivo, při kterých nemůže být zcela vyloučeno a kontrolováno zasažení orgánu jiných než je cílový orgán. Skutečně způsob podle vynálezu umož40 ňuje kontrolu lokalizace transfekované tkáně (naprosto jasně spojené s objemem tkáně podrobené lokálním elektrickým pulzům) a proto poskytuje i možnost návratu k výchozímu stavu tím, že se úplně nebo částečně odstraní sval, což je možné díky tomu, že svalová tkáň obecně není vitálně důležitá a má velkou regenerační kapacitu. Velká flexibilita použití umožňuje optimalizovat způsob podle druhu zvířete (použití v humánní nebo veterinární medicíně), věku pacienta a jeho či jejího věku nebo fyziologického a/nebo patologického stavu.

Způsob podle vynálezu dále poprvé umožňuje transfekovat nukleové kyseliny značné velikosti, na rozdíl od virových metod, ve kterých je velikost transgenu limitována velikostí kapsidy. Tato možnost je podstatná pro přenos značně velikých genů jako je dystrofin nebo obecně geny s introny a/nebo značně velikých regulačních prvků, které jsou nezbytné například pro fyziologicky regulovanou tvorbu hormonů. Dále Je tato možnost základní pro přenos episomů nebo umělých kvasinkových chromozomů či minichromozomů.

-9CZ 299473 B6

Příklady uvedené v další části slouží k ilustraci vynálezu, aniž by vynález jakkoliv omezovaly. V příkladech jsou odkazy na následující obrázky.

Přehled obrázků na výkresech • Obr. 1: Účinek elektrických pulzů s vysokou intenzitou pole na transfekci plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru.

• Obr. 2: Účinek elektrických pulzů se střední intenzitou pole na transfekci plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru.

• Obr. 3: Účinek elektrických pulzů se slabou intenzitou pole na transfekci plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru.

• Obr. 4: Účinek elektrických pulzů se slabou intenzi tou pole a s různou délkou trvání na transfekci plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru.

• Obr. 5: Účinnost elektropřenosu plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši při slabé intenzitě pole, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru.

• Obr. 6: Kinetika exprese luciferázy v horním holenním svalu myši. Podání plazmidů pXL2774 s elektropřenosem () nebo bez (X) elektropřenosu, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru.

• Obr. 7: Hladina exprese jako funkce dávky DNA podané s eletropřenosem (·) nebo bez elektropřenosu (□), uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru.

• Obr. 8 : Vliv různých typů elektrod na účinnost elektropřenosu.

• Obr. 9: Kinetika sérové koncentrace secemované alkalické fosfatázy. Podání plazmidů pXL3010 s elektropřenosem () nebo bez elektropřenosu (♦), uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru.

• Obr. 10: Kinetika exprese FGF 1 ve svalu s elektropřenosem (bílé sloupce) a bez elektropřenosu (černé sloupce).

• Obr. 11: Mapy plasmidů pXL3179 a pXL3212.

• Obr. 12: Mapy plasmidů pXL3388 apXL3031.

• Obr. 13: Mapy plasmidů pXL3 004 a pXL3 010.

• Obr. 14: Mapy plasmidů pXL3149 a pXL3096.

• Obr. 15: Mapy plasmidů pXL3353 a pXL3354.

• Obr. 16 : Mapa plasmidů pXL3348.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Pokusy prováděné způsobem podle dosavadního stavu techniky, kdy elektrické pole inhibuje transfekci

Standardní podmínky elektroporace, které se užívají standardně dle dosavadního stavu techniky, 45 byly vyzkoušeny a prokázalo se, že jsou neúčinné nebo dokonce inhibují přenos nukleových kyselin (plazmidové DNA) do příčně pruhovaného svalu.

-10CZ 299473 B6

Materiály a metody, obecné podmínky pokusů

V tomto příkladu byly užity následující produkty:

DNA pXL2774 (patentová přihláška PCT/FR 96/01414) je plazmidová DNA obsahující gen luciferázy jako reportérový gen. Ostatní použité produkty jsou běžně komerčně dostupné: ketamin, xylazin, fyziologický roztok (NaCl 0,9 %).

Byl použit běžný komerční osciloskop a generátor elektrických pulzů (obdélníkových nebo ío čtvercových kmitů) (Electropulsator PS 15, Jouan, Francie). Eletrody byly ploché elektrody z nerezové oceli vzdálené od sebe 1 až 15 mm.

Pokusy se prováděly na myších C57B1/6. Myši pocházející z různých klecí byly před pokusech náhodně promíchány (randomizace).

Myši byl anestetizovány směsí ketaminu a xylazinu. Roztok plazmidů (30 μΐ roztoku s 500 μg/ml 0,9% NaCl) byl injikován skrz kůži podélně do horního lýtkového svalu pravé i levé končetiny pomocí stříkačky Hamilton. Elektrody byly potřeny vodivým gelem a injikovaná končetina byla pak umístěna mezi elektrody, tak aby s nimi byla v kontaktu.

Elektrické pulzy byly aplikovány kolmo na osu svalu pomocí generátoru obdélníkových pulzů jednu minutu po injekci. Pomocí osciloskopu se sledovalo napětí ve voltech, V (hodnoty uváděné v příkladech představují maximální hodnoty), trvání pulzu v milisekundách, ms, a frekvence v hertzech, Hz, přičemž frekvence byla 1 Hz. Bylo aplikováno 8 po sobě jdoucích pulzů.

Pro vyhodnocení transfekce svalu byly myši utraceny sedm dní po podání plazmidů. Horní lýtkový sval obou končetin byl vyjmut, zvážen, umístěn do lyzovacího pufru a rozmělněn. Suspenze byla centrifugována a byl tak získán čistý supematant. Měření aktivity luciferázy se provádělo v 10 μΐ supematantu pomocí komerčního luminometru, ve kterém se automaticky přidával k roztoku substrát. Intenzita luminiscence je uvedena v relativních jednotkách (RFU) pro sval při známém celkovém objemu suspenze (1 xlO⁶RFU odpovídá 30 pg luciferázy). Každý pokus byl opakován 10 x, tj. 5 zvířat bylo injikováno oboustranně. Statistické vyhodnocení bylo provedeno pomocí neparametrických testů.

Výsledky a diskuse

Výsledky jsou ilustrovány dvěma obrázky, kde je užito buďto lineámí/nebo logaritmické měřítko (Obr. 1)

V tomto prvním pokusu se testovaly účinky elektrického pole 800 až 1200 V/cm, což jsou podmínky umožňující elektroporaci nádorů (Mir et al., Eur. J. Cancer 27, 68, 1991).

Bylo pozorováno (viz obr. 1), ve srovnání s kontrolní skupinou, kde byla injikována DNA bez· elektrických pulzů, že • s osmi pulzy 1200 V/cm a délkou 0,1 ms byla průměrná hodnota aktivity luciferázy mnohem nižší, • s pulzy 1200 V/cm a délkou 1 ms tři zvířata uhynula a navíc průměrná aktivita(luciferázy byla mnohem nižší, • s pulzy 800 V/cm a délkou 1 ms byla průměrná hodnota luciferázové aktivity také významně snížena.

Většina svalů, které byly vystaveny působení elektrického pole, byla viditelně změněna (svaly byly drobivé a bělavého vzhledu).

- 11 CZ 299473 B6

Příklad 2

Přenos nukleových kyselin pomocí elektrického pole střední intenzity

Tento pokus byl proveden na myších C57B1/6. Až na intenzitu elektrického pole a jeho trvání byli podmínky provádění pokusu prakticky shodné s příkladem 1.

Výsledky jsou uvedeny na obr.2. Opakoval se v podstatě výsledek příkladu 1, tj. inhibující ío účinek 8 pulzů intenzity 800V/cm a délky 1 ms na aktivitu luciferázy detekované ve svalu.

Užitím pole intenzity 600 V/cm byla zjištěna stejná inhibice a stejné změny svalové tkáně. Ale na druhé straně velmi překvapivě snižování napětí vedlo ktomu, že svalová tkáň nebyla již poškozována a při 400 a 200 V/cm byla míra transfekce svalů v průměru vyšší než u svalů bez aplikace elektrického pole. Je třeba poznamenat, že ve vztahu ke kontrolní skupině (nebyla vystavena působení elektrického pole) rozptyl hodnot luciferázové aktivity je významně snížen při 200 V/cm (střední chyba průměru je 20,59 % ve srovnání s hodnotou 43,32 % v nepřítomnosti elektrického pole, viz obr. 2A).

Příklad 3

Pokus s přenosem nukleové kyseliny pomocí pulzů pole nízké intenzity, který ukazuje velmi vysokou stimulaci exprese transgenu

Tento pokus byl proveden na myších C57B1/6. Až na intenzitu elektrického pole a jeho trvání, a skutečnost, že pulzy byly aplikovány 25 vteřin po injekci DNA, byly podmínky shodné s předchozími příklady.

Výsledky jsou uvedeny na obr. 3. Průměrné hodnoty exprese transgenu luciferázy byly výrazně zvýšeny při trvání pulzu 20 ms při 100 V/cm a počínaje pulzy dlouhými 5 ms při 200 V/cm.

Pokus také jasně ukázal, že průměrná hodnota luciferázové aktivity získané po eletrotransfekci DNA do svaluje funkcí trvání elektrických pulzů, pokud se užije napětí 200 a 100 V/cm. Bylo také pozorováno, že rozptyl hodnot luciferázové aktivity byl významně snížen u skupiny, kde byla aplikována elektrotransfekce (obr. 3A). V nepřítomnosti elektrického pole (kontrola) byla relativní střední chyba průměru 77,43 % průměrné hodnoty, zatímco se snížila na 14% (200 V/cm, 5 ms) a na 41,27 % (200 V/cm, 20 ms) anebo na 30 až 48 % při elektropřenosu v poli 100 V/cm.

V nej lepších podmínkách tohoto pokusu byl faktor zvýšení exprese transgenu 89,7 vzhledem ke kontrole injikované bez aplikace elektrických pulzů.

Příklad 4

Pokus s elektropřenosem nukleové kyseliny do svalu při 200 V/cm, který ukazuje zvýšení exprese transgenu více než 200x

Tento experiment byl proveden na myších DBA 2 s elektrickými pulzy 200 V/cm s různou délkou. Ostatní podmínky byly shodné jako, v příkladu 3.

Pokus potvrdil, že při 200 V/cm se transfekce luciferázy zvyšuje, když se zvyšuje trvání pulzu nad 5 ms (obr. 4 a 5). Bylo zde opět pozorováno snížení vnitroskupinové variability detekované hodnotou střední chyby průměru, u skupiny (relativní s elektrotransfekcí ve srovnání s kontrolou hodnoty střední chyby průměru byly 35 % pro kontrolu a 25, 22, 16, 18 a 26 % pro série pulzů

- 12CZ 299473 B6 s dobou 1,5, 10, 15, 20 a 24 ms, v uvedeném pořadí). V optimálních podmínkách v tomto pokusu byla zvýšena exprese transgenu 205 x vzhledem ke kontrole injikované bez elektrických pulzů. Výsledky pokusu ukazují, žezměny v době trvání pulzu jsou prostředkem jak modulovat účinnost přenosu nukleových kyselin a jak regulovat hladinu exprese transgenu.

Příklad 5

Účinnosti elektropřenosu nukleových kyselin je funkcí součinu „počet pulzů x intenzita pole x doba trvání každého pulzu“

Obr. 5 slouží za příklad důležitosti parametru odpovídajícího součinu „počet pulzů x intenzita pole x trvání každého pulzu“. Tento parametr ve skutečnosti odpovídá integrálu funkce závislé na čase, která popisuje změny elektrického pole.

Data uvedená na obr. 5 byla získána v průběhu pokusů v příkladech 2, 3 a 4 s intenzitami elektrického pole 200 V/cm a 100 V/cm a bez elektrického pole. Údaje ukazují, že účinnost transfekce roste jako funkce součinu celkové doby expozice elektrickému poli a intenzity pole. Stimulujícího účinku bylo dosaženo při hodnotě parametru „počet pulzů x intenzita pole x trvání každého pulzu“ přesahující 1 kV xms/cm. Podle výhodného provedení vynálezu stimulace je dosaženo pro hodnoty součinu „elektrické pole x celková doba trvání pulzů“ shodné nebo vyšší než 5 kV x ms/cm.

Příklad 6

Vliv prodloužení doby elektrického pulzu

Tento příklad ilustruje fakt, že je možné prodloužit trvání jednotky pulzu ještě více než bylo zkoušeno v příkladu 4.

Pokus byl proveden s myšmi C57B1/6, použit byl plazmid pXL2774, množství podané DNA bylo 15 pg. Byl užit generátor elektrických pulzů, poskytující délku pulzů větší než 20 ms (Gentronics, model T 820, Centronics, San Diego, CA), byl užit proměnlivý počet pulzů a doba pulzu, ale při konstantní intenzitě pole 200 V/cm, ostatní podmínky byly shodné jako v příkladu 1. Výsledky jsou uvedeny v tab. 1.

Trvání pulzu (ms)	0	1	5	10	20	30	40	50	60	80
Pokus A 8 pulsů	11 ±5	39 ± 6	211 ±26	288 ±46	1158 + 238	1487 ±421	2386 ±278
Pokus 3 4 pulsy	11 ±5	26, 8 ±6	123 + 17	246 ±32	575 ±88	7 04 ±130		3440± 1077
Pokus C 4 pulsy	15 ±8						2885 + 644		2626 ±441	1258 ±309

Tabulka 1: Střední hodnota aktivity luciferázy v milionech relativních jednotek (RLU) na sval ± střední chyba průměru (SEM), v každé skupině N=10. Podmínky elektropřenosu: intenzita pole 200 V/ cm, 8 nebo 4 pulzy (proměnlivé trvání jednotky), frekvence 1 Hz.

Zvýšená exprese transgenu byla pozorována při prodloužení trvání jednotky pulzů (na alespoň 40 ms při aplikaci série 8 pulzů nebo na alespoň 50 ms při aplikaci série 4 pulzů při intenzitě pole 200 V/cm). Tento příklad ukazuje, že optimální doba trvání pulzu závisí na počtu aplikovaných pulzů a že trvání jednotky pulzů může dosáhnout až 80 ms, přičemž touto hodnotu není omezeno.

- 13 CZ 299473 B6

Příklad 7

Účinnost elektropřenosu jako funkce počtu elektrických pulzů

Tento příklad demonstruje vliv rostoucího počtu pulzů na účinnost elektropřenosu nukleových kyselin.

V pokusu byly použity myšiC57Bl/6, plazmid pXL2774, množství podané DNA bylo 15 pg. Proměnlivý byl počet pulzů, doba pulzu byla 20 ms, intenzita pole 200 V/cm. Ostatní podmínky pokusu byly stejné jako v příkladu 1. Výsledky jsou uvedeny v tab. 2.

Počet pulzů	0	1	2	r····1 11 4	6	3	12	16
celkem	70	147	281	439	678	813	S29	890
RLU	± 56	± 26	± 46	±50	± 129	± 73	± 169	± 137

Tabulka 2: Průměrná hodnota exprese luciferázy v milionech relativních jednotek (RLU) na sval ± střední chyba průměru (SEM), v každé skupině N=10. Podmínky elektropřenosu: intenzita pole 200 V/cm, proměnlivý počet pulzů délky 20 ms, frekvence 1 Hz.

Bylo zjištěno, že exprese luciferázy se podstatně zvyšovala počínaje aplikací jediného pulzu a pak se dále zvyšovala se zvyšujícím se počtem pulzů. Ukázalo se, že variací počtu pulzů se může modulovat účinnost přenosu nukleové kyseliny a tím regulovat hladina exprese transgenu.

Snížení variability odpovědi demonstrované snížením hodnoty střední chyby průměru relativně k hodnotě průměru se potvrdilo pro všechny skupiny, u kterých byl aplikován elektropřenos.

Příklad 8

Vliv zvýšení frekvence elektrických pulzů

Tento příklad ukazuje, že rostoucí frekvence pulzů překvapivě umožňuje zvýšit účinnost transfekce. Navíc, z hlediska klinického použití, pulzy s vyšší frekvencí zvyšují komfort pacienta tím, že se snižuje celkový čas aplikace.

V tomto pokusu byly použity myši C57B1/6. Použitý plazmid byl pXL2774, množství podané DNA bylo 15 pg. Frekvence se v pokusu měnila (od 0,1 do 4 Hz). Doba pulzu byla 20 ms, intenzita pole 200 V/cm. Ostatní experimentální podmínky byly stejné jako v příkladu 1. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny v tab. 3.

Frekvence (Hertz)	0	0, 1	0, 2	0, o	1	2	3	4
Pokus A 8 pulsů	5 ±2	54 ±13	95 ±16	405 ±60	996 ±156	1528 ±257
Pokus B 4 pulsy		114 ±14	163 ±2 4	175 ±26	337 ±53	587 ±90
Pokus C 8 pulsů	21 ±14				1294 ±189	2141 ±387	3634 ±868	2819 ±493
Pokus D 4 pulsy					1451 ±228	1572 ±320	1222 ±126	2474 ±646

Tabulka 3: Průměrná hodnota aktivity luciferázy v milionech relativních jednotek (RLU) na sval ± střední chyba průměru (SEM), N=10 v každé skupině. Podmínky elektropřenosu: intenzita pole 200 V/cm, 8 nebo 4 pulzy, délka pulzu 20 ms, proměnlivá frekvence.

- 14CZ 299473 B6

Výsledky získané v pokusu „A“ ukázaly, že vyšší frekvence (vyšší než 1 Hz) jsou účinnější než nízké frekvence, které odpovídají delší době mezi následujícími pulzy (10 s při 0,1Hz). Transfekční účinnost se zvyšovala s frekvencí v testovaném rozmezí od 0,1 do 4 Hz při 4 pulzech a od 0,1 do 3 Hz při aplikaci 8 pulzů.

Příklad 9

Vliv aplikace elektrického pole exponenciálně se zmenšujícího v závislosti na čase

Tento příklad ukazuje účinek aplikace exponenciálně se snižujícího elektrického pole na účinnost přenosu nukleových kyselin.

V tomto pokusu byly užity myši C57B1/6. V pokuse byl užit plazmid pXL3031 (obr. 12), což je vektor odvozený z plazmidu pXL2774, do kterého byl vložen gen luc+ kódující modifikovanou (cytoplazmatickou) luciferázu zPhotinus pyralis získanou zpGL3basic (GenBank CVU47295) pod kontrolu promotoru získaného z časného úseku cytomegaloviru (hCMV IE, GenBank HS51EE) s polyadenylační signálem z pozdního úseku viru SV40 (GenBank SV4CG). Bylo podáno 10 pg DNA.

Byl použit zdroj elektrických pulzů, který umožňoval aplikovat (model Easyject, Equibio, Plus, Kent, UK) pulzy elektrického pole s intenzitou měnící se podle exponenciálně klesající funkce v závislosti na čase (Equibio elektropulzátor, model Easyject Plus, Kent, UK). Velikost aplikovaného napětí odpovídá hodnotě napětí v maximu exponenciály. Druhým nastavitelným parametrem byla kapacitance (v pF), která kontroluje celkové množství dodané energie. Výsledky jsou uvedeny v tab. 4.

	Kap. 150pF	Kap. 300pF	Kap. 4 50pF	Kap. 600pF	Kap. 1200pF	Kap. 2400pF	Kap. 3000pF
4 0 V/cm						1,23	11
100 V/cm				16,5	2, 8	6, 5	23, 9
150 V/cm				1/8	3, 5	6,1
200 V/cm		5, 1		15, 8	18,8	121,5	189,7
300 V/cm	32,1	90, 5	48,7	760, 4	56, 2
400 V/cm		795
600 V/cm	62
800 V/cm	3, 1	1/1

Tabulka 4: Faktor zvýšení exprese (aktivity luciferázy) po aplikaci exponenciálně se snižujících pulzů. Faktor zvýšení je vypočten vzhledem ke kontrole, která byla získána injekcí plazmidu pXL3031 bez použití elektropřenosu (uvedeny jsou průměrné hodnoty faktoru zvýšení, v každém testu bylo N = 4 až N = 6.

Pro srovnání uvádíme, že faktor zvýšení exprese pro přenos pXL3031 při aplikaci obdélníkových pulzů (intenzita 200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, s frekvencí 1 Hz) byl v témže pokusu 44.

Tyto údaje ukazují, že je možné užít obdélníkové elektrické pulzy exponenciálně se snižujícího elektrického pole. Kromě toho v takovém případě bylo dosaženo podstatného zvýšení exprese při nízké intenzitě pole s vyšší kapacitanci (např. 200 V/cm a kapacitance 3000 pF) nebo při vysoké intenzitě pole s nižší kapacitanci (např. 400 V/cm a kapacitance 300 pF).

Příklad 10

Vliv kombinace krátkého pulzu vysokého napětí několika dlouhých pulzů nízkého napětí

-15CZ 299473 B6

Tento příklad ukazuje, že aplikované elektrické pole může být kombinace alespoň jednoho pulzu silného pole 500 až 800 V/cm po krátkou dobu, např. 50 nebo 100 ps, a alespoň jednoho pulzu slabého pole (méně než 100 V/cm) po delší dobu, např. delší než 1 ms až do 90 ms jak bylo užito v tomto pokusu.

Slabé elektrické pole v tomto pokusu mělo intenzitu 80 V/cm a bylo aplikováno ve 4 pulzech s frekvencí 1 Hz ms a dobou jednoho pulzu 90 ms. Byla použita dvě komerční elektropulzní zařízení. Elektrické pulzy byly nejdříve aplikovány jedním a pak druhým zařízením, změna se ío uskutečnila v době kratší než 1 vteřina pomocí manuální kontroly zařízení.

Plazmid použitý v tomto pokusu byl pXL3031. Podané množství DNA bylo 3 pg. Byly použity proměnlivé hodnoty intenzity elektrického pole, jak jsou uvedeny v tab. 5, ostatní experimentální podmínky byly shodné s příkladem 1.

Podmínky elektrického pole	Pokus 1 (3 pg pXL3031)	Pokus 2 (3 pg pXL3031)
Kontroly (bez elektrického pole)	320 1 126	75 + 27
Al : 500 V/cm , 1 x 0.1 ms	-	169 ± 63
A3 : 800 V/cm , 1 x 0.1 ms	416 ± 143	272 ± 84
B : 80 V/cm , 4 x 90 ms, 1 Hz	1282 ± 203	362,21 ± 85,17
Podmínky: Al, pak B	-	1479 ± 276
Podmínky: A.3, pak B	3891 ± 418	1426 ± 209
Podmínky: B, pak A3	-	347 + 66

Tabulka 5: Střední hodnoty luciferázové aktivity ± střední chyba průměru (SEM) v milionech RLU na sval. V každé skupině N = 10.

Tabulka 5, shrnující výsledky získané ve dvou sériích experimentů, ukazuje, že aplikace krátkého vysokonapěťového pulzu, nebo 4 dlouhých nízkonapěťových po sobě následujících pulzů, jen málo zvyšuje transfekční účinnost ve srovnání s kontrolní skupinou, která dostala injekci plazmidu pXL3031 ale nebyla vystavena působení elektrického pole. Totéž platí, když se aplikují slabé pulzy před pulzem vysokého napětí.

Naproti tomu v obou sériích pokusů kombinace krátkého vysokonapěťového pulzu následovaného 4 po sobě jdoucími pulzy nízkého napětí zřetelně vedla ke zvýšení účinnosti transfekce DNA.

Jak bylo ukázáno v příkladu 1 a 2, aplikace 8 pulzů při intenzitě 600, 800 nebo 1200 V/ cm po dobu 1 ms s frekvencí 1 Hz způsobovala svalové léze a inhibovala transfekci. Výsledky získané v tomto příkladu 10 ukazují, že za popsaných podmínek je možné požít vysokonapěťové pole, aniž by způsobilo léze. A skutečně podle makroskopické vyšetření svalů svaly nebyly nikdy viditelně poškozeny. Užití vysokonapěťové pole s krátkou dobou trvání v kombinaci se slabým polem delšího trvání poskytuje další prostředek pro modulaci účinnosti přenosu DNA.

Příklad 11

Elektropřenos s plazmidy různých velikostí, geny řízenými různými promotory a nebo se sekvencemi pro různá cílová místa proteinu exprimovaného transgenem

11 .a - Elektropřenos plazmidů různé velikosti

Byly testovány plazmidy různých velikostí (2,8 kb, 3,8 kb, 8,6 kb, 20 kb a 52,5 kb) obsahující gen kódující luciferázu. množství podaného plazmidu bylo 10 pg na sval. Bylo aplikováno

-16CZ 299473 B6 elektrické pole s intenzitou 200 V/ cm v 8 pulzech délky 20 ms s frekvencí 2 Hz, ostatní podmínky byly shodné s příkladem 1.

Bylo pozorováno zvýšení exprese transgenu přibližně 50 x s plazmidy velikosti 2,8 a 3,8 kb, asi 5 80 x pro plazmid velikosti 8,6 kb a zvýšení 3 a ž 6 x pro plazmidy velké 20 a 52,6 kb.

Tento příklad demonstruje možnost přenosu plazmidů velkých 20 kb a více.

.b — Kontrola luminiscenčního signálu v nepřítomnosti genu kódujícího luciferázu o

Jako kontrola, a také pro vyloučení možnosti, že luminiscenční signál pozorovaný v testech luciferázové aktivity je výsledkem radikálů vznikajících ve tkáni vlivem elektrického působení, byla aktivita luciferázy testována na svalech, do kterých byl vnesen plazmid nekódující luciferázu a pak byly podrobeny účinkům elektrického pole.

Elektropřenos	-	+
Plazmid pXL 3004 (15 pg)	0,016 ± 0, 005	0,015 ± 0,006
kódující β-galaktosidázu	(n = 6)	(n=6)
Plazmid pXL 277 4 (15 pg)	7,33 + 3,5,	491,71 + 122,28
kódující luciferázu	(n = 10)	(n = 10)

Tabulka 6: Aktivita lucifrázy ve svalech injikovaných různými plazmidy, buďto s nebo bez aplikace elektrického pole. Podmínky pokusu: 200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, frekvence 1 Hz. Průměrná hodnota ± střední chyba průměru pro luciferázovou aktivitu v milionech RLU na sval.

Výsledky ukazují, že bazální luciferázová aktivita ve svalech injikovaných plazmidem, který Dekóduje luciferázu, je zcela zanedbatelná.

.c - Elektropřenos genů řízených různými promotory

Byl testován účinek různých promotorů na hladinu exprese přenesených genů s aplikací elektrického pole nebo bez něho.

Množství plazmidu injikované do každého svalu bylo 2 pg. Bylo aplikováno elektrické pole s intenzitou 200 V/cm v 8 pulzech délky 20 ms s frekvencí 1 Hz, ostatní podmínky byly shodné s příkladem 1. Výsledky jsou uvedeny v tab. 7. Testovaný plazmid byl pXL3031 s konstruktem CMV-LUC. Konstrukt PGK odpovídal tomu, že promotor CMV byl nahrazen promotorem PGK v plazmidu pXL3031.

Promotor	PGK	CMV
Elektropřenos	-	+		+
RLU	8 ± 2,8	1070 + 327	157 + 83	20350+ 1112
Faktor zesílení	x 133,7	x 129,3

Tabulka 7: Průměrné hodnoty ± střední chyba průměru luciferázové aktivity v milionech RLU na 35 sval.

Výsledky ukazují, že když je DNA přenášena v přítomnosti elektrického pole, faktor zvýšení exprese transgenu je srovnatelný bez ohledu na původ a sílu promotoru.

- 17CZ 299473 B6 .d — Elektropřenos genu s různými cílovými místy proteinu exprimovaného transgenem

Tento příklad ilustruje přenos genů kódujících proteiny s různou lokalizací. Plazmid pXL3031 kóduje luciferázu syntetizovanou v cytosolu a plazmid pXL2774 kóduje luciferázu směrovanou do peroxisomů.

Množství plazmidů injikované do svalu bylo 10 pg. Bylo aplikováno elektrické pole s intenzitou 200 V/cm v 8 pulzech délky 20 ms s frekvencí 1 Hz, ostatní podmínky byly shodné s příkladem 1. Výsledky jsou uvedeny v tab. 8.

pXL2774	PXL3031
elektropřenos -	elektropřenos +	elektropřenos -	elektropřenos +
11 ± 5	1158 + 238	839 ± 281	111524 ± 16862

Tabulka 8: Průměrné hodnoty ± střední chyba průměru luciferázové aktivity v milionech RLU.

Výsledky ukazují, že způsob podle vynálezu je vhodný pro přenos genů, které kódují proteiny s různou buněčnou lokalizací, zvláště pak pro peroxisomální a cytosolické proteiny.

Příklad 12

Kinetika a histologická analýza exprese transgenu

12.a-Kinetika exprese transgenu

Tento příklad ukazuje, že přenos nukleových kyselin v přítomnosti elektrického pole za podmínek podle vynálezu umožňuje získat expresi transgenu s vysokou a stabilní hladinou na dobu nejméně 4 měsíců.

V tomto pokusu byly užity myši C67B1/6. Použitý plazmid byl pXL2774, množství podané DNA bylo 15 pg. Po injekci DNA bylo aplikováno elektrické pole (nikoliv u kontroly) následujících vlastností: 200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, frekvence 1 Hz. Ostatní podmínky byly stejné jako v příkladu 1. Aktivita luciferázy byla stanovena pro skupiny 10 myší utracených v různé době po injekci DNA. Výsledky jsou ukázány na obr. 6.

Bylo pozorováno, že exprese lucifeázy je detekovatelná od třetí hodiny po injekci plazmidů a zvyšuje se až do třetího dne (D3) a pak začíná klesat od 35. dne.

Bylo také pozorováno, že u skupin, kde byly aplikovány elektrické pulzy, se exprese transgenu udržovala na výrazně vyšší hladině než u kontrolní skupiny. Dále bylo pozorováno, že hladina exprese zůstala vysoká a konstantní i po 35 dnech a nejméně do 120 dnů. Tato vysoká a trvalá exprese transgenu je zvláště významná z perspektivy dlouhodobého klinického využití terapeutických genů.

12.b - Histologická analýza

Histologická analýza byla provedena ve stejných podmínkách, kromě toho, že byl podán plazmid pCOR CMV-lacZ (pXL3004) kódující β-galaktosidázu s jadernou lokalizací.

Plazmid pXL3004 (viz obr. 13) je vektor získaný z plazmidů pXL2774 (viz WO 97/10343), který byl modifikován vložením genu lacZ doplněného signální sekvencí pro jadernou lokalizaci (viz Mouvel et al., 1994, Virology 204, 180-189), pod kontrolou promotoru CMV z plazmidů

-18CZ 299473 B6 pCDNA3 (Invitrogen, Holandsko) a polyadenylačního signálu časnéhoúseku SV40 (Genbank SV4CG).

Zvířata byla utracena 7 dnů po podání plazmidů. Histologická analýza umožnila detekovat buňky exprimující β-galaktosidázu jejichž jádro leží v rovině řezu (Xgal histochemie).

Počet myofibril s pozitivním jádrem v rovině řezu byl v průměru 76 u skupiny (n = 8), která dostala plazmid pXL3004 a pak byla vystavena působení elektrických pulzů, ve srovnání s průměrem 8,5 u kontrolní skupiny (N=8), tj. zvířaty, která dostala plazmid pXL3004 ale bez aplikace ío elektrických pulzů.

Bylo pozorováno, že počet svalových vláken exprimujících transgen byl v průměru 9 x vyšší ve srovnání s kontrolní skupinou. Většina svalových vláken byla v klidovém stadiu s jádrem lokalizovaným periferně. Fibrily s centrálně lokalizovaným jádrem jen vzácně exprimovaly β-galaktosidázu. Bylo také pozorováno, že podél dráhy vpichu plazmidů je hustota pozitivních svalových vláken na jednotku povrchu vyšší ve skupině s elektropřenosem ve srovnání s kontrolní skupinou.

Tyto výsledky souhrnně ukazují, ve srovnání se svaly, které nebyly vystaveny elektrickému poli, že elektropřenos umožňuje výrazně zvýšit počet svalových vláken exprimujících transgen a také vede k výraznému zvýšení povrchu oblasti exprimující transgen. Bylo také pozorováno, že aplikace elektrického pole nevyvolává významné zánětlivé reakce.

Příklad 13

Vliv okamžiku, kdy je injikován plazmid, vzhledem k aplikaci elektrického pole

Tento příklad ilustruje skutečnost, že nukleové kyseliny mohou být podávány přinejmenším 30 minut, a dokonce přinejmenším 1 hodinu před aplikací elektrického pole.

V pokusu byly užity myši C57B1/6, použitý plazmid byl pXL2774 a množství podané DNA bylo 15 pg nebo 1,5 pg. Podání DNA předcházela nebo následovala aplikace elektrického pole: 200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, frekvence 1 Hz. Ostatní experimentální podmínky byly stejné jako v příkladu 1. Kontrolní myši obdržely injekci plazmidů, ale nebyly vystaveny elektrickému poli. Získané výsledky jsou uvedeny v tab. 9.

Tabulka 9A: Injekce DNA bez aplikace elektrického pole

	pokus 1 pXL2774 (15 pg)	pokus 2 pXL2774 (15 pg)	pokus 3 pXL2774 (1,5 pg)	pokus 4 pXL2774 (15 pg)	pokus 5 PXL2774 (1,5 pg)
kontrola	7±4	8+6	0.4±0.2	22 + 15	lil

Tabulka 9B: Injekce DNA před aplikací elektrického pole

čas	pokus 1	pokus 2	pokus 3	pokus 4	pokus 5
-120 minut				20±5	2±1
-60 minut				106±22	10 ±3
-30 minut	303 ± 36	237 + 61	7 ± 3	184 ± 22	15 ± 4
-5 minut	410 i 7
-60 s	253 i 51
-20 s	492 ± 122	201 ± 43	9 ± 3	123 ± 23	12 ± 2

-19CZ 299473 B6

Tabulka 9C: Injekce DNA po aplikaci elektrického pole

čas	pokus 1	pokus 2	pokus 3	pokus 4	pokus 5
+ 10 s				7 ± 7
+ 20 s	11 ± 6	0,4 ± 0,1
+ 60 s	8 ± 7			17 ± 15

Tabulka 9: Průměrné hodnoty ± SEM luciferázové aktivity v milionech RLU na sval. V každé skupině N = 10 svalů.

Přítomnost DNA v okamžiku aplikace elektrického poleje podmínkou účinné elektrotmasfekce. Překvapivě bylo pozorováno, že injekce plazmidové DNA může být aplikována nejméně 30 minut a do konce až jednu hodinu (pokusy 4 a 5) před aplikací elektrického pole, aniž by to výrazně ovlivnilo hladinu exprese. Podobné výsledky byly získány jak s dávkami 15 pg plazmidů ío na sval tak i s 10 x nižšími dávkami 1,5 pg.

Tyto výsledky umožňují představit si aplikaci několika injekcí stejného plazmidů, nebo různých plazmidů, do svalu v různých okamžicích před aplikací elektrického pole. Je také možné aplikovat několik injekcí do rozsáhlé oblasti svalu a pak aplikovat sérii elektrických pulzů na celou injikovanou oblast.

Příklad 14

Statistická studie závislosti mezi injikovanou dávkou DNA a hladinou exprese

Statistická analýza uvedená v tomto příkladu dovoluje srovnání závislosti účinku na dávce transgenu při aplikaci elektrického pole nebo bez něho. Tento pokus potvrdil, že elektropřenos značně snižuje variabilitu exprese transgenu.

Pět týdnů staré myši C57B1/6 byly injikovány plazmidem pXL3031 intramuskulámě bilaterálně do horního holenního svalu. Dávky plazmidů byly v rozpětí od 0,25 do 32 pg DNA. Bezprostředně po injekci byla jedna z injikovaných končetin vystavena působení elektrického pole 250 V/cm se 4 pulzy v délce 20 ms a frekvencí 1 Hz.

Zvířata byla utracena 5 dnů po ošetření a exprese transgenu se zkoumala ve tkáňových extraktech z každého svalu. Výsledky jsou uvedeny na obr. 7.

Porovnání změn v rozptylu jako funkce průměru pro každou sérii myší (n= 10) jasně ukázalo, že rozložení exprese transgenu má logaritmicko-normální charakter. Grafická analýza výsledků na obr. 7 potvrzená výpočty ukázala, že exprese se mění lineárně s logaritmem injikované dávky DNA.

Cochranův test ukázal, že zde existuje homogenita rozptylu pro každou regresi (s elektropřenosem a bez něho), což umožnilo použití reziduálního rozptylu k provedení všech výpočtů.

Test odchylky od linearity nebyl významný v rámci 5% rizika při elektropřenosu. Naproti tomu odchylka od linearity byla vysoce významná (p<0,01), což ukazuje na značnou heterogenitu za podmínek bez elektropřenosu). Reziduální rozptyl je při elektropřenosu 5x nižší.

Vezmeme-li v úvahu stanovené hodnoty reziduálního rozptylu, je možné užít 5x méně zvířat k získání stejné síly testu srovnání transfekční účinnosti s elektropřenosem a bez elektropřenosu. Tudíž pro demonstraci rozdílu v expresi charakterizovaném faktorem 2, 5 nebo 10, s 95% spolehlivostí, bylo by nutné injikovat 33, 8 nebo 5 zvířat s elektropřenosem a 165, 40 nebo 25 zvířat bez elektropřenosu. Tabulka shrnující tento typ výpočtů v případě elektropřenosu následuje.

-20CZ 299473 B6

poměr účinnosti	P = 95%	P = 90%	P = 85%	P — 75%
2	33	28	24	19
0	8	7	6	6
10	5	5	4	4

Tudíž snížení interindividuální variability dosažené elektropřenosem dovoluje provádět přesné analytické studie transfekce ke srovnání exprese různých genů. Umožňuje lepší definici léčebných dávek a také zabraňuje riziku spojenému s překročením dávek přijatelných v terapeutickém rozmezí.

Výsledek testu srovnávajícího směrnice získané každou regresní závislost nebyl významný. Lze tedy s 5% rizikem pokládat směrnice obou regresí za rovnoběžné.

Výpočty relativního účinku ukázaly, že k získání stejného účinku by bylo třeba injikovat do svalu ío 250x více DNA ve standardních podmínkách ve srovnáním s elektropřenosem (243 ± 85, 95% interval spolehlivosti).

Tyto výsledky pomocí korelace ukazují, že při stejné dávce DNA je hladina exprese 500x vyšší při elektropřenosu ve srovnání se standardním postupem bez elektropřenosu.

Příklad 15

Srovnání různých typů elektrod

Cílem tohoto příkladu bylo srovnání účinnosti přenosu DNA při použití dvou typů elektrod, a sice destičkových elektrod a jehlových elektrod. Kromě toho jehlové elektrody byly testovány pro různé orientace implantace.

Plazmid pXL2774 (150 pg) byl injikován do trojhlavého svalu potkana. Destičkové elektrody byly umístěny jak bylo popsáno v příkladu 1 se vzájemnou vzdáleností elektrod 1,2 cm.

U jehlových elektrod byla mezielektrodová vzdálenost 0,9 cm. Jehlové elektrody byly vnořeny ve stejné délce do svalové tkáně, buďto paralelně, nebo kolmo k ose svalových vláken, na obou stranách místa injekce. Bez ohledu na typ a orientaci elektrod, vlastnosti elektrického pole byly následující: intenzita 200 V/cm, 8 pulzů po 20 ms, frekvence 2 Hz. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny na obr. 8.

Výsledky ukazují, že aplikace elektrického pole pomocí dvou paralelních jehel implantovaných do svalu poskytuje výsledky srovnatelné s těmi, které byly získány s destičkovými elektrodami v kontaktu s kůží obklopující sval. Bylo také ukázáno, že účinnost elektropřenosu je nezávislá na směru implantace jehlových elektrod vzhledem k ose svalových vláken.

Tento příklad ukázal, že způsob podle vynálezu dovoluje elektropřenos nukleových kyselin jak s vnějšími (destičkovými), tak invazivními (jehlovými) elektrodami, a to bez ohledu na orientaci vzhledem k cílové tkáni. Použití jehlových elektrod je zvláště výhodné pro podávání nukleové kyseliny do velkých svalů, neboť umožní, že celkové napětí pulzů není velké (např. 100 V při vzdálenosti mezi elektrodami 0,5 cm s intenzitou elektrického pole 200 V/cm).

Příklad 16

Účinnost elektropřenosu do různých svalů myši, potkana, králíka a opice

Tento příklad ilustruje fakt, že elektropřenos nukleových kyselin se může využít u mnoha různých typů svalů různých druhů savců (myši, potkani, králíci a opice).

-21 CZ 299473 B6

Podmínky aplikace elektrického pole jsou definovány v tab. 10A u každého druhu zvířete. Výsledky tohoto pokusu jsou také uvedeny v tab. 1OA.

druh	plazmid	vlastnosti elektrického pole	horní holenní sval	lýtko- vý sval	přivý stehenní sval	vyl val	čAyřhla— vý sval
ED. ys	10 μς pXL3031	8x200 V/cm 20 rnsec, 2 Hz	x28	x!96	x342	XÍ21
potkan	150 pg pXL3031	8x200V/cm 20 msec, 2 Hz	x31			Xl60	Xl3, 2
králík	2 00 pg PXL2774	4x200 V/cm 20 msec, 1 Hz	X25417			x724	X3595

Tabulka 10A: Faktor zvýšení hladiny exprese luciferázy využitím elektropřenosu. Faktor byl 5 vypočten vzhledem k aktivitě luciferázy získané injekcí plazmidů pXL3031 nebo pXL2774 bez elektropřenosu. Údaje jsou průměrné hodnoty vždy z 10 svalů v každé skupině. Aktivita luciferázy byla stanovena sedm dnů po podání plazmidů.

Elektropřenos byl také testován na opicích rodu makak (Macaca fascicularis). Použit byl ío plazmid pXL3179 obsahující gen kódující fibroblastový růstový faktor 1 (FGF1 nebo aFGF).

Plazmid pXL3179 (obr. 11) byl odvozen z plazmidů pXL2774 (WO 97/10343), kde byl signální peptid lidského fibroblastového interferonového systému fúzován s cDNA pro FGF1 (sp-FGFl, Jouanneau et al., 1991, PNAS 88: 2 893-2 897), a byl vložen pod kontrolu promotoru získaného z časného úseku humánního cytomegaloviru (hCMV IE) a polyadenylačního signálu pozdního úseku viru SV40 (Genbank SV4CG)

Exprese FGF1 byla stanovena imunohistochemickým způsobem. Hodnoty ukazují počet pozitivních řezů 3. dny po intramuskulámí injekci 500 pg plazmidů pXL3179. Charakteristiky apli20 kovaného elektrického pole byly: 200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, frekvence 1 Hz. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny následující tabulce.

sval	elektropřenos -	elektropřenos +
trojhlavý sval	0	0
horní holenní sval	0	30
dvoj hlavy sval	0	4
čtyřhlavý sval	0	30

Tabulka 10B: Imunohistochemická demonstrace exprese FGF1 v různých svalech opice Macaca fascicularis. Hodnoty ukazují počty pozitivních řezů 3 dny po intramuskulámí injekci 500 pg plazmidů pXL3179 kódujícího FGF1, a to buďto s (+), a nebo bez (-) aplikace elektrického pole.

Výsledky ukazují, že elektropřenos významně zvyšuje expresi transgenu v různých typech svalů u různých druhů savců.

Příklad 17

Účinnost elektropřenosu do bránice potkana

Možnost dlouhotrvající a stabilní exprese terapeutického genu přímo v úrovni bránice je důleži35 tým terapeutickým přístupem, který je zejména výhodný v souvislosti s léčením degenerativních nemocí, které ovlivňují funkci tohoto svalu, zejména Duchenneovy myopatie.

-22CZ 299473 B6

Potkani byli podrobeni anestézii směsí largactylu a ketaminu (1 mg/kg largactyl, 150 mg/kg ketamin). V tomto experimentu byla bránice obnažena řezem podél sterna. Injekce byla provedena do bránice (50 pg plazmidu pXL2774 v 50 pl 20mM NaCl a 5% glukózy). Destičkové elektrody pak byly umístěny na každou stranu bránice podél dráhy injekce, (vzájemná vzdálenost elektrod byla 1 mm). Elektrické pole bylo následující: 160 V/cm nebo 300 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, frekvence 1 Hz. Elektrické pole bylo aplikováno na sval v době kratší než 1 minuta po injekci. Operační rána pak byla uzavřena.

V / cm	0	160 ]	300
celkové RLU	48 ± 33	920+474 j	51 ± 29

ío Tabulka 11: Hodnoty aktivity luciferázy jsou průměrné hodnoty ± střední chyba průměru (SEM) v milionech relativních jednotek (RLU) na sval, N=12 v každé skupině.

Tento příklad demonstruje významné zlepšení exprese transgenu v bránici po aplikaci 8 pulzů délky 20 ms pole s intenzitou 160 V/cm (p < 0,003, použit Mann-Whitneyův neparametrický test).

Příklad 18

Přenos genu kódujícího secemovanou alkalickou fosfatázu (SeAP) a kinetika exprese SeAP

Tento příklad ilustruje využití způsobu podle vynálezu k transformaci svalu v orgán, který exprimuje a secemuje polypeptid, který účinkuje jako lék nebo vakcína, a také k zajištění přítomnosti tohoto polypetidu ve vysoké a stálé koncentraci v krevním oběhu.

V tomto příkladu byl způsob elektropřenosu podle vynálezu testován na dospělých myších s plazmidem obsahujícím gen, který kóduje secemovatelnou alkalickou fosfatázu z lidské placenty. Dospělé myšiC57Bl/6 dostaly jednostranně do jednoho horního holenního svalu injekci plazmidu pXL3010.

PlazmidpXL3010 (viz obr. 13) je vektor odvozený zColEl, gen kódující secemovanou alkalickou fosfatázu (SeAP) z pSEAP-basic (Clontech, Genbank č. CVU09660) byl vložen pod kontrolu promotoru CMV (pCDNA3, Invitrogen, Holandsko) a polyadenylační signál pozdního úseku SV40 GenBank SV4CG).

Bylo aplikováno následující elektrické pole: intenzita elektrického pole 200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, frekvence 1 Hz. Elektrické pole bylo aplikováno 20 s po injekci plazmidu. Krevní vzorky se odebíraly 7 dní později z retroorbitálního plexu. Koncentrace alkalické fosfatázy v séru se měřila pomocí komerčně dostupného chemiluminiscenčního testu (Phospha-light, Tropix, Bedford,

01730). Několik svalů, pak vystavených působení elektrického pole nebo bez elektrického pole, bylo injikováno nekódujícím plazmidem (pUC19), což umožnilo ověřit nepřítomnost signálu odpovídajícího endogenní alkalické fosfatáze. Výsledky jsou uvedeny v tab. 12.

-23 CZ 299473 B6

plazmid pXL3010 μα	plazmid p’JCl9 49	elektropřenos ~	elektropřenos +
0,1	0	0.03 ± 0.01 (n=5.)	123 ±0.21 (n=10)
0, 3	0	0.05 ±0.02 (n=5)	1.92 ± 0,33 (n=10)
1	0	0.1.6 ± o . 04 (n=5)	7,58 ± 1.18 (n=10)
10	0	1.52 ± 0.59 (n=10)	262.87 ± 54.97 (n=10)
400	0	15.64 ± 10.77 (n=5)	2203.11 ± 332.34 (n=5·)
0, 1	9, 9	0..088 ± 0, 015 (n=5)	21.39 ± 3.54 (n=10)
0, 3	9, 7	0.90 ± 0.49 (n=5)	35.67 ± 16.15 (n=10)
1	3	0.26 ± 0.09 (n=5)	201.68 ± 32.38 (n=10)
10	0	0.21 ± 0.05 (n=10)	357.84. ± 77.02 (n=10)

Tabulka 12: Průměrné hodnoty koncentrace alkalické fosfatázy (SeAP) ± SEM v oběhu vyjádřené v ng/ml séra.

Když byl plazmid pXL3010 podán elektrotransfekcí, byl pozorován faktor zvýšení koncentrace SeAP v krvi 140 až 170.

Injekce 400 pg plazmidu (injekce; 100 pg v 54 pl oboustranně a dvakrát s 30 minutovým intervalem) s elektropřenosem vedla k sérové koncentraci alkalické fosfatázy 2200 ng/ml proti ío 16 ng/ml kontroly.

Je nutno dodat, že použití nekódující DNA(pUC19), které umožnilo pracovat s konstantním množstvím DNA (vždy celkem 10 pgDNA na myš) dále zlepšilo hladinu elektrotransfekce pro malá množství plazmidu pXL3010 (menší než 1 pg).

Kinetika exprese SeAP byla také sledována. V tomto případě byla dávka DNA 15 pg na sval injikována oboustranně (30 pg na myš). Výsledky jsou uvedeny na obr. 9. 7 dnů po transfekci byla pozorována významná a stálá hladina (alespoň po 2 měsíce) sérové koncentrace SeAP po podání pXL3010 elektropřenosem.

Tyto výsledky potvrdily, že přenos nukleové kyseliny do svalu způsobem podle vynálezu umožňuje dosáhnout vysoké a trvalé exprese, a to jak proteinů lokalizovaných ve svalu, tak i proteinů secemovaných, takže je možné přeměnit sval na orgán, který produkuje a secemuje požadovaný polypeptid.

Příklad 19

Přenos genu kódujícího erytropoetin (EPO)

Plazmid pXL3348 obsahující gen kódující erytropoetin byl injikován oboustranně do horního svalu dospělých myšíC57Bl/6. Plazmid pXL3348 (obr. 16) je vektor odvozený z plazmidu pXL2774, do kterého byl vložen myší gen pro erytropoetin (NCBI: 193086) pod kontrolu promotoru ěasného úseku lidského cytomegaloviru (hCMV-IE) a polyadenylačního signálu pozdního úseku viru SV40 (Genbank SV4CG). Bylo aplikováno elektrické pole následujících vlastností:

intenzita 200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, frekvence 1 Hz. Elektrické pole bylo aplikováno bezprostředně po injekci plazmidu.

Bylo pozorováno významné řešení obsahu erytropoetinu v krvi 7 a 24. den (D7 a D24) po podání 10 mg pXL3348 elektropřenosem. Kromě toho, fyziologický účinek zvýšení erytropoetinu, který vedl ke zvýšení hematokritu, byl vel,mi vysoký (85 %) a od 7. dne byl takový dokonce i pro velmi malá množství plazmidu (1 pg).

-24CZ 299473 B6

	sérová hladina erytropoetinu (mlU/ml) sedmý den (D7)	sérová hladina erytropoetinu (mlU/ml) čtyřiadvacátý den (D24)
plazmid	elektropřenos	elektropřenos +	elektropřenos	elektropřenos J.
pXL3348 (i pg)	0	3.0 ± 1.6	0	1.12 ± 0.8
pXL3348 (10 pg)	0,9 ± 0,9	61.8 ± 15.8	0	74.1 ± 28.9
pUCl9 (i pg)		0		0
	hematokrit % vzorky sedmého dne (D7)	hematokrit % čtyřiadvacátý den (D24)
plazmid	elektropřenos	elektropřenos -Γ	elektropřenos	elektropřenos T
pXL3348 (i pg)	38.5 ± 0.5	35.0 ± 3.6	50.8 ± 2.3	81 ± 0.5
pXL3348 (10 pg)	32.0 ± 3.2	26.0 + 4.1	69.0 ± 5.1	83.0 ± 1.0
pUC19 (i pg)		30.8 ± 2.3		4 3 2 4- 0 9

Tabulka 13: Průměrné hodnoty ± SEM, N=4 až 5 ve skupině.

Příklad 20

Přenos genu kódujícího vaskulámí endotelový růstový faktor (VEGF)

Myším C57B1/6 nebo SCID byl injikován do horního holenního svalu oboustranně pCOR hVEGF (pXL3212, 15 pg).

Plazmid pXE3212 (obr. 11) byl odvozen z plazmidů pXE2774 (WO97/10343) vložením cDNA kódující VEGF 165 (vaskulámí endotelový růstový faktor, Genbank HUMEGFAA) pod kontrolou promotoru časného úseku lidského cytomegaloviru (hCMV-IE) a polyadenylačního signálu pozdního úseku z SV40 (Genbank SV4CG).

Elektropřenos byl proveden v následujících podmínkách: intenzita pole 250 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, frekvence 2 Hz. Krevní vzorky byly odebrány z retroorbitálního plexu. Krev byla odebrána jeden den před a sedm dnů po injekci plazmidů. Imunoenzymatické kvantitativní stanovení lidského VEGF bylo provedeno pomocí soupravy Quantikine (R&D Systems). Byly provedeny dodatečné série lidského VEGF v myším séru. Výsledky těchto pokusů jsou uvedeny v tab. 14.

kmen myší	den	elektropřenos	lidský VEGF (ng/1)
C57B1/6	D-l	-	nedetekovatelnv
C57B1/6	D+7	-1.	393 ± 110
SCID	rS t U“_L	-	nedetekovatelný
SCID	D+7	+	99 ± 26

Tabulka 14: Hodnoty sérové koncentrace VEGF (ng/1) u C57B1/6 a SCID myší.

-25CZ 299473 B6

Příklad 21

Přenos genu kódujícího koagulační faktor IX

Plazmid pXL33 88 (15 pg) byl injikován bilaterálně do holenního svalu myšíC57Bl/6 nebo 5 SCID.

Plazmid pXL3388 viz (obr. 12) je vektor odvozený z plazmidu pXL2774 (WO97/10343) vložením cDNA kódující lidský koagulační faktor IX („Christmas factor“, Genbank HUMFIXA) pod kontrolou časného úseku lidského cytomegaloviru (hCMV-IE) a polyadenylačního signálu pozdního úseku z SV40 (Genbank SV4CG).

Elektropřenos byl proveden za následujících podmínek: intenzita pole 200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, frekvence 2 Hz. Krevní vzorky byly odebrány z retroorbitálního plexu. Vzorky se odebíraly 7 dnů po injekci plazmidu. Výsledky jsou uvedeny v tab. 15.

kmen myší	inj ekce	elektropřenos	lidský faktor IX (pg/l)
C57B1/6	pXL3388	+	69 + 12
C57B1/6	pXL3388	-	nedetekovatelný
C57B1./6	0,9% NaCl	+	nedetekovatelný
SCID	pXL33S8	+	66 ± 5
SCID	pXL3388	-	nedetekovatelný

Tabulka 15: Hodnoty koncentrace faktoru IX (pg/l) v plazmě u myší C57B1/6 a SCID.

Lidský koagulační faktor IX byl detekovatelný v krvi myší pouze tehdy, když byl plazmid podán v podmínkách a způsobem podle vynálezu.

Příklad 22

Přenos genu kódujícího fibroblastový růstový faktor 1 (FGF1)

Do holenního svalu myší C57B1/6 nebo SCID byl bilaterálně injikován plazmid pCorCMVaFGF (pXL3096, 15 pg).

Plazmid pXL3096 (obr. 14) je vektor odvozený z plazmidu pXL2774 (WO97/10343) vložením sekvence vytvářející trojšroubovici (TH, viz Wil et al., 1997, Gene Ther. 4: 323-330) s fúzí genu kódujícího signální peptid lidského fibroblastového interferonu a cDNA kódující FGF 1 (fibro30 blastový růstový faktor 1, sp-FGFl, Jouanneau et al., PNAS 88: 2 893-2 897) pod kontrolou promotoru lidského hCMV-IE, a následované vedoucí sekvencí thymidinkinázy z HSV (transkribovanou, netranslatovanou) a polyadenylačním signálem z SV40.

Elektropřenos byl proveden za podmínek: intenzita pole 200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms a frekvence 2Hz.

Přítomnost FGF1 byla detekována imunohistochemicky.

Výsledky transfekce myší C57B1/6 jsou uvedeny na obr. 10. Počet pozitivních svalových vláken byl vždy zřetelně vyšší u svalů podrobených elektropřenosu než u kontrolních svalů (které obdržely pouze samotnou injekci plazmidu pXL3096). V 21. s35. den (D21 a D35) je přítomnost FGF u kontrolních skupin prakticky nedetekovatelná, zatímco u skupin po elektrotransfekci bylo detekováno velké množství pozitivních svalových vláken. Výsledky pro myši SCID jsou uvedeny v tab. 16.

-26CZ 299473 B6

	elektropřenos	levý horní holenní	pravý horní holenní
pXL30S6	+	600	450
(15 pg	-r	700	500
pXL30S6	-	3	0
(15 μα	-	3	0
	-	0	0
pXL30S6	-Γ	80	7 0
(1,5 ug’	+	20	35
	+	110	100
pXL30S6	-	0	0
(1/5 ug ]	-	0	1

Tabulka 16: Exprese FGF, imunohistochemická studie a počet pozitivních vláken v řezech ze střední části svalu.

Exprese FGF1, určená počtem pozitivních vláken imunohistochemickou metodou, byla detekována výlučně u myší, u kterých bylo aplikováno elektrické pole. Kromě toho je třeba si všimnout, že exprese FGF1 byla detekována do konce i při nízkých dávkách DNA.

ío Příklad 23

Přenos genu kódujícího neurotrofický faktor NT3

Způsob podle vynálezu byl užit u dospělých myší (C57B1/6) a mladých myší Xt/pmn k přenosu genu kódujícího neurotrofm NT3. Myši Xt/pmn představují model amyotrofické laterální sklerózy (ALS), charakteristické časnou a rychlou degenerací motorických neuronů a průměrnou očekávanou délkou života ,40 dnů.

23.1 - Přenos genu kódujícího NT3 do dospělých myší

Plazmid pXL3194 (12,5 pg), který obsahuje gen kódující myší neurotrofm 3 (NT3), byl injikován oboustranně do horního holenního svalu 5 týdnů starých myší C57B1/6 nebo mláďat myší.

Plazmid pXL3194 (viz obr. 14) je vektor odvozený z plazmidů pXL2774 (WO97/10343) vložením myšího genu pro myší neurotrofin 3 (NT3, Genbank MMNT3) pod kontrolou časného úseku lidského cytomegaloviru (hCMV-IE) a polyadenylačního signálu pozdního úseku z SV40 (Genbank SV4CG).

Bylo aplikováno elektrické pole následujících vlastností: intenzita elektrického pole 250 V/cm, 4 pulzy délky 20 ms, frekvence 1 Hz. Elektrické pole bylo aplikováno bezprostředně po injekci.

Přítomnost NT3 byla detekována v supematantu připraveném centrifugací (12 000xg) svalu rozdrceného v PBS 7 dnů po podání genu, a byla kvantifikována pomocí ELISA testu (souprava od firmy Promega).

Průměrné hodnoty vypočtené pro 20 svalů (95% interval spolehlivosti) byly 75 ± 11 pg/sval (DNA podaná bez aplikace elektropřenosu) a 2700 ± 900 ng/sval (DNA podaná s elektropřenosem).

Pokud byl plazmid pXL3149 podán v podmínkách a způsobem podle vynálezu, bylo pozorováno zvýšení v produkci NT3 ve svalu až 55x.

-27CZ 299473 B6

23.2 - Přenos genu kódujícího NT3 do mláďat myší

Podobný pokus byl proveden u 4 až 5 dnů starých heterozygotních myší Xt/pmn s plazmidem pXL3149. Byla injikována dávka 130 pg DNA na každé zvíře do různých svalů (lýtkový sval

25 pg, horní holenní sval 12,5 pg).

Bylo aplikováno následující elektrické pole: 500 V/cm, 4 pulzy délky 20 ms, frekvence 1 Hz.

Přítomnost NT3 byla hodnocena u těchto myší sedm dnů po podání plazmidu a aplikaci io elektrického pole v plazmě a ve svalu (lýtkový sval nebo horní holenní sval). Kontrola bazální hladiny NT3 byla získána podáním roztoku 0,9% NaCl. NT3 byl kvantitativně stanoven pomocí

ELISA soupravy (Promega). Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny v tab. 17.

	0,9	% NaCl	pXL3l$4
elektropřenos	-	+	-	-L
plazma	0	0	4 6 ±10	1599 ± 639
	(n=2)	(n=2)	ř n= 4)	(n=4)
lýtkový sval	3619±10	1619 ± 150	3647 + 1078	19754±3818
	(n=2)	(n=2)	(n=8)	(n-8)
horní holenní	1415±363	1453 ± 375	1400 ± 155	1S826±3135
sval	(n-4)	(n=2)	(r-8)	(n=S)

Tabulka 17: Průměrné hodnoty NT3 ± SEM (pg/sval nebo pg/ml plazmy).

V experimentálních podmínkách tohoto příkladu byla detekována bazální hladina NT3 v lýtkovém a holenním svalu. Za standardních podmínek bez elektropřenosu hladina exprese NT3 po injekci plazmidu pXL3149 nebyla vyšší bazální hladina ve svalu. Když bylo užito k přenosu způsobu podle vynálezu, bylo pozorováno zvláště velké zvýšení množství NT3 ve svalu. Bylo také výrazně zvýšeno množství NT3 secemované svalem a detekované v plazmě (zvýšeno 35 x).

Výsledky demonstrují, že pro dané množství DNA způsob podle vynálezu umožňuje velmi významně zvýšit účinnost přenosu a dosáhnout, a to nejen ve svalu, ale i v plazmě, velkého zvýšení obsahu neurotrofinů jako je NT3.

Příklad-24

Přenos genu kódujícího lidský růstový hormon

Plazmid pXL3353 (10 pg) nebo plazmid pXL3354 (10 pg) byl injikován jednostranně do holenního svalu myšíC57Bl/6. Plazmid pXL3353 (viz obr. 15) je vektor odvozený z plazmidu pXL2774 vložením genomového genu pro lidský růstový hormon (fragment hGH Xbal/Sph zasahující od iniciačního signálu transkripce až k místu BamHI 224 bp za polyadenylačním signálem) pod kontrolou časného úseku lidského cytomegaloviru (hCMV-IE) a polyadenylač35 ního signálu pozdního úseku z SV40 (Genbank SV4CG). cDNA pro hGH byla získána reverzní transkripcí z poly(A+)mRNA knihovny z lidské hypoíyzy po 30 cyklech PCR amplifíkace s následujícími oligonukleotidovými primery:

Oligonukleotid komplementární k úseku 5':

5 -GGGTCTAGAGCCACCATGGCTACAGGCTCCCGGAC-3'

Tento oligonukleotid obsahuje Xbal místo a Kozákovu sekvenci.

Oligonukleotid komplementární k úseku 3':

-28CZ 299473 B6 '-GGG ATCC ATTTACTAG A AGCCACAGCTGCCTC-3'

Tento oligonukleotid obsahuje místo Nsil a stop-kodon.

Amplifikovaný fragment byl vložen do plazmidů pCR2.1 (souprava TA Cloning Kit, Invitrogen) 5 a sekvencován. Fragment Xbal/Nsil velikosti 681 bp obsahující hGH cDNA byl ligován s fragmentem Xbal/Nsil z pXL3353, čímž byl vytvořen plazmid pXL3354 (obr. 15).

Elektropřenos byl proveden za podmínek: intenzita elektrického pole 200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, frekvence 1 Hz. Elektrické pole bylo aplikováno bezprostředně po injekci plazmidové ío DNA. Přítomnost hGH byla hodnocena sedm dnů po injekci plazmidů v supematantu ze svalu rozdrceného v pufru PBS po centrifugaci ve 12 000xg. Množství hGH bylo stanoveno ELISA testem (Boehringer Manheim).

	injekce genomové hGH ípXL3353)	injekce hGH cDNA (pXL3354)
elektro přenos		+	—	T
horní	87,1	1477,6	2820,0	15739,1
hoienní	± 9,3	± 67, 6	± 487,5	± 915,5
sval	(n=10)	(n=10)	(n=10)	(n=10)

Tabulka 18: Průměrné hodnoty exprese proteinu hGH ± SEM (pg/sval).

Tyto výsledky ukazují, že elektropřenos podle předkládaného vynálezu umožňuje mnohem vyšší expresi lidského růstového hormonu. Je třeba připomenout, že toto zvýšení bylo pozorováno i když byl podán plazmid obsahující celý gen se všemi regulačními sekvencemi.

Příklad 25

Účinek elektropřenosu na expresi trans genů pro vakcinaci

Tento příklad ukazuje, že způsob podle předkládaného vynálezu je využitelný pro přenos genů kódujících požadované vakcinační peptidy.

Experiment byl proveden na 9 týdnů starých samicích myší Balb/c. Elektrody byly ploché elektrody z nerezové oceli vzdálené od sebe 5 mm. VR-HA je plazmidová DNA obsahující gen pro hemaglutinin z chřipkového viru (kmen A/PR/8/34). VR-gB je plazmidová DNA, obsahující gen pro glykoprotein B (gB) lidského cytomegaloviru (kmen Towne).

Roztok plazmidů (50 μΐ roztoku-20 pg/ml nebo 200 pg/ml v 0,9% NaCl) byl injikován skrz kůži podélně do horního lýtkového svalu levé končetiny. Elektrické pulzy byly aplikovány kolmo na osu svalu pomocí generátoru obdélníkových pulzů 20 sekund po injekci (intenzita elektrického pole 200 V/cm, 8 po sobě jdoucích pulzů dílky 20 ms, frekvence 1 Hz).

Pro hodnocení stimulace imunitní odpovědi byl použit následující imunizační protokol:

DO byl odebrán vzorek pre-imunního séra Dl první injekce, s elektropřenosem nebo bez

D21 odebrán vzorek imunního séra

D22 zesilující injekce, s elektropřenosem nebo bez D42 odebrán vzorek imunního séra

D63 odebrán vzorek imunního séra

-29CZ 299473 B6

Vzorky krevního séra byly odebírány z retroorbitálního sinusu. Množství specifických protilátek bylo stanoveno pomocí ELISA testu. Každé experimentální podmínky byly testovány na 10 zvířatech injikovaných jednostranně.

Výsledky uvádějící titry protilátek proti chřipkovému hemaglutininu jsou uvedeny v tab. 19A.

	elektro přenos	DO	D21	D42	D63
VR-HA (i μ?)	~~	<50	132 ± 739	1201 ± 4380	1314 ± 2481
VR-HA (i pg)	4-	<50	1121 + 1237	10441 ± 7819	8121 ± 5619
(P)			(0.0135)	(0.0022)	(0.0033)
VR-HA (10 pg)		<50	781 ± 666	5113 i 16015	4673 ± 8238
VR-HA (iopg)	+	<50	4153 ± 2344	74761 ± 8S228	41765 ± 52361
(p)			(0.0002)	(0.0005)	(0.0007)

Tabulka 19-a: Titr protilátek proti chřipkovému hemaglutininu po injekci 1 nebo lOpgDNA (VR-HA) buďto bez (-), a nebo s (+) aplikací elektrického pole. Tyto výsledky představují ío geometrický průměr ze skupin po 10 zvířatech (N=8 pro skupinu injikovanou 1 pg, exponovanou elektrickému poli a testovanou v D63) ± směrodatná odchylka. Hodnota p byla získána srovnáním vždy dvou skupin injikovaných DNA a pak buďto s aplikací elektrického pole, nebo bez pomocí statistického neparametrického Mann-Whitneyova testu.

Tyto výsledky ukazují, že titr protilátek proti chřipkovému hemaglutininu výrazně vzrostl, a to asi lOx, ve skupině, kde byly aplikovány elektrické pulzy. Takže myši, které obdržely 1 pg DNA-při současné aplikaci elektrických pulzů měly mírně vyšší průměrný titr protilátek proti hemaglutininu než myši, které obdržely 10 pg DNA, ale nebyly podrobeny působení elektrického pole.

Výsledky ukazující protilátkovou reakci namířenou proti CMV glykoproteinů B jsou uvedeny v tab. 19B.

	elektro přenos	DO	D21	D42	D63
VR-gB (10gg)	-	<50	73 ± 138	755 ± 1766	809 ± 1363
VR-gB (10μα)	+	<50	200 ± 119	3057 ± 1747	2112 ± 1330
(p)			(0.0558)	(0.0108)	(0.0479)

Tabulka 19—b: Titr protilátek proti CMV glykoproteinů B po injekci 10 pg DNA (VR-gB) buďto bez (-), a nebo s (+) aplikací elektrických pulzů. Tyto výsledky představují geometrický průměr ze skupin po 10 zvířatech (N=9 pro skupiny exponované elektrickému poli) ± směrodatná odchylka. Hodnota p byla získána srovnáním vždy dvou skupin injikovaných DNA a pak buďto s aplikací elektrického pole, nebo bez pomocí statistického neparametrického Mann-Whitneyova testu.

Tyto výsledky ukazují, že titr anti-gB protilátek vzrostl 4 x do 42. dne (D42) ve skupině podrobené působení elektrických pulzů. Bylo také pozorováno, že koeficient rozptylu byl 3x menší u skupiny myší s aplikací elektrických pulzů.

Claims (2)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   I. Nukleová kyselina a elektrické pole s intenzitou 1 až 800 V/cm, jako sdružený produkt,

   5 vyznačující se tím, že je určen pro jejich samostatnou nebo časově oddělenou aplikaci in vivo do příčně pruhovaného svalu a pro genovou terapii založenou na in vivo elektrotransfekci do příčně pruhovaného svalu následující po podání nukleové kyseliny, kdy celková doba aplikace elektrického poleje delší než 10 ms.

   ío 2. Sdružený produkt podle nároku 1, vyznačující se tím, že intenzita elektrického poleje 4 až 400 V/cm.

   3. Sdružený produkt podle nároku 1, vyznačující se tím, že intenzita elektrického pole je 30 až 300 V/cm.

   4. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků laž3, vyznačující se tím, že

   15 aplikace elektrického pole na sval obsahuje jeden nebo několik pulzů s pravidelnou frekvencí.

   5. Sdružený produkt podle nároku 4, vyznačující se tím, že aplikace elektrického pole na sval obsahuje 1 až 100 000 pulzů s frekvencí 0,1 až 1000 Hz.

   20 6. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že elektrické pulzy jsou aplikovány nepravidelně, a že funkce popisující závislost intenzity elektrického pole na čase projeden pulz je proměnlivá.

   7. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků lažó, vyznačující se tím, že

   25 integrál funkce popisující proměnlivost elektrického pole v čase má hodnotu větší než

   1 kV x ms/cm.

   8. Sdružený produkt podle nároku 7, vyznačující se tím, že integrál je větší než 5 kV x ms/cm.

   9. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků laž8, vyznačující se tím, že elektrické pulzy jsou vybrány ze skupiny obsahující pulzy typu obdélníkových kmitů, exponenciálně tlumených kmitů, oscilujících unipolámích kmitů omezeného trvání, oscilujících bipolárních kmitů omezeného trvání a dalších tvarů kmitů.

   10. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, v y z n a č u j í c í se t í m , že elektrické pulzy obsahují pulzy obdélníkových kmitů.

   II. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků lažlO, vyznačující se tím, že

   40 elektrické pulzy se aplikují elektrodami, které jsou umístěny buďto po straně svalu nebo v kontaktu s kůží.

   12. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků lažlO, vyznačující se tím, že elektrické pulzy se aplikují elektrodami, které jsou vloženy do vnitřku svalu.

   13. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, vyznačující se tím , že nukleová kyselina se injikuje do svalu.

   14. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků lažl2, vyznačující se tím, že

   50 nukleová kyselina se injikuje systémově.

   15. Sdružený produkt podle nároku 14, vyznačující se tím, že nukleová kyselina se injikuje intraarteriálně nebo intravenózně.

   -31 CZ 299473 B6

   16. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků lažl2, vyznačující se tím, že nukleová kyselina se podává cestou topickou, kutánní, perorální, vaginální, intranasální, subkutánní nebo intraokulámí.

   17. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků lažl6, vyznačující se tím, že nukleová kyselina je obsažena v přípravku, který navíc obsahuje farmaceuticky přijatelné excipienty pro různé způsoby podávání.

   ío 18. Sdružený produkt podle nároku 17, vyznačující se tím, že přípravek je vhodný pro parenterální podávání.

   19. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků lažl8, vyznačující se tím, že nukleová kyselina je deoxyribonukleová kyselina.

   20. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 1 až 18, vyznačující se tím, že nukleová kyselina je ribonukleová kyselina.

   21. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 1 až 20, vyznačující se tím, že

   20 nukleová kyselina je syntetického nebo biosyntetického původu, nebo je izolována z viru, z jednobuněčného nebo vícebuněčného eukaryotického organismu nebo z prokaryotického organismu.

   22. Sdružený produkt podle nároku 21, vyznačující se tím, že podávaná nukleová

   25 kyselina je spojena s některými nebo všemi složkami původního organismu a/nebo systému užitého pro syntézu.

   23. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 1 až 22, vyznačující se tím, že nukleová kyselina kóduje požadovanou RNA nebo požadovaný protein.

   24. Sdružený produkt podle nároku 23, vyznačující se tím, že RNA je katalytická RNA nebo antisense RNA.

   25. Sdružený produkt podle nároku 23, vyznačující se tím, že nukleová kyselina

   35 kóduje protein vybraný ze skupiny obsahující enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfokiny, růstové faktory, trofícké faktory, angiogenní faktory, neurotrofické faktory, růstové faktory kostí, hematopoetické faktory, koagulační faktory, antigeny a proteiny účastnící se v metabolismu aminokyselin, lipidů a dalších esenciálních složek buňky.

   40 26. Sdružený produkt podle nároku 25, vyznačující se tím, že nukleová kyselina kóduje angiogenní faktory VEGF a FGF, neurotrofické faktory BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, FGF1, NT3, NT5, protein GAX, inzulín k léčení diabetů, růstový hormon, cytokin, α-1-antitripsin, kalcitonin, leptin a apolipoproteiny, enzymy biosyntézy vitamínů, hormony a neuromediátory.

   27. Sdružený produkt podle nároku 23, vyznačující se tím, že nukleová kyselina kóduje protilátku, variabilní fragment jednořetězcové protilátky (ScFv) nebo jakýkoliv protilátkový fragment, který má vhodnou rozpoznávací schopnost pro účely imunoterapie, nebo kóduje rozpustný receptor, peptid, který je agonistou nebo antagonistou receptoru nebo adhezního

   50 proteinu, nebo kóduje umělý, chimérický nebo zkrácený protein.

   28. Sdružený produkt podle nároku 27, vyznačující se tím, že nukleová kyselina kóduje antiidiotypovou protilátku, rozpustný fragment receptoru CD4 nebo receptoru TNFa nebo acetylcholinového receptoru.

   -32CZ 299473 B6

   29. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 25 až 28, vyznačující se tím, že nukleová kyselina kóduje prekurzor terapeutického proteinu.

   30. Sdružený produkt podle kteréhokoli v z nároků 1 až 29, vyznačující se tím, že

   5 nukleová kyselina je ve formě plazmidů.

   31. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 1 až 29, vyznačující se tím, že nukleová kyselina obsahuje gen velkého rozsahu a/nebo introny a/nebo regulační prvky malého nebo velkého rozsahu.

   32. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků laž29, vyznačující se tím, že nukleová kyselina je episomální DNA nebo umělý kvasinkový chromosom nebo minichromosom.

   15 33. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 1 až 32, vyznačující se tím, že nukleová kyselina obsahuje sekvence, které umožňují a/nebo podporují expresi transgenu ve svalu.

   34. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků laž33, vyznačující se tím, že

   20 nukleová kyselina je spojena s jakýmkoliv typem vektoru nebo s jakoukoliv kombinací vektorů, které umožňují zlepšit přenos nukleové kyseliny, jako jsou viry, syntetická nebo biosyntetická činidla nebo propulzní či jiné částice.

   35. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků laž34, vyznačující se tím, že

   25 sval se podrobí ošetření, jehož cílem je zlepšit přenos genu, přičemž toto ošetření je farmakologické povahy lokální nebo systémovou cestou nebo se jedná o ošetření enzymatické, permeabilizující, chirurgické, mechanické, tepelné nebo fyzikální povahy.

   36. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků laž35, vyznačující se tím, že

   30 umožňuje to, aby sval produkoval činidlo ve fyziologické nebo terapeutické dávce, přičemž činidlo je buďto ve svalových buňkách, neboje secemováno.

   37. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků laž35, vyznačující se tím, že umožňuje modulovat množství exprimovaného transgenu tím, že se moduluje objem svalové

   35 tkáně, která je transfekována.

   38. Sdružený produkt podle nároku 37, vyznačující se tím, že umožňuje modulovat objem svalové tkáně, která je transfekována, tím, že se užije více míst k podávání.

   40 39. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků laž38, vyznačující se tím, že umožňuje modulovat množství exprimovaného transgenu tím, že se moduluje počet, tvar, povrch a uspořádání elektrod, a tím, že se mění intenzita, počet, trvání, frekvence a tvar pulzů, a také tím, že se mění množství a objem podávané nukleové kyseliny.

   45 40. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 1 až 39, vyznačující se tím, že umožňuje kontrolovat lokalizaci transfekované tkáně prostřednictvím objemu tkáně vystavené lokálním elektrickým pulzům.

   41. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 1 až 40, vyznačující se tím, že

   50 umožňuje návrat do počátečního stavu tím, že se odstraní oblast transfekované tkáně.

   20 výkresů 55

   -33CZ 299473 B6 □činek elektrických pulzů s vysokou intenzitou pole na transfekci plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru (SEM).

   Φ

   O

   C

   Q.

   +-»

   Ui <0

   O (0

   O) o

   ΓΠΗ φΛΟΜΡΟ

   Obr. la

   O.ímsec 1msee imsec

   Elektrické pole (V/cm) a trvání pulzu (ms) (8 pulzů s frekvenci 1 Hz)

   -34CZ 299473 B6

   Účinek elektrických pulzů s vysokou intenzitou pole na transfekci plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota + střední chyba průměru (SEM).

   CQ

   8 8 § 8 8 my θ^ΛθΜΐθο

   0 1200 0,Imsec 1200 Imsec 800 Imsec

   Elektrické pole (V/cm) a trvání pulzu (ms) (8 pulzů s frekvencí 1 Hz)

   Obr. lb

   Účinek elektrických pulzů se střední intenzitou pole na transfekci plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru (SEM).

   Obr. 2a

   -36CZ 299473 B6

   Účinek elektrických pulzů se střední intenzitou pole na transfekci plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru (SEM).

   Φ o

   c

   Q.

   □

   u) c

   u

   Φ c

   ffl § 8 8 a 8 £ Ξ mM 9ΛΟ>|ΡΟ

   Obr. 2b <A £ § ε □

   - o. § 2* «7 s s ε a — N

   I 1

   I E *“ ra § ? o > 0) ° O o. *φ o

   X

   UJ

   -37CZ 299473 B6

   Účinek elektrických pulzů se slabou intenzitou pole na transfekci plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru (SEM).

   Φ o

   c

   Q.

   ‘C (0

   Ul o

   4 ·« 44H 4 4 4 0 ma ?λο>ιιθο

   Obr.3a

   Elektrické pole (V/cm) a trvání pulzu (ms) (8 pulzů s frekvencí 1 Hz)

   -38CZ 299473 B6

   Účinek elektrických pulzů se slabou intenzitou pole na transfekci plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru (SEM).

   ω e>

   c

   o.

   W

   C u

   <0

   Φ

   C cd

   Obr. 3b

   -39CZ 299473 B6

   Účinek elektrických puizů se slabou intenzitou pole a s různou délkou trvání na transfekci plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru (SEM).

   Φ o

   Έ

   CL □

   4-» tn

   CQ cn o

   -J <

   Elektrické pole (V/cm) a trvání pulzu (ms) (8 pulzú s frekvencí 1 Hz)

   8 2 my ®Λο>ιιθο

   Obr. 4a

   -40CZ 299473 B6 účinek elektrických pulzů se slabou intenzitou pole a s různou délkou trvání na transfekcí plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru (SEM).

   Φ

   O c

   o.

   «

   Km c

   &_ ‘«J

   Φ c

   Σ3 od §§§§§§§§§§§§§§§ 2 ? 5 § B § 8 s 2 S 8 ? 8 8 Ž my 9AO>1PO

   Obr. 4b

   -41 CZ 299473 B6 účinnost elektropřenosu plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši při slabé intenzitě poie, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru (SEM).

   E o

   la

   E «3

   N

   CL «

   >U

   O

   CL

   X

   N □

   O.

   ^kE ίβ x

   o o

   o.
2. 2«:

   o •c a>

   <u

   (. EU ^UEAOZipjEpUEfS E|Xq £Jap| ‘(VNQ yUjOlUES) ÁUldn)(S iu|oj)uo>( a;oupoq aiuamrud elozejza Az^jajioni esajdxa lUAijEjaj

   Obr. 5