MX2014004065A

MX2014004065A - Matrices de soporte derivadas de tn3 especificas para cd40l y sus metodos de empleo.

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Publication number: MX2014004065A
Application number: MX2014004065A
Authority: MX
Inventors: Anthony Coyle; Manuel Baca; Thomas Thisted; Stacey Drabic; Luba Grinberg; Shabazz Novarra; Vaheh Oganesyan; David Kenneth Spencer; Ronald Herbst
Original assignee: Medimmune Llc
Priority date: 2011-10-11
Filing date: 2012-10-10
Publication date: 2014-08-22
Also published as: JP2015501147A; US11104720B2; CN116063509A; KR20200085376A; JP7068231B2; ES2819075T3; US20230242619A1; CN108948196B; SG10201707813YA; HUE051439T2; RU2704992C2; RU2014117511A; EP2771022A2; EP3753567A1; EP2771022B1; KR102434073B1; CY1123690T1; JP6140712B2; CN103874501A; US20180312572A1

Abstract

La presente invención proporciona matrices de soporte basadas en el dominio FnIII de la tenascina 3 que se unen específicamente a CD4OL. La invención proporciona además variantes modificadas con una mayor afinidad por la diana. La presente invención también se refiere a matrices de soporte diseñadas como agentes profilácticos, terapéuticos o de diagnóstico, en particular para usos terapéuticos contra el LES y otras enfermedades y afecciones autoinmunes.

Description

MATRICES DE SOPORTE DERIVADAS DE TN3 ESPECIFICAS PARA CD40L Y SUS METODOS DE EMPLEO CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere en general al campo de los miméticos de anticuerpos, específicamente a matrices de soporte derivadas del tercer dominio de fibronectina de tipo III de la tenascina C humana útiles, por ejemplo, para generar productos con características de unión novedosas. En particular, la invención se refiere a matrices de soporte de Tn3 específicas para CD40L, métodos para preparar tales matrices de soporte, y sus métodos de empleo para el diagnóstico y tratamiento del lupus eritematoso sistémico y trastornos autoinmunitarios y/o inflamatorios.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Esta invención se refiere a matrices de soporte proteicas específicas para CD40L que se unen a CD40L útiles, por ejemplo, para el tratamiento de trastornos autoinmunitarios y/o inflamatorios.

Las biomoléculas capaces de unirse específicamente a un epítopo diana deseado son muy importantes como herramientas terapéuticas, de investigación y de diagnóstico médico. Un ejemplo muy conocido de esta clase de moléculas es el anticuerpo. Se pueden seleccionar anticuerpos que se unan específicamente y que tengan afinidad por prácticamente REF. : 247328 cualquier epítopo estructural. Sin embargo, los anticuerpos clásicos son moléculas heterotetraméricas estructuralmente complejas que son difíciles de expresar en sistemas eucariotas simples. Como consecuencia, la mayoría de los anticuerpos se producen utilizando sistemas de expresión celular de mamíferos costosos y complejos.

Se pueden utilizar proteínas con estructuras tridimensionales relativamente definidas, denominadas habitualmente matrices de soporte proteicas, como reactivos para el diseño de productos modificados. Un área particular en la que este tipo de matrices de soporte son útiles es el campo del diseño de miméticos de anticuerpos. Los miméticos de anticuerpos, es decir, agentes terapéuticos proteicos pequeños que no son anticuerpos, aprovechan las ventajas de los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpos, tales como una afinidad de unión a las dianas alta y una inmunogenia y una toxicidad bajas, mientras que evitan algunos de los inconvenientes, tales como la tendencia de los fragmentos de anticuerpos a agregarse y a ser menos estables que las IgG completas.

Se puede hacer frente a estos inconvenientes utilizando fragmentos de anticuerpos creados mediante la eliminación de partes del plegamiento original de los anticuerpos. Sin embargo, esto suele provocar su agregación cuando los residuos aminoacídicos , que normalmente estarían internalizados en el entorno hidrofóbico tal como una interfaz entre un domino variable y constante, se ven expuestos al disolvente. Un ejemplo de un mimético de anticuerpo basado en una matriz de soporte se basa en la estructura de un dominio de fibronectina de tipo III (FnlII) , un dominio presente en numerosos filos y clases de proteínas tales como en proteínas estructurales y sanguíneas de mamíferos. El diseño y el uso de matrices de soporte de FnlII derivadas del tercer dominio FnlII de la tenascina C humana se describen en las solicitudes de PCT PCT/US2011/032184 y PCT/US2011/032188 , las cuales se incorporan en su totalidad a la presente por referencia.

El CD40L es un miembro de la familia de moléculas TNF que se expresa principalmente en linfocitos T activados (incluidos los subtipos ThO, Thl y Th2) y forma homotrimeros al igual que otros miembros de esta familia. Además, también se ha descubierto que el CD40L se expresa en mastocitos, y basófilos y eosinófilos activados. El CD40L se une al receptor CD40 (CD40R) en células presentadoras de antígeno (APC, por sus siglas en inglés) , lo cual produce muchos efectos dependiendo del tipo de célula diana. En general, el CD40L desempeña la función de una molécula coestimuladora e induce la activación en APC en relación con la estimulación de los receptores de los linfocitos T por parte de las moléculas MHC sobre las APC.

La señalización a través del receptor CD40 por parte de CD40L inicia la cascada de eventos que provocan la activación de las células portadoras del receptor CD40 y la sensibilización óptima de los linfocitos T CD4+. Más específicamente, la interacción cognada entre CD40L y el receptor CD40 fomenta la diferenciación de los linfocitos B en células secretoras de anticuerpos y linfocitos B de memoria (Burkly, en Adv. Exp. Med. Bio., Vol . 489., D. M. Monroe, U. Hedner, M. R. Hoffman, C. Negrier, G. F. Savidge y G. C. I. White, eds . Klower Academic/Plenum Publishers, 2001, p. 135) . Además, la interacción entre CD40L y el receptor CD40 fomenta la inmunidad mediada por células mediante la activación de macrófagos y células dendríticas, y la generación de linfocitos citolíticos naturales y linfocitos T citotóxicos (remítase a Burkly, supra) .

Se ha demostrado que la interacción entre CD40L y el receptor CD40 es importante en varias enfermedades autoinmunes inducidas experimentalmente tales como la artritis inducida por colágeno, encefalomielitis alérgica experimental, ooforitis, colitis y nefritis lúpica inducida por fármacos. Específicamente, se ha demostrado que la inducción de enfermedades en todos estos modelos se puede bloquear con antagonistas de CD40L en el momento en el que se administre el antígeno. El bloqueo de enfermedades utilizando antagonistas anti-CD40L también se ha observado en modelos de enfermedades autoinmunes espontáneas en animales, incluidas la diabetes insulinodependiente y la nefritis lúpica, así como también modelos patológicos de la enfermedad del injerto contra el huésped, un trasplante, la fibrosis pulmonar y la aterosclerosis .

La disrupción de la vía CD40L/CD40R mediante el bloqueo de CD40L se ha demostrado que es beneficiosa en muchas enfermedades mediadas por el sistema inmunitario (por ejemplo, pero sin carácter limitante, lupus eritematoso sistémico (LES) , artritis reumatoide (AR) , esclerosis múltiple (E ) , enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y rechazo de aloinjerto) . Por ejemplo, el tratamiento con anticuerpos anti-CD40L previno o mejoró la nefritis en un modelo de artritis inducida por colágeno en ratones (Mohán et al. J. Immuno. 154:1470). Además, los anticuerpos anti-CD40L preservaron la función renal en ratones SNF1 con nefritis estabilizada. (Kalled et al. J. Immuno. 160:2158). Los niveles de CD40L tienen una correlación estrecha con la gravedad de la patología clínica (es decir, la reducción de la inflamación) y el daño en el tejido diana, tanto en los seres humanos como no humanos .

El LES es una enfermedad autoinmune progresiva y en algunos casos mortal . Las diversas presentaciones del lupus varían entre un sarpullido y artritis, pasando por anemia y trombocitopenia , hasta incluso psicosis. Existen pruebas evidentes que demuestran que muchos mecanismos de defensa del sistema inmunitario participan en el proceso inflamatorio que provoca enfermedades renales, cutáneas, cerebrales y trombosis. Un rasgo característico del LES es la pérdida de tolerancia a los linfocitos B y los autoanticuerpos prevalecen en pacientes con esta enfermedad. En la nefropatía lúpica, los autoanticuerpos anti-ADN bicatenario pueden formar complejos de anticuerpo-nucleosoma y depositarse en la membrana basal glomerular renal. Estos inmunocomplejos activan a su vez el complemento, lo cual puede provocar glomerulonefritis .

En los pacientes con LES se han detectado niveles elevados de expresión de CD40R así como también de CD40L. El incremento de la señal coestimuladora probablemente contribuye a la respuesta inflamatoria patológica observada en el LES. Los linfocitos T de LES han incrementado de forma espontánea la activación asociada con un umbral reducido de activación para autoantígenos . Además, estas células son hiposensibles a otra estimulación antigénica, son resistentes a la apoptosis, tienen una mayor tasa de supervivencia después de la activación y tienen muchas vías de señalización intracelular alteradas. Tras la activación de CD40R en las APC por parte del CD40L de los linfocitos T, tanto las APC como los linfocitos T se activan, producen citocinas y en el LES contribuyen a la producción de autoanticuerpos patogénicos y lesiones tisulares (nefritis lúpica) . El bloqueo de la vía CD40R/CD40L es eficaz, solo o combinado, para bloquear la enfermedad en ratones predispuestos a desarrollar lupus. En pacientes con LES, un anticuerpo anti-CD40L humanizado redujo los anti-ADNbc y los linfocitos B, la proteinuria y redujo la gravedad de la enfermedad en el LES.

Sin embargo, el bloqueo de CD40L con anticuerpos tradicionales ha suscitado considerables preocupaciones concernientes a su seguridad. Por ejemplo, un estudio con anticuerpos anti-CD40L 5c8 (BIOGEN®) en pacientes que padecían púrpura trombocitopénica idiopática (PTI) refractaria se suspendió debido a que se reportaron complicaciones tromboebólicas (Davidson et al. Arth Rheu, 43:S271). Además, otros ensayos con anticuerpos alternativos dirigidos contra CD40L originaron otras complicaciones trombóticas relacionadas (Davis et al. Arth Rheu, 43:S281; Schuler, Transplantation, 77:717). Teniendo en cuenta las complicaciones del antagonismo con anticuerpos dirigidos de CD40L, se sigue necesitando un modo de bloquear y antagonizar CD40L con una alternativa que no sea un anticuerpo. Por lo tanto, el bloqueo de CD40L con una matriz de soporte basada en Tn3 es una alternativa atractiva para evitar la agregación plaquetaria mediada por Fab2 y/o Fe y sus efectos secundarios posteriores .

La mención o discusión de una referencia en la presente no se debe interpretar como una admisión de que esta sea una técnica anterior a la presente invención.

SUMARIO DE LA INVENCION La invención proporciona una matriz de soporte de Tn3 que comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la subunidad monomérica comprende siete hebras beta denominadas A, B, C, D, E, F y G, y seis regiones de bucles denominadas AB, BC, CD, DE, EF y FG, y donde la matriz de soporte de Tn3 se une específicamente a CD40L. En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una única subunidad monomérica específica para CD40L. En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende dos subunidades monoméricas específicas para CD40L conectadas en tándem. En algunas modalidades específicas, la matriz de soporte de Tn3 comprende dos subunidades monoméricas específicas para CD40L que están conectadas directamente.

En algunas modalidades, dos subunidades monoméricas específicas para CD40L están conectadas por medio de un conector. En otras modalidades, el conector comprende un conector peptídico, que puede ser un conector peptídico flexible. En algunas modalidades, el conector peptídico comprende una secuencia (GmX)n donde X es serina (S) , alanina (A) , glicina (G) , leucina (L) , isoleucina (I) o valina (V) ; m y n tienen valores de números enteros; m es 1, 2, 3 o 4; y, |n es l, 2, 3, 4, 5, 6 o 7. En algunas modalidades, el conectdr peptídico comprende la SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 142 o SEQ ID NO: 143.

En algunas modalidades, la unión de una matriz de soporte de Tn3 que comprende dos subunidades monoméricas específicas para CD40L con CD40L es mejor que la de una matriz de soporte de Tn3 que comprende una única subunidad monomérica específica para CD40L. En otras modalidades, la unión de una matriz de soporte de Tn3 que comprende dos subunidades monoméricas específicas para CD40L con CD40L mejora la acción sobre la diana en comparación con la de una matriz de soporte de Tn3 que comprende una única subunidad monomérica específica para CD40L. En otras modalidades, la mejora en la unión de la matriz de soporte de Tn3 con CD40L es una mejora en la afinidad de unión, una mejora en la avidez de unión o ambas. En ciertas modalidades, la afinidad de unión de una matriz de soporte de Tn3 que comprende dos subunidades monoméricas específicas para CD40L con CD40L y la estabilidad proteica de la matriz de soporte de Tn3 son mejores que las de una matriz de soporte de Tn3 que comprende una única subunidad monomérica específica para CD40L. En algunas modalidades, la avidez de unión de una matriz de soporte de Tn3 que comprende dos subunidades monoméricas específicas para CD40L por CD40L y la estabilidad proteica de la matriz de soporte de Tn3 son mejores que las de una matriz de soporte de Tn3 que comprende una única subunidad monomérica específica para CD40L.

En algunas modalidades, al menos una subunidad monomérica específica para CD40L en una matriz de soporte de Tn3 está unida a un conector o a un resto heterólogo. En otras modalidades, un conector o un resto heterólogo en una matriz de soporte de Tn3 está conjugado con el extremo N o el extremo C de una subunidad monomérica específica para CD40L. En ciertas modalidades, el conector unido a una subunidad monomérica específica para CD40L en una matriz de soporte de Tn3 comprende un conector peptídico, que en algunas modalidades puede ser un conector peptídico flexible. El conector peptídico puede comprender, en ciertas modalidades, una secuencia (GmX)n donde X es serina (S) , alanina (A), glicina (G) , leucina (L) , isoleucina (I) o valina (V) ; m y n son números enteros; m es l, 2, 3 o 4; y, n es l, 2, 3, 4, 5, 6 o 7. En algunas modalidades, el conector peptídico unido a una subunidad monomérica específica para CD40L en una matriz de soporte de Tn3 comprende la SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 142 o SEQ ID NO: 143.

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende un conector que comprende un resto funcional . En algunas modalidades, este resto funcional es una inmunoglobulina o uno de sus fragmentos. En ciertas modalidades, esta inmunoglobulina o su fragmento comprende un dominio Fe. En algunas modalidades, este dominio Fe no consigue inducir al menos una función efectora mediada por FcyR. En algunas modalidades, esta función efectora mediada por FCYR es ADCC.

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende al menos una subunidad monomérica específica para CD40L unida a un resto heterólogo. En algunas modalidades, este resto heterólogo comprende una composición seleccionada entre el grupo constituido por: una proteína, un péptido, un dominio proteico, un conector, un fármaco, una toxina, un agente citotóxico, un contraste, un radionucleido, un compuesto radioactivo, un polímero orgánico, un polímero inorgánico, un polietilenglicol (PEG) , biotina, una albúmina, una albúmina sérica humana (HSA, por sus siglas en inglés) , una porción de unión a FcRn de HSA, un anticuerpo, un dominio de un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo de un dominio, un dominio de unión a albúmina, una enzima, un ligando, un receptor, un péptido de unión, una matriz de soporte que no sea de FnlII, un epítopo marcador, un polímero polipeptídico recombinante, una citocina y una combinación de dos o más de estos restos.

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende al menos una subunidad monomérica específica para CD40L conjugada con PEG. En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende al menos una subunidad monomérica específica para CD40L conjugada con una albúmina. En ciertas modalidades, esta albúmina es albúmina sérica humana (HSA) . En otras modalidades, esta HSA es una variante de HSA. En otras modalidades específicas, la secuencia de aminoácidos de la variante de HSA es la SEQ ID NO: 133. En otras modalidades, la variante de HSA tiene al menos una propiedad mejorada en comparación con una HSA nativa o un fragmento de una HSA nativa. En ciertas modalidades, la propiedad mejorada es una semivida plasmática alterada en comparación con la semivida plasmática de una HSA nativa o un fragmento de una HSA nativa. En algunas modalidades, la semivida plasmática alterada es una semivida plasmática más prolongada en comparación con la semivida plasmática de una HSA nativa o un fragmento de una HSA nativa. En otras modalidades, la semivida plasmática alterada es una semivida plasmática más corta en comparación con la semivida plasmática de una HSA nativa o un fragmento de una HSA nativa.

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 se fusiona con una variante de HSA que comprende al menos una sustitución aminoacídica en el dominio III de la HSA. En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 se fusiona con una variante de HSA que comprende la secuencia de la HSA madura completa (SEQ ID NO: 133 o 138) o un fragmento de esta, salvo por al menos una sustitución aminoacídica, numerada respecto a la posición en la HSA madura completa, en una posición seleccionada entre el grupo constituido por 407, 415, 463, 500, 506, 508, 509, 511, 512, 515, 516, 521, 523, 524, 526, 535, 550, 557, 573, 574 y 580; donde la sustitución aminoacídica no comprende sustituir una lisina (K) por ácido glutámico (E) en la posición 573, y donde la matriz de soporte de Tn3 tiene una semivida plasmática más prolongada que la semivida plasmática de una matriz de soporte de Tn3 que no está conjugada con la variante de HSA.

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 se fusiona con una variante de HSA, donde al menos una sustitución aminoacídica, numerada respecto a la posición en la HSA madura completa, se encuentra en una posición seleccionada entre el grupo constituido por 463, 508, 523 y 524, donde la matriz de soporte de Tn3 tiene una semivida plasmática más prolongada que la semivida plasmática de una matriz de soporte de Tn3 que no está conjugada con la variante de HSA. En algunas modalidades, la variante de HSA comprende la secuencia de la HSA madura completa (SEQ ID NO: 133 o 138) o un fragmento de esta, salvo por al menos una sustitución aminoacídica, numerada respecto a la posición en la HSA madura completa, seleccionada entre el grupo constituido por: (a) sustitución de leucina (L) en la posición 407 por asparagina (N) o tirosina (Y) ; (b) sustitución de valina (V) en la posición 415 por treonina (T) ; (c) sustitución de leucina (L) en la posición 463 por asparagina (N) ; (d) sustitución de lisina (K) en la posición 500 por arginina (R) ; (e) sustitución de treonina (T) en la posición 506 por tirosina (Y) ; (f) sustitución de treonina (T) en la posición 508 por arginina (R) ; (g) sustitución de fenilalanina (F) en la posición 509 por metionina (M) o triptófano (W) ; (h) sustitución de alanina (A) en la posición 511 por fenilalanina (F) ; (i) sustitución de ácido aspártico (D) en la posición 512 por tirosina (Y); (j) sustitución de treonina (T) en la posición 515 por glutamina (Q) ; (k) sustitución de leucina (L) en la posición 516 por treonina (T) o triptófano (W) ; (1) sustitución de arginina (R) en la posición 521 por triptófano (W) ; (m) sustitución de isoleucina (I) en la posición 523 por ácido aspártico (D) , ácido glutámico (E) , glicina (G) , lisina (K) o arginina (R) ; (n) sustitución de lisina (K) en la posición 524 por leucina (L) ; (o) sustitución de Glutamina (Q) en la posición 526 por metionina (M) ; (p) sustitución de histidina (H) en la posición 535 por prolina (P) ; (q) sustitución de ácido aspártico (D) en la posición 550 por ácido glutámico (E) ; (r) sustitución de lisina (K) en la posición 557 por glicina (G) ; (s) sustitución de lisina (K) en la posición 573 por fenilalanina (F) , histidina (H) , prolina (P) , triptófano (W) o tirosina (Y) ; (t) sustitución de lisina (K) en la posición 574 por asparagina (N) ; (u) sustitución de glutamina (Q) en la posición 580 por lisina (K) ; y (v) una combinación de dos o más de estas sustituciones, donde la matriz de soporte de Tn3 tiene una semivida plasmática más prolongada que la semivida plasmática de una matriz de soporte de Tn3 que no está conjugada con la variante de HSA.

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 se fusiona con una variante de HSA que comprende la secuencia de la HSA madura completa (SEQ ID NO: 133 o 138) o un fragmento de esta, salvo por al menos una sustitución aminoacídica, numerada respecto a la posición en la HSA madura completa, seleccionada entre el grupo constituido por: (a) sustitución de leucina (L) en la posición 463 por asparagina (N) ; (b) sustitución de treonina (T) en la posición 508 por arginina (R) ; (c) sustitución de isoleucina (I) en la posición 523 por ácido aspártico (D) , ácido glutámico (E) , glicina (G) , lisina (K) o arginina (R) ; (d) sustitución de lisina (K) en la posición 524 por leucina (L) ; y (e) una combinación de dos o más de estas sustituciones, donde la matriz de soporte de Tn3 tiene una semivida plasmática más prolongada que la semivida plasmática de una matriz de soporte de Tn3 que no está conjugada con la variante HSA.

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende al menos dos subunidades monoméricas específicas para CD40L idénticas. En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende al menos dos subunidades monoméricas específicas para CD40L diferentes. En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 es un agonista del receptor CD40. En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 es un antagonista del receptor CD40.

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende al menos dos subunidades monoméricas específicas para CD40L que están unidas específicamente al mismo epítopo de CD40L. En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende al menos dos subunidades monoméricas específicas para CD40L que están unidas específicamente a epítopos diferentes de CD40L. En algunas modalidades, estos epítopos de CD40L diferentes son epítopos no superpuestos. En otras modalidades, estos epítopos de CD40L diferentes son epítopos superpuestos .

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 se une al menos a dos moléculas de CD40L. En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L que se une a al menos dos moléculas de CD40L.

En algunas modalidades, las hebras beta de al menos una subunidad monomérica específica para CD40L de la matriz de soporte de Tn3 tienen al menos un 90% de identidad secuencial respecto a las hebras beta de la SEQ ID NO: 3. En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L que comprende una hebra beta A que comprende la SEQ ID NO: 11, o que comprende una hebra beta A que comprende la SEQ ID NO: 11, salvo por al menos una mutación. En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L que comprende una hebra beta B que comprende la SEQ ID NO : 12, o que comprende una hebra beta B que comprende la SEQ ID NO: 12, salvo por al menos una mutación. En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L que comprende una hebra beta C que comprende la SEQ ID NO: 13 o 14, o que comprende una hebra beta C que comprende la SEQ ID NO: 13 o 14, salvo por al menos una mutación, y donde la cisteína en la SEQ ID NO: 13 o 14 no está sustituida. En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L que comprende una hebra beta D que comprende la SEQ ID NO: 15, o que comprende una hebra beta D que comprende la SEQ ID NO: 15, salvo por al menos una mutación.

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L que comprende una hebra beta E que comprende la SEQ ID NO: 16, o que comprende una hebra beta E que comprende la SEQ ID NO: 16, salvo por al menos una mutación. En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L que comprende una hebra beta F que comprende la SEQ ID NO: 17, o que comprende una hebra beta F que comprende la SEQ ID NO: 17, salvo por al menos una mutación, y donde la cisteína en la SEQ ID NO: 17 no está sustituida. En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L que comprende una hebra beta G que comprende la SEQ ID NO: 18, o que comprende una hebra beta G que comprende la SEQ ID NO: 18, salvo por al menos una mutación.

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L que comprende la secuencia de aminoácidos: IEV (XAB) nALITW (XBC) nCELXiYGI (XCD) nTTIDL (XDE) nYSI (XEF) nYEVSLIC (XPG) nKETFTT donde: XAB, BC/ XCD/ XDE/ ¾F y XFG representan los residuos aminoacídicos presentes en las secuencias de los bucles AB, BC, CD, DE, EF y FG, respectivamente; Xi representa el residuo aminoacídico A o T; y la longitud del bucle n es un número entero comprendido entre 2 y 26.

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle CD comprende la SEQ ID NO: 6 y la secuencia del bucle EF comprende la SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 137. En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs : 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 y 168. En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle DE comprende una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs : 94, 95, 96, 97, 98 y 169. En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle FG comprende una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs: 9, 99, 139 y 170.

En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs: 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 y 174. En ciertas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle DE comprende una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs : 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128 y 175. En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle FG comprende una secuencia seleccionada entre los grupos constituidos por las SEQ ID NOs : 129, 130 y 177. En ciertas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle AB comprende una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs: 4 y 136.

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 83, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139. En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 83, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 99. En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 84, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 95 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139.

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 85, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139. En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 86, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 96 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139. En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 87, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 97 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139.

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 88, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 95 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139. En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 89, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139. En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 90, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139.

En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 91, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 95 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139. En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 92, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 98 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139. En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 93, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139.

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 100, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 118 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 101, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 119 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 102, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 120 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 103, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 121 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136.

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 104, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 122 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 105, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 121 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 106, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 123 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136.

En ciertas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 107, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 123 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 108, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 118 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 109, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 123 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En algunas modalidades, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 110, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 121 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136.

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 111, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 123 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 130. En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 108, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 121 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En a1gunas moda1idades , la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 112, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 124 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO : 113, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 125 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136.

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 114, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 118 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 115, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 126 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 116, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 127 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 117, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 128 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136.

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L que comprende una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs : 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 y 146. En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L que comprende la secuencia de aminoácidos : IEVKDVTDTTALI WX1DX2X3X4X5X6X7X8CELTYGIKDVPGDRTTI DLWX9HX10AX 11YS IGNLKPDTEYEVSLI CRX12GDMSSNPAKETFTT (SEQ ID NO: 167) donde: (a) ?? representa un residuo aminoacídico de serina (S) o leucina (L) ; (b) X2 representa un residuo aminoacídico de ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E) ; (c) X3 representa un residuo aminoacídico de histidina (H) , isoleucina (I) , valina (V) , fenilalanina (F) o triptófano (W) ; (d) X4 representa un residuo aminoacídico de alanina (A) , glicina (G) , ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) ; (e) X5 representa un residuo aminoacídico de ácido glutámico (E) , leucina (L) , glutamina (Q) , serina (S) , ácido aspártico (D) o asparagina (N) ; (f) X6 representa un residuo aminoacídico de fenilalanina (F) o tirosina (Y) ; (g) X7 representa un residuo aminoacídico de isoleucina (I) , valina (V) , histidina (H) , ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) ; (h) X8 representa un residuo aminoacídico de glicina (G) , triptófano (W) o valina (V) ; (i) X9 representa un residuo aminoacídico de triptófano ( ) , fenilalanina (F) o tirosina (Y); (j) i0 representa un residuo aminoacídico de (S) , glutamina (Q) , metionina (M) o histidina (H) ; (k) Xu representa un residuo aminoacídico de triptófano (W) o histidina (H) ; y (1) Xi2 representa un residuo aminoacídico de arginina (R) o serina (S) .

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L que comprende una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs : 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 y 82.

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L que comprende la secuencia de aminoácidos : IEVX1DVTDTTALITWX2X3RSX4X5X6X7X8X9XioCELXiiYGIKDVPGDRTTIDLX12 Xi3Xi4Xi5YVHYSIGNLKPDTXi6YEVSLICLTTDGTYX17NPAKETFTT (SEQ ID NO: 171) donde : (a) i representa un residuo aminoacídico de lisina (K) o ácido glutámico (E) ; (b) X2 representa un residuo aminoacídico de treonina (T) o isoleucina (I) ; (c) X3 representa un residuo aminoacídico de asparagina (N) o alanina (A) ; (d) X4 representa un residuo aminoacídico de serina (S) , leucina (L) , alanina (A) , fenilalanina (F) o tirosina (Y) ; (e) X5 representa un residuo aminoacídico de tirosina (Y), alanina (A), glicina (G) , valina (V), isoleucina (I) o serina (S) ; (f) X6 representa un residuo aminoacídico de tirosina (Y) , serina (S) , alanina (A) o histidina (H) ; (g) X7 representa un residuo aminoacídico de asparagina (N) , ácido aspártico (D) , histidina (H) o tirosina (Y) ; (h) X8 representa un residuo aminoacídico de leucina (L) , fenilalanina (F) , histidina (H) o tirosina (Y) ; (i) X9 representa un residuo aminoacídico de histidina (H) , prolina (P) , serina (S) , leucina (L) o ácido aspártico (D) ; (j) Xio representa un residuo aminoacídico de glicina (G) , fenilalanina (F) , histidina (H) o tirosina (Y) ; (k) Xn representa un residuo aminoacídico de alanina (A) o treonina (T) ; (1) Xi2 representa un residuo aminoacídico de serina (S) , asparagina (N) , ácido glutámico (E) , arginina (R) o ácido aspártico (D) ; (m) Xi3 representa un residuo aminoacídico de serina (S) , glutamina (Q) , treonina (T) , asparagina (N) o alanina (A) ; (n) X14 representa un residuo aminoacídico de prolina (P) , valina (V), isoleucina (I) o alanina (A) o ningún aminoácido; (o) i5 representa un residuo aminoacídico de isoleucina (I) o ningún aminoácido; (p) Xi6 representa un residuo aminoacídico de ácido glutámico (E) o lisina (K) ; y (q) X17 representa un residuo aminoacídico de serina (S) o asparagina (N) .

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs : 134, 135, 205, 206, 207 y 208. En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NO: 134, 135, 205, 206, 207 y 208.

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs : 201, 202, 203 y 204. En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs: 201, 202, 203 y 204. En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la especificación por CD40L es hacia el CD40L humano. En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, donde la especificación por CD40L es hacia el CD40L unido a la membrana (SEQ ID NO: 1) , el CD40L soluble (SEQ ID NO: 2) o uno de sus fragmentos. En algunas modalidades específicas, la matriz de soporte de Tn3 se une a CD40L y previene la unión de CD40L a CD40.

La invención también proporciona un método para alterar una actividad en una célula que expresa CD40L, el cual comprende poner la célula en contacto con una matriz de soporte de Tn3, donde la matriz de soporte de Tn3 se une a CD40L y previene la unión de CD40L a CD40. En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 se une a CD40L con una afinidad (¾) aproximadamente menor o igual a 1 µ?, o aproximadamente menor o igual a 500 nM, o aproximadamente menor o igual a 100 nM, o aproximadamente menor o igual a 50 nM, o aproximadamente menor o igual a 25 nM, o aproximadamente menor o igual a 10 nM, o aproximadamente menor o igual a 5 nM, o aproximadamente menor o igual a 2 nM.

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L que se une específicamente a un epítopo de CD40L que comprende los aminoácidos situados en las posiciones 142-155, 200-230 o 247-251 de la SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L que interacciona con los aminoácidos E142, Y146, M148, N151, L155, R200, R203 y E230 de CD40L. En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L que interacciona con los aminoácidos R203, 1204, V247, H249 y T251 de CD40L. En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L que interacciona con los aminoácidos E142, Y146, M148, N151 y L155 de CD40L, que están situados en una primera molécula de CD40L, y con los aminoácidos R200, R203 y E230 de CD40L, que están situados en una segunda molécula de CD40L. En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una subunidad monomérica específica para CD40L que interacciona con los aminoácidos R203 e 1204 de CD40L, que están situados en una primera molécula de CD40L, y con los aminoácidos V247, H249 y T251 de CD40L, que están situados en una segunda molécula de CD40L.

La invención también proporciona polipéptidos que comprenden uno o más monomeros de Tn3 específicos para CD40L, que incluyen, sin carácter limitante, las fusiones de albúmina sérica que se describen en la presente.

La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L, un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico que codifica una matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L y una célula huésped que comprende el vector. La invención también proporciona un método para producir una matriz de soporte de Tn3 que comprende cultivar la célula huésped en condiciones en las que se exprese la matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L codificada por la molécula de ácido nucleico.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L y un excipiente farmacéuticamente aceptable. La invención también proporciona un método para prevenir, tratar, mejorar o controlar una enfermedad autoinmune en un paciente que lo necesite que comprende administrar una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende una matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L.

La invención también proporciona un método para reducir la frecuencia o la cantidad de corticosteroide administrado a un paciente que padece una enfermedad autoinmune que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende una matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L.

La enfermedad autoinmune tratada mediante la administración de una matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L puede ser alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos, enfermedad autoinmune de Addison, enfermedades autoinmunes de la glándula suprarrenal, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, ooforitis y orquitis autoinmunes, síndrome de Sjogren, psoriasis, aterosclerosis , retinopatías diabéticas y de otros tipos, fibroplasia retrolental, degeneración macular asociada con la edad, glaucoma neovascular, hemangiomas, hiperplasias tiroideas (incluida la enfermedad de Grave), trasplante de cornea y de otros tejidos e inflamación crónica, sepsis, artritis reumatoide, peritonitis, enfermedad de Crohn, lesión por reperfusión, septicemia, choque endotóxico, fibrosis quística, endocarditis, psoriasis, artritis (p. ej . , artritis psoriásica) , choque anafiláctico, isquemia orgánica, lesión por reperfusión, lesión de la médula espinal y rechazo de injerto, trobocitopenia autoinmune, enfermedad de Behcet, penfigoide ampolloso, cardiomiopatía, dermatitis herpetiforme , síndrome de fatiga crónica y disfunción inmunitaria (SFCDI) , polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Churg-Strauss , penfigoide cicatrical, síndrome de CREST, síndrome de aglutininas frías, enfermedad de Crohn, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia-fibromiositis, glomerulonefritis , enfermedad de Graves, Guillain-Barre , tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI) , neuropatía por IgA, artritis juvenil, liquen plano, lupus eritematoso, enfermedad de Meniere, conectivitis mixta, esclerosis múltiple, diabetes mellitus mediada por el sistema inmunitario o de tipo 1, miastenia grave, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policrondritis , síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis psoriásica, fenómeno de Raynauld, síndrome de Reiter, artritis reumatoide, sarcoidosis, escleroderma, síndrome de Sjogren, síndrome de Stiff-man, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, colitis ulcerativa, uveítis, vasculitis tales como vasculitis de la dermatitis herpetiforme , vitíligo y granulomatosis de Wegener.

En algunas modalidades específicas, la enfermedad autoinmune tratada mediante la administración de una matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L es el lupus eritematoso sistémico (LES) .

Los métodos de tratamiento con matrices de soporte de Tn3 específicas para CD40L pueden comprender además una terapia adicional tal como inmunoterapia, terapia biológica, quimioterapia, radioterapia o terapia con fármacos de bajo peso molecular.

La invención también proporciona un cristal proteico que comprende una matriz de soporte de Tn3 que consiste en la SEQ ID NO: 20 en un complejo con el CD40L soluble (SEQ ID NO: 2) donde el cristal tiene una red cristalina en un grupo espacial ortorrómbico ?2?2?2? y unas dimensiones de celda unidad, +/- 0.1%, de a=85.69 Á, b=90.64 Á y c=95.56 Á. En algunas modalidades, la unidad asimétrica del cristal comprende un trímero de CD40L y tres moléculas de la matriz de soporte de Tn3. En otras modalidades, los cristales difractan los rayos X para determinar las coordenadas estructurales respecto a una resolución de un valor menor o igual a 3.2 Á.

La invención también proporciona un cristal proteico que comprende una matriz de soporte de Tn3 que consiste en la SEQ ID NO: 68 en un complejo con el CD40L soluble (SEQ ID NO: 2) donde el cristal tiene una red cristalina en un grupo espacial cúbico P2i3 y unas dimensiones de celda unidad, +/-0.1%, de a=b=c=97.62 Á. En algunas modalidades, la unidad asimétrica del cristal comprende una molécula de CD40L y una molécula de la matriz de soporte de Tn3. En otras modalidades, el cristal difracta los rayos X para determinar las coordenadas estructurales respecto a una resolución de un valor menor o igual a 2.7 Á.

La invención también proporciona un cristal proteico que comprende una matriz de soporte de Tn3 que consiste en la SEQ ID NO: 28 o 146 en un complejo con el CD40L soluble (SEQ ID NO: 2) donde el cristal tiene una red cristalina en un grupo espacial P321 y unas dimensiones de celda unidad, +/- 0.1%, de a=95.53 Á, b=93.53 Á y c=66.69 Á. En algunas modalidades, la unidad asimétrica del cristal comprende una molécula de CD40L y una molécula de la matriz de soporte de Tn3. En otras modalidades, el cristal difracta los rayos X para determinar las coordenadas estructurales respecto a una resolución de un valor menor o igual a 2.8 Á.

La invención también proporciona un cristal proteico que comprende dos matrices de soporte de Tn3 diferentes que consisten en la SEQ ID NO: 68 y la SEQ ID NO: 28 o 146 en un complejo con el CD40L soluble (SEQ ID NO: 2) donde el cristal tiene una red cristalina en un grupo espacial cúbico P2X y unas dimensiones de celda unidad, +/- 0.1%, de a=80.32 Á, b=143.48 Á, c=111.27 Á, ß=98.22 Á. En algunas modalidades, la unidad asimétrica del cristal comprende dos trímeros de CD40L y seis de cada molécula de la matriz de soporte de Tn3. En otras modalidades, el cristal difracta los rayos X para determinar las coordenadas estructurales respecto a una resolución de un valor menor o igual a 1.9 Á.

En algunas modalidades, el cristal proteico se produce utilizando difusión de vapor en gota sentada. La invención también proporciona un método para sintetizar un cristal proteico, que comprende: (a) mezclar un volumen de una solución que comprende una matriz de soporte de Tn3 que comprende una subunidad monomérica específica para CD40L en un complejo con CD40L con un volumen de una solución de reservorio que comprende un precipitante; y (b) incubar la mezcla obtenida en el paso (a) en un recipiente cerrado, en condiciones adecuadas para la cristalización hasta que se forme el cristal proteico. En algunas modalidades, el método para producir el cristal proteico comprende utilizar la difusión de vapor en gota sentada.

En algunas modalidades, el método para sintetizar un cristal proteico se utiliza para producir cristales que comprenden las subunidades monoméricas de Tn3 específicas para CD40L de la SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 68 o SEQ ID NO: 146.

La invención también proporciona un medio de almacenamiento de datos legible mecánicamente que comprende un material de almacenamiento de datos codificado con instrucciones legibles mecánicamente para: (a) transformar los datos en una representación gráfica tridimensional para la estructura de una porción de un cristal proteico de una matriz de soporte de Tn3 que comprende una subunidad monomérica específica para CD40L en un complejo con CD40L; y (b) originar la representación visual de la representación gráfica tridimensional. En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende la SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 68 o SEQ ID NO: 146. En otras modalidades, el cristal proteico es: (a) un cristal proteico que comprende una matriz de soporte de Tn3 que consiste en la SEQ ID NO: 20 en un complejo con el CD40L soluble (SEQ ID NO: 2) donde el cristal tiene una red cristalina en un grupo espacial ortorrómbico P2i2i2i y unas dimensiones de celda unidad, +/- 0.1%, de a=85.69 Á, b=90.64 Á y c=95.56 A; (b) un cristal proteico que comprende una matriz de soporte de Tn3 que consiste en la SEQ ID NO: 68 en un complejo con el CD40L soluble (SEQ ID NO: 2) donde el cristal tiene una red cristalina en un grupo espacial cúbico P2i3 y unas dimensiones de celda unidad, +/- 0.1%, de a=b=c=97.62 Á; o (c) un cristal proteico que comprende una matriz de soporte de Tn3 que consiste en la SEQ ID NO: 20 y una matriz de soporte de Tn3 que consiste en la SEQ ID NO: 68, donde ambas matrices de soporte de Tn3 forman un complejo con el CD40L soluble (SEQ ID NO: 2) (d) un cristal proteico que comprende una matriz de soporte de Tn3 que consiste en la SEQ ID NO: 28 o 146 en un complejo con el CD40L soluble (SEQ ID NO: 2) donde el cristal tiene una red cristalina en un grupo espacial P321 y unas dimensiones de celda unidad, +/- 0.1%, de a=95.53 Á, b=93.53 Á y c=66.69 Á (e) un cristal proteico que comprende dos matrices de soporte de Tn3 diferentes que consisten en la SEQ ID NO: 68 y la SEQ ID NO: 28 o 146 en un complejo con el CD40L soluble (SEQ ID NO : 2) donde el cristal tiene una red cristalina en un grupo espacial cúbico P2i y unas dimensiones de celda unidad, +/- 0.1%, de a=80.32 Á, b=143.48 Á, c=111.27 Á, ß=98.22 Á.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS A los efectos de ilustración de la invención, en las figuras se representan ciertas modalidades de la invención. Sin embargo, la invención no se limita a las disposiciones ni los procedimientos concretos de las modalidades representadas en las figuras.

La FIG. 1A muestra la inhibición de la expresión de CD86 inducida por CD40L murino (MuCD40L) medida utilizando un ensayo de D10G4. l/PBMC (siglas en inglés de las células mononucleares de sangre periférica) . Se ensayaron la matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L de ratón M13, su variante con afinidad optimizada M31 (aproximadamente una mejora de la afinidad de 20x) , el anticuerpo monoclonal anti-CD40L MR1 y un control negativo. También se muestran los valores de CI50.

La FIG. IB muestra la inhibición de CD40L en un ensayo de NfkB murino. El ensayo emplea células NIHT3T que expresan el CD40R murino y que contienen un constructo indicador de NfkB-luciferasa . La adición de CD40L produce señalización (medida como la actividad luciferasa) que es inhibida tanto por el anticuerpo anti-CD40L MR1 como por la matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L M31.

La FIG. 2A muestra el diseño de matrices de soporte de Tn3 específicas para CD40L bivalentes en tándem y constructos de fusión de albúmina sérica (SA, por sus siglas en inglés) .

La FIG. 2B muestra el análisis por SDS-PAGE de un constructo 13 monovalente purificado (constructo de Tn3 específico para CD40L) o matrices de soporte bivalentes en tándem con conectores que contienen 1, 3, 5 o 7 unidades de Gly4Ser (denominadas GS) que unen dos subunidades monoméricas M13 de Tn3. El constructo M13 monovalente se analizó en la calle 2, el constructo dimérico con 1 unidad de GS (Cl) se analizó en las calles 3 y 7, el constructo dimérico con 3 unidades de GS (C2) se analizó en las calles 4 y 8, el constructo dimérico con 5 unidades de GS (C3) se analizó en las calles 5 y 9, y el constructo dimérico con 7 unidades de GS (C4) se analizó en las calles 6 y 10. Las muestras se analizaron en condiciones no reducidas (calles 2-6) o condiciones reducidas (calles 7-10) .

La FIG. 2C muestra la inhibición competitiva de la unión del CD40L murino al receptor CD40 murino inmovilizado en un chip biosensor por parte de las matrices de soporte específicas para CD40L murino monovalentes (M13) o bivalentes en tándem (M13 -XGS- 13 , donde x es 1, 3, 5 o 7, correspondientes a matrices de soporte bivalentes con conectores que contienen 1, 3, 5 o 7 unidades de Gly4Ser) . También se indica la concentración que produce el 50% de inhibición (CI50) para los diferentes constructos.

La FIG. 2D muestra el efecto inhibitorio de las matrices de soporte de Tn3 específicas para CD40L murino monovalentes (M13) y bivalentes en tándem sobre la expresión de CD86 inducida por CD40L murino en linfocitos B. Se proporcionan los valores de CI50 para todos los constructos de Tn3 y para el anticuerpo anti-CD40L murino MR1.

La FIG. 3A muestra unos niveles de expresión elevados de la matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L bivalente en tándem fusionada con albúmina sérica de ratón (MSA, por sus siglas en inglés) en células HEK 293. Estos constructos tienen 1 repetición (G4S) en el conector entre las unidades de matriz de soporte de Tn3 y 3 repeticiones (G4S) en el conector entre la matriz de soporte de Tn3 y MSA. Además, el constructo contiene una mutación N49Q en cada una de las matrices de soporte M13 y M31 para eliminar un sitio de N-glicosilación potencial. Se analizaron 10 µ??? de sobrenadante de cultivo extraídos 3 o 6 días después de la transfección en un gel de SDS-PAGE junto con cantidades conocidas de la proteína purificada. El nivel de expresión se estimó que era de 200 mg/L 6 días después de la transfección. La purificación se llevó a cabo mediante IMAC a través de un marcador His C-terminal.

La FIG. 3B muestra la inhibición de la expresión de CD86 inducida por CD40L murino (MuCD40L) medida utilizando un ensayo de D10G4.1/células PBMC. Se ensayaron una matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L bivalente en tándem (M13 -1GS-M13 ) , el mismo constructo fusionado con albúmina sérica de ratón (MSA, por sus siglas en inglés) (M13-1GS-M13-MSA) y el anticuerpo monoclonal anti-CD40L murino MR1. Se proporcionan los valores de CI50 para todos los constructos.

La FIG. 3C muestra la inhibición de la expresión de CD86 inducida por CD40L murino (MuCD40L) medida utilizando un ensayo de D10G4.1/células PBMC. Se ensayaron una matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L bivalente en tándem (M13-1GS-M13) fusionada con albúmina sérica de ratón (MSA) (M13-1GS-M13-MSA) , una variante con afinidad madura de la matriz de soporte M13 conjugada con MSA (M3?????-MSA) , una matriz de soporte bivalente en tándem que comprende la variante con afinidad optimizada M31 conjugada con MSA (M31-1GS-M31-MSA) , una matriz de soporte bivalente en tándem de control negativo que no se une a CD40L murino (D1-1GS-D1-MSA) y el anticuerpo monoclonal MR1. Se proporcionan los valores de CI50.

La FIG. 4A muestra las propiedades farmacocinéticas de varios constructos específicos para CD40L murino en ratones según se determinaron mediante ELISA. Se indican los valores de la semivida (ti/2) plasmática para cada constructo.

La FIG. 4B muestra las propiedades farmacocinéticas de 342-HSA específico para CD40L humano y una variante de 342-HSA que comprende la sustitución de Leu en la posición 463 por Asn (L463N) y la sustitución de Lys en la posición 524 por Leu (K524L) en monos cinomólogos según se determinaron mediante ELISA.

La FIG. 5A muestra la maduración de los linfocitos B en los centros germinales (GC, por sus siglas en inglés) de un ensayo de inmunización con eritrocitos de oveja (SRBC, por sus siglas en inglés) . Se ensayó el anticuerpo monoclonal anti-CD40L murino MR1.

La FIG. 5B muestra la maduración de los linfocitos B en los centros germinales (GC, por sus siglas en inglés) de un ensayo de inmunización con eritrocitos de oveja (SRBC, por sus siglas en inglés) . Se ensayaron constructos monovalentes y di alentes derivados de M31 fusionados con MSA. El constructo bivalente DI -DI conjugado con MSA se utilizó como control negativo.

La FIG. 5C muestra la maduración de los linfocitos B en la periferia (no GC) de un ensayo de inmunización con eritrocitos de oveja (SRBC) . Se ensayaron constructos monovalentes y divalentes derivados de M31 fusionados con MSA. El constructo bivalente DI -DI conjugado con MSA se utilizó como control negativo.

La FIG. 5D muestra el porcentaje (% de CD4) y el número (# de CD4) de células positivas para CD4 de un ensayo de inmunización con eritrocitos de oveja (SRBC) . Se ensayaron constructos monovalentes y bivalentes derivados de M31 fusionados con MSA, y los anticuerpos monoclonales anti-CD40L MR1. El constructo bivalente Dl-Dl conjugado con MSA se utilizó como control negativo.

La FIG. 5E muestra el porcentaje (% de CD44hi) y el número (# de CD44hi) de células positivas para CD44hi de un ensayo de inmunización con eritrocitos de oveja (SRBC) . Se ensayaron constructos monovalentes y bivalentes derivados de M31 fusionados con MSA, y los anticuerpos monoclonales anti-CD40L MR1. El constructo bivalente Dl-Dl conjugado con MSA se utilizó como control negativo.

La FIG. 5F muestra la cantidad de IgG anti-SRBC de un ensayo de inmunización con eritrocitos de oveja (SRBC) . Se ensayaron constructos monovalentes y divalentes derivados de 31 fusionados con MSA. El constructo bivalente DI-DI conjugado con MSA se utilizó como control negativo.

La FIG. 5G muestra los títulos de IgM anti-KLH de un modelo de respuesta de anticuerpos dependiente de linfocitos T específicos para KLH (TDAR, por sus siglas en inglés) . Se ensayaron constructos monovalentes y divalentes derivados de 342 fusionados con HSA.

La FIG. 5H muestra los títulos de IgG anti-KLH de un modelo de respuesta de anticuerpos dependiente de linfocitos T específicos para KLH (TDAR, por sus siglas en inglés) . Se ensayaron constructos monovalentes y divalentes derivados de 342 fusionados con HSA.

La FIG. 6A muestra el efecto inhibitorio de las matrices de soporte de Tn3 monoméricas específicas para CD40L humano monovalentes 309 y 311 sobre la expresión de CD86 inducida por CD40L humano en PBMC humanas positivas para CD19 estimuladas con células DI .1 Jurkat .

La FIG. 6B muestra el efecto inhibitorio de las matrices de soporte de Tn3 monoméricas específicas para CD40L humano monovalentes 309 y 311 sobre la proliferación de linfocitos B estimulada con CD40L humano.

La FIG. 6C muestra el efecto inhibitorio de las matrices de soporte de Tn3 monoméricas específicas para CD40L humano monovalentes 309 y 311 sobre el número de células en plasma en cocultivos de linfocitos T/B. También se demostró que la matriz de soporte de Tn3 309 se une a linfocitos T primarios activados por FACS (los datos no se muestran) . Se utilizó una matriz de soporte DI ( "Neg Tn3") como control. También se utilizaron dos anticuerpos monoclonales contra CD40L, denominados aCD40L (RE) y aCD40L(Bio) (anticuerpo monoclonal anti-CD40L humano 5c8 de Biogen) como controles.

La FIG. 7A muestra que las matrices de soporte de Tn3 específicas para CD40L humano monovalentes 309 y 311 tienen características biofísicas similares. Ambas matrices de soporte se monodispersan según se midió mediante SEC.

La FIG. 7B muestra que las matrices de soporte de Tn3 específicas para CD40L humano monovalentes 309 y 311 tienen características biofísicas similares. Ambas matrices de soporte tienen una termoestabilidad similar a la matriz de soporte de Tn3 original (denominada Tn3 (natural) en el gráfico) según se midió mediante calorimetría diferencial de barrido (CDB) .

La FIG. 8A muestra la inhibición de la expresión de CD86 inducida por CD40L humano sobre células PBMC positivas para CD19 humanas estimuladas con células Jurkat DI .1. Se ensayaron matrices de soporte de Tn3 específicas para CD40L humano monovalentes (311) y bivalentes (311_3GS y 311_7GS) . Se muestran los valores de CI50 para cada constructo.

La FIG. 8B muestra la inhibición de la expresión de CD86 inducida por CD40L humano sobre células PBMC positivas para CD19 humanas humanas estimuladas con células Jurkat DI .1. Se ensayaron las matrices de soporte de Tn3 específicas para CD40L humano monovalentes (309) y bivalentes (309_3GS y 309_7GS) , así como también el anticuerpo monoclonal anti-CD40L humano 5c8 de Biogen. Se muestran los valores de CI50 para cada constructo y el anticuerpo.

La FIG. 9A muestra el diseño de una matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L humano bivalente en tándem representativa fusionada con albúmina sérica humana (HSA) . "GGGGG" (SEQ ID NO: 148) y "GGGGA" (SEQ ID NO: 149) son conectores alternativos a los conectores "GGGGS" (SEQ ID NO: 147) .

La FIG. 9B muestra una purificación de prueba de células 293F en una columna IEX. La fracción del hombro (<10% del pico mayoritario) contiene proteína O-glicosilada unida a residuos de serina presentes en los conectores.

La FIG. 9C muestra la inhibición de la expresión de CD86 inducida por CD40L humano sobre células PBMC positivas para CD19 humanas estimuladas con células Jurkat DI .1. Se ensayaron una matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L humano bivalente (309) , la misma matriz de soporte fusionada con HSA y el anticuerpo monoclonal anti-CD40L humano 5c8 de Biogen.

La FIG. 9D muestra la inhibición de la expresión de CD86 inducida por CD40L humano sobre células PBMC positivas para CD19 humanas estimuladas con células Jurkat Dl.l. Se evaluaron tres matrices de soporte de Tn3 específicas para CD40L humano bivalentes (309) . Había tres repeticiones (GS) presentes en el conector entre las subunidades específicas para CD40L humano (309 en este ejemplo) , mientras que el conector entre las subunidades 309 y la HSA variaba entre 1 y 3 repeticiones (G4S) . También se ensayó el anticuerpo monoclonal anti-CD40L humano 5c8 de Biogen.

La FIG. 10A muestra el efecto de las secuencias de los bucles imitantes de 309 (panel de la izquierda) y 311 (panel de la derecha) sobre la unión de CD40L. La unión indica la intensidad de la señal en el ensayo de unión. WT es la variante con la secuencia líder original (secuencia de Tn3 original) , mientras que BC, DE y FG denotan variantes en las que la secuencia del bucle BC, DE o FG se han modificado respecto a la secuencia de Tn3 original tal como está presente en la tenascina C humana.

La FIG. 10B muestra los perfiles de inhibición de un panel de matrices de soporte con afinidad optimizada según se midieron en función de la expresión de CD86 inducida por CD40L humano en células PBMC positivas para CD19 humanas estimuladas con células Dl.l Jurkat. Los monómeros de Tn3 específicos para CD40L humano correspondientes al clon 309 tenían afinidad optimizada. Los monómeros con afinidad optimizada se denominan del clon 340 al clon 349. El constructo del clon 309wtFG tenía todo el bucle FG reemplazado por el bucle FG de la matriz de soporte de Tn3 original. También se ensayó el anticuerpo monoclonal anti-CD40L 5c8.

La FIG. 10C muestra los perfiles de inhibición según se midieron en función de la expresión de CD86 inducida por CD40L humano sobre células PBMC positivas para CD19 humanas estimuladas con células Jurkat DI .1. Se muestran el perfil del monómero de Tn3 específico para CD40L humano 311, su variante K4E y un control negativo.

La FIG. 10D muestra los perfiles de inhibición según se midieron en función de la expresión de CD86 inducida por CD40L humano sobre células PBMC positivas para CD19 humanas estimuladas con células Jurkat DI .1. Se muestran el perfil del monómero de Tn3 específico para CD40L humano 311K4E, el monómero con afinidad optimizada 311K4E_12 y el anticuerpo monoclonal anti-CD40L 5c8. También se presentan las CI50 para los dos constructos y el anticuerpo.

La FIG. 11A y la FIG. 11B muestran un alineamiento de múltiples secuencias de la matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L original 309, la variante 309FGwt y las variantes con afinidad optimizada 340-349. Los residuos aminoacídicos 1-42 se muestran en la FIG. 11A y los residuos aminoacídicos 43-83 se muestran en la FIG. 11B. Los bucles de las variantes están ensombrecidos. La secuencia de aminoácidos consenso se presenta debajo del alineamiento de múltiples secuencias. Las secuencias alineadas corresponden a las secuencias de aminoácidos de los clones correspondientes a matrices de soporte de Tn3 309 (SEQ ID NO: 20) , 309FGwt (SEQ ID NO: 22), 340 (SEQ ID NO: 24), 341 (SEQ ID NO: 26), 342 (SEQ ID NO: 28), 343 (SEQ ID NO: 30), 344 (SEQ ID NO: 32), 345 (SEQ ID NO: 34), 346 (SEQ ID NO: 36), 347 (SEQ ID NO: 38), 348 (SEQ ID NO: 40) y 349 (SEQ ID NO: 42).

La FIG. 12A y la FIG. 12B muestran un alineamiento de múltiples secuencias de la matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L original 311, la variante 311K4E y las variantes con afinidad optimizada 311K4E_1-311K4E_21. Los residuos aminoacídicos 1-44 se muestran en la FIG. 12A y los residuos aminoacídicos 45-87 se muestran en la FIG. 12B. Los bucles de las variantes están ensombrecidos. Las variaciones de aminoácidos fuera de los bucles ensombrecidos están en recuadros. Se presenta una secuencia consenso debajo del alineamiento de múltiples secuencias. Las secuencias alineadas corresponden a las secuencias de aminoácidos de los clones correspondientes a matrices de soporte de Tn3 311 (SEQ ID NO: 44), 311K4E (SEQ ID NO: 46), 311K4E_1 (SEQ ID NO: 48), 311K4E_2 (SEQ ID NO: 50), 311K4E_2 (SEQ ID NO: 52), 311K4E_3 (SEQ ID NO: 54), 311K4E_4 (SEQ ID NO: 56), 311K4E_5 (SEQ ID NO: 58), 311K4E_7 (SEQ ID NO: 60), 311K4E_8 (SEQ ID NO: 62), 311K4E_9 (SEQ ID NO: 64), 311K4E_10 (SEQ ID NO: 66), 311K4E_11 (SEQ ID NO: 68), 311K4E_12 (SEQ ID NO: 70), 311K4E_13 (SEQ ID NO: 72), 311K4E_14 (SEQ ID NO: 74), 311K4E_15 (SEQ ID NO: 76), 311K4E_16 (SEQ ID NO: 78), 311K4E_19 (SEQ ID NO: 80), 311K4E_20 (SEQ ID NO: 82) y 311K4E_21 (SEQ ID NO: 84).

La FIG. 13 muestra un ensayo de inhibición de NfkB humano que emplea células HEK293 que expresan el receptor CD40 humano y que contienen un constructo indicador de NfkB-luciferasa. La adición de CD40L humano provoca señalización (medida como la actividad luciferasa) que se puede inhibir con moléculas que se unen a CD40L. Se ensayaron las matrices de soporte de Tn3 específicas para CD40L 340 y 342, así como también el anticuerpo monoclonal anti-CD40L 5c8.

La FIG. 14 muestra la unión de matrices de soporte de Tn3 específicas para CD40L humano a linfocitos T CD4+ humanos activados con anti-CD3/28 durante 24 h. Se ensayaron una matriz de soporte monovalente 342 fusionada con HSA (denominada 342 -HSA) y una matriz de soporte bivalente 342 fusionada con HSA (denominada 342 -342 -HSA) .

La FIG. 15 muestra la inhibición de la proliferación de linfocitos T/B humanos primarios el día 3. Se ensayaron una matriz de soporte monovalente 340 fusionada con HSA (340-HSA) , una matriz de soporte monovalente 342 fusionada con HSA (342-HSA) y una matriz de soporte bivalente 342 fusionada con HSA (342 -342-HSA) . Se muestran los valores de CI50 para cada constructo.

La FIG. 16A muestra un ensayo de agregación en plaquetas lavadas. El gráfico muestra una agregación inducida por ADP representativa como control positivo para un donante (los tres trazos superiores, respectivamente, ADP: 0.5 µ?, 1 µ? y 2 µ?) junto con el complejo inmunitario (CI) del anticuerpo monoclonal 5c8 (600 nM) y el CD40L humano soluble (200 nM) .

La FIG. 16B muestra un ensayo de agregación en plaquetas lavadas. El gráfico muestra una falta de agregación cuando se utilizaron complejos inmunitarios preformados de las matrices bivalentes 309-309 (no fusionadas con HSA) y el CD40L humano soluble. La concentración de CD40L humano (forma soluble) se mantuvo constante a 600 nM, y la concentración de los constructos de las matrices de soporte varió entre 200 nM y 800 nM.

La FIG. 16C muestra un ensayo de agregación en plaquetas lavadas. El gráfico muestra una falta de agregación cuando se utilizaron complejos inmunitarios preformados de las matrices monovalentes 342 fusionadas con HSA y el CD40L humano soluble. La concentración de CD40L humano (forma soluble) se mantuvo constante a 600 nM, y la concentración de los constructos de las matrices de soporte varió entre 100 nM y 400 nM. El gráfico también muestra la rápida agregación inducida por el complejo inmunitario del anticuerpo monoclonal 5c8 de Biogen y el CD40L humano soluble .

La FIG . 17A muestra una representación de cintas de la estructura cristal ina del CD40L soluble en un complej o con la matriz de soporte de Tn3 específ ica para CD40L monomérica 309 . El CD40L forma un trímero (pol ipéptidos A, B y C) . Cada matriz de soporte 309 (polipéptidos D, E y F, indicados con círculos) está en contacto con dos polipéptidos de CD40L. Se enumeran los contactos específicos entre cada matriz de soporte 309, y los primeros y segundos polipéptidos de CD40L. Esta es una vista "desde arriba hacia abaj o" de la estructura .

La FIG . 17B muestra una representación de cintas de la estructura cristal ina del CD40L soluble en un complej o con la matriz de soporte de Tn3 específ ica para CD40L monomérica 311K4E_12 . El CD40L forma un trímero (pol ipéptidos A, B y C) . Cada matriz de soporte monomérica 311K4E_12 (pol ipéptidos D , E y F , indicados con círculos ) está en contacto con dos pol ipéptidos de CD40L . Se enumeran los contactos específ icos entre cada matriz de soporte monomérica 311K4E_12 , y el primer y el segundo polipéptido de CD40L . Esta es una vista "desde arriba hacia abaj o" de la estructura .

La FIG . 17C muestra una representación de cintas que ilustra que las matrices de soporte 311K4E_12 y 309 (indicas con círculos) se unen a epítopos diferentes situados en partes diferentes del complejo trímero de CD40L. Ambas matrices de soporte se unen en el mismo surco que interaccionaría con el receptor CD40. Esta es una vista "lateral" de la estructura.

La FIG. 17D muestra una representación de cintas de la estructura cristalina del CD40L soluble en un complejo con la matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L monomérica 342. Solamente se muestran un CD40L y una matriz de soporte monomérica 342. Se enumeran los contactos específicos entre la matriz de soporte monomérica 342 y los primeros polipéptidos de CD40L.

La FIG. 17E muestra una representación de cintas que ilustra que las matrices de soporte 342 y 311K4E_12 se pueden unir simultáneamente a epítopos diferentes situados en partes diferentes del complejo trímero de CD40L. Ambas matrices de soporte se unen en el mismo surco que interaccionaría con el receptor CD40. Esta es una vista "lateral" de la estructura.

La FIG. 18A muestra la localización de los contactos entre los aminoácidos en la matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L monomérica 311K4E_12 (SEQ ID NO: 68) y un trímero formado por moléculas de CD40L soluble (SEQ ID NO: 2) tal como se muestra en la FIG. 17A. Cada matriz de soporte está en contacto con 2 moléculas de CD40L. Se muestra la secuencia de CD40L (SEQ ID NO: 2) . Subrayado con línea punteada = dominio citoplasmático; subrayado con línea continua = proteína de membrana de tipo II con señal de anclaje; subrayado doble = porción cocristalizada con la matriz de soporte de Tn3 ; ensombrecido oscuro = residuos en el l.er CD40L que entran en contacto con Tn3 ; ensombrecido claro = residuos en el 2.° CD40L que entran en contacto con Tn3.

La FIG . 18B muestra la localización de los contactos entre los aminoácidos en la matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L monomérica 309 y el trímero de CD40L tal como se muestra en la FIG. 17B. Cada matriz de soporte está en contacto con 2 moléculas de CD40L. Se muestra la secuencia de CD40L (SEQ ID NO: 2) . Subrayado con línea punteada = dominio citoplasmático; subrayado con línea continua = proteína de membrana de tipo II con señal de anclaje; subrayado doble = porción cocristalizada con la matriz de soporte Tn3 ; ensombrecido oscuro = residuos en el l.er CD40L que entran en contacto con Tn3 ; ensombrecido claro = residuos en el 2.° CD40L que entran en contacto con Tn3 ; el residuo en un recuadro doble está en contacto con el bucle FG de la matriz de soporte 309, que probablemente no se conserva en clones con un bucle FG natural.

En las FIGS . 19A-19C. La fig. 19A muestra un cromatograma ilustrativo de la elución de la matriz de soporte Tn3 (309 o 311K4E 12) , CD40L y el complejo entre ellos a la salida de la columna GL Superdex 200 10/300 de exclusión por tamaños. La fig. 19B muestra cristales del complejo de 309-CD40L. El cristal que se muestra creció hasta alcanzar unas dimensiones de hasta 0.15 x 0.15 x 0.1 mm. La fig. 19 C muestra cristales del complejo de 311K4E_12-CD40L.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Definiciones Antes de describir la presente invención en detalle, se debe sobreentender que esta invención no se limita a composiciones o pasos de procesos específicos, ya que estos pueden variar. Cabe destacar que, tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas del singular "un/a" y "el/la" incluyen los referentes en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. El término "un" (o "una"), así como las expresiones "uno o más" y "al menos un" se pueden utilizar indistintamente en la presente.

Además, cuando se utilice "y/o" en la presente se debe interpretar como una descripción específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Así pues, se pretende que el término "y/o", según se utiliza en una frase tal como "A y/o B" de la presente, incluya "A y B " , "A o B", "A" (solo) y "B" (solo) . De modo similar, se pretende que el término "y/o", según se utiliza en una frase tal como "A, B y/o C", incluya cada una de las siguientes modalidades: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).

A menos que se definan de otro modo, todos los términos científicos y técnicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que interpreta comúnmente un experto en la técnica a la que se refiere esta descripción. Por ejemplo, el Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2.a ed. , 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3.a ed. , 1999, Academic Press; y el Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revisado, 2000, Oxford University Press, proporcionan al experto un diccionario general con muchos de los términos utilizados en esta invención.

Las unidades, prefijos y símbolos se representan con su forma aceptada por el Sistema Internacional de Unidades (SI) . Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación de amino a carboxi . Los encabezamientos que se proporcionan en la presente no son limitaciones de los diferentes aspectos o modalidades de la invención, los cuales se pueden considerar por referencia a la memoria descriptiva en conjunto. Por consiguiente, los términos definidos inmediatamente a continuación se definen más detalladamente por referencia a la memoria descriptiva en su totalidad.

Se sobreentenderá que cuando se describan modalidades en la presente con la expresión "que comprende", también se proporcionarán modalidades por lo demás análogas descritas en términos de "constituido por" y/o "constituido esencialmente por".

En la presente, se hace referencia a los aminoácidos ya sea mediante sus símbolos de tres letras conocidos habitualmente o mediante los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. De modo similar, se hace referencia a los nucleótidos mediante sus códigos de una única letra aceptados habitualmente .

El término "epítopo", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un determinante proteico capaz de unirse a una matriz de soporte de la invención. Los epítopos están constituidos normalmente por agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como cadenas laterales de azúcares o aminoácidos y normalmente tienen unas características estructurales tridimensionales específicas, así como también unas características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se diferencian en que la unión a los primeros, pero no a los segundos, se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes .

Las expresiones "dominio de fibronectina de tipo III (FnlII) " "dominio FnlII" y "matriz de soporte de FnlII" se refieren a polipéptidos homólogos al dominio de la fibronectina humana de tipo III que contiene al menos 7 hebras beta que están distribuidas entre dos láminas beta, que a su vez están empaquetadas la una contra la otra para formar el núcleo de la proteína, y que además contienen bucles expuestos al disolvente que conectan las hebras beta entre sí. Hay al menos tres de estos bucles en cada borde del sándwich de láminas beta, donde el borde es el límite de la proteína perpendicular a la dirección de las hebras beta. En ciertas modalidades, un dominio FnlII comprende 7 hebras beta, denominadas A, B, C, D, E, F y G, unidas a seis regiones de bucles, denominadas AB, BC, CD, DE, EF y FG, donde una región de bucle conecta cada hebra beta.

La expresión "matriz de soporte de Tn3 " , tal como se utiliza en la presente, se refiere a moléculas que comprenden al menos una matriz de soporte de FnlII, donde la hebra beta A comprende la SEQ ID NO: 11, la hebra beta B comprende la SEQ ID NO: 12, la hebra beta C comprende la SEQ ID NO: 13 o 14, la hebra beta D comprende la SEQ ID NO: 15, la hebra beta E comprende la SEQ ID NO: 16, la hebra beta F comprende la SEQ ID NO: 17 y la hebra beta G comprende la SEQ ID NO: 18, donde al menos un bucle es una variante de origen no natural de los bucles en la "matriz de soporte de Tn3 original" . En ciertas modalidades, una o más de las hebras beta de un módulo de Tn3 comprenden al menos una sustitución aminoacídica, salvo que los residuos de cisteína en la hebra beta C (p. ej . , la cisteína en las SEQ ID NOs : 13 o 14) y la hebra beta F (SEQ ID NO: 17) no están sustituidos.

La expresión "Tn3 original", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una matriz de soporte de FnlII que comprende la SEQ ID NO: 3, es decir, una matriz de soporte de FnlII con modificación cisteínica estabilizada térmicamente derivada del 3.er dominio FnlII de la tenascina C humana.

Las expresiones "multímero" o "matriz de soporte multimérica" se refiere a una molécula que comprende al menos dos matrices de soporte de FnlII asociadas. Las matrices de soporte que forman una matriz de soporte multimérica se pueden unir a través de un conector que permita a cada matriz de soporte funcionar de forma independiente.

Las expresiones "monómero", "subunidad monomérica" o "matriz de soporte monomérica" se refieren a una molécula que comprende únicamente una matriz de soporte de FnlII.

La expresión "subunidad monomérica específica para CD40L", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un monómero de Tn3 derivado de una "Tn3 original" donde el monómero de Tn3 se une específicamente a CD40L o un fragmento de este, p. ej . , una forma soluble de CD40L.

El término "ADN" se refiere a una secuencia de dos o más desoxirribonucleótidos naturales o modificados unidos covalentemente .

La expresión "proteína de fusión" se refiere a una proteína que incluye (i) una o más matrices de soporte de la invención unidas a (ii) una segunda proteína diferente (es decir, una proteína "heteróloga" ) .

TABLA 1: Secuencias y SEQ ID NOs de los componentes de "Tn3 original" La expresión "resto heterólogo" se utiliza en la presente para indicar la adición de una composición a una matriz de soporte de Tn3 de la invención, donde la composición normalmente no forma parte de un dominio FnlII. Los restos heterólogos ilustrativos incluyen proteínas, péptidos, dominios proteicos, conectores, fármacos, toxinas, contrastes, compuestos radioactivos, polímeros orgánicos e inorgánicos y cualesquiera otras composiciones que puedan proporcionar una actividad que no sea inherente en el propio dominio FnlII que incluyen, sin carácter limitante, polietilenglicol (PEG) , un agente citotóxico, un radionucleido, un contraste, biotina, un dominio de dimerización (p. ej . , un dominio de cremallera de leucina) , albúmina sérica humana (HSA, por sus siglas en inglés) o una de sus porciones de unión a FcRn, un dominio o fragmento de un anticuerpo (p. ej . , un dominio variable de un anticuerpo, un dominio CH1, un dominio Ckappa, un dominio Clambda, un dominio CH2 o un dominio CH3) , un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo de un dominio, un dominio de unión a albúmina, una molécula de IgG, una enzima, un ligando, un receptor, un péptido de unión, una matriz de soporte que no sea de FnlII, un epítopo marcador, un polímero polipeptídico recombinante, una citocina y similares.

El término "conector", tal como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier conjunto molecular que une o conecta dos o más matrices de soporte. El conector puede ser una molécula cuya función es actuar como un "espaciador" entre módulos en una matriz de soporte o también puede ser una molécula con una función adicional (es decir, un "resto funcional"). Una molécula incluida en la definición de "resto heterólogo" también puede funcionar como conector.

Los términos "unido" y "fusionado" se utilizan indistintamente. Estos términos se refieren a la unión de dos o más matrices de soporte, restos heterólogos o conectores por cualquier medio, incluido un método recombinante o de conjugación química.

Las expresiones "dominio" o "dominio proteico" se refieren a una región de una proteína que se puede plegar en forma de una estructura tridimensional estable, normalmente independientemente del resto de la proteína, y a la cual se le puede atribuir una función particular. Esta estructura conserva una función específica asociada con la función del dominio dentro de la proteína original, p. e . , actividad enzimática, creación de un motivo de reconocimiento para otra molécula o para proporcionar los componentes estructurales necesarios para que una proteína exista en un entorno particular de proteínas. Tanto dentro de una familia de proteínas como dentro de superfamilias de proteínas relacionadas, los dominios proteicos pueden ser regiones conservadas evolutivamente. Cuando se describe el componente de una matriz de soporte multimérica, las expresiones "dominio", "matriz de soporte monoméricas " , "subunidad monoméricas" y "módulo" se pueden utilizar indistintamente. La expresión "dominio FnlII nativo" se refiere a cualquier dominio FnlII no recombinante que sea codificado por un organismo vivo.

La expresión "secuencia proteica" o "secuencia de aminoácidos" se refiere a una representación lineal de los constituyentes aminoacídicos en un polipéptido en una dirección de amino-terminal a carboxi-terminal en la que los residuos que van seguidos en la representación son contiguos en la estructura primaria del polipéptido.

La expresión "ácido nucleico" se refiere a dos o más nucleótidos unidos covalentemente , o análogos o derivados de nucleótidos cualesquiera. Esta expresión, tal como se utiliza en la presente, incluye, sin carácter limitante, ADN, ARN y APN. Las expresiones "ácido nucleico" y "polinucleótido" se utilizan indistintamente en la presente.

Se pretende que el término "polinucleótido" abarque un ácido nucleico en singular así como también ácidos nucleicos en plural, y se refiere a una molécula o constructo de ácido nucleico aislado, p. ej . , ARN mensajero (ARNm) o ADN plasmídico (ADNp) . El término ácido nucleico o polinucleótido "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN que ha sido retirada de su entorno nativo. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica, p. ej . , una matriz de soporte de la invención contenida en un vector, se considera aislado a los efectos de la presente invención. Otros ejemplos de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes conservados en células huésped heterólogas o polinucleótidos purificados (parcial o sustancialmente) en solución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcritos de ARN in vivo o in vitro de polinucleótidos de la presente invención. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados de acuerdo con la presente invención incluyen además las moléculas de este tipo producidas sintéticamente. Además, un polinucleótido o un ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento regulador tal como un promotor, un sitio de unión ribosómico o un terminador de la transcripción.

La expresión 11 farmacéuticamente aceptable" se refiere a un compuesto o una proteína que se puede administrar a un animal (por ejemplo, un mamífero) sin consecuencias médicas adversas significativas.

La expresión "portador fisiológicamente aceptable" se refiere a un portador que no ejerce un impacto perjudicial significativo sobre el huésped tratado y que retiene las propiedades terapéuticas del compuesto junto al cual se administra. Un portador fisiológicamente aceptable ilustrativo es una solución salina fisiológica. Los expertos en la técnica estarán familiarizados con otros portadores fisiológicamente aceptables y sus formulaciones, los cuales se describen, por ejemplo, en Rendngton's Pharmaceutical Sciences, (18.a edición), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, Pa., incorporados a la presente por referencia.

El término "polipéptido" se refiere a cualquier secuencia de dos o más aminoácidos unidos linealmente mediante enlaces amídicos (enlaces peptídicos) independientemente de su longitud, modificación postraduccional o función. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en la presente. Así pues, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos u oligopéptidos quedan incluidos dentro de la definición de "polipéptido" y el término "polipéptido" se puede utilizar indistintamente o en lugar de cualquiera de estos términos. Se pretende que el término "polipéptido" también haga referencia a los productos de las modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido que incluyen, sin carácter limitante, glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos bloqueadores/protectores conocidos, escisión proteolítica o modificación mediante aminoácidos de origen no natural. Un polipéptido se puede derivar de una fuente biológica natural o se puede producir mediante tecnología recombinante, pero no se traduce necesariamente a partir de una secuencia de ácido nucleico designada. Un polipéptido se puede generar de cualquier forma, incluida la síntesis química.

También se incluyen como polipéptidos de la presente invención los fragmentos, derivados, análogos o variantes de los péptidos anteriores, y cualquier combinación de estos. Las variantes pueden ser de origen natural o no natural . Las variantes de origen no natural se pueden producir mediante técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica. Las variantes polipeptídicas pueden comprender sustituciones, deleciones o adiciones aminoacídicas conservadoras o no conservadoras. También se incluyen como "derivados" aquellos péptidos que contienen uno o más derivados aminoacídicos de origen natural de los veinte aminoácidos estándar.

El término "aleatorizada" o "mutada" se refiere a que se incluyen una o más alteraciones aminoacídicas, incluidas la deleción, sustitución o adición, en relación con una secuencia patrón. El término "aleatorización" o "mutación" se refiere al proceso de introducción, en una secuencia, de la alteración aminoacídica . La aleatorización o mutación se puede conseguir mediante una variación secuencial intencionada, oculta o espontánea, generalmente de una secuencia que codifica un ácido nucleico, y se puede llevar a cabo mediante cualquier técnica, por ejemplo, PCR, PCR propensa a errores o síntesis química de ADN. Los términos "aleatorización", "aleatorizada", "mutación", "mutada" y similares se utilizan indistintamente en la presente.

Las expresiones "cognada" o "proteína no mutada cognada" se refieren a una proteína que es idéntica secuencialmente a una variante proteica, salvo por las mutaciones aminoacídicas introducidas en la variante proteica, donde la variante proteica está aleatorizada o mutada.

El término "AR " se refiere a una secuencia de dos o más ribonucleótidos naturales o modificados unidos covalentemente . Un ejemplo de un ARN modificado incluido en este término es el ARN con enlaces fosforotioato .

Las expresiones "matriz de soporte de la invención" o "matrices de soporte de la invención", tal como se utilizan en la presente, se refieren a matrices de soporte de Tn3 multiméricas así como también a matrices de soporte de Tn3 monoméricas . El término "diana" se refiere a un compuesto reconocido por una matriz de soporte específica de la invención. Los términos "diana" y "antígeno" se utilizan indistintamente en la presente. El término "especificación", tal como se utiliza en la presente, p. ej . , en las expresiones "se une específicamente" o "unión específica", se refiere a la afinidad relativa por la cual una estructura de soporte de Tn3 de la invención se une a uno o más antígenos a través de uno o más dominios de unión a antígeno, y la unión implica cierta complementariedad entre uno o más dominios de unión a antígeno y uno o más antígenos. De acuerdo con esta definición, se dice que una estructura de soporte de Tn3 de la invención se "une específicamente" a un epítopo cuando se une al epítopo más fácilmente de lo que se uniría a un epítopo no relacionado aleatorio.

Una matriz de soporte con "afinidad madura" es una matriz de soporte con una o más alteraciones, generalmente en un bucle, que provocan una mejora en la afinidad de la matriz de soporte de Tn3 por un epítopo en comparación con una matriz de soporte de Tn3 original que no posee la alteración o alteraciones.

El término "afinidad", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una medición de la fuerza de la unión de una matriz de soporte de Tn3 determinada de la invención a un epítopo individual .

El término "avidez", tal como se utiliza en la presente, se refiere a la estabilidad global del complejo entre una población de matrices de soporte de Tn3 de la invención y un epítopo determinado, es decir, la fuerza combinada funcionalmente de la unión de una pluralidad de matrices de soporte de Tn3 con el antígeno. La avidez está relacionada tanto con la afinidad de los dominios de unión a antígeno individuales con epítopos específicos como también con la valencia de la matriz de soporte de la invención.

La expresión "acción sobre la diana" se refiere a la unión de una matriz de soporte de Tn3 de la invención con una o más dianas y a los efectos biológicos generados por la unión. A este respecto, múltiples unidades de unión a antígeno en una matriz de soporte de Tn3 pueden interaccionar con diversas dianas y/o epítopos y, por ejemplo, hacer que dos dianas se acerquen físicamente, desencadenar cascadas metabólicas a través de la interacción con dianas diferentes, etc. En lo que respecta a CD40L, la expresión "acción sobre la diana" se refiere al efecto conseguido, por ejemplo, mediante el incremento, la estimulación o la activación de una o más actividades biológicas de CD40L.

El término "valencia", tal como se utiliza en la presente, se refiere al número de módulos de unión a antígeno potenciales, p. ej . , el número de módulos de FnlII en una matriz de soporte de la invención. Cuando una matriz de soporte de Tn3 de la invención comprende más de un módulo de unión a antígeno, cada módulo de unión se puede unir específicamente, p. e . , al mismo epítopo o a un epítopo diferente, en la misma diana o en dianas diferentes.

La expresión "enlace disulfuro", tal como se utiliza en la presente, incluye el enlace covalente formado entre dos átomos de azufre. El aminoácido cisteína comprende un grupo tiol que puede formar un enlace o puente disulfuro con un segundo grupo tiol .

Los términos " inmunoglobulina" y "anticuerpo" comprenden múltiples clases de polipéptidos variadas que se pueden distinguir bioquímicamente. Los expertos en la técnica comprenderán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon. La naturaleza de esta cadena es la que determina la "clase" del anticuerpo como IgG, IgM, IgA IgG o IgE, respectivamente. Un experto en la técnica diferenciará fácilmente las versiones modificadas de cada una de estas clases. El término "anticuerpo", tal como se utiliza en la presente, incluye, sin carácter limitante, un anticuerpo intacto, un anticuerpo modificado, un dominio VL o VL de anticuerpo, un dominio CHl , un dominio Ckappa, un dominio Clambda y un dominio Fe (véase a continuación) , un CH2 o un dominio CH3.

La expresión "dominio Fe", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una porción de una región constante de un anticuerpo. Tradicionalmente , la expresión "dominio Fe" se refiere a un producto de la escisión por acción de una proteasa (p. ej . , la papaína) que abarca la regiones apareadas CH2, CH3 y la región bisagra de un anticuerpo. En el contexto de esta exposición, la expresión "dominio Fe" o "Fe" se refiere a cualquier polipéptido (o ácido nucleico que codifique el polipéptido) , independientemente del método de producción, que incluya toda o una porción de las regiones CH2 , CH3 y la región de bisagra de un polipéptido inmunoglobulínico.

La expresión "anticuerpo modificado" , tal como se utiliza en la presente, incluye las formas sintéticas de anticuerpos que están alterados de modo que no son naturales, p. ej . , anticuerpos que comprenden al menos dos porciones de cadena pesada pero no dos cadenas pesadas enteras (como, p. ej . , los anticuerpos con dominios eliminados o minicuerpos) ; formas multiespecíficas de anticuerpos (p. ej . , biespecíficas , triespecíficas , etc.) alterados para que se unan a dos o más antígenos o a epítopos diferentes de un único antígeno. Además, la expresión "anticuerpo modificado" incluye las formas multivalentes de anticuerpos (p. ej . , trivalentes, tetravalentes, etc.) que se unen a tres o más copias del mismo antígeno. (Remítase a, p. ej . , Antibody Engineering, Kontermann & Dubel, eds . , 2010, Springer Protocols, Springer) .

La expresión "semivida in vivo" se utiliza con su significado habitual, es decir, el momento en el que el 50% de la actividad biológica de un polipéptido sigue estando presente en el cuerpo/órgano diana, o el momento en el que la actividad del polipéptido es el 50% de su valor inicial. Como alternativa a la determinación de la semivida in vivo funcional, se puede determinar la "semivida sérica", es decir, el momento en el que el 50% de las moléculas de polipéptido circulan en el plasma o el torrente sanguíneo antes de ser eliminadas. La determinación de la semivida sérica suele ser más simple que la determinación de la semivida in vivo funcional, y la magnitud de la semivida sérica normalmente es una buena indicación de la magnitud de la semivida in vivo funcional. Las expresiones alternativas a la semivida sérica incluyen "semivida plasmática", semivida circulante, semivida circulatoria, aclaramiento sérico, aclaramiento plasmático y semivida de aclaramiento. La ncionalidad que se ha de retener normalmente se selecciona entre actividad procoagulante, proteolítica, de unión a cofactores, de unión a receptores u otro tipo de actividad biológica asociada con la proteína particular.

El término "aumento" con respecto a la semivida in vivo funcional o semivida plasmática se utiliza para indicar que la semivida relevante del polipéptido ha aumentado significativamente desde un punto de vista estadístico en comparación con la de una molécula de referencia (por ejemplo, un polipéptido no modificado) , según se determina en condiciones comparables.

El término "reducción" con respecto a la semivida in vivo funcional o semivida plasmática se utiliza para indicar que la semivida relevante del polipéptido se ha reducido significativamente desde un punto de vista estadístico en comparación con la de una molécula de referencia (por ejemplo, un polipéptido no modificado) , según se determina en condiciones comparables.

El término "expresión", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un proceso mediante el cual un gen produce un agente bioquímico, por ejemplo, una matriz de soporte de la invención o uno de sus fragmentos. El proceso incluye cualquier manifestación de la presencia funcional del gen en la célula que incluye, sin carácter limitante, el silenciamiento génico así como también tanto la expresión transitoria como la expresión estable. Esto incluye, sin carácter limitante, la transcripción del gen en uno o más ARNm y la traducción de tales ARNm en uno o más polipéptidos . Si el producto deseado final es un agente bioquímico, la expresión incluye la creación del agente bioquímico y cualquiera de sus precursores .

Un "producto de expresión" puede ser un ácido nucleico, p. ej . , un ARN mensajero producido por la transcripción de un gen o un polipéptido. Los productos de expresión descritos en la presente también incluyen ácidos nucleicos con modificaciones postranscripcionales , p. e . , poliadenilación, o polipéptidos con modificaciones postraduccionales , p. ej . , metilación, glicosilación, la adición de lípidos, la asociación con otras subunidades proteicas, la escisión proteolítica y similares.

La expresión "vector" o "vector de expresión" se utiliza en la presente para hacer referencia a vectores utilizados de acuerdo con la presente invención como vehículo para introducir y expresar un producto de expresión deseado en una célula huésped. Como sabrán los expertos en la técnica, tales vectores se puede seleccionar fácilmente entre el grupo constituido por plásmido, fagos, virus y retrovirus. En general, los vectores compatibles con la presente invención comprenderán un marcador seleccionable , sitios de restricción adecuados para fomentar la clonación del ácido nucleico deseado y la capacidad de entrar y/o replicarse en células eucariotas o procariotas.

La expresión "célula huésped" se refiere a células que albergan vectores construidos utilizando técnicas de ADN recombinante y que codifican al menos un producto de expresión. En las descripciones de los procesos para aislar un producto de expresión a partir de huéspedes recombinantes , las expresiones "célula" y "cultivo celular" se utilizan indistintamente para denotar la fuente del producto de expresión, a menos que se especifique claramente lo contrario, es decir, la recuperación del producto de expresión a partir de las "células" se refiere a la recuperación a partir de células enteras centrifugadas o la recuperación a partir del cultivo celular que contiene tanto el medio como las células suspendidas.

Los términos "tratar" o "tratamiento", tal como se utilizan en la presente, se refieren tanto a un tratamiento terapéutico como a medidas preventivas o profilácticas, donde el objetivo es prevenir o ralentizar (reducir) un trastorno o cambio fisiológico no deseado en un sujeto, tal como el avance de una afección o enfermedad inflamatoria. Los resultados clínicos deseados o beneficiosos incluyen, sin carácter limitante, el alivio de síntomas, la reducción del alcance de la enfermedad, la estabilización (es decir, no empeoramiento) del estado de la enfermedad, la ralentización o reducción del avance de la enfermedad, la mejora o paliación del estado patológico y la remisión (ya sea parcial o total), tanto detectables como no detectables .

El término "tratamiento" también se refiere a la prolongación de la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Los sujetos que necesitan tratamiento incluyen los que ya padecen la afección o trastorno, así como aquellos que son propensos a padecer la afección o trastorno, o aquellos en los que se ha de prevenir la afección o trastorno.

Los términos "sujeto", "individuo", "animal", "paciente" o "mamífero" se refieren a cualquier individuo, paciente o animal, en particular a un sujeto mamífero, para el cual se desea obtener un diagnóstico, un pronóstico o una terapia. Los sujetos mamíferos incluyen los seres humanos, animales domésticos, animales de granja y de zoológico, animales de deportes o animales de compañía tales como perros, gatos, conejillos de Indias, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado, vacas y demás.

El término "CD40L", tal como se utiliza en la presente, se refiere, sin carácter limitante, al CD40L expresado en la superficie de los linfocitos T, al CD40L expresado recombinantemente, al CD40L expresado y purificado a partir de E. coli u otros sistemas de expresión de proteínas recombinantes adecuados, el CD40L glicosilado y fragmentos solubles de CD40L. El término "CD40L" , tal como se utiliza en la presente, también se refiere a egaCD40L. MegaCD40L™ es un constructo de alta actividad en el que dos ligandos CD40 triméricos están unidos artificialmente a través del dominio de colágeno de ACRP30/adiponectina . Este constructo simula muy eficazmente la agregación asistida por la membrana natural de CD40L in vivo. Proporciona una alternativa simple e igualmente potente a las combinaciones de [CD40L+potenciador] (Alexis biochemicals) . El término "CD40L" se refiere a las formas monoméricas de CD40L así como también a las formas oligoméricas, p. ej , CD40L trimérico.

El término "CD40L" se refiere tanto al CD40L completo como a los fragmentos solubles, p. ej . , formas de dominio extracelular de CD40L generadas por proteólisis. Las secuencias de aminoácidos de las formas solubles y unidas a membrana del CD40L humano (Swissprot: P29965) se muestran en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, respectivamente.

Las expresiones "antagonista de CD40L" o "antagonista" se utilizan en su sentido más amplio e incluyen cualquier molécula que inhiba, reduzca o inactive parcial o completamente una o más actividades biológicas de CD40L, y las variantes biológicamente activas de esta, in vitro, in situ o in vivo. Por ejemplo, un antagonista de CD40L puede funcionar para inhibir, reducir o inactivar parcial o completamente una o más actividades biológicas de una o más moléculas de CD40L, o una o más moléculas de CD40L unidas a CD40 u otras dianas, in vivo, in vitro o in situ, como resultado de su unión a CD40L.

La expresión "agonista de CD40L" o "agonista" se utiliza en su sentido más amplio e incluye cualquier molécula que incremente, estimule o active parcial o completamente una o más actividades biológicas de CD40L, y las variantes biológicamente activas de esta, in vitro, in situ o in vivo. Por ejemplo, un agonista de CD40L puede funcionar para incrementar, estimular o activar parcial o completamente una o más actividades biológicas de una o más moléculas de CD40L, o una o más moléculas de CD40L unidas a CD40R u otras dianas, in vivo, in vitro o in situ, como resultado de su unión a CD40L.

El término "cristal", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una forma de estado sólido de la materia en la que los átomos están colocados siguiendo un patrón que se repite periódicamente en tres dimensiones, normalmente formando una red.

La expresión "simetría del grupo espacial", tal como se utiliza en la presente, se refiere a toda la simetría del cristal que combina la simetría traslacional de una red cristalina con la simetría del grupo puntual. Un "grupo espacial" está designado por una letra mayúscula que identifica el grupo de la red (P, A, F, etc.) que va seguida por el símbolo del grupo puntual en el que los elementos de rotación y reflexión se extienden para incluir los ejes helicoidales y los planos de deslizamiento. Cabe destacar que la simetría del grupo puntual para un grupo espacial particular se puede determinar eliminando el símbolo de centrado de la celda del grupo espacial y reemplazando todos los ejes helicoidales por ejes de rotación similares y reemplazando todos los planos de deslizamiento por planos de espejo. La simetría del grupo puntual para un grupo espacial describe la simetría real de su red recíproca.

La expresión "celda unidad", tal como se utiliza en la presente, se refiere a los átomos de un cristal que están colocados siguiendo un patrón regular que se repite, en el cual la unidad que se repite más pequeña se denomina celda unidad. Se puede reconstituir la estructura entera si se conoce la celda unidad, que se caracteriza por tres longitudes (a, b y c) y tres ángulos (a, ß y ?) . Las cantidades a y b son las longitudes de los lados de la base de la celda y ? es el ángulo entre estos dos lados. La cantidad c es la altura de la celda unidad. Los ángulos OÍ y ß describen los ángulos entre la base y las caras verticales de la celda unidad.

La expresión "medio de almacenamiento de datos legible mecánicamente", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un material de almacenamiento de datos codificado con datos legibles mecánicamente, donde una máquina está programada con instrucciones para utilizar tales datos y es capaz de presentar los datos en el formato deseado, por ejemplo, una representación gráfica tridimensional de moléculas o complejos moleculares.

La expresión "patrón de difracción de rayos X" se refiere al patrón obtenido a partir de la dispersión de rayos X de la disposición periódica de moléculas o átomos en un cristal. La cristalografía de rayos X es una técnica que aprovecha el hecho de que los rayos X sean difracados por los cristales. Los rayos X tienen la longitud de onda adecuada (en el intervalo de angstrom, aproximadamente 10"8 cm) para ser dispersados por la nube electrónica de un átomo de un tamaño comparable. Basándose en el patrón de difracción obtenido a partir de la dispersión de rayos X de la disposición periódica de moléculas o átomos en el cristal, se puede reconstruir la densidad electrónica. Se puede extraer información adicional sobre la fase ya sea a partir de los datos de difracción o a partir de experimentos de difracción complementarios para completar la reconstrucción (el problema de la fase en cristalografía) . Un modelo es el que se construye progresivamente para obtener la densidad electrónica experimental, refinada frente a los datos para producir una estructura molecular precisa. Las coordenadas estructurales de rayos X definen una configuración única de puntos en el espacio. Los expertos en la técnica comprenderán que un conjunto de coordenadas estructurales para una proteína o un complejo de proteína-ligando, o una de sus porciones, definen un conjunto de puntos relativo que, a su vez, definen una configuración en tres dimensiones. Un conjunto de coordenadas completamente diferente puede definir una configuración similar o idéntica, siempre que las distancias y los ángulos entre las coordenadas sigan siendo esencialmente los mismos. Además, se puede definir una configuración de puntos al incrementar o reducir las distancias entre las coordenadas en un factor escalar, manteniendo los ángulos esencialmente iguales.

La expresión "estructura cristalina", tal como se utiliza en la presente, se refiere a la disposición espacial tridimensional o en forma de red de las unidades moleculares o atómicas que se repiten en un material cristalino. La estructura cristalina de un material cristalino se puede determinar mediante métodos cristalográficos de rayos X, remítase, por ejemplo, a "Principies of Protein X-Ray Crystallography" de Jan Drenth, Springer Advanced Texts in Chemistry, Springer Verlag, 2.a ed. , febrero de 1999, ISBN: 0387985875, y a "Introduction to Macromolecular Crystallography" de Alexander McPherson, Wiley-Liss, 18 de octubre de 2002, ISB : 0471251224.

La expresión "función efectora" se refiere a aquellas actividades biológicas de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo atribuibles a la región Fe (una región Fe nativa o una secuencia de aminoácidos variante de la región Fe) de un anticuerpo y que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de un anticuerpo incluyen: unión a Clq y citotoxicidad dependiente del complemento; unión al receptor Fe; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés) ; fagocitosis; reducción de la expresión de receptores de la superficie celular (p. ej . , receptores de linfocitos B) ; y activación de los linfocitos B.

La expresión "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la que las Ig secretadas unidas a receptores Fe (FcR) presentes en ciertas células citotóxicas (p. ej . , citolíticas (NK, por sus siglas en inglés) , neutrófilos y macrófagos) permiten que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana portadora de antígeno y subsecuentemente destruyan las células diana con citotoxinas.

La expresión "receptor Fe" o "FcR" describe un receptor que se une a la región Fe de un anticuerpo. El FcR puede ser un FcR humano de secuencia nativa. El FcR se puede unir a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FCYRII y FCYRIII, incluidas las variantes alélicas y formas derivadas de un mecanismo corte y empalme alternativo de estos receptores. La expresión también incluye el receptor neonatal FcRn.

La expresión "secuencia consenso" se refiere a una secuencia proteica que muestra los aminoácidos más comunes en una posición particular después de alinear múltiples secuencias. Una secuencia consenso es una forma de representar los resultados de un alineamiento de múltiples secuencias, en el que se comparan entre sí secuencias relacionadas. La secuencia consenso muestra qué residuos son los más abundantes en el alineamiento en cada posición y el grado de variabilidad en cada posición.

Introducción El CD40L (conocido también como CD154, ligando CD40, gp39 o TBAM) es una glicoproteína de membrana de tipo II de 33 kDa (Swiss-ProtAcc-No P29965) . Además, existen formas solubles de CD40L más cortas de 18 kDa (también conocidas como sCD40L o CD40L soluble) . Estas formas solubles de CD40L se generan mediante el procesamiento proteolítico de la proteína unida a la membrana, pero la actividad celular de las especies solubles es débil en ausencia de oligomerización de orden superior (p. ej . , trimerización) .

La presente invención proporciona una familia de matrices de soporte proteicas de origen no natural recombinantes (matrices de soporte de Tn3) que pueden unirse a CD40L. En particular, las proteínas descritas en la presente se pueden utilizar para presentar bucles definidos que son análogos a las regiones determinantes de la complementariedad ("CDR", por sus siglas en inglés) de una región variable de un anticuerpo. Estos bucles se pueden someter a aleatorización o evolución restringida para generar una variedad capaz de unirse a multitud de compuestos diana. Las matrices de soporte de Tn3 se pueden utilizar como monómeros o se pueden disponer como matrices multiméricas capaces de unirse a CD40L.

En modalidades específicas, la invención proporciona ligantes específicos para CD40L que son útiles para prevenir, mejorar, detectar, diagnosticar o monitorizar enfermedades, tales como, sin carácter limitante, las enfermedades autoinmunes . En otras modalidades específicas, las matrices de soporte de Tn3 específicas para CD40L de la invención son útiles para tratar enfermedades y afecciones autoinmunes. En algunas modalidades, las enfermedades autoinmunes pueden incluir, sin carácter limitante, el lupus eritematoso sistémico (LES) , artritis reumatoide (AR) , esclerosis múltiple (EM) , enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) y rechazo de aloinjerto.

Las matrices de soporte de Tn3 de la invención comprenden subunidades monoméricas específicas para CD40L derivadas del tercer dominio FnlII de la tenascina C humana, en las que al menos se ha creado un enlace disulfuro intramolecular de origen no natural . Las subunidades monoméricas que constituyen las matrices de soporte de Tn3 de la invención se pliegan correctamente de forma independiente unas de otras, retienen su especificación y afinidad de unión, y cada una de las matrices monoméricas retiene sus propiedades funcionales. Cuando las subunidades monoméricas se disponen en matrices de soporte de Tn3 multiméricas de valencia alta, las subunidades monoméricas se pliegan correctamente de forma independiente unas de otras, retienen su especificación y afinidad de unión, y cada uno de los monómeros retiene sus propiedades funcionales.

Las matrices de soporte de Tn3 de la invención que comprenden más de una subunidad monomérica se pueden unir a múltiples epítopos, p. ej . , (i) se unen a múltiples epítopos en una única diana, (ii) se unen a un único epítopo en múltiples dianas, (iii) se unen a múltiples epítopos situados en subunidades diferentes de una diana o (iv) se unen a múltiples epítopos en múltiples dianas, y de este modo se incrementa la avidez.

Además, debido a la posibilidad de variar la distancia entre múltiples monómeros mediante conectores, las matrices de soporte de Tn3 multiméricas son capaces de unirse a múltiples moléculas diana en una superficie (ya sea en la misma célula/superficie o en células/superficies diferentes) . Como resultado de su capacidad para unirse simultáneamente a más de una diana, una matriz de soporte de Tn3 multimérica de la invención se puede utilizar para modular múltiples vías, entrecruzar receptores en una superficie celular, unir receptores de la superficie celular en células independientes y/o unir moléculas o células diana a un sustrato.

Además, la presente invención proporciona matrices de soporte con afinidad madura en las que se modula la afinidad de una matriz de soporte por una diana específica mediante mutación. Asimismo, la invención proporciona métodos para producir las matrices de soporte de la invención así como también métodos para diseñar matrices de soporte con propiedades fisicoquímicas, farmacológicas o inmunológicas deseables. Además, la presente invención proporciona usos de tales matrices de soporte y métodos para su uso terapéutico, profiláctico y diagnóstico.

El motivo estructural FnlII Las matrices de soporte de Tn3 de la presente invención se basan en la estructura de un módulo de fibronectina de tipo III (FnlII) , un dominio presente en los tres dominios de vida y virus, y en muchas clases de proteínas. En modalidades específicas, las matrices de soporte de la invención se derivan del tercer dominio FnlII de la tenascina C humana (remítase a la Solicitud Internacional N.° PCT/US2008/012398 , publicada como WO 2009/058379; la Solicitud Internacional N.° PCT/US2011/032184, publicada como WO 2011/130324; y la Solicitud Internacional N.° PCT/US2011/032188 , publicada como WO2011130328) .

En una modalidad específica, las matrices de soporte de Tn3 de la invención comprenden una subunidad monomérica específica para CD40L derivada de una matriz de soporte de Tn3 original. El pliegue tridimensional global del monómero está estrechamente relacionado con el del fragmento de anticuerpo funcional más pequeño, la región variable de la cadena pesada (VH, por sus siglas en inglés) , que en los anticuerpos de camellos y camélidos (p. ej . , llamas) comprende la unidad de reconocimiento de antígeno completa.

Las subunidades monoméricas de Tn3 de la invención y el dominio FnlII nativo de la tenascina C se caracterizan por la misma estructura tridimensional, concretamente, una estructura de beta-sándwich con tres hebras beta (A, B y E) en un lado y cuatro hebras beta (C, D, F y G) en el otro lado, conectadas por seis regiones de bucles conectadas. Estas regiones de bucles se denominan de acuerdo con las hebras beta conectadas a los extremos N y C de cada bucle. Por consiguiente, el bucle AB está situado entre las hebras beta A y B, el bucle BC está situado entre las hebras B y C, el bucle CD está situado entre las hebras beta C y D, el bucle DE está situado entre las hebras beta D y E, el bucle EF está situado entre las hebras beta E y F, y el bucle FG está situado entre las hebras beta F y G. Los dominios FnlII poseen bucles expuestos al disolvente que son tolerantes a la aleatorización, lo cual facilita la generación de diversas combinaciones de matrices de soporte proteicas capaces de unirse a dianas específicas con una afinidad alta.

En un aspecto de la invención, las subunidades monoméricas de Tn3 se someten a evolución dirigida diseñada para aleatorizar uno o más de los bucles que son análogos a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) de una región variable de un anticuerpo. Tal técnica de evolución dirigida da como resultado la producción de moléculas similares a anticuerpos con afinidades altas por dianas de interés, p. ej . , CD40L.

Además, en algunas modalidades, las matrices de soporte de Tn3 descritas en la presente se pueden utilizar para presentar bucles expuestos definidos (por ejemplo, bucles aleatorizados previamente y seleccionados en función de la unión a la diana) con el fin de dirigir la evolución de moléculas que se unen a tales bucles introducidos. Este tipo de selección se puede llevar a cabo para identificar moléculas de reconocimiento para cualquier bucle similar a CDR individual o, como alternativa, para reconocer dos o los tres bucles similares a CDR combinados en un resto de unión al epítopo no lineal. Hay un grupo de tres bucles (denominados BC, DE y FG) , que pueden conferir unión a dianas específicas, entre las hebras B y C; las hebras D y E, y las hebras beta F y G, respectivamente. Los bucles BC, DE y FG del tercer dominio FnlII de la tenascina C humana tienen una longitud de 9, 6, y 10 residuos aminoacídicos , respectivamente. La longitud de estos bucles está comprendida en el intervalo estrecho de los bucles de reconocimiento de antígenos cognados que se encuentran en las cadenas pesadas de los anticuerpos, es decir, 7-10, 4-8, y 4-28 aminoácidos de longitud, respectivamente. De forma análoga, hay un segundo grupo de bucles, los bucles AB, CD y EF (7, 7 y 8 aminoácidos de longitud, respectivamente) entre las hebras beta A y B; las hebras beta C y D; y las hebras beta E y F, respectivamente.

Una vez aleatorizados y seleccionados para que tengan una unión de alta afinidad a una diana, los bucles en la matriz de soporte de Tn3 monomérica pueden establecer contactos con dianas que sean equivalentes a los contactos de los bucles CDR cognados en los anticuerpos. Por consiguiente, en algunas modalidades, los bucles AB, CD y EF se aleatorizan y seleccionan para que tengan una unión de alta afinidad a una o más dianas, p. ej . , CD40L. En algunas modalidades, este proceso de aleatorización y selección se puede realizar en paralelo a la aleatorización de los bucles BC, DE, y FG, mientas que en otras modalidades este proceso de aleatorización y selección se realiza en serie.

Subunidades monoméricas específicas para CD40L La invención proporciona matrices de soporte de Tn3 específicas para CD40L recombinantes de origen no natural que comprenden una pluralidad de dominios de hebras beta unidos a una pluralidad de regiones de bucles, donde una o más de tales regiones de bucles varían en la deleción, sustitución o adición de al menos un aminoácido respecto a los bucles cognados en la Tn3 natural (SEQ ID NO: 3) (remítase a la TABLA 1) .

Para generar subunidades monoméricas de Tn3 específicas para CD40L con las características de unión novedosas, se somete la Tn3 original a adiciones, deleciones o sustituciones aminoacídicas . Se sobreentenderá que, cuando se compare la secuencia de una subunidad monomérica de Tn3 específica para CD40L con la secuencia de la Tn3 original, se utiliza la misma definición de las hebras beta y los bucles. En algunas modalidades, las subunidades monoméricas de Tn3 específicas para CD40L de la invención comprenden la secuencia de aminoácidos : IEV (XAB) nALITW (XBC) nCELXiYGI (XCD) nTTIDL (XDE) nYSI (XEF) nYEVSLIC (XFG) nKETFTT donde : (a) XAB, XBc, XCD, XDE/ XEF y XFG representan los residuos aminoacídicos presentes en las secuencias de los bucles AB, BC, CD, DE, EF y FG, respectivamente; (b) Xi representa un residuo aminoacídico de alanina (A) o treonina (T) ; y (c) la longitud del bucle n es un número entero comprendido entre 2 y 26.

TABLA 2 : Secuencias de los bucles de los clones de Tn3 utilizados en estos estudios † Clones que comprenden una hebra beta C que tiene la secuencia CELAYGI (SEQ ID NO: 14) , todos los demás clones comprenden una hebra beta C que tiene la secuencia CELTYGI (SEQ ID NO: 13) .

En algunas variantes en la familia 309, p. ej . , 342, el bucle FG se puede reemplazar por la SEQ ID NO : 139.

** En algunas variantes en la familia 311, el bucle BC se puede modificar para reemplazar la tirosina en la posición 21. Se contempla específicamente que los residuos aminoacídicos de reemplazo puedan tener una cadena lateral pequeña .

En algunas modalidades, las subunidades monoméricas de Tn3 específicas para CD40L de la invención consisten en la secuencia de aminoácidos: IEV (XAB) nALITW (XBC) nCELXiYGI (XCD) nTTIDL (XDE) nYSI (XEF) nYEVSLIC (XFG)nKETFTT donde : (a) ???» ¾C/ XCD; DE; ¾F y ¾G representan los residuos aminoacídicos presentes en las secuencias de los bucles AB, BC, CD, DE, EF y FG, respectivamente; (b) Xx representa un residuo aminoacídico de alanina (A) o treonina (T) ; y (c) la longitud del bucle n es un número entero comprendido entre 2 y 26.

En una modalidad, las hebras beta de la matriz de soporte de Tn3 monomérica específica para CD40L tienen al menos un 90% de identidad secuencial respecto a las hebras beta de la matriz de soporte de Tn3 original (SEQ ID NO: 3) . Para calcular tal porcentaje de identidad secuencial, las secuencias de aminoácidos se alinean aplicando métodos conocidos en la técnica. El porcentaje de identidad secuencial se define como la relación entre (a) el número de aminoácidos situados en las hebras beta que son idénticos en el alineamiento de secuencias y (b) el número total de aminoácidos situados en las hebras beta.

En una modalidad, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 136. En otra modalidad, la secuencia del bucle CD comprende la SEQ ID NO: 6. En otra modalidad, la secuencia del bucle EF comprende la SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 137. En una modalidad, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 136. En otra modalidad, la secuencia del bucle CD consiste en la SEQ ID NO: 6. En otra modalidad, la secuencia del bucle EF consiste en la SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 137.

En una modalidad, la secuencia del bucle BC comprende una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOS: 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 y 93. En otra modalidad, la secuencia del bucle BC consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs: 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 y 93.

En una modalidad, la secuencia del bucle DE comprende una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs : 94, 95, 96, 97 y 98. En otra modalidad, la secuencia del bucle DE consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs: 94, 95, 96, 97 y 98.

En una modalidad, la secuencia del bucle FG comprende una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs: 9, 99 y 139. En otra modalidad, la secuencia del bucle FG consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs : 9, 99 y 139.

En una modalidad, la secuencia del bucle BC comprende una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs: 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116 y 117. En otra modalidad, la secuencia del bucle BC consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs: 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116 y 117.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle DE comprende una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs : 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127 y 128. En otras modalidades, la secuencia del bucle DE consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs : 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127 y 128.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle FG comprende una secuencia seleccionada entre los grupos constituidos por las SEQ ID NOs: 129 y 130. En otras modalidades, la secuencia del bucle FG consiste en una secuencia seleccionada entre los grupos constituidos por las SEQ ID NOS: 129 y 130.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 83, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139. En algunas modalidades, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 83, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 9 o 139.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 83, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 99. En otras modalidades, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 83, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 99.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 84, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 95 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139. En otras modalidades, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 84, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 95 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 9 o 139.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 85, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139. En otras modalidades, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 85, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 9 o 139.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 86, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 96 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139. En otras modalidades, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 86, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 96 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 9 o 139.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 87, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 97 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139. En otras modalidades, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 87, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 97 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO : 9 o 139.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 88, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 95 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139. En otras modalidades, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 88, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 95 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 9 o 139.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 89, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139. En otras modalidades, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 89, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 9 o 139.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 90, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139. En otras modalidades, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 90, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 9 o 139.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 91, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 95 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139. En otras modalidades, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 91, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 95 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 9 o 139.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 92, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 98 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139. En otras modalidades, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 92, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 98 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 9 o 139.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 93, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139. En otras modalidades, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 93, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 9 o 139.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 168, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 169 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 170. En otras modalidades, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 168, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 169 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 170.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 100, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 118 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras modalidades, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 100, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 118 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 101, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 119 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras modalidades, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 101, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 119 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO : 129.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 102, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 120 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras modalidades, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 102, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO : 120 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 103, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 121 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras modalidades, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 103, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 121 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 104, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 122 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras modalidades, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 104, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 122 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 105, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 121 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras modalidades, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 105, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 121 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 106, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 123 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras modalidades, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 106, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 123 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 107, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 123 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras modalidades, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 107, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 123 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 108, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 118 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras modalidades, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 108, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 118 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 109, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 123 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras modalidades, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 109, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 123 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 110, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 121 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras modalidades, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 110, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 121 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 111, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 123 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 130. En otras modalidades, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 111, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 123 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 130.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 108, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 121 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras modalidades, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 108, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO : 121 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 112, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 124 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras modalidades, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 112, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 124 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 113, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 125 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras modalidades, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 113, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 125 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 114, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 118 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras modalidades, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 114, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 118 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 115, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 126 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras modalidades, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 115, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 126 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 116, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 127 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras modalidades, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 116, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 127 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 129.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 117, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 128 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129. En otras modalidades, la secuencia del bucle AB consiste en la SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 117, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 128 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO : 129.

En algunas modalidades, la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 174, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 175 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 177. En otras modalidades, la secuencia del bucle BC consiste en la SEQ ID NO: 174, la secuencia del bucle DE consiste en la SEQ ID NO: 175 y la secuencia del bucle FG consiste en la SEQ ID NO: 177.

En algunas modalidades, la subunidad monoraérica específica para CD40L comprende una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 y 146. En otras modalidades, la subunidad monomérica específica para CD40L consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs : 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 y 146.

En algunas modalidades, la subunidad monomérica específica para CD40L comprende la SEQ ID NO: 28 o 146. En otras modalidades, la subunidad monomérica específica para CD40L consiste en la SEQ ID NO: 28 o 146.

En algunas modalidades, las subunidades monoméricas de Tn3 específicas para CD40L de la invención comprenden la secuencia de aminoácidos : IEVKDVTDTTALITWX1DX2X3X4X5X6X7X8CELTYGIKDVPGDRTTIDLWX9HX10AX 11YSIGNLKPDTEYEVSLICRX12GDMSSNPAKETFTT (SEQ ID NO: 167) donde : (a) Xi representa un residuo aminoacídico de serina (S) o leucina (L) ; (b) X2 representa un residuo aminoacídico de ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E) ; (c) X3 representa un residuo aminoacídico de histidina (H) , isoleucina (I) , valina (V) , fenilalanina (F) o triptófano ( ) ; (d) X4 representa un residuo aminoacídico de alanina (A) , glicina (G) , ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) ; (e) X5 representa un residuo aminoacídico de ácido glutámico (E) , leucina (L) , glutamina (Q) , serina (S) , ácido aspártico (D) o asparagina (N) ; (f) X6 representa un residuo aminoacídico de fenilalanina (F) o tirosina (Y) ; (g) X7 representa un residuo aminoacídico de isoleucina (I) , valina (V) , histidina (H) , ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) ; (h) X8 representa un residuo aminoacídico de glicina (G) , triptófano ( ) o valina (V) ; (i) X9 representa un residuo aminoacídico de triptófano (W) , fenilalanina (F) o tirosina (Y) ; (j) Xio representa un residuo aminoacídico de serina (S) , glutamina (Q) , metionina (M) o histidina (H) ; (k) Xn representa un residuo aminoacídico de triptófano (W) o histidina (H) ; y (1) Xi2 representa un residuo aminoacídico de arginina (R) o serina (S) .

En algunas modalidades, las subunidades monoméricas de Tn3 específicas para CD40L de la invención consisten en la secuencia de aminoácidos : IEVKDVTDTTALITWXiDX2X3X4X5X6X7X8CELTYGIKDVPGDRTTIDLWX9HXioAX nYSIGNLKPDTEYEVSLICRXi2GDMSSNPAKETFTT (SEQ ID NO: 167) donde : (a) Xi representa un residuo aminoacídico de serina (S) o leucina (L) ; (b) X2 representa un residuo aminoacídico de ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E) ; (c) X3 representa un residuo aminoacídico de histidina (H) , isoleucina (I) , valina (V) , fenilalanina (F) o triptófano (W) ; (d) X4 representa un residuo aminoacídico de alanina (A) , glicina (G) , ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) ; (e) X5 representa un residuo aminoacídico de ácido glutámico (E) , leucina (L) , glutamina (Q) , serina (S) , ácido aspártico (D) o asparagina (N) ; (f) X6 representa un residuo aminoacídico de fenilalanina (F) o tirosina (Y) ; (g) X7 representa un residuo aminoacídico de isoleucina (I) , valina (V) , histidina (H) , ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) ; (h) X8 representa un residuo aminoacídico de glicina (G) , triptófano (W) o valina (V) ; (i) X9 representa un residuo aminoacídico de triptófano (W) , fenilalanina (F) o tirosina (Y) ; (j) Xio representa un residuo aminoacídico de serina (S) , glutamina (Q) , metionina (M) o histidina (H) ; (k) Xn representa un residuo aminoacídico de triptófano (W) o histidina (H) ; y (1) Xi2 representa un residuo aminoacídico de arginina (R) o serina (S) .

En algunas modalidades, la subunidad monomérica específica para CD40L comprende una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs : 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 y 82. En algunas modalidades, la subunidad monomérica específica para CD40L consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs : 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 y 82.

En algunas modalidades, las subunidades monoméricas de Tn3 específicas para CD40L de la invención comprenden la secuencia de aminoácidos : IEVX1DVTDTTALITWX2X3RSX4X5X6 7 8 9 ioCELXiiYGIKDVPGDRTTIDLX12 Xi3Xi4Xi5YVHYSIGNLKPDTXi6YEVSLICLTTDGTYX17NPAKETFTT (SEQ ID NO: 171) donde : (a) Xi representa un residuo aminoacídico de lisina (K) o ácido glutámico (E) ; (b) X2 representa un residuo aminoacídico de treonina (T) o isoleucina (I) ; (c) X3 representa un residuo aminoacídico de asparagina (N) o alanina (A) ; (d) X4 representa un residuo aminoacídico de serina (S) , leucina (L) , alanina (A) , fenilalanina (F) o tirosina (Y) ; (e) X5 representa un residuo aminoacídico de tirosina (Y) , alanina (A) , glicina (G) , valina (V) , isoleucina (I) o serina (S) ; (f) X6 representa un residuo aminoacídico de tirosina (Y) , serina (S) , alanina (A) o histidina (H) ; (g) X7 representa un residuo aminoacídico de asparagina (N) , ácido aspártico (D) , histidina (H) o tirosina (Y) ; (h) X8 representa un residuo aminoacídico de leucina (L) , fenilalanina (F) , histidina (H) o tirosina (Y) ; (i) X9 representa un residuo aminoacídico de histidina (H) , prolina (P) , serina (S) , leucina (L) o ácido aspártico (D) ; (j) Xio representa un residuo aminoacídico de glicina (G) , fenilalanina (F) , histidina (H) o tirosina (Y) ; (k) Xn representa un residuo aminoacídico de alanina (A) o treonina (T) ; (1) Xi2 representa un residuo aminoacídico de serina (S) , asparagina (N) , ácido glutámico (E) , arginina (R) o ácido aspártico (D) ; (m) X13 representa un residuo aminoacídico de serina (S) , glutamina (Q) , treonina (T) , asparagina (N) o alanina (A) ; (n) ??4 representa un residuo aminoacídico de prolina (P) , valina (V) , isoleucina (I) o alanina (A) o ningún aminoácido; (o) Xi5 representa un residuo aminoacídico de isoleucina (I) o ningún aminoácido; (p) Xi6 representa un residuo aminoacídico de ácido glutámico (E) o lisina (K) ; y (q) i7 representa un residuo aminoacídico de serina (S) o asparagina (N) .

En algunas modalidades, las subunidades monoméricas de Tn3 específicas para CD40L de la invención consisten en la secuencia de aminoácidos: IEVX1DVTDTTALITWX2X3RSX4X5X6X7X8X9XioCELXiiYGI KDVPGDRTTIDLX12 Xi3Xi4X15YVHYSIGNLKPDTXi6YEVSLICLTTDGTYXi7NPAKETFTT (SEQ ID NO: 171) donde : (a) ?? representa un residuo aminoacídico de lisina (K) o ácido glutámico (E) ; (b) X2 representa un residuo aminoacídico de treonina (T) o isoleucina (I) ; (c) X3 representa un residuo aminoacídico de asparagina (N) o alanina (A) ; (d) X4 representa un residuo aminoacídico de serina (S) , leucina (L) , alanina (A) , fenilalanina (F) o tirosina (Y) ; (e) X5 representa un residuo aminoacídico de tirosina (Y) , alanina (A) , glicina (G) , valina (V) , isoleucina (I) o serina (S) ; (f) X6 representa un residuo aminoacídico de tirosina (Y) , serina (S) , alanina (A) o histidina (H) ; (g) X7 representa un residuo aminoacídico de asparagina (N) , ácido aspártico (D) , histidina (H) o tirosina (Y) ; (h) X8 representa un residuo aminoacídico de leucina (L) , fenilalanina (F) , histidina (H) o tirosina (Y) ; (i) X9 representa un residuo aminoacídico de histidina (H) , prolina (P) , serina (S) , leucina (L) o ácido aspártico (D) ; (j) Xio representa un residuo aminoacídico de glicina (G) , fenilalanina (F) , histidina (H) o tirosina (Y) ; (k) Xn representa un residuo aminoacídico de alanina (A) o treonina (T) ; (1) Xi2 representa un residuo aminoacídico de serina (S) , asparagina (N) , ácido glutámico (E) , arginina (R) o ácido aspártico (D) ; (m) Xi3 representa un residuo aminoacídico de serina (S) , glutamina (Q) , treonina (T) , asparagina (N) o alanina (A) ; (n) Xi4 representa un residuo aminoacídico de prolina (P) , valina (V) , isoleucina (I) o alanina (A) o ningún aminoácido; (o) Xi5 representa un residuo aminoacídico de isoleucina (I) o ningún aminoácido; (p) ??? representa un residuo aminoacídico de ácido glutámico (E) o lisina (K) ; y (q) Xi7 representa un residuo aminoacídico de serina (S) o asparagina (N) .

En algunas modalidades, una matriz de soporte monomérica específica para CD40L comprende un módulo de Tn3 en el que una o más hebras beta comprenden al menos una sustitución aminoacídica salvo que los residuos de cisteína en las hebras beta C y F (SEQ ID NOs : 13 o 14; y la SEQ ID NO: 17, respectivamente) no se pueden sustituir.

Los bucles que conectan las diferentes hebras beta de una subunidad monomérica específica para CD40L se pueden aleatorizar en longitud y/o diversidad secuencial. En una modalidad, una subunidad monomérica específica para CD40L tiene al menos un bucle que está aleatorizado en longitud y/o diversidad secuencial. En una modalidad, al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis bucles de una subunidad monomérica específica para CD40L están aleatorizados en longitud y/o diversidad secuencial. En una modalidad, al menos un bucle de una subunidad monomérica específica para CD40L se mantiene constante, mientras que al menos un bucle adicional está aleatorizado en longitud y/o diversidad secuencial. En otra modalidad, al menos uno, al menos dos o los tres bucles AB, CD y EF se mantienen constantes, mientras que al menos uno, al menos dos o los tres bucles BC, DE y FG están aleatorizados en longitud o diversidad secuencial. En otra modalidad, al menos uno, al menos dos o al menos los tres bucles AB, CD y EF están aleatorizados, mientras que al menos uno, al menos dos o los tres bucles BC, DE y PG están aleatorizados en longitud y/o diversidad secuencial. En otra modalidad más, al menos uno, al menos dos, al menos tres de los bucles, al menos cuatro, al menos cinco o los seis bucles AB, CD, EF, BC, DE y FG están aleatorizados en longitud o diversidad secuencial.

En algunas modalidades, uno o más residuos dentro de un bucle se mantienen constantes, mientras que los otros residuos están aleatorizados en longitud y/o diversidad secuencial. En algunas modalidades, uno o más residuos dentro de un bucle se mantienen con un número limitado y predeterminado de aminoácidos diferentes, mientras que los otros residuos están aleatorizados en longitud y/o diversidad secuencial. Por consiguiente, una subunidad monomérica específica para CD40L de la invención puede comprender uno o más bucles que tengan una secuencia consenso degenerada y/o uno o más residuos aminoacídicos invariantes.

En una modalidad, la subunidad monomérica específica para CD40L de la invención comprende un bucle AB que está aleatorizado. En otra modalidad, la subunidad monomérica específica para CD40L de la invención comprende un bucle BC que está aleatorizado. En una modalidad, la subunidad monomérica específica para CD40L de la invención comprende un bucle CD que está aleatorizado. En una modalidad, la subunidad monomérica específica para CD40L de la invención comprende un bucle DE que está aleatorizado. En una modalidad, la subunidad monomérica específica para CD40L de la invención comprende un bucle EF que está aleatorizado.

En ciertas modalidades, la subunidad monomérica específica para CD40L de la invención comprende un bucle FG que se mantiene de modo que tenga al menos un residuo aminoacídico menos que el bucle FG cognado del tercer dominio FnlII de la tenascina C humana y además está aleatorizado en una o más posiciones.

En modalidades específicas, al menos uno de los bucles BC, DE y FG está aleatorizado, donde la hebra beta A comprende la SEQ ID NO: 10 u 11, la hebra beta B comprende la SEQ ID NO: 12, la hebra beta C comprende la SEQ ID NO: 13 o 14, la hebra beta D comprende la SEQ ID NO: 15, la hebra beta E comprende la SEQ ID NO: 16, la hebra beta F comprende la SEQ ID NO: 17 y la hebra beta G comprende la SEQ ID NO: 18, el bucle AB comprende la SEQ ID NO: 4 o 136, el bucle CD comprende la SEQ ID NO: 6 y el bucle EF comprende la SEQ ID NO:8 o 137.

En otras modalidades específicas, al menos uno de los bucles AB, CD y EF está aleatorizado, donde la hebra beta A comprende la SEQ ID NO: 10 u 11, la hebra beta B comprende la SEQ ID NO: 12, la hebra beta C comprende la SEQ ID NO: 13 o 14, la hebra beta D comprende la SEQ ID NO: 15, la hebra beta E comprende la SEQ ID NO: 16, la hebra beta F comprende la SEQ ID NO: 17 y la hebra beta G comprende la SEQ ID NO: 18, el bucle BC comprende la SEQ ID NO: 5, el bucle DE comprende la SEQ ID NO: 7 y el bucle FG comprende la SEQ ID NO : 9 o 139.

Aumento de la estabilidad de las matrices de soporte La estabilidad de las matrices de soporte de Tn3 se puede incrementar mediante numerosos métodos diferentes. En algunas modalidades, las matrices de soporte de Tn3 de la invención se estabilizan elongando las regiones amino- y/o carboxiterminal . Las regiones amino- y/o carboxiterminales se pueden elongar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de 10 aminoácidos. En otras modalidades, las matrices de soporte de Tn3 de la invención se pueden estabilizar introduciendo una alteración que incremente la semivida sérica, tal como se ha descrito en la presente. En otra modalidad adicional, las matrices de soporte de Tn3 de la invención comprenden una adición, deleción o sustitución de al menos un residuo aminoacídico para estabilizar el núcleo hidrófobo de la matriz de soporte.

Las matrices de soporte de Tn3 de la invención se pueden estabilizar eficazmente creando enlaces disulfuro no naturales tal como se describe en la Solicitud de Patente Internacional N.° PCT/US2011/032184. En algunas modalidades, las matrices de soporte de la invención comprenden enlaces disulfuro de origen no natural, tal como se describe en la Publicación de PCT N.°: O 2009/058379. Se puede utilizar un método bioinformático para identificar posiciones candidatas adecuadas para crear enlaces disulfuro.

En una modalidad, una subunidad monomérica de Tn3 de la invención comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco enlaces disulfuro intramoleculares de origen no natural. En una modalidad, una subunidad monomérica de Tn3 de la invención comprende al menos un enlace disulfuro intramolecular de origen no natural, donde el enlace disulfuro de origen no natural estabiliza el monómero. En otra modalidad adicional, las matrices de soporte de Tn3 de la invención comprenden al menos un enlace disulfuro de origen no natural, donde el enlace está situado entre dos matrices de soporte de Tn3 monoméricas o multiméricas diferentes, es decir, el enlace disulfuro es un enlace disulfuro intermolecular. Por ejemplo, un enlace disulfuro puede unir matrices de soporte diferentes (por ejemplo, dos matrices de soporte monoméricas específicas para CD40L) , una matriz de soporte de Tn3 y un conector, una matriz de soporte de Tn3 y un dominio Fe, o una matriz de soporte de Tn3 y un anticuerpo o un fragmento de este.

En algunas modalidades, las matrices de soporte de Tn3 de la invención comprenden al menos un enlace disulfuro intermolecular de origen no natural que une una subunidad monomérica de Tn3 y un resto heterologo aislado, una subunidad monomérica de Tn3 y un resto heterologo fusionado o conjugado con la misma matriz de soporte de Tn3, o una subunidad monomérica de Tn3 y un resto heterologo fusionado o conjugado con una matriz de soporte de Tn3 diferente.

En algunas modalidades, las matrices de soporte de Tn3 de la invención comprenden un enlace disulfuro que forma una matriz de soporte de Tn3 multimérica constituida por al menos 2, al menos 3, al menos 4 o más subunidades monoméricas.

En otra modalidad, las matrices de soporte de Tn3 de la invención pueden comprender una elongación de las regiones aminoterminal y/o carboxiterminal . En una modalidad, la matriz de soporte de Tn3 de la invención comprende una alteración para incrementar la semivida sérica, tal como se ha descrito en la presente. En otra modalidad adicional, las matrices de soporte de la invención comprenden una adición, deleción o sustitución de al menos un residuo aminoacídico para estabilizar el núcleo hidrófobo de la matriz de soporte.

Mediciones de la estabilidad La estabilidad de las subunidades monoméricas de Tn3 de la invención, aisladas o como parte de una matriz de soporte de Tn3 multimérica, se puede medir fácilmente mediante técnicas conocidas en la técnica, tales como la desnaturalización térmica (Tm) y caotrópica (tal como el tratamiento con sales de guanidina o urea) , el tratamiento con proteasas (tal como el tratamiento con termolisina) u otra metodología aceptada en la técnica para determinar la estabilidad de una proteína. Se puede encontrar una revisión exhaustiva de técnicas empleadas para medir la estabilidad de una proteína, por ejemplo, en "Current Protocols in Molecular Biology" y "Current Protocols in Protein Science" de John Wiley and Sons. 2007.

Matrices de soporte de Tn3 multiméricas Un aspecto de la presente invención proporciona matrices de soporte de Tn3 multiméricas que comprenden al menos dos subunidades monoméricas de Tn3 de la invención unidas en tándem y donde al menos uno de los monómeros es una subunidad monomérica específica para CD40L. Tales matrices de soporte de Tn3 multiméricas se pueden preparar en múltiples formatos. En un aspecto específico, la invención proporciona matrices de soporte de Tn3 multiméricas, donde al menos dos subunidades monoméricas específicas para CD40L están conectadas en tándem a través de un conector peptídico. En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 multimérica exhibe un incremento en la valencia y/o la avidez de unión a la diana u otra acción de la diana o las dianas. En algunas modalidades, el incremento en la valencia y/o la avidez de la unión a la diana se consigue al unir múltiples subunidades monoméricas a la misma diana. En algunas modalidades, el incremento en la valencia mejora una acción específica sobre la diana, tal como el incremento de la dimerización de una proteína diana.

En una modalidad específica, una matriz de soporte de Tn3 multimérica de la invención comprende al menos dos subunidades monoméricas específicas para CD40L conectadas en tándem, donde cada subunidad monomérica específica para CD40L se une al menos a una diana y donde cada subunidad monomérica específica para CD40L comprende una pluralidad de hebras beta unidas a una pluralidad de regiones de bucles, donde al menos un bucle es una variante de origen no natural del bucle cognado en la matriz de soporte de Tn3 original (SEQ ID NO: 3).

En una modalidad, las matrices de soporte de Tn3 multiméricas se generan mediante una unión covalente entre subunidades monoméricas específicas para CD40L, por ejemplo, mediante una unión directa de las subunidades monoméricas específicas para CD40L o mediante la inclusión de un conector, p. ej . , un conector peptídico. En ejemplos particulares, las matrices de soporte de CD40L unidas covalentemente se generan construyendo genes de fusión que codifican las subunidades monoméricas específicas para CD40L o, como alternativa, creando codones para residuos de cisteína en las subunidades monoméricas específicas para CD40L y permitiendo que se formen enlaces disulfuro entre los productos de expresión.

En una modalidad, las matrices de soporte de Tn3 multiméricas de la invención comprenden al menos dos subunidades monoméricas específicas para CD40L que están conectadas directamente entre sí sin ningún aminoácido interpuesto adicional. En otra modalidad, las matrices de soporte de Tn3 multiméricas de la invención comprenden al menos dos subunidades monoméricas específicas para Cd40L que están conectadas en tándem a través de un conector, p. ej . , un conector peptídico.

En una modalidad específica, las matrices de soporte de Tn3 multiméricas de la invención comprenden al menos dos subunidades monoméricas específicas para CD40L que están conectadas en tándem a través de un conector peptídico, donde el conector peptídico comprende de 1 a aproximadamente 1000, 0 de 1 aproximadamente 500, o de 1 aproximadamente 250, o de 1 aproximadamente 100, o de 1 aproximadamente 50, o de 1 aproximadamente 25 aminoácidos. En una modalidad específica, la matriz de soporte de Tn3 multimérica comprende al menos dos subunidades monoméricas específicas para CD40L que están conectadas en tándem a través de un conector peptídico, donde el conector peptídico comprende de 1 a aproximadamente 20, o de 1 aproximadamente 15, o de 1 aproximadamente 10, o de 1 aproximadamente 5 aminoácidos .

En una modalidad específica, la matriz de soporte de Tn3 multimérica comprende al menos dos subunidades monoméricas específicas para CD40L que están conectadas en tándem a través de un conector, p. ej . , un conector peptídico, donde el conector es un resto funcional. El resto funcional se seleccionará en función de las características y/o la función deseadas de la matriz de soporte de Tn3 multimérica. Por ejemplo, se puede utilizar un resto funcional útil para la purificación (p. ej . , un marcador de histidina) como conector. Los restos funcionales útiles como conectores incluyen, sin carácter limitante, polietilenglicol (PEG) , un agente citotóxico, un radionucleido, un contraste, biotina, un dominio de dimerización, albúmina sérica humana (HSA) o una de sus porciones de unión a FcRn, un dominio o fragmento de un anticuerpo, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo de un dominio, un dominio de unión a albúmina, una molécula de IgG, una enzima, un ligando, un receptor, un péptido de unión, una matriz de soporte que no sea de Tn3 , un epítopo marcador, un polímero polipeptídico recombinante , una citocina y similares. Los conectores peptídicos y restos funcionales específicos que se pueden utilizar como conectores se describen más adelante.

En modalidades específicas, el resto funcional es una inmunoglobulina o uno de sus fragmentos. En algunas modalidades, la inmunoglobulina o su fragmento comprende un dominio Fe. En algunas modalidades, el dominio FcR no consigue inducir al menos una función efectora mediada por FcyR tal como ADCC (siglas en inglés para, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos) . En la técnica hay constancia de que el dominio Fe se puede alterar para reducir o suprimir al menos una función efectora mediada por FcyR, remítase, por ejemplo, a las Pat. de EE. UU. N.os 5.624.821 y 6.737.056.

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 multimérica comprende al menos dos subunidades monoméricas específicas para CD40L que están conectadas a través de uno o más conectores, donde los conectores interpuestos entre cada subunidad monomérica específica para CD40L pueden ser los mismos conectores o conectores diferentes. En algunas modalidades, un conector puede comprender múltiples conectores, que pueden ser el mismo conector o conectores diferentes. En algunas modalidades, cuando una pluralidad de conectores se concatenan, algunos o todos los conectores pueden ser restos funcionales.

Estequiometría de la unión de las matrices de soporte En algunas modalidades, una matriz de soporte de Tn3 monomérica o multimérica puede comprender una subunidad monomérica específica para CD40L para epítopos diferentes, que pueden ser epítopos diferentes en una única molécula de CD40L o en moléculas diana de CD40L diferentes. En algunas modalidades, una matriz de soporte de Tn3 multimérica puede comprender subunidades monoméricas específicas para CD40L donde cada subunidad tenga como diana uno o más epítopos diferentes en una o más moléculas de CD40L.

En otras modalidades, una matriz de soporte de Tn3 monomérica o multimérica puede unirse a dos o más epítopos diferentes en la misma molécula de CD40L. En algunas modalidades, los epítopos diferentes son epítopos no superpuestos. En otras modalidades, los epítopos diferentes son epítopos superpuestos.

En otra modalidad adicional específica, una matriz de soporte de Tn3 monomérica o multimérica se puede unir a uno o más epítopos en una molécula de CD40L y se puede unir además a uno o más epítopos en una segunda molécula de CD40L. En algunas modalidades, las diferentes moléculas diana forman parte de un complejo oligomérico, p. ej . , un complejo de CD40L trimérico.

En otra modalidad específica más, una matriz de soporte de Tn3 monomérica o multimérica se puede unir a un único epítopo en un trímero de CD40L. En otra modalidad adicional, una matriz de soporte de Tn3 monomérica o multimérica se puede unir al mismo epítopo en al menos dos trímeros de CD40L.

En ciertas modalidades, una matriz de soporte de Tn3 monomérica o multimérica se puede unir al mismo epítopo en dos o más copias de una molécula de CD40L en una superficie celular adyacente. En ciertas modalidades, una matriz de soporte de Tn3 monomérica o multimérica se puede unir al mismo epítopo en dos o más copias de una molécula de CD40L en solución. En algunas modalidades, una matriz de soporte de Tn3 monomérica o multimérica se puede unir al mismo epítopo o a epítopos diferentes en CD40L con afinidades y/o avideces de unión idénticas o diferentes.

En otra modalidad, una matriz de soporte de Tn3 monomérica o multimérica se puede unir a epítopos en una o más copias de CD40L y conseguir o incrementar (p. ej . , sinérgicamente) una acción deseada sobre la diana, p. ej . , prevenir la unión a un receptor o prevenir la oligomerización.

Además, cuando una matriz de soporte de Tn3 monomérica o multimérica de la invención comprende una pluralidad de subunidades monoméricas específicas para CD40L, p. ej . , monómeros diferentes donde cada monómero tiene como diana epítopos diferentes en CD40L, tales subunidades monoméricas se pueden disponer de acuerdo con un patrón determinado o una orientación especial para conseguir o incrementar un efecto biológico determinado. Tales combinaciones de subunidades monoméricas se pueden organizar y evaluar subsecuentemente utilizando métodos conocidos en la técnica.

Fusiones La invención proporciona matrices de soporte de Tn3 en las que al menos una subunidad monomérica específica para CD40L puede estar fusionada con un resto heterólogo. En este contexto, el resto heterólogo no se utiliza como espaciador para unir las matrices de soporte sino que puede proporcionar funcionalidad adicional a la matriz de soporte de Tn3. En algunas modalidades, un resto heterólogo también puede funcionar como conector. La presente invención abarca el uso de matrices de soporte de Tn3 conjugadas o fusionadas con uno o más restos heterólogos que incluyen, sin carácter limitante, péptidos, polipéptidos , proteínas, proteínas de fusión, moléculas de ácidos nucleicos, moléculas de bajo peso molecular, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgánicas y moléculas orgánicas. Por consiguiente, la invención proporciona polipéptidos que comprenden uno o más monómeros de Tn3 específicos para CD40L, que incluyen, sin carácter limitante, las proteínas de fusión que se describen en la presente.

La presente invención abarca el uso de matrices de soporte de Tn3 fusionadas recombinantemente o conjugadas químicamente con una proteína o un polipéptido heterologos, o uno de sus fragmentos. La conjugación incluye tanto la conjugación covalente como no covalente. En algunas modalidades, una matriz de soporte de Tn3 se puede fusionar o conjugar químicamente con un polipéptido de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos 500 o al menos 1000 aminoácidos para generar proteínas de fusión.

La fusión o conjugación de una matriz de soporte de Tn3 con uno o más restos heterologos puede ser directa, es decir, sin un conector interpuesto entre una matriz de soporte de Tn3 y un resto heterólogo, o a través de una o más secuencias conectoras descritas en la presente. En algunas modalidades, se pueden utilizar matrices de soporte para dirigir polipéptidos heterólogos a tipos de células particulares, ya sea in vitro o in vivo, mediante la fusión o conjugación de matrices de soporte de Tn3 con anticuerpos específicos para receptores de la superficie celular particulares en las células diana.

Las matrices de soporte de Tn3 fusionadas o conjugadas con polipéptidos heterólogos también se pueden utilizar en inmunoensayos in vitro y métodos de purificación utilizando métodos conocidos en la técnica. Remítase, p. ej . , a la Publicación Internacional N.° WO 93/21232; la Patente Europea N.° EP 439.095; Naramura et al., Immunol . Lett. 39:91-99, 1994; la Pat. de EE. UU. N.° 5.474.981; Gillies et al., PNAS 89:1428-1432, 1992; y Fell et al., J. Immunol. 146:2446-2452, 1991, las cuales se incorporan en su totalidad por referencia .

En algunas modalidades, las matrices de soporte de Tn3 se pueden integrar en la respuesta inmunitaria humana mediante la fusión o conjugación de una matriz de soporte con una inmunoglobulina o un dominio de esta incluida, sin carácter limitante, la región constante de una IgG (Fe), p. ej . , a través del extremo M o C. De forma análoga, se puede utilizar una fusión entre una matriz de soporte de Tn3 y una proteína de complemento, tal como CIq, para actuar sobre las células.

Varias publicaciones describen métodos para obtener moléculas fisiológicamente activas cuyas semividas se modifican introduciendo un polipéptido de unión a FcRn en las moléculas (remítase, p. ej . , a WO 97/43316; Pat. de EE . UU. N.° 5.869.046; Pat. de EE . UU. N.° 5.747.035; WO 96/32478; y WO 91/14438) , fusionando las moléculas con anticuerpos cuyas afinidades de unión a FcRn se conservan pero las afinidades por otros receptores Fe se han reducido en gran medida (remítase, p. ej . , a WO 99/43713) o fusionando las moléculas con dominios de unión a FcRn de anticuerpos (remítase, p. ej . , a WO 00/09560; la Pat . de EE. UU. N.° 4.703.039). También se pueden encontrar técnicas y métodos específicos para incrementar la semivida de las moléculas fisiológicamente activas en la Patente de EE. UU. N.° 7.083.784. Específicamente, se contempla que las matrices de soporte de Tn3 se pueden fusionar a una región Fe de una IgG, donde la región Fe comprende las mutaciones en residuos aminoacídicos M252Y/S254T/T256E o H433K/N434F/Y436H, donde las posiciones aminoacídicas se designan de acuerdo con los esquemas de numeración de Kabat . Se contempla específicamente la fusión de una matriz de soporte de Tn3 con una variante del dominio Fe que no es capaz de inducir ADCC.

En algunas modalidades, la semivida de la matriz de soporte de Tn3 se puede incrementar genéticamente mediante la fusión de la matriz de soporte de Tn3 con un polipéptido recombinante no estructurado intrínsicamente (p. ej . , un polipéptido XTEN™) o mediante la conjugación con polietilenglicol (PEG) .

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 se puede fusionar con moléculas que incrementan o extienden la semivida sérica o in vivo. En algunas modalidades, la matriz de soporte se puede fusionar o conjugar con albúmina, tal como albúmina sérica humana (HSA) , uno de sus fragmentos de unión al receptor neonatal Fe (FcRn) , PEG, polisacáridos , anticuerpos, complemento, hemoglobina, un péptido de unión, lipoproteínas y otros factores para incrementar su semivida en el torrente sanguíneo y/o su penetración tisular. Cualquiera de estas fusiones se puede generar mediante técnicas estándar, por ejemplo, mediante la expresión de la proteína de fusión a partir de un gen de fusión recombinante construido utilizando secuencias génicas de acceso público.

En algunas modalidades, se puede mejorar una propiedad de la matriz de soporte de Tn3 mediante la conjugación o fusión con una variante de HSA, es decir, una molécula derivada de la HSA completa (SEQ ID NO: 139) que comprende al menos una sustitución aminoacídica, una deleción o una truncación de la secuencia.

En algunas modalidades, la propiedad mejorada mediante la conjugación con una variante de HSA es la semivida plasmática. La mejora en la semivida plasmática de la matriz de soporte de Tn3 puede ser una alteración en la propiedad tal como un incremento o una reducción de la semivida plasmática, o cambios en otros parámetros farmacocinéticos . En algunas modalidades, la variante de HSA es un mutante derivado de la HSA completa (SEQ ID NO: 138) . En una modalidad específica, la variante de HSA comprende una sustitución de cisteína en la posición 34 por serina (SEQ ID NO: 133) . Las variantes de HSA que se pueden utilizar para modificar la semivida plasmática de una matriz de soporte de Tn3 se describen, p. ej . , en las Publicaciones Internacionales WO 2011/103076 y WO 2011/051489, las cuales se incorporan en su totalidad por referencia. En algunas modalidades, la semivida plasmática de una matriz de soporte de Tn3 de la invención se incrementa fusionándola con una variante de HSA que comprende al menos una sustitución aminoacídica en el dominio III de la HSA.

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 de la invención comprende una variante de HSA que comprende la secuencia de la HSA madura completa (SEQ ID NO: 138) o un fragmento de esta, salvo por al menos una sustitución aminoacídica, numerada respecto a la posición en la HSA madura completa, en una posición seleccionada entre el grupo constituido por 407, 415, 463, 500, 506, 508, 509, 511, 512, 515, 516, 521, 523, 524, 526, 535, 550, 557, 573, 574 y 580; donde la sustitución aminoacídica no comprende sustituir una lisina (K) por ácido glutámico (E) en la posición 573, y donde la matriz de soporte de Tn3 tiene una semivida plasmática más prolongada que la semivida plasmática de una matriz de soporte de Tn3 que no está conjugada con la variante de HSA.

En algunas modalidades diferentes, al menos una sustitución aminoacídica, numerada respecto a la posición en la HSA madura completa, se encuentra en una posición seleccionada entre el grupo constituido por 463, 508, 523 y 524, donde la matriz de soporte de Tn3 tiene una semivida plasmática más prolongada que la semivida plasmática de una matriz de soporte de Tn3 que no está conjugada con la variante de HSA.

En otras modalidades, una matriz de soporte de Tn3 de la invención comprende una variante de HSA que comprende la secuencia de la HSA madura completa (SEQ ID NO: 133 o 138) o un fragmento de esta, salvo por al menos una sustitución aminoacídica, numerada respecto a la posición en la HSA madura completa, seleccionada entre el grupo constituido por: (a) sustitución de leucina (L) en la posición 407 por asparagina (N) o tirosina (Y) ; (b) sustitución de valina (V) en la posición 415 por treonina (T) ; (c) sustitución de leucina (L) en la posición 463 por asparagina (N) ; (d) sustitución de lisina (K) en la posición 500 por arginina (R) ; (e) sustitución de treonina (T) en la posición 506 por tirosina (Y) ; (f) sustitución de treonina (T) en la posición 508 por arginina (R) ; (g) sustitución de fenilalanina (F) en la posición 509 por metionina (M) o triptófano (W) ; (h) sustitución de alanina (A) en la posición 511 por fenilalanina (F) ; (i) sustitución de ácido aspártico (T) en la posición 512 por tirosina (Y) ; (j) sustitución de treonina (T) en la posición 515 por glutamina (Q) ; (k) sustitución de leucina (L) en la posición 516 por treonina (T) o triptófano ( ) ; (1) sustitución de arginina (R) en la posición 521 por triptófano (W) ; (m) sustitución de isoleucina (I) en la posición 523 por ácido aspártico (D) , ácido glutámico (E) , glicina (G) , lisina (K) o arginina (R) ; (n) sustitución de lisina (K) en la posición 524 por leucina (L) ; (o) sustitución de glutamina (Q) en la posición 526 por metionina (M) ; (p) sustitución de histidina (H) en la posición 535 por prolina (P) ; (q) sustitución de ácido aspártico (T) en la posición 550 por ácido glutámico (E) ; (r) sustitución de lisina (K) en la posición 557 por glicina (G) ; (s) sustitución de lisina (K) en la posición 573 por fenilalanina (F) , histidina (H) , prolina (P) , triptófano (W) o tirosina (Y) ; (t) sustitución de lisina (K) en la posición 574 por asparagina (N) ; (u) sustitución de glutamina (Q) en la posición 580 por lisina (K) ; y (v) una combinación de dos o más de estas sustituciones, donde la matriz de soporte de Tn3 tiene una semivida plasmática más prolongada que la semivida plasmática de una matriz de soporte de Tn3 no conjugada con la variante de HSA.

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 comprende una variante de HSA que comprende la secuencia de la HSA madura completa (SEQ ID NO: 133 o 138) o un fragmento de esta, salvo por al menos una sustitución aminoacídica, numerada respecto a la posición en la HSA madura completa, seleccionada entre el grupo constituido por: (a) sustitución de leucina (L) en la posición 463 por asparagina (N) ; (b) sustitución de treonina (T) en la posición 508 por arginina (R) ; (c) sustitución de isoleucina (I) en la posición 523 por ácido aspártico (D) , ácido glutámico (E) , glicina (G) , lisina (K) o arginina (R) ; (d) sustitución de lisina (K) en la posición 524 por leucina (L) ; y (e) una combinación de dos o más de estas sustituciones, donde la matriz de soporte de Tn3 tiene una semivida plasmática más prolongada que la semivida plasmática de una matriz de soporte de Tn3 no conjugada con la variante de HSA.

Es más, las matrices de soporte de Tn3 de la invención se pueden fusionar con secuencias marcadoras, tales como un péptido para facilitar la purificación. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido polihistidínico (marcador His) , p. ej . , un marcador de octahistidina (marcador His-8) o marcador de hexahistidina (marcador His- 6) tal como el marcador proporcionado en un vector de expresión pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif , 91311) , entre otros vectores, muchos de los cuales se comercializan. Tal como se describe en Gentz et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EE. UU. 86:821-824, 1989, por ejemplo, la polihistidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otros marcadores peptídicos útiles para la purificación incluyen, sin carácter limitante, un marcador de hemaglutinina ("HA"), que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe (remítase, p. ej . , a Wilson et al., Cell 37:767, 1984), un marcador FLAG, un marcador de estreptavidina , un marcador myc , un marcador V5 , un marcador GFP, un marcador AU1, un marcador AU5, un marcador ECS, un marcador GST o un marcador OLLAS .

Se pueden generar otras proteínas de fusión que comprenden matrices de soporte de Tn3 de la invención mediante técnicas de transposición genética, transposición de motivos, transposición de exones y/o transposición de codones (denominados colectivamente "transposición de ADN") .

La transposición de ADN se puede emplear para alterar la acción de las matrices de soporte de Tn3 sobre la diana (p. ej . , generar matrices de soporte con afinidades superiores y velocidades de disociación inferiores) . Las matrices de soporte de Tn3 se pueden alterar mediante mutagénesis aleatoria por PCR propensa a errores, inserción de nucleótidos al azar u otros métodos antes de la recombinación. Una o más porciones de un polinucleótido que codifica una matriz de soporte, que se une a una diana específica se puede recombinar con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o más moléculas heterólogas .

Fusiones con dominios Fe y anticuerpos En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 de la invención comprende una subunidad monomérica específica para CD40L fusionada con un dominio o fragmento de un anticuerpo (p. ej . , una IgG) , incluido, sin carácter limitante, un dominio Fe.

En algunas modalidades, solamente una subunidad monomérica específica para CD40L se conjuga o fusiona con un dominio o fragmento de un anticuerpo. Por ejemplo, una única subunidad monomérica específica para CD40L se puede fusionar con el extremo N de un polipéptido de un dominio o fragmento de un anticuerpo (p. ej . , una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo) . En otras modalidades, las matrices de soporte de Tn3 se crean fusionando o conjugado una o más subunidades monoméricas específicas para CD40L con el extremo N y/o el extremo C de un polipéptido de un dominio o fragmento de un anticuerpo (p. ej . , una cadena pesada y/o una cadena ligera de un anticuerpo o un dominio Fe) .

En algunas modalidades, algunas o todas las subunidades monoméricas específicas para CD40L fusionadas con un dominio o fragmento de un anticuerpo son idénticas. En algunas modalidades diferentes, algunas o todas las subunidades monoméricas específicas para CD40L fusionadas con un dominio o fragmento de un anticuerpo son diferentes.

En una modalidad específica, la matriz de soporte de Tn3 de la invención comprende una subunidad monomérica específica para CD40L fusionada con un dominio Fe. En otras modalidades, la matriz de soporte de Tn3 de la invención comprende al menos dos subunidades monoméricas específicas para CD40L fusionadas con un dominio Fe. En una modalidad específica, dos de las subunidades monoméricas específicas para CD40L fusionadas con un dominio Fe son idénticas. En una modalidad específica, dos de las subunidades monoméricas específicas para CD40L fusionadas con un dominio Fe son diferentes. En una modalidad específica, dos subunidades monoméricas específicas para CD40L fusionadas con un dominio Fe están conectadas entre sí en tándem y una de las subunidades monoméricas específicas para CD40L está fusionada con un dominio Fe .

En algunas modalidades, se pueden dimerizar diferentes matrices de soporte de Tn3 de la invención utilizando mutaciones del dominio Fe que favorezcan la formación de heterodímeros . En la técnica se sabe que las variantes de la región Fe (p. e . , sustituciones y/o adiciones y/o deleciones aminoacídicas) incrementan o reducen la función efectora del anticuerpo y pueden alterar las propiedades farmacocinéticas (p. ej . , la semivida) del anticuerpo. Por lo tanto, en ciertas modalidades, las matrices de soporte de Tn3 de la invención comprenden uno o más dominios Fe que comprenden una región Fe alterada en los que se han realizado una o más alteraciones en la región Fe con el fin de modificar las propiedades funcionales y/o farmacocinéticas de la matriz de soporte de Tn3. En ciertas modalidades, las matrices de soporte de Tn3 de la invención comprenden uno o más dominios Fe que comprenden una región Fe alterada en los que se han realizado una o más alteraciones en la región Fe con el fin de reducir o suprimir al menos una función efectora mediada por FcR.

También se sabe que la glicosilación de la región Fe se puede modificar para incrementar o reducir la función efectora y/o la actividad antiinflamatoria. Por consiguiente, en una modalidad, una matriz de soporte de Tn3 de la invención comprende una región Fe con glicosilación alterada de los residuos aminoacídicos para modificar las propiedades citotóxicas y/o antiinflamatorias de las matrices de soporte de Tn3.

Topologías de las matrices de soporte de Tn3 Las matrices de soporte de Tn3 de la invención se pueden fusionar con el extremo C de los dominios Fe, cadenas ligeras de anticuerpos y cadenas pesadas de anticuerpos en cualquier disposición espacial adecuada. Remítase, p. ej . , a la Publicación Internacional PCT/US2011/032184 para consultar una descripción detallada de las topologías de las matrices de soporte contempladas .

Generación de las matrices de soporte de la invención Las matrices de soporte de Tn3 que se describen en la presente se pueden utilizar en cualquier técnica para desarrollar proteínas de unión a una diana nuevas o mejoradas. En un ejemplo particular, la diana está inmovilizada en un soporte sólido, tal como una resina en una columna o un pocilio de una placa de microtitulación, y la diana se pone en contacto con una colección de proteínas de unión basadas en matrices de soporte candidatas . La colección puede consistir en clones construidos a partir de una matriz de soporte de Tn3 , mediante aleatorización de la secuencia y/o la longitud de los bucles similares a CDR.

A este respecto, la expresión en bacteriófagos (fagos) es una técnica muy conocida que permite cribar colecciones de oligopéptidos extensas para identificar uno o más miembros de tales colecciones que sean capaces de unirse específicamente a una diana. La expresión en fagos es una técnica mediante la cual se expresan variantes polipeptídicas como proteínas de fusión con la proteína capsídica en la superficie de partículas bacteriófagas (Scott, J. K. y Smith, G. P. (1990) Science 249: 386). Se puede emplear un método bioinformático para determinar las preferencias en cuanto a la longitud y la diversidad de los bucles de los dominios FnlII de origen natural. Utilizando este análisis, las preferencias en cuanto a la longitud y la diversidad secuencial de los bucles se puede emplear para elaborar un método de "aleatorización restringida" . En esta aleatorización restringida, las preferencias relativas en cuanto a la longitud y la secuencia de los bucles se incorporan en el desarrollo de una estrategia en la que utiliza una colección. La integración del análisis de la longitud y la diversidad secuencial de los bucles en el desarrollo de una colección da como resultado una aleatorización restringida (es decir, ciertas posiciones dentro del bucle aleatorizado se limitan en lo que respecta al aminoácido que puede encontrarse en esa posición) .

La invención también proporciona colecciones recombinantes que comprenden diversas poblaciones de matrices de soporte de Tn3 de origen no natural. En una modalidad, las colecciones comprenden matrices de soporte de Tn3 de origen no natural que comprenden una pluralidad de dominios de hebras beta unidos a una pluralidad de regiones de bucles, donde uno o más de dichos bucles varían en la deleción, sustitución o adición de al menos un aminoácido. En una modalidad específica, las colecciones comprenden matrices de soporte de Tn3 derivadas de la matriz de soporte de Tn3 natural .

Tal como se ha indicado anteriormente, los bucles que conectan las diferentes hebras beta de las matrices de soporte se pueden aleatorizar en longitud y/o diversidad secuencial. En una modalidad, las colecciones de la invención comprenden matrices de soporte de Tn3 que contienen al menos un bucle que está aleatorizado en longitud y/o diversidad secuencial. En una modalidad, al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis bucles de las matrices de soporte de Tn3 están aleatorizados en longitud y/o diversidad secuencial. En una modalidad, al menos un bucle se mantiene constante, mientras que al menos un bucle adicional está aleatorizado en longitud y/o diversidad secuencial. En otra modalidad, al menos uno, al menos dos o los tres bucles AB, CD y EF se mantienen constantes, mientras que al menos uno, al menos dos o los tres bucles BC, DE y FG están aleatorizados en longitud o diversidad secuencial. En otra modalidad, al menos uno, al menos dos o al menos los tres bucles AB, CD y EF están aleatorizados, mientras que al menos uno, al menos dos o los tres bucles BC, DE y FG están aleatorizados en longitud y/o diversidad secuencial.

En una modalidad específica, las colecciones de la invención comprenden matrices de soporte de FnlII, donde la hebra beta A comprende la SEQ ID NO: 10 u 11, la hebra beta B comprende la SEQ ID NO: 12, la hebra beta C comprende la SEQ ID NO: 13 o 14, la hebra beta D comprende la SEQ ID NO: 15, la hebra beta E comprende la SEQ ID NO: 16, la hebra beta F comprende la SEQ ID NO: 17, y la hebra beta G comprende la SEQ ID NO: 18.

En una modalidad específica, las colecciones de la invención comprenden matrices de soporte de FnlII, donde la hebra beta A consiste en la SEQ ID NO: 10 u 11, la hebra beta B consiste en la SEQ ID NO: 12, la hebra beta C consiste en la SEQ ID NO: 13 o 14, la hebra beta D consiste en la SEQ ID NO: 15, la hebra beta E consiste en la SEQ ID NO: 16, la hebra beta F consiste en la SEQ ID NO: 17, y la hebra beta G consiste en la SEQ ID NO: 18.

En una modalidad específica, las colecciones de la invención comprenden matrices de soporte de FnlII, donde la hebra beta A consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 10 u 11, la hebra beta B consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 12, la hebra beta C consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 13 o 14, la hebra beta D consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 15, la hebra beta E consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 16, la hebra beta F consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 17, y la hebra beta G consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 18.

Tal como se ha detallado anteriormente, uno o más residuos dentro de un bucle se pueden mantener constantes, mientras que otros residuos están aleatorizados en longitud y/o diversidad secuencial. Opcionalmente o como alternativa, uno o más residuos dentro de un bucle se pueden mantener hasta un número predeterminado y limitado de aminoácidos diferentes, mientras que otros residuos están aleatorizados en longitud y/o diversidad secuencial. Por consiguiente, las colecciones de la invención comprenden matrices de soporte de Tn3 que pueden comprender uno o más bucles que tengan una secuencia consenso degenerada y/o uno o más residuos aminoacídicos invariantes. En otra modalidad, las colecciones de la invención comprenden matrices de soporte de Tn3 que contienen bucles BC que están aleatorizados. En otra modalidad, las colecciones de la invención comprenden matrices de soporte de Tn3 que contienen bucles BC que están aleatorizados . En otra modalidad más, las colecciones de la invención comprenden matrices de soporte de Tn3 que contienen bucles BC que están aleatorizados.

En una modalidad, las colecciones de la invención comprenden matrices de soporte de Tn3 que contienen bucles DE que están aleatorizados. En una modalidad, las colecciones de la invención comprenden matrices de soporte de Tn3 que contienen bucles FG que están aleatorizados. En otra modalidad, las colecciones de la invención comprenden matrices de soporte de FnlII que contienen bucles FG que están aleatorizados.

En una modalidad específica, las colecciones de la invención comprenden matrices de soporte, donde las matrices de soporte comprenden la secuencia de aminoácidos: IEV (XAB) nALITW (XBC) nCELXnYGI (XCD) nTTIDL (XDE) nYSI (XEF) nYEVSLIC (XFG) n KETFTT donde : (a) XAB, XBC, XCD, XDE/ XEF Y XFG representan los residuos aminoacídicos presentes en las secuencias de los bucles AB, BC, CD, DE, EF y FG, respectivamente; (b) ?? representa un residuo aminoacídico de A o T; y (c) la longitud del bucle n es un número entero comprendido entre 2 y 26.

En algunas modalidades, las colecciones de la invención comprenden subunidades monoméricas de Tn3 específicas para CD40L de la invención que comprenden la secuencia de aminoácidos : IEVKDVTDTTALITWX1DX2X3X4X5X6X7X8CELTYGIKDVPGDRTTIDLWX9HX1oAX YSIGNLKPDTEYEVSLICRXi2GDMSSNPAKETFTT (SEQ ID NO: 167) donde : (a) Xi representa un residuo aminoacídico de serina (S) o leucina (L) ; (b) X2 representa un residuo aminoacídico de ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E) ; (c) X3 representa un residuo aminoacídico de histidina (H) , isoleucina (I) , valina (V) , fenilalanina (F) o triptófano (W) ; (d) X4 representa un residuo aminoacídico de alanina (A) , glicina (G) , ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) ; (e) X5 representa un residuo aminoacídico de ácido glutámico (E) , leucina (L) , glutamina (Q) , serina (S) , ácido aspártico (D) o asparagina (N) ; (f) X6 representa un residuo aminoacídico de fenilalanina (F) o tirosina (Y) ; (g) X7 representa un residuo aminoacídico de isoleucina (I) , valina (V) , histidina (H) , ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) ; (h) X8 representa un residuo aminoacídico de glicina (G) , triptófano (W) o valina (V) ; (i) X9 representa un residuo aminoacídico de triptófano ( ) , fenilalanina (F) o tirosina (Y) ; (j) Xio representa un residuo aminoacídico de serina (S) , glutamina (Q) , metionina (M) o histidina (H) ; (k) Xn representa un residuo aminoacídico de triptófano (W) o histidina (H) ; y (1) X12 representa un residuo aminoacídico de arginina (R) o serina (S) .

En algunas modalidades, las colecciones de la invención comprenden subunidades monoméricas de Tn3 específicas para CD40L de la invención que comprenden la secuencia de aminoácidos : IEVX1DVTDTTALITWX2X3RSX4X5 6X7X8X9 io ELXiiYGI KDVPGDRTTIDLX12 X13X14X15YVHYSIGNLKPDTX16YEVSLICLTTDGTYX17NPAKETFTT (SEQ ID NO: 171) donde : (a) Xx representa un residuo aminoacídico de lisina (K) o ácido glutámico (E) ; (b) X2 representa un residuo aminoacídico de treonina (T) o isoleucina (I) ; (c) X3 representa un residuo aminoacídico de asparagina (N) o alanina (A) (d) X4 representa un residuo aminoacídico de serina (S) , leucina (L) , alanina (A) , fenilalanina (F) o tirosina (Y) ; (e) X5 representa un residuo aminoacídico de tirosina (Y) , alanina (A) , glicina (G) , valina (V) , isoleucina (I) o serina (S) ; (f) X6 representa un residuo aminoacídico de tirosina (Y) , serina (S) , alanina (A) o histidina (H) ; (g) X7 representa un residuo aminoacídico de asparagina (N) , ácido aspártico (D) , histidina (H) o tirosina (Y) ; (h) X8 representa un residuo aminoacídico de leucina (L) , fenilalanina (F) , histidina (H) o tirosina (Y) ; (i) X9 representa un residuo aminoacídico de histidina (H) , prolina (P) , serina (S) , leucina (L) o ácido aspártico (D) ; (j) Xio representa un residuo aminoacídico de glicina (G) , fenilalanina (F) , histidina (H) o tirosina (Y) ; (k) Xn representa un residuo aminoacídico de alanina (A) o treonina (T) ; (1) Xi2 representa un residuo aminoacídico de serina (S) , asparagina (N) , ácido glutámico (E) , arginina (R) o ácido aspártico (D) ; (m) Xi3 representa un residuo aminoacídico de serina (S) , glutamina (Q) , treonina (T) , asparagina (N) o alanina (A) ; (n) Xi4 representa un residuo aminoacídico de prolina (P) , valina (V) , isoleucina (I) o alanina (A) o ningún aminoácido; (o) Xi5 representa un residuo aminoacídico de isoleucina (I) o ningún aminoácido; (p) Xi6 representa un residuo aminoacídico de ácido glutámico (E) o lisina (K) ; y (q) Xi7 representa un residuo aminoacídico de serina (S) o asparagina (N) .

La invención también comprende métodos para identificar una matriz de soporte de Tn3 recombinante que se una a una diana, p. ej . , CD40L, y que tenga una mayor estabilidad o acción mejorada sobre la diana, p. ej . , CD40L, en comparación con una matriz de soporte de Tn3 original cribando las colecciones de la invención.

En ciertas modalidades, el método para identificar una matriz de soporte de Tn3 recombinante que tenga una mayor estabilidad proteica en comparación con una matriz de soporte de Tn3 original y que se una específicamente a una diana comprende : poner en contacto el ligando diana con una colección de la invención en condiciones adecuadas para formar un complejo de matriz de soporte : ligando diana; obtener a partir del complejo, la matriz de soporte que se une al ligando diana; determinar si la estabilidad de la matriz de soporte obtenida en el paso (b) es superior a la de la matriz de soporte de Tn3 natural .

Se puede utilizar el mismo método para identificar una matriz de soporte de Tn3 recombinante con una afinidad, avidez de unión mejoradas, etc. a la diana. En una modalidad, en el paso (a) se incuba la colección de matrices de soporte de la invención con una diana inmovilizada. En una modalidad, en el paso (b) se lava el complejo de matriz de soporte : ligando diana para eliminar los ligantes no específicos y los ligantes unidos más estrechamente se eluyen en condiciones muy rigurosas, y se realiza una PCR para recuperar la información sobre la secuencia. Se contempla específicamente que los ligantes y/o la información sobre la secuencia obtenida en el paso (b) se pueden utilizar para crear una nueva colección utilizando los métodos que se describen en la presente o con los que estará familiarizado un experto en la técnica, que se pueden utilizar para repetir el proceso de selección, con o sin mutagénesis posterior de la secuencia. En algunas modalidades, se pueden realizar varias rondas de selección hasta obtener ligantes con suficiente afinidad por el antígeno.

Una modalidad adicional de la invención es un conjunto de moléculas de ácidos nucleicos aislados que codifican una colección que comprende las matrices de soporte de la invención y que es como se ha descrito anteriormente.

Las matrices de soporte de la invención se pueden someter a maduración de la afinidad. En este proceso aceptado en la técnica, una proteína de unión específica se somete a un esquema que selecciona en función del incremento de la afinidad por una diana específica (remítase a Wu et al., Nati. Acad. Sci. EE. UU. 95 (11) : 6037-42 ) . Las matrices de soporte resultantes de la invención pueden exhibir características de unión al menos equiparables a las de las matrices de soporte antes de la maduración de la afinidad al compararlas .

La invención también proporciona métodos para identificar la secuencia de aminoácidos de una matriz de soporte proteica capaz de unirse a una diana para formar así un complejo de matriz de soporte : diana. En una modalidad, el método comprende: (a) poner en contacto una colección de la invención con una diana inmovilizada o separable; (b) separar los complejos de matriz de soporte : diana de las matrices de soporte libres; (c) provocar la replicación de las matrices de soporte separadas de (b) para obtener así una nueva colección de expresión de polipéptidos que se diferencia de la de (a) en que tiene una menor diversidad y en que está enriquecida en matrices de soporte expresadas capaces de unirse a la diana; (d) repetir opcionalmente los pasos (a) y (b) con la nueva colección de (c) ; y (e) determinar la secuencia de ácido nucleico de la región que codifica la matriz de soporte expresada de una especie de (d) y, por lo tanto, deducir la secuencia peptídica capaz de unirse a la diana.

En otra modalidad, las matrices de soporte de Tn3 de la invención se pueden aleatorizar adicionalmente tras su identificación mediante la criba de la colección. En una modalidad, los métodos de la invención comprenden además aleatorizar al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis bucles de una matriz de soporte identificada a partir de una colección utilizando un método descrito en la presente. En otra modalidad, la matriz de soporte adicionalmente aleatorizada se somete a un método subsecuente para identificar una matriz de soporte capaz de unirse a una diana. Este método comprende (a) poner en contacto la matriz de soporte adicionalmente aleatorizada con una diana inmovilizada o separable, (b) separar los complejos de matriz de soporte adicionalmente aleatorizada : diana de las matrices de soporte libres, (c) provocar la replicación de las matrices de soporte separadas de (b) , opcionalmente repetir los pasos (a) - (c) y (d) determinar la secuencia de ácido nucleico de la región que codifica la matriz de soporte adicionalmente aleatorizada y, por lo tanto, deducir la secuencia peptídica capaz de unirse a la diana.

En otra modalidad, las matrices de soporte adicionalmente aleatorizadas comprenden al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis bucles aleatorizados que se habían aleatorizado previamente en la primera colección. En una modalidad alternativa adicional, las matrices de soporte adicionalmente aleatorizadas comprenden al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis bucles aleatorizados que previamente no se habían aleatorizado en la primera colección.

La invención también proporciona un método para obtener al menos dos matrices de soporte de Tn3 que se unan a al menos una o más dianas . Este método permite cribar los agentes que actúan cooperativamente para obtener una respuesta particular. Puede ser conveniente utilizar este tipo de criba cuando se necesite una actividad agonista que requiera la cooperación de más de una matriz de soporte. Este método permite cribar agentes cooperantes sin reformatear la colección para formar complejos multiméricos . En una modalidad, el método de la invención comprende poner en contacto un ligando diana con una colección de la invención en condiciones que permitan que se forme un complejo de matriz de soporte : ligando diana, conectar las matrices de soporte con un agente reticulante (definido como un agente que junta, en proximidad cercana, al menos dos matrices de soporte idénticas o diferentes) donde la reticulación de las matrices de soporte produce una respuesta detectable y obtener a partir del complejo las matrices de soporte que se unen a la diana. En una modalidad adicional, el agente reticulante es un anticuerpo específico para la matriz de soporte o un fragmento de este, un anticuerpo específico para un epítopo marcador o un fragmento de este, un dominio de dimerización, tal como una región Fe, un motivo de hélice superenrollada (por ejemplo, sin carácter limitante, una cremallera de leucina) , un reticulante químico u otro dominio de dimerización conocido en la técnica.

La invención también proporciona métodos para detectar un compuesto utilizando las matrices de soporte de Tn3 de la invención. Basándose en las especificaciones de unión de las matrices de soporte de Tn3 obtenidas mediante la criba de la colección, es posible utilizar tales matrices de soporte de Tn3 en ensayos para detectar la diana específica en una muestra, tales como para métodos de diagnóstico. En una modalidad, el método para detectar un compuesto comprende poner en contacto el compuesto en una muestra con una matriz de soporte de Tn3 de la invención en condiciones que permitan que se forme un complejo de compuesto :matriz de soporte y detectar la matriz de soporte, y de este modo se detecta el compuesto en una muestra. En modalidades adicionales, la matriz de soporte se marca (es decir, con un radiomarcador, marcador fluorescente, con actividad enzimática o colorimétrico) para facilitar la detección del compuesto.

La invención también proporciona métodos para capturar un compuesto utilizando las matrices de soporte de Tn3 de la invención. Basándose en las especificaciones de unión de las matrices de soporte de Tn3 obtenidas mediante la criba de la colección, es posible utilizar tales matrices de soporte de Tn3 en ensayos para capturar la diana específica en una muestra, tales como para métodos de purificación. En una modalidad, el método para capturar un compuesto en una muestra comprende poner en contacto el compuesto en una muestra con una matriz de soporte de la invención en condiciones que permitan la formación de un complejo de compuesto rmatriz de soporte y separar el complejo de la muestra, y de este modo se captura el compuesto en la muestra. En modalidades adicionales, la matriz de soporte de Tn3 se inmoviliza para facilitar la separación del complejo de compuesto :matriz de soporte.

En algunas modalidades, las matrices de soporte de Tn3 aisladas de las colecciones de la invención comprenden al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o más bucles aleatorizados . En algunas modalidades, las secuencias de los bucles de las matrices de soporte de Tn3 aisladas se pueden intercambiar de una matriz de soporte donante a cualquier bucle en una matriz de soporte de FnlII receptora incluidas, sin carácter limitante, una matriz de soporte de Tn3 receptora (por ejemplo, una secuencia del bucle FG de una matriz de soporte donante se puede transferir a cualquier bucle en una matriz de soporte de FnlII receptora) . En modalidades específicas, las secuencias de los bucles aisladas se pueden transferir al bucle cognado en la matriz de soporte receptora (por ejemplo, una secuencia del bucle FG de una matriz de soporte donante se puede transferir a una matriz de soporte de FnlII receptora en la posición del bucle FG) . En algunas modalidades, las secuencias de los bucles aisladas se pueden "mezclar y combinar" al azar con varias matrices de soporte receptoras .

En otras modalidades, las secuencias de las matrices de soporte de Tn3 aisladas se pueden identificar por la secuencia de los bucles. Por ejemplo, se utiliza una colección para la adsorción a una diana particular y se aisla una colección de ligantes específicos. Las secuencias de los bucles aleatorizados se pueden caracterizar como secuencias específicas independientemente del contexto de la matriz de soporte de Tn3 (es decir, la matriz de soporte que se une a una diana X donde la matriz de soporte comprende una secuencia del bucle FG de la SEQ ID NO:X) . En modalidades alternativas, cuando una matriz de soporte exhibe dos secuencias de bucles que se unen a la diana X, las secuencias de los bucles se pueden caracterizar como las que se unen a la diana X en ausencia de la secuencia de las matrices de soporte. Es decir, se contempla que las matrices de soporte aisladas de una colección que se unen a una diana particular se puedan expresar como las secuencias de bucles variables que se unen a la diana independientemente del contexto de la matriz de soporte. Este proceso sería análogo al concepto de las CDR en las regiones variables de anticuerpos.

Maduración de la afinidad El desarrollo de las matrices de soporte de Tn3 de la invención puede implicar uno o más pasos de maduración de la afinidad in vitro o in vivo. En algunas modalidades, las subunidades monoméricas de Tn3 pueden someterse a un único paso de maduración de la afinidad. En otras modalidades, las subunidades monoméricas de Tn3 se pueden someter a dos o más pasos de maduración de la afinidad. Se puede emplear cualquier estrategia de maduración de la afinidad que produzca, en general, cambios aminoacídicos en una matriz de soporte de Tn3 original o específicamente cambios aminoacídicos en los bucles de una matriz de soporte de Tn3 original que mejoran la unión de la matriz de soporte de Tn3 con afinidad madura al antígeno deseado.

Estos cambios aminoacídicos se pueden conseguir, por ejemplo, mediante mutagénesis aleatoria, mutagénesis "walk though" y mutagénesis " look through" . Tales mutagénesis se pueden conseguir, por ejemplo, mediante PCR propensa a errores, cepas "imitadoras" de levaduras o bacterias, la incorporación de cambios de ácidos nucleicos aleatorios o definidos durante la síntesis ab initio de toda o parte de una molécula de unión basada en FnlII. Los métodos para llevar a cabo la maduración de la afinidad y/o mutagénesis se describen, por ejemplo, en las Pat . de EE. UU. N.os 7.195.880; 6.951.725; 7.078.197; 7.022.479; 5.922.545; 5.830.721; 5.605.793; 5.830.650; 6.194.550; 6.699.658; 7.063.943; 5.866.344 y la Publicación de PCT WO06023144.

Tales métodos de maduración de la afinidad pueden requerir además que se incremente la rigurosidad del ensayo de criba de la unión al antígeno para seleccionar las matrices de soporte de Tn3 con afinidad mejorada por un antígeno. Los métodos reconocidos en la técnica para incrementar la rigurosidad de un ensayo de interacción proteína-proteína se pueden utilizar en la presente. En una modalidad, se varían una o más de las condiciones del ensayo (por ejemplo, la salinidad del tampón de ensayo) para reducir la afinididad de la matriz de soporte de Tn3 por el antígeno deseado. En otra modalidad, se reduce la duración del tiempo permitido para que la matriz de soporte de Tn3 se una al antígeno deseado.

En otra modalidad, se puede incluir un paso de unión competitiva en el ensayo de interacción proteína-proteína. Por ejemplo, se puede dejar que la matriz de soporte de Tn3 se una primero a un antígeno inmovilizado deseado. A continuación, se añade una concentración específica de antígeno no inmovilizado que sirve para competir por la unión con el antígeno inmovilizado de modo que las matrices de soporte de Tn3 con la menor afinidad por el antígeno se eluyan del antígeno inmovilizado lo cual resulta en la selección de las matrices de soporte de Tn3 con una mayor afinidad de unión al antígeno. La rigurosidad de las condiciones del ensayo se puede incrementar aún más aumentando la concentración del antígeno no inmovilizado que se añade al ensayo.

Los métodos de criba también pueden requerir múltiples rondas de selección para enriquecer una o más de las matrices de soporte de Tn3 con una unión al antígeno mejorada. En una modalidad, en cada ronda de selección se introducen más mutaciones aminoacídicas en la matriz de soporte de Tn3. En otra modalidad, en cada ronda de selección se incrementa la rigurosidad de la unión al antígeno deseado para seleccionar las matrices de soporte de Tn3 con una mayor afinidad por el antígeno .

En algunas modalidades, se lleva a cabo una maduración de la afinidad mediante la mutagénesis por saturación de porciones de los bucles BC, DE y FG de Tn3. En algunas modalidades, la mutagénesis por saturación se lleva a cabo utilizando mutagénesis de Kunkel . En otras modalidades, la mutagénesis por saturación se lleva a cabo utilizando PCR.

En algunas modalidades, se aplican al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o más de cinco rondas de maduración de la afinidad. En algunas modalidades, la mutagénesis por saturación se aplica únicamente a un bucle, mientras que en algunas modalidades diferentes, se muta únicamente un bucle o una porción de un bucle durante una ronda de maduración de la afinidad. En algunas modalidades, más de un bucle o porciones de uno o más de un bucle se mutan durante la misma ronda de maduración de la afinidad.

En otras modalidades, los bucles BC, DE y FG mutaron simultáneamente durante la misma ronda de maduración de la afinidad.

En el caso de los monómeros para crear matrices de soporte de Tn3 multiméricas que se unan a epítopos diferentes de la misma diana, cada especificación de unión se puede cribar de forma independiente .

En algunas modalidades, los bucles se aleatorizan utilizando una colección de expresión en fagos. En algunas modalidades, la unión de una matriz de soporte de Tn3 a una diana deseada se puede determinar utilizando métodos reconocidos en la técnica. Además, las secuencias de aminoácidos de las matrices de soporte de Tn3 identificadas en las cribas se pueden determinar utilizando métodos reconocidos en la técnica.

En algunas modalidades, las matrices de soporte monoméricas con afinidad madura de la invención exhiben una mayor afinidad por CD40L de al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 40 veces, al menos 60 veces, al menos 80 veces o al menos 100 veces más o superior en comparación con la misma matriz de soporte de Tn3 antes de la maduración de la afinidad, según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales o mediante otros ensayos conocidos en la técnica. En algunas modalidades, las matrices de soporte monoméricas con afinidad madura de la invención tienen una constante de disociación (¾) inferior a 5 µ?, inferior a 1 µ?, inferior a 500 µ?, inferior a 250 µ?, inferior a 100 µ? o inferior a 50 µ?, según se mide mediante resonancia de plasmones superficiales o mediante otros ensayos conocidos en la técnica.

Estos métodos de maduración de la afinidad se pueden aplicar para desarrollar matrices de soporte de Tn3 con propiedades de unión mejoradas deseables tales como una mayor afinidad u otras características deseables, tales como propiedades farmacocinéticas favorables, potencia alta, baja inmunogenia, mayor o menor reactividad cruzada, etc.

Generación de repeticiones en tándem El enlace de constructos en tándem, un dímero formado enlazando dos subunidades monoméricas específicas para CD40L, se puede generar ligando oligonucleótidos en sitios de restricción utilizando enzimas de restricción conocidas en la técnica que incluyen, sin carácter limitante, enzimas de restricción de tipo II y de tipo IIS.

Las matrices de soporte de Tn3 multiméricas de la invención pueden comprender un conector en el extremo C y/o el extremo N y/o entre dominios tal como se ha descrito en la presente. Además, las matrices de soporte de la invención que comprenden al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8 o matrices de soporte polipeptídicas se pueden fusionar o conjugar con un dominio de dimerización que incluye, sin carácter limitante, un resto de anticuerpo seleccionado entre: (i) un fragmento Fab que contiene los dominios VL, CL, VH y CH1; (ii) un fragmento Fab' , que es un fragmento Fab que tiene uno o más residuos de cisteína en el extremo C del dominio CH1; (iü) un fragmento Fd que contiene los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fd' que contiene los dominios VH y CH1 y uno o más residuos de cisteína en el extremo C del dominio CH1; (v) un fragmento Fv que contiene los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo; (vi) un fragmento dAb que consiste en un dominio VH; (vii) regiones CDR aisladas; (viii) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab' enlazados por un puente disulfuro en la región de bisagra; (ix) moléculas de anticuerpo monocatenario (p. ej . , Fv monocatenario; scFv) ; (x) un "diacuerpo" con dos sitios de unión al antígeno, que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica; (xi) un "anticuerpo lineal" que comprende un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con polipéptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión al antígeno; (xii) un anticuerpo completo; y (xiii) una región Fe que comprende CH2-CH3, que puede comprender además toda o una porción de una región de bisagra y/o una región CH1.

Producción de las matrices de soporte de Tn3 La expresión recombinante de una matriz de soporte de Tn3 de la invención requiere la construcción de un vector de expresión que contenga un polinucleótido que codifique la matriz de soporte de Tn3. Una vez que se ha obtenido un polinucleótido que codifique una matriz de soporte de Tn3 , el vector para la producción de la matriz de soporte de Tn3 se puede producir mediante tecnología de ADN recombinante utilizando técnicas muy conocidas en la técnica. Por lo tanto, en la presente se describen métodos para preparar una proteína mediante la expresión de un polinucleótido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una matriz de soporte de Tn3. Se pueden utilizar métodos con los que estarán muy familiarizados los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contengan secuencias que codifiquen matrices de soporte polipeptídicas y señales de control traduccionales y transcripcionales adecuadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. La invención proporciona, por lo tanto, vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una matriz de soporte de Tn3 de la invención, unida operablemente a un promotor.

El vector de expresión se transfiere a una célula huésped mediante técnicas convencionales y las células transfectadas se cultivan posteriormente mediante técnicas convencionales para producir una matriz de soporte de Tn3 de la invención. Por consiguiente, la invención incluye células huésped que contienen un polinucleótido que codifica una matriz de soporte de la invención, unido operablemente a un promotor heterólogo. Las células huésped adecuadas incluyen, sin carácter limitante, microorganismos tales como bacterias (p. ej . , E. coli y B. subtilis) .

Se pueden utilizar varios sistemas de vectores de expresión en huéspedes para expresar las matrices de soporte de Tn3 de la invención. Tales sistemas de expresión en huéspedes representan vehículos mediante los cuales se pueden producir y posteriormente purificar secuencias codificantes de interés, pero también representan células que, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos adecuadas, pueden expresar una matriz de soporte de la invención in s tu. Estos incluyen, sin carácter limitante, microorganismos tales como bacterias (p. ej . , E. coli y B. subtilis) transformados con vectores de expresión de ADN bacteriófago recombinante , ADN plasmídico o ADN cósmido que contienen secuencias que codifican matrices de soporte o sistemas celulares de mamíferos (p. ej . , células COS, CHO, BHK, 293, NSO y 3T3) .

Por ejemplo, en la Publicación de la Solicitud de Patente Internacional N.° WO 2009/058379 se describen métodos útiles para producir las matrices de soporte de Tn3 de la invención. Una vez que se ha producido una matriz de soporte de la invención por expresión recombinante, esta se puede purificar mediante cualquier método conocido en la técnica para purificar una proteína.

En algunas modalidades, las matrices de soporte de la invención se pueden producir en una forma glicosilada reemplazando residuos aminoacídicos que se pueden glicosilar durante la expresión recombinante. En una modalidad específica, se pueden reemplazar aminoácidos de serina en un conector de glicina-serina (p. ej . , la SEQ ID NO : 131 o la SEQ ID NO: 132) por otros residuos aminoacídicos tales como alanina, glicina, leucina, isoleucina o valina (remítase, p. ej . , a las SEQ ID NOs : 140, 141, 142 y 143) para prevenir la glicosilación durante la expresión recombinante . En algunas modalidades específicas, se elimina un sitio de N-glicosilación de una matriz de soporte de Tn3 de la invención. En otras modalidades, una matriz de soporte de la invención se puede desglicosilar después de la expresión recombinante. En la técnica se conocen métodos de desglicosilación in vitro después de la expresión recombinante que emplean, p. ej . , cócteles enzimáticos (por ejemplo, los kits PFGasa F, Enodo F Multi, Orela O-linked Glycan Reléase, Enzymatic CarboRelease y Enzymatic DeGlycoMx deglycosylation comercializados por QA-bio, Palm Desert, CA) .

Se puede escalar la producción de las matrices de soporte de Tn3 de la invención en el laboratorio de investigación para producir matrices de soporte en reactores a escala analítica o reactores a escala de producción, tal como se describe en la Publicación de Patente de EE . UU. N.° 2010-0298541 Al.

Producción escalable de matrices de soporte de Tn3 secretadas Las matrices de soporte de Tn3 de la invención se pueden producir intracelularmente o como una forma secretada. En algunas modalidades, las matrices de soporte secretadas están debidamente plegadas y son totalmente funcionales. Las matrices de soporte de Tn3 de la invención se pueden producir mediante un proceso escalable. En algunas modalidades, las matrices de soporte se pueden producir mediante un proceso escalable de la invención en el laboratorio de investigación que se puede escalar para producir las matrices de soporte de la invención en biorreactores a escala analítica (por ejemplo, sin carácter limitante, biorreactores de 5L, 10L, 15L, 30L o 50L) . En otras modalidades, las matrices de soporte de Tn3 se pueden producir mediante un proceso escalable de la invención en el laboratorio de investigación que se puede escalar para producir las matrices de soporte de Tn3 de la invención en biorreactores a escala de producción (por ejemplo, sin carácter limitante, 75L, 100L, 150L, 300L o 500L) . En algunas modalidades, el proceso escalable de la invención produce poca o ninguna reducción en la eficiencia de producción en comparación con el proceso de producción llevado a cabo en el laboratorio de investigación.

Conectores Las subunidades monoméricas en una matriz de soporte de Tn3 multimérica se pueden conectar mediante conectores proteicos y/o no proteicos, donde cada conector está fusionado a al menos dos subunidades monoméricas. Un conector adecuado puede consistir en un conector proteico, un conector no proteico y combinaciones de estos. Las combinaciones de conectores pueden ser homoméricas o heteroméricas . En algunas modalidades, una matriz de soporte de Tn3 multimérica de la invención comprende una pluralidad de subunidades monoméricas donde todos los conectores son idénticos. En otras modalidades, una matriz de soporte de Tn3 multimérica comprende una pluralidad de subunidades monoméricas donde al menos uno de los conectores es funcional o estructuralmente diferente del resto de los conectores. En algunas modalidades, los propios conectores pueden contribuir a la actividad de una matriz de soporte de Tn3 multimérica mediante su participación directa o indirecta en la unión a una diana.

En algunas modalidades, el conector proteico es un polipéptido. El polipéptido conector debe tener una longitud, que sea adecuada para enlazar dos o más subunidades monoméricas, de forma que asuman la conformación correcta entre sí para que retengan así la actividad deseada.

En una modalidad, el conector polipeptídico comprende de 1 a aproximadamente 1000 residuos aminoacídicos , de 1 a aproximadamente 50 residuos aminoacídicos, 1-25 residuos aminoacídicos, 1-20 residuos aminoacídicos, 1-15 residuos aminoacídicos, 1-10 residuos aminoacídicos, 1- 5 residuos aminoacídicos, 1-3 residuos aminoacídicos. La invención proporciona además ácidos nucleicos, tales como ADN, ARN o combinaciones de ambos, que codifican la secuencia del conector polipeptídico. Los residuos aminoacídicos seleccionados para su inclusión en el conector polipeptídico deben exhibir propiedades que no interfieran de forma significativa con la actividad o función de la matriz de soporte de Tn3 multimérica de la invención. Por lo tanto, un conector polipeptídico no debe exhibir en general un cambio que fuera incompatible con la actividad o función de la matriz de soporte de Tn3 multimérica de la invención, ni interferir con el plegamiento interno, ni formar enlaces u otras interacciones con residuos aminoacídicos en una o más subunidades monoméricas que impidieran seriamente la unión de la matriz de soporte de Tn3 multimérica de la invención a CD40L.

En la bibliografía hay constancia del uso de conectores peptídicos tanto naturales como artificiales para conectar polipéptidos en polipéptidos de fusión conectados novedosos. Por consiguiente, los conectores que fusionan dos o más subunidades monoméricas son conectores naturales, conectores artificiales o combinaciones de estos. En algunas modalidades, las secuencias de aminoácidos de todos los conectores peptídicos presentes en una matriz de soporte de Tn3 multimérica de la invención son idénticas. En otras modalidades, las secuencias de aminoácidos de al menos dos de los conectores peptídicos presentes en una matriz de soporte de Tn3 multimérica de la invención son diferentes.

En algunas modalidades, un conector polipeptídico posee flexibilidad conformacional . En algunas modalidades, una secuencia de conector polipeptídico comprende una secuencia de aminoácidos (G-G-G-G-X) m donde X es alanina (A), serina (S) , glicina (G) , isoleucina (I) , leucina (L) o valina (V) y m es un número entero positivo (remítase a, p. ej . , SEQ ID NO: 209) . En una modalidad específica, una secuencia de conector polipeptídico comprende una secuencia de aminoácidos (G-G-G-G-S)m donde m es un número entero positivo (remítase a, p. ej . , la SEQ ID NO: 147) . En otra modalidad específica, una secuencia de conector polipeptídico comprende una secuencia de aminoácidos (G-G-G-G-G)m donde m es un número entero positivo (remítase a, p. ej . , la SEQ ID NO: 148) . En otra modalidad específica adicional, una secuencia de conector polipeptídico comprende una secuencia de aminoácidos (G-G-G-G-A)m donde m es un número entero positivo (remítase a, p. ej . , la SEQ ID NO: 149) . En algunas modalidades, un conector polipeptídico es un polipéptido artificial o natural no estructurado inherentemente (remítase a, p. ej . , Schellenberger et al., Nature Biotechnol. 27:1186-1190, 2009; remítase también a Sickmeier et al., Nucleic Acids Res. 35 :D786-93, 2007) .

El conector peptídico se puede modificar de modo que se introduzca un residuo aminoacídico que comprenda un grupo de enlace para un resto no polipeptídico. Algunos ejemplos de estos residuos aminoacídicos pueden ser un residuo de cisteína (al cual se enlaza posteriormente el resto no polipeptídico) o la secuencia de aminoácidos puede incluir un sitio de N-glicosilación in vivo (enlazando de este modo un resto de azúcar (in vivo) al conector peptídico) .

En algunas modalidades, las secuencias de aminoácidos de todos los conectores peptídicos presentes en el multímero polipeptídico son idénticas. Como alternativa, las secuencias de aminoácidos de todos los conectores peptídicos presentes en el multímero polipeptídico pueden ser diferentes.

Mareaje o conjugación de las matrices de soporte de Tn3 Las matrices de soporte de Tn3 de la invención se pueden utilizar en forma no conjugada o conjugada con al menos uno de diversos restos heterólogos para facilitar la detección de la diana o para el diagnóstico por imágenes o la terapia. Las matrices de soporte de Tn3 se pueden marcar o conjugar ya sea antes o después de la purificación, cuando se realiza una purificación .

Muchos restos heterólogos carecen de grupos funcionales adecuados a los que las matrices de soporte de Tn3 de la invención se puedan enlazar. Por lo tanto, en algunas modalidades, la molécula efectora se enlaza a la matriz de soporte a través de un conector, donde el conector contiene grupos reactivos para la conjugación. En algunas modalidades, el resto heterólogo conjugado con una matriz de soporte de Tn3 de la invención puede funcionar como conector. En otras modalidades, el resto se conjuga con la matriz de soporte de Tn3 a través de un conector que puede ser escindible o no escindible. En una modalidad, la molécula enlazante escindible es una molécula enlazante escindible redox, de modo que la molécula enlazante sea escindible en entornos con un potencial redox inferior, tal como el citoplasma y otras regiones con concentraciones superiores de moléculas con grupos sulfhidrilo libres. Los ejemplos de moléculas enlazantes que se pueden escindir debido a un cambio en el potencial redox incluyen aquellas que contienen disulfuros.

En algunas modalidades, las matrices de soporte de Tn3 de la invención se modifican para proporcionar grupos reactivos para la conjugación. En tales matrices de soporte, el extremo N y/o el extremo C también puede servir para proporcionar grupos reactivos para la conjugación. En otras modalidades, el extremo N se puede conjugar con un resto (tal como, sin carácter limitante, PEG) , mientras que el extremo C está conjugado con otro resto (tal como, sin carácter limitante, biotina) o viceversa.

La expresión "polietilenglicol " o "PEG" se refiere a un compuesto polietilenglicólico o un derivado de este, con o sin agentes de acoplamiento, restos activantes o de acoplamiento (p. ej . , con tiol, triflato, tresilato, aziridina, oxirano, N-hidroxisuccinimida o un resto maleimida) . Se pretende que el término " PEG" indique polietilenglicol de un peso molecular comprendido entre 500 y 150 000 Da, incluidos sus análogos, donde, por ejemplo, el grupo OH terminal ha sido reemplazado por un grupo metoxi (denominado mPEG) .

Las matrices de soporte de Tn3 de la invención se pueden derivatizar con polietilenglicol (PEG) . El PEG es un polímero hidrosoluble lineal constituido por unidades que se repiten de óxido de etileno con dos grupos hidroxilo terminales. Los PEG se clasifican por sus pesos moleculares que normalmente varían entre aproximadamente 500 daltons y aproximadamente 40 000 daltons. En una modalidad específica, los PEG empleados tienen pesos moleculares comprendidos entre 5000 daltons y aproximadamente 20 000 daltons. Los PEG acoplados a las matrices de soporte de la invención pueden estar ramificados o no ramificados. Remítase, p. ej . , a Monfardini, C. et al. 1995 Bioconjugate Chem 6:62-69. Los PEG son comercializados por Nektar Inc., Sigma Chemical Co. y otras compañías. Tales PEG incluyen, sin carácter limitante, monometoxipolietilenglicol (MePEG-OH) , monometoxipolietilenglicol-succinato (MePEG-S) , monometoxipolietilenglicol-succinato de succinimidilo (MePEG-S- NHS) , monometoxipolietilenglicol-amina (MePEG-NH2) , monometoxipolietilenglicol -tresilato (MePEG-TRES) y monometoxipolietilenglicol-imidazolilcarbonilo (MePEG-IM) .

Resumiendo, el polímero hidrofílico que se emplea, por ejemplo, PEG, está bloqueado en un extremo con un grupo no reactivo tal como un grupo metoxi o etoxi . Posteriormente, el polímero se activa en el otro extremo por reacción con un agente activante adecuado, tal como haluros cianúricos (por ejemplo, cloruro, bromuro o fluoruro cianúrico) , carbonildiimidazol , un reactivo anhídrico (por ejemplo, un anhídrido dihalosuccínico, tal como anhídrido dibromosuccínico) , azida acílica, éter p-diazoniumbencílico, 3- (p-diazoniumfenoxi) -2-éter hidroxipropílico) y similares. El polímero activado se hace reaccionar posteriormente con un polipéptido como los descritos en la presente para producir un polipéptido derivatizado con un polímero. Como alternativa, se puede activar un grupo funcional en las matrices de soporte de Tn3 para que reaccione con el polímero o se pueden unir los dos grupos en una reacción de acoplamiento concertado utilizando métodos de acoplamiento conocidos. Se apreciará fácilmente que los polipéptidos de la invención se pueden derivatizar con PEG utilizando numerosos esquemas de reacción diferentes que son de uso habitual y con los que estarán familiarizados los expertos en la técnica. Un PEG se puede acoplar a una matriz de soporte de la invención en uno o más grupos funcionales en cualquiera de los extremos de la matriz de soporte de Tn3 o dentro de la matriz de soporte de Tn3. En ciertas modalidades, el PEG se acopla al extremo N o al extremo C.

En otras modalidades, las matrices de soporte de Tn3 de la invención, los análogos o derivados de estas se pueden conjugar con un agente de diagnóstico o detectable. Tales matrices de soporte de Tn3 pueden ser útiles para monitorizar o pronosticar el desarrollo o el avance de una enfermedad como parte de un procedimiento de evaluación clínica, tal como la determinación de la eficacia de una terapia particular.

La presente invención abarca además los usos de las matrices de soporte de Tn3 conjugadas con un resto terapéutico. Una matriz de soporte de Tn3 se puede conjugar con un resto terapéutico tal como una citotoxina, p. ej . , un agente citostático o citocidal, un agente terapéutico o un ión metálico radioactivo, p. ej . , emisores alfa. Una citotoxina o agente citotóxido incluye cualquier agente que es perjudicial para las células.

Ensayos de las matrices de soporte de Tn3 La afinidad de unión y otras propiedades de unión de una matriz de soporte de Tn3 a un antígeno se pueden determinar mediante diversos métodos de ensayo in vitro conocidos en la técnica que incluyen, por ejemplo, métodos de equilibrio (p. ej . , enzimoinmunoensayo (ELISA) o análisis cinético (p. ej . , análisis BIACORE ) , y otros métodos tales como ensayos de unión indirecta, ensayos de unión competitiva, electroforesis en gel y cromatografía (p. ej . , filtración en gel) . Estos y otros métodos pueden utilizar un marcador en uno o más de los componentes que se estén examinando y/o emplear diversos métodos de detección que incluyen, sin carácter limitante, marcadores cromogénicos, fluorescentes, luminiscentes o isotópicos. Se puede consular una descripción detallada de las propiedades cinéticas y las afinidades de unión en Paul, W.E., ed., Fundamental Immunology, 4.a Ed. , Lippincott-Raven, Filadelfia (1999) .

En algunas modalidades, las matrices de soporte de Tn3 de la invención se unen específicamente a una diana con unas propiedades cinéticas específicas. En algunas modalidades, las matrices de soporte de Tn3 de la invención pueden tener una constante de disociación o Kd (kOff/k0n) inferior a lxlO~2M, lxl0~3M, lxl0~4M, lxlO~5M, lxlO~6M, lxlO"7M, lxlO"8M, lxlO"9 , lxlO"10M, Ixl0-11M, lxlO"12M, lxlO~13M, lxlO"14M o inferior a 1?10~15 . En modalidades específicas, las matrices de soporte de Tn3 de la invención tienen una K¿ de 500 µ?, 100 µ?, 500 nM, 100 nM, 1 nM, 500 M, 100 pM o inferior según se determina mediante un ensayo BIAcore® o mediante otros ensayos conocidos en la técnica.

En una modalidad alternativa, la afinidad de las matrices de soporte de Tn3 de la invención se describe en términos de la constante de asociación (Ka) , que se calcula como la relación kon/koff, de al menos lxlC^NT1, 1?103?_1, 1?104?~\ 1?105?_1, 1?106?_1, lxloV1, 1?108?_1, 1?109?"\ lxl010M" 1 lxlO^M"1 1?1012?_1, 1?1013?"\ 1?1014?_1, 1?1015?_1 o al menos 5 X 1015 M"1.

En ciertas modalidades, la velocidad a la que las matrices de soporte de Tn3 de la invención se disocian de un epítopo diana puede ser más relevante que el valor de la ¾ o la Ka. En algunas modalidades, las matrices de soporte de Tn3 de la invención tienen una kQff inferior a 10~3 s"1, inferior a 5xl0~3 s"1, inferior a 10~4 s"1, inferior a 5xl0~4 s"1, inferior a 10~5 s_1, inferior a 5xl0"5 s"1, inferior a 10"6 s"1, inferior a 5xl0"6 s"1, inferior a 10"7 s"1, inferior a 5xl0"7 s"1, inferior a 10"8 s"1, inferior a 5xl0"8 s"1, inferior a 10~9 s"1, inferior a 5xl0"9 s"1 o inferior a 10"10 s"1.

En otras modalidades, la velocidad a la que las matrices de soporte de Tn3 de la invención se asocian con un epítopo diana puede ser más relevante que el valor de la ¾ o la Ka. En este caso, las matrices de soporte de Tn3 de la invención se unen a una diana con una velocidad kon de al menos 105 M_1s" 1, al menos 5xl05 M^s"1, al menos 10s M^s"1, al menos 5 x 106 M" 1s"1, al menos 107 M"1s"1, al menos 5 x 107 M^s"1 o al menos 108 M^s"1 o al menos 109 M^s"1.

Las matrices de soporte de Tn3 de la invención también se pueden adherir a soportes sólidos que son particularmente útiles para los inmunoensayos o la purificación del antígeno diana. Estos soportes sólidos incluyen, sin carácter limitante, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno.

Matrices de soporte de Tn3 específicas para CD40L La invención proporciona matrices de soporte de Tn3 que se unen específicamente a CD40L . En modalidades específicas, las matrices de soporte de la invención se unen específicamente al CD40L humano. En otras modalidades específicas, las matrices de soporte de Tn3 de la invención se unen a homólogos de CD40L de ratón, gallina, Rhesus, cinomólogo, rata o conejo. En algunas modalidades, las matrices de soporte de Tn3 de la invención se unen a un epítopo expuesto de CD40L. Tales modalidades incluyen el CD40L expresado endógenamente en células y/o células transfectadas para expresar ectópicamente el receptor.

En algunas modalidades, las matrices de soporte de Tn3 de la invención reconocen epítopos expresados en un CD40L monomérico. En otras modalidades, las matrices de soporte de Tn3 de la invención reconocen epítopos expresados en una forma trimérica de CD40L. En otras modalidades, las matrices de soporte de Tn3 de la invención reconocen epítopos expresados en un CD40L unido a la membrana. En otras modalidades, las matrices de soporte de Tn3 de la invención reconocen epítopos expresados en CD40L soluble.

En otras modalidades adicionales, las matrices de soporte de Tn3 de la invención se unen a CD40L monomérico y previenen o interfieren con la oligomerización de las moléculas de CD40L. En otras modalidades adicionales, las matrices de soporte de la invención reducen o inhiben la interacción de CD40L con CD40. En otras modalidades, las matrices de soporte de Tn3 agonizan la señalización celular mediada por CD40L. En otras modalidades adicionales, las matrices de soporte de Tn3 antagonizan la señalización celular mediada por CD40L.

La invención también proporciona métodos para modular la actividad de CD40L utilizando las matrices de soporte de Tn3 que se describen en la presente. En algunas modalidades, los métodos de la invención comprenden poner en contacto un CD40L con matrices de soporte específicas para CD40L, y bloquear la interacción entre CD40 y CD40L. En otras modalidades, los métodos de la invención comprenden poner en contacto una célula que expresa CD40L con una matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L y prevenir la escisión proteolítica de CD40L de la superficie celular. En otras modalidades, los métodos de la invención comprenden poner en contacto un monómero de CD40L con una matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L y prevenir la oligomerización de CD40L. En otras modalidades, la dimerización u oligomerización de CD40L se puede conseguir utilizando las matrices de soporte de Tn3 multiméricas .

En algunas modalidades, los métodos de la invención comprenden la administración de una matriz de soporte específica para CD40L que reduce una respuesta inmunitaria mediada por CD40 (remítase, p. ej . , a Elqueta et al. 229: 152-172, 2009) o una vía de señalización posterior iniciada por la unión de CD40 a CD40L, según se mide mediante ensayos rutinarios conocidos en la técnica.

Sin que ello suponga ceñirse a ninguna teoría particular, las matrices de soporte de CD40L de la presente invención podrían funcionar previniendo la unión de CD40L a CD40, uniéndose al CD40L soluble y secuestrándolo, alterando la interacción de CD40L con CD40 pero sin prevenir la unión, previniendo o incrementado la escisión enzimática mediada por metaloproteasas de CD40L de la superficie celular para proporcionar CD40L soluble, previniendo o incrementando la endocitosis de CD40L en la superficie celular, etc.

Secuencias de unión a CD40L específicas En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 de la invención comprende subunidades monoméricas específicas para CD40L que comprenden al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis secuencias de bucles que se unen a CD40L.

En algunas modalidades, las subunidades monoméricas específicas para CD40L comprenden al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos seis secuencias de bucles de clones monoméricos que se unen a CD40L seleccionadas entre: 309 (clon de la familia 309 original aislado de la colección de Tn3 virgen; SEQ ID NO: 20) , 309FGwt (clon 309 original con un bucle FG humanizado; SEQ ID NO: 22), 340 (clon 309 con afinidad madura; SEQ ID NO: 24), 341 (clon 309 con afinidad madura; SEQ ID NO: 26), 342 (clon 309 con afinidad madura; SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 146), 343 (clon 309 con afinidad madura; SEQ ID NO: 30), 344 (clon 309 con afinidad madura; SEQ ID NO: 32), 345 (clon 309 con afinidad madura; SEQ ID NO: 34) , 346 (clon 309 con afinidad madura; SEQ ID NO: 36), 347 (clon 309 con afinidad madura; SEQ ID NO: 38) , 348 (clon 309 con afinidad madura; SEQ ID NO: 40) , 349 (clon 309 con afinidad madura; SEQ ID NO: 42) , 311 (clon de la familia 311 original aislado de la colección de Tn3 virgen; SEQ ID NO: 44) , 311K4E (variante del clon de la familia 311 procedente de la primera ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 46) ; 311K4E_1 (variante del clon de la familia 311 procedente de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 48) , 311K4E_2 (variante del clon de la familia 311 procedente de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 50) ; 311K4E_3 (variante del clon de la familia 311 procedente de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 52) ; 311K4E_4 (variante del clon de la familia 311 procedente de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 54) ; 311K4E 5 (variante del clon de la familia 311 procedente de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 56) ; 311K4E_7 (variante del clon de la familia 311 procedente de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 58) ; 311K4E_8 (variante del clon de la familia 311 procedente de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 60); 311K4E_9 (variante del clon de la familia 311 procedente de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 62) ; 311K4E_10 (variante del clon de la familia 311 procedente de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 64); 311K4E_11 (variante del clon de la familia 311 procedente de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 66) ; 311K4E_12 (variante del clon de la familia 311 procedente de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 68) ; 311K4E_13 (variante del clon de la familia 311 procedente de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 70) ; 311K4E_14 (variante del clon de la familia 311 procedente de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 72); 311K4E_15 (variante del clon de la familia 311 procedente de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 74) ; 311K4E_16 (variante del clon de la familia 311 procedente de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 76); 311K4E_19 (variante del clon de la familia 311 procedente de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 78) ; 311K4E_20 (variante del clon de la familia 311 procedente de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 80) y 311K4E_21 (variante del clon de la familia 311 procedente de la segunda ronda de maduración de la afinidad; SEQ ID NO: 82) .

En algunas modalidades, las subunidades monoméricas específicas para CD40L comprenden al menos una secuencia de bucle seleccionada entre las secuencias de bucles enumeradas en la TABLA 2. En otras modalidades, las subunidades monoméricas específicas para CD40L comprenden al menos una secuencia del bucle BC seleccionada entre las secuencias del bucle BC enumeradas en la TABLA 2. En otras modalidades, las subunidades monoméricas específicas para CD40L comprenden al menos una secuencia del bucle DE seleccionada entre las secuencias del bucle DE enumeradas en la TABLA 2. En otras modalidades, las subunidades monoméricas específicas para CD40L comprenden al menos una secuencia del bucle FG seleccionada entre las secuencias del bucle FG enumeradas en la TABLA 2.

En algunas modalidades, las subunidades monoméricas específicas para CD40L comprenden una secuencia del bucle BC seleccionada entre las secuencias del bucle BC enumeradas en la TABLA 2; y una secuencia del bucle DE seleccionada entre las secuencias del bucle DE enumeradas en la TABLA 2. En otras modalidades, las subunidades monoméricas específicas para CD40L comprenden una secuencia del bucle BC seleccionada entre las secuencias del bucle BC enumeradas en la TABLA 2; y una secuencia del bucle FG seleccionada entre las secuencias del bucle FG enumeradas en la TABLA 2. En otras modalidades, las subunidades monoméricas específicas para CD40L comprenden una secuencia del bucle DE seleccionada entre las secuencias del bucle DE enumeradas en la TABLA 2; y una secuencia del bucle FG seleccionada entre las secuencias del bucle FG enumeradas en la TABLA 2. En algunas modalidades, una subunidad monomérica específica para CD40L comprende secuencias de bucles correspondientes a secuencias de bucles de uno, dos o tres clones de Tn3 diferentes.

En ciertas modalidades, cuando la secuencia de las matrices de soporte monoméricas específica para CD40L contiene un conector y/o un marcador de histidina (p. ej . , un marcador His-8) en el extremo C de la secuencia o aminoácidos N-terminales adicionales, este conector C-terminal y/o marcador de histidina y los aminoácidos N-terminales adicionales se pueden eliminar, y por lo tanto la secuencia de aminoácidos correspondiente contiene una deleción de las secuencias del conector C-terminal y el marcador His y el aminoácido o los aminoácidos N-terminales adicionales.

En algunas modalidades, la matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L comprende una única subunidad monomérica, p. ej . , la secuencia del clon 342 (clon 309 con afinidad madura; SEQ ID NO: 28 y/o SEQ ID NO: 146) . En otras modalidades, la matriz de soporte específica para CD40L comprende más de una subunidad monomérica, p. ej . , dos subunidades monoméricas del clon 342 (SEQ ID NO: 28 y/o SEQ ID NO: 146) en tándem (remítase, p. ej . , a la SEQ ID NO: 135) . En modalidades específicas, las matrices de soporte de Tn3 de la invención se conjugan con una variante de HSA (remítase, p. ej . , a la SEQ ID NO: 134 y la SEQ ID NO: 135). En modalidades adicionales, la HSA se puede conjugar en el extremo N o el extremo C de la matriz de soporte de Tn3 multimérica.

En una modalidad específica, la matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L comprende una única subunidad monomérica 311K4E_12, un conector GS y una variante de HSA C34S (remítase, p. ej . , a la SEQ ID NO: 201). En otra modalidad específica, la matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L comprende una única subunidad monomérica 311K4E_12 con una variante CELTYG de una hebra beta C, un conector constituido íntegramente por glicina (todo glicina) y una variante de HSA C34S (remítase, p. ej . , a la SEQ ID NO: 202). En otra modalidad específica, la matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L comprende dos subunidades 311K4E_12 en tándem y dos conectores GS, donde uno de los conectores GS conecta las subunidades entre sí y un segundo conector GS conecta una subunidad a una variante de HSA C34S (remítase, p. ej., a la SEQ ID NO: 203). En otra modalidad específica adicional, la matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L comprende dos subunidades 311K4E_12 en tándem y dos conectores constituidos íntegramente por glicina, donde uno de los conectores constituidos íntegramente por glicina conecta las subunidades entre sí y un segundo conector constituido íntegramente por glicina conecta una subunidad a una variante de HSA C34S (remítase, p. ej . , a la SEQ ID NO: 204) .

En una modalidad específica, la matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L comprende dos subunidades 309 conectadas en tándem a través de un conector GS (remítase, p. ej . , a la SEQ ID NO: 205) . En otra modalidad específica, la matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L comprende una única subunidad 309 conectada a una variante de HSA C34S (remítase, p. ej . , a la SEQ ID NO: 206) . En otra modalidad específica, la matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L comprende dos subunidades 309 en tándem y dos conectores GS, donde uno de los conectores GS conecta las subunidades entre sí y un segundo conector GS conecta una subunidad a una variante de HSA C34S (remítase, p. ej . , a la SEQ ID NO: 207).

En una modalidad específica, la matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L comprende una única subunidad monomérica 342, un conector GS y una variante de HSA C34S (remítase, p. ej . , a la SEQ ID NO: 134). En otra modalidad específica, la matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L comprende una única subunidad monomérica 342, un conector constituido íntegramente por glicina y una variante de HSA C34S (remítase, p. ej . , a la SEQ ID NO: 144). En otra modalidad específica, la matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L comprende dos subunidades 342 en tándem y dos conectores GS, donde uno de los conectores GS conecta las subunidades entre sí y un segundo conector GS conecta una subunidad a una variante de HSA C34S (remítase, p. ej . , a la SEQ ID NO: 135) . En otra modalidad específica adicional, la matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L comprende dos subunidades 342 en tándem y dos conectores constituidos íntegramente por glicina, donde uno de los conectores constituidos íntegramente por glicina conecta las subunidades entre sí y un segundo conector constituido íntegramente por glicina conecta una subunidad a una variante de HSA C34S (remítase, p. ej . , a la SEQ ID NO: 145) . En otra modalidad específica adicional, la matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L comprende dos subunidades 342 conectadas en tándem a través de un conector GS (remítase, p. ej . , a la SEQ ID NO: 208) .

En una modalidad específica, la matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L comprende, en otra modalidad específica, la matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L comprende una subunidad 311 o una subunidad derivada de 311 (p. ej . , 311K4E_12) y una subunidad 309 o una subunidad derivada de 309 (p. ej . , 342) en tándem y dos conectores GS, donde un conector GS conecta las subunidades entre sí y un segundo conector GS conecta una subunidad a una variante de HSA C34S (remítase, p. ej . , a la SEQ ID NO: 135). En otra modalidad específica adicional, la matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L comprende una subunidad 311 o una subunidad derivada de 311 (p. ej . , 311K4E_12) y una subunidad 309 o una subunidad derivada de 309 (p. ej . , 342) en tándem y dos conectores constituidos íntegramente por glicina, donde uno de los conectores constituidos íntegramente por glicina conecta las subunidades entre sí y un segundo conector constituido íntegramente por glicina conecta una subunidad a una variante de HSA C34S (remítase, p. ej . , a la SEQ ID NO: 145) .

En la FIG. 2A se muestran ejemplos de matrices de soporte de Tn3 específicas para CD40L bivalentes en tándem y fusiones con albúmina sérica (SA) (remítase también a la FIG. 9A) . Aunque se proporcionan conectores específicos en la FIG. 2A, se contemplan otros conectores como los proporcionados en la presente. Aunque se puede utilizar SA madura natural, p. ej . , albúmina sérica murina (MSA) o albúmina sérica humana (HSA) , se contempla que se puedan sustituir uno o más residuos aminoacídicos de cisteína (C) en la SA madura, por ejemplo, por serina (S) , alanina (A) , glicina (G) , etc.

A continuación se muestran constructos representativos. La secuencia de la SA está subrayada. Los conectores están en un recuadro. Se sobreentenderá que numerosas variaciones quedan incluidas dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, los conectores se pueden alterar (en la presente se proporcionan varios ejemplos no limitantes) , el primero o los dos residuos aminoacídicos N-terminales (SQ) pueden estar ausentes y/o sustituidos con residuos aminoacídicos alternativos, se puede incorporar un marcador (p. ej . , marcador 6xHis) , se pueden utilizar matrices de soporte específicas para CD40L alternativas (p. ej . , aquellas basadas en el 10.° dominio Fn3 de la fibronectina) en un constructo similar, etc.

Constructo 1 de HSA monovalente 342 (SEQ ID NO: 134) [monómero 342] -conector (G4S) 2-HSAc34s SQIEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPD TEYEVSLICRSGDMSSNPAKETFTTGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLI AFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYG EMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARR HPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQK FGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVStLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEA DV FLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLE CCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQ NLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKR MPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVT CCTESLVMRRPCFSALEVDETYVPKEFNAE TFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAV DDFAAFVEKCCKADDKE TCFAEEGKKLVAASQAALGL Constructo 2 de HSA monovalente 342 (SEQ ID NO: 144) [monómero 342] -conector G10-HSAC34S: SQIEVKDVTDTTALITWSDDFGEYV CELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPD TEYEVSLICRSGDMSSNPAKETFTTGGGGGGGGGGDAHKSEVAHRFKDLGEENF ALVLI AFAQYLQQSPFEDHVKLV EVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYG EMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARR HPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQK FGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDV FLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQ NLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKR MPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAE TFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLIAV DDFAAFVEKCCKADDKE TCFAEEGKKLVAASQAALGL Constructo 1 de HSA bivalente 342 (SEQ ID NO: 135) [monómero 342] -conector (G4S) 3- [monómero 342] -conector (GS) 2-HSAC34S: SQIEVKDVTDTTALITWSDDFGEYV CELTYGIKDVPGDRTTIDL YHHAHYSIGNL PD TEYEVSLICRSGDMSSNPAKETFTTGGGGSGGGGSGGGGSRLDAPSQIEVKDVTDTTALI T SDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDL YHHAHYSIGNLKPDTEYEVSLICRSGDMS SNPAKETFTTGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHV KLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGD LCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNE CFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR YKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLS QRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCE KPLLE SHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCK YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPD YSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLI QNCELFEQLGE YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLG VGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQL CVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKE RQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAV DDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQ AALGL Constructo 2 de HSA bivalente 342 (SEQ ID NO: 145) [monómero 342] -conector G15- [monómero 342] -conector Gi0-HSAC34S: SQIEV DVTDTTALIT SDDFGEYV CELTYGIKDVPGDRTTIDL YHHAHYSIGNL PD TEYEVSLICRSGDMSSNPAKETFTTGGGGGGGGGGGGGGGRLDAPSQIEVKDVTDTTALI TWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPDTEYEVSLICRSGD S SNPAKETFTTGGGGGGGGGGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHV KLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNE CFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDV CTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR YKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLS QRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCE KPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPD YSWLLLRIAKTYETTLEKCCAAADPHECYA VFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQL CVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVP EFNAETFTFHADICTLSEKE RQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCC ADDKETCFAEEGKKLVAASQ AALGL Constructo 1 de HSA monovalente 311K4E_12 (SEQ ID NO: 201) [monómero 311K4E_12] -conector (G4S) 2-HSAC34S : SQIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLK PDTEYEVSLICLTTDGTY NPAKETFTTGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKAL VLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRE TYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEI ARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCAS LQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAK YICENQDSISS LKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEA 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NAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAV DDFAAFVEKCCKAD DKETCFAEEGKKLVAASQAALGL Constructo 1 de HSA bivalente 311K4E_12 (SEQ ID NO: 203) [monómero 311K4E_12] -conector G4S3- [monómero 311K4E_12] -conector (G4S)2-HSAC34S : SQIE EDVTDTTALITWTNRSSYSNLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLK PDTEYEVSLICLTTDGTYNNPAKETFTTGGGGSGGGGSGGGGSRLDAPSQIEVEDVTDTT ALITWTNRSSYSNLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKPDTEYEVSLICL TTDGTYNNPAKETFTTGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQS PFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQ EPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPEL LFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAW AVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSK LKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEY ARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCEL FEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLS WLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADIC TLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKK LVAASQAALGL Constructo 2 de HSA bivalente 311K4E_12 (SEQ ID NO: 204) [monómero 311K4E_12] -conector G1S- [monómero 311K4E_12] -conector Gi0-HSAC34S: SQIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLK PDTEYEVSLICLTTDGTY NPAKETFTTGGGGGGGGGGGGGGGRLDAPSQIEVEDVTDTT ALITWTNRSSYSNLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKPDTEYEVSLICL TTDGTYNNPAKETFTTGGGGGGGGGGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQS PFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQ EPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPEL LFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAW AVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSK LKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEY ARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCEL FEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLS WLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADIC TLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKK LVAASQAALGL Composiciones farmacéuticas En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo, sin carácter limitante, una composición farmacéutica, que contiene una o una combinación de matrices de soporte de Tn3 de la presente invención, formulada junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones pueden incluir una o una combinación de, por ejemplo, sin carácter limitante, dos o más matrices de soporte de Tn3 de la invención diferentes. Por ejemplo, una composición farmacéutica de la invención puede comprender una combinación de matrices de soporte de Tn3 que se unen a epítopos diferentes en el antígeno diana o que tienen actividades complementarias. En una modalidad específica, una composición farmacéutica comprende una única matriz de soporte de Tn3 monomérica de la invención. En una modalidad específica, una composición farmacéutica comprende una matriz de soporte de Tn3 multimérica de la invención. En otra modalidad específica más, una composición farmacéutica comprende una matriz de soporte de Tn3 dimérica de la invención .

Las composiciones farmacéuticas de la invención también se pueden administrar en terapia combinada, tal como, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia combinada puede incluir una matriz de soporte de Tn3 de la presente invención combinada con al menos una terapia adicional donde la terapia puede ser inmunoterapia, quimioterapia, radioterapia o terapia con fármacos. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables.

Métodos de empleo de las matrices de soporte Las matrices de soporte de Tn3 de la presente invención tienen utilidades terapéuticas y diagnósticas in vitro e in vivo. Por ejemplo, estas moléculas se pueden administrar a las células en un cultivo, p. ej . , in vitro o ex vivo, o en un sujeto, p. ej . , in vivo, para tratar, prevenir o diagnosticar diversos trastornos.

La invención también proporciona métodos de empleo de las matrices de soporte de Tn3 de la invención. La presente invención también abarca el uso de las matrices de soporte de Tn3 de la invención para prevenir, diagnosticar, controlar, tratar o mejorar uno o más síntomas asociados con enfermedades, trastornos patológicos o trastornos que incluyen, sin carácter limitante, el cáncer, trastornos inflamatorios y autoinmunitarios e enfermedades infecciosas, ya sea solas o combinadas con otras terapias. La invención también abarca el uso de las matrices de soporte de Tn3 de la invención conjugadas o fusionadas con un resto (p. ej . , agente terapéutico o fármaco) para prevenir, controlar, tratar o mejorar uno o más síntomas asociados con enfermedades, trastornos o infecciones que incluyen, sin carácter limitante, el cáncer, trastornos inflamatorios y autoinmunitarios e enfermedades infecciosas, ya sea solas o combinadas con otras terapias.

La invención también proporciona métodos para el bloqueo de epítopos que no se consigue fácilmente con anticuerpos convencionales. Por ejemplo, en una modalidad, las matrices de soporte de Tn3 de la invención se pueden utilizar para bloquear primero un antígeno adyacente y durante la unión, otro dominio de unión se puede acoplar al antígeno críptico.

La invención también proporciona métodos de empleo de las matrices de soporte de Tn3 de la invención para juntar tipos de células diferentes. En una modalidad, las proteínas de la invención pueden unirse a una célula diana con un dominio de unión y reclutar otra célula a través de otro dominio de unión. En otra modalidad, la primera célula puede ser una célula cancerosa y la segunda célula es una célula efectora inmunitaria tal como un linfocito NK. En otra modalidad, las matrices de soporte de Tn3 de la invención se pueden utilizar para fortalecer la interacción entre dos células diferentes, tales como una célula presentadora de antígeno y un linfocito T, con el fin de estimular posiblemente la respuesta inmunitaria.

La invención también proporciona métodos de empleo de las matrices de soporte de Tn3 para reducir una población celular. En una modalidad, los métodos de la invención son útiles en la reducción de los siguientes tipos de células: eosinófilos, basófilos, neutrófilos, linfocitos T, linfocitos B, mastocitos, monocitos y células tumorales .

La invención también proporciona métodos de empleo de las matrices de soporte de Tn3 como reactivos de diagnóstico. Tales reactivos de diagnóstico se podrían utilizar para evaluar la presencia o ausencia de CD40L, la presencia del receptor CD40, la eficiencia de la unión de CD40L al receptor CD40, el CD40L libre en un paciente, el CD40L libre en una muestra o el CD40L unido al receptor CD40 en una muestra.

Las matrices de soporte de Tn3 de la invención y las composiciones que las comprenden son útiles para muchos propósitos, por ejemplo, como agentes terapéuticos contra una amplia gama de enfermedades y trastornos crónicos y agudos que incluyen, sin carácter limitante, enfermedades autoinmunes y/o inflamatorias. Las composiciones y los métodos de la invención que se describen en la presente son útiles para prevenir o tratar trastornos autoinmunitarios y/o trastornos inflamatorios.

Los ejemplos de trastornos autoinmunitarios y/o inflamatorios incluyen, sin carácter limitante, alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos , enfermedad autoinmune de Addison, enfermedades autoinmunes de la glándula suprarrenal, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, ooforitis y orquitis autoinmunes, síndrome de Sjogren, psoriasis, aterosclerosis , retinopatías diabéticas y de otros tipos, fibroplasia retrolental, degeneración macular asociada con la edad, glaucoma neovascular, hemangiomas, hiperplasias tiroideas (incluida la enfermedad de Grave) , trasplante de cornea y de otros tejidos e inflamación crónica, sepsis, artritis reumatoide, peritonitis, enfermedad de Crohn, lesión por reperfusión, septicemia, choque endotóxico, fibrosis quística, endocarditis, psoriasis, artritis (p . ej . , artritis psoriásica) , choque anafiláctico , isquemia orgánica, lesión por reperfusión, lesión de la médula espinal y rechazo de injerto, trobocitopenia autoinmune, enfermedad de Behcet, penfigoide ampolloso, cardiomiopatía, dermatitis herpetiforme, síndrome de fatiga crónica y disfunción inmunitaria (SFCDI) , polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Churg-Strauss , penfigoide cicatrical, síndrome de CREST, síndrome de aglutininas frías, enfermedad de Crohn, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia-fibromiositis , glomerulonefritis , enfermedad de Graves, Guillain-Barre , tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI) , neuropatía por IgA, artritis juvenil, liquen plano, lupus eritematoso, enfermedad de Meniere, conectivitis mixta, esclerosis múltiple, diabetes mellitus mediada por el sistema inmunitario o de tipo 1, miastenia grave, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policrondritis , síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis psoriásica, fenómeno de Raynauld, síndrome de Reiter, artritis reumatoide, sarcoidosis, escleroderma, síndrome de Sjogren, síndrome de Stiff-man, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, colitis ulcerativa, uveítis, vasculitis tales como vasculitis de la dermatitis herpetiforme, vitíligo y granulomatosis de Wegener.

Los ejemplos de trastornos inflamatorios incluyen, sin carácter limitante, asma, encefalitis, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) , trastornos alérgicos, choque séptico, fibrosis pulmonar, espondiloartropatía indiferenciada, artropatía indiferenciada, artritis, osteolisis inflamatoria e inflamación crónica como resultado de infecciones víricas o bacterianas. Las composiciones y los métodos de la invención se pueden utilizar con una o más terapias convencionales que se pueden utilizar para prevenir, controlar o tratar las en ermedades anteriores .

La invención proporciona métodos para prevenir, controlar, tratar o mejorar el cáncer, enfermedades autoinmunes, inflamatorias o infecciosas, o uno o más síntomas, o uno o más de sus síntomas, donde dichos métodos comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una o más matrices de soporte de Tn3 de la invención combinadas con uno o más agentes terapéuticos que no sean agentes anticancerosos (también conocidos como, terapias no anticancerosas) .

Los ejemplos de estos agentes incluyen, sin carácter limitante, agentes antieméticos, agentes antifúngicos, agentes antibacterianos, tales como antibióticos, agentes antiinflamatorios y agentes antivirales. Los ejemplos no limitantes de agentes antieméticos incluyen metopimazina y metoclopramida . Los ejemplos no limitantes de agentes antifúngicos incluyen fármacos azólicos, imidazol, triazol, polieno, amfotericina y ririmidina. Los ejemplos no limitantes de agentes antibacterianos incluyen dactinomicina, bleomicina, eritromicina, penicilina, mitramicina, cefalosporina, imipenem, axtreonam, vancomicina, cicloserina, bacitracina, cloramfenicol , clindamicina, tetraciclina, estreptomicina, tobramicina, gentamicina, amikacina, kanamicina, neomicina, espectinomicina, trimetoprim, norfloxacina, refampina, polimixina, amfotericina B, nistatina, cetocanazol, isoniazida, metronidazol y pentamidina. Los ejemplos no limitantes de agentes antivirales incluyen análogos de nucleósidos (p. ej . , zidovudina, aciclivir, gangciclivir, vidarbina, idoxuridina, trifluridina y ribavirina) , foscaret, amantadina, rimantadina, saquinavir, indinavir, ritonavir, interferón ( " IFN" ) , ß o y y AZT. Los ejemplos no limitantes de agentes antiinflamatorios incluyen fármacos antiinflamatorios no esteroides ("AINE"), fármacos antiinflamatorios esteroides, agonistas beta, agentes anticolinérgicos y metilxantinas .

En una modalidad, la invención comprende composiciones capaces de tratar la inflamación crónica. En una modalidad, las composiciones son útiles en el direccionamiento de células inmunitarias para su destrucción o desactivación. En una modalidad, las composiciones son útiles en el direccionamiento de linfocitos T activados, linfocitos T inactivos, linfocitos B, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, mastocitos o células dendríticas. En otra modalidad, la invención comprende composiciones capaces de reducir la función de las células inmunitarias . En otra modalidad, las composiciones son capaces de suprimir la función de las células inmunitarias.

En otra modalidad, la invención comprende composiciones útiles para el tratamiento de enfermedades del tubo digestivo. Las matrices de soporte de la invención exhiben un nivel alto de estabilidad en condiciones de pH bajo. La estabilidad a pH bajo sugiere que la composición será adecuada para la administración oral para varios trastornos gastrointestinales, tales como el síndrome del intestino irritable, el reflujo gastroesofágico, pseudoobstrucciones intestinales, síndrome de evacuación gástrica rápida, náuseas resistentes al tratamiento, úlcera péptica, apendicitis, colitis isquémica, colitis ulcerativa, gastritis, enfermedad por Helicojbacter pylori, enfermedad de Crohn, enfermedad de Whipple, celiaquía, diverticulitis , diverticulosis, disfagia, hernia de hiato, trastornos por infecciones esofágicas, hipo, mericismo y otros.

La invención también proporciona composiciones combinatorias y métodos de empleo de tales composiciones en la prevención, el tratamiento, la reducción o la mejora de la enfermedad o sus síntomas. Las matrices de soporte de Tn3 de la invención se pueden combinar con terapias convencionales adecuadas para la prevención, el tratamiento, la reducción o la mejora de la enfermedad o sus síntomas. Las terapias convencionales representativas se pueden encontrar en Physician's Desk Reference (56.a ed. , 2002 y 57.a ed. , 2003). En algunas modalidades, las matrices de soporte de Tn3 de la invención se pueden combinar con quimioterapia, radioterapia, cirugía, inmunoterapia con un agente biológico (anticuerpo o péptido) , moléculas de bajo peso molecular u otra terapia conocida en la técnica. En algunas modalidades, la terapia combinatoria se administra a la vez. En otras modalidades, la terapia combinatoria se administra por separado.

La invención también proporciona métodos para diagnosticar enfermedades. Las matrices de soporte de Tn3 de la invención que se unen a una diana específica asociada con una enfermedad se pueden implementar en un método utilizado para diagnosticar la enfermedad. En una modalidad, las matrices de soporte de Tn3 de la invención se utilizan en un método para diagnosticar una enfermedad en un sujeto, donde el método comprende obtener una muestra a partir del sujeto, poner en contacto la diana con la matriz de soporte de Tn3 en la muestra en condiciones que permitan que se forme la interacción de diana :matriz de soporte, identificar el complejo de diana:matriz de soporte y de este modo se detecta la diana en la muestra. En otras modalidades, la enfermedad que se desea diagnosticar se describe en la presente.

La invención también proporciona métodos para el registro gráfico de imágenes de dianas específicas. En una modalidad, las matrices de soporte de Tn3 de la invención conjugadas con contrastes tales como proteínas fluorescentes verdes, otros marcadores fluorescentes (Cy3, CyS, rodamina y otros) , biotina o radionucleidos se pueden utilizar en métodos para el registro gráfico de imágenes de la presencia, la ubicación y el avance de una diana específica. En algunas modalidades, el método para el registro gráfico de imágenes de una diana que comprende una matriz de soporte de Tn3 de la invención se lleva a cabo in vitro. En otras modalidades, el método para el registro gráfico de imágenes de una diana que comprende una matriz de soporte de Tn3 de la invención se lleva a cabo in vivo. En otras modalidades, el método para el registro gráfico de imágenes de una diana que comprende una matriz de soporte de Tn3 de la invención se lleva a cabo por MRI, barrido PET, rayos X, detección de fluorescencia y por otros métodos de detección conocidos en la técnica.

La invención también proporciona métodos para monitorizar el avance, la recidiva, el tratamiento o la mejora de una enfermedad utilizando las matrices de soporte de la invención. En una modalidad, los métodos para monitorizar el avance, la recidiva, el tratamiento o la mejora de una enfermedad se llevan a cabo mediante los métodos de registro gráfico de imágenes, diagnóstico o poniendo un compuesto/diana en contacto con una matriz de soporte de Tn3 de la invención como las presentadas en la presente.

Dosificación y administración farmacéutica Para preparar composiciones farmacéuticas o estériles que incluyen una matriz de soporte de Tn3 de la invención, se mezcla una matriz de soporte con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Para la administración, las composiciones están preferentemente exentas de pirógenos y están sustancialmente exentas de endotoxinas y/o sustancias pirogénicas relacionadas. La selección de un régimen de administración para un agente terapéutico depende de varios factores que incluyen la tasa de renovación sérica o tisular de la entidad, el nivel de los síntomas, la inmunogenia de la entidad y la accesibilidad de las células diana en la matriz biológica. En ciertas modalidades, un régimen de administración maximiza la cantidad de agente terapéutico administrado al paciente que concuerde con un nivel aceptable de efectos secundarios.

Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden variar para obtener así una cantidad del principio activo que sea eficaz para conseguir la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particulares, sin que sea tóxica para el paciente. Los niveles de dosificación seleccionados dependerán de diversos factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas o el éster, la sal o la amida de estas, la vía de administración, el periodo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se esté empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales empleados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, la afección, el estado de salud general y el historial clínico anterior del paciente que se esté tratando, y factores similares muy conocidos en las técnicas médicas.

Una composición de la presente invención también se puede administrar a través de una o más vías de administración utilizando uno o más de diversos métodos conocidos en la técnica. En ciertas modalidades, las matrices de soporte de Tn3 de la invención se pueden formular para garantizar una distribución adecuada in vivo.

Equivalentes Los expertos en la técnica reconocerán o serán capaces de determinar, sin utilizar nada más que experimentación rutinaria, muchos equivalentes de las modalidades específicas de la invención descritas en la presente. Se pretende que tales equivalentes queden abarcadas por las siguientes reivindicaciones.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en esta memoria descriptiva se incorporan a la presente por referencia en la misma medida que si se indicara de forma específica e individual que cada publicación, patente o solicitud de patente individual se incorporase a la presente por referencia.

EJEMPLOS A continuación, la invención se describe haciendo referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son únicamente ilustrativos y no se debe interpretar de ningún modo que la invención se limite a estos ejemplos, sino que se debe interpretar como que engloba todas y cada una de las variaciones que sean evidentes como resultado de la información que se proporciona en la presente.

Ejemplo 1 Construcción de una colección de 3 bucles en la matriz de soporte de Tn3 original Se construyó una colección basándose en la matriz de soporte de Tn3 original, descrita en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional N.° WO 2009/058379, donde esta se denomina "Tn3 SS4 " . La colección contenía regiones aleatorizadas de los bucles BC, DE y FG. Este diseño incorporaba la secuencia caracterizada y diversidad de longitudes de los bucles en la colección de Tn3 , coherentes con los patrones de diversidad descritos para los dominios FnlII naturales, tres longitudes diferentes para los bucles BC y PG, y se empleó un esquema de codones mixtos "NHT" para introducir diversidad en la colección (H = A, T, C) . Este esquema generaba 12 codones que codificaban 12/20 aminoácidos (remítase a la TABLA 3) , es decir, cada codón codificaba un único aminoácido. Es más, no hay ningún codón de parada o cisteína (Cys) .

TABLA 3 La diversidad de la colección se generó utilizando ios oligonucleótidos degenerados que se muestran en la TABLA 4.

TABLA 4 Códigos de los nucleótidos: N = G/A/T/C; H = A/T/C; R = A/G; S = G/C; B = T/C/G; V = A/C/G; M = A/C; K = G/T La colección se preparó utilizando los oligonucleótidos que se muestran en la TABLA 5.

TABLA 5 Se creó una mezcla de los oligonucleótidos degenerados (proporciones equimolares de los oligonucleótidos correspondientes a los bucles BC y FG, respectivamente) , BCX-DE bridge v2 , DE-FGX bridge v2 y Kpnl amp rev v2 en una reacción PCR de 20 ciclos sin un exceso de cebadores externos. Este producto se diluyó y se amplificó en una reacción de PCR ordinaria utilizando los cebadores BC library amp v2 y Kpnl reverse v2. El producto resultante de la PCR generó un gen Tn3 completo que se digirió a continuación con Ncol y Kpnl, y se ligó al vector de expresión en fagos (descrito en WO 2009/058379) . El ADN se transformó en E. coli por electroporación. La diversidad final de la colección se estimó que era de aproximadamente 7.9 x 1010 miembros.

Tras la electroporación, la colección se incubó durante 1 hora a 37° C con agitación. Se añadió el fago cooperador M13K07 y después de una hora las células se diluyeron hasta un volumen superior y se cultivaron a 37 °C con agitación durante la noche. Al día siguiente, se retiraron los fagos y se concentraron a partir del sobrenadante por precipitación con PEG 8000.

Ejemplo 2 Adsorción de colecciones para matrices de soporte de Tn3 especificas para el CD40L humano Se adsorbieron colecciones de Tn3 expresadas en fago que contenían >1010 secuencias únicas frente a CD40L. La diversidad de estas colecciones se derivó de la variabilidad de las secuencias y longitudes en los bucles BC, DE y FG los cuales son análogos a los tres bucles CDR de un dominio variable de un anticuerpo. La selección de las proteínas de Tn3 líderes se llevó a cabo adsorbiendo colecciones en CD40L humano biotinilado recombinante y una línea celular CHO que sobreeexpresaba CD40L. Se utilizaron rondas alternas de adsorción frente a estos dos reactivos para garantizar que las líderes reconocerían el dominio extracelular recombinante así como también el CD40L anclado en la membrana nativo.

Se biotiniló el CD40L humano recombinante (MegaCD40L humano; Axxora) con EZ-Link sulfo-NHS-biotina (Pierce, Rockford, IL) utilizando un exceso molar del quíntuple del reactivo biotinilante . Tras incubar durante 1 hora a temperatura ambiente, la muestra se dializó en PBS durante la noche para eliminar la biotina no conjugada. Se inmovilizaron 10 ig de CD40L biotinilado sobre microesferas de estreptavidina M280 (Dynal, Carlsbad, CA) y a continuación se realizó un bloqueo con PBS que contenía 10 mg/mL de BSA durante 2 horas. El estímulo consistía en colecciones desarrolladas como se describe en el Ejemplo 1 o, adicionalmente, colecciones desarrolladas utilizando técnicas de construcción estándar, tales como las descritas en WO 2009/058379.

Los fagos se bloquearon en PBS que contenía 10 mg/mL de BSA durante 2 horas. El estímulo bloqueado se añadió a microesferas de estreptavidina M280 de control bloqueadas (sin diana) y se incubó en un agitador de balanceo durante 2 horas a temperatura ambiente para reducir la colección de ligantes a las microesferas. La colección reducida se añadió posteriormente a las microesferas recubiertas con CD40L y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente en una plataforma de balanceo. Después de tres lavados con PBST (PBS + Tween al 0.1%) para eliminar el fago no unido, las microesferas se añadieron a células E. coli XL-1 Blue en fases de crecimiento exponenciales, que se coinfectaron subsecuentemente con el fago cooperador 13K07 en 60 mL de medio 2xYT que contenía 50 µg/mL· de carbenicilina . Tras cultivar durante la noche a 37 °C con agitación, se recogieron los fagos por precipitación con PEG a partir del medio que se había cultivado durante la noche.

La segunda ronda de adsorción (Ronda 2) se llevó a cabo en una línea celular CHO que sobreexpresaba CD40L. La colección de fagos se bloqueó en 3% de BSA/PBS con balanceo a temperatura ambiente durante 1 hora. Las células se desprendieron con Accutase (Invitrogen) , se lavaron 2x con 5 mL de PBS y se bloquearon 107 células en 1 mL de 3% de BSA/PBS con balanceo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las células bloqueadas se centrifugaron a 500xg, 5 minutos, se resuspendieron cuidadosamente en la solución de la colección de fagos bloqueados y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Se eliminó el fago no unido lavando cuidadosamente las células 3 veces en 1 mL de 3% de BSA/PBS y una vez en PBS, y formando un pellet celular por centrif gación a 500xg durante 5 minutos en una microcentrífuga utilizando un tubo Eppendorf nuevo para cada lavado. El pellet celular se añadió directamente a E. coli XL-1 Blue en fases de crecimiento exponenciales, que se procesaron posteriormente como se describe en la Ronda 1.

La Ronda de adsorción 3 se llevó a cabo como se describe en la Ronda 1, salvo que los fagos unidos se eluyeron añadiendo HCl 100 mM seguido de la neutralización con Tris-HCl 1 M, pH 8. Se utilizó fago neutralizado eluido para infectar las células E. coli XL1 Blue como se describe en la Ronda 1.

La Ronda de adsorción 4 nuevamente se llevó a cabo en células como se describe en la Ronda 2, salvo que se realizaron 5 lavados en 3% de BSA/PBS. La Ronda 5 se realizó utilizando 5 ig de MegaCD40L biotinilado, pero por lo demás al igual que se describe para la Ronda 3.

Después de 5 rondas de adsorción, se realizó una selección de las variantes de Tn3 resultantes como proteína soluble. Se utilizaron stocks de fagos amplificados y precipitados con PEG en una PCR para amplificar un conjunto de fragmentos que abarcaban las secuencias de Tn3 codificadas. Este conjunto de fragmentos se digirió con Ncol + Kpnl y se clonó en los sitios Ncol - Kpnl correspondientes del plásmido pSec-oppA (L25M) -Tn3 (remítase, por ejemplo, a O 2009/058379) . Se inocularon células E. coli BL21 DE3 transformadas con los constructos derivados pSec-oppA (L25M) -Tn3 en MagicMedia autoinductor (Invitrogen) que contenía carbenicilina (100 g/mL) en placas de 96 pocilios profundos. Los cultivos se cultivaron durante 18 horas con agitación a 37 °C y las células se separaron del medio por centrifugación. El medio que contenía variantes de Tn3 solubles secretadas se utilizó directamente en un ensayo de criba para la unión a CD40L.

Se cribaron diez grupos de 96 clones para identificar las proteínas Tn3 que se unían específicamente al CD40L recombinante . Resumiendo, el ensayo de criba empleó la captura de variantes de Tn3 marcadas con His solubles secretadas en el medio por unión a un anticuerpo anti-His inmovilizado en pocilios de microplacas. Tras la captura, el medio y la proteína en exceso se eliminaron por lavado, y la interacción entre las variantes de Tn3 capturadas y CD40L se monitorizó utilizando MegaCD40L humano biotinilado y midiendo la diana remanente (después de lavar la placa) mediante SA-HRP y con reactivos de ELISA convencionales.

En el paso de captura, el anticuerpo anti-His inmovilizado se saturó con Tn3 y la cantidad molar de Tn3 capturado en cada pocilio se volvió prácticamente idéntica independientemente de los niveles de expresión de los clones individuales. Esta normalización de los niveles de Tn3 dio como resultado niveles de ensayo proporcionales a la eficiencia de la interacción con la diana e inafectados por las diferencias potenciales en los niveles de expresión de la proteína .

Los positivos para este ensayo se secuenciaron para identificar 34 secuencias de Tn3 únicas que se unieron al CD40L recombinante . Entre el panel de secuencias de Tn3 que se unen a CD40L únicas, un subgrupo de 24 clones, que tenían una señal de ensayo robusta y unos buenos niveles de expresión a juzgar por la SDS-PAGE del sobrenadante del cultivo, se sometió a reexpresión y purificación a pequeña escala .

En resumen, se inocularon células E. coli BL21 DE3 transformadas con los constructos derivados pSec-oppA (L25M) -Tn3 en medio Superbroth que contenía carbenicilina (100 g/mL) con 1% de glucosa. Los cultivos se cultivaron a 37 °C hasta una densidad óptica (D.O.) de 0.5-0.8 y a continuación se indujeron con IPTG 0.2 mM. Tras agitar a 37 °C durante 5 horas, las células se separaron del medio por centrifugación. La purificación de las matrices de soporte de Tn3 del medio se efectuó mediante purificación por lotes utilizando Ni-NTA Superflo (Qiagen) , lavando en 2x PBS con imidazol 20 mM y eluyendo con 2x PBS con imidazol 250 mM. Las muestras se dializaron en PBS y las concentraciones se determinaron por absorbancia UV a 280 nm de acuerdo con Gilí and von Hippel (Anal. Biochem. 182: 319, 1989).

Sobre la base de la clasificación del ensayo y el comportamiento SEC, la expresión de 8 líderes se escaló y se purificó hasta niveles de endotoxinas bajos (< 1 EU/mg) para su evaluación en un ensayo celular funcional.

Dos clones de Tn3 (denominados 309 y 311) mostraron una actividad similar en ensayos bioquímicos y a base de células (FIGS. 6A, 6B, 6C) , y fueron 3-5 veces más potentes que el clon rival más próximo.

Las matrices de soporte de Tn3 específicas para CD40L humano monovalentes 309 y 311 inhibieron el número total de linfocitos B, el número de células plasmáticas y la conmutación de clase de Ig (FIGS. 6A, 6B y 6C) . La FIG. 6 A muestra el efecto inhibitorio de 309 y 311 sobre la expresión de CD86 inducida por HuCD40L en PBMC humanas positivas para CD19 estimuladas con células DI .1 Jurkat; la FIG. 6B muestra la inhibición de la proliferación de los linfocitos B estimulada por HuCD40L por parte de 309 y 311; y la FIG. 6C C muestra la inhibición del número de células plasmáticas en cocultivos de linfocitos T/B. También se demostró que 309 se une a linfocitos T primarios activados por FACS (los datos no se muestran) . Se estimularon PBMC con MegaCD40L humano recombinante (Axxora) o células Jurkat que expresaban CD40L humano (Dl.l, ATCC) , y se midió el porcentaje de células CD19+/CD86+ por FACS después de 24 horas.

Los clones líderes 309 y 311 se monodispersaron y no presentaron ninguna tendencia a agregarse o formar oligómeros de orden superior en solución según se determinó mediante un análisis cromatográfico de exclusión por tañamos (SEC) de muestras purificadas (FIG. 7A) .

Las estabilidades térmicas de los clones líderes 309 y 311 se determinaron por calorimetría diferencial de barrido (CDB) utilizando muestras proteicas con una concentración de 1 mg/mL en PBS a pH 7.2 y se compararon con la estabilidad térmica de la proteína Tn3 original (FIG. 7B) . Los clones líderes 309 y 3011 tenían Tm de 70 ± 1 °C cuyo valor era solo ligeramente inferior a la Tm de la Tn3 original (72 °C) .

Como no se identificaron clones con reactividad cruzada murinos se llevó a cabo un proceso de adsorción similar al descrito anteriormente para identificar la Tn3 específica murina denominada M13. M13 también presentó actividad en un ensayo a base de células PBMC (remítase a la FIG. 1A) Ejemplo 3 Optimización de las matrices de soporte de Tn3 específicas para CD40L líderes La optimización de la afinidad se utilizó para incrementar la potencia de los líderes de Tn3 seleccionados. En general, se realizaron una o más rondas de mutagénesis en los bucles de Tn3 por contacto con la diana, con la selección de variantes mejoradas a partir de colecciones de expresión en fagos combinatorias. 3.1 Intercambio de bucles Con el fin de determinar cuáles de los 3 bucles en los dos líderes participaban en la interacción con CD40L, se generaron constructos en los que cada secuencia de bucle individual se modificó por la secuencia de bucle de la Tn3 original tal como se encuentra en la tenascina C humana. Se compararon las actividades de las variantes mutadas con las variantes originales en un ensayo de unión llevado a cabo como se describe para el ensayo de criba descrito anteriormente (FIG. 10A) . Para ambos líderes la mutación de los bucles BC y DE provocó una pérdida completa de la unión a CD40L, mientras que la modificación del bucle FG por la secuencia de Tn3 original no producía ningún efecto (para 309) o un efecto limitado (311) sobre la unión. Por lo tanto, los bucles BC y DE parecían contener las secuencias principalmente responsables del contacto con CD40L, y por eso se seleccionaron fundamentalmente para optimizar la afinidad. 3.2 Optimización del líder 309 de las matrices de soporte de Tn3 específicas para CD40L Como el experimento de intercambio de bucles indicó que la secuencia del bucle FG de 309 se podía sustituir con la secuencia del bucle FG de Tn3 original sin una pérdida sustancial de potencia de unión, se decidió utilizar este constructo (denominado 309FGwt) como base para la maduración de la afinidad. Esto eliminaría las mutaciones no esenciales que se desvíen de la secuencia de tenascina C original para reducir el riesgo de posible inmunogenia. Cabe notar que la secuencia del bucle FG de Tn3 original contenía un motivo RGD que se eliminó posteriormente mediante una mutación en las moléculas líderes finales. Se generaron tres colecciones de bucles BC y una colección de bucles DE.

Para las tres colecciones de bucles BC se realizaron tres rondas de PCR utilizando los oligos degenerados BC9 PCR, BC 9-loop K y 309 BC-loop NNKdope (TABLA 6) junto con el cebador inverso Kpnl amp rev v2 (TABLA 5) utilizando un patrón derivado 309FG t en el que los codones del bucle BC habían sido reemplazados por codones de parada. Posteriormente, la amplificación por PCR de dichos fragmentos con los cebadores BC library amp v2 (TABLA 5) y Kpnl reverse v2 proporcionó el fragmento de colección de Tn3 completo.

Para la colección de bucles DE con una amplificación por PCR con DE PCR y Kpnl amp reverse v2 en un patrón derivado 309FGwt (en el cual los codones del bucle DE habían sido reemplazados por codones de parada) proporcionó un fragmento que contenía el bucle DE aleatorizado y el bucle FG de Tn3 natural, el cual se combinó con un fragmento que codificaba la región de Tn3 anterior al bucle DE generado por PCR con BC library amp v2 y BCX-DE bridge v2 en un patrón de 309. Los dos fragmentos se unieron en una PCR solapante con los cebadores externos BC library amp v2 y Kpnl reverse v2.

TABLA 6: Oligonucleótidos de ADN empleados para generar la colección OL (optimización del líder) de 309FGwt 1= Codones para todo 19aa(-cys) 2= Codones para Ala/Pro 3= Codones para Ala/Gly; 4= 70% de G, 10% de A, 10% de C, 10% de T 5= 10% de G, 70% de A, 10% de C, 10% de T 6= 10% de G, 10% de A, 70% de C, 10% de T 7= 10% de G, 10% de A, 10% de C, 70% de T 8= 70% de A, 15% de C, 15% de T K = 50% de G/50% de T Los fragmentos Ncol-Kpnl se clonaron en el vector de expresión en fagos, y se generó una colección de fagos como se describe en el Ejemplo 1.

Las cuatro colecciones se adsorbieron por separado en MegaCD40L humano biotinilado como se describe en la primera ronda del Ejemplo 2, utilizando 4 pg de CD40L en la Ronda 1 y 1 pg en la Ronda 2. Tras amplificar el resultado en los fagos después de la Ronda 2, se aisló el ADN monocatenario utilizando el kit Qiagen Spin M13 (Qiagen, Valencia, CA) , y las combinaciones de fragmentos que contenían el bucle BC de colecciones de bucles BC se amplificaron utilizando BC lib amp v2 y BC shuffle rev, mientras que la combinación de fragmentos que contenían el bucle DE se amplificó a partir de la colección de bucles DE utilizando los cebadores DE-shuffle FWD y Kpnl reverse v2. Los fragmentos de PCR se purificaron en gel y se acoplaron a través de su secuencia solapante utilizando los cebadores externos BC lib amp v2 y Kpnl reverse v2. El fragmento de PCR resultante se utilizó para generar una colección en el vector fágico como se describió anteriormente. Esta colección se adsorbió durante un total de 5 rondas en MegaCD40L humano biotinilado como se describe en el Ejemplo 2, salvo que las colecciones se pusieron en contacto inicialmente con una diana en una concentración de 50 nM, 20 nM, 20 nM y 10 nM (en un volumen total de 50 µ??) para las Rondas 1-4 durante 2 horas antes de incubar con las microesferas magnéticas de estreptavidina M280 bloqueadas durante 10 minutos y después lavar.

Los resultados se clonaron en conjunto en los sitios Ncol - Kpnl del plásmido pSec-oppA(L25M) -Tn3 pSec, y se cribaron dieciséis placas de 96 pocilios para determinar la unión a CD40L utilizando proteína soluble en el ensayo de criba descrito anteriormente. Se eligieron los 270 clones con el puntaje más alto, se volvieron a ensayar y se secuenciaron. Se seleccionaron diez clones para su caracterización detallada en función de un ensayo de unión y análisis secuencial. Esto incluyó la evaluación de la potencia en el ensayo en PBMC, la determinación de K¿ para la unión a CD40L en un ensayo en biosensores, la estabilidad termodinámica determinada por calorimetría diferencial de barrido y la tendencia a agregarse o formar oligómeros de orden superior en solución por análisis cromatográf ico de exclusión por tamaños. Los resultados se resumen en la TABLA. 7. Las secuencias de los clones 309 y 309FGwt alineadas con los diez clones optimizados (denominados 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348 y 349) se muestran en las FIGS. 11A y 11B.

Las variantes con afinidad madura mostraron una potencia superior en 1-3 logs (unidades logarítmicas) al clon 309, mantuvieron una alta estabilidad según se midió por DSC y la mayoría se monodispersaron según se midió por SEC .

TABLA 7 Variante PBMC CI50 (nM) Kd (nM) Perfil SEC Tm, CDB 309 226 191 OK 72 309FGwt 760 nd OK 71 340 0.7 2.2 OK 77 341 0.7 nd OK(¿ ?) 71 342 0.7 1.4 OK 73 343 0.6 2.0 OK 69 (¿?) 344 1.3 nd OK (65+78.5) 345 37.3 39 OK 72 346 9.0 14.9 OK 71 347 11.0 10.7 OK 70 348 1.0 1.8 ¿? nd 349 38.2 21 OK(¿?) nd Los ensayos en PBMC se realizaron estimulando PBMC con células Jurkat que expresaban CD40L humano (Dl.l, ATCC) y se midió el porcentaje de células CD19+/CD86+ por FACS después de 24 horas. Este ensayo se utilizó para evaluar y clasificar el panel de matrices de soporte de Tn3 líderes para emerger a partir de la priorización basada en criterios bioquímicos. Los resultados de los ensayos en PBMC se muestran en la FIG. 10B y se resumen en la TABLA 7.

Las mediciones de la afinidad se realizaron en el sistema de análisis de la interacción entre proteínas ProteOn XPR36 (Bio-Rad, Hercules, CA) con un chip sensor GLC a 25 °C. Se utilizó solución salina tamponada con fosfato ProteOn con Tween 20 al 0.005%, pH 7.4 (PBS/Tween) , como tampón de análisis. Se inmovilizó MegaCD40L humano en el chip con una densidad superficial de aproximadamente 2300 RU. Se prepararon diluciones con un factor de dilución de 2 de las variantes de Tn3 (340, 342, 343, 345, 346, 347, 348 y 349) en PBS/Tween/0.5 mg/mL de BSA, pH 7.4 (de 150 a 4.7 nM) . Se inyectaron muestras de cada concentración en los seis canales para el analito con una velocidad de flujo de 30 L/min durante 300 segundos. La ¾ se determinó utilizando el ajuste de análisis de equilibrio en el software ProteOn. Los resultados se muestran en la TABLA 7.

Se analizaron diez variantes de Tn3 específicas para TCD40L para determinar su estabilidad mediante CDB. Resumiendo, las mediciones de CDB se realizaron en un CDB VP-Capillary (MicroCal) . Las proteínas se intercambiaron en PBS (pH 7.2) mediante diálisis exhaustiva y se ajustaron hasta una concentración de 0.25-0.5 mg/mL para el análisis por CDB. Las muestras se sometieron a un barrido de 20 a 95 °C a una velocidad de barrido de 90 °C/hora, sin repetición del barrido. Los resultados se muestran en la TABLA 7.

Se obtuvo una mejora hasta 300 veces superior en la CI50 respecto a 309 y una mejora 1000 veces superior respecto a la base 309FGwt utilizada para generar la colección de optimización del líder para los mejores clones. Siete clones tuvieron una K¿ en el intervalo de nM de un único dígito. 3.3 Optimización del líder 311 de las matrices de soporte de Tn3 específicas para CD40L Antes de realizar el experimento de uso de los bucles mencionado anteriormente (remítase a la FIG. 10A) , un intento inicial de una colección de optimización del líder se fundamentó en introducir diversidad en el bucle FG de 311, generando y cribando la colección de expresión en fago resultante. La criba se realizó después de 4 rondas de adsorción en MegaCD40L humano biotinilado como se describió previamente, y se descubrió que la mayoría de los resultados positivos contenían una mutación fortuita del residuo K4 a E en la región constante aminoterminal de Tn3 , anterior al bucle BC. No se observó ningún consenso obvio entre las secuencias de los bucles FG de los resultados positivos. La introducción de la mutación K4E independiente en 311 provocó un aumento de aproximadamente 100 veces en la potencia (desde aproximadamente 4 uM hasta 36 nM) en el ensayo en PBMC (remítase a la FIG. 10C) .

Como el experimento de intercambio de bucles indicó que las secuencias de los bucles BC y DE eran necesarias para la unión a CD40L, estos bucles fueron la diana en la base 311K4E para una maduración de la afinidad adicional. Se generaron dos colecciones independientes. Una colección tenía como diana el bucle BC con una estrategia en la que cada residuo tenía un 50% de posibilidades de ser la secuencia de 311 natural y aproximadamente un 50% de posibilidades de ser uno de los otros 11 residuos codificados NHT. La otra colección aleatorizaba completamente el bucle DE de 6 residuos.

Para la colección de bucles BC, se utilizaron los oligonucleótidos BCll-311Gly y BC11-311NHT (TABLA 8) en reacciones PCR con el cebador inverso Kpnl amp rev v2 (TABLA 5) en un patrón derivado de 311 en el que los codones del bucle BC se habían reemplazado con codones de parada para generar fragmentos que incluían los bucles BC, DE y FG. Por último, la amplificación de una mezcla 1:1 de estos fragmentos con los cebadores BC library amp K4E y Kpnl amp rev v2 proporcionó el fragmento de colección de Tn3 completo.

La colección de bucles DE se generó como la colección de bucles DE de 309FGwt descrita anteriormente, salvo que se utilizó un patrón derivado de 311 en las reacciones PCR y se utilizó el cebador BC library amp K4E en la amplificación por PCR final.

TABLA 8. Oligos empleados para generar la colección de optimización del líder 311K4E. 2=10% de G, 70% de A, 10% de c, 10% de T 3=10% de G, 10% de A, 70% de c, 10% de T 4=10% de G, 10% de A, 10% de c, 70% de T 5=70% de A, 15% de c, 15% de T 6=15% de A, 70% de c, 15% de T 7=15% de A, 15% de c, 70% de T V=33% de A, 33 % de C, 33% de G H=33% de A, 33 % de C, 33 % de T Los fragmentos de la colección completos se digirieron con Ncol y Kpnl, se clonaron en el vector de expresión en fagos, y se generaron colecciones de fagos como se describe en el Ejemplo 1.

Las dos colecciones se adsorbieron por separado en MegaCD40L humano biotinilado como se describe en el Ejemplo 1, utilizando 10 g de proteína en la Ronda 1, 5 g en la Ronda 2 y 5 g en la Ronda 3 . Tras la amplificación del resultado fágico después de la Ronda 3 , se aisló ADN monocatenario utilizando un kit Qiagen (Qiagen, Valencia, CA) , y las dos colecciones se transpusieron como se describe para las colecciones de 309FGwt . La colección transpuesta se adsorbió durante un total de 5 rondas en MegaCD40L humano biotinilado como se describe anteriormente para la colección transpuesta de 309FGwt util izando 100 nM , 20 nM , 4 nM , 1 nM y 1 nM de diana en las Rondas 1 - 5 .

Los resultados se clonaron en conjunto en el vector de secreción soluble como se describió previamente , y se cribaron cinco placas de 96 poci lios para determinar la unión a CD40L util i zando el ensayo de criba de proteína soluble descrito anteriormente . Los resultados positivos se identificaron con relación a la señal obtenida con la variante de la base 311K4E . Los 18 clones únicos con el puntaje más alto, denominados 311K4E_1, 311K4E_2 , 311K4E_3 , 311K4E_4311K4E_5, 311K4E_7 , 311K4E_8, 311K4E_9, 311K4E_10, 311K4E_11 , 311K4E_12 , 311K4E_13 , 311K4E 14 , 311K4E 15 , 311K4E_16, 311K4E_19, 311K4E_20 y 311K4E_21 (secuencias mostradas en la FIG. 12A y la FIG. 12B) se ensayaron como proteínas no purificadas crudas para la clasificación según la disociación. Se realizaron estimaciones de la disociación de matrices de soporte de Tn3 no purificadas en el sistema de análisis de la interacción entre proteínas ProteOn XPR36 (Bio-Rad, Hercules, CA) en una matriz biosensora con CD40L inmovilizado sobre un chip. Se inmovilizó egaCD40L humano en un chip GLC (BioRad) y todas las variantes se diluyeron hasta una concentración estimada de 80 nM, se inyectaron con una velocidad de flujo de 30 L/min durante 300 segundos con un tiempo de disociación fijado a 1200 segundos. Se utilizó PBS, Tween20 al 0.005%, EDA 3 mM, pH7.4 como tampón de análisis. Las disociaciones se clasificaron por inspección visual de los sensogramas. Un subgrupo de cuatro variantes que presentaron las disociaciones más lentas, 311K4E_3, 311K4E_11, 311K4E_12 y 311K4E_15, se purificó y se determinó que los valores de I¾ estaban comprendidos entre 1.1 y 6.4 nM (TABLA 9).

TABLA 9. Kd de 311K4E y 4 variantes purificadas por afinidad que se unen al CD40L humano.

Tal como se indica en la FIG. 10D, la reducción en la Kd (de 18 nM a 1 nM) de 311K4E_12 corresponde a un incremento de 12 veces en la potencia en el ensayo en PBMC relativo a la base 311K4E.

En conclusión, las campañas de optimización del líder de los resultados iniciales 309 y 311 a partir de las colecciones vírgenes condujeron a ligantes en el intervalo de nM de un único dígito de CD40L.

Se llevó a cabo una campaña de optimización similar en la molécula M13 específica para murinos (no se muestran los datos) . La molécula específica para CD40L murino optimizada resultante (denominada M31) mostró un aumento de aproximadamente 20 veces en la potencia en el ensayo en PBMC frente a la molécula original (FIG. 1A) .

Ejemplo 4 Expresión y purificación de fusiones Tn3-HSA específicas para CD40L no marcadas Se expresaron constructos de Tn3 fusionados con HSA como los descritos en las FIGS . 2A y 9A en una línea celular 293F de mamífero mediante transfección transitoria. Se generaron constructos de expresión de la fusión Tn3-HSA basados en un vector de expresión de mamífero generado mediante fabricación propia. Para incrementar la homogeneidad del producto, se empleó una forma mutante de HSA (denominada HSA C34S) en la que la cisteína 34 parcialmente expuesta desapareada había mutado a serina (Zhao et al., 2009, Eur. J. Pharm. Biopharm. 72 : 405-11) .

La proteína de fusión se pudo purif icar en una purif icación de un paso mediante cromatograf ía de intercambio iónico ( IEX) . En la FIG . 9B se muestra un ej emplo de la elución de 309- 309 -HSA de una columna Q-HP (GE HealthCare) con un gradiente salino . Además del pico principal , se observaron picos de elución posterior menores (que constituían menos de un 10% del área de picos total) . El análisis por espectrometría de masas indicó que estos picos secundarios menores estaban enriquecidos en especies 309-309-HSA O-glicosiladas . Las fracciones que contenían el pico principal se juntaron y se utilizaron para ensayos de actividad subsecuentes .

Para las purificaciones a escala mayor, el paso de IEX mencionado anteriormente fue precedido por la captura de las fusiones de Tn3-HSA a partir del sobrenadante del cultivo mediante cromatografía de afinidad utilizando matrices de afinidad de HSA, p. ej . , HiTrap Blue HP (GE HealthCare ) . Tras lavar, la proteína de fusión HSA se consiguió eluir con un tampón que contenía ácido octenoico . El eluato se colocó en una columna Q-HP después de una dilución triple en tampón fosfato .

El análisis del pico o los picos menores reveló la presencia de restos carbohidrato unidos a través de O . Se propuso que el O-glicano se trataba de una mezcla heterogénea de carbohidratos derivados de una estructura central O-xilosilada reportada previamente (Wakabayashi et al . , 1999 , J". Biol . Chem . 274 : 5436 - 5442 ) que se muestra a continuación : GICA-S04 Galactosa Galactosa— NANA I Xilosa Proteína Se determinó que el sitio predominante de la unión se encontraba en el conector GGGGS entre los dominios Tn3. Se comprobó también que el glicano estaba presente en menor medida en el conector GGGGS situado entre la Tn3 y la HSA. Los niveles de 0-glicano fueron, por lo tanto, superiores en los constructos bivalentes en comparación con los constructos monovalentes y fueron superiores en el material producido en las células HEK en comparación con las células CHO. Los niveles también variaron entre los constructos de Tn3 diferentes. Por consiguiente, el nivel de O-glicano se puede reducir mediante una sección cuidadosa de las células huésped, por ejemplo, el uso de células CHO u otras células que se comprobó que producían material con niveles inferiores de O-glicano. Además, el material que contiene el O-glicano se puede eliminar mediante métodos de purificación para obtener un producto más homogéneo que carezca del O-glicano. Como alternativa, el conector se puede modificar para eliminar el sitio o los sitios principales de unión del 0-glicano, por ejemplo, mutando el residuo Ser a uno Gly. Los conectores en varios constructos se diseñaron de nuevo para que contuvieran uno o más conectores GGGGG. No se detectaron 0-glicanos de ningún tipo en el material que contenía el o los conectores GGGGG y no se observó ninguna diferencia en la actividad (los datos no se muestran) .

Ejemplo 5 Extensión de la semivida sérica de las matrices de soporte de Tn3 específicas para CD40L La fusión con albúmina sérica se exploró como estrategia para prolongar la semivida sérica de las matrices de soporte de Tn3 específicas para CD40L. Para determinar las propiedades farmacocinéticas (PK, por sus siglas en inglés) de las fusiones de Tn3-MSA específicas para CD40L murino se llevó a cabo un ensayo PK de ratón. Las fusiones con MSA se eligieron para estudios de moléculas surrogadas frente a las fusiones con HSA correspondientes debido a que el FcRn de ratón se une a HSA con un enlace considerablemente más débil que con el que se une a MSA, lo cual da como resultado un menor reciclaje a partir de endosomas y consecuentemente una mayor regeneración (Andersen et al. J. Biol . Chem. 285, 4826-4836, 2010) .

Las células HEK 293 se utilizaron para expresar la matriz de soporte de Tn3 bivalente en tándem específica para CD40L de ratón fusionada con MSA. Se observaron unos niveles de expresión altos (FIG. 3A) . Estos constructos tenían un conector (G4S) entre las unidades de matriz de soporte de Tn3 y 3 repeticiones (G4S) en el conector entre la matriz de soporte y MSA. Además, se introdujo una mutación N49Q en cada una de las matrices de soporte M13 y M31 para eliminar un sitio de W-glicosilación potencial. Esta mutación no afectó a la potencia de estas matrices de soporte (los datos no se muestran) . El nivel de expresión se estimó que era de 200 mg/L 6 días después de la transfección . La purificación se llevó a cabo mediante IMAC a través de un marcador His C-terminal . La producción de proteína purificada se estimó que era de 125 mg/L de sobrenadante de cultivo.

Cuando se fusionó MSA con matrices de soporte M13 bivalentes, se observó una reducción del óctuple en la potencia en comparación con la matriz de soporte M13 dimérica sin MSA (FIG. 3B) . Una matriz de soporte bivalente que comprendía M31 con afinidad madura fusionada con MSA fue 140 veces más potente que la matriz de soporte M13 bivalente correspondiente fusionada con MSA, aproximadamente 900 veces más potente que la fusión de M31 monovalente con MSA, y tenía una potencia comparable con la del anticuerpo monoclonal anti-CD40L murino MR1 (FIG. 3C) .

Para determinar las propiedades PK de las fusiones de Tn3 específica para CD40L-MSA se llevó a cabo un análisis PK de ratón. Los constructos proteicos se administraron por vía intravenosa en una dosis de 10 mg/kg en ratones CD-1 hembra de 5-7 semanas. Se extrajeron muestras de 150 µ?-? de sangre de cada ratón en puntos de evaluación diferentes y se determinó la concentración sérica de la fusión Tn3 -HSA mediante un ensayo ELISA. Resumiendo, se recubrieron placas Nunc MaxiSorp con el anticuerpo anti-FLAG M2 (Agilent) , se bloquearon con leche al 4% en PBS+Tween al 0.1%(PBST) y se incubaron con egaCD40L murino (Axxora) . El MegaCD40L se inmovilizó a través de su marcador FLAG . Las muestras séricas y los estándares proteicos se diluyeron en leche al 4% en PBST y se añadieron después de lavar la placa en PBST. Tras incubar, la placa se lavó en PBST y se utilizó anticuerpo policlonal anti-TN3 de conejo (Covance) para detectar los constructos de fusión de Tn3-HSA utilizando anticuerpo de conejo producido en cabra conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch) en un protocolo de ELISA estándar. Las concentraciones en muestras séricas se determinaron en función de curvas de regresión lineal estándar generadas mediante ensayos de dilución del mismo constructo de fusión de Tn3-MSA. Las concentraciones se determinaron como un promedio para 3 ratones diferentes.

Como se puede observar en la FIG. 4A, M31-MSA y M13- 13-MSA tuvieron semividas de 38 y 31 horas, respectivamente, mientras que el constructo de M31-M31-HSA tuvo una semivida de 12 horas. En comparación, el constructo en tándem de 13-M13 por sí solo (sin estar fusionado con MSA) presentó una semivida de 30 minutos (no se muestra) .

En contraste con las observaciones de las matrices de soporte de ratones, cuando HSA se fusionó con matrices de soporte específicas para CD40L humano no hubo ninguna reducción significativa en la potencia. La FIG. 9C muestra que no hubo ninguna reducción significativa en la potencia fusionando una matriz de soporte de Tn3 bivalente específica para CD40L humano que comprendía dos monómeros 309 con HSA según se midió en ensayos en PMBC.

Las propiedades PK del constructo monomérico 342 -HSA específico para CD40L humano se comparó con las de una variante de 342-HSA que comprendía dos sustituciones (L463N y K524L) para incrementar la semivida sérica en monos cinomólogos después de una única inyección intravenosa. Los constructos proteicos se administraron por inyección en bolo lenta en una dosis de 10 mg/kg a monos cinomólogos macho que pesaban 2-5 kg . Se extrajo 1 mL de sangre/animal/punto de la evaluación de los vasos sanguíneos periféricos antes de la dosis, 5 minutos y 30 minutos después de la dosis; 2, 12, 24 y 48 horas después de la dosis; y los Días 4, 8, 11, 15, 22, 29, 36, 43 y 57. La concentración sérica de la fusión de Tn3-HSA se determinó mediante un ensayo ELISA. Resumiendo, se recubrieron placas Nunc MaxiSorp con el anticuerpo anti-FLAG M2 (Agilent) , se bloquearon con leche al 4% en PBS+Tween al 0.1%(PBST) y se incubaron con MegaCD40L humano (Axxora) . El MegaCD40L se inmovilizó a través de su marcador FLAG. Las muestras séricas y los estándares proteicos se diluyeron en leche al 4% en PBST y se añadieron después de lavar la placa en PBST. Tras incubar, la placa se lavó en PBST y se utilizó anticuerpo policlonal anti-TN3 de conejo (Covance) para detectar los constructos de fusión de Tn3-HSA utilizando anticuerpo de conejo producido en cabra conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch) en un protocolo de ELISA estándar. Las concentraciones en muestras séricas se determinaron en función de curvas de regresión lineal estándar generadas mediante ensayos de dilución del mismo constructo de fusión de Tn3-HSA. Las concentraciones se representan en la FIG. 4B. La semivida del constructo de 342 -HSA fue de aproximadamente 7 días, mientras que el constructo variante de 342 -HSA L463N/K524L mostró un aumento en la semivida de 13-17 días durante la fase lineal inicial (FIG. 4B) . Después de 30 días, las concentraciones séricas del constructo variante de 342-HSA L463N/K524L se redujeron más rápidamente en comparación con el constructo de HSA natural. Estas observaciones pueden indicar cierta inmunogenia de este constructo en monos.

Ejemplo 6 Caracterización de las matrices de soporte de Tn3 especificas para CD40L 6.1 Métodos experimentales 6.1.1 Ensayo de estimulación en PB C: Se extrajo sangre de donantes sanos de acuerdo con las pautas de seguridad de Medlmmune. Se aislaron PBMC mediante tubos CPT (centrifugación a 1500 g durante 20 minutos) y se estimularon 1 x 106 PBMC (por afección) con MegaCD40L humano recombinante (Axxora) o células Jurkat que expresaban CD40L humano (Dl.l, ATCC) . El porcentaje de células CD19+/CD86+ se midió mediante FACS después de estimular durante 24 horas. Este ensayo se utilizó para evaluar y clasificar el panel de matrices de soporte de Tn3 líderes para emerger a partir de la priorización basada en criterios bioquímicos. El ensayo también se puede llevar a cabo con una línea celular que exprese CD40L murino (D10.G4) o MegaCD40L murino (Axxora ALX522120) en vez de la estimulación con células humanas o proteína recombinante ya que el ligando murino presenta reactividad cruzada con el receptor humano. 6.1.2 Ensayo de NFKB/CD40R murino: Las células NIH3T3 indicadoras de NFKB (sistema de indicador de NFKB de Panomics y transfección de mCD40R interna) se estimularon con la proteína recombinante MegaCD40L murina (Axxora, cat . ALX522120) o células D10.G4 que sobreexpresaban CD40L (ATCC) durante 24 horas con o sin matrices de soporte de Tn3. Se añadió Bright-Glow (Promega E2610) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La lectura fue de la luminiscencia (700) a través de la activación indicadora de NF B realizada en un sistema EnVision (Perkin Elmer) . 6.1.3 Ensayo de NFKB/CD40R humano: Las células HEK293 indicadoras (Panomics e internamente) se estimularon con la proteína recombinante MegaCD40L (Axxora ALX522110) o células subclónicas Jurkat Dl.l que sobreexpresaban CD40L (ATCC) durante 24 horas con o sin matrices de soporte de Tn3. Se añadió Bright-Glow (Promega E2610) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La lectura fue de la luminiscencia (700) a través de la activación indicadora de NFKB realizada en un sistema EnVision (Perkin Elmer) . 6.1.4 Ensayo de células duales: Se aislaron linfocitos T/B primarios de varios donantes. Se cultivaron linfocitos T CD4+ humanos estimulados con anti-CD3 y tratados con mitomicina C (1x10s) con linfocitos B humanos purificados (5xl04) . Las lecturas fueron las siguientes: Día 2: marcadores de la activación (FACS) , Día 5: proliferación de linfocitos B (metabolito ATP, Cell-Titer Glo, Invitrogen) , Día 7: diferenciación celular plasmática (FACS), Día 7: producción de Ig (ELISA, R&D Systems) . 6.1.5 Ensayos de agregación plaquetaria: El difosfato de adenosina (ADP) era de Chrono-Log (Havertown, PA, EE . UU.).

Todos los demás productos eran al menos de calidad de reactivo. Se extrajeron muestras de sangre de voluntarios sanos en citrato de sodio 12.9 mM y se centrifugaron a 150xg durante 15 minutos para obtener PRP (siglas en inglés de plasma rico en plaquetas) . Tras la separación de PRP, los tubos se centrifugaron de nuevo a 1200xg durante 15 minutos para obtener PPP (plasma con un bajo contenido de plaquetas) . Las plaquetas se lavaron utilizando el método descrito por Mustard et al. (Br. J. Haematol . 22:193-204, 1972) y se resuspendieron en solución de Tyrode que contenía CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, dextrosa al 0.1%, albúmina sérica bovina al 0.35%, 0.05 U/mL de apirasa, pH 7.35. La agregación plaquetaria se estudió utilizando un agregómetro de transmisión de la luz (Chrono-Log 700-4DR, Chrono-Log Corporation, Havertown, PA, EE. UU.) y se registró durante 10 min tras la estimulación de plaquetas con los agonistas plaquetarios indicados tal como se describe. Se preincubaron matrices de soporte de Tn3 con el CD40L soluble (sCD40L) para formar inmunocomplejos antes de la adición. 6.1.6 Ensayos de inmunización: Se adquirieron eritrocitos de oveja (SRBC, por sus siglas en inglés) en Colorado Serum (Denver, CO) y se diluyeron 10 veces en medio HBSS justo antes de usarlos. Se inmunizaron ratones con 0.2 mL de SRBC diluidos el día 0. Se ensayó la respuesta en el centro germinal (GC) primaria en ratones estimulados 14 días después de la inmunización mediante FACS (linfocitos B en GC, linfocitos B no GC y todos los subgrupos de linfocitos T) . Las matrices de soporte de Tn3 y los controles se administraron los Días 9-13 en incrementos de 24 horas tal como se indica. 6.1.7 Ensayos de respuesta de anticuerpos dependiente de linfocitos T específicos para KLH (TDAR) : Se realizaron administraciones a monos cinomólogos {Macaca fascicularis) de origen chino y que pesaban 3.1-4.6 kg, (Covance Research Products, Alice TX) por vía intravenosa (vena safena o cefálica) una vez por semana con la dosis indicada (0.5, 5, 40 mg/kg) de inhibidor (342-monómero-Tn3 -HSA y 342-342 bivalente-Tn3 -HSA o control/vehículo. Se reconstituyó KLH (N.° de lote MD158678A, proveedor Pierce Biotechnologies, Rockford, Illinois) con la cantidad adecuada de agua estéril para inyección (proveedor Midwest Veterinary Supply, Norristown, Pensilvania) en condiciones estériles. Los viales se removieron para mezclarlos y después se combinaron en un vial estéril. Se administró 1 mL de solución de KLH (10 mg/mL) por vía subcutánea en la espalda de cada animal, hacia la izquierda de la línea central en dos ocasiones (Día 1 y Día 29) , durante el transcurso de 1 hora desde el final de la administración del artículo de prueba o control. Se extrajeron muestras de sangre para un análisis posterior de todos los animales en los siguientes puntos de evaluación: antes de la prueba y los Días 4, 6, 8, 11, 15, 22, 25, 32, 34, 36, 39, 43, 46, 50 y 57. Las muestras se extrajeron los Días 8, 15 y 22 antes de administrar la dosis. La evaluación de las titulaciones de los anticuerpos IgM e IgG específicos para KLH se realizaron los Días 8, 11 y 15. Las titulaciones de los anticuerpos IgM e IgG específicos para KLH del Día 15 se muestran en las Figuras 5G y 5H, respectivamente. El método de titulación de punto de inflexión empleó un formato ELISA para detectar anticuerpos anti-KLH en suero de mono. Las muestras se incubaron con KLH, que estaba inmovilizada en una placa de ELISA. Tras incubar, las placas se lavaron y los anticuerpos unidos se detectaron con anticuerpos anti-IgG o IgM de mono producidos en cabra conjugados con HRP y a continuación se visualizaron con tetrametilbencidina (TMB) .

Para todos los experimentos en los que se utilizaron animales, se siguieron las buenas prácticas zootécnicas aceptables en la actualidad, p. ej . , Manual para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio; National Academy Press, 2011. Huntingdon Life Sciences, East Millstone, Nueva Jersey completamente acreditada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de los Animales de Laboratorio Internacional (AAALAC) . Los animales fueron monitorizados por el personal técnico para controlar cualesquiera condiciones que requirieran cuidados veterinarios y fueron tratados según procediese. 6.2 Las matrices de soporte de Tn3 específicas para CD40L neutralizan funcionalmente las interacciones CD40L: CD40.

Los linfocitos T que expresan CD40L se acoplan con linfocitos B que expresan CD40 lo cual produce la activación de la vía de señalización de NF B (Zangani, 2009) . Por lo tanto, se utilizó una línea celular indicadora de NFKB-luciferasa para determinar si las moléculas de anti-CD40L-Tn3 podrían inhibir la señalización posterior al acoplamiento de CD40. Se estimularon células HEK293 que expresaban CD40L humano y el indicador con MegaCD40L humano o murino en CE90 (concentración eficaz que provoca un 90% de inhibición; es decir, 1.5 yg/mL para el MegaCD40L humano y 3 g/mL para el MegaCD40L murino) .

Las 342 moléculas específicas para humanos inhibieron la actividad de NFKB inducida por CD40L humano con una CI50 de 1.5 nM (FIG. 13). La molécula M31 específica para murinos neutralizó la actividad de NFKB inducida por CD40L murino con una CI50 = 1.6 nM (FIG. IB) . Tanto los anticuerpos monoclonales anti-CD40L de control positivo 5c8 (anti-CD40L humano) como MR1 (anti-CD40L murino) funcionaron aproximadamente 10 veces mejor que las matrices de soporte de Tn3 monoméricas con CI50 de 0.200 nM +/- SD (umbral más bajo del ensayo) . Esto se podría deber en parte a la naturaleza bivalente de los anticuerpos monoclonales que contribuyen a la avidez de la interacción con sus respectivos CD40L. 6.3 Las matrices de soporte de Tn3 diméricas específicas para CD40L exhiben una unión mejorada.

Los datos experimentales indican que la unión de una matriz de soporte de Tn3 bivalente específica para CD40L mejoró frente a la de una matriz de soporte de Tn3 monomérica específica para CD40L. La unión de la matriz de soporte de Tn3 bivalente específica para CD40L a CD40L mejoró la acción sobre la diana, en algunos casos aproximadamente 3 logs frente a la de una matriz de soporte de Tn3 monomérica específica para CD40L in vitro, como se muestra en la FIG. 2C y la FIG. 2D (murino) , y la FIG. 8A y la FIG. 8B (humano) .

La FIG. 2C muestra la inhibición competitiva de la unión de CD40L murino al receptor CD40 murino inmovilizado en un chip biosensor por parte de matrices de soporte específicas para CD40L murino (M13) monovalentes o bivalentes en tándem. Los monómeros 13 estaban unidos con conectores peptídicos de longitud variable que comprendían una (1GS) , tres (3GS) , cinco (5GS) o siete repeticiones (7GS) "GGGGS". La CI50 de la matriz de soporte M13 -1GS-M13 fue 29 nM, mientras que la CI50 de la matriz de soporte M13 monomérica fue 71 nM. Las CI50 de las matrices de soporte M13 divalentes con conectores más largos fueron drásticamente inferiores (5-6 nM) .

La FIG. 2D muestra el efecto inhibitorio de las matrices de soporte específicas para CD40L murino monovalentes (M13) o bivalentes en tándem sobre la expresión de CD86 inducida por CD40L murino en linfocitos B. Las matrices de soporte bivalentes eran aproximadamente 3 logs más potentes que las matrices de soporte monovalentes .

Las FIGS. 8A y 8B muestran que las matrices de soporte de Tn3 específicas para CD40L humano 309 y 311 exhiben una mayor potencia en un formato en tándem bivalente. Las matrices de soporte bivalentes 311 (FIG. 8A) y las matrices de soporte bivalentes 309 (FIG. 8B) mostraron aproximadamente una mejora de 7 veces y 500-1000 veces, respectivamente, en la inhibición de la expresión inducida por CD40L humano en PBMC humanas positivas para CD19 estimuladas con células Jurkat DI .1. Las matrices de soporte bivalentes 309 fueron comparables en potencia al anticuerpo anti-CD40L humano monoclonal 5c8 de Biogen.

La solubilidad, estabilidad y facilidad de la purificación no se vio afectada por la adición de conectores peptídicos de longitud variable que comprendían una (1GS) , tres (3GS) , cinco (5GS) o siete repeticiones (7GS) "GGGGS" (remítase a la FIG. 2B) . 6.4 Unión y función de las matrices de soporte de Tn3 específicas para CD40L.

Además de la unión bioquímica descrita anteriormente, es importante verificar que estas matrices de soporte de Tn3 novedosas eran capaces de unirse a CD40L endógeno expresado en los linfocitos T primarios después de la activación. Los linfocitos T se aislaron de múltiples donantes y se activaron tal como se ha descrito. Después de 24 horas, se incrementó la expresión de CD40L según se determinó mediante tinción con el anticuerpo monoclonal 5c8 (específico para humanos) y el anticuerpo monoclonal MR1 (específico para murinos) (los datos no se muestran) . Las moléculas de matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L fueron capaces de detectar niveles comparables de expresión de CD40L a los de los anticuerpos monoclonales lo cual confirma que estas moléculas se pueden unir a la proteína nativa.

Una de las consecuencias funcionales de la interacción CD40L:CD40 es el incremento de las moléculas coestimuladoras en los linfocitos B (Yellin et al., J. Exp. Med. 6:1857-1864, 1995) . Las moléculas de Tn3 dirigidas a CD40L se evaluaron para determinar su capacidad de prevenir esto. Se utilizaron líneas celulares que expresaban CD40L humano o murino endógenamente (subclónicas DI .1 Jurkat o D10.G4, respectivamente) para estimular las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) . Una vez estimuladas, la activación de los linfocitos B se evaluó midiendo el porcentaje de incremento de CD86 por parte de los linfocitos B CD19+ mediante citometría de flujo. En este ensayo, los anticuerpos monoclonales de control positivo fueron capaces de inhibir el porcentaje de CD19+ de las células con expresión de CD86 con una CI50 de 0.170 nM (5c8) y 0.230 nM (MR1) . La 342 de Tn3 optimizada específica para humanos fue capaz de antagonizar el incremento de CD86 con valores de CI50 = 0.700n (n = 5 donantes) (remítase a la FIG. 10B y la TABLA 7) .

La M31 de Tn3 optimizada específica para murinos tuvo una CI50 de 1.5 nM. Estos resultados similares se observaron cuando se utilizó la proteína Mega-CD40L recombinante para estimular las PBMC. Los datos experimentales demostraron que ambas moléculas, ya sea específicas para humanos o murinos, no pueden inhibir únicamente la vía de señalización principal dentro de una célula (NF B) , sino también una de sus funciones más importantes: interacciones de linfocitos T-B. Esta acción inhibitoria puede contrarrestar la contribución de CD40L en muchas enfermedades y afecciones autoinmunes. 6.5 Tn3 anti-CD40L inhiben la proliferación de linfocitos B y la diferenciación de las células plasmáticas después del cocultivo de T/B.

Las interacciones de CD40L sobre linfocitos T con linfocitos B que expresan CD40 son un aspecto fundamental de la cooperación de los linfocitos T que facilita el desarrollo de respuestas inmunitarias adaptable (Banchereau, 1994; Oxenius, 1996, van Kooten & Bancheréáu, 1997) . Para modelar esto, las fusiones de anti-hCD40L Tn3 -HSA del dímero 340, 342 y 342-342 se evaluaron en cocultivos celulares primarios de linfocitos T y linfocitos B donde los linfocitos T CD4+ humanos estimulados con anti-CD3 y tratados con mitomicina C se cultivaron con linfocitos B humanos purificados. Se midió la capacidad de los linfocitos B para proliferar el día cuatro para diferenciarse en células plasmáticas (PC) llegado el día siete y modificar su clase de anticuerpo de producción (los datos de PC y anticuerpos no se muestran) (FIG. 15) (Ettinger, 2007) . La matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L 342-342-HSA fue capaz de reducir la proliferación inducida por linfocitos T en al menos un 50% en comparación con la proliferación celular de linfocitos B en ausencia de matrices de soporte o en presencia de una matriz de soporte de control no específica. La proliferación es un precursor, señal uno, de la diferenciación de las células plasmáticas, cuando se produce la ligadura CD40L:CD40. También se observaron la inhibición de la diferenciación de las células plasmáticas y el cambio de la clase de anticuerpo (no se muestran los datos) . 6.6 Disrupción in vivo del eje CD40:CD40L.

La función principal de las interacciones CD40L:CD40R en respuestas inmunitarias dependientes de T ha sido debidamente caracterizada (Noelle, 1992; Renshaw, 1994, Wykes, 2003). La matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L murino M31 (M31-MSA y M31-M31- SA) se utilizó para evaluar los efectos de estas moléculas novedosas en un modelo de inmunización dependiente de T mediante la inmunización de ratones (por vía intravenosa) el día cero con eritrocitos de oveja (SRBC) .

Los días 9-13, se inyectó la dosis indicada de inhibidor en los ratones por vía intraperitoneal a diario y el día 14 se cuantificaron los linfocitos B en GC en los ganglios esplénicos y linfáticos. Fue necesario administrar una dosis diaria debido a la corta Ti/2 de esta molécula in vivo, 31 horas (FIG. 4). Se ha establecido que CD40L controla las respuestas humorales tales como la generación de centros germinales en sitios anatómicos tales como el bazo y los ganglios linfáticos a partir de los descubrimientos previos (Jacob, 1991) . En la presente, se observó la disrupción de la contribución del eje CD40L:CD40 a la formación de una forma dependiente de la dosis con M31-MSA frente a la matriz virgen o nuestro control no específico, Dl-MSA, tal como demostró el porcentaje de linfocitos B en GC.

Incluso en una concentración de 10 mg/kg, M31-MSA fue capaz de suprimir el porcentaje de linfocitos B en GC (FIG. 5B) así como también el anticuerpo monoclonal MRl (FIG. 5A) . Otras subpoblaciones de células parecían normales, incluidas las poblaciones de linfocitos T específicos, lo cual garantizaba que los resultados observados no se debían al agotamiento de linfocitos T (FIG. 5C, FIG. 5D, FIG. 5E) . Además, los resultados de los datos de ELISA para anti-Ig de SRBC eran equiparables a los datos de los linfocitos B en centros germinales (FIG. 5F) . Teniendo todo esto en cuenta, estos datos indicaron que la matriz de soporte de Tn3 específica para murinos 31-MSA puede anular reacciones controladas por la señalización de CD40.

De forma análoga, la matriz de soporte de Tn3 específica para CD40L humano 342 (342-HSA y 342-342-HSA) se utilizó para evaluar los efectos de estas moléculas novedosas en el modelo de respuesta de anticuerpos dependiente de linfocitos T específicos para KLH (TDAR) en monos cinomólogos. En la presente, la disrupción del eje CD40L:CD40 provoca la supresión de la generación de anticuerpos para el antígeno KLH de una forma dependiente de la dosis. Tal como se muestra en las Figuras 5G y 5H, el constructo bivalente 342 suprimió los niveles de anticuerpos IgM e IgG en una concentración de 0.5 mg/kg (mpk) y se observó una supresión prácticamente total para 5 mg/kg. El constructo monomérico 342 también suprimió los niveles de IgM e IgG pero en concentraciones superiores con una supresión prácticamente total para 40 mg/kg. Estos datos indicaron que los constructos de las matrices de soporte de Tn3 específicas para humanos 342-HSA y 342-342-HSA pueden anular reacciones controladas por la señalización de CD40. 6.7 Las matrices de soporte de Tn3 específicas para CD40L humano no inducen la agregación plaquetaria.

Los ensayos clínicos en humanos con anticuerpos monoclonales anti-CD40L se interrumpieron cuando se produjeron t omboembolismos en varios pacientes (Davidson et al. Arth Rheu, 43:S271) . Los análisis preclínicos posteriores sugirieron que este era un efecto inespecífico de los anticuerpos monoclonales anti-CD40L. Por lo tanto, era importante evaluar las matrices de soporte de Tn3 específicas para CD40L humano en ensayos de agregación plaquetaria.

Cuando se utilizó una proporción de tres moléculas de CD40L fisiológico respecto a una molécula del anticuerpo monoclonal anti-CD40L, se observaron efectos proagregadores en plasma rico en plaquetas (PRP) citrado, plaquetas lavadas y sangre completa (FIG. 16A) . Estos efectos eran mediados por interacciones dependientes del dominio Fe del anticuerpo monoclonal posteriores a la unión de CD40L (los datos no se muestran) . En ausencia de la fusión del dominio Fe, no se observó agregación. No se observó agregación en múltiples donantes con ninguna de las matrices de soporte de Tn3 específicas para CD40L humano, ya fuera como dímeros o como proteínas de fusión HSA (FIG. 16B y FIG. 16C) .

Los efectos secundarios perjudiciales que se observaron en los ensayos clínicos se observaron creando un inmunocomplejo de CD40L soluble/anticuerpo monoclonal anti-CD40L en presencia de plaquetas (FIG. 16A y trazo 5C8 en la FIG. 16C) . Otro ejemplo de esto se puede observar en la histología del estudio murino de FcvRIIa humano transgénico (Francis et al., 2010). Tras la administración de los complejos inmunitarios de CD40L soluble/anticuerpo monoclonal, se observó una abundancia de trombos en el tejido pulmonar minutos después de la administración. Sin embargo, cuando se duplicó con matrices de soporte de Tn3 anti-CD40L, la histología presente en el pulmón era normal de acuerdo con las muestras de control ( los datos no se muestran) .

Ej emplo 7 Dominios de fibronectina de tipo III modificados para unirse a CD40L: clonación, expresión, purificación, cristalización y análisis por difracción de rayos X preliminar de dos complejos.

Se cocristal izó CD40L soluble humano recombinante con dos matrices de soporte de Tn3 monoméricas específ icas para CD40L , 309 y 311K4E-12, ambas aisladas como ligantes de CD40L a partir de colecciones de expresión en fagos . Los cristales se difractaron a 3.1 y 2.9 Á respectivamente . Además, se cocristalizó CD40L soluble humano recombinante con la 342 monomérica de Tn3 optimizada sola y con tanto la 342 monomérica como la 311K4E_12 monomérica. Los cristales para estas estructuras se difractaron a 2.8 y 1.9 Á respectivamente . Las estructuras cristalinas correspondientes ayudan a comprender la interacción entre las matrices de soporte de Tn3 y CD40L, y se pueden utili zar para diseñar l igantes de CD40L con una af inidad mayor y constructos en tándem que se unen a múltiples epítopos . 7 . 1 Expresión y purif icación de moléculas de Tn3 y CD40L soluble humano Para producir moléculas de Tn3 sin marcadores para la cristalización, las proteínas se expresaron en E. coli utilizando un vector inducible por IPTG de fabricación interna diseñado para secretar proteínas expresadas recombinantemente en el espacio periplásmico . Este vector tiene un promotor Ptac, una mutación L25/M en el péptido señal OppA (MTNITKRSLVAAGVLAALMAGNVAMA) (SEQ ID NO : 210), un marcador 8xHis carboxiterminal además de un sitio de escisión con trombina. Las secuencias de Tn3 se subclonaron entre el péptido señal y el sitio de escisión con trombina.

Las proteínas marcadas con His secretadas expresadas se purificaron utilizando una resina Ni-NTA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen, Valencia, California, EE. UU. ) , y posteriormente se escindieron con trombina seguida de una nueva purificación por afinidad con Ni-NTA para eliminar la proteína intacta sin cortar y el fragmento marcado con His cortado. Este paso de purificación fue seguido de un paso de intercambio iónico utilizando columnas HiTrap Q (GE Healthcare, Piscataway, Nueva Jersey, EE. UU. ) llevado a cabo en un purificador Ákta (GE Healthcare, Piscataway, Nueva Jersey, EE. UU.) . Las proteínas Tn3 sin marcar purificadas muestran una pureza superior al 95% y homogeneidad sobre la base de los resultados de SDS-PAGE y SEC.

El gen CD40L soluble humano (113-261, UNIPROT: P29965) se sintetizó mediante GeneArt con un marcador 6xHis aminoterminal y se clonó en un vector de expresión de mamífero interno bajo el control del mayor promotor temprano inmediato de citomegalovirus (hCMVie) (Boshart et al., Cell 41: 521-530,1985). El gen CD40L se clonó en marco con- un péptido señal CD33. Los genes EBNA y Ori P en el vector se utilizaron para incrementar la expresión proteica. El gen CD40L también incorporaba una secuencia poli-A SV40 para permitir el procesamiento adecuado de su AR m en el extremo 3'. El constructo se transfectó de forma transitoria en células en suspensión 293F (células renales embriónicas humanas [HEK] cultivadas en medio 293 Freestyle y utilizando 293 Fectin, Invitrogen, Carlsbad, California, EE . UU. ) . Las células se cultivaron utilizando un protocolo estándar y el medio se recogió después de 4 y 8 días. La proteína CD40L soluble se purificó a continuación utilizando una resina Ni-NTA seguida de un paso de intercambio iónico utilizando una columna Hi-Trap SP FF (GE Healthcare, Piscataway, Nueva Jersey, EE . UU.) y diálisis frente a Tris 50 mM pH 7.5, NaCl 50 mM.

Para preparar los complejos, la molécula de Tn3 , ya sea 309 o 311K4E_12 o 342, se mezcló con CD40L en una proporción de 1.1:1, se concentró utilizando concentradores Vivaspin (punto de inflexión de 30 000 Da; GE Healthcare, Piscataway, New Jersey, EE. UU. ) hasta aproximadamente 10 mg/mL y se sometió a cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) utilizando una columna Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare, Piscataway, Nueva Jersey, EE. UU.) preequilibrada con Tris-HC1 50 mM, pH 7.5, NaCl 100 mM, NaN3 al 0.02% (FIG. 19, panel A) . Después del paso de separación, el complejo se concentró hasta 18 mg/mL y se sometió a cristalización. El complejo 342-311K4E_12-CD40L se preparó esencialmente como se describió anteriormente utilizando una proporción 1.1:1.1:1 de los tres componentes. 7.2 Criba y optimización de la cristalización Se prepararon experimentos de cristalización en gota sentada en placas Intelli de 96 pocilios (Art Robbins Instruments, Sunnyvale, California, EE. UU.) utilizando un robot de cristalización Phoenix (Art Robbins Instruments, Sunnyvale, California, EE. UU.) mezclando volúmenes de 300 nL de solución del pocilio y solución del complejo proteico en el compartimento de la gota y dejando que se equilibre frente a 50 de solución del pocilio. Se utilizaron tamices de cristalización comerciales de Hampton Research (Aliso Viejo, California, EE. UU.), Emerald BioSystems (Bainbridge Island, Washington, EE . UU. ) y Molecular Dimensions (Apopka, Florida, EE. UU. ) .

La cristalización de cada uno de los complejos 309-CD40L, 342-CD40L y 342 -311K4E_12 -CD40L requirió un paso de optimización que incluía una criba adicional utilizando un tamiz aditivo HT (Hampton Research, Aliso Viejo, California, EE . UU. ) . En el paso de optimización, la solución del pocilio de la placa de 96 pocilios se rellenó con un 80% de solución seleccionada en la criba inicial y un 20% del aditivo respectivo. La gota fue de 300 nL de solución de proteína y 300 nL de la nueva solución del pocilio después de mezclar exhaustivamente esta última. Se recogieron los cristales con calidad de difracción directamente de las placas de 96 pocilios. Para la crioconservación, el cristal se transfirió a tres soluciones consecutivas de aguas madres con concentraciones crecientes de glicerol.

Los cristales de 311-CD40L con calidad de difracción se cultivaron en el tamiz inicial a partir de la solución que no requirió adición de agente criogénico. 7.3 Difracción de rayos X y recopilación de datos Se obtuvieron los patrones de difracción de rayos X para el complejo de 309-CD40L a partir de un monocristal en el generador de haces 5.0.3 de Advanced Light Source en el Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley (Universidad de California, Berkeley) equipado con un detector de rayos X ADSC Q315R CCD (Area Detector Systems Corporation, Poway, California, EE . UU. ) . Se registraron 360 imágenes consecutivas con un intervalo de oscilación de 0.5°, a una distancia entre el cristal y el detector de 300 mm, y con un tiempo de exposición de 0.8 segundos.

Se registraron los patrones de difracción de rayos X para los complejos 311K4E_12-CD40L, 342-CD40L y 342- 311K4E_12-CD40L a partir de monocristales en el generador de haces 31-ID-D de Advanced Photon Source en el Laboratorio Nacional Argonne (Universidad de Chicago, Chicago, IL) equipado con un detector Rayonix 225 HE (Rayonix LLC, Evanston, Illinois, EE . UU.). Se registraron 180 imágenes consecutivas con un intervalo de oscilación de 1°, a una distancia entre el cristal y el detector de 300 mm, y con un tiempo de exposición de 0.8 segundos.

La reducción y el ajuste de la escala de todos los datos se realizaron utilizando un paquete HKL2000 (Otwinowski & inor, Methods in Enzymology, 276:307-326. 1997). 7.4 Resultados y discusión La condición de cristalización más reproducible del complejo 309-CD40L resultó ser B5 (NaN03 0.2 M, PEG3350 al 20%) en el tamiz Peg/Ion (Hampton Research) . Una optimización adicional con tamiz aditivo proporcionó un cristal con calidad de difracción a partir de la condición Al (BaCl2-2H20 0.1 M) . El cristal que se muestra en la FIG. 19, panel B, se recogió de una placa de 96 pocilios y se enfrió en nitrógeno líquido después de transferirlo a la solución de aguas madre suplementada con glicerol al 20%.

Simetría del grupo espacial : El cristal pertenecía al grupo espacial ortorrómbico P212121 con unos parámetros de celda de a=85.69 Á, b=90.64 Á, c=95.56 Á y difractaba a 3.1 Á. Cabe esperar que la unidad asimétrica contenga un trímero de CD40L y tres moléculas de 309 con un valor de VM de aproximadamente 2.3 Á3/Da.

Para la cristalización de 311K4E_12-CD40L, el tamiz Cryo I & II (Emerald BioStructures) proporcionó varias condiciones que no requerían optimización ni crioconservación . Se utilizó un monocristal (FIG. 19, panel C) de la condición F7 (PEG 600 al 40%, CH3COONa 0.1 M, MgCl2 0.2 M) para la recopilación de los datos .

Simetría del grupo espacial: El cristal pertenecía al grupo espacial cúbico P213 con unos parámetros de celda de 97.62 Á y difractaba a 2.6 Á. La unidad asimétrica contiene un CD40L y una molécula de 311K4E_12 con un valor de VM de aproximadamente 2.9 Á3/Da.

Simetría del grupo espacial 342-CD40L: El cristal pertenecía al grupo espacial P321 con unos parámetros de celda de a=93.53 Á, b=93.53 Á, c=66.69 Á, resolución= 2.8 Á.

La unidad asimétrica contiene un monómero CD40L y un monómero 342.

Simetría del grupo espacial 342-311K4E_12-CD40L : El cristal pertenecía al grupo espacial P21 con unos parámetros de celda de a=80.32 Á, b=143.48 Á, c=111.27 Á, ß=98.22°, resolución= 1.9 Á. La unidad asimétrica contiene dos trímeros CD40, seis monómeros 342 y seis monómeros 311K4E-12.

Los datos estadísticos para todas las estructuras se muestran en la TABLA 10.

TABLA 10. Datos estadísticos de la recopilación de datos rayos X . 309-CD40L 311K4E-12 Longitud de onda, Á 0.9793 0.9793 Resolución, Á 50.0-3.05 (3.16-3. 05) 50.0-2.94 Grupo espacial P2X3 Parámetros de celda, a=85.69. b=90.64, c=95.56 a=97.62 Á Reflexiones totales 94 024 128 140 Reflexiones únicas 14 555 6720 Redundancia media 6.5 (6.4) a 19.2 (19.7) Integridad, % 100.0 (100.0) 99.4 (100.0) 0.097 (0.443) 0.114 (0.785) Media l/a (I) 17.2 (4.6) a 20.1 (2.4) a Los valores entre paréntesis corresponden a la cubierta de resolución más elevada 342-CD40L 342-311K4E_12-CD40L Longitud de onda, Á 0.9793 0.9793 Resolución, Á 50.0-2.8 (2.83-2.82) a 144.5-1.9 (1.96-1.95) a Grupo espacial P321 P2! Parámetros de celda, Á a=93.53, b=93.53, a=80.32, b=143.48, Reflexiones totales Reflexiones únicas Redundancia media Integridad, % Media ?/s (I) a Los valores entre pa :esis corresponden a la c sierta de resolución más elevada El CD40L formó un trímero (polipéptidos A, B y C en la FIG. 17A) . Cada matriz de soporte de Tn3 309 (polipéptidos D, E y F en la FIG. 17A) estaba en contacto con dos polipéptidos CD40L. La estructura cristalina reveló que hay seis contactos específicos entre cada matriz de soporte 309 y el primer y el segundo polipéptido CD40L. El ácido aspártico 17 en el BC está en contacto con la treonina 251 en el primer CD40L. El ácido glutámico 18 en el bucle BC está en contacto con la arginina 203 en el primer CD40L y con la isoleucina 204 en el segundo CD40L. La serina 47 en el bucle DE está en contacto con la histidina 249 en el primer CD40L. El triptófano 49 en el bucle DE está en contacto con la valina 247 en el primer CD40L. El ácido aspártico 70 en el bucle FG está en contacto con la serina 185 en el segundo CD40L (remítase a la FIG. 17A) . Los residuos aminoacídicos de CD40L que están en contacto con la matriz de soporte 311 también se muestran en la FIG. 18A.

En el caso de 309, cada matriz de soporte monomérica 311K4E_12 (polipéptidos A, B y C en la FIG. 17B) está en contacto con dos polipéptidos CD40L. La estructura cristalina reveló que hay 19 contactos específicos entre cada matriz de soporte 311K4E_12 y el primer y el segundo polipéptido CD40L. La asparagina 17 en el bucle BC está en contacto con la tirosina 146 y el ácido glutámico 142 en el primer CD40L. La arginina 18 en el bucle BC está en contacto con el ácido glutámico 142, la tirosina 146 y la metionina 148 en el primer CD40L. La serina 19 en el bucle BC está en contacto con el ácido glutámico 142 y la leucina 155 en el primer CD40L. La serina 22 en el bucle BC está en contacto con la asparagina 151 en el primer CD40L. La histidina 15 en el bucle BC está en contacto con la tirosina 146 en el primer CD40L. La histidina 51 en el bucle DE está en contacto con la tirosina 146 en el primer CD40L y con el ácido glutámico 230 en el segundo CD40L. La valina 50 en el bucle DE está en contacto con el ácido glutámico 230 en el segundo CD40L. La región aminoterminal de la matriz de soporte monomérica 311K4E 12 está conectada con el segundo CD40L. La arginina 200 en el segundo CD40L está en contacto con la treonina 7, el ácido aspártico 8 y la treonina 10 en la región aminoterminal de 311K4E_12. La arginina 203 en el segundo CD40L está en contacto con el ácido glutámico 4 y el ácido aspártico 5. Los residuos aminoacídicos de CD40L que están en contacto con la matriz de soporte 309 también se muestran en la FIG . 18B.

Las estructuras cristalinas de CD40L en los complejos con 309 y 311K4E_12 mostraron que las matrices de soporte monoméricas 311K4E_12 y 309 se unen a epitopos diferentes situados en partes diferentes del complejo trimérico de CD40L (FIG. 17C) . Las estructuras mostraron que ambas matrices de soporte se unen en el mismo surco que interaccionaria con el receptor CD40.

La estructura cristalina de una 342 con CD40L se proporciona en la Figura 17D y muestra que aunque 342 se une a la misma parte de CD40L, se observan cambios específicos en CD40L en los residuos que están en contacto en comparación con el clon 309 original. Específicamente, en 342 el aspartato 18 en el bucle BC está en contacto con la treonina 251 de CD40L y la histidina 47 del bucle DE está en contacto con la histidina 249 de CD40L, la histidina 48 del bucle DE está en contacto con la histidina 249, la serina 245 y la serina 248 de CD40L, y la histidina 50 del bucle DE está en contacto con la valina 247 de CD40L.

La estructura cristalina de una 342 y una 311K4E_12 con CD40L demuestra que ambas matrices de soporte se pueden unir simultáneamente a sus epitopos respectivos que están situados en partes diferentes del complejo trimérico CD40L (FIG 17E) . Se mantienen los contactos para cada una de las matrices de soporte independientes (descritos anteriormente) .

Los ejemplos que se muestran anteriormente ilustran varios aspectos de la invención y la práctica de los métodos de la invención. No se pretende que estos ejemplos proporcionen una descripción exhaustiva de las numerosas modalidades diferentes de la invención. Por lo tanto, aunque la invención se ha descrito en cierto detalle con carácter ilustrativo y a modo de ejemplo a efectos de claridad y comprensión, los expertos en la técnica se darán cuenta inmediatamente de que se pueden realizar muchos cambios y modificaciones sin que ello suponga alejarse de la naturaleza o el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en esta memoria descriptiva se incorporan a la presente por referencia en la misma medida que si se indicara de forma especifica e individual que cada publicación, patente o solicitud de patente individual se incorporase a la presente por referencia.

SECUENCIAS SEQ ID NO: 1 CD40L s IP29965ICD40L_HUMANO - Forma de membrana Dominio citoplasmático = 1-20 Región de la proteína de membrana de tipo II con señal de anclaje = 21-46 Forma soluble = 113-261 MIETYNQTSPRSAATGL ISM IFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRLDKIEDERNLH EDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEMQKGDQNP QIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSN REASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVN VTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL SEQ ID NO. 2 CD40L- Forma soluble, corresponde también al constructo cocristalizado MQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIY AQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQ PGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL SEQ ID No: 3 Tn3 (con bucles no modificados) IEVKDVTDTTALITWFKPLAEIDGCELTYGIKDVPGDRTTIDLTEDENQYSIGNLKPDTE YEVSLICRRGDMSSNPAKETFTT SEQ ID NO. 4 3.er FnlII de tenascina C, bucle AB (Tn3) KDVTDTT SEQ ID NO. 5 3.er FnlII de tenascina C, bucle BC (Tn3) FKPLAEIDG SEQ ID NO. 6 3.er FnlII de tenascina C, bucle CD (Tn3) KDVPGDR SEQ ID NO. 7 3.er Fnlll de tenascina C, bucle DE (Tn3) TEDENQ SEQ ID NO. 8 3.er Fnlll de tenascina C, bucle EF (Tn3) GNLKPDTE SEQ ID NO. 9 3.er Fnlll de tenascina C, bucle FG (Tn3) ; también en los clones 309FGwt, 340,341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348 y 349 RRGDMSSNPA SEQ ID NO. 10 3.er Fnlll de tenascina C, hebra beta A (Tn3) RLDAPSQIEV SEQ ID NO. 11 3.er Fnlll de tenascina C, hebra beta A (Tn3) truncación N-terminal IEV SEQ ID NO. 12 3.er Fnlll de tenascina C, hebra beta B (Tn3) ALITW SEQ ID NO. 13 3.er Fnlll de tenascina C, hebra beta C (variante de Tn3) CELAYGI SEQ ID NO. 14 3.er Fnlll de tenascina C, hebra beta C (Tn3) CELTYGI SEQ ID NO. 15 3.er Fnlll de tenascina C, hebra beta D (Tn3) TTIDL SEQ ID NO. 16 3.er Fnlll de tenascina C, hebra beta E (Tn3) YSI SEQ ID NO. 17 3.er FnlII de tenascina C, hebra beta F (Tn3) YEVSLIC SEQ ID NO. 18 3.er FnlII de tenascina C, hebra beta G (Tn3) ETFTT SEQ ID NO. 19 Clon 309 - Clon original aislado de la colección de Tn3 virgen AIEVKDVTDTTALI SDEFGHYDGCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPDT EYEVSLICYTDQEAGNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 20 Clon 309 - Clon original aislado de la colección de Tn3 virgen (sin A N-term, ni conector C-term, ni marcador His8) IEVKDVTDTTALITWSDEFGHYDGCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPDTE YEVSLICYTDQEAGNPAKETFTT SEQ ID NO. 21 Clon 309FGwt - Clon original con un bucle FG "humanizado" AIEVKDVTDTTALITWSDEFGHYDGCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPDT EYEVSLICRRGDMSSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 22 Clon 309FGwt - Clon original con un bucle FG "humanizado" (sin A N-term ni conector C-term ni marcador His8) IEVKDVTDTTALITWSDEFGHYDGCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPDTE YEVSLICRRGDMSSNPAKETFTT SEQ ID NO. 23 Clon 340 - Variante con afinidad madura AIEVKDVTDTTALI WSDDFDNYEWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHMAWYSIGNLKPDT EYEVSLICRRGDMSSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 24 Clon 340 - Variante con afinidad madura (sin A N-term ni conector C-term ni marcador His8) IEVKDVTDTTALI WSDDFDNYEWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHMAWYSIGNLKPDTE YEVSLICRRGDMSSNPAKETFTT SEQ ID NO. 25 Clon 341 - Variante con afinidad madura AIEVKDVTDTTALITWSDDFADYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPDT EYEVSLICRRGDMSSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 26 Clon 341 - Variante con afinidad madura (sin A N-term ni conector C-term ni marcador His8) IEVKDVTDTTALITWSDDFADYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPDTE YEVSLICRRGDMSSNPAKETFTT SEQ ID NO. 27 Clon 342 - Variante con afinidad madura (con un bucle FG WT) AIEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPDT EYEVSLICRRGDMSSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 28 Clon 342 - Variante con afinidad madura (con un bucle FG WT; sin A N-term ni conector C-term ni marcador His8) IEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPDTE YEVSLICRRGDMSSNPAKETFTT SEQ ID NO. 29 Clon 343 - Variante con afinidad madura AIEVKDVTDTTALITWLDDWGSYHVCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHQAWYSIGNLKPDT EYEVSLICRRGDMSSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 30 Clon 343 - Variante con afinidad madura (sin A N-term ni conector C-term ni marcador His8) IEVKDVTDTTALITWLDDWGSYHVCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHQA YSIGNLKPDTE YEVSLICRRGDMSSNPAKETFTT SEQ ID NO. 31 Clon 344 - Variante con afinidad madura AIEVKDVTDTTALITWSDEVGDYWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHMAWYSIGNL PDT EYEVSLICRRGDMSSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 32 Clon 344 - Variante con afinidad madura (sin A N-term ni conector C-term ni marcador His8) IEVKDVTDTTALITWSDEVGDYWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHMAWYSIGNLKPDTE YEVSLICRRGDMSSNPAKETFTT SEQ ID NO. 33 Clon 345 - Variante con afinidad madura AIEVKDVTDTTALI WSDDFAEYVGCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPDT EYEVSLICRRGDMSSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 34 Clon 345 - Variante con afinidad madura (sin A N-term, ni conector C-term, ni marcador His8) IEVKDVTDTTALITWSDDFAEYVGCELTYGIKDVPGDRT IDLWWHSAWYSIGNLKPDTE YEVSLICRRGDMSSNPAKETFTT SEQ ID NO. 35 Clon 346 - Variante con afinidad madura AIEVKDVTDTTALITWSDDFEEYWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPDT EYEVSLICRRGDMSSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 36 Clon 346 - Variante con afinidad madura (sin A N-term ni conector C-term ni marcador His8) IEVKDVTDTTALITWSDDFEEYWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPDTE YEVSLICRRGDMSSNPAKETFTT SEQ ID NO. 37 Clon 347 - Variante con afinidad madura AIEVKDVTDTTALITWSDEVGQYVGCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHMAWYSIGNLKPDT EYEVSLICRRGDMSSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 38 Clon 347 - Variante con afinidad madura (sin A N-term ni conector C-term ni marcador His8) IEVKDVTDTTALITWSDEVGQYVGCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHMAWYSIGNLKPDTE YEVSLICRRGDMSSNPAKETFTT SEQ ID NO. 39 Clon 348 - Variante con afinidad madura AIEVKDVTDTTALITWSDDIGLYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWFHQAWYSIGNLKPDT EYEVSLICRRGDMSSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 40 Clon 348 - Variante con afinidad madura (sin A N-term, ni conector C-term, ni marcador His8) IEVKDVTDTTALITWSDDIGLYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWFHQAWYSIGNLKPDTE YEVSLICRRGDMSSNPAKETFTT SEQ ID NO. 41 Clon 349 - Variante con afinidad madura AIEVKDVTDTTALITWSDEHAEFIGCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPDT EYEVSLICRRGDMSSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 42 Clon 349 - Variante con afinidad madura (sin A N-term, ni conector C-term, ni marcador His8) IEVKDVTDTTALI WSDEHAEFIGCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPDTE YEVSLICRRGDMSSNPAKETFTT SEQ ID NO. 43 Clon 311 - Clon original aislado de la colección de Tn3 virgen AIEVKDVTDTTALI WTNRSSYYNLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLSSPYVHYSIGNLKP DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 44 Clon 311 - Clon original aislado de la colección de Tn3 virgen (sin A N-term, ni conector C-term, ni marcador His8) IEVKDVTDTTALITWTNRSSYYNLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLSSPYVHYSIGNLKPD TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT SEQ ID NO. 45 Clon 311K4E - Variante de la primera ronda de maduración de la afinidad AIEVEDVTDTTALI WTNRSSYYNLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLSSPYVHYSIGNLKP DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 46 Clon 311K4E - Variante de la primera ronda de maduración de la afinidad (sin A N-term, ni conector C-term, ni marcador His8) IEVEDVTDTTALITWTNRSSYYNLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLSSPYVHYSIGNLKPD TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT SEQ ID NO. 47 Clon 311K4E_1 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad AIEVEDVTDTTALITWINRSYYADLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLDQIYVHYSIGNLKP DTKYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 48 Clon 311K4E_1 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad (sin A N-term, ni conector C-term, ni marcador His8) IEVEDVTDTTALITWINRSYYADLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLDQIYVHYSIGNLKPD TKYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT SEQ ID NO. 49 Clon 311K4E_2 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad AIEVEDVTDTTALI WTNRSSYSHLDGCELTYGIKDVPGDRTTIDLSAAIYVHYSIGNLK PDTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 50 Clon 311K4E_2 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad (sin A N-term, ni conector C-term, ni marcador His8) IEVEDVTDTTALITWTNRSSYSHLDGCELTYGIKDVPGDRTTIDLSAAIYVHYSIGNLKP DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT SEQ ID NO. 51 Clon 311K4E_3 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad AIEVEDVTDTTALITWINRSSYHNFPHCELAYGIKDVPGDRTTIDLNSPYVHYSIGNLKP DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 52 Clon 311K4E_3 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad (sin A N-term, ni conector C-term, ni marcador His8) IEVEDVTDTTALIT INRSSYHNFPHCELAYGIKDVPGDRTTIDLNSPYVHYSIGNLKPD TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT SEQ ID NO. 53 Clon 311K4E_4 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad AIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNHLGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNNIYVHYSIGNLKP DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 54 Clon 311K4E_4 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad (sin A N-term, ni conector C-term, ni marcador His8) IEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNHLGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNNIYVHYSIGNLKPD TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT SEQ ID NO. 55 Clon 311K4E_5 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad AIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNFHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNSPYVHYSIGNLKP DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 56 Clon 311K4E_5 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad (sin A N-term, ni conector C-term, ni marcador His8) IEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNFHGCELAYGI DVPGDRTTIDLNSPYVHYSIGNLKPD TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT SEQ ID NO. 57 Clan 311K4E_7 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad AIEVEDVTDTTALI WTNRSFYSNLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKP DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 58 Clon 311K4E_7 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad (sin A N-term, ni conector C-term, ni marcador His8) IEVEDVTDTTALITWTNRSFYSNLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKPD TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT SEQ ID NO. 59 Clon 311K4E_8 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad AIEVEDVTDTTALITWTNRSSYAYLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKP DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 60 Clon 311K4E_8 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad (sin A N-term, ni conector C-term, ni marcador His8) IEVEDVTDTTALITWTNRSSYAYLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKPD TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT SEQ ID NO. 61 Clon 311K4E_9 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad MEVEDVIDTIALITWINRSSYANLHGOT DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 62 Clon 311K4E_9 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad (sin A N-term, ni conector C-term, ni marcador His8) IEVEDVTDTTALITWINRSSYANLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLSSPYVHYSIGNLKPD TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT SEQ ID NO. 63 Clon 311K4E_10 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad AIEVEDVTDTTALITWTNRSSYANYHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKP DTE EVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 64 Clon 311K4E_10 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad (sin A N-term, ni conector C-term, ni marcador His8) IEVEDVTDTTALITWTNRSSYANYHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKPD TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT SEQ ID NO. 65 Clon 311K4E_11 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad AIEVEDVTDTTALITWTNRSSYANLPGCELTYGIKDVPGDRTTIDLNSPYVHYSIGNLKP DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 66 Clon 311K4E_11 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad (sin A N-term, ni conector C-term, ni marcador His8) IEVEDVTDTTALITWTNRSSYANLPGCELTYGIKDVPGDRTTIDLNSPYVHYSIGNLKPD TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT SEQ ID NO. 67 Clon 311K4E_12 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad AIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKP DTEYEVSLICLTTDGTYNNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 68 Clon 311K4E_12 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad (sin A N-term, ni conector C-term, ni marcador His8) IEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKPD TEYEVSLICLTTDGTYN PAKETFTT SEQ ID NO. 69 Clon 311K4E_13 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad AIEVEDVTDTTALIT INRSSYANLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLNSPYVHYSIGNLKP DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 70 Clon 311K4E_13 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad (sin A N-term, ni conector C-term, ni marcador His8) IEVEDVTDTTALI WINRSSYANLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLNSPYVHYSIGNLKPD TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT SEQ ID NO. 71 Clon 311K4E_14 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad AIEVEDVTDTTALITWTARSAYSHHHYCELTYGI DVPGDRTTIDLRQPYVHYSIGNLKP DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 72 Clon 311K4E_14 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad (sin A N-term, ni conector C-term, ni marcador His8) IEVEDVTDTTALITWTARSAYSHHHYCELTYGIKDVPGDRTTIDLRQPYVHYSIGNLKPD TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT SEQ ID NO. 73 Clon 311K4E_15 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad AIEVEDVTDTTALITWTNRSSYANYHHCELTYGIKDVPGDRTTIDLELYVHYSIGNLKPD TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 74 Clon 311K4E_15 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad (sin A N-term, ni conector C-term, ni marcador His8) IEVEDVTDTTALITWTNRSSYANYHHCELTYGIKDVPGDRTTIDLELYVHYSIGNLKPDT EYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT SEQ ID NO. 75 Clon 311K4E_16 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad AIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSDLPGCELTYGIKDVPGDRTTIDLSSPYVHYSIGNLKP DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 76 Clon 311K4E_16 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad (sin A N-term, ni conector C-term, ni marcador His8) IEVEDVTDTTALITWTNRSSYSDLPGCELTYGI DVPGDRTTIDLSSPYVHYSIGNLKPD TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT SEQ ID NO. 77 Clon 311K4E_19 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad AIEVEDVTDTTALITWTHRSAYSNHSFCELTYGIKDVPGDRTTIDLNTPYVHYSIGNLKP DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 78 Clon 311K4E_19 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad (sin A N-term, ni conector C-term, ni marcador His8) IEVEDVTDTTALITWTHRSAYSNHSFCELTYGI DVPGDRTTIDLNTPYVHYSIGNLKPD TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT SEQ ID NO. 79 Clon 311K4E_20 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad AIEVEDVTDTTALITWTNRSLYANFHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLEQVYVHYSIGNLKP DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 80 Clon 311K4E_20 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad (sin A N-term, ni conector C-term, ni marcador His8) IEVEDVTDTTALITWTNRSLYANFHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLEQVYVHYSIGNLKPD TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT SEQ ID NO. 81 Clon 311K4E_21 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad AIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLPGCELTYGIKDVPGDRTTIDLNQVYVHYSIGNLKP DTEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTTGGGTLGHHHHHHHH SEQ ID NO. 82 Clon 311K4E_21 - Variante clónica de la segunda ronda de maduración de la afinidad (sin A N-term, ni conector C-term, ni marcador His8) IEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLPGCELTYGIKDVPGDRTTIDLNQVYVHYSIGNLKPD TEYEVSLICLTTDGTYSNPAKETFTT SEQ ID NO. 83 Clon 309 y 309FGwt - bucle BC SDEFGHYDG SEQ ID NO. 84 Clon 340 - bucle BC SDDFDNYEW SEQ ID NO. 85 Clon 341 - bucle BC SDDFADYVW SEQ ID NO. 86 Clon 342 - bucle BC SDDFGEYVW SEQ ID NO. 87 Clon 343 - bucle BC LDDWGSYHV SEQ ID NO. 88 Clon 344 - bucle BC SDEVGDYW SEQ ID NO. 89 Clon 345 - bucle BC SDDFAEYVG SEQ ID NO. 90 Clon 346 - bucle BC SDDFEEYW SEQ ID NO. 91 Clon 347 - bucle BC SDEVGQYVG SEQ ID NO. 92 Clon 348 - bucle BC SDDIGLYVW SEQ ID NO. 93 Clon 349 - bucle BC SDEHAEFIG SEQ ID NO. 94 Clon 309, 309FGwt, 341, 345, 346, 349 - bucle DE WWHSA SEQ ID NO. 95 Clon 340, 344, 347 - bucle DE YH A SEQ ID NO. 96 Clon 342 - bucle DE WYHHAH SEQ ID NO. 97 Clon 343 - bucle DE WYHQAW SEQ ID NO. 98 Clon 348 - bucle DE WFHQAW SEQ ID NO. 99 Clon 309 - bucle FG YTDQEAGNPA SEQ ID NO. 100 Clon 311, 311K4E - bucle BC TNRSSYY LHG SEQ ID NO. 101 Clon 311K4E_1 - bucle BC INRSYYADLHG SEQ ID NO. 102 Clon 311K4E_2 - bucle BC TNRSSYSHLDG SEQ ID NO. 103 Clon 311K4E_3 - bucle BC INRSSYHNFPH SEQ ID NO. 104 Clon 311K4E_4 - bucle BC TNRSSYSNHLG SEQ ID NO. 105 Clon 311K4E_5 - bucle BC TNRSSYSNFHG SEQ ID NO. 106 Clon 311K4E_7 - bucle BC TNRSFYSNLHG SEQ ID NO. 107 Clon 311K4E_8 - bucle BC TNRSSYAYLHG SEQ ID NO. 108 Clon 311K4E_9, 311K4E_13 - bucle BC INRSSYANLHG SEQ ID NO. 109 Clon 311K4E 10 - bucle BC TNRSSYANYHG SEQ ID NO. 110 Clon 311K4E_11 - bucle BC TNRSSYANLPG SEQ ID NO. 111 Clon 311K4E_12 - bucle BC TNRSSYSNLHG SEQ ID NO. 112 Clon 311K4E_14 - bucle BC TARSAYSHHHY SEQ ID NO. 113 Clon 311K4E_15 - bucle BC TNRSSYANYHH SEQ ID NO. 114 Clon 311K4E_16 - bucle BC TNRSSYSDLPG SEQ ID NO. 115 Clon 311K4E_19 - bucle BC THRSAYSNHSF SEQ ID NO. 116 Clon 311K4E_20 - bucle BC TNRSLYANFHG SEQ ID NO. 117 Clon 311K4E_21 - bucle BC TNRSSYSNLPG SEQ ID NO. 118 Clon 311, 311K4E, 311K4E_9, 311K4E_16 bucle DE SSPYVH SEQ ID NO. 119 Clon 311K4E 1 - bucle DE DQIYVH SEQ ID NO. 120 Clon 311K4E_2 - bucle DE SAAIYVH SEQ ID NO. 121 Clon 311K4E_3, 311K4E_5, 311K4E_11, 311K4E_13 - bucle DE NSPYVH SEQ ID NO. 122 Clon 311K4E_4 - bucle DE NNIYVH SEQ ID NO. 123 Clon 311K4E_7, 311K4E_8, 311K4E_10, 311K4E_12 - bucle DE NQPYVH SEQ ID NO. 124 Clon 311K4E_14 - bucle DE RQPYVH SEQ ID NO. 125 Clon 311K4E_15 - bucle DE ELYVH SEQ ID NO. 126 Clon 311K4E_19 - bucle DE NTPYVH SEQ ID NO. 127 Clon 311K4E_20 - bucle DE EQVYVH SEQ ID NO. 128 Clon 311K4E_21 - bucle DE NQVYVH SEQ ID NO. 129 Clon 311, 311K4E, 311K4E_1, 311K4E_2 , 311K4E_3 , 311K4E_4, 311K4E_5, 311K4E_7, 311K4E_8, 311 4E_9, 311K4E_10, 311K4E_11, 311K4E_13 , 311K4E_14 , 311 4E_15, 311K4E_16, 311K4E_19, 311K4E_20, 311K4E_21 - bucle FG LTTDGTYSNPA SEQ ID NO. 130 Clon 311K4E_12 - bucle FG LTTDGTYNNPA SEQ ID NO. 131 Conector 2GS - (Gly4Ser)2 GGGGSGGGGS SEQ ID NO. 132 Conector 3GS - (Gly4Ser)3 GGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO. 133 Mutante C34S de HSA la localización de la mutación de Cys->Ser está subrayada DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFA TCVADESAE NCD SLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEV DVMCTAFHDNEETFL KYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLP KLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTK VHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLE SHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLG FLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKC CAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVST PTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHE TPVSDRVT CCTES LVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKP AT KEQLKAV DDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL SEQ ID NO. 134 342-2GS-HSAC34S - Constructo monovalente HSAC34S está subrayado SQIEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPD TEYEVSLICRSGDMSSNPAKETFTTGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLI AFAQYLQQSPFEDHVKLV EVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYG EMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARR HPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQK FGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVE DEMPADLPSLAADFVESKDVC YAEAKDV FLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQ NLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKR MPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAE TFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKE TCFAEEGKKLVAASQAALGL SEQ ID NO. 135 342-3GS-342-2GS-HSAC34S Constructo bivalente HSA está subrayado SQIEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPD TEYEVSLICRSGDMSSNPA ETFTTGGGGSGGGGSGGGGSRLDAPSQIEVKDVTDTTALI TWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNL PDTEYEVSLICRSGD S SNPAKETFTTGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHV KLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNE CFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR YKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLS QRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCE KPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPD YSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKR PCAEDYLSWLNQL CVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVP EFNAETFTFHADICTLSEKE RQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVE CC ADDKETCFAEEGKKLVAASQ AALGL SEQ ID NO. 136 variante E N-terminal del bucle AB de la familia de clones 311 EDVTDTT SEQ ID NO. 137 Variante K C-terminal del bucle EF de la familia de clones 311 GNLKPDTK SEQ ID NO. 138 HSA humana completa DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAE NCDKSLHTLFGD LCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEV DVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLP KLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQ FGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLT VHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKC CAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVST PTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTES LVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKAT KEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL SEQ ID NO. 139 Variante del bucle FG de 309 (mutante RR->RS) ; puede estar presente en 342 constructos RSGDMSSNPA SEQ ID NO. 140 Conector 2GX - (Gly4X) 2 ; X = Ala, Gly, Leu, lie, Val GGGGXGGGGX SEQ ID NO. 141 Conector 3GX - (Gly4X)3; X = Ala, Gly, Leu, lie, Val GGGGXGGGGXGGGGX SEQ ID NO. 142 Conector G10 - (Gly4Gly)2 GGGGGGGGGG SEQ ID NO. 143 Conector G15 - (Gly4Gly) 3 GGGGGGGGGGGGGGG SEQ ID NO. 144 342-G10-HSAC34S - Constructo monovalente 2 - Conectores todo Gly HSA está subrayado SQIEVKDVTDTTALIT SDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPD TEYEVSLICRSGDMSSNPAKETFTTGGGGGGGGGGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLI AFAQYLQQSPFEDHVKLVMEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYG EMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDV CTAFHDNEETFLKKYLYEIARR HPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPICLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQK FGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDV FLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQ NLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKR MPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAE TFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPK¾TKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKE TCFAEEGKKLVAASQAALGL SEQ ID NO. 145 342-G15-342-G10-HSAC34S Constructo bivalente 2 - Conectores todo Gly HSA está subrayado SQIEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDL YHHAHYSIGNLKPD TEYEVSLICRSGDMSSNPAKETFTTGGGGGGGGGGGGGGGRLDAPSQIEVKDVTDTTALI TWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPDTEYEVSLICRSGDMS SNPAKETFTTGGGGGGGGGGDAHKSEVAHRFKDLGEENF ALVLIAFAQYLQQSPFEDHV KL NEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNE CFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFL KYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR YKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLS QRFPIAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADIJAKYICENQDSISSKLKECCE KPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPD YSWLLLRLAKTYETTLE CCAAADPHECYA VFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQL CVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKE RQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCC ADDKETCFAEEGKKLVAASQ AALGL SEQ ID NO. 146 Clon 342 - Variante con afinidad madura (con la variante del bucle FG RR->RS subrayada) IEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPDTE YEVSLICRSGDMSSNPAKETFTT SEQ ID NO. 147 Módulo conector Gly-Ser, (G4S)n donde n = 1-7; se muestra el módulo (G4S)n donde n=l GGGGS SEQ ID NO. 148 Módulo conector Gly, (G5)n donde n = 1-7; se muestra el módulo (G5)n donde n=l GGGGG SEQ ID NO. 149 Módulo conector Gly-Ala, (G4A)n donde n = 1-7; se muestra el módulo (G4A)n donde n=l GGGGA SEQ ID NO. 150 Marcador de polihistidina (H8) - Un componente opcional de las matrices de soporte de Tn3 útil para la purificación se puede combinar con residuos conectores adicionales.

HHHHHHHH SEQ ID NO. 151 Conector-marcador de polihistidina - Un componente opcional de las matrices de soporte de Tn3 útil para la purificación GGGGSHHHHHHHH SEQ ID NO. 152 MSA madura natural EAHKSEIAHRYNDLGEQHF GLVLIAFSQYLQKCSYDEHAKLVQEVTDFAKTCVADESAA NCDKSLHTLFGDKLCAIPNLRENYGELADCCTKQEPERNECFLQHKDDNPSLPPFERPEA EAMCTSFKENPTTFMGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEQYNEILTQCCAEADKESCLTP KLDGVKEKALVSSVRQRMKCSS QKFGERAFKA AVARLSQTFPNADFAEITKLATDLTK VNKECCHGDLLECADDRAELA Y CENQATISSKLQTCCDKPLLKKAHCLSEVEHDTMPA DLPAIAADFVEDQEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKC CAEANPPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCDLYEKLGEYGFQNAILVRYTQKAPQVST PTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEDQRLPCVEDYLSAILNRVCLLHE TPVSEHVTKCCSGS LVERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPEKEKQI KQTALAELVKHKPKAT AEQLKTVMDDFAQFLDTCCKAADKDTCFSTEGPNLVTRCKDALA SEQ ID NO. 153 Mutante en Cys de MSA madura-C34S/C579S; residuos mutados subrayados EAHKSEIAHRYNDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKSSYDEHAKLVQEVTDFAKTCVADESAA NCDKSLHTLFGDKLCAIPNLRENYGELADCCTKQEPERNECFLQHKDDNPSLPPFERPEA EAMCTSFKENPTTFMGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEQYNEILTQCCAEADKESCLTP KLDGVKEKALVSSVRQRMKCSSMQKFGERAFKAWAVARLSQTFPNADFAEITKLATDLTK VNKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQTCCDKPLLKKAHCLSEVEHDTMPA DLPAIAADFVEDQEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKC CAEANPPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCDLYEKLGEYGFQNAILVRYTQKAPQVST PTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEDQRLPCVEDYLSAILNRVCLLHE TPVSEHVTKCCSGS LVERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPEKE QIKKQTALAELVKHKP AT AEQLKTVMDDFAQFLDTCCKAADKDTCFSTEGPNLVTRSKDALA SEQ ID NO. 154 Clon M13; los bucles BC, DE, FG están subrayados IEVKDVTDTTALIT HDAFGYDFGCELTYGIKDVPGDRTTIDLPDHFHNYSIGNLKPDT EYEVSLICANDHGFDSNPAKETFTT SEQ ID NO. 155 Clon M13N49Q; mutación N49Q subrayada IEVKDVTDTTALIT HDAFGYDFGCELTYGIKDVPGDRTTIDLPDHFHQYSIGNLKPDT EYEVSLICANDHGFDSNPAKETFTT SEQ ID NO. 156 M13N49Q-1GS- 13N49Q Constructo bivalente; mutación N49Q subrayada SQIEVKDVTDTTALITWHDAFGYDFGCELTYGIKDVPGDRTTIDLPDHFHQYSIGNLKPD TEYEVSLICANDHGFDSNPAKETFTTTGGGGSRLDAPSQIEVKDVTDTTALITWHDAFGY DFGCELTYGIKDVPGDRTTIDLPDHFHQYSIGNLKPDTEYEVSLICA DHGFDSNPAKET FTT SEQ ID NO. 157 M13N49Q-3GS-MSA-C34S/C579S constructo monovalente; mutaciones subrayadas SQIEVKDVTDTTALITWHDAFGYDFGCELTYGIKDVPGDRTTIDLPDHFHQYSIGNLKPD TEYEVSLICANDHGFDSNPAKETFTTGGGGSGGGGSGGGGSEAHKSEIAHRYNDLGEQHF KGLVLIAFSQYLQKSSYDEHAKLVQEVTDFAKTCVADESAANCDKSLHTLFGDKLCAIPN LRENYGELADCCTKQEPERNECFLQHKDDNPSLPPFERPEAEA CTSFKENPTTFMGHYL HEVARRHPYFYAPELLYYAEQYNEILTQCCAEADKESCLTPKLDGVKEKALVSSVRQRMK CSSMQKFGERAFKA AVARLSQTFPNADFAEITKLATDLTKVNKECCHGDLLECADDRAE LAKYMCENQATISSKLQTCCDKPLLKKAHCLSEVEHDTMPADLPAIAADFVEDQEVCKNY AEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEANPPACYGTVLAEFQP LVEEPKNLVKTNCDLYEKLGEYGFQNAILVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCT LPEDQRLPCVEDYLSAILNRVCLLHEKTPVSEHVTKCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVP KEFKAETFTFHSDICTLPEKEKQIKKQTALAELVKHKPKATAEQLKTVMDDFAQFLDTCC KAADKDTCFSTEGPNLVTRSKDALA SEQ ID NO. 158 13N49Q-1GS-M13N49Q-3GS-MSA-C34S/C579S constructo bivalente; mutaciones subrayadas SQIEVKDVTDTTALITWHDAFGYDFGCELTYGIKDVPGDRTTIDLPDHFHQYSIGNLKPD TEYEVSLICANDHGFDSNPAKETFTTTGGGGSRLDAPSQIEVKDVTDTTALITWHDAFGY DFGCELTYGIKDVPGDRTTIDLPDHFHQYSIGNLKPDTEYEVSLICANDHGFDSNPAKET FTTGGGGSGGGGSGGGGSEAHKSEIAHRYNDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKSSYDEHAKL VQEVTDFAKTCVADESAANCDKSLHTLFGDKLCAIPNLRENYGELADCCTKQEPERNECF LQHKDDNPSLPPFERPEAEAMCTSFKENPTTFMGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEQYN EILTQCCAEADKESCLTPKLDGVKEKALVSSVRQRMKCSSMQKFGERAFKA AVARLSQT FPNADFAEITKLATDLTKV KECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQTCCD P LLKKAHCLSEVEHDTMPADLPAIAADFVEDQEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYS VSLLLRLAKKYEATLEKCCAEANPPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCDLYE LGEYG FQNAILVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEDQRLPCVEDYLSAILNRVCL LHEKTPVSEHV KCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPEKEKQ IKKQTALAELVKHKPKATAEQLKTVMDDFAQFLDTCCKAADKDTCFSTEGPNLVTRSKDA LA SEQ ID NO. 159 Clon M31; los bucles BC, DE, FG están subrayados IEVKDVTDTTALITWHDPSGYDFWCELTYGIKDVPGDRTTIDLPDHFHNYSIGNLKPDTE YEVSLICA DHGFDSYPAKETFTT SEQ ID NO. 160 Clon M31N49Q; mutación N49Q subrayada IEVKDVTDTTALITWHDPSGYDFWCELTYGIKDVPGDRTTIDLPDHFHQYSIGNLKPDTE YEVSLICANDHGFDSYPAKETFTT SEQ ID NO. 161 M31N49Q-1GS-M31N49Q constructo bivalente; mutación N49Q subrayada SQIEVKDVTDTTALITWHDPSGYDFWCELTYGIKDVPGDRTTIDLPDHFHQYSIGNLKPD TEYEVSLICANDHGFDSYPAKETFTTTGGGGSRLDAPSQIEVKDVTDTTALITWHDPSGY DFWCELTYGIKDVPGDRTTIDLPDHFHQYSIGNLKPDTEYEVSLICANDHGFDSYPAKET FTT SEQ ID NO. 162 M31N49Q-3GS-MSA-C34S/C579S constructo monovalente; mutaciones subrayadas SQIEVKDVTDTTALITWHDPSGYDFWCELTYGIKDVPGDRTTIDLPDHFHQYSIGNLKPD TEYEVSLICANDHGFDSYPAKETFTTGGGGSGGGGSGGGGSEAHKSEIAHRYNDLGEQHF KGLVLIAFSQYLQKSSYDEHAKLVQEVTDFAKTCVADESAANCDKSLHTLFGDKLCAIPN LRENYGELADCCTKQEPERNECFLQHKDDNPSLPPFERPEAEA CTSFKENPTTFMGHYL HEVARRHPYFYAPELLYYAEQYNEILTQCCAEADKESCLTPKLDGVKEKALVSSVRQR K CSSMQKFGERAFKAWAVARLSQTFPNADFAEITKLATDLTKVNKECCHGDLLECADDRAE LAKYMCENQATISSKLQTCCDKPLLKKAHCLSEVEHDT PADLPAIAADFVEDQEVCK Y AEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEANPPACYGTVLAEFQP LVEEPKNLVKTNCDLYEKLGEYGFQNAILVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGT CCT LPEDQRLPCVEDYLSAILNRVCLLHEKTPVSEHVTKCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVP KEFKAETFTFHSDICTLPE EKQIKKQTALAELVKHKPKATAEQLKTVMDDFAQFLDTCC KAADKDTCFSTEGPNLVTRSKDALA SEQ ID NO. 163 M31N49Q-1GS-M31N49Q-3GS-MSA-C34S/C579S constructo bivalente; mutaciones subrayadas SQIEVKDVTDTTALITWHDPSGYDF CELTYGIKDVPGDRTTIDLPDHFHQYSIGNLKPD TEYEVSLICANDHGFDSYPAKETFTTTGGGGSRLDAPSQIEVKDVTDTTALITWHDPSGY DF CELTYGIKDVPGDRTTIDLPDHFHQYSIG LKPDTEYEVSLICANDHGFDSYPAKET FTTGGGGSGGGGSGGGGSEAHKSEIAHRYNDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKSSYDEHAKL VQEVTDFAKTCVADESAANCDKSLHTLFGDKLCAIPNLRENYGELADCCTKQEPERNECF LQHKDDNPSLPPFERPEAEAMCTSFKENPTTFMGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEQYN EILTQCCAEADKESCLTPKLDGVKE ALVSSVRQRMKCSSMQKFGERAFKAWAVARLSQT FPNADFAEITKLATDLT V KECCHGDLLECADDRAELA YMCENQA ISSKLQTCCDKP LLKKAHCLSEVEHDTMPADLPAIAADFVEDQEVCK YAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYS VSLLLRLAKKYEATLEKCCAEANPPACYGTVLAEFQPLVEEPK LVKTNCDLYEKLGEYG FQNAILVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGT CCTLPEDQRLPCVEDYLSAILNRVCL LHEKTPVSEHVTKCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVP EFKAETFTFHSDICTLPEKEKQ IKKQTALAELVKHKPKATAEQLKTVMDDFAQFLDTCC AADKDTCFSTEGPNLVTRSKDA LA SEQ ID NO. 164 Clon DI - Tn3 de control negativo IEVKDVTDTTALIT SPGERIWMFTGCELTYGIKDVPGDRTTIDLTEDENQYSIGNLKPD TEYEVSLICPNYERISNPAKETFTTT SEQ ID NO. 165 D1-1GS-D1-3G- SA-C34S/C579S constructo bivalente; mutaciones subrayadas SQIEVKDVTDTTALITWSPGERIWMFTGCELTYGIKDVPGDRTTIDLTEDENQYSIGNLK PDTEYEVSLICPNYERISNPAKETFTTTGGGGS LDAPSQIEVKDVTDTTALITWSPGER IWMFTGCELTYGIKDVPGDRTTIDLTEDENQYSIGNLKPDTEYEVSLICPNYERISNPAK ETFTTGGGGSGGGGSGGGGSEAHKSEIAHRYNDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKSSYDEHA KLVQEVTDFAKTCVADESAANCDKSLHTLFGDKLCAIPNLRENYGELADCCTKQEPERNE CFLQHKDDNPSLPPFERPEAEAMCTSFKENPTTFMGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEQ YNEILTQCCAEADKESCLTPKLDGVKEKALVSSVRQRMKCSSMQKFGERAFKAWAVARLS QTFPNADFAEITKLATDLTKVNKECCHGDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQTCCD KPLLKKAHCLSEVEHDTMPADLPAIAADFVEDQEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPD YSVSLLLRLAKKYEATLEKCCAEANPPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLVKTNCDLYEKLGE YGFQNAILVRYTQKAPQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEDQRLPCVEDYLSAILNRV CLLHEKTPVSEHVTKCCSGSLVERRPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPEKE KQIKKQTALAELVKHKPKATAEQLKTVMDDFAQFLDTCCKAADKDTCFSTEGPNLVTRSK DALA SEQ ID NO. 166 Mutante de RDG a SDG del clon 342; mutación subrayada IEVKDVTDTTALITWSDDFGEYVWCELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPDTE YEVSLICRSGDMSSNPAKETFTT SEQ ID NO. 167 309FG t consenso Todas las hebras son hebras de Tn3 originales; la hebra C beta es una variante de CELTYGI (SEQ ID NO: 14) ; los bucles AB, CD, EF son bucles de Tn3 originales Xl= Ser o Leu X2= Asp o Glu X3= His, lie, Val, Phe o Trp X4= Ala, Gly, Glu o Asp X5= Glu, Leu, Gln, Ser, Asp o Asn X6= Phe o Tyr X7= lie, Val, His, Glu o Asp X8= Gly, Trp o Val X9= Trp, Phe o Tyr X10= Ser, Gln, Met o His Xll= Trp o His X12= Arg o Ser IEVKDVTDTTALITWX1DX2X3X4X5X6X7X8CELTYGIKDVPGDRTTIDLWX9HX10AX11YSIGNLKPDTE YEVSLICRX12GDMSSNPAKETFTT SEQ ID NO. 168 309FG t consenso, bucle BC Xl= Ser o Leu X2= Asp o Glu X3= His, lie, Val, Phe o Trp X4= Ala, Gly, Glu o Asp X5= Glu, Leu, Gln, Ser, Asp o Asn X6= Phe o Tyr X7= lie, Val, His, Glu o Asp X8= Gly, Trp o Val X1DX2X3X4X5X6X7X8 SEQ ID NO. 169 309FGwt consenso, bucle DE X9= Trp, Phe o Tyr X10= Ser, Gln, Met o His Xll= Trp o His WX9HX10AX11 SEQ ID NO. 170 309FG t consenso, bucle FG X12= Arg o Ser RX1 GDMSSNPA SEQ ID NO. 171 311 consenso; todas las hebras son hebras de Tn3 originales; dos variantes de la hebra beta C (SEQ ID NO: 13 y 14) ; el bucle CD es un bucle de Tn3 original XI= Lys o Glu X2= Thr o lie X3= Asn o Ala X4= Ser, Leu, Ala, Phe o Tyr X5= Tyr, Ala, Gly, Val, lie o Ser (contacto BC/N-term) X6= Tyr, Ser, Ala o His X7= Asn, Asp, His o Tyr X8= Leu, Phe, His o Tyr X9= His, Pro, Ser, Leu o Asp X10= Gly, Phe, His o Tyr Xll= Ala o Thr X12= Ser, Asn, Glu, Arg o Asp X13= Ser, Gln, Thr, Asn o Ala X14= Pro, Val, -, lie o Ala (- ningún aminoácido) X15= - o lie (- ningún aminoácido) X16= Glu o Lys X17= Ser o Asn IEVX1DVTDTTALITWX2X3 SX4X5X6X7X8X9X10CELX11YGIKDVPGDRTTIDLX12X13X14X15YVH YSIGNLKPDTX16YEVSLICLTTDGTYX17NPA ETFTT SEQ ID NO. 172 311 consenso; hebra beta C en los clones de la familia 311 Xll= Ala o Thr CELX11YGI SEQ ID NO. 173 311 consenso; bucle AB Xl= Lys o Glu X1DVTDTT SEQ ID NO. 174 311 consenso; bucle BC X2= Thr o lie X3= Asn o Ala X4= Ser, Leu, Ala, Phe o Tyr X5= Tyr, Ala, Gly, Val, lie o Ser (contacto BC/N-term) X6= Tyr, Ser, Ala o His X7= Asn, Asp, His o Tyr X8= Leu, Phe, His o Tyr X9= His, Pro, Ser, Leu o Asp X10= Gly, Phe, His o Tyr X2X3RSX4X5X6X7X8X9X10 SEQ ID NO. 175 311 consenso; bucle DE X12= Ser, Asn, Glu, Arg o Asp X13= Ser, Gln, Thr, Asn o Ala X14= Pro, Val, -, lie o Ala (- ningún aminoácido) X15= - o lie (- ningún aminoácido) X12X13X14X15YVH SEQ ID NO. 176 311 consenso; bucle EF X16= Glu o Lys GNLKPDTX16 SEQ ID NO. 177 311 consenso; bucle FG X17= Ser o Asn LTTDGTYX17NPA SEQ ID NO. 178 BC9 NHT oligo; bucle BC Códigos de los nucleótidos: N = G/A/T/C; H = A/T/C; R = A/G; S = G/C; B = T/C/G; V = A/C/G; M = A/C; K = G/T ACCGCGCTGATTACCTGGNHTNHTSCGNHTGSTNHTNHTNHTGGCTGTGAACTGACCTAT GGCATTAAA SEQ ID NO. 179 BC11 NHT oligo; bucle BC Códigos de los nucleótidos : N = G/A/T/C; H = A/T/C; R = A/G; ? = G/C; B = T/C/G; V = A/C/G; M = A/C; K = G/T ACCGCGCTGATTACCTGGNHTNHTBSTNHTNHTNHTNHTNHTNHTNHTGGCTGTGAACTG ACCTATGGCATTAAA SEQ ID NO. 180 BC12 NHT oligo; bucle BC Códigos de los nucleótidos: N = G/A/T/C; H = A/T/C; R = A/G; S = G/C; B = T/C/G; V = A/C/G; M = A/C; K = G/T ACCGCGCTGATTACCTGGNHTV ACCGNHTNHTNHTRRCRGCNHTVTTNHTGGCTGTGAA CTGACCTATGGCATTAAA SEQ ID NO. 181 DE NHT oligo; bucle DE Códigos de los nucleótidos: N = G/A/T/C; H = A/T/C; R = A/G; S = G/C; B = T/C/G; V = A/C/G; = A/C; K = G/T CGATCGCACCACCATAGATCTGNHTNHTNHTNHTNHTNHTTATAGCATTGGTAACCTGAA ACCG SEQ ID NO. 182 FG9 NHT oligo; bucle FG Códigos de los nucleótidos: N = G/A/T/C; H = A/T/C; R = A/G; S = G/C; B = T/C/G; V = A/C/G; M = A/C; = G/T GAATATGAAGTGAGCCTGATTTGCNHTAMSNHTNHTGGTNHTNHTNHTKCGAAAGAAACC TTTACCACCGGTG SEQ ID NO. 183 FG10 NHT oligo; bucle FG Códigos de los nucleótidos: N = G/A/T/C; H = A/T/C; R = A/G; S = G/C; B = T/C/G; V = A/C/G; M = A/C; K = G/T GAATATGAAGTGAGCCTGATTTGCNHTAMS HTNHTNHT HTRGCNHTCCGGCGAAAGAA ACCTTTACCACCGGTG SEQ ID NO. 184 FG11 NHT oligo; bucle FG Códigos de los nucleótidos: N = G/A/T/C; H = A/T/C; R = A/G; S = G/C; B = T/C/G; V = A/C/G; = A/C; K = G/T GAATATGAAGTGAGCCTGATTTGCNHTAMSNHTNHTGGTNHTNHTAGCAACCCGGCGAAA GAAACCTTTACCACCGGTG SEQ ID NO. 185 BCX-DE bridge v2 oligo CAGATCTATGGTGGTGCGATCGCCCGGCACATCTTTAATGCCATAGGTCAGTTCACA SEQ ID NO. 186 DE-FGX bridge v2 oligo GCAAATCAGGCTCACTTCATATTCGGTATCCGGTTTCAGGTTACCAATGCTAT SEQ ID NO. 187 Kpnl amp rev v2 oligo CGGGTCGGTTGGGGTACCGCCACCGGTGGTAAAGGTTTCTTT SEQ ID NO. 188 Kpnl reverse v2 oligo CGGGTCGGTTGGGGTA SEQ ID NO. 189 BC library amp v2 oligo GGCCCAGCCGGCCATGGCCGCCATTGAAGTGAAAGATGTGACCGATACCACCGCGCTGAT TACCTGG SEQ ID NO. 190 BC9 PCR oligo Códigos de los nucleótidos: 1= Codones para todo 19aa(-cys) 2= Codones para Ala/Pro 50/50; 3= Codones para Ala/Gly ACCGCGCTGATTACCTGGTCT1213111GGCTGTGAACTGACCTATGGCATTAAAGATG SEQ ID NO. 191 BC 9 -loop NNK Oligo Códigos de los nucleótidos : K= 50% de G/50% de T ACCGCGCTGATTACCTGG NKSMG NKGSTNNKN KNN GGCTGTGAACTGACCTA TGGCATTAAA SEQ ID NO. 192 309 BC-loop NNKdope oligo Códigos de los nucleótidos: 4= 70% de G, 10% de A, 10% de C, 10% de T; 5= 10% de G,70% de A, 10% de C,10% de T; 6=10% de G,10% de A, 70% de C, 10% de T; 7= 10% de G,10% de A, 10% de C,70% de T; 8= 70% de A, 15% de C, 15% de T; y = 50% de G/50% de T ACCGCGCTGATTACCTGG76K45K45K77K44K65K78T45K44KTGTGAACTGACCTA TGGCATTAAA SEQ ID NO. 193 DE PC oligo Códigos de los nucleótidos: 1= Codones para todo 19aa(-cys) GATGTGCCGGGCGATCGCACCACCATAGATCTG111111TATAGCATTGGTAACCTGAAA CCGG SEQ ID NO. 194 Upstr BCloop Rev oligo CCAGGTAATCAGCGCGGTGGTAT SEQ ID NO. 195 BC shuffle rev oligo CAGATCTATGGTGGTGCGATCGC SEQ ID NO. 196 DE shuffle F D oligo TGTGAACTGACCTATGGCATTAAAGATGT SEQ ID NO. 197 BCll-311Gly oligo Códigos de los nucleótidos: 1=70% de G, 10% de A, 10% de C, 10% de T; 2=10% de G, 70% de A, 10% de C, 10% de T; 3=10% de G, 10% de A, 70% de C, 10% de T; 4=10% de G, 10% de A, 10% de C, 70% de T; 5=70% de A, 15% de C, 15% de T; 6=15% de A, 70% de C, 15% de T; 7=15% de A, 15% de C, 70% de T; V=33% de A, 33% de C, 33% de G.

ACCGCGCTGATTACCTGG26T25TV1T46T46T45T45T25T37T35TGGCTGTGAACTG ACCTATGGCATTAAA SEQ ID NO. 198 BC11-311NHT oligo Códigos de los nucleótidos: 1=70% de G, 10% de A, 10% de C, 10% de T 2=10% de G, 70% de A, 10% de C, 10% de T; 3=10% de G, 10% de A, 70% de C, 10% de T; 4=10% de G, 10% de A, 10% de C, 70% de T; 5=70% de A, 15% de C, 15% de T; 6=15% de A, 70% de C, 15% de T; 7=15% de A, 15% de C, 70% de T; V=33% de A, 33% de C, 33% de G; y H=33% de A, 33% de C, 33% de T ACCGCGCTGATTACCTGG26T25TV1T46T46T45T45T25T37T35TNHTTGTGAACTG ACCTATGGCATTAAA SEQ ID NO. 199 BC library amp K4E oligo GGCCCAGCCGGCCATGGCCGCCATTGAAGTGGAAGATGTGACCGATACCACCGCGCTGAT TACCTGG SEQ ID NO. 200 Variante de HSA con semivida prolongada (C34S, L463N, K524L) ; las mutaciones están subrayadas DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAE NCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEV DVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLP KLDELRDEGKASSAKQRL CASLQKFGERAFKA AVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTK VHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKC CAAADPHECYA VFDEFKPLVEEPQNLI QNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVST PTLVEVSRNLGKVGS CCKHPEAKR PCAEDYLSWLNQLCVNHEKTPVSDRVTKCCTES LVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQILKQTALVELVKHKPKAT KEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL SEQ ID NO. 201 311K4E_12-I constructo monovalente variante (comprende el conector GS y C34S HSA) ; el conector y la serina mutada están subrayados SQIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLK PDTEYEVSLICLTTDGTYNNPAKETFTTGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKAL VLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRE TYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEI ARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLP LDELRDEGKASSAKQRLKCAS LQ FGERAF A AVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLA YICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEA KDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVE EPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPE AKR PCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVT CCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEF NAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKAD DKETCFAEEGKKLVAASQAALGL SEQ ID NO. 202 311K4E_12-I constructo monovalente variante (comprende la variante CELTYG de la hebra C beta, el conector todo G y C34S HSA) ,· el conector y la serina mutada están subrayados SQIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLK PDTEYEVSLICLTTDGTYNNPAKETFTTGGGGGGGGGGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKAL VLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRE TYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEI ARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCAS LQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAK YICENQDSISSILKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEA KDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLE CCAAADPHECYAKVFDEFKPLVE EPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPE AKR PCAEDYLSWLNQLCVLHE TPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEF NAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKAD DKETCFAEEGKKLVAASQAALGL SEQ ID NO. 203 311K4E_12-I constructo bivalente variante (comprende conectores GS y C34S HSA) ; los conectores y la serina mutada están subrayados SQIEVEDVTDTTALITWT RSSYSNLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLK PDTEYEVSLICLTTDGTY NPAKETFTTGGGGSGGGGSGGGGSRLDAPSQIEVEDVTDTT ALITWTNRSSYSNLHGCELAYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKPDTEYEVSLICL TTDGTYN PAKETFTTGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQS PFEDHVKLWEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQ EPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHD EETFLKKYLYEIARRHPYFYAPEL LFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAW AVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSK LKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEY ARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCEL FEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLS WLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADIC TLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAV DDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKK LVAASQAALGL SEQ ID NO. 204 311K4E_12-I constructo bivalente variante (comprende conectores todo G y S34 HSA) ; los conectores y la serina mutada están subrayados SQIEVEDVTDTTALITWTNRSSYSNLHGCELTYGIKDVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLK PDTEYEVSLICLTTDGTYNNPAKETFTTGGGGGGGGGGGGGGGRLDAPSQIEVEDVTDTT ALITWTNRSSYSNLHGCELAYGI DVPGDRTTIDLNQPYVHYSIGNLKPDTEYEVSLICL TTDGTYNNPAKETFTTGGGGGGGGGGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQS PFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQ EPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPEL LFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAW AVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSK LKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEY ARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCEL FEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLG VGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLS WLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADIC TLSEKERQIK QTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKK L AASQAALGL SEQ ID NO. 205 309-3GS-309 constructo bivalente SQIEVKDVTDTTALITWSDEFGH DGCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNL PD TEYEVSLICYTDQEAGNPAKETFTTGGGGSGGGGSGGGGSRLDAPSQIEVKDVTDTTALI TWSDEFGHYDGCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPDTEYEVSLICYTDQEA GNPAKETFTT SEQ ID NO. 206 309-2GS-HSAC34S constructo monovalente SQIEVKDVTDTTALITWSDEFGHYDGCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPD TEYEVSLICYTDQEAGNPAKETFTTGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENF ALVLI AFAQYLQQSPFEDHVKLV EVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYG EMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARR HPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQK FGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDV FLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQ NLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTK VPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKR MPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAE TFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADD E TCFAEEGKKLVAASQAALGL SEQ ID NO. 207 309-3GS-309-2GS-HSAC34S constructo bivalente SQIEVKDVTDTTALITWSDEFGHYDGCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPD TEYEVSLICYTDQEAGNPAKETFTTGGGGSGGGGSGGGGSRLDAPSQIEVKDVTDTTALI TWSDEFGHYDGCELTYGIKDVPGDRTTIDLWWHSAWYSIGNLKPDTEYEVSLICYTDQEA GNPAKETFTTGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHV KLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNE CFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDV CTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR YKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAF AWAVARLS QRFPKAEFAEVSKLVTDLT VHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCE KPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPD YSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE YKFQNALLVRYTK VPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCC HPEAKRMPCAEDYLSWLNQL CVLHE TPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKE RQI KQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQ AALGL SEQ ID NO. 208 342-3GS-342 constructo bivalente SQIEVKDVTDTTALITWSDDFGEYV CELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNLKPD TEYEVSLICRSGDMSSNPAKETFTTGGGGSGGGGSGGGGSRLDAPSQIEVKDVTDTTALI T SDDFGEYV CELTYGIKDVPGDRTTIDLWYHHAHYSIGNL PDTEYEVSLICRSGDMS SNPAKETFTT SEQ ID NO. 209 Módulo conector Gly-Ser, (G4X)n donde X=G, S, A, L, I o V y n = 1-7; se muestra el módulo (G4X)n donde n=l GGGGX SEQ ID NO. 210 Mutante L25/M del péptido señal OppA MTNITKRSLVAAGVLAALMAGNVAMA Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una matriz de soporte de Tn3 que comprende una subunidad monomérica específica para CD40L, caracterizada porque la subunidad monomérica comprende siete hebras beta denominadas A, B, C, D, E, F y G, y seis regiones de bucles denominadas AB, BC, CD, DE, EF y FG, y donde la matriz de soporte de Tn3 se une específicamente a CD40L.

2. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una subunidad monomérica específica para CD40L.

3. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende dos subunidades monoméricas específicas para CD40L conectadas en tándem.

4. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque las dos subunidades monoméricas específicas para CD40L están conectadas directamente.

5. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque las dos subunidades monoméricas específicas para CD40L están conectadas por un conector.

6. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el conector comprende un conector peptídico.

7. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el conector peptídico es un conector peptídico flexible.

8. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el conector peptídico comprende una secuencia (GmX)n donde: (a) X es serina (S) , alanina (A) , glicina (G) , leucina (L) , isoleucina (I) o valina (V) ; (b) m y n son números enteros; (c) m es 1, 2, 3 o 4; y (d) n es 1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 o 7.

9. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el conector peptídico comprende la SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 142 o SEQ ID NO: 143.

10. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la unión de la matriz de soporte con CD40L es mejor que la de una matriz de soporte de Tn3 que comprende una única subunidad monomérica específica para CD40L.

11. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la unión de la matriz de soporte con CD40L mejora la acción sobre la diana en comparación con la de una matriz de soporte de Tn3 que comprende una única subunidad monomérica específica para CD40L.

12. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la mejora en la unión con CD40L es una mejora en la afinidad de unión, una mejora en la avidez de unión o ambas.

13. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la afinidad de unión con CD40L y la estabilidad proteica son mejores que las de una matriz de soporte de Tn3 que comprende una única subunidad monomérica específica para CD40L.

14. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la avidez de unión con CD40L y la estabilidad proteica son mejores que las de una matriz de soporte de Tn3 que comprende una única subunidad monomérica específica para CD40L.

15. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizada porque al menos una subunidad monomérica específica para CD40L está unida a un conector o a un resto heterologo.

16. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque un conector o un resto heterologo está conjugado con el extremo N o el extremo C de la matriz de soporte.

17. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 15 o 16, caracterizada porque el conector comprende un conector peptídico.

18. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el conector peptídico es un conector peptídico flexible.

19. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 17 o 18, caracterizada porque el conector peptídico comprende una secuencia (GmX)n donde: (a) X es serina (S) , alanina (A) , glicina (G) , leucina (L) , isoleucina (I) o valina (V) ; (b) m y n son números enteros; (c) m es l, 2, 3 o 4; y (d) n es 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7.

20. La Tn3 de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el conector peptídico comprende la SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 142 o SEQ ID NO: 143.

21. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el conector comprende un resto funcional .

22. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el resto funcional es una inmunoglobulina o uno de sus fragmentos.

23. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la inmunoglobulina o uno de sus fragmentos comprende un dominio Fe .

24. La matriz de soporte de Tn3 de la reivindicación 23, caracterizada porque el dominio Fe no consigue inducir al menos una función efectora mediada por FCYR

25. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la función efectora mediada por FcyR es ADCC.

26. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque al menos una subunidad monomérica específica para CD40L está unida a un resto heterólogo.

27. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 15 o 26, caracterizada porque el resto heterólogo comprende una composición seleccionada del grupo constituido por: una proteína, un péptido, un dominio proteico, un conector, un fármaco, una toxina, un agente citotóxico, un contraste, un radionucleido, un compuesto radioactivo, un polímero orgánico, un polímero inorgánico, un polietilenglicol (PEG) , biotina, una albúmina, una albúmina sérica humana (HSA, por sus siglas en inglés) , una porción de unión a FcRn de HSA, un anticuerpo, un dominio de un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo de un dominio, un dominio de unión a albúmina, una enzima, un ligando, un receptor, un péptido de unión, una matriz de soporte que no sea de FnlII, un epítopo marcador, un polímero polipeptídico recombinante, una citocina y una combinación de dos o más de estos restos.

28. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque al menos una subunidad monomérica específica para CD40L está conjugada con PEG.

29. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque al menos una subunidad monomérica específica para CD40L está conjugada con una albúmina.

30. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque la albúmina es albúmina sérica humana (HSA) .

31. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque la HSA es una variante de HSA.

32. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos de la variante de HSA es la SEQ ID NO: 133.

33. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque la variante de HSA tiene al menos una propiedad mejorada en comparación con una HSA nativa o un fragmento de una HSA nativa.

34. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque la propiedad mejorada es una semivida plasmática alterada en comparación con la semivida plasmática de una HSA nativa o un fragmento de una HSA nativa.

35. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque la semivida plasmática alterada es una semivida plasmática más prolongada en comparación con la semivida plasmática de una HSA nativa o un fragmento de una HSA nativa.

36. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque la semivida plasmática alterada es una semivida plasmática más corta en comparación con la semivida plasmática de una HSA nativa o un fragmento de una HSA nativa.

37. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 o 33-36, caracterizada porque la variante de HSA comprende al menos una sustitución aminoacídica en el dominio III de la HSA.

38. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 o 33-37, caracterizada porque la variante de HSA comprende la secuencia de la HSA madura completa (SEQ ID NO: 133 o 138) o un fragmento de esta, salvo por al menos una sustitución aminoacídica, numerada respecto a la posición en la HSA madura completa, en una posición seleccionada entre el grupo constituido por 407, 415, 463, 500, 506, 508, 509, 511, 512, 515, 516, 521, 523, 524, 526, 535, 550, 557, 573, 574 y 580; donde la sustitución aminoacídica no comprende sustituir una lisina (K) por ácido glutámico (E) en la posición 573, y donde la matriz de soporte de Tn3 tiene una semivida plasmática más prolongada que la semivida plasmática de una matriz de soporte de Tn3 que no está conjugada con la variante de HSA.

39. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque la sustitución aminoacídica, numerada respecto a la posición en la HSA madura completa, se encuentra en una posición seleccionada entre el grupo constituido por 463, 508, 523 y 524, donde la matriz de soporte de Tn3 tiene una semivida plasmática más prolongada que la semivida plasmática de una matriz de soporte de Tn3 que no está conjugada con la variante de HSA.

40. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 o 33-38, caracterizada porque la variante de HSA comprende la secuencia de la HSA madura completa (SEQ ID NO: 133 o 138) o un fragmento de esta, salvo por al menos una sustitución aminoacídica, numerada respecto a la posición en la HSA madura completa, seleccionada entre el grupo constituido por: (a) sustitución de leucina (L) en la posición 407 por asparagina (N) o tirosina (Y) ; (b) sustitución de valina (V) en la posición 415 por treonina (T) ; (c) sustitución de leucina (L) en la posición 463 por asparagina (N) ; (d) sustitución de lisina (K) en la posición 500 por arginina (R) ; (e) sustitución de treonina (T) en la posición 506 por tirosina (Y) ; (f) sustitución de treonina (T) en la posición 508 por arginina (R) ; (g) sustitución de fenilalanina (F) en la posición 509 por metionina (M) o triptófano (W) ; (h) sustitución de alanina (A) en la posición 511 por fenilalanina (F) ; (i) sustitución de ácido aspártico (T) en la posición 512 por tirosina (Y) ; (j) sustitución de treonina (T) en la posición 515 por glutamina (Q) ; (k) sustitución de leucina (L) en la posición 516 por treonina (T) o triptófano (W) ; (1) sustitución de arginina (R) en la posición 521 por triptófano (W) ; (m) sustitución de isoleucina (I) en la posición 523 por ácido aspártico (D) , ácido glutámico (E) , glicina (G) , lisina (K) o arginina (R) ; (n) sustitución de lisina (K) en la posición 524 por leucina (L) ; (o) sustitución de glutamina (Q) en la posición 526 por metionina (M) ; (p) sustitución de histidina (H) en la posición 535 por prolina (P) ; (q) sustitución de ácido aspártico (D) en la posición 550 por ácido glutámico (E) ; (r) sustitución de lisina (K) en la posición 557 por glicina (G) ; (s) sustitución de lisina (K) en la posición 573 por fenilalanina (F) , histidina (H) , prolina (P) , triptófano (W) o tirosina (Y) ; (t) sustitución de lisina (K) en la posición 574 por asparagina (N) ; (u) sustitución de glutamina (Q) en la posición 580 por lisina (K) ; y (v) una combinación de dos o más de estas sustituciones, donde la matriz de soporte de Tn3 tiene una semivida plasmática más prolongada que la semivida plasmática de una matriz de soporte de Tn3 no conjugada con la variante de HSA.

41. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque la variante de HSA comprende la secuencia de la HSA madura completa (SBQ ID NO: 133 o 138) o un fragmento de esta, salvo por al menos una sustitución aminoacídica, numerada respecto a la posición en la HSA madura completa, seleccionada entre el grupo constituido por: (a) sustitución de leucina (L) en la posición 463 por asparagina (N) ; (b) sustitución de treonina (T) en la posición 508 por arginina (R) ; (c) sustitución de isoleucina (I) en la posición 523 por ácido aspártico (D) , ácido glutámico (E) , glicina (G) , lisina (K) o arginina (R) ; (d) sustitución de lisina (K) en la posición 524 por leucina (L) ; y ( e) una combinación de dos o más de estas sustituciones , donde la matri z de soporte de Tn3 tiene una semivida plasmática más prolongada que la semivida plasmática de una matriz de soporte de Tn3 no conj ugada con la variante de HSA .

42 . La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-14, caracterizada porque comprende al menos dos subunidades monoméricas específicas para CD40L idénticas .

43. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-15, caracterizada porque comprende al menos dos subunidades monoméricas específicas para CD40L diferentes.

44 . La matriz de soporte de Tn3 de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la matriz de soporte es un agonista del receptor CD40.

45 . La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la matriz de soporte es un antagonista del receptor CD40 .

46 . La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 - 14 , caracterizada porque al menos dos subunidades monoméricas específ icas para CD40L se unen específ icamente al mismo epítopo de CD40L .

47 . La matri z de soporte de Tn3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 - 14 , caracterizada porque al menos dos subunidades monoméricas específicas para CD40L se unen específicamente a epítopos de CD40L diferentes.

48. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque los epítopos de CD40L diferentes son epítopos no superpuestos.

49. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque los epítopos de CD40L diferentes son epítopos superpuestos.

50. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la matriz de soporte se une a al menos dos moléculas de CD40L.

51. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque una única subunidad monomérica específica para CD40L se une a al menos dos moléculas de CD40L.

52. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las hebras beta de al menos una subunidad monomérica específica para CD40L tienen al menos un 90% de identidad secuencial respecto a las hebras beta de la SEQ ID NO: 3.

53. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la hebra beta A comprende la SEQ ID NO : 11, salvo por al menos una mutación.

54. La matriz de soporte de Tn3 de la reivindicación 1, caracterizada porque la hebra beta B comprende la SEQ ID NO: 12, salvo por al menos una mutación.

55. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la hebra beta C comprende la SEQ ID NO: 13 o 14, salvo por al menos una mutación, y donde la cisteína en la SEQ ID NO: 13 o 14 no está sustituida.

56. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la hebra beta D comprende la SEQ ID NO: 15, salvo por al menos una mutación.

57. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la hebra beta E comprende la SEQ ID NO: 16, salvo por al menos una mutación.

58. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la hebra beta F comprende la SEQ ID NO: 17, salvo por al menos una mutación, y donde la cisteína en la SEQ ID NO: 17 no está sustituida.

59. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la hebra beta G comprende la SEQ ID NO: 18, salvo por al menos una mutación.

60. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la subunidad monomérica específica para CD40L comprende la secuencia de aminoácidos: IEV (XAB) nALIT (XBC) nCELXiYGI (XCD) nTTIDL (XDE) nYSI (XEF) nYEVSLIC (XFG)nKETFTT donde : (a) XAB, XBC» XCD XDE, XEF y FG representan los residuos aminoacídicos presentes en las secuencias de los bucles AB, BC, CD, DE, EF y FG, respectivamente; (b) Xi representa un residuo aminoacídico de A o T; y (c) la longitud del bucle n es un número entero comprendido entre 2 y 26.

61. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la secuencia del bucle AB comprende la SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 136, la secuencia del bucle CD comprende la SEQ ID NO: 6 y la secuencia del bucle EF comprende la SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 137.

62. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la secuencia del bucle BC comprende una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs: 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 y 92.

63. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la secuencia del bucle DE comprende una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs : 94, 95, 96, 97, 98 y 169.

64. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la secuencia del bucle FG comprende una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs : 9, 99, 139 y 170.

65. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la secuencia del bucle BC comprende una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs : 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 y 174.

66. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la secuencia del bucle DE comprende una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs : 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128 y 175.

67. La matriz de soporte de Tn3 de la reivindicación 60, caracterizada porque la secuencia del bucle FG comprende una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs: 129, 130 y 177.

68. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque: (a) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 83, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139; (b) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 83, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 99; (c) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 84, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 95 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139; (d) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 85, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139; (e) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 86, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 96 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139; (f) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 87, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 97 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139; (g) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 88, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 95 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139; (h) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 89, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139; (i) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 90, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139; (j) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 91, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 95 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139; (k) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 92, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 98 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO : 9 o 139; o (1) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 93, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 94 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 9 o 139.

69. La matriz de soporte de Tn3 de la reivindicación conformidad con 60, caracterizada porque: (a) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 100, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 118 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129; (b) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 101, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 119 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129; (c) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 102, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 120 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129; (d) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 103, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 121 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129; (e) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 104, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 122 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129; (f) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 105, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 121 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129; (g) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 106, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 123 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129; (h) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 107, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 123 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129; (i) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 108, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 118 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129; (j) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 109, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 123 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129; (k) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 110, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 121 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129; (1) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 111, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 123 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 130; (m) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 108, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 121 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129; (n) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 112, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 124 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129; (o) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 113, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 125 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129; (p) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 114, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 118 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129; (q) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 115, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 126 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129; (r) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 116, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 127 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129; o (s) la secuencia del bucle BC comprende la SEQ ID NO: 117, la secuencia del bucle DE comprende la SEQ ID NO: 128 y la secuencia del bucle FG comprende la SEQ ID NO: 129.

70. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 69, caracterizada porque el bucle AB comprende la SEQ ID NO: 136.

71. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 68, caracterizada porque la subunidad monomérica específica para CD40L comprende una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs : 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 y 146.

72. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la subunidad monomérica específica para CD40L comprende la secuencia de aminoácidos : IEVKDVTDTTALITWX1DX2X3X4X5X6X7X8CELTYGIKDVPGDRTTIDL X9HX10AX 11YSIGNLKPDTEYEVSLICRX12GDMSSNPAKETFTT (SEQ ID NO: 167) donde : (a) Xi representa un residuo aminoacídico de serina (S) o leucina (L) ; (b) X2 representa un residuo aminoacídico de ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E) ; (c) X3 representa un residuo aminoacídico de histidina (H) , isoleucina (I) , valina (V) , fenilalanina (F) o triptófano (W) ; (d) X4 representa un residuo aminoacídico de alanina (A) , glicina (G) , ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) ; (e) X5 representa un residuo aminoacídico de ácido glutámico (E) , leucina (L) , glutamina (Q) , serina (S) , ácido aspártico (D) o asparagina (N) ; (f) X6 representa un residuo aminoacídico de fenilalanina (F) o tirosina (Y) ; (g) X7 representa un residuo aminoacídico de isoleucina (I) , valina (V) , histidina (H) , ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) ; (h) X8 representa un residuo aminoacídico de glicina (G) , triptófano (W) o valina (V) ; (i) X9 representa un residuo aminoacídico de triptófano (W) , fenilalanina (F) o tirosina (Y) ; (j) Xio representa un residuo aminoacídico de serina (S) , glutamina (Q) , metionina (M) o histidina (H) ; (k) Xn representa un residuo aminoacídico de triptófano (W) o histidina (H) ; y (1) Xi2 representa un residuo aminoacídico de arginina (R) o serina (S) .

73. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 69, caracterizada porque la subunidad monomérica específica para CD40L comprende una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs : 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 y 82.

74. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la subunidad monomérica específica para CD40L comprende la secuencia de aminoácidos : IEVX1DVTDTTALITWX2X3RSX4X5 6 7 8 9 ioCELX1iYGIKDVPGDRTTIDLX12 X13X14X15YVHYS IGNLKPDTX16YEVSLICLTTDGTYX17NPAKETFTT (SEQ ID NO: 171) donde : (a) Xx representa un residuo aminoacídico de lisina (K) o ácido glutámico (E) ; (b) X2 representa un residuo aminoacídico de treonina (T) o isoleucina (I) ; (c) X3 representa un residuo aminoacídico de asparagina (N) o alanina (A) ; (d) X4 representa un residuo aminoacídico de serina (S) , leucina (L) , alanina (A) , fenilalanina (F) o tirosina (Y) ; (e) X5 representa un residuo aminoacídico de tirosina (Y) , alanina (A) , glicina (G) , valina (V) , isoleucina (I) o serina (S) ; (f) X6 representa un residuo aminoacídico de tirosina (Y) , serina (S) , alanina (A) o histidina (H) ; (g) X7 representa un residuo aminoacídico de asparagina (N) , ácido aspártico (D) , histidina (H) o tirosina (Y) ; (h) X8 representa un residuo aminoacídico de leucina (L) , fenilalanina (F) , histidina (H) o tirosina (Y) ; (i) X9 representa un residuo aminoacídico de histidina (H) , prolina (P) , serina (S) , leucina (L) o ácido aspártico (D) ; (j) ??? representa un residuo aminoacídico de glicina (G) , fenilalanina (F) , histidina (H) o tirosina (Y) ; (k) Xn representa un residuo aminoacídico de alanina (A) o treonina (T) ; (1) Xi2 representa un residuo aminoacídico de serina (S) , asparagina (N) , ácido glutámico (E) , arginina (R) o ácido aspártico (D) ; (m) X13 representa un residuo aminoacídico de serina (S) , glutamina (Q) , treonina (T) , asparagina (N) o alanina (A) ; (n) X14 representa un residuo aminoacídico de prolina (P) , valina (V) , isoleucina (I) o alanina (A) o ningún aminoácido; (o) i5 representa un residuo aminoacídico de isoleucina (I) o ningún aminoácido; (p) Xi6 representa un residuo aminoacídico de ácido glutámico (E) o lisina (K) ; y (q) Xi7 representa un residuo aminoacídico de serina (S) o asparagina (N) .

75. Una matriz de soporte de Tn3 , caracterizada porque comprende una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs : 134, 135, 205, 206, 207 y 208.

76. Una matriz de soporte de Tn3 , caracterizada porque consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs : 134, 135, 205, 206, 207 y 208.

77. Una matriz de soporte de Tn3 , caracterizada porque comprende una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs : 201, 202, 203 y 204.

78. Una matriz de soporte de Tn3 , caracterizada porque consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID NOs: 201, 202, 203 y 204.

79. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el CD40L es el CDL40 humano.

80. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con la reivindicación 79, caracterizada porque el CD40L es el CD40L unido a la membrana (SEQ ID NO: 1) , el CD40L soluble (SEQ ID NO: 2) o uno de sus fragmentos.

81. Una matriz de soporte de Tn3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la matriz de soporte se une a CD40L y previene la unión de CD40L a CD40.

82. Una matriz de soporte de Tn3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la matriz de soporte se une a CD40L y altera la señalización mediada por CD40.

83. Un método para alterar una actividad en una célula que expresa CD40L caracterizado porque comprende poner la célula en contacto con una matriz de soporte de Tn3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la matriz de soporte de Tn3 se une a CD40L y previene la unión de CD40L a CD40.

84. Un método para alterar una respuesta de señalización mediada por CD40, caracterizado porque comprende poner una célula que expresa CD40L en contacto con una matriz de soporte de Tn3 de cualquiera de conformidad con las reivindicaciones precedentes, donde la matriz de soporte de Tn3 se une a CD40L y altera la señalización mediada por CD40.

85. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque la respuesta de señalización mediada por CD40 es una respuesta inmunitaria dependiente de T.

86. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la matriz de soporte se une a CD40L con una afinidad (¾) aproximadamente menor o igual a 1 µ?, o aproximadamente menor o igual a 500 M, o aproximadamente menor o igual a 100 nM, o aproximadamente menor o igual a 50 nM, o aproximadamente menor o igual a 25 nM, o aproximadamente menor o igual a 10 nM, o aproximadamente menor o igual a 5 nM, o aproximadamente menor o igual a 2 nM.

87. La matriz de soporte de Tn3 de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque una subunidad monomérica específica para CD40L se une específicamente a un epítopo de CD40L que comprende los aminoácidos situados en las posiciones 142-155, 200-230 o 247-251 de la SEQ ID NO: 2.

88. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-61, 65-67, 69, 70, 73, 74, 77 y 78, caracterizada porque una subunidad monomérica específica para CD40L interacciona con los aminoácidos E142, Y146, M148, N151, L155, R200, R203 y E230 de CD40L.

89. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-64, 68, 71, 72, 75 y 76, caracterizada porque una subunidad monomérica específica para CD40L interacciona con los aminoácidos R203, 1204, V247, H249 y T251 de CD40L.

90. La matriz de soporte de Tn3 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-64, 68, 71, 72, 75 y 76, caracterizada porque una subunidad monomérica especifica para CD40L interacciona con los aminoácidos S245, V247, H249 y T251 de CD40L.

91. La matriz de soporte de Tn3 de la reivindicación 88, caracterizada porque los aminoácidos E142, Y146, M148, N151 y L155 de CD40L están situados en una primera molécula de CD40L, y los aminoácidos R200, R203 y E230 están situados en una segunda molécula de CD40L.

92. La matriz de soporte de Tn3 de la reivindicación 89, caracterizada porque los aminoácidos R203 e 1204 de CD40L están situados en una primera molécula de CD40L, y los aminoácidos V247, H249 y T251 de CD40L están situados en una segunda molécula de CD40L.

93. Una molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque codifica una matriz de soporte de Tn3 de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

94. Un vector de expresión caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 93.

95. Una célula huésped, caracterizada porque comprende el vector de la reivindicación 94.

96. Un método para producir una matriz de soporte de Tn3, caracterizado porque comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 95, en condiciones en las que se exprese la matriz de soporte de Tn3 codificada por la molécula de ácido nucleico.

97. Una composición caracterizada porque comprende una matriz de soporte de Tn3 de cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

98. Un método para prevenir, tratar, mejorar o controlar una enfermedad autoinmune en un paciente que lo necesite, caracterizado porque comprende administrar una cantidad eficaz de una composición de conformidad con la reivindicación 96.

99. Un método para reducir la frecuencia o la cantidad de corticosteroido administrado a un paciente que padece una enfermedad autoinmune caracterizado porque comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición de conformidad con la reivindicación 93.

100. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 98 o 99, caracterizado porque la enfermedad autoinmune se selecciona entre el grupo constituido por alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos , enfermedad autoinmune de Addison, enfermedades autoinmunes de la glándula suprarrenal, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, ooforitis y orquitis autoinmunes, síndrome de Sjogren, psoriasis, aterosclerosis , retinopatías diabéticas y de otros tipos, fibroplasia retrolental, degeneración macular asociada con la edad, glaucoma neovascular, hemangiomas, hiperplasias tiroideas (incluida la enfermedad de Grave) , trasplante de cornea y de otros tejidos e inflamación crónica, sepsis, artritis reumatoide, peritonitis, enfermedad de Crohn, lesión por reperfusión, septicemia, choque endotóxico, fibrosis quística, endocarditis, psoriasis, artritis (p. ej . , artritis psoriásica) , choque anafiláctico, isquemia orgánica, lesión por reperfusión, lesión de la médula espinal y rechazo de injerto, trobocitopenia autoinmune, enfermedad de Behcet, penfigoide ampolloso, cardiomiopatía, dermatitis herpetiforme , síndrome de fatiga crónica y disfunción inmunitaria (SFCDI) , polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Churg-Strauss , penfigoide cicatrical, síndrome de CREST, síndrome de aglutininas frías, enfermedad de Crohn, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia-fibromiositis , glomerulonefritis , enfermedad de Graves, Guillain-Barre, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI) , neuropatía por IgA, artritis juvenil, liquen plano, lupus eritematoso, enfermedad de Meniere, conectivitis mixta, esclerosis múltiple, diabetes mellitus mediada por el sistema inmunitario o de tipo 1, miastenia grave, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policrondritis , síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis psoriásica, fenómeno de Raynauld, síndrome de Reiter, artritis reumatoide, sarcoidosis, escleroderma, síndrome de Sjogren, síndrome de Stiff-man, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, colitis ulcerativa, uveítis, vasculitis tales como vasculitis de la dermatitis herpetiforme , vitíligo y granulomatosis de Wegener.

101. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 98 o 99, caracterizado porque la enfermedad autoinmune es lupus eritematoso sistémico (LES) .

102. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 98 o 99, caracterizado porque el método comprende además una terapia adicional, donde la terapia es inmunoterapia, terapia biológica, quimioterapia, radioterapia o terapia con fármacos de bajo peso molecular.

103. Un cristal proteico caracterizado porque comprende una matriz de soporte de Tn3 que consiste en la SEQ ID NO: 20 en un complejo con el CD40L soluble (SEQ ID NO: 2) donde el cristal tiene una red cristalina en un grupo espacial ortorrómbico P2i2i2i y unas dimensiones de celda unidad, +/-0.1%, de a=85.69 Á, b=90.64 Á y c=95.56 Á.

104. El cristal proteico de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque la unidad asimétrica del cristal comprende un trímero de CD40L y tres moléculas de la matriz de soporte de Tn3.

105. El cristal proteico de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque el cristal difracta los rayos X para determinar las coordenadas estructurales respecto a una resolución de un valor menor o igual a 3.2 Á.

106. Un cristal proteico caracterizado porque comprende una matriz de soporte de Tn3 que consiste en la SEQ ID NO: 68 en un complejo con el CD40L soluble (SEQ ID NO: 2) donde el cristal tiene una red cristalina en un grupo espacial cúbico ?2?3 y unas dimensiones de celda unidad, +/- 0.1%, de a=b=c=97.62 Á.

107. El cristal proteico de conformidad con la reivindicación 106, caracterizado porque la unidad asimétrica del cristal comprende una molécula de CD40L y una molécula de la matriz de soporte de Tn3.

108. El cristal proteico de conformidad con la reivindicación 106, caracterizado porque el cristal difracta los rayos X para determinar las coordenadas estructurales respecto a una resolución de un valor menor o igual a 2.7 Á.

109. Un cristal proteico caracterizado porque comprende una matriz de soporte de Tn3 que consiste en la SEQ ID NO: 28 o 146 en un complejo con el CD40L soluble (SEQ ID NO: 2) donde el cristal tiene una red cristalina en un grupo espacial P321 y unas dimensiones de celda unidad, +/- 0.1%, de a=95.53 Á, b=93.53 Á y c=66.69 Á.

110. El cristal proteico de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque la unidad asimétrica del cristal comprende una molécula de CD40L y una molécula de la matriz de soporte de Tn3.

111. El cristal proteico de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque el cristal difracta los rayos X para determinar las coordenadas estructurales respecto a una resolución de un valor menor o igual a 2.8 Á.

112. Un cristal proteico caracterizado porque comprende dos matrices de soporte de Tn3 diferentes que consisten en la SEQ ID NO: 68 y la SEQ ID NO: 28 o 146 en un complejo con el CD40L soluble (SEQ ID NO: 2) donde el cristal tiene una red cristalina en un grupo espacial cúbico P2i y unas dimensiones de celda unidad, +/- 0.1%, de a=80.32 Á, b=143.48 Á, c=111.27 Á, ß=98.22 Á.

113. El cristal proteico de conformidad con la reivindicación 112, caracterizado porque la unidad asimétrica del cristal comprende dos trímeros de CD40L y seis de cada molécula de la matriz de soporte de Tn3.

114. El cristal proteico de conformidad con la reivindicación 112, caracterizado porque el cristal difracta los rayos X para determinar las coordenadas estructurales respecto a una resolución de un valor menor o igual a 1.9 Á.

115. El cristal proteico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 103-114, caracterizado porque la proteína se cristaliza mediante difusión de vapor en gota sentada.

116. Un método para sintetizar un cristal proteico, caracterizado porque que comprende: (a) mezclar un volumen de una solución que comprende una matriz de soporte de Tn3 que comprende una subunidad monomérica específica para CD40L en un complejo con CD40L con un volumen de una solución de reservorio que comprende un precipitante; y (b) incubar la mezcla obtenida en el paso (a) en un recipiente cerrado, en condiciones adecuadas para la cristalización hasta que se forme el cristal proteico.

117. El método de conformidad con la reivindicación 116, caracterizado porque el cristal proteico se produce mediante difusión de vapor en gota sentada.

118. El método de conformidad con la reivindicación 116, caracterizado porque la matriz de soporte de Tn3 comprende la SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO: 68 O SEQ ID NO: 146.

119. Un medio de almacenamiento de datos legible mecánicamente caracterizado porque comprende un material de almacenamiento de datos codificado con instrucciones legibles mecánicamente para: (a) transformar los datos en una representación gráfica tridimensional para la estructura de una porción de un cristal proteico de una matriz de soporte de Tn3 que comprende una subunidad monomérica específica para CD40L en un complejo con CD40L; y (b) originar la representación visual de la representación gráfica tridimensional.

120. El medio de almacenamiento de datos legible mecánicamente de conformidad con la reivindicación 119, caracterizado porque la matriz de soporte de Tn3 comprende la SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 68 o SEQ ID NO: 146.

121. El medio de almacenamiento de datos legible mecánicamente de conformidad con la reivindicación 119, caracterizado porque el cristal proteico es el cristal de conformidad con la reivindicación 103, el cristal de la reivindicación 106, el cristal de conformidad con la reivindicación 118, o cualquier combinación de estos.