JP2015501147A - CD40L特異的Tn3由来足場およびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、部分的には、2011年10月11日に出願された米国仮特許出願第61/546,028号明細書、2010年4月13日に出願された米国仮特許出願第61/323,708号明細書;2011年4月12日に出願された国際出願第PCT/US2011/032184号明細書;2011年4月12日に出願された国際出願第PCT/US2011/032188号明細書;および2008年10月10日に出願されたPCT出願第PCT/US2008/012398号明細書に関連し、国際公開第2009/058379A2号パンフレットとして公開された主題を含有する。上記参照出願のそれぞれは、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
本出願は、2012年10月3日に作成され、232キロバイトのサイズを有する表題「CD40L−101WO1_SL.txt」のテストファイル(test filed)としてEFS−Webを介するアプリケーションを用いて提出された配列表を参照により組み込む。
IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKETFTT
(式中、XAB、XBC、XCD、XDE、XEF、およびXFGは、それぞれAB、BC、CD、DE、EF、およびFGループの配列中に存在するアミノ酸残基を表し;X1は、アミノ酸残基AまたはTを表し;ループの長さnは、2から26の整数である)
を含むCD40L特異的モノマーサブユニットを含む。
IEVKDVTDTTALITWX1DX2X3X4X5X6X7X8CELTYGIKDVPGDRTTIDLWX9HX10AX11YSIGNLKPDTEYEVSLICRX12GDMSSNPAKETFTT(配列番号167)
(式中、(a)X1は、アミノ酸残基セリン(S)またはロイシン(L)を表し;(b)X2は、アミノ酸残基アスパラギン酸(D)またはグルタミン酸(E)を表し;(c)X3は、アミノ酸残基ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)またはトリプトファン(W)を表し;(d)X4は、アミノ酸残基アラニン(A)、グリシン(G)、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)を表し;(e)X5は、アミノ酸残基グルタミン酸(E)、ロイシン(L)、グルタミン(Q)、セリン(S)、アスパラギン酸(D)またはアスパラギン(N)を表し;(f)X6は、アミノ酸残基フェニルアラニン(F)またはチロシン(Y)を表し;(g)X7は、アミノ酸残基イソロイシン(I)、バリン(V)、ヒスチジン(H)、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)を表し;(h)X8は、アミノ酸残基グリシン(G)、トリプトファン(W)またはバリン(V)を表し;(i)X9は、アミノ酸残基トリプトファン(W)、フェニルアラニン(F)またはチロシン(Y)を表し;(j)X10は、アミノ酸残基セリン(S)、グルタミン(Q)、メチオニン(M)またはヒスチジン(H)を表し;(k)X11は、アミノ酸残基トリプトファン(W)またはヒスチジン(H)を表し;(l)X12は、アミノ酸残基アルギニン(R)またはセリン(S)を表す)
を含むCD40L特異的モノマーサブユニットを含む。
IEVX1DVTDTTALITWX2X3RSX4X5X6X7X8X9X10CELX11YGIKDVPGDRTTIDLX12X13X14X15YVHYSIGNLKPDTX16YEVSLICLTTDGTYX17NPAKETFTT(配列番号171)
(式中、
(a)X1は、アミノ酸残基リジン(K)またはグルタミン酸(E)を表し;
(b)X2は、アミノ酸残基トレオニン(T)またはイソロイシン(I)を表し;
(c)X3は、アミノ酸残基アスパラギン(N)またはアラニン(A)を表し;
(d)X4は、アミノ酸残基セリン(S)、ロイシン(L)、アラニン(A)、フェニルアラニン(F)またはチロシン(Y)を表し;
(e)X5は、アミノ酸残基チロシン(Y)、アラニン(A)、グリシン(G)、バリン(V)、イソロイシン(I)またはセリン(S)を表し;
(f)X6は、アミノ酸残基チロシン(Y)、セリン(S)、アラニン(A)またはヒスチジン(H)を表し;
(g)X7は、アミノ酸残基アスパラギン(N)、アスパラギン酸(D)、ヒスチジン(H)またはチロシン(Y)を表し;
(h)X8は、アミノ酸残基ロイシン(L)、フェニルアラニン(F)、ヒスチジン(H)またはチロシン(Y)を表し;
(i)X9は、アミノ酸残基ヒスチジン(H)、プロリン(P)、セリン(S)、ロイシン(L)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(j)X10は、アミノ酸残基グリシン(G)、フェニルアラニン(F)、ヒスチジン(H)またはチロシン(Y)を表し;
(k)X11は、アミノ酸残基アラニン(A)またはトレオニン(T)を表し;
(l)X12は、アミノ酸残基セリン(S)、アスパラギン(N)、グルタミン酸(E)、アスパラギン(R)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(m)X13は、アミノ酸残基セリン(S)、グルタミン(Q)、トレオニン(T)、アスパラギン(N)またはアラニン(A)を表し;
(n)X14は、アミノ酸残基プロリン(P)、バリン(V)、イソロイシン(I)またはアラニン(A)またはアミノ酸無しを表し;
(o)X15は、アミノ酸残基イソロイシン(I)またはアミノ酸無しを表し;
(p)X16は、アミノ酸残基グルタミン酸(E)またはリジン(K)を表し;
(q)X17は、アミノ酸残基セリン(S)またはアスパラギン(N)を表す)
を含むCD40L特異的モノマーサブユニットを含む。
(a)可溶性CD40L(配列番号2)との複合体中の配列番号20からなるTn3足場を含むタンパク質結晶であって、P212121斜方晶空間群およびa=85.69Å、b=90.64Å、c=95.56Åの単位格子寸法、+/−0.1%における結晶格子を有するタンパク質結晶;
(b)可溶性CD40L(配列番号2)との複合体中の配列番号68からなるTn3足場を含むタンパク質結晶であって、P213立方晶空間群およびa=b=c=97.62Åの単位格子寸法、+/−0.1%における結晶格子を有するタンパク質結晶;または
(c)配列番号20からなるTn3足場および配列番号68からなるTn3足場を含むタンパク質結晶であって、両方のTn3足場は、可溶性CD40L(配列番号2)との複合体中に存在するタンパク質結晶
(d)可溶性CD40L(配列番号2)との複合体中の配列番号28または146からなるTn3足場を含むタンパク質結晶であって、P321空間群およびa=95.53Å、b=93.53Å、c=66.69Åの単位格子寸法、+/−0.1%における結晶格子を有するタンパク質結晶
(e)可溶性CD40L(配列番号2)との複合体中の配列番号68および配列番号28または146からなる2つ異なるTn3足場を含むタンパク質結晶であって、P21立方晶空間群およびa=80.32Å、b=143.48Å、c=111.27Å、β=98.22Åの単位格子寸法、+/−0.1%における結晶格子を有するタンパク質結晶
である。
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、具体的な組成物またはプロセス工程が変動し得るため、それらに限定されないことを理解すべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が特に明記しない限り、複数参照対象を含むことに留意しなければならない。「a」(また「an」)という用語、ならびに「1つ以上の」、および「少なくとも1つの」という用語は、本明細書において同義に使用することができる。
CD40L(CD154、CD40リガンド、gp39またはTBAMとしても公知)は、33kDaのII型膜糖タンパク質(Swiss−Protアクセッション番号P29965)である。さらに、より短い18kDaのCD40L可溶性形態が存在する(sCD40Lまたは可溶性CD40Lとしても公知)。これらのCD40Lの可溶性形態は、膜結合タンパク質のタンパク質分解プロセシングにより生成されるが、可溶性種の細胞活性は、より高次のオリゴマー化(例えば、トリマー化)を除き弱い。
本発明のTn3足場は、生物およびウイルス、ならびに多数のタンパク質クラスの3つ全ての領域にわたり広く見出されているドメインであるIII型フィブロネクチンモジュール(FnIII)の構造をベースとする。具体的な実施形態において、本発明の足場は、ヒトテネイシンCの第3FnIIIドメインに由来する(国際公開第2009/058379号パンフレットとして公開されている国際出願第国際出願第PCT/US2008/012398号明細書;国際公開第2011/130324号パンフレットとして公開されているPCT/US2011/032184号明細書;および国際公開第2011130328号パンフレット参照として公開されている国際出願第PCT/US2011/032188号明細書)。
本発明は、複数のループ領域に結合している複数のベータ鎖ドメインを含むCD40L特異的組換え非天然Tn3足場であって、前記ループ領域の1つ以上は、野生型Tn3(配列番号3)(表1参照)中のコグネートループからの少なくとも1つのアミノ酸の欠失、置換または付加により変動するTn3足場を提供する。
IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKETFTT
(式中、
(a)XAB、XBC、XCD、XDE、XEF、およびXFGは、それぞれAB、BC、CD、DE、EF、およびFGループの配列中に存在するアミノ酸残基を表し;
(b)X1は、アミノ酸残基アラニン(A)またはトレオニン(T)を表し;
(c)ループの長さnは、2から26の整数である)
を含む。
IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKETFTT
(式中、
(a)XAB、XBC、XCD、XDE、XEF、およびXFGは、それぞれAB、BC、CD、DE、EF、およびFGループの配列中に存在するアミノ酸残基を表し;
(b)X1は、アミノ酸残基アラニン(A)またはトレオニン(T)を表し;
(c)ループの長さnは、2から26の整数である)
からなる。
IEVKDVTDTTALITWX1DX2X3X4X5X6X7X8CELTYGIKDVPGDRTTIDLWX9HX10AX11YSIGNLKPDTEYEVSLICRX12GDMSSNPAKETFTT(配列番号167)
(式中、
(a)X1は、アミノ酸残基セリン(S)またはロイシン(L)を表し;
(b)X2は、アミノ酸残基アスパラギン酸(D)またはグルタミン酸(E)を表し;
(c)X3は、アミノ酸残基ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)またはトリプトファン(W)を表し;
(d)X4は、アミノ酸残基アラニン(A)、グリシン(G)、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(e)X5は、アミノ酸残基グルタミン酸(E)、ロイシン(L)、グルタミン(Q)、セリン(S)、アスパラギン酸(D)またはアスパラギン(N)を表し;
(f)X6は、アミノ酸残基フェニルアラニン(F)またはチロシン(Y)を表し;
(g)X7は、アミノ酸残基イソロイシン(I)、バリン(V)、ヒスチジン(H)、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(h)X8は、アミノ酸残基グリシン(G)、トリプトファン(W)またはバリン(V)を表し;
(i)X9は、アミノ酸残基トリプトファン(W)、フェニルアラニン(F)またはチロシン(Y)を表し;
(j)X10は、アミノ酸残基セリン(S)、グルタミン(Q)、メチオニン(M)またはヒスチジン(H)を表し;
(k)X11は、アミノ酸残基トリプトファン(W)またはヒスチジン(H)を表し;
(l)X12は、アミノ酸残基アルギニン(R)またはセリン(S)を表す)
を含む。
IEVKDVTDTTALITWX1DX2X3X4X5X6X7X8CELTYGIKDVPGDRTTIDLWX9HX10AX11YSIGNLKPDTEYEVSLICRX12GDMSSNPAKETFTT(配列番号167)
(式中、
(a)X1は、アミノ酸残基セリン(S)またはロイシン(L)を表し;
(b)X2は、アミノ酸残基アスパラギン酸(D)またはグルタミン酸(E)を表し;
(c)X3は、アミノ酸残基ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)またはトリプトファン(W)を表し;
(d)X4は、アミノ酸残基アラニン(A)、グリシン(G)、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(e)X5は、アミノ酸残基グルタミン酸(E)、ロイシン(L)、グルタミン(Q)、セリン(S)、アスパラギン酸(D)またはアスパラギン(N)を表し;
(f)X6は、アミノ酸残基フェニルアラニン(F)またはチロシン(Y)を表し;
(g)X7は、アミノ酸残基イソロイシン(I)、バリン(V)、ヒスチジン(H)、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(h)X8は、アミノ酸残基グリシン(G)、トリプトファン(W)またはバリン(V)を表し;
(i)X9は、アミノ酸残基トリプトファン(W)、フェニルアラニン(F)またはチロシン(Y)を表し;
(j)X10は、アミノ酸残基セリン(S)、グルタミン(Q)、メチオニン(M)またはヒスチジン(H)を表し;
(k)X11は、アミノ酸残基トリプトファン(W)またはヒスチジン(H)を表し;
(l)X12は、アミノ酸残基アルギニン(R)またはセリン(S)を表す)
からなる。
IEVX1DVTDTTALITWX2X3RSX4X5X6X7X8X9X10CELX11YGIKDVPGDRTTIDLX12X13X14X15YVHYSIGNLKPDTX16YEVSLICLTTDGTYX17NPAKETFTT(配列番号171)
(式中、
(a)X1は、アミノ酸残基リジン(K)またはグルタミン酸(E)を表し;
(b)X2は、アミノ酸残基トレオニン(T)またはイソロイシン(I)を表し;
(c)X3は、アミノ酸残基アスパラギン(N)またはアラニン(A)を表し;
(d)X4は、アミノ酸残基セリン(S)、ロイシン(L)、アラニン(A)、フェニルアラニン(F)またはチロシン(Y)を表し;
(e)X5は、アミノ酸残基チロシン(Y)、アラニン(A)、グリシン(G)、バリン(V)、イソロイシン(I)またはセリン(S)を表し;
(f)X6は、アミノ酸残基チロシン(Y)、セリン(S)、アラニン(A)またはヒスチジン(H)を表し;
(g)X7は、アミノ酸残基アスパラギン(N)、アスパラギン酸(D)、ヒスチジン(H)またはチロシン(Y)を表し;
(h)X8は、アミノ酸残基ロイシン(L)、フェニルアラニン(F)、ヒスチジン(H)またはチロシン(Y)を表し;
(i)X9は、アミノ酸残基ヒスチジン(H)、プロリン(P)、セリン(S)、ロイシン(L)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(j)X10は、アミノ酸残基グリシン(G)、フェニルアラニン(F)、ヒスチジン(H)またはチロシン(Y)を表し;
(k)X11は、アミノ酸残基アラニン(A)またはトレオニン(T)を表し;
(l)X12は、アミノ酸残基セリン(S)、アスパラギン(N)、グルタミン酸(E)、アスパラギン(R)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(m)X13は、アミノ酸残基セリン(S)、グルタミン(Q)、トレオニン(T)、アスパラギン(N)またはアラニン(A)を表し;
(n)X14は、アミノ酸残基プロリン(P)、バリン(V)、イソロイシン(I)またはアラニン(A)またはアミノ酸無しを表し;
(o)X15は、アミノ酸残基イソロイシン(I)またはアミノ酸無しを表し;
(p)X16は、アミノ酸残基グルタミン酸(E)またはリジン(K)を表し;
(q)X17は、アミノ酸残基セリン(S)またはアスパラギン(N)を表す)
を含む。
IEVX1DVTDTTALITWX2X3RSX4X5X6X7X8X9X10CELX11YGIKDVPGDRTTIDLX12X13X14X15YVHYSIGNLKPDTX16YEVSLICLTTDGTYX17NPAKETFTT(配列番号171)
(式中、
(a)X1は、アミノ酸残基リジン(K)またはグルタミン酸(E)を表し;
(b)X2は、アミノ酸残基トレオニン(T)またはイソロイシン(I)を表し;
(c)X3は、アミノ酸残基アスパラギン(N)またはアラニン(A)を表し;
(d)X4は、アミノ酸残基セリン(S)、ロイシン(L)、アラニン(A)、フェニルアラニン(F)またはチロシン(Y)を表し;
(e)X5は、アミノ酸残基チロシン(Y)、アラニン(A)、グリシン(G)、バリン(V)、イソロイシン(I)またはセリン(S)を表し;
(f)X6は、アミノ酸残基チロシン(Y)、セリン(S)、アラニン(A)またはヒスチジン(H)を表し;
(g)X7は、アミノ酸残基アスパラギン(N)、アスパラギン酸(D)、ヒスチジン(H)またはチロシン(Y)を表し;
(h)X8は、アミノ酸残基ロイシン(L)、フェニルアラニン(F)、ヒスチジン(H)またはチロシン(Y)を表し;
(i)X9は、アミノ酸残基ヒスチジン(H)、プロリン(P)、セリン(S)、ロイシン(L)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(j)X10は、アミノ酸残基グリシン(G)、フェニルアラニン(F)、ヒスチジン(H)またはチロシン(Y)を表し;
(k)X11は、アミノ酸残基アラニン(A)またはトレオニン(T)を表し;
(l)X12は、アミノ酸残基セリン(S)、アスパラギン(N)、グルタミン酸(E)、アスパラギン(R)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(m)X13は、アミノ酸残基セリン(S)、グルタミン(Q)、トレオニン(T)、アスパラギン(N)またはアラニン(A)を表し;
(n)X14は、アミノ酸残基プロリン(P)、バリン(V)、イソロイシン(I)またはアラニン(A)またはアミノ酸無しを表し;
(o)X15は、アミノ酸残基イソロイシン(I)またはアミノ酸無しを表し;
(p)X16は、アミノ酸残基グルタミン酸(E)またはリジン(K)を表し;
(q)X17は、アミノ酸残基セリン(S)またはアスパラギン(N)を表す)
からなる。
本発明のTn3足場の安定性は、多くの異なるアプローチにより増加させることができる。一部の実施形態において、本発明のTn3足場は、Nおよび/またはC末端領域の伸長により安定化することができる。Nおよび/またはC末端領域は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または11個以上のアミノ酸だけ伸長することができる。他の実施形態において、本発明のTn3足場は、本明細書に記載のとおり血清半減期を増加させる変化を導入することにより安定化することができる。さらに別の実施形態において、本発明のTn3足場は、足場の疎水性コアを安定化するための少なくとも1つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換を含む。
単離され、またはマルチマーTn3足場の一部としての本発明のTn3モノマーサブユニットの安定性は、当分野において周知の技術、例えば、熱(Tm)およびカオトロピック変性(例えば、尿素、またはグアニジン塩による処理)、プロテアーゼ処理(例えば、サーモリシンによる処理)またはタンパク質安定性を測定する当分野において認められた別の方法により容易に計測することができる。タンパク質安定性を計測するために使用される技術の包括的考察は、例えば、“Current Protocols in Molecular Biology”および“Current Protocols in Protein Science”by John Wiley and Sons.2007に見出すことができる。
本発明の一態様は、タンデムに連結されている少なくとも2つの本発明のTn3モノマーサブユニットを含むTn3マルチマー足場であって、モノマーの少なくとも1つは、CD40L特異的モノマーサブユニットであるTn3マルチマー足場を提供する。このようなマルチマーTn3足場は、複数のフォーマットにアセンブルすることができる。具体的な態様において、本発明は少なくとも2つのCD40L特異的モノマーサブユニットがペプチドリンカーを介してタンデムに連結されているマルチマーTn3足場を提供する。一部の実施形態において、マルチマーTn3足場は、標的結合の価数および/もしくはアビディティー、または標的の他の作用の増加を示す。一部の実施形態において、複数のモノマーサブユニットが同一標的に結合する場合に標的結合の価数および/またはアビディティーの増加が達成される。一部の実施形態において、価数の増加により、標的に対する特異的作用、例えば、標的タンパク質のダイマー化の増加が改善される。
一部の実施形態において、モノマーまたはマルチマーTn3足場は、単一のCD40L分子上または異なるCD40L標的分子上の異なるエピトープであり得る、異なるエピトープに特異的なCD40L特異的モノマーサブユニットを含み得る。一部の実施形態において、マルチマーTn3足場は、それぞれのサブユニットが1つ以上のCD40L分子上の1つ以上の異なるエピトープを標的化するCD40L特異的モノマーサブユニットを含み得る。
本発明は、少なくとも1つのCD40L特異的モノマーサブユニットが異種部分に融合していてよいTn3足場を提供する。これに関して、異種部分は、スペーサーとして足場を結合させるために使用されるのではなく、Tn3足場に追加の機能を提供し得る。一部の実施形態において、異種部分は、リンカーとしても機能し得る。本発明は、1つ以上の異種部分、例として、限定されるものではないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、模倣剤、合成薬物、無機分子、および有機分子にコンジュゲートまたは融合しているTn3足場の使用を包含する。したがって、本発明は、1つ以上のCD40L特異的Tn3モノマー、例として、限定されるものではないが、本明細書に記載の融合タンパク質を含むポリペプチドを提供する。
(a)407位におけるロイシン(L)のアスパラギン(N)またはチロシン(Y)への置換;
(b)415位におけるバリン(V)のトレオニン(T)への置換;
(c)463位におけるロイシン(L)のアスパラギン(N)への置換;
(d)500位におけるリジン(K)のアルギニン(R)への置換;
(e)506位におけるトレオニン(T)のチロシン(Y)への置換;
(f)508位におけるトレオニン(T)のアルギニン(R)への置換;
(g)509位におけるフェニルアラニン(F)のメチオニン(M)またはトリプトファン(W)への置換;
(h)511位におけるアラニン(A)のフェニルアラニン(F)への置換;
(i)512位におけるアスパラギン酸(D)のチロシン(Y)への置換;
(j)515位におけるトレオニン(T)のグルタミン(Q)への置換;
(k)516位におけるロイシン(L)のトレオニン(T)またはトリプトファン(W)への置換;
(l)521位におけるアルギニン(R)のトリプトファン(W)への置換;
(m)523位におけるイソロイシン(I)のアスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、グリシン(G)、リジン(K)、またはアルギニン(R)への置換;
(n)524位におけるリジン(K)のロイシン(L)への置換;
(o)526位におけるグルタミン(Q)のメチオニン(M)への置換;
(p)535位におけるヒスチジン(H)のプロリン(P)への置換;
(q)550位におけるアスパラギン酸(D)のグルタミン酸(E)への置換;
(r)557位におけるリジン(K)のグリシン(G)への置換;
(s)573位におけるリジン(K)のフェニルアラニン(F)、ヒスチジン(H)、プロリン(P)、トリプトファン(W)、またはチロシン(Y)への置換;
(t)574位におけるリジン(K)のアスパラギン(N)への置換;
(u)580位におけるグルタミン(Q)のリジン(K)への置換;および
(v)前記置換の2つ以上の組合せ
からなる群から選択される全長成熟HSA中の位置に対して番号付与される少なくとも1つのアミノ酸置換を除き、
前記Tn3足場は、前記HSAバリアントにコンジュゲートしていないTn3足場の血漿半減期よりも長い血漿半減期を有する。
(a)463位におけるロイシン(L)のアスパラギン(N)への置換;
(b)508位におけるトレオニン(T)のアルギニン(R)への置換;
(c)523位におけるイソロイシン(I)のアスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、グリシン(G)、リジン(K)、またはアルギニン(R)への置換;
(d)524位におけるリジン(K)のロイシン(L)への置換;および
(e)前記置換の2つ以上の組合せ
からなる群から選択される全長成熟HSA中の位置に対して番号付与される少なくとも1つのアミノ酸置換を除き、
前記Tn3足場は、前記HSAバリアントにコンジュゲートしていないTn3足場の血漿半減期よりも長い血漿半減期を有する。
一部の実施形態において、本発明のTn3足場は、抗体(例えば、IgG)のドメインまたは断片、例として、限定されるものではないが、Fcドメインに融合しているCD40L特異的モノマーサブユニットを含む。
本発明のTn3足場は、任意の好適な空間配置でFcドメイン、抗体軽鎖、および抗体重鎖のC末端に融合させることができる。例えば、企図される足場トポロジーの詳細な説明について国際公開PCT/US2011/032184号明細書参照。
本明細書に記載のTn3足場は、新たなまたは改善された標的結合タンパク質を進化させる任意の技術において使用することができる。1つの特定の例において、標的を固体支持体、例えば、カラム樹脂またはマイクロタイタープレートウェル上に固定化し、標的を候補足場ベース結合タンパク質のライブラリーと接触させる。このようなライブラリーは、CDR様ループの配列および/または長さのランダム化を介してTn3足場から構築されたクローンからなり得る。
IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKETFTT
(式中、
(a)XAB、XBC、XCD、XDE、XEF、およびXFGは、それぞれAB、BC、CD、DE、EF、およびFGループの配列中に存在するアミノ酸残基を表し;
(b)X1は、アミノ酸残基AまたはTを表し;
(c)ループの長さnは、2から26の整数である)
を含む足場を含む。
IEVKDVTDTTALITWX1DX2X3X4X5X6X7X8CELTYGIKDVPGDRTTIDLWX9HX10AX11YSIGNLKPDTEYEVSLICRX12GDMSSNPAKETFTT(配列番号167)
(式中、
(a)X1は、アミノ酸残基セリン(S)またはロイシン(L)を表し;
(b)X2は、アミノ酸残基アスパラギン酸(D)またはグルタミン酸(E)を表し;
(c)X3は、アミノ酸残基ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)またはトリプトファン(W)を表し;
(d)X4は、アミノ酸残基アラニン(A)、グリシン(G)、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(e)X5は、アミノ酸残基グルタミン酸(E)、ロイシン(L)、グルタミン(Q)、セリン(S)、アスパラギン酸(D)またはアスパラギン(N)を表し;
(f)X6は、アミノ酸残基フェニルアラニン(F)またはチロシン(Y)を表し;
(g)X7は、アミノ酸残基イソロイシン(I)、バリン(V)、ヒスチジン(H)、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(h)X8は、アミノ酸残基グリシン(G)、トリプトファン(W)またはバリン(V)を表し;
(i)X9は、アミノ酸残基トリプトファン(W)、フェニルアラニン(F)またはチロシン(Y)を表し;
(j)X10は、アミノ酸残基セリン(S)、グルタミン(Q)、メチオニン(M)またはヒスチジン(H)を表し;
(k)X11は、アミノ酸残基トリプトファン(W)またはヒスチジン(H)を表し;
(l)X12は、アミノ酸残基アルギニン(R)またはセリン(S)を表す)
を含む本発明のCD40L特異的Tn3モノマーサブユニットを含む。
IEVX1DVTDTTALITWX2X3RSX4X5X6X7X8X9X10CELX11YGIKDVPGDRTTIDLX12X13X14X15YVHYSIGNLKPDTX16YEVSLICLTTDGTYX17NPAKETFTT(配列番号171)
(式中、
(a)X1は、アミノ酸残基リジン(K)またはグルタミン酸(E)を表し;
(b)X2は、アミノ酸残基トレオニン(T)またはイソロイシン(I)を表し;
(c)X3は、アミノ酸残基アスパラギン(N)またはアラニン(A)を表し;
(d)X4は、アミノ酸残基セリン(S)、ロイシン(L)、アラニン(A)、フェニルアラニン(F)またはチロシン(Y)を表し;
(e)X5は、アミノ酸残基チロシン(Y)、アラニン(A)、グリシン(G)、バリン(V)、イソロイシン(I)またはセリン(S)を表し;
(f)X6は、アミノ酸残基チロシン(Y)、セリン(S)、アラニン(A)またはヒスチジン(H)を表し;
(g)X7は、アミノ酸残基アスパラギン(N)、アスパラギン酸(D)、ヒスチジン(H)またはチロシン(Y)を表し;
(h)X8は、アミノ酸残基ロイシン(L)、フェニルアラニン(F)、ヒスチジン(H)またはチロシン(Y)を表し;
(i)X9は、アミノ酸残基ヒスチジン(H)、プロリン(P)、セリン(S)、ロイシン(L)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(j)X10は、アミノ酸残基グリシン(G)、フェニルアラニン(F)、ヒスチジン(H)またはチロシン(Y)を表し;
(k)X11は、アミノ酸残基アラニン(A)またはトレオニン(T)を表し;
(l)X12は、アミノ酸残基セリン(S)、アスパラギン(N)、グルタミン酸(E)、アスパラギン(R)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(m)X13は、アミノ酸残基セリン(S)、グルタミン(Q)、トレオニン(T)、アスパラギン(N)またはアラニン(A)を表し;
(n)X14は、アミノ酸残基プロリン(P)、バリン(V)、イソロイシン(I)またはアラニン(A)またはアミノ酸無しを表し;
(o)X15は、アミノ酸残基イソロイシン(I)またはアミノ酸無しを表し;
(p)X16は、アミノ酸残基グルタミン酸(E)またはリジン(K)を表し;
(q)X17は、アミノ酸残基セリン(S)またはアスパラギン(N)を表す)
を含む本発明のCD40L特異的Tn3モノマーサブユニットを含む。
標的リガンドを本発明のライブラリーと、足場:標的リガンド複合体の形成に好適な条件下で接触させること;
複合体から標的リガンドに結合する足場を得ること;
工程(b)において得られた足場の安定性が野生型Tn3足場のそれよりも大きいかどうかを判定すること
を含む。
本発明のTn3足場の開発は、1つ以上のインビトロまたはインビボ親和性成熟工程を含み得る。一部の実施形態において、Tn3モノマーサブユニットは、単一の親和性成熟の工程を受け得る。他の実施形態において、Tn3モノマーサブユニットは、2つ以上の親和性成熟の工程を受け得る。一般に、親和性成熟Tn3足場の所望抗原への結合を改善する親Tn3足場中のアミノ酸変化、または具体的には親Tn3足場ループ中のアミノ酸変化をもたらす任意の親和性成熟アプローチを用いることができる。
2つのCD40L特異的モノマーサブユニットを結合させることにより形成されるダイマーであるタンデム構築物の結合は、当分野において公知の制限酵素、例として、限定されるものではないが、II型およびIIS型制限酵素を使用する制限酵素部位におけるオリゴヌクレオチドのライゲーションにより生成することができる。
(i)VL、CL、VHおよびCH1ドメインを有するFab断片;
(ii)CH1ドメインのC末端において1つ以上のシステイン残基を有するFab断片であるFab’断片;
(iii)VHおよびCH1ドメインを有するFd断片;
(iv)VHおよびCH1ドメインならびにCH1ドメインのC末端における1つ以上のシステイン残基を有するFd’断片;
(v)抗体単一アームのVLおよびVHドメインを有するFv断片;
(vi)VHドメインからなるdAb断片;
(vii)単離CDR領域;
(viii)ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋により結合している2つのFab’断片を含む二価の断片であるF(ab’)2断片;
(ix)単鎖抗体分子(例えば、単鎖Fv;scFv);
(x)同一ポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン(VL)に連結されている重鎖可変ドメイン(VH)を含む、2つの抗原結合部位を有する「ダイアボディー」;
(xi)相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒になって一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムFdセグメント(VH−CH1−VH−CH1)を含む「直鎖抗体」;
(xii)全長抗体;ならびに
(xiii)CH2−CH3を含み、ヒンジ領域および/またはCH1領域の全部または一部をさらに含み得るFc領域。
本発明のTn3足場の組換え発現は、Tn3足場をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を要求する。Tn3足場をコードするポリヌクレオチドを得たら、Tn3足場産生のためのベクターを当分野において周知の技術を使用する組換えDNA技術により産生することができる。したがって、ヌクレオチド配列をコードするTn3足場を含有するポリヌクレオチドを発現させることによりタンパク質を調製する方法が本明細書に記載される。当業者に周知の方法を使用して足場ポリペプチドコード配列ならびに適切な転写および転写制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ組換えDNA技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換え技術が含まれる。したがって、本発明は、プロモーターに作動可能に結合している本発明のTn3足場をコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。
本発明のTn3足場は、細胞内で、または分泌形態として産生することができる。一部の実施形態において、分泌足場は、適正にフォールドされ、完全に機能的である。本発明のTn3足場は、スケーラブルプロセスにより産生することができる。一部の実施形態において、足場は、スケールアップして本発明の足場を分析スケールのバイオリアクター(例えば、限定されるものではないが、5L、10L、15L、30L、または50Lバイオリアクター)で産生可能な、研究室における本発明のスケーラブルプロセスにより産生することができる。他の実施形態において、Tn3足場は、スケールアップして本発明のTn3足場を生産スケールのバイオリアクター(例えば、限定されるものではないが、75L、100L、150L、300L、または500L)で産生することができる、研究室における本発明のスケーラブルプロセスにより産生することができる。一部の実施形態において、本発明のスケーラブルプロセスは、研究室において実施される産生プロセスと比較して生産効率の低減をほとんど、または全くもたらさない。
マルチマーTn3足場中のモノマーサブユニットは、タンパク質および/または非タンパク質リンカーにより連結することができ、それぞれのリンカーは、少なくとも2つのモノマーサブユニットに融合される。好適なリンカーは、タンパク質リンカー、非タンパク質リンカー、およびそれらの組合せからなっていてよい。リンカーの組合せは、ホモマーであってもヘテロマーであってもよい。一部の実施形態において、本発明のマルチマーTn3足場は、複数のモノマーサブユニットを含み、全てのリンカーは、同一である。他の実施形態において、マルチマーTn3足場は、複数のモノマーサブユニットを含み、リンカーの少なくとも1つは、残りのリンカーとは機能的にまたは構造的に異なる。一部の実施形態において、リンカーは、標的への結合に直接的または間接的に関与することにより、それ自体でマルチマーTn3足場の活性に寄与し得る。
本発明のTn3足場は、非コンジュゲート形態で使用することができ、または標的検出を容易にするために、または画像化もしくは治療法のために、種々の異種部分の少なくとも1つにコンジュゲートさせることができる。Tn3足場は、精製を実施する場合、精製の前または後のいずれかで標識しまたはコンジュゲートさせることができる。
Tn3足場の抗原への結合親和性および他の結合特性は、当分野において公知の種々のインビトロアッセイ法、例として、例えば、平衡法(例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)またはカイネティクス(例えば、BIACORE(登録商標)分析)、ならびに他の方法、例えば、間接結合アッセイ、競合結合アッセイ、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー(例えば、ゲル濾過)により測定することができる。これらのおよび他の方法は、試験されている構成要素の1つ以上に対する標識を利用し、および/または種々の検出法、例として、限定されるものではないが、発色、蛍光、発光、または同位体標識を用い得る。結合親和性およびカイネティクスについての詳細な説明は、Paul,W.E.,ed.,Fundamental Immunology,4th Ed.,Lippincott−Raven,Philadelphia(1999)に見出すことができる。
本発明は、CD40Lに特異的に結合するTn3足場を提供する。具体的な実施形態において、本発明の足場は、ヒトCD40Lに特異的に結合する。他の具体的な実施形態において、本発明のTn3足場は、マウス、ニワトリ、アカゲザル、カニクイザル、ラット、またはウサギからのCD40L相同体に結合する。一部の実施形態において、本発明のTn3足場は、CD40Lの露出エピトープに結合する。このような実施形態には、細胞上で内因的に発現したCD40Lおよび/または受容体を異所的に発現するように形質移入された細胞が含まれる。
一部の実施形態において、本発明のTn3足場は、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つのCD40Lに結合するループ配列を含むCD40L特異的モノマーサブユニットを含む。
別の態様において、本発明は、組成物、例えば、限定されるものではないが、薬学的に許容可能な担体と一緒に配合された、本発明のTn3足場の1つまたは組合せを含有する医薬組成物を提供する。このような組成物は、例えば、限定されるものではないが、本発明の2つ以上の異なるTn3足場の1つまたは組合せを含み得る。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合し、または相補的な活性を有するTn3足場の組合せを含み得る。具体的な実施形態において、医薬組成物は、本発明の単一のモノマーTn3足場を含む。具体的な実施形態において、医薬組成物は、本発明のマルチマーTn3足場を含む。さらに別の具体的な実施形態において、医薬組成物は、本発明のダイマーTn3足場を含む。
本発明のTn3足場は、インビトロおよびインビボにおいて診断および治療有用性を有する。例えば、これらの分子を、培養物中の細胞に、例えば、インビトロもしくはエキソビボで、または対象中に、例えば、インビボで投与して種々の障害を治療、予防または診断することができる。
本発明のTn3足場を含む医薬組成物または滅菌組成物を調製するため、足場を、薬学的に許容可能な担体または賦形剤と混合する。投与のため、組成物は、好ましくは発熱物質不含であり、エンドトキシンおよび/または関連する発熱物質を実質的に含まない。治療剤のための投与計画の選択は、いくつかの要因、例として、実体の血清または組織ターンオーバー速度、症状のレベル、実体の免疫原性、および生体マトリックス中の標的細胞の接近性に依存する。ある実施形態において、投与計画は、許容可能なレベルの副作用と一致する患者に送達される治療剤の量を最大化する。
当業者は、定型以下の実験を使用して本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識し、または確認することができる。このような均等物は、以下の特許請求の範囲により包含されることが意図される。
親Tn3足場に基づく3ループライブラリーの構築
ライブラリーは、「Tn3SS4」と命名される国際特許出願公開の国際公開第2009/058379号パンフレットに記載の親Tn3足場に基づき構築した。ライブラリーは、BC、DEおよびFGループのランダム化領域を含有した。この設計は、天然FnIIIドメインについて記載される多様性のパターン、BCおよびFGループについての3つの異なる長さと一致する特性決定された配列およびループ長さの多様性をTn3ライブラリー中に組み込み、多様性をライブラリー中に導入するための「NHT」混合コドンスキームを使用した(H=A、T、C)。このスキームは、12/20個のアミノ酸(表3参照)をコードする12個のコドンを生成し、すなわち、それぞれのコドンは、特有のアミノ酸をコードした。さらに、停止コドンもシステイン(Cys)コドンも存在しなかった。
ヒトCD40L特異的Tn3足場についてのライブラリーのパニング
>1010個のユニーク配列を含有するファージディスプレイされたTn3ライブラリーを、CD40Lに対してパニングした。これらのライブラリーの多様性は、抗体可変ドメイン内の3つのCDRループと相似のBC、DEおよびFGループの配列および長さの変動性に由来した。リードTn3タンパク質の選択は、組換えビオチン化ヒトCD40LおよびCD40L過剰発現CHO細胞系に対するライブラリーのパニングにより実施した。これら2つの試薬に対する交互のパニングラウンドを使用してリードが組換え細胞外ドメインおよびネイティブ膜固定CD40Lを認識することを確保した。
CD40L特異的Tn3足場リード最適化
親和性最適化を使用して選択されたTn3リードの効力を増加させた。一般に、標的に接触するTn3ループ内の1つ以上の突然変異誘発ラウンドを実施し、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリーから改善されたバリアントを選択した。
2つのリード中の3つのどのループがCD40Lとの相互作用に関与するのかを決定するため、それぞれの単一ループ配列をヒトテネイシンCに見出される親Tn3ループ配列に変化させた構築物を生成した。突然変異バリアントの活性を、上記スクリーニングアッセイに記載のとおり実施された結合アッセイにおいて元のバリアントと比較した(図10A)。両方のリードについて、BCおよびDEループの突然変異は、CD40Lへの結合の完全な損失をもたらした一方、親Tn3配列へのFGループの変化は、結合に対する効果を有さず(309について)または限定された効果を有した(311)。したがって、BCおよびDEループが主としてCD40Lへの接触を担う配列を含有すると考えられ、したがって最初に親和性最適化のために選択した。
ループスワッピング実験は309FGループ配列を親Tn3FGループ配列により結合効力の実質的な損失なしで親Tn3FGループ配列により置換することができることを示したため、この構築物(309FGwtと称する)を親和性成熟のための骨格として使用することが決定された。これは、親テネイシンC配列から逸脱する非必須突然変異を排除して考えられる免疫原性リスクを低減させる。親Tn3FGループ配列は、最終リード分子中の突然変異により後に排除されるRGDモチーフを含有したことに留意すべきである。3つのBCループライブラリーおよび1つのDEループライブラリーを生成した。
上記ループ使用実験(図10A)を実施する前に、リード最適化ライブラリーにおける最初の試みは、311のFGループ中での多様性の導入、得られたファージディスプレイライブラリーの生成およびスクリーニングにフォーカスした。スクリーニングは、上記ビオチン化ヒトMegaCD40Lに対する4つのパニングラウンド後に実施し、大多数の陽性ヒットがBCループ上流のTn3のN末端定常領域中の残基K4からEへの偶発的突然変異を含有することが見出された。陽性ヒットのFGループ配列の中で明らかなコンセンサスは検出されなかった。311中への単一のK4E突然変異の導入は、PBMCアッセイにおいて効力(約4μMから36nM)の約100倍の増加をもたらした(図10C参照)。
タグ無しCD40L特異的Tn3−HSA融合体の発現および精製
図2Aおよび9Aに概説されるHSAに融合しているTn3構築物を、哺乳動物293F細胞系中で一過的形質移入により発現させた。Tn3−HSA融合発現構築物は、インハウス生成哺乳動物発現ベクターに基づき生成した。産物均一性を増加させるため、未対合の部分露出システイン34がセリンに突然変異されたHSAの突然変異形態(HSA C34Sと命名)(Zhao et al.,2009,Eur.J.Pharm.Biopharm.72:405−11)を用いた。
CD40L特異的Tn3足場の血清半減期の拡張
血清アルブミンへの融合体を、CD40L特異的Tn3足場の血清半減期を拡張するための戦略として利用した。ネズミCD40L特異的Tn3−MSA融合体の薬物動態(PK)特性を測定するため、マウスPKアッセイを実施した。MSA融合体は、対応するHSA融合体に対するサロゲート分子の試験について選択した。それというのも、マウスFcRnはHSAにそれがMSAに結合するよりもかなり弱く結合し、エンドソームからの再循環の減少および結果的にターンオーバーの増加をもたらすためである(Andersen et al.J.Biol.Chem.285,4826−4836,2010)。
CD40L特異的Tn3足場の特性決定
6.1 実験的方法
6.1.1 PBMC刺激アッセイ:血液は、MedImmune安全ガイドラインに従って健常ドナーから得た。PBMCは、CPTチューブを介して単離し(20分間における1500gの回転)、1×106個のPBMC(条件当たり)を組換えヒトMegaCD40L(Axxora)またはヒトCD40L発現Jurkat細胞(D1.1,ATCC)により刺激した。CD19+/CD86+細胞の割合を刺激24時間後にFACSにより計測した。このアッセイを使用してリーディングTn3足場のパネルを試験およびランキングして生化学的基準に基づく優先順位付けから浮上させた。このアッセイは、ネズミCD40L発現細胞系(D10.G4)またはネズミMegaCD40L(Axxora ALX522120)をヒト細胞または組換えタンパク質刺激に代えて用いて実施することもできる。それというのも、ネズミリガンドはヒト受容体と交差反応するためである。
上記生化学的結合に加え、これらの新規Tn3足場が初代T細胞上で活性化後に発現される内因性CD40Lに結合し得ることを確認することが重要であった。T細胞を複数のドナーから単離し、上記のとおり活性化させた。24時間後、5c8(ヒト特異的)モノクローナル抗体およびMR1(ネズミ特異的)モノクローナル抗体による染色により判定されるとおりCD40L発現が上方調節された(データ示さず)。CD40L特異的Tn3足場分子は、モノクローナル抗体と同等レベルのCD40L発現を検出し得、これらの分子がネイティブタンパク質に結合し得ることを確認した。
T依存性免疫応答におけるCD40L:CD40R相互作用の中心的役割は、十分特性決定されている(Noelle,1992;Renshaw,1994,Wykes,2003)。ネズミCD40L特異的Tn3足場M31(M31−MSAおよびM31−M31−MSA)を使用して0日目にマウスをヒツジ赤血球(SRBC)により免疫化(静脈内)することによりT依存性免疫化モデルにおけるこれらの新規分子の効果を評価した。
CD40Lに結合するように遺伝子操作されたフィブロネクチンIII型ドメイン:2つの複合体のクローニング、発現、精製、結晶化および予備X線回折分析
組換えヒト可溶性CD40Lを、両方ともCD40L結合剤としてファージディスプレイライブラリーから単離された2つのCD40L特異的Tn3モノマー足場309および311K4E−12と共結晶化した。結晶は、それぞれ3.1および2.9Åに回折した。さらに、組換えヒト可溶性CD40Lを、最適化Tn3モノマー342単独ならびに342モノマーおよび311K4E_12モノマーの両方と共結晶化した。これらの構造についての結晶は、それぞれ2.8および1.9Åに回折した。対応する結晶構造は、Tn3足場とCD40Lとの相互作用の理解を支援し、より高い親和性のCD40L結合剤および複数のエピトープに結合するタンデム構築物を設計するために使用することができる。
結晶化のためにタグ無しTn3分子を産生するため、組換え発現タンパク質をペリプラズム空間中に分泌するように設計されたインハウスIPTG誘導性ベクターを使用して大腸菌(E.coli)中でタンパク質を発現させた。このベクターは、Ptacプロモーター、OppAシグナルペプチド突然変異体L25/M(MTNITKRSLVAAGVLAALMAGNVAMA)(配列番号210)、C末端8×Hisタグをトロンビン開裂部位に加えて有する。Tn3配列を、シグナルペプチドとトロンビン開裂部位との間でサブクローニングした。
シッティングドロップ結晶化実験は、300nLの容量のウェル溶液およびタンパク質複合体溶液を液滴区画中で混合し、それを50μLのウェル溶液に対して平衡させることによりPhoenix結晶化ロボット(Art Robbins Instruments,Sunnyvale,California,USA)を使用して96ウェルIntelliプレート(Art Robbins Instruments,Sunnyvale,California,USA)中で設定した。Hampton Research(Aliso Viejo,California,USA)、Emerald BioSystems(Bainbridge Island,Washington,USA)およびMolecular Dimensions(Apopka,Florida,USA)からの市販の結晶化スクリーンを使用した。
309−CD40L複合体についてのX線回折パターンを、ADSC Q315R CCD X−Ray検出器(Area Detector Systems Corporation,Poway,California,USA)を備えるLawrence Berkeley National Laboratory(University of California,Berkeley)におけるAdvanced Light SourceのBeamline5.0.3において単結晶から収集した。0.5°の振動範囲を有する360個の連続画像を、300mmの結晶から検出器の距離および0.8秒の曝露時間において収集した。
309−CD40L複合体の最も再現性の高い結晶化条件は、Peg/Ion Screen(Hampton Research)におけるB5(0.2MのNaNO3、20%のPEG3350)であると考えられた。Additive Screenを用いるさらなる最適化により、A1条件(0.1MのBaCl2・2H2O)からの回折質結晶を得た。図19、パネルBに示される結晶を96ウェルプレートから回収し、20%のグリセロールを補給した母液に移した後に液体窒素中で冷却した。
Claims (121)
- CD40L特異的モノマーサブユニットを含むTn3足場であって、前記モノマーサブユニットは、A、B、C、D、E、F、およびGと命名される7つのベータ鎖、ならびにAB、BC、CD、DE、EF、およびFGと命名される6つのループ領域を含み、CD40Lに特異的に結合するTn3足場。
- 単一のCD40L特異的モノマーサブユニットを含む、請求項1に記載のTn3足場。
- タンデムに連結されている2つのCD40L特異的モノマーサブユニットを含む、請求項1に記載のTn3足場。
- 前記2つのCD40L特異的モノマーサブユニットが、直接連結されている、請求項3に記載のTn3足場。
- 前記2つのCD40L特異的モノマーサブユニットが、リンカーにより連結されている、請求項3に記載のTn3足場。
- 前記リンカーは、ペプチドリンカーを含む、請求項5に記載のTn3足場。
- 前記ペプチドリンカーが、フレキシブルペプチドリンカーである、請求項6に記載のTn3足場。
- 前記ペプチドリンカーが、(GmX)n配列(式中、
(a)Xは、セリン(S)、アラニン(A)、グリシン(G)、Leu(L)、イソロイシン(I)、またはバリン(V)であり;
(b)mおよびnは、整数であり;
(c)mは、1、2、3または4であり;
(d)nは、1、2、3、4、5、6、または7である)
を含む、請求項7に記載のTn3足場。 - 前記ペプチドリンカーが、配列番号131、配列番号132、配列番号142または配列番号143を含む、請求項8に記載のTn3足場。
- 前記足場のCD40Lへの結合は、単一のCD40L特異的モノマーサブユニットを含むTn3足場のそれと比べて改善される、請求項3に記載のTn3足場。
- 前記足場のCD40Lへの結合は、標的に対する作用を単一のCD40L特異的モノマーサブユニットを含むTn3足場のそれと比べて改善する、請求項3に記載のTn3足場。
- 前記CD40Lへの結合の改善は、結合親和性の改善、結合アビディティーの改善、またはその両方である、請求項10に記載のTn3足場。
- CD40Lについての結合親和性およびタンパク質安定性が、単一のCD40L特異的モノマーサブユニットを含むTn3足場のそれらと比べて改善される、請求項10に記載のTn3足場。
- CD40Lについての結合アビディティーおよびタンパク質安定性が、単一のCD40L特異的モノマーサブユニットを含むTn3足場のそれらと比べて改善される、請求項10に記載のTn3足場。
- 少なくとも1つのCD40L特異的モノマーサブユニットが、リンカーに、または異種部分に結合している、請求項1〜9のいずれか一項に記載のTn3足場。
- リンカーまたは異種部分が、前記足場のN末端またはC末端にコンジュゲートしている、請求項15に記載のTn3足場。
- 前記リンカーが、ペプチドリンカーを含む、請求項15または16に記載のTn3足場。
- 前記ペプチドリンカーが、フレキシブルペプチドリンカーである、請求項17に記載のTn3足場。
- 前記ペプチドリンカーが、(GmX)n配列(式中、
(a)Xは、セリン(S)、アラニン(A)、グリシン(G)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、またはバリン(V)であり;
(b)mおよびnは、整数であり;
(c)mは、1、2、3または4であり;
(d)nは、1、2、3、4、5、6、または7である)
を含む、請求項17または18に記載のTn3足場。 - 前記ペプチドリンカーが、配列番号131、配列番号132、配列番号142、または配列番号143を含む、請求項19に記載のTn3。
- 前記リンカーが、機能的部分を含む、請求項15に記載のTn3足場。
- 前記機能的部分が、免疫グロブリンまたはその断片である、請求項21に記載のTn3足場。
- 前記免疫グロブリンまたはその断片が、Fcドメインを含む、請求項22に記載のTn3足場。
- 前記Fcドメインが、少なくとも1つのFcγR媒介エフェクター機能を誘導し得ない、請求項23に記載のTn3足場。
- 前記少なくとも1つのFcγR媒介エフェクター機能が、ADCCである、請求項24に記載のTn3足場。
- 少なくとも1つのCD40L特異的モノマーサブユニットが、異種部分に結合している、請求項15に記載のTn3足場。
- 前記異種部分が、タンパク質、ペプチド、タンパク質ドメイン、リンカー、薬物、毒素、細胞傷害剤、造影剤、放射性核種、放射性化合物、有機ポリマー、無機ポリマー、ポリエチレングリコール(PEG)、ビオチン、アルブミン、ヒト血清アルブミン(HSA)、HSA FcRn結合部分、抗体、抗体のドメイン、抗体断片、単鎖抗体、ドメイン抗体、アルブミン結合ドメイン、酵素、リガンド、受容体、結合ペプチド、非FnIII足場、エピトープタグ、組換えポリペプチドポリマー、サイトカイン、および前記部分の2つ以上の組合せからなる群から選択される組成物を含む、請求項15または26に記載のTn3足場。
- 少なくとも1つのCD40L特異的モノマーサブユニットが、PEGにコンジュゲートしている、請求項27に記載のTn3足場。
- 少なくとも1つのCD40L特異的モノマーサブユニットが、アルブミンにコンジュゲートしている、請求項27に記載のTn3足場。
- 前記アルブミンが、ヒト血清アルブミン(HSA)である、請求項29に記載のTn3足場。
- 前記HSAが、バリアントHSAである、請求項30に記載のTn3足場。
- 前記バリアントHSAのアミノ酸配列が、配列番号133である、請求項31に記載のTn3足場。
- 前記バリアントHSAが、ネイティブHSAまたはネイティブHSA断片と比較して少なくとも1つの改善された特性を有する、請求項31に記載のTn3足場。
- 前記改善された特性が、ネイティブHSAまたはネイティブHSA断片の血漿半減期と比較して変化した血漿半減期である、請求項33に記載のTn3足場。
- 前記変化した血漿半減期が、ネイティブHSAまたはネイティブHSA断片の血漿半減期と比較して長い血漿半減期である、請求項34に記載のTn3足場。
- 前記変化した血漿半減期が、ネイティブHSAまたはネイティブHSA断片の血漿半減期と比較して短い血漿半減期である、請求項34に記載のTn3足場。
- 前記HSAバリアントが、HSAドメインIII中の少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、請求項31または33〜36のいずれか一項に記載のTn3足場。
- 前記HSAバリアントが、全長成熟HSA(配列番号133または138)の配列をまたはその断片を含み、但し、407、415、463、500、506、508、509、511、512、515、516、521、523、524、526、535、550、557、573、574、および580からなる群から選択される位置における全長成熟HSA中の位置に対して番号付与される少なくとも1つのアミノ酸置換を除き;前記少なくとも1つのアミノ酸置換は、573位におけるリジン(K)のグルタミン酸(E)への置換を含まず、前記HSAバリアントにコンジュゲートしていないTn3足場の血漿半減期よりも長い血漿半減期を有する、請求項31または33〜37のいずれか一項に記載のTn3足場。
- 全長成熟HSA中の位置に対して番号付与される前記少なくとも1つのアミノ酸置換が、463、508、523、および524からなる群から選択される位置におけるものであり、前記HSAバリアントにコンジュゲートしていないTn3足場の血漿半減期よりも長い血漿半減期を有する、請求項38に記載のTn3足場。
- 前記HSAバリアントが、全長成熟HSA(配列番号133または138)の配列またはその断片を含み、但し、
(a)407位におけるロイシン(L)のアスパラギン(N)またはチロシン(Y)への置換;
(b)415位におけるバリン(V)のトレオニン(T)への置換;
(c)463位におけるロイシン(L)のアスパラギン(N)への置換;
(d)500位におけるリジン(K)のアルギニン(R)への置換;
(e)506位におけるトレオニン(T)のチロシン(Y)への置換;
(f)508位におけるトレオニン(T)のアルギニン(R)への置換;
(g)509位におけるフェニルアラニン(F)のメチオニン(M)またはトリプトファン(W)への置換;
(h)511位におけるアラニン(A)のフェニルアラニン(F)への置換;
(i)512位におけるアスパラギン酸(D)のチロシン(Y)への置換;
(j)515位におけるトレオニン(T)のグルタミン(Q)への置換;
(k)516位におけるロイシン(L)のトレオニン(T)またはトリプトファン(W)への置換;
(l)521位におけるアルギニン(R)のトリプトファン(W)への置換;
(m)523位におけるイソロイシン(I)のアスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、グリシン(G)、リジン(K)、またはアルギニン(R)への置換;
(n)524位におけるリジン(K)のロイシン(L)への置換;
(o)526位におけるグルタミン(Q)のメチオニン(M)への置換;
(p)535位におけるヒスチジン(H)のプロリン(P)への置換;
(q)550位におけるアスパラギン酸(D)のグルタミン酸(E)への置換;
(r)557位におけるリジン(K)のグリシン(G)への置換;
(s)573位におけるリジン(K)のフェニルアラニン(F)、ヒスチジン(H)、プロリン(P)、トリプトファン(W)、またはチロシン(Y)への置換;
(t)574位におけるリジン(K)のアスパラギン(N)への置換;
(u)580位におけるグルタミン(Q)のリジン(K)への置換;および
(v)前記置換の2つ以上の組合せ
からなる群から選択される全長成熟HSA中の位置に対して番号付与される少なくとも1つのアミノ酸置換を除き、
前記HSAバリアントにコンジュゲートしていないTn3足場の血漿半減期よりも長い血漿半減期を有する、請求項31または33〜38のいずれか一項に記載のTn3足場。 - 前記HSAバリアントが、全長成熟HSA(配列番号133または138)の配列またはその断片を含み、但し、
(a)463位におけるロイシン(L)のアスパラギン(N)への置換;
(b)508位におけるトレオニン(T)のアルギニン(R)への置換;
(c)523位におけるイソロイシン(I)のアスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、グリシン(G)、リジン(K)、またはアルギニン(R)への置換;
(d)524位におけるリジン(K)のロイシン(L)への置換;および
(e)前記置換の2つ以上の組合せ
からなる群から選択される全長成熟HSA中の位置に対して番号付与される少なくとも1つのアミノ酸置換を除き、
前記HSAバリアントにコンジュゲートしていないTn3足場の血漿半減期よりも長い血漿半減期を有する、請求項40に記載のTn3足場。 - 少なくとも2つの同一のCD40L特異的モノマーサブユニットを含む、請求項3〜14のいずれか一項に記載のTn3足場。
- 少なくとも2つの異なるCD40L特異的モノマーサブユニットを含む、請求項3〜15のいずれか一項に記載のTn3足場。
- CD40受容体アゴニストである、請求項1〜43のいずれか一項に記載のTn3足場。
- CD40受容体アンタゴニストである、請求項1〜44のいずれか一項に記載のTn3足場。
- 少なくとも2つのCD40L特異的モノマーサブユニットが、同一のCD40Lエピトープに特異的に結合する、請求項3〜14のいずれか一項に記載のTn3足場。
- 少なくとも2つのCD40L特異的モノマーサブユニットが、異なるCD40Lエピトープに特異的に結合する、請求項3〜14のいずれか一項に記載のTn3足場。
- 前記異なるCD40Lエピトープが、非重複エピトープである、請求項47に記載のTn3足場。
- 前記異なるCD40Lエピトープが、重複エピトープである、請求項47に記載のTn3足場。
- 少なくとも2つのCD40L分子に結合する、請求項1〜49のいずれか一項に記載のTn3足場。
- 単一のCD40L特異的モノマーサブユニットが、少なくとも2つのCD40L分子に結合する、請求項1〜50のいずれか一項に記載のTn3足場。
- 少なくとも1つのCD40L特異的モノマーサブユニットのベータ鎖が、配列番号3のベータ鎖と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項1に記載のTn3足場。
- 前記Aベータ鎖が、少なくとも1つの突然変異を除き配列番号11を含む、請求項1に記載のTn3足場。
- 前記Bベータ鎖が、少なくとも1つの突然変異を除き配列番号12を含む、請求項1に記載のTn3足場。
- 前記Cベータ鎖が、少なくとも1つの突然変異を除き配列番号13または14を含み、配列番号13のシステインも配列番号14のシステインも置換されていない、請求項1に記載のTn3足場。
- 前記Dベータ鎖が、少なくとも1つの突然変異を除き配列番号15を含む、請求項1に記載のTn3足場。
- 前記Eベータ鎖が、少なくとも1つの突然変異を除き配列番号16を含む、請求項1に記載のTn3足場。
- 前記Fベータ鎖が、少なくとも1つの突然変異を除き配列番号17を含み、配列番号17のシステインが置換されていない、請求項1に記載のTn3足場。
- 前記Gベータ鎖が、少なくとも1つの突然変異を除き配列番号18を含む、請求項1に記載のTn3足場。
- 前記CD40L特異的モノマーサブユニットが、アミノ酸配列:
IEV(XAB)nALITW(XBC)nCELX1YGI(XCD)nTTIDL(XDE)nYSI(XEF)nYEVSLIC(XFG)nKETFTT
(式中、
(a)XAB、XBC、XCD、XDE、XEF、およびXFGは、それぞれ前記AB、BC、CD、DE、EF、およびFGループの配列中に存在するアミノ酸残基を表し;
(b)X1は、アミノ酸残基AまたはTを表し;
(c)ループの長さnは、2から26の整数である)
を含む、請求項1〜59のいずれか一項に記載のTn3足場。 - 前記ABループの配列が、配列番号4または配列番号136を含み、前記CDループの配列が、配列番号6を含み、前記EFループの配列が、配列番号8または配列番号137を含む、請求項60に記載のTn3足場。
- 前記BCループの配列が、配列番号83、84、85、86、87、88、89、90、91、92からなる群から選択される配列を含む、請求項60に記載のTn3足場。
- 前記DEループの配列が、配列番号94、95、96、97、98、および169からなる群から選択される配列を含む、請求項60に記載のTn3足場。
- 前記FGループの配列が、配列番号9、99、139、および170からなる群から選択される配列を含む、請求項60に記載のTn3足場。
- 前記BCループの配列が、配列番号100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、および174からなる群から選択される配列を含む、請求項60に記載のTn3足場。
- 前記DEループの配列が、配列番号118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、および175からなる群から選択される配列を含む、請求項60に記載のTn3足場。
- 前記FGループの配列が、配列番号129、130、および177からなる群から選択される配列を含む、請求項60に記載のTn3足場。
- (a)前記BCループの配列が、配列番号83を含み、前記DEループの配列が、配列番号94を含み、前記FGループの配列が、配列番号9または139を含み;
(b)前記BCループの配列が、配列番号83を含み、前記DEループの配列が、配列番号94を含み、前記FGループの配列が、配列番号99を含み;
(c)前記BCループの配列が、配列番号84を含み、前記DEループの配列が、配列番号95を含み、前記FGループの配列が、配列番号9または139を含み;
(d)前記BCループの配列が、配列番号85を含み、前記DEループの配列が、配列番号94を含み、前記FGループの配列が、配列番号9または139を含み;
(e)前記BCループの配列が、配列番号86を含み、前記DEループの配列が、配列番号96を含み、前記FGループの配列が、配列番号9または139を含み;
(f)前記BCループの配列が、配列番号87を含み、前記DEループの配列が、配列番号97を含み、前記FGループの配列は、配列番号9または139を含み;
(g)前記BCループの配列が、配列番号88を含み、前記DEループの配列が、配列番号95を含み、前記FGループの配列が、配列番号9または139を含み;
(h)前記BCループの配列が、配列番号89を含み、前記DEループの配列が、配列番号94を含み、前記FGループの配列が、配列番号9または139を含み;
(i)前記BCループの配列が、配列番号90を含み、前記DEループの配列が、配列番号94を含み、前記FGループの配列が、配列番号9または139を含み;
(j)前記BCループの配列が、配列番号91を含み、前記DEループの配列が、配列番号95を含み、前記FGループの配列が、配列番号9または139を含み;
(k)前記BCループの配列が、配列番号92を含み、前記DEループの配列が、配列番号98を含み、前記FGループの配列が、配列番号9または139を含み;または
(l)前記BCループの配列が、配列番号93を含み、前記DEループの配列が、配列番号94を含み、前記FGループの配列が、配列番号9または139を含む、
請求項60に記載のTn3足場。 - (a)前記BCループの配列が、配列番号100を含み、前記DEループの配列が、配列番号118を含み、前記FGループの配列が、配列番号129を含み;
(b)前記BCループの配列が、配列番号101を含み、前記DEループの配列が、配列番号119を含み、前記FGループの配列が、配列番号129を含み;
(c)前記BCループの配列が、配列番号102を含み、前記DEループの配列が、配列番号120を含み、前記FGループの配列が、配列番号129を含み;
(d)前記BCループの配列が、配列番号103を含み、前記DEループの配列が、配列番号121を含み、前記FGループの配列が、配列番号129を含み;
(e)前記BCループの配列が、配列番号104を含み、前記DEループの配列が、配列番号122を含み、前記FGループの配列が、配列番号129を含み;
(f)前記BCループの配列が、配列番号105を含み、前記DEループの配列が、配列番号121を含み、前記FGループの配列が、配列番号129を含み;
(g)前記BCループの配列が、配列番号106を含み、前記DEループの配列が、配列番号123を含み、前記FGループの配列が、配列番号129を含み;
(h)前記BCループの配列が、配列番号107を含み、前記DEループの配列が、配列番号123を含み、前記FGループの配列が、配列番号129を含み;
(i)前記BCループの配列が、配列番号108を含み、前記DEループの配列が、配列番号118を含み、前記FGループの配列が、配列番号129を含み;
(j)前記BCループの配列が、配列番号109を含み、前記DEループの配列が、配列番号123を含み、前記FGループの配列が、配列番号129を含み;
(k)前記BCループの配列が、配列番号110を含み、前記DEループの配列が、配列番号121を含み、前記FGループの配列が、配列番号129を含み;
(l)前記BCループの配列が、配列番号111を含み、前記DEループの配列が、配列番号123を含み、前記FGループの配列が、配列番号130を含み;
(m)前記BCループの配列が、配列番号108を含み、前記DEループの配列が、配列番号121を含み、前記FGループの配列が、配列番号129を含み;
(n)前記BCループの配列が、配列番号112を含み、前記DEループの配列が、配列番号124を含み、前記FGループの配列が、配列番号129を含み;
(o)前記BCループの配列が、配列番号113を含み、前記DEループの配列が、配列番号125を含み、前記FGループの配列が、配列番号129を含み;
(p)前記BCループの配列が、配列番号114を含み、前記DEループの配列が、配列番号118を含み、前記FGループの配列が、配列番号129を含み;
(q)前記BCループの配列が、配列番号115を含み、前記DEループの配列が、配列番号126を含み、前記FGループの配列が、配列番号129を含み;
(r)前記BCループの配列が、配列番号116を含み、前記DEループの配列が、配列番号127を含み、前記FGループの配列が、配列番号129を含み;または
(s)前記BCループの配列が、配列番号117を含み、前記DEループの配列が、配列番号128を含み、前記FGループの配列が、配列番号129を含む、
請求項60に記載のTn3足場。 - 前記ABループが、配列番号136を含む、請求項69に記載のTn3足場。
- 前記CD40L特異的モノマーサブユニットが、配列番号20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42および146からなる群から選択される配列を含む、請求項68に記載のTn3足場。
- 前記CD40L特異的モノマーサブユニットが、アミノ酸配列:
IEVKDVTDTTALITWX1DX2X3X4X5X6X7X8CELTYGIKDVPGDRTTIDLWX9HX10AX11YSIGNLKPDTEYEVSLICRX12GDMSSNPAKETFTT(配列番号167)
(式中、
(a)X1は、アミノ酸残基セリン(S)またはロイシン(L)を表し;
(b)X2は、アミノ酸残基アスパラギン酸(D)またはグルタミン酸(E)を表し;
(c)X3は、アミノ酸残基ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)またはトリプトファン(W)を表し;
(d)X4は、アミノ酸残基アラニン(A)、グリシン(G)、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(e)X5は、アミノ酸残基グルタミン酸(E)、ロイシン(L)、グルタミン(Q)、セリン(S)、アスパラギン酸(D)またはアスパラギン(N)を表し;
(f)X6は、アミノ酸残基フェニルアラニン(F)またはチロシン(Y)を表し;
(g)X7は、アミノ酸残基イソロイシン(I)、バリン(V)、ヒスチジン(H)、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(h)X8は、アミノ酸残基グリシン(G)、トリプトファン(W)またはバリン(V)を表し;
(i)X9は、アミノ酸残基トリプトファン(W)、フェニルアラニン(F)またはチロシン(Y)を表し;
(j)X10は、アミノ酸残基セリン(S)、グルタミン(Q)、メチオニン(M)またはヒスチジン(H)を表し;
(k)X11は、アミノ酸残基トリプトファン(W)またはヒスチジン(H)を表し;
(l)X12は、アミノ酸残基アルギニン(R)またはセリン(S)を表す)
を含む、請求項60に記載のTn3足場。 - 前記CD40L特異的モノマーサブユニットが、配列番号44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、および82からなる群から選択される配列を含む、請求項69に記載のTn3足場。
- 前記CD40L特異的モノマーサブユニットが、アミノ酸配列:
IEVX1DVTDTTALITWX2X3RSX4X5X6X7X8X9X10CELX11YGIKDVPGDRTTIDLX12X13X14X15YVHYSIGNLKPDTX16YEVSLICLTTDGTYX17NPAKETFTT(配列番号171)
(式中、
(a)X1は、アミノ酸残基リジン(K)またはグルタミン酸(E)を表し;
(b)X2は、アミノ酸残基トレオニン(T)またはイソロイシン(I)を表し;
(c)X3は、アミノ酸残基アスパラギン(N)またはアラニン(A)を表し;
(d)X4は、アミノ酸残基セリン(S)、ロイシン(L)、アラニン(A)、フェニルアラニン(F)またはチロシン(Y)を表し;
(e)X5は、アミノ酸残基チロシン(Y)、アラニン(A)、グリシン(G)、バリン(V)、イソロイシン(I)またはセリン(S)を表し;
(f)X6は、アミノ酸残基チロシン(Y)、セリン(S)、アラニン(A)またはヒスチジン(H)を表し;
(g)X7は、アミノ酸残基アスパラギン(N)、アスパラギン酸(D)、ヒスチジン(H)またはチロシン(Y)を表し;
(h)X8は、アミノ酸残基ロイシン(L)、フェニルアラニン(F)、ヒスチジン(H)またはチロシン(Y)を表し;
(i)X9は、アミノ酸残基ヒスチジン(H)、プロリン(P)、セリン(S)、ロイシン(L)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(j)X10は、アミノ酸残基グリシン(G)、フェニルアラニン(F)、ヒスチジン(H)またはチロシン(Y)を表し;
(k)X11は、アミノ酸残基アラニン(A)またはトレオニン(T)を表し;
(l)X12は、アミノ酸残基セリン(S)、アスパラギン(N)、グルタミン酸(E)、アスパラギン(R)またはアスパラギン酸(D)を表し;
(m)X13は、アミノ酸残基セリン(S)、グルタミン(Q)、トレオニン(T)、アスパラギン(N)またはアラニン(A)を表し;
(n)X14は、アミノ酸残基プロリン(P)、バリン(V)、イソロイシン(I)またはアラニン(A)またはアミノ酸無しを表し;
(o)X15は、アミノ酸残基イソロイシン(I)またはアミノ酸無しを表し;
(p)X16は、アミノ酸残基グルタミン酸(E)またはリジン(K)を表し;
(q)X17は、アミノ酸残基セリン(S)またはアスパラギン(N)を表す)
を含む、請求項60に記載のTn3足場。 - 配列番号134、135、205、206、207および208からなる群から選択される配列を含むTn3足場。
- 配列番号134、135、205、206、207および208からなる群から選択される配列からなるTn3足場。
- 配列番号201、202、203、および204からなる群から選択される配列を含むTn3足場。
- 配列番号201、202、203、および204からなる群から選択される配列からなるTn3足場。
- 前記CD40Lが、ヒトCD40Lである、請求項1〜78のいずれか一項に記載のTn3足場。
- 前記CD40Lが、膜結合CD40L(配列番号1)、可溶性CD40L(配列番号2)、またはその断片である、請求項79に記載のTn3足場。
- CD40Lに結合し、CD40LのCD40への結合を妨害する、請求項1〜80のいずれか一項に記載のTn3足場。
- CD40Lに結合し、CD40媒介シグナリングを破壊する、請求項1〜81のいずれか一項に記載のTn3足場。
- CD40L発現細胞を請求項1〜82のいずれか一項に記載のTn3足場と接触させることを含むCD40L発現細胞の活性を変化させる方法であって、前記Tn3足場は、CD40Lに結合し、CD40LのCD40への結合を妨害する方法。
- CD40L発現細胞を請求項1〜82のいずれか一項に記載のTn3足場と接触させることを含むCD40媒介シグナリング応答を変化させる方法であって、前記Tn3足場は、CD40Lに結合し、CD40媒介シグナリングを破壊する方法。
- 前記CD40媒介シグナリング応答が、T依存性免疫応答である、請求項84に記載の方法。
- 約1μM以下、または約500nM以下、または約100nM以下、または約50nM以下、または約25nM以下、または約10nM以下、または約5nM以下、または約2nM以下の親和性(Kd)でCD40Lに結合する、請求項1〜82のいずれか一項に記載のTn3足場。
- CD40L特異的モノマーサブユニットが、配列番号2の142から155、200から230、または247から251位に局在するアミノ酸を含むCD40Lエピトープに特異的に結合する、請求項1〜82および86のいずれか一項に記載のTn3足場。
- CD40L特異的モノマーサブユニットが、CD40Lアミノ酸E142、Y146、M148、N151、L155、R200、R203、およびE230と相互作用する、請求項1〜61、65〜67、69、70、73、74、77、および78のいずれか一項に記載のTn3足場。
- CD40L特異的モノマーサブユニットが、CD40Lアミノ酸R203、I204、V247、H249、およびT251と相互作用する、請求項1〜64、68、71、72、75、および76のいずれか一項に記載のTn3足場。
- CD40L特異的モノマーサブユニットが、CD40Lアミノ酸S245、V247、H249、およびT251と相互作用する、請求項1〜64、68、71、72、75、および76のいずれか一項に記載のTn3足場。
- CD40Lアミノ酸E142、Y146、M148、N151、L155が、第1のCD40L分子中に局在し、アミノ酸R200、R203、およびE230が、第2のCD40L分子中に局在する、請求項88に記載のTn3足場。
- CD40Lアミノ酸R203およびI204が、第1のCD40L分子中に局在し、CD40Lアミノ酸V247、H249、およびT251が、第2のCD40L分子中に局在する、請求項89に記載のTn3足場。
- 請求項1〜82および86〜92のいずれか一項に記載のTn3足場をコードする単離核酸分子。
- 請求項93に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項94に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 前記核酸分子によりコードされるTn3足場が発現される条件下で請求項95に記載の宿主細胞を培養することを含む、Tn3足場を産生する方法。
- 請求項1〜82および86〜92のいずれか一項に記載のTn3足場および薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物。
- 有効量の請求項96に記載の組成物を投与することを含む、自己免疫疾患の予防、治療、改善、または管理が必要とされる患者における自己免疫疾患を予防、治療、改善、または管理する方法。
- 治療有効量の請求項93に記載の組成物を患者に投与することを含む、自己免疫疾患を有する患者に投与されるコルチコステロイドの頻度および量を低減させる方法。
- 前記自己免疫疾患が、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、シェーグレン症候群、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性および他の網膜症、水晶体後線維増殖症、加齢性黄斑変性、血管新生性緑内障、血管腫、甲状腺過形成(グレーブス病を含む)、角膜および他の組織移植、ならびに慢性炎症、敗血症、関節リウマチ、腹膜炎、クローン病、再灌流損傷、敗血症、内毒素ショック、嚢胞性線維症、心内膜炎、乾癬、関節炎(例えば、乾癬性関節炎)、アナフィラキシーショック、臓器虚血、再灌流損傷、脊髄損傷および同種移植片拒絶反応。自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能不全症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄多発性神経障害、チャーグストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、CREST症候群、寒冷凝集素症、クローン病、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛−線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、IgA神経障害、若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、1型または免疫介在性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、例えば、疱疹状皮膚炎血管炎、白斑およびウェゲナー肉芽腫症からなる群から選択される、請求項98または99のいずれか一項に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス(SLE)である、請求項98または99のいずれか一項に記載の方法。
- 追加の治療法をさらに含み、前記治療法は、免疫療法、生物療法、化学療法、放射線療法、または小分子薬物療法である、請求項98または99のいずれか一項に記載の方法。
- 可溶性CD40L(配列番号2)との複合体中の配列番号20からなるTn3足場を含むタンパク質結晶であって、P212121斜方晶空間群およびa=85.69Å、b=90.64Å、c=95.56Åの単位格子寸法、+/−0.1%における結晶格子を有するタンパク質結晶。
- 前記結晶の非対称単位が、CD40LのトリマーおよびTn3足場の3つの分子を含む、請求項103に記載のタンパク質結晶。
- 構造座標の決定のためのX線を、3.2Å以下の値の分解能に回折させる、請求項103に記載のタンパク質結晶。
- 可溶性CD40L(配列番号2)との複合体中の配列番号68からなるTn3足場を含むタンパク質結晶であって、P213立方晶空間群およびa=b=c=97.62Åの単位格子寸法、+/−0.1%における結晶格子を有するタンパク質結晶。
- 前記結晶の非対称単位が、1つのCD40L分子および1つのTn3足場分子を含む、請求項106に記載のタンパク質結晶。
- 構造座標を決定するためのX線を、2.7Å以下の値の分解能に回折させる、請求項106に記載のタンパク質結晶。
- 可溶性CD40L(配列番号2)との複合体中の配列番号28または146からなるTn3足場を含むタンパク質結晶であって、P321空間群および、a=95.53Å、b=93.53Å、c=66.69Åの単位格子寸法、+/−0.1%における結晶格子を有するタンパク質結晶。
- 前記結晶の非対称単位が、1つのCD40L分子および1つのTn3足場分子を含む、請求項109に記載のタンパク質結晶。
- 構造座標を決定するためのX線を、2.8Å以下の値の分解能に回折させる、請求項109に記載のタンパク質結晶。
- 可溶性CD40L(配列番号2)との複合体中の配列番号68および配列番号28または146からなる2つの異なるTn3足場を含むタンパク質結晶であって、P21立方晶空間群およびa=80.32Å、b=143.48Å、c=111.27Å、β=98.22Åの単位格子寸法、+/−0.1%における結晶格子を有するタンパク質結晶。
- 前記結晶の非対称単位が、2つのCD40Lトリマーおよび6つのそれぞれのTn3足場分子を含む、請求項112のタンパク質結晶。
- 構造座標を決定するためのX線を、1.9Å以下の値の分解能に回折させる、請求項112に記載のタンパク質結晶。
- シッティングドロップ蒸気拡散により結晶化されている、請求項103〜114のいずれか一項に記載のタンパク質結晶。
- (a)CD40Lとの複合体中のCD40L特異的モノマーサブユニットを含むTn3足場を含むある容量の液体を、沈殿剤を含むある容量のリザーバー溶液と混合すること;および
(b)工程(a)において得られた混合物を密閉容器中で、タンパク質結晶が形成するまで結晶化に好適な条件下でインキュベートすること
を含む、タンパク質結晶を作製する方法。 - 前記タンパク質結晶を、シッティングドロップ蒸気拡散により産生する、請求項116に記載の方法。
- 前記Tn3足場が、配列番号20、配列番号28、配列番号68または配列番号146を含む、請求項116に記載の方法。
- (a)データを、CD40Lと複合体化されたCD40L特異的モノマーサブユニットを含むTn3足場のタンパク質結晶の一部の構造についてのグラフ三次元表示に変換するための;および
(b)前記グラフ三次元表示の表示をもたらすための、
機械可読命令が符号化されたデータ保存材料を含む機械可読データ保存媒体。 - 前記Tn3足場が、配列番号20、配列番号28、配列番号68または配列番号146を含む、請求項119に記載の機械可読データ保存媒体。
- 前記タンパク質結晶が、請求項103に記載の結晶、請求項106に記載の結晶、請求項118に記載の結晶、またはそれらの任意の組合せである、請求項119に記載の機械可読データ保存媒体。
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