CN110520444A - 用于制备多特异性抗体的多肽接头 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于制备多特异性抗体的突变体多肽接头、所述多特异性抗体和用于产生所述多特异性抗体的方法。

Description

用于制备多特异性抗体的多肽接头
本发明涉及可用以医学领域的具有改善的特性的多特异性抗体。
发明背景
治疗性融合蛋白已经成为药物开发中的重要方式。通常，使用肽接头构建来自不同功能性蛋白质模块的多域蛋白质。所得的多域蛋白设计成结合与个别模块关联的靶物(或者同时施加个别模块的生物学功能)以增强与分离的单一域相关的生物学效应或产生由分离的单一域得不到的新的生物学活性。存在有利用肽接头的分子的许多例子：抗体的单链可变域(scFv)、免疫细胞因子(细胞因子-抗体融合物)、双特异性抗体(BsAb)等。特定融合蛋白的接头的选择由以下考虑因素决定，诸如：1)接头是否需要柔性以将各个域折叠成特定的三级结构(例如基于scFv的抗体)，2)接头是否需要刚性以在蛋白质域之间提供必要的分离，或3)接头是否必须是可切割的，以允许在体内分离域以产生期望的活性(Xiaoying Chen,et al,Adv Drug Deliv Rev.2013.65(10):1357–1369)。由于不适当的接头可能降低或消除融合蛋白的期望活性(Yumi Maeda等,Anal.Biochem.1997.249(2):147-152)，接头的选择可以是关键的。
已经鉴定出用于构建融合蛋白的各种接头序列(Richard George and JaapHeringa,Protein Engineering.2003.15(11):871–879；Xiaoying Chen等,Adv DrugDeliv Rev.2013.65(10):1357–1369)。也存在有已经编译融合蛋白构建中采用的接头序列的各种可用数据库：1)由新加坡国立大学(National University of Singapore)编译的SynLinker(http://synlinker.syncti.org)，和2)国际遗传工程机器竞赛(InternationalGenetically Engineered Machine Competition)(http://parts.igem.org/Protein_domains/Linker)；阿姆斯特丹自由大学综合生物信息学中心(Centre for IntegrativeBioinformatics at Vrije Universiteit Amsterdam)(http://www.ibi.vu.nl/ programs/linkerdbwww)。
国际专利申请WO2013/005194公开了用接头构建的多特异性抗体，所述接头从IgG1铰链序列，接着是IgG1CH2域序列的N端末端，接着是来自IgA1铰链中心部分的8个氨基酸的半刚性接头序列设计。包含IgA1铰链中心部分的此种半刚性接头对于提供抗体的这两个Fab域的充分分离是重要的，以避免来自对内部Fc-近端Fab2的抗原结合互补位产生影响的外部Fab1的C端末端的空间位阻。
然而，本发明人已经鉴定，大量糖型的存在不会使得产生开发治疗剂所需要的此类多特异性抗体的一致性制剂变得如此容易。另外，此类制剂的表征也会使相当复杂的，这会使得不同制造批次的比较变得费力。
发明概述
本发明人然后已经认识到这可以通过重新设计接头，尤其是通过从接头消除糖基化位点来改善。
因此，本发明提供了接头多肽，其包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：EPKX1CDKX2HX3X4PPX5PAPELLGGPX6X7PPX8PX9PX10GG(SEQ ID NO:1)，
其中X1,X2,X3,X4,X5,X6,X7,X8,X9,X10相同或不同，是如本文中定义的任何氨基酸；条件是多肽不包含以下序列或不由以下序列组成：EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG(SEQ ID NO:5)或EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG(SEQ ID NO:6)。
此类多肽可用作融合蛋白，更特别地多特异性抗体，特别是双特异性抗体中的接头。
因此，本发明的主题是多特异性抗原结合片段，其包含至少两个具有不同CH1和CL域的Fab片段，其中每个Fab片段识别感兴趣的不同表位，并且所述Fab片段以任何次序串联排列，第一Fab片段的CH1域的C端末端经由多肽接头与接着的Fab片段的VH域的N端末端连接，
所述多特异性抗原结合片段的特征在于所述多肽接头序列包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：EPKX1CDKX2HX3X4PPX5PAPELLGGPX6X7PPX8PX9PX10GG(SEQ IDNO:1)，其中X1,X2,X3,X4,X5,X6,X7,X8,X9,X10相同或不同，是任何氨基酸；条件是所述接头序列不包含以下序列或不由以下序列组成：EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG(SEQID NO:5)或EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG(SEQ ID NO:6)。
进一步提供了多特异性抗体，其具有两个相同的抗原结合臂，每个抗原结合臂由如本文中限定的多特异性抗原结合片段组成。
在一个优选的实施方案中，提供了多特异性抗体，其具有免疫球蛋白样结构，所述免疫球蛋白样结构包含：
-两个相同的抗原结合臂，每个抗原结合臂由如本文中限定的多特异性抗原结合片段组成；
-免疫球蛋白的二聚化CH2和CH3域；
-IgA、IgG或IgD的铰链区，其将所述抗原结合臂的CH1域的C端末端与CH2域的N端末端连接。
因此，本发明更特别提供了多特异性抗体，优选双特异性抗体，其包含两条重链和四条轻链，
其中每条重链包含
a.包含铰链-CH2-CH3域的免疫球蛋白的Fc区，
b.所述Fc区通过所述铰链域与抗体1(Ab1)的Fab重链CH1-VH连接，
c.所述Fc区继而通过多肽接头序列与抗体2(Ab2)的Fab重链CH1-VH连接，其中所述多肽接头序列将Ab1的所述Fab重链VH域的N端与Ab2的所述CH1域的C端连接，
且所述四条轻链包含与其关联重链域缔合的Ab1轻链和Ab2轻链；
其特征在于所述多肽接头序列包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：EPKX1CDKX2HX3X4PPX5PAPELLGGPX6X7PPX8PX9PX10GG(SEQ ID NO:1)，
其中X1,X2,X3,X4,X5,X6,X7,X8,X9,X10相同或不同，是任何氨基酸；条件是所述接头序列不包含以下序列或不由以下序列组成：EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG(SEQID NO:5)或EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG(SEQ ID NO:6)。
在一个具体的实施方案中，多肽接头序列包含选自下组的序列或由选自下组的序列组成：
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPGGPPGPGPGGG(SEQ ID NO:2)；
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPAPAPAGG(SEQ ID NO:3)；和
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPGPAPGGG(SEQ ID NO:4)。
本发明的进一步的主题是多肽，其包含如本文中限定的多特异性抗原结合片段或多特异性抗体，优选双特异性抗体的重链，优选由如本文中限定的多特异性抗原结合片段或多特异性抗体，优选双特异性抗体的重链组成。
本发明进一步提供了多核苷酸，其包含编码此类多肽的序列。
用包含所述多核苷酸的表达载体转染的宿主细胞也是本发明的一部分。
本发明的进一步的主题是产生如本文中描述的多特异性抗体，优选双特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：a)在合适的培养基和培养条件中培养表达如本文中限定的抗体重链和如本文中限定的抗体轻链的宿主细胞；并且b)从培养基或从所述培养的细胞中回收所述产生的抗体。
附图简述
图1是本发明的全长BiXAb双特异性抗体的示意图。
图2是仅含有通过接头连接的两个Fab域且没有Fc域的双特异性构建体(Fab-Fab)的示意图。
图3A显示了BiXAb2b的大小排阻层析分析。
图3B显示了BiXAb3b的大小排阻层析分析。
图3C显示了Fab-Fab3b的大小排阻层析分析。
图4A显示了Fab-Fab3a的LC-MS分析的MS谱。
图4B显示了Fab-Fab3b的LC-MS分析的MS谱。
图5A显示了BiXAb3a的LC-MS分析的MS谱。
图5B显示了BiXAb3b的LC-MS分析的MS谱。
发明详述
定义
天然存在的抗体分子的基本结构是Y形四聚体四级结构，其由通过非共价相互作用和链间二硫键保持在一起的两条相同重链和两条相同轻链组成。
在哺乳动物物种中，存在有五类重链：α、δ、ε、γ和μ，它们分别决定免疫球蛋白的类别(同种型)：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。重链N端可变域(VH)之后是恒定区，其在γ、α和δ重链中含有三个域(从N端至C端编号为CH1、CH2和CH3)，而μ和ε重链的恒定区由四个域组成(从N端至C端编号为CH1、CH2、CH3和CH4)。IgA、IgG和IgD的CH1和CH2域通过柔性铰链分开，所述柔性铰链在不同类别之间，并且在IgA和IgG的情况下在不同亚型之间在长度上有所变化：lgG1、IgG2、IgG3和IgG4分别具有15、12、62(或77)和12个氨基酸的铰链，IgA1和IgA2分别具有20和7个氨基酸的铰链。
存在有两类轻链：λ和κ，它们可以与任何重链同种型缔合，但是在给定的抗体分子中都是相同类型的。这两条轻链似乎在功能上相同。它们的N-端可变域(VL)之后是由称为CL的单一域组成的恒定区。
重链和轻链通过CH1和CL域之间以及VH和VL域之间的蛋白质/蛋白质相互作用配对，并且两条重链通过它们的CH3域之间的蛋白质/蛋白质相互作用而缔合。
抗原结合区对应于Y形结构的臂，其各自由与重链的VH和CH1域配对的完整轻链组成，并且称为Fab片段(代表片段抗原结合)。Fab片段第一次通过木瓜蛋白酶消化从天然免疫球蛋白分子产生，所述木瓜蛋白酶消化在链间二硫键的氨基端侧在铰链区中切割抗体分子，从而释放两个相同的抗原结合臂。其他蛋白酶如胃蛋白酶也在铰链区中，但在链间二硫键的羧基端侧切割抗体分子，从而释放由两个相同Fab片段组成的片段，并通过二硫键保持连接；F(ab’)2片段中二硫键的还原产生Fab’片段。
对应于VH和VL域的抗原结合区的部分称为Fv片段(代表可变片段)；它包含CDR(互补决定区)，其形成抗原结合位点(也称为互补位)。
抗体的效应器区域负责其与免疫细胞上的效应器分子的结合，对应于Y形结构的茎，并且包含重链的成对的CH2和CH3域(或CH2、CH3和CH4域，取决于抗体的类别)，并且称为Fc(代表可结晶片段)域。
由于两条重链和两条轻链的同一性，天然存在的抗体分子具有两个相同的抗原结合位点，因此同时结合两个相同的表位。
在本发明的上下文中，“多特异性抗原结合片段”在本文中定义为具有两个或更多个抗原结合区的分子，每个抗原结合区识别不同的表位。不同的表位可以由相同的抗原性分子或不同的抗原性分子携带。术语“识别”是指片段特异性结合靶抗原。
若抗体以比它结合其他物质更大的亲和力、亲合力、更容易和/或以更长的持续时间结合，则抗体“特异性结合”靶抗原。“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(尽管它可以包括)排他性结合。通常但不是必需，提及结合意味着优先结合。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指评估治疗和/或治疗的哺乳动物。受试者可以是人，但也包括其他哺乳动物，特别是那些可用作人类疾病的实验室模型的哺乳动物，例如，小鼠、大鼠、兔子、狗等。
术语“治疗”或“处理”是指动作、应用或疗法，其中包括人在内的受试者以直接或间接改善受试者的状况为目的而受到医疗帮助。特别地，该术语是指在一些实施方案中降低发病率或减轻症状、消除复发、预防复发、预防发病、改善症状、改善预后或其组合。熟练技术人员将理解，治疗不一定导致症状的完全不存在或消除。例如，就癌症而言，“治疗”或“处理”可以指减缓新生性或恶性细胞生长、增殖或转移、预防或延迟新生性或恶性细胞生长、增殖或转移的形成、或它们的某种组合。
设计多特异性抗体
本文中提供了多特异性抗原结合片段和多特异性抗体构建体，其包含所述片段，其中每个多特异性抗原结合片段基本上由通过本发明的接头分开的串联排列的Fab片段组成。
此类片段和构建体优选包含来自人免疫球蛋白，优选IgG，仍优选IgG1的链。
在包含超过两个不同Fab片段的多特异性抗原结合片段的情况下，分离Fab片段的多肽接头可以是相同的或不同的。
根据本发明的多特异性抗体的优选实施方案，它具有两个相同的抗原结合臂，每个抗原结合臂由如上文限定的多特异性抗原结合片段组成。根据抗体的意图用途，抗原结合臂可以以多种方式连接在一起。
若希望获得没有Fc介导的效应的抗体，则抗体将不包含Fc区。在此情况下，两个抗原结合臂可以连接在一起，例如如下进行：
-通过经由由分离Fab片段的多肽接头提供的链间二硫键使抗原结合臂同二聚化；和/或
-经由在每个抗原结合臂的C端末端添加含有允许形成链间二硫键的半胱氨酸残基的多肽延伸，和产生铰链样结构的所述多肽延伸的同源二聚化；作为非限制性实例，所述多肽延伸可以是例如IgG1、IgG2或IgG3的铰链序列；
-经由半刚性接头，所述半刚性接头连接两个抗原结合臂的重链的C端末端以形成单一多肽链并将所述抗原结合臂维持于彼此之间足够的距离。
或者，若期望效应器功能如CDC、ADCC或ADP，则本发明的多特异性抗体可以进一步包含提供这些效应器功能的Fc域。Fc域的选择取决于期望效应器功能的类型。
在此种情况下，本发明的多特异性抗体具有免疫球蛋白样结构，其包含：
-如上文限定的两个相同的多特异性抗原结合臂；
-免疫球蛋白的二聚化CH2和CH3域；
-将抗原结合臂的CH1域的C端末端连接到CH2域的N端末端的IgA、IgG或IgD的铰链区，或者备选地当CH3域后的CH4域来自IgM或IgE时，在此情况下抗原结合臂的CH1域的C端末端可以直接连接到CH2域的N端末端。
优选地，CH2和CH3域、铰链区和/或CH4域源自相同的免疫球蛋白或与抗原结合臂的CH1域相同的同种型和亚类的免疫球蛋白。
可以使用CH2、CH3和任选地CH4域，以及来自天然免疫球蛋白的铰链区。若想要的话，还可以使它们突变，例如以调控抗体的效应器功能。在某些情况下，可以省略整个或部分CH2或CH3域。
更具体地，本发明提供了双特异性四价抗体，其包含针对它们的每个靶物的两个结合位点和功能性Fc域，其允许激活效应器功能，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和吞噬。
本发明的此类优选抗体是全长抗体。优选地，它们包含来自人免疫球蛋白，优选IgG，仍优选IgG1的重链和轻链。
轻链可以是λ或κ轻链；它们优选是κ轻链。
在一个优选的实施方案中，本发明的接头以四-Fab双特异性抗体形式连接IgGFab域，其氨基酸序列包含与合适的IgG轻链序列共表达的由所述多肽接头连接的至少两个Fab的重链序列，然后是天然铰链序列，然后是IgG Fc序列。
在图1中显示了具有IgG样结构的命名为BiXAb抗体的本发明抗体的实例。下面描述的命名为BiXAb2a、BiXAb2b、BiXAb2c和BiXAb3b的抗体是具体的实例。
本发明的双特异性抗体通常包含
-由Fc(铰链-CH2-CH3)构成的连续重链
-接着是抗体1Fab重链(CH1-VH)和抗体2的连续Fab重链(CH1-VH)，后者通过本发明的多肽接头序列连接，
-并且在蛋白质表达期间，所得的重链组装成二聚体，而共表达的抗体1和抗体2轻链(VL-CL)与其关联的重链缔合以形成最终的串联F(ab)’2-Fc分子，
抗体1(Ab1)和抗体2(Ab2)不同。
在一个优选的实施方案中，描述了双特异性抗体，其包含
·两个Fab片段，它们具有由以下组成的不同CH1和CL域
a)具有源自人IgG1/κ的CH1和C-κ域和Ab1的VH和VL域的Fab片段，
b)具有源自人IgG1/κ的CH1和C-κ域和Ab2的VH和VL域的Fab片段，
c)源自人κ恒定域的突变轻链CL恒定域，
d)突变的重链CH1恒定域
Fab片段按以下次序串联排列
-Ab1Fab片段的CH1域的C端末端经由多肽接头与Ab2Fab片段的VH域的N端末端连接，
-人IgG1的铰链区，其将Ab2片段的CH1域的C端末端连接至CH2域的N端，
-人IgG1的二聚化CH2和CH3域。
Ab1和Ab2可以是任何感兴趣的抗体，尤其是具有治疗兴趣的任何抗体。
在一个具体实施方案中，不同的Ab1和Ab2独立地选自抗EGFR抗体和抗HER2/neu抗体。在一个优选的实施方案中，不同的Ab1和Ab2选自一方面上西妥昔单抗或其突变衍生物和另一方面上曲妥珠单抗或其突变衍生物。
在另一个具体的实施方案中，不同的Ab1和Ab2独立地选自抗CD38抗体和抗PD-L1抗体。
此类抗体可用作药物，更具体地用于治疗癌症。
在整个本说明书中，氨基酸序列根据Kabat等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991)限定。
图2中显示了本发明的构建体的另一个实例，其是不含Fc域的多特异性抗原结合片段Fab-Fab。下面描述了称为Fab-Fab3a的具体实例。
此类Fab-Fab构建体通常包含两个不同的Fab域。此类抗体仅拥有一个Fab域，每个Fab域结合抗原1和抗原2。它们拥有与在相应的BiXAb抗体中相同的轻链；然而，Fab-Fabs的重链以下述方式缩短，使得它们的大多数C端残基是半胱氨酸-220(以EU编号)。
接头设计
根据本发明的多肽接头序列包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：EPKX1CDKX2HX3X4PPX5PAPELLGGPX6X7PPX8PX9PX10GG(SEQ ID NO:1)，
其中X1,X2,X3,X4,X5,X6,X7,X8,X9,X10相同或不同，是任何氨基酸；条件是接头序列不包含以下氨基酸或不由以下氨基酸组成：EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG(SEQID NO:5)或EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG(SEQ ID NO:6)。
多肽接头序列由小于80个氨基酸，优选小于60个氨基酸，仍优选小于40个氨基酸组成。
在一个具体的实施方案中，X1,X2和X3相同或不同，是苏氨酸(T)或丝氨酸(S)。
在另一个具体的实施方案中，X1,X2和X3相同或不同，是除苏氨酸(T)或丝氨酸(S)以外的任何氨基酸，优选地其中X1,X2和X3相同或不同，选自下组：Ala(A),Gly(G),Val(V),Asn(N),Asp(D)和Ile(I)，仍优选X1,X2和X3相同或不同，可以是Ala(A)或Gly(G)。
或者，X1,X2和X3相同或不同，可以是Leu(L),Glu(E),Gln(Q),Met(M),Lys(K),Arg(R),Phe(F),Tyr(T),His(H),Trp(W)，优选Leu(L),Glu(E),或Gln(Q)。
在一个具体的实施方案中，X4和X5相同或不同，是选自下组的任何氨基酸：丝氨酸(S)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)和甘氨酸(G)。
在一个优选的实施方案中，X4是丝氨酸(S)或半胱氨酸(C)。
在一个优选的方面，X5是丙氨酸(A)或半胱氨酸(C)。
在一个具体的实施方案中，X6,X7,X8,X9,X10相同或不同，是除苏氨酸(T)或丝氨酸(S)以外的任何氨基酸。优选地，X6,X7,X8,X9,X10相同或不同，选自下组：Ala(A),Gly(G),Val(V),Asn(N),Asp(D)和Ile(I)。
或者，X6,X7,X8,X9,X10相同或不同，可以是Leu(L),Glu(E),Gln(Q),Met(M),Lys(K),Arg(R),Phe(F),Tyr(T),His(H),Trp(W)，优选Leu(L),Glu(E)或Gln(Q)。
在一个优选的实施方案中，X6,X7,X8,X9,X10相同或不同，选自下组：Ala(A)和Gly(G)。
在一个优选的实施方案中，X6和X7是相同的并且优选选自下组：Ala(A)和Gly(G)。
在一个优选的实施方案中，多肽接头序列包含序列SEQ ID NO:1或由序列SEQ IDNO:1组成，其中
X1,X2和X3相同或不同，是苏氨酸(T)、丝氨酸(S)；
X4是丝氨酸(S)或半胱氨酸(C)；
X5是丙氨酸(A)或半胱氨酸(C)；
X6,X7,X8,X9,X10相同或不同，选自下组：Ala(A)和Gly(G)。
在一个具体的实施方案中，多肽接头序列包含选自下组的序列或由选自下组的序列组成：
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPGGPPGPGPGGG(SEQ ID NO:2)；
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPAPAPAGG(SEQ ID NO:3)；和
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPGPAPGGG(SEQ ID NO:4)。
在另一个优选的实施方案中，多肽接头序列包含序列SEQ ID NO:1或由序列SEQID NO:1组成，其中
X1,X2和X3相同或不同，是Ala(A)或Gly(G)；
X4是丝氨酸(S)或半胱氨酸(C)；
X5是丙氨酸(A)或半胱氨酸(C)；
X6,X7,X8,X9,X10相同或不同，选自下组：Ala(A)和Gly(G)。
生产抗体
将编码本发明抗体重链和轻链的核酸***表达载体中。可以在相同或不同表达载体中克隆轻链和重链。编码免疫球蛋白链的DNA区段与表达载体中的控制序列可操作地连接，所述控制序列确保免疫球蛋白多肽的表达。此类控制序列包括信号序列、启动子、增强子和转录终止序列。表达载体通常可作为附加体或作为宿主染色体DNA的组成部分在宿主生物中复制。通常，表达载体含有选择标志物，例如四环素或新霉素，以允许检测用期望的DNA序列转化的那些细胞。
在一个实例中，在一个表达载体中包含重链和轻链编码序列(例如，编码VH和VL、VH-CH1或VL-CL的序列)两者。在另一个实例中，将抗体的重链和轻链的每个克隆到单独的载体中。在后一种情况下，可以将编码重链和轻链的表达载体共转染到一个宿主细胞中以表达这两条链，它们可以在体内或体外组装以形成完整的抗体。
在一个具体的实施方案中，用三种独立的表达载体(例如质粒)共转染宿主细胞，导致所有三条链(即分别为重链HC和两条轻链LC1和LC2)的共产生以及多特异性抗体的分泌。
更特别地，可以有利地以以下分子比率3:2:2(HC:LC1:LC2)使用三种载体。
用于表达本文所述抗体的重组载体通常含有与启动子(组成性或可诱导型)可操作连接的编码抗体氨基酸序列的核酸。载体可以适用于原核生物、真核生物或两者的复制和整合。典型的载体含有转录和翻译终止子、起始序列和可用于调节编码抗体的核酸表达的启动子。任选地，载体含有通用表达盒，其含有至少一个独立的终止子序列、允许在真核生物和原核生物两者中的盒复制的序列(即穿梭载体)、以及原核和真核***两者的选择标志物。
如本文所述的多特异性抗体可以在原核或真核表达***，例如细菌、酵母、丝状真菌、昆虫和哺乳动物细胞中产生。本发明的重组抗体不必在真核细胞中糖基化或表达；然而，通常优选在哺乳动物细胞中表达。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是人胚肾系(293细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK细胞)、中国仓鼠卵巢细胞/-或+DHFR(CHO、CHO-S、CHO-DG44、Flp-in CHO细胞)、非洲绿猴肾细胞(VERO细胞)和人肝细胞(Hep G2细胞)。
由于本领域已经开发了许多能够分泌完整免疫球蛋白的合适宿主细胞系，并且包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞，优选骨髓瘤细胞系或经转化的B细胞或杂交瘤，优选的是哺乳动物组织细胞培养物表达和产生多肽。
在最优选的实施方案中，本发明的多特异性抗体，优选双特异性抗体通过使用CHO细胞系产生，最有利的是CHO-S细胞系。
这些细胞的表达载体可以包括表达控制序列，例如复制起点、启动子和增强子，以及必需的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点和转录终止子序列。优选的表达控制序列是源自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛***瘤病毒、巨细胞病毒等的启动子。
可以通过公知的方法将含有感兴趣的多核苷酸序列(例如，重链和轻链编码序列和表达控制序列)的载体转移到宿主细胞中，所述方法随细胞宿主的类型而变化。例如，磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主。(一般参见Sambrook等,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Press,第2版,1989)。当将重链和轻链克隆到分开的表达载体上时，将载体共转染以获得完整免疫球蛋白的表达和组装。
用载体转化或转染宿主细胞(例如，通过化学转染或电穿孔方法)并在常规营养培养基(或适当修饰)中培养以诱导启动子，选择转化子或扩增编码期望序列的基因。
一旦表达，可以进一步分离或纯化本发明的整个抗体、其二聚体、单独的轻链和重链或其他免疫球蛋白形式，以获得对于进一步测定和应用而言基本上同质的制剂。可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化方法。例如，合适的纯化程序可以包括在免疫亲和或离子交换柱上分级、乙醇沉淀、高效液相层析(HPLC)、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、硫酸铵沉淀和凝胶过滤(一般参见Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,N.Y.,1982)。对于药物用途，优选至少约90至95％同质性的基本上纯的免疫球蛋白，并且最优选98至99％或更高的同质性。
体外生产允许按比例放大以产生大量期望的本发明的多特异性，优选双特异性抗体。此类方法可以采用同质悬浮培养，例如，在气升式反应器中或在连续搅拌反应器中，或固定化或包埋的细胞培养物，例如，在中空纤维、微胶囊中，在琼脂糖微珠或陶瓷盒上。
治疗应用
本发明的另一方面是包含根据本发明的抗体的药物组合物。本发明的另一方面是根据本发明的抗体在制备药物组合物中的用途。本发明的另一方面是制备包含根据本发明的抗体的药物组合物的方法。
另一方面，本发明提供了含有与药物载体一起配制的如本文中限定的抗体的组合物，例如药物组合物。
可以通过本领域中已知的多种方法施用本发明的组合物。
通过参考以下实施例将更容易理解如此在上文一般描述的本发明，这些实施例以举例说明的方式提供，并不意图限制本发明。
实施例
设计
本发明的第一双特异性抗体是具有以下结构的称为BiXAb2a的抗体：
i)连续重链，其包含
·与SEQ ID NO:7对应的曲妥珠单抗重链可变区(VH)
·与SEQ ID NO:8对应的来自人IgG1的野生型CH1恒定域(Kabat第192位的残基是苏氨酸)
连接2个Fab重链的多肽接头，其由
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPGGPPGPGPGGG(SEQ ID NO:2)组成；
·与SEQ ID NO:9对应的西妥昔单抗重链可变区(VH)
·与SEQ ID NO:10对应的来自人IgG1的突变CH1恒定域(Kabat第192位的残基已经从苏氨酸突变为谷氨酸)
·与SEQ ID NO:11对应的来自人IgG1的野生型铰链区
·与SEQ ID NO:12对应的来自人IgG1的野生型CH2域
·与SEQ ID NO:13对应的来自人IgG1的野生型CH3域
因此，本发明的双特异性抗体具有SEQ ID NO:14的连续重链(701个残基)
ii)由SEQ ID NO:15组成的野生型曲妥珠单抗轻链
iii)西妥昔单抗轻链，其具有与SEQ ID NO:16对应的来自人κ的突变恒定域(Kabat位置的残基Ser 114和Asn 137已经分别突变为Ala和Lys)。
本发明的第二双特异性抗体是称为BiXAb2b的抗体，除接头以外，所述抗体由相同的序列构成，所述接头是
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPAPAPAGG(SEQ ID NO:3)。
本发明的第三双特异性抗体是称为BiXAb2c的抗体，除接头以外，所述抗体由相同的序列构成，所述接头是
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPGPAPGGG(SEQ ID NO:4)。
本发明的第四双特异性抗体是称为BiXAb3b的抗体，其具有以下结构：
i)连续重链，所述连续重链包含
·与SEQ ID NO:23对应的阿特珠单抗(Atezolizumab)重链可变区(VH)
(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS)
·与SEQ ID NO:10对应的来自人IgG1的突变CH1恒定域(Kabat第192位的残基已经从苏氨酸突变为谷氨酸)
连接2个Fab重链的多肽接头，其由SEQ ID NO:3组成；
与SEQ ID NO:17对应的达雷木单抗(Daratumumab)重链可变区(VH)
(EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFNSFAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKDKILWFGEPVFDYWGQGTLVTVSS)
·与SEQ ID NO:8对应的来自人IgG1的野生型CH1恒定域(Kabat第192位的残基是苏氨酸)
·与SEQ ID NO:11对应的来自人IgG1的野生型铰链区
·与SEQ ID NO:12对应的人IgG1的野生型CH2域
·与SEQ ID NO:13对应的人IgG1的野生型CH3域
[因此，本发明的重链具有SEQ ID NO:18的连续重链EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVEVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPAPAPAGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFNSFAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKDKILWFGEPVFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK]
ii)阿特珠单抗轻链，其具有与SEQ ID NO:19对应的来自人κ的突变恒定域(Kabat位置处的残基Ser 114和Asn 137已经分别突变为Ala和Lys)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPAVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLKNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
iii)由SEQ ID NO:20组成的野生型达雷木单抗轻链
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
为了比较目的，也产生称为BiXAb3a的抗体，其与BiXAb3b抗体的差异在于由以下组成的接头：
EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG(SEQ ID NO:6)。
本发明的另一种构建体称为Fab-Fab3b；它由与BiXAb3b相同的序列构成，只是重链中缺少铰链、CH2和CH3域。因此，Fab-Fab3b具有SEQ ID NO:21的连续重链
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVEVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPAPAPAGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFNSFAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKDKILWFGEPVFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
为了比较目的，也产生称为Fab-Fab3a的构建体，其由与BiXAb3a相同的序列构成，只是重链中缺少铰链、CH2和CH3域。
下文显示了SEQ ID NO:7至16。
·SEQ ID NO:7
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS
·SEQ ID NO:8
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV
·SEQ ID NO:9
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA
·SEQ ID NO:10
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVEVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV
·SEQ ID NO:11
EPKSCDKTHTCPPCP
·SEQ ID NO:12
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
·SEQ ID NO:13
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
·SEQ ID NO:14
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPGGPPGPGPGGGQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVEVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
·SEQ ID NO:15
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
·SEQ ID NO:16
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPAVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLKNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
基因合成
使用抗HER2(曲妥珠单抗，克隆humAb4D5-8)和抗EGFR(西妥昔单抗)的氨基酸序列以使用GeneScript程序设计针对哺乳动物表达的密码子优化后的DNA序列。对于重链，通过GeneScript合成具有用于限制酶消化的侧翼序列的DNA，它们编码信号肽、Fab1的可变区和恒定CH1域、接着是假铰链接头和Fab2的可变区和恒定CH1域。对于轻链，通过GeneScript合成编码信号肽和可变区和恒定κ区的DNA。
实施使用PfuTurbo Hot Start的PCR反应以扩增***物，然后所述***物对于重链和轻链分别用NotI+ApaI和NotI+HindIII消化。将双重消化的重链片段与已经***有人IgG1CH1+铰链+CH2+CH3域的经NotI+ApaI处理的pcDNA3.1表达载体(Invitrogen)连接。将双重消化的轻链片段与经NotI+HindIII处理的pcDNA3.1表达载体(Invitrogen)连接。通过双链DNA测序验证质粒DNA。
表达和纯化
通过在适应于悬浮液中的无血清培养基(来自Life TechnologiesTM的CHO SFM-II培养基)的CHO-S细胞中以2:3:3＝HC:LC1:LC2摩尔比(1个连续重链(HC)和2个轻链(LC))共转染在分开的载体上编码的3个基因，依靠瞬时基因表达产生本发明的双特异性抗体。通常，对于50mL中等规模表达测试，将总共50μg的质粒DNA(25μg重链1、12.5μg曲妥珠单抗轻链和12.5μg西妥昔单抗轻链)在1.5mL Eppendorf管中混合，添加1mL含有25μL 3mg/mL PEI转染试剂(Polyplus)pH7.0的CHO SFM培养基，在室温温育20分钟。将DNA-PEI的混合物加载到125mL摇瓶中49mL 1-2×106/mL Life Technologies的Invitrogen FreeStyleTM CHO-S细胞中。将细胞再摇动6天。通过以3,000rpm离心细胞15分钟收获上清液。使用FortéBio的蛋白A生物传感器(Systems)测定上清液中BiXAb的表达效价。然后使用MabSelectSuRe(GE Healthcare Life Sciences)在蛋白A亲和介质上纯化双特异性单克隆抗体(BiXAb)。在1M TRIS中进行中和的情况下使用0.1M甘氨酸pH3.5从蛋白A洗脱抗体。将Dulbecco PBS(Lonza BE17-512Q)中的纯化抗体进行无菌过滤(来自Techno PlasticProducts AG的0.2μM无菌滤器)，并使用Eppendorf在280nm处通过OD读数确定终浓度。
SDS-PAGE分析
使用Gel Biorad Stain-Free 4-15％凝胶和相应的运行缓冲液在还原条件和非还原条件下进行电泳。通过将纯化的BiXAb或Fab-Fab抗体与2X SDS样品缓冲液组合并在95℃加热5分钟来制备样品。还原样品的制备包括在加热之前添加NuPAGE还原剂。使用LadderPrecision Plus蛋白质未染色标准品(Biorad)测定表观MW。
大小排阻层析分析
在工程化蛋白分子中经常观察到蛋白质聚集。我们进行了分析大小排阻层析(SEC)来测定我们的抗体的高分子量种类含量。我们采用了SEC-s3000(300x 7.8mm)柱(BioSep)和Aktapurifier 10***(GE Healthcare)；使用PBS缓冲液pH 7.4以1mL/min的流速进行测定法。
BiXAb2b(图3A)、BiXAb3a、BiXAb3b(图3B)、Fab-Fab3a和Fab-Fab3b(图3C)的SEC色谱图证明主峰对应于单体BiXAb和Fab-Fab抗体的预期大小；这些峰占总样品的99.9-100.0％。因此，我们得出结论，含有新接头的抗体不具有高分子量种类。单体峰的窄且对称的形状提示所有BiXAb和Fab-Fab得到正确组装并由单一种类表示。
提供差示扫描量热法表征BiXAb
使用差示扫描量热法(DSC)测试BiXAb2b的热稳定性。使用MicrocalTM VP-毛细管DSC***(Malvern Instruments)进行差示扫描量热法实验。
将样品离心(20,000xg，5分钟，4℃)，并且定量其蛋白质含量，之后采用IgG分析程序，使用Nanodrop ND-1000分光光度计(Thermo Scientific)进行DSC分析。为了测定法，将样品在PBS中稀释至终浓度1mg/mL。
预平衡时间为3分钟，并且得到的热分析图在20和110℃之间以60℃/h的扫描速率、25秒的过滤时段和中等反馈获得。在样品分析前，测量5次缓冲液/缓冲液扫描以稳定仪器，并在每次蛋白质/缓冲液扫描之间进行缓冲液/缓冲液扫描。将数据拟合到非2-态解折叠模型(non-2-state unfolding model)，通过扣除基线来调整转变前和转变后。
DSC结果证明BiXAb2b的DSC概况表现出两个转变。较小的峰具有96Kcal/摩尔/℃的Cp max和71.5℃的Tm1，对应于CH2和Fab域两者的解折叠，并且较大的峰具有190Kcal/摩尔/℃的Cp max和80.5℃的Tm2，对应于CH3域的解折叠。
液相层析/质谱术(LC-MS)分析
使用与Q-Exactive质谱仪(Thermo Fisher Scientific,Bremen,Germany)和Proswift RP-4H反相柱(250mm×1mm；Thermo Fisher)偶联的Dionex Ultimate3000***获得LC-MS/MS数据。柱炉温设定为65℃。注射10微升用于LC分离。以0.2mL/min的流速递送由具有0.1％甲酸的LC-MS级水(A相)和具有0.1％甲酸的乙腈(B相)组成的流动相梯度(总运行时间20分钟)。通过电喷射离子化(ESI)将洗脱的抗体种类引入Q-Exactive仪中，其使用全扫描15,000分辨率以正离子模式运行。使用Xcalibur 2.2软件(Thermo FisherScientific,Bremen,Germany)进行仪器控制和数据文件处理。
图4A和4B分别呈现了Fab-Fab3a(含有具有SEQ ID NO:6的接头)和Fab-Fab3a(含有具有SEQ ID NO:3的接头)的LC-MS分析。图4A证明具有与SEQ ID NO:6对应的接头的Fab-Fab3a的LC-MS谱比相关Fab-Fab3b抗体的LC-MS谱是显著更为异质的，所述相关Fab-Fab3b抗体仅在接头(SEQ ID NO:3)的组成上不同。Fab-Fab3a抗体中的接头序列含有PSTPPTPSPS(SEQ ID NO:22)序列，其存在于人IgA1铰链中，并且已知在2个苏氨酸和2个丝氨酸残基处经受O-连接的糖基化。由于这些位点的糖基化是异质的，产物通常拥有多个糖型，其群体受重组蛋白的表达条件的强烈影响。Fab-Fab3a中N-连接的和O-连接的糖基化位点的总数为至少4，解释了图4A中观察到的复杂MS谱。设计对应于SEQ ID NO:3的接头序列，以减少由于非同质的O-连接的糖基化所致的异质性。因此，接头部分中的几个丝氨酸和苏氨酸残基用甘氨酸残基替换，所述接头部分的序列与已知经历O-连接糖基化的人IgA1铰链序列的该部分序列匹配；另外，在接头中也用甘氨酸替换几个其他丝氨酸和苏氨酸残基。图4B显示含有SEQ ID NO:3接头的Fab-Fab3b的MS谱基本上得到简化；这是因为Fab-Fab3b分析物的复杂性低于Fab-Fab3a分析物，其谱在图4A中呈现。因此，我们得出结论，通过用SEQ ID NO:3接头替换SEQ ID NO:6的接头，从Fab-Fab3b抗体中消除4个O-连接的糖基化位点，产生基本上更同质的BiXAb制剂。
含有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:3接头的双特异性抗体的同质性差异从全长BiXAb抗体的分析看特别明显，所述全长BiXAb抗体是拥有两个接头序列并且因此在BiXAb制剂中拥有增加数目的糖型的对称分子。另外，BiXAb拥有两个N-连接的糖基化位点，在Fc-域的每个重链上一个。BiXAb3a(用SEQ ID NO:6接头构建)和BiXAb3b(用SEQ ID NO:3接头构建)的LC-MS谱分别在图5A和5B中呈现。基于接头序列的差异，BiXAb3a相对于BiXAb3b含有8个额外的O-连接的糖基化位点。BiXAb3a中的大量O-连接糖基化位点解释了图5A中高度复杂的MS谱。这两种BiXAb抗体在Fc域中拥有2个N-糖基化位点，导致促成这两种BiXAb的异质性的另外的糖型，这解释了图5B中观察到的BiXAb3b的残留量的异质性。
序列表
<110> 拜奥穆尼克斯制药
<120> 用于制备多特异性抗体的多肽接头
<130> B2412PC
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(11)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(25)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 1
Glu Pro Lys Xaa Cys Asp Lys Xaa His Xaa Xaa Pro Pro Xaa Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Xaa Xaa Pro Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa
20 25 30
Gly Gly
<210> 2
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 2
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ala Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Gly Gly Pro Pro Gly Pro Gly Pro Gly
20 25 30
Gly Gly
<210> 3
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 3
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ala Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ala Ala Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala
20 25 30
Gly Gly
<210> 4
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 4
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ala Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ala Ala Pro Pro Gly Pro Ala Pro Gly
20 25 30
Gly Gly
<210> 5
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 5
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser
20 25 30
Gly Gly
<210> 6
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 6
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser
20 25 30
Gly Gly
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val
<210> 9
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 10
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Glu Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 12
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100 105 110
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 14
<211> 701
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ala Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Gly Gly Pro Pro Gly Pro Gly Pro Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu
245 250 255
Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile
260 265 270
Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp
275 280 285
Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp
290 295 300
Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser
305 310 315 320
Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser
325 330 335
Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr
340 345 350
Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
355 360 365
Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
370 375 380
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
385 390 395 400
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
405 410 415
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
420 425 430
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Glu Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
435 440 445
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
450 455 460
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
465 470 475 480
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
485 490 495
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
500 505 510
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
515 520 525
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
530 535 540
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
545 550 555 560
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
565 570 575
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
580 585 590
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
595 600 605
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
610 615 620
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
625 630 635 640
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
645 650 655
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
660 665 670
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
675 680 685
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
690 695 700
<210> 15
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 16
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ala Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Lys Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 17
<211> 122
<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 18
<211> 702
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Glu Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Ser Pro Pro Ala Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ala
225 230 235 240
Ala Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu
245 250 255
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
260 265 270
Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe Ala Met Ser Trp Val Arg
275 280 285
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser
290 295 300
Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
305 310 315 320
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
325 330 335
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Lys Asp Lys Ile Leu
340 345 350
Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
355 360 365
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
370 375 380
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
385 390 395 400
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
405 410 415
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
420 425 430
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
435 440 445
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
450 455 460
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
465 470 475 480
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
485 490 495
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
500 505 510
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
515 520 525
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
530 535 540
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
545 550 555 560
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
565 570 575
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
580 585 590
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
595 600 605
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
610 615 620
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
625 630 635 640
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
645 650 655
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
660 665 670
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
675 680 685
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
690 695 700
<210> 19
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ala Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Lys Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 20
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 20
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 21
<211> 475
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Glu Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Ser Pro Pro Ala Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ala
225 230 235 240
Ala Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu
245 250 255
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
260 265 270
Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe Ala Met Ser Trp Val Arg
275 280 285
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser
290 295 300
Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
305 310 315 320
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
325 330 335
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Lys Asp Lys Ile Leu
340 345 350
Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
355 360 365
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
370 375 380
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
385 390 395 400
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
405 410 415
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
420 425 430
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
435 440 445
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
450 455 460
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
465 470 475
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser
1 5 10
<210> 23
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115

Claims (27)

1.多特异性抗原结合片段，其包含至少两个具有不同CH1和CL域的Fab片段，其中每个Fab片段识别感兴趣的不同表位，并且所述Fab片段以任何次序串联排列，第一Fab片段的CH1域的C端末端经由多肽接头与接着的Fab片段的VH域的N端末端连接，
所述多特异性抗原结合片段的特征在于所述多肽接头序列包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：
EPKX1CDKX2HX3X4PPX5PAPELLGGPX6X7PPX8PX9PX10GG(SEQ ID NO:1)，其中X1,X2,X3,X4,X5,X6,X7,X8,X9,X10相同或不同，是任何氨基酸；条件是所述接头序列不包含以下序列或不由以下序列组成：
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG(SEQ ID NO:5)或EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG(SEQ ID NO:6)。
2.多特异性抗体，其具有两个相同的抗原结合臂，每个抗原结合臂由权利要求1的多特异性抗原结合片段组成。
3.权利要求2的多特异性抗体，其具有免疫球蛋白样结构，所述免疫球蛋白样结构包含：
-两个相同的抗原结合臂，每个抗原结合臂由如权利要求1限定的多特异性抗原结合片段组成；
-免疫球蛋白的二聚化CH2和CH3域；
-IgA、IgG或IgD的铰链区，其将所述抗原结合臂的CH1域的C端末端与CH2域的N端末端连接。
4.多特异性抗体，优选双特异性抗体，其包含两条重链和四条轻链，
其中每条重链包含
a.包含铰链-CH2-CH3域的免疫球蛋白的Fc区，
b.所述Fc区通过所述铰链域与抗体1(Ab1)的Fab重链CH1-VH连接，
c.所述Fc区继而通过多肽接头序列与抗体2(Ab2)的Fab重链CH1-VH连接，其中所述多肽接头序列将Ab1的所述Fab重链VH域的N端与Ab2的所述CH1域的C端连接，
且所述四条轻链包含与其关联重链域缔合的Ab1轻链和Ab2轻链；
其中所述多肽接头序列包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：EPKX1CDKX2HX3X4PPX5PAPELLGGPX6X7PPX8PX9PX10GG(SEQ ID NO:1)，
其中X1,X2,X3,X4,X5,X6,X7,X8,X9,X10相同或不同，是任何氨基酸；条件是所述接头序列不包含以下序列或不由以下序列组成：
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG(SEQ ID NO:5)或EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG(SEQ ID NO:6)。
5.权利要求1至4中任一项的多特异性抗原结合片段或多特异性抗体，其中X1,X2和X3相同或不同，是苏氨酸(T)或丝氨酸(S)。
6.权利要求1至4中任一项的多特异性抗原结合片段或多特异性抗体，其中X1,X2和X3相同或不同，是除苏氨酸(T)或丝氨酸(S)以外的任何氨基酸，优选地，其中X1,X2和X3相同或不同，选自下组：Ala(A),Gly(G),Val(V),Asn(N),Asp(D)和Ile(I)。
7.权利要求1至6中任一项的多特异性抗原结合片段或多特异性抗体，其中X4和X5相同或不同，是选自下组的任何氨基酸：丝氨酸(S)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)和甘氨酸(G)。
8.权利要求1至7中任一项的多特异性抗原结合片段或多特异性抗体，其中X6,X7,X8,X9,X10相同或不同，是除苏氨酸(T)或丝氨酸(S)以外的任何氨基酸。
9.权利要求1至8中任一项的多特异性抗原结合片段或多特异性抗体，其中X4是丝氨酸(S)或半胱氨酸(C)。
10.权利要求1至9中任一项的多特异性抗原结合片段或多特异性抗体，其中X5是丙氨酸(A)或半胱氨酸(C)。
11.权利要求1至9中任一项的多特异性抗原结合片段或多特异性抗体，其中X6,X7,X8,X9,X10相同或不同，选自下组：Ala(A),Gly(G),Val(V),Asn(N),Asp(D)和Ile(I)。
12.权利要求11的多特异性抗原结合片段或多特异性抗体，其中X6,X7,X8,X9,X10相同或不同，选自下组：Ala(A)和Gly(G)。
13.权利要求12的多特异性抗原结合片段或多特异性抗体，其中X6和X7是相同的，并且优选选自下组：Ala(A)和Gly(G)。
14.权利要求12的多特异性抗原结合片段或多特异性抗体，其中所述多肽接头序列包含序列或由序列组成，所述序列选自下组：
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPAPAPAGG(SEQ ID NO:3)；
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPGGPPGPGPGGG(SEQ ID NO:2)；
和
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPGPAPGGG(SEQ ID NO:4)。
15.权利要求1至14中任一项的多特异性抗原结合片段或多特异性抗体，其识别EGFR和HER2/neu两者。
16.权利要求4的多特异性抗体，其中Ab1和Ab2是不同的，独立选自下组：在一方面上西妥昔单抗或其突变衍生物和在另一方面上曲妥珠单抗或其突变衍生物。
17.权利要求1至14中任一项的多特异性抗原结合片段或多特异性抗体，其识别CD38和PD-L1两者。
18.多肽，其包含如权利要求1至17中任一项限定的抗原结合片段的重链或多特异性抗体的重链，优选地由如权利要求1至17中任一项限定的抗原结合片段的重链或多特异性抗体的重链组成。
19.多核苷酸，其包含编码权利要求18的多肽的序列。
20.宿主细胞，其用包含权利要求19的多核苷酸的表达载体转染。
21.权利要求20的宿主细胞，其进一步用编码两种不同轻链的至少两种多核苷酸转化：与所述重链的第一VH/CH1区特异性配对的第一轻链；与所述重链的第二VH/CH1区特异性配对的第二轻链。
22.权利要求21的宿主细胞，其另外用编码第三轻链的第三多核苷酸转化，所述第三轻链不同于所述第一和第二轻链，并且与所述重链的第三VH/CH1区特异性配对。
23.用于制备如权利要求1至17中任一项限定的抗原结合片段或多特异性抗体的方法，其中所述方法包括培养权利要求20至22中任一项的宿主细胞，并且从所述培养物回收所述抗原结合片段或抗体。
24.如权利要求1至17中任一项限定的多特异性抗原结合片段或多特异性抗体，其用作药物。
25.如权利要求15至17中任一项限定的多特异性抗原结合片段或多特异性抗体，其用于治疗癌症。
26.多肽，所述多肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：EPKX1CDKX2HX3X4PPX5PAPELLGGPX6X7PPX8PX9PX10GG(SEQ ID NO:1)，
其中X1,X2,X3,X4,X5,X6,X7,X8,X9,X10相同或不同，是如权利要求1至10中任一项限定的任何氨基酸；条件是所述多肽不包含以下序列或不由以下序列组成：
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG(SEQ ID NO:5)或EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG(SEQ ID NO:6)。
27.权利要求26的多肽，所述序列包含选自下组的序列或由选自下组的序列组成：
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPAPAPAGG(SEQ ID NO:3)；
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPGGPPGPGPGGG(SEQ ID NO:2)；
和
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPGPAPGGG(SEQ ID NO:4)。
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