CN102549012B - 纯化白蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
公开了一种改进的纯化白蛋白(或其变体或片段)、含白蛋白(或其变体或片段)的融合蛋白或者含白蛋白(或其变体或片段)的缀合物的方法。
Description
序列表索引
本申请含有计算机可读形式的序列表。该算机可读形式通过提述并入本文。
技术领域
本发明涉及一种用于纯化白蛋白、其变体或片段)，含白蛋白、其变体或片段的融合蛋白，或者含白蛋白、其变体或片段)的缀合物的方法。白蛋白可以是获得自动物或微生物如酵母的血清白蛋白，如人血清白蛋白。
背景技术
白蛋白用于治疗有严重烧伤，休克或失血的病人。它也用于补充培养高等真核细胞的培养基和作为药理学活性化合物(其中许多需要稳定化)的赋形剂。白蛋白融合蛋白是一种蛋白与白蛋白或与其变体或片段的融合体，并且提高所述蛋白的半衰期，如增加的体内半衰期。目前，白蛋白是从血液产品，如血清中获得，或在微生物，如酵母中或由转基因植物或动物重组产生。为了提供足够纯的产品以满足使用者的需要和/或获得高产量的产品，白蛋白必须从生产源中纯化出来。
目前白蛋白产品的一个问题是所需的纯化方法。能够获得高纯度但是这需要多个费时和/或昂贵的层析纯化步骤。例如，WO 2000/044772中描述的纯化方法包括三步骤的方法：阳离子交换层析然后是阴离子交换层析然后是染料结合(亲和)层析。因此，需要一种更简单的纯化方法。
发明内容
本发明提供一种更简单的白蛋白纯化方法。因此本发明涉及一种用于纯化白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物的方法，该方法包括：
(i)用包含白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物的水溶液上样于包含结合在固体支持物上的白蛋白特异性配体的固体基质；
(ii)洗涤所述基质以除去至少一些杂质；并
(iii)从基质上洗脱白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物，获得纯化的白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物。
发明人已鉴定了可以用一种单一亲和步骤代替先前白蛋白纯化中使用的公知的分离步骤，如阳离子交换和染料结合方法，所述单一亲和步骤相对于这些公知步骤提高了不想要的蛋白的清除和/或提高了产量。
在整个本说明书中，术语“白蛋白”包括天然存在的白蛋白、白蛋白相关蛋白和其变体，如天然的或工程化的变体。变体包括多态性，片段如结构域和亚结构域，片段和/或融合蛋白。白蛋白可与SEQ ID No.1具有至少40,50,60,70,80,90,95,96,97,98,99%的相似性或同一性。
附图简述
图1.Prosaptide白蛋白融合体纯化的SDS-PAGE，见实施例2。
图2显示T20白蛋白融合体纯化的SDS-PAGE，见实施例2。
图3显示IL1RA白蛋白融合体纯化的SDS-PAGE，见实施例2。
图4显示AlbuPureTM纯化的动物白蛋白的SDS-PAGE，见实施例8。
图5显示AlbuPureTM纯化的白蛋白片段的SDS-PAGE，见实施例8。
发明详述
本发明涉及一种纯化白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物的方法。在本申请和权利要求中，术语“纯化”意指一种方法，通过该方法至少一种不希望得到的化合物，如细胞碎片、其他血浆或宿主细胞蛋白、盐、脂质碳水化合物等，相对于希望得到的化合物减少了。取决于用于此方法的起始材料，可从希望得到的化合物，白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白中完全地或部分地除去不希望得到的化合物。
作为血浆的最丰富的蛋白质，白蛋白是本领域已知的，人们已经从大量哺乳动物和禽类中描述和表征了白蛋白，并认为其在维持正确的渗透压中具有作用并且其在转运血流中多种化合物中也具有作用。
原则上本发明的方法可用于纯化任何已知白蛋白，例如源自人、狗、绵羊、山羊、牛(bovine)、奶牛(cow)、驴、兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠和鸡(chicken)的白蛋白。优选的白蛋白是人血清白蛋白，尤其是具有SEQ ID NO:1中公开的序列的人血清白蛋白。
本发明所述的白蛋白变体意指具有白蛋白整体结构但与亲本白蛋白相比已改变了至少一个氨基酸残基的化合物。其中亲本白蛋白是理解为天然的未改变的白蛋白化合物。变体可与亲本白蛋白在多于一个位置上不同，而且原则上只要变体保持白蛋白的整体结构，对于改变的数目没有确定的上限，所述改变包括氨基酸残基的取代、缺失或***以及化学修饰。在一个优选实施方案中，与亲本白蛋白相比白蛋白变体包含1个改变，优选地至少2个改变，更优选至少5个改变，更优选至少10个改变，甚至更优选至少20个改变，以及最优选具有至少25个改变。
白蛋白变体与亲本白蛋白优选地具有至少60%的序列同一性，优选地至少70%的序列同一性，更优选至少80%的序列同一性，甚至更优选至少90%的序列同一性，甚至更优选至少95%的序列同一性，最优选与亲本白蛋白具有至少98%的序列同一性。
在一个优选实施方案中，白蛋白或其片段或变体与SEQ ID No.1具有至少40,50,60,70,80,90,95,96,97,98,99%的序列同一性。
同一性：两条氨基酸序列之间或两条核苷酸序列之间的相关性由参数“同一性”来描述。
就本发明而言，两条氨基酸序列之间的同一性的程度是使用如EMBOSS程序包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open SoftwareSuite，Rice等，2000，Trends in Genetics 16：276-277)(优选版本3.0.0或更新的版本)中的Needle程序所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)来确定的。使用的可选参数是：缺口产生罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性，其是如下计算的：
(相同的残基数x100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)。
在描述本发明的多种变体时，应用下述的命名法以便参考。在所有的情况中，应用了公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
取代：对于氨基酸取代，采用了如下的命名法：[原始氨基酸，位置，取代的氨基酸]。因此，苏氨酸在位置226用丙氨酸取代记为“Thr226Ala”或“T226A”。多个位置突变通过加入标记(“+”)分开，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，代表分别在位置205用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)和在位置411用苯丙氨酸(F)取代丝氨酸(S)的突变。
缺失：对于氨基酸缺失，采用了如下命名法：[原始氨基酸，位置*]。因此，在位置195缺失甘氨酸记为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失通过加入标记(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
***：对于氨基酸***，采用了如下的命名法：[原始氨基酸，位置，原始氨基酸，新***的氨基酸]。因此，在位置195的甘氨酸之后***赖氨酸记为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸***记为[原始氨基酸,位置,原始氨基酸,新***的氨基酸#1,新***的氨基酸#2;等等]。例如，在位置195的甘氨酸之后***赖氨酸和丙氨酸记为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。
在此情况下，通过在***的氨基酸残基前的氨基酸残基的位置号添加小写字母而对***的氨基酸残基进行编号。因此，在上一例子中序列为：
| 亲本: | 变体: |
| 195 | 195 195a 195b |
| G | G -K -A |
在一个优选实施方案中，白蛋白变体衍生自具有SEQ ID NO:1所示序列的人血清白蛋白，通过取代、缺失或***至少1个氨基酸残基，优选至少2个氨基酸残基，更优选至少5个氨基酸残基，甚至更优选至少10个氨基酸残基进行。
在另一个优选实施方案中，变体白蛋白由包含源自人血清白蛋白的一部分和源自另一种白蛋白的一部分的杂合白蛋白组成。
具有取代D494N的在(Biochim Biophys Acta.1991,1097:49-54)中公开的具有更低的血浆半衰期的天然变体可以作为变体白蛋白的例子提及。
优选的白蛋白变体包括为了在表面提供一个反应性巯基而在白蛋白中产生的变体，例如在未公布的PCT申请PCT/EP2010/051751(通过提述包括在本申请中)中描述的SEQ ID NO:1的变体：L585C,D1C,A2C,D562C,A364C,A504C,E505C,T79C,E86C,D129C,D549C,A581C,D121C,E82C,S270C,A578C,L595LC,D1DC,A2AC,D562DC,A364AC,A504AC,E505EC,T79TC,E86EC,D129DC,D549DC,A581AC,A581AC,D121DC,E82EC,S270SC,A579AC,C360*,C316*,C75*,C168*,C558*,C361*,C91*,C124*,C169*和C567*，以及在未公布的欧洲专利申请EP09174698.2(通过提述包括在本申请中)中公开的SEQ ID NO:1在位置492,493,494,495和496中改变的变体。
白蛋白片段意欲理解为包含白蛋白分子的一部分但其中缺少白蛋白分子的至少另一部分的分子。片段可包含白蛋白的N端或C端部分或者白蛋白的内部部分，而且它可以甚至由两个或多个在天然白蛋白分子中不直接相连的白蛋白片段组成。结构域I、结构域II、结构域III以及它们其中两者的组合，可作为优选的白蛋白片段的例子。术语“白蛋白片段”也涵盖白蛋白变体的片段。
白蛋白片段可以甚至包括一个白蛋白的一个或多个部分，以及一个或多个不同白蛋白的一个或多个部分，例如，人血清白蛋白的一部分与兔血清白蛋白的另一部分。
白蛋白的片段包括至少10个氨基酸残基，优选地至少25个氨基酸残基，更优选至少50个氨基酸残基，甚至更优选至少100个氨基酸残基，更优选至少200个氨基酸残基，更优选至少300个氨基酸残基，更优选至少400个氨基酸残基，以及最优选至少500个氨基酸残基。
本发明中，术语包含白蛋白或其变体或片段的“融合蛋白”意指包含白蛋白或其变体或片段序列以及一个或多个不同于白蛋白或其变体或片段的序列的多肽。原则上融合蛋白的非白蛋白部分可以为任意多肽，但是，优选的是其具有医药用途。
在融合蛋白的白蛋白部分和非白蛋白部分之间可以或可以不具有接头序列，所述接头可以含有特定蛋白酶的切割位点。
在一个优选实施方案中，融合蛋白的非白蛋白部分是具有医药用途的多肽，例如具有治疗作用的多肽。
WO 9315199，WO 01079271和WO 03059934(通过提述并入本申请)中公开的白蛋白融合多肽可以作为融合蛋白的例子。
本发明中含白蛋白或其变体或片段的缀合物可意指通过将一个或多个缀合配偶体化学附接于白蛋白或其变体或片段上而制备的化合物。缀合配偶体可以是生物活性化合物，如治疗或诊断化合物。治疗化合物可为用于癌症化疗的化疗药物，其可为抑制细胞生长的或细胞毒性的；其可为肿瘤抑制试剂。
缀合配偶体可以使用本领域已知的方法附接于白蛋白或其变体或片段。
WO 2009019314和未公布的欧洲专利申请EP 09174698.2(以提述方式并入)中能够找到合适的缀合配偶体和连接缀合配偶体与白蛋白或其变体或片段的方法的例子。
所述方法中的第一步是提供含有结合于固体支持物的白蛋白特异性配体的固体基质。含有结合到固体支持物上的白蛋白特异性配体的固体基质具有特异地结合白蛋白的能力。所述具有以比其他化合物更高的亲和力结合特定蛋白的能力的基质在本领域中是公知的。
原则上白蛋白特异性配体可为任意对白蛋白具备高亲和力的配体。原则上对白蛋白有特异性的配体可通过以下发现：将候选配体结合于固体支持物，通过使候选配体与白蛋白溶液接触测试亲和力，用不含白蛋白的溶液冲洗配体，随后通过冲洗后附接于候选配体的白蛋白的量评估候选配体结合白蛋白的能力。
优选的白蛋白特异性配体是2-氯-4,6-二(2’-硫代苯胺)-S-三嗪。
原则上固体支持物可以是在预设条件下是惰性的任意固相材料。惰性是指固体支持物与包含白蛋白的水溶液、洗涤溶液、洗脱溶液的组分不发生或仅在不显著程度上发生化学相互作用。
本发明可使用的固体支持物的例子包括聚合物，例如纤维素或琼脂糖及其衍生物、聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酸(酯)类和硅酸盐。
上述的固体支持物和将白蛋白特异性配体结合于固体支持物的方法是本领域公知的，技术人员知晓如何将上述教导应用到本发明中。WO 97/10887中可以发现用于将白蛋白特异性配体结合于固体支持物的优选方法的例子。特别优选的含有结合于固体支持物的白蛋白结合配体2-氯-4,6-二(2’-硫代苯胺)-S-三嗪的固体基质是以商品名‘Albupure TM’由ProMetic BioSciences Ltd,Cambridge,UK可得到的固体基质。
通常地在筒、柱或能够填充固体材料的其他形式容器中填充含有白蛋白结合配体的固体基质作为固定床，而且含有白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物的水溶液，洗涤和洗脱溶液能够流过含有固体基质的固定床，然而，其他公知的技术，如将固体基质与适当的溶液在容器中混合然后是分离步骤(如过滤或离心)，以及流化床技术也可应用于本发明的方法。提供亲和材料如含有白蛋白特异性配体的固体基质的技术是本领域已知的，而且选择并将合适的技术应用于本发明在普通实施者的技术范围内。
原则上含有白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物的水溶液可以是任意如此的溶液。含有白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物的合适水溶液的例子包括：血浆或其级分，能够产生上述蛋白的细胞的细胞培养物的培养物上清液，能够产生上述蛋白的转基因动物的乳和能够产生上述蛋白的转基因植物的提取物。含有白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物的水溶液可为其中生产蛋白的培养基，例如细胞培养物上清液，或者其部分纯化的级分。
待与固体基质接触的含有白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物的水溶液的pH具有4-9.5，优选4-9，更优选4-8，及最优选4.5-8范围内的pH。若水溶液本身不具备上述pH值，通常需要使用公知的pH调节化合物，如用于提高pH的氢氧化钠或氢氧化钾和用于降低pH的盐酸、硫酸或乙酸，来调节pH。
采用公知的技术将含有白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物的水溶液上样到含有白蛋白结合配体的固体基质上。熟练的技术人员可以理解的是可考虑到因素如上样量、上样速率、流动粘度、接触时间等优化上样条件，而且此优化完全在本领域熟练技术人员的技术范围内。
在将含有白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物的水溶液上样到固体基质的过程中，白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物结合于连接于固体基质的白蛋白结合配体。
上样后，洗涤含白蛋白结合配体(其现在结合于白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物)的固体基质以除去杂质。
本发明的杂质意指除包含白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物的水溶液中包含的白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物以外的化合物。杂质可以是化合物，例如蛋白、碳水化合物、脂类、小有机分子、盐类、化学试剂等，而且通常存在多种不同杂质的混合物。
通常用含有水、无机盐和缓冲液体系的水溶液洗涤基质。还可存在额外的化合物如表面活性剂、防腐剂、螯合剂。通常洗涤溶液是本领域已知的并且可用于本发明。在将固体基质置于固定床的情况下，洗涤步骤通常通过用对应于至少1体积固定床，优选至少2体积，更优选至少3体积，最优选至少5体积固定床的洗涤溶液灌注(perfusing)固定床来进行。
洗涤溶液可具有4-9.5，更优选4-9，甚至更优选4-8，及最优选5-8范围内的pH。
洗涤可在一步或多步中进行，其中在每步中用洗涤溶液洗涤固体基质。
优选使用两个或更多个洗涤步骤，其可使用具有相同pH的洗涤溶液或具有不同pH的洗涤溶液进行。在一个优选实施方案中，两个或更多个洗涤步骤的pH是不同的，并且两个或更多个洗涤步骤的pH是连续升高或连续降低的，优选地两个或更多个洗涤步骤的pH是连续升高的。
在连续升高pH的两个或更多个洗涤步骤的实施方案中，第一洗涤步骤的pH优选在pH 4.0-8.0的范围内，优选在pH 4.0-7.0的范围内，更优选在pH 4.0-6.0的范围内。最后洗涤步骤优选在pH 7.0-9.5的范围内，优选在pH8.0-9.5的范围内，最优选在pH 8.5-9.5的范围内。优选地在第一和最后步骤间有至少一个进一步的步骤，如在第一和最后步骤间有1,2,3,4或5步。
洗涤步骤后，用含有脂肪酸的盐或硫氰酸盐的洗脱溶液，或使用具有10.0或更高pH的洗脱溶液，或其任意组合，从固体基质洗脱白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物。
脂肪酸的盐优选是在洗脱条件下在洗脱溶液中具有至少10mM，优选地至少20mM，更优选至少50mM，甚至更优选至少100mM，最优选至少500mM溶解度的脂肪酸的盐。合适的脂肪酸的盐可提及乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸和癸酸的钠盐和钾盐。
在洗脱条件下的脂肪酸的盐的浓度优选在5mM-0.5M的范围内，优选在10mM-100mM的范围内。
原则上根据本发明可使用任意硫氰酸盐，但是，优选使用在洗脱条件下在洗脱溶液中具有至少10mM，优选的至少20mM，更优选至少50mM，甚至更优选至少100mM，甚至更优选至少500mM，最优选至少1M溶解度的硫氰酸盐。此外，优选使用在终产物中具有可接受的阳离子的硫氰酸盐。根据本发明可使用的硫氰酸盐的合适的例子包括：硫氰酸钠和硫氰酸钾。硫氰酸盐优选在洗脱溶液中以5mM-1M范围内，优选10mM-500mM范围内的浓度使用。
洗脱液可进一步包括缓冲液***、盐和防腐剂，优选药用级的。基于本申请和亲和介质领域的教导组成洗脱溶液在普通实施者的技术范围内。
洗脱通常用小体积进行从而以高浓度获得白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物，但另一方面，又希望使用更大体积以获得更大产量。因此，技术人员需要使用公知的优化方法，相对于体积、流速等优化洗脱。
根据本发明的方法，白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物的回收率较高，通常高于25%，优选高于40%，更优选高于50%，更优选高于60%，甚至更优选高于70%，甚至更优选高于80%，最优选高于90%。
本发明的方法可以作为在本发明的方法之前和/或之后涉及一个或多个额外的纯化步骤的更长的纯化流程的一部分，或者它可以无额外步骤而进行。通常，尤其是固体基质是在固定床中提供时，为了从包含白蛋白或其变体或片段、含白蛋白或其变体或片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体或片段的缀合物水溶液中去除特殊材料和/或脂质胶束，优选在本发明的方法前进行分离步骤，否则所述特殊材料和/或胶束可阻塞固定床并使床层的流动性质恶化。
在如下实施例中进一步说明本发明，所述实施例不应被认为以任何方式限制本发明的范围。
实施例
材料：
固体基质：使用含有2-氯-4,6-二(2’-硫代苯胺)-S-三嗪的固体基质，此固体基质可以商品名“Albupure TM”由ProMetic BioSciences Ltd,Cambridge,UK得到。
重组人血清白蛋白(rHSA)：使用含有编码人血清白蛋白的表达质粒的重组酵母的发酵的培养物上清液作为rHSA的来源。表达质粒的产生、转化酵母菌株、发酵条件基本上如WO 00/44772实施例1所公开的。
实施例1：rHSA的两步AlbuPureTM纯化与三步传统纯化的比较
阳离子交换，阴离子交换和染料亲和层析的常规三步纯化方法如WO2000/044772中所述进行。
两步AlbuPureTM纯化通过如下进行：使用乙酸和水调整用于层析的rHSA发酵上清液以实现pH为大约5.3且导电率为大约3mS.cm-1。将用AlbuPureTM基质填充的柱用50mM乙酸钠pH5.3平衡。将相当于20mg rHSA/每mL基质的调整后样品的体积上样。连续用50mM乙酸钠pH5.3、50mM磷酸钠pH6.0、50mM磷酸钠pH7.0和50mM乙酸铵pH8.0洗涤基质，之后用50mM乙酸铵,10mM辛酸钠pH7.0洗脱，并最终用0.5M氢氧化钠再生。将AlbuPureTM洗脱物用水稀释到2.5mS/cm并用乙酸将pH调整到pH 5.5以调整用于阴离子离子交换层析。如WO 2000/044772所述使用DE-FF Sepharose进行阴离子交换层析。由通过GP-HPLC测量的浓度和相关的回到开始时的总量(related backto the total amount at the start)计算白蛋白产量。用抗酵母抗体的夹心法ELISA测量宿主细胞蛋白(HCP)并测量相对于起始材料的清除倍数。
表1：
因此，两步法给出多18%产量(产品)并保持大约相当的HCP水平(在测定法的限度内)。
实施例2：rHSA融合体
用乙酸和水对分别含有prosaptide、T20(PCT/IB03/00434)和IL1RA的C-末端rHSA融合体的酵母来源的培养物上清液进行调整用于层析以实现大约5.3的pH和2.6-3.3mS.cm-1的导电率。将用AlbuPureTM基质填充的1.6cm×11.0cm(22.1mL)柱子用50mM乙酸钠pH5.3平衡。将相当于20mg融合蛋白/每mL基质的调整后样品的体积上样。连续用50mM乙酸钠pH5.3、50mM磷酸钠pH6.0、50mM磷酸钠pH7.0和50mM乙酸铵pH8.0洗涤基质，之后用50mM乙酸铵,10mM辛酸钠pH7.0洗脱，并最终用0.5M氢氧化钠再生。Prosaptide白蛋白融合体纯化的SDS PAGE如图1所示。T20白蛋白融合体纯化的SDS-PAGE如图2所示。IL1RA白蛋白融合体纯化的SDS-PAGE如图3所示。
实施例3：抗FITC(scFv(vHvL)-rHSA-FLAG)抗体
用水对含有抗FITC(scFv(vHvL)-rHSA-FLAG)(EP申请No 09 159 642公开)抗体融合体(N-端融合体)的酵母来源的培养物上清液进行调整用于层析以实现6.2的pH和7.9mS.cm-1的导电率。将用AlbuPureTM基质填充的4.4cm×11.0cm(167.3mL)柱子用50mM磷酸钠pH6.0平衡。将相当于9.5mg蛋白/每mL基质的调整后样品的体积上样。连续用50mM磷酸钠pH6.0、50mM磷酸钠pH7.0和50mM乙酸铵pH8.0洗涤基质，先用50mM乙酸铵，10mM辛酸钠pH7.0然后用50mM乙酸铵，30mM辛酸钠，200mM氯化钠pH7.0洗脱结合的蛋白。基质用0.5M氢氧化钠再生。如通过GP.HPLC估计的，在合并的2洗脱物中回收了总共84%的抗FITC(scFv(vHvL)-rHSA-FLAG)。
实施例4：抗AMA(vNAR-rHSA-FLAG)抗体融合体
含有抗AMA(vNAR-rHSA-FLAG)抗体融合体(N-端融合体)的酵母来源的培养物上清液无需调整，在5.8的pH和47.0mS.cm-1的导电率进行纯化。将用AlbuPureTM基质填充的2.6cm×11.0cm(58.4mL)柱子用50mM磷酸钠pH6.0平衡并将相当于14.25mg蛋白/每mL基质的样品的体积上样。先用50mM磷酸钠pH6.0然后用50mM乙酸铵pH8.0洗涤基质。先用50mM乙酸铵，10mM辛酸钠pH7.0，然后用50mM乙酸铵，30mM辛酸钠，200mM氯化钠pH7.0，最后用含1M硫氰酸钾的磷酸盐缓冲盐水pH8.6洗脱结合的蛋白。基质用0.5M氢氧化钠再生。如通过GP.HPLC估计的，在合并的3洗脱物中回收了总共53%的抗AMA(vNAR-rHSA-FLAG)。
实施例5：在pH范围4.0-10.0中AlbuPure基质上样量(loading)的影响
研究了在pH4.0,5.0,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,9.5和10.0，上样量对分步收率和基质容量的影响。用合适pH增量的缓冲液稀释部分纯化的N-端抗-FITC scFv-rHA融合体至10mg.mL-1来制备上样材料。然后检查每一上样样品的pH，必要时用NaOH或冰醋酸调节。用1mL 50mM乙酸钠pH5.0平衡含有200uL AlbuPureTM基质(ProMetic Biosciences)的5mm直径×10mm床高离心驱动的MediaScoutMiniColumns。每根柱子施加足够的上样材料(1mL)以实现50mg融合蛋白/每mL基质的上样量。先用1mL 50mM乙酸钠pH5.0(洗涤1)，然后用1mL 50mM乙酸铵pH8.0(洗涤2)洗涤每根柱子。然后用1mL50mM乙酸铵，50mM辛酸钠pH8.0洗脱每根柱子。收集所有层析级分并通过凝胶渗透高效液相层析(GP.HPLC)估计scFv-rHA融合体浓度。收率和容量如表2制表和显示。本实例的回收率由结合到柱子的总量(上样量减去穿透物中的量)而不是上样量计算以在此实验中给出更具代表性的结果。容量由结合的量(上样量减去穿透物中的量)除以基质体积(200μL)计算。
表2：上样pH对scFv-rHA融合体回收率和AlbuPure基质容量的影响
数据表明上样pH的4.0-9.5的范围是合适的。
实施例6：不同洗涤pH组合的影响
研究了使用在不同pH增量下的缓冲液组合的洗涤对分步回收率和酵母抗原(YA)清除率的影响。通过解冻并过滤(0.8μm)冻存的N-端抗-FITC scFv-rHA融合体发酵培养物上清液来制备上样材料。不进行进一步调整。用1mL 50mM乙酸钠pH5.0平衡含200μL AlbuPureTM基质(ProMetic Biosciences)的5mm直径×10mm床高离心驱动的MediaScoutMiniColumns。每根柱子施加足够的上样材料(1mL)以实现20mg融合蛋白/每mL基质的上样量。如表2所示洗涤每根柱子。然后用1mL 50mM乙酸铵，50mM辛酸钠pH8.0洗脱每根柱子。收集所有层析级分并通过凝胶渗透高效液相层析(GP.HPLC)估计scFv-rHA融合体浓度。通过酶联免疫测定法(ELISA)估计YA水平。回收率和YA清除率如表3制表和显示。将YA清除率均一化至完全洗涤方案(pH5,6,7&8),如实施例1使用的。
表3：不同的洗涤pH组合对scFv-rHA融合体回收率的影响
数据表明在pH5-pH9的洗涤条件，按任意顺序进行以给出比根据实施例1的阳离子交换更好的回收率和/或酵母抗原(HCP)清除率。在pH10材料被过早洗脱，如下所示在pH4以下也可进行，但如果pH4是洗脱前的最后洗则洗脱时需要小心。
实施例7：不同洗脱条件的影响
研究了多种洗脱液对分步回收率的影响。用50mM乙酸钠pH5.0稀释部分纯化的N-端抗-FITC scFv-rHA融合体至4mg.mL-1来制备上样材料。用1mL50mM乙酸钠pH5.0平衡含有200μL AlbuPureTM基质(ProMetic Biosciences)的5mm直径×10mm床高离心驱动的MediaScoutMiniColumns。每根柱子施加足够的上样材料(1mL)上样以实现20mg融合蛋白/每mL基质的上样量。先用1mL 50mM乙酸钠pH5.0(洗涤1)，然后用1mL 50mM乙酸铵pH8.0(洗涤2)洗涤每根柱子。然后用适宜的缓冲液(表3)洗脱每根柱子。收集所有层析级分并通过凝胶渗透高效液相层析(GP.HPLC)估计scFv-rHA融合体浓度。回收率如表4制表和显示。
表4：不同洗脱液对scFv-rHA融合体回收率的影响
实施例8：白蛋白片段和动物白蛋白
使用AlbuPureTM基质使用单一层析步骤从摇瓶培养物上清液中纯化动物白蛋白和白蛋白片段。将培养物上清液(350mL)施加于用50mM乙酸钠pH5.3平衡的6cm床高、2.0mL填充床。上样后，用50mM乙酸钠pH5.3然后用50mM乙酸铵pH8.0洗涤柱子。用50mM乙酸铵、10mM pH8.0辛酸(盐)pH8.0，50mM乙酸铵、30mM辛酸钠、200mM氯化钠pH7.0，或200mM硫氰酸钾洗脱产品。用0.5M氢氧化钠清洗柱子。AlbuPureTM纯化的动物白蛋白的SDS-PAGE如图4所示。
Claims (26)
1.一种用于纯化白蛋白或其片段、含白蛋白或其片段的融合蛋白或者含白蛋白或其片段的缀合物的方法，所述方法包括：
(i)用含白蛋白或其片段、含白蛋白或其片段的融合蛋白或者含白蛋白或其片段的缀合物的水溶液上样包含结合在固体支持物上的白蛋白特异性配体的固体基质，所述白蛋白特异性配体是2-氯-4,6-二(2’-硫代苯胺)-S-三嗪；
(ii)洗涤所述基质以除去至少一些杂质；并
(iii)从所述基质上洗脱白蛋白或其片段、含白蛋白或其片段的融合蛋白或者含白蛋白或其片段的缀合物，以提供纯化的白蛋白或其片段、含白蛋白或其片段的融合蛋白或者含白蛋白或其片段的缀合物；所述片段选自结构域I、结构域II、结构域III以及它们其中两者的组合；
其中所述白蛋白源自人、兔、小鼠、大鼠、或狗。
2.依照权利要求1所述的方法，其中所述白蛋白是SEQ ID NO:1中公开的序列的人血清白蛋白。
3.依照权利要求1所述的方法，其中所述包含白蛋白或其片段、含白蛋白或其片段的融合蛋白、或者含白蛋白或其片段的缀合物的水溶液选自发酵上清液、血清、转基因原料的乳或者转基因植物的提取物。
4.依照权利要求3所述的方法，其中所述的发酵上清液是部分纯化的发酵上清液。
5.依照权利要求3所述的方法，其中所述血清是血清级分。
6.依照权利要求3所述的方法，其中所述血清是部分纯化的血清。
7.依照权利要求5所述的方法，其中所述血清级分是部分纯化的血清级分。
8.依照权利要求1或权利要求3所述的方法，其中上样到所述基质上的包含白蛋白或其片段、含白蛋白或其片段的融合蛋白或者含白蛋白或其片段的缀合物的水溶液具有4-9.5的pH。
9.依照权利要求8所述的方法，其中上样到所述基质上的包含白蛋白或其片段、含白蛋白或其片段的融合蛋白或者含白蛋白或其片段的缀合物的水溶液具有pH4-9。
10.依照权利要求9所述的方法，其中上样到所述基质上的包含白蛋白或其片段、含白蛋白或其片段的融合蛋白或者含白蛋白或其片段的缀合物的水溶液具有pH4-8。
11.依照权利要求10所述的方法，其中上样到所述基质上的包含白蛋白或其片段、含白蛋白或其片段的融合蛋白或者含白蛋白或其变体的缀合物的水溶液具有4-7的pH。
12.依照权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白包含白蛋白部分和非白蛋白多肽部分。
13.依照权利要求12所述的方法，其中所述非白蛋白多肽具有医药用途。
14.依照权利要求1所述的方法，其中所述洗涤是通过具有连续升高的pH的一次或多次洗涤进行的。
15.依照权利要求14所述的方法，其中第一次洗涤具有在pH4.0-6.0的范围内的pH。
16.依照权利要求14或15所述的方法，其中最后一次洗涤具有在pH7.0-9.0的范围内的pH。
17.依照权利要求14-15任一项所述的方法，其中在第一次和最后一次洗涤步骤之间具有至少一次额外的洗涤步骤。
18.依照权利要求16所述的方法，其中在第一次和最后一次洗涤步骤之间具有至少一次额外的洗涤步骤。
19.依照权利要求1所述的方法，其中使用含有脂肪酸的盐或硫氰酸盐的水溶液，或者在pH 10或更高的条件下，从所述基质上洗脱所述白蛋白或其片段、含白蛋白或其片段的融合蛋白或者含白蛋白或其片段的缀合物。
20.依照权利要求19所述的方法，其中所述的脂肪酸的盐在水中具有大于10mM的溶解度。
21.依照权利要求20所述的方法，其中所述的脂肪酸盐是选自丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸的盐。
22.依照权利要求19-21任一项所述的方法，其中洗脱缓冲液中所述脂肪酸盐的浓度是在5mM-0.5M的范围内。
23.依照权利要求22所述的方法，其中洗脱缓冲液中所述脂肪酸盐的浓度是在10mM-100mM的范围内。
24.依照权利要求19所述的方法，其中所述硫氰酸盐是选自钠、钾、铵、钡或其他1族或2族碱金属的盐。
25.依照权利要求19或24所述的方法，其中所述硫氰酸盐以5mM-1M的范围内的浓度使用。
26.依照权利要求25所述的方法，其中所述硫氰酸盐以10mM-500mM的范围内的浓度使用。
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