CN113474364A - Cd40l拮抗剂及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文提供了一种人CD40L特异性Tn3分子及其治疗用途。

Description

CD40L拮抗剂及其用途
背景技术
CD40/CD40L途径在驱动体液免疫应答中起关键作用，并已与多种自身免疫性疾病的发病机制有关。CD40在包括树突状细胞(DC)、巨噬细胞和B细胞(1)在内的多种抗原呈递细胞上组成型表达，也可以在非造血细胞上表达。
CD40配体CD40L(也称为CD154)的表达受到高度调节，并且主要存在于活化的CD4+T细胞上(2)。B细胞和活化的T细胞之间的CD40/CD40L相互作用对于建立对T-依赖性抗原的有效体液应答是至关重要的(3-5)。CD40/CD40L轴在体外驱动B细胞扩增、分化和同种型转换(6-9)。在体内，CD40信号传导对于生发中心(GC)形成、体细胞超突变以及记忆B细胞和长寿命浆细胞的生成是必需的(10-13)。人类中的CD40或CD40L缺陷会导致X连锁的超免疫球蛋白综合征，这种疾病的特征是同种型类别转换受损，其表现为高水平的血清IgM伴随低至不可检测的IgG、IgA或IgE和对感染的易感性增加(14-16)。
针对CD40L的化合物的临床试验已显示，靶向CD40途径在自身免疫性疾病中具有潜在益处。在一项II期试验中，人源化5c8抗CD40L抗体BG9588显著降低了增殖性狼疮肾炎患者的蛋白尿和抗dsDNA抗体滴度(17)。另外的研究表明，抗CD40L治疗可减少活动性SLE患者中存在的循环CD38hi Ig分泌细胞以及外周GC B细胞(18,19)。还显示抗CD40L单克隆抗体(mAb)治疗可在免疫性血小板减少症(ITP)的患者亚组中诱导深度应答(20)。
尽管已证明抗CD40L mAb治疗在临床试验中具有潜力，但其程序由于不利的血栓栓塞事件已被暂停。尽管没有精确定义，但对这些未曾预料到的安全问题的一种潜在解释是FcγRIIa(或CD32a)在人而不是小鼠血小板上表达(21)。CD40L在活化的血小板上也高度表达(22)，其中抗体介导的同时与相邻细胞上的CD40L和FcγRIIa的结合可能导致血小板聚集。小鼠模型支持FcγRIIa在抗CD40L诱导的血小板减少症中的作用。在人FcγRIIa的转基因小鼠中，抗CD40L mAb引起休克和血小板减少症(23)。在野生型小鼠或注射了不能接合FcγR的无糖基化形式抗体的转基因小鼠中没有观察到这种效果。
为了靶向CD40L，但没有与mAb相关的潜在并发症，产生了CD40L特异性Tn3支架蛋白(24,25)。Tn3蛋白来源于人生腱蛋白C的第三纤连蛋白III型结构域，并可以被工程化以赋予靶标特异性结合特性(26，27)。二价CD40L特异性Tn3蛋白与人血清白蛋白(HSA)的融合产生了能够结合人CD40L并阻止其与CD40受体相互作用的分子，即VIB4920。与CD40L/CD40相互作用中的这种破坏一致，VIB4920能够通过阻断CD40信号传导事件而在体外有效抑制人B细胞的活化和分化。
本领域需要一种新的治疗剂，其可显著影响体液免疫应答并治疗自身免疫和/或炎性病症。本领域还需要在有需要的患者中诱导对替代疗法的免疫耐受性。
现已发现，当施用于患有自身免疫/炎性疾病或障碍的患者时，VIB4920可减轻疾病的临床症状和降低其他标志。特别地，与安慰剂相比，以特定剂量向类风湿性关节炎(RA)受试者施用VIB4920导致类风湿因子(RF)自身抗体的滴度、Vectra DA生物标志评分和通过DAS28-CRP测量的疾病活动在统计学上的显著降低。
发明内容
本说明书提供了一种用于抑制受试者中B细胞和T细胞介导的免疫应答的方法。该方法包括以下步骤：向有需要的受试者施用500mg至3000mg VIB4920的剂量，和抑制B细胞和T细胞介导的免疫应答。
本说明书还提供了一种用于治疗自身免疫性疾病或障碍的方法。该方法包括以下步骤：向有需要的受试者施用500mg至3000mg VIB4920的剂量，从而治疗自身免疫性疾病或障碍。
本说明书进一步提供了一种用于降低正在接受RA治疗的患者的RA疾病活动的量度的方法。该方法包括以下步骤：向患者施用VIB4920，和降低患者中RA疾病活动的量度。降低的RA疾病活动的量度可以包括DAS28-CRP、临床疾病活动指数(CDAI)、压痛关节计数、肿胀关节计数、患者整体评估(patient’s global assessment)或医师整体评估(physician’s global assessment)中的一种或多种。可以以约500mg至3000mg的剂量施用VIB4920。
本说明书还提供了一种用于降低正在接受RA治疗的患者的RF自身抗体的方法。该方法包括以下步骤：以约500mg至3000mg的剂量向患者施用VIB4920，和降低患者的RF自身抗体。
本说明书另外提供了一种用于降低正在接受RA治疗的患者的生物标志评分的方法。该方法包括以下步骤：向患者施用约500mg至3000mg VIB4920，和降低患者的生物标志评分。在这样的方法中，生物标志评分可以是浆细胞(PC)基因标签、Vectra-DA评分或血清C反应蛋白(CRP)水平中的一种或多种。
本说明书还提供了一种用于降低有需要的患者的PC基因标签的方法。该方法包括以下步骤：向有需要的患者施用VIB4920，和降低该患者中的PC基因标签评分。有需要的患者可以是正在接受***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、肌炎、抗磷脂综合征、自身免疫性肝炎、斯耶格伦氏病(Sjogren’s disease)、或其他自身免疫性病症或炎性病症、以及移植和移植物抗宿主病的治疗的患者。可以以约500mg至3000mg的剂量向有需要的患者施用VIB4920。
本说明书进一步提供了一种用于降低正在接受自身免疫性障碍治疗的患者的自身抗体、或降低正在接受移植治疗的患者的同种抗体的方法。该方法包括以下步骤：向有需要的患者施用VIB4920，和降低该患者的自身抗体或同种抗体。在这样的方法中，患者正在接受以存在自身抗体为特征的自身免疫性疾病的治疗，或者患者正在接受治疗以防止移植排斥。以约500mg至3000mg的剂量向患者施用VIB4920。
本说明书还提供了一种用于减轻患者炎症的方法。该方法包括以下步骤：向有需要的患者施用VIB4920，和减轻该患者的炎症。该患者可以是正在接受炎性疾病或障碍的治疗的患者，或者可以是正在接受应答于器官或组织移植的预期炎症的预防性治疗的患者。可以以约500mg至3000mg的剂量施用VIB4920。
本说明书进一步提供了一种诱导患者对替代疗法的免疫耐受性的方法。该方法包括以下步骤：向需要替代疗法的患者施用VIB4920，和诱导该患者对该替代疗法的免疫耐受性。可以以约1000mg至3000mg的剂量施用VIB4920。
附图说明
图1A-1G提供了人CD40L特异性Tn3克隆的生物化学特征，包括VIB4920(一种与HSA融合的二价342克隆)的生物化学特征。图1A示出了如通过Proteon测量的一组人CD40L特异性Tn3克隆抑制CD40-CD40L相互作用的能力。所示的抑制百分比在Tn3浓度范围内。显示了两个重复孔的平均值。图1B示出了抗CD40L Tn3蛋白抑制经由NFkB的CD40L介导的信号传导的能力。在抗CD40L Tn3蛋白存在的情况下，用重组CD40L刺激表达CD40R和NFkB-萤光素酶-报告基因的HEK293细胞过夜。显示了萤光素酶活性的抑制百分比。数据代表两个重复孔的平均值。图1C示出了各种浓度的Tn3构建体对CD86上调的抑制。在与CD40L Tn3蛋白预孵育后，用重组CD40L刺激人PBMC，并通过流式细胞术评估CD86的表达。显示了两个重复孔的平均值。图1D在ELISA测定中测试了指示的Tn3分子抑制CD40-CD40L相互作用的能力。数据代表两个重复孔的平均值。图1E提供了筛选克隆342与一组相关TNF家族成员(包括Fas、TNFα、TNFβ和OX40L)结合的数据。发现克隆342选择性结合CD40L。图1F基于342Tn3的结晶和公开的HSA的晶体结构提出的VIB4920的结构(1)。图1G通过共同的CD40L分子排列的CD40/CD40L和342/CD40L结构的图画演示。以绿色显示CD40L，以品红色显示Tn3，并且以青色显示CD40受体。
图2A-2D提供了人CD40L特异性Tn3克隆342的结构表征。图2A是三聚体342/CD40L结构的图画演示。CD40L的细胞外结构域显示为绿色；342显示为品红色。图2B示出了342和CD40L之间的界面。CD40L和342的片段分别显示为绿色和品红色管。氢键中涉及的氨基酸用短线表示。氢键用具有相关距离
Figure BDA0002992432990000051
的黑色虚线表示。显示了键距离最大为
Figure BDA0002992432990000052
图2C和图2D示出了(图2C)CD40L和(图2D)342CD40L特异性Tn3的相互作用表面的静电表面电势。分子被旋转近90度以显示界面，并且是半透明的以允许可视化氢键中涉及的氨基酸。红色表示带负电的表面，并且蓝色表示正电荷。
图3A-3G示出了在离体研究中VIB4920如何抑制CD40信号传导和人B细胞的活化，但不诱导血小板聚集。图3A显示在用CD40L刺激过夜的工程化HEK29细胞中，VIB4920对NFkB萤光素酶信号的抑制百分比。数据代表两个重复孔的平均值。显示了两项独立研究中的一项。图3B示出了VIB4920和抗CD40L mAb如何能够抑制经刺激的人PBMC的CD86上调。用重组人megaCD40L刺激人PBMC，并在24小时通过流式细胞术测量CD19+/CD86+细胞的百分比。数据代表两个重复孔的平均值。图3C在对照或抗CD40L(mAb或VIB4920Tn3)存在下，用IL-21和megaCD40L刺激人B细胞。在第3天定量了B细胞扩增。虚线表示未刺激的细胞中的ATP水平。显示的数据是三个重复孔的平均值和SD，并代表两个独立的实验。图3D和图3E示出了抗CD40L(mAb或VIB4920 Tn3)对未刺激的(nil)或用IL-21、抗IgM和megaCD40L刺激的人B细胞的作用。在第7天定量了PC数。具体而言，图3D示出了指示分子在第7天对IgD-CD38hi PC在第7天的百分比的作用。图3E示出了在指定浓度下使用指定分子在第7天对PC数的作用。显示的数据是三个重复孔的平均值和SD，并代表两个独立的实验。****＝p<0.0001，通过双尾未配对学生t检验。图3F和图3G示出了抗CD40L(mAb或VIB4920 Tn3)分子对与预先形成的免疫复合物孵育的、洗涤的人血小板的作用；测量血小板聚集或其缺乏12-14分钟。图3F示出了聚集百分比。在指示时，在添加免疫复合物之前，将血小板与抗CD32a抗体预孵育5分钟。二磷酸腺苷(ADP)用作聚集的阳性对照。图3G提供了在血小板与免疫复合物孵育后使用指定浓度的VIB4920(Tn3)或抗CD40L mAb(5c8)的聚集百分比。数据代表两个独立实验。
图4A和4B.小鼠替代物CD40L特异性Tn3应答于免疫在体内显示出有效的中和活性。在图4A和图4B中，在第0天用绵羊红细胞(SRBC)免疫小鼠，并从第9天到第13天每天施用对照或抗CD40L Tn3(M31-MSA)。图4A提供了在第14天通过流式细胞术定量的脾和***中生发中心B细胞的百分比。点代表个体动物，并且数据代表两项独立研究。****＝p<0.0001，通过双尾未配对学生t检验。图4B提供了在第14天从血清中定量的抗绵羊红细胞IgG的产生。数据代表每组四只动物的平均值和SEM(n＝1个研究)。
图5A和5B：1a期临床研究的研究设计，以评估VIB4920在健康志愿者中的安全性。图5A示出了1a期研究的研究队列。图5B提供了1a期研究给药和免疫策略。
图6A和6B：在健康志愿者的1a期研究中，VIB4920显示出有利的PK曲线。图6A示出了在指定的时间点通过ELISA测定的VIB4920的循环水平。虚线代表测定的灵敏度下限。误差条代表平均值的标准偏差，这不是针对具有N＝2个受试者的组计算的。图6B示出了在指定的时间点在所有剂量队列中通过ELISA评估的可溶性CD40L的水平。虚线代表测定的检测下限。
图7：在健康志愿者的1a期研究中，VIB4920以高剂量抑制抗药物抗体(ADA)。通过ELISA测定ADA的存在。每个队列中的每个受试者都用单独的线描绘。具有高ADA(>480中值滴度)的受试者用品红色线表示；具有低ADA(<480中值滴度)的受试者用深蓝色线表示；具有不可检测到的ADA的受试者用浅蓝色线表示。
图8A-8C：VIB4920以剂量依赖性方式在健康人志愿者中抑制B细胞增殖和TDAR。健康志愿者在用安慰剂或VIB4920治疗前14天用KLH免疫，并在给药后15天进行再攻击。图8A提供了健康志愿者在多个时间点和不同VIB4920剂量下的抗KLH IgG滴度。图8B提供了健康志愿者在多个时间点和不同剂量的VIB4920下的抗KLH IgM滴度。通过ELISA测量IgG和IgM滴度。图8C是在第43天抑制抗KLH IgG的剂量响应模型。
图9A-9C：VIB4920在降低健康人受试者的TDAR中抑制B细胞增殖和浆细胞应答。图9A提供了在TDAR测试研究中、在接受安慰剂或高剂量VIB4920的志愿者中、在不同时间点通过流式细胞术定量的循环中增殖B细胞(Ki67+CD19+)的检测频率。图9B提供了在TDAR测试研究中、在接受安慰剂或高剂量VIB4920的志愿者中、在不同时间点通过流式细胞术定量的循环中类别转换记忆B细胞(Ki67+CD19+IgD-CD27+)的检测频率。图9C提供了通过TaqmanPCR评估的全血中的PC标签评分。显示了安慰剂和高剂量VIB4920组的平均值和标准误差表达值。*＝P<0.05，**＝P<0.01相对于安慰剂，通过曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney Utest)。
图10：1b期研究设计，用于评估RA患者中的VIB4920。箭头指示VIB4920或安慰剂的剂量。
图11：VIB4920 1b期临床试验RA患者的队列人口统计学和临床特征。
图12：VIB4920显示出在RA患者中的可接受的安全特征。显示了最常见的TEAE发生于RA受试者的1b期研究中至少2名受试者中。
图13A-13C：VIB4920在RA患者的1b期研究中显示出线性PK和ADA的剂量依赖性降低。图13A提供了在指定的时间点通过ELISA测定的循环VIB4920的浓度。虚线代表测定的灵敏度下限。显示了平均值和平均值的标准误差。图13B提供了在研究中的任何时间点，对于所施用的每种剂量，通过ELISA测定的具有阳性ADA滴度的受试者的百分比。图13C提供了在具有可检测ADA的受试者中通过ELISA测定的随时间的ADA滴度。
图14A-14F：VIB4920降低了RA患者中的疾病指数评分和自身抗体。图14A示出了对于指定剂量的VIB4920或安慰剂，在指示的时间点评估的DAS28-CRP相对于基线的变化(指示平均值和标准误差)。图14B示出了对于指定剂量的VIB4920或安慰剂，在指示的时间点评估的CDAI相对于基线的变化(指示平均值和标准误差)。图14C示出了对于指定剂量的VIB4920或安慰剂，在指示的时间点评估的患者整体评估相对于基线的变化(指示平均值和标准误差)。图14D示出了对于指定剂量的VIB4920或安慰剂，在指示的时间点评估的医师整体评估相对于基线的变化(指示平均值和标准误差)。图14E示出了对于指定剂量的VIB4920或安慰剂，在指示的时间点评估的Vectra DA评分相对于基线的变化(指示平均值和标准误差)。图14F示出了对于每个指定剂量的VIB4920或安慰剂，在指定时间点通过ELISA测量的RF抗体滴度的降低百分比的测量结果。
图15A-15B：VIB4920剂量依赖性地降低RA患者中的DAS28-CRP评分和RF自身抗体。图15A示出了第85天的DAS28-CRP评分在安慰剂与指定剂量的VIB4920之间的差异。显示了线性剂量应答；其被鉴定为用于评估VIB4920剂量与疾病活动降低之间关系的最佳拟合模型。图15B示出了在第85天，在指定剂量的VIB4920下，RF自身抗体相对于安慰剂的降低百分比。显示了Emax模型；其被确定为用于评估VIB4920剂量与RF滴度的关系的最佳拟合。
图16：VIB4920改善了所治疗的RA患者的DAS28类别。显示了第85天的DAS28类别。分别在1000mg和1500mg组中治疗的50％和75％的RA患者在第85天具有低疾病活动或缓解。
图17A-17C：在RA受试者的1b期研究中，VIB4920对压痛/肿胀关节计数和CRP的作用。图17A示出了在指定的剂量和时间点下，RA受试者的压痛关节计数相对于基线的变化。图17B示出了在指定的剂量和时间点下，RA受试者的肿胀关节计数相对于基线的变化。图17C示出了在指定的剂量和时间点下，RA受试者的CRP水平与基线的比率的变化。显示了每个的平均值和标准误差。
图18：VIB4920分子的氨基酸序列。
图19A-19B：克隆342CD40L特异性Tn3分子的氨基酸序列。
图20：二价克隆342CD40L特异性Tn3分子的氨基酸序列。
图21A和21B：克隆309CD40L特异性Tn3分子的氨基酸序列。
图22A-22F：在12周的VIB4920给药时间段和施用最后一次VIB4920剂量后的12周观察期期间，VIB4920降低RA患者疾病指数评分和自身抗体。图22A示出了对于指定剂量的VIB4920或安慰剂，在指示的时间点评估的DAS28-CRP相对于基线的变化(指示平均值和标准误差)。图22B示出了对于指定剂量的VIB4920或安慰剂，在指示的时间点评估的CDAI相对于基线的变化(指示平均值和标准误差)。图22C示出了对于指定剂量的VIB4920或安慰剂，在指示的时间点评估的患者整体评估相对于基线的变化(指示平均值和标准误差)。图22D示出了对于指定剂量的VIB4920或安慰剂，在指示的时间点评估的医师整体评估相对于基线的变化(指示平均值和标准误差)。图22E示出了对于指定剂量的VIB4920或安慰剂，在指示的时间点评估的Vectra DA评分相对于基线的变化(指示平均值和标准误差)。图22F示出了对于每个指定剂量的VIB4920或安慰剂，在指定时间点通过ELISA测量的RF抗体滴度的降低百分比的测量结果。
图23A-23C：VIB4920影响RA患者的压痛/肿胀关节计数和CRP。在RA患者的1b期临床试验中，在给药阶段和给药后12周观察期内均可检测到VIB4920的影响。图23A示出了在指定的剂量和时间点下，RA受试者的压痛关节计数相对于基线的变化。图23B示出了在指定的剂量和时间点下，RA受试者的肿胀关节计数相对于基线的变化。图23C示出了在指定的剂量和时间点下，RA受试者的CRP水平与基线的比率的变化。显示了每个的平均值和标准误差。
具体实施方式
本文描述了VIB4920，及其在用于抑制B细胞介导的免疫应答的方法中、在用于治疗自身免疫性疾病或障碍的方法中、在减轻炎症的方法中、在用于降低患者自身抗体的方法中、在降低患者RA疾病活动度量的方法中、在降低患者RF自身抗体的方法中、在降低患者浆细胞基因标签评分的方法中、以及在诱导患者对替代疗法的免疫耐受性的方法中的用途。
如果使用VIB4920治疗自身免疫性疾病或障碍，可以使用VIB4920治疗斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性艾迪生病、肾上腺自身免疫性疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性***和***、干燥综合征(Sjogren'ssyndrome)、银屑病、动脉粥样硬化、糖尿病和其他视网膜病、晶状体后纤维增生症、老年性黄斑变性、新生血管性青光眼、血管瘤、甲状腺增生(包括格雷夫斯病)、角膜和其他组织移植、和慢性炎症、脓毒症、类风湿性关节炎、腹膜炎、克罗恩氏病、再灌注损伤、败血症、内毒素休克、囊性纤维化、心内膜炎、银屑癣、关节炎(例如银屑病关节炎)、过敏性休克、器官缺血、再灌注损伤、脊髓损伤和同种异体移植物排斥、自身免疫性血小板减少症、***、大疱性类天疱疮、心肌症、乳糜泻-皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、变应性肉芽肿性血管炎、瘢痕性类天疱疮、CREST综合征、冷凝集素病、克罗恩氏病、盘状狼疮、特发性混合性冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、吉兰-巴雷综合征、移植物抗宿主病、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、幼年型关节炎、扁平苔癣、红斑狼疮、美尼尔氏病、混合性结蒂组织病、IgG4介导疾病多发性硬化、1型或免疫介导型糖尿病、重症肌无力、寻常天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺性综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病关节炎、雷诺氏现象、莱特尔氏综合征、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征、僵人综合征、***性红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、ANCA相关血管炎、其他血管炎(例如疱疹样皮炎血管炎)、白癜风、实体器官移植排斥、移植物抗宿主病、肾移植受体中的群体反应性抗体脱敏、胰岛细胞移植和同种异体造血干细胞移植、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)、肾小球肾炎。
更具体地，VIB4920可以用于治疗RA、***性红斑狼疮(SLE)、肌炎、抗磷脂综合征、自身免疫性肝炎、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)、狼疮肾炎、炎性肌病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、***性硬化病、血管炎、皮肤狼疮、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力、IgG4相关疾病、或干燥综合征。此外，VIB4920可用于治疗移植物抗宿主病、和/或减轻或预防器官或组织移植的排斥。
自身免疫性疾病或障碍的治疗可以采取抑制B细胞或T细胞介导的免疫应答的形式，这可能是类别转换抗体的减少、循环B细胞亚群的减少、血浆活动的减少或浆细胞和浆细胞基因标签的减少。自身免疫性疾病或障碍的治疗可以是炎症标志的降低。炎症标志可能是自身抗体水平、浆细胞(PC)或PC基因标签(表征为基因IGHA1、IGJ、IGKC、IGKV4-1和TNFRSF17的表达的标签)、循环B细胞亚群和类别转换抗体中的一种或多种。自身免疫性疾病或障碍的治疗可以是临床体征和症状的减轻，例如通过患者或医师整体评估所测量的那些临床体征和症状的减轻。临床体征和症状可能包括关节炎、疼痛、疲劳、发烧、不适、皮疹、虚弱或器官功能障碍的体征(如蛋白尿或肾功能损失)中的一种或多种。
如果方法是降低正在接受自身免疫性障碍治疗的患者的自身抗体中的一种，则这些自身抗体可以是例如正在接受SLE、干燥综合征、炎性肌病或***性硬化病的治疗的患者的抗核抗体。抗核抗体可以是抗SSA/Ro或抗SSB-La自身抗体(SLE或干燥综合征)、抗dsDNA抗体(SLE)、抗Smith抗体(SLE)、抗拓扑异构酶抗体(***性硬化病)、或抗组蛋白抗体(SLE)中的一种或多种。如果方法是降低正在接受自身免疫性障碍治疗的患者的自身抗体中的一种，则这些自身抗体可以是例如正在接受自身免疫性肝炎治疗的患者的肝肾微粒体1型抗体。如果方法是降低正在接受自身免疫性障碍治疗的患者的自身抗体中的一种，则这些自身抗体可以是例如正在接受重症肌无力治疗的患者的抗烟碱乙酰胆碱受体或抗肌肉特异性激酶抗体。如果方法是降低正在接受移植治疗的患者的抗体中的一种，则这些抗体可以是同种抗体。
降低正在接受自身免疫性障碍治疗的患者的自身抗体可以是将自身抗体的百分比降低至比施用VIB4920之前低至少20％的水平。可以将自身抗体的百分比降低至相对于VIB4920治疗前的自身抗体水平的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、或至少80％的水平。自身抗体的降低可以在开始VIB4920施用的一个月至三个月内实现。
如果自身免疫性疾病或障碍是RA，则类风湿性关节炎治疗可以是降低RF自身抗体、抗瓜氨酸化肽抗体、Vectra DA生物标志评分(Vectra DA生物标志评分是白介素-6、肿瘤坏死因子受体I型、血管细胞粘附分子1、表皮生长因子、血管内皮生长因子A、YKL-40、基质金属蛋白酶1、MMP-3、CRP、血清淀粉样蛋白A、瘦素、和抵抗素的表达水平的复合评分)、浆细胞(PC)标签、血清反应性C蛋白(CRP)、DAS28-CRP、或临床疾病活动指数(CDAI)中的一种或多种的，或者可以是降低压痛关节数、关节压痛强度、肿胀关节数、或关节肿胀强度。如果自身免疫性疾病或障碍是RA，则治疗可以是实现ACR20、ACR50、或ACR70。
自身免疫性疾病或障碍的治疗可表征为相对于用VIB4920治疗之前的水平，疾病或障碍的临床症状减轻、或炎症减轻、或疾病或障碍的生物标志降低至少20％。这些症状或炎症或生物标志中任一种的减少可以是症状或炎症或生物标志相对于开始用VIB4920治疗之前的水平减少至少50％。这种减少可以使得自身免疫性疾病或障碍表征为缓解。
此外，如果自身免疫性疾病或障碍是类风湿性关节炎，则该自身免疫性疾病或障碍的治疗可以将患者的RF自身抗体降低至相对于VIB4920治疗前的RF自身抗体水平的约至少20％、至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少75％、或至少80％的水平。如果自身免疫性疾病或障碍是类风湿性关节炎，则治疗该自身免疫性疾病或障碍可以是DAS28-CRP的降低，并且DAS28-CRP的降低可以使得存在至少-1.2、或至少-1.5、或至少-2.0或至少-2.2的调整平均差。另外，如果自身免疫性疾病或障碍是类风湿性关节炎，则治疗该自身免疫性疾病或障碍可以是Vectra DA生物标志评分的降低，并且该降低可以是至少-10.3、或至少-10.5、或至少-10.8的调整平均差。
如果将VIB4920用于减轻炎症的方法，则该炎症可能由炎性疾病或障碍导致，或者可能是由于或预期为损伤，例如由于器官或组织移植手术。如果将VIB4920用于减轻炎性疾病或障碍中的炎症的方法，则该炎性疾病或障碍可以是炎性肌病、或狼疮肾炎、皮肤狼疮、RA、SLE、ITP、肌炎、干燥综合征、血管炎、***性硬化病、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力或局灶性节段性肾小球硬化症。如果将VIB4920用于减轻炎症的方法，则该炎症可能是由于或预期为损伤，例如由于器官或组织移植手术。
如果将VIB4920用于诱导患者对替代疗法的免疫耐受性的方法，则VIB4920可通过降低患者中针对替代疗法的中和抗体的产生来诱导免疫耐受性。如果患者未接受过替代疗法，或者还没有产生针对替代疗法的中和抗体，则诱导免疫耐受性可以在第一种情况中阻止患者产生针对替代疗法的中和抗体。然而，如果患者产生针对替代疗法的中和抗体，则VIB4920可以通过降低患者产生的针对替代疗法的中和抗体的水平来诱导免疫耐受性。可以将患者针对替代疗法产生的中和抗体水平降低至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或达到不可检测到的水平。患者针对替代疗法的中和抗体的产生水平的降低百分比可以是以下的比较或可以通过比较以下确定：在施用第一剂量的VIB4920之前应答于替代疗法产生的中和抗体的第一水平和在施用第一或第二或第三或第四或第五剂量的VIB4920之后应答于替代疗法产生的中和抗体的第二水平。可替代地，患者针对替代疗法的中和抗体的产生水平的降低百分比可以是以下的比较或可以通过比较以下确定：在施用第一剂量的VIB4920之前应答于替代疗法产生的峰值中和抗体水平和在施用第一或第二或第三或第四或第五剂量的VIB4920之后应答于替代疗法产生的峰值中和抗体水平。
可替代地或另外地，患者针对替代疗法的免疫耐受性诱导可以是针对替代疗法的T细胞应答的降低。如果患者未接受过替代疗法，或者已经接受了替代疗法但尚未对替代疗法产生T细胞免疫应答，则VIB4920可以通过阻止针对替代疗法的初始T细胞应答的形成来降低患者的T细胞应答。然而，如果患者针对替代疗法已有T细胞应答，则VIB4920可以通过降低针对替代疗法的现有T细胞应答来诱导免疫耐受性。可以将针对替代疗法的T细胞应答降低至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或达到不可检测到的水平。患者针对替代疗法的T细胞应答的降低百分比可以是以下的比较或可以通过比较以下确定：在施用第一剂量的VIB4920之前针对替代疗法的第一水平的T细胞应答和在施用第一或第二或第三或第四或第五剂量的VIB4920之后针对替代疗法的第二水平的T细胞应答。可替代地，患者针对替代疗法的T细胞应答的降低百分比可以是以下的比较或可以通过比较以下确定：在施用第一剂量的VIB4920之前针对替代疗法的峰值T细胞应答水平和在施用第一或第二或第三或第四或第五剂量的VIB4920之后针对替代疗法的峰值T细胞应答水平。T细胞应答的降低可以表征为通过替代疗法刺激的CD4+T细胞的增殖和/或刺激的减少。T细胞应答的降低可以表征为针对替代疗法的CD4依赖性CD8+T细胞应答的降低。
诱导免疫耐受性的替代疗法可以是肽或蛋白质替代疗法。如果替代疗法是肽疗法或蛋白质疗法，则它可以是VIII因子或IX因子疗法，并可以施用以治疗患有血友病的患者。如果替代疗法是肽疗法或蛋白质疗法，则它可以是酶替代疗法(ERT)。如果替代疗法是ERT，则该替代疗法可以是阿加糖酶(agalsidase)α或阿加糖酶β，其可以替代α半乳糖苷酶A，并可以治疗患有法布里病的患者。如果替代疗法是ERT，则该替代疗法可以是拉罗尼酶(iaronidase)，其可以替代α-L-艾杜糖苷酶，并且该替代疗法可以治疗患有黏多糖贮积症(MPS)1型(也称为贺勒氏综合征、贺勒氏施艾氏综合征或施艾氏综合征，取决于其严重程度)的患者。如果替代疗法是ERT，则该替代疗法可以是阿葡糖苷酶(alglucosidase)，其可以替代α-葡糖苷酶，并且该替代疗法可以治疗患有庞贝病的患者。如果替代疗法是ERT，则该替代疗法可以是艾杜硫酸酯酶(idursulfase)，其可以替代艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，并且该替代疗法可以治疗患有II型MPS的患者。如果替代疗法是ERT，则该替代疗法可以是伊米苷酶或维拉苷酶α或他利西酶α，其可以替代β-葡糖脑苷脂酶，并且该替代疗法可以治疗患有戈谢病的患者。如果替代疗法是ERT，则该替代疗法可以是Naglazyme芳基硫酸酯酶B，其可以替代N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶，并且该替代疗法可以治疗患有MPS VI的患者。如果肽或蛋白质替代疗法是肽或蛋白质，则免疫耐受性诱导可以在患者中降低针对该肽或蛋白质的中和抗体的产生和/或可以降低针对该肽或蛋白质的T细胞应答。
此外，诱导免疫耐受性的替代疗法可以是包含编码治疗性肽或蛋白质的核酸的病毒载体。如果替代疗法是包含编码治疗性肽或蛋白质的核酸的病毒载体，则该病毒载体可以是腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、痘病毒、甲病毒、单纯疱疹病毒载体或任何其他能够将编码治疗性肽或蛋白质的核酸递送至患者细胞的病毒载体。可以例如通过假型化和/或删除其野生型基因和/或包括编码治疗性肽或蛋白质的核酸来修饰病毒载体。
由病毒载体的核酸编码的治疗性肽或蛋白质可以是治疗性肽或蛋白质因子VIII或因子IX，或者可以是ERT，例如阿加糖酶α、阿加糖酶β、艾杜硫酸酯酶、拉罗尼酶、阿葡糖苷酶α、伊米苷酶、维拉苷酶α、他利西酶α、或Naglazyme芳基硫酸酯酶B。
此外，如果替代疗法是包含编码治疗性肽或蛋白质的核酸的病毒载体，则VIB4920可通过降低对该病毒载体的免疫应答、或通过降低对由该病毒载体编码的治疗性肽或蛋白质或两者的免疫应答来诱导免疫耐受性。VIB4920可通过减少对病毒载体(载体本身或被病毒载体感染的细胞)的中和抗体和/或T细胞应答来诱导对病毒载体的免疫耐受性。另外地或可替代地，VIB4920可通过减少对病毒载体的核酸编码的治疗性肽或蛋白质的中和抗体或T细胞应答来诱导对包含病毒载体的替代疗法的免疫耐受性。
用于各种方法的VIB4920可包含如图18所示的氨基酸序列。VIB4920可以具有如图18所示的氨基酸序列，或可以具有相对于图18所示的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基变化。如果VIB4920具有相对于图18所示的那些的氨基酸序列变化，则这些变化可能针对接头中的一个。VIB4920包含将两个CD40L特异性单体分开的Gly15接头、和将CD40L特异性单体与HSA序列分开的Gly10接头。可以改变这些接头中的两个或一个，并且可以被(GmX)n的氨基酸序列替换，其中X是丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、Leu(L)、异亮氨酸(I)、或缬氨酸(V)；m和n是整数值；m是1、2、3或4；并且n是1、2、3、4、5、6、或7。例如，可以改变一个或两个接头以具有包含GGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGS、GGGGGGGGGG或GGGGGGGGGGGGGGG中一个的氨基酸序列。如果VIB4920具有相对于图18所示氨基酸序列的氨基酸序列，这可能是由于与两个CD40L特异性单体融合的HSA氨基酸序列的一个或多个变化。与两个CD40L特异性单体融合的HSA可以相对于与两个CD40L特异性Tn3单体融合的HSA发生改变，除了在选自由以下组成的组的位置处相对于全长成熟HSA中的位置编号的至少一个氨基酸取代：407、415、463、500、506、508、509、511、512、515、516、521、523、524、526、535、550、557、573、574和580；其中所述至少一个氨基酸取代不包含在位置573处的赖氨酸(K)取代为谷氨酸(E)。如果VIB4920具有相对于图18所示的那些的氨基酸序列变化，这些变化可能针对CD40L特异性Tn3单体中一个或两个的氨基酸序列，只要它不会对VIB4920的体内功效产生不利作用，例如，氨基酸序列的变化使得一个或两个CD40L特异性Tn3单体具有如图19A所示的氨基酸序列。
在方法中施用的VIB4920的剂量可以是约500mg至约3000mg之间的剂量。该剂量可以是在约750mg至约3000mg之间、或约1000mg至约3000mg之间、或约1500mg至约3000mg之间、或约500mg至约2000mg之间、或约750mg至约2000mg之间、或约1000mg至约2000mg之间、或约1000mg至约2500mg之间、或约1000mg至约1500mg之间。该剂量可以是500mg、750mg、900mg、1000mg、1250mg、1500mg、1750mg、2000mg、2250mg、2500mg、或3000mg。
可以约每隔一周施用、或者每月施用两次剂量VIB4920。也可以约每周、或约每月一次施用剂量VIB4920。可以每7天、每10天、每14天、每15天、每16天、每14-10天、每14-16天或每30天施用剂量VIB4920。可以通过静脉内或皮下注射施用剂量VIB4920。
如果施用的VIB4920的剂量为1000mg、1500mg或约1000mg至约1500mg之间中的一种，则可以每隔一周施用、或可以每月施用两次该剂量。如果剂量VIB4920为3000mg，则可以每月施用一次该剂量VIB4920。如果剂量VIB4920为500mg或750mg，则可以每隔一周施用一次、或者可替代地每月施用两次该剂量VIB4920。这些剂量中任一种均可以静脉内施用。
VIB4920的剂量和给药方案可以使得施用VIB4920实现治疗任何自身免疫/炎性疾病或障碍的任何治疗效果，例如，自身抗体降低、Vectra DA评分降低、浆细胞标签降低、CRP降低、DAS28-CRP降低、肿胀关节计数减少、压痛关节计数减少、CDAI降低、患者整体评估改善、医师整体评估改善、ACR20实现、ACR50实现、或ACR70实现，这些可以被认为是“持久的”。VIB4920在自身免疫/炎性疾病或障碍的治疗中的“持久的”作用是在施用VIB4920疗程的最后一个剂量后，VIB4920所实现的治疗效果维持(尽管不再施用VIB4920)至少4周、至少6周、至少8周、至少10周、至少12周、至少16周、至少20周或至少24周。VIB4920的疗程可以是施用500mg至3000mg(例如，500mg、750mg、1000mg、1250mgm 1500mg、1750mg、2000mg、2250mg、2500mg、2750mg或3000mg)的VIB4920剂量，持续约8周至24周(例如，8周、或10周、或12周、或14周、或16周、或18周、或20周、或22周、或24周、或2个月或4个月、或6个月)，给药间隔为每7至31天(例如，每7天、每10天、每14天、每15天、每16天、每14-10天、每14-16天、或每30天)一次。
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实例
实例1-CD40L特异性Tn3蛋白的分离和优化
Tn3是一种小的蛋白质支架，长度约90个氨基酸，其具有免疫球蛋白样折叠，包括在结构上类似于抗体互补决定区的环，可以将其随机化以选择特异性结合特性(24)。
如在WO 2013/055745中详细描述的分离人CD40L特异性Tn3克隆(也参见24，27，50)。简而言之，人CD40L特异性Tn3的选择包括五轮淘选，在重组人CD40L蛋白和表达人CD40L的CHO细胞系的选择之间交替。仅使用重组小鼠CD40L蛋白选择鼠CD40L特异性Tn3蛋白。将来自选择输出的Tn3基因集中克隆到表达载体中，并通过捕获在包被有抗His抗体(2ug/ml于PBS中)的Maxisorp板上来评估各个His标记的变体的CD40L结合。添加生物素化的MegaCD40L(恩佐生物科技公司(Enzo Biosciences)，0.5μg/mL)并孵育1.5小时。用PBS/Tween洗涤一次后，使用SA-HRP(1:1000稀释)监测捕获的Tn3变体与CD40L之间的相互作用。20分钟后，将板在PBS/Tween中洗涤两次，用TMB底物显色，然后用2.5MH3PO4终止。在450nm下测量吸光度。CD40L特异性Tn3蛋白的亲和力成熟是通过从噬菌体展示的文库中选择改善的候选物进行的，其中CDR样环是随机突变的(24)。该策略产生克隆342(图19)(一种人CD40L特异性309的改善变体(图21A))和克隆M31(一种鼠CD40L特异性M13的改善变体)。还制备了另外的人CD40L-Tn3克隆，例如克隆304、311、320、310、321和322。参见，WO 2013/055745，其通过引用并入本文。
表征这组人CD40L特异性Tn3克隆在生物化学抑制CD40L与其受体(CD40)结合中的能力。该组中的所有七个均抑制CD40L与CD40的结合，IC50值低于1μM(图1A)。在基于细胞的报告基因测定中进一步评估在生物化学CD40L-CD40抑制测定法中两种最有效的抑制剂对CD40L介导的信号传导的抑制。用重组人CD40L蛋白刺激表达人CD40和NF-kB-萤光素酶报道基因的HEK-293细胞。人CD40L特异性Tn3蛋白309和311在微摩尔浓度下剂量依赖性地抑制CD40L诱导的NF-kB报道基因表达(图1B)，突出了这些蛋白在功能上抑制CD40/CD40L信号传导的能力。
如在二价抗体的情况下发生的，与多个靶标的同时结合可导致亲合力显著增加。为了探索二价对CD40L特异性Tn3蛋白效力的影响，两个拷贝的相同Tn3模块(309-309；例如，图21B)经由含有间隔子的柔性Gly4Ser连接以形成串联二价融合蛋白。人原代B细胞应答于通过CD40的刺激来上调激活标志CD86。人外周血单核细胞(PBMC)与单价CD40L特异性Tn3 309的预孵育以剂量依赖性方式抑制人CD19+B细胞上CD86的上调(图1C)。令人惊讶的是，与单价Tn3相比，在使用二价构建体的这种原代细胞测定中，效力提高了近1000倍(图1C)。此外，克隆309的亲和力成熟(通过可变CDR样环区域中的随机诱变)导致克隆342，显著提高了对CD40L的结合亲和力(309：190nM；342：1.4nM)，并显示出在抑制CD40-CD40L相互作用中效力提高约300倍(图1D)。还筛选了亲和力成熟的克隆342与一组相关的TNF家族成员(包括Fas、TNFα、TNFβ和OX40L)的结合，并发现其选择性结合CD40L。参见图1E。
最后，与其他替代支架技术一样并且由于其小尺寸，裸Tn3分子在全身施用时预期表现出从循环中非常快速的清除。为了改善蛋白质的药代动力学特性，将CD40特异性Tn3蛋白质与血清白蛋白融合(28，29)。当全身递送时，二价小鼠替代物CD40L特异性Tn3蛋白M13-M13在小鼠中的半衰期<30分钟。小鼠血清白蛋白(MSA)与M13-M13 Tn3蛋白的融合导致血清半衰期延长65倍，并且清除降低345倍(表1)。
表1：与血清白蛋白融合可大大提高M13-M13 Tn3分子的半衰期
分子 M13-M13 M13-M13-MSA
半衰期(天数) 0.02 1.3
Cmax(μg/ml) 10.7 135.8
AUC(μg/天/ml) 0.4 142.1
CL(ml/天/kg) 24305.2 70.4
Vss(ml/kg) 346.5 126.8
5-7周龄CD-1小鼠接受带有或不带有MSA的二价CD40L特异性Tn3分子的单次注射(n＝12/组；10mg/kg，i.v.)。在15分钟至72小时之间的各个时间点，从n＝3只小鼠/组中抽取血液，并通过ELISA测定Tn3蛋白的循环水平。
基于这些观察，二价人CD40L特异性Tn3分子VIB4920由串联的342个CD40L特异性Tn3蛋白组成，为了获得最佳效力，其与人血清白蛋白(HSA)融合，从而改善了半衰期(图1F；图18)。
为了更好地理解CD40L和VIB4920之间相互作用的分子性质，进行了晶体学研究。表达、纯化、共结晶CD40L特异性Tn3(342)和可溶性CD40L蛋白，并以
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分辨率测定结构。与Tn3复合的三聚体可溶性CD40L的分子结构示于图2A。与CD40L的界面由大部分来自Tn3的第二修饰环的氨基酸组成，包括在分子之间形成的十个氢键中的八个(在
Figure BDA0002992432990000212
的距离内，图2B)。分子的初始表征表明342Tn3能够阻断CD40L和CD40之间的相互作用。为了使该作用的细节可视化，将CD40/CD40L复合物的结构与342/CD40L的结构重叠(图1G)。重叠显示342和CD40共享CD40L上的共同结合位点。因此，VIB4920与CD40竞争并阻止其与CD40L的结合。
实例2-VIB4920阻断人B细胞的活化和分化
CD40信号传导已被广泛表征，并涉及多种不同途径和转录因子的活化，包括NF-kB(30)，其可促进B细胞活化、增殖和分化(31)。因此，使用表达人CD40和NF-kB萤光素酶报道基因的细胞系研究VIB4920抑制CD40L介导的NF-kB活化的能力。用重组人CD40L或用表达CD40L的细胞刺激该细胞系来诱导NF-κB活化。VIB4920能够使用该细胞系有效阻断CD40信号传导，如NF-kB活化的剂量依赖性抑制所证明的(IC50：0.899nM；图3A)。
静息B细胞组成性表达低水平的共刺激分子CD86，其在活化(包括通过CD40活化)后迅速上调(32)。用重组人CD40L刺激原代人PBMC，并在16小时后通过流式细胞术评估CD86在B细胞上的表达。VIB4920完全阻止了CD40L介导的原代人B细胞对CD86的上调(图3B)。
实例3-VIB4920在体外不诱导血小板聚集
抗CD40L定向mAb在临床试验中由于安全性问题而失败，这在很大程度上是由于与血小板细胞表面上的交联CD40L有关的血栓栓塞并发症。为了证实缺乏Fc结构域的VIB4920不会诱导血小板聚集，我们在体外评估了其对洗涤的人血小板的影响。如前所述，当与sCD40L预复合时，抗CD40L mAb(人IgG1)显示出诱导血小板聚集的显著能力(图3F)。应答迅速，mAb-sCD40L免疫复合物在8分钟内诱导80％的血小板聚集。重要的是，将血小板与阻断FcγRIIa的抗体(mAb IV.3)预孵育可防止mAb免疫复合物介导的聚集，这与Fc受体在该应答中的重要作用相一致(图3F)。相反，在几种测试浓度下，VIB4920在该测定中均未显示出诱导血小板聚集的倾向(图3G)。这些数据表明，在Tn3构建体中不存在Fc区可以降低临床中用治疗性抗CD40L抗体观察到的血小板聚集和血栓栓塞事件的风险。为证实该结果，来自给药高达300mg/kg VIB4920的非人灵长类动物的长期(7个月)研究的数据(未显示)未鉴定出血小板功能中的不良发现，例如，未鉴定出D-二聚体(以监测血凝块)，PFA100(以评估血小板功能)、或TAT复合物(凝血酶抗凝血酶复合物)测试中的不良发现。
实例4-CD40L特异性Tn3蛋白在体内调节免疫应答
CD40L在促进T依赖性免疫应答中的核心作用已得到充分表征(9，35)。因此，使用T依赖性免疫模型来评估Tn3-MSA融合蛋白在体内阻断体液免疫应答的能力。由于人和鼠CD40L之间的序列同源性不足，因此将CD40L特异性小鼠替代物Tn3 M31用于这些研究。
为了测试Tn3-MSA融合蛋白是否能够在体内阻断免疫应答，给小鼠接种绵羊红细胞(SRBC)，然后在接种后9-13天每天用抗CD40LTn3蛋白进行治疗。在第14天，通过流式细胞术定量脾和***生发中心B细胞来评估所治疗的动物中的免疫应答。如所预期的，在对照治疗的小鼠中用SRBC免疫导致生发中心频率的显著扩大(图4A)。在用CD40L特异性Tn3-MSA融合蛋白治疗的小鼠中观察到了生发中心B细胞频率的剂量依赖性降低(图4A)。在30mg/kg的剂量下，CD40L特异性Tn3-MSA融合蛋白诱导生发中心形成的完全抑制(如通过脾和***中几乎没有生发中心B细胞所评估的)，相当于对照未免疫的小鼠。药物施用不会干扰其他细胞亚群，包括特定的T细胞群体，从而确保观察到的作用不是继发于T细胞耗竭(数据未显示)。另外，抗SRBC IgG水平反映了生发B细胞应答的水平，其中在较高剂量的抗CD40LTn3下，SRBC特异性Ig滴度显著降低(图4B)。实例5-健康志愿者对VIB4920的耐受性良好
在18-49岁健康成人中进行的1a期(Ph1a)研究中，对VIB4920在人体内的安全特性进行了评估。将受试者纳入七个单剂量递增队列，其中VIB4920剂量为至多3000mg，并随机化分配VIB4920或安慰剂(图5A和5B)。如通过治疗-紧急不良事件(TEAE)和治疗-紧急严重不良事件(TESAE)的发生率来测量主要终点、安全性和耐受性。在所有剂量队列中，TEAE通常临床意义不大，最常见的事件包括鼻咽炎(普通感冒)和头痛(表2)。
表2：VIB4920在人体中显示出良好的安全特征
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在健康志愿者的Ph1a研究中至少2名受试者中发生最常见的TEAE
重要的是，具有一种或多种研究产品相关的TEAE的受试者的总体百分比在总VIB4920组(40.9％)和安慰剂(33.3％)之间是相当的。此外，没有发生与输注相关的反应、严重感染或死亡，并且仅报道了一次TESAE，即安慰剂组的胫骨骨折。值得注意的是，在此Ph1a研究中，用VIB4920治疗后未观察到临床上明显的凝血或血小板功能异常。
实例6-VIB4920在健康志愿者中显示出有利的PK/PD曲线。
除了评估VIB4920的安全特征之外，Ph1a研究还评估了药代动力学(PK)和药效动力学(PD)终点。在单次静脉内给药3-3000mg后，VIB4920的PK曲线是线性的，并且以与剂量成比例的方式增加暴露(图6A)。该分子的平均终末半衰期为8天，最高剂量下的半衰期高达10.1+/-1.87天。
CD40L是跨膜蛋白；然而，它可以被活化的T细胞和血小板裂解并脱落。可溶性CD40L(sCD40L)是一种18-KDa三聚体，其在健康的供体中以低水平检测到，并在自身免疫性疾病患者的循环中增加(36，37)。施用VIB4920后对sCD40L水平的测量代表了靶接合的潜在量度，因为与VIB4920结合的sCD40L可以在循环中保留并积累。如所预期的，在施用VIB4920后血浆中总sCD40L存在剂量依赖性增加(图6B)，这表明靶接合。当剂量从3mg增加到3000mg时，达到血浆中最大总sCD40L的时间从11.5天增加到84天，这表明在最高剂量组中靶接合维持时间更长。
实例7-在接受较高VIB4920剂量的健康受试者中观察到ADA降低
生物药物本质上具有高度特异性/选择性；然而，它们是能够引发免疫应答的复合分子。抗药物抗体(ADA)是治疗剂的免疫原性的量度。在健康志愿者中，在接受低剂量VIB4920的绝大多数患者中均检测到ADA(图7)。更具体地说，在3-100mg剂量范围内的20名受试者中，有18名具有可检测的ADA，其中10名表现出高ADA滴度(大于480的中值滴度)。相反，在较高剂量水平的VIB4920下，ADA的频率显著降低(图7)，其中3000mg剂量组中8名受试者中只有1名产生可检测的抗药物滴度。在高剂量的VIB4920下观察到的ADA频率降低支持了该分子的免疫调节能力。另外，低百分比和低滴度的ADA可以转化为具有更好耐受性的、更有效的治疗剂。
实例8-VIB4920在健康志愿者中抑制T细胞依赖性抗体应答
进一步评估了VIB4920影响健康受试者体液免疫应答的能力。通过测定VIB4920对T细胞依赖性抗体应答(TDAR)的作用来进行此评估，该应答是通过用钥孔血蓝蛋白(KLH)免疫而诱导的。所有治疗组中的健康受试者均接受了两次皮下KLH免疫接种：(第一次)在用VIB4920或安慰剂给药前14天，和(第二次)在给药后15天(图5B)。监测针对KLH产生的IgM和IgG抗体直到第113天。
TDAR遵循在安慰剂治疗的受试者中的预期趋势，即趋势包括在第22天(二次免疫后一周)抗KLH IgG滴度急剧增加，在第29天观察到IgG的峰值水平，然后KLH特异性IgG抗体下降直至监测期结束(图8A)。此外，与先前的报道一致，安慰剂治疗组中的二次抗KLH应答以IgG为主，其中在再攻击后检测到KLH特异性IgM总体上有明显更适度的增加(图8B)(38-41)。
如预期的那样，用低剂量VIB4920治疗的健康志愿者的抗KLH滴度接近于安慰剂治疗组的抗KLH滴度。相反，用较高剂量VIB4920治疗的健康志愿者表现出对KLH的二次应答明显降低，使得在第43天，抗KLH IgG从300mg剂量(p＝0.035)开始在统计学上显著降低，并随1,000mg(p＝0.002)和3,000mg(p<0.001)而增加。值得注意的是，在第43天，在1000mg和3000mg队列中，与安慰剂相比，针对KLH的IgG分别降低了78％和86％(图8C)。在最高剂量组中，8名受试者中有7名在第43天具有不可检测到的抗KLH-IgG滴度，这表明VIB4920几乎完全抑制了体液免疫应答。
实例9-通过抑制B细胞增殖和浆细胞应答介导VIB4920免疫抑制
通过在免疫接种前后收集受试者的外周血，并通过流式细胞术表征循环淋巴细胞亚群，可以更好地定义VIB4920抑制二次免疫应答的机制。在安慰剂治疗的健康受试者中，二次免疫诱导B细胞增殖，这通过在访视第22天(即再攻击后7天)检测到循环中Ki67+CD19+B细胞的频率增加来表明(图9A)。
在接受高剂量VIB4920的受试者中，在再攻击之前，增殖B细胞的基线频率与安慰剂治疗组相比降低。这与提出的分子作用机制是一致的。此外，在接受高剂量VIB4920的队列中，免疫后的B细胞增殖应答显著受损，这由缺乏Ki67+B细胞增加所显示。参见攻击后一周的3000mg队列(图9A)。进一步的表型分析显示，在IgD-CD27+同种型转换记忆群体中发现了VIB4920对增殖B细胞的最大影响(图9B)。这些数据与TDAR结果(显示出VIB4920对应答于二次攻击的IgG产生具有抑制作用)一致。
在用KLH二次免疫前后，还对安慰剂或VIB4920治疗的受试者的外周血中的基因表达变化进行了监测。具体而言，浆细胞(PC)基因标签是一种能够检测循环PC频率的甚至细微变化的准确和稳健的标签(42)，被用于确定基因表达的某些变化。与TDAR结果一致，在再攻击后一周，免疫诱导了安慰剂治疗的受试者的全血中PC基因标签评分的显著增加，其在两周返回到基线(图9C)。在最高VIB4920剂量队列(3000mg)中，在用KLH再攻击之前，外周血中PC基因标签评分与安慰剂治疗的受试者相比明显降低(图9C)。重要的是，接受高剂量VIB4920的志愿者在再免疫后PC基因标签评分没有增加。这些数据突出了VIB4920的作用机制，并显示出其抑制B细胞和PC应答的有效能力。
实例10-在RA患者中VIB4920的多剂量施用是安全的并且耐受性良好
已经建立的VIB4920具有可接受的安全特征，并在健康志愿者中显示出机理验证，多次递增剂量、概念证明Ph1b临床研究在患有中度至重度活动性RA的成年患者中进行。RA患者用VIB4920(75mg，n＝8；500mg，n＝10；1000mg，n＝12；或1500mg，n＝12)或安慰剂(n＝15)治疗，通过静脉内(i.v.)输注每隔一周施用，持续12周(图10)。然后在治疗后再观察患者12周。在第12周测量的关键终点包括安全性、耐受性、PK参数、ADA和疾病活动变化(DAS28-CRP)以及另外的生物标志，例如RF自身抗体、血清C反应蛋白(CRP)和Vectra-DA评分。53名患者完成了12周的治疗；2名患者(VIB4920 75mg组中1名，VIB4920 1500mg组中1名)由于不良事件而中断治疗，安慰剂组中1名患者撤回知情同意书，而VIB4920 75mg组中1名患者失去随访。基线时研究群体的主要人口统计学和临床特征在图11中给出。
总体而言，VIB4920通常是安全的，并且具有良好的耐受性，其中在安慰剂和四个活性剂量组之间观察到TEAE平衡分布。报告的最常见的TEAE为腹泻、多汗症、上呼吸道感染和***，各在3例患者中发生(7.1％)。参见图12。没有发现血栓形成不良事件或临床上明显的凝血异常。1例不良事件(优选术语“脑炎”)被报告为严重和危及生命，发生在6剂研究药物后的1500mg剂量组中。未发现病原性感染因子，在中断VIB4920后数月类似症状复发，并且随后患者被诊断为脑转移性黑色素瘤。
实例11-VIB4920在RA患者中显示出线性PK曲线和剂量依赖性降低的ADA
在接受低剂量VIB4920的RA患者中观察到ADA，类似于接受低剂量VIB4920的健康Ph1a研究志愿者。接受75mg VIB4920的8名RA患者中的3名(37.5％)和接受500mg VIB4920的10名RA患者中的3名(30％)发展出ADA(图13B)。在75mg VIB4920剂量组中，8名受试者中有2名在治疗阶段期间发展出可检测的ADA；500mg VIB4920治疗组中的所有3名受试者在治疗后均发展出可检测的ADA(图13C)。在治疗期间，在1000mg剂量组中未检测到ADA；一名受试者在治疗阶段后具有可检测到的ADA。在1500mg剂量组中未检测到ADA(图13B)，这表明VIB4920在较高剂量下有效抑制了ADA应答。
实例12-VIB4920降低RA患者的疾病活动
测定DAS-28/CRP评分以确定VIB4920是否降低1b期临床试验的RA患者中的疾病活动。DAS-28/CRP评分是用于RA的综合临床疾病活动评分，其中考虑到：肿胀关节数、压痛关节数、CRP水平以及患者的整体健康评估。在较高剂量下，VIB4920显著降低了RA患者的DAS28-CRP评分量化的疾病活动(图14A和图22A)。在治疗开始后第12周，DAS28-CRP(SE)自基线的调整平均变化为：VIB49201500mg组为-2.3(0.3)，VIB4920 1000mg组为-2.2(0.3)，VIB4920500mg组为-1.2(0.3)，VIB4920 75mg组为0.1(0.4)，以及安慰剂组为-1.0(0.3)(图14A)。令人惊讶的是，在施用最后一剂VIB4920后，在RA患者中观察到的DAS28-CRP评分降低至少再持续了12周(参见图22A，尤其是访问日113、141和169天)。VIB4920对DAS28-CRP的作用是迅速的，其中在第15天(仅在单剂量药物之后)评分显著降低。
此外，与安慰剂相比，在两种最高剂量的VIB4920下疾病活动的降低具有临床意义和统计学意义；VIB4920 1500mg组的第12周的调整平均差(SE)为-1.4(0.4)，VIB49201000mg组为-1.2(0.4)，p值分别为0.002和0.006。使用线性剂量响应模型，显示出DAS28CRP具有统计学显著的剂量响应(p<0.001)。显著的结果主要来自1000mg和1500mg治疗组；500mg和75mg组相比于安慰剂几乎没有益处或没有益处(图15A)。就个体临床应答而言，1500mg组中75％患者和1000mg剂量组中50％患者在第12周的DAS28-CRP评分为3.2或更低，这表明他们在主要终点处于低疾病活动或临床缓解。参见图16。
实例13-VIB4920降低了RA患者的免疫生物标志和炎性生物标志
使用Vectra DA血液测试来测定VIB4920对免疫和炎性生物标志的作用。VectraDA测试是一种可商购并经过验证的测试，其测量疾病活动的12种生物标志(粘附分子、生长因子、细胞因子、基质金属蛋白酶、骨骼肌蛋白、激素和急性期蛋白)并将其组合为单个评分以评估驱动RA疾病活动的关键机制和途径。在每隔一周施用VIB4920的12周时间段期间(图14E)以及在不再施用VIB4920的12周观察期期间(图22E)，剂量为1500mg和1000mg的VIB4920均显著降低了Vectra DA多生物标志评分。1500mg剂量的VIB4920相对于安慰剂(第12周)的调整平均差为-14.4(-21.5，-7.2)，p＝0.001，并且1000mg剂量的VIB4920相对于安慰剂(第12周)的调整平均差为-10.3(-17.4，-3.3)，p＝0.018(图14E)。
功效结果在该试验中评价的其他终点之间是高度一致的(包括临床疾病活动指数-CDAI、压痛和肿胀关节计数、患者和医师整体评估、和血清CRP水平)，支持1000和1500mg作为该研究中的临床有效剂量(图14B-14D和图17A-17C；还参见图22B-22D和图23A-23C)。
实例14-VIB4920显著降低RA受试者的类风湿因子自身抗体
类风湿因子自身抗体(RF)是针对IgG的Fc部分产生的自身抗体家族。它们在RA中升高并且与不良预后有关。考虑到VIB4920的作用机制，评估了其对RA受试者中自身抗体滴度的影响。值得注意的是，在12周的每隔一周的治疗期间，VIB4920在500、1000和1500mg剂量水平下显著降低了RF滴度(图14F)。此外，令人惊讶的是，在施用最后一剂VIB4920后的整个12周的观察期内，在1000和1500mg剂量水平下维持了降低的RF滴度(图22F)。早在第29天，应答于VIB4920，RF滴度相对于基线的降低是明显的；到第85天，高剂量VIB4920使RF滴度降低约50％。使用Emax模型，VIB4920在RF滴度相对于基线的降低方面显示出统计学上显著的剂量响应(p<0.001)(图15B)。
实例15-方法
NF-kB报告基因测定。
表达NF-kB萤光素酶报告基因的HEK293细胞(潘诺米克公司(Panomics))经过工程化以稳定表达人全长CD40R。将细胞以5x 104个细胞/孔的密度接种在96孔聚-D-赖氨酸包被的板(BD生物科技公司(BD Biosciences))中，并用megaCD40L重组蛋白(1.5ug/ml，恩佐生物科技公司)或过表达CD40L的D1.1 Jurkat亚克隆(ATCC)细胞在对照或CD40L特异性Tn3(在指定浓度下)存在或不存在下刺激16-24小时。使用Bright-Glo萤光素酶测定***(普洛麦格(Promega))在SpectraMax M5酶标仪(美国分子仪器公司(Molecular Devices))上检测发光。
CD86上调测定
在米迪缪尼有限公司审查委员会(MedImmune’s Institutional Review Board)批准的知情同意后，从健康的供体中收集人血。离心后，从CPT管(BD生物科技公司)中分离出外周血单核细胞。在指定的CD40L特异性Tn3或mAb(克隆5c8)存在下，用重组megaCD40L(100ng/ml，恩佐生物科技公司)在96孔圆底板中刺激PBMC(2.5-5.0x 105个细胞/孔)16-18小时。使用流式细胞术来评估CD19+B细胞上的CD86表达。使用以下抗体：CD86(克隆2331，BD制药公司(BD Pharmingen))CD19(克隆HIB19，BD制药公司)。
人B细胞测定
分离PBMC。使用MACS细胞分离技术(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec))对总B细胞进行负选择，其通常产生大于95％的纯度。将纯化的外周血B细胞以每孔0.5至1.0×105个B细胞的密度培养在96孔圆底板中的终体积150μl完全培养基中。用于B细胞实验的培养基是RPMI 1640(英杰公司(Invitrogen))，其补充有10％FCS、青霉素-链霉素(100单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素)、2-巯基乙醇(55μM)、L-谷氨酰胺(2mM)和HEPES(5mM)。在培养开始时，在抗IgM F(ab’)2(5.0μg/ml，杰克逊免疫研究实验室(Jackson ImmunoResearchLaboratories))存在或不存在下，用IL-21(33ng/ml，派普泰克公司(PeproTech Inc.))和megaCD40L(1.5nM，恩佐生物科技公司)的组合刺激B细胞。根据制造商的说明，通过使用细胞滴度-Glo发光测定法(普洛麦格(Promega))在培养的第3天或第4天测量ATP来定量B细胞扩增。在第7天通过流式细胞术定量PC分化。获得固定时间量的细胞，并且将PC定义为CD19+IgD-CD38hi细胞。
鼠SRBC免疫模型
在第0天，将balb/c小鼠(杰克逊实验室(Jackson Laboratories))用0.2ml SRBC(科罗拉多血清公司(Colorado Serum Company))直接从瓶中取出后通过腹膜内注射进行免疫。从第9-13天(静脉内)每天施用对照(30mg/kg)或CD40L-特异性Tn3(如所示，高达30mg/kg)。在第14天通过流式细胞术定量脾中生发中心B细胞的频率。将GC B细胞定义为CD19+B220+Fas+PNA+B细胞。
血小板聚集测定
将来自健康供体的人血收集到含有柠檬酸、右旋糖和钠的ACD溶液B管中。离心后，将三分之二的富含血小板的血浆转移到聚丙烯管中，并与腺苷三磷酸双磷酸酶(2U/ml)孵育10分钟，以防止在处理过程中血小板活化。将血小板沉淀并重悬于改良的Tyrode缓冲液(137mM NaCl、2.7mM KCl、1mM MgCl2、5.6mM右旋糖、3.3mM NaH2PO4、20mM HEPES、0.1％BSA、和pH 7.4)中。
通过在室温下将mAb(h5c8或阴性对照抗体)或抗CD40L Tn3与hCD40L(293细胞来源)混合5分钟来产生免疫复合物(IC)。在某些实验中，在添加IC前，将血小板与抗CD32a抗体(IV.3)预孵育5分钟。根据制造商的说明书，在四通道光学血小板凝集计(型号700，Chrono-Log公司，哈弗敦，宾夕法尼亚州)中在37℃在搅拌下进行血小板聚集测定。在将洗涤的血小板与激动剂混合后，监测光透射12-20分钟。
Ph1a受试者和研究设计
在18-49岁的健康成年人(包括不具有生育能力的女性)中进行I期、随机、盲法、安慰剂对照研究(NCT 02151110)。将受试者随机分成7个剂量队列(3、10、30、100、300、1000或3000mg)，并根据研究方案和剂量递增委员会(DEC)的建议进行顺序给药，该委员会审查了来自当前剂量队列的安全性和耐受性数据以及来自先前剂量队列的累积数据。通过皮下施用两次单独的1mg KLH免疫在受试者中诱导TDAR。第一次KLH免疫在筛选期间施用，即用VIB4920或安慰剂给药之前14天；第二次KLH免疫在用VIB4920或安慰剂给药后的第15天施用。当第5队列(300mg)、第6队列(1000mg)和第7队列(3000mg)中的所有受试者分别在第43天完成时，按照方案进行了三次中期分析。
VIB4920的PK测定
使用验证的夹心ELSA方法测量人K2EDTA血浆中的VIB4920，其中在每次孵育后用1x PBS/0.1％Tween 20(PBST)进行洗涤步骤，以除去未结合的组分。简而言之，将能肯公司(Nunc)微量滴定板在2℃-8℃下用1μg/mL抗VIB4920小鼠单克隆抗体(米迪缪尼有限公司(MedImmune))包被过夜。在添加到板之前，将标准品、质量对照(QC)、和含有VIB4920的样品在0.5％牛血清白蛋白(BSA)/PBST中稀释至1:50的方法最低要求稀释度(MRD)。孵育2小时后，将1μg/mL已用生物素标记的抗VIB4920大鼠抗体(米迪缪尼有限公司)添加到板中并孵育1小时。通过链霉亲和素连接的辣根过氧化物酶(HRP，通用电气医疗集团(GEHealthcare))和SureBlueTM四甲基联苯胺(TMB)过氧化物酶底物(KPL公司(KPL,Inc.))的连续孵育使结合复合物可视化。用0.2M硫酸终止显色，然后在酶标仪上于450nm进行分析。定量范围为0.05至1.60μg/mL；超出定量范围的样品用合并的K2EDTA血浆稀释以使浓度在该方法的可测量范围内。
sCD40L的定量
在筛选期间和第1、2、3、5、8、15、22、29、43、57、85和113天收集血浆样品以测量sCD40L浓度。使用人sCD40L铂ELISA试剂盒(伊生物技术公司(eBioscience))测量人K2EDTA血浆中的总可溶性CD40L(游离的sCD40L和与VIB4920结合的sCD40L)，该试剂盒已进行了改良以满足程序需求并经过鉴定以确保准确性和精密度。简而言之，将标准品、QC和含sCD40L的样品在含有0.5％BSA/PBST和VIB4920的测定稀释液中稀释至1:50的方法MRD，以确保可比和一致的结果。每次孵育后用PBST洗涤，以除去未结合的组分。将稀释的样品添加至用抗sCD40L抗体预先包被的板中，并孵育1.5小时。然后添加HRP缀合的抗人sCD40L以结合被包被抗体捕获的sCD40L。通过连续添加TMB过氧化物酶底物和终止溶液(磷酸)使结合复合物可视化，然后在酶标仪上于450和540nm处进行分析。定量范围为6.25至400.00ng/mL；超出定量范围的样品用合并的K2EDTA血浆稀释以使浓度在该方法的可测量范围内。
ADA的测量
使用验证的夹心ELISA方法测定人K2EDTA血浆中针对VIB4920的ADA的存在，其中在每次孵育后均用PBST洗涤，以除去未结合的组分。简而言之，将QC和样品在含有0.5％BSA/PBST的测定稀释液中稀释至1:60的方法MRD，添加至洗涤的PierceTM蛋白G包被的板(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher))中，并孵育2小时。将在测定稀释液中制备的1μg/mL生物素标记的VIB4920孵育过夜，特异性检测针对VIB4920的ADA。通过链霉亲和素连接的HRP(通用电气医疗集团)和SureBlueTM TMB过氧化物酶底物(KPL公司)的连续孵育使结合复合物可视化。用0.2M硫酸终止显色，然后在酶标仪上于450nm进行分析。对每个样品进行三层处理，其中首先将样品应答与统计确定的截止OD值进行比较，等于该值或高于该值时，样品被视为潜在阳性，而低于该值时，样品被确定为ADA阴性。在excel VIB4920存在下，对潜在阳性样品进行第二次竞争评估；将抑制百分比等于或高于统计确定的确认截点的样品定义为确认阳性，并进行滴度评估。低于确认截点的样品被认为针对VIB4920的ADA呈阴性。将滴定的样品在合并的人K2EDTA血浆中连续稀释至筛选截止值以下，滴度结果报告为在测量阴性之前样品测量为阳性时的最高稀释度的倒数。
抗KLH抗体的评估
使用验证的夹心ELISA方法测量人血清中的抗钥孔血蓝蛋白(KLH)IgG抗体，其中在每次孵育后均用PBST洗涤，以除去未结合的组分；所有步骤均使用100μL体积/孔。简而言之，将能肯公司(Nunc)微量滴定板在2℃-8℃下用在1x PBS(pH 7.2)中制备的3μg/mL KLH(Immucothel，生物合成药品公司(biosyn Arzneimittel GmbH))包被过夜。将标准品和QC(由不同的同种型和亲和力的九种单克隆抗KLH IgG抗体(阿斯利康公司(AstraZeneca))的混合物组成)、以及含有抗KLH抗体的样品在0.5％BSA/PBST中稀释至1:250的方法MRD，然后添加到板中。孵育2小时后，将HRP缀合的小鼠抗人IgG(英杰公司(Invitrogen))添加到板中并孵育1小时以特异性检测抗KLH IgG抗体。通过连续添加TMB过氧化物酶底物和终止溶液(0.2M硫酸)使结合复合物可视化，然后在酶标仪上于450处进行分析。定量范围为163.30至10000.00ng/mL；超出定量范围的样品用血清稀释以使浓度在该方法的可测量范围内。
Ph1a中的流式细胞术
将血液收集在Cytochex BCT管(Streck(Streck))中，运送到科文斯中心实验室服务公司(Covance Central Laboratories Services)(印第安纳州印第安纳波利斯)，并使用验证的方法通过流式细胞术进行测试。简而言之，将细胞用针对CD45(克隆HI30)、CD19(克隆HIB19)、IgD(克隆IA6-2)、CD27(克隆M-T271)和CD38(克隆HIT2，所有BD)的荧光染料标记的抗体染色，以鉴定B细胞群体。随后将细胞用FACSPerm2(BD公司(BectonDickenson))处理，并针对细胞内Ki67(克隆KI67，百进公司(Biolegend))表达进行染色以测量增殖细胞。
PC标签
如先前所述测定PC基因标签(Streicher 2014)。简而言之，使用PAXgene血液RNA试剂盒(凯杰公司(Qiagen))从PAXgene血液管中提取总RNA。对于TaqMan qPCR，使用SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix试剂盒(生命科学技术公司(LifeTechnologies))和随机引物生成cDNA。使用TaqMan Pre-Amp Master Mix试剂盒制备样品，并使用BioMark实时PCR***进行分析。我们使用2个参考基因(β-肌动蛋白和GAPDH)的平均值和每个患者的基线表达水平作为对照来计算ΔΔCt值。通过计算2-ΔΔCt来确定倍数变化值。
Ph1b患者和研究设计
在进入研究前至少6个月，对根据EULAR/ACR标准(Aletaha等人2010)诊断患有RA的18-70岁患者进行Ib期随机、盲法、安慰剂对照研究。受试者具有中度至重度活动，如在筛选时至少3.2的DAS28-CRP评分、和在筛选和随机化时至少4个肿胀关节和4个压痛关节所定义的。筛选时，患者的类风湿因子(RF-IgM≥14单位/mL)或抗瓜氨酸化肽抗体(ACPA)呈阳性。患者以每周7.5-25mg的剂量接受甲氨蝶呤(MTX)，或在MTX不耐受的情况下接受另一种常规DMARD，在筛选前至少12周开始并且以稳定剂量持续至少6周。只要在我们的研究中在随机化前进行适当的冲洗，就可以接受针对RA的生物药剂(利妥昔单抗或其他B细胞耗竭剂除外)进行的先前治疗。患者用安慰剂(n＝15)或VIB4920(75mg，n＝8；500mg n＝10；1000mgn＝12；或1500mg n＝12)治疗，每隔一周i.v.输注给药且持续12周，随后进行12周的治疗后观察。VECTRA-DA评分的测量由科盛生物科技公司(Crescendo Bioscience)(加利福尼亚州旧金山)进行，而RF自身抗体测量由科文斯中心实验室服务公司(新泽西州普林斯顿)进行。
统计分析
在SRBC模型中，使用双尾未配对学生t检验评估治疗对原代人B细胞扩增、血浆分化和GC B细胞应答的影响。使用曼-惠特尼U检验在多个时间点比较VIB4920与安慰剂的基因标签评分(图9C)。使用Graphpad Prism软件进行统计检验和绘图。使用MCP-Mod方法分析第85天的DAS28-CRP和RF相对于基线的变化的剂量响应，包括作为协变量的相应基线，并使用针对剂量响应的三个预先指定的候选模型(线性、Emax和Hill-Emax模型)。针对多重性调整剂量响应信号的测试，以将总体错误率(family-wise error rate)控制在0.10水平。在基于Akaike信息标准指示为显著的那些模型中选择最终模型。使用重复测量的混合模型(MMRM)分析，对DAS28-CRP、RF、Vectra DA、CDAI、压痛关节计数、肿胀关节计数、患者和医师整体评估以及血清CRP相对于基线的变化进行分析，其中包括相应的基线结果作为协变量。
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Claims (122)

1.一种用于在受试者中抑制B细胞介导的免疫应答的方法，该方法包括：
向有需要的受试者施用500mg至3000mg VIB4920之间的剂量；和
抑制该B细胞介导的免疫应答。
2.如权利要求1所述的方法，其中该剂量在1000mg至1500mg VIB4920之间。
3.如权利要求2所述的方法，其中该剂量是1000mg VIB4920。
4.如权利要求2所述的方法，其中该剂量是1500mg VIB4920。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中每14天施用、或每月施用两次该剂量。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中静脉内施用该剂量。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该B细胞介导的免疫应答的抑制是抗体类别转换的降低。
8.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该B细胞介导的免疫应答的抑制是循环B细胞的减少。
9.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该B细胞介导的免疫应答的抑制是浆细胞活性的降低。
10.如权利要求9中任一项所述的方法，其中该浆细胞活性的降低的特征在于浆细胞标签的降低。
11.如权利要求10所述的方法，其中该浆细胞标签的降低的特征在于基因IGHA1、IGJ、IGKC、IGKV4-1、和TNFRSF17的表达的降低。
12.一种用于治疗自身免疫性疾病或障碍的方法，该方法包括：
向有需要的患者施用500mg至3000mg VIB4920之间的剂量；和
治疗该自身免疫性疾病或障碍。
13.如权利要求12所述的方法，其中该剂量在1000mg至1500mg VIB4920之间。
14.如权利要求13所述的方法，其中该剂量是1000mg VIB4920。
15.如权利要求14所述的方法，其中该剂量是1500mg VIB4920。
16.如权利要求12-15中任一项所述的方法，其中每14天施用、或每月施用两次该剂量。
17.如权利要求12-16中任一项所述的方法，其中静脉内施用该剂量。
18.如权利要求12-17中任一项所述的方法，其中治疗该自身免疫性疾病或障碍的特征在于炎症标志的降低。
19.如权利要求18所述的方法，其中这些炎症标志包括自身抗体水平、浆细胞(PC)标签、循环B细胞和抗体类别转换中的一种或多种。
20.如权利要求18所述的方法，其中该治疗是减轻临床症状。
21.如权利要求12所述的方法，其中该自身免疫性疾病或障碍是类风湿性关节炎。
22.如权利要求21所述的方法，其中该治疗是降低以下一种或多种：类风湿因子(RF)自身抗体、Vectra DA生物标志评分、浆细胞(PC)标签、血清反应性C蛋白(CRP)、DAS28-CRP、肿胀关节计数、压痛关节计数、或临床疾病活动指数(CDAI)。
23.如权利要求22所述的方法，其中该治疗是降低类风湿因子自身抗体。
24.如权利要求23所述的方法，其中该RF自身抗体的降低是降低至少50％，且不迟于治疗开始后85天。
25.如权利要求22所述的方法，其中该治疗是降低DAS28-CRP。
26.如权利要求25所述的方法，其中该DAS28-CRP的降低是至少-1.2的调整平均差。
27.如权利要求25所述的方法，其中施用单剂量的VIB4920后可检测到DAS28-CRP的降低。
28.如权利要求22所述的方法，其中该治疗是降低Vectra DA生物标志评分。
29.如权利要求28所述的方法，其中该Vectra DA生物标志评分的降低是至少-10.3的调整平均差。
30.如权利要求12所述的方法，其中该自身免疫性疾病或障碍是***性硬化病、肌炎、抗磷脂综合征、自身免疫性肝炎、狼疮肾炎、特发性血小板减少性紫癜、血管炎、皮肤狼疮、自身免疫性溶血性贫血、斯耶格伦氏病、IgG4相关疾病、或***性红斑狼疮中的一种。
31.如权利要求30所述的方法，其中该治疗是减轻该自身免疫性疾病或障碍的临床症状。
32.如权利要求30所述的方法，其中该治疗是降低PC标签。
33.如权利要求32所述的方法，其中该PC标签的降低的特征在于基因IGHA1、IGJ、IGKC、IGKV4-1、和TNFRSF17的表达的降低。
34.如权利要求30所述的方法，其中该治疗是降低该自身免疫性疾病或障碍的一种或多种生物标志。
35.一种用于降低正在接受类风湿性关节炎(RA)治疗的患者的类风湿性关节炎疾病活动的量度的方法，该方法包括：
向该患者施用VIB4920；
其中该RA疾病活动的量度包括DAS28-CRP、临床疾病活动指数(CDAI)、患者整体评估或医师整体评估中的一种或多种；
其中以约500mg至3000mg之间的剂量施用该VIB4920；和
降低该患者中RA疾病活动的量度。
36.如权利要求35所述的方法，其中以约1000mg至2000mg之间的剂量施用该VIB4920。
37.如权利要求36所述的方法，其中以约1000mg至1500mg之间的剂量施用该VIB4920。
38.如权利要求37所述的方法，其中以约1000mg的剂量施用该VIB4920。
39.如权利要求37所述的方法，其中以约1500mg的剂量施用该VIB4920。
40.如权利要求35-39中任一项所述的方法，其中每14天施用、或每月施用两次该VIB4920。
41.如权利要求35-40中任一项所述的方法，其中静脉内施用该VIB4920。
42.如权利要求35-41中任一项所述的方法，其中该量度是DAS28-CRP并且该降低是至少-1.2的调整平均变化。
43.如权利要求42所述的方法，其中该降低是至少-2.2的调整平均变化。
44.如权利要求35-41中任一项所述的方法，其中该量度是DAS28-CRP，并且在第一剂量的VIB4920后观察到该降低。
45.一种用于降低正在接受类风湿性关节炎治疗的患者的类风湿因子(RF)自身抗体的方法，该方法包括：
以约500mg至3000mg之间的剂量向该患者施用VIB4920；和
降低该患者的RF自身抗体。
46.如权利要求45所述的方法，其中该剂量在约1000mg至约2000mg之间。
47.如权利要求46所述的方法，其中该剂量在约1000mg至约1500mg之间。
48.如权利要求47所述的方法，其中该剂量是约1000mg。
49.如权利要求48所述的方法，其中该剂量是约1500mg。
50.如权利要求45-49中任一项所述的方法，其中每14天施用、或每月施用两次该剂量。
51.如权利要求45-50中任一项所述的方法，其中静脉内施用该剂量。
52.如权利要求45-51中任一项所述的方法，其中该RF自身抗体降低至少40％。
53.如权利要求46-51中任一项所述的方法，其中该RF自身抗体降低至少50％。
54.如权利要求46-53中任一项所述的方法，其中该RF自身抗体降低不迟于治疗开始后85天。
55.一种用于降低正在接受类风湿性关节炎治疗的患者的生物标志评分的方法，该方法包括：
向该患者施用约500mg至3000mg VIB4920，
其中该生物标志评分是浆细胞(PC)基因标签、Vectra-DA评分、或血清C反应蛋白水平(CRP)中的一种或多种；和
降低该患者的生物标志评分。
56.如权利要求55所述的方法，其中该剂量在约1000mg至约2000mg之间。
57.如权利要求56所述的方法，其中该剂量在约1000mg至约1500mg之间。
58.如权利要求57所述的方法，其中该剂量是约1000mg。
59.如权利要求58所述的方法，其中该剂量是约1500mg。
60.如权利要求55-59中任一项所述的方法，其中每14天施用、或每月施用两次该剂量。
61.如权利要求55-60中任一项所述的方法，其中静脉内施用该剂量。
62.如权利要求55-61中任一项所述的方法，其中该生物标志评分是Vectra DA并且该降低是至少-10.3的调整平均差。
63.如权利要求57-61中任一项所述的方法，其中该生物标志评分是血清CRP。
64.一种用于降低有需要的患者的浆细胞(PC)基因标签的方法，该方法包括：
向有需要的患者施用VIB4920，
其中该患者正在接受***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、肌炎、抗磷脂综合征、自身免疫性肝炎或斯耶格伦氏病的治疗，并且
其中以约500mg至3000mg的剂量施用该VIB4920；和
降低该患者的PC基因标签评分。
65.如权利要求64所述的方法，其中该剂量在约1000mg至约2000mg之间。
66.如权利要求65所述的方法，其中该剂量在约1000mg至约1500mg之间。
67.如权利要求66所述的方法，其中该剂量是约1000mg。
68.如权利要求67所述的方法，其中该剂量是约1500mg。
69.如权利要求64-68中任一项所述的方法，其中每14天施用、或每月施用两次该剂量。
70.如权利要求64-69中任一项所述的方法，其中静脉内施用该剂量。
71.一种用于降低正在接受自身免疫性障碍治疗的患者的自身抗体的方法，该方法包括：
向有需要的患者施用VIB4920，
其中该患者正在接受以存在自身抗体为特征的自身免疫性疾病的治疗；和
其中以约500mg至3000mg的剂量施用该VIB4920；和
降低该患者的自身抗体。
72.如权利要求71所述的方法，其中该剂量在约1000mg至约2000mg之间。
73.如权利要求72所述的方法，其中该剂量在约1000mg至约1500mg之间。
74.如权利要求73所述的方法，其中该剂量是约1000mg。
75.如权利要求73所述的方法，其中该剂量是约1500mg。
76.如权利要求71-75中任一项所述的方法，其中每14天施用、或每月施用两次该剂量。
77.如权利要求71-76中任一项所述的方法，其中静脉内施用该剂量。
78.如权利要求71-77中任一项所述的方法，其中该自身免疫性疾病是***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、肌炎、抗磷脂综合征、自身免疫性肝炎或斯耶格伦氏病。
79.一种减轻患者的炎症的方法，该方法包括：
向有需要的患者施用VIB4920，
其中该患者正在接受炎性疾病或障碍的治疗，或者正在接受应答于器官或组织移植的预期炎症的预防性治疗；和
其中以约1000mg至3000mg的剂量施用该VIB4920；和
减轻该患者的炎症。
80.如权利要求79所述的方法，其中该剂量在约1000mg至约2000mg之间。
81.如权利要求80所述的方法，其中该剂量在约1000mg至约1500mg之间。
82.如权利要求79所述的方法，其中该剂量是约1000mg。
83.如权利要求79所述的方法，其中该剂量是约1500mg。
84.如权利要求79所述的方法，其中该剂量是约3000mg。
85.如权利要求79-84中任一项所述的方法，其中每14天施用、或每月施用两次该剂量。
86.如权利要求79-85中任一项所述的方法，其中静脉内施用该剂量。
87.如权利要求84所述的方法，其中每月施用一次该剂量。
88.如权利要求79-87中任一项所述的方法，其中该患者正在接受联合治疗或预防性治疗以防止器官或组织移植的排斥。
89.如权利要求79-87中任一项所述的方法，其中该炎性疾病或障碍是炎性肌病，或是狼疮肾炎、皮肤狼疮、RA、SLE、ITP、肌炎、干燥综合征、血管炎、***性硬化病、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力或局灶性节段性肾小球硬化症。
90.如权利要求21所述的方法，其中该治疗是实现ACR20、ACR50、或ACR70。
91.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中抑制该B细胞介导的免疫应答是持久的。
92.如权利要求12-34或90中任一项所述的方法，其中治疗该自身免疫性疾病或障碍是持久的。
93.如权利要求35-44中任一项所述的方法，其中降低该患者中RA疾病活动的量度是持久的。
94.如权利要求45-54中任一项所述的方法，其中降低该患者的RF自身抗体是持久的。
95.如权利要求55-63中任一项所述的方法，其中降低该患者的生物标志评分是持久的。
96.如权利要求64-70中任一项所述的方法，其中降低该患者的PC基因标签评分是持久的。
97.如权利要求71-78中任一项所述的方法，其中降低该患者的自身抗体是持久的。
98.如权利要求79-89中任一项所述的方法，其中减轻该患者的炎症是持久的。
99.一种诱导患者对替代疗法的免疫耐受性的方法，该方法包括：
向需要替代疗法的患者施用VIB4920，
其中以约1000mg至3000mg的剂量施用该VIB4920；和
在该患者中诱导对该替代疗法的免疫耐受性。
100.如权利要求99所述的方法，其中以约1500mg至3000mg的剂量施用该VIB4920。
101.如权利要求100所述的方法，其中以约2500mg至3000mg的剂量施用该VIB4920。
102.如权利要求101所述的方法，其中以约3000mg的剂量施用该VIB4920。
103.如权利要求99-102中任一项所述的方法，其中约每两周至每四周施用一次该剂量。
104.如权利要求103所述的方法，其中约每四周施用一次该剂量。
105.如权利要求102所述的方法，其中每月施用一次该剂量。
106.如权利要求99、102或105中任一项所述的方法，其中该替代疗法是蛋白质或肽。
107.如权利要求106所述的方法，其中诱导免疫耐受性包括降低患者中针对蛋白质或肽的中和抗体的产生。
108.如权利要求107所述的方法，其中该蛋白质是因子VIII，并且该患者是血友病患者。
109.如权利要求107所述的方法，其中该蛋白质是因子IX，并且该患者是血友病患者。
110.如权利要求108所述的方法，其中诱导免疫耐受性是降低患者的中和抗因子VIII抗体。
111.如权利要求106所述的方法，其中该蛋白质或肽是酶。
112.如权利要求111所述的方法，其中该酶是阿加糖酶α或阿加糖酶β，并且该患者是法布里病患者。
113.如权利要求111所述的方法，其中该酶是艾杜硫酸酯酶，并且该患者是黏多糖贮积症II型或亨特氏综合征患者。
114.如权利要求111所述的方法，其中该酶是拉罗尼酶，并且该患者是黏多糖贮积症I型综合征患者。
115.如权利要求111所述的方法，其中该酶是阿葡糖苷酶α，并且该患者是庞贝病患者。
116.如权利要求99、102或105中任一项所述的方法，其中该替代疗法是包含编码治疗性肽或蛋白质的核酸的病毒载体。
117.如权利要求116所述的方法，其中诱导对该替代疗法的免疫耐受性包括在该患者中降低对病毒载体的免疫应答、降低针对治疗性蛋白质的中和抗体、或两者。
118.如权利要求117所述的方法，其中该病毒载体是腺相关病毒(AAV)。
119.如权利要求118所述的方法，其中诱导免疫耐受性包括降低对AAV的免疫应答。
120.如权利要求119所述的方法，其中对AAV的免疫应答的降低是对AAV的T细胞应答的降低或对AAV的抗体的降低。
121.如权利要求120所述的方法，其中T细胞应答的降低是对AAV衣壳蛋白的T细胞应答的降低。
122.如权利要求117所述的方法，其中诱导对该替代疗法的免疫耐受性包括降低针对治疗性蛋白质的中和抗体。
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