CN101616934A - 抑制dr6结合app的dr6抗体及其在治疗神经学病症中的用途 - Google Patents

Abstract

提供了用于治疗神经学病症(包括阿耳茨海默氏病)的包含DR6拮抗剂的方法和组合物。DR6拮抗剂包括增强哺乳动物神经元细胞或组织的生长、再生或存活的抗APP抗体、抗DR6抗体、DR6免疫粘附素和DR6变体(及其融合蛋白)。

Description

抑制DR6结合APP的DR6抗体及其在治疗神经学病症中的用途

对相关申请的交叉引用

本申请是依据37CFR 1.53(b)(1)提交的非临时申请，依据35USC 119(e)要求2006年12月22日提交的临时申请号60/871,528和2007年2月12日提交的临时申请号60/900,848的优先权，通过述及将其内容收入本文。

发明领域

本发明一般涉及使用DR6拮抗剂治疗神经学病症的方法和在此类方法中有用的DR6拮抗剂组合物，所述DR6拮抗剂例如抑制DR6与其关联配体APP之间的结合。在任选的实施方案中，使用DR6拮抗剂(诸如DR6受体抗体、DR6受体变体、DR6受体免疫粘附素或APP抗体)来治疗神经学病症(包括阿耳茨海默氏病的治疗)。

发明背景

本领域已经鉴定了属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族的多种配体和受体。在这些配体中有肿瘤坏死因子-α(“TNF-α”)、肿瘤坏死因子-β(“TNF-β”或“淋巴毒素-α”)、淋巴毒素-β(“LT-β”)、CD30配体、CD27配体、CD40配体、OX-40配体、4-1BB配体、LIGHT、Apo-1配体(也称作Fas配体或CD95配体)、Apo-2配体(也称作Apo2L或TRAIL)、Apo-3配体(也称作TWEAK)、APRIL、OPG配体(也称作RANK配体、ODF或TRANCE)和TALL-1(也称作BlyS、BAFF或THANK)(参见例如Ashkenazi，Nature Review，2：420-430(2002)；Ashkenaziand Dixit，Science，281：1305-1308(1998)；Ashkenazi and Dixit，Curr.Opin.CellBiol.，11：255-260(2000)；Golstein，Curr.Biol.，7：750-753(1997)；Wallach，Cytokine Reference，Academic Press，2000，pages 377-411；Locksley等，Cell，104：487-501(2001)；Gruss and Dower，Blood，85：3378-3404(1995)；Schmid等，Proc.Natl.Acad.Sci.，83：1881(1986)；Dealtry等，Eur.J.Immunol.，17：689(1987)；Pitti等，J.Biol.Chem.，271：12687-12690(1996)；Wiley等，Immunity，3：673-682(1995)；Browning等，Cell，72：847-856(1993)；Armitage等，Nature，357：80-82(1992)；WO 97/01633，公开于1997年1月16日；WO 97/25428，公开于1997年7月17日；Marsters等，Curr.Biol.，8：525-528(1998)；Chicheportiche等，Biol.Chem.，272：32401-32410(1997)；Hahne等，J.Exp.Med.，188：1185-1190(1998)；WO 98/28426，公开于1998年7月2日；WO 98/46751，公开于1998年10月22日；WO 98/18921，公开于1998年5月7日；Moore等，Science，285：260-263(1999)；Shu等，J.Leukocyte Biol.，65：680(1999)；Schneider等，J.Exp.Med.，189：1747-1756(1999)；Mukhopadhyay等，J.Biol.Chem.，274：15978-15981(1999))。

由这些TNF家族配体介导的多种细胞应答的诱发通常是通过它们与特定细胞受体结合而开始的。在迄今为止已经鉴定的TNF受体超家族成员中包括TNFR1、TNFR2、p75-NGFR、TACI、GITR、CD27、OX-40、CD30、CD40、HVEM、Fas(也称作Apo-1或CD95)、DR4(也称作TRAIL-R1)、DR5(也称作Apo-2或TRAIL-R2)、DR6(也称作TR9，在文献中也称作TNF受体超家族成员21或TNFRSF21)、DcR1、DcR2、护骨蛋白(OPG)、RANK和Apo-3(也称作DR3或TRAMP)(参见例如Ashkenazi，Nature Reviews，2：420-430(2002)；Ashkenazi and Dixit，Science，281：1305-1308(1998)；Ashkenazi and Dixit，Curr.Opin.Cell Biol.，11：255-260(2000)；Golstein，Curr.Biol.，7：750-753(1997)；Wallach，Cytokine Reference，Academic Press，2000，pages 377-411；Locksley等，Cell，104：487-501(2001)；Gruss and Dower，Blood，85：3378-3404(1995)；Hohman等，J.Biol.Chem.，264：14927-14934(1989)；Brockhaus等，Proc.Natl.Acad.Sci.，87：3127-3131(1990)；EP 417,563，公开于1991年3月20日；Loetscher等，Cell，61：351(1990)；Schall等，Cell，61：361(1990)；Smith等，Science，248：1019-1023(1990)；Lewis等，Proc.Natl.Acad.Sci.，88：2830-2834(1991)；Goodwin等，Mol.Cell.Biol.，11：3020-3026(1991)；Stamenkovic等，EMBO J.，8：1403-1410(1989)；Mallett等，EMBO J.，9：1063-1068(1990)；Anderson等，Nature，390：175-179(1997)；Chicheportiche等，J.Biol.Chem.，272：32401-32410(1997)；Pan等，Science，276：111-113(1997)；Pan等，Science，277：815-818(1997)；Sheridan等，Science，277：818-821(1997)；Degli-Esposti等，J.Exp.Med.，186：1165-1170(1997)；Marsters等，Curr.Biol.，7：1003-1006(1997)；Tsuda等，BBRC，234：137-142(1997)；Nocentini等，Proc.Natl.Acad.Sci.，94：6216-6221(1997)；vonBulow等，Science，278：138-141(1997)；Johnson等，Cell，47：545-554(1986)；Radeke等，Nature，325：593-597(1987)；Pan等，FEBS Lett.，431：351-356(1998))。

大多数这些TNF受体家族成员共享细胞表面受体的典型结构，包括胞外区、跨膜区和胞内区，而其它成员则天然发现是缺少跨膜和胞内结构域的可溶性蛋白质。典型TNFR的胞外部分包含从NH2-末端起始的多个富含半胱氨酸结构域(CRD)的重复氨基酸序列样式。

关于TNF受体和配体家族的综述一般参见例如Wallach，CytokineReference，Academic Press，2000，页377-411；Locksley等，Cell，104：487-501(2001)；Ware，Cytokine&Growth Factor Reviews，14：181-184(2003)；Liu等，Immunity，15(1)：23-34(2001)；及Bossen等，J Biol Chem.281(20)：13964-71(2006)。

称作DR6受体(在文献中也称作“TR9”；在文献中也称作TNF受体超家族成员21或TNFRSF21)的TNFR家族成员已经被描述为I型跨膜受体，其具有四个胞外富含半胱氨酸的基序和一个胞质死亡结构域结构(Pan等，FEBSLett.，431：351-356(1998)；还可参见美国专利6,358,508；6,667,390；6,919,078；6,949,358)。已经报道了DR6在某些转染细胞系中的过表达导致凋亡及NF-kB和JNK二者的活化(Pan等，FEBS Letters，431：351-356(1998))。在DR6缺陷小鼠模型中，T细胞在JNK活化方面受到实质性损伤，而且在用蛋白质抗原攻击DR6(-/-)小鼠时，发现它们的T细胞过度增殖并展现出通向Th2应答的深刻极化(而Th1分化没有受到同等影响)(Zhao等，J.Exp.Med.，194：1441-1448(2001))。还报道了在体外对DR6的靶向破坏导致增强的T辅助细胞2(Th2)分化(Zhao等，见上文)。DR6拮抗剂或拮抗剂在调控B细胞介导的疾患中的各种用途记载于2005年3月31日公布的US 2005/0069540。

DR6受体可能在调节OVA诱导的小鼠哮喘模型中的气道炎症中发挥作用(Venkataraman等，Immunol.Lett.，106：42-47(2006))。

使用髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG(35-55))诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎模型，发现与野生型(WT)同窝出生者相比，DR6-/-小鼠对CNS疾病的发作和进展二者高度有抗性。如此，DR6可能牵涉调节实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导和进展中的白细胞浸润和功能(Schmidt等，J.Immunol.，175：2286-2292(2005))。

虽然已经鉴定了多个TNF配体和受体家族成员具有各式各样的生物学活性和特性，但是很少的此类配体和受体有报道牵涉神经学相关功能。例如，2004年8月26日公布的WO2004/071528记载了在鼠模型中抑制CD95(Fas)配体/受体复合物来治疗脊髓损伤。

发明概述

在本发明的实施方案中，提供了分离的死亡受体6(“DR6”)拮抗剂。本文中所公开的拮抗剂的某些实施方案抑制或阻断DR6与一种或多种其关联配体之间的相互作用。在优选的实施方案中，本文中所公开的DR6拮抗剂抑制或阻断DR6与其关联配体淀粉状蛋白前体蛋白(“APP”)之间的相互作用。DR6拮抗剂的实施方案可包括抗体，诸如DR6或APP抗体。此类DR6拮抗性抗体可以是例如单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或人抗体。在本发明的某些实施方案中，DR6拮抗剂可包括抗DR6抗体，其结合DR6胞外结构域多肽或其片段，且任选可结合包含图1A氨基酸1-349或42-349的DR6多肽。或者，DR6拮抗剂可包括抗APP抗体，其结合APP多肽，且任选的是可结合包含图1B(SEQ ID NO：6)氨基酸66-81的APP多肽。DR6拮抗剂还包括DR6免疫粘附素、DR6变体、DR6片段、其共价修饰形式、或其融合蛋白，以及小分子拮抗剂。举例而言，DR6拮抗剂可包括PEG化DR6或融合至异源序列(诸如表位标签、抗体片段(诸如人Fc)、或亮氨酸拉链)的可溶性胞外结构域形式DR6。

本发明的例示性实施方案还包括抑制或阻断DR6对APP的结合的方法，包括在DR6对APP的结合受到抑制的条件下将DR6多肽和/或APP多肽暴露于一种或多种DR6拮抗剂。在此类方法中所使用的典型DR6拮抗剂包括结合DR6或APP的抗体，以及可溶性DR6多肽。任选的是，通过观察抑制DR6与APP之间的结合的能力来选择这些方法中所使用的DR6拮抗剂。在本发明的某些实施方案中，使用此类方法来例如在体外组织培养中抑制神经元细胞的凋亡和/或增强神经元细胞的生长和/或存活。所述方法涵盖使用单一类型的DR6拮抗剂分子或两种或更多类型的DR6拮抗剂的组合。

本发明的实施方案还提供了用于增强哺乳动物中的神经元细胞或组织的生长或再生或存活的方法，包括对哺乳动物施用有效量的DR6拮抗剂。在任选的实施方案中，DR6拮抗剂的施用在所述哺乳动物中增强神经元细胞或组织的生长并阻断神经元细胞或组织的细胞死亡和变性(degeneration)。神经元细胞或组织可包括例如运动神经元、感觉神经元、连合神经元、轴突、小胶质、和/或少突胶质细胞。在本发明的有些实施方案中，此类方法中所使用的DR6拮抗剂可包括结合APP并抑制其结合DR6的能力的抗体。在本发明的其它实施方案中，此类方法中所使用的DR6拮抗剂可包括结合DR6并抑制其结合APP的能力的抗体。或者，DR6拮抗剂可包括DR6免疫粘附素、连接至非蛋白质性质聚合物(其选自下组：聚乙二醇、聚丙二醇、和聚氧化烯)的DR6多肽、或DR6多肽变体。所述方法中所采用的DR6免疫粘附素可包含融合至免疫球蛋白Fc区的可溶性DR6受体。另外，本发明的DR6拮抗剂可包括小分子。

本发明的实施方案还提供了用于治疗神经学病症的方法，包括对哺乳动物施用有效量的DR6拮抗剂。在任选的实施方案中，所述方法包括治疗哺乳动物中的阿耳茨海默氏病。此类方法中所使用的DR6拮抗剂可包括结合APP并抑制其结合DR6的能力的的抗体。DR6拮抗剂还可包括DR6抗体。或者，DR6拮抗剂可包括DR6免疫粘附素、连接至非蛋白质性质聚合物(其选自下组：聚乙二醇、聚丙二醇、和聚氧化烯)的DR6多肽、DR6抗体或DR6变体。所述方法中所采用的DR6免疫粘附素可包含融合至免疫球蛋白Fc区的可溶性DR6受体。所述方法中所采用的抗DR6抗体可结合包含图1A氨基酸1-349或42-349的DR6受体。

本发明的实施方案还包括用于诊断患有神经学病症的或对神经学病症易感的患者的方法，包括自所述患者获取样品并对所述样品测试具有与SEQID NO：1之DR6多肽序列不同的多肽序列的DR6多肽变体的存在。典型的是，在此类方法中，所述多肽变体被鉴定为具有与对SEQ ID NO：1之DR6多肽序列观察到的亲和力不同的对APP多肽的亲和力。

本发明的实施方案还提供了用于鉴定抑制DR6对APP的结合的感兴趣分子的方法。此类方法可包括在存在或不存在感兴趣分子的情况中组合DR6和APP；然后检测在存在所述感兴趣分子的情况中对DR6结合APP的抑制。任选的是，使用在细胞表面上表达DR6的哺乳动物细胞实施此类方法；并进一步包括检测对DR6活化或信号传导的抑制。本发明的实施方案进一步包括通过此类方法鉴定的分子。任选的是，感兴趣分子是结合APP的抗体、结合DR6的抗体或可溶性DR6多肽。

本发明的实施方案还提供了能够特异性结合APP配体、DR6受体和/或能够调控与DR6和/或其配体和/或共受体(co-receptor)有关的生物学活性、且在各种神经学病症的治疗中有用的抗体。在具体的实施方案中，提供了特异性结合DR6多肽的胞外结构域序列的抗体(在下文实施例中有进一步描述)。典型的抗体是那些结合APP或DR6的和对抑制DR6与APP之间的结合的能力进行了进一步选择的。任选的是，抗体是单克隆抗体。任选的是，单克隆抗体包括由分别以编号PTA-8095、PTA-8094、或PTA-8096保藏于ATCC的杂交瘤分泌的3F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7抗体。

还提供了结合与分别以ATCC编号PTA-8095、PTA-8094、或PTA-8096保藏的杂交瘤细胞系生成的3F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7单克隆抗体所结合表位相同的表位的抗体。一方面，本发明关注显示至少与抗体3F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7相同的对DR6的亲和力和/或展现出至少与抗体3F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7相同的生物学活性和/或效力的抗DR6抗体，包括3F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7抗体。

在其它具体的实施方案中，提供了生成单克隆抗体3F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7且分别以编号PTA-8095、PTA-8094、或PTA-8096保藏于ATCC的杂交瘤细胞系，及由分别以编号PTA-8095、PTA-8094、或PTA-8096保藏于ATCC的杂交瘤分泌的单克隆抗体3F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7。

还提供了分离的抗DR6单克隆抗体，包括结合DR6多肽且竞争性抑制由分别以ATCC编号PTA-8095、PTA-8094、或PTA-8096保藏的杂交瘤生成的单克隆抗体结合所述DR6多肽的抗体。还提供了嵌合的或人源化的抗DR6抗体，其特异性结合DR6多肽且包含(a)自由分别以编号PTA-8095、PTA-8094、或PTA-8096保藏于ATCC杂交瘤分泌的3F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7抗体衍生的序列。任选的是，此类抗体可包含自3F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7抗体衍生的重链、轻链或可变区。

又一方面，本发明关注编码本文抗DR6抗体或抗体片段的分离的核酸分子、包含此类核酸分子的载体、包含此类核酸分子的宿主细胞、和用于生产本文抗体和抗体片段的方法。

本发明进一步涉及包含本文中所定义的DR6拮抗剂和载体的组合物。载体可以是药学可接受载体，而且组合物可进一步包含别的药剂。

另一方面，本发明关注制品，其包括容器和装在所述容器内的组合物，其中所述组合物包含本发明的DR6拮抗剂。制品可进一步包括关于在体外或在体内使用DR6拮抗剂的说明。在一个优选的实施方案中，所述说明关注神经学病症的治疗。

在一个相关方面，本发明的实施方案包括试剂盒，其包括第一容器、所述容器上的标签、和装在所述容器内的组合物。在此类试剂盒中，所述组合物包含有效治疗至少一种类型的哺乳动物神经元细胞中的凋亡的DR6拮抗剂，所述容器上的所述标签或包括在所述容器中的包装插页指示所述组合物可用于抑制至少一种类型的哺乳动物神经元细胞中的凋亡。任选的是，试剂盒包括别的部件(element)，诸如装有药学可接受缓冲剂的第二容器；和/或关于使用所述DR6拮抗剂来抑制至少一种类型的哺乳动物神经元细胞中的凋亡的说明。

本发明进一步提供了本文所述DR6拮抗剂和组合物用于制备或制造药物的用途，所述药物用于治疗哺乳动物中的神经学病症，包括用于治疗阿耳茨海默氏病。

附图简述

图1A显示了人DR6cDNA的核苷酸序列(图1A-1，SEQ ID NO：2)、其推导氨基酸序列(图1A-2，SEQ ID NO：1)以及其结构域体系结构的示意图(图1A-3)。在DR6示意图中，指示了结构域边界，包括推定的信号肽、富含半胱氨酸的结构域基序、跨膜结构域和死亡结构域。在此示意图中，指示了推定的信号肽、富含半胱氨酸的结构域基序、跨膜结构域、和死亡结构域的推定结构域边界。图1B显示了人淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的695同等型的cDNA的核苷酸序列(图1B-1，SEQ ID NO：5)及其推导氨基酸序列(图1B-2，SEQ ID NO：6)。图1C显示了人淀粉状蛋白前体蛋白的751同等型的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。图1D显示了人淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的770同等型的cDNA的核苷酸序列(图1D-1，SEQ ID NO：8)及其推导氨基酸序列(图1D-2，SEQ ID NO：9)。参见例如UniProtKB/Swiss-prot条目P05067及相关公开内容，包括分别涉及同等型ID P05067-1、同等型ID P05067-4和同等型IDP05067-8的(http://expasy.org/uniprot/P05067)。

图2A显示了在发育阶段E10.5-E12.5，DR6在发育中的中枢神经***中强表达，包括脊髓的运动和连合神经元及背根神经节神经元。图2B显示了在轴突和细胞主体上表达的DR6蛋白。图2C显示了在分化中的神经元中表达的DR6 mRNA。

图3显示了背侧脊髓外植体存活测定法中轴突变性和神经元细胞死亡的示意图；指示了通过电穿孔将RNA干扰siRNA剂与表达GFP的质粒一起导入胚胎连合神经元中。

图4A图示了在背侧脊髓存活测定法中小干扰RNA对DR6表达的抑制阻断连合轴突变性并阻止神经元细胞死亡。图4B显示了RNAi抗性DR6cDNA挽救被DR6siRNA所阻断的变性表型。

图5显示了在背侧脊髓存活测定法中拮抗性DR6抗体帮助阻断轴突变性和神经元细胞死亡。

图6提供了神经元的机制示意图和照片，显示了在外植体存活测定法中由c-Jun N-末端激酶(JNK)的药理学抑制作用引起的DR6下游胞内信号传导的下调阻止轴突变性和神经元细胞死亡。

图7显示了在离体(ex vivo)全胚胎培养物中拮抗性DR6抗体对脊髓运动和中间神经元的存活的神经保护性效果。

图8提供了用经过切割的胱天蛋白酶-3抗体免疫染色的E15.5脊髓颈段切片的照片，以显示DR6的丢失导致DR6缺无胚胎的脊髓和背根神经节中神经元细胞死亡的降低。

图9A显示了来自表达经过切割的胱天蛋白酶-3的E15.5 DR6 KO胚胎的神经元细胞的定量，其展示DR6缺无胚胎中的神经元细胞死亡与DR6+/-同窝出生者对照(DR6杂合)相比降低大约50％。图9B提供了细胞的照片，显示了DR6是运动轴突变性所需要的，正如在存在和不存在神经营养性生长因子的情况中正常和DR6敲除小鼠的比较所证实的。图9C提供了细胞的照片，显示了损伤诱发的轴突变性在DR6敲除小鼠中被延迟了。

图10A提供了神经元的照片，显示了抗DR6抗体抑制各种营养因子被剥夺的神经元中由于神经因子(NGF)供应断绝所导致的轴突变性。图10B提供了来自连合、感觉和运动神经元中凋亡细胞主体的TUNEL染色显像的进一步照片数据，其显示了抗DR6抗体抑制各式各样的营养因子被剥夺的神经元的变性。

图11A提供了连合神经元的照片，显示了DR6-Fc能延迟连合轴突变性。图11B提供了感觉神经元的照片，显示了DR6-Fc能延迟由NGF供应断绝诱发的感觉轴突变性。

图12A提供了神经元的照片，使用DR6-AP显示了轴突上的DR6结合位点。图12B提供了在存在和不存在NGF的情况中的神经元的照片，显示了在NGF剥夺后DR6配体结合位点自轴突丢失。图12C提供了处于发育阶段E12.5的BAX缺无感觉轴突的研究的照片，显示了β-分泌酶(BACE)抑制剂能阻断NGF供应断绝后DR6-AP结合位点自感觉轴突的消失。

图13A提供了自多种Western印迹规程得到的数据的照片，其中用DR6-AP(左上)或抗N-APP抗体(右上)探查来自神经元细胞的多肽，以及如下的多肽：(1)因其结合DR6的能力而选择的；和然后的(2)用抗N-APP抗体探查的(下面的，“DR6-ECD下拉”)。此数据将淀粉状蛋白前体蛋白(APP)鉴定为DR6胞外域结合配体。图13B提供了自多种印迹实验得到的数据的照片，其容许显现用DR6-AP探查的轴突条件化培养基中的DR6配体(包括APP多肽)。此印迹数据鉴定了许多APP多肽，包括位于35kDa的N-末端APP以及C99-APP和C83/C89APP多肽。

图14A提供了神经元的照片，显示了APP胞外域在NGF剥夺后不久脱落。图14B提供了细胞的照片，显示了DR6胞外域结合培养细胞所生成的APP。图14C提供了细胞的照片，显示了DR6是感觉轴突上的N-APP主要受体，而且APP结合位点在DR6缺无小鼠的神经元细胞中被显著消减。图14D提供了细胞的照片，显示了DR6功能阻断性抗体破坏DR6胞外域与N-APP之间的相互作用。

图15A提供了神经元的照片，显示了在连合轴突测定法中针对N-末端APP的多克隆抗体阻断轴突变性。图15B提供了神经元的照片，显示了诊断N-末端APP的多克隆抗体以及22C11抗APP单克隆抗体抑制由NGF消除诱导的局部轴突变性。图15C提供了神经元的照片，显示了添加N-APP能挽救被β-分泌酶(BACE)活性的抑制作用所阻断的轴突变性。图15D提供了神经元的照片，显示了通过RNAi实现的APP消除使神经元细胞对N-APP诱导的死亡敏化。

图16A提供了神经元的照片，显示了DR6功能是N-APP诱导的轴突变性所需要的，但不是Aβ触发的变性所需要的。图16B提供了神经元的照片，显示了功能阻断性DR6抗体未能阻断Aβ触发的轴突变性。

图17A提供了神经元的照片，显示了对JNK和上游胱天蛋白酶-8的抑制延迟了轴突变性，但是下游胱天蛋白酶-3则不然。图17B提供了来自E12.5外植体培养物的运动神经元的照片，显示了胱天蛋白酶-3在细胞主体中发挥功能，而胱天蛋白酶-6在轴突中发挥功能。图17C提供了感觉神经元的照片，显示了虽然胱天蛋白酶-3不是轴突变性所需要的，但是BAX是所需要的。图17D提供了连合神经元的照片，显示了胱天蛋白酶-3在细胞主体中发挥功能，而胱天蛋白酶-6在轴突中发挥功能。

发明详述

本文中描述或提到的技术和规程一般得到了本领域技术人员的充分理解，而且通常利用常规方法得以采用，诸如例如广泛应用的分子克隆方法，记载于Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y。适当时，牵涉使用市售试剂盒和试剂的规程一般依照制造商规定的方案和/或参数进行，除非另有说明。

在描述本发明的方法和测定法之前，应当理解本发明不限于所描述的具体方法、方案、细胞系、动物种或属、构建物和试剂，因为它们当然可以有所变化。还应当理解本文中所使用的术语只是为了描述具体实施方案，并非意图限制本发明的范围，只有所附权利要求才对本发明范围进行了限制。

必须注意的是，在用于本文及所附权利要求时，单数形式“一个/种”、“该”和“所述”等包括复数所指物，除非另有明确规定。如此，例如，提到“一处遗传改变”包括多处此类改变，提到“一种探针”包括一种或多种探针及其本领域技术人员知道的等效物，诸如此类。说明书和相关权利要求中所述所有数值(例如氨基酸22-81、1-354等)理解为以术语“约”修饰。

将本文中提到的所有出版物收入本文作为参考，以披露和描述与所引用出版物有关的方法和/或材料。引用本文中所引用的出版物是因为它们是在本申请的提交日之前公开的。本文中的任何文字都不应解释为承认本发明的发明人没有资格凭借更早的优先权日或在先发明日而早于所述出版物。此外，实际发表日可能与所显示的有所不同，需要独立查证。

I.定义

术语“淀粉状蛋白前体蛋白”或“APP”包括由APP前mRNA所编码的多种多肽同等型(isoform)，例如图1B-1D分别所示APP695、APP751和App770同等型(自APP前mRNA的可变剪接转录物翻译得到的同等型)，以及APP同等型的翻译后加工部分。正如本领域已知的，自APP基因转录得到的APP前mRNA经历外显子可变剪接以产生多种同等型(参见例如Sandbrink等，AnnNY Acad.Sci.777：281-287(1996)；及与PubMed NCBI蛋白编号P05067有关的信息)。此可变外显子剪接产生695、751、和770个氨基酸的三种主要同等型(参见例如Kang等，Nature 325：733-736(1987)；Kitaguchi等，Nature 331：530-532(1988)；Ponte等，Nature 331：525-527(1988)；及Tanzi等，Nature 331：528-532(1988))。这些同等型中的两种(App₇₅₁和APP₇₇₀)包含56个残基的***物，其与Kunitz家族的丝氨酸蛋白酶抑制物(KPI)高度同源且遍在表达。相反，缺乏KPI基序的较短同等型APP₆₉₅主要在神经***中(例如在神经元和神经胶质细胞中)表达，而且为此常常称作“神经元APP”(参见例如Tanzi等，Science 235：880-884(1988)；Neve等，Neuron 1：669-677(1988)；及Haas等，J.Neurosci 11：3783-3793(1991))。APP各同等型(包括695、751和770)经历重大翻译后加工事件(参见例如Esch等，1990 Science 248：1122-1124；Sisodia等，1990 Science 248：492-495)。例如，每一种这些同等型受到多种分泌酶和/或分泌酶复合物的切割，该事件产生APP片段，包括包含APP胞外域的N-末端分泌多肽(sAPPα和sAPPβ)。由α-分泌酶或β-分泌酶进行的切割分别导致可溶性N-末端APP多肽sAPPα和sAPPβ的产生和胞外释放，及相应膜锚定的C-末端片段C83和C99的保留。γ-分泌酶对C83的后续加工产生P3多肽。这是主要的分泌途径，而且是不产生淀粉状蛋白的。或者，早老蛋白/呆蛋白介导的γ-分泌酶对C99的加工释放淀粉状蛋白β多肽、淀粉状蛋白-β40(Aβ40)和淀粉状蛋白-β42(Aβ42)，即淀粉状蛋白斑块的主要成分，及细胞毒性C-末端片段γ-CTF(50)、γ-CTF(57)和γ-CTF(59)。有证据提示每种切割事件的相对重要性取决于细胞类型。例如，非神经元细胞优先由α-分泌酶途径加工APP，其在Aβ序列内切割APP，由此排除Aβ的形成(参见例如Esch等，1990 Science248：1122-1124；Sisodia等，1990 Science 248：492-495)。相反，神经元细胞由β-分泌酶途径加工APP₆₉₅的大得多的部分，这通过至少两种酶类别的联合活性产生完整Aβ。在神经元细胞中，β-分泌酶在Aβ结构域的氨基末端切割APP₆₉₅，释放一种不同的N-末端片段(sAPPβ)。另外，γ-分泌酶在羧基末端的另一位点切割APP，产生长40个(Aβ40)或42个(Aβ42)氨基酸的Aβ种类(参见例如Seubert等，1993 Nature 361：260-263；Suzuki等，1994 Science 264：1336-1340；及Turner等，1996 J.Biol.Chem.271：8966-8970)。

术语“APP”、“APP蛋白”和“APP多肽”在用于本文时涵盖天然APP序列和APP变体及其加工片段。这些术语涵盖在多种哺乳动物(包括人)中表达APP。APP可以是内源表达的，正如在多种人组织谱系中所天然发生的，或者可以是通过重组或合成方法而表达的。“天然序列APP”包括与衍生自自然界的APP具有相同氨基酸序列的多肽(例如695、751和770同等型及其加工部分)。如此，天然序列APP可具有来自任何哺乳动物(包括人)的天然存在APP的氨基酸序列。此类天然序列APP可以从自然界分离，或者可通过重组或合成手段生成。术语“天然序列APP”明确涵盖天然存在的加工和/或分泌形式的(例如包含例如胞外结构域序列的可溶形式)、天然存在变体形式(例如可变剪接和/或蛋白水解加工形式)和天然存在等位变体。APP变体可包括天然序列APP的片段或删除突变体。

在本发明的实施方案中有用的APP多肽包括那些上文和如下非限制性例子中所描述的。可以选择这些例示形式，用于本发明的各个实施方案。在本发明的有些实施方案中，APP多肽包含全长APP同等型，诸如图1B-1D所示APP₆₉₅和/或APP₇₅₁和/或APP₇₇₀同等型。在本发明的其它实施方案中，APP多肽包含APP的翻译后加工形式，例如经历了分泌酶(诸如α-分泌酶、β-分泌酶或γ-分泌酶)切割的APP多肽(例如可溶性N-末端片段，诸如sAPPα或sAPPβ)。在本发明的相关实施方案中，可以选择APP多肽，以包含一个或多个特定结构域，诸如N-末端胞外域(参见例如Quast等，FASEB J.2003；17(12)：1739-41)、肝素结合结构域(参见例如Rossjohn等，Nat Struct Biol.1999Apr；6(4)：327-31)、铜II型(参见例如Hesse等，FEBS Letters 349(1)：109-116(1994))或Kunitz蛋白酶抑制剂结构域(参见例如Ponte等，Nature；331(6156)：525-7(1988))。在本发明的有些实施方案中，APP多肽包含观察到包含受到本文中所公开的DR6拮抗剂(诸如抗体或DR6免疫粘附素)识别的表位的序列，例如APP₆₉₅的氨基酸22-81，一种包含单克隆抗体22C11所结合的表位的序列(参见例如Hilbich等，Journal of Biological Chemistry，268(35)：26571-26577(1993))。

在本发明的某些实施方案中，APP多肽不包含一种或多种特定结构域或序列，例如不包含某些N-末端或C-末端氨基酸的APP多肽(例如实施例12中公开的人重组N-APP多肽)、不包含Kunitz蛋白酶抑制剂结构域的APP多肽(例如APP₆₉₅)、或不包含阿耳茨海默氏病β淀粉状蛋白(Aβ)序列的APP多肽(例如sAPPβ，一种不包含Aβ₄₀和/或Aβ₄₂序列的多肽)(参见例如Bond等，J.Struct Biol.2003 Feb；141(2)：156-70)。在本发明的其它实施方案中，本发明的实施方案中所使用的APP多肽包含一种或多种结构域或序列但不包含其它结构域或序列，例如包含N-末端胞外域(或至少其观察到受到DR6拮抗剂(诸如单克隆抗体22C11)结合的部分)但不包含一个或多个分泌酶切割位点C端的结构域或序列(诸如aβ淀粉状蛋白(Aβ)序列)的APP多肽(例如sAPPα或sAPPβ)。

术语“胞外结构域”、“胞外域”或“ECD”指APP基本上不含跨膜结构域和胞质结构域的形式。可溶性ECD通常将具有少于1％的所述跨膜结构域和胞质结构域，优选将具有少于0.5％的所述结构域。可以理解，为本发明多肽鉴定的任何跨膜结构域是依照本领域常规用于鉴定该种类型疏水结构域的标准而鉴定的。跨膜结构域的精确边界可以变化，但最有可能的是最初鉴定的结构域任一末端不超过约5个氨基酸。在优选的实施方案中，ECD将由多肽不含跨膜结构域和胞质或胞内结构域的(而且不是膜结合的)可溶性胞外结构域序列组成。

术语“APP变体”意指如下文所定义的、与具有图1B-1D所示氨基酸序列的人APP具有至少约80％，优选至少约85％、86％、87％、88％、89％，更优选至少约90％、91％、92％、93％、94％，最优选至少约95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的APP多肽，或其可溶性片段，或其可溶性胞外结构域。此类变体包括例如在图1B-1D全长或成熟序列的N-或C-末端添加或删除一个或多个氨基酸残基的APP多肽或者在多肽的内部序列或结构域中***或删除一个或多个氨基酸残基的APP多肽，包括来自其它物种的变体，但排除天然序列APP多肽。

“DR6”或“DR6受体”包括本领域所指的其多核苷酸和多肽序列如图1A-1至1A-2所示的受体。Pan等人记载了称作“DR6”或“TR9”的TNF受体家族成员的多核苷酸和多肽序列(Pan等，FEBS Lett.，431：351-356(1998)；还可参见美国专利6,358,508；6,667,390；6,919,078；6,949,358)。人DR6受体是655个氨基酸的蛋白质(见图1A-2)，其具有推定的信号序列(氨基酸1-41)、胞外结构域(氨基酸42-349)、跨膜结构域(氨基酸350-369)、接着是胞质结构域(氨基酸370-655)。术语“DR6受体”在用于本文时涵盖天然序列受体和受体变体。这些术语涵盖在多种哺乳动物(包括人)中表达的DR6受体。DR6受体可以是内源表达的，正如在多种人组织谱系中所发生的，或者可以是通过重组或合成方法而表达的。“天然序列DR6受体”包括与衍生自自然界的DR6受体具有相同氨基酸序列的多肽。如此，天然序列DR6受体可具有来自任何哺乳动物(包括人)的天然存在DR6受体的氨基酸序列。此类天然序列DR6受体可以从自然界分离，或者可通过重组或合成手段生成。术语“天然序列DR6受体”明确涵盖天然存在的截短或分泌形式的受体(例如包含例如胞外结构域序列的可溶形式)、天然存在变体形式(例如可变剪接形式)和天然存在等位变体。受体变体可包括天然序列DR6受体的片段或删除突变体。

术语“胞外结构域”、“胞外域”或“ECD”指DR6受体基本上不含跨膜结构域和胞质结构域的形式。可溶性ECD通常将具有少于1％的所述跨膜结构域和/或胞质结构域，优选将具有少于0.5％的所述结构域。可以理解，为本发明多肽鉴定的任何跨膜结构域是依照本领域常规用于鉴定该种类型疏水结构域的标准而鉴定的。跨膜结构域的精确边界可以变化，但最有可能的是最初鉴定的结构域任一末端不超过约5个氨基酸。在优选的实施方案中，ECD将由多肽不含跨膜结构域和胞质或胞内结构域的(而且不是膜结合的)可溶性胞外结构域序列组成。

术语“DR6变体”意指如下文所定义的，与具有图1A所示推导氨基酸序列的人DR6具有至少约80％，优选至少约85％、86％、87％、88％、89％，更优选至少约90％、91％、92％、93％、94％，最优选至少约95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的DR6多肽，或其可溶性片段，或其可溶性胞外结构域。此类变体包括例如在图1A全长或成熟序列的N-或C-末端添加或删除一个或多个氨基酸残基的DR6多肽或者在多肽的内部序列或结构域中***或删除一个或多个氨基酸残基的DR6多肽，包括来自其它物种的变体，但排除天然序列DR6多肽。任选的是，DR6变体包括包含图1A氨基酸1-349或42-349及至多10处保守氨基酸替代的可溶形式DR6受体。优选的是，此类变体起DR6拮抗剂的作用，如下文所定义的。

术语“DR6拮抗剂”以最广义使用，包括任何在体外、原位、在体内或回体(ex vivo)部分或完全阻断、抑制、或中和DR6受体结合其关联配体(优选其关联配体APP)，或者激活神经元细胞或组织中的一种或多种胞内信号或胞内信号传导途径之能力的分子。举例而言，DR6拮抗剂可部分或完全阻断、抑制、或中和DR6受体激活导致神经元细胞或组织中凋亡或细胞死亡的神经元细胞或组织中一种或多种胞内信号或胞内信号传导途径的能力。DR6拮抗剂可通过多种机制来起部分或完全阻断、抑制、或中和DR6的作用，包括但不限于通过阻断、抑制、或中和关联配体对DR6的结合、DR6与其关联配体(例如APP)间复合物的形成、DR6受体的寡聚化、DR6受体与异源共同受体间复合物的形成、关联配体对DR6受体/异源共同受体复合物的结合、或DR6受体、异源共同受体、及其关联配体间复合物的形成。DR6拮抗剂可以以直接或间接方式发挥功能。本发明所涵盖的DR6拮抗剂包括但不限于APP抗体、DR6抗体、免疫粘附素、DR6免疫粘附素、DR6融合蛋白、共价修饰形式DR6、DR6变体及其融合蛋白、或高级寡聚物形式DR6(二聚体、聚集体)、或同聚物或异聚物形式DR6、小分子(诸如JNK信号传导级联的药理学抑制物，包括Jun N-末端激酶JNK活性的小分子和肽抑制物)、在信号转导途径中在JNK上游发挥功能的蛋白激酶MLK和MKK活性的药理学抑制物、JNK结合支架蛋白JIP-1的药理学抑制物、JNK结合其底物(诸如c-Jun或AP-1转录因子复合物)的药理学抑制物、JNK介导的其底物(诸如JNK结合域(JBD)肽)和/或JNK的底物结合域的磷酸化的药理学抑制物和/或包含JNK底物磷酸化位点的肽抑制物、阻断ATP结合JNK的小分子、和阻断底物结合JNK的小分子。

为了测定DR6拮抗剂是否部分或完全阻断、抑制或中和DR6受体激活神经元细胞或组织中的一种或多种胞内信号或胞内信号传导途径的能力，可实施测定法来评估DR6拮抗剂对例如各种神经元细胞或组织的影响(如实施例中所述)，以及在中风/脑缺血的体内模型、神经变性性疾病的体内模型(诸如帕金森氏病的小鼠模型、阿耳茨海默氏病的小鼠模型、肌萎缩性侧索硬化ALS的小鼠模型、脊髓性肌萎缩SMA的小鼠模型、局灶性和整体性脑缺血的小鼠/大鼠模型(例如常见的颈动脉闭塞模型或大脑中动脉闭塞模型)中、或在离体(ex vivo)全胚胎培养物中。可以以已知的体外或体内测定格式来实施各种测定法，诸如下文描述的或如本领域已知的和文献中记载的(参见例如McGowan等，TRENDS in Genetics，22：281-289(2006)；Fleming等，NeuroRx，2：495-503(2005)；Wong等，Nature Neuroscience，5：633-639(2002))。用于测定DR6拮抗剂是否部分或完全阻断、抑制或中和DR6受体激活神经元细胞或组织中一种或多种胞内信号或胞内信号传导途径的能力的测定法的一个实施方案包括在存在或不存在DR6拮抗剂或潜在DR6拮抗剂(即感兴趣分子)的情况中将DR6和APP组合，然后在存在此DR6拮抗剂或潜在DR6拮抗剂的情况中检测对DR6结合APP的抑制。

“核酸”意图包括任何DNA或RNA，例如组织样品中存在的染色体、线粒体、病毒和/或细菌核酸。术语“核酸”涵盖双链核酸分子的两条链或其中之一，包括完整核酸分子的任何片段或部分。

“基因”意指在编码或转录蛋白质或调控其它基因表达方面具有功能性作用的任何核酸序列或其部分。基因可以完全由负责编码功能性蛋白质的核酸组成，或者只有部分核酸负责编码或表达蛋白质。核酸序列可以在基因的外显子、内含子、起始或终止区、启动子序列、其它调控序列或独特邻近区中包含遗传异常。

术语“氨基酸”指所有天然存在的L-α-氨基酸。此定义意图包括正亮氨酸、鸟氨酸和高半胱氨酸。氨基酸通过单字母或三字母标示鉴别：

Asp    D    天冬氨酸    Ile    I    异亮氨酸

Thr    T    苏氨酸      Leu    L    亮氨酸

Ser    S    丝氨酸      Tyr    Y    酪氨酸

Glu    E    谷氨酸      Phe    F    苯丙氨酸

Pro    P    脯氨酸      His    H    组氨酸

Gly    G    甘氨酸      Lys    K    赖氨酸

Ala    A    丙氨酸      Arg    R    精氨酸

Cys    C    半胱氨酸    Trp    W    色氨酸

Val    V    缬氨酸      Gln    Q    谷氨酰胺

Met    M    甲硫氨酸    Asn    N    天冬酰胺

在附图中，可采用某些其它单字母或三字母标示来指向和鉴定序列中给定位置处的两种或多种氨基酸或核苷酸。

“分离的”，在用于描述本文中所公开的各种肽或蛋白质时，意指已经鉴定且与/由其天然环境的一种成分分开和/或回收的肽或蛋白质。肽或蛋白质的天然环境的污染性成分指通常会干扰其诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将肽或蛋白质纯化至(1)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(2)根据使用考马斯蓝或优选银染色的非还原性或还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质，或(3)根据质谱或肽作图技术，达到同质。既然肽或蛋白质的天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的物质包括重组细胞内的原位肽或蛋白质。然而，分离的肽或蛋白质通常通过至少一个纯化步骤来制备。

关于本文中所鉴定的序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分，候选序列中与参考序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。可以以本领域技术范围内的多种方式进行序列对比以测定百分比氨基酸序列同一性。本领域技术人员可决定测量序列对比的适宜参数，包括指派对所比较的全长序列获得最大对比所需的算法。为了本发明，可使用序列比较计算机程序ALIGN-2来获得百分比氨基酸序列同一性值，ALIGN-2程序由Genentech公司编写，其源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office，Washington，DC，20559)，并以美国版权注册号TXU510087注册。公众可通过Genentech公司(South San Francisco，CA)得到ALIGN-2程序。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。

杂交反应的“严格性”可以由本领域普通技术人员容易的确定，而且通常根据探针长度、洗涤温度和盐浓度凭经验计算。一般而言，较长的探针要求较高的温度以正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于当互补链存在于低于其解链温度的环境中时变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间的期望同一性程度越高，可使用的相对温度也越高。结果是，推断出较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格，而较低温度也就较不严格。关于杂交反应严格性的其它细节和解释，参见Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology，Wiley Interscience Publishers(1995)。

“高严格性条件”，如本文中所定义的，通过如下各项定义：(1)采用低离子强度和高温进行清洗；0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，于50℃；(2)在杂交过程中采用变性剂；50％(v/v)甲酰胺及0.1％牛血清清蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5及750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠，于42℃；或(3)采用50％甲酰胺，5x SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH 6.8)，0.1％焦磷酸钠，5x Denhardt氏溶液，超声处理的鲑鱼精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS，和10％硫酸右旋糖苷，于42℃，及于42℃在0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)和50％甲酰胺中于55℃清洗，接着于55℃在含EDTA的0.1x SSC中进行高严格性清洗。

“中等严格条件”可以如Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，New York，Cold Spring Harbor Press(1989)中所述鉴定，包括于37℃在含20％甲酰胺，5x SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH 7.6)，5x Denhardt氏溶液，10％硫酸右旋糖苷，和20mg/ml变性剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育过夜，接着于约37-50℃在1x SSC中清洗滤膜。技术人员将认识到如何在必要时调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度等因素。

术语“引物”指与互补RNA或DNA靶多核苷酸杂交并充当通过核苷酸转移酶的作用从单核苷酸逐步合成多核苷酸的起点(如例如聚合酶链反应中所发生的)的寡核苷酸序列。

术语“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。

若一段核酸与另一段核酸序列处于功能性相互关系中，则它是“可操作连接的”。例如，若前序列(presequence)或分泌前导(secretory leader)的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白质(preprotein)，则它与该多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作连接。一般而言，“可操作连接的”意味着相连的DNA序列是相邻的，而且在分泌前导的情况中意味着相邻且处于阅读状态。然而，增强子不必相邻。连接可以通过在方便的限制性位点处的连接来实现。若没有此类位点，则依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。

术语“标记物”在用于本文时指与试剂诸如核酸探针或抗体直接或间接偶联或融合，以便于检测它所偶联或融合的试剂的化合物或组合物。标记物可以是自身可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。

在用于本文时，术语“免疫粘附素”指将异源蛋白质(“粘附素”)的结合特异性与免疫球蛋白恒定域的效应器功能联合起来的抗体样分子。在结构上，免疫粘附素包括不同于抗体的抗原识别和结合位点(即是“异源”的)、具有期望结合特异性的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定域序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分典型的是至少包含受体或配体的结合位点的连续氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定域序列可以从任何免疫球蛋白获得，诸如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。

“DR6受体抗体”、“DR6抗体”、或“抗DR6抗体”以广义使用，指结合至少一种形式DR6受体(优选人DR6受体，诸如图1A所示DR6序列)或其胞外结构域序列的抗体。任选的是，DR6抗体与异源序列或分子融合或连接。优选的是，异源序列允许或帮助抗体形成更高等级或寡聚复合物。术语“抗DR6抗体”及其语法等同物具体涵盖下文实施例部分中所描述的DR6单克隆抗体。任选的是，DR6抗体结合DR6受体但不与任何其它肿瘤坏死因子家族受体(例如DR4、DR5、TNFR1、TNFR2、Fas)结合或发生交叉反应。任选的是，根据BIAcore结合测定法的测量，本发明的DR6抗体在约0.067μM到约0.033μM的浓度范围内结合DR6受体。

术语“抗APP抗体”、“APP抗体”及语法等同物以广义使用，指结合至少一种形式APP(优选人APP，诸如本文具体所述APP多肽同等型)的抗体。优选的是，APP抗体是DR6拮抗性抗体。例如，在本文中所公开的用于生成和/或鉴定DR6拮抗剂的方法中，可以使用APP和/或其一部分的一种或多种同等型作为免疫原来免疫动物(例如小鼠，作为生成单克隆抗体的过程的一部分)和/或作为探针来筛选化合物文库(例如重组抗体库)。在本发明的实施方案中有用的典型APP多肽包括如下非限制性例子。可以选择这些例示形式，用于本发明的各个实施方案。在本发明的有些实施方案中，APP多肽包含全长APP同等型，诸如图1所示APP₆₉₅和/或APP₇₅₁和/或APP₇₇₀同等型。在本发明的其它实施方案中，APP多肽包含APP的翻译后加工形式，例如经历了分泌酶(诸如α-分泌酶、β-分泌酶或γ-分泌酶)切割的APP多肽(例如可溶性N-末端片段，诸如sAPPα或sAPPβ)。在本发明的相关实施方案中，可以选择APP多肽，以包含一个或多个特定结构域，诸如N-末端胞外域(参见例如Quast等，FASEB J.2003；17(12)：1739-41)、肝素结合结构域(参见例如Rossjohn等，Nat Struct Biol.1999 Apr；6(4)：327-31)、铜II型(参见例如Hesse等，FEBSLetters 349(1)：109-116(1994))或Kunitz蛋白酶抑制剂结构域(参见例如Ponte等，Nature；331(6156)：525-7(1988))。在本发明的有些实施方案中，APP多肽包含观察到包含受到本文中所公开的DR6拮抗剂(诸如抗体或DR6免疫粘附素)识别的表位的序列，例如APP₆₉₅的氨基酸22-81，一种包含单克隆抗体22C11所结合的表位的序列(参见例如Hilbich等，Journal of BiologicalChemistry，268(35)：26571-26577(1993))。在本发明的某些实施方案中，APP多肽不包含一种或多种特定结构域或序列，例如不包含某些N-末端或C-末端氨基酸的APP多肽(例如实施例12中公开的人重组N-APP多肽)、不包含Kunitz蛋白酶抑制剂结构域的APP多肽(例如APP₆₉₅)、或不包含阿耳茨海默氏病β淀粉状蛋白(Aβ)序列的APP多肽(例如sAPPβ，一种不包含Aβ40和/或Aβ42序列的多肽)(参见例如Bond等，J.Struct Biol.2003 Feb；141(2)：156-70)。在本发明的其它实施方案中，本发明的实施方案中所使用的APP多肽包含一种或多种结构域或序列但不包含其它结构域或序列，例如包含N-末端胞外域(或至少其观察到受到DR6拮抗剂(诸如单克隆抗体22C11)结合的部分)但不包含一个或多个分泌酶切割位点C端的结构域或序列(诸如aβ淀粉状蛋白(Aβ)序列)的APP多肽(例如sAPPα或sAPPβ)。任选的是，抗APP抗体会抑制APP多肽对DR6的结合，而且会在10μg/ml至50μg/ml的浓度结合至APP多肽，如本文中所描述的和/或如定量的基于细胞的结合测定法中所测量的。

术语“抗体”在本文中以最广义使用，明确覆盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。

“天然抗体”指通常由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在一端具有一个可变域(V_H)，接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个可变域(V_L)，而另一端是一个恒定域。轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，而轻链的可变域与重链的可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链与重链可变域之间形成界面。

术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体序列间差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作高变区或互补决定区的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。

用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，及一个剩余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)₂片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。

“Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。正是在这种构造中，每个可变域的三个高变区相互作用而在V_H-V_L二聚体表面上限定了一个抗原结合位点。六个高变区一起赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异性的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。

Fab片段还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带至少一个游离硫醇基的Fab′的称谓。F(ab′)₂抗体片段最初是作为在成对Fab′片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab′片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联形式。

根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。

根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体可归入不同的类。完整抗体有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同类的抗体对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。优选的是，Fv多肽在V_H与V_L结构域之间进一步包含多肽接头，其使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见Plückthun，于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315页，1994。

术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链(V_H-V_L)中包含相连的重链可变域(V_H)和轻链可变域(V_L)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的记载于例如EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变形式外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。此外，与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性以外，单克隆抗体的优势在于它们是由杂交瘤培养物合成的，未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，有待依照本发明使用的单克隆抗体可以通过首次由Kohler等(1975)Nature 256：495记载的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法来制备(参见例如美国专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”也可以使用例如Clackson等(1991)Nature352：624-628及Marks等(1991)J.Mol.Biol.222：581-597中记载的技术从噬菌体抗体库分离。

单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类动物(例如旧大陆猴类(Old World Monkey)，诸如狒狒、恒河猴或猕猴)的可变域抗原结合序列和人恒定区序列的“灵长类化”抗体(美国专利No.5,693,780)。

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指以最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。

术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及重链可变域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，(1991))和/或那些来自“高变环”的残基(例如轻链可变域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重链可变域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。“框架区”或“FR”残基指可变域中那些除此处定义的高变区残基以外的残基。

“结合”目的抗原的抗体指能够以足够亲和力和/或亲合力结合该抗原，使得该抗体可作为治疗剂或诊断剂用于靶向表达该抗原的细胞的抗体。

为了本发明，“免疫疗法”指用抗体治疗哺乳动物(优选人类患者)的方法，其中抗体可以是未偶联的或“裸露的”抗体，或者抗体可以偶联或融合有异源分子或试剂，诸如一种或多种细胞毒剂，由此产生“免疫偶联物”。

“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95％，最优选重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用考马斯蓝或优选的银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。

术语“带标签的”在用于本文时指包含抗体或多肽且其与“标签多肽”融合的嵌合分子。标签多肽具有足够残基以提供表位而可制备针对其的抗体或者提供一些其它功能诸如寡聚的能力(例如具有亮氨酸拉链结构域的肽所发生的)，但又足够短使得其不干扰所述抗体或多肽的活性。标签多肽优选还是相当独特的，使得标签特异性抗体基本上不与其它表位发生交叉反应。合适的标签多肽通常具有至少6个氨基酸残基，通常约8个到约50个氨基酸残基之间(优选约10个到约20个残基之间)。

术语“Fc受体”或“FcR”用于描述能结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是能结合IgG抗体的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII、和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见

Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel等，Immunomethods 4：25-34(1994)；及de Haas等，J.Lab.Clin.Med.126：330-341(1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。该术语还包括新生儿受体，FcRn，其负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer等，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等，J.Immuno1.24：249(1994))。FcR在本文中包括多态性，诸如编码FcγRIIIa的基因中导致位于受体能结合IgG1的区域中第158位氨基酸或为苯丙氨酸(F)或为缬氨酸(V)的遗传二态性。纯合缬氨酸FcγRIIIa(FcγIIIa-158V)已经在体外显示出相对于纯合苯丙氨酸FcγRIIIa(FcγRIIIa-158F)或杂合(FcγIIIa-158F/V)受体具有更高的对人IgG1的亲和力且介导升高的ADCC。

术语“多元醇”在用于本文时泛指多羟基醇化合物。多元醇可以是例如任何水溶性聚(亚烷基氧化物)聚合物，而且可具有线性链或分支链。优选的多元醇包括那些在一个或多个羟基位置用化学基团诸如具有1至4个碳的烷基取代的多元醇。典型的是，多元醇是聚(亚烷基二醇)，优选聚(乙二醇)(PEG)。然而，本领域技术人员认识到，其它多元醇诸如聚(丙二醇)和聚乙烯-聚丙二醇共聚物可利用本文中关于PEG描述的偶联技术得以采用。多元醇包括本领域众所周知的那些类型以及可公开获得的那些类型，诸如从商业来源获得，诸如

公司。

术语“偶联”(conjugate)在本文中依照其最广泛的定义使用，指接合或连接到一起。若分子像接合在一起时那样起作用或运作，则它们是“偶联”的。

表述“有效量”指药剂(例如DR6拮抗剂等)有效预防、缓解或治疗所讨论病症或疾患的量。本发明的DR6拮抗剂在减缓或终止变性性神经学病症的进展中或者在增强受损神经元细胞或组织的修复和帮助恢复正确神经功能中会是有用的。

术语“处理”、“治疗”和“疗法”在用于本文时指治疗性处理、预防性处理、和防范性处理。连续治疗或施用指以至少每天一次为基础、期间没有中断一天或多天的处理。间歇治疗或施用或者间歇方式的治疗或施用指本质上并非连续而是循环的处理。

在用于本文时，术语“病症”一般指任何会受益于本文所述DR6拮抗剂治疗的疾患。这包括慢性和急性病症，以及那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状况。

“神经元细胞或组织”一般指运动神经元、中间神经元(包括但不限于连合神经元)、感觉神经元(包括但不限于背根神经节神经元)、黑质的多巴胺(DA)神经元、纹状体DA神经元、皮层神经元、脑干神经元、脊髓中间神经元和运动神经元、海马神经元(包括但不限于海马的CA1锥体神经元)、和前脑神经元。术语神经元细胞或组织在本文中意图指由细胞体、轴突和树突组成的神经元细胞，以及指可形成此类神经元细胞一部分的轴突或树突。

“神经学病症”在本文中用于指包括神经变性性疾患、以中枢或周围神经***的功能障碍或以神经元细胞或组织的坏死和/或凋亡为特征的神经元细胞或组织损害损伤、及与营养因子剥夺有关的神经元细胞或组织损伤在内的疾患。神经变性性疾病的例子包括家族性和散发性肌萎缩性侧索硬化(分别为FALS和ALS)、家族性和散发性帕金森氏病、亨庭顿氏病(亨廷顿舞蹈症)、家族性和散发性阿耳茨海默氏病、脊髓性肌萎缩(SMA)、视神经病(opticalneuropathies)(诸如青光眼或牵涉视网膜变性、糖尿病神经病变、或黄斑变性的伴生疾病(associated disease))、由于内耳感觉细胞或神经元变性引起的听力损失、癫痫、贝耳氏麻痹(Bell’s palsy)、与染色体17连锁的伴有帕金森综合征(parkinsonism)的额颞痴呆(FTDP-17)、多发性硬化、弥漫性大脑皮层萎缩、Lewy小体痴呆、皮克病(Pick disease)、三核苷酸重复病(trinucleotiderepeat disease)、朊病毒病症(prion disorder)、和夏德二氏综合征(Shy-Dragersyndrome)。神经元细胞或组织损伤可源自危及神经元细胞或组织的存活或正确功能的多种不同原因，包括但不限于：源自例如限制(暂时地或永久地)血流的缺血状况的急性和非急性损伤，就像在整体性和局灶性脑缺血(中风)中那样；对例如大脑组织或脊髓的切口或切伤；神经元组织中的损害或斑块(placques)；对细胞的生长和存活所需要的营养因子的剥夺；暴露于神经毒素，诸如化疗剂；以及偶发的其它疾病状态(incidental to other disease states)诸如慢性代谢病诸如糖尿病或肾功能不全。

“受试者”或“患者”指需要治疗的任何单个受试者，包括人。还意图作为受试者包括的有参加临床研究试验而没有显示出任何疾病临床征候的任何受试者、参加流行病学研究的受试者、或作为对照的受试者。

术语“哺乳动物”在用于本文时指归入哺乳类的任何哺乳动物，包括人、牛、马、犬、和猫。在本发明的一个优选实施方案中，哺乳动物指人。

II.本发明的例示性方法和材料

先前的研究检验了神经***发育过程中的细胞死亡现象(Hamburger等，J. Neurosci.，1：60-71(1981)；Oppenheim，Ann.Rev.Neurosci.，14：453-501(1991)；O’Leary等，J.Neurosci.，6：3692-3705(1986)；Henderson等，Nature，363：266-270(1993)；Yuen等，Brain Dev.，18：362-368(1996))。认为神经元细胞的死亡在多种神经学病症(诸如家族性和散发性肌萎缩性侧索硬化(分别为FALS和ALS)、家族性和散发性帕金森氏病、亨庭顿氏病、家族性和散发性阿耳茨海默氏病和脊髓性肌萎缩(SMA))的形成和/或进展中发挥作用(Price等，Science，282：1079-1083(1998))。

申请人出人意料地发现DR6(TNFR家族的一个成员)在胚胎和成人中枢神经***(包括大脑皮层、海马、运动神经元和脊髓的中间神经元)中高度表达。如下文实施例中所述，申请人进行了多种实验测定法来检验DR6作为神经元细胞存活或死亡的调节物可能发挥的作用。连合神经元的存活依赖来自其中间靶物之一(脊髓的底板)的营养支持。在体外外植体培养物中，申请人发现通过RNA干扰来抑制DR6表达阻断连合神经元的轴突变性。还在背侧脊髓存活测定法中测试了抗DR6单克隆抗体，确定了通过DR6特异性抗体3F4.4.8、4B6.9.7、和1E5.5.7抑制DR6受体信号传导阻止体外外植体培养物中连合神经元的轴突变性。已经在文献中报道了DR6经JNK的活化来发信号(Pan等，见上文1998；Zhao等，见上文2001)。因而，为了调查DR6-JNK信号传导在轴突变性中的作用，进行了背侧脊髓存活测定法，其中用肽抑制剂L-JNK-I阻断连合神经元中的JNK信号传导途径。此JNK信号传导抑制部分阻断背侧脊髓存活测定法中的轴突变性。如此，认为DR6至少部分经JNK途径发出轴突变性过程信号。为了更好地理解发育过程中DR6在神经元细胞死亡的调节中的作用，在全胚培养***中用抗DR6抗体阻断DR6信号传导。惊人的是，某些DR6特异性抗体对DR6信号传导的抑制在此***中针对天然发生的发育性细胞死亡保护脊髓神经元。因此，DR6拮抗剂(诸如DR6拮抗性抗体)可用于降低神经学病症(诸如神经变性性病症，例如ALS、SMA、阿耳茨海默氏病、和帕金森氏病、FTDP-17、亨庭顿氏病)和中风中发生的神经元细胞死亡。为了检验DR6在体内是否真正地发挥促凋亡受体的功能，申请人分析了处于发育阶段E15.5的DR6敲除胚的表型。与DR6作为神经元细胞存活的负调节物的作用一致，在DR6缺失脊髓和背根神经节中检测到与DR6杂合同窝出生者对照相比神经元细胞死亡降低大约40％至50％。

申请人还出人意料地发现淀粉状蛋白前体蛋白(APP)是DR6受体的关联配体，而且APP发挥经DR6受体触发轴突变性的功能。先前假设淀粉状蛋白前体蛋白在阿耳茨海默氏病中发挥一些尽管没有完全了解的作用(Selkoe，J.Biol.Chem.271：18295(1996)；Scheuner；等，Nature Med.2：864(1996)；Goate，等，Nature 349：704(1991))。

认为DR6拮抗剂在治疗各种神经学病症中会是尤其有用的。本发明因而提供了DR6拮抗剂组合物和用于在哺乳动物中抑制、阻断和中和DR6活性的方法，包括施用有效量的DR6拮抗剂。优选的是，所采用的DR6拮抗剂量会是有效阻断轴突变性和神经元细胞死亡的量。这可以依照例如下文和实施例中所描述的方法来实现。

所述方法中可采用的DR6拮抗剂包括但不限于DR6和/或APP免疫粘附素、包含DR6和/或APP的融合蛋白、DR6和/或APP的共价修饰形式、DR6和/或APP变体、其融合蛋白、及DR6和/或APP抗体。本文中描述了可用于生成拮抗剂的多种技术。例如，描述了用于制备DR6和APP多肽的方法和技术。还描述了DR6和APP多肽的进一步修饰、及针对DR6和APP的抗体。

本文中所公开的方法具有许多实施方案。本发明提供了抑制DR6结合APP的方法，包括在DR6对APP的结合受到抑制的条件下将DR6多肽和/或APP多肽暴露于一种或多种DR6拮抗剂。本发明的相关实施方案提供了抑制对包含SEQ ID NO：1氨基酸1-655的DR6多肽和包含SEQ ID NO：6氨基酸66-81的APP多肽(例如sAPPβ)的结合的方法，该方法包括将DR6多肽和APP多肽与结合DR6或APP的分离的拮抗剂组合，其中所述分离的拮抗剂选自结合APP的抗体、结合DR6的抗体和包含SEQ ID NO：1氨基酸1-354的可溶性DR6多肽中的至少一种；且所述分离的拮抗剂是根据其抑制DR6和APP结合的能力选择的；使得DR6对APP的结合受到抑制。

任选的是，在此类方法中，一种或多种DR6拮抗剂选自结合DR6的抗体(例如竞争性抑制由分别以ATCC编号PTA-8095、PTA-8094、或PTA-8096保藏的杂交瘤细胞系生成的3F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7单克隆抗体的结合的结合DR6的抗体)、包含SEQ ID NO：1氨基酸1-354的可溶性DR6多肽(例如DR6免疫粘附素)、或结合APP的抗体(例如单克隆抗体22C11)。在本发明的某些实施方案中，DR6拮抗剂是连接至一种或多种选自下组的非蛋白质性质聚合物的结合DR6的抗体、结合APP的抗体或可溶性DR6多肽：聚乙二醇、聚丙二醇、和聚氧化烯。

在这些方法的任选实施方案中，DR6多肽是在一种或多种哺乳动物细胞(例如连合神经元细胞、感觉神经元细胞或运动神经元细胞)的细胞表面上表达的，而且所述一种或多种DR6拮抗剂的结合抑制DR6活化或信号传导。在本发明的一个此类实施方案中，所述方法是在体外实施的，用以抑制一种或多种表达DR6的哺乳动物细胞中的凋亡，从而增强组织培养物中神经元细胞的生长和/或再生和/或存活。举例而言，此类DR6拮抗剂作为组织培养基(例如那些设计用于繁殖神经元细胞培养物的)的体外添加剂是有用的。具体而言，正如本领域已知的，某些神经元细胞培养物的繁殖可能由于此类细胞经历凋亡的倾向而成问题。例如，有些神经元培养物在缺乏外源因子(诸如神经生长因子)时死亡。本文中所提供的公开内容显示了DR6拮抗剂可用于此类神经元细胞培养物以增强细胞生长和/或再生和/或存活，例如以与此类培养物中神经生长因子的使用类似的方式。

在本发明的其它实施方案中，可以在患有神经学疾患或病症的哺乳动物中体内实施抑制DR6结合APP的方法。任选的是，神经学疾患或病症是肌萎缩性侧索硬化、帕金森氏病、亨庭顿氏病或阿耳茨海默氏病。或者，神经学疾患或病症包括源自中风、对大脑或脊髓组织的创伤、或神经元组织中的损害的神经元细胞或组织损伤。

本发明的其它实施方案提供了治疗患有神经学疾患或病症的哺乳动物的方法，包括对所述哺乳动物施用有效量的一种或多种DR6拮抗剂。典型的是，在此类方法中，一种或多种DR6拮抗剂选自结合DR6的抗体、包含SEQ IDNO：1氨基酸1-354的可溶性DR6多肽、和结合APP的抗体。在本发明的任选实施方案中，神经学疾患或病症是肌萎缩性侧索硬化、帕金森氏病、亨庭顿氏病或阿耳茨海默氏病。或者，神经学疾患或病症包括源自中风、对大脑或脊髓组织的创伤、或神经元组织中的损害的神经元细胞或组织损伤。在本发明的各种实施方案中，对所述哺乳动物施用一种或多种别的治疗剂。在本发明的某些例示性实施方案中，所述一种或多种别的治疗剂选自NGF、凋亡抑制剂、EGFR抑制剂、β-分泌酶抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、胆碱酯酶抑制剂、抗Aβ抗体和NMDA受体拮抗剂。任选的是，所述一种或多种DR6拮抗剂和/或别的治疗剂是经注射、输注或灌注施用于哺乳动物的。

本发明的其它实施方案提供了鉴定抑制DR6结合APP的感兴趣分子的方法，该方法包括：在存在或不存在感兴趣分子的情况中组合DR6和APP，然后检测在存在所述感兴趣分子的情况中对DR6结合APP的抑制。本发明的相关实施方案提供了确定某组合物是否调控包含SEQ ID NO：1氨基酸1-655(和任选的SEQ ID NO：1氨基酸1-354)的DR6多肽和包含SEQ ID NO：6氨基酸66-81的APP多肽(例如APP₆₉₅、sAPPα或sAPPβ)之间结合的方法，该方法包括将组合物与DR6和APP组合，然后将存在该组合物时的DR6和APP之间的结合与不存在该组合物时的DR6和APP之间的结合进行比较，由此确定该组合物是否调控DR6和APP之间的结合。任选的是，此类方法中的结合差异通过表面等离振子共振(SPR)技术(例如可自Biacore Life Sciences获得的)来测量。本发明的实施方案进一步包括依照这些方法鉴定的感兴趣分子。

本发明的其它实施方案包括诊断患有神经学病症的或对神经学病症易感的患者的方法，包括自所述患者获取样品并对所述样品测试具有与SEQ IDNO：1之DR6多肽序列不同的多肽序列的DR6多肽变体的存在。任选的是，该方法进一步包括鉴定所述多肽变体是否具有与对SEQ ID NO：1之DR6多肽序列观察到的亲和力不同的对APP多肽的亲和力。本发明的相关实施方案包括确定哺乳动物中是否存在包含SEQ ID NO：1氨基酸1-655的DR6多肽变体的方法，该方法包括将哺乳动物中所表达的DR6多肽的序列与SEQ ID NO：1进行比较，由此确定该哺乳动物中是否存在DR6多肽变体。这些方法的某些实施方案可包括进一步的步骤，即鉴定观察到在哺乳动物中存在的多肽变体是否是APP结合变体，其中APP结合变体表征为所具有的对包含SEQ ID NO：6氨基酸66-81的淀粉状蛋白前体蛋白(APP)多肽(例如APP₆₉₅、sAPPα或sAPPβ)的结合亲和力不同于包含SEQ ID NO：1的DR6多肽对包含SEQ IDNO：6氨基酸66-81的APP多肽的结合亲和力。任选的是，此类方法中结合亲和力的差异是通过表面等离振子共振(SPR)技术(例如可自Biacore LifeSciences获得的)测量的。这些方法的有些实施方案可包括选择具有在肌萎缩性侧索硬化、帕金森氏病、亨庭顿氏病或阿耳茨海默氏病中观察到的症状或疾患的患者个体的步骤。

在本文所述全长天然序列DR6和APP多肽之外，可制备DR6和/或APP多肽变体。DR6和/或APP变体可通过将适宜核苷酸变化引入编码DNA和/或通过期望多肽的合成来制备。本领域技术人员会领会，氨基酸变化可能改变DR6和/或APP多肽的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置或者改变膜锚定特征。

本文所述DR6和/或APP多肽中的变异可以例如使用关于保守和非保守突变的任何技术和指导方针来产生，例如美国专利No.5,364,934中所提出的。变异可以是一个或多个编码多肽的密码子的替代、删除或***，其导致与天然序列多肽相比氨基酸序列中的变化。任选地，变异是通过在DR6和/或APP多肽的一个或多个结构域中用任何其它氨基酸替代至少一个氨基酸实现的。确定哪个氨基酸残基可以被***、替代或删除而不会不利地影响期望活性的指导可以通过比较DR6多肽的序列与同源的已知蛋白质分子的序列，并使高度同源性的区域中产生的氨基酸序列变化的数目最小化而发现。氨基酸替代可以是用另一个具有相似结构和/或化学性质的氨基酸替代一个氨基酸的结果，诸如用丝氨酸替代亮氨酸，即保守氨基酸替代。任选地，***或删除可以在大约1至5个氨基酸的范围中。可以如下确定容许的变异，即在序列中***地产生氨基酸的***、删除或替代，并对所得的变体测试DR6和/或APP拮抗活性。

本文中提供了DR6和/或APP多肽片段。此类片段可以是在N端或C端截短的，或者可以缺少内部残基，例如在与全长天然蛋白相比时。某些片段缺少对于DR6多肽的期望生物学活性不是至关重要的氨基酸残基。

DR6和/或APP多肽可以通过许多常规技术中的任一种来制备。可以化学合成期望的肽片段。备选的方法牵涉通过酶促消化生成多肽片段，例如通过用已知在由特定氨基酸残基限定的位点处切割蛋白质的酶处理蛋白质，或通过用合适的限制酶消化DNA并分离期望片段来实现。另一种合适的技术牵涉分离并扩增编码期望多肽片段的DNA片段，其通过聚合酶链式反应(PCR)实现。在PCR中的5’和3’引物上采用限定DNA片段的期望端的寡核苷酸。

在具体的实施方案中，下表中优选替代的标题下显示了感兴趣的保守替代。如果此类替代导致生物学活性变化，那么可导入表中称为“例示替代”的更实质变化，或如下文参照氨基酸分类进一步所述，并筛选产物。

表

原始残基	例示替代	优选替代
			Ala(A)	val；leu；ile	val
Arg(R)	lys；gln；asn	lys
			Asn(N)	gln；his；asp；lys；arg	gln
Asp(D)	glu；asn	glu
			Cys(C)	ser；ala	ser
Gln(Q)	asn；glu	asn
			Glu(E)	asp；gln	asp
Gly(G)	ala	ala

His(H)	asn；gln；lys；arg	arg
			Ile(I)	leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸	leu
Leu(L)	正亮氨酸；ile；val；met；ala；phe	ile
			Lys(K)	arg；gln；asn	arg
Met(M)	leu；phe；ile	leu
			Phe(F)	leu；val；ile；ala；tyr	tyr
Pro(P)	ala	ala
			Ser(S)	thr；cys	cys
Thr(T)	ser	ser
			Trp(W)	tyr；phe	tyr
Tyr(Y)	trp；phe；thr；ser	phe
			Val(V)	ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸	leu

对DR6和/或APP多肽的功能或免疫学身份的实质性修饰可通过选择对维持以下方面的效果差异显著的替代来实现：(a)替代区域中多肽主链的结构，例如作为(折叠)片层或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据共同的侧链特性，天然存在残基可如下分组：

(1)疏水性的：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；

(2)中性、亲水性的：cys、ser、thr；

(3)酸性的：asp、glu；

(4)碱性的：asn、gln、his、lys、arg；

(5)影响链取向的残基：gly、pro；及

(6)芳香族的：trp、tyr、phe。

非保守替代需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。还可以将此类替代残基引入保守替代位点中，或更优选地，引入剩余(非保守的)位点中。

变异可以使用本领域中已知的方法来产生，诸如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描、及PCR诱变。可以对所克隆的DNA实施定点诱变[Carter等，Nucl.Acids Res.，13：4331(1986)；Zoller等，Nucl.Acids Res.，10：6487(1987)]、盒式诱变[Wells等，Gene，34：315(1985)]、限制性选择诱变[Wells等，Philos.Trans.R.Soc.London SerA，317：415(1986)]或其它已知的技术以生成DR6多肽变体DNA。

还可以采用扫描氨基酸分析以沿着连续的序列鉴定一个或多个氨基酸。相对较小的、中性氨基酸是优选的扫描氨基酸之一。此类氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、及半胱氨酸。丙氨酸通常是此组中优选的扫描氨基酸，因为其消除了超出β-碳外的侧链，且不太可能改变变体的主链构象[Cunningham和Wells，Science，244：1081-1085(1989)]。通常还优选丙氨酸，因为其是最常见的氨基酸。进一步地，其在掩蔽位置和暴露位置两者中被频繁发现[Creighton，The Proteins，(W.H.Freeman&Co.，N.Y.)；Chothia，J.Mol.Biol.，150：1(1976)]。若丙氨酸替代不能产生足够量的变体，则可以使用电子等排(isoteric)氨基酸。

不涉及维持DR6和/或APP多肽的正确构象的任何半胱氨酸残基一般也可以用丝氨酸替代以改善分子的氧化稳定性，并阻止异常交联。相反地，可以将半胱氨酸键添加至DR6和/或APP多肽以改善其稳定性。

本文中所公开的发明的各实施方案适用于极其广泛的APP多肽。例如，在本发明的某些实施方案中，APP是图1B-1D所示全长695、750或770APP同等型(isoform)。在本发明的其它实施方案中，APP包含具有胞外域且自翻译后加工事件生成的APP的N端部分(例如sAPPα或sAPPβ)。任选的是，例如，APP可包括695、750或770APP同等型之一的可溶形式，其源自分泌酶的切割作用，例如神经元APP695的可溶形式，其源自β-分泌酶的切割作用。在一个具体的例示性实施方案中，APP包含APP₆₉₅的氨基酸20-591(参见例如Jin等，J.Neurosci.，14(9)：5461-5470(1994))。在本发明的另一个实施方案中，APP包括具有受到单克隆抗体22C11(例如可得自Chemicon International Inc.，Temecula，CA，U.S.A.)识别的表位的多肽。任选的是，APP包含APP₆₉₅的残基66-81，即包含22C11表位的区域(参见例如Hilbrich，J.B.C.卷268，期35：26571-26577(1993))。

以下描述主要涉及通过培养经包含DR6多肽编码核酸的载体转化或转染的细胞来生成DR6和/或APP多肽。当然，可以采用备选方法(其在本领域是公知的)来制备DR6和/或APP多肽。例如，合适的氨基酸序列或其部分可以通过使用固相技术的直接肽合成来生成[参见例如Stewart等，Solid-PhasePeptide Synthesis，W.H.Freeman Co.，San Francisco，CA(1969)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85：2149-2154(1963)]。体外蛋白质合成可以使用手动技术或通过自动化来实施。可以实现自动化合成，例如使用Applied Biosystems肽合成仪(Foster City，CA)使用制造商的说明书来实现。DR6和/或APP多肽的各个部分可以使用化学或酶促方法来分开地化学合成并组合以生成期望的DR6和/或APP多肽。

所描述的方法和技术类似地适用于DR6和/或APP变体、修饰形式的DR6和/或APP、及DR6和/或APP抗体的生产。

编码DR6和/或APP多肽的DNA的分离

可以自cDNA文库获得编码DR6和/或APP多肽的DNA，该cDNA文库是从认为拥有DR6和/或APP多肽mRNA并以可检测水平表达它的组织中制备的。因而，人DR6和/或APP多肽DNA可以方便地获自从人组织中制备的cDNA文库。编码DR6和/或APP多肽的基因还可以获自基因组文库或通过已知的合成规程(例如自动化核酸合成)获得。

可以用设计的探针(诸如至少约20-80个碱基的寡核苷酸)筛选文库以鉴定感兴趣基因或由其编码的蛋白质。用所选择的探针筛选cDNA或基因组文库可以使用标准规程(诸如记载于Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中的)来进行。分离编码DR6多肽的基因的备选方法是使用PCR方法[Sambrook等，见上文；Dieffenbach等，PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Laboratory Press，1995)]。

筛选cDNA文库的技术在本领域是公知的。选作探针的寡核苷酸序列应当有足够的长度，并且是足够明确的以使得假阳性降至最低。寡核苷酸优选是标记的，使得其可以在与正在被筛选的文库中的DNA杂交后被检出。标记的方法在本领域是公知的，并包括使用放射性标记物(像³²p-标记的ATP)、生物素化或酶标记。杂交条件(包括中等严格性和高度严格性)在Sambrook等，见上文中有提供。

此类文库筛选方法中鉴定的序列可以与公共数据库(诸如GenBank)或其它私有序列数据库中存储且可获得的其它已知序列相比较和比对。分子的规定区域内或整个全长序列的序列同一性(或是在氨基酸水平或是在核苷酸水平)可以使用本领域已知的及本文所述的方法来测定。

可以如下获得具有蛋白质编码序列的核酸，即使用本文首次公开的推理氨基酸序列，并在需要时如Sambrook等，见上文所述的那样使用常规引物延伸规程来筛选选择的cDNA或基因组文库以检测前体，并处理可能还没有逆转录成cDNA的mRNA中间体。

宿主细胞的选择和转化

将宿主细胞用本文所述用于DR6和/或APP多肽生成的表达或克隆载体转染或转化，并在为了诱导启动子、选择转化体、或扩增编码期望序列的基因而适当改良的常规营养培养基中培养。技术人员无需过度实验就可以选择培养条件，诸如培养基、温度、pH等。一般而言，用于使细胞培养物生产力最大化的原理、方案、及实践技术可参见Mammalian Cell Biotechnology：aPractical Approach，M.Butler，编(IRL Press，1991)和Sambrook等，见上文。

真核细胞转染和原核细胞转化的方法对于普通技术人员是已知的，例如，CaCl₂、CaPO₄、脂质体介导的和电穿孔。根据使用的宿主细胞，使用对于此类细胞适当的标准技术来实施转化。采用氯化钙的钙处理(如记载于Sambrook等，见上文的)或电穿孔一般用于原核生物。根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)感染用于某些植物细胞的转化，如Shaw等，Gene，23：315(1983)和1989年6月29日公布的WO 89/05859所记载的。对于没有此类细胞壁的哺乳动物细胞，可以采用Graham和van der Eb，Virology，52：456-457(1978)的磷酸钙沉淀方法。哺乳动物细胞宿主***转染的一般性方面已经记载于美国专利No.4,399,216。典型地，依照Van Solingen等，J.Bact.，130：946(1977)和Hsiao等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，76：3829(1979)的方法来实施向酵母中的转化。然而，还可以使用用于将DNA导入细胞的其它方法，诸如通过核显微注射、电穿孔、与完整细胞进行的细菌原生质体融合、或聚阳离子，例如Polybrene、多鸟氨酸。对于转化哺乳动物细胞的各种技术，参见Keown等，Methods in Enzymology，185：527-537(1990)和Mansour等，Nature，336：348-352(1988)。

适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、或高等真核细胞。合适的原核生物包括但不限于真细菌，诸如革兰氏阴性的或革兰氏阳性的生物体，例如肠杆菌科，诸如大肠杆菌。多种大肠杆菌菌株是公众可获得的，诸如大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC 31,446)；大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)；大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27,325)及K5772(ATCC 53,635)。其它合适的原核宿主细胞包括肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，诸如埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌或大肠埃希氏杆菌(E.coli))、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescans))、及志贺氏菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacilli)(诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公开的DD 266,710中所披露的地衣芽孢杆菌41P))、假单胞菌属(Pseudomonas)(诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))、及链霉菌属(Streptomyces)。这些例子是例示性的而非限制性的。菌株W3110是一种特别的优选宿主或亲本宿主，因为其是供重组DNA产物发酵用的常用宿主菌株。优选地，宿主细胞分泌最少量的蛋白水解酶。例如，可以修饰菌株W3110以在编码宿主内源性蛋白质的基因中产生遗传突变，此类宿主的例子包括大肠杆菌W3110菌株1A2(其具有完整基因型tonA)；大肠杆菌W3110菌株9E4(其具有完整基因型tonAptr3)；大肠杆菌W3110菌株27C7(ATCC 55,244)(其具有完整基因型tonA ptr3phoA E15(argF-lac)169 degP ompT kan^r)；大肠杆菌W3110菌株37D6(其具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan^r)；大肠杆菌W3110菌株40B4(其是含非卡那霉素抗性degP删除突变的菌株37D6)；及具有1990年8月7日公告的美国专利No.4,946,783所披露的突变型周质蛋白酶的大肠杆菌菌株。或者，体外克隆方法(例如PCR或其它核酸聚合酶反应)是合适的。

在原核生物之外，真核微生物(诸如丝状真菌或酵母)是适于DR6多肽编码载体的克隆或表达宿主。酿酒酵母或啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)是常用的低等真核宿主微生物。其它的包括粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach和Nurse，Nature，290：140[1981]；1985年5月2日公布的EP 139,383)；克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)宿主(美国专利No.4,943,529；Fleer等，Bio/Technology，9：968-975(1991))，诸如例如乳克鲁维氏酵母(K.lactis)(MW98-8C，CBS683，CBS4574；Louvencourt等，J.Bacteriol.，154(2)：737-742[1983])、脆壁克鲁维氏酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维氏酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克曼氏克鲁维氏酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维氏酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)；Van den Berg等，Bio/Technology，8：135(1990))、耐热克鲁维氏酵母(K.thermotolerans)、及马克斯克鲁维氏酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris)(EP 183,070；Sreekrishna等，J.Basic Microbiol.，28：265-278[1988])；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)(Case等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76：5259-5263[1979])；许旺氏酵母属(Schwanniomyces)，诸如西方许旺氏酵母(Schwanniomyces occidentalis)(1990年10月31日公布的EP 394,538)；及丝状真菌，诸如例如脉孢霉菌(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)(1991年1月10日公布的WO 91/00357)，及曲霉属(Aspergillus)宿主，诸如构巢曲霉(A.nidulans)(Balance等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，112：284-289[1983]；Tilburn等，Gene，26：205-221[1983]；Yelton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：1470-1474[1984])及黑曲霉(A.niger)(Kelly和Hynes，EMBO J.，4：475-479[1985])。甲基营养型酵母在本文中是合适的，并包括但不限于选自下列属的、能够在甲醇上生长的酵母：汉逊氏酵母属(Hansenula)、假丝酵母属、克勒克氏酵母属(Kloeckera)、毕赤氏酵母属(Pichia)、糖酵母属(Saccharomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)、及红酵母属(Rhodotorula)。这类酵母例示性的特定种类的列表可参见C.Anthony，TheBiochemistry of Methylotrophs，269(1982)。

适于表达糖基化DR6和/或APP多肽的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子包括昆虫细胞(诸如果蝇S2及夜蛾(Spodoptera)Sf9)，以及植物细胞，诸如棉花、玉米、马铃薯、大豆、牵牛花、番茄、及烟草的细胞培养物。已经鉴定出很多杆状病毒株和变体及相应的来自下组宿主的许可性昆虫宿主细胞，诸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)，及家蚕(Bombyx mori)。用于转染的多种病毒株是公众可获得的(例如苜蓿尺蠖(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株)，并且此类病毒可以用作依照本发明的本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。

然而，兴趣最大的是脊椎动物细胞，而且使培养(组织培养)中的脊椎动物细胞增殖已经成为常规规程。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子是经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293细胞或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham等，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼年仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人***细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠***肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；及人肝瘤(hepatoma)系(Hep G2)。

将宿主细胞用上文所述供DR6和/或APP多肽生成用的表达或克隆载体转化，并在为了诱导启动子、选择转化体、或扩增编码期望序列的基因而适当改良的常规营养培养基中培养。

可复制载体的选择和使用

可以将编码DR6和/或APP多肽的核酸(例如cDNA或基因组DNA)***供克隆(DNA的扩增)用的或供表达用的可复制载体中。多种载体是公众可获得的。载体可以是例如质粒、粘粒、病毒颗粒、或噬菌体形式。合适的核酸序列可以通过多种规程而***载体中。一般而言，使用本领域已知的技术将DNA***合适的限制性内切核酸酶位点中。载体构件一般包括但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、及转录终止序列。含有一种或多种这些构件的合适载体的构建采用对于技术人员已知的标准连接技术。

DR6和/或APP不仅可以直接重组生成，而且还可以作为含异源多肽(其可以是在成熟蛋白或多肽的N端的信号序列或具有特定切割位点的其它多肽)的融合多肽而重组合成。一般而言，信号序列可以是载体的构件，或者其可以是***载体中的DR6和/或APP多肽编码DNA的一部分。信号序列可以是原核信号序列，其选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或热稳定的肠毒素II前导序列。对于酵母分泌，信号序列可以是例如酵母转化酶前导序列、α-因子前导序列(包括糖酵母属和克鲁维氏酵母属α-因子前导序列，后者记载于美国专利No.5,010,182)、或酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母(C.albicans)葡糖淀粉酶前导(1990年4月4日公布的EP 362,179)、或1990年11月15日公布的WO 90/13646所记载的信号。在哺乳动物细胞表达中，可以使用哺乳动物信号序列来指导蛋白质分泌，诸如来自相同或相关物种的分泌性多肽的信号序列，以及病毒分泌前导序列。

表达载体和克隆载体都含有使得载体能够在一种或多种所选择的宿主细胞中复制的核酸序列。用于多种细菌、酵母、和病毒的此类序列是公知的。来自质粒pBR322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适用于酵母，而各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)对于哺乳动物细胞中的克隆载体是有用的。

表达和克隆载体典型地会包含选择基因(也称为选择标志)。典型的选择基因编码下述蛋白质，其(a)赋予对抗生素或其它毒素(例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤、或四环素)的抗性，(b)补充营养缺陷型缺陷，或(c)提供不能从复合培养基获得的关键营养物，例如编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。

适用于哺乳动物细胞的选择标志的例子是那些使得有能力摄取DR6和/或APP多肽编码核酸的细胞得以鉴定的选择标志，诸如DHFR或胸苷激酶。在采用野生型DHFR时，适当的宿主细胞是DHFR活性缺陷的CHO细胞系，其制备和增殖如Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216(1980)所述的。适合酵母中使用的选择基因是酵母质粒YRp7中存在的trp1基因[Stinchcomb等，Nature，282：39(1979)；Kingsman等，Gene，7：141(1979)；Tschemper等，Gene，10：157(1980)]。trp1基因提供了供缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变型菌株(例如ATCC No.44076或PEP4-1[Jones，Genetics，85：12(1977)])用的选择标志。

表达和克隆载体通常包含与DR6和/或APP多肽编码核酸序列可操作连接的启动子以指导mRNA合成。多种潜在宿主细胞所识别的启动子是公知的。适于与原核宿主一起使用的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子***[Chang等，Nature，275：615(1978)；Goeddel等，Nature，281：544(1979)]、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子***[Goeddel，Nucleic Acids Res.，8：4057(1980)；EP36,776]、及杂合启动子，诸如tac启动子[deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：21-25(1983)]。细菌***中使用的启动子还会包含与编码DR6和/或APP多肽的DNA可操作连接的Shine-Dalgamo(S.D.)序列。

适于与酵母宿主一起使用的启动序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶的启动子[Hitzeman等，J.Biol.Chem.，255：2073(1980)]或其它糖酵解酶(诸如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶、及葡糖激酶)的启动子[Hess等，J.Adv.Enzyme Reg.，7：149(1968)；Holland，Biochemistry，17：4900(1978)]。

其它酵母启动子(其是具有额外优势即转录受生长条件控制的诱导型启动子)是下组蛋白质的启动子区：醇脱氢酶2、异细胞色素(isocytochrome)C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。适于在酵母表达中使用的载体和启动子在EP 73,657中有进一步的描述。

在哺乳动物宿主细胞中来自载体的DR6和/或APP多肽转录受到如下启动子控制，例如自病毒(诸如多瘤病毒、禽痘病毒(1989年7月5日公布的UK2,211,504)、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛***状瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒及猿病毒40(SV40))基因组、异源哺乳动物启动子(例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)、及自热休克启动子获得的启动子，倘若此类启动子与宿主细胞***相容的话。

高等真核生物转录编码DR6和/或APP多肽的DNA可以通过将增强子序列***载体中而得以增加。增强子是对启动子起作用而增加其转录的顺式作用DNA元件，通常为约10-300bp。目前已知许多来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白、及胰岛素)的增强子序列。典型地，然而，会使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括复制起点的晚期侧上的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点的晚期侧上的多瘤病毒增强子、及腺病毒增强子。增强子可以在DR6和/或APP多肽编码序列的5’或3’位置剪接入载体中，但优选位于启动子5’的位点。

真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人、或来自其它多细胞生物体的有核细胞)中使用的表达载体还会包含转录终止及使mRNA稳定所必需的序列。此类序列通常可获自真核生物的或病毒的DNA或cDNA的5’非翻译区，偶尔地3’非翻译区。这些区域包含作为编码DR6多肽的mRNA的非翻译部分中的多腺苷酸化片段转录的核苷酸区段。

适于改编后在重组脊椎动物细胞培养物中合成DR6和/或APP多肽的其它方法、载体和宿主细胞记载于Gething等，Nature，293：620-625(1981)；Mantei等，Nature，281：40-46(1979)；EP 117,060；及EP 117,058。

培养宿主细胞

用于生成本发明的DR6和/或APP多肽的宿主细胞可以在多种培养基中培养。商品化的培养基(诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、及Dulbecco氏改良Eagle氏培养基((DMEM)Sigma))适于培养宿主细胞。此外，Ham等，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes等，Anal.Biochem.102：255(1980)，美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985中所述的任何培养基可以用作宿主细胞的培养基。任何这些培养基可以在需要时补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白、或表皮生长因子)、盐类(诸如氯化钠、钙、镁、及磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCIN^TM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围中的终浓度存在的无机化合物)、及葡萄糖或等同能源。还可以包括本领域技术人员是已知的适当浓度的任何其它必需的补充物。培养条件(诸如温度、pH等)就是那些先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的，而且对于普通技术人员是显而易见的。

检测基因扩增/表达

基于本文所提供的序列，基因扩增和/或表达可以在样品中直接测量，例如使用适当标记的探针通过常规Southern印迹、Northern印迹(用以定量mRNA的转录)[Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：52015205(1980)]、斑点印迹(DNA分析)、或原位杂交来实现。或者，可以采用能识别特定双链体的抗体，所述双链体包括DNA双链体、RNA双链体、及DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白质双链体。继而可以标记抗体，并可以实施测定法，其中双链体结合至表面，使得在表面上形成双链体后，可以检出双链体所结合的抗体的存在。

或者，基因表达可以通过免疫学方法(诸如细胞或组织切片的免疫组织化学染色和细胞培养物或体液的测定法)来测量以直接定量基因产物的表达。对于免疫组织化学染色和/或体液测定法有用的抗体可以是单克隆的或多克隆的，而且可以在任何哺乳动物中制备。方便地，抗体可以针对天然序列DR6多肽或针对基于本文所提供DR6序列的合成肽或针对与DR6DNA融合且编码特定抗体表位的外源序列而制备。

DR6多肽的纯化

可以从培养基或从宿主细胞溶胞产物中回收各种形式的DR6和/或APP多肽。若是膜结合的，则可以使用合适的去污剂溶液(例如Triton-X 100)或通过酶促切割而将其从所述膜中释放。DR6多肽的表达中所采用的细胞可以通过多种物理或化学手段(诸如冷冻-融化循环、超声处理、机械破碎、或细胞溶胞剂)来破坏。

可能希望从重组细胞蛋白或多肽中纯化DR6和/或APP多肽。如下规程是合适的纯化规程的例示：通过在离子交换柱上分级；乙醇沉淀；反相HPLC；硅土上或阳离子交换树脂(诸如DEAE)上的层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤；蛋白A Sepharose柱以除去污染物，诸如IgG；及金属螯合柱以结合加表位标签形式的DR6和/或APP多肽。可以采用蛋白质纯化的多种方法，而且此类方法在本领域中是已知的，并记载于例如Deutscher，Methods in Enzymology，182(1990)；Scopes，ProteinPurification：Principles and Practice，Springer-Verlag，New York(1982)。所选择的纯化步骤会取决于例如所使用的生成方法和所生成的特定DR6多肽的性质。

本发明的方法中可以采用可溶形式的DR6和/或APP作为DR6拮抗剂。此类可溶形式的DR6和/或APP可以包含修饰，如下文所述(诸如通过与免疫球蛋白、表位标签或亮氨酸拉链融合)。进一步设想了将免疫粘附素分子用于本文中的方法。DR6和/或APP免疫粘附素可包含各种形式的DR6和/或APP，诸如全长多肽以及可溶、胞外结构域形式的DR6和/或APP或其片段。在具体的实施方案中，所述分子可包含DR6多肽与免疫球蛋白或其特定区域的融合物。对于二价形式的免疫粘附素，此类融合物可以是与IgG分子Fc区的融合物。Ig融合物优选包含用可溶形式的(跨膜结构域删除或灭活的)多肽代替Ig分子内至少一个可变区的替代。在一个特别优选的实施方案中，免疫球蛋白融合物包含IgG1分子的铰链、CH2和CH3，或者铰链、CH1、CH2和CH3区。关于免疫球蛋白融合物的生成还可参见美国专利第5,428,130号，1995年6月27日公告及Chamow等，TIBTECH，14：52-60(1996)。

一种任选的免疫粘附素设计是将粘附素(例如DR6和/或APP胞外域)的结合结构域与免疫球蛋白重链的Fc区进行组合。通常，在制备本发明的免疫粘附素时，将编码粘附素结合结构域的核酸融合在编码免疫球蛋白恒定区序列N-末端的核酸的C-末端侧，然而N-末端融合物也是可能的。

通常，在此类融合物中，所编码的嵌合多肽将至少保留有功能活性的免疫球蛋白重链恒定区铰链、CH₂和CH₃结构域。还可以对恒定区Fc部分的C-末端进行融合，或者紧挨着重链CH₁或轻链对应区的N-末端进行。进行融合的精确位点不是至关重要的；具***点是众所周知的，而且可以进行选择以优化免疫粘附素的生物学活性、分泌或结合特征。

在一个优选的实施方案中，将粘附素序列融合在免疫球蛋白G₁(IgG₁)Fc区的N-末端。有可能将整个重链恒定区与粘附素序列融合。然而，更优选的是，在融合中使用在铰链区中紧挨着在化学上定义IgG Fc的木瓜蛋白酶切割位点(即残基216，以重链恒定区的第一个残基为114)或其它免疫球蛋白的类似位点上游开始的序列。在一个特别优选的实施方案中，将粘附素氨基酸序列与IgG重链的(a)铰链区、CH₂和CH₃，或者(b)CH₁、铰链、CH₂和CH₃结构域融合。

对于双特异性免疫粘附素，将免疫粘附素装配成多聚体，特别是异二聚体或异四聚体。通常，这些装配好的免疫球蛋白将具有已知的单元结构。基本的四链结构单元就是IgG、IgD和IgE存在的形式。四链单元在更高分子量的免疫球蛋白中重复；IgM通常作为通过二硫键保持在一起的四个基本单元的五聚体存在。IgA球蛋白及偶尔的IgG球蛋白也可以以多聚体的形式存在于血清中。在多聚体的情况中，四个单元可以是各自相同的或不同的。

下面示意性的列举了在本文范围内的各种例示性的装配好的免疫粘附素：

(a)AC_L-AC_L；

(b)AC_H-(AC_H，AC_L-AC_H，AC_L-V_HC_H，或V_LC_L-AC_H)；

(c)AC_L-AC_H-(AC_L-AC_H，AC_L-V_HC_H，V_LC_L-AC_H，或V_LC_L-V_HC_H)

(d)AC_L-V_HC_H-(AC_H，AC_L-V_HC_H，或V_LC_L-AC_H)；

(e)V_LC_L-AC_H-(AC_L-V_HC_H，或V_LC_L-AC_H)；及

(f)(A-Y)n-(V_LC_L-V_HC_H)₂，

其中各个A代表相同或不同的粘附素氨基酸序列；

V_L是免疫球蛋白轻链可变域；

V_H是免疫球蛋白重链可变域；

C_L是免疫球蛋白轻链恒定域；

C_H是免疫球蛋白重链恒定域；

n是大于1的整数；

Y代表共价交联剂的残基。

为简短起见，上述结构只显示了关键特征；它们没有标明免疫球蛋白的连接(J)或其它结构域，也没有显示二硫键。然而，若结合活性需要此类结构域，则构建时它们应当存在于它们在免疫球蛋白分子中所占据的通常位置。

或者，可以将粘附素序列***免疫球蛋白重链与轻链序列之间，从而得到包含嵌合重链的免疫球蛋白。在这个实施方案中，将粘附素序列融合在免疫球蛋白每个臂中的免疫球蛋白重链的3’端，或是在铰链与CH₂结构域之间，或是在CH₂与CH₃结构域之间。类似的构建物已报道于Hoogenboom等，Mol.Immunol.，28：1027-1037(1991)。

尽管本发明的免疫粘附素中不需要存在免疫球蛋白轻链，然而免疫球蛋白轻链可以与粘附素-免疫球蛋白重链融合多肽共价结合的形式存在，或是以直接与粘附素融合的形式存在。在前一种情况中，通常将编码免疫球蛋白轻链的DNA与编码粘附素-免疫球蛋白重链融合蛋白的DNA共表达。在分泌后，杂合重链与轻链将共价结合以提供包含二个二硫键相连的免疫球蛋白重链-轻链对的免疫球蛋白样结构。适于制备此类结构的方法披露于例如美国专利第4,816,567号，公告于1989年3月28日。最方便的是通过将编码粘附素部分的cDNA序列与免疫球蛋白cDNA序列以符合读码框的形式融合来构建免疫粘附素。然而，也可以使用与基因组免疫球蛋白片段的融合(参见例如Aruffo等，Cell，61：1303-1313(1990)；和Stamenkovic等，Cell，66：1133-1144(1991))。后一种类型的融合要求存在Ig调控序列以供表达。编码IgG重链恒定区的cDNA可以根据已发表的序列自衍生自脾或外周血淋巴细胞的cDNA文库分离，通过杂交或者通过聚合酶链式反应(PCR)技术。将编码免疫粘附素的“粘附素”和免疫球蛋白部分的cDNA串联***在所选宿主细胞中高效表达的质粒载体。

在另一个实施方案中，DR6拮抗剂可以通过以美国专利Nos.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所列方式将受体多肽与多种非蛋白质性质聚合物之一，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯，或者其它类似分子诸如聚谷氨酸酯/盐(polyglutamate)连接而共价修饰。此类PEG化形式可使用本领域已知技术来制备。

本发明还设想了亮氨酸拉链形式的这些分子。“亮氨酸拉链”是本领域中用于指增强、促进或驱动其融合配偶体(例如亮氨酸拉链与之融合或连接的序列或分子)二聚化或三聚化的富含亮氨酸序列的术语。本领域已经记载了多种亮氨酸拉链多肽。参见例如Landschulz等，Science，240：1759(1988)；美国专利5,716,805；WO 94/10308；Hoppe等，FEBS Letters，344：1991(1994)；Maniatis等，Nature，341：24(1989)。本领域技术人员将领会，亮氨酸拉链序列可以融合在DR6分子的5′或3′端。

本发明的DR6和/或APP多肽还可以以如下方式修饰，即通过将多肽与另一种异源多肽或氨基酸序列融合而形成嵌合分子。优选的是，所述异源多肽或氨基酸序列的作用是使嵌合分子寡聚化。在一个实施方案中，此类嵌合分子包括DR6和/或APP多肽与标签多肽的融合，所述标签多肽提供了抗标签抗体可选择性结合的表位。通常将表位标签置于多肽的氨基或羧基末端。此类表位标记形式的多肽的存在情况可使用针对标签多肽的抗体来检测。还有，表位标签的提供使得多肽易于使用抗标签抗体或结合表位标签的其它类型亲和机制通过亲和纯化进行纯化。多种标签多肽及其相应的抗体是本领域众所周知的。例子包括聚组氨酸(poly-his)或聚组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签；流感HA标签多肽及其抗体12CA5(Field等，Mol.Cell.Biol.，8：2159-2165(1988))；c-myc标签及其抗体8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10(Evan等，Molecular and Cellular Biology，5：3610-3616(1985))；及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborsky等，Protein Engineering，3(6)：547-553(1990))。其它标签多肽包括Flag肽(Hopp等，BioTechnology，6：1204-1210(1988))；KT3表位肽(Martin等，Science，255：192-194(1992))；α-微管蛋白表位肽(Skinner等，J.Biol.Chem.，266：15163-15166(1991))；及T7基因10蛋白肽标签(Lutz-Freyermuth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6393-6397(1990))。

抗DR6和抗APP抗体

本发明的其它实施方案提供了DR6和/或APP抗体。例示性抗体包括多克隆的、单克隆的、人源化的、双特异性的和异源偶联的抗体。这些抗DR6和/或APP抗体优选是DR6拮抗性抗体。

多克隆抗体

本发明的抗体可包括多克隆抗体。用于制备多克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的。多克隆抗体可在哺乳动物中生成，例如通过一次或多次注射免疫剂和根据需要的佐剂。通常，免疫剂和/或佐剂将通过多次皮下或腹膜内注射而注射到哺乳动物中。免疫剂可包括DR6和/或APP多肽(例如DR6和/或APP ECD)或其融合蛋白。将免疫剂与已知在所免疫哺乳动物中有免疫原性的蛋白质偶联可能是有用的。此类免疫原性蛋白质的例子包括但不限于匙孔

血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。可采用的佐剂的例子包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰基脂质A、合成的海藻糖二白喉菌酸酯(dicorynomycolate))。免疫方案可以由本领域技术人员无需过多实验做出选择。然后可以对哺乳动物采血，并对血清测定DR6和/或APP抗体滴度。根据需要，可对哺乳动物进行加强免疫，直到滴度升高或达到稳定的高浓度(plateau)。

单克隆抗体

或者，本发明的抗体可以是单克隆抗体。单克隆抗体可使用杂交瘤法制备，诸如Kohler and Milstein，Nature 256：495(1975)所述。在杂交瘤法中，小鼠、仓鼠或其它适宜的宿主动物通常用免疫剂免疫以引发生成或能够生成将特异性结合免疫剂的抗体的淋巴细胞。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。

免疫剂将通常包括DR6和/或APP多肽(例如DR6和/或APP ECD)或其融合蛋白，诸如DR6ECD-IgG和/或APP sAPP-IgG融合蛋白。

通常，若希望为人起源的细胞，则使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，或者，若希望为非人哺乳动物来源的细胞，则使用脾细胞或***细胞。然后，使用合适的融合剂，诸如聚乙二醇，将淋巴细胞与永生化细胞系融合以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，AcademicPress(1986)，pp.59-103)。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类、牛和人起源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可在合适的培养基中培养，所述培养基优选含有抑制未融合的永生化细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的培养基通常将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(“HAT培养基”)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。

优选的永生化细胞系是那些高效融合、支持选定的抗体生成细胞稳定地高水平地表达抗体、并对诸如HAT培养基等培养基敏感的细胞系。更优选的永生化细胞系是鼠源骨髓瘤系，可从例如索尔克研究所细胞分配中心(SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diege，California，USA)和美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，Virginia，USA)获得。此类鼠骨髓瘤细胞系的一个例子是P3X63Ag8U.1(ATCC CRL 1580)。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已有描述(Kozbor，J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications，Marcel Dekker，Inc.，New York(1987)pp.51-63)。

然后可对杂交瘤细胞在其中培养的培养基测定针对DR6和/或APP的单克隆抗体的存在。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。此类技术和测定法是本领域已知的。单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson and Pollard，Anal.Biochem.107：220(1980)的Scatchard分析或通过BiaCore分析来测定。

在鉴定得到期望的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释流程进行亚克隆，并通过标准方法进行培养(Goding，见上文)。适于这一目的的培养基包括例如Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基或RPMI-1640培养基。或者，杂交瘤细胞可在哺乳动物中作为腹水进行体内培养。

可通过常规免疫球蛋白纯化流程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基或腹水分开或纯化。

单克隆抗体还可通过重组DNA技术来生成，诸如美国专利4,816,567中所述。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规流程分离和测序(例如使用能够特异性结合编码单克隆抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞是此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到不另外产生免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞中，诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。还可以修饰DNA，例如通过替代，即用人重链和轻链恒定区的编码序列代替同源鼠源序列(Morrison等，Proc.Nat.Acad.Sci.81：6851(1984))，或者通过共价接合免疫球蛋白编码序列和非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列。可以以该方式制备具有本文中抗DR6单克隆抗体的结合特异性的“嵌合”或“杂合”抗体。

通常用此类非免疫球蛋白多肽替代本发明抗体的恒定域，或者用它们替代本发明抗体的一个抗原结合位点的可变域以产生嵌合二价抗体，其包含对DR6具有特异性的一个抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一抗原结合位点。

嵌合或杂合抗体也可在体外使用合成蛋白质化学的已知方法来制备，包括那些涉及交联剂的方法。例如，可使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。适于此目的的试剂的例子包括亚氨基硫醇酯/盐(iminothiolate)和4-巯基丁酰亚胺酸甲酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。

也可以生成单链Fv片段，诸如Iliades等，FEBS Letters，409：437-441(1997)中所述。此类单链片段使用各种接头的偶联记载于Kortt等，ProteinEngineering，10：423-433(1997)。本领域知道用于重组生产和操作抗体的多种技术。下文更为详细的描述了熟练技术人员通常使用的此类技术的例示性例子。

人源化抗体

通常，人源化抗体中引入了一个或多个来自非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们通常取自“输入”可变区。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法进行(Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 239：1534-1536(1988))，即用啮齿类CDR或CDR序列替代人抗体的相应序列。

因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体，其中基本上少于整个人可变区用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代的人抗体。

重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力及其它有利的生物学特性。为了实现这一目标，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，且为本领域技术人员所熟悉。可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从共有和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得期望抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。一般而言，CDR残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。

人抗体

人单克隆抗体可通过杂交瘤方法生成。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已有描述，例如Kozbor，J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.，New York(1987)。

现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫时生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(J_H)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移整套人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击时生成人抗体。参见例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551-255(1993)；Jakobovits等，Nature 362：255-258(1993)。

Mendez等人(Nature Genetics 15：146-156(1997))进一步改进了技术，生成了称为“Xenomouse II”(异种移植物小鼠)的转基因小鼠品系，它在受到抗原攻击时生成高亲和力的完全人的抗体。这是如上所述通过将数百万碱基的人重链和轻链基因座种系整合到内源JH区段有删除的小鼠中而实现的。Xenomouse II携带1,020kb的人重链基因座，包含大约66种V_H基因、完整的D_H和J_H区、及三种不同的恒定区(μ、δ和χ)，还携带800kb人κ基因座，包含32种Vκ基因、Jκ区段和Cκ基因。这些小鼠中生成的抗体在所有方面与在人体中看到的极其相似，包括基因重排、装配和全集。由于内源J_H区段的删除防止了鼠基因座的基因重排，因此人抗体较之内源抗体优先表达。

或者，噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature 348：552-553(1990))可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变区(V)基因全集生成人抗体和抗体片段。依照这种技术，将抗体V结构域基因以符合读码框的方式克隆到丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状噬菌体颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因的选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种形式进行；有关综述参见例如Johnson，Kevin S.and Chiswell，David J.，Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。Clackson等，Nature 352：624-628(1991)从衍生自经免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库中分离得到大量不同的抗噁唑酮抗体。可本质上遵循Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)或Griffith等，EMBO J.12：725-734(1993)所述技术，由未免疫人供体构建V基因全集和分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。在天然免疫应答中，抗体基因以高比率积累突变(体细胞高变)。导入的有些变化将赋予更高亲和力，展示高亲和力表面免疫球蛋白的B细胞在随后的抗原攻击过程中优先复制和分化。这种天然过程可通过采用称为“链改组”的技术来模拟(Marks等，Bio/Technol.10：779-783(1992))。在这种方法中，通过噬菌体展示得到的“初始”人抗体的亲和力可通过用从未免疫供体得到的V结构域基因天然存在的变体(全集)相继替换重链和轻链V区基因而提高。此技术得以生成亲和力在nM范围中的抗体和抗体片段。Waterhouse等，Nucl.Acids Res.21：2265-2266(1993)记载了用于构建非常大的噬菌体全集(也称为“所有文库的母库”(the mother-of-alllibraries))的策略。基因改组也可用于从啮齿类抗体衍生人抗体，其中人抗体具有与起始啮齿类抗体相似的亲和力和特异性。依照此方法，它也称为“表位印记”(epitope imprinting)，通过噬菌体展示技术得到的啮齿类抗体的重链或轻链V结构域基因用人V结构域基因全集替换，产生啮齿类-人嵌合物。对抗原进行的选择导致能够恢复功能性抗原结合位点的人可变区的分离，即表位决定(印记，imprint)配偶体的选择。在重复该过程以替换剩余啮齿类V结构域时，得到人抗体(参见PCT专利申请WO 93/06213，公开于1993年4月1日)。与传统的通过CDR移植进行的啮齿类抗体的人源化不同，此技术提供完全人的抗体，它们不含啮齿类起源的框架或CDR残基。

正如下文详细讨论的，本发明的抗体可任选包括抗体单体、抗体二聚体、以及抗体的多价形式。本领域技术人员可通过本领域已知技术并使用本文中的DR6和/或APP抗体来构建此类二聚体或多价形式。用于制备单价抗体的方法也是本领域众所周知的。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和经修饰重链的重组表达。重链通常在Fc区中的任意点截短以防止重链交联。或者，相关半胱氨酸残基用另一种氨基酸残基替代或删除以防止交联。

双特异性抗体

双特异性抗体指对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆，优选人或人源化抗体。在本案中，一种结合特异性是对DR6受体，另一种是对任何其它抗原，优选对另一种受体或受体亚基。用于生成双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，双特异性抗体的重组生成基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种重链具有不同的特异性(Millstein and Cuello，Nature305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成十种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产率低。1993年5月13日公开的WO 93/08829及Traunecker等，EMBO 10：3655-3659(1991)中披露了类似的流程。

依照一种不同的且更优选的方法，将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。融合优选使用包含至少部分铰链、CH₂和CH₃区的免疫球蛋白重链恒定域。优选在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH₁)。将编码免疫球蛋白重链融合物及，如果需要，免疫球蛋白轻链的DNA***分开的表达载体，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比率表达导致高产量时或在该比率没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列***同一个表达载体。在该方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了分离的便利途径，因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于1994年3月3日公开的PCR申请WO 94/04690。

关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh等，Methods inEnzymology 121：210(1986)。

异源偶联抗体

异源偶联抗体也在本发明的范围之内。异源偶联抗体由两种共价连接的抗体构成。此类抗体建议例如用于将免疫***细胞靶向不想要的细胞(美国专利4,676,980)及用于治疗HIV感染(PCT申请WO 91/00360和WO 92/200373；EP 03089)。异源偶联抗体可使用任何方便的交联方法来生成。合适的交联剂是本领域众所周知的，连同许多交联技术一起披露于美国专利4,676,980。

抗体片段

在某些实施方案中，抗DR6和/或APP抗体(包括鼠的、人的和人源化的抗体，及抗体变体)是抗体片段。已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto等，J.Biochem.Biophys.Methods 24：107-117(1992)；Brennan等，Science 229：81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。例如，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并化学偶联以形成F(ab′)₂片段(Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992))。在另一个实施方案中，F(ab′)₂片段是使用亮氨酸拉链GCN4形成的，以促进F(ab′)₂分子的装配。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离Fv、Fab或F(ab′)₂片段。用于生成抗体片段的多种技术对熟练从业人员将是显而易见的。例如，可使用木瓜蛋白酶进行消化。木瓜蛋白酶消化的例子记载于94年12月22日公开的WO 94/29348和美国专利4,342,566。用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称作Fab片段，各自具有一个抗原结合位点，及一个残余Fc片段。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)₂片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。

抗体消化中产生的Fab片段还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH₁)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于重链CH₁结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab′的称谓。F(ab′)₂抗体片段最初是作为在Fab′片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab′片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。

抗体的糖基化变体

抗体在其恒定区中的保守位置发生糖基化(Jefferis and Lund，Chem.Immunol.65：111-128(1997)；Wright and Morrison，TibTECH 15：26-32(1997))。免疫球蛋白的寡糖侧链影响蛋白质的功能(Boyd等，Mol.Immunol.32：1311-1318(1996)；Wittwe and Howard，Biochem.29：4175-4180(1990))，及糖蛋白各部分间的分子内相互作用，它可影响糖蛋白的构象和所呈现的三维表面(Hefferis and Lund，supra；Wyss and Wagner，Current Opin.Biotech.7：409-416(1996))。寡糖还可用来使给定糖蛋白靶向基于特定识别结构的某些分子。例如，已有报道，在无半乳糖基化IgG中，寡糖模块从CH₂之间的空间“伸出”，末端N-乙酰葡糖胺残基得以结合甘露糖结合蛋白(Malhotra等，Nature Med.1：237-243(1995))。用糖肽酶除去中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中所生成的CAMPATH-1H(一种识别人淋巴细胞CDw52抗原的重组人源化鼠单克隆IgG1抗体)上的寡糖导致补体介导的细胞溶解(CMCL)完全降低(Boyd等，Mol.Immunol.32：1311-1318(1996))，而用神经氨酸酶选择性消除唾液酸残基不导致DMCL的丧失。还有报道，抗体的糖基化影响抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。具体而言，有报道说，其中β(1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII)(催化等分GlcNAc形成的糖基转移酶)的表达受四环素调控的CHO细胞具有改良的ADCC活性(Umana等，Mature Biotech.17：176-180(1999))。

抗体的糖基化变体指其中抗体的糖基化样式发生改变的变体。改变意味着删除抗体中发现的一个或多个碳水化合物模块，向抗体中添加一个或多个碳水化合物模块，改变糖基化(糖基化样式)的组成、糖基化的程度、等。糖基化变体可以通过例如在编码抗体的核酸序列中消除、改变和/或添加一个或多个糖基化位点来制备。

抗体的糖基化典型的或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。如此，多肽中这两种三肽序列任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。

向抗体中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上述三肽序列而便利的完成(用于N-连接的糖基化位点)。所述改变还可通过向初始抗体的序列中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(用于O-连接的糖基化位点)。

还可以在不改变基础核苷酸序列的前提下改变抗体的糖基化(包括糖基化样式)。糖基化很大程度上取决于用于表达抗体的宿主细胞。由于用于表达作为潜在治疗剂的重组糖蛋白例如抗体的细胞类型很少是天然细胞，因此可预期抗体的糖基化样式将有显著变异(参见例如Hse等，J.Biol.Chem.272：9062-9070(1997))。在宿主细胞的选择之外，在抗体的重组生成过程中影响糖基化的因素包括生长模式、培养基配方、培养密度、氧供氧用(oxygenation)、pH、纯化方案、诸如此类。已经提出多种方法用于改变在特定宿主生物体中实现的糖基化样式，包括导入或过表达涉及寡糖生成的某些酶(美国专利5,047,335；5,510,261和5.278,299)。糖基化或某些类型的糖基化可从糖蛋白中酶促清除，例如使用内切糖苷酶H(Endo H)。另外，可对重组宿主细胞进行遗传工程改组，例如使其在加工某些类型的多糖方面缺陷。这些和类似的技术是本领域众所周知的。

抗体的糖基化结构可通过碳水化合物分析的常规技术容易的分析，包括凝集素层析、NMR、质谱、HPLC、GPC、单糖成分分析、序贯酶促消化和HPAEC-PAD，它利用高pH阴离子交换层析根据电荷来分离寡糖。为分析目的释放寡糖的方法也是知道的，包括但不限于酶促处理(常常使用肽-N-糖苷酶F/内切-β-半乳糖苷酶进行)、使用强碱环境的消除以释放主要是O-连接结构、及使用无水肼的化学方法以释放N-和O-连接寡糖二者。

例示性抗体

如下文实施例中所述，已经鉴定了许多抗DR6单克隆抗体。在任选的实施方案中，本发明的DR6抗体将具有与本文中明确公开的任何抗DR6和/或APP抗体相同的生物学特征。

术语“生物学特征”用于指单克隆抗体的体外和/或体内活性或特性，诸如特异性结合DR6或者阻断、抑制或中和DR6活化的能力。DR6和/或APP抗体的特性和活性在下文实施例中有进一步描述。

任选的是，本发明的单克隆抗体将具有与下文实施例中具体表征的任何抗体相同的生物学特征，和/或与这些抗体结合相同表位。这可通过进行多种测定法来测定，诸如本文和实施例中所述。例如，为了测定某单克隆抗体是否具有与本文中明确提到的DR6和/或APP抗体相同的特异性，可在竞争性结合测定法中比较其活性。另外，特定抗DR6和/或APP抗体所结合的表位可通过DR6和/或APP和所讨论抗体间复合物的结晶学研究来测定。

如本文所述，DR6和/或APP抗体将优选拥有期望的DR6拮抗活性。此类DR6抗体可包括但不限于嵌合的、人源化的、人的和亲和力成熟的抗体。如上所述，DR6和/或APP抗体可使用多种技术构建或改组以实现这些期望活性或特性。

本发明的其它实施方案包括这样的本文中所公开的抗DR6受体和/或APP配体抗体，它与选自下组的一种或多种非蛋白质性质的聚合物相连：聚乙二醇、聚丙二醇和聚氧化烯(polyoxyalkylene)。任选的是，本文中所公开的抗DR6受体和/或APP配体抗体是糖基化的或者未糖基化的。

本发明的抗体包括“交联”DR6和/或APP抗体。术语“交联”在用于本文时指至少两个IgG分子结合到一起以形成一个(或单一)分子。DR6和/或APP抗体可使用多种连接分子来交联，优选的是，DR6和/或APP抗体是使用抗IgG分子、补体、化学修饰或分子工程而交联的。本领域技术人员应当领会，一旦抗体结合细胞表面膜，补体对抗体分子具有相对较高的亲和力。因此，认为补体可作为交联分子用于连接细胞表面膜所结合的两个或多个抗DR6抗体。

本发明还提供了编码本文所述DR6和/或APP抗体的分离核酸、包含所述核酸的载体和宿主细胞、及用于生成所述抗体的重组技术。

为了重组生成抗体，分离编码它的核酸，并***可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。可以使用常规流程容易地分离编码抗体的DNA并测序(例如使用能够与编码抗体的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。可以获得许多载体。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。

本文中的方法包括用于生成嵌合的和重组的抗DR6和/或APP抗体的方法，包括如下步骤：提供包含编码抗DR6和/或APP抗体轻链或重链(或者轻链和重链二者)的DNA序列的载体；用所述载体转染或转化宿主细胞；并在足以生成重组抗DR6和/或APP抗体产物的条件下培养所述宿主细胞。

DR6拮抗剂的配制剂

在制备本文中的典型配制剂时，注意到所采用成分的推荐品质或“等级”将取决于配制剂的最终用途。对于治疗用途，各种成分优选是容许作为药用产品添加剂的等级的(诸如“GRAS”)。

在某些实施方案中，提供了包含DR6拮抗剂及一种或多种赋形剂的组合物，所述赋形剂提供足够离子强度以提高DR6拮抗剂的溶解性和/或稳定性，其中该组合物的pH为6(或大约6)至9(或大约9)。DR6拮抗剂可以通过任何合适方法来制备以实现期望的蛋白质纯度，例如依照上文方法。在某些实施方案中，DR6拮抗剂在宿主细胞中重组表达或通过化学合成来制备。DR6拮抗剂在配制剂中的浓度可以根据例如配制剂的计划用途而变化。本领域技术人员无需过多实验就可以决定DR6拮抗剂的期望浓度。

配制剂中提供足够离子强度以提高DR6拮抗剂的溶解性和/或稳定性的一种或多种赋形剂任选是多离子(polyionic)有机或无机酸、天冬氨酸(盐)/(酯)、硫酸钠、琥珀酸钠、醋酸钠、氯化钠、Captisol^TM、Tris、精氨酸盐或其它氨基酸、糖和多元醇诸如海藻糖和蔗糖。优选的是，配制剂中提供足够离子强度的一种或多种赋形剂是盐。可采用的盐包括但不限于钠盐和精氨酸盐。所采用盐的类型和盐的浓度优选使得配制剂具有相对较高的离子强度，使得配制剂中的DR6拮抗剂是稳定的。任选的是，盐在配制剂中存在的浓度为约20mM至约0.5M。

组合物的pH优选为6(或大约6)至9(或大约9)，更优选大约6.5至大约8.5，甚至更优选大约7至大约7.5。在此实施方案的一个优选方面，组合物还将包含缓冲剂以至少维持组合物的pH为大约6至大约8。可采用的缓冲剂的例子包括但不限于Tris、HEPES和组氨酸。在采用Tris时，任选将pH调至大约7至8.5。在采用Hepes或组氨酸时，任选将pH调至大约6.5至7。任选的是，缓冲剂在配制剂中的使用浓度为大约5mM至大约50mM。

特别是对于液体配制剂(或重建的冻干配制剂)，可能希望在组合物中包含一种或多种表面活性剂。此类表面活性剂可以包括例如非离子表面活性剂，像TWEEN^TM或PLURONICS^TM(例如聚山梨醇酯或poloxamer)。优选的是，表面活性剂包括聚山梨醇酯20(“TWEEN 20”)。表面活性剂的使用浓度任选为大约0.005％至大约0.2％。

本发明的配制剂可以在DR6拮抗剂及上文所述那些成分之外进一步包含各种其它赋形剂或成分。任选的是，供肠胃外施用的配制剂可以包含药剂学或肠胃外可接受的载体，即在所采用的剂量和浓度对接受者无毒且与配制剂的其它组分相容的载体。任选的是，载体是肠胃外载体，诸如与接受者的血液等渗的溶液。此类载体媒介的例子包括水、盐水或缓冲溶液，诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。各种任选的药剂学可接受的载体、赋形剂或稳定剂进一步记载于Remington′s PharmaceuticalSciences，16th edition，Osol，A.ed.(1980)。

本文中的配制剂还可含有一种或多种防腐剂。例子包括氯化十八烷基二甲基苄基铵、氯化己烷双胺、苯扎氯铵(氯化烷苄基二甲基铵的混合物，其中烷基为长链化合物)和苯索氯铵。其它类型的防腐剂包括芳香醇、对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、和间甲酚。抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；丁醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；或聚乙二醇(PEG)。

本发明的组合物可包括液体配制剂(液体溶液或液体悬浮液)和冻干配制剂，以及悬浮液配制剂。

如果是液体，最终配制剂优选冷冻贮存于≤20℃。或者，可冻干该配制剂并作为与注射用水重建的粉剂提供，该粉剂任选可贮存于2-30℃。

用于治疗性施用的配制剂必须是无菌的。通过无菌滤膜(例如0.2微米滤膜)过滤可轻易实现灭菌。通常将治疗用组合物置于具有灭菌存取口的容器中，例如具有可用皮下注射针头刺穿的塞子的静脉内溶液袋或药瓶。

作为水溶液或用于重建的冻干配制剂，通常将组合物存储在单个单位或多剂量容器中，例如密封的安瓿或药瓶。该容器可以是本领域可获得的任何容器，并用常规方法填充。任选的是，该配制剂可装入注射笔装置(或装入笔装置的药筒)，诸如那些本领域可获得的装置(参见例如美国专利5,370,629)，它们适合配制剂的治疗性投递。例如，可使用注射用水重建冻干的DR6拮抗剂配制剂来制备注射液。

使用DR6拮抗剂的疗法

本发明的DR6拮抗剂具有多种效用。DR6拮抗剂在神经学病症的诊断和治疗中是有用的。哺乳动物中本文所述各种病理学疾患的诊断可以由熟练从业人员来进行。诊断技术是本领域可获得，其容许例如哺乳动物中各种神经学病症的诊断或检测。

通过本发明治疗的神经学病症包括家族性和散发性肌萎缩性侧索硬化(分别为FALS和ALS)、家族性和散发性帕金森氏病、亨庭顿氏病、家族性和散发性阿耳茨海默氏病和脊髓性肌萎缩(SMA)(Price等，见上文)。这些疾病中许多以成年中期发作为典型，且导致神经***特定神经元亚群的快速变性(degeneration)，最终导致过早死亡。

肌萎缩性侧索硬化(ALS)是最常诊断出的渐进性运动神经元疾病。该病以皮层、脑干和脊髓中运动神经元的变性为特征(Siddique等，J.Neural Transm. Suppl.，49：219-233(1997)；Siddique等，Neurology，47：(4 Suppl 2)：S27-34；discussion S34-5(1996)；Rosen等，Nature，362：59-62(1993)；Gurney等，Science，264：1772-17751994))。

帕金森氏病(震颤麻痹)是常见的神经变性性病症，其通常出现于生命中期至晚期。家族性和散发性病例有发生，尽管家族性病例只占所观察到的病例的1-2％。患者常常具有神经细胞损失及脑干蓝斑和黑质中的反应性神经胶质瘤病(reactive gliosis)和Lewy小体(Lewy bodies)。作为一类，黑质纹状体多巴胺能神经元似乎是最受影响的(Uhl等，Neurology，35：1215-1218(1985)；Levine等，Trends Neurosci.，27：691-697(2004)；Fleming等，NeuroRx，2：495-503(2005))。

近端脊髓性肌萎缩(SMA)是常见的人类常染色体隐性神经变性性疾病，典型地以脊髓运动神经元损失和四肢和躯干肌肉萎缩为特征(Monani等，Hum.Mol.Genet.，9：2451-2457(2000)；Monani等，J.Cell Biol.，160：41-52(2003))。它以10,000个体中1例的频率发生，而且是婴儿死亡的最常见遗传原因。根据发作的年龄和疾病表型的严重性，近端SMA分为I型(重度)、II型(中度)、和III型(轻度)SMA。该病的所有三种形式都是由于运动神经元基因(SMN1)的端粒存活的突变或丧失(Monani等，见上文，2000；Monani等，见上文，2003))。

已经在许多神经变性性疾病中报道了神经元细胞损失，包括阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、和脊髓性肌萎缩(SMA)。

任选的是，患者中阿耳茨海默氏病的诊断可基于第四版《精神障碍的诊断和统计手册》(Diagnostic and Statistical Manual of Mental disorders，DSM-IV-TR)的标准(参见例如美国精神病学会精神障碍的诊断和统计手册第四版修订文本(American Psychiatric Association.Diagnostic and statisticalmanual of mental disorders，4th Edition-text revised).Washington，DC：2000)。简言之，DSM-IV-TR标准包括：(A)形成多种认知缺陷，其表现为记忆受损和以下一项或多项二者：(1)失语；(2)失用；(3)失认；或(4)执行机能紊乱；(B)该认知缺陷呈现自先前的机能下降且引起社会或职业机能的显著损害；(C)病程以逐渐发作和持续下降为特征；(D)该认知缺陷不是由于其它中枢神经***的、***性的、或物质诱导的引起记忆和认知渐进性缺陷的疾患；和(E)该紊乱不能由其它精神病学病症更好的解释。可做出阿耳茨海默氏病诊断的备选标准包括那些基于国家神经病学和交流障碍和中风学会-阿耳茨海默氏病和相关病症学会(National Institute of Neurological and CommunicativeDisorders and Stroke-Alzheimer′s Disease and Related Disorder Association，NINDS-ADRDA)工作组关于阿耳茨海默氏病的标准(参见例如McKhann等，Neurology 1984；34：939-944)。简言之，NINCDS-ADRDA关于可能的阿耳茨海默氏病的标准包括伴有非典型性发作、表现(presentation)、或进展且没有已知病因的痴呆综合征，其中认为任何能够引起痴呆的共同发病的疾病(co-morbid disease)不是原因。NINCDS-ADRDA关于可能的阿耳茨海默氏病的标准包括通过临床和神经心理测验确定的痴呆，且牵涉(a)两个或更多个认识领域(包括记忆)的渐进性缺陷；(b)在40和90岁之间发作；和(c)不存在能够引起痴呆综合征包括谵妄的***性的或其它的脑病。NINCDS-ADRDA关于确诊的阿耳茨海默氏病的标准包括达到关于可能的阿耳茨海默氏病的标准且经尸检或活检具有阿耳茨海默氏病的组织病理学证据。

修订后的NINDS-ADRDA诊断标准已经在Dubois等，The LancetNeurology，Volume 6，Issue 8，August 2007，Pages 734-746中提出。正如下文简要概述的，为了达到这种关于可能的阿耳茨海默氏病的标准，患病个体必须满足标准A(核心临床标准)和B、C、D、或E中记录的至少一项或多项支持性生物标志物标准。在此语境中，标准A以存在早期的和显著的事件记忆缺陷为特征，该缺陷包括以下特征：(1)患者或知情人报告了超过6个月里逐渐的和渐进的记忆功能变化；(2)测验中显著受损的事件记忆的客观证据：这一般由在提示或认识测验中和在先前已经控制了信息的有效编码后没有显著改善或没有恢复正常的回忆缺陷所构成；(3)AD发作时或随着AD发展，事件记忆缺陷可以是与其它认知变化隔离的(isolated)或联合的(associated)。标准B以存在居中颞叶萎缩为特征，表现为例如：MRI及使用视觉评分(visualscoring)的定性评级(qualitative ratings)(参比完善表征的正常年龄标准的群体)和感兴趣区域的定量容量测定(quantitative volumetry)(参比完善表征的正常年龄标准的群体)证明了海马、内嗅皮质、杏仁核的体积损失。标准C以异常脑脊髓液生物标志物为特征，例如淀粉状蛋白β_1-42浓度低、总τ浓度升高、或磷酸-τ浓度升高、或三者的组合。标准C以使用PET的功能性神经影像的特定样式为特征，例如双侧颞顶区中葡萄糖代谢降低。标准C以近亲属中证明AD常染色体显性突变为特征。若存在以下各项，则认为AD确诊：(1)根据NIA-Reagan关于AD死后诊断的标准的要求，疾病的临床和组织病理学(脑活检或尸检)两种证据；标准必须存在(参见例如Neurobiol Aging 1997；18：S1-S2)；和(2)AD的临床和遗传两种证据(染色体1、14、或21上的突变)；标准必须存在。

在本发明的方法中，DR6拮抗剂优选在载体，优选药学可接受载体中施用于哺乳动物。合适的载体及其配制剂记载于《Remington′s PharmaceuticalSciences》中，第16版，1980，Mack Publishing Co.，Osol等人编。典型的是，在配制剂中使用适宜量的药学可接受盐使得配制剂等渗。载体的例子包括盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。溶液的pH优选约5至约8，更优选约7至约7.5。其它载体包括持续释放制剂，诸如含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜、脂质体或微胶囊。对本领域技术人员显而易见的是，根据例如施用路径和所施用DR6拮抗剂的浓度，某些载体可能是更优选的。

DR6拮抗剂可通过注射(例如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、门静脉内(intraportal))、口服施用于哺乳动物，或者通过确保以有效形式投递至血流的其它方法诸如灌注。DR6拮抗剂还可通过隔离灌注(isolated perfusion)技术(诸如隔离组织灌注)，或通过鞘内、眼内，或腰椎穿刺来施用，以发挥局部治疗效果。不易穿过血脑屏障的DR6拮抗剂可直接给予，例如大脑内，或进入脊髓空间(spinal cord space)或其它方式，其会将它们运输穿过屏障。施用DR6拮抗剂的有效剂量和时间表可凭经验确定，做出此类决定在本领域技术范围内。本领域技术人员将理解，必须施用的DR6拮抗剂剂量将取决于例如将接受拮抗剂的哺乳动物、施用路径、所用拮抗剂的具体类型及施用于哺乳动物的其它药物。选择适宜剂量的指导见例如关于抗体治疗性用途的文献，例如《Handbook of Monoclonal Antibodies》，Ferrone等人编，NogesPublications，Park Ridge，NJ，1985，第22章，第303-357页；Smith等，Antibodiesin Human Diagnosis and Therapy，Haber等，eds.，Raven Press，New York(1977)pp.365-389。DR6抗体单独使用的典型日剂量可在每天约1μg/kg体重至多达100mg/kg体重的范围内或更多，这取决于上述因素。

DR6拮抗剂也可以与一种或多种其它治疗剂联合施用于哺乳动物。此类其它治疗剂的例子包括表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂，例如结合或以其它方式与EGFR直接相互作用且阻止或降低其信号传导活性的化合物，诸如Tarceva，抗体，像C225(也称作西妥昔单抗(cetuximab)和

(ImCloneSystems Inc.))，完全人的ABX-EGF(panitumumab，Abgenix Inc.)，以及称作E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3和E7.6.3的及US 6,235,883中记载的完全人的抗体；MDX-447(Medarex Inc)，以及EGFR小分子抑制剂，诸如US5616582，US5457105，US5475001，US5654307，US5679683，US6084095，US6265410，US6455534，US6521620，US6596726，US6713484，US5770599，US6140332，US5866572，US6399602，US6344459，US6602863，US6391874，WO9814451，WO9850038，WO9909016，WO9924037，US6344455，US5760041，US6002008，US5747498中记载的化合物；具体的小分子EGFR抑制剂包括OSI-774(CP-358774，erlotinib，OSI Pharmaceuticals)；PD 183805(CI 1033，2-丙烯酰胺(propenamide)，N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-，二盐酸盐，Pfizer Inc.)；Iressa(ZD1839，吉非替尼(gefitinib)，4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉，AstraZeneca)；ZM 105180((6-氨基-4-(3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉，Zeneca)；BIBX-1382(N8-(3-氯-4-氟-苯基)-N2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5，4-d]嘧啶-2，8-二胺，Boehringer Ingelheim)；PKI-166((R)-4-[4-[(1-苯基乙基)氨基]-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-基]-酚)；(R)-6-(4-羟基苯基)-4-[(1-苯基乙基)氨基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶)；CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁炔酰胺(butynamide))；和EKB-569(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺(butenamide))。可采用的其它治疗剂包括凋亡抑制剂，特别是胞内凋亡抑制剂，例如胱天蛋白酶抑制剂，诸如胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-6、或胱天蛋白酶-8抑制剂，Bid抑制剂，Bax抑制剂或其任意组合。合适的抑制剂的例子一般有胱天蛋白酶抑制剂，二肽抑制剂，氨基甲酸酯抑制剂，取代的天冬氨酸缩醛，杂环二羰酰胺(heterocyclyldicarbamides)，喹啉-(二肽、三肽、四肽)衍生物，取代的2-氨基苯酰胺胱天蛋白酶抑制剂，取代的a-羟酸胱天蛋白酶抑制剂，亚硝基化的抑制作用；CASP-1；CASP-3：蛋白质抑制剂，反义分子，烟酰(nicotinyl)-天冬氨酰-酮，y-酮酸二肽衍生物，CASP-8：反义分子，相互作用蛋白CASP-9，CASP2：反义分子；CASP-6：反义分子；CASP-7：反义分子；和CASP-12抑制剂。其它例子有线粒体抑制剂，诸如Bcl-2调控因子；衍生自Bad的Bcl-2突变型肽、Bad、BH3相互作用结构域死亡激动剂、Bax抑制蛋白及BLK基因和基因产物。凋亡的其它合适胞内调控剂有CASP9/Apaf-1结合的拮抗剂、Apaf-1表达的反义调控剂、用于抑制凋亡的肽、包含单纯疱疹病毒R1亚基的抗凋亡组合物、MEKK1及其片段、存活蛋白(Survivin)的调控剂、凋亡抑制剂的调控剂、和HIAP2。此类药剂的其它例子包括抑制线粒体释放细胞色素c并阻断胱天蛋白酶-3mRNA上调的米诺环素(Minocycline)(NeuroapoptosisLaboratory)、作为p53抑制剂的Pifithrin alpha(UIC)、作为JNK途径抑制剂的CEP-1346(Cephalon Inc.)、抑制促凋亡GAPDH信号传导的TCH346(Novartis)、作为泛胱天蛋白酶抑制剂的IDN6556(Idun Pharmaceuticals)、作为胱天蛋白酶-3抑制剂的AZQs(AstraZeneca)、作为胱天蛋白酶-1/-4抑制剂的HMR-3480(Aventis Pharma)、和溶解血块(溶栓药)的Activase/TPA(Genentech)。

除了DR6拮抗剂之外可以施用的其它合适药剂包括胆碱酯酶抑制剂(诸如多奈哌齐(Donepezil)、加兰他敏(Galantamine)、利伐斯的明(Rivastigmine)、他克林(Tacrine))、NMDA受体拮抗剂(诸如美金刚(Memantine))、Aβ聚集抑制剂、抗氧化剂、γ-分泌酶调控剂、NGF模拟物或NGF基因疗法、PPARγ激动剂、HMG-CoA还原酶抑制剂(他汀类药物(statins))、安帕金(ampakines)、钙通道阻断剂、GABA受体拮抗剂、糖原合酶激酶抑制剂、静脉内免疫球蛋白、蝇蕈碱受体激动剂(muscarinic receptor agonists)、烟碱受体调控剂(nicotinic receptor modulators)、主动的或被动的Aβ免疫接种、磷酸二酯酶抑制剂、血清素受体拮抗剂和抗Aβ抗体(参见例如WO 2007/062852；WO2007/064972；WO 2003/040183；WO 1999/06066；WO 2006/081171；WO1993/21526；EP 0276723B1；WO 2005/028511；WO 2005/082939)。

DR6拮抗剂可以与一种或多种其它治疗剂顺序或同时施用。DR6拮抗剂和治疗剂的量取决于例如所用药物的类型、所治疗的病理学疾患、及施用的时间表和路径，但是通常低于各自单独使用时的量。

对哺乳动物施用DR6拮抗剂后，可以以熟练从业人员众所周知的多种方式监测哺乳动物的生理学状况。

本发明DR6拮抗剂的治疗效果可在体外测定法中和使用体内动物模型来检验。多种众所周知的测定法和动物模型可用于测试候选治疗剂的功效。此类模型的体内本质使得它们特别能预报在人类患者中的响应。各种神经变性性疾患的动物模型和用于检验与这些神经变性模型有关的病理过程(例如在存在和不存在DR6拮抗剂时)的有关技术在下文实施例14中讨论。

各种神经学病症的动物模型包括非重组的和重组的(转基因的)动物。非重组动物模型包括例如啮齿类(例如鼠)模型。此类模型可通过使用标准技术(例如皮下注射、尾静脉注射、脾植入、腹膜内植入、和肾囊下植入)将细胞导入同基因小鼠中来生成。体内模型包括中风/脑缺血模型、神经变性性疾病的体内模型，诸如帕金森氏病的小鼠模型；阿耳茨海默氏病的小鼠模型；肌萎缩性侧索硬化ALS的小鼠模型；脊髓性肌萎缩SMA的小鼠模型；局灶性和整体性脑缺血的小鼠/大鼠模型，例如常见的颈动脉闭塞模型或大脑中动脉闭塞模型；或在离体(ex vivo)全胚胎培养物中。可以以已知的体外或体内测定格式来实施各种测定法，诸如下文描述的或如本领域已知的和文献中记载的(参见例如McGowan等，TRENDS in Genetics，22：281-289(2006)；Fleming等，NeuroRx，2：495-503(2005)；Wong等，Nature Neuroscience，5：633-639(2002))。各种此类动物模型也可以自商业销售商获得，诸如Jackson Laboratory(参见http://jaxmice.jax.org)。

许多本领域已知的动物模型可用于检验本文中所公开的DR6拮抗剂对神经学病症(诸如AD)的活性(参见例如Rakover等，Neurodegener Dis.2007；4(5)：392-402；Mouri等，FASEB J.2007 Jul；21(9)：2135-48；Minkeviciene等，JPharmacol Exp Ther.2004 Nov；311(2)：677-82；及Yuede等，Behav Pharmacol.2007 Sep；18(5-6)：347-63))。例如，本文中所公开的DR6拮抗剂对小鼠认知功能的效果可使用目标识别测验(object recognition tests)来检验(参见例如Ennaceur等，Behav.Brain Res.1988；31：47-59)。本文中所公开的DR6拮抗剂对例如脑炎症的活性可以在小鼠中检验，通过例如设计用于测量炎症标志物(诸如IL-1β和TNF-α)和抗炎细胞因子IL-10在小鼠血浆级分中水平的ELISA方案以及组织化学分析(参见例如Rakover等，Neurodegener Dis.2007；4(5)：392-402)。

本文中所公开的DR6拮抗剂对人类中神经学病症(诸如阿耳茨海默氏病(AD))的效果可以例如通过认知结果测量(cognitive outcome measure)连同整体评价(global assessment)的使用来检验(参见例如Leber P：Guidelines for theClinical Evaluation of Antidementia Drugs，1st draft，Rockville，MD，US Foodand Drug Administration，1990)。对神经学病症(诸如AD)的效果可以例如使用单组或多组标准来检验。例如，欧洲药品评价机构(European MedicineEvaluation Agency，EMEA)引入了与功能和整体二者活性中认知和稳定方面预定改善程度对应的响应者(responders)的定义(参见例如European MedicineEvaluation Agency(EMEA)：Note for Guidelines on Medicinal Products in theTreatment of Alzheimer’s Disease.London，EMEA，1997)。本领域知道许多可单独地或与组合地用于评估患者对药剂响应的特定的、已建立的测试(参见例如Van Dyke等，AM J Geriatr.Psychiatry 14：5(2006)。例如可使用严重病损组(Severe Impairment Battery，SIB)来评估对药剂的响应，这是一种用于测量患有更严重AD的患者中认知变化的测试(参见例如Schmitt等，Alzheimer DisAssoc Disord 1997；11(suppl 2)：51-56)。也可以使用19项阿耳茨海默氏病合作研究-日常生活活动清单(19-item Alzheimer’s Disease CooperativeStudy-Activities of Daily Living inventory，ADCSADL19)来测量对药剂的响应，这是测量实行日常生活活动的独立性水平的19项清单，为晚期痴呆设计并经过验证(参见例如Galasko等，J Int Neuropsychol Soc 2005；11：446-453)。也可以使用基于临床医师访谈的变化印象加护理员输入(Clinician’sInterview-Based Impression of Change Plus Caregiver Input，CIBIC-Plus)来测量对药剂的响应，这是基于与患者和护理员二者的结构化访谈的七点整体变化评级(参见例如Schneider等，Alzheimer Dis Assoc Disord 1997；11(suppl2)：22-32)。也可以使用神经精神病学清单(Neuropsychiatric Inventory，NPI)来测量对药剂的响应，其基于护理员访谈来评估12项行为症状的频率和严重性(参见例如Cummings等，Neurology 1994；44：2308-2314)。

多种胆碱酯酶抑制剂(多奈哌齐(Donepezil)、加兰他敏(Galantamine)、利伐斯的明(Rivastigmine)和他克林(Tacrine))以及美金刚(Memantine)(一种已知的N-甲基-D-天冬氨酸盐/酯(NMDA)受体拮抗剂)已经收到管理机构批准用于阿耳茨海默氏病的治疗(参见例如Roberson等，Science 314：781-784(2006))。在胆碱酯酶抑制剂在轻度至中度严重性AD患者中的临床试验中，治疗应答的普通定义牵涉六个月里阿耳茨海默氏病评估量表-认知子表(Alzheimer’s Disease Assessment Scale-Cognitive Subscale，ADAS-cog)上至少四点的改善(参见例如Winblad等，Int J Geriatr Psychiatry 2001；16：653-666；Cummings J.，Am J Geriatr Psychiatry 2003；11：131-145；及Lanctot等，CMAJ2003；169：557-564)。还已经将这些结果与分别将疾病过程倒退6个月或1年进行了比较(参见例如Doraiswamy等，Alzheimer Dis Assoc Disord(2001)15：174-183)。在美金刚的临床试验中，已经将治疗响应者预定为在整体能力方面显示没有衰退且在功能或认知任一能力方面均显示没有衰退的患者(参见例如Reisberg等，N.Engl.J.Med.2003；348：1333-1341)。美金刚在服用稳定剂量胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐的患者中的另一项试验将美金刚表征为展现出在结果测量方面胜过安慰剂的益处，包括相对于严重病损组(SevereImpairment Battery，SIB)和改良19项AD认知研究-日常生活活动清单(modified 19-item AD Cooperative Study-Activities of Daily Living Inventory，ADCS-ADL19)、基于临床医师访谈的变化印象加护理员意见(Clinician′sInterview-Based Impression of Change Plus Caregiver Input，CIBIC-Plus)、神经精神病学清单(Neuropsychiatric Inventory，NPI)、和老年病学患者行为评级量表(Behavioral Rating Scale for Geriatric Patients，BGP Care DependencySubscale)的基线的变化(参见例如Tariot等，JAMA 2004；291：317-324)。通过在多种SIB、ADCS-ADL19、CIBIC-Plus和NPI结果测量间产生症状的改善和稳定二者，美金刚已经进一步表征为有效(参见例如van Dyck等，AM J Geriatr.Psychiatry 14：5(2006))。

DR6拮抗剂的诊断应用

家族性阿耳茨海默氏病(FAD)或常染色体显性早发性阿耳茨海默氏病(ADEOAD)指通常在生命早期(定义为在65岁之前，通常介于20-65岁之间)侵袭的罕见形式阿耳茨海默氏病，其可以是以常染色体显性方式遗传的。关于淀粉状蛋白前体蛋白(APP)、早老蛋白1(PSEN1)、和早老蛋白2(PSEN2)基因的研究提供了这些基因中的突变负责大多数ADEOAD观察病例的证据(参见例如Raux等，Journal of Medical Genetics 2005；42：793-795)。然而，此类症状的许多观察病例仍然没有得到解释。本文中所呈现的资料提示死亡受体6的多肽和/或多核苷酸变体可能负责FAD和/或其它神经学病症的一些病例。本发明的实施方案包括测定个体中是否存在包含SEQ ID NO：1的死亡受体6(DR6)多肽的多肽变体的方法，该方法包括比较个体中存在的DR6多肽的序列与SEQ IDNO：1，以确定该个体中是否存在DR6的多肽变体。在此类方法中任选的是，该患者患有或怀疑患有FAD和/或其它神经学病症。

在此语境中，可以通过本领域众所周知的多种手段来分析患者样品中的DR6多肽和/或多核苷酸(例如用以鉴定DR6的天然存在变体)，包括但不限于临床样品和细胞系的免疫组织化学分析、原位杂交、RT-PCR分析、Western印迹分析、及组织阵列分析。用于评估DR6基因(例如DR65’和3’调节序列、内含子、外显子等等)和DR6基因产物(例如DR6 mRNA、DR6多肽等等)的序列的典型方案可见于例如Ausubel等编，2007，Current Protocols In MolecularBiology，单元2(Northern印迹)、单元4(Southern印迹)、单元15(免疫印迹)和单元18(PCR分析)。

在此类分析的一个例示性实施方案中，自患有神经学病症或怀疑患有神经学病症的患者获取神经元细胞，从而可以通过诸如免疫测定法、Northern印迹测定法或多核苷酸序列分析的规程来分析其中表达的DR6多肽和/或mRNA序列(参见例如Lane等，Laryngoscope.2002；112(7 Pt 1)：1183-9；及Silani等，Amyotroph Lateral Scler Other Motor Neuron Disord.200；2 Suppl 1：S69-76)。在本发明的某些实施方案中，可以通过免疫测定法诸如Western印迹分析来分析自患者神经元细胞(其可以任选在体外培养中传代)得到的DR6多肽(参见例如Pettermann等，J Neurosci.(10)：3624-3632(1988))。或者，可以通过例如自患者神经元细胞提取的mRNA的逆转录酶链式反应(RT-PCR)分析来分析DR6基因的部分或整个编码区。在本发明的其它实施方案中，自神经元细胞以外的细胞获取DR6基因组序列，例如成纤维细胞或外周血白细胞，然后分析以确定这些基因组序列是否编码DR6的多肽变体和/或包含DR6的多核苷酸变体(包括5’和3’调节序列变体，例如影响DR6在细胞中表达水平的)。在本发明的某些实施方案中，此类分析可以仿效淀粉状蛋白前体蛋白(APP)、早老蛋白1(PSEN1)、和早老蛋白2(PSEN2)基因的分析(参见例如Nagasaka等，Proc Natl Acad SciUSA.2005；102(41)：14854-9；及Finckh等，Neurogenetics.2005；6(2)：85-9)。

用于鉴定DR6拮抗剂的筛选方法

本发明的实施方案包括鉴定抑制DR6结合APP的感兴趣分子的方法，该方法包括在存在或不存在感兴趣分子的情况中组合DR6和APP，然后在存在所述感兴趣分子的情况中检测对DR6结合APP的抑制。具体而言，使用本文中所提供的公开内容，能鉴定例如与DR6和/或APP相互作用并抑制DR6与APP之间相互作用的蛋白质、小分子和其它分子。在此方法的一个例示性实施方案中，可以将DR6固定化在基质上。然后可以在存在和不存在感兴趣分子的情况中观察游离APP(例如用可检测标志物标记的APP，所述可检测标志物诸如显色标志物、荧光标签、放射性标记物、磁标签、或酶促反应产物等)结合固定化DR6的能力。然后可以使用APP对DR6的结合的降低(例如经由可检测标志物的水平和/或位置的变化观察到的)来鉴定分子为抑制APP结合DR6的能力。在本发明的备选实施方案中，可以将APP固定化在基质上，以在存在和不存在感兴趣分子的情况中检测APP结合游离DR6(例如用可检测标志物标记的DR6)的能力。任选的是，在此类实施方案中，感兴趣分子可以是抗体。

本文中所提供的公开内容容许本领域中用于表征多肽(诸如DR6和APP)之间结合的多种方案来鉴定抑制DR6和APP之间结合相互作用的分子。本发明的此类实施方案包括那些采用ELISA测定法(例如竞争性或三明治式ELISA测定法，如美国专利No.6,855,508；6,113,897；和7,241,803中所披露的)、放射免疫测定法(例如Ausubel等编，Current Protocols In MolecularBiology，2007单元10.24中所披露的)、Western印迹测定法(例如如Pettermann等，J Neurosci.(10)：3624-3632(1988)和下文实施例10中所披露的)、免疫组织学测定法(例如如下文实施例10中所披露的)、IAsys分析和CM-5(BIAcore)传感器芯片分析(参见例如美国专利No.6,720,156和7,101,851)。在本发明的某些实施方案中，鉴定抑制DR6对APP结合的感兴趣分子的方法使用蛋白质微阵列。蛋白质微阵列通常使用于限定位置在表面上固定化的感兴趣蛋白质分子(例如DR6和/或APP)，而且已经用于鉴定小分子结合蛋白(参见例如Wilson等，Curr.Opinion in Chemical Biology 2001，6，81-85；及Zhu，H.，等，Science 2001，293，1201-2105)。

试剂盒和制品

在本发明的其它实施方案中，提供了包含对于治疗神经学病症有用的物质的制品和试剂盒。所述制品包括带有标签的容器。合适的容器包括例如瓶、管形瓶、和试管。所述容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料，而且优选是经过灭菌的。所述容器装有有效治疗神经学病症(包括阿耳茨海默氏病)的活性剂。组合物中的活性剂是DR6拮抗剂，而且优选包括抗DR6单克隆抗体或抗APP单克隆抗体。容器上的标签指明该组合物用于治疗神经学病症，而且还可指明体内或体外用途的指导，诸如上文所描述的那些。制品或试剂盒任选进一步包括包装插页，其指通常包括在治疗用产品商业包装中的说明，它包含有关此类治疗用产品使用的适应症、用法、剂量、施用、禁忌、要与所包装产品联合的其它治疗性产品、和/或警告信息等。

本发明的试剂盒包括上文所述容器和第二容器，其中装有缓冲剂。它可进一步包括从商业和用户立场出发需要的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针和注射器。

实施例

通过下文实施例进一步描述和例示了本发明的各个方面，这些实施例无一旨在限制本发明的范围。

实施例1：胚胎和成年中枢神经***中的DR6表达

进行了鼠胚胎组织中TNF受体超家族表达样式的RNA原位筛选。更具体的说，使用mRNA Locator试剂盒(Ambion，产品目录号1803)遵照制造商的方案实施原位杂交实验。使用如下DR6 cDNA一级序列来生成用于这些实验的核糖核酸探针：

GAGCAGAAACGGCTCCTTTATTACCAAAGAAAAGAAGGACACAGTGTTGCGGCAGGTCCGCCTGGACCCCTGTGACTTGCAGCCCATCTTTGATGACATGCTGCATATCCTGAACCCCGAGGAGCTGCGGGTGATTGAAGAGATTCCCCAGGCTGAGGACAAACTGGACCGCCTCTTCGAGATCATTGGGGTCAAGAGCCAAGAAGCCAGCCAGACCCTCTTGGACTCTGTGTACAGTCATCTTCCTGACCTATTGTAGAACACAGGGGCACTGCATTCTGGGAATCAACCTACTGGCGG.(SEQ ID NO：3)

使用Maxiscript试剂盒(Ambion，产品目录号1308)依照制造商的方案进行核糖核酸探针的体外合成。

如图2A中所示，在处于E10至E12阶段(已知发生神经元细胞死亡的阶段)的发育中的脊髓和背根神经节细胞中，发现DR6几乎由已分化的神经元专门表达，而非增殖中的先祖。

如图2B中所述，DR6蛋白在神经元的细胞主体和轴突二者上表达。

在图2B中，上面的两幅图显示了来自正常小鼠的神经元，显现DR6(左)或对照蛋白(右)。下面的两幅图相应地显示了来自DR6敲除小鼠的神经元，显现DR6(左)或对照蛋白(右)。

用于生成此图中所显示的数据的材料和方法如下。为了显现如例如图2B中所显示的感觉轴突上的DR6蛋白表达，在Genentech使用人重组DR6作为免疫原生成DR6特异性小鼠单克隆抗体(见下文实施例3)。通过免疫荧光对这些抗体进一步筛选它们识别在细胞表面上表达的全长小鼠和人DR6的能力。一种称作“RA.3”(也称为“3F4.8.8”单抗，且在下文实施例3和实施例7中有进一步描述)的此类抗体与人和小鼠DR6多肽二者起交叉反应，并被用于显现如图2B中所显示的轴突上的DR6表达。使用本领域已知的标准方案实施免疫荧光染色规程(Nikolaev等，2003，Cell，112(1)，29-40)。为了显现轴突上的DR6表达，在Axioplan-2成像Zeiss显微镜上使用来自Carl Zeiss Imaging Solutions的Axio Vision40 Release 4.5.0.0SP1(03/2006)计算机软件拍摄照片。

如图2C中所示，DR6 mRNA由分化中的神经元表达。在图2C中，由左至右，三幅照片分别显示了来自处于发育阶段E10.5、E11.5和E12.5的正常小鼠的神经元的脑部扫描。

用于生成此图中所显示的数据的材料和方法如下。为了显现发育中的小鼠胚胎中的DR6 mRNA表达，对在E10.5-E12.5小鼠胚胎的胸轴水平采集的20微米组织横切片实施使用DR6 3’UTR特异性的放射性标记的RNA探针进行的原位mRNA杂交(ISH)。使用mRNA Locator原位杂交试剂盒依照制造商的方案如mRNA Locator说明手册(Ambion Inc.，产品目录号1803)中所概述的那样实施ISH实验。在体外翻译反应中使用MAXIscript试剂盒依照制造商的说明手册(Ambion Inc.，产品目录号1308-1326)生成与小鼠DR6 3’UTR的反义序列对应的放射性标记的mRNA探针。将Kodak放射自显影乳液(Kodak)施加于带有胚胎组织横切片的载玻片来显现DR6 mRNA表达数据。在暗视野中在Axioplan-2成像Zeiss显微镜上使用来自Carl Zeiss Imaging Solutions的Axio Vision40 Release 4.5.0.0SP1(03/2006)计算机软件拍摄照片。

用于生成这些实验中的核糖核酸探针的DR6cDNA的一级序列如下：

GAGCAGAAACGGCTCCTTTATTACCAAAGAAAAGAAGGACACAGTGTTGCGGCAGGTCCGCCTGGACCCCTGTGACTTGCAGCCCATCTTTGATGACATGCTGCATATCCTGAACCCCGAGGAGCTGCGGGTGATTGAAGAGATTCCCCAGGCTGAGGACAAACTGGACCGCCTCTTCGAGATCATTGGGGTCAAGAGCCAAGAAGCCAGCCAGACCCTCTTGGACTCTGTGTACAGTCATCTTCCTGACCTATTGTAGAACACAGGGGCACTGCATTCTGGGAATCAACCTACTGGCGG(SEQ ID NO：3)

进一步分析使用Allen脑图册(http://www.brainatlas.org/aba/；Allen脑图册是公众可获得的科学资源，其提供了小鼠脑中大约20,000种基因的表达地图)揭示了DR6在成年脑的大脑皮层中高表达。DR6mRNA在例如皮层神经元、海马CA1-CA4锥体神经元和齿状回中表达。DR6蛋白在成年皮层和海马中的神经元细胞主体中表达。

这种表达样式提供了证据来证明，在其在发育中的左右之外，DR6还在与神经元细胞损失有关的神经变性性疾病的进展中发挥功能。

实施例2：RNA干扰对DR6表达的抑制阻止外植体培养物中连合神经元的轴突变性

连合神经元是一组在发育阶段E9.5至E11.5之间在背侧脊髓中产生的长投射的脊髓中间神经元。认为连合神经元的存活依赖于来自它们的中间靶物之一即脊髓底板的营养支持。这种依赖性发生在一个持续数天的时间段期间，那时它们的轴突沿底板延伸，之后它们形成另外的营养要求。神经元对顺便地衍生自它们的中间轴突靶物的营养支持的依赖性提供了快速消除错误投射的神经元的机制，这可能有助于防止在神经***的发育过程中形成异常神经元回路(Wang等，Nature，401：765-769(1999))。

为了检验DR6在连合神经元的轴突变性和程序性细胞死亡中的功能性作用，进行了基于RNAi的背侧脊髓存活测定法(Kennedy等，Cell，78：425-435(1994)；Wang等，见上文，1999)(见图3)。将E13大鼠或E11.5小鼠胚胎置于L15培养基(Gibco)中，并将siRNA(IDT)与绿色荧光蛋白(“GFP”)编码质粒一起注射入神经管中。然后通过电穿孔将siRNA和质粒投递至背侧祖细胞。解剖出背侧脊髓外植体，包埋入3D-胶原凝胶基质中，并在含重组导蛋白(netrin)-1(R&D Pharmaceuticals)和5％马血清(Sigma)的Opti-MEM/F12培养基(Invitrogen)中于37℃在5％CO₂环境中培养。在16小时内，作为对化学引诱物导蛋白-1的应答，连合神经元自外植体长出，进入胶原基质凝胶中(Kennedy等，见上文，1994)。通过使用倒置显微镜的观察，通过GFP荧光显现连合轴突。

如图4A中所示，在缺乏衍生自底板的营养因子支持的情况中培养48小时后，连合神经元经历程序性细胞死亡且它们的轴突变性(还可参见Wang等，见上文，1999)。当连合神经元中的DR6表达被DR6特异性siRNA分子下调时，这样的轴突变性被显著阻断(见图4，下面的小图)。在使用非靶向siRNA分子进行的对照实验中没有观察到这种对轴突变性的抑制。这些数据提示DR6是在来自连合神经元的中间靶物即脊髓底板的营养支持断绝时连合神经元的轴突变性所需要的重要的促凋亡受体。

如图4B中所示，RNAi抗性DR6 cDNA挽救了被DR6siRNA阻断的变性表型。

在图4B中，由左至右，上面的四幅照片显示了在存在以下各项时的神经元：(1)对照RNAi；(2)暴露于DR6siRNA#3的野生型DR6；(3)暴露于DR6siRNA#2的错配DR6；和(4)暴露于DR6siRNA#3的错配DR6。下面的两幅小图显示了以下各项的放射自显影照片：(1)在存在对照siRNA、siRNA#2、和siRNA#3时的野生型DR6mRNA；和(2)在存在对照siRNA、siRNA#2、和siRNA#3时的错配DR6mRNA。

用于生成此图中所显示的数据的材料和方法如下。为了调查DR6受体在连合神经元的轴突变性和程序性细胞死亡中的生理学作用，依照本领域已知方案实施了背侧脊髓存活测定法(Kennedy等，Cell，78：425-435(1994)；Wang等，Nature，401：765-769(1999))(数据显示在图4B中)。将E13大鼠胚胎置于L15培养基(Gibco)中，并将如下siRNA构建体(图4B)注射入它们的神经管中：

对照非靶向的、或靶向的DR6siRNA#2、或靶向的DR6siRNA#3(IDT)以及野生型的或错配的DR6cDNA和GFP编码质粒。将DR6cDNA和GFPcDNA亚克隆入可自BCCM/LMBP购得的pCAGGS载体骨架中。然后通过电穿孔将siRNA和质粒投递至背侧祖细胞。然后解剖出背侧脊髓外植体，包埋入3D胶原凝胶基质中，并在含重组导蛋白-1和5％马血清(Sigma)的Opti-MEM/F12培养基(Invitrogen)中于37℃在5％CO₂环境中培养。在16小时内，作为对化学引诱物导蛋白-1的应答，连合神经元自外植体长出，进入胶原基质凝胶中(Kennedy等，Cell，78：425-435(1994))。通过使用倒置显微镜的观察，通过GFP荧光显现连合轴突。在缺乏衍生自底板的营养因子支持的情况中培养48小时后，连合神经元经历程序性细胞死亡且它们的轴突变性(Wang等，Nature，401：765-769(1999))(图4B)。然而，轴突变性程序能被靶向DR6特异性siRNA#3的导入所阻断(图4B)。DR特异性siRNA#3的特异性的、上靶(on-target)效应在挽救实验中得到了进一步证实，其中siRNA#3抗性错配DR6 cDNA构建体与DR6 siRNA#3一起的过表达恢复了轴突变性表型(图4B)。所呈现的实验证据证实了DR6受体功能是在自它们的中间靶物即脊髓底板收回时连合神经元的轴突变性和死亡所需要的。

上文所述测定法中所使用的DR6siRNAs#2和#3(有义链)及与DR6siRNA#3序列互补的DR6cDNA错配片段的序列如下：

大鼠DR6siRNA#25’-AAU CUG UUG AGU UCA UGC CUU-3’(SEQ IDNO：11)

大鼠DR6siRNA#35’-CAA UAG GUC AGG AAG AUG GCU-3’(SEQ IDNO：12)

与DR6siRNA#3序列互补的大鼠DR6cDNA错配片段：5’-GGACTCTGTGTACAGTCACCTCCCAGATCTGTTATAG  -3’(SEQ IDNO：13)

实施例3：抗DR6抗体对DR6受体信号传导的抑制阻止外植体培养物中连合神经元的轴突变性

使用抗DR6抗体进行了背侧脊髓存活测定法(如上文实施例2中所描述的)。采用显微镜观察(使用GFP的绿色荧光通道)来显现连合轴突。依照本领域已知方案实施背侧脊髓存活测定法(Kennedy等，Cell，78：425-435(1994)；Wang等，Nature，401：765-769(1999))，带有上文实施例2中所概述的修改。将GFP表达质粒构建体(将GFP cDNA亚克隆入可自BCCM/LMBP购得的pCAGGS载体骨架)注射入E13大鼠胚胎的神经管中。然后通过电穿孔将GFP表达质粒投递至背侧祖细胞。铺板后24小时以40ug/ml将抗DR6阻断性抗体或对照正常小鼠IgG添加至连合外植体。铺板后48小时如下文所概述的那样拍摄连合外植体的照片。为了显现表达GFP的连合轴突，在Axiovert 200Zeiss倒置显微镜上(在GFP的绿色荧光通道中)使用来自Carl Zeiss ImagingSolutions的Axio Vision40 Release 4.5.0.0SP1(03/2006)计算机软件拍摄照片。

用于此实验的抗DR6抗体如下生成。

使用融合有Fc的人DR6胞外结构域序列(hDR6-ECD-Fc)作为免疫原来生成抗DR6小鼠单克隆抗体。所使用的hDR6-ECD-Fc免疫原的序列如下：

MGTSPSSSTALASCSRIARRATATMIAGSLLLLGFLSTTTAQPEQKASNLIGTYRHVDRATGQVLTCDKCPAGTYVSEHCTNTSLRVCSSCPVGTFTRHENGIEKCHDCSQPCPWPMIEKLPCAALTDRECTCPPGMFQSNATCAPHTVCPVGWGVRKKGTETEDVRCKQCARGTFSDVPSSVMKCKAYTDCLSQNLVVIKPGTKETDNVCGTLPSFSSSTSPSPGTAIFPRPEHMETHEVPSSTYVPKGMNSTESNSSASVRPKVLSSIQEGTVPDNTSSARGKEDVNKTLPNLQVVNHQQGPHHRHILKLLPSMEATGGEKSSTPIKGPKRGHPRQNLHKHFDINEHLPWMIPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：4)

使用先前描述的方案生成融合多肽(Ashkenazi等，Curr Opin Immunol.，9(2)：195-200(1997)；Haak-Frendscho等，J Immunol.，152(3)：1347-53(1994))。

通过大约8周时间段里注射100ul hDR6-ECD-Fc免疫原(1mg/动物)给9周龄Balb/c小鼠免疫。然后将所有经免疫小鼠的***(11x10⁶细胞/ml，5ml)与PU.1骨髓瘤细胞(来自ATCC的鼠骨髓瘤细胞)(5x10⁶细胞/ml，5ml)融合。将细胞以2x10⁶细胞/ml分配入4块板中。

使用捕捉ELISA对杂交瘤筛选对上文所述hDR6-ECD-Fc多肽的特异性结合。将板用50ul 2ug/ml山羊抗人IgG Fc特异性(Cappel产品目录号55071)于4℃包被过夜。将板用PBS加Brij清洗3次，并将板用200ul 2％BSA于室温封闭1小时。然后将板用PBS加Brij清洗3次。随后，将板与100ul/孔的0.4ug/ml免疫粘附素一起在摇床上温育1小时。然后将板用PBS加Brij清洗3次。将100ul一抗添加至孔，并在摇床上温育1小时。再次将板用PBS加Brij清洗3次。100ul1∶1000绵羊抗小鼠IgG HRP(不与人交叉，Cappel产品目录号55569)抗体1小时。将板用PBS加Brij清洗3次。添加50ul底物(TMB Microwell过氧化物酶KPL#50-76-05)并将板温育5分钟。用50ul/孔终止液(KPL#50-85-05)终止反应。读取450nm处的吸光度。所使用的测定缓冲液含有PBS、5％BSA、和0.05％Tween 20。

然后通过有限稀释(含10％HCF、10％FCS的SCDME培养基)克隆在捕捉ELISA测定法中测试对hDR6-ECD-Fc多肽的结合为阳性的杂交瘤。10天后，取出板并通过上文所述捕捉ELISA测定有一个集落的孔。然后对多种选定的单克隆抗体测试同种型，并显示为IgG1同种型。

然后在背侧脊髓存活测定法中对鉴别为“3B11.7.7”、“3F4.4.8”、“4B6.9.7”、和“1E5.5.7”的四种抗DR6单抗测试它们阻断轴突变性的能力。

惊人的是，这些抗DR6单抗中的某些(3F4.4.8、4B6.9.7、和1E5.5.7)能够部分地抑制由培养中48小时的营养剥夺诱导的连合神经元的轴突变性(见图5)。认为此类抗体可能促进神经元存活，例如通过阻断推定的DR6配体与DR6受体之间的相互作用或通过抑制配体依赖性DR6信号传导。3B11.7.7DR6抗体在诱导轴突变性中具有略微的刺激效应。

实施例4：Jun N末端激酶(JNKI)的特异性肽抑制剂对DR6受体信号传导的抑制

DR6受体据报道通过JNK的活化来发信号，而且观察到JNK活性在DR6缺无小鼠模型中受损(Pan等，FEBS Lett.，431：351-356(1998)；Zhao等，Journalof Experimental Medicine，卷194，1441-1441，2001))。为了检验DR6-JNK信号传导在轴突变性中的作用，实施了背侧脊髓存活测定法(如上文实施例2中所描述的)，只是通过使用1μM浓度的肽抑制剂L-JNK-I((L)-HIV-TAT48-57-PP-JBD20；Calbiochem)阻断连合神经元中的JNK信号传导途径。测试了作为对照的DMSO(SIGMA)和正常小鼠IgG。

如图6中所示，这种对JNK信号传导的抑制在背侧脊髓存活测定法中部分地阻断轴突变性。这些数据提示DR6至少部分地通过JNK途径发出轴突变性过程的信号。

实施例5：抗DR6抗体对DR6受体信号传导的抑制阻止小鼠胚胎脊髓中的神经元细胞死亡

进行了测定法，其中在全胚胎培养***中用抗DR6单抗阻断DR6信号传导。下文所述此***容许小鼠全胚胎在管形瓶中在体外培养2天，自发育阶段E9.5至E11.5。自子宫解剖出E9.5胚胎，卵黄囊附着于胚胎，并且在100％大鼠血清(Harlan)中第一天在65％氧气环境中和第二天在95％氧气中培养于37℃。以10ug/ml终浓度在测定法中添加抗DR6单抗(上文实施例中所述)，并以10ug/ml浓度使用正常小鼠IgG抗体作为对照。

通过使用识别经过切割的胱天蛋白酶-3的抗体(针对经过切割的胱天蛋白酶-3的抗体，购自R&D Systems)进行的免疫荧光染色来检测和显微镜检术观察凋亡细胞。结果显示于图7。惊人的是，在此***中抗DR6单抗3F4.4.8、4B6.9.7、和1E5.5.7对DR6的抑制针对天然发生的发育性细胞死亡保护脊髓神经元。

实施例6：DR6缺无小鼠中降低的神经元细胞死亡

分析了处于发育阶段E15.5的DR6敲除胚胎(Zhao等，Journal ofExperimental Medicine，Vol.194，1441-1441，2001)的表型。经过切割的胱天蛋白酶3是凋亡细胞的标志物，而且为了检验胚胎脊髓中神经元细胞死亡的程度，使用经过切割的胱天蛋白酶3的免疫染色(针对经过切割的小鼠胱天蛋白酶-3的抗体，购自R&D Systems)。还检验了作为对照的DR6杂合同窝出生者。将低聚甲醛(PFA)固定的胚胎组织切片在封闭液(2％热灭活的山羊血清(Sigma)/PBS(Gibco)/0.1％ Triton(Sigma))中封闭1小时并与一抗(1∶500稀释的针对经过切割的小鼠胱天蛋白酶-3的抗体，购自R&D Systems)一起在封闭液中于4℃温育过夜。将切片用封闭液于室温历时1小时清洗3次，并与二抗(1∶500稀释的山羊抗家兔Alexa 488，Molecular Probes，Invitrogen)一起于室温温育1小时。然后将切片用封闭液于室温清洗1小时并通过绿色通道中的免疫荧光显现。

对每个胚胎每个脊髓切片的胱天蛋白酶3阳性核的数目定量(见图8和9A)。在DR6缺无小鼠脊髓和背根神经节(DRG)中检测到与DR6杂合同窝出生者对照相比神经元细胞死亡降低大约40-50％(图8和9A)。因而，认为在体内DR6信号传导促进发育中的神经***中的神经元细胞死亡。

如图9B中所示，DR6是运动轴突变性所需要的，正如DR6缺无小鼠所证实的。在存在和不存在脑衍生的神经营养因子(BDNF)和神经营养蛋白3(NT-3)(BDNF和NT-3得自Chemicon)的情况中分析来自处于发育阶段E13.5的DR6敲除胚胎(Zhao等，Journal of Experimental Medicine，卷194，1441-1441，2001)以及正常胚胎的腹侧脊髓外植体(运动神经元)。

在图9B中，左上小图显示了在存在BDNF和NT-3的情况中的来自正常小鼠的腹侧脊髓外植体，而左下小图显示了在存在BDNF和NT-3的情况中的来自DR6敲除(KO)小鼠的腹侧脊髓外植体。类似的，右上小图显示了在不存在这些生长因子的情况中的来自正常小鼠的腹侧脊髓外植体，而右下小图显示了在不存在BDNF和NT-3的情况中的来自DR6敲除(KO)小鼠的腹侧脊髓外植体。

用于生成此图9B中所显示的数据的材料和方法如下。如Henderson等，Nature，363：266-270(1993)中所述的那样但有少许修改实施运动神经元腹侧脊髓存活测定法。使用经酒精处理的剪子解剖出DR6杂合或DR6缺无小鼠E13.5胚胎并置于温热的L15培养基(Gibco)中。使用同一剪子和镊子，打开胚胎的腹区，取出器官，切掉肋，并解剖出整个脊髓，然后用镊子除去周围的脑脊膜组织。除去顶板，获得了开书型脊髓制备物(open book prep of spinalcord)。分离包括MMC和LMC运动柱的脊髓腹侧一半并小心地切掉剩余的底板组织。用在L15中包被过的黄色枪头(tip)将腹侧脊髓转移至装有L15+5％FBS(Sigma)血清的新小盘，用于使用钨针头进一步切成外植体。

给经PDL/层粘连蛋白包被的8孔载玻片(Becton，Dickinson and Company)装填500ul每孔Neurobasal培养基(Invitrogen)加均为50ng/ml的重组BDNF和NT-3(Chemicon)，加B-27补充物X50(Invitrogen)；加青霉素-链霉素-谷氨酰胺X100(产品目录号10378-016；Gibco)加葡萄糖X100。将切好的腹侧脊髓外植体置于每个孔中(每个孔2-3个外植体)并在37℃温箱中放置48小时以生长。2天后，如下实施营养因子剥夺：取走旧的培养基，并将孔用Neurobasal培养基(不含营养因子)温和地清洗2次。

添加预温热的Neurobasal培养基/B-27(Invitrogen)(如上文所述制备，不含营养因子)加20ug/ml的抗BDNF和抗NT3阻断性抗体(Genentech，Inc.)。然后将带有外植体的载玻片于37℃再温育24-48小时。

2天后，将外植体在PBS中的4％PFA中固定，用Net凝胶(Nikolaev等，2003，Cell，112(1)，29-40)中的0.2％Triton于0℃透化10分钟，并用Net凝胶清洗2次。为了封闭非特异性结合位点，将载玻片在含1％BSA的PBS中于4℃温育过夜。为了显现变性中的运动轴突，次日实施用抗p75NTR特异性抗体(1∶500稀释，Chemicon)进行的免疫染色(1∶500稀释的一抗于4℃在1％BSA/PBS中过夜，1∶500稀释的二抗于室温1小时)。取下孔，并使用Fluoromount-G来将盖玻片装在载玻片上。为了显现表达p75NTR的运动轴突，在Axioplan-2成像Zeiss显微镜上使用来自Carl Zeiss Imaging Solutions的Axio Vision40 Release 4.5.0.0SP1(03/2006)计算机软件拍摄照片。

如图9C中所公开的数据所示，由损伤诱导的变性在DR6敲除小鼠中得到延迟。

在图9C中，由左至右，上面的四幅小图分别显示了来自正常小鼠的神经元：在存在神经生长因子(NGF)的情况中；及损伤后4、8或16小时。在图9C中，由左至右，下面的4幅小图分别显示了来自DR6KO小鼠的神经元：在存在外源神经生长因子(NGF)的情况中；及损伤后4、8或16小时。

如下实施如图9C中所示的体外感觉轴突损害测定法。解剖出DR6杂合或DR6缺无小鼠E12.5胚胎并置于温热的L15培养基(Gibco)中。使用同一剪子和镊子，打开胚胎的腹区，取出器官，切掉肋，并用镊子解剖出附着于脊髓的背根神经节(DRG)。然后用在L15中包被过的黄色枪头将DRG转移至装有L15+5％FBS(Sigma)血清的新的小盘，用于使用钨针头进一步切成1/4DRG外植体。

给经PDL/层粘连蛋白预包被的8孔载玻片(Becton，Dickinson andCompany)装填500ul每孔Neurobasal培养基(Invitrogen)加50ng/ml NGF(RocheMolecular Biochemicals)，加B-27补充物X50(Invitrogen)；加青霉素-链霉素-谷氨酰胺X100；加葡萄糖X100。将切好的DRG外植体置于每个孔中(每个孔2-3个DRG外植体)并在37℃温箱中放置48小时以生长。2天后，如下实施轴突损害测定法：通过用微型刀(Fine Science Tools)在DRG外植体的正上方和正下方给感觉轴突做两平行切口来诱发损伤。DRG外植体左边和右边的没有切过的轴突充当内源无损害对照。将带有切过的DRG外植体的载玻片在损伤后0、4、8、16和24小时在PBS中的4％PFA中固定，用Net凝胶(Nikolaev等，2003，Cell，112(1)，29-40)中的0.2％Triton于0℃透化10分钟，并用Net凝胶清洗2次。为了封闭非特异性结合位点，将载玻片在PBS中的1％BSA中于4℃温育过夜。为了显现变性中的感觉轴突，次日实施用神经元III类β-微管蛋白(TUJ1)特异性抗体(1∶500稀释，Covance)的免疫染色(1∶500稀释的一抗于4℃在1％BSA/PBS中过夜，1∶500稀释的二抗于室温1小时)。取下孔，并使用Fluoromount-G来给载玻片安装盖玻片。为了显现用免疫荧光标记的感觉轴突，在Axioplan-2成像Zeiss显微镜上使用来自Carl Zeiss Imaging Solutions的Axio Vision40 Release 4.5.0.0SP1(03/2006)计算机软件拍摄照片。

实施例7：抗DR6抗体拮抗剂抑制神经元变性

如图10A中所示，抗DR6抗体抑制各式各样被剥夺了营养因子的神经元的变性(在轴突变性测定法中)。

在图10A中，由左至右，前面的两组上下两幅照片显示了来自连合神经元的数据。在这前面的四幅照片中，上面的两幅照片显示了在分别存在对照IgG和RA.5 DR6抗体的情况中的连合神经元，而下面的两幅照片显示了在分别存在RA.1 DR6抗体和RA.3 DR6抗体的情况中的连合神经元。图10A中中间的两组上下两幅照片显示了来自感觉神经元的数据。在这中间的四幅照片中，上面的两幅照片分别显示了在存在和不存在NGF的情况中的感觉神经元，而下面的两幅照片显示了在不存在NGF但分别存在RA.1 DR6抗体和RA.3 DR6抗体的情况中的感觉神经元。图10A右侧的两组上下两幅照片显示了来自运动神经元的数据。在右边这四幅照片中，上面的两幅照片分别显示了在存在和不存在生长因子的情况中的运动神经元，而下面的两幅照片显示了在不存在生长因子但分别存在RA.1 DR6抗体和RA.3 DR6抗体的情况中的运动神经元。

用于生成此图中所显示的数据的材料和方法如下。小鼠单克隆RA.1-RA.5 DR6抗体是如上文实施例3中所述通过用DR6胞外域免疫小鼠而生成的。在此实施例和附图中称作“RA.1”和“RA.3”抗体的DR6抗体分别是实施例3中所描述的“1E5.5.7”和“3F4.4.8”抗体(例如简单地使用备选命名来指称)。类似的，在此实施例和附图中述及的“RA.5”抗体是实施例3中所描述的“3B11.7.7”抗体(例如已经使用备选命名来指称)。

如上文所述实施例2和实施例6中的那样但有如下修改地实施感觉、运动、和连合外植体培养。对于连合外植体存活测定法，在铺板后24小时以20ug/ml终浓度将DR6抗体RA.1或RA.3、或者对照IgG添加至连合外植体培养物(图10A)。对于感觉外植体培养物，在铺板后48小时实施NGF剥夺测定法。在铺板后48小时以20ug/ml终浓度将不含NGF但含NGF阻断性抗体(Genentech，Inc.)以及所示DR6抗体(RA.1或RA.3)或对照IgG的新鲜Neurobasal培养基添加至感觉外植体培养物(图10A)。对于运动外植体培养物，在铺板后48小时实施营养因子剥夺测定法。在铺板后48小时以20ug/ml终浓度将不含NT3/BDNF但含BDNF阻断性抗体和NT3阻断性抗体(发挥阻断营养因子的功能的单抗，Genentech，Inc.)以及所示DR6抗体(RA.1或RA.3)或对照IgG的新鲜Neurobasal培养基添加至感觉外植体培养物(图10A)。为了显现通过免疫荧光染色用抗TUJ1(Covance)和抗p75NTR(Chemicon/Millipore)抗体标记的感觉和运动轴突，在Axioplan-2成像Zeiss显微镜上使用来自Carl Zeiss Imaging Solutions的Axio Vision40 Release 4.5.0.0SP1(03/2006)计算机软件拍摄照片。为了显现表达GFP的连合轴突，在Axiovert 200 Zeiss倒置显微镜上(在GFP的绿色荧光通道中)使用来自CarlZeiss Imaging So1utions的Axio Vision40 Release 4.5.0.0SP1(03/2006)计算机软件拍摄照片。

如图10B中所示，抗DR6抗体抑制各式各样被剥夺了营养因子的神经元的变性(在经TUNEL染色的凋亡中细胞主体的测定法中)。在图10B中，自左边开始，两组上下两幅显示了来自连合神经元的数据。在这前面的四幅照片中，上面的两幅照片显示了在分别存在对照IgG和RA.5 DR6抗体的情况中的连合神经元，而下面的两幅照片显示了在分别存在RA.1 DR6抗体和RA.3DR6抗体的情况中的连合神经元。图10B中中间两组上下两幅照片显示了来自感觉神经元的数据。在这中间的四幅照片中，上面的两幅照片分别显示了在存在和不存在NGF的情况中的感觉神经元，而下面的两幅照片显示了在不存在NGF但分别存在RA.1 DR6抗体和RA.3 DR6抗体的情况中的感觉神经元。图10B右侧的两组上下两幅照片显示了来自运动神经元的数据。在这些右边的四幅照片中，上面的两幅照片分别显示了在存在和不存在生长因子的情况中的运动神经元，而下面的两幅照片显示了在不存在生长因子但分别存在RA.1 DR6抗体和RA.3 DR6抗体的情况中的运动神经元。

图10中的公开内容提示配体在DR6在轴突变性中的功能中可能发挥重要作用。

用于生成此图中所显示的数据的材料和方法如下。如上所述，小鼠单克隆RA.1-RA.5 DR6抗体是如上文实施例3中所述通过用DR6胞外域免疫小鼠而生成的。如上文所述实施例2和实施例6中的那样但有如下概述的修改地实施感觉、运动、和连合外植体培养。对于连合外植体存活测定法，如上文实施例3中所述，在铺板后24小时以20ug/ml终浓度分别将DR6抗体RA.1和RA.3、抗体RA.5(或者称作“1B11.7.7”，Genentech，Inc.)、或对照IgG(Genentech，Inc.)添加至连合外植体培养物(图10B，左边)。

对于感觉外植体培养物，在铺板后48小时实施NGF剥夺测定法。在铺板后48小时以20ug/ml终浓度将不含NGF但含NGF阻断性抗体(Genentech，Inc.)以及DR6抗体RA.1或RA.3、或对照IgG(Genentech，Inc.)的新鲜Neurobasal培养基添加至感觉外植体培养物(图10B，中间)。对于运动外植体培养物，在铺板后48小时实施营养因子剥夺测定法。在铺板后48小时以20ug/ml终浓度将不含NT3/BDNF但含BDNF阻断性抗体和NT3阻断性抗体(发挥阻断营养因子的功能的单抗，Genentech，Inc.)以及RA.1或RA.3、或对照IgG(Genentech，Inc.)的新鲜Neurobasal培养基添加至感觉外植体培养物(图10B，右边)。

将外植体在4％PFA/PBS中固定并为在单细胞水平检测凋亡进行加工，所述检测基于使用原位细胞死亡检测试剂盒(产品目录号11684795910，Roche)依照制造商的说明手册(Roche)标记DNA链断裂(TUNNEL技术)。通过荧光显微术分析连合感觉和运动外植体培养物的细胞主体中的凋亡(图10B)。为了显现荧光标记的TUNNEL阳性凋亡细胞主体，在Axioplan-2成像Zeiss显微镜上(在红色荧光通道中)使用来自Carl Zeiss Imaging Solutions的Axio Vision40 Release 4.5.0.0SP1(03/2006)计算机软件拍摄照片。

实施例8：DR6免疫粘附素拮抗剂抑制神经元变性

如图11A中所示，hDR6-ECD-Fc延迟连合轴突变性。上文实施例3中描述了此测定法中所使用的hDR6-ECD-Fc免疫粘附素蛋白。

在图11A中，由左至右，第一幅照片提供了显示48小时时的连合轴突变性的对照。第二幅照片显示了在存在30ug/ml hDR6-ECD-Fc的情况中48小时时的连合轴突变性。第三幅照片显示了在存在10ug/ml hDR6-ECD-Fc的情况中48小时时的连合轴突变性。

用于生成此图中所显示的数据的材料和方法如下。如上文实施例2-6中所述制备连合外植体培养物和实施存活测定法。上文实施例3中描述了此测定法中所使用的hDR6-ECD-Fc免疫粘附素。为了显现GFP标记的连合轴突，在Axiovert 200 Zeiss倒置显微镜上(在GFP的绿色荧光通道中)使用来自CarlZeiss Imaging Solutions的Axio Vision40 Release 4.5.0.0SP1(03/2006)计算机软件拍摄照片。

如图11B中所示，hDR6-ECD-Fc延迟由神经生长因子(NGF)断绝诱发的感觉轴突变性。在图11B中，由左至右，上面的三幅照片分别显示了在0、6和24小时时的在存在对照Fc的情况中被剥夺了NGF的感觉神经元，而下面的三幅照片分别显示了在0、6和24小时时的在存在DR6-Fc构建体的情况中被剥夺了NGF的感觉神经元。

图11中所提供的公开内容提供了进一步提示，即配体可能在DR6在轴突变性中的功能中发挥重要作用。

用于生成此图中所显示的数据的材料和方法如下。为了检验配体是否是DR6在感觉轴突变性中的功能所需要的，如下实施感觉轴突生长和变性的隔室化培养分析。使用Campenot神经细胞室***在不同隔室(不同的流体环境)中分隔神经元突出(轴突)与细胞主体，这与神经元细胞主体在神经***的一个位置中并投射它们的轴突至另一位置的远端靶物类似。该测定法如Campenot(Campenot等，.J Neurosci.11(4)：1126-39(1991))最初记载的那样但有如下修改的实施。简言之，将35mm组织培养盘用PDL/层粘连蛋白包被并用钉耙(Tyler Research)刮擦以产生轨迹，如例如Campenot等，见上文的图1和图4中所示。

将一滴培养基(含B27补充物、25ng/ml NGF、和4g/L甲基纤维素的Neurobasal培养基)置于经过刮擦的底层上。将Teflon分隔器(Tyler Research)安置在硅脂上并将少量硅脂放置于中央槽的口部。将衍生自E12.5小鼠DRG的经解离的感觉神经元悬浮在甲基纤维素增稠的培养基中并加载入配有22号针头的一次性使用无菌注射器中。在解剖显微镜下将此细胞悬浮液注射入每个隔室化盘的中央槽中。让神经元沉降过夜。给盘的外周(细胞主体隔室)和内部轴突隔室装填含甲基纤维素的培养基。在体外，在3-5天内，轴突开始进入左边和右边的隔室，如例如Campenot等，见上文的图1和图4中所示。

为了触发局部轴突变性，用含NGF阻断性抗体(抗NGF，Genentech，Inc.，20ug/ml)的Neurobasal培养基替代轴突隔室的含NGF的培养基。NGF剥夺后0小时、6小时、或24-48小时，将感觉神经元在4％PFA中于室温固定30分钟并为用轴突标志物TUJ-1(Covance，1∶500稀释)进行的免疫荧光染色进行加工以通过荧光显微术显现变性中的轴突(图11B)(如上文实施例7所述)。为了显现Campenot室的轴突隔室中免疫荧光标记的感觉轴突，在Axioplan-2成像Zeiss显微镜上使用来自Carl Zeiss Imaging Solutions的Axio Vision40 Release4.5.0.0SP1(03/2006)计算机软件拍摄照片。

为了检验配体是否是DR6在由NGF断绝触发的轴突变性程序中的功能所需要的，在Campenot室的轴突隔室中包括30ug/ml hDR6-ECD-Fc免疫粘附素蛋白(上文实施例3中所述)或30ug/ml对照Fc(Genentech，Inc.)以及抗NGF处理。NGF剥夺后0-24小时，将Campenot室中的轴突用4％PFA/PBS固定并通过使用TUJ-1(1∶500，Covance)/偶联有荧光基团Alexa 488的二抗(MolecularProbes，BD)进行的免疫荧光染色来显现(图11B)。

NGF剥夺触发了轴突变性的惊人样式，如图11B中所示。重要的是，hDR6-ECD-Fc免疫粘附素蛋白的添加延迟此***中轴突变性的发生(图11B，下面的小图)。因而，这些数据提示可溶性配体可能是DR6受体在通过消除生长因子诱发的局部轴突变性中的功能所需要的。

实施例9：NGF剥夺后DR6配体结合位点自轴突脱落

如图12A和12B中所示，使用DR6-AP构建体来显现感觉轴突上的DR6结合位点。

在图12A中，由左至右，上面的两幅照片分别以低和高放大倍数显示了使用DR6-AP构建体以显现在存在NGF的情况中处于发育阶段E12.5的感觉轴突48小时时这些轴突上DR6结合位点的显像，而下面的两幅照片分别以低和高放大倍数显示了使用AP对照构建体的感觉轴突的显像。

如图12B中所示，DR6配体结合位点在NGF剥夺后自感觉轴突丢失。

在图12B中，由左至右，上面的两幅照片显示了感觉轴突上DR6结合位点的显像，其中第一幅照片显示了在存在NGF和BAX抑制剂的情况中的感觉神经元，而第二幅照片显示了在存在NGF的情况中的Bax缺无的感觉神经元。下面的两幅照片分别显示了在不存在NGF但存在BAX抑制剂的情况中的感觉神经元及在不存在NGF的情况中的Bax缺无的感觉神经元。在存在和不存在神经营养蛋白的情况中在运动轴突中观察到等同的结果。

用于生成图12A和12B中所显示的数据的材料和方法如下。使用pRK5-AP克隆载体(参见例如Yan等，Nature Immunology 1，37-41(2000))，通过将小鼠DR6胞外域融合至人胚胎碱性磷酸酶来生成DR6-AP构建体(DR6-AP)。PRK5亲本克隆载体可自Becton，Dickinson and Company，Pharmingen division获得。用于生成DR6-AP融合蛋白的鼠DR6胞外域序列如下：

MGTRASSITALASCSRTAGQVGATMVAGSLLLLGFLSTITAQPEQKTLSLPGTYRHVDRTTGQVLTCDKCPAGTYVSEHCTNMSLRVCSSCPAGTFTRHENGIERCHDCSQPCPWPMIERLPCAALTDRECICPPGMYQSNGTCAPHTVCPVGWGVRKKGTENEDVRCKQCARGTFSDVPSSVMKCKAHTDCLGQNLEVVKPGTKETDNVCGMRLFFSSTNPPSSGTVTFSHPEHMESHDVPSSTYEPQGMNSTDSNSTASVRTKVPSGIEEGTVPDNTSSTSGKEGTNRTLPNPPQVTHQQAPHHRHILKLLPSSMEATGEKSSTAIKAPKRGHPRQNAHKHFDINEH(SEQ ID NO：14)

Bax缺无小鼠系(Bax-R1)先前已有记载(Deckwerth等，Neuron，卷17，401-411，1996)，而且得自Jackson Laboratories。以10uM使用BAX抑制肽来阻断神经元细胞死亡(Bax-V5，Tocris Inc)。

为了生成小鼠DR6胞外域-AP融合蛋白(DR bv6-AP)，使用FuGene转染试剂(Roche)依照制造商的方案用15ug DR6-AP融合表达构建体转染在DMEM/10％FBS(Gibco)培养基中培养的COS-1细胞。转染后12小时，将COS-1细胞培养基换成OPTI-MEM(Invitrogen)。转染后48小时，收集并过滤含有DR6-AP蛋白的COS-1细胞条件化培养基。如下定量培养基中DR6-AP蛋白的量：

将100ul 2XAP缓冲液(通过将100mg对硝基苯基磷酸盐(Sigma)和15ul1M MgCl₂添加至15ml 2M二乙醇胺pH 9.8来制备)与等体积的经转染COS细胞条件化培养基或来自未转染COS-1细胞的对照条件化培养基混合。在12-15分钟里对反应的颜色显色，此时O.D.在线性范围内(0.1-1)。然后通过添加800ul蒸馏水来调节反应体积，并测量405nm吸光度波长处的O.D.。以nM计的浓度依照如下公式计算(用于100ul)：C(nM)＝O.D.X 100X(60/显色时间)/30。

为了原位DR6-AP感觉轴突结合测定法，在含50ng/ml NGF(Roche)的如上文实施例7-8中所概述的Neurobasal培养基/B27(Invitrogen)中培养野生型的或Bax缺无的感觉外植体。铺板后2天，DRG外植体或是不处理或是如上文实施例7-8中所述剥夺NGF。添加Bax抑制肽，如图12B所示(10uM，Bax-V5，Tocris)。NGF剥夺后12小时，将DRG外植体用结合缓冲液(HBSS，Gibco产品目录号14175-095，含0.2％BSA，0.1％NaN3，5mM CaCl₂，1mM MgCl₂，20mMHEPES，pH＝7.0)清洗2次。然后实施AP结合测定法，即制备DR6-AP条件化培养基和结合缓冲液(或对照AP条件化培养基和结合缓冲液)的1∶1混合物，将其直接施加至8孔培养载玻片(Becton，Dickinson and Company)中的DRG外植体并于室温温育90分钟。

温育后，通过将DRG外植体用结合缓冲液漂洗5次来洗掉未结合的DR6-AP蛋白。然后将DRG外植体用PBS中稀释的3.7％甲醛于室温固定12分钟。通过将DRG外植体用HBS缓冲液(20mM HEPES pH＝7.0，150mM NaCl)漂洗3次来除去剩余的甲醛。通过在HBS缓冲液中于65℃热灭活30分钟来阻断内源AP活性。然后将DRG外植体在AP反应缓冲液(100mM TRIS pH＝9.5，100mM NaCl，50mM MgCl₂)中漂洗3次。然后通过在含1/50(以体积计)NBT/BCIP原液(Roche，产品目录号1681451)的AP反应缓冲液中对DRG外植体上的颜色着色斑于室温显色过夜来显现结合至感觉轴突的DR6-AP融合蛋白(图12A和12B)。在平行的对照实验中，将来自经AP转染的COS细胞的条件化培养基用于AP轴突结合测定法(图12A，下面的小图)。

如图12B中所示，DR6-AP结合位点在NGF剥夺后自感觉轴突表面丢失，提示DR6配体在营养剥夺后被释放入轴突条件化培养基中。

如图12C中所示，处于发育阶段E12.5的BAX缺无感觉轴突的研究显示了β-分泌酶(BACE)抑制剂能阻断NGF断绝后DR6-AP结合位点自感觉轴突消失。在图12C中，由左至右，上面的三幅照片显示了在分别存在DMSO对照、OM99-2(BACE-I抑制剂)和TAP1(α-分泌酶-I抑制剂)的情况中的这些神经元。下面的照片显示了在存在NGF的情况中的这些神经元。

上文描述了用于生成此数据的小鼠DR6胞外域-AP融合蛋白。Bax缺无小鼠系(Bax-R1)先前已有记载(Deckwerth等，Neuron，卷17，401-411，1996)，而且得自Jackson Laboratories。如上文关于图12A和12B所述的那样实施DRG外植体培养和DR6-AP轴突结合测定法。在此测定法中以1um终浓度使用BACE抑制剂(InSolution OM99-2，Calbiochem/Merck)。在此测定法中以10uM终浓度使用α-分泌酶抑制剂TAPI(TAPI-1，Calbiochem)。为了显现DR6-AP阳性感觉轴突(通过上文实施例9中所概述的AP比色法染色反应来染色)，在Axioplan-2成像Zeiss显微镜上使用来自Carl Zeiss Imaging Solutions的Axio Vision40 Release 4.5.0.0SP1(03/2006)计算机软件拍摄亮视野照片。

实施例10：淀粉状蛋白前体蛋白(APP)是DR6的关联配体

如图13中所示，发现N-APP是DR6胞外域相关配体。

在图13A中，由左至右，前两幅印迹提供了来自使用DR6-AP构建体进行的研究的数据，以探查在存在和不存在生长因子的情况中(及在存在Bax抑制剂的情况中)自感觉和运动神经元得到的蛋白质。在这些印迹中，在剥夺了生长因子(及在存在Bax抑制剂的情况中)的感觉和运动神经元中都观察到APP多肽(包括在大约35kDA处的强条带)。图13A的中央印迹显示了用自剥夺了生长因子的感觉神经元得到的多肽的抗N-APP抗体探针相应地观察到APP多肽(包括在大约35kDA处的强条带)。1∶100稀释用于Western印迹实验的多克隆抗N-APP抗体得自Thermo Scientific(产品目录号RB-9023-P1)。以10uM使用Bax抑制肽P5(Tocris Biosciences，产品目录号1786，细胞通透性的Bax线粒体转位合成肽抑制剂)。

图13A右边的印迹中所呈现的数据进一步证实了APP是DR6胞外域相关配体的观察结果。在NGF剥夺的条件下自Campenot室轴突隔室收集感觉轴突条件化培养基，并使用一般性下拉方案(general pull-down protocol)(例如Nikolaev等，2004，BBRC，323，1216-1222)自感觉轴突条件化培养基纯化DR6-ECD胞外域相关因子。将偶联有DR6-ECD-His胞外域(下文所述构建体)的NiNTA珠(Sigma)与50ml感觉轴突条件化培养基在如下条件下一起温育：150mM NaCl，0.2％NP-40(Calbiochem)，1X PBS缓冲液，于4℃过夜。然后将偶联有DR6-ECD-His胞外域的NiNTA珠(Sigma)用10倍过量的结合缓冲液(150mM NaCl，0.2％NP-40(Calbiochem)，在1X PBS缓冲液中)清洗5次，并用1X SDS样品加载缓冲液(Invitrogen)洗脱DR6-ECD结合蛋白复合物，然后将其经凝胶电泳分开并用抗N-APP抗体探查。来自此DR6-ECD下拉实验的数据相应地鉴定了APP多肽(包括在35kDA处的强条带)。

依照先前记载的方案(Pettmann等，1988，J.Neurosci.，8(10)：3624-3632)对轴突条件化培养基实施DR6-AP印迹测定法。用于Western印迹实验的多克隆抗N-APP抗体得自Thermo Scientific(产品目录号RB-9023-P1)。所使用的小鼠DR6胞外域-AP融合蛋白如上文实施例9中所描述的。表达小鼠重组DR6-ECD-His，随后自CHO细胞培养物纯化。鼠DR6-ECD-His的氨基酸序列如下：

MGTRASSITALASCSRTAGQVGATMVAGSLLLLGFLSTITAQPEQKTLSLPGTYRHVDRTTGQVLTCDKCPAGTYVSEHCTNMSLRVCS SCPAGTFTRHENGIERCHDCSQPCPWPMIERLPCAALTDRECICPPGMYQSNGTCAPHTVCPVGWGVRKKGTENEDVRCKQCARGTFSDVPSSVMKCKAHTDCLGQNLEVVKPGTKETDNVCGMRLFFSSTNPPSSGTVTFSHPEHMESHDVPSSTYEPQGMNSTDSNSTASVRTKVPSGIEEGTVPDNTSSTSGKEGTNRTLPNPPQVTHQQAPHHRHILKLLPSSMEATGEKSSTAIKAPKRGHPRQNAHKHFDINEHHHHHH(SEQ ID NO：15)

图13B通过DR6印迹显示了轴突条件化培养基中的DR6配体的另一个显像。此印迹数据鉴定了许多APP多肽，包括在35kDa处的N-末端APP以及C99-APP和C83/C89 APP多肽。依照先前记载的方案(Pettmann等，1988，J.Neurosci.，8(10)：3624-3632)对轴突条件化培养基实施DR6-AP印迹测定法。如上文实施例8中所述生成小鼠DR6胞外域-AP融合蛋白。表达小鼠DR6-ECD-His，随后自CHO细胞培养物纯化。DR6-ECD-His的氨基酸序列见下文。用于Western印迹实验的多克隆抗N-APP抗体得自Thermo Scientific(产品目录号RB-9023-P1)。为了显现膜系留的APP C-末端片段(CTF)C99-APP和C83/C89-APP，使用识别Aβ中央部分内的表位的4G8抗体(单克隆4G8，1∶500，Covance)对轴突溶胞物实施Western印迹分析。

图14A提供的照片显示了NGF剥夺后不久发生APP胞外域的脱落。在图14A中，在存在为了阻断轴突变性而添加的Bax抑制剂的情况中，将处于生长因子消除后不同时间的神经元用N-APP多克隆抗体染色。由左至右，这些照片显示了0小时以及NGF消除(及添加抗NGF抗体)后3、6、12和24小时时的轴突变性。

用于在APP轴突脱落实验中显现表面APP表达的多克隆抗N-APP抗体得自Thermo Scientific(产品目录号RB-9023-P1)。如上文实施例6和7中所述的那样实施感觉外植体培养。如上文实施例7中所述的那样但有如下修改地实施NGF剥夺测定法。在NGF剥夺后的指定时间间隔(0小时、3小时、6小时、12小时、和24小时)后将DRG外植体培养物在4％PFA/PBS中固定。为了显现表面APP表达，如实施例6和7中所述的那样但没有Triton透化处理地为免疫荧光染色加工DRG外植体，其中使用上文所述抗N-APP一抗。

为了显现感觉轴突上的表面APP表达(用抗N-APP抗体免疫荧光标记，Thermo Scientific(产品目录号RB-9023-P1))，在Axioplan-2成像Zeiss显微镜上(在红色荧光通道中)使用来自Carl Zeiss Imaging Solutions的Axio Vision40Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)计算机软件拍摄照片。

图14B提供的照片显示了DR6胞外域结合培养细胞所表达的APP。在图14B中，由左至右，上面的两幅照片显示了分别用DR6-APP(具有DR6胞外域)探查的对照Cos细胞和表达APP的细胞。下面的两幅照片显示了用DR6-AP探查的p75NTR受体和DR6受体表达细胞。DR6胞外域不结合p75NTR或DR6受体表达细胞。

用于生成此图中所显示的数据的材料和方法如下。为了测试APP是否直接与DR6胞外域相互作用，实施了基于细胞的AP结合测定法(图14B)。为了生成DR6胞外域-AP融合蛋白(DR6-AP)，使用FuGene转染试剂(Roche)依照制造商的方案用15ug DR6-AP融合表达构建体转染在DMEM/10％FBS(Gibco)培养基中培养的COS-1细胞。转染后12小时，将COS-1细胞培养基换成OPTI-MEM(Invitrogen)。转染后48小时，收集并过滤含有DR6-AP蛋白的COS-1细胞条件化培养基。

依照如下规程定量培养基中DR6-AP蛋白的量。将100ul 2XAP缓冲液(通过将100mg对硝基苯基磷酸盐(Sigma)和15ul 1M MgCl₂添加至15ml 2M二乙醇胺pH 9.8来制备)与等体积的经转染COS细胞条件化培养基或来自未转染COS-1细胞的对照条件化培养基混合。在12-15分钟里对反应的颜色显色，此时O.D.在线性范围内(0.1-1)。然后通过添加800ul蒸馏水来调节反应体积，并测量405nm吸光度波长处的O.D.。以nM计的浓度依照如下公式计算(用于100ul)：C(nM)＝O.D.X 100X(60/显色时间)/30。

为了APP AP结合测定法，使用FuGene转染试剂(Roche)依照制造商的方案每孔用2ug APP表达载体转染在6孔培养盘中在DMEM/10％FBS(Gibco)培养基中培养的COS-1细胞。转染后2天，将细胞用结合缓冲液(HBSS，Gibco产品目录号14175-095，含0.2％BSA，0.1％NaN₃，5mM CaCl₂，1mM MgCl₂，20mM HEPES，pH＝7.0)清洗两次。然后实施AP结合测定法，即制备DR6-AP条件化培养基和结合缓冲液的1∶1混合物，将其直接应用至过表达APP的COS-1细胞并于室温温育90分钟。温育后，通过将COS-1细胞用结合缓冲液漂洗5次来洗掉未结合的DR6-AP蛋白。然后将细胞用在PBS中稀释的3.7％甲醛于室温固定12分钟。通过将细胞用HBS缓冲液(20mM HEPES pH＝7.0，150mM NaCl)漂洗3次来除去剩余的甲醛。通过在HBS缓冲液中于65℃热灭活30分钟来阻断内源AP活性。然后将COS-1细胞在AP反应缓冲液(100mM TRISpH＝9.5，100mM NaCl，50mM MgCl₂)中漂洗3次。然后通过在含1/50(以体积计)NBT/BCIP原液(Roche，产品目录号1681451)的AP结合缓冲液中对COS-1细胞上的颜色反应于室温显色过夜来显现DR6-AP融合蛋白对跨膜APP的结合(图14B)。在平行的对照实验中，将来自未转染COS细胞的条件化培养基用于AP结合测定法。在相同的实验条件下在COS-1细胞中表达的跨膜p75NTR和DR6受体不显示对DR6-AP融合蛋白的特异性结合(图14B)，指示DR6胞外域与APP之间的相互作用是特异性的。

图14C提供的照片显示了DR6是感觉轴突上的N-APP的主要受体，而且APP结合位点在DR6缺无小鼠的神经元细胞中显著消减。在图14C中，由左至右，上面的三幅照片显示了分别用AP对照、N-APP-AP、和Sema3A-AP探查的自DR6+/-(het)小鼠得到的神经元。下面的三幅照片相应地显示了分别用AP对照、N-APP-AP、和Sema3A-AP探查的自DR6-/-(KO)小鼠得到的神经元。

用于生成图14C中所显示的数据的材料和方法如下。如上文实施例9中所述生成小鼠DR6胞外域-AP融合蛋白。如先前所记载的那样(Feiner等，1997，Neuron，卷19，539-545)生成小鼠Sema3A胞外域-AP(Sema3A-AP)融合蛋白。DR6缺无小鼠系(DR6.KO)先前已有记载(Zhao等，Journal of ExperimentalMedicine，卷194，1441-1441，2001)。如上文实施例9关于图12A和12B所述实施DRG外植体培养和DR6-AP轴突结合测定法。

图14D提供的照片显示了拮抗性DR6抗体破坏DR6胞外域与神经元APP之间的相互作用。在这些研究中，将N-APP添加至表达DR6的神经元细胞，然后用抗N-APP抗体显现。由左至右，前四幅照片显示了在分别存在以下各项的情况中N-APP结合神经元表面上的DR6的能力：对照IgG；RA.4抗DR6抗体；RA.3抗DR6抗体；和RA.1抗DR6抗体。最右边的照片显示了使用对照IgG的细胞上DR6的染色。

用于生成此图中所显示的数据的材料和方法如下。如先前所记载的那样(Okada等，Nature，2006，卷444，369-373)但有以下修改地实施用于获得图14D中所显示的数据的基于细胞的配体结合测定法。为了生成N-末端生长因子样结构域APP-His融合蛋白(N-APP-His)，使用FuGene转染试剂(Roche)依照制造商的方案用15ug N-APP-His融合表达构建体转染在DMEM/10％FBS(Gibco)培养基中培养的COS-1细胞。转染后12小时，将COS-1细胞培养基换成OPTI-MEM(Invitrogen)。转染后48小时，收集并过滤含有N-APP-His蛋白的COS-1细胞条件化培养基。通过Western印迹分析用上文所述抗N-APP抗体测定N-APP-His浓度。

此结合测定法中所使用的人N-APP-His的氨基酸序列如下：

MLPGLALLLLAAWTARALEVPTDGNAGLLAEPQIAMFCGRLNMHMNVQNGKWDSDPSGTKTCIDTKEGILQYCQEVYPELQITNVVEANQPVTIQNWCKRGRKQCKTHPHFVIPYRCLVGEFVSDALLVPDKCKFLHQERMDVCETHLHWHTVAKETCSEKSTNLHDYGMLLPCGIDKFRGVEFVCCPLAEESDNVDSADAEEDHHHHHH(SEQ ID NO：10)

然后实施N-APP-His结合测定法，即制备N-APP-His条件化培养基与结合缓冲液的1∶1混合物，将其直接施加至过表达DR6受体的COS-1细胞并于室温温育90分钟。如所示的那样，与N-APP-His条件化培养基和结合缓冲液一起个别地以20ug/ml添加DR6单抗RA.1、RA.3或RA.4(上文实施例3和7所述)。在对照实验中与N-APP-His条件化培养基和结合缓冲液一起以20ug/ml添加正常小鼠IgG(Genentech Inc)。

通过免疫荧光染色用抗N-APP抗体(Thermo Scientific产品目录号RB-9023-P1)依照如实施例6和7的方案所述的已知方案(Okada等，Nature，2006，卷444，369-373)来显现N-APP对表达DR6受体的细胞的结合。为了显现结合至细胞表面上DR6受体的N-APP蛋白(用抗N-APP抗体免疫荧光标记的，Thermo Scientific(产品目录号RB-9023-P1))，在Axioplan-2成像Zeiss显微镜上(在红色荧光通道中)使用来自Carl Zeiss Imaging Solutions的Axio Vision40Release 4.5.0.0SP1(03/2006)计算机软件拍摄照片。

实施例11：淀粉状蛋白前体蛋白(APP)活化DR6来诱导轴突变性

图15A提供的照片显示了针对N-末端APP的多克隆抗体在连合轴突测定法中阻断轴突变性。由左至右，图15A中的照片显示了在分别存在以下各项的情况中的连合轴突变性：对照IgG；30ug/ml抗NAPP抗体；和1.1ug/ml抗NAPP抗体。

用于生成图15A中所显示的数据的材料和方法如下。如实施例2的方案和图4B中所生成的数据中所述用所示数量的多克隆抗N-APP抗体(ThermoScientific产品目录号RB-9023-P1，经过大量透析的)或对照IgG(家兔IgG，R&D Systems)实施连合外植体存活测定法。为了显现GFP标记的连合轴突，在Axiovert 200 Zeiss倒置显微镜上(在GFP的绿色荧光通道中)使用来自CarlZeiss Imaging Solutions的Axio Vision40 Release 4.5.0.0SP1(03/2006)计算机软件拍摄照片。

图15B提供的照片显示了N-末端APP抗体抑制由NGF消除诱发的感觉轴突变性。由左至右，图15B上面的三幅照片分别显示了在存在NGF和以下各项的情况中的感觉轴突：对照抗体；抗APP单克隆抗体22C11；和抗APP多克隆抗体。下面的三幅照片相应地分别显示了在不存在NGF(以及抗NGF抗体)和以下各项的情况中的感觉轴突：对照抗体；抗APP单克隆抗体22C11；和抗APP多克隆抗体。

用于生成此图15B中所显示的数据的材料和方法如下。如上文实施例8中所述在Campenot室中实施NGF剥夺测定法。此测定法中所使用的针对N-末端APP的抗体是多克隆抗N-APP抗体(Thermo Scientific产品目录号RB-9023-P1，经过大量透析的)或22C11单克隆抗体(22C11，Chemicon，经过大量透析的)。添加正常IgG(家兔IgG，R&D Systems)作为对照实验。如实施例1、7和8中所述用TUJ1抗体(1∶500，Covance)实施感觉轴突的免疫荧光标记。为了显现Campenot室的轴突隔室中的免疫荧光标记的感觉轴突，在Axioplan-2成像Zeiss显微镜上使用来自Carl Zeiss Imaging Solutions的Axio Vision40 Release 4.5.0.0SP1(03/2006)计算机软件拍摄照片。

图15C提供的照片显示了添加N-APP能挽救通过对β-分泌酶(BACE)活性的抑制而阻断的轴突变性。由左至右，图15C上面的三幅照片显示了在分别存在以下各项的情况中观察到的神经元(在不存在NGF的情况中培养的)和轴突变性：DMSO对照、BACE抑制剂、和N-APP(及BACE-I)。图15C下面的三幅照片显示了相应地显示了分别在存在以下各项的情况中的神经元(在存在NGF的情况中培养的)：DMSO对照、BACE抑制剂、和N-APP(及BACE-I)。

用于生成此图15C中所显示的数据的材料和方法如下。如上文实施例8中所述在Campenot室中实施NGF剥夺测定法。此测定法中所使用的人重组N-APP氨基酸19-306购自Novus(Novus Biologicals，产品目录号H00000351-P01)。在NGF剥夺时，与BACE抑制剂(1uM终浓度，InSolutionOM99-2，Calbiochem/Merck)一起以3ug/ml添加N-APP。在此测定法中以1uM终浓度使用BACE抑制剂(InSolution OM99-2，Calbiochem/Merck)。如实施例1、7和8中所述用TUJ1抗体(1∶500，Covance)实施感觉轴突的免疫荧光标记。为了显现Campenot室轴突隔室中的免疫荧光标记的感觉轴突，在Axioplan-2成像Zeiss显微镜上使用来自Carl Zeiss Imaging Solutions的Axio Vision40Release 4.5.0.0SP1(03/2006)计算机软件拍摄照片。

图15D提供的照片显示了RNAi对APP的消除使在存在BACE抑制剂的情况中的神经元细胞生长对N-APP诱发的细胞死亡敏化。在图15D中，由左至右，上面的三幅照片显示了在存在对照RNAi的情况中培养的神经元。这些上面的照片显示了分别与3ug/ml N-APP或0.1ug/ml N-APP一起培养的对照以及神经元。下面的三幅照片显示了在存在APP RNAi的情况中培养的神经元。这些下面的照片显示了与3ug/ml N-APP或0.1ug/ml N-APP一起培养的对照以及神经元。

用于生成此图15D中所显示的数据的材料和方法如下。如实施例2中所述实施连合外植体培养物中的APP RNAi。此测定法中所使用的人重组N-APP氨基酸19-306购自Novus(Novus Biologicals，产品目录号H00000351-P01)。在此测定法中依照制造商的方案使用预设计的大鼠特异性APPON-TARGETplus siRNA集合以下调E13大鼠连合外植体中的APP表达(APPON-TARGETplus siRNA集合，GeneID：54226，产品目录号088191，Dharmacon Inc.)。为了显现GFP标记的和RFP标记的连合轴突(如实施例2和7中所述)，在Axiovert 200 Zeiss倒置显微镜上(在GFP的绿色荧光通道中)使用来自Carl Zeiss Imaging Solutions的Axio Vision40 Release 4.5.0.0SP1(03/2006)计算机软件拍摄照片。

实施例12：DR6是APP诱发的轴突变性所需要的但不是Aβ触发的变性所需要的

如图16A中所述，DR6活化是N-APP诱发的轴突变性所需要的。

在图16A中，由左至右，上面的三幅照片显示了自DR6+/-(het)小鼠获得的神经元。第一幅的照片显示了未暴露于Aβ或N-APP的对照神经元，第二幅照片显示了暴露于Aβ的神经元，而第三幅照片显示了暴露于N-APP的神经元。下面的三幅照片显示了自DR6-/-(KO)小鼠获得的神经元。由左至右，下面的第一幅照片显示了未暴露于Aβ或N-APP的对照神经元，第二幅照片显示了暴露于Aβ的神经元，而第三幅照片显示了暴露于N-APP的神经元。

用于生成此图16A中所显示的数据的材料和方法如下。如实施例2中所述实施连合外植体培养和存活测定法。DR6缺无小鼠系(DR6.KO)先前已有记载(Zhao等，Journal of Experimental Medicine，卷194，1441-1441，2001)。此测定法中所使用的人重组N-APP氨基酸19-306购自Novus(Novus Biologicals，产品目录号H00000351-P01)。此测定法中所使用的重组人β淀粉状蛋白氨基酸1-42购自Chemicon(超纯的人Aβ1-42，产品目录号AG912，Chemicon)。铺板后24小时与BACE抑制剂一起以3ug/ml将N-APP添加至连合外植体。铺板后24小时与BACE抑制剂一起以3uM将重组人β淀粉状蛋白氨基酸1-42添加至连合外植体。在此测定法中以1uM终浓度使用BACE抑制剂(InSolutionOM99-2，Calbiochem/Merck)。将连合外植体与指定量的N-APP或Aβ一起再温育24小时。在连合外植体铺板后48小时收集数据。为了显现连合轴突，在Axiovert 200 Zeiss倒置显微镜上(in the bright field)使用来自Carl ZeissImaging Solutions的Axio Vision40 Release 4.5.0.0SP1(03/2006)计算机软件拍摄照片。

如图16B所示，拮抗性DR6抗体未能阻断由Aβ触发的轴突变性。在图16B中，由左至右，上面的三幅照片显示了对照神经元、在存在BACE-I的情况中的神经元、和在存在BACE-I和Aβ的情况中的神经元。在图16B中，下面的两幅照片显示了在存在BACE-I、Aβ和抗DR6抗体RA.1的情况中的神经元，然后是在存在BACE-I、Aβ和抗DR6抗体RA.3的情况中的神经元。

用于生成此图16B中所显示的数据的材料和方法如下。如实施例2中所述实施连合外植体培养和存活测定法。此测定法中所使用的重组人β淀粉状蛋白氨基酸1-42购自Chemicon(超纯的人Aβ1-42，产品目录号AG912，Chemicon)。在此测定法中以1uM终浓度使用BACE抑制剂(InSolution OM99-2，Calbiochem/Merck)。在铺板后24小时与BACE抑制剂和指定的抗DR6单抗(40ug/ml)一起以3uM将重组人β淀粉状蛋白氨基酸1-42添加至连合外植体。在此测定法中以1uM终浓度使用BACE抑制剂(InSolution OM99-2，Calbiochem/Merck)。将连合外植体与指定量的Aβ一起再温育24小时。在连合外植体铺板后48小时收集数据。

小鼠单克隆RA.1-RA.5DR6抗体是如上文实施例3中所述通过用DR6胞外域免疫小鼠而生成的。如上所述，在本文中称作RA.1和RA.3抗体的DR6抗体分别是“1E5.5.7”和“3F4.4.8”，即实施例3中所描述的DR6抗体。为了显现GFP标记的连合轴突，在Axiovert 200 Zeiss倒置显微镜上(in the greenfluorescence channel for GFP)使用来自Carl Zeiss Imaging Solutions的Axio Vision40 Release 4.5.0.0SP1(03/2006)计算机软件拍摄照片。

实施例13：胞内DR6信号传导

胱天蛋白酶是程序性细胞死亡途径中的重要因子(参见例如Grutter等，Curr Opin Struct Biol.10(6)：649-55(2000)；Kuida等，Nature 384(6607)：368-72(1996)；及Finn等，J Neurosci.20(4)：1333-41(2000))，而且有些胱天蛋白酶与神经变性性疾病(包括亨庭顿氏病和AD)中的胞内信号传导有关(参见例如Wellington等，J Neurosci.22(18)：7862-72(2002)；Graham等，Cell125(6)：1179-91(2006)；Guo等，Am J Pathol.(2)：523-31(2004)；及Horowitz等，J Neurosci.24(36)：7895-902(2004))。

图17A显示了培养5天然后暴露于各种不同培养条件达24小时的感觉神经元的照片。如图17A中所示，通过对JNK和上游胱天蛋白酶-8但非下游胱天蛋白酶-3的抑制延迟了轴突变性。

在图17A中，左边的两幅照片以递减的次序显示了分别暴露于NGF和抗NGF抗体的感觉神经元。在图17A中，右边的四幅照片以递减的次序显示了分别暴露于抗NGF抗体和JNK抑制剂；抗NGF抗体和胱天蛋白酶-8抑制剂；抗NGF抗体和BAX抑制剂；及抗NGF抗体和胱天蛋白酶-3抑制剂的感觉神经元。

用于生成此图17A中所显示的数据的材料和方法如下。如上文实施例8中所述在Campenot室中实施NGF剥夺测定法。在此测定法中以1uM终浓度使用小分子JNK抑制剂SP 600125，(产品目录号1496，Tocris Bioscience)。在此测定法中以10uM使用胱天蛋白酶-3抑制剂Z-DEVD-FMK(Z-DEVD-FMK，产品目录号264155，Calbiochem)。在此测定法中以10uM使用胱天蛋白酶-8抑制剂Z-IETD-FMK(Z-IETD-FMK，产品目录号FMK007，R&D Systems)。以10uM使用BAX抑制肽来阻断神经元细胞死亡(Bax-V5，Tocris Inc)。Bax缺无小鼠系(Bax-R1)先前已有记载(Deckwerth等，Neuron，卷17，401-411，1996)，而且得自Jackson Lab。如实施例1、7和8中所述用TUJ1抗体(1∶500，Covance)实施感觉轴突的免疫荧光标记。为了显现Campenot室的轴突隔室中的免疫荧光标记的感觉轴突，在Axioplan-2成像Zeiss显微镜上使用来自Carl ZeissImaging Solutions的Axio Vision40 Release 4.5.0.0SP1(03/2006)计算机软件拍摄照片。

图17B提供了来自E12.5运动神经元外植体培养物的运动神经元的照片，显示了胱天蛋白酶-3在细胞主体中发挥功能，而胱天蛋白酶-6在轴突中发挥功能。

在图17B中，由左至右，四幅照片显示了分别与以下各项一起培养的神经元：(1)生长因子；(2)没有生长因子且不存在胱天蛋白酶抑制剂(对照)；(3)没有生长因子但存在胱天蛋白酶-3抑制剂；和(4)没有生长因子但存在胱天蛋白酶-6抑制剂。

用于生成此图17B中所显示的数据的材料和方法如下。在此测定法中以10uM使用胱天蛋白酶-3抑制剂Z-DEVD-FMK(Z-DEVD-FMK，产品目录号264155，Calbiochem)。在此测定法中以10uM使用胱天蛋白酶-6抑制剂Z-VEID-FMK(Z-VEID-FMK，产品目录号550379，Becton，Dickinson andCompany PHARMINGEN Division)。如上文实施例6中所述实施运动神经元腹侧脊髓存活测定法。如实施例1、7和8中所述用TUJ1抗体(1∶500，Covance)实施运动轴突的免疫荧光标记。为了显现免疫荧光标记的运动轴突，在Axioplan-2成像Zeiss显微镜上使用来自Carl Zeiss Imaging Solutions的Axio Vision40 Release 4.5.0.0SP1(03/2006)计算机软件拍摄照片。

图17C提供了培养5天然后暴露于各种不同培养条件达24小时的感觉神经元的照片。图17C中的数据显示了虽然胱天蛋白酶-3似乎不是轴突变性所需要的，但是BAX是。

在图17C中，由左至右，上面的四幅照片分别显示了与NGF一起培养，然后是在存在抗NGF抗体的情况中(即NGF剥夺)培养16、24和48小时的BAX+/+神经元。下面的四幅照片相应地分别显示了与NGF一起培养，然后是与抗NGF抗体一起培养16、24和48小时的BAX-/-神经元。

用于生成此图17C中所显示的数据的材料和方法如下。如上文实施例8中所述在Campenot室中实施NGF剥夺测定法。Bax缺无小鼠系(Bax-R1)先前已有记载(Deckwerth等，Neuron，卷17，401-411，1996)，而且得自Jackson Lab。在NGF剥夺测定法中在Campenot室的轴突隔室中使用NGF抗体(单克隆功能阻断性抗NGF#911，Genentech，20ug/ml)。如实施例1、7和8中所述用TUJ1抗体(1∶500，Covance)实施感觉轴突的免疫荧光标记。为了显现Campenot室的轴突隔室中的免疫荧光标记的感觉轴突，在Axioplan-2成像Zeiss显微镜上(在绿色荧光通道中)使用来自Carl Zeiss Imaging Solutions的Axio Vision40Release 4.5.0.0SP1(03/2006)计算机软件拍摄照片。

图17D提供了在不同培养条件下培养24小时的E13大鼠外植体连合神经元的培养物的照片。图17D中的数据显示了胱天蛋白酶-3在细胞主体中发挥功能，而胱天蛋白酶-6在轴突中发挥功能。

在图17D中，由左至右，上面的三幅照片显示了对照神经元同分别与胱天蛋白酶-3或胱天蛋白酶-6抑制剂一起培养的神经元相比较的GFP分析。下面的三幅照片相应地显示了对照神经元同分别与胱天蛋白酶-3或胱天蛋白酶-6抑制剂一起培养的神经元相比较的TUNEL(细胞死亡)分析。

用于生成此图17D中所显示的数据的材料和方法如下。如实施例2中所述实施连合外植体培养和存活测定法。通过如上文实施例7中所述TUNNEL测定法在连合外植体培养物中显现连合细胞主体中的程序性细胞死亡。将连合外植体在4％PFA/PBS中固定并为单细胞水平的程序性细胞死亡(凋亡)的检测加工，该检测基于使用原位细胞死亡检测试剂盒(产品目录号11 684 795910，Roche)依照制造商的说明手册(Roche)的DNA链断裂标记(TUNNEL技术)。通过荧光显微镜检术分析连合感觉和运动外植体培养物的细胞主体中的凋亡(图17D)。在此测定法中以10uM使用胱天蛋白酶-3抑制剂Z-DEVD-FMK(Z-DEVD-FMK，产品目录号264155，Calbiochem)。在此测定法中以10uM使用胱天蛋白酶-6抑制剂Z-VEID-FMK(Z-VEID-FMK，产品目录号550379，Becton，Dickinson and Company，PHARMINGEN Division)。为了显现GFP标记的连合轴突，在Axiovert 200 Zeiss倒置显微镜上(在GFP的绿色荧光通道中)使用来自Carl Zeiss Imaging Solutions的Axio Vision40 Release4.5.0.0SP1(03/2006)计算机软件拍摄照片。为了显现荧光标记的TUNNEL阳性凋亡细胞主体，在Axioplan-2成像Zeiss显微镜上(在供TUNNEL用的红色荧光通道中)使用来自Carl Zeiss Imaging Solutions的Axio Vision40 Release4.5.0.0SP1(03/2006)计算机软件拍摄照片。

实施例14：动物模型中的DR6拮抗活性

熟练技术人员可采用多种与不同神经变性性疾病有关的动物模型来检验DR6拮抗剂在体内的效果。例如，APP/RK转基因小鼠表达突变型淀粉状蛋白前体蛋白多肽并展现严重的神经变性和凋亡。因此，APP/RK转基因小鼠提供了阿耳茨海默氏病的模型，其可用于检验DR6拮抗剂对在此动物模型中观察到的与此综合征有关的病理过程的效果(参见例如Moechars等，Neuroscience 91(3)：819-830(1999))。多种其它转基因鼠系(诸如APP23和JNPL3转基因系)表达突变型阿耳茨海默氏相关多肽并进一步展现神经元细胞损失。APP23和JNPL3转基因小鼠如此提供阿耳茨海默氏病的备选模型，其中可施用DR6拮抗剂(参见例如McGowan等，TRENDS in Genetics卷22期5(2006))。

G93A SOD1转基因小鼠表达人超氧化物歧化酶突变型多肽并展现升高水平的胱天蛋白酶-3表达以及运动神经元凋亡。G93A SOD1转基因小鼠提供了肌萎缩性侧索硬化的模型，其可用于检验DR6拮抗剂的效果(参见例如Tokuda等，Brain Res.1148：234-242(2007)；及Wang等，Eur.J.Neurosci.26(3)：633-641(2007))。R6/2转基因小鼠在其天然启动子的控制下表达亨廷顿的外显子-1及延伸的N-末端多谷氨酸重复并展现渐进性神经病理学变化，其再现人类中的亨庭顿氏病(参见例如Mangarini等，Cell，87，493-506(1996)；Chen等，Nat.Med.6，797-801(2000))。R6/2转基因小鼠提供了亨庭顿氏病的模型，其可用于检验DR6拮抗剂对在此动物模型中观察到的与此综合征有关的病理过程的效果(参见例如Wang等，European Journal of Neuroscience，26：633-641(2007))。PK-KO转基因小鼠不表达Park-2基因的蛋白质产物，展现与帕金森氏病类似的异常，并具有比来自野生型小鼠的神经元对凋亡更加易感的神经元(参见例如Casarejos等，J Neurochem.97(4)：934-46(2006))。PK-KO转基因小鼠提供了帕金森氏病的模型，其可用于表征DR6拮抗剂对在此动物模型中观察到的与此综合征有关的病理过程的效果。另外，许多转基因小鼠系(诸如Smn-/-SMN2小鼠、携带人AP启动子下的纯的239个三核苷酸CAG重复的转基因小鼠、以及有人SMN^C的至少一个拷贝在鼠背景中发挥功能的天然小鼠Smn基因转基因双重敲除)都或是不表达存活运动神经元基因的蛋白质产物或是表达其改变型式，并因此展现与脊髓性肌萎缩疾病类似的异常(参见例如Hsiu等，Nature Genetics 24，66-70(2000)；Ferri等，Neuroreport 15(2)：275-280(2004)；Ferri等，Curr Biol.2003 Apr 15；13(8)：669-73；及Rossol等，Journal of Cell Biology，卷163，期4，801-812(2003))。此类转基因鼠系因此提供了脊髓性肌萎缩的模型，其可用于表征DR6拮抗剂对在此动物模型中观察到的与此综合征有关的病理过程的效果。

神经病学疾病或病症的动物模型(包括上文所述那些)可用于检验本文中所公开的DR6拮抗剂的效果，例如一种或多种结合DR6的抗体(例如3F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7单克隆抗体)、和/或一种或多种结合APP的可溶性形式DR6(例如包含SEQ ID NO：1氨基酸1-354的)、和/或一种或多种结合APP的抗体(例如22C11单克隆抗体)以及彼此组合的和/或与本领域已知的其它治疗剂组合的这些药剂。

在本文中所公开的一种或多种DR6拮抗剂的实验测试的例示性方案中，可以将许多来自动物模型的年龄和性别匹配的动物(例如6月龄雌性APP/RK转基因小鼠)指派给多个测试和/或对照组之一。然后可以依照特定的施用方案对这些动物的第一测试组施用选定的DR6拮抗剂(例如腹膜内注射DR6拮抗剂抗体，每次注射20mg/kg体重，每两周一次，持续6个月)。其它测试组的条件可以依照标准实践而变化，例如施用不同剂量的DR6拮抗剂(例如1、5、10、15mg/kg体重)、施用不同进度表的DR6拮抗剂(例如每周一次，持续12个月)、施用不同的DR6拮抗剂(例如DR6免疫粘附素)、使用药剂组合(例如与胆碱酯酶抑制剂组合的DR6拮抗剂)、使用不同施用路径(例如静脉内施用)等。一组或多组的动物可充当对照，例如依照与接受DR6拮抗剂的测试组相同的施用过程接受无菌磷酸盐缓冲盐水。

在接受DR6拮抗剂后的有些时间段，然后可以对这些动物的测试组和匹配对照组进行比较，例如检验和/或表征DR6拮抗剂在体内的效果。例如，可以通过诸如磁共振显微术和/或免疫组织化学分析的技术来评估包含来自这些动物的测试组和对照组的特定组织或器官(例如脑)的神经元细胞的样品以比较这些组中的神经元细胞的状况(参见例如Petrik等，NeuromolecularMed.9(3)：216-29(2007))。或者，可以通过诸如多光子显微术的技术来评估自这些组得到的样品以证明诸如改变的神经突轨迹、树突棘损失或树突变细(thinning)的现象(参见例如Tsai等，Nat.Neurosci.7，1181-1183(2004)；及Spires等，J.Neurosci.25，7278-7287(2005))。或者，可以用自这些组得到的血液或其它组织样品进行ELISA方案，其设计用于测量炎症和/或凋亡的标志物的水平，诸如IL-1β、TNF-α、IL-10、p53蛋白、干扰素-γ、或NF-κB(参见例如Rakover等，Neurodegener.Dis.4(5)：392-402(2007)；及Mogi等，NeurosciLett.414(1)：94-7(2007))。或者，可以在本领域已知的行为测试范例中比较来自测试组和匹配对照组的动物，例如Morris水迷宫或目标识别测试(参见例如Hsiao等，Science 274，99-102(1996)；Janus等，Nature 408，979-982(2000)；Morgan等，Nature 408，982-985(2000)；及Ennaceur等，Behav.Brain Res.1988；31：47-59)。测试组与匹配对照组动物间的比较结果容许本领域技术人员检验DR6拮抗剂在体内在动物模型中的效果。

实施例1-13中所包括的数据及与此数据的有关表征证明了DR6拮抗剂会例如在体内抑制神经元细胞的凋亡。具体而言，上文实施例1-13教导了例如：(1)DR6在极其多种神经元细胞中诱导凋亡；(2)APP是结合DR6并触发DR6介导的凋亡的DR6关联配体；和(3)在体外抑制DR6/APP结合相互作用的DR6拮抗剂因此在体内抑制DR6介导的凋亡。鉴于申请人的发现和公开内容，本领域技术人员会合理预期DR6拮抗剂在体内抑制DR6介导的凋亡。为此，熟练技术人员会合理预期动物模型(诸如上文所述那些)和相关技术用于检验在这些动物模型中观察到的各种病理过程以验证DR6拮抗剂的生物学活性，如本文所述。

实施例15：脊髓性肌萎缩动物模型中的RA.1(“1E5.5.7”)、RA.2、RA.3(“3F4.4.8”)和RA.4抗体处理

脊髓性肌萎缩(SMA)是侵袭脊髓前角中的运动神经元的退行性(recessive)运动神经元疾病，而且认为它源自SMN(存活运动神经元)蛋白的减少(reduction)。SMA的动物模型是具有品系名称FVB.Cg-Tg(SMN2*delta7)4299Ahmb Tg(SMN2)89Ahmb SmnltmlMsd/J(JAX5025)的转基因小鼠系(参见例如Le等，Human Molecular Genetics14(6)：845-857(2005))。此三重突变小鼠包含两个转基因等位基因和一个靶定突变体。Tg(SMN2*delta7)4299Ahmb等位基因由缺少外显子7的SMA cDNA组成，而Tg(SMN2)89Ahmb等位基因由完整的人SMN2基因组成。在下文说明中，此品系也称作德耳塔(Δ，Delta)7SMAKO模型。

对于靶定的Smn等位基因是纯合的且对于两种转基因等位基因是纯化的小鼠展现与患有脊髓性肌萎缩(SMA)的患者相似的症状和神经病理。在出生时，三重突变体比正常的同窝出生者显著地要更小。到第5天，肌肉软弱的征候明显并在随后的一周里变得越来越显著，即小鼠展现异常的步态、后肢颤抖和趋于摔倒。存活均值为大约13天。三重突变体小鼠进一步展现受损的对表面翻正(surface righting)、负向地性(negative geotaxis)和悬崖转向(cliffaversion)的应答，但是对触觉刺激的应答没有受损。这些小鼠中自发的运动活性和握力也显著受损(参见例如Butchbach等，Neurobiol Dis.27(2)：207-19(2007))。下面的方案设计用于检验某些抗体(诸如DR6拮抗性抗体)和剂量对Δ7SMA模型小鼠(KO)的存活、体重和肌紧张性的效果。

如上所述，此研究中所使用的小鼠可以是Δ-7SMA(JAX 5025)KO模型(smn-/-；SMN2+/+；d7+/+)。可以在出生时将窝随机精选成10只动物(或一些其它数目)，其中例如取出相等数目的雄性和雌性。遵循此方案，可以在第一次剂量给药时(P3)将窝精选成8只小鼠。可以从研究中剔除任何具有少于6只幼仔的窝。可以在出生时(P0)给来自在周一和周三之间出生的窝的小鼠剪尾。可以通过本领域已知的多种方法来实施基因分型，例如使用可通过商业途径从分子诊断学公司诸如Transnetyx Inc获得的活检中转基因、敲除、和敲入突变的自动化基因分型服务筛选。通常在出生后48小时内可获得此基因型数据。

可以在例示性实验中使用例如在周一到周三出生的小鼠。可以在P3开始给小鼠IP剂量给药。此研究中的典型数目可以是：(1)例如平均10只KO(5只雄性和5只雌性)对照接受媒介诸如无菌PBS；(2)例如平均10只KO(5只雄性和5只雌性)接受第一剂量的相应抗体，其包含20mg/kg；和(3)例如平均10只KO(5只雄性和5只雌性)接受第二剂量的相应DR6抗体，其包含5mg/kg。每种动物可接受相应RA.1、RA.2、RA.3、和RA.4抗体的IP剂，每周两次。“RA.1抗体”对应于“1E5.5.7”，而“RA.3抗体”对应于“3F4.4.8”。“RA.2抗体”对应于“4B6.9.7”，而“RA.4抗体”对应于“2C7.3.7”(Genentech，Inc.，一种结合DR6但不阻断功能的抗体)。“RA.5抗体”对应于“3B11.7.7”(Genentech，Inc.，一种结合DR6但可增强或刺激DR6活性的抗体)。

RA.1、RA.2、RA.3和RA.4抗体可保存于4C。在必要时，可以在剂量给药前将这些抗体温暖至室温。可使用典型的媒介，诸如PBS。虽然此实施例中的RA.1、RA.2、RA.3、和RA.4单克隆抗体是使用人DR6多肽序列作为免疫原而生成的，但是所有这些抗体都与人以及大鼠和小鼠DR6起反应，正如诸如实施例7中所描述的轴突变性和凋亡测定法的方案所显示的。

在一个例示性的实施方案中，所评估的DR6拮抗剂可以是拮抗性抗体：RA.1、RA.2、RA.3和RA.4；每种抗体的处理组的数目可以是2(每组10只动物)；施用路径可以是IP；而剂量范围可以是5和20mg/kg。任选的是，组可以如下：(1)RA.1：5mg/kg IP；(2)RA.1：20mg/kg IP；(3)RA.2：5mg/kg IP；(4)RA.2：20mg/kg IP；(5)RA.3：5mg/kg IP；(6)RA.3：20mg/kg IP；(7)RA.4：5mg/kg IP；(8)RA.4：20mg/kg IP；和(9)媒介(PBS)IP。在此方案中，可以每天一次给小鼠称重。在出生后天数(PND)10、12和14，可以给窝中的每只幼仔称体重。在PND 6、8、10、12、14和16，可以对研究中的每只动物实施肌紧张性评估(参见例如下文所提供的例示性表型分型方案)。

在出生日(P0)，可以使用无毒墨水给幼仔纹身，施加在皮下下，并采集剪尾样品用于基因分型(结果通常可在48小时内获得)。在实验那天(P3)，可以每天同一时间将有新生儿的母兽带到实验室并在测试开始前不受打扰的呆上至少10分钟。可以首先在趋地性测试中然后在管测试中(管测试有2此连续的试验)测试幼仔。可以将幼仔置于加热垫上直至窝中的所有幼仔接受了测试，然后可以将所有幼仔返回它们的母兽(在操作后可以将幼仔与它们的笼草垫混合以将母兽的排斥降至最低)。可以自出生起每天检查存活和体重直至断奶。通常在先前实施的长期MTD研究过程中评估药物对新生儿轴体温的影响。体温：可以在规定的年龄采集轴体温的一个读数。

可以通过包括趋地性在内的检验方案对测试组和对照组的小鼠检验差异。趋地性测试动物在被面向下地放置在倾斜平台上时给自己定向的能力。此测试测量运动协调和前庭***。

可使用Kaplan-Meier分析来实施存活评估，其中以Mantel-Cox作为事后检验(post-hoc test)。

为了分析随时间重复测量得到的数据，可采用混合效果模型(MixedEffects Models)(也称作混合ANOVA模型)。此方法基于似然估算(likelihoodestimation)而非动差估算(moment estimation)(像典型的重复测量ANOVA分析中的那样)，但是它由于小鼠随时间的死亡而更加易于丢失数值。可以使用SAS 9.1.3.(SAS Institute，Cary，NC)中的PROC MIXED程序来拟合所有模型。处理是模型中最重要的因素。还可以考虑性别和天数，以及它们与处理的相互作用。

研究终点可以是死亡。

可以通过诸如实施例14中所述(例如组织学分析)的方法进一步评估动物。另外，可以评估血清/血液以测定RA.1、RA.2、RA.3和RA.4血清浓度。

材料保藏

以下材料已经保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209，USA)(ATCC)：

材料       ATCC保藏号    保藏日

3F4.4.8    PTA-8095      2006年12月21日

4B6.9.7    PTA-8094      2006年12月21日

1E5.5.7    PTA-8096      2006年12月21日

此保藏是依据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约(Budapest Treaty)及其(布达佩斯条约)实施细则的规定进行的。这保证了自保藏之日起保存保藏的存活培养物30年。保藏物可根据布达佩斯条约的条款通过ATCC获得，并服从Genentech公司与ATCC之间的协议，它保证了在有关美国专利授权后或者在任何美国或外国专利申请向公众公开后，以两者中居先者为准，公众可永久且不受限制的获得保藏培养物的后代，而且保证了依据35USC§122及依照它的管理章程(包括37CFR§1.14，特别要提及886OG 638)由美国专利和商标局长批准的个人将有资格获得保藏培养物的后代。

本申请的受让人已同意，若保藏材料的培养物在合适条件下培养时死亡、丢失或遭到破坏，则他将在接到通知后迅速用同一培养物的另一份材料更换。所保藏材料的可获得性并不解释为对违反任何政府机构依据其专利法所授予的权利实施本发明的许可。

认为前述书面描述足以使本领域技术人员能够实施本发明。本发明并不限于本文所呈现实施例的范围。实际上，根据上面的描述，在本文所显示和描述之外，本发明的多种修饰对于本领域技术人员是显而易见的，而且在所附权利要求的范围内。

序列表

<110>健泰科生物技术公司(GENENTECH，INC.)

<120>抑制DR6结合APP的DR6抗体及其在治疗神经学病症中的用途

<130>P2417R1

<140>60/871528

<141>2006-12-22

<140>60/900848

<141>2007-02-12

<160>15

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>655

<212>PRT

<213>人“死亡受体6”

<400>1

Met Gly Thr Ser Pro Ser Ser Ser Thr Ala Leu Ala Ser Cys Ser Arg

 1               5                  10                  15

Ile Ala Arg Arg Ala Thr Ala Thr Met Ile Ala Gly Ser Leu Leu Leu

            20                  25                  30

Leu Gly Phe Leu Ser Thr Thr Thr Ala Gln Pro Glu Gln Lys Ala Ser

         35                 40                  45

Asn Leu Ile Gly Thr Tyr Arg His Val Asp Arg Ala Thr Gly Gln Val

    50                  55                  60

Leu Thr Cys Asp Lys Cys Pro Ala Gly Thr Tyr Val Ser Glu His Cys

65                  70                  75                  80

Thr Asn Thr Ser Leu Arg Val Cys Ser Ser Cys Pro Val Gly Thr Phe

                85                  90                  95

Thr Arg His Glu Asn Gly Ile Glu Lys Cys His Asp Cys Ser Gln Pro

            100                 105                 110

Cys Pro Trp Pro Met Ile Glu Lys Leu Pro Cys Ala Ala Leu Thr Asp

        115                 120                 125

Arg Glu Cys Thr Cys Pro Pro Gly Met Phe Gln Ser Asn Ala Thr Cys

    130                 135                 140

Ala Pro His Thr Val Cys Pro Val Gly Trp Gly Val Arg Lys Lys Gly

145                 150                 155                 160

Thr Glu Thr Glu Asp Val Arg Cys Lys Gln Cys Ala Arg Gly Thr Phe

                165                 170                 175

Ser Asp Val Pro Ser Ser Val Met Lys Cys Lys Ala Tyr Thr Asp Cys

            180                 185                 190

Leu Ser Gln Asn Leu Val Val Ile Lys Pro Gly Thr Lys Glu Thr Asp

        195                 200                 205

Asn Val Cys Gly Thr Leu Pro Ser Phe Ser Ser Ser Thr Ser Pro Ser

    210                 215                 220

Pro Gly Thr Ala Ile Phe Pro Arg Pro Glu His Met Glu Thr His Glu

225                 230                 235                 240

Val Pro Ser Ser Thr Tyr Val Pro Lys Gly Met Asn Ser Thr Glu Ser

                245                 250                 255

Asn Ser Ser Ala Ser Val Arg Pro Lys Val Leu Ser Ser Ile Gln Glu

            260                 265                 270

Gly Thr Val Pro Asp Asn Thr Ser Ser Ala Arg Gly Lys Glu Asp Val

        275                 280                 285

Asn Lys Thr Leu Pro Asn Leu Gln Val Val Asn His Gln Gln Gly Pro

    290                 295                 300

His His Arg His Ile Leu Lys Leu Leu Pro Ser Met Glu Ala Thr Gly

305                 310                 315                 320

Gly Glu Lys Ser Ser Thr Pro Ile Lys Gly Pro Lys Arg Gly His Pro

                325                 330                 335

Arg Gln Asn Leu His Lys His Phe Asp Ile Asn Glu His Leu Pro Trp

            340                 345                 350

Met Ile Val Leu Phe Leu Leu Leu Val Leu Val Val Ile Val Val Cys

        355                 360                 365

Ser Ile Arg Lys Ser Ser Arg Thr Leu Lys Lys Gly Pro Arg Gln Asp

    370                 375                 380

Pro Ser Ala Ile Val Glu Lys Ala Gly Leu Lys Lys Ser Met Thr Pro

385                 390                 395                 400

Thr Gln Asn Arg Glu Lys Trp Ile Tyr Tyr Cys Asn Gly His Gly Ile

                405                 410                 415

Asp Ile Leu Lys Leu Val Ala Ala Gln Val Gly Ser Gln Trp Lys Asp

            420                 425                 430

Ile Tyr Gln Phe Leu Cys Asn Ala Ser Glu Arg Glu Val Ala Ala Phe

        435                 440                 445

Ser Asn Gly Tyr Thr Ala Asp His Glu Arg Ala Tyr Ala Ala Leu Gln

    450                 455                 460

His Trp Thr Ile Arg Gly Pro Glu Ala Ser Leu Ala Gln Leu Ile Ser

465                 470                 475                 480

Ala Leu Arg Gln His Arg Arg Asn Asp Val Val Glu Lys Ile Arg Gly

                485                 490                 495

Leu Met Glu Asp Thr Thr Gln Leu Glu Thr Asp Lys Leu Ala Leu Pro

            500                 505                 510

Met Ser Pro Ser Pro Leu Ser Pro Ser Pro Ile Pro Ser Pro Asn Ala

        515                 520                 525

Lys Leu Glu Asn Ser Ala Leu Leu Thr Val Glu Pro Ser Pro Gln Asp

    530                 535                 540

Lys Asn Lys Gly Phe Phe Val Asp Glu Ser Glu Pro Leu Leu Arg Cys

545                 550                 555                 560

Asp Ser Thr Ser Ser Gly Ser Ser Ala Leu Ser Arg Asn Gly Ser Phe

                565                 570                 575

Ile Thr Lys Glu Lys Lys Asp Thr Val Leu Arg Gln Val Arg Leu Asp

            580                 585                 590

Pro Cys Asp Leu Gln Pro Ile Phe Asp Asp Met Leu His Phe Leu Asn

        595                 600                 605

Pro Glu Glu Leu Arg Val Ile Glu Glu Ile Pro Gln Ala Glu Asp Lys

    610                 615                 620

Leu Asp Arg Leu Phe Glu Ile Ile Gly Val Lys Ser Gln Glu Ala Ser

625                 630                 635                 640

Gln Thr Leu Leu Asp Ser Val Tyr Ser His Leu Pro Asp Leu Leu

                645                 650                 655

<210>2

<211>3662

<212>DNA

<213>人“死亡受体6”

<400>2

gccaccacgt gtgtccctgc gcccggtggc caccgactca gtccctcgcc gaccagtctg  60

ggcagcggag gagggtggtt ggcagtggct ggaagcttcg ct atg gga agt tgt     114

tcc ttt gct ctc tcg cgc cca gtc ctc ctc cct ggt tct cct cag ccg    162

ctg tcg gag gag agc acc cgg aga cgc ggg ctg cag tcg cgg cgg ctt    210

ctc ccc gcc tgg gcg gcc gcg ccg ctg ggc agg tgc tga gcg ccc cta    258

gag cct ccc ttg ccg cct ccc tcc tct gcc cgg ccg cag cag tgc aca    306

tgg ggt gtt gga ggt aga tgg gct ccc ggc ccg gga ggc ggc ggt gga    354

tgc ggc gct ggg cag aag cag ccg ccg att cca gct gcc ccg cgc gcc    402

ccg ggc gcc cct gcg agt ccc cgg ttc agc cat ggg gac ctc tcc gag    450

cag cag cac cgc cct cgc ctc ctg cag ccg cat cgc ccg ccg agc cac    498

agc cac gat gat cgc ggg ctc cct tct cct gct tgg att cct tag cac    546

cac cac agc tca gcc aga aca gaa ggc ctc gaa tct cat tgg cac ata    594

ccg cca tgt tga ccg tgc cac cgg cca ggt gct aac ctg tga caa gtg    642

tcc agc agg aac cta tgt ctc tga gca ttg tac caa cac aag cct gcg    690

cgt ctg cag cag ttg ccc tgt ggg gac ctt tac cag gca tga gaa tgg    738

cat aga gaa atg cca tga ctg tag tca gcc atg ccc atg gcc aat gat    786

tga gaa att acc ttg tgc tgc ctt gac tga ccg aga atg cac ttg ccc    834

acc tgg cat gtt cca gtc taa cgc tac ctg tgc ccc cca tac ggt gtg    882

tcc tgt ggg ttg ggg tgt gcg gaa gaa agg gac aga gac tga gga tgt    930

gcg gtg taa gca gtg tgc tcg ggg tac ctt ctc aga tgt gcc ttc tag    978

tgt gat gaa atg caa agc ata cac aga ctg tct gag tca gaa cct ggt    1026

ggt gat caa gcc ggg gac caa gga gac aga caa cgt ctg tgg cac act    1074

ccc gtc ctt ctc cag ctc cac ctc acc ttc ccc tgg cac agc cat ctt    1122

tcc acg ccc tga gca cat gga aac cca tga agt ccc ttc ctc cac tta    1170

tgt tcc caa agg cat gaa ctc aac aga atc caa ctc ttc tgc ctc tgt    1218

tag acc aaa ggt act gag tag cat cca gga agg gac agt ccc tga caa    1266

cac aag ctc agc aag ggg gaa gga aga cgt gaa caa gac cct ccc aaa    1314

cct tca ggt agt caa cca cca gca agg ccc cca cca cag aca cat cct    1362

gaa gct gct gcc gtc cat gga ggc cac tgg ggg cga gaa gtc cag cac    1410

gcc cat caa ggg ccc caa gag ggg aca tcc tag aca gaa cct aca caa    1458

gca ttt tga cat caa tga gca ttt gcc ctg gat gat tgt gct ttt cct    1506

gct gct ggt gct tgt ggt gat tgt ggt gtg cag tat ccg gaa aag ctc    1554

gag gac tct gaa aaa ggg gcc ccg gca gga tcc cag tgc cat tgt gga    1602

aaa ggc agg gct gaa gaa atc cat gac tcc aac cca gaa ccg gga gaa    1650

atg gat cta cta ctg caa tgg cca tgg tat cga tat cct gaa gct tgt    1698

agc agc cca agt ggg aag cca gtg gaa aga tat cta tca gtt tct ttg    1746

caa tgc cag tga gag gga ggt tgc tgc ttt ctc caa tgg gta cac agc    1794

cga cca cga gcg ggc cta cgc agc tct gca gca ctg gac cat ccg ggg    1842

ccc cga ggc cag cct cgc cca gct aat tag cgc cct gcg cca gca ccg    1890

gag aaa cga tgt tgt gga gaa gat tcg tgg gct gat gga aga cac cac    1938

cca gct gga aac tga caa act agc tct ccc gat gag ccc cag ccc gct    1986

tag ccc gag ccc cat ccc cag ccc caa cgc gaa act tga gaa ttc cgc    2034

tct cct gac ggt gga gcc ttc ccc aca gga caa gaa caa ggg ctt ctt    2082

cgt gga tga gtc gga gcc cct tct ccg ctg tga ctc tac atc cag cgg    2130

ctc ctc cgc gct gag cag gaa cgg ttc ctt tat tac caa aga aaa gaa    2178

gga cac agt gtt gcg gca ggt acg cct gga ccc ctg tga ctt gca gcc    2226

tat ctt tga tga cat gct cca ctt tct aaa tcc tga gga gct gcg ggt    2274

gat tga aga gat tcc cca ggc tga gga caa act aga ccg gct att cga    2322

aat tat tgg agt caa gag cca gga agc cag cca gac cct cct gga ctc    2370

tgt tta tag cca tct tcc tga cct gct gta gaa cat agg gat act gca    2418

ttc tgg aaa tta ctc aat tta gtg gca ggg tgg ttt ttt aat ttt ctt    2466

ctg ttt ctg att ttt gtt gtt tgg ggt gtg tgt gtg tgt ttg tgt gtg    2514

tgt gtg tgt gtg tgt gtg tgt gtg tgt tta aca gag aat atg gcc agt    2562

gct tga gtt ctt tct cct tct ctc tct ctc ttt ttt ttt taa ata act    2610

ctt ctg gga agt tgg ttt ata agc ctt tgc cag gtg taa ctg ttg tga    2658

aat acc cac cac taa agt ttt tta agt tcc ata ttt tct cca ttt tgc    2706

ctt ctt atg tat ttt caa gat tat tct gtg cac ttt aaa ttt act taa    2754

ctt acc ata aat gca gtg tga ctt ttc cca cac act gga ttg tga ggc    2802

tct taa ctt ctt aaa agt ata atg gca tct tgt gaa tcc tat aag cag    2850

tct tta tgt ctc tta aca ttc aca cct act ttt taa aaa caa ata tta    2898

tta cta ttt tta tta ttg ttt gtc ctt tat aaa ttt tct taa aga tta    2946

aga aaa ttt aag acc cca ttg agt tac tgt aat gca att caa ctt tga    2994

gtt atc ttt taa ata tgt ctt gta tag ttc ata ttc atg gct gaa act    3042

tga cca cac tat tgc tga ttg tat ggt ttt cac ctg gac acc gtg tag    3090

aat gct tga tta ctt gta ctc ttc tta tgc taa tat gct ctg ggc tgg    3138

aga aat gaa atc ctc aag cca tca gga ttt gct att taa gtg gct tga    3186

caa ctg ggc cac caa aga act tga act tca cct ttt agg att tga gct    3234

gtt ctg gaa cac att gct gca ctt tgg aaa gtc aaa atc aag tgc cag    3282

tgg cgc cct ttc cat aga gaa ttt gcc cag ctt tgc ttt aaa aga tgt    3330

ctt gtt ttt tat ata cac ata atc aat agg tcc aat ctg ctc tca agg    3378

cct tgg tcc tgg tgg gat tcc ttc acc aat tac ttt aat taa aaa tgg    3426

ctg caa ctg taa gaa ccc ttg tct gat ata ttt gca act atg ctc cca    3474

ttt aca aat gta cct tct aat gct cag ttg cca ggt tcc aat gca aag    3522

gtg gcg tgg act ccc ttt gtg tgg gtg ggg ttt gtg ggt agt ggt gaa    3570

gga ccg ata tca gaa aaa tgc ctt caa gtg tac taa ttt att aat aaa    3618

cat tag gtg ttt gtt aaa aaa aaa aaa aaa aaa aaa aaa aaa aa         3662

<210>3

<211>300

<212>DNA

<213>小家鼠(Mus Musculis)

<400>3

gagcagaaac ggctccttta ttaccaaaga aaagaaggac acagtgttgc ggcaggtccg    60

cctggacccc tgtgacttgc agcccatctt tgatgacatg ctgcatatcc tgaaccccga    120

ggagctgcgg gtgattgaag agattcccca ggctgaggac aaactggacc gcctcttcga    180

gatcattggg gtcaagagcc aagaagccag ccagaccctc ttggactctg tgtacagtca    240

tcttcctgac ctattgtaga acacaggggc actgcattct gggaatcaac ctactggcgg    300

<210>4

<211>582

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合体

<400>4

Met Gly Thr Ser Pro Ser Ser Ser Thr Ala Leu Ala Ser Cys Ser Arg

 1               5                  10                  15

Ile Ala Arg Arg Ala Thr Ala Thr Met Ile Ala Gly Ser Leu Leu Leu

            20                  25                  30

Leu Gly Phe Leu Ser Thr Thr Thr Ala Gln Pro Glu Gln Lys Ala Ser

        35                  40                  45

Asn Leu Ile Gly Thr Tyr Arg His Val Asp Arg Ala Thr Gly Gln Val

    50                  55                  60

Leu Thr Cys Asp Lys Cys Pro Ala Gly Thr Tyr Val Ser Glu His Cys

65                  70                  75                  80

Thr Asn Thr Ser Leu Arg Val Cys Ser Ser Cys Pro Val Gly Thr Phe

                85                  90                  95

Thr Arg His Glu Asn Gly Ile Glu Lys Cys His Asp Cys Ser Gln Pro

            100                 105                 110

Cys Pro Trp Pro Met Ile Glu Lys Leu Pro Cys Ala Ala Leu Thr Asp

        115                 120                 125

Arg Glu Cys Thr Cys Pro Pro Gly Met Phe Gln Ser Asn Ala Thr Cys

    130                 135                 140

Ala Pro His Thr Val Cys Pro Val Gly Trp Gly Val Arg Lys Lys Gly

145                 150                 155                 160

Thr Glu Thr Glu Asp Val Arg Cys Lys Gln Cys Ala Arg Gly Thr Phe

                165                 170                 175

Ser Asp Val Pro Ser Ser Val Met Lys Cys Lys Ala Tyr Thr Asp Cys

            180                 185                 190

Leu Ser Gln Asn Leu Val Val Ile Lys Pro Gly Thr Lys Glu Thr Asp

        195                 200                 205

Asn Val Cys Gly Thr Leu Pro Ser Phe Ser Ser Ser Thr Ser Pro Ser

    210                 215                 220

Pro Gly Thr Ala Ile Phe Pro Arg Pro Glu His Met Glu Thr His Glu

225                 230                 235                 240

Val Pro Ser Ser Thr Tyr Val Pro Lys Gly Met Asn Ser Thr Glu Ser

                245                 250                 255

Asn Ser Ser Ala Ser Val Arg Pro Lys Val Leu Ser Ser Ile Gln Glu

            260                 265                 270

Gly Thr Val Pro Asp Asn Thr Ser Ser Ala Arg Gly Lys Glu Asp Val

        275                 280                 285

Asn Lys Thr Leu Pro Asn Leu Gln Val Val Asn His Gln Gln Gly Pro

    290                 295                 300

His His Arg His Ile Leu Lys Leu Leu Pro Ser Met Glu Ala Thr Gly

305                 310                 315                 320

Gly Glu Lys Ser Ser Thr Pro Ile Lys Gly Pro Lys Arg Gly His Pro

                325                 330                 335

Arg Gln Asn Leu His Lys His Phe Asp Ile Asn Glu His Leu Pro Trp

            340                 345                 350

Met Ile Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

        355                 360                 365

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

    370                 375                 380

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

385                 390                 395                 400

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

                405                 410                 415

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

            420                 425                 430

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

        435                 440                 445

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

    450                 455                 460

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

465                 470                 475                 480

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

                485                 490                 495

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

            500                 505                 510

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

        515                 520                 525

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

    530                 535                 540

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

545                 550                 555                 560

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

                565                 570                 575

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

            580

<210>5

<211>2088

<212>DNA

<213>淀粉状蛋白前体蛋白695cDNA

<400>5

atgctgcccg gtttggcact gctcctgctg gccgcctgga cggctcgggc gctggaggta    60

cccactgatg gtaatgctgg cctgctggct gaaccccaga ttgccatgtt ctgtggcaga    120

ctgaacatgc acatgaatgt ccagaatggg aagtgggatt cagatccatc agggaccaaa    180

acctgcattg ataccaagga aggcatcctg cagtattgcc aagaagtcta ccctgaactg    240

cagatcacca atgtggtaga agccaaccaa ccagtgacca tccagaactg gtgcaagcgg    300

ggccgcaagc agtgcaagac ccatccccac tttgtgattc cctaccgctg cttagttggt    360

gagtttgtaa gtgatgccct tctcgttcct gacaagtgca aattcttaca ccaggagagg    420

atggatgttt gcgaaactca tcttcactgg cacaccgtcg ccaaagagac atgcagtgag    480

aagagtacca acttgcatga ctacggcatg ttgctgccct gcggaattga caagttccga    540

ggggtagagt ttgtgtgttg cccactggct gaagaaagtg acaatgtgga ttctgctgat    600

gcggaggagg atgactcgga tgtctggtgg ggcggagcag acacagacta tgcagatggg    660

agtgaagaca aagtagtaga agtagcagag gaggaagaag tggctgaggt ggaagaagaa    720

gaagccgatg atgacgagga cgatgaggat ggtgatgagg tagaggaaga ggctgaggaa    780

ccctacgaag aagccacaga gagaaccacc agcattgcca ccaccaccac caccaccaca    840

gagtctgtgg aagaggtggt tcgagttcct acaacagcag ccagtacccc tgatgccgtt    900

gacaagtatc tcgagacacc tggggatgag aatgaacatg cccatttcca gaaagccaaa    960

gagaggcttg aggccaagca ccgagagaga atgtcccagg tcatgagaga atgggaagag    1020

gcagaacgtc aagcaaagaa cttgcctaaa gctgataaga aggcagttat ccagcatttc    1080

caggagaaag tggaatcttt ggaacaggaa gcagccaacg agagacagca gctggtggag    1140

acacacatgg ccagagtgga agccatgctc aatgaccgcc gccgcctggc cctggagaac    1200

tacatcaccg ctctgcaggc tgttcctcct cggcctcgtc acgtgttcaa tatgctaaag    1260

aagtatgtcc gcgcagaaca gaaggacaga cagcacaccc taaagcattt cgagcatgtg    1320

cgcatggtgg atcccaagaa agccgctcag atccggtccc aggttatgac acacctccgt    1380

gtgatttatg agcgcatgaa tcagtctctc tccctgctct acaacgtgcc tgcagtggcc    1440

gaggagattc aggatgaagt tgatgagctg cttcagaaag agcaaaacta ttcagatgac    1500

gtcttggcca acatgattag tgaaccaagg atcagttacg gaaacgatgc tctcatgcca    1560

tctttgaccg aaacgaaaac caccgtggag ctccttcccg tgaatggaga gttcagcctg    1620

gacgatctcc agccgtggca ttcttttggg gctgactctg tgccagccaa cacagaaaac    1680

gaagttgagc ctgttgatgc ccgccctgct gccgaccgag gactgaccac tcgaccaggt    1740

tctgggttga caaatatcaa gacggaggag atctctgaag tgaagatgga tgcagaattc    1800

cgacatgact caggatatga agttcatcat caaaaattgg tgttctttgc agaagatgtg    1860

ggttcaaaca aaggtgcaat cattggactc atggtgggcg gtgttgtcat agcgacagtg    1920

atcgtcatca ccttggtgat gctgaagaag aaacagtaca catccattca tcatggtgtg    1980

gtggaggttg acgccgctgt caccccagag gagcgccacc tgtccaagat gcagcagaac    2040

ggctacgaaa atccaaccta caagttcttt gagcagatgc agaactag                 2088

<210>6

<211>695

<212>PRT

<213>人淀粉状蛋白前体蛋白APP695

<400>6

Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg

 1               5                  10                  15

Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro

            20                  25                  30

Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln

        35                  40                  45

Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp

    50                  55                  60

Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu

65                  70                  75                  80

Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn

                85                  90                  95

Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val

            100                 105                 110

Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu

        115                 120                 125

Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys

    130                 135                 140

Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu

145                 150                 155                 160

Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile

                165                 170                 175

Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu

            180                 185                 190

Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val

        195                 200                 205

Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys

    210                 215                 220

Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu

225                 230                 235                 240

Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu

                245                 250                 255

Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile

            260                 265                 270

Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg

        275                 280                 285

Val Pro Thr Thr Ala Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu

    290                 295                 300

Glu Thr Pro Gly Asp Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys

305                 310                 315                 320

Glu Arg Leu Glu Ala Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg

                325                 330                 335

Glu Trp Glu Glu Ala Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp

            340                 345                 350

Lys Lys Ala Val Ile Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu

        355                 360                 365

Gln Glu Ala Ala Asn Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala

    370                 375                 380

Arg Val Glu Ala Met Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn

385                 390                 395                 400

Tyr Ile Thr Ala Leu Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe

                405                 410                 415

Asn Met Leu Lys Lys Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His

            420                 425                 430

Thr Leu Lys His Phe Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala

        435                 440                 445

Ala Gln Ile Arg Ser Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu

    450                 455                 460

Arg Met Asn Gln Ser Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala

465                 470                 475                 480

Glu Glu Ile Gln Asp Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn

                485                 490                 495

Tyr Ser Asp Asp Val Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser

            500                 505                 510

Tyr Gly Asn Asp Ala Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr

        515                 520                 525

Val Glu Leu Leu Pro Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln

    530                 535                 540

Pro Trp His Ser Phe Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn

545                 550                 555                 560

Glu Val Glu Pro Val Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr

                565                 570                 575

Thr Arg Pro Gly Ser Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser

            580                 585                 590

Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val

        595                 600                 605

His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys

    610                 615                 620

Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val

625                 630                 635                 640

Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile

                645                 650                 655

His His Gly Val Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg

            660                 665                 670

His Leu Ser Lys Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys

        675                 680                 685

Phe Phe Glu Gln Met Gln Asn

    690                 695

<210>7

<211>751

<212>PRT

<213>人淀粉状蛋白前体蛋白(APP751)

<400>7

Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg

 1               5                  10                  15

Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro

            20                  25                  30

Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln

        35                  40                  45

Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp

    50                  55                  60

Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu

65                  70                  75                  80

Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn

                85                  90                  95

Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val

            100                 105                 110

Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu

        115                 120                 125

Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys

    130                 135                 140

Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu

145                 150                 155                 160

Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile

                165                 170                 175

Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu

            180                 185                 190

Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val

        195                 200                 205

Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys

    210                 215                 220

Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu

225                 230                 235                 240

Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu

                245                 250                 255

Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile

            260                 265                 270

Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg

        275                 280                 285

Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile

    290                 295                 300

Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe

305                 310                 315                 320

Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr

                325                 330                 335

Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Ile Pro Thr Thr Ala Ala Ser Thr

            340                 345                 350

Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp Glu Asn Glu

        355                 360                 365

His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala Lys His Arg

    370                 375                 380

Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala Glu Arg Gln

385                 390                 395                 400

Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile Gln His Phe

                405                 410                 415

Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn Glu Arg Gln

            420                 425                 430

Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met Leu Asn Asp

        435                 440                 445

Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu Gln Ala Val

    450                 455                 460

Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys Tyr Val Arg

465                 470                 475                 480

Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe Glu His Val

                485                 490                 495

Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser Gln Val Met

            500                 505                 510

Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser Leu Ser Leu

        515                 520                 525

Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp Glu Val Asp

    530                 535                 540

Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val Leu Ala Asn

545                 550                 555                 560

Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala Leu Met Pro

                565                 570                 575

Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro Val Asn Gly

            580                 585                 590

Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe Gly Ala Asp

        595                 600                 605

Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val Asp Ala Arg

    610                 615                 620

Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser Gly Leu Thr

625                 630                 635                 640

Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe

                645                 650                 655

Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe

            660                 665                 670

Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val

        675                 680                 685

Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu

    690                 695                 700

Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val Glu Val Asp

705                 710                 715                 720

Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met Gln Gln Asn

                725                 730                 735

Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met Gln Asn

            740                 745                 750

<210>8

<211>2310

<212>DNA

<213>人淀粉状蛋白前体蛋白(APP770)

<400>8

atgctgcccg gtttggcact gctcctgctg gccgcctgga cggctcgggc gctggaggta    60

cccactgatg gtaatgctgg cctgctggct gaaccccaga ttgccatgtt ctgtggcaga    120

ctgaacatgc acatgaatgt ccagaatggg aagtgggatt cagatccatc agggaccaaa    180

acctgcattg ataccaagga aggcatcctg cagtattgcc aagaagtcta ccctgaactg    240

cagatcacca atgtggtaga agccaaccaa ccagtgacca tccagaactg gtgcaagcgg    300

ggccgcaagc agtgcaagac ccatccccac tttgtgattc cctaccgctg cttagttggt    360

gagtttgtaa gtgatgccct tctcgttcct gacaagtgca aattcttaca ccaggagagg    420

atggatgttt gcgaaactca tcttcactgg cacaccgtcg ccaaagagac atgcagtgag    480

aagagtacca acttgcatga ctacggcatg ttgctgccct gcggaattga caagttccga    540

ggggtagagt ttgtgtgttg cccactggct gaagaaagtg acaatgtgga ttctgctgat    600

gcggaggagg atgactcgga tgtctggtgg ggcggagcag acacagacta tgcagatggg    660

agtgaagaca aagtagtaga agtagcagag gaggaagaag tggctgaggt ggaagaagaa    720

gaagccgatg atgacgagga cgatgaggat ggtgatgagg tagaggaaga ggctgaggaa    780

ccctacgaag aagccacaga gagaaccacc agcattgcca ccaccaccac caccaccaca    840

gagtctgtgg aagaggtggt tcgagaggtg tgctctgaac aagccgagac ggggccgtgc    900

cgagcaatga tctcccgctg gtactttgat gtgactgaag ggaagtgtgc cccattcttt    960

tacggcggat gtggcggcaa ccggaacaac tttgacacag aagagtactg catggccgtg    1020

tgtggcagcg ccatgtccca aagtttactc aagactaccc aggaacctct tgcccgagat    1080

cctgttaaac ttcctacaac agcagccagt acccctgatg ccgttgacaa gtatctcgag    1140

acacctgggg atgagaatga acatgcccat ttccagaaag ccaaagagag gcttgaggcc    1200

aagcaccgag agagaatgtc ccaggtcatg agagaatggg aagaggcaga acgtcaagca    1260

aagaacttgc ctaaagctga taagaaggca gttatccagc atttccagga gaaagtggaa    1320

tctttggaac aggaagcagc caacgagaga cagcagctgg tggagacaca catggccaga    1380

gtggaagcca tgctcaatga ccgccgccgc ctggccctgg agaactacat caccgctctg    1440

caggctgttc ctcctcggcc tcgtcacgtg ttcaatatgc taaagaagta tgtccgcgca    1500

gaacagaagg acagacagca caccctaaag catttcgagc atgtgcgcat ggtggatccc    1560

aagaaagccg ctcagatccg gtcccaggtt atgacacacc tccgtgtgat ttatgagcgc    1620

atgaatcagt ctctctccct gctctacaac gtgcctgcag tggccgagga gattcaggat    1680

gaagttgatg agctgcttca gaaagagcaa aactattcag atgacgtctt ggccaacatg    1740

attagtgaac caaggatcag ttacggaaac gatgctctca tgccatcttt gaccgaaacg    1800

aaaaccaccg tggagctcct tcccgtgaat ggagagttca gcctggacga tctccagccg    1860

tggcattctt ttggggctga ctctgtgcca gccaacacag aaaacgaagt tgagcctgtt    1920

gatgcccgcc ctgctgccga ccgaggactg accactcgac caggttctgg gttgacaaat    1980

atcaagacgg aggagatctc tgaagtgaag atggatgcag aattccgaca tgactcagga    2040

tatgaagttc atcatcaaaa attggtgttc tttgcagaag atgtgggttc aaacaaaggt    2100

gcaatcattg gactcatggt gggcggtgtt gtcatagcga cagtgatcgt catcaccttg    2160

gtgatgctga agaagaaaca gtacacatcc attcatcatg gtgtggtgga ggttgacgcc    2220

gctgtcaccc cagaggagcg ccacctgtcc aagatgcagc agaacggcta cgaaaatcca    2280

acctacaagt tctttgagca gatgcagaac                                     2310

<210>9

<211>770

<212>PRT

<213>人淀粉状蛋白前体蛋白(APP770)

<400>9

Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg

 1               5                  10                  15

Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro

            20                  25                  30

Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln

        35                  40                  45

Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp

    50                  55                  60

Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu

65                  70                  75                  80

Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn

                85                  90                  95

Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val

            100                 105                 110

Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu

        115                 120                 125

Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys

    130                 135                 140

Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu

145                 150                 155                 160

Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile

                165                 170                 175

Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu

            180                 185                 190

Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val

        195                 200                 205

Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys

    210                 215                 220

Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu

225                 230                 235                 240

Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu

                245                 250                 255

Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile

            260                 265                 270

Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg

        275                 280                 285

Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile

    290                 295                 300

Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe

305                 310                 315                 320

Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr

                325                 330                 335

Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr

            340                 345                 350

Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala

        355                 360                 365

Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp

    370                 375                 380

Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala

385                 390                 395                 400

Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala

                405                 410                 415

Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile

            420                 425                 430

Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn

        435                 440                 445

Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met

    450                 455                 460

Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu

465                 470                 475                 480

Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys

                485                 490                 495

Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe

            500                 505                 510

Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser

        515                 520                 525

Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser

    530                 535                 540

Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp

545                 550                 555                 560

Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val

                565                 570                 575

Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala

            580                 585                 590

Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro

        595                 600                 605

Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe

    610                 615                 620

Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val

625                 630                 635                 640

Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser

                645                 650                 655

Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp

            660                 665                 670

Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu

        675                 680                 685

Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly

    690                 695                 700

Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu

705                 710                 715                 720

Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val

                725                 730                 735

Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met

            740                 745                 750

Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met

        755                 760                 765

Gln Asn

770

<210>10

<211>210

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人

<400>10

Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg

 1               5                  10                  15

Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro

            20                  25                  30

Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln

        35                  40                  45

Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp

    50                  55                  60

Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu

65                  70                  75                  80

Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn

                85                  90                  95

Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val

            100                 105                 110

Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu

        115                 120                 125

Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys

    130                 135                 140

Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu

145                 150                 155                 160

Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile

                165                 170                 175

Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu

            180                 185                 190

Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp His His His His

        195                 200                 205

His His

    210

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SiRNA

<400>11

aaucuguuga guucaugccu u                     21

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>褐家鼠(Rattus norvegicus)

<400>12

caauagguca ggaagauggc u                     21

<210>13

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>褐家鼠

<400>13

ggactctgtg tacagtcacc tcccagatct gttatag    37

<210>14

<211>349

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>14

Met Gly Thr Arg Ala Ser Ser Ile Thr Ala Leu Ala Ser Cys Ser Arg

 1               5                  10                  15

Thr Ala Gly Gln Val Gly Ala Thr Met Val Ala Gly Ser Leu Leu Leu

            20                  25                  30

Leu Gly Phe Leu Ser Thr Ile Thr Ala Gln Pro Glu Gln Lys Thr Leu

        35                  40                  45

Ser Leu Pro Gly Thr Tyr Arg His Val Asp Arg Thr Thr Gly Gln Val

    50                  55                  60

Leu Thr Cys Asp Lys Cys Pro Ala Gly Thr Tyr Val Ser Glu His Cys

65                  70                  75                  80

Thr Asn Met Ser Leu Arg Val Cys Ser Ser Cys Pro Ala Gly Thr Phe

                85                  90                  95

Thr Arg His Glu Asn Gly Ile Glu Arg Cys His Asp Cys Ser Gln Pro

            100                 105                 110

Cys Pro Trp Pro Met Ile Glu Arg Leu Pro Cys Ala Ala Leu Thr Asp

        115                 120                 125

Arg Glu Cys Ile Cys Pro Pro Gly Met Tyr Gln Ser Asn Gly Thr Cys

    130                 135                 140

Ala Pro His Thr Val Cys Pro Val Gly Trp Gly Val Arg Lys Lys Gly

145                 150                 155                 160

Thr Glu Asn Glu Asp Val Arg Cys Lys Gln Cys Ala Arg Gly Thr Phe

                165                 170                 175

Ser Asp Val Pro Ser Ser Val Met Lys Cys Lys Ala His Thr Asp Cys

            180                 185                 190

Leu Gly Gln Asn Leu Glu Val Val Lys Pro Gly Thr Lys Glu Thr Asp

        195                 200                 205

Asn Val Cys Gly Met Arg Leu Phe Phe Ser Ser Thr Asn Pro Pro Ser

    210                 215                 220

Ser Gly Thr Val Thr Phe Ser His Pro Glu His Met Glu Ser His Asp

225                 230                 235                 240

Val Pro Ser Ser Thr Tyr Glu Pro Gln Gly Met Asn Ser Thr Asp Ser

                245                 250                 255

Asn Ser Thr Ala Ser Val Arg Thr Lys Val Pro Ser Gly Ile Glu Glu

            260                 265                 270

Gly Thr Val Pro Asp Asn Thr Ser Ser Thr Ser Gly Lys Glu Gly Thr

        275                 280                 285

Asn Arg Thr Leu Pro Asn Pro Pro Gln Val Thr His Gln Gln Ala Pro

    290                 295                 300

His His Arg His Ile Leu Lys Leu Leu Pro Ser Ser Met Glu Ala Thr

305                 310                 315                 320

Gly Glu Lys Ser Ser Thr Ala Ile Lys Ala Pro Lys Arg Gly His Pro

                325                 330                 335

Arg Gln Asn Ala His Lys His Phe Asp Ile Asn Glu His

            340                 345

<210>15

<211>354

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>小家鼠

<400>15

Met Gly Thr Arg Ala Ser Ser Ile Thr Ala Leu Ala Ser Cys Ser Arg

 1               5                  10                  15

Thr Ala Gly Gln Val Gly Ala Thr Met Val Ala Gly Ser Leu Leu Leu

            20                  25                  30

Leu Gly Phe Leu Ser Thr Ile Thr Ala Gln Pro Glu Gln Lys Thr Leu

        35                  40                  45

Ser Leu Pro Gly Thr Tyr Arg His Val Asp Arg Thr Thr Gly Gln Val

    50                  55                  60

Leu Thr Cys Asp Lys Cys Pro Ala Gly Thr Tyr Val Ser Glu His Cys

65                  70                  75                  80

Thr Asn Met Ser Leu Arg Val Cys Ser Ser Cys Pro Ala Gly Thr Phe

                85                  90                  95

Thr Arg His Glu Asn Gly Ile Glu Arg Cys His Asp Cys Ser Gln Pro

            100                 105                 110

Cys Pro Trp Pro Met Ile Glu Arg Leu Pro Cys Ala Ala Leu Thr Asp

        115                 120                 125

Arg Glu Cys Ile Cys Pro Pro Gly Met Tyr Gln Ser Asn Gly Thr Cys

    130                 135                 140

Ala Pro His Thr Val Cys Pro Val Gly Trp Gly Val Arg Lys Lys Gly

145                 150                 155                 160

Thr Glu Asn Glu Asp Val Arg Cys Lys Gln Cys Ala Arg Gly Thr Phe

                165                 170                 175

Ser Asp Val Pro Ser Ser Val Met Lys Cys Lys Ala His Thr Asp Cys

            180                 185                 190

Leu Gly Gln Asn Leu Glu Val Val Lys Pro Gly Thr Lys Glu Thr Asp

        195                 200                 205

Asn Val Cys Gly Met Arg Leu Phe Phe Ser Ser Thr Asn Pro Pro Ser

    210                 215                 220

Ser Gly Thr Val Thr Phe Ser His Pro Glu His Met Glu Ser His Asp

225                 230                 235                 240

Val Pro Ser Ser Thr Tyr Glu Pro Gln Gly Met Asn Ser Thr Asp Ser

                245                 250                 255

Asn Ser Thr Ala Ser Val Arg Thr Lys Val Pro Ser Gly Ile Glu Glu

            260                 265                 270

Gly Thr Val Pro Asp Asn Thr Ser Ser Thr Ser Gly Lys Glu Gly Thr

        275                 280                 285

Asn Arg Thr Leu Pro Asn Pro Pro Gln Val Thr His Gln Gln Ala Pro

    290                 295                 300

His His Arg His Ile Leu Lys Leu Leu Pro Ser Ser Met Glu Ala Thr

305                 310                 315                 320

Gly Glu Lys Ser Ser Thr Ala Ile Lys Ala Pro Lys Arg Gly His Pro

                325                 330                 335

Arg Gln Asn Ala His Lys His Phe Asp Ile Asn Glu His His His His

            340                 345                 350

His His

Claims (65)

1.一种抑制死亡受体6(DR6)结合淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的方法，包括在DR6对APP的结合受到抑制的条件下将DR6多肽和/或APP多肽暴露于一种或多种DR6拮抗剂。

2.权利要求1的方法，其中所述一种或多种DR6拮抗剂选自结合DR6的抗体、包含SEQ ID NO：1氨基酸1-354的可溶性DR6多肽、和结合APP的抗体。

3.权利要求2的方法，其中所述可溶性DR6多肽包括DR6免疫粘附素。

4.权利要求3的方法，其中所述可溶性DR6多肽包含融合至免疫球蛋白Fc区的DR6胞外结构域序列。

5.权利要求2的方法，其中所述结合DR6的抗体结合包含图1(SEQ ID NO：1)氨基酸1-349或42-349的DR6多肽。

6.权利要求2的方法，其中所述结合DR6的抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

7.权利要求2的方法，其中所述结合DR6的抗体竞争性抑制由分别以ATCC编号PTA-8095、PTA-8094、或PTA-8096保藏的杂交瘤细胞系生成的3F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7单克隆抗体的结合。

8.权利要求2的方法，其中所述结合DR6的抗体或可溶性DR6多肽是连接至一种或多种选自下组的非蛋白质性质聚合物的：聚乙二醇、聚丙二醇、和聚氧化烯。

9.权利要求1的方法，其中所述结合APP的抗体是单克隆抗体。

10.权利要求9的方法，其中所述结合APP的单克隆抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

11.权利要求9的方法，其中所述结合APP的单克隆抗体竞争性抑制3F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7抗体的结合。

12.权利要求9的方法，其中所述结合APP的抗体是连接至一种或多种选自下组的非蛋白质性质的聚合物的：聚乙二醇、聚丙二醇、和聚氧化烯。

13.权利要求1的方法，其中所述DR6多肽是在一种或多种哺乳动物细胞的细胞表面上表达的且所述一种或多种DR6拮抗剂的结合抑制DR6活化或信号传导。

14.权利要求13的方法，其中该方法是在体外实施的，用以抑制一种或多种表达DR6的哺乳动物细胞中的凋亡。

15.权利要求13的方法，其中该方法是在体内实施的，用以抑制一种或多种表达DR6的哺乳动物细胞中的凋亡。

16.权利要求13的方法，其中所述一种或多种在细胞表面上表达DR6多肽的哺乳动物细胞中至少一种是连合神经元细胞、感觉神经元细胞或运动神经元细胞。

17.权利要求13的方法，其中该方法是在体内在具有神经学疾患或病症的哺乳动物中实施的。

18.权利要求17的方法，其中所述神经学疾患或病症是肌萎缩性侧索硬化、帕金森氏病、亨庭顿氏病或阿耳茨海默氏病。

19.权利要求17的方法，其中所述神经学疾患或病症包含神经元细胞或组织损伤，其源自中风、对大脑或脊髓组织的创伤、或神经元组织中的损害。

20.权利要求1的方法，其中所述一种或多种DR6拮抗剂中至少一种抑制DR6对包含SEQ ID NO：6氨基酸66-81的APP多肽的结合。

21.权利要求1的方法，其中所述一种或多种DR6拮抗剂中至少一种抑制APP对包含SEQ ID NO：1氨基酸1-655的DR6多肽的结合。

22.一种治疗患有神经学疾患或病症的哺乳动物的方法，包括对所述哺乳动物施用有效量的一种或多种DR6拮抗剂。

23.权利要求22的方法，其中所述一种或多种DR6拮抗剂选自结合DR6的抗体、包含SEQ ID NO：1氨基酸1-354的可溶性DR6多肽、和结合APP的抗体。

24.权利要求23的方法，其中所述可溶性DR6多肽包括DR6免疫粘附素。

25.权利要求23的方法，其中所述可溶性DR6多肽包含融合至免疫球蛋白Fc区的DR6胞外结构域序列。

26.权利要求23的方法，其中所述结合DR6的抗体结合包含图1(SEQ IDNO：1)氨基酸1-349或42-349的DR6多肽。

27.权利要求23的方法，其中所述结合DR6的抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

28.权利要求23的方法，其中所述结合DR6的抗体竞争性抑制由分别以ATCC编号PTA-8095、PTA-8094、或PTA-8096保藏的杂交瘤细胞系生成的3F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7单克隆抗体的结合。

29.权利要求23的方法，其中所述结合DR6的抗体或可溶性DR6多肽是连接至一种或多种选自下组的非蛋白质性质聚合物的：聚乙二醇、聚丙二醇、和聚氧化烯。

30.权利要求22的方法，其中所述结合APP的抗体是单克隆抗体。

31.权利要求30的方法，其中所述结合APP的单克隆抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

32.权利要求30的方法，其中所述结合APP的单克隆抗体竞争性抑制单克隆抗体22C11的结合。

33.权利要求30的方法，其中所述结合APP的单克隆抗体是连接至一种或多种选自下组的非蛋白质性质的聚合物的：聚乙二醇、聚丙二醇、和聚氧化烯。

34.权利要求22的方法，其中所述一种或多种DR6拮抗剂中至少一种抑制DR6对包含SEQ ID NO：6氨基酸66-81的APP多肽的结合。

35.权利要求22的方法，其中所述一种或多种DR6拮抗剂中至少一种抑制APP对包含SEQ ID NO：1氨基酸1-655的DR6多肽的结合。

36.权利要求22的方法，其中所述神经学疾患或病症是肌萎缩性侧索硬化、帕金森氏病、亨庭顿氏病或阿耳茨海默氏病。

37.权利要求22的方法，其中所述神经学疾患或病症包含神经元细胞或组织损伤，其源自中风、对大脑或脊髓组织的创伤、或神经元组织中的损害。

38.权利要求22的方法，其中对所述哺乳动物施用一种或多种别的治疗剂。

39.权利要求22的方法，其中所述一种或多种DR6拮抗剂是经注射、输注或灌注对所述哺乳动物施用的。

40.权利要求38的方法，其中所述一种或多种别的治疗剂选自NGF、凋亡抑制剂、EGFR抑制剂、β-分泌酶抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、胆碱酯酶抑制剂、抗Aβ抗体和NMDA受体拮抗剂。

41.一种鉴定抑制DR6对APP的结合的感兴趣分子的方法，该方法包括：

在存在或不存在感兴趣分子的情况中组合DR6和APP；并

测定在存在所述感兴趣分子的情况中对DR6结合APP的抑制。

42.权利要求41的方法，其中所述感兴趣分子是结合APP的抗体、结合DR6的抗体或包含SEQ ID NO：1氨基酸1-354的可溶性DR6多肽。

43.权利要求41的方法，其中对于在存在感兴趣分子的情况中对于DR6对APP的结合的抑制的检测是在无细胞测定法中实施的。

44.权利要求41的方法，进一步包括：

使用在细胞表面上表达DR6的哺乳动物细胞实施所述方法；并检测对DR6活化或信号传导的抑制。

45.一种组合物，其包含依照权利要求40的方法鉴定的感兴趣分子。

46.权利要求45的组合物和载体。

47.权利要求46的组合物，其中所述载体是药学可接受载体。

48.一种分离的DR6拮抗剂，包括(a)结合包含SEQ ID NO：1的DR6多肽的单克隆抗体或(b)可溶性DR6多肽或(c)结合包含SEQ ID NO：6的APP的单克隆抗体，其中所述DR6拮抗剂抑制APP对DR6的结合。

49.权利要求48的分离的DR6拮抗剂，其中所述可溶性DR6多肽包括DR6免疫粘附素。

50.权利要求49的分离的DR6拮抗剂，所述可溶性DR6多肽包含融合至免疫球蛋白Fc区的DR6胞外结构域序列。

51.权利要求48的分离的DR6拮抗剂，其中所述结合DR6的抗体结合包含图1(SEQ ID NO：1)氨基酸1-349或42-349的DR6多肽。

52.权利要求48的分离的DR6拮抗剂，其中所述结合DR6的抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

53.权利要求48的分离的DR6拮抗剂，其中所述结合DR6的抗体竞争性抑制由分别以ATCC编号PTA-8095、PTA-8094、或PTA-8096保藏的杂交瘤细胞系生成的3F4.4.8、4B6.9.7、或1E5.5.7单克隆抗体的结合。

54.权利要求48的分离的DR6拮抗剂，其中所述结合DR6的抗体或可溶性DR6多肽是连接至一种或多种选自下组的非蛋白质性质聚合物的：聚乙二醇、聚丙二醇、和聚氧化烯。

55.权利要求48的分离的DR6拮抗剂，其中所述DR6拮抗剂抑制DR6对包含SEQ ID NO：6氨基酸66-81的APP多肽的结合。

56.权利要求48的分离的DR6拮抗剂，其中所述拮抗剂结合通过位阻抑制而抑制DR6对APP的结合的表位。

57.权利要求48的分离的DR6拮抗剂，其中所述结合APP的单克隆抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

58.权利要求48的分离的DR6拮抗剂，其中所述结合APP的抗体竞争性抑制22C11单克隆抗体的结合。

59.权利要求48的分离的DR6拮抗剂，其中所述结合APP的抗体是连接至一种或多种选自下组的非蛋白质性质的聚合物的：聚乙二醇、聚丙二醇、和聚氧化烯。

60.权利要求48的分离的DR6拮抗剂，其中所述拮抗剂抑制DR6对包含SEQID NO：6氨基酸66-81的APP多肽的结合。

61.一种药物组合物，其包含权利要求47-60的DR6拮抗剂和药学可接受载体。

62.一种诊断患有神经学病症的或对神经学病症易感的患者的方法，包括自所述患者获取样品并对所述样品测试具有与SEQ ID NO：1之DR6多肽序列不同的多肽序列的DR6多肽变体的存在。

63.权利要求62的方法，进一步包括鉴定所述多肽变体是否具有与对SEQ IDNO：1之DR6多肽序列观察到的亲和力不同的对APP多肽的亲和力。

64.一种制品，包括：

(a)包含有效量的权利要求47-60的DR6拮抗剂的组合物；

(b)装有所述组合物的容器；和

(c)粘贴至所述容器的标签或包括在所述容器中的包装插页，其提供关于所述DR6拮抗剂在神经学疾患或病症的治疗中的用途的说明。

65.一种试剂盒，包括：

第一容器、所述容器上的标签、和装在所述容器内的组合物，其中所述组合物包含有效抑制至少一种类型的哺乳动物神经元细胞中的凋亡的活性剂，所述容器上的所述标签或包括在所述容器中的包装插页指示所述组合物可用于抑制至少一种类型的哺乳动物神经元细胞中的凋亡，且所述组合物中的所述活性剂包含权利要求47-60的至少一种DR6拮抗剂；

装有药学可接受缓冲剂的第二容器；和

关于使用所述DR6拮抗剂来抑制至少一种类型的哺乳动物神经元细胞中的凋亡的说明。

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