JP2015512409A - 脊髄性筋萎縮症用治療剤としての４−アミノピリジン - Google Patents

Abstract

Ｋ＋チャネル（ＦＤＡ承認広域スペクトルＫ＋チャネル遮断薬４−ＡＰの使用）の薬理学的遮断が、ＳＭＮ枯渇がもたらす重大な結果である介在ニューロンまたは感覚ニューロン入力による運動回路の興奮性障害に伴って起こるｓｍｎ変異表現型に確実に有益であることを見出した。これらの観察に基づいて、本発明のある態様は、４−アミノピリジン、４−（ジメチルアミノ）ピリジン、４−（メチルアミノ）ピリジンおよび４−（アミノメチル）ピリジンなどの１つ以上のカリウムチャネル遮断薬の治療有効量を投与することによるＳＭＡ治療方法を対象とする。他の態様は２個以上のカリウムチャネル遮断薬を含む新医薬製剤を対象とする。【選択図】図７Ｄ

Description

関連出願に対するクロスリファレンス

本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ． §１１９（ｅ）の下、２００８年３月１５日に提出された米国仮特許出願Ｎｏ．６１／６１５４６６および２０１２年３月２６日に提出された米国仮特許出願Ｎｏ．６１／０５７１９０の優先権を主張するものであり、参照することにより全体が十分に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。
政府の利益のステイトメント

本発明は、国防総省により与えられたコントラクトＮｏ．Ｗ８１ＸＷＨ−０８−１−０００９のもと政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）は、遍在する生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質の枯渇による運動ニューロン機能低下および筋肉の衰えが特徴であるヒト致死的疾患である。ＳＭＡは、脊髄の前角における運動ニューロンの変性が筋肉の麻痺および萎縮を引き起こすことが特徴である常染色体劣性疾患である。ＳＭＡは、年齢および重症度にしたがって従来３つのタイプに分類されている：幼児（期）のＳＭＡ−１型またはウェルドニッヒ・ホフマン病（通常０−６月）は、最も重症な形態であり、１歳以内に発症し独立して座位を維持することができない。中間型ＳＭＡ−２型（通常７−１８月）は、立ったり歩いたりはできないが、少なくとも生活のなかでしばらくは座位を維持することが出来る子供と類型化される。脱力の始まりは通常６〜１８月の間のいずれかの時点で認識される。若年性ＳＭＡ−３型またはクーゲルベルク・ヴェランダー病（通常＞１８月を超える、は、いつかは歩ける人たちと類型化される。成人ＳＭＡ−４型は、通常青年期後期に舌、手、または足において始まり、体の他の部分にも進行する脱力に関連する。疾患の経過は、とてもゆっくりで、平均余命にはほとんどまたは一切影響を与えない。またとても重症なＳＭＡの症状の出産前の発症および早期新生児死亡は、ＳＭＡ０型として分類される（Ｅｕｒ Ｊ Ｐａｅｄｉａｔｒ Ｎｅｕｒｏｌ １９９９； ３：４９−５１； Ｌａｎｃｅｔ １９９５； ３４６：１１６２； Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ １９９２； ２：４２３−４２８）．ＳＭＡは、６０００−１００００人の生児出生中約１人に生じ、保因頻度は５０人に１人であり、ヒトにおいて２番目に多い常染色体劣性遺伝性疾患であり、幼児死亡率の最も多い遺伝子的原因である（Ｓｅｍｉｎ Ｎｅｕｒｏｌ １９９８； １８：１９−２６）。

リンケージマッピングは ＳＭＡの遺伝子座として運動ニューロン生存（ＳＭＮ）遺伝子を同定した（Ｌｅｆｅｂｖｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ８０， １−５）。ヒトにおいては、２個のほとんど同じＳＭＮ遺伝子（ＳＭＮ１およびＳＭＮ２）が染色体５ｑ１３に存在する。ＳＭＮ１内に欠損または変異があるがＳＭＮ２遺伝子にはない場合にはすべてのかたちの近位のＳＭＡを生じる（Ｌｅｆｅｂｖｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ８０， １−５）。ＳＭＮ１は、偏在的に発現する、細胞の生存のための重要なプロセスであるｓｎＲＮＰアセンブリーに必要な３８ ｋＤａＳＭＮタンパク質をコードする（Ｗａｎ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ． ２００５． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２５：５５４３−５５５１）。ほぼ相同な遺伝子ＳＭＮ２は、不安定な短縮タンパク質である、ＳＭＮ．ＤＥＬＴＡ．７を産出するエクソン７のスキッピングのためにＳＭＮ１の欠損を補うことはできない（Ｌｏｒｓｏｎ， Ｃ． Ｌ．， ｅｔ ａｌ． １９９８． Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １９：６３−６６； Ｌｅｆｅｂｖｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９９５； ＢｕｒｇｈｅｓおよびＢｅａｔｔｉｅ， ２００９）。

ＳＭＮ１とＳＭＮ２は、エクソン７の６位において重要なＣがＴに置換されている点で異なる（ＳＭＮ２の転写産物中のＣ６Ｕ）（Ｌｏｒｓｏｎ， Ｃ． Ｌ．， ｅｔ ａｌ． １９９９． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：６３０７−６３１１； Ｍｏｎａｎｉ， Ｕ． Ｒ．， ｅｔ ａｌ． １９９９． Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． ８：１１７７−１１８３）。Ｃ６Ｕはコード配列を変えないが、ＳＭＮ１におけるエクソン７スキッピングを生じるに十分である。したがってＳＭＡは、ＳＭＮ１の完全な欠損とは対照的に、ＳＭＮ１の低レベルにより生じる（ＢｕｒｇｈｅｓおよびＢｅａｔｔｉｅ， ２００９）。ＳＭＮはＲＮＡ代謝に関連する多様な細胞プロセスに関与している多機能なたんぱく質である（Ｐｅｌｌｉｚｚｏｎｉ， ２００７）。

ＳＭＡに有効な薬物治療は無いのでそのような治療に対するニーズは大きい。

発明のある態様は、脊髄性筋萎縮症の対象を同定する工程、および広域ベースの
Ｋ＋チャネル遮断薬および４−アミノピリジン、４−（ジメチルアミノ）ピリジン、４−（メチルアミノ）ピリジンおよび４−（アミノメチル）ピリジンからなる群から選択される遮断薬などのＫ＋チャネル遮断薬の治療有効量を対象に投与する工程を含む方法を対象とする。本発明の方法における我々の他のＫ＋チャンネル遮断薬は、ドフェチリド、ソタロール、イブチリド）、アジミリド、ブレチリウム、クロフィリウム、Ｅ−４０３１、ニフェカラント、テジサミル、およびセマチリドが挙げられる。ひとつの態様において、治療有効量は、投与あたり約０．５ｍｇ〜１００ｍｇの範囲の量であり遮断薬は１日に１〜３回投与される。

他の態様は４−ＡＰおよび１つ以上の列挙された治療剤を含む、好ましくは血液脳関門通過送達用または硬膜外静脈叢、脳、脊椎または髄液への直接投与用に製剤化された医薬製剤を対象とする。本発明の方法はＳＭＡ：１型、２または３型のいずれかの形態を治療するためにも使用することができる。

本発明は、下記図中の実施例により示されるがそれに限定されない。

図１。ｓｍｎ変異体は、筋肉サイズ減少、移動力低下、運動リズム欠損および神経筋接合部（ＮＭＪ）神経伝達物質放出異常を有する。Ａ−Ｂ。ＴＲＩＴＣファロイジン（ｐｈａｌｌｏｄｉｎ）で標識した３幼虫齢の、コントロール（Ａ）およびＳＭＮＸ７変異体（Ｂ）のセグメントＡ３の筋肉のサンプルイメージは、Ｄａ−Ｇａｌ４（遺伝子型：Ｄａ−Ｇａｌ４／ＵＡＳ：：ｆｌａｇＳＭＮ；ＳＭＮＸ７／ＳＭＮＸ７）によりドライブされたＵＡＳ−ｆｌａｇ−ＳＭＮの遍在的発現により完全にレスキューされた筋肉表面積の縮小（Ｃ）を示す。Ｄ−Ｆ。６０秒の幼虫の移動経路を重ね合せた１０個のサンプルは、コントロール（Ｄ）およびＳＭＮＸ７変異体（Ｅ）から追跡している。Ｓｍｎ変異体幼虫は、トランスジェニックＳＭＮ（Ｆ）の遍在的発現により補正されたコントロールに比べ速度が低かった。Ｇ−Ｉ。脳、腹神経索および運動ニューロンが損傷されていないセミインタクトな幼虫の標本のセグメントＡ１における筋肉６からのレコーディング。コントロールの幼虫では、蠕動性筋肉収縮（Ｇ）に対応する律動的な突発活性を伴う規則的な運動リズムを引き起こす。対照的にｓｍｎ変異体幼虫は、ＳＭＮの遍在的発現によりレスキューされた平均スパイク間インターバルの増加（Ｉ）に示されるように、短く非協調性突発（Ｈ）を伴う不規則な運動パターンを有している。Ｊ−Ｌ。コントロール（Ｊ）およびＳＭＮＸ７変異体（Ｋ）幼虫におけるセグメントＡ３の筋肉６から記録された代表的な波形。ＳＭＮＸ７変異体は、コントロール（Ｋ）よりも興奮性シナプス後電位誘発（ｅＥＰＳＰ）振幅が増加した。この増加は、ＳＭＮ（Ｌ）の遍在的発現により修正された。誤差バーは平均標準誤差を示す。＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、コントロールに対して計算された有意差。補足図Ｓ１は、ＳＭＮＸ７変異体が、コントロールに対して、６％未満のＳＭＮタンパク質レベルを有することを示す。

図２。ＳＭＮ発現は、ｓｍｎ変異体をレスキューするため神経において必要とされるが、筋肉には必要とされない。Ａ−Ｄ。（Ａ）コントロール、（Ｂ）ＳＭＮＸ７変異体、（Ｃ）筋肉のみにトランスジェニックＳＭＮ発現＊を伴うＳＭＮＸ７変異体（Ｇ１４−Ｇａｌ４／ＵＡＳ：：ｆｌａｇＳＭＮ；ＳＭＮＸ７／ＳＭＮＸ７）または（Ｄ）ニューロン（ｎｓｙｂ−Ｇａｌ４／ＵＡＳ：：ｆｌａｇＳＭＮ；ＳＭＮＸ７／ＳＭＮＸ７）のセグメントＡ３の筋肉のサンプルイメージ。筋肉におけるＳＭＮ発現の回復は筋肉サイズには効果はなかったが、ニューロンにおける回復は筋肉表面積を完全にレスキューした。Ｅ−Ｈ．コントロールに対して正規化された、筋肉表面積（Ｅ）、移動力（Ｆ）、運動リズム（Ｇ）およびＮＭＪ ｅＥＰＳＰ振幅（Ｈ）の定量化。ニューロンにおけるトランスジェニックＳＭＮの発現はすべてのｓｍｎ変異表現型をレスキューするが、筋肉における発現はレスキューしない。誤差バーは平均標準誤差を示す。＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、図に示されている場合を除きコントロールに対して計算された有意差。

図３。ＳＭＮ発現は、コリン作動性ニューロンにおいて必要とされるが、運動ニューロンにおいては必要とされない；Ａ−Ｄ。コントロール（Ａ）、ＳＭＮＸ７変異体（Ｂ）、ｓｍｎ変異体の運動ニューロンに発現されたトランスジェニックＳＭＮ（ＯＫ３７１−Ｇａｌ４／ＵＡＳ：：ＳＭＮ；ＳＭＮＸ７／ＳＭＮＸ７）（Ｃ）、ｓｍｎ変異体のコリン作動性ニューロンにおいて発現されたトランスジェニックＳＭＮ（Ｃｈａ−Ｇａｌ４／ＵＡＳ：：ＳＭＮ；ＳＭＮＸ７／ＳＭＮＸ７）（Ｄ）の代表的な波形。運動ニューロンにおけるトランスジェニックＳＭＮの発現はｓｍｎ変異体中の正常な神経伝達物質放出を回復しないが、コリン作動性ニューロンにおけるＳＭＮの発現は正常なｅＥＰＳＰ振幅を回復している。Ｅ−Ｆ。コントロールに対して正規化された筋肉表面積（Ｅ）、移動力（Ｆ）、運動リズム（Ｇ）およびＮＭＪ ｅＥＰＳＰ振幅（Ｈ）の定量化。ＯＫ３７１−Ｇａｌ４もしくはＯＫ６−Ｇａｌ４を伴うｓｍｎ変異体の運動ニューロンまたはＧＡＤ１−Ｇａｌ４を伴うＧＡＢＡ作動性ニューロン中におけるトランスジェニックＳＭＮの発現は如何なる表現型もレスキューしない。対照的に、Ｃｈａ−Ｇａｌ４を伴うコリン作動性ニューロンにおけるトランスジェニックＳＭＮの発現は、筋肉サイズ、運動速度および中枢性運動リズムを完全にレスキューし、ＮＭＪでの正常ｅＥＰＳＰ振幅を回復している（Ｄ）。＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、コントロールに対して計算された有意差。

図４．ＳＭＮは、固有受容性および中枢性コリン作動性ニューロンの両者に必要とされる。Ａ。発現パターンコリン作動性ニューロンＧａｌ４系統（ドット）。Ｃｈａ−Ｇａｌ４は、中枢性および感覚コリン性作動性ニューロンの両者において発現する。Ｃｌｈ２０１−Ｇａｌ４はｍｄおよびｅｓ感覚ニューロンにおいてのみ発現する。１００３．３−Ｇａｌ４、ｐｐｋ−Ｇａｌ４およびｐｐｋ−Ｇａｌ４は、ｍｄ、ｅｓまたはｃｈ感覚ニューロンのサブセットにおいて発現する。斜めの平行線はｓｍｎ変異表現型をレスキューする能力を示す。Ｂ、Ｃ。ＵＡＳ：：ＣＤ８−ＧＦＰで標識された、野生型（Ｂ）またはＳＭＮＸ７変異体（Ｃ）の腹神経索におけるＮＰ２２２５−Ｇａｌ４を伴うｂｄおよびＩ型ｍｄ感覚ニューロンの軸索。感覚軸索は、通常はｓｍｎ変異体中のＣＮＳに突き出ている。Ｄ−Ｇ。コントロールに対して正規化された、筋肉表面積（Ｄ）、移動力（Ｅ）、運動リズム（Ｆ）およびＮＭＪ ｅＥＰＳＰ振幅（Ｇ）の定量化（遺伝子型：Ｇａｌ４／ＵＡＳ：：ｆｌａｇＳＭＮ；ＳＭＮＸ７／ＳＭＮＸ７）。Ｃｈａ−Ｇａｌ４を伴ったｓｍｎ変異体における中枢性および感覚性コリン作動性ニューロンの両者におけるトランスジェニックＳＭＮの発現はすべての表現型を完全にレスキューする。ＳＭＮすべての感覚ニューロンの回復は、筋肉サイズを増加させ、運動リズムおよびＮＭＪにおける神経伝達物質放出を完全にレスキューするが、固有受容性Ｉ型ｍｄニューロンおよびＮＰ２２２５−Ｇａｌ４を伴うｂｄニューロンにおけるＳＭＮを回復するのに相同する移動力はレスキューしない。ＩＩ、ＩＩＩもしくはＩＶ型ｍｄニューロン、ｅｓニューロンまたは１００３．３−Ｇａｌ４もしくはｐｐｋ−Ｇａｌ４を伴うｃｈニューロンにおけるＳＭＮの回復は如何なるｓｍｎ変異表現型をレスキューしない。 スケールバー＝１０μｍ。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、示されている場合を除きコントロールに対して計算された有意差。

図５。胚発生後のＳＭＮの回復はｓｍｎ変異体をレスキューする。Ａ。神経系におけるトランスジェニックＳＭＮ誘導の模式図。ＲＵ４８６はジーンスイッチ（ｇｅｎｅｓｗｉｔｃｈ）Ｇａｌ４に誘導される導入遺伝子の活性化に必要とされる。Ｅｌａｖ：：ジーンスイッチ／ＵＡＳ：：ｆｌａｇＳＭＮ；ＳＭＮＸ７／ＳＭＮＸ７幼虫は、孵化直後、孵化４８時間後または９６時間後に、ビークル培地またはＲＵ４８６含有培地のいずれかに移された。Ｂ。孵化０、４８または９６時間後のビークル培地またはＲＵ４８６培地のいずれかで育てられたｓｍｎ変異体から記録された代表的な波形。各時点ごとのＳＭＮの誘導は、正常のｅＥＰＳＰ振幅を完全に回復させた。Ｃ−Ｆ。コントロールに対して正規化された、筋肉表面積（Ｃ）、移動力（Ｄ）、運動リズム（Ｅ）およびＮＭＪ ｅＥＰＳＰ振幅（Ｆ）の定量化。筋肉サイズ、移動力および運動リズムは、トランスジェニックＳＭＮが孵化直後に誘発されれば完全にレスキューされるが、ＳＭＮ誘導が遅れれば、レスキューは不完全になる。対照的に、４８時間だけのＳＭＮの誘導は、ＮＭＪ正常神経伝達物質放出を完全に回復するには十分である。誤差バーは平均標準誤差を示す。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、示されている場合を除きコントロールに対して計算された有意差。

図６。コリン作動性ニューロン活性抑制は、ｓｍｎ変異表現型を模倣する。Ａ。コントロールまたはＣｈａ−Ｇａｌ４を伴うコリン作動性ニューロンにおいて発現される、ＵＡＳ−ヒトＫｉｒ２．１もしくはＵＡＳＰＬＴＸＩＩのＮＭＪから記録された代表的な波形。Ｋｉｒ２．１を伴うコリン作動性ニューロン興奮性の抑制またはＰＬＴＸＩＩを伴う神経伝達物質放出は、運動ニューロンからの神経伝達物質放出を増加させている。Ｂ。コリン作動性ニューロンにおけるＫｉｒ２．１またはＰＬＴＸの発現は、律動的運動活動を破壊する。Ｃ−Ｆ。コントロールに対して正規化された、筋肉表面積（Ｃ）、移動力（Ｄ）、運動リズム（Ｅ）およびＮＭＪ ｅＥＰＳＰ振幅（Ｆ）の定量化。コリン作動性ニューロンにおけるＫｉｒ２．１またはＰＬＴＸＩＩの発現は、筋肉サイズを変えなかったが、運動スピードを減少させ、運動リズムを破壊し、運動ニューロンからの誘発神経伝達物質放出の振幅を増加させる。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、示されている場合を除きコントロールに対して計算された有意差。

図７。遺伝または薬学的Ｋ＋チャネルの阻害はｓｍｎ変異表現型を改善する。Ａ−Ｃ。（Ａ）コントロール、（Ｂ）ｓｍｎ変異体および（Ｃ）Ｃｈａ−Ｇａｌ４を伴うコリン作動性ニューロンにおいてＵＡＳドミナントネガティブシェイカーＫ＋チャンネル（ＵＡＳ−ＳＤＮ）を発現しているｓｍｎ変異体からの運動経路のトレース。ＳＤＮ発現は、ｓｍｎ変異体の移動力のレスキューを増加させている。Ｄ−Ｇ。コントロールに対して正規化された、筋肉表面積（Ｄ）、移動力（Ｅ）、運動リズム（Ｆ）およびＮＭＪ ｅＥＰＳＰ振幅（Ｇ）の定量化。Ｃｈａ−Ｇａｌ４を伴うコリン作動性ニューロンにおけるＳＤＮの発現は、コントロールレベルに対するｓｍｎ変異体の、筋肉サイズ（Ｄ）、移動力（Ｅ）、運動リズム（Ｆ）およびＮＭＪ神経伝達物質放出（Ｇ）を回復する。２ｍＭ ４−アミノピリジン（４−ＡＰ）を幼虫の成長を通して培養培地に添加することは、コントロール動物における筋肉サイズは変えなかったが、ｓｍｎ変異体の筋肉サイズを増加させた（Ｄ）。４−ＡＰ投与は、コントロール動物における移動力、運動リズムおよび神経伝達物質放出を抑制する。ｓｍｎ変異体への４−ＡＰ投与は、移動力（Ｅ）およびＮＭＪでの神経伝達物質放出（Ｇ）を、コントロールの４−ＡＰ処置動物とは有意に異なることのないレベルまで修正し、実質的に運動リズム（Ｆ）における欠陥を修正する。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、 ＊＊＊＝ｐ＜０．００１、示されている場合を除きコントロールに対して計算された有意差。

図８は、ＳＭＮＸ７変異体が、コントロールに比べて、６％未満のＳＭＮタンパク質レベルを有することを示す。

図９ Ａ。ｓｍｎＸ７変異体のＮＭＪ ｍＥＰＳＰ振幅は、野生型（ＷＴ）コントロールに類似する。Ｂ。ＮＭＪ ｍＥＰＳＰ周波数は、コントロールに比べてｓｍｎＸ７変異体では増加する。Ｃ。ＮＭＪ素量的含有量は、コントロールに比べてｓｍｎＸ７変異体では増加する。Ｄ。ｓｍｎＸ７ヘテロ接合性変異体は、コントロールに対して類似のＮＭＪ ｅＥＰＳＰ振幅を有する。ｓｍｎＸ７とｓｍｎ７３ＡｏまたはｓｍｎＥ３３のトランスアレリック（ｔｒａｎｓａｌｌｅｌｉｃ）コンビネーションは、ｓｍｎＸ７ホモ接合性変異体に似たＮＭＪ ｅＥＰＳＰ振幅の増加を有する。Ｅ。ａｎｔｉ−ＣＳＰ（緑色）で染色して前シナプスを標識し、ａｎｔｉ−ｈｒｐ（赤色）で染色し神経膜を標識した、３齢ｓｍｎＸ７ヘテロ接合性およびｓｍｎＸ７ホモ接合性変異体幼虫のセグメントＡ３の筋肉４におけるＮＭＪシナプス終末の代表的なイメージ。
スケールバー＝２０μｍ。
Ｆ。ボタン数の定量化 ヘテロ接合性対ホモ接合性のｓｍｎ変異体におけるボタン数変化なし。誤差バーは平均標準誤差を示す。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、コントロールに対して計算された有意差。

詳細な記載

本発明は、ＳＭＮがｓｍｎ変異表現型をレスキューするために、固有受容性ニューロンおよびコリン作動性介在ニューロンの両者において回復されなければならないことを発見したことに基づく。さらにＳＭＡの動物モデルにおいて中枢性コリン作動性ニューロンの興奮性の増加が、運動ネットワーク活動を増加させｓｍｎ変異表現型を変えたことを発見した。実験は、Ｋ＋チャネルの薬理学的な阻害（ＦＤＡ承認広域スペクトルＫ＋チャネル遮断薬４−ＡＰを使用）は、ＳＭＮ枯渇がもたらす重大な結果である介在ニューロンまたは感覚ニューロンの入力による運動回路の興奮性障害に伴って起こる結果である、ｓｍｎ変異表現型に確実に有益であることを示した。これらの観察に基づき、本発明のある態様は、１つ以上のカリウムチャネル遮断薬、特に４−アミノピリジン（以下４−ＡＰとする）、４−（ジメチルアミノ）ピリジン、４−（メチルアミノ）ピリジンおよび４−（アミノメチル）ピリジン（ここでは「治療剤」と総称する）の治療有効量を投与することによりＳＭＡを治療する方法を対象とする。他の態様は、２個以上のカリウムチャネル遮断薬を含む新医薬製剤を対象とする。
概説

移動力は、神経ネットワークの協調的な活動に依存する。神経回路の慢性不全は、最終的には該ネットワーク内のニューロン変性、損傷の悪化や疾患の一番の原因を隠してしまうことにつながるかもしれないという仮説が立てられている（ＰａｌｏｐおよびＭｕｃｋｅ，２０１０）。ＳＭＡは幼児死亡率の最も多い遺伝性原因であり（Ｐｅａｒｎ，１９７８）、劣性のみならず単一遺伝子性でもある。ＳＭＡは運動ニューロン機能変化および衰退を特徴とする。

別の神経変性疾患であるＡＬＳのマウスモデルにおける最近の研究は、星状膠細胞のような他の脊髄細胞が疾患病態に対して寄与していることを同定し、運動ニューロンと他のパートナー細胞の間の相互作用が運動ニューロン疾患に対する重要な寄与因子であるかもしれないことを示唆している（Ｉｌｉｅｖａ ｅｔ ａｌ．，２００９）。

ＳＭＮは、組織偏在的に発現し、マウス、ゼブラフィッシュ、ミバエ、線形動物およびイーストで見出されたオルソログと共に進化を経て高度に保存されている（ＳｃｈｍｉｄおよびＤｉＤｏｎａｔｏ，２００７）。遺伝モデルでは、すべてのＳＭＮタンパク質を完全に除去すると細胞の生存が失われる。対照的にＳＭＡ患者にみられるＳＭＮレベルの減少は大部分の臓器系を著しく障害するようには見えない（ＣｒａｗｆｏｒｄおよびＰａｒｄｏ， １９９６）。しかしながら、ＳＭＡ患者は、典型的には四肢近位部や体幹筋肉が最も重篤に侵されることを伴う運動問題や筋力低下を発症し、進行するとついには呼吸不全や死に至る（Ｓｗｏｂｏｄａ ｅｔ ａｌ．，２００５）。検視研究は、ＳＭＡ患者が病理学的異常運動ニューロンおよび運動ニューロン損失の証拠を有していることを示している（Ｓｉｍｉｃ， ２００８）。しかしながら、このことが運動系不全の原因なのか終末の結果なのかは現在のところ明らかでない。

ＳＭＡにおける多くの研究は、ＳＭＡマウスモデルＳＭＮ−Δ７を使用してマウスで行われ、そのマウスでは運動ニューロンの損失が起こるよりかなり前に運動行動の深刻な初期損傷がある（Ｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，２０１０ａ）。神経筋接合部（ＮＭＪ）の多くの末端には神経が分布されているが、いくつかは器質的異常を有し（Ｋａｒｉｙａ ｅｔ ａｌ．，２００８； Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１；ＭｃＧｏｖｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）、ＮＭＪ神経伝達はこれらの変異体においては素量的含有量で〜５０％の減少を伴う異常である（Ｋａｒｉｙａ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９）。それにもかかわらずこれらのＮＭＪ末端は正常な筋肉単収縮張力をまだうみ出している（Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

最近運動ニューロン欠陥に加えて、超早期の脊髄反射の損失や運動ニューロンへの固有受容性シナプス入力数の減少が、ＳＭＮ−Δ７マウスに観察されているが、ＳＭＡ表現型に対するこれらの変化の機能的寄与は未だに知られていない（Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｍｅｎｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

本願明細書中の研究は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ＳＭＮ変異モデルを用いて、ＳＭＡに関連する経路における中枢性感覚ニューロン、末梢感覚ニューロンおよび運動ニューロンの神経回路（ｎｅｕｒｏｃｉｒｃｕｉｔｒｙ）および生理機能を検討する。
ショウジョウバエＳＭＮ変異モデル

筋肉サイズの減少および移動力、運動リズムおよび運動ニューロン神経伝達の欠陥を有するショウジョウバエｓｍｎ変異体；重要な細胞部位や運動系においてＳＭＮが必要であるかを決定するために利用した。ショウジョウバエでは、運動ニューロンはグルタミン酸作動性のみであるが、末梢感覚ニューロンのみならず大多数の興奮性介在ニューロンはコリン作動性である Ｂａｉｎｅｓ，２００６； ＳａｌｖａｔｅｒｒａおよびＫｉｔａｍｏｔｏ， ２００１）。ショウジョウバエｓｍｎ変異体のロバストな表現型レスキューは、シナプス神経伝達物質放出の振幅や持続時間を増加させる電位依存性カリウムチャネル（Ｋｖチャネル）の遺伝子的遮断により作られた。ショウジョウバエにおいては、哺乳類に比べて運動ニューロンや末梢感覚ニューロンが異なる神経伝達物質を有していたとしても、カリウムチャネル活性剤の効果は、神経伝達物質放出を増加させ、そして活動電位を増加させる点で同じである。

固有受容性ニューロンは、運動回路へ重要な入力を提供し（ＨｕｇｈｅｓおよびＴｈｏｍａｓ，２００７）、コリン作動性介在ニューロンはショウジョウバエＣＮＳ機能に重要であり（Ｋｉｔａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０００）、例えば運動ニューロンに向けてシナプス出力が挙げられる（Ｂａｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）。神経系成長の完成後のＳＭＮの回復は、連結性というよりむしろＳＭＮの枯渇により壊される運動回路の機能であることを示しているので、ＳＭＮ−依存性の表現型をレスキューするのに十分である。二つの方向のエビデンスがさらにこのことを支持している。第１にコリン作動性ニューロンの活動の抑制は、運動ニューロンへの非自律的効果などの多数のｓｍｎ変異表現型を模倣することができる。第２にＫ＋チャンネル遮断を通して運動回路の興奮性を増加させることはｓｍｎ変異体欠陥をレスキューしうる。本願の結果は、ショウジョウバエにおけるＳＭＮの枯渇が、運動回路における選択サブセットのニューロンの機能不全を起こし、その結果運動ニューロンや筋肉などの運動系の他につながる構成の活動を破壊することを示す。これらの発見は、神経回路機能不全により誘発される神経系疾患のためのパラダイムとしてのＳＭＡのショウジョウバエモデルを確立している。
結果の要約

前述した機能損失ｓｍｎ変異体を使用して（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３； Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｒａｊｅｎｄｒａ ｅｔ ａｌ．，２００７）、（１）ショウジョウバエにおけるＳＭＮの枯渇は、ＳＭＡ表現型に似た筋肉成長低下および移動力不全をもたらし、（２）異常な律動的運動出力および神経筋接合部神経伝達を伴うことを確認した。驚くべきことに、これらの欠陥は筋肉または運動ニューロンのどちらにおいてもＳＭＮのトランスジェニック回復によりショウジョウバエｓｍｎ変異体においてレスキューできなかった。むしろ、ｓｍｎ変異表現型をレスキューするためにはＳＭＮは固有受容性ニューロンおよびコリン作動性介在ニューロンにおいても回復されなければならないことを現在では見出している。運動ニューロンおよび筋肉の破壊は、感覚−運動のネットワーク活動の主要な機能不全の二次的な結果であり、さらに運動回路興奮性を増加させるための遺伝的または感覚ニューロンの薬理学的操作は確実にＳＭＮ変異表現型ｘｘに有益であることをこの発見は示している。

実施例１の結果は、ショウジョウバエモデルが有効であることを実証し、ショウジョウバエＳＭＮ変異体では、筋肉成長、移動力および運動リズムの欠陥を伴うＮＭＪ誘発神経伝達物質放出も増加したことを示している（図１および２）。

実施例２の結果は、ＳＭＮの筋肉回復とは対照的に、ＳＭＮの汎ニューロン的な回復が、コントロールレベルに対してｓｍｎ変異体の筋肉表面積を完全にレスキューしたことを示し（図２ Ｂ、Ｄ、Ｅ）、またそれらの移動速度、律動的運動出力およびＮＭＪ ｅＥＰＳＰ振幅を完璧に回復させたことを示している（図 図２Ｆ−Ｈ）。それらの結果は、ｓｍｎ変異体幼虫において筋肉が成長しないことが、筋肉線維そのものにおいてではなく、神経系における通常のＳＭＮレベルに対する非自律的な要件のせいであることを示した。

実施例３の結果は、ＳＭＮがコリン作動性ニューロンに必要でありグルタミナージック（ｇｌｕｔａｍｉｎｅｒｇｉｃ）運動ニューロンには必要でないこと、ＳＭＮが固有受容性にも中枢性コリン作動性ニューロンにも必要であることを示している。中枢性コリン作動性ニューロン中のトランスジェニックＳＭＮレベルの発現はｓｍｎ変異体の筋肉成長、移動力および律動的活動欠陥を完璧にレスキューした（図３Ｅ−Ｇ）。さらにコリン作動性ニューロンにおけるＳＭＣの発現もコントロールレベルに対するｓｍｎ変異体のＮＭＪ末端におけるｅＥＰＳＰ振幅を完全にレスキューした（図３Ｄ、Ｈ）。このようにコリン作動性ニューロンにおけるＳＭＮの発現のみが、ｓｍｎ変異表現型を完全にレスキューするのに十分であり、運動ニューロンや筋肉の両者のＳＭＮ−依存性欠陥を非自律的にレスキューすることができる。さらに実験は、胚発生後のＳＭＮ発現回復は、運動回路アセンブリーに持続的欠陥を有さないｓｍｎ変異体をレスキューすることができるということも示した。ＮＭＪ神経伝達物質は後の段階であってもＳＭＮレベルを上昇させることで完全に補正されるようにＳＭＮ回復のタイミングに対する示差的表現型感受性がある一方、移動力、運動リズムおよび筋肉成長のためにはより早い時期に、より長い時間高いＳＭＮレベルにさらす必要があった。最終的に、運動ニューロンの神経伝達物質放出特性に与える細胞非自律的効果などのｓｍｎ変異体の多数の特徴が再現されたコリン作動性ニューロン活動の阻害は、ｓｍｎ変異体における機能の低下を有する運動回路上のコリン作動性感覚ニューロンに一致している。

運動回路がｓｍｎ変異体において機能性の欠損を有しているという仮説を実施例４は構築しているので、実験は、それらの動物における中枢性コリン作動性ニューロンの興奮性の増加が、運動ネットワーク活動を増加させｓｍｎ変異表現型を変えることが出来るかどうかをテストするために設計された。様々な実験の結果は、Ｋ＋チャネルの薬理学的な阻害（ＦＤＡ承認広域スペクトルＫ＋チャネル遮断薬４−ＡＰを使用）が、ＳＭＮ枯渇がもたらす重大な結果である、介在ニューロンまたは感覚ニューロンの入力による運動回路の興奮性障害に伴って起こるｓｍｎ変異表現型に確実に有益でありうることを示した。
結果の考察

本願の結果は、少なくとも二つのグループの運動回路ニューロン（ｂｄおよびＩ型ｍｄ感覚ニューロン）におけるＳＭＮの回復が、幼虫の表現型のフルレスキューをもたらすことを立証している。ｂｄおよびＩ型ｍｄ感覚ニューロンは、ショウジョウバエ幼虫の協調的な収縮運動に必要な固有受容性感覚フィードバック回路の重要な要素である（ＨｕｇｈｅｓおよびＴｈｏｍａｓ， ２００７）。ｂｄおよびＩ型ｍｄのサブセットの感覚ニューロンは、固有受容感覚に重要であるメカノセンシティブ（ｍｅｃｈａｎｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）ＮｏｍｐＣメカノセンシティブ（ｍｅｃｈａｎｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）ＮｏｍｐＣ ＴＲＰチャンネルを発現させる（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。感覚フィードバックは、ショウジョウバエ 幼虫の中枢性パターンジェネレーターアセンブリーまたは基本の胚性および幼虫の動きに必要にはみえない（Ｃｒｉｓｐ ｅｔ ａｌ．，２００８）。しかしながら感覚入力が無ければ、律動的運動回路活動（Ｆｏｘ ｅｔ ａｌ．，２００６）も協調的な運動挙動も重篤に壊される（ＨｕｇｈｅｓおよびＴｈｏｍａｓ，２００７；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ｂｄおよびＩ型ｍｄ感覚ニューロンにおけるＳＭＮレスキューは、この活動を制御する感覚入力に対して重要な役割に一致するｓｍｎ変異体の律動的運動出力を回復した（Ｆｏｘ ｅｔ ａｌ．，２００６）。しかしながら、固有受容性ニューロンのみにおけるＳＭＮの回復は、ｓｍｎ変異体の運動速度を補正するのには十分ではなく、完全な運動性を回復するためには、さらにニューロンにはＳＭＮの野生型レベルが必要であることを示している。

すべてのコリン作動性中枢性感覚ニューロンにおけるＳＭＮ発現は、移動力などのすべてのｓｍｎ変異体幼虫の表現型を完璧にレスキューした。したがって、これらの結果は、細胞自律性には１つ以上のグループの中枢性コリン作動性ニューロンにおいてＳＭＮが必要であることを暗示している。この理論により拘束されなければ、これらのニューロンが、脳からの入力（ＣａｔｔａｅｒｔおよびＢｉｒｍａｎ，２００１）、または効果的な移動力に必要な協調を促進するセグメントの中枢性パターンジェネレーター間の他の連結を減少させうることもありえる。しかしながら、レスキュー分析は運動回路の個々の要素がいくつかのｓｍｎ変異表現型に有意に寄与できることを示したが、筋肉成長のような他の表現型は中枢性および末梢性コリン作動性ニューロンの両者において正常レベルのＳＭＮ発現がさらに必要である。

コリン作動性運動回路ニューロンのみがＳＭＮ枯渇に選択的に影響を受けやすいことは興味深い。（Ｌｏｔｔｉ，Ｉｍｌａｃｈ ｅｔ ａｌ）では、コリン作動性ニューロン機能に要求される遺伝子のＳＭＮ−依存性の欠損スプライシングが同定され、ＳＭＮのように、コリン作動性ニューロンで特異的に回復しｓｍｎ変異表現型をレスキューする可能性を示した。本願で示した結果と合わせると、ＳＭＮ枯渇が遺伝子のサブセットの発現を破壊し、遺伝子のいくつかはコリン作動性運動回路ニューロンの正常な機能に非常に必要とされることが認められる。これらの結果は、ＲＮＡスプライシングにおけるＳＭＮの役割とＳＭＮの低下に対する運動回路機能の脆弱性の間の機構的なリンクを実証している。

各系において利用される神経伝達物質は異なるけれども、運動回路−固有受容性ニューロンの基本的なエレメントである、介在ニューロンと運動ニューロンは、ショウジョウバエとヒトとの間で保存されている（ＭａｒｄｅｒおよびＲｅｈｍ，２００５）。例えば、ヒトおよびマウス運動ニューロンはコリン作動性であるが、固有受容性ニューロンはグルタミン酸作動性であり、ショウジョウバエ運動回路で利用されている逆の神経伝達である。しかしながらショウジョウバエモデルはそれにもかかわらずヒトＳＭＡの治療に関係している。なぜなら中枢性感覚ニューロンとカリウムチャネル活性剤が接触することによる神経伝達物質放出の延長は神経伝達物質に特異的でないからである；薬物は非特異的に活動電位を持続させそれにより神経伝達物質放出を増加させる。この理論により拘束されなければ、コリン作動性ニューロンがＳＭＮレベル低下に対する特定の保存された感受性を有するという可能性がある。

ショウジョウバエｓｍｎ変異体の固有受容性ニューロンにおけるＳＭＮの回復は、運動ニューロンにおける正常なＮＭＪ神経伝達物質放出特性を回復するのには十分であった。このことは、直接的シナプスの接触がなくとも、恐らく中間介在ニューロン連結を介して、これらのニューロンにおけるＳＭＮの増加が運動ニューロン電気生理学的性質に影響を与えうることを示唆している。したがって、運動回路の配線の具体的な詳細がショウジョウバエと脊椎動物の間で異なっていても、運動ネットワークの重要な関係と機能は保存され、ＳＭＮの枯渇に選択的に影響を受けやすいという可能性がある。

低分子Ｋ＋チャネル遮断薬４−ＡＰおよび４−（ジメチルアミノ）ピリジン（データ示さず）処理もショウジョウバエｓｍｎ変異表現型をレスキューした。野生型動物において、４−ＡＰ処理は、筋肉サイズには影響しなかったが、神経系の至る所および筋肉中に存在するＫ＋チャネルの全体的な阻害により予測されるような、移動力を低下させＮＭＪ神経伝達物質放出抑制を阻害した（Ｗｉｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１）。それにもかかわらず、４−ＡＰの投与は有意にｓｍｎ変異体の筋肉面積も移動力も増加させ、律動的運動出力およびＮＭＪ神経伝達における欠陥を完全に補正した。

４−ＡＰでの治療は、脊髄損傷、重症筋無力症およびＬａｍｂｅｒｔ−Ｅａｔｏｎ症候群の患者の機能の改善に関連している（Ｈａｙｅｓ，２００７）。また該治療はイヌ遺伝性運動ニューロン疾患における筋肉単収縮張力を改善し得る（Ｐｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。４−ＡＰの徐放性製剤が多発性硬化症におけるヒト臨床用途のため最近ＦＤＡに承認された（ＣｈｗｉｅｄｕｋおよびＫｅａｔｉｎｇ，２０１０）。しかしながら、本願での発見までには、いかなるレベルでＳＭＡが中枢性感覚ニューロンに関与しているかは知られていなかった。

ショウジョウバエｓｍｎ変異体モデルにおける４−ＡＰの薬効は、感覚−運動回路中のコリン作動性ニューロン伝達上にその活性を介して起こりうる。ヒトに対してこの知見を推定すると、４−ＡＰのような他の化合物は脊髄内で作用して感覚ニューロンから神経伝達物質放出を増加させ、それにより運動ニューロン系ネットワークの興奮性を増加させ、脊髄性筋萎縮症の症状を改善するための治療剤としても使用できる。
発明の実施形態

血液脳関門を通過するために製剤化された４−ＡＰ（または生物活性誘導体またはそのバリアント）の治療有効量を投与することにより、ＳＭＡを治療しうることがこのたび見出された。本発明においては、ＳＭＡを治療するために、４−（ジメチルアミノ）ピリジン、４−（メチルアミノ）ピリジンおよび４−（アミノメチル）ピリジンなどの他のカリウムチャネル遮断薬を、単独でまたはお互い組み合わせて使用することができる。「医薬製剤」中で後述のとおり、治療剤は、同日にまたは異なる日に投与することができる。

本発明に使用する他のＫ＋チャンネル遮断薬としては、ドフェチリド、ソタロール、イブチリド（洞律動への心房細動急性転換用に食品医薬品局に承認されている）、アジミリド、ブレチリウム、クロフィリウム、Ｅ−４０３１、ニフェカラント、テジサミルおよびセマチリドが挙げられる。

特定の他の態様は、１つより多い治療剤の製剤、たとえばＢＢＢを通過するための薬剤の能力を最適化する製剤を対象とする。
治療的Ｋチャネル遮断薬および投与量

４−アミノピリジンは、ＩＮＮファンピリジン（ｆａｍｐｒｉｄｉｎｅ）およびダルファンピリジン（ｄａｌｆａｍｐｒｉｄｉｎｅ）としても知られている（アコーダ セラピューティクス社（Ａｃｏｒｄａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク、Ａｍｐｙｒａ（登録商標）の名前で販売）。４−ＡＰは、化学式Ｃ_５Ｈ_４Ｎ-ＮＨ_２を有する有機化合物である。該分子は、ピリジンの３つの異性体アミンの一つである。 ４−ＡＰは、電圧−活性化Ｋ＋チャネルファミリーのＫｖ１（Ｓｈａｋｅｒ、ＫＣＮＡ）のメンバーの比較的選択的なブロッカーである。１ｍＭの濃度では、他のナトリウム、カルシウムおよびカリウムコンダクタンスには有意な効果を示さずに、シェイカーチャネルを選択的かつ可逆的に遮断する。カリウムチャネルのサブタイプを明らかにする際に４−ＡＰは調査ツールとして長い間使用されているが、現在は、ＦＤＡにより承認され多発性硬化症のいくつかの症状に対応し、数種の疾患を有する成人の歩行に症状改善を示している（Ｓｏｌａｒｉ Ａ， Ｕｉｔｄｅｈａａｇ Ｂ， Ｇｉｕｌｉａｎｉ Ｇ， Ｐｕｃｃｉ Ｅ， Ｔａｕｓ Ｃ （２００１）． Ｓｏｌａｒｉ， Ａｌｅｓｓａｎｄｒａ． ｅｄ． “Ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅｓ ｆｏｒ ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ”． Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔ Ｒｅｖ （４）； Ｋｏｒｅｎｋｅ ＡＲ， Ｒｉｖｅｙ ＭＰ， Ａｌｌｉｎｇｔｏｎ ＤＲ （Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００８）． “Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ ｆａｍｐｒｉｄｉｎｅ ｆｏｒ ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ”、Ａｎｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ ４２ （１０）： １４５８-６５； Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ： ｆａｍｐｒｉｄｉｎｅ”． Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｐｒｅｓｃｒｉｂｅｒ （３４）： １１９-１２３， Ａｕｇｕｓｔ ２０１１。当該薬物は、商品名Ｎｅｕｒｅｌａｎとして合衆国においてオーファンドラッグの地位を有する。ファンピリジン（ｆａｍｐｒｉｄｉｎｅ）もＡｍｐｙｒａ（登録商標）として合衆国でアコーダ セラピューティクス社により販売されている（ＦＤＡは多発性硬化症の成人の歩行を改善させるためにＡｍｐｙｒａを承認している）。

またファンピリジン（ｆａｍｐｒｉｄｉｎｅ）（４−ＡＰ）は、脊髄損傷、重症筋無力症およびＬａｍｂｅｒｔ−Ｅａｔｏｎ症候群の患者に臨床的に使用し（Ｈａｙｅｓ，２００７）、イヌ遺伝性運動ニューロン疾患における筋肉単収縮張力を改善し得る（Ｐｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。ファンピリジンは、活動電位を延長し、その結果としてニューロンからの神経伝達物質放出を増加させる広域べースのカリウムチャネル遮断薬である。該薬剤は動物実験においてテトロドトキシン毒性を無効にすることも示されている。４−ＡＰで治療されたＭＳ患者は２９．５％〜８０％の応答率を示した。長期の研究（３２月）は、４−ＡＰに初期に反応した患者の８０−９０％は長期に有益であったことを示した。４−ＡＰでの治療は脊髄損傷、重症筋無力症およびＬａｍｂｅｒｔ−Ｅａｔｏｎ症候群の患者の機能改善に関連し（Ｈａｙｅｓ，２００７）、イヌ遺伝性運動ニューロン疾患における筋肉単収縮張力を改善し得る（Ｐｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。

種々の濃度の４-ＡＰを、１７人の温度感受性ＭＳ患者の臨床用途のために試験した。投与量の範囲は４-ＡＰ７．５〜５２．５ｍｇ、１日１〜３回、３〜４時間間隔、１日を超え５日間まで試験した。４−ＡＰを与えられた１７人の患者のうち１３人（７６％）がプラセボグループに比べて、臨床上重要な運動および視覚の改善を示した。７０％の連日の４−ＡＰ改善は、７〜１０時間続いた。４−ＡＰの２回の連続投与に対する改善は、プラセボ２．３６時間（治療−観察期間平均９．０６時間の２６％）に比べて平均７．０７時間続いた（治療−観察期間平均８．５３時間の８３％）。重大な副作用は起こらなかった。Ｓｔｅｆｏｓｋｉ Ｄ，ｅｔ ａｌ．；Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．１９９１ Ｓｅｐ；４１（９）：１３４４−８；４−Ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ： ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．ＦＤＡ承認用量１０ｍｇを１日２回経口で投与した。

治療有効量は種々要因により変化しうる。例えば：１．１つ以上の剤が投与されるかどうか；２．剤の薬効、単独または他の剤と組み合わせ；３．製剤のタイプ、薬剤はゆっくり放出されるからより高い量を含めることができる徐放性処方など；４．患者の年齢、疾患の重症度；５．投与頻度；および６．個々の対象の剤に対する耐性および反応性。
医薬製剤および投与

ある態様においては、疾患の１つ以上の症状を改善するのに必要な、１つ以上の治療剤の多様な治療有効量を、１日または週もしくは月の一定期間投与する。治療剤は単独で（すなわち唯一の特定の剤で治療）、または２以上の剤を別々にもしくは組み合わせて投与されうる。剤は１日１回以上投与されうる。異なる剤の治療有効量は、特定の剤によって変わりうるし、剤が単独または別の剤と一緒に投与されるかどうかよって変わりうる。治療有効量は特定の製剤に基づいても変化しうる。

本発明の方法で使用される医薬組成物は、１つ以上の治療剤の治療有効量、すなわち対象における本願に記載の疾患を予防または治療に十分な量を含み、局所または全身投与用に製剤化されている。対象は好ましくはヒトであり、同様にヒト以外でもありえる。好ましい対象は、既述の疾患の一つが疑われる、該疾患と診断されている、または 該疾患の発症のリスクにある人間でありえる。

治療投与のための活性剤は、好ましくは、毒性が低く血液脳関門を通過する。この療法の進行は、所望の治療効果を達成する投与量に調節するために使用されうる従来技術やアッセイにより簡単にモニターされる。

治療剤の組成は製薬上許容し得る担体も含みうる。本明細書で使用される用語「製薬上許容し得る担体」としては、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗ウイルス薬、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤など製薬学的投与に混合可能なものが挙げられる。追加の活性化合物も組成物に加えることができる。他の局所製剤はＳｈｅｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，７，１５１，０９１に記載されている。

治療組成物は、例えば、結合剤、フィラー、担体、保存剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤および賦形剤などの通常使用する添加剤、例えば、製薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等を含んでもよい。これらの組成物は通常１％−９５％の活性成分、好ましくは２％−７０％の活性成分を含む。

治療剤は、また投与ルートおよび標準的な製薬学的プラクティスに従って選択されるような混合可能で生理学的に許容しうる希釈剤または賦形剤と一緒に混合しうる。適当な希釈剤および賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセリン等、またはその混合物である。また、必要なら、組成物は湿潤剤もしくは乳化剤、安定化剤もしくはｐＨ緩衝剤のような補助物質を少量含んでもよい。

いくつかの態様において、本発明の治療組成物は、液剤もしくは懸濁剤、または固形の形態のいずれに調製してもよいが、好ましくは経口投与用に調製する。製剤には、結合剤、フィラー、担体、保存剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤および賦形剤などの通常使用する添加剤、例えば、製薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等を含んでもよい。溶液、懸濁液または徐放性製剤は通常１％−９５％の活性成分、好ましくは２％−７０％の活性成分を含む。

また製剤には２つ以上の治療される特定の適用に必要な治療剤、好ましくはお互い悪影響を与えない相補的活性を有するものを含んでもよい。当該分子は、好ましくは意図された目的のために有効な量で組み合わせて存在する．

徐放性製剤の適切な例としては、治療剤を含む固形疎水ポリマーの半透過性のマトリックスが挙げられ、マトリックスは造形品の形態、例えばフィルムまたはマイクロカプセルである。徐放性マトリックスとしては、特に限定されないが、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、もしくはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド、Ｌ−グルタミン酸とｙ エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、ルプロンデポ（ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ）（乳酸−グリコール酸 コポリマーおよびロイプロリドアセテートからなる注射可能な微小体）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、およびポリＤ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。いっぽうエチレン−ビニルアセテーテオおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは１００日間を超えて分子の放出が可能であるが、特定のヒドロゲルはより短い時間周期でタンパク質を放出する。

本発明の治療剤は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する限り、如何なる適当な手段によって投与のために製剤化されていてもよい。ＢＢＢを通過する治療剤を製剤化する戦略は周知であり以下が挙げられる：
ＢＢＢの透過性（開口）を増加
血液−脳障壁の浸透圧性開口
化学開口
脳血管拡張：翼口蓋神経節の刺激、酸化窒素吸入
集中的超音波による血液−脳障壁の破壊
ＢＢＢ通過トランスポートを促進するための薬理学的戦略
脂溶性を高めるための薬物修飾
トランスポート／担体システムの使用
薬物送達を妨げる流出トランスポータの阻害
トロイの木馬アプローチ
キメラペプチド
モノクローナル抗体融合タンパク質
プロドラッグバイオ変換戦略
ナノ粒子技術
ニューロイムノフィリン

薬物を脳に送達するための別の可能性は脳または脊髄への直接投与であり、これによりＢＢＢを迂回する。これは例えば硬膜外静脈叢への注射または脳、脊椎もしくは髄液（ＣＳＦ）への薬物の直接導入によりなしえる。薬物ポンプは本発明の方法における治療剤の持続投与を促進することができる。

リポソームは脳に低分子を送達するのに有用でありうる。特に有用なリポソームは、例えば、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を使用した逆相蒸発法により作りうる。リポソームは、所望の径を有するリポソームを作るために一定の孔径のフィルターを通して押し出される。本発明のポリペプチドは、例えば、Ｗｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ．３７０（１−２）：２６−３２（２００９）に記載のように、リポソームに結合しうる。

脳または脊髄へ送達用の薬物を製剤化する方法のレビューに関しては、Ｒｅｉｎｈａｒｄ Ｇａｂａｔｈｕｌｅｒ， Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ ３７ （２０１０） ４８-５７ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｄｒｕｇｓ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ-ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｔｏ ｔｒｅａｔ ｂｒａｉｎ ｄｉｓｅａｓｅｓを参照。またＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｖｏｌｕｍｅ ２０１１， Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９， ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９． Ｒｅｖｉｅｗ Ａｒｔｉｃｌｅ Ｃａｒｌｏｓ Ｓｐｕｃｈ ａｎｄＣａｒｍｅｎ Ｎａｖａｒｒｏ， Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ａｃｔｉｖｅ Ａｇｅｎｔｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ （Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）を参照。

Ｉｎ ｖｉｖｏ投与に関しては、医薬組成物は、好ましくは経口または非経口、すなわち、関節内、静脈内、腹腔内、皮下もしくは筋肉内投与される。特定の態様においては、医薬組成物は、ボーラス投与により静脈内または腹腔内に投与される。Ｓｔａｄｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，２８６，６３４。疾患の予防または治療に関しては、適切な投与量は、疾患の重症度、薬物が予防もしくは治療用に投与されるかどうか、薬歴、患者の病歴および薬物への反応性および担当医の裁量によって決められるだろう。

得られた製薬学的製剤は、従来周知の滅菌技術により殺菌してもよい。水溶液は、次に使用のため包装または無菌条件下でろ過、凍結乾燥し、投与前に無菌性水溶液と合わされる凍結乾燥製剤であってもよい。組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、浸透圧調整剤等の生理的条件に近づけるために要求される製薬上許容し得る補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等を含んでもよい。また脂質懸濁剤は、貯蔵時のフリーラジカルおよび脂質過酸化ダメージに対して脂質を保護する脂質保護剤を含んでもよい。α−トコフェロールのような脂溶性のフリーラジカルクエンチャーおよびフェリオキサミンのような水溶性鉄特異性キレート剤が適切である。

この発明の医薬組成物は多様な剤形であってよく、剤形は好ましい投与方法に従って選択してもよい。剤形としては、例えば、錠剤、ピル、散剤、溶液もしくは懸濁剤、座薬、注射用および注入用溶液などの、固形、半固形および液状の剤形が挙げらる。好ましい形態は意図する投与方法および治療の適用によって決まる。

本発明の医薬組成物は、例えば、取り込みまたは安定性を刺激する補助因子の有無にかかわらず無菌性で等張の製剤にしてもよい。製剤は、好ましくは液剤か凍結乾燥された散剤でありえる。例えば、本発明の組成物は、５．０ｍｇ／ｍｌクエン酸一水和物、２．７ｍｇ／ｍｌトリクエン酸ナトリウム、４１ｍｇ／ｍｌマンニトール、１ｍｇ／ｍｌグリシンおよび１ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０を含む製剤緩衝剤で希釈してもよい。この溶液は、凍結乾燥し、冷蔵下で保存し、投与前に無菌性注射用蒸留水（ＵＳＰ）でもどしうる。

適当な溶媒は水和物を含む。適切な塩としては、有機酸および無機酸または塩基で形成されるものが挙げられる。製薬上許容し得る塩基塩としては、アンモニウム塩、ナトリウムおよびカリウムとの塩などのアルカリ金属塩、カルシウムおよびマグネシウムとの塩などのアルカリ土類金属塩およびジシクロヘキシルアミンおよびＮ−メチル−Ｄ−グルカミンなどの有機塩基との塩が挙げられる。

経口投与に適切な本発明に使用される製剤は、それぞれ所定の量の活性成分を含有するカプセル、カシェー（ｃａｃｈｅｔｓ）または錠剤のような個別の単位；散剤もしくは顆粒剤；溶液または水性液剤中もしくは非水溶性液剤中の懸濁剤；または水中油型液体乳剤もしくは油中水型液体乳剤、として存在してもよい。活性成分はまたボーラス、舐剤もしくはペーストとしても存在してもよい。

非経口投与用の製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬および対象とする被験者の血液を用いて製剤を等張にする溶質を含んでいてもよい水性および非水性無菌性注射溶液；および懸濁化剤および増粘剤を含んでいてもよい水性および非水性無菌性懸濁剤、が挙げられる。製剤は、単位用量または複数回用量の容器（例えば密閉されたアンプルおよびバイアル）中に存在してもよく、使用直前に無菌性液体担体（例えば生理食塩水または注射用蒸留水）の添加のみが必要なフリーズドライ（凍結乾燥）条件で保存してもよい。即時の注射溶液および懸濁剤は既述の種類の無菌性散剤、顆粒及び錠剤から調製してもよい。

本発明の治療剤は、同時に投与してもよく、同時に投与とは個々の薬剤が同時に対象内に存在するように薬剤を投与することを意味する。薬剤の併用投与（同じまたは別のルートを介する）に加えて、同時投与は、異なる時間での薬剤投与（同じまたは別のルートを介する）が挙げられる。
定義

一般的に、本願で記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学およびタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用する名称および技術は、技術分野で使用される周知および普通に使用されているものである。本発明の方法および技術は、別段の記載がない限り、技術分野で周知および本願明細書を通して引用や検討している様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されている慣用の方法に従い通常行われる。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ （１９９２， ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ ２００２）； Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９９０）； Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ４^ｔｈ ｅｄ．， Ｅｒｉｃ Ｒ． Ｋａｎｄｅｌ， Ｊａｍｅｓ Ｈ． Ｓｃｈｗａｒｔ， Ｔｈｏｍａｓ Ｍ． Ｊｅｓｓｅｌｌ ｅｄｉｔｏｒｓ． ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ／Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ． （２０００）を参照。別段定義しない限り、本願で使用されているすべての技術的および科学的用語は当業者に普通に理解されるのと同じ意味を有する。

用語「人間」、「対象」および「患者」は本願明細書においては区別しないで使われ、診断、治療、または療法が望まれるいかなる哺乳類の対象、特にヒトをいう。本願で使用される「対象」は、通常如何なる生きている多細胞生物を示す。対象は、動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、イヌおよびネコ）および植物に限定されないが、ヒト上科の動物（例えば、ヒト、チンパンジーおよびモンキー）が挙げられる。その用語にはトランスジェニックおよびクローンの種も含まれる。用語「患者」は人も獣医学上の対象も示す。

「投与」は、当業者に公知の種々の方法および送達システムのいずれかを使用して作用または行われる手段で送達することを意味する。投与は、例えば、経口または静脈内、埋め込み、経粘膜、経皮、皮内、筋肉内、皮下、もしくは腹腔内で行い得る。また投与は、例えば１回、数回および／または１つ以上の延長期間を超えて行われうる。

フレーズ「治療有効量」は、治療結果を生み出すのに十分な量を意味する。一般的に、治療結果は、客観的または主観的に疾患または状態が改善することであり、生理学的プロセスを誘導もしくは高め、生理学的プロセスを遮断もしく阻害することにより達成されるものであり、疾患もしくは状態の除去もしくは緩和を助けるもしくは寄与する生物学的機能を達成するという一般的用語によってなし得る。例えば、疾患の重症度もしくは一連の１つ以上の症状を除去または減少することである。十分な治療効果は、必ずしも一回の投与によりおこるわけではなく一連の投与後にのみ起こるかもしれない。したがって治療有効量は、１回以上の投与において投与されるかもしれない。

疾患を「治療する」は、有効なまたは所望の結果を得るためのステップを採ることを意味し、疾患の１つ以上の症状の緩和、軽減もしくは改善；疾患の広がりの減少；疾患の進行の遅延もしくは緩慢化；メトリック（ｍｅｔｒｉｃ）（統計的）疾患を改善および一時的抑制もしくは一定に保つなどの臨床結果が挙げられる。「治療」はとられるステップを示す。

「緩和」は疾患または疾患の症状を減少または改善することを意味する。例えば、緩和は疾患の表現型の発現前に（すなわち疾患の症状が現れる前に）治療剤を投与することにより達成しうる。緩和は、疾患もしくは疾患の症状を避ける、阻止する、減少するもしくは除去することにより、疾患の影響を軽快することが挙げられる。本願明細書で記載されている列挙された疾患を緩和することは症状が生じる前に列挙された疾患を「治療する」という定義の中にはいる。疾患を緩和する治療剤の量は本願明細書では「治療有効量」として示される。

実施例
材料と方法

ショウジョウバエストック。ｓｍｎＸ７（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）は小さな欠失であり、転写開始部位の９３ｂｐ上流から３’ＵＴＲの最後４４ｂｐまでの全ｓｍｎコード領域を他の座を破壊することなく取り除く。通常の培養条件では、３齢まで生存したホモ接合性ｓｍｎＸ７変異体の数は、これまでの報告（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）通り、ほとんどない。しかしながら、もしストックが低密度で培養されれば、この段階まで生存した数の増加を確実にみることができるであろう。そうするために、親ストックおよびコントロールを、イーストペーストを添加したグレープジュース寒天プレート上に一夜放置し、プレートを移動させ、第３幼虫齢に達するまで２５℃で培養した。ｓｍｎ７３Ａｏは機能欠失型点変異アレルであり、不安定なタンパク質を生成する。その結果は、これらの動物のＮＭＪでの誘発性神経伝達物質放出における減少が報告されているこれまでのＳＭＮ７３Ａｏアレルに基づく電気生理学的観察とは異なる（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。この知見は１つのＳＭＮ７３Ａｏストック（Ｂ＃４８０２）でも見られた。しかしながら、この欠陥はトランスジェニックＳＭＮではレスキューすることができなかった（データ示さず）。別のＳＭＮ７３Ａｏストック（Ｇｒｅｇ Ｍａｔｅｒａ，ＵＮＣより贈呈）はＳＭＮが低いことが確認されており、戻し交雑を複数回行い野生型バックグラウンドとなり、ホモ接合性及びトランスヘテロ接合性の両方の組み合わせにおいてｅＥＰＳＰの振幅がｓｍｎＸ７や他のｓｍｎ変異体アレルと同じぐらい迄に増大した（補足図２Ｄ）。従前の知見は第二の部位突然変異のせいである可能性があると結論づけられた。同様に、ＳＭＮ７３Ａｏアレルについて、以前にはその減少が報告されていた（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）が、ｓｍｎＸ７変異体では、形態学的シナプスボタンにおいてＸ変化なし、が観察された。これらの結果は、ＮＭＪ形態学的変化がほとんどない、もしくはない、ということを示した他の「強い」ｓｍｎアレルの観察と一致する（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）。以前の研究におけるように、トランスジェニックＳＭＮの遍在的発現が、成虫の生存能力、移動力および筋肉サイズをレスキューすることができる（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｒａｊｅｎｄｒａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。しかしながら、筋肉もしくはニューロン発現で十分という以前の報告（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）とは対照的に、ＳＭＮ変異体の移動力をレスキューするにはｎｓｙｂ−Ｇａｌ４もしくはジーンスイッチ（ｇｅｎｅｓｗｉｔｃｈ）ｅｌａｖ−Ｇａｌ４との、ＳＭＮのニューロンに限定された発現だけが必要であるということがわかった。この不一致に対する可能な説明としては、これらの研究に用いられた中胚葉性ｈｏｗ２４Ｂ−Ｇａｌ４ドライバー（Ｂｒａｎｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｉｍｏｎ，１９９３）が強い筋肉発現に加えて有意なニューロン発現を示す、ということである。ＵＡＳ：：Ｆｌａｇ−Ｓｍｎ−染色体ＩＩに挿入されたアミノ末端Ｆｌａｇ配列を有する全長Ｓｍｎタンパク質（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）。ターゲット発現が抗−Ｆｌａｇ免疫組織化学を用いて確認された（データ示さず）。ＵＡＳ−ＰＬＴＸＩＩ（分泌シグナル配列としてＮ末端からＣ末端へ構築されたメンブレンテザー ＰＬＴＸＩＩ、成熟し切断されたＰＬＴＸ−ＩＩペプチド配列、埋込みｃ−Ｍｙｃエピトープタグを有する親水性リンカー配列、およびＧＰＩターゲット配列（Ｂ．Ｃ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｎｉｔａｂａｃｈ ａｎｄ ＢＤＭ 未出版）Ｇａｌ４株：ｎｓｙｂ−Ｇａｌ４（Ｂｕｓｈｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００９），ＯＫ６−Ｇａｌ４，Ｇ１４−Ｇａｌ４（Ａｂｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００２），ＯＫ３７１−Ｇａｌ４（Ｍａｈｒ ａｎｄ Ａｂｅｒｌｅ，２００６），アクチン−Ｇａｌ４（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９７），Ｃｈａ−Ｇａｌ４（Ｓａｌｖａｔｅｒｒａ ａｎｄ Ｋｉｔａｍｏｔｏ，２００１），ｃｌｈ２０１−Ｇａｌ４，１００３．３−Ｇａｌ４（Ｈｕｇｈｅｓ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，２００７），ｐｐｋ−Ｇａｌ４（Ａｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００３）ＮＰ２２２５−Ｇａｌ４（Ｓｕｇｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００３），Ｇａｄ１−Ｇａｌ４（Ｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２）およびｅｌａｖ−ジーンスイッチ（ｇｅｎｅｓｗｉｔｃｈ）（Ｏｓｔｅｒｗａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１）。ＵＡＳ株：ＵＡＳ−Ｆｌａｇ−Ｓｍｎ（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８），ＵＡＳ−Ｋｉｒ２．１（Ｐａｒａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００１），ＵＡＳ−ＰＬＴＸＩＩおよびＵＡＳ−ＳＤＮ（Ｍｏｓｃａ ｅｔ ａｌ．，２００５）電気生理学。ＮＭＪ電気生理学：筋肉６，セグメントＡ３からの細胞内レコーディングを既報（Ｉｍｌａｃｈ ａｎｄ ＭｃＣａｂｅ，２００９）のようにして行った。簡単に述べると、３幼虫齢を切開し、１．０ｍＭ Ｃａ２＋を含有するＨＬ３生理食塩水中でレコーディングを行った。静止膜電位が−５５ｍＶ未満の場合のレコーディングデータのみを分析した。Ａｘｏｃｌａｍｐ ２Ｂアンプを用いてレコーディングを行った。データを１ｋＨｚでローパスフィルタにかけ、デジタル化し、Ｄｉｇｉｄａｔａ１３２２Ａインターフェースを用いてディスクに記録した。ＭｉｎｉＡｎａｌｙｓｉｓプログラム（Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｆｔ，Ｉｎｃ．）のピーク検出特性を用いてｅＥＰＳＰとｍＥＰＳＰ振幅の両方を測定した。全ての事象を遺伝子型にかかわらず手作業で確認した。ｍＥＰＳＰの振幅および周波数は刺激なしでの連続レコーディングから計算した（５０-１００ｓ）。非線形積算誤差を補正（Ｍａｒｔｉｎ，１９５５）した後（ｅＥＰＳＰ振幅／ｍＥＰＳＰ振幅）（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８）を計算することによって、それぞれ個々のレコーディングについて素量的含有量を得た。運動リズム：自発的運動リズムを既報（Ｆｏｘ ｅｔ ａｌ．，２００６）のようにして記録した。簡単に述べると、ＣＮＳおよび運動ニューロンに影響をおよぼさない標準生理食塩水中で、腹腔セグメントＡ１の筋肉６からレコーディングを行った（Ｊａｎ ａｎｄ Ｊａｎ，１９７６）。平均イベント間インターバルを測定するために、３分間に起こった全ての自発的ｅＥＰＳＰイベントを、ＭｉｎｉＡｎａｌｙｓｉｓ（Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｆｔ，Ｉｎｃ．）のピーク検出特性を用いて検出した。移動力：基本的に、既報（Ｓｕｓｔｅｒ ａｎｄ Ｂａｔｅ，２００２）に記載したようにしてアッセイを行った。簡単に述べると、一匹の幼虫をライトボックス上の１％アガロースプレートに置いた（２５℃、７０％湿度）。１分間の馴化の後、移動経路のビデオ記録をＥＭＺ−８ＴＲ顕微鏡に搭載したカメラ（Ｓｅｎｔｅｃｈ ＳＴＣ−６２０ＣＣビデオカメラ）に取込み、ファイナルカットエクスプレス ｖ ４．０（Ａｐｐｌｅ）で記録した。それらをＱｕｉｃｋＴｉｍｅ ｖ７．６．４（Ａｐｐｌｅ）でｑｕｉｃｋｔｉｍｅ．ｍｏｖファイルに変換した。経路長と速度をＤＩＡＳ ｖ ３．４．２（Ｓｏｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ソフトを用いて分析した。ＮＭＪ免疫組織化学。ワンダリングする３幼虫齢を解剖し、既報（Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，２００９ａ；Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，２００９ｂ）のようにして染色した。筋肉４腹腔セグメントＡ３で、ＩｂおよびＩｓ型ボタンをＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｚ１顕微鏡上の４０ｘ対物レンズを用いて数えた。用いた抗体はマウス抗−システインストリングタンパク質（ＣＳＰ，１：２００，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ）、Ｃｙ５−コンジュゲート ヤギ抗−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（１：４００，Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）およびヤギ抗−マウスＡｌｅｘａ４８８（１：２０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であった。幼虫の標本をＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０共焦点顕微鏡でイメージ化した。

ウエスタンブロッティング。ウエスタンブロッティングには下記モノクロナール抗体を用いた：ショウジョウバエ−特異的抗−ＳＭＮ（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）、抗−βアクチン（Ｓｉｇｍａ）、抗−チューブリンＤＭ １Ａ（Ｓｉｇｍａ）および抗−ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ）。ウエスタンブロット解析用総タンパク質抽出物はＳＤＳサンプルバッファ（２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、５％ｂメルカプトエタノール、６０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ６．８、ブロモフェノールブルー）中でのショウジョウバエ３幼虫齢のホモジナイゼーション後、短時間超音波処理と煮沸を行って作製した。タンパク質濃度はＲＣ ＤＣプロテインアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。全てのタンパク質サンプルは１２％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ／ＰＡＧＥ後ニトロセルロース膜に転写して分析した。

ショウジョウバエストック：ｓｍｎＸ７（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）、ｓｍｎ７３Ａｏ（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）、ｓｍｎＥ３３（Ｒａｊｅｎｄｒａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。

筋肉測定：筋肉面積測定はファロイジン（ｐｈａｌｌｏｄｉｎ）染色された筋肉フィレ標本のセグメントＡ３の筋肉６で行った（Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，２００９）。

移動力：幼虫の移動力評価は基本的に既報（Ｓｕｓｔｅｒ ａｎｄ Ｂａｔｅ，２００２）の通りにして行った（補足情報参照）。

運動リズム：自発的運動リズムを既報（Ｆｏｘ ｅｔ ａｌ．，２００６）の通りにして記録した。平均スパイク間インターバルを測定するために、３分間に起こった全ての自発的ｅＥＰＳＰイベントを、ＭｉｎｉＡｎａｌｙｓｉｓ（Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｆｔ，Ｉｎｃ．）のピーク検出特性を用いて検出した。

ＮＭＪ電気生理学：筋肉６，セグメントＡ３からの細胞内レコーディングを既報（Ｉｍｌａｃｈ ａｎｄ ＭｃＣａｂｅ，２００９）のようにして行った。

薬物処理：ジーンスイッチＧＡＬ４ ＳＭＮ発現は、ＳＭＮ変異体での表現型測定前の１４８時間、９６時間、７２時間もしくは４８時間、幼虫をＲＵ４８６（１０ｇ／ｍｌ）で育てることで誘発した（コントロールはすべてワンダリングＬ３期で分析した）。ＳＭＮ誘導はウエスタンブロットで確認した。４−ＡＰ処理のために、２ｍＭ ４−ＡＰ（Ｓｉｇｍａ）をイーストペーストに加え、幼虫は孵化後すぐ、及び続く幼虫期を通じてその上で育てられた。

統計方法：有意性は指示通りＩｎｓｔａｔ ３．０（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いてＡＮＯＶＡでテストされた。すべての図において、誤差バーは平均標準誤差を示す。＊＝ｐ＜０．０５，＊＊＝ｐ＜０．０１，＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
実施例１。 ショウジョウバエｓｍｎ変異体モデルの検証。

ＳＭＡ患者にみられる低ＳＭＮレベルをショウジョウバエにてモデル化するために、接合タンパク質を持たないＳＭＮアレル（ｓｍｎＸ７）を使った。該アレルは、その近くにある座を破壊することなく全ｓｍｎコード領域を取り除く小さな欠損を有する（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）。これらにおける残存ＳＭＮは、３幼虫齢段階のコントロールと比べてＳＭＮレベルの６％未満を提供した母系タンパク質によるものである（補足図１Ａ）。他のｓｍｎ変異体アレルについてのこれまでの報告（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）通り、ｓｍｎＸ７変異体は決して蛹化せず、その代わり３幼虫齢であることに固執し、しばしばこの段階で５日間以上生き続けた。

この表現型がＳＭＮに依存していることを確認するために、アクチン−Ｇａｌ４を用いてｓｍｎＸ７変異体でトランスジェニックＵＡＳ ｆｌａｇ−タグ化されたＳＭＮコンストラクトを遍在的に発現させた（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）。これによりｓｍｎＸ７変異体の通常の蛹化が回復し、１００％幼虫蛹化開始および８０％を超えてその後生きた成虫を産み出すところまでいった（データ示さず）。従って、ｓｍｎＸ７変異体は幼虫後半段階では低ＳＭＮレベルであるが、トランスジェニックＳＭＮでレスキューされうる。注記がある場合を除いて、この変異体アレルを以後の全ての実験で使用した。

ショウジョウバエｓｍｎ変異体幼虫はコントロール動物よりも小さかった。これに筋肉サイズ低下が伴うかどうかを評価するために、ｓｍｎ変異体およびコントロール幼虫の筋肉をファロイジン標識した。その結果、ｓｍｎ変異体はコントロールに比べて筋肉表面積が４６％（Ｐ＜０．００１）減少していた（図１Ａ−Ｃ，またＴａｂｌｅ Ｓ１も参照）。この欠陥はトランスジェニックＳＭＮの遍在的発現により完全にレスキューされた。ｓｍｎ変異体の幼虫は動きが遅く、動く頻度はコントロールより少なかった。この欠陥を定量するために、ビデオ捕獲追跡ソフトを使ってｓｍｎ変異体およびコントロール幼虫の移動力を測定した。その結果、ｓｍｎ変異体は移動速度がコントロール動物に比べて６３％（Ｐ＜０．００１）低かったが、トランスジェニックＳＭＮの遍在的発現によってコントロールレベルにまでレスキューされた（図１Ｄ−Ｆ）。従って、ＳＭＡ患者と同様に、低ＳＭＮレベルを示すショウジョウバエは筋肉および移動力に欠陥がある。

ショウジョウバエ幼虫の移動力は腹神経索（ＶＮＣ）におけるセグメント中枢パターン−生成ネットワーク（ＣＰＧｓ）の律動的活動にリンクしており（Ｆｏｘ ｅｔ ａｌ．，２００６）、該ネットワークは脳半球（Ｃａｔｔａｅｒｔ ａｎｄ Ｂｉｒｍａｎ，２００１）と固有受容性感覚ニューロン（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｈｕｇｈｅｓ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，２００７；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７）の両方からの入力を受け取り、運動ニューロンへ活動を出力する。このパターン−生成ニューロンの活動を測定するために、運動ニューロンの自発的活動を、脳を残しＶＮＣをｉｎ ｓｉｔｕで残した標本に記録した（Ｆｏｘ ｅｔ ａｌ．，２００６）。コントロール動物において、運動活性が一定間隔で律動的に一挙に起こるのはこれまでの研究の通りだった（Ｃａｔｔａｅｒｔ ａｎｄ Ｂｉｒｍａｎ，２００１；Ｆｏｘ ｅｔ ａｌ．，２００６）（図１Ｇ）。対照的に、長さが一定しない、短期間の不規則的突発を生じていたｓｍｎ変異体においてはその活動が乱れた（図１Ｈ）。この欠陥は、ｓｍｎ変異体とコントロールにおける全ての自発的スパイクイベント間の平均スパイクインターバルを一定期間測定することで定量した。コントロールと比較して、ｓｍｎ変異体はスパイク間インターバルが９０％（Ｐ＜０．００１）増加した（図１Ｉ）。移動力と同様，トランスジェニックＳＭＮの遍在的発現により、正常な律動的運動活性が完全に復活した。従って、ショウジョウバエｓｍｎ変異体は運動回路の出力に欠陥がある。
個々の運動ニューロンの神経伝達物質放出特性

脳を摘出し運動ニューロンを吸引電極で直接刺激した（Ｉｍｌａｃｈ ａｎｄ ＭｃＣａｂｅ，２００９）。コントロールと比較して、ｓｍｎ変異体のＮＭＪにおいて誘発興奮性シナプス後電位（ｅＥＰＳＰ）振幅は２３％（Ｐ＜０．００５）増加した（図１Ｊ−Ｌ）。ｓｍｎＸ７変異体におけるＮＭＪ ｅＥＰＳＰ振幅の増加はトランスジェニックＳＭＮの遍在的発現によってコントロールレベルにまで復活した（図１Ｌ）。微小興奮性シナプス後電位（ｍＥＰＳＰ）周波数も６０％（Ｐ＜０．０５）増加していた。対照的に、ｓｍｎ変異体ＮＭＪ末端におけるｍＥＰＳＰ振幅はコントロールと差がなく（補足図２Ａ，Ｂ）、素量含有量の６４％（Ｐ＜０．００１）増加につながった（補足図２Ｃ）。これらの知見はｓｍｎ変異体における運動ニューロンの神経伝達物質放出特性のシナプス前変化と一致する。ｓｍｎＸ７と他のｓｍｎ変異体アレルとのトランス−ヘテロ接合組合せを行った結果、これらの変異体におけるｅＥＰＳＰ振幅の同様の変化を確認した。ヘテロ接合ｓｍｎＸ７動物では見られなかった変化である（補足図２Ｄ）。ｓｍｎＸ７変異体ＮＭＪの形態学的特性を研究した際には、シナプスボタン数にコントロールと比べて有意差は見られなかった（補足図２Ｅ）。要約すると、ショウジョウバエｓｍｎ変異体は、筋肉成長、移動力や運動リズムの欠陥を伴うＮＭＪ誘発性神経伝達物質放出を増加させた。
実施例２。 神経系におけるＳＭＮの復活はｓｍｎ変異表現型を救う。

ＳＭＮの枯渇はショウジョウバエの筋肉成長に加えて運動システムの複数の出力に障害を与えた。通常のＳＭＮレベルに対する細胞自律的な要件を同定するため、より多くの組織限定Ｇａｌ４ドライバーをｓｍｎ変異体のレスキュー評価に繰り返し用いた。まず、Ｇ１４−Ｇａｌ４（幼虫の筋肉特異的ドライバー）を用いてトランスジェニックＳＭＮをｓｍｎＸ７変異体の筋肉においてのみ発現させた。これによってｓｍｎＸ７変異体における、筋肉表面積の有意な増加（図２Ｃ，Ｅ）もしくは移動力、律動的な運動出力およびＮＭＪ ｅＥＰＳＰ振幅に対する効果は生じなかった（図２Ｆ−Ｈ）。

次に、ニューロン特異的ｎｓｙｂ−Ｇａｌ４ドライバーを用いて、ｓｍｎ変異体の神経系においてのみＳＭＮ回復を調べた。ＳＭＮの筋肉回復とは対照的に、ＳＭＮの汎ニューロン的な回復によってｓｍｎ変異体の筋肉表面積はコントロールレベルに迄回復し（図２Ｂ，Ｄ，Ｅ）、移動速度、律動的運動出力およびＮＭＪ ｅＥＰＳＰ振幅も完全に回復した（図２Ｆ−Ｈ）。ｓｍｎ変異体のニューロン単独でのレスキューでは生きたショウジョウバエ成虫を生み出すのに十分ではないが（データ示さず）、それは多分に、レスキューされない組織におけるＳＭＮレベルが細胞生存度を損なうほどまで完全に枯渇するせいである（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。それらの結果は、ｓｍｎ変異体幼虫において筋肉が成長しないことが、筋肉繊維そのものにおいてではなく、神経系における通常のＳＭＮレベルに対する非自律的な要件のせいであることを証明した。
実施例３。 ＳＭＮはコリン作動性ニューロンにおいて必要とされるが運動ニューロンにおいては必要とされない。

ショウジョウバエＶＮＣには、ヒトの脊髄のように、多様な神経伝達物質発現を示すニューロンが集まっている。一部の中枢性介在ニューロンに加えて全てのショウジョウバエ運動ニューロンはグルタミン酸作動性である（Ｄａｎｉｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，２００８）。ｓｍｎ変異体のＮＭＪにおける神経伝達物質放出にはシナプス前欠陥があるため、運動ニューロンにおけるトランスジェニックＳＭＮ発現が有するｓｍｎ変異体レスキュー能力をテストした。ｓｍｎ変異体のグルタミン酸作動性ニューロンにおいてのみトランスジェニックＳＭＮを発現させるために、ＯＫ３７１−Ｇａｌ４を小胞グルタミン酸輸送体プロモーターに挿入し、エンハンサートラップとして用いた。そうすることによって、ｓｍｎ変異体単独と比較して筋肉表面積、移動速度、律動的運動出力に差が生じることはなかった（図３Ｆ−Ｇ）。驚いたことに、これらの動物のＮＭＪでのｅＥＰＳＰ振幅の異常な増加は減少しなかった（図３Ｂ，Ｃ，Ｅ）。この予想外の結果は、二つ目の別の運動ニューロン特異的なドライバーＯＫ６−Ｇａｌ４を使って確認した（図３Ｅ−Ｈ）。従って、筋肉成長にＳＭＮが必要であるのと同様、ｓｍｎ変異体のＮＭＪにおける異常な神経伝達物質放出は、運動ニューロンでのＳＭＮの細胞自律的喪失の結果ではない。この結果はショウジョウバエ運動回路中の他のニューロンタイプがＳＭＮを必要とするかどうかを解明する研究を促した。

抑制的入力は運動回路機能の重要な制御因子である（Ｆｅａｔｈｅｒｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０００）ので、グルタミン酸脱炭酸酵素１プロモーターＧａｌ４をＧＡＢＡ作動性ニューロンでのＳＭＮの回復に使用した。しかしながら如何なるｓｍｎ変異表現型も有意にレスキューされなかった（図３ＥＨ）。ショウジョウバエ神経系の興奮性ニューロンの大部分はコリン作動性であり（Ｓａｌｖａｔｅｒｒａ ａｎｄ Ｋｉｔａｍｏｔｏ，２００１）、運動ニューロンはコリン作動性ニューロンからのシナプス入力を受け取る（Ｂａｉｎｅｓ，２００６）。従って、コリンアセチルトランスフェラーゼ（Ｃｈａ）プロモーター駆動Ｇａｌ４を用いてｓｍｎ変異体のトランスジェニックＳＭＮを回復させた。グルタミン作動性およびＧＡＢＡ作動性のドライバーとは対照的に、コリン作動性ニューロンにおけるトランスジェニックＳＭＮレベルの発現は、ｓｍｎ変異体の筋肉成長、移動力および律動的活動の欠陥を完全にレスキューした（図３Ｅ−Ｇ）。さらに、コリン作動性ニューロンでのＳＭＮ発現もｓｍｎ変異体のＮＭＪ末端でのｅＥＰＳＰ振幅をコントロールレベルにまで完全にレスキューした（図３Ｄ，Ｈ）。従って、コリン作動性ニューロンのみにおけるＳＭＮ発現はｓｍｎ変異表現型を完全にレスキューするのに十分であり、運動ニューロンと筋肉の両方のＳＭＮ依存性の欠陥を非自律的にレスキューすることができる。
ＳＭＮは固有受容性ニューロンと中枢性コリン作動性ニューロンの両方に必要である。

全てのショウジョウバエ幼虫の感覚ニューロンは、興奮性中枢性ニューロンの大部分に加えてコリン作動性である（Ｓａｌｖａｔｅｒｒａ ａｎｄ Ｋｉｔａｍｏｔｏ，２００１）。これら２つの集団間における通常のＳＭＮレベルの要件を精査するために、感覚ニューロンのみにおけるトランスジェニックＳＭＮ発現がｓｍｎ変異表現型をレスキューする能力を評価した。ショウジョウバエ感覚ニューロンは主に３つのタイプに分類され、それらは５つのサブクラス（ｂｄ，Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，ＩＶ）がある多重樹状突起ニューロン（ｍｄ）、外感覚器ニューロン（ｅｓ）と弦音器官ニューロン（ｃｈ）である。感覚ニューロンＧａｌ４ドライバーのパネル（図４Ａ）を、感覚ニューロンの主要タイプにおいてのみＳＭＮを回復するために使用した。ＳＭＮを全てのｍｄニューロンとｅｓ感覚ニューロンで発現させ、ｃｈニューロンもしくは中枢ニューロンでは発現させなかった場合、ｓｍｎ変異体の律動的運動出力と誘発性ＮＭＪ ｅＥＰＳＰ振幅の両方がコントロールレベルにまで回復し、筋肉表面積はコントロールの８３．５％にまで増加した（Ｐ＜０．０５）（図４Ｄ，Ｆ，Ｇ）。しかしながら、このドライバーを用いたトランスジェニックＳＭＮの発現はｓｍｎ変異体の移動力を有意に変化させることはなかった（図４Ｅ）。対照的に、ｃｈニューロンにおけるＳＭＮの発現は如何なるｓｍｎ変異表現型をもレスキューしなかった（図４Ｄ−Ｇ）。ｓｍｎ変異体の律動的運動出力、ＮＭＪ神経伝達の欠陥をレスキューし、筋肉成長を増加させるには、ｂｄおよびＩ型ｍｄニューロンにおいてのみＳＭＮをレスキューすれば充分であることが、より小さなサブセットであるｍｄもしくはｅｓ感覚ニューロンで発現する追加のＧａｌ４ドライバー（図４Ａ）を用いてわかった（図４Ｄ，Ｆ，Ｇ）。Ｃｈａ−Ｇａｌ４を用いて、ＣＮＳおよび末梢コリン作動性ニューロンの両方においてＳＭＮを発現させると、移動力と筋肉サイズを含む全ての表現型が完全にレスキューされた（図４Ｄ−Ｇ）。これは、ｓｍｎ変異体の移動力を完璧に補正し、筋肉サイズを完全に復活させるためには、ｂｄおよびＩ型ｍｄ感覚ニューロンに加えて、ＣＮＳ内に存在する別の少なくとももう一つ追加的なコリン作動性ニューロン集団においてＳＭＮが復活しなければならないということを示している。ショウジョウバエ幼虫の運動回路への固有受容フィードバックにはｂｄおよびＩ型ｍｄ感覚ニューロンの両方が必要であることが最近実証された（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０； Ｈｕｇｈｅｓ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，２００７）。これらのニューロンがＳＭＮの枯渇により形態的な障害を受けるのかを判定するために、ｓｍｎ変異体における標識ｂｄおよびＩ型ｍｄニューロンの感覚もしくは軸索突起を調べたが、感覚プロセス（データ示さず）およびコントロールと同様にＣＮＳ内に突出しているこれらのニューロンの軸索において明らかな欠陥は発見されなかった（図４Ｂ，Ｃ）。従って、データは、固有受容性ニューロンのＳＭＮが減るとその発達や連結性よりも機能に障害を与える可能性があることを示している。
Ｓｍｎ変異表現型は胚発生後にレスキューできる。

ショウジョウバエ幼虫のニューロンは、孵化に先立つ胚発生２４時間の間に発達し、連結して機能的になる（Ｂａｉｎｅｓ，２００６）。ＳＭＮ枯渇がこの時期に神経系アセンブリーを妨害し得たかを判定するために、「ジーンスイッチ（ｇｅｎｅｓｗｉｔｃｈ）」ＲＵ４８６−薬誘導性Ｇａｌ４システムを用いてトランスジェニックＳＭＮの一時的な回復をコントロールした。胚発生完了に続いてトランスジェニックＳＭＮを発現することでｓｍｎ変異表現型をレスキューすることができたかを調べるために、ニューロン特異的ｅｌａｖ−ジーンスイッチ（ｇｅｎｅｓｗｉｔｃｈ）ドライバーを担持するｓｍｎ変異体幼虫およびコントロールを孵化直後、及び続く幼虫期を通じてＲＵ４８６含有培地に曝した（図５Ａ）。トランスジェニックＳＭＮ発現が誘発されなかった場合はｓｍｎ変異体単独の場合との違いはなかった（図５Ｃ−Ｆ）。対照的に、胚発生直後にＳＭＮ発現が誘発された場合は、３幼虫齢の筋肉サイズ、移動力、律動的運動出力および運動ニューロンｅＥＰＳＰ振幅はコントロール動物と区別がつかなかった（図５Ｂ−Ｆ）。この結果により、胚発生後のＳＭＮ発現回復は、運動回路アセンブリーに持続的欠陥を有さないｓｍｎ変異体をレスキューすることができるということが立証された。

ｓｍｎ変異体の神経系統におけるＳＭＮ発現を漸進的に幼虫期後期まで延ばした。胚孵化より４８もしくは９６時間後にトランスジェニックＳＭＮをｓｍｎ変異体に誘発した場合、コントロールに比べて筋肉容積、運動リズム欠陥および移動力が部分的にしか回復されていない表現型中間体が得られた（図５Ｃ−Ｄ）。対照的に、ｓｍｎ変異体におけるＮＭＪ ｅＥＰＳＰ振幅は、４８時間のＳＭＮ発現だけで完全にコントロールレベルにまで回復した（図５Ｂ，Ｆ）。これらの結果は、ＳＭＮ回復のタイミングに対する示差的表現型感受性を示すもので、ＮＭＪ神経伝達物質は後の段階であってもＳＭＮレベルを上昇させることで完全に補正される一方、移動力、運動リズムおよび筋肉成長のためにはより早い時期に、より長い時間高いＳＭＮレベルにさらす必要があった。
コリン作動性ニューロン活性の阻害はＳＭＮ枯渇の態様を模倣する。

ショウジョウバエ胚発生の間、運動ニューロンへのコリン作動性入力を完全に取り除くと、運動ニューロンの過剰興奮性および神経伝達増加を生じる（Ｂａｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）。ｓｍｎ変異体における運動ニューロン特性における非自律的変化は、運動回路におけるコリン作動性ニューロンからの不完全な興奮性入力によって説明されるかもしれないとの仮説が立てられた。全てのコリン作動性ニューロン活性の完全なる喪失もしくは阻害は胚致死性を生じる（Ｋｉｔａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０００）。この仮説を試すために、コリン作動性ニューロンにおける神経伝達を部分的に阻害するようデザインされたトランスジェニックツールを採用した。膜脱分極を阻害するヒト内向き整流チャンネルＫｉｒ２．１を中等度レベルで発現している系統（Ｐａｒａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）もしくはシナプスＮ−型電位開口型カルシウムチャンネルを阻害する、メンブレンテザー Ｐｌｅｃｔｒｅｕｒｙｓ毒素ＩＩ（ＰＬＴＸＩＩ）を発現する系統（Ｂ．Ｃ．，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｎｉｔａｂａｃｈ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｍ，未出版）を用いた。このアプローチの有効性を判定するために、まず、これらの導入遺伝子をＯＫ６−Ｇａｌ４を用いて運動ニューロンのみに発現させた。Ｋｉｒ２．１はｅＥＰＳＰ振幅を３２％減少させ（Ｐ＜０．００１）、一方ＰＬＴＸＩＩ発現はｅＥＰＳＰ振幅を９６％減少させ（Ｐ＜０．００１）、両導入遺伝子は神経伝達を部分的に阻害できることがわかった。

コリン作動性ニューロン機能の阻害が運動システムにもたらす影響を調べるために、Ｃｈａ−Ｇａｌ４を用いてＫｉｒ２．１もしくはＰＬＴＸＩＩを野生型動物のコリン作動性ニューロンで発現させた。どちらの導入遺伝子のコリン作動性ニューロンにおける発現も筋肉表面積には効果がなかった（図６Ｃ）。しかしながら、これらの導入遺伝子の発現は、移動力をそれぞれ４１％（Ｐ＜０．００１）と４２％（Ｐ＜０．００１）も有意に阻害した（図６Ｄ）。それらはまた自発的律動的運動活性を乱し、平均スパイク間インターバルを５４％（Ｐ＜０．０５）もしくは５９％（Ｐ＜０．０５）増加させた（図６Ｂ，Ｅ）。重要なことは，コリン作動性ニューロン機能の阻害がグルタミン酸作動性運動ニューロンのＮＭＪにおけるｅＥＰＳＰ振幅も増加させたということである（図６Ａ，Ｆ）。コリン作動性ニューロンにおけるＫｉｒ２．１発現はＮＭＪ ｅＥＰＳＰ振幅を５０％増加させ（Ｐ＜０．００１）、ＰＬＴＸ発現は４５％増加させた（Ｐ＜０．００１）（図６Ｆ）。従って、ｓｍｎ変異体における機能が低下した運動回路内のコリン作動性ニューロンと同様に、コリン作動性ニューロン活性の阻害は、運動ニューロンの神経伝達物質放出特性に及ぼす非細胞自律的効果を含む多数のｓｍｎ変異体の特徴を再現した。
実施例４． ニューロンの興奮性の増加はｓｍｎ変異表現型をレスキューする。

ｓｍｎ変異体における運動回路は機能的欠損を有するという仮説に基づいて、これらの動物においてコリン作動性ニューロンの興奮性を増加させると運動ネットワーク活動を増加させることができ、ｓｍｎ変異表現型を変えることができるかを判定するために実験が行われた。ドミナントネガティブ（ＳＤＮ）導入遺伝子でシェイカー（Ｓｈ）ＩＡ型外向きＫ＋電流を阻害すると膜興奮性を増強し、シナプス終末におけるｅＥＰＳＰの振幅および持続時間を増加させる（Ｍｏｓｃａ ｅｔ ａｌ．，２００５）。Ｋ＋チャンネル活性を阻害する遺伝学的手法はｓｍｎ変異表現型に有益であったので、Ｋ＋チャネルの薬理学的アンタゴニストも有効になりうるかを調べる実験を行った。４−アミノピリジン（４−ＡＰ）（ＦＤＡ認可された脊椎動物用の電位活性型低分子阻害剤）（Ｈａｙｅｓ， ２００７）およびショウジョウバエＫ＋チャネル（Ｗｉｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１）を調べた。幼虫の培地に４−ＡＰを加え、化合物を滴定して、野生型幼虫が致死性なしに薬に耐えうる最大用量（２ｍＭ）を同定した。幼虫期間を通じて４−ＡＰにさらすことで得られる効果をコントロールおよびｓｍｎ変異体の両方において調べた。コントロール動物において、４−ＡＰは筋肉サイズには効果がなかったが幼虫の移動力を３５％減少させ（Ｐ＜０．０１）、律動的運動活性を４０％低下させ（Ｐ＜０．０１）、ＮＭＪ ｅＥＰＳＰ振幅を２１％減少させ（Ｐ＜０．００１）、この用量は軽度の全身毒性を示した（図７Ｄ−Ｇ）。それにもかかわらず、ｓｍｎ変異体は幼虫期間を通じて４−ＡＰ含有培地で生育し、筋肉表面積が未処置ｓｍｎ変異体に比べて６６％増加した（Ｐ＜０．００１）（図７Ｄ）。移動力も５５％増加し（Ｐ＜０．０５）、４−ＡＰ処理したコントロールと有意に異なることはなかった（図７Ｅ）。ｓｍｎ変異体の律動的運動活性における欠陥は実質的に改善され、スパイク間インターバルの異常な増加は減少し、４−ＡＰ処理したコントロールよりたった３１％多いだけであった（ｐ＜０．００１）（図７Ｆ）。最後に、４−ＡＰ処理したｓｍｎ変異体のＮＭＪ ＥＰＳＰ振幅増加は２７％減少し（Ｐ＜０．００１）、４−ＡＰ処理したコントロールと有意に異なることはなかった（図７Ｇ）。従って、Ｋ＋チャネルの薬理学的な阻害は遺伝的阻害同様、ＳＭＮ枯渇がもたらす重大な結果である運動回路の興奮性障害に伴って起こるｓｍｎ変異表現型にとって確実に有益でありうる。

本発明を具体的な態様を参照して記載した。しかしながら、本発明のより広い精神と範囲を逸脱することなく、様々な修正および変更をなし得ることは明らかであろう。従って、本明細書や図面は限定する意味においてではなく説明を意図した意味において考慮する。上に記載した実験例および以下の実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。ここで本出願を通じて引用されたすべての文献、係属中の特許出願や公開された特許に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。特異なタームを採用しているが、特に記載していない場合それらはその分野で用いられるのと同様の意味で使われている。

参考文献

Claims (16)

1. 脊髄性筋萎縮症の対象を同定する工程および
   Ｋ＋チャネル遮断薬の治療有効量を対象に投与する工程
   を含む方法。
2. Ｋ＋チャネル遮断薬が、広域ベースのＫ＋チャネル遮断薬である請求項１に記載の方法。
3. Ｋ＋チャネル遮断薬が、４−アミノピリジンである請求項１に記載の方法。
4. Ｋ＋チャネル遮断薬が、４−（ジメチルアミノ）ピリジン、４−（メチルアミノ）ピリジンおよび４−（アミノメチル）ピリジンからなる群より選ばれる請求項１に記載の方法。
5. 治療有効量が、投与あたり約０．５ｍｇ〜１００ｍｇの範囲の量であり、当該遮断薬は１日１〜３回投与される請求項１に記載の方法。
6. 治療有効量が、投与あたり約１０ｍｇである請求項１に記載の方法。
7. Ｋ＋チャネル遮断薬が、経口投与用に製剤化されている請求項１に記載の方法。
8. 治療有効量が、投与あたり約０．５ｍｇ〜１０ｍｇの量である請求項１に記載の方法。
9. ４−ＡＰならびに４−（ジメチルアミノ）ピリジン、４−（メチルアミノ）ピリジンおよび４−（アミノメチル）ピリジンからなる群より選ばれる一つ以上の剤を含む医薬製剤。
10. ４−ＡＰおよび一つ以上の剤が、血液脳関門通過送達用リポソームに製剤化される請求項８の医薬製剤。
11. 血液脳関門通過送達用リポソームに製剤化された４−ＡＰを含む医薬製剤。
12. ＳＭＡが、１型ＳＭＡである請求項１に記載の方法。
13. ＳＭＡが、２型ＳＭＡである請求項１に記載の方法。
14. ＳＭＡが、３型ＳＭＡである請求項１に記載の方法。
15. Ｋ＋チャネル遮断薬が、硬膜外静脈叢、脳、脊椎または髄液へ直接投与される請求項１に記載の方法。
16. Ｋ＋チャネル遮断薬が、ドフェチリド、ソタロール、イブチリド、アジミリド、ブレチリウム、クロフィリウム、Ｅ−４０３１、ニフェカラント、テジサミルおよびセマチリドからなる群より選ばれる請求項１に記載の方法。