KR102353847B1 - 안구인두 근이영양증(opmd)의 치료용 시약 및 이의 용도 - Google Patents

안구인두 근이영양증(opmd)의 치료용 시약 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 개시 내용은 안구인두 근이영양증(OPMD) 치료를 위하여 PABPN1을 표적화하는 RNA 간섭(RNAi) 시약, 그를 포함하는 조성물, 및 OPMD를 앓거나 그에 대한 성향이 있는 개인을 치료하기 위한 이의 용도에 관한 것이다.

Description

안구인두 근이영양증(OPMD)의 치료용 시약 및 이의 용도
관련 출원 데이터
본 출원은 2016년 4월 14일 출원된 미국 가출원 62/322,745의 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 본 명세서에 참고로서 포함된다.
기술 분야
본 개시 내용은 안구인두 근이영양증(OPMD) 치료용 RNA 간섭(RNAi) 시약, 그를 포함하는 조성물, 및 OPMD를 앓거나 그에 대한 성향이 있는 개인을 치료하기 위한 이의 이용에 관한 것이다.
OPMD는 상염색체 우성 유전되고, 느리게 진행되며, 후발성인 퇴행성 근육 장애이다. 이 질환은 주로 점진적인 눈꺼풀 처짐(안검하수) 및 연하 장애(연하곤란)에 의해 특징지어진다. 인두 및 윤상인두(cricopharyngeal) 근육은 OPMD에서 특이적 표적이다. 근위사지(Proximal limb) 허약은 질환 진행의 후기 단계에서 뒤따르는 경향이 있다. 이 질환을 유발하는 돌연변이는 폴리(A) 결합 단백질 핵 1(PABPN1) 유전자의 코딩 영역에서 (GCN)n 트리뉴클레오티드 반복부의 비정상적 확장이다. 이러한 확장은 PABPN1 단백질의 N-말단에서 확장된 폴리알라닌로(polyalanine tract)를 유도한다: 10개의 알라닌이 정상 단백질에 존재하는데, 돌연변이 형태에서 11개 내지 18개의 알라닌으로 확장된다(expPABPN1). 이 질환의 주요 병리학적 특징은 expPABPN1의 핵 집합체이다. 확장된 PABPN1의 오접힘(misfolding)은 발병된 세포의 핵 내부에서 불용성 중합체성 섬유성 집합체의 축적을 초래한다. PABPN1은 집합 성향 단백질이고, OPMD에서 돌연변이 알라닌-확장된 PABPN1은 야생형 정상 단백질의 경우보다 더욱 높은 집합 속도를 갖는다. 그러나, OPMD에서 핵 집합체가 병리학적 작용 또는 세포 방어 메커니즘의 결과로서 보호 기능을 갖는지의 여부는 여전히 불명확하다.
어떤 치료, 약리작용 또는 다른 것들도 현재 OPMD에 대해 이용가능하지 않다. 증상에 대한 외과 수술은 안검하수를 부분적으로 교정하고, 중간 내지 중증으로 발병된 개인에서 연하를 개선할 수 있다. 예를 들어, 윤상인두 근절개술은 현재 이들 환자에서 연하를 개선시키는 데 이용가능한 유일한 가능한 치료이다. 그러나, 이는 종종 연하 장애 및 질식에 이어 사망을 유도하는 인두 근조직의 점진적인 악화를 교정하지는 않는다.
따라서, OPMD를 앓는 환자 및/또는 그에 대한 성향이 있는 사람에서 OPMD를 치료하기 위한 치료제에 대한 필요가 남아있다.
본 개시 내용은 부분적으로는 OPMD의 치료를 위한 치료제가 현재 존재하지 않는다는 본 발명자들의 인식에 기반한다. 따라서, 본 개시 내용은 OPMD의 원인이 되는 PABPN1 mRNA 전사물의 영역을 표적화하는 RNAi 시약을 제공한다. 본 발명자들은 이들 RNAi 시약이, 다르게는 OPMD의 원인이 되는 돌연변이 PABPN1 단백질, 즉 확장된 폴리알라닌로를 포함하는 그러한 PABPN1 단백질로 번역될 전사물 변이체를 포함하여, PABPN1 mRNA 전사물의 전사후 저해에 효과적임을 나타내었다. 예를 들어, 본 개시 내용의 예시적인 RNAi 시약은 OPMD의 시험관 내 및 생체 내 모델 모두에서 PABPN1 단백질의 발현을 저해 또는 감소시킴을 나타낸다. 나아가, 본 개시 내용은 본 개시 내용의 RNAi 시약에 의해 표적화되지 않는 mRNA 전사물을 갖는 야생형 인간 PABPN1 단백질의 발현을 위한 시약을 제공한다(이하, "PABPN1 대체 시약"). 본 발명자들은, 본 개시 내용의 RNAi 시약과 함께 투여되는 경우, PABPN1 대체 시약이 RNAi 시약에 대해 내성이고 기능성인 전사물을 갖는 PABPN1 단백질을 발현할 수 있음을 나타내었다. 본 발명자들에 의한 이들 발견은 OPMD의 치료에서 치료적 응용을 가질 수 있는 시약을 제공한다.
따라서, 본 개시 내용은 PABPN1 단백질에 상응하는 RNA 전사물의 영역에 실질적으로 상보적인 적어도 17개의 인접한 뉴클레오티드의 이펙터 서열을 포함하는 RNA를 제공하며, 여기서 RNA 전사물의 영역은 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나에 설명된다. 바람직하게는, 이펙터 서열은 길이 30개 미만의 뉴클레오티드일 것이다. 예를 들어, 적합한 이펙터 서열은 길이 17개 내지 29개의 뉴클레오티드 범위일 수 있다.
이펙터 서열은, 이펙터 서열이 실질적으로 상보적인, 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나에 나타낸 서열에 대해 6개 염기 쌍의 미스매치를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 이펙터 서열은, 이펙터 서열이 실질적으로 상보적인, 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나에 나타낸 서열에 대해 5개 염기 쌍의 미스매치를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 이펙터 서열은, 이펙터 서열이 실질적으로 상보적인, 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나에 나타낸 서열에 대해 4개 염기 쌍의 미스매치를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 이펙터 서열은, 이펙터 서열이 실질적으로 상보적인, 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나에 나타낸 서열에 대해 3개 염기 쌍의 미스매치를 포함한다. 또 다른 예에서, 이펙터 서열은, 이펙터 서열이 실질적으로 상보적인, 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나에 나타낸 서열에 대해 2개 염기 쌍의 미스매치를 포함한다. 또 다른 예에서, 이펙터 서열은, 이펙터 서열이 실질적으로 상보적인, 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나에 나타낸 서열에 대해 1개 염기 쌍의 미스매치를 포함한다. 또 다른 예에서, 이펙터 서열은 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나에 나타낸 서열 내에서 균등한 길이의 영역에 대해 100% 상보적이다.
본 개시 내용의 RNA는 단일-가닥 RNA 분자일 수 있다. 예를 들어, 단일-가닥 RNA는 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 염기 미스매치는 제외하고 서열번호 5에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열로, 단, 서열번호 5에 나타낸 서열과 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있는 이펙터 서열을 포함하는 RNA;
1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 염기 미스매치는 제외하고 서열번호 7에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열로, 단, 서열번호 7에 나타낸 서열과 듀플렉스를 형성할 수 있는 이펙터 서열을 포함하는 RNA; 및
1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 염기 미스매치는 제외하고 서열번호 9에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열로, 단, 서열번호 9에 나타낸 서열과 듀플렉스를 형성할 수 있는 이펙터 서열을 포함하는 RNA.
예를 들어, 단일-가닥 RNA는 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 8에 나타낸 서열로부터 선택되는 이펙터 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, RNA는 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열을 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 개시 내용의 RNA는 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
(i) 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 염기 미스매치는 제외하고 서열번호 5에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열로, 단, 서열번호 5에 나타낸 서열과 듀플렉스를 형성할 수 있는 이펙터 서열 및 (ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 이펙터 보체 서열을 포함하는 RNA;
(i) 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 염기 미스매치는 제외하고 서열번호 7에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열로, 단, 서열번호 7에 나타낸 서열과 듀플렉스를 형성할 수 있는 이펙터 서열 및 (ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 이펙터 보체 서열을 포함하는 RNA; 및
(i) 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 염기 미스매치는 제외하고 서열번호 9에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열로, 단, 서열번호 9에 나타낸 서열과 듀플렉스를 형성할 수 있는 이펙터 서열 및 (ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 이펙터 보체 서열을 포함하는 RNA.
또 다른 예에서, 개시 내용의 RNA는 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
서열번호 4에 나타낸 이펙터 서열 및 서열번호 4에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열을 포함하는 RNA;
서열번호 6에 나타낸 이펙터 서열 및 서열번호 6에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열을 포함하는 RNA; 및
서열번호 8에 나타낸 이펙터 서열 및 서열번호 8에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열을 포함하는 RNA.
예를 들어, 본 개시 내용의 RNA의 이펙터 보체 서열은 상응하는 이펙터 서열에 대하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 미스매치를 포함할 수 있으며, 단, 동족 이펙터 및 이펙터 보체 서열은 듀플렉스를 형성할 수 있다.
또 다른 예에서, 본 개시 내용의 RNA는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된다:
서열번호 4에 나타낸 이펙터 서열 및 서열번호 5에 나타낸 이펙터 보체 서열을 포함하는 RNA;
서열번호 6에 나타낸 이펙터 서열 및 서열번호 7에 나타낸 이펙터 보체 서열을 포함하는 RNA; 및
서열번호 8에 나타낸 이펙터 서열 및 서열번호 9에 나타낸 이펙터 보체 서열을 포함하는 RNA.
따라서, 본 개시 내용의 RNA는 짧은 간섭 RNA(siRNA) 듀플렉스 또는 이중-가닥 RNA(dsRNA)의 형태로 제공될 수 있음을 이해될 것이다.
대안적으로는, 본 개시 내용의 RNA는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 형태로 제공될 수 있다. shRNA로서 제공되는 경우, 본 개시 내용의 RNA는 이펙터 서열과 이펙터 보체 서열 사이에 위치된 루프 서열을 포함할 수 있다. 적합한 루프 서열은 당업계에서 알려진 것들로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 본 개시 내용에 따른 shRNA는 본 명세서에서 기재된 이펙터 및 이펙터 보체 서열과 그 사이에 위치된 스템(stem) 루프 서열과의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일 예에서, 본 개시 내용의 RNA는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(i) 서열번호 10에 나타낸 이펙터 서열, (ii) 서열번호 10에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열, 및 (iii) 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열 사이에 위치된 스템 루프 서열을 포함하는 shRNA;
(i) 서열번호 12에 나타낸 이펙터 서열, (ii) 서열번호 12에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열, 및 (iii) 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열 사이에 위치된 스템 루프 서열을 포함하는 shRNA; 및
(i) 서열번호 14에 나타낸 이펙터 서열, (ii) 서열번호 14에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열, 및 (iii) 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열 사이에 위치된 스템 루프 서열을 포함하는 shRNA.
일 예에서, 본 개시 내용의 RNA는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(i) 서열번호 10에 나타낸 이펙터 서열, (ii) 서열번호 11에 나타낸 이펙터 보체 서열, 및 (iii) 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열 사이에 위치된 스템 루프 서열을 포함하는 shRNA;
(i) 서열번호 12에 나타낸 이펙터 서열, (ii) 서열번호 13에 나타낸 이펙터 보체 서열, 및 (iii) 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열 사이에 위치된 스템 루프 서열을 포함하는 shRNA; 및
(i) 서열번호 14에 나타낸 이펙터 서열, (ii) 서열번호 15에 나타낸 이펙터 보체 서열, 및 (iii) 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열 사이에 위치된 스템 루프 서열을 포함하는 shRNA.
예를 들어, 본 개시 내용에 따른 shRNA는 서열번호 16 내지 서열번호 21 중 하나에 나타낸 서열을 포함할 수 있다.
본 개시 내용에 따른 RNA는 OPMD를 치료하기 위한 기타 다른 치료제와 함께 병용되거나 사용될 수 있음은 당업자에 의해 이해될 수 것이다. 따라서, 본 개시 내용은 OPMD 치료를 위한 하나 이상의 기타 다른 약제와 조합되어 본 명세서에 기재된 바와 같은 RNA를 제공한다. 일 예에서,
(a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 RNA; 및
(b) (i) 본 명세서에 기재된 바와 같은 RNA; 또는
(ii) OPMD의 원인이 되는 PABPN1 단백질에 상응하는 RNA 전사물의 영역에 실질적으로 상보적인, 적어도 17개의 인접한 뉴클레오티드의 이펙터 서열을 포함하는 RNA
로부터 선택되는 적어도 하나의 RNA;
를 포함하는 복수의 RNA가 제공되며, 여기서 (a)의 RNA 및 (b)의 RNA는 상이한 이펙터 서열을 포함한다.
일 예에서, (b)의 RNA는 본 명세서에 기재된 바와 같은 RNA이다.
일 예에서, 본 개시 내용의 복수의 RNA는:
(a) 본 명세서에 기재된 것과 같은, 서열번호 1에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적인 적어도 17개의 인접한 뉴클레오티드의 이펙터 서열을 포함하는 제1 RNA;
(b) 본 명세서에 기재된 것과 같은, 서열번호 2에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적인 적어도 17개의 인접한 뉴클레오티드의 이펙터 서열을 포함하는 제2 RNA; 및
(c) 본 명세서에 기재된 것과 같은, 서열번호 3에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적인 적어도 17개의 인접한 뉴클레오티드의 이펙터 서열을 포함하는 제3 RNA
로부터 선택되는 적어도 2개의 RNA를 포함한다.
일 예에서, 복수의 RNA 중 적어도 하나 또는 각각은 본 명세서에 기재된 ssRNA로부터 선택되는 ssRNA이다. 예를 들어, 본 개시 내용의 복수의 RNA는:
(a) 서열번호 4에 나타낸 이펙터 서열을 포함하는 제1 RNA;
(b) 서열번호 6에 나타낸 이펙터 서열을 포함하는 제2 RNA; 및
(c) 서열번호 8에 나타낸 이펙터 서열을 포함하는 제3 RNA
로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 ssRNA를 포함할 수 있다.
일 예에서, 복수의 RNA 중 적어도 하나 또는 각각은 본 명세서에 기재된 dsRNA로부터 선택되는 dsRNA이다. 예를 들어, 본 개시 내용의 복수의 RNA는:
(a) 서열번호 4에 나타낸 이펙터 서열 및 서열번호 4에 나타낸 서열에 대해 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열, 예를 들어 서열번호 5에 나타낸 서열을 포함하는 제1 RNA;
(b) 서열번호 6에 나타낸 이펙터 서열 및 서열번호 6에 나타낸 서열에 대해 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열, 예를 들어 서열번호 7에 나타낸 서열을 포함하는 제2 RNA; 및
(c) 서열번호 8에 나타낸 이펙터 서열 및 서열번호 8에 나타낸 서열에 대해 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열, 예를 들어 서열번호 9에 나타낸 서열을 포함하는 제3 RNA
로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 dsRNA를 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 본 명세서에 기재된 복수의 RNA 중 적어도 하나 또는 각각의 RNA는 shRNA 형태로 존재할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 복수의 shRNA 각각은 상응하는 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열 사이에 위치된 스템 루프 서열을 포함하여 shRNA가 단일한 인접 서열을 형성하도록 할 것이다. 예를 들어, 본 개시 내용의 복수의 shRNA는:
(a) (i) 서열번호 10에 나타낸 이펙터 서열, (ii) 서열번호 10에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열, 예를 들어 서열번호 11에 나타낸 서열, 및 (iii) 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열 사이에 위치된 스템 루프 서열을 포함하는 제1 RNA;
(b) (i) 서열번호 12에 나타낸 이펙터 서열, (ii) 서열번호 12에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열, 예를 들어 서열번호 13에 나타낸 서열, 및 (iii) 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열 사이에 위치된 스템 루프 서열을 포함하는 제2 RNA; 및
(c) (i) 서열번호 14에 나타낸 이펙터 서열, (ii) 서열번호 14에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열, 예를 들어 서열번호 15에 나타낸 서열, 및 (iii) 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열 사이에 위치된 스템 루프 서열을 포함하는 제3 RNA
로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 RNA를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 개시 내용의 복수의 RNA는 본 명세서에 기재된 바와 같은 제1 RNA 및 제2 RNA를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 본 개시 내용의 복수의 RNA는 본 명세서에 기재된 바와 같은 제1 RNA 및 제3 RNA를 포함한다. 또 다른 예에서, 본 개시 내용의 복수의 RNA는 본 명세서에 기재된 바와 같은 제2 RNA 및 제3 RNA를 포함한다. 또 다른 예에서, 본 개시 내용의 복수의 RNA는 본 명세서에 기재된 바와 같은 제1 RNA, 제2 RNA 및 제3 RNA를 포함한다.
본 개시 내용에 따른 복수의 RNA는 10개 이하의 RNA, 예컨대 2개의 RNA 또는 3개의 RNA 또는 4개의 RNA 또는 5개의 RNA 또는 6개의 RNA 또는 7개의 RNA 또는 8개의 RNA 또는 9개의 RNA 또는 10개의 RNA를 포함할 수 있다. 일 예에서, 복수의 RNA는 본 명세서에 기재된 2개의 RNA를 포함한다. 또 다른 예에서, 복수의 RNA는 본 명세서에 기재된 3개의 RNA를 포함한다.
복수의 shRNA가 제공되는 본 개시 내용의 일 예에 따르면, 복수는:
(i) 서열번호 16에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA; 및
(ii) 서열번호 18에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA
를 포함하거나 이로 이루어진다.
복수의 shRNA가 제공되는 본 개시 내용의 일 예에 따르면, 복수는:
(i) 서열번호 16에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA; 및
(ii) 서열번호 20에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA
를 포함하거나 이로 이루어진다.
복수의 shRNA가 제공되는 본 개시 내용의 일 예에 따르면, 복수는:
(i) 서열번호 18에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA; 및
(ii) 서열번호 20에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA
를 포함하거나 이로 이루어진다.
복수의 shRNA가 제공되는 본 개시 내용의 일 예에 따르면, 복수는:
(i) 서열번호 16에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA;
(ii) 서열번호 18에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA; 및
(iii) 서열번호 20에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA
를 포함하거나 이로 이루어진다.
일 예에서, 본 명세서에 기재된 복수의 RNA는 단일 조성물로서 함께 제공될 수 있다.
일 예에서, 본 명세서에 기재된 복수의 RNA는 다중 조성물로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 복수의 RNA 각각은 별도로 제공될 수 있다. 대안적으로, 복수 중 적어도 하나의 RNA는 별도로 제공될 수 있고, 복수 중 둘 이상은 조성물 내에 함께 제공될 수 있다.
본 개시 내용의 RNA 또는 각각의 RNA는 핵산으로부터 전사될 수 있는 DNA-지향 RNA(ddRNA)일 수 있다. 따라서, 본 개시 내용은 또한 본 개시 내용의 RNA를 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 DNA-지향 RNAi(ddRNAi) 구조물을 제공하며, 예를 들어 여기서 RNA는 본 명세서에 기재된 바와 같은 shRNA이다.
shRNA를 인코딩하는 DNA 서열은 이펙터 서열과 이펙터 보체 서열 사이에 위치된 루프 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 개시 내용의 shRNA를 인코딩하는 DNA 서열은 서열번호 16 내지 서열번호 21 중 어느 하나에 나타낸 서열로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 예에서, 본 개시 내용의 shRNA를 인코딩하는 DNA 서열은 또한 3' 말단에서 종결자 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 본 개시 내용은 복수의 shRNA를 발현할 수 있는 ddRNAi 구조물을 제공한다. 예를 들어, 본 개시 내용의 ddRNAi 구조물은 본 개시 내용의 복수의 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 DNA 서열(들)을 포함하는 핵산을 포함할 수 있고, 예를 들어, 여기서 RNA 각각은 본 명세서에 기재된 바와 같은 shRNA이다.
일 예에서, ddRNAi 구조물은:
(a) (i) 서열번호 1에 나타낸 PABPN1 서열에 실질적으로 상보적인 적어도 17개의 인접한 뉴클레오티드의 영역을 포함하는 이펙터 서열; 및
(ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열
을 포함하는 shRNA 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 제1 핵산;
(b) (i) 서열번호 2에 나타낸 PABPN1 서열에 실질적으로 상보적인 적어도 17개의 인접한 뉴클레오티드의 영역을 포함하는 이펙터 서열; 및
(ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열
을 포함하는 shRNA 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 제2 핵산; 및
(c) (i) 서열번호 3에 나타낸 PABPN1 서열에 실질적으로 상보적인 적어도 17개의 인접한 뉴클레오티드의 영역을 포함하는 이펙터 서열; 및
(ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열
을 포함하는 shRNA 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 제3 핵산
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 둘의 핵산을 포함할 수 있다.
일 예에서, 제1 핵산 내에 포함된 DNA 서열은 서열번호 10에 나타낸 이펙터 서열 및 서열번호 11에 나타낸 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA 서열을 인코딩한다.
일 예에서, 제2 핵산 내에 포함된 DNA 서열은 서열번호 12에 나타낸 이펙터 서열 및 서열번호 13에 나타낸 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA 서열을 인코딩한다.
일 예에서, 제3 핵산 내에 포함된 DNA 서열은 서열번호 14에 나타낸 이펙터 서열 및 서열번호 15에 나타낸 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA 서열을 인코딩한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 shRNA를 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 각각의 핵산은 동족 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열 사이에 위치된 루프 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다.
일 예에서, 제1 핵산은 서열번호 16 또는 서열번호 17에 나타낸 shRNA 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함한다.
일 예에서, 제2 핵산은 서열번호 18 또는 서열번호 19에 나타낸 shRNA 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함한다.
일 예에서, 제3 핵산은 서열번호 20 또는 서열번호 21에 나타낸 shRNA 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 각각의 shRNA는 선택적으로 shRNA의 3' 말단에서 2개의 인접 우라실(UU)을, 예를 들어 RNA Pol III 프로모터로부터의 전사 종결의 결과로서 추가로 포함할 수 있다.
각각의 핵산은 또한 shRNA를 인코딩하는 DNA 서열의 3' 말단에서 종결자 서열을 포함할 수 있다.
일 예에서, 복수의 RNA를 발현할 수 있는 ddRNAi 구조물은 본 명세서에 기재된 제1 핵산 및 본 명세서에 기재된 제2 핵산을 포함한다. 일 예에서, 복수의 RNA를 발현할 수 있는 ddRNAi 구조물은 본 명세서에 기재된 제1 핵산 및 본 명세서에 기재된 제3 핵산을 포함한다. 일 예에서, 복수의 RNA를 발현할 수 있는 ddRNAi 구조물은 본 명세서에 기재된 제2 핵산 및 본 명세서에 기재된 제3 핵산을 포함한다. 일 예에서, 복수의 RNA를 발현할 수 있는 ddRNAi 구조물은 본 명세서에 기재된 제1 핵산, 본 명세서에 기재된 제2 핵산 및 본 명세서에 기재된 제3 핵산을 포함한다.
본 개시 내용의 3개의 shRNA를 발현할 수 있는 예시적인 ddRNAi 구조물은:
서열번호 16에 나타낸 shRNA 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 제1 핵산;
서열번호 18에 나타낸 shRNA 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 제2 핵산; 및
서열번호 20에 나타낸 shRNA 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 제3 핵산
을 포함한다.
본 명세서에 기재된 각각의 shRNA는 선택적으로 shRNA의 3' 말단에서 2개의 인접한 우라실(UU)을, 예를 들어 RNA Pol III 프로모터로부터의 전사 종결의 결과로서 추가로 포함할 수 있다.
일 예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 ddRNAi 구조물은 본 개시 내용의 shRNA를 인코딩하는 핵산 또는 각각의 핵산에 작동적으로 연결된 단일 프로모터를 포함한다.
또 다른 예에서, 본 개시 내용의 shRNA를 인코딩하는 각각의 핵산은 별개의 프로모터에 작동적으로 연결된다. 예를 들어, 프로모터(들)는 shRNA(들)를 인코딩하는 개별적인 DNA 서열(들)의 상류에 위치된다. 복수의 프로모터를 포함하는 ddRNAi 구조물에서, 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다. 예시적인 프로모터는 예를 들어, U6 및 H1 프로모터와 같은, RNA pol III 프로모터이다.
본 개시 내용의 3개의 shRNA를 발현할 수 있는 ddRNAi 구조물의 예에 따르면, ddRNAi 구조물은:
(a) 서열번호 16에 나타낸 shRNA 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 제1 핵산의 상류의 U6-1 프로모터;
(b) 서열번호 18에 나타낸 shRNA 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 제2 핵산의 상류의 U6-9 프로모터; 및
(c) 서열번호 20에 나타낸 shRNA 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 제3 핵산의 상류의 H1 프로모터
를 포함할 수 있다.
일 예에서, 본 개시 내용의 3개의 shRNA를 발현할 수 있는 ddRNAi 구조물은 서열번호 22에 나타낸 서열을 포함한다. 일 예에서, 본 개시 내용의 3개의 shRNA를 발현할 수 있는 ddRNAi 구조물은 서열번호 23에 나타낸 서열을 포함한다.
또 다른 예에서, 본 개시 내용은 복수의 ddRNAi 구조물을 제공하며, 각각의 ddRNAi 구조물은 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 shRNA를 발현할 수 있다. 복수의 ddRNAi 구조물은:
(a) (i) 서열번호 1에 나타낸 PABPN1 서열에 실질적으로 상보적인 적어도 17개의 인접한 뉴클레오티드의 영역을 포함하는 이펙터 서열; 및
(ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열
을 포함하는 shRNA 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 제1 ddRNAi 구조물;
(b) (i) 서열번호 2에 나타낸 PABPN1 서열에 실질적으로 상보적인 적어도 17개의 인접한 뉴클레오티드의 영역을 포함하는 이펙터 서열; 및
(ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열
을 포함하는 shRNA 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 제2 ddRNAi 구조물; 및
(c) (i) 서열번호 3에 나타낸 PABPN1 서열에 실질적으로 상보적인 적어도 17개의 인접한 뉴클레오티드의 영역을 포함하는 이펙터 서열; 및
(ii) 이펙터 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열
을 포함하는 shRNA 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 제3 ddRNAi 구조물
로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 ddRNAi 구조물을 포함할 수 있다.
일 예에서, 제1 ddRNAi 구조물은 서열번호 10에 나타낸 이펙터 서열 및 서열번호 11에 나타낸 이펙터 보체 서열을 인코딩하는 DAN 서열을 포함하는 핵산을 포함한다.
일 예에서, 제2 ddRNAi 구조물은 서열번호 12에 나타낸 이펙터 서열 및 서열번호 13에 나타낸 이펙터 보체 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산을 포함한다.
일 예에서, 제3 ddRNAi 구조물은 서열번호 14에 나타낸 이펙터 서열 및 서열번호 15에 나타낸 이펙터 보체 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산을 포함한다.
복수 개 중 각각의 ddRNAi 구조물에서, 개별적인 shRNA를 인코딩하는 DNA 서열은 개별적인 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열 사이에 위치된 루프 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다.
일 예에서, 제1 ddRNAi 구조물은 서열번호 16 또는 서열번호 17에 나타낸 shRNA 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산을 포함한다.
일 예에서, 제2 ddRNAi 구조물은 서열번호 18 또는 서열번호 19에 나타낸 shRNA 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산을 포함한다.
일 예에서, 제3 ddRNAi 구조물은 서열번호 20 또는 서열번호 21에 나타낸 shRNA 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산을 포함한다.
각각의 ddRNAi 구조물에서, 핵산 또는 각각의 핵산은 shRNA를 인코딩하는 DNA 서열의 3' 말단에서 종결 서열을 또한 포함할 수 있다.
ddRNAi 구조물로부터 발현된 각각의 shRNA는 또한 선택적으로 shRNA의 3' 말단에서 2개의 인접 우라실(UU)을, 예를 들어 RNA Pol III 프로모터로부터의 전사 종결의 결과로서 추가로 포함할 수 있다.
일 예에서, 복수의 ddRNAi 구조물은 본 명세서에서 기재된 제1 ddRNAi 구조물 및 본 명세서에서 기재된 제2 ddRNAi 구조물을 포함한다. 일 예에서, 복수의 ddRNAi 구조물은 본 명세서에서 기재된 제1 ddRNAi 구조물 및 본 명세서에서 기재된 제3 ddRNAi 구조물을 포함한다. 일 예에서, 복수의 ddRNAi 구조물은 본 명세서에서 기재된 제2 ddRNAi 구조물 및 본 명세서에서 기재된 제3 ddRNAi 구조물을 포함한다. 일 예에서, 복수의 ddRNAi 구조물은 본 명세서에서 기재된 제1 ddRNAi 구조물, 본 명세서에서 기재된 제2 ddRNAi 구조물, 및 본 명세서에서 기재된 제3 ddRNAi 구조물을 포함한다.
예시적인 복수의 ddRNAi 구조물은:
서열번호 16에 나타낸 shRNA 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 제1 ddRNAi 구조물;
서열번호 18에 나타낸 shRNA 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 제2 ddRNAi 구조물; 및
서열번호 20에 나타낸 shRNA 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 제3 ddRNAi 구조물
을 포함한다.
복수의 ddRNAi 구조물 중 각각의 ddRNAi 구조물은 본 개시 내용의 shRNA를 인코딩하는 핵산 또는 각각의 핵산에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함할 수 있다.
복수의 ddRNAi 구조물 중 하나 이상이 하나 초과의 shRNA를 발현할 수 있는 예에 따르면, shRNA를 인코딩하는 각각의 핵산은 별개의 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 프로모터(들)는 shRNA(들)를 인코딩하는 개별적인 DNA 서열(들)의 상류에 위치된다. 복수의 프로모터를 포함하는 ddRNAi 구조물에서, 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다. 예시적인 프로모터는, 예를 들어 U6 및 H1 프로모터와 같은 RNA pol III 프로모터이다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 ddRNAi 구조물 또는 각각의 ddRNAi 구조물은 발현 벡터 내에 포함될 수 있다.
복수의 ddRNAi 구조물이 존재하는 예에 따르면, ddRNAi를 포함하는 복수의 발현 벡터가 제공될 수 있다. 일 예에서, 복수의 발현 벡터들 중 하나 이상은 본 명세서에 개시된 바와 같은 복수의 ddRNAi 구조물을 포함한다. 또 다른 예에서, 복수 중 각각의 ddRNAi 구조물은 별개의 발현 벡터 내에 포함된다. 본 문단에서 이전의 임의의 방식에서, 복수의 발현 벡터는 본 개시 내용에 따른 복수의 shRNA를 집합적으로 발현할 수 있다.
본 개시 내용은 본 명세서에 기재된 바와 ddRNAi 구조물, 복수의 ddRNAi 구조물, 발현 벡터 및/또는 복수의 발현 벡터를 포함하는 조성물을 또한 제공한다. 일 예에서, 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 또한 포함할 수 있다
일 예에서, 개시 내용의 조성물은 ddRNAi 구조물(들)에 의해 인코딩된 각각의 shRNA에 의해 표적화되지 않은 mRNA 전사물을 갖는 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산을 조성물 내에 추가로 포함한다. 예를 들어, 기능성 PABPN1 단백질은, 예를 들어 서열번호 25에 나타낸 서열을 갖는, 야생형 인간 PABPN1 단백질이다.
일 예에서, 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은, 그로부터 전사된 mRNA가 조성물 내에서 ddRNAi 구조물(들)에 의해 인코딩된 shRNA 또는 각각의 shRNA에 의해 표적화되지 않도록 코돈-최적화된다. 일 예에서, 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 서열번호 24에 나타낸 서열을 포함한다. 일 예에서, 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 5' 말단에서 코작 서열을 또한 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 발현 벡터 내에 포함될 것이다.
ddRNAi 구조물 또는 각각의 ddRNAi 구조물이 단일 발현 벡터 내에 포함되는 예에 따르면, ddRNAi 구조물(들) 및 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 동일한 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 대안적으로는, ddRNAi 구조물(들) 및 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 상이한 발현 벡터 내에 포함될 수 있다.
본 개시 내용의 복수의 ddRNAi 구조물이 복수의 발현 벡터 내에 포함되는 예에 따르면, 각각의 ddRNAi 구조물은 상이한 발현 벡터 내에 포함될 수 있고, 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 ddRNAi 구조물을 포함하는 적어도 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다.
일 예에서, 발현 벡터 또는 각각의 발현 벡터는 플라스미드 또는 미니서클(minicircle)이다.
일 예에서, 플라스미드 또는 미니서클 또는 발현 벡터 또는 ddRNAi 구조물 또는 각각의 플라스미드 또는 미니서클 또는 발현 벡터 또는 ddRNAi 구조물은 양이온성 DNA 결합 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌이민과 복합체화된다.
또 다른 예에서, 발현 벡터 또는 각각의 발현 벡터는 바이러스성 벡터이다. 예를 들어, 바이러스성 벡터는 아데노-연관 바이러스성(AAV) 벡터, 레트로바이러스성 벡터, 아데노바이러스성 벡터(AdV) 및 렌티바이러스성(LV) 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시 내용은 하나 이상의 RNA, 예를 들어 PABPN1 단백질의 야생형 mRNA 전사물을 표적화하는 것으로서 본 명세서에 기재된, shRNA에 의해 표적화되지 않는 mRNA 전사물을 갖는 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산을 또한 제공한다. 일 예에서, 본 개시 내용의 핵산에 의해 인코딩된 기능성 PABPN1 단백질은 예를 들어 서열번호 25에 나타낸 서열을 갖는 야생형 인간 PABPN1 단백질과 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 본 개시 내용의 핵산은, 그로부터 전사된 mRNA가, 하나 이상의 RNA, 예를 들어 PABPN1 단백질의 야생형 mRNA 전사물을 표적화하는 것으로서 본 명세서에서 기재된, shRNA에 의해 표적화되지 않도록 코돈-최적화될 수 있다. 일 예에서, 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 서열번호 24에 나타낸 서열을 포함한다. 일 예에서, 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 5' 말단에서 코작 서열을 또한 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 발현 벡터는 본 개시 내용의 ddRNAi의 맥락에서 상기 본 명세서에서 기재된 바와 같은 임의의 발현 벡터일 수 있다. 또한 본 명세서에서 상기 기재된 바와 같이, 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터는 본 개시 내용의 하나 이상의 ddRNAi 구조물(들)을 포함할 수도 있다.
본 개시 내용의 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은, RNA, 복수의 RNA, ddRNAi 구조물, 복수의 ddRNAi 구조물, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터 및/또는 본 명세서에 기재된 조성물과 조합되어, 또는 이들로 이미 치료를 받은 피험자에서, OPMD를 치료하는 데 유용할 수 있다.
본 개시 내용은 피험자에서 OPMD의 원인인 PABPN1 단백질의 발현 억제 방법을 또한 제공하며, 상기 방법은 RNA, 복수의 RNA, ddRNAi 구조물, 복수의 ddRNAi 구조물, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터 및/또는 본 명세서에 기재된 조성물을 피험자에게 투여하는 것을 포함한다.
본 개시 내용은 OPMD를 앓고 있는 피험자에서 OPMD의 치료 방법을 또한 제공하며, 상기 방법은 RNA, 복수의 RNA, ddRNAi 구조물, 복수의 ddRNAi 구조물, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터 및/또는 본 명세서에 기재된 조성물을 피험자에게 투여하는 것을 포함한다. OPMD의 치료방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산을 피험자에게 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 개시 내용은 OPMD를 앓고 있는 피험자에서 OPMD의 치료 방법을 또한 제공하며, 상기 방법은 본 개시 내용의 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산을 피험자에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 피험자는 RNA, 복수의 RNA, ddRNAi 구조물, 복수의 ddRNAi 구조물, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터 및/또는 본 명세서에 기재된 조성물을 미리 투여받았다. 본 개시 내용은 OPMD를 앓고 있는 피험자에서 OPMD의 치료 방법을 또한 제공하며, 상기 방법은 피험자에게:
(a) OPMD의 원인이 되는 PABPN1 단백질의 발현을 억제하는 하나 이상의 약제로서, 상기 약제(들)는 (i) RNA, 복수의 RNA, ddRNAi 구조물, 복수의 ddRNAi 구조물, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터 및/또는 본 명세서에 기재된 조성물로부터 선택되는 약제; 및
(b) (a)의 약제에 의해 표적화되지 않은 mRNA 전사물을 갖는 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터
를 투여하는 것을 포함한다.
일 예에서, 기능성 PABPN1 단백질은 예를 들어 서열번호 25에 나타낸 서열을 갖는 야생형 인간 PABPN1 단백질의 아미노산 서열을 포함한다.
일 예에서, 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 그로부터 전사된 mRNA가 RNAi를 통해 작용하는 (a)의 약제에 의해 표적화되지 않도록 코돈-최적화된다. 일 예에서, 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 서열번호 24에 나타낸 서열을 포함한다. 일 예에서, 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 5' 말단에서 코작 서열을 또한 포함할 수 있다.
일 예에서, (a)의 약제(들) 및 (b)의 발현 벡터는 피험자에게 함께 투여된다. 일 예에서, (a)의 약제(들) 및 (b)의 발현 벡터는 별도로 그러나 동시에 피험자에게 투여된다. 일 예에서, (a)의 약제(들) 및 (b)의 발현 벡터는 피험자에게 연속하여 투여된다.
본 개시 내용은:
(a) OPMD의 원인인 PABPN1 단백질의 발현을 저해하기 위한 하나 이상의 약제로, (i) RNA, 복수의 RNA, ddRNAi 구조물, 복수의 ddRNAi 구조물, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터 및/또는 본 명세서에 기재된 조성물로부터 선택되는 약제(들); 및
(b) (a)의 약제에 의해 표적화되지 않은 mRNA 전사물을 갖는 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터
를 포함하는 키트를 또한 제공한다.
일 예에서, 기능성 PABPN1 단백질은, 예를 들어 서열번호 25에 나타낸 서열을 갖는 야생형 인간 PABPN1 단백질이다.
일 예에서, 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 그로부터 전사된 mRNA가 RNAi를 통해 작용하는 (a)의 약제에 의해 표적화되지 않도록 코돈-최적화된다. 일 예에서, 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 서열번호 24에 나타낸 서열을 포함한다. 일 예에서, 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 5' 말단에서 코작 서열을 또한 포함할 수 있다.
일 예에서, 키트는 본 개시 내용의 방법에서의 이용 지시사항을 추가로 포함한다.
본 개시 내용은 RNA, 복수의 RNA, ddRNAi 구조물, 복수의 ddRNAi 구조물, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터 및/또는 본 명세서에 기재된 조성물의, 피험자에서 OPMD를 치료 또는 예방하기 위한 의약 제조에서의 용도를 또한 제공한다.
본 개시 내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산의, 피험자에서 OPMD를 치료 또는 예방하기 위한 의약 제조에서의 용도를 또한 제공한다. 이러한 예에 따른 OPMD의 치료는, RNA, 복수의 RNA, ddRNAi 구조물, 복수의 ddRNAi 구조물, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터 및/또는 본 명세서에 기재된 조성물로부터 선택되는 RNAi를 통하여 작용하는 약제와 함께 의약을 피험자에게 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 RNAi를 통하여 작용하는 약제에 의해 표적화되지 않는 mRNA 전사물을 갖는다. 또 다른 예를 따라, OPMD의 치료는 RNA, 복수의 RNA, ddRNAi 구조물, 복수의 ddRNAi 구조물, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터 및/또는 본 명세서에 기재된 조성물로부터 선택되는 RNAi를 통해 작용하는 약제를 이미 투여받은 피험자에게, 의약을 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 RNAi를 통하여 작용하는 약제에 의해 표적화되지 않는 mRNA 전사물을 갖는다.
본 개시 내용은 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터의, 피험자에서 OPMD를 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에서의 용도를 또한 제공하며, 여기서 의약은 RNA, 복수의 RNA, ddRNAi 구조물, 복수의 ddRNAi 구조물, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터 및/또는 본 명세서에 기재된 조성물로부터 선택되는 RNAi를 통해 작용하는 약제를 포함하고, 여기서 기능성 PABPN1 단백질은 약제에 의해 표적화되지 않는 mRNA 전사물을 갖는다.
일 예에서, 기능성 PABPN1 단백질은 예를 들어 서열번호 25에 나타낸 서열을 갖는 야생형 인간 PABPN1 단백질의 아미노산 서열을 갖는다.
일 예에서, 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은, 그로부터 전사된 mRNA가 약제에 의해 표적화되지 않도록 코돈-최적화된다. 일 예에서, 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 서열번호 24에 나타낸 서열을 포함한다. 일 예에서, 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 5' 말단에서 코작 서열을 또한 포함할 수 있다.
상기 예들 각각에서, 치료될 피험자는 OPMD를 앓고 있거나, OPMD에 대한 유전적인 성향이 있을 수 있다.
본 개시 내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 RNA, 복수의 RNA, ddRNAi 구조물, 복수의 ddRNAi 구조물, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터, 조성물 및/또는 키트를 치료 용도를 위해 또한 제공한다. 예를 들어, RNA, 복수의 RNA, ddRNAi 구조물, 복수의 ddRNAi 구조물, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터, 조성물 및/또는 키트는 피험자 및/또는 본 명세서에서 개시된 방법에서 OPMD의 치료에서의 이용을 위한 것일 수 있다.
본 개시 내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산을 치료에서의 이용을 위해 또한 제공한다. 예를 들어, 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 피험자에서 OPMD 치료에서의 이용 및/또는 본 명세서에 개시된 방법에서의 이용을 위한 것일 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 예에 따른 OPMD의 치료는 OPMD의 원인이 되는 PABPN1 단백질, 즉 피험자에서 확장된 폴리알라닌로를 갖는 PABPN1 단백질의 발현의 하나 이상의 감소 또는 억제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로 본 명세서에 기재된 임의의 예에 따른 OPMD의 치료는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산을 이용한, 피험자에서 PABPN1 단백질의 대체를 포함할 수 있다. 예를 들어, PABPN1 단백질의 대체는 야생형 PABPN1 단백질의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일 예에서, 치료는 OPMD의 원인이 되는 PABPN1 단백질의 발현을 감소 또는 억제시킬 것이며, 피험자에서 정상 길이의 폴리아닐린 잔기를 갖는 기능성 PABPN1 단백질을 대체할 것이다.
도 1은 후보 dsRNA 서열(dsRNA1, dsRNA2 및 dsRNA3)로 형질감염 후 건강한(LHCNM2) 또는 OPMD에 발병된(KMOP6/4) 인간 근원세포에서 인간 PABPN1의 발현 수준을 나타낸다.
도 2는 PABPN1 mRNA에 대하여 단일 및 트리시스트로닉(tricistronic) shRNA(들)를 발현하는 AAV 플라스미드로 형질감염 후의 HEK293T 세포에서 PABPN1 녹다운(knockdown) 효율을 예시한다. PABPN1 발현은 GAPDH 발현에 상대적으로 나타내었다(*p<0.05, ***p<0.005).
도 3a는 (A) pAAV-HBVpol, (B) pAAV-shRNAx3-long, (C) pAAV mut-PABPN1-FLAG, 또는 (D) pAAV Opt-hPABPN1-MYC로 형질감염된 HEK293T 세포 내에서 발현된 GAPDH 단백질에 대한 PABPN1 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯이다.
도 3b는 왼쪽에서 오른쪽으로, (i) 형질감염되지 않은 대조구 HEK293T 세포, (ii) pAAV-HBVpol로 형질감염된 HEK293T 세포, (iii) pAAV-shRNA5로 형질감염된 HEK293T 세포, (iv) pAAV-shRNA5 및 pAAV mut-PABPN1-FLAG로 형질감염된 HEK293T 세포, (v) pAAV-shRNA5 및 pAAV Opt-hPABPN1-MYC로 형질감염된 HEK293T 세포, (vi) pAAV-shRNAx3-short로 형질감염된 HEK293T 세포, (vii) pAAV-shRNAx3-short 및 pAAV mut-PABPN1-FLAG로 형질감염된 HEK293T 세포, (viii) pAAV-shRNAx3-short 및 pAAAV Opt-hPABPN1-MYC로 형질감염된 HEK293T 세포, (ix) pAAV-shRNAx3-long으로 형질감염된 HEK293T 세포, (x) pAAV-shRNAx3-long 및 pAAV mut-PABPN1-FLAG로 형질감염된 HEK293T 세포, 및 (xi) pAAV-shRNAx3-long 및 pAAV Opt-hPABPN1-MYC로 형질감염된 HEK293T 세포에서 형질감염되지 않은 HEK293T 세포 내 PABPN1 발현에 대해 정규화된 평균 PABPN1 발현을 예시한다(**p<0.01, ***p<0.005).
도 3c는 왼쪽에서 오른쪽으로, (i) pAAV-HBVpol, (ii) pAAV mut-PABPN1-FLAG 및 pAAV-HBVpol, (iii) pAAV Opt-hPABPN1-MYC 및 pAAV-HBVpol, (iv) pAAV-shRNAx3-long, (v) pAAV mut-PABPN1-FLAG 및 pAAV-shRNAx3-long, 또는 (vi) pAAV Opt-hPABPN1-MYC 및 pAAV-shRNAx3-long으로 형질감염된 HEK293T 세포 내에서 발현된 GAPDH 단백질에 대한 Myc-태그된 PABPN1 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯이다.
도 4a는 대조구 H2kB-D7e 세포 및 (A) pAAV-HBVpol, (B) pAAV-shRNAx3-long 또는 (C) pAAV mut-PABPN1-FLAG 및 pAAV-shRNAx3-long으로 형질감염된 H2kB-D7e 세포에서 GAPDH 단백질에 대한 PABPN1 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯이다.
도 4b는 (B) pAAV-shRNAx3-long, (D) pAAV Opt-hPABPN1-MYC 및 pAAV-shRNAx3-long, (A) pAAV-HBVpol, 또는 (C) pAAV mut-PABPN1-FLAG 및 pAAV-shRNAx3-long으로 형질감염된 H2kB-D7e 세포에서 GAPDH 단백질에 대한 Myc-태그된 PABPN1 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯이다.
도 4c는 (i) pAAV Opt-hPABPN1-MYC, (ii) pAAV-HBVpol, (iii) pAAV-shRNAx3-long, 및 (iv) pAAV-shRNAx3-long 및 pAAV Opt-hPABPN1-MYC로 형질감염된 H2kB-D7e 세포에서의 GAPDH 발현(퍼센트로서 표시)에 대한 Myc-태그된 코돈-최적화된 PABPN1 발현의 평균 수준을 예시한다.
도 4d는 (A) pAAV-HBVpol, (C) pAAV mut-PABPN1-FLAG, 및 pAAV-shRNAx3-long, (B) pAAV-shRNAx3-long, 또는 (D) pAAV Opt-hPABPN1-MYC 및 pAAV-shRNAx3-long으로 형질감염된 H2kB-D7e 세포에서 GAPDH 단백질에 대한 FLAG-태그된 돌연변이 PABPN1 단백질(확장된 폴리알라닌로를 포함)의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯이다.
도 4e는 왼쪽에서 오른쪽으로, (A) pAAV-HBVpol, (B) pAAV-shRNAx3-long, (C) pAAV-shRNAx3-long, 또는 (D) pAAV-shRNAx3-long 및 pAAV-shRNAx3-long으로 형질감염된 H2kB-D7e 세포에서 GAPDH 발현(퍼센트로 표시됨)에 대한 FLAG-태그된 돌연변이 PABPN1 단백질(확장된 폴리알라닌로를 포함)의 평균 수준을 예시한다.
도 5는 (i) 식염수로 처리된 A17 마우스, (ii) 식염수로 처리된 FvB 마우스, (iii) scAAV8-shRNAx3-long으로 처리된 A17, (iv) ssAAV9 Opt-hPABPN1-MYC로 처리된 A17 및 (v) scAAV8-shRNAx3-long 및 ssAAV9 Opt-hPABPN1-MYC로 처리된 A17로부터 절제된 티비알리스 앤테리어(Tibialis anterior)(TA) 근육의 (A) 중량, (B) 비력, 및 (C) 등척성 최대력을 나타낸다. 모든 근육은 주사 후 18주에 취하였다.
도 6a는 (i) 식염수로 처리된 A17 마우스, (ii) 식염수로 처리된 FvB 마우스, (iii) scAAV8-shRNAx3-long으로 처리된 A17, (iv) ssAAV9 Opt-hPABPN1-MYC로 처리된 A17 및 (v) scAAV8-shRNAx3-long 및 ssAAV9 Opt-hPABPN1-MYC로 처리된 A17로부터의 티비알리스 앤테리어(TA) 근육에서 빈쿨린(vinculin) 단백질 발현에 대한 PABPN1 단백질 발현의 평균 수준을 나타내는 웨스턴 블롯이다.
도 6b는 도 6a에서 웨스턴 블롯의 농도계 분석에 의해 결정된 바와 같이, (i) 식염수로 처리된 A17 마우스, (ii) 식염수로 처리된 FvB 마우스, (iii) scAAV8-shRNAx3-long으로 처리된 A17, (iv) ssAAV9 Opt-hPABPN1-MYC 로 처리된 A17 및 (v) scAAV8-shRNAx3-long 및 ssAAV9 Opt-hPABPN1-MYC로 처리된 A17로부터의 티비알리스 앤테리어(TA) 근육에서 PABPN1 단백질 발현의 수준을 예시한다.
도 6c는 (i) 식염수로 처리된 A17 마우스, (ii) 식염수로 처리된 FvB 마우스, (iii) scAAV8-shRNAx3-long으로 처리된 A17, (iv) ssAAV9 Opt-hPABPN1-MYC로 처리된 A17 및 (v) scAAV8-shRNAx3-long 및 ssAAV9 Opt-hPABPN1-MYC로 처리된 A17로부터의 티비알리스 앤테리어(TA) 근육에서 빈쿨린 단백질 발현에 대한 MYC 단백질 발현의 평균 수준을 나타내는 웨스턴 블롯이다. 이 웨스턴 블롯은 myc-에피토프가 ssAAV9 Opt-hPABPN1-MYC 단독 또는 scAAV8-shRNAx3-long과 조합 처리된 모든 근육에서 검출됨을 예시한다. 화살표는 정확한 분자량에서 검출된 밴드를 나타낸다.
도 6d는 도 6c에서 웨스턴 블롯의 농도계 분석에 의해 결정된 바와 같이, ssAAV9 Opt-hPABPN1-MYC 단독 또는 scAAV8-shRNAx3-long와의 조합을 이용하여 주사 후 18주에 A17 마우스들로부터 티비알리스 앤테리어(TA) 근육에서 검출된 Myc-태그의 수준을 예시한다. 이 그래프는 scAAV8-shRNAx3-long 및 ssAAV9 Opt-hPABPN1-MYC 모두가 주사된 근육에서 공동 발현되는 경우, scAAV8-shRNAx3-long은 optPABPN1 단백질 양에 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
도 7a는 PABPN1에 대한 면역형광 조직화학분석 및 (i) 식염수로 처리된 A17 마우스, (ii) 식염수로 처리된 FvB 마우스, (iii) scAAV8-shRNAx3-long으로 처리된 A17, (iv) ssAAV9 Opt-hPABPN1-MYC로 처리된 A17 및 (v) scAAV8-shRNAx3-long 및 ssAAV9 Opt-hPABPN1-MYC로 처리된 A17로부터의 티비알리스 앤테리어(TA) 근육의 섹션에서 라미닌 검출을 나타낸다. 섹션들은 조직으로부터 모든 가용성 PABPN1을 버리기 위해 1 M KCl로 예비처리하였다. PABPN1 양성 핵내 봉입체(INIs)의 수는 scAAV8-shRNAx3-long 처리된 근육에서 유의하게 감소된다. 모든 근육 섹션은 주사한지 18주 후에 취하였다.
도 7b는 (i) 식염수로 처리된 A17 마우스, (ii) 식염수로 처리된 FvB 마우스, (iii) scAAV8-shRNAx3-long으로 처리된 A17, (iv) ssAAV9 Opt-hPABPN1-MYC로 처리된 A17 및 (v) scAAV8-shRNAx3-long 및 ssAAV9 Opt-hPABPN1-MYC로 처리된 A17로부터의 티비알리스 앤테리어(TA) 근육의 섹션에서 INI를 함유하는 핵의 수준(퍼센트로 표시됨)을 예시한다. 이 그래프는 scAAV8-shRNAx3-long, 또는 scAAV8-shRNAx3-long 및 ssAAV9 Opt-hPABPN1-MYC 모두 중 어느 하나를 이용한 처리가 식염수 주사된 A17 근육에 비하여 INI의 양을 각각 약 10% 및 5%로 감소시킴을 예시한다(CNF=35%)(본페로니(Bonferroni) 포스트-독 시험을 이용한 일원배치 분산분석 ***p<0.001).
도 8a는 (i) 식염수로 주사된 A17 마우스, (ii) 식염수로 주사된 FvB 마우스, (iii) scAAV8-shRNAx3-long으로 처리된 A17, (iv) ssAAV9 Opt-hPABPN1-MYC로 처리된 A17 및 (v) scAAV8-shRNAx3-long 및 ssAAV9 Opt-hPABPN1-MYC로 처리된 A17로부터 절제된 티비알리스 앤테리어(TA) 근육의 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색된 섹션의 이미지를 나타낸다. 이들 이미지는 A17 근육에서 내생의 PABPN1의 고갈이 중심 핵화된 섬유의 양을 증가시키는 반면, ssAAV9-opt hPABPN1-MYC의 공동 주사는 중심 핵을 갖는 섬유의 양을 식염수 주사된 A17 근육에서 수득된 것과 동일한 수준으로 보존하였음을 나타내며, 이는 코돈-최적화된 hPABPN1의 공동 발현이 근육 퇴행을 방지함을 나타낸다. 모든 근육 섹션은 주사 후 18주에 취하였다.
도 8b는 (i) 식염수로 처리된 A17 마우스, (ii) 식염수로 처리된 FvB 마우스, (iii) scAAV8-shRNAx3-long으로 처리된 A17, (iv) ssAAV9 Opt-hPABPN1-MYC로 처리된 A17 및 (v) scAAV8-shRNAx3-long 및 ssAAV9 Opt-hPABPN1-MYC로 처리된 A17로부터 절제된 티비알리스 앤테리어(TA) 근육의 섹션에서 콜라겐 VI에 대한 면역염색의 대표 이미지를 제공한다. 모든 근육 섹션은 주사 후 18주에 취하였다.
도 8c는 (i) 식염수로 처리된 A17 마우스, (ii) 식염수로 처리된 FvB 마우스, (iii) scAAV8-shRNAx3-long으로 처리된 A17, (iv) ssAAV9 Opt-hPABPN1-MYC로 처리된 A17 및 (v) scAAV8-shRNAx3-long 및 ssAAV9 Opt-hPABPN1-MYC로 처리된 A17로부터 절제된 티비알리스 앤테리어(TA) 근육의 섹션에 대해 중심 핵화된(CN) 섬유의 퍼센트를 예시한다. 모든 근육 섹션은 주사 후 18주에 취하였다.
도 8d는 (i) 식염수로 주사된 A17 마우스, (ii) 식염수로 주사된 FvB 마우스, (iii) scAAV8-shRNAx3-long으로 처리된 A17, (iv) ssAAV9 Opt-hPABPN1-MYC로 처리된 A17 및 (v) scAAV8-shRNAx3-long 및 ssAAV9 Opt-hPABPN1-MYC로 처리된 A17로부터 절제된 티비알리스 앤테리어(TA) 근육의 섹션에서 콜라겐 VI 양성 영역의 퍼센트를 예시한다. 이 그래프는 scAAV8-shRNAx3-long 및 ssAAV9 Opt-hPABPN1-MYC로 처리된 근육에서의 섬유화에 있어서 유의한 감소를 나타낸다.
도 8e는 그룹 당 평균 근섬유 크기를 예시하며, ssAAV9-opt hPABPN1-MYC 단독으로 또는 scAAV8-shRNAx3-long과 함께 처리된 근육의 근섬유가 식염수로 처리된 근육의 근섬유보다 더 크다는 것을 나타낸다(평균 ± SEM n = 5-8, 본페로니 포스트-독 시험을 이용한 일원배치 분산분석, 또는 카이-자승 분석, *p<0.05, ***p<0.001, ns: 유의차 없음).
도 8f는 (i) 식염수로 주사된 A17 마우스, (ii) 식염수로 주사된 FvB 마우스, (iii) scAAV8-shRNAx3-long으로 처리된 A17, (iv) ssAAV9 Opt-hPABPN1-MYC로 처리된 A17 및 (v) scAAV8-shRNAx3-long 및 ssAAV9 Opt-hPABPN1-MYC로 처리된 A17로부터 절제된 티비알리스 앤테리어(TA) 근육의 근섬유 단면적(CSA) 섹션의 분포를 예시한다. 카이-자승 분석에 의한 상이한 군의 비교는 식염수만을 투여받은 동물에 비교시 scAAV8-shRNAx3-long 단독 및 ssAAV9 Opt-hPABPN1-MYC와 함께 처리된 근육의 근섬유 분포에서의 변화를 예시한다.
서열목록에 대한 설명
서열번호 1: PABPN1 mRNA Region 1로 지정된 PABPN1 단백질에 상응하는 mRNA 전사물 내 영역에 대한 RNA 서열.
서열번호 2: PABPN1 mRNA Region 2로 지정된 PABPN1 단백질에 상응하는 mRNA 전사물 내 영역에 대한 RNA 서열.
서열번호 3: PABPN1 mRNA Region 3으로 지정된 PABPN1 단백질에 상응하는 mRNA 전사물 내 영역에 대한 RNA 서열.
서열번호 4: 각각 ssRNA1 및 dsRNA1로 지정된 ssRNA 및 dsRNA에 대한 RNA 이펙터 서열.
서열번호 5: dsRNA1로 지정된 dsRNA에 대한 RNA 이펙터 보체 서열.
서열번호 6: 각각 ssRNA2 및 dsRNA2로 지정된 ssRNA 및 dsRNA에 대한 RNA 이펙터 서열.
서열번호 7: dsRNA2로 지정된 dsRNA에 대한 RNA 이펙터 보체 서열.
서열번호 8: 각각 ssRNA3 및 dsRNA3으로 지정된 ssRNA 및 dsRNA에 대한 RNA 이펙터 서열.
서열번호 9: dsRNA3으로 지정된 dsRNA에 대한 RNA 이펙터 보체 서열.
서열번호 10: shRNA1 및 shRNA2로 지정된 shRNA에 대한 RNA 이펙터 서열.
서열번호 11: shRNA1 및 shRNA2로 지정된 shRNA에 대한 RNA 이펙터 보체 서열.
서열번호 12: shRNA3 및 shRNA4로 지정된 shRNA에 대한 RNA 이펙터 서열.
서열번호 13: shRNA3 및 shRNA4로 지정된 shRNA에 대한 RNA 이펙터 보체 서열.
서열번호 14: shRNA5 및 shRNA6으로 지정된 shRNA에 대한 RNA 이펙터 서열.
서열번호 15: shRNA5 및 shRNA6으로 지정된 shRNA에 대한 RNA 이펙터 보체 서열.
서열번호 16: shRNA1로 지정된 shRNA에 대한 RNA 서열.
서열번호 17: shRNA2로 지정된 shRNA에 대한 RNA 서열.
서열번호 18: shRNA3으로 지정된 shRNA에 대한 RNA 서열.
서열번호 19: shRNA4로 지정shRNA에 대한 RNA 서열.
서열번호 20: shRNA5로 지정된 shRNA에 대한 RNA 서열.
서열번호 21: shRNA6으로 지정된 shRNA에 대한 RNA 서열.
서열번호 22: 짧은 OPMD 트리플 구조물에 대한 DNA 서열.
서열번호 23: 긴 OPMD 트리플 구조물에 대한 DNA 서열.
서열번호 24: 인간 코돈-최적화된 PABPN1 cDNA 서열에 대한 DNA 서열.
서열번호 25: 코돈-최적화된 인간 PABPN1 단백질에 대한 아미노산 서열.
서열번호 26: 인간 코돈-최적화된 PABPN1 cDNA 서열에 대한 DNA 서열(Myc-태그 이용).
서열번호 27: 코돈-최적화된 인간 PABPN1 단백질에 대한 아미노산 서열(Myc-태그 이용).
서열번호 28: 돌연변이 인간 PABPN1 단백질에 대한 cDNA 서열(FLAG-태그 이용).
서열번호 29: 돌연변이 인간 PABPN1 단백질에 대한 아미노산 서열(FLAG 태그 이용).
일반 사항
본 명세서 전체에 걸쳐, 특별히 달리 언급되지 않거나 문맥이 달리 요구하지 않는 경우, 단일 단계, 특징, 물질의 조성, 단계들의 군 또는 물질의 특징 또는 조성의 군에 대한 언급은, 물질의 그러한 단계, 특징, 물질의 조성, 단계들의 군 또는 물질의 특징 또는 조성의 군의 하나 또는 복수(즉, 하나 이상)를 포괄하는 것으로 여겨질 것이다.
당업자는 본 개시 내용이 구체적으로 기재된 것들 외에 변화 및 변경되기 쉬움을 이해할 것이다. 본 개시 내용은 모든 그러한 변화 및 변경을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 개시 개시 내용은, 개별적으로 또는 집합적으로, 본 명세서에 언급된 또는 표시된 단계, 특징, 조성 및 화합물 모두 및 상기 단계 또는 특징의 임의의 모든 조합 또는 임의의 둘 이상의 조합을 또한 포함한다.
본 개시 내용은, 예시 목적만을 위해 의도된 본 명세서에 기재된 특정 예에 의한 범주 내로 한정되지 않는다. 기능적으로-균등한 생성물, 조성물 및 방법은 본 개시 내용의 범주 내에서 명확하다.
본 명세서에서 본 개시 내용의 임의의 예는 구체적으로 달리 언급되지 않는 경우, 본 개시 내용의 임의의 기타 다른 예에 필요한 변경을 가하여 적용하는 것으로 이해되어야 한다.
특별히 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 (예를 들어, 세포 배양, 분자 유전학, 면역학, 면역조직화학, 단백질 화학, 및 생화학 분야의 )당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해될 것이다.
달리 나타내지 않는 한, 본 개시 내용에 사용된 재조합 DNA, 재조합 단백질, 세포 배양 및 면역학적 기법은 당업자에게 잘 공지된 표준 절차이다. 그러한 기법은 예컨대 문헌 [J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)], [J. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)], [T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991)], [D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 및 1996)], 및 [F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 현재까지의 모든 업데이트 포함)], ㅔEd Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)], 및 [J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (현재까지의 모든 업데이트 포함)]의 문헌 정보에 걸쳐 기재 및 설명된다.
문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 본 명세서에 걸쳐, 단어 "포함하다(comprise)" 또는 "포함한다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 언급된 단계 또는 성분 또는 정수, 또는 단계들 또는 성분들 또는 정수들의 군의 포함을 의미하는 것으로 이해되지만, 임의의 기타 다른 단계 또는 성분 또는 정수, 또는 성분들 또는 정수들의 배제를 의미하지는 않는다.
용어 "및/또는", 예를 들어 "X 및/또는 Y"는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y"를 의미하는 것으로 이해될 것이며, 두 의미 모두 또는 어느 하나의 의미에 대한 명료한 뒷받침을 제공하는 것으로 여겨질 것이다.
선택되는 정의
"RNA"는 적어도 하나의 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. "리보뉴클레오티드"는
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위치에서 히드록실 기를 갖는 뉴클레오티드를 의미한다. 용어는 이중-가닥 RNA, 단일-가닥 RNA, 분리된 RNA, 예컨대 부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합적으로 생산된 RNA뿐만 아니라, 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 천연 RNA와 상이한 변경된 RNA를 포함한다. 그러한 변경은, 예컨대 RNA의 말단(들)에의, 또는 내부적으로 예를 들어 RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에서의 비-뉴클레오티드 재료의 부가를 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 RNA 분자에서 뉴클레오티드는 또한 비표준 뉴클레오티드, 예컨대 비천연 뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드를 포함할 수도 있다. 이들 변경된 RNA는 유사체 또는 천연 RNA의 유사체로 지칭될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "RNAi 시약"은 "RNA 간섭" 또는 "RNAi"를 유도할 수 있는 RNA를 지칭한다.
용어 "RNA 간섭" 또는 "RNAi"는 세포의 세포질 내에서 일반적으로 이중 가닥 RNA(dsRNA) 분자 및 단일-가닥 짧은-간섭 RNA(ss-siRNA) 분자에 의해 개시되는 유전자 발현의 RNA-의존성 사일런싱을 지칭한다. dsRNA 분자 또는 ss-siRNA 분자는 표적 핵산 서열의 전사 생성물을 감소 또는 억제하며, 이에 의해 유전자를 사일런싱한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "이중 가닥 RNA" 또는 "dsRNA"는 서로 유사한 길이의 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열을 포함하고 듀플렉스 구조를 갖는 RNA 분자를 지칭한다. 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열은 단일 RNA 가닥 또는 별개의 RNA 가닥으로 존재할 수 있다. "이펙터 서열"(종종 "가이드 가닥"으로서도 지칭됨)은, 본 경우에는 PABPN1 mRNA 전사물의 영역인 표적 서열에 대해 실질적으로 상보적이다. "이펙터 서열"은 또한 "안티센스 서열"로서 지칭될 수 있다. "이펙터 보체 서열"은 이펙터 서열에 대해 충분히 상보적이어서, 이는 이펙터 서열에 어닐링하여 듀플렉스를 형성할 수 있도록 한다. 이와 관련하여, 이펙터 보체 서열은 표적 서열의 영역에 대해 실질적으로 상동성일 것이다. 당업자에게는 명백할 것인, 용어 "이펙터 보체 서열"은 또한 "이펙터 서열의 보체" 또는 센스 서열 또는 패신저(passenger) 가닥 서열로서 지칭될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "듀플렉스"는 2개의 상보적인 또는 실질적으로 상보적인 핵산(예를 들어, RNA들)에서의 영역, 또는 왓슨-크릭 염기 쌍형성(pairing)에 의해 또는 상보적이거나 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열들 간에 안정화된 듀플렉스를 가능하게 하는 임의의 기타 다른 방식에 의해 서로 염기 쌍을 형성하는, 단일-가닥 핵산(예를 들어, RNA)의 2개의 상보적인 또는 실질적으로 상보적인 영역을 지칭한다. 듀플렉스 영역 내에서 100% 상보성은 요구되지 않으며; 실질적인 상보성이면 가능함을 당업자는 이해할 것이다. 실질적인 상보성은 69% 이상의 상보성을 포함할 수 있다. 예를 들어 19 개의 염기 쌍으로 이루어진 듀플렉스 영역에서 단일 미스매치(즉, 18개의 염기 쌍과 1개의 미스매치)는 94.7%의 상보성을 초래하며, 듀플렉스 영역을 실질적으로 상보적으로 한다. 또 다른 예에서, 19개의 염기 쌍으로 이루어지는 듀플렉스 영역에서 2개의 미스매치(즉, 17개의 염기 쌍 및 2개의 미스매치)는 89.5%의 상보성을 초래하며, 듀플렉스 영역을 실질적으로 상보적으로 한다. 또 다른 예에서, 19개의 염기 쌍으로 이루어지는 듀플렉스 영역에서 3개의 미스매치(즉, 16개의 염기 쌍 및 3개의 미스매치)는 84.2%의 상보성을 결과로서 초래하며, 듀플렉스 영역을 실질적으로 상보적으로 만드는 것 등이 있다.
dsRNA는 헤어핀 또는 스템 루프 구조로서, 스템 루프로 명명된 적어도 2개의 뉴클레오티드 서열에 의해 연결된 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열로 구성된 듀플렉스 영역이 제공될 수 있다. dsRNA가 헤어핀 또는 스템 루프 구조로서 제공되는 경우, 이는 "헤어핀 RNA" 또는 "짧은 헤어핀 RNAi 약제" 또는 "shRNA"로서 지칭될 수 있다. 헤어핀 또는 스템 루프 구조 내에 제공된, 또는 헤어핀 또는 스템 루프 구조를 생성하는 기타 다른 dsRNA 분자는 1차 miRNA 전사물(pri-miRNA) 및 전구체 microRNA(pre-miRNA)를 포함한다. Pre-miRNA shRNA들은 스템-루프 구조를 형성하는 1차 miRNA 전사물의 영역을 인식 및 방출하는, 드로샤(Drosha) 및 파샤(Pasha) 효소의 작용에 의해 pri-miRNA로부터 자연적으로 생산될 수 있다. 대안적으로는, pri-miRNA 전사물은 천연의 스템-루프 구조를 인공적/재조합 스템-루프 구조로 대체하도록 조작될 수 있다. 이 경우, 드로샤 및 파샤는 인공 shRNA를 인식 및 방출한다. 이 방식을 이용하여 생산된 dsRNA 분자는 "shmiRNA", "shmiRs" 또는 "microRNA 프레임워크 shRNA"로서 알려져 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "단일-가닥 짧은-간섭 RNA", "ss-siRNA", "단일-가닥 RNA", "ssRNA" 또는 유사 표현은 이펙터 서열을 포함하고 단일-가닥 구조를 갖는 RNA 분자를 지칭한다. dsRNA 분자에 대해 본 명세서에 기재된 바와 같은, "이펙터 서열"(종종 "안티센스 서열" 또는 "가이드 가닥"으로서 지칭됨)은, 본 경우에서 PABPN1 mRNA 전사물의 영역인 표적 서열에 대해 실질적으로 상보적이다. 그러나, 듀플렉스 구조를 갖는 RNAi 시약과 달리, ssRNA는 이펙터 보체 서열을 포함하지 않는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 서열과 관련된 용어 "상보성"은 왓슨-크릭 염기 쌍형성에 의한 서열의 보체를 지칭하며, 이에 따르면 구아닌(G)은 시토신(C)과 쌍을 형성하고, 아데닌(A)은 우라실(U) 또는 티민(T) 중 어느 하나와 쌍을 형성한다. 서열은 다른 서열의 전체 길이에 대하여 상보적일 수 있거나, 다른 서열의 특정 부분 또는 길이에 대해 상보적일 수 있다. 당업자는 U가 RNA에 존재할 수 있음, 및 T가 DNA에 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, RNA 또는 DNA 서열 중 어느 하나 내의 A는 RNA 서열에서 U 또는 DNA 서열에서 T와 쌍을 형성할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "실질적으로 상보적인"은, 안정적이고 특이적인 결합이 핵산 서열들 간에, 예를 들어 이펙터 서열과 이펙터 보체 서열 간 또는 이펙터 서열과 표적 서열 간에 발생하기에 충분한 상보성 정도 또는 정확한 염기형성을 나타내는 데 사용된다. 핵산의 서열은 그의 표적 또는 보체의 상보성에 100%일 필요는 없음이 이해된다. 본 용어는 오버행은 제외한 또 다른 서열에 대해 상보적인 서열을 포괄한다. 일부 경우에서, 서열은 1개 내지 2개의 미스매치를 갖는 기타 다른 서열에 대해 상보적이다. 일부 경우에서, 서열은 1개의 미스매치를 제외하고 상보적이다. 일부 경우에서, 서열은 2개의 미스매치를 제외하고 상보적이다. 다른 경우에서, 서열은 3개의 미스매치를 제외하고 상보적이다. 또 다른 경우에서, 서열은 4개의 미스매치를 제외하고 상보적이다.
본 개시 내용의 RNA의 문맥에서 사용된 바와 같은 용어 "인코딩된" 또는 "코딩하는"은 RNA가 DNA 주형으로부터 전사될 수 있음을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 본 개시 내용의 RNA를 인코딩하거나 코딩하는 핵산은 개별적인 RNA의 전사에 대한 주형으로서의 역할을 하는 DNA 서열을 포함할 것이다.
용어 "DNA-지향 RNAi 구조물" 또는 "ddRNAi 구조물"은, 전사된 경우 RNAi를 유도하는 RNA 분자를 생산하는 DNA 서열을 포함하는 핵산을 지칭한다. ddRNAi 구조물은 적어도 2개의 뉴클레오티드의 스템 루프에 의해 연결된 듀플렉스 영역을 갖는 헤어핀 구조물, 즉 shRNA 내로 셀프-어닐링될 수 있는 단일 RNA로서, 또는 다중 shRNA를 갖는 단일 RNA로서 또는 개별적으로 단일 shRNA로서 각각 접힘가능한 다중 RNA 전사물로서 전사되는 핵산을 포함할 수 있다. ddRNAi 구조물은 예를 들어 프로모터에 작동적으로 연결된, 발현 벡터, 즉 "ddRNAi 발현 구조물" 내에 존재할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "작동적으로 연결된" 또는 "작동성 연결"(또는 유사 표현)은, 코딩 핵산 서열이 코딩 서열의 발현을 촉진하는 방식으로, 조절 서열 예를 들어 프로모터에 연결되거나 연합됨을 의미한다. 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 및 기술분야에서 알려지고 코딩 서열의 발현을 감독하도록 선택되는 기타 다른 발현 제어 성분을 포함한다.
"벡터"는 핵산을 세포 내로 도입시키기 위한 비히클을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 벡터는, 플라스미드, 파스미드(phagemid), 바이러스, 세균, 및 바이러스성 또는 세균성 공급원으로부터 유도된 비히클을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. "플라스미드"는 원형의 이중-가닥 DAN 분자이다. 본 개시 내용에 따른 이용에 유용한 형태의 벡터는 바이러스성 벡터로, 여기서 이종성 DNA 서열은 하나 이상의 바이러스성 유전자 또는 그의 일부를 결실하도록 변경될 수 있는 바이러스성 유전체 내로 삽입된다. 특정 벡터는 숙주 세포에서 자율적 복제가 가능하다(예를 들어, 숙주 세포에서 기능하는 복제 기원을 갖는 벡터). 기타 다른 벡터는 숙주 세포의 유전체 내로 안정하게 통합될 수 있고, 이에 따라 숙주 유전체와 함께 복제된다. 기타 다른 벡터는 숙주 세포의 유전체 내로의 통합 없이 염색체 외 상태를 지속한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "발현 벡터"는 본 개시 내용의 RNA 분자를 발현할 수 있는 벡터를 의미하는 것으로 이해될 것이다.
"기능성 PABPN1 단백질"은 야생형 PABPN1 단백질의 기능적 특성, 예를 들어 포유동물 세포에서 mRNA 폴리아데닐화의 위치 및/또는 인트론 스플라이싱을 제어하는 능력을 갖는 PABPN1 단백질을 의미하는 것으로 이해되어야 할 것이다. 따라서, "기능성 PABPN1 단백질"은 피험자에서 발현되거나 존재하는 경우, OPMD의 원인이 되지 않는 PABPN1 단백질인 것으로 이해될 것이다. 일 예에서, "기능성 PABPN1 단백질"에 대한 본 명세서에서의 언급은 인간의 야생형 PABPN1 단백질을 언급한다. 인간 야생형 PABPN1 단백질의 서열이 NCBI RefSeq NP_004634에 나타나 있다. 이에 따라, 기능성 인간 PABPN1 단백질은 NCBI RefSeq NP_004634에 나타낸 인간 PABPN1 단백질의 생체 내 기능적 특성을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "치료하는", "치료하다" 또는 "치료" 및 이의 변형들은 임상 병리학의 과정 동안 치료되는 개인 또는 세포의 자연적 과정을 변경시키도록 설계된 임상적 개입을 지칭한다. 치료의 바람직한 효과는 질병 진행 속도 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함한다. 이어서 OPMD의 치료는 피험자에서 OPMD의 원인이 되는 PABPN1 단백질의 발현의 감소 또는 억제 및/또는 피험자에서 폴리알라닌 잔기의 정상의 길이를 갖는 PABPN1 단백질의 발현을 포함한다. 바람직하게는, OPMD의 치료는 피험자에서 OPMD의 원인이 되는 PABPN1 단백질의 발현의 감소 또는 억제, 및 피험자에서 폴리알라닌 잔기의 정상 길이를 갖는 PABPN1 단백질의 발현을 포함한다. 예를 들어 상기 치료 결과 중 하나 이상이 달성되는 경우, 개인은 성공적으로 "치료된다".
"치료유효량"은 피험자에서 예를 들어 이에 한정되지는 않지만 안검하수, 연하곤란 및 근육 허약을 포함하는, OPMD의 하나 이상의 증상에서의 측정가능한 개선과 같이, OPMD 상태에서의 측정가능한 개선을 달성하는 데 요구되는 적어도 최소의 농도 또는 양이다. 본 명세서에서 치료유효량은 환자의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중과 같은 인자, 및 개인에서 바람직한 반응을 유도하는 RNA, ddRNAi 또는 발현 구조물의 능력 및/또는 피험자에서 기능성 PABPN1 단백질을 발현하는 발현 벡터의 능력에 따라 변화될 수 있다. 치료유효량은 RNA, ddRNAi 구조물 또는 발현 벡터의 임의의 독성 또는 유해한 효과보다, 단독으로 또는 피험자에서 기능성 PABPN1 단백질 발현의 치료적으로 유리한 효과와 함께 고려되는, OPMD의 원인이 되는 PABPN1 단백질의 발현을 억제, 저해 또는 감소시키는 RNA, ddRNAi 구조물 또는 발현 벡터의 치료적으로 유리한 효과가 더 큰 경우도 해당된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, "피험자" 또는 "환자"는 OPMD를 앓고 있거나 그에 대한 유전적인 성향이 있는, 즉 OPMD의 원인이 되는 PABPN1 유전자 변형체를 갖는 인간 또는 인간이 아닌 동물일 수 있다. "인간이 아닌 동물"은 영장류, 가축(예를 들어, 양, 말, 소, 돼지, 당나귀), 반려 동물(예를 들어, 개와 고양이 같은 동물), 실험용 동물(예를 들어, 마우스, 토끼, 래트, 기니 피그, 초파리, 예쁜꼬마 선충(C.elegans), 제브라피쉬), 수행 동물(예를 들어, 경주마, 낙타, 그레이하운드) 또는 포획된 야생동물일 수 있다. 일 예에서, 피험자 또는 환자는 포유동물이다. 일 예에서, 피험자 또는 환자는 인간이다.
용어 "감소된 발현", "발현에서의 감소" 또는 유사 표현은 표적 유전자, 예를 들어 PABPN1 유전자로부터의 단백질 및/또는 mRNA 생성물 수준에서의 관찰가능한 감소 또는 부재를 지칭한다. 감소는 절대적일 필요는 없지만, 본 개시 내용의 RNA에 의해 발생되는 RNAi의 결과로서 검출가능한 또는 관찰가능한 변화이기에 충분한 부분적 감소일 수 있다. 감소는 RNA, ddRNAi 구조물 또는 발현 벡터를 결여하는 세포에 대하여, 표적 핵산으로부터의 mRNA 및/또는 단백질 생성물 수준에서의 감소를 결정함으로써 측정될 수 있으며, 적게는 1%, 5% 또는 10%이거나, 또는 절대적, 즉 100% 억제일 수 있다. 감소 효과는 세포 또는 생물의 외형적 특성, 즉 정량적 및/또는 정성적 표현형의 검사에 의해 결정될 수 있으며, 본 개시 내용의 RNA, ddRNAi 구조물 또는 발현 벡터의 투여 후 세포 또는 생물 내에서 expPABPN1의 핵 집합체의 존재의 검출 또는 양에서의 변화를 또한 포함할 수 있다.
RNAi에 대한 약제
일 예에서, 본 개시 내용은 RNAi를 유도할 수 있는 RNA를 제공하며, 여기서 RNA는 PABPN1 단백질에 상응하는 RNA 전사물의 영역에 실질적으로 상보적인 적어도 17개의 인접한 뉴클레오티드의 이펙터 서열을 포함하며, 여기서 RNA 전사물의 영역은 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나에 나타낸다. 바람직하게는, 본 개시 내용의 RNA는 길이 30개 미만의 뉴클레오티드인 이펙터 서열을 포함할 것이다. 예를 들어, 적합한 이펙터 서열은 길이 17개 내지 29개 범위의 뉴클레오티드일 수 있다.
일 예에서, 이펙터 서열은 PABPN1 단백질에 상응하는 RNA 전사물의 영역에 실질적으로 상보적이며, 여기서 RNA 전사물의 영역이 서열번호 1에 나타낸다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 1에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있으며, 그에 대하여 6개의 미스매치 염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 1에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있으며, 그에 대하여 5개의 미스매치 염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 1에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있으며, 그에 대하여 4개의 미스매치 염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 1에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있으며, 그에 대하여 3개의 미스매치 염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 1에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있으며, 그에 대하여 2개의 미스매치 염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 1에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있으며, 그에 대하여 1개의 미스매치 염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 1에 나타낸 서열에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서, 이펙터 서열은 PABPN1 단백질에 상응하는 RNA 전사물의 영역에 실질적으로 상보적이며, 여기서 RNA 전사물의 영역은 서열번호 2에 나타낸다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 2에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있으며, 그에 대하여 6개의 미스매치 염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 2에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있으며, 그에 대하여 5개의 미스매치 염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 2에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있으며, 그에 대하여 4개의 미스매치 염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 2에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있으며, 그에 대하여 3개의 미스매치 염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 2에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있으며, 그에 대하여 2개의 미스매치 염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 2에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있으며, 그에 대하여 1개의 미스매치 염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 2에 나타낸 서열에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서, 이펙터 서열은 PABPN1 단백질에 상응하는 RNA 전사물의 영역에 실질적으로 상보적이며, 여기서 RNA 전사물의 영역은 서열번호 3에 나타낸다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 3에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있으며, 그에 대하여 6개의 미스매치 염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 3에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있으며, 그에 대하여 5개의 미스매치 염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 3에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있으며, 그에 대하여 4개의 미스매치 염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 3에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있으며, 그에 대하여 3개의 미스매치 염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 3에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있으며, 그에 대하여 2개의 미스매치 염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 3에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있으며, 그에 대하여 1개의 미스매치 염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 3에 나타낸 서열에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서, 본 개시 내용의 RNA는 단일-가닥 RNA(ssRNA)이다.
본 개시 내용에 따른 ssRNA는 PABPN1 단백질에 상응하는 RNA 전사물의 영역에 실질적으로 상보적인 적어도 17개의 인접한 뉴클레오티드의 이펙터 서열을 포함할 수 있고, 여기서 RNA 전사물의 영역은 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나에 나타낸다. 예를 들어, 본 개시 내용의 ssRNA는 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 8에 나타낸 서열에 실질적으로 동일한 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열을 포함할 수 있다.
일 예에서, 본 개시 내용의 ssRNA는 서열번호 4에 나타낸 서열에 실질적으로 동일한 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 4에 나타낸 서열에 실질적으로 동일할 수 있고, 이에 대해 변화하는 6개의 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 4에 나타낸 서열에 실질적으로 동일할 수 있고, 이에 대해 변화하는 5개의 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 4에 나타낸 서열에 실질적으로 동일할 수 있고, 이에 대해 변화하는 4개의 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 4에 나타낸 서열에 실질적으로 동일할 수 있고, 이에 대해 변화하는 3개의 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 4에 나타낸 서열에 실질적으로 동일할 수 있고, 이에 대해 변화하는 2개의 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 4에 나타낸 서열에 실질적으로 동일할 수 있고, 이에 대해 변화하는 1개의 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 4에 나타낸 서열에 100% 동일할 수 있다.
일 예에서, 본 개시 내용의 ssRNA는 서열번호 6에 나타낸 서열에 실질적으로 동일한 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 6에 나타낸 서열에 실질적으로 동일할 수 있고, 이에 대해 변화하는 6개의 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 6에 나타낸 서열에 실질적으로 동일할 수 있고, 이에 대해 변화하는 5개의 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 6에 나타낸 서열에 실질적으로 동일할 수 있고, 이에 대해 변화하는 4개의 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 6에 나타낸 서열에 실질적으로 동일할 수 있고, 이에 대해 변화하는 3개의 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 6에 나타낸 서열에 실질적으로 동일할 수 있고, 이에 대해 변화하는 2개의 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 6에 나타낸 서열에 실질적으로 동일할 수 있고, 이에 대해 변화하는 1개의 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 6에 나타낸 서열에 100% 동일할 수 있다.
일 예에서, 본 개시 내용의 ssRNA는 서열번호 8에 나타낸 서열에 실질적으로 동일한 서열을 포함하거나, 이로 이루어지는 이펙터 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 8에 나타낸 서열에 실질적으로 동일할 수 있고, 이에 대해 변화하는 6개의 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 8에 나타낸 서열에 실질적으로 동일할 수 있고, 이에 대해 변화하는 5개의 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 8에 나타낸 서열에 실질적으로 동일할 수 있고, 이에 대해 변화하는 4개의 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 8에 나타낸 서열에 실질적으로 동일할 수 있고, 이에 대해 변화하는 3개의 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 8에 나타낸 서열에 실질적으로 동일할 수 있고, 이에 대해 변화하는 2개의 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 8에 나타낸 서열에 실질적으로 동일할 수 있고, 이에 대해 변화하는 1개의 염기를 함유할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 8에 나타낸 서열에 100% 동일할 수 있다.
일 예에서, RNAi를 유도해낼 수 있는 본 개시 내용의 RNA는 이중-가닥 RNA(dsRNA)이다. 본 개시 내용에 따른 dsRNA는 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열을 포함할 것이며, 여기서 이펙터 서열은 PABPN1 단백질에 상응하는 RNA 전사물의 영역에 실질적으로 상보적인, 적어도 17개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 RNA 전사물의 영역은 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나에 나타낸다.
본 개시 내용에 따른 예시적인 dsRNA는 표 3에서 "이펙터 보체"로 명명된 열에 기재된 이펙터 보체 서열에 대해 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하며, 즉 서열번호 5, 서열번호 7 및 서열번호 9이다.
일 예에서, 본 개시 내용은 서열번호 5에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 dsRNA를 제공한다. 예를 들어, 이펙터 서열은 6개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 5에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 5개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 5에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 4개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 5에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 3개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 5에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 2개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 5에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 하나의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 5에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 5에 나타낸 서열에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서, 본 개시 내용은 서열번호 7에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 dsRNA를 제공한다. 예를 들어, 이펙터 서열은 6개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 7에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 5개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 7에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 4개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 7에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 3개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 7에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 2개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 7에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 하나의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 7에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 7에 나타낸 서열에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서, 본 개시 내용은 서열번호 9에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 dsRNA를 제공한다. 예를 들어, 이펙터 서열은 6개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 9에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 5개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 9에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 4개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 9에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 3개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 9에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 2개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 9에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 하나의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 9에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 9에 나타낸 서열에 100% 상보적일 수 있다.
본 개시 내용의 dsRNA가, (본 명세서에 기재된 바와 같은) 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 미스매치를 제외하고 표 3에서 "이펙터 보체"로 명명된 열에 기재된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 경우, 이펙터 서열은 여전히 표 3에서 상응하는 이펙터 보체 서열과 듀플렉스를 형성할 수 있을 것이다.
일 예에서, 본 개시 내용은 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열을 포함하는 dsRNA를 제공하며, 여기서 이펙터 서열은 표 3에서 "이펙터"로 명명된 열에 기재된, 즉 서열번호 4, 서열번호 6 및 서열번호 8로부터 선택되는 서열이며, dsRNA의 이펙터 보체 서열은 그의 이펙터 서열에 실질적으로 상보적이다. 예를 들어, RNA의 이펙터 보체 서열은 동족 이펙터 서열에 대하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 미스매치를 포함할 수 있지만, 여전히 그와 함께 듀플렉스를 형성할 수 있다.
일 예에서, dsRNA는 서열번호 4에 나타낸 이펙터 서열 및 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 염기 미스매치를 제외하고 그에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 6개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 4에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 5개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 4에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 4개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 4에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 3개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 4에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 2개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 4에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 하나의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 4에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 서열번호 4에 나타낸 서열에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서, dsRNA는 서열번호 6에 나타낸 이펙터 서열 및 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 염기 미스매치를 제외하고 그에 대해 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 6개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 6에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 5개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 6에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 4개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 6에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 3개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 6에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 2개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 6에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 하나의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 6에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 서열번호 6에 나타낸 서열에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서, dsRNA는 서열번호 8에 나타낸 이펙터 서열 및 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 염기 미스매치를 제외하고 그에 대해 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 6개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 8에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 5개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 8에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 4개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 8에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 3개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 8에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 2개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 8에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 하나의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 8에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 서열번호 8에 나타낸 서열에 100% 상보적일 수 있다.
본 개시 내용에 따른 예시적인 dsRNA는, 각각 "이펙터" 및 "이펙터 보체"로 명명된 표 3의 열에 기재된 바와 같이 상응하는 이펙터 및 이펙터 보체 서열을 포함한다. 일 예에서, dsRNA의 상응하는 이펙터 및 이펙터 보체 서열은, 예를 들어 왓슨-크릭 염기 쌍 형성에 의해 듀플렉스화되는 별개의 핵산으로서 제공될 수 있다.
dsRNA인 본 개시 내용의 예시적인 RNA는 서열번호 4에 나타낸 서열로 이루어진 이펙터 서열 및 서열번호 5에 나타낸 서열로 이루어진 이펙터 보체 서열을 포함한다.
dsRNA인 본 개시 내용의 예시적인 RNA는 서열번호 6에 나타낸 서열로 이루어진 이펙터 서열 및 서열번호 7에 나타낸 서열로 이루어진 이펙터 보체 서열을 포함한다.
dsRNA인 본 개시 내용의 예시적인 RNA는 서열번호 8에 나타낸 서열로 이루어진 이펙터 서열 및 서열번호 9에 나타낸 서열로 이루어진 이펙터 보체 서열을 포함한다.
RNAi를 유도해낼 수 있는 본 개시 내용의 RNA는 또한 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)로서 제공될 수 있다. 본 개시 내용의 실시예에 따른 shRNA는 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열을 포함할 것이며, 여기서 이펙터 서열은 PABPN1 단백질에 상응하는 RNA 전사물의 영역에 실질적으로 상보적인 적어도 17개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 RNA 전사물의 영역은 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나에 설명된다.
본 개시 내용에 따른 예시적인 shRNA는 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열을 포함하며, 여기서 이펙터 서열은 표 4에서 "이펙터 보체"로 명명된 열에 기재된 이펙터 보체 서열, 즉 서열번호 11, 서열번호 13 및 서열번호 15에 실질적으로 상보적이다.
일 예에서, 본 개시 내용은 서열번호 11에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 shRNA를 제공한다. 예를 들어, 이펙터 서열은 6개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 11에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 5개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 11에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 4개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 11에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 3개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 11에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 2개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 11에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 하나의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 11에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 11에 나타낸 서열에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서, 본 개시 내용은 서열번호 13에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 shRNA를 제공한다. 예를 들어, 이펙터 서열은 6개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 13에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 5개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 13에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 4개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 13에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 3개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 13에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 2개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 13에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 하나의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 13에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 13에 나타낸 서열에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서, 본 개시 내용은 서열번호 15에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 shRNA를 제공한다. 예를 들어, 이펙터 서열은 6개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 15에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 5개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 15에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 4개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 15에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 3개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 15에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 2개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 15에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 하나의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 15에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 서열은 서열번호 15에 나타낸 서열에 100% 상보적일 수 있다.
본 개시 내용의 shRNA가, (본 명세서에 기재된 바와 같은) 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 미스매치를 제외하고 표 4에서 "이펙터 보체"로 명명된 열에 기재된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 경우, 이펙터 서열은 표 4에서 상응하는 이펙터 보체 서열과 함께 듀플렉스 영역을 여전히 형성할 수 있을 것이다.
또 다른 예에서, 본 개시 내용은 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA를 제공하며, 여기서 이펙터 서열은 표 4에 "이펙터"로 명명된 열에 기재된, 즉 서열번호 10, 서열번호 12 및 서열번호 14로부터 선택되는 서열이며, shRNA의 이펙터 보체 서열은 그의 이펙터 서열에 실질적으로 상보적이다. 예를 들어, shRNA의 이펙터 보체 서열은 동족 이펙터 서열에 대하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 미스매치를 포함할 수 있지만, 여전히 그와 함께 듀플렉스를 형성할 수 있다.
일 예에서, shRNA는 서열번호 10에 나타낸 이펙터 서열 및 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 염기 미스매치를 제외하고 그에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 6개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 10에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 5개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 10에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 4개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 10에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 3개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 10에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 2개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 10에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 하나의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 10에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 서열번호 10에 나타낸 서열에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서, shRNA는 서열번호 12에 나타낸 이펙터 서열 및 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 염기 미스매치를 제외하고 그에 대해 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 6개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 12에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 5개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 12에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 4개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 12에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 3개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 12에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 2개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 12에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 하나의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 12에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 서열번호 12에 나타낸 서열에 100% 상보적일 수 있다.
일 예에서, shRNA는 서열번호 14에 나타낸 이펙터 서열 및 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 염기 미스매치를 제외하고 그에 대해 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 6개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 14에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 5개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 14에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 4개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 14에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 3개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 14에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 2개의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 14에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 하나의 염기 미스매치를 제외하고, 서열번호 14에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 보체 서열은 서열번호 14에 나타낸 서열에 100% 상보적일 수 있다.
본 개시 내용의 RNA가 shRNA로서 제공되는 경우, 각각의 RNA가 하나의 인접한 서열을 형성하도록, 스템 루프 서열이 상응하는 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열 사이에 위치될 것이다. 스템 루프 서열은 이펙터 서열과 이펙터 보체 서열이 서로 어닐링되는 것을, 즉 왓슨-크릭 염기 쌍 형성에 의해 듀플렉스 영역을 형성하는 것을 가능하게 하기에 충분한 길이이다. 적합한 스템 루프 서열은 예를 들어 당업계에서 알려진 것들로부터 선택될 수 있다.
본 개시 내용에 따른 예시적인 shRNA는, 각각 "이펙터" 및 "이펙터 보체"로 명명된 표 4의 열에 기재된 바와 같은 상응하는 이펙터 및 이펙터 보체 서열을 포함한다. 그러한 예시적인 shRNA는 본 명세서에 기재된 바와 같이 선택적으로 변경된, 표 5에 나타낸 서열을 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 예시적인 RNA인 shRNA는 서열번호 10에 나타낸 서열로 이루어진 이펙터 서열 및 서열번호 11에 나타낸 서열로 이루어진 이펙터 보체 서열을 포함한다. 본 예에 따른 shRNA는 서열번호 16에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 대안적으로는, 본 예에 따른 shRNA는 서열번호 17에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
본 개시 내용의 예시적인 RNA인 shRNA는 서열번호 12에 나타낸 서열로 이루어진 이펙터 서열 및 서열번호 13에 나타낸 서열로 이루어진 이펙터 보체 서열을 포함한다. 본 예에 따른 shRNA는 서열번호 18에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 대안적으로는, 본 예에 따른 shRNA는 서열번호 19에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
본 개시 내용의 예시적인 RNA인 shRNA는 서열번호 14에 나타낸 서열로 이루어진 이펙터 서열 및 서열번호 15에 나타낸 서열로 이루어진 이펙터 보체 서열을 포함한다. 본 예에 따른 shRNA는 서열번호 20에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 대안적으로는, 본 예에 따른 shRNA는 서열번호 21에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
본 명세서에 기재된 각각의 shRNA는 선택적으로 shRNA의 3' 말단에서 2개의 인접 우라실(UU)을, 예를 들어 RNA Pol III 프로모터로부터의 전사 종결의 결과로서 추가로 포함할 수 있다.
본 개시 내용은, 즉 RNAi를 유도해낼 수 있는 복수의 RNA를 또한 제공하며, 여기서 RNA 각각은 OPMD의 원인이 되는 PABPN1 단백질에 상응하는 RNA 전사물의 영역에 실질적으로 상보적인 적어도 17개의 인접한 뉴클레오티드의 이펙터 서열을 포함하고, 복수의 적어도 하나의 RNA는 본 명세서에 나타낸 바와 같은 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 RNA이다. 바람직하게는, 복수의 RNA 각각은 길이가 30개 미만의 뉴클레오티드인 이펙터 서열을 포함한다. 예를 들어 적합한 이펙터 서열은 길이가 17개 내지 29개의 뉴클레오티드 범위일 수 있다.
서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는, ssRNA, dsRNA 및 shRNA를 포함하는 예시적인 RNA가 기재되었으며, 본 개시 내용의 이러한 예에 필요한 변경을 가하여 적용될 수 있는 것으로 여겨진다.
본 개시 내용에 따른 복수의 RNA는 본 명세서에 기재된 바와 같은 RNA 2개를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 본 개시 내용에 따른 복수의 RNA는 본 명세서에 기재된 RNA 3개를 포함할 수 있다.
이에 따라, 본 개시 내용에 따른 복수의 RNA는, 표 1에 나타낸 바와 같이, OPMD의 원인이 되는 PABPN1 단백질에 상응하는 RNA 전사물의 영역에 실질적으로 상보적인 적어도 17개의 인접한 뉴클레오티드를 갖는 이펙터 서열을 포함하는 본 명세서에 기재된 RNA를 하나 이상 포함할 수 있다.
일 예에서, 복수 중 적어도 하나의 RNA의 이펙터 서열은 서열번호 1에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적이다.
일 예에서, 복수 중 적어도 하나의 RNA의 이펙터 서열은 서열번호 2에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적이다.
일 예에서, 복수 중 적어도 하나의 RNA의 이펙터 서열은 서열번호 3에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적이다.
일 예에서, 복수 중 적어도 하나의 RNA의 이펙터 서열은 서열번호 1에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적이고, 복수 중 또 다른 RNA의 이펙터 서열은 서열번호 2에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적이다.
일 예에서, 복수 중 적어도 하나의 RNA의 이펙터 서열은 서열번호 1에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적이고, 복수 중 또 다른 RNA의 이펙터 서열은 서열번호 3에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적이다.
일 예에서, 복수 중 적어도 하나의 RNA의 이펙터 서열은 서열번호 2에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적이고, 복수 중 또 다른 RNA의 이펙터 서열은 서열번호 3에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적이다.
일 예에서, 복수 중 적어도 하나의 RNA의 이펙터 서열은 서열번호 1에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적이고, 복수 중 또 다른 RNA의 이펙터 서열은 서열번호 2에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적이고, 복수 중 여전히 또 다른 RNA의 이펙터 서열은 서열번호 3에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적이다.
서열번호 1 내지 서열번호 3 중 하나에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적인 적어도 17개의 인접한 뉴클레오티드의 이펙터 서열을 포함하는, ssRNA, dsRNA, shRNA 및 shmiRNA를 포함하는, 예시적인 RNA가 본 명세서에 기재된다.
일 예에서, 본 개시 내용은 ssRNA인 복수의 RNA를 제공하며, 이들 각각은 표 2에 "이펙터 서열"로 명명된 열에 나타낸 이펙터 서열에 실질적으로 동일한 이펙터 서열을 포함한다.
본 개시 내용의 예시적인 복수의 ssRNA는:
(i) 서열번호 4에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열을 포함하는 ssRNA; 및
(ii) 서열번호 6에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열을 포함하는 ssRNA
를 포함한다.
본 개시 내용의 예시적인 복수의 ssRNA는:
(i) 서열번호 4에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열을 포함하는 ssRNA; 및
(ii) 서열번호 8에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열을 포함하는 ssRNA
를 포함한다.
본 개시 내용의 예시적인 복수의 ssRNA는:
(i) 서열번호 6에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열을 포함하는 ssRNA; 및
(ii) 서열번호 8에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열을 포함하는 ssRNA
를 포함한다.
본 개시 내용의 예시적인 복수의 ssRNA는:
(i) 서열번호 4에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열을 포함하는 ssRNA;
(ii) 서열번호 6에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열을 포함하는 ssRNA; 및
(iii) 서열번호 8에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열을 포함하는 ssRNA
를 포함한다.
일 예에서, 본 개시 내용은 dsRNA인 복수의 RNA를 제공하며, 이들 각각은 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열을 포함하며, 여기서 이들 각각의 RNA의 이펙터 서열은 표 3에서 "이펙터 보체"로 명명된 열에 나타낸 이펙터 보체 서열에 실질적으로 상보적이다. 예를 들어, 각각의 dsRNA 이펙터 서열은 표 3에서 "이펙터"로 명명된 열에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 동족 이펙터 보체 서열은 표 3에서 "이펙터 보체"로 명명된 열에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
표 3에서 "이펙터 보체"로 명명된 열에 나타낸 이펙터 보체 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 예시적인 dsRNA가 본 명세서에 기재된다.
본 개시 내용의 예시적인 복수의 RNA는:
(i) 서열번호 4에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 5에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 dsRNA; 및
(ii) 서열번호 6에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 7에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 dsRNA
를 포함한다.
본 개시 내용의 예시적인 복수의 RNA는:
(i) 서열번호 4에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 5에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 dsRNA; 및
(ii) 서열번호 8에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 9에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 dsRNA
를 포함한다.
본 개시 내용의 예시적인 복수의 RNA는:
(i) 서열번호 6에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 7에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 dsRNA; 및
(ii) 서열번호 8에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 9에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 dsRNA
를 포함한다.
본 개시 내용의 예시적인 복수의 RNA는:
(i) 서열번호 4에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 5에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 dsRNA;
(ii) 서열번호 6에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 7에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 dsRNA; 및
(iii) 서열번호 8에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 9에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 dsRNA
를 포함한다.
또 다른 예에서, 본 개시 내용의 복수의 RNA는 복수의 shRNA로서 제공되며, 여기서 각각의 shRNA의 이펙터 서열은 표 4에 "이펙터 보체"로 명명된 열에 나타낸 이펙터 보체 서열에 실질적으로 상보적이다. 예를 들어, 각각의 shRNA의 이펙터 서열은 표 4에 "이펙터"로 명명된 열에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 동족 이펙터 보체 서열은 표 4에서 "이펙터 보체"로 명명된 열에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
표 4에 "이펙터 보체"로 명명된 열에 나타낸 이펙터 보체 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 예시적인 shRNA가 본 명세서에 기재된다.
본 개시 내용의 예시적인 복수의 RNA는:
(i) 서열번호 10에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 11에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA; 및
(ii) 서열번호 12에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 13에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA
를 포함한다.
본 개시 내용의 예시적인 복수의 RNA는:
(i) 서열번호 10에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 11에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA; 및
(ii) 서열번호 14에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 15에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA
를 포함한다.
본 개시 내용의 예시적인 복수의 RNA는:
(i) 서열번호 12에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 13에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA; 및
(ii) 서열번호 14에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 15에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA
를 포함한다.
본 개시 내용의 예시적인 복수의 RNA는:
(i) 서열번호 10에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 11에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA; 및
(ii) 서열번호 12에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 13에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA; 및
(iii) 서열번호 14에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 15에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA
를 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 복수의 shRNA 각각은 상응하는 이펙터 서열과 이펙터 보체 서열 사이에 위치되는 스템 루프 서열을 포함하여 shRNA가 단일의 인접한 서열을 형성하도록 할 것이다. 예시적인 shRNA는 본 명세서에서, 예를 들어 표 5에 기재된다.
일 예에서, 본 개시 내용은 복수의 RNA를 제공하며, 여기서 복수의 RNA는:
(i) 서열번호 16에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA; 및
(ii) 서열번호 18에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA
를 포함하거나 이로 이루어진다.
일 예에서, 본 개시 내용은 복수의 RNA를 제공하며, 여기서 복수의 RNA는:
(i) 서열번호 16에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA; 및
(ii) 서열번호 20에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA
를 포함하거나 이로 이루어진다.
일 예에서, 본 개시 내용은 복수의 RNA를 제공하며, 여기서 복수의 RNA는:
(i) 서열번호 18에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA; 및
(ii) 서열번호 20에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA
를 포함하거나 이로 이루어진다.
일 예에서, 본 개시 내용은 복수의 RNA를 제공하며, 여기서 복수의 RNA는:
(i) 서열번호 16에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA;
(ii) 서열번호 18에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA; 및
(iii) 서열번호 20에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA
를 포함하거나 이로 이루어진다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 각각의 shRNA는 선택적으로 shRNA의 3' 말단에서 2개의 인접 우라실(UU)을, 예를 들어 RNA Pol III 프로모터로부터의 전사 종결의 결과로서 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 본 개시 내용의 복수의 RNA는 복수의 shmiRNA로서 제공되며, 여기서 각각의 shmiRNA의 이펙터 서열은 표 4에서 "이펙터 보체"로 명명된 열에 나타낸 이펙터 보체 서열에 실질적으로 상보적이다. 예를 들어, 각각의 shmiRNA의 이펙터 서열은 표 4에 "이펙터"로 명명된 열에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 동족 이펙터 보체 서열은 표 4에서 "이펙터 보체"로 명명된 열에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
표 4에서 "이펙터 보체"로 명명된 열에서 나타낸 이펙터 보체 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 예시적인 shmiRNA이 본 명세서에서 기재된다.
본 개시 내용의 예시적인 복수의 RNA는:
(i) 서열번호 10에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 11에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiRNA; 및
(ii) 서열번호 12에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 13에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiRNA
를 포함한다.
본 개시 내용의 예시적인 복수의 RNA는:
(i) 서열번호 10에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 11에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiRNA; 및
(ii) 서열번호 14에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 15에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiRNA
를 포함한다.
본 개시 내용의 예시적인 복수의 RNA는:
(i) 서열번호 12에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 13에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiRNA; 및
(ii) 서열번호 14에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 15에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiRNA
를 포함한다.
본 개시 내용의 예시적인 복수의 RNA는:
(i) 서열번호 10에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 11에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiRNA;
(ii) 서열번호 12에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 13에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiRNA; 및
(iii) 서열번호 14에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 15에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shmiRNA
를 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 복수의 shmiRNA 각각은 상응하는 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열 사이에 위치된 스템 루프 서열을 포함하여 shmiRNA가 단일한 인접 서열을 형성하도록 할 것이다. 예시적인 shmiRNA는 본 명세서에서, 예를 들어 표 5에 기재된다.
일 예에서, 본 개시 내용은 복수의 RNA를 제공하며, 여기서 복수의 RNA는:
(i) 서열번호 16에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shmiRNA; 및
(ii) 서열번호 18에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shmiRNA
를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일 예에서, 본 개시 내용은 복수의 RNA를 제공하며, 여기서 복수의 RNA는:
(i) 서열번호 16에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shmiRNA; 및
(ii) 서열번호 20에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shmiRNA
를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일 예에서, 본 개시 내용은 복수의 RNA를 제공하며, 여기서 복수의 RNA는:
(i) 서열번호 18에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shmiRNA; 및
(ii) 서열번호 20에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shmiRNA
를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일 예에서, 본 개시 내용은 복수의 RNA를 제공하며, 여기서 복수의 RNA는:
(i) 서열번호 16에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shmiRNA;
(ii) 서열번호 18에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shmiRNA; 및
(iii) 서열번호 20에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shmiRNA
를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
본 명세서에 기재된 각각의 shmiRNA는 선택적으로 mishRNA의 3' 말단에서 2개의 인접 우라실(UU)을, 예를 들어 RNA Pol III 프로모터로부터의 전사 종결의 결과로서 추가로 포함할 수 있다.
일 예에 따르면, 본 명세서에 기재된 복수의 RNA는 단일 조성물로서 함께 제공될 수 있다.
다른 예에 따르면, 본 명세서에 기재된 복수의 RNA는 다중 조성물로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 복수의 RNA 중 각각은 별도로 제공될 수 있다. 대안적으로는, 복수 중 적어도 하나의 RNA는 별도로 제공될 수 있거나, 복수 중 둘 이상은 조성물로 함께 제공될 수 있다.
본 개시 내용의 RNA 또는 복수의 RNA는 합성 RNA 또는 DNA-지향 RNA(ddRNA)를 포함할 수 있다. 합성 RNA는 통상적인 올리고뉴클레오티드 합성에 의한 것과 같이 당업계에서 알려진 방법에 의해 제조될 수 있으며, siRNA 약제의 반감기 및/또는 효능을 증가기키고/증가시키거나 더욱 강건한 전달 제형을 허용하기 위한 화학적 변경들을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 많은 화학적 변경이 알려져 있으며 당업계에서 잘 설명되어 있다.
일 예에서, 본 개시 내용의 RNA의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변경된다. 다른 예에서, "실질적으로 모든 뉴클레오티드가 변경된다"는 본 개시 내용의 RNA는 대체로 그러나 전체는 아니도록 변경되어, 5개, 4개, 3개, 2개, 또는 1개 이하의 변경되지 않은 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일 예에서, 본 개시 내용의 RNA는 하나 이상의 오버행(overhang) 영역 및/또는 듀플렉스의 하나 또는 두 가닥 모두의, 3'-말단, 5'-말단, 또는 양 말단 모두에서 캡핑기를 포함한다. 오버행 영역은 길이 1개 내지 6개의 뉴클레오티드, 예를 들어 길이 2개 내지 6개의 뉴클레오티드, 길이 1개 내지 5개의 뉴클레오티드, 길이 2개 내지 5개의 뉴클레오티드, 길이 1개 내지 4개의 뉴클레오티드, 길이 2개 내지 4개의 뉴클레오티드, 길이 1개 내지 3개의 뉴클레오티드, 길이 2개 내지 3개의 뉴클레오티드, 또는 길이 1개 내지 2개의 뉴클레오티드일 수 있다. 오버행은 다른 하나보다 더 긴 한 가닥의 결과, 또는 엇갈린(staggered) 동일 길이의 두 가닥의 결과일 수 있다. 오버행은 표적 mRNA와 미스매치를 형성할 수 있거나, 표적화되는 유전자 서열에 상보적일 수 있거나 또는 다른 서열일 수 있다. 제1 및 제2 가닥은 또한 예를 들어, 헤어핀을 형성하도록 추가의 염기에 의해 또는 기타 다른 비-염기 링커에 의해 연결될 수 있다.
일 예에서, RNA의 오버행 영역에서 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 2'-당 변경된, 예컨대 2-F, 2'-O-메틸, 티미딘(T), 데옥시-티민(dT), 2'-O-메톡시에틸-5-메틸유리딘(Teo), 2'-O-메톡시에틸아데노신(Aeo), 2'-O-메톡시에틸-5-메틸시티딘(m5Ceo), 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 변경된 또는 변경되지 않은 뉴클레오티드이다. 예를 들어, dTdT는 어느 하나의 가닥 상의 어느 하나의 말단에 대한 오버행 서열일 수 있다. 오버행은 표적 mRNA와 미스매치를 형성할 수 있거나, 이는 표적화되는 유전자 서열에 상보적이거나 또 다른 서열일 수 있다.
RNA의 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 두 가닥 모두에서 5'- 또는 3'-오버행은 인산화될 수 있다. 일부 예에서, 오버행 영역(들)은 2개의 뉴클레오티드 사이의 포스포로티오에이트를 갖는 2개의 뉴클레오티드를 함유하고, 여기서 2개의 뉴클레오티드는 동일하거나 상이할 수 있다.
일 예에서, 본 개시 내용의 RNA는 단지 하나의 오버행을 함유하며, 이는 그의 전체 안정성에 영향을 미치지 않고 RNA의 간섭 활성을 강화할 수 있다. 예를 들어, 단일-가닥 오버행은 이펙터 서열의 3'-종결 말단에, 또는 대안적으로는 이펙터 보체 서열의 3'-종결 말단에 위치된다. 일 예에서, RNA는, 이펙터 보체 서열(또는 이펙터 서열의 3'-말단)에 위치한, 블런트(blunt) 말단, 또는 그 반대를 또한 포함한다.
변경은 예를 들어, 말단 변경, 예를 들어, 5'-말단 변경(인산화, 컨쥬게이션(conjugation), 역전된 연결) 또는 3'-말단 변경(컨쥬게이션, DNA 뉴클레오티드, 역전된 연결, 등); 염기 변경, 예를 들어, 안정화 염기, 탈안정화 염기, 또는 파트너의 확장된 레퍼터리, 염기의 제거(비염기성 뉴클레오티드), 또는 컨쥬게이트된 염기와 염기 쌍을 형성하는 염기; 당 변경(예를 들어, 2'-위치 또는 4'-위치에서) 또는 당의 대체; 및/또는 인산디에스테르 연결의 변경 또는 대체를 포함하는, 골격 변경을 포함한다. 본 개시 내용에서 유용한 RNA의 특정 예는 변경된 골격 또는 비천연 뉴클레오티드간 연결을 함유하는 RNA를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 변경된 골격을 갖는 RNA들은 특히, 골격에 인 원자를 갖지 않는 것들을 포함한다. 본 명세서의 목적을 위해, 그리고 당업계에서 때때로 언급되는 바와 같이, 그의 뉴클레오티드간 골격에 인 원자를 갖지 않는 변경된 RNA는 또한 올리고뉴클레오시드인 것으로 간주될 수 있다. 일부 예에서, 변경된 RNA는 그의 뉴클레오시드간 골격 내에 인 원자를 가질 것이다. 인-함유 연결의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허로는 미국 특허 7,015,315; 7,041,816; 7,273,933; 7,321,029; 및 미국 특허 RE39464가 포함되지만 이로 한정되지는 않는다.
그 안에 인 원자를 포함하지 않는 변경된 RNA 골격은 짧은 사슬 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 또는 하나 이상의 짧은 사슬 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 뉴클레오시드간 연결에 의해 형성되는 골격을 갖는다. 이들은 모르폴리노 연결(뉴클레오시드의 당 부분으로부터 일부 형성됨)을 갖는 것들; 실록산 골격; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아미드 골격; 아미드 골격; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 갖는 기타 다른 것들을 포함한다. 이들 올리고뉴클레오시드의 예시적인 형태를 교시하는 대표적인 미국 특허로는, 미국 특허 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 및 5,677,439가 포함되지만, 이로 한정되지는 않는다.
다른 예에서, 본 개시 내용의 RNA(들)는 RNA 모방체이거나 이를 포함하며, 예를 들어, 뉴클레오티드 단위의 골격은 신규 기로 대체된다. 염기 단위는 적절한 핵산 표적 화합물과의 혼성화를 위해 유지된다. 그러한 한 올리고머성 화합물인, 뛰어난 혼성화 특성을 갖는 것으로 나타난 RNA 모방체는 펩티드 핵산(PNA)으로서 지칭된다. PNA 화합물에서, RNA의 당 골격은 아미드 함유 골격, 특히 아미노에틸글리신 골격으로 대체된다. 핵염기는 유지되어, 골격의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 대해 직접적 또는 간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허로는 미국 특허 5,539,082; 5,714,331; 및 5,719,262가 포함되지만, 이로 한정되지는 않는다.
변경된 RNA는 또한 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 포함할 수 있다. RNA, 예를 들어 본 명세서에서 특징된 dsRNA는 2'-위치에서: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬 중 하나를 포함할 수 있고, 여기서 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환 또는 비치환된 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있다. 예시적인 적합한 변경은 O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH1)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2를 포함하고, 여기서 n 및 m은 1 내지 약 10이다.
개시 내용의 RNA는 또한 핵염기(당업계에서 종종 단순히 "염기"로서 지칭됨) 변경 또는 치환을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은, "변경되지 않은" 또는 "천연" 핵염기는 퓨린 염기인 아데닌(A) 및 구아닌(G)을 포함하고, 피리미딘 염기인 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. 변경된 핵염기는, 데옥시-티민(dT), 5-메틸시토신(5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 아데닌 및 구아닌의 기타 다른 알킬 유도체들, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 기타 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 유사체 기타 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-다아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌과 같은 기타 다른 합성 및 천연 핵염기를 포함한다.
본 개시 내용의 RNA는 또한 하나 이상의 잠긴(locked) 핵산(LNA)을 포함하도록 변경될 수 있다. 잠긴 핵산은 리보오스 모이어티가 2' 및 4' 탄소를 연결하는 추가의 브릿지를 포함하는 변경된 리보오스 모이어티를 갖는 뉴클레오티드이다. 이 구조는 3'-엔도 구조 입체배좌에서 리보오스를 효과적으로 "잠근다". siRNA로의 잠긴 핵산의 첨가는 혈청에서 siRNA 안정성을 증가시키고, 표적을 벗어난 효과를 감소키는 것으로 나타났다(문헌 [Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447]).
RNA의 말단에 대한 잠재적으로 안정화하는 변경은 N-(아세틸아미노카프로일)-4-히드록시프롤리놀(Hyp-C6-NHAc), N-(카프로일-4-히드록시프롤리놀(Hyp-C6), N-(아세틸-4-히드록시프롤리놀(Hyp-NHAc), 티미딘-2'-O-데옥시티미딘(에테르), N-(아미노카프로일)-4-히드록시프롤리놀(Hyp-C6-아미노), 2-도코사노일-우리딘-3"-포스페이트, 전환된 염기 dT(idT) 및 기타를 포함할 수 있다. 이러한 변경의 개시 내용은 PCT 공보 WO 2011/005861에서 찾을 수 있다.
일 예에서, 본 개시 내용의 RNA는 화학적으로 합성된다. 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 특정 변경된 올리고뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 결여한 올리고뉴클레오티드의 일부)는, 예를 들어 문헌 [Caruthers et al., (1992), Methods in Enzymology 211, 3-19], WO 99/54459, [Wincott et al., (1995), Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684], [Wincott et al., (1997)], [Methods Mol. Bio., 74, 59], [Brennan et al., (1998), Biotechnol Bioeng., 61, 33-45], 및 Brennan의 미국 특허 6,001,311에 기재된 바와 같은, 당업계에 알려진 프로토콜을 이용하여 합성된다. 올리고뉴클레오티드의 합성은 일반적인 핵산 보호 및 커플링 기, 예컨대 5'-말단에서 디메톡시트리틸, 및 3'-말단에서 포스포아미다이트를 이용한다.
변경이 없는 RNA는 문헌 [Usman et al., (1987), J. Am. Chem. Soc., 109, 7845]; [Scaringe et al., (1990), Nucleic Acids Res., 18, 5433]에 기재된 바와 같은 절차를 이용하여 합성된다. 이들 합성은 본 개시 내용의 특정 RNA에 대해 사용될 수 있는, 일반적인 핵산 보호 및 커플링 기, 예컨대 5'-말단에서 디메톡시트리틸, 및 3'-말단에서 포스포아미다이트를 이용한다.
특정 예에서, 본 개시 내용의 RNA는 미국 특허 6,995,259, 6,686,463, 6,673,918, 6,649,751, 및/또는 6,989,442에 기재된 방법에 따라 합성, 탈보호 및 분석된다.
대안적인 예에서, 본 개시 내용의 RNA는 별개의 성분으로서 합성되고, 예를 들어 결찰(문헌 [Moore et al., (1992), Science 256, 9923] 또는 WO 93/23569)에 의해, 또는 합성 및/또는 탈보호 후 혼성화에 의해, 후-합성적으로 함께 합쳐진다.
ddRNAi
shRNA 또는 shmiRNA인 본 개시 내용의 RNA는 핵산으로부터 전사될 수 있다. 따라서, 일 예에서 본 개시 내용은 본 개시 내용의 RNA를 인코딩하는 핵산을 제공한다.
일 예에서, 핵산은 DNA이다.
또 다른 예에서, 본 개시 내용은 본 개시 내용의 복수의 RNA를 인코딩하는 핵산을 제공한다.
또 다른 예에서, 본 개시 내용은 본 개시 내용의 복수의 RNA를 인코딩하는 복수의 핵산을 제공한다. 예를 들어, 복수의 핵산 각각은 본 명세서에 기재된 단일 RNA를 인코딩할 수 있다. 또 다른 예에서, 하나 이상의 핵산은 복수의 RNA를 인코딩하며, 예를 들어 복수의 핵산은 본 개시 내용의 둘 이상의 RNA를 인코딩하고 복수의 또 다른 핵산은 본 개시 내용의 하나 이상의 RNA를 인코딩한다.
일 예에서, 본 명세서에 기재된 복수의 핵산은 예를 들어 단일 조성물에서 함께 제공된다.
또 다른 예에서, 본 명세서에 기재된 복수의 핵산은 복수의 성분, 예를 들어 복수의 조성물로서 제공된다. 예를 들어, 복수의 핵산 각각은 개별적으로 제공될 수 있다. 대안적으로는, 본 개시 내용의 적어도 3개의 핵산이 제공되는 예에서, 핵산 중 적어도 하나는 개별적으로 제공될 수 있으며, 복수 중 둘 이상은 함께 제공될 수 있다.
일부 예에서, 본 개시 내용의 핵산은 예를 들어 RNA의 전사를 촉진하기 위하여 하나 이상의 추가의 성분을 포함한다. 예를 들어, 핵산은 본 개시 내용의 RNA를 인코딩하는 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 기타 다른 성분들은 예를 들어 전사 종결자는 당업계에서 알려져 있고/있거나 본 명세서에 기재되어 있다.
일 예에서, 핵산은 DNA-지향 RNAi(ddRNAi) 구조물이다.
일 예에서, ddRNAi 구조물은 프로모터에 작동적으로 연결된 본 개시 내용의 RNA를 인코딩하는 서열을 포함한다.
일 예에서, ddRNAi 구조물은 본 개시 내용의 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열을 포함하는 RNA를 인코딩하는 서열을 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 개시 내용의 RNA는, PABPN1 단백질에 상응하는 RNA 전사물의 영역에 실질적으로 상보적인 적어도 17개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 이펙터 서열을 포함할 것이며, 여기서 RNA 전사물의 영역은 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나에 나타낸다. 예시적인 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열은 표 4에 나타낸다.
예를 들어, 서열은 프로모터, 예를 들어 U6 또는 H1에 작동적으로 연결될 수 있다. 일 예에서, 두 서열은 모두 동일한 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 일 예에서, 두 서열 모두는 상이한 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다.
일 예에서, 본 개시 내용은 이펙터 서열을 인코딩하는 서열 및 이펙터 보체 서열을 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물을 제공하며, 여기서 이펙터 서열은 표 4에 "이펙터 보체"로 명명된 열에 기재된 이펙터 보체 서열에 실질적으로 상보적이다. 예를 들어, 표 4에서 "이펙터 보체"로 명명된 열에 기재된 이펙터 보체 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열은, 표 4에서 상응하는 이펙터 보체 서열과 듀플렉스된 경우 0개, 1개, 2개, 3개 또는 4개의 미스매치를 포함할 수 있다.
일 예에서, 본 개시 내용은, 4개의 염기 미스매치를 제외하고, 표 4에 "이펙터 보체"로 명명된 열에 기재된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물을 제공한다.
일 예에서, 본 개시 내용은, 3개의 염기 미스매치를 제외하고, 표 4에 "이펙터 보체"로 명명된 열에 기재된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물을 제공한다.
일 예에서, 본 개시 내용은, 2개의 염기 미스매치를 제외하고, 표 4에 "이펙터 보체"로 명명된 열에 기재된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물을 제공한다.
일 예에서, 본 개시 내용은, 하나의 염기 미스매치를 제외하고, 표 4에 "이펙터 보체"로 명명된 열에 기재된 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물을 제공한다.
일 예에서, 본 개시 내용은 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열을 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물을 제공하며, 여기서 이펙터 서열은 표 4에서 "이펙터 보체"로 명명된 열에 기재된 서열에 대해 100% 상보적이다. 일 예에서, ddRNAi 구조물은 ddRNAi 구조물에 의해 인코딩된 이펙터 서열에 대해 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다.
본 개시 내용의 예시적인 ddRNAi 구조물은 표 4에 기재된 바와 같은 상응하는 이펙터 및 이펙터 보체 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다.
일 예에서, 본 개시 내용은 이펙터 서열을 인코딩하는 서열 및 이펙터 보체 서열을 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물을 제공하며, 여기서 이펙터 서열은 표 4에 "이펙터"로 명명된 열에 나타낸 서열로 이루어진다. 일 예에서, 이펙터 보체 서열은 표 4에서 "이펙터 보체"로서 명명된 열에 나타낸 서열로 이루어진다.
본 개시 내용의 예시적인 ddRNAi 구조물은 서열번호 10에 나타낸 서열로 이루어지는 이펙터 서열을 인코딩하는 서열 및 서열번호 11에 나타낸 서열로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다.
본 개시 내용의 또 다른 예시적인 ddRNAi 구조물은 서열번호 12에 나타낸 서열로 이루어지는 이펙터 서열을 인코딩하는 서열 및 서열번호 13에 나타낸 서열로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다.
본 개시 내용의 추가의 예시적인 ddRNAi 구조물은 서열번호 14에 나타낸 서열로 이루어지는 이펙터 서열을 인코딩하는 서열 및 서열번호 15에 나타낸 서열로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다.
또 다른 예에서, 본 개시 내용은 본 개시 내용의 복수의 RNA를 인코딩하고, 본 개시 내용의 RNA 및 RNAi를 유도할 수 있는 적어도 하나의 기타 다른 RNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물을 제공한다.
일 예에서, 본 개시 내용은 본 개시 내용의 복수의 RNA를 인코딩하는 ddRNAi 구조물을 제공하며, 여기서 각각의 RNA는 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 (또는 각각의) RNA의 이펙터 서열은 표 4에서 "이펙터 보체"로 명명된 열에 기재된 서열에 실질적으로 상보적이다. 표 4에 "이펙터 보체"로 명명된 열에 기재된 서열에 대해 "실질적으로 상보적인" 이펙터 서열을 포함하는 본 개시 내용의 예시적인 RNA가 기재되었으며, 본 개시 내용의 이러한 예에 필요한 변경을 가하여 적용되는 것으로 여겨질 것이다. 그러나, 일 예에서 본 개시 내용은 본 개시 내용의 복수의 RNA를 인코딩하는 ddRNAi 구조물을 제공하며, 여기서 각각의 RNA는 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 (또는 각각의) RNA의 이펙터 서열은 표 4에 "이펙터"로 명명된 열에 나타낸 서열로 이루어진다. 일 예에서, 적어도 하나의 (또는 각각의) RNA의 이펙터 보체 서열은 표 4에 "이펙터 보체"로 명명된 열에 나타낸 서열로 이루어진다.
일 예에서, 본 개시 내용은 본 개시 내용의 복수의 RNA를 인코딩하는 ddRNAi 구조물을 제공하며, 이들 각각은 RNAi를 유도할 수 있고, 여기서:
(i) 적어도 하나의 RNA는 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열을 포함하고, 여기서 RNA의 이펙터 서열은 표 4에서 "이펙터"로 명명된 열에 나타낸 서열로 이루어지고(일 예에서, 각각의 RNA의 이펙터 보체 서열은 표 4에 "이펙터 보체"로 명명된 열에 나타낸 서열로 이루어진다);
(ii) 적어도 하나의 RNA는 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열을 포함하고, 여기서 RNA의 이펙터 서열은 OPMD의 원인이 되는 PABPN1 단백질에 상응하는 RNA 전사물의 영역에 실질적으로 상보적인 적어도 17개의 인접한 뉴클레오티드의 서열로 이루어진다.
예를 들어, (ii)의 적어도 하나의 RNA는 (i)의 RNA와 상이할 수 있지만, 표 4에서 "이펙터"로 명명된 열에 나타낸 서열로 이루어진다(일 예에서, 각각의 RNA의 이펙터 보체 서열은 표 4에서 "이펙터 보체"로 명명된 열에 나타낸 서열로 이루어진다).
본 개시 내용의 예시적인 ddRNAi 구조물은:
(i) 서열번호 10에 나타낸 서열로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 11에 나타낸 서열로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 RNA를 인코딩하는 서열; 및
(ii) 서열번호 12에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 13에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 RNA를 인코딩하는 서열
을 포함한다.
본 개시 내용의 예시적인 ddRNAi 구조물은:
(i) 서열번호 10에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 11에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 RNA를 인코딩하는 서열; 및
(ii) 서열번호 14에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 15에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 RNA를 인코딩하는 서열
을 포함한다.
본 개시 내용의 예시적인 ddRNAi 구조물은:
(i) 서열번호 12에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 13에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 RNA를 인코딩하는 서열; 및
(ii) 서열번호 14에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 15에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 RNA를 인코딩하는 서열
을 포함한다.
본 개시 내용의 또 다른 예시적인 ddRNAi는:
(i) 서열번호 10에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 11에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 RNA를 인코딩하는 서열;
(ii) 서열번호 12에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 13에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 RNA를 인코딩하는 서열; 및
(iii) 서열번호 14에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 15에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 RNA를 인코딩하는 서열
을 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 개시 내용의 shRNA 및/또는 shmiRNA는, 상응하는 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열 사이에 위치된 스템 루프 서열을 포함하여 개별적인 RNA가 단일한 인접 서열을 형성하도록 할 것이다. 이에 따라, 본 개시 내용의 ddRNAi는 상응하는 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열을 각각 인코딩하는 서열 사이에 위치된 스템 루프를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
일 예에서, ddRNAi 구조물은 프로모터에 작동적으로 연결된 본 개시 내용의 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함한다. 예를 들어, 본 개시 내용의 ddRNAi 구조물은 프로모터, 예를 들어 U6 또는 H1 프로모터에 작동적으로 연결된 표 5에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함한다.
예시적인 ddRNAi 구조물은 서열번호 16 또는 서열번호 17에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일 예에서, ddRNAi 구조물은 서열번호 16에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일 예에서, ddRNAi 구조물은 서열번호 17에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA을 인코딩하는 서열을 포함한다.
예시적인 ddRNAi 구조물은 서열번호 18 또는 서열번호 19에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일 예에서, ddRNAi 구조물은 서열번호 18에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일 예에서, ddRNAi 구조물은 서열번호 19에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함한다.
예시적인 ddRNAi 구조물은 서열번호 20 또는 서열번호 21에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일 예에서, ddRNAi 구조물은 서열번호 20에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일 예에서, ddRNAi 구조물은 서열번호 21에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함한다.
본 개시 내용은 본 개시 내용의 적어도 하나의 shRNAi를 포함하는 복수의 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물을 또한 제공한다.
일 예에서, 본 개시 내용은 복수의 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물을 제공하며, 여기서 각각의 shRNA는 OPMD의 원인이 되는 PABPN1 단백질에 상응하는 RNA 전사물의 영역에 실질적으로 상보적인 적어도 17개의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 shRNA는 표 4에 "이펙터 보체"로 명명된 열에 나타낸 이펙터 보체 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함한다. 표 4에 "이펙터 보체"로 명명된 열에 나타낸 이펙터 보체 서열에 실질적으로 상보적인 예시적인 이펙터 서열은 기재되었으며, 본 개시 내용의 이러한 예에 필요한 변경을 가하여 적용되는 것으로 여겨질 수 있다. 예를 들어, ddRNAi 구조물에 의해 인코딩된 복수 중 적어도 하나의 shRNA의 이펙터 서열은 표 4에서 "이펙터"로 명명된 열에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다(예를 들어, 동족 이펙터 보체 서열은 표 4에서 "이펙터 보체"로 명명된 열에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다).
또 다른 예에서, 본 개시 내용은 복수의 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물을 제공하고, 여기서 각각의 shRNA의 이펙터 서열은 표 4에서 "이펙터"로 명명된 열에 나타낸 이펙터 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 개별적인 shRNA의 동족 이펙터 보체 서열은 표 4에 "이펙터 보체"로 명명된 열에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 표 4에 "이펙터 보체"로 명명된 열에 나타낸 이펙터 보체 서열에 대해 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 예시적인 shRNA가 본 명세서에 기재된다.
본 개시 내용의 예시적인 ddRNAi 구조물은 복수의 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있으며, 이러한 복수의 shRNA는:
(i) 서열번호 10에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 11에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA; 및
(ii) 서열번호 12에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 13에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA
를 포함한다.
본 개시 내용의 예시적인 ddRNAi 구조물은 복수의 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있으며, 복수의 shRNA는:
(i) 서열번호 10에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 11에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA; 및
(ii) 서열번호 14에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 15에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA
를 포함한다.
본 개시 내용의 예시적인 ddRNAi 구조물은 복수의 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있으며, 복수의 shRNA는:
(i) 서열번호 12에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 13에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA; 및
(ii) 서열번호 14에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 15에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA
를 포함한다.
본 개시 내용의 예시적인 ddRNAi 구조물은 복수의 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있으며, 복수의 shRNA는:
(i) 서열번호 10에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 11에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA;
(ii) 서열번호 12에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 13에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA; 및
(iii) 서열번호 14에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 15에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA
를 포함한다.
본 개시 내용의 예시적인 shRNA가 표 5에 기재된다. 따라서, 본 개시 내용의 ddRNAi 구조물은 표 5에 기재된 복수의 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
일 예에서, 본 개시 내용은 복수의 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물을 제공하며, 여기서 복수의 shRNA는:
(i) 서열번호 16에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA; 및
(ii) 서열번호 18에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA
를 포함하거나 이로 이루어진다.
일 예에서, 본 개시 내용은 복수의 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물을 제공하며, 여기서 복수의 shRNA는:
(i) 서열번호 16에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA; 및
(ii) 서열번호 20에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA
를 포함하거나 이로 이루어진다.
일 예에서, 본 개시 내용은 복수의 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물을 제공하고, 여기서 복수의 shRNA는:
(i) 서열번호 18에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA; 및
(ii) 서열번호 20에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA
를 포함하거나 이로 이루어진다.
일 예에서, 본 개시 내용은 복수의 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물을 제공하고, 여기서 복수의 shRNA는:
(i) 서열번호 16에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA;
(ii) 서열번호 18에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA; 및
(iii) 서열번호 20에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA
를 포함하거나 이로 이루어진다.
본 개시 내용은 복수의 RNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물을 또한 제공하며, 상기 복수의 RNA는 서열번호 16에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA 및 본 개시 내용의 적어도 하나의 기타 다른 shRNA를 포함한다.
본 개시 내용은 복수의 RNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물을 또한 제공하며, 상기 복수의 RNA는 서열번호 18에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA 및 본 개시 내용의 적어도 하나의 기타 다른 shRNA를 포함한다.
본 개시 내용은 복수의 RNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물을 또한 제공하며, 상기 복수의 RNA는 서열번호 20에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA 및 본 개시 내용의 적어도 하나의 기타 다른 shRNA를 포함한다.
또 다른 예에서, 본 개시 내용은 프로모터에 작동적으로 연결된 shmiRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물을 제공한다. 예를 들어, 본 개시 내용의 ddRNAi 구조물은 프로모터, 예를 들어 RNA pol II 프로모터에 작동적으로 연결된 표 5에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shmiRNA를 인코딩하는 서열을 포함한다. 이펙터와 이펙터 보체 서열의 예시적인 조합이 본 개시 내용의 shRNA(들)를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물의 맥락에서 기재되었으며, shmiRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물을 기재하는 이러한 예에 필요한 변경을 가하여 적용될 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, ddRNAi 구조물은 프로모터에 작동적으로 연결된 본 개시 내용의 RNA(예를 들어, 본 개시 내용의 shRNA 또는 shmiRNA)를 인코딩하는 서열을 일반적으로 포함한다. 예를 들어, 본 개시 내용의 shRNA 또는 shmiRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물은 RNA pol III 프로모터, 예를 들어 U6 또는 H1 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 대안적으로, 본 개시 내용의 shRNA 또는 shmiRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물은 RNA pol II 프로모터, 예를 들어 UbC, CMV 또는 PGK 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. ddRNAi 구조물이 복수의 shRNA를 인코딩하는 경우, 복수의 shRNA 중 하나를 인코딩하는 서열 각각은 프로모터, 예를 들어 U6 또는 H1 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 대안적으로는, ddRNAi 구조물이 복수의 shRNA를 인코딩하는 경우, 복수의 shRNA를 인코딩하는 서열 각각은 동일한 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, Pol II 프로모터, 예를 들어 UbC, CMV 또는 PGK 프로모터는 복수의 shRNA 또는 shmiRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 더욱 큰 구조물의 발현을 유도하는 데 특히 유용할 수 있다.
종종 ddRNAi 구조물은 벡터, 예를 들어 플라스미드 또는 미니플라스미드 또는 바이러스성 벡터 내에 존재한다.
일 예에서, ddRNAi 구조물 내에서 본 개시 내용의 복수의 RNA(예를 들어, shRNA 또는 shmiRNA)를 인코딩하는 서열은 동일한 프로모터에 작동적으로 연결된다. 예를 들어, 구조물은 본 개시 내용의 상이한 shRNA 또는 shmiRNA를 인코딩하는 서열에 작동적으로 연결된 각각의 복제물과 동일한 프로모터의 복수의 복제물을 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 본 개시 내용의 shRNA 또는 shmiRNA를 인코딩하는 서열에 작동적으로 연결된 각각의 프로모터는 상이하다. 예를 들어, 본 개시 내용의 3개의 shRNA를 인코딩하는 ddRNAi 구조물에서, 개별적인 shRNA를 인코딩하는 3개의 서열은 상이한 프로모터에 각각 작동적으로 연결된다. 유사하게, 본 개시 내용의 3개의 shmiRNA를 인코딩하는 ddRNAi 구조물에서, 개별적인 shmiRNA를 인코딩하는 3개의 서열은 상이한 프로모터에 각각 작동적으로 연결된다.
추가의 예에서, 3개 이상의 shRNA를 인코딩하는 ddRNAi 구조물에서, shRNA 또는 shmiRNA를 인코딩하는 둘(이상)의 서열은 동일한 프로모터에 연결되고, RNA를 인코딩하는 하나(이상)의 서열은 상이한 프로모터에 연결된다.
일 예에서, 프로모터는 구성 프로모터이다. 프로모터와 관련하여 언급된 경우 용어 "구성"은 특정 자극(예를 들어, 열 쇼크, 화학물질, 광 등) 부재 하에서 작동적으로 연결된 핵산 서열의 전사를 지시할 수 있음을 의미한다. 통상적으로, 구성 프로모터는 실질적으로 임의의 세포 및 임의의 조직에서 코딩 서열의 발현을 지시할 수 있다. 본 개시 내용의 RNA를 전사하는 데 사용된 프로모터는 유비퀴틴, CMV,
Figure 112018113170220-pct00002
히스톤 H4, EF-1α 또는 RNA 폴리머라제 II에 의해 제어된 pgk 유전자에 대한 프로모터, 또는 RNA 폴리머라제 I에 의해 제어된 프로모터 성분을 포함한다.
일 예에서, Pol II 프로모터 예컨대 CMV, SV40, U1,
Figure 112020037744472-pct00003
또는 하이브리드 Pol II 프로모터가 사용된다. 기타 다른 적합한 Pol II 프로모터가 당업계에 알려져 있으며, 본 개시 내용의 이러한 예에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, Pol II 프로모터 계는, 드로샤와 파샤 효소의 작용에 의해, 하나 이상의 shmiRNA로 가공되는 pri-miRNA를 발현하는 본 개시 내용의 ddRNAi 구조물에서 바람직할 수 있다. Pol II 프로모터 계는 또한 단일 프로모터의 제어 하에서 복수의 shRNA 또는 shmiRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 본 개시 내용의 ddRNAi 구조물에서 바람직할 수 있다. 조직 특이성이 요구되는 경우, Pol II 프로모터 계가 또한 바람직할 수 있다.
또 다른 예에서, RNA 폴리머라제 III에 의해 제어된 프로모터, 예컨대 U6 프로모터(U6-1, U6-8, U6-9), H1 프로모터, 7SL 프로모터, 인간 Y 프로모터(hY1, hY3, hY4(예를 들어, 문헌 [Maraia, et al., (1994) Nucleic Acids Res 22(15):3045-52] 참조) 및 hY5(문헌 Maraia, et al., (1994) Nucleic Acids Res 24(18):3552-59] 참조), 인간 MRP-7-2 프로모터, 아데노바이러스 VA1 프로모터, 인간 tRNA 프로모터, 또는 5s 리보솜성 RNA 프로모터가 사용된다. Pol III 프로모터는 shRNA를 발현하는 본 개시 내용의 ddRNAi 구조물에서 바람직할 수 있다.
본 개시 내용의 ddRNAi 구조물에서의 이용에 적합한 프로모터는 미국 특허 8,008,468 및 미국 특허 8,129,510에 기재되어 있다.
일 예에서, 프로모터는 RNA pol III 프로모터이다. 예를 들어, 프로모터는 U6 프로모터이다. 또 다른 예에서, 프로모터는 H1 프로모터이다.
구조물 내 프로모터가 U6 프로모터인 경우, 이는 U6-1 프로모터, U6-8 프로모터 또는 U6-9 프로모터(예를 들어, 문헌 [Domitrovich, et al., (2003) Nucleic Acids Res, 31:2344-2352] 참조)일 수 있다. 예를 들어, 구조물 내 프로모터는 U6-1 프로모터이다. 예를 들어, 구조물 내 프로모터는 U6-8 프로모터이다. 예를 들어, 구조물 내 프로모터는 U6-9 프로모터이다.
본 개시 내용의 복수의 shRNA를 인코딩하는 ddRNAi 구조물의 경우, shRNA 중 적어도 하나를 인코딩하는 서열은 U6 프로모터에 작동적으로 연결되고, 적어도 기타 다른 하나의 RNA를 인코딩하는 서열은 H1 프로모터에 작동적으로 연결된다.
본 개시 내용의 3개의 shRNA를 인코딩하는 ddRNAi 구조물의 경우, 2개의 shRNA를 인코딩하는 서열은 U6 프로모터에 각각 작동적으로 연결되고, 다른 RNA를 인코딩하는 서열은 H1 프로모터에 작동적으로 연결된다. 예를 들어, 5'에서 3' 방향으로 고려되는 경우, 제1 및 제2 서열은 U6 프로모터에 각각 작동적으로 연결되고, 제3 서열은 H1 프로모터에 작동적으로 연결된다. 예를 들어, 5'에서 3' 방향으로 고려되는 경우, 제1 서열은 U6-1 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있고, 제2 서열은 U6-9 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있고, 제3 서열은 H1 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다.
또 다른 예에서, 2개의 RNA를 인코딩하는 서열은 H1 프로모터에 각각 작동적으로 연결되고, 다른 RNA를 인코딩하는 서열은 U6 프로모터에 작동적으로 연결된다.
일부 예에서, 가변적 강도의 프로모터가 이용된다. 예를 들어, 둘 이상의 강한 프로모터(예컨대 Pol III형 프로모터)의 이용은, 예를 들어 이용가능한 뉴클레오티드 또는 전사에 필요한 기타 다른 세포 성분의 풀을 고갈시킴으로써 세포에 부담을 줄 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 몇몇 강한 프로모터의 이용은 세포에서 RNAi 약제의 발현의 독성 수준을 유발할 수 있다. 이에 따라, 일부 예에서 다중-프로모터 ddRNAi 구조물에서 하나 이상의 프로모터는 구조물에서 기타 다른 프로모터보다 더 약하거나, 구조물 내 모든 프로모터는 최대 속도 미만으로 shRNA를 발현할 수 있다. 프로모터는 또한 각종 분자 기법을 이용하여 변경될 수 있거나, 다르게는 예를 들어, 각종 조절 성분의 변경을 통해, 보다 적은 수준 또는 보다 강한 수준의 전사를 획득한다. 감소된 전사 달성의 한 수단은 프로모터 활성을 제어하는 것으로 알려진 프로모터 내에서 서열 성분을 변경하는 것이다. 예를 들어, 근위 서열 성분(PSE)은 인간 U6 프로모터의 활성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(예를 들어, 문헌 [Domitrovich,　et al., (2003)　Nucleic Acids Res　31:　2344-2352] 참조). 강한 프로모터, 예컨대 인간 U6-1, U6-8 또는 U6-9 프로모터 내에 존재하는 PSE 성분의, 약한 프로모터, 예컨대 인간 U6-7 프로모터로의 대체는 하이브리드　U6-1, U6-8 또는 U6-9 프로모터의 활성을 감소시킨다.
본 개시 내용의 일부 예에 유용한 프로모터는 조직-특이적 또는 세포-특이적일 수 있다. 프로모터에 적용되는 경우, 용어 "조직 특이적"은 상이한 유형의 조직(예를 들어, 간)에서 관심 대상의 동일한 뉴클레오티드 서열의 발현의 상대적인 부재 하에, 특정 유형의 조직(예를 들어, 눈 또는 근육의 조직)으로 관심 대상의 핵산의 선택적 전사를 지시할 수 있는 프로모터를 지칭한다. 프로모터에 적용되는 바와 같은 용어 "세포-특이적"은 동일 조직 내 상이한 유형의 세포에서 관심 대상의 동일한 뉴클레오티드 서열의 발현의 상대적 부재 하에, 특정 유형의 세포에서 관심 대상의 핵산의 선택적인 전사를 지시할 수 있는 프로모터를 지칭한다.
일 예에서, 본 개시 내용의 ddRNAi 구조물은 본 개시 내용의 shRNA(들) 또는 shmiRNA(들)의 발현을 증가시키기 위해 하나 이상의 인핸서를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 예에서의 이용에 적절한 인핸서는 CMV 인핸서(문헌 [Xia et al, (2003) Nucleic Acids Res 31(17):e100]) 및 당업자에게 알려진 기타 다른 인핸서를 포함한다.
추가의 예에서, 본 개시 내용의 ddRNAi 구조물은 본 개시 내용의 shRNA 또는 shmiRNA를 인코딩하는 핵산에 연결된 전사 종결자를 포함할 수 있다. 다중 shRNA 또는 다중 shmiRNA를 인코딩하는 ddRNAi 구조물의 경우, 각각의 핵산에 연결된 종결자는 동일하거나 상이할 수 있다. 일 예에서, 예를 들어 하나 이상의 pol III 프로모터(들)의 제어 하에서 shRNA(들)를 인코딩하는 ddRNAi 구조물의 경우에서와 같이, 종결자는 4개 이상 또는 5개 이상 또는 6개 이상의 T 잔기의 인접 스트레치(stretch)이다.
일부 예에서, 상이한 프로모터가 사용된 경우, 종결자는 상이할 수 있으며, 종결자가 유도된 그 유전자로부터의 프로모터에 매치된다. 그러한 종결자는 SV40 폴리 A, AdV VA1 유전자, 5S 리보솜성 RNA 유전자, 및 인간 t-RNA에 대한 종결자를 포함한다. 추가적으로, 프로모터 및 종결자는 혼합 및 매치될 수 있으며, 이는 RNA pol II 프로모터와 종결자를 이용하여 흔히 이루어지는 바와 같다.
일 예에서, 다중 RNA를 인코딩하는 ddRNAi 구조물에서 각각의 프로모터/RNA 인코딩 서열/종결자 성분에서 프로모터 및 종결자는 모두 상이하여 성분들 간에 DNA 재조합 발생 가능성을 감소시킨다.
일 예에서, 본 개시 내용의 ddRNAi 구조물은 U6 프로모터에 작동적으로 연결되고, 적어도 4개의 티미딘 잔기, 예를 들어 4개 또는 5개 또는 6개의 티미딘 잔기를 포함하는 종결자에 연결된, 본 개시 내용의 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함한다. 선택적으로, shRNA를 인코딩하는 서열은 또한 하나의 구아닌을 포함하는 전사 개시제에 연결될 수 있다.
일 예에서, 본 개시 내용의 ddRNAi 구조물은 프로모터, 예를 들어 U6 또는 H1 프로모터에 작동적으로 연결된 표 5에 나타낸 서열로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일 예에서, shRNA를 인코딩하는 서열은, 예를 들어 적어도 4개의 티미딘 잔기, 예컨대 4개 또는 5개 또는 6개의 티미딘 잔기를 포함하는 종결자에 연결된다.
일 예시적인 ddRNAi 구조물은 U6 프로모터, 예를 들어 U6-1 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 16에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열, 및 6개의 인접 티미딘 잔기를 포함하는 종결 서열을 포함한다.
또 다른 예시적인 ddRNAi 구조물은 U6 프로모터, 예를 들어 U6-9 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 18에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열, 및 6개의 인접 티미딘 잔기를 포함하는 종결자를 포함한다.
또 다른 예시적인 ddRNAi 구조물은 H1 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 20에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열, 및 5개의 인접 티미딘 잔기를 포함하는 종결자를 포함한다.
또 다른 예에서, 본 개시 내용은 복수의 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물을 제공하며, 여기서 ddRNAi 구조물은 (i) 프로모터, 예를 들어 U6 또는 H1 프로모터에 작동적으로 연결된 표 5에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열 및 (ii) 프로모터에 작동적으로 연결된 본 개시 내용의 적어도 하나의 기타 다른 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일 예에서, (i)의 서열은, 예를 들어 적어도 5개의 인접 티미딘 잔기를 포함하는 종결자에 연결된다. 일 예에서, (ii)의 서열은, 예를 들어 적어도 5개의 티미딘 잔기를 포함하는 종결자에 연결된다. 일 예에서, (i) 및 (ii)의 서열은, 예를 들어 적어도 5개의 티미딘 잔기를 포함하는 종결자에 각각 연결된다.
일 예에서, 본 개시 내용은 복수의 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물을 제공하고, 여기서 ddRNAi 구조물은: (i) U6 프로모터, 예를 들어 U6-1 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 16에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열, 및 6개의 인접한 티미딘 잔기를 포함하는 종결자; 및 (ii) 프로모터에 작동적으로 연결된 본 개시 내용의 적어도 하나의 기타 다른 shRNA를 인코딩하는 서열 및 적어도 4개의 티미딘 잔기를 포함하는 종결자를 포함한다.
일 예에서, 본 개시 내용은 복수의 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물을 제공하고, 여기서 ddRNAi 구조물은: (i) U6 프로모터, 예를 들어 U6-9 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 18에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열, 및 6개의 인접한 티미딘 잔기를 포함하는 종결자; 및 (ii) 프로모터에 작동적으로 연결된 본 개시 내용의 적어도 하나의 기타 다른 shRNA를 인코딩하는 서열 및 적어도 4개의 티미딘 잔기를 포함하는 종결자를 포함한다.
일 예에서, 본 개시 내용은 복수의 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물을 제공하고, 여기서 ddRNAi 구조물은: (i) H1 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 20에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열, 및 5개의 인접한 티미딘 잔기를 포함하는 종결자; 및 (ii) 프로모터에 작동적으로 연결된 본 개시 내용의 적어도 하나의 기타 다른 shRNA를 인코딩하는 서열 및 적어도 4개의 티미딘 잔기를 포함하는 종결자를 포함한다.
본 개시 내용은 복수의 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물을 또한 제공하며, 여기서 ddRNAi 구조물은:
(i) U6 프로모터, 예를 들어 U6-1 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 16에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열, 및 6개의 인접한 티미딘 잔기를 포함하는 종결자; 및
(ii) U6 프로모터, 예를 들어 U6-9 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 18에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열, 및 6개의 인접한 티미딘 잔기를 포함하는 종결자
를 포함한다.
본 개시 내용은 복수의 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물을 또한 제공하며, 여기서 ddRNAi 구조물은:
(i) U6 프로모터, 예를 들어 U6-1 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 16에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열, 및 6개의 인접한 티미딘 잔기를 포함하는 종결자; 및
(ii) H1 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 20에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열, 및 5개의 인접한 티미딘 잔기를 포함하는 종결자
를 포함한다.
본 개시 내용은 복수의 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물을 또한 제공하며, 여기서 ddRNAi 구조물은:
(i) U6 프로모터, 예를 들어 U6-1 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 18에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열, 및 6개의 인접한 티미딘 잔기를 포함하는 종결자; 및
(ii) H1 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 20에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열 및 5개의 인접한 티미딘 잔기를 포함하는 종결자
를 포함한다.
본 개시 내용은 복수의 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물을 또한 제공하며, 여기서 ddRNAi 구조물은:
(i) U6 프로모터, 예를 들어 U6-1 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 16에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열, 및 6개의 인접한 티미딘 잔기를 포함하는 종결자;
(ii) U6 프로모터, 예를 들어 U6-9 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 18에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열, 및 6개의 인접한 티미딘 잔기를 포함하는 종결자; 및
(iii) H1 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 20에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열 및 5개의 인접한 티미딘 잔기를 포함하는 종결자
를 포함한다.
또 다른 예에서, 본 개시 내용은 각각 shRNA를 인코딩하는 복수의 ddRNAi 구조물을 제공하며, 여기서 복수의 ddRNAi 구조물 중 적어도 하나는 본 개시 내용의 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물이다. 본 개시 내용의 예시적인 shRNA는 기재되었으며, 이러한 예에 필요한 변경을 가하여 적용될 수 있다.
일 예에서, 본 개시 내용은 각각 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 복수의 ddRNAi 구조물을 제공하며, 여기서 복수의 ddRNAi 구조물 중 적어도 하나는 표 4에서 "이펙터 보체"로 명명된 열에 나타낸 이펙터 보체 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물이다. 표 4에 "이펙터 보체"로 명명된 열에 나타낸 이펙터 보체 서열에 실질적으로 상보적인 예시적인 이펙터 서열은 기재되었으며, 본 개시 내용의 이러한 예에 필요한 변경을 가하여 적용될 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 ddRNAi 구조물에 의해 인코딩된 shRNA의 이펙터 서열은 표 4에 "이펙터"로 명명된 열에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다(적어도 하나의 ddRNAi 구조물에 의해 인코딩된 shRNA의 동족 이펙터 보체 서열은 예를 들어 표 4에서 "이펙터 보체"로 명명된 열에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다).
또 다른 예에서, 본 개시 내용은 각각 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 복수의 ddRNAi 구조물을 제공하며, 여기서 ddRNAi 구조물 각각은 표 4에 "이펙터"로 명명된 열에 나타낸 이펙터 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함한다. 개별적인 shRNA의 동족 이펙터 보체 서열은 표 4에서 "이펙터 보체"로 명명된 열에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 복수의 ddRNAi 구조물에서 예시적인 ddRNAi 구조물은 표 4에서 "이펙터 보체"로 명명된 열에 나타낸 이펙터 보체 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함한다는 것이 본 명세서에 기재되어 있다.
본 개시 내용의 예시적인 복수의 ddRNAi 구조물은:
(i) 서열번호 10에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 11에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물; 및
(ii) 서열번호 12에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 13에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물
을 포함한다.
본 개시 내용의 예시적인 복수의 ddRNAi 구조물은:
(i) 서열번호 10에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 11에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물; 및
(ii) 서열번호 14에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 15에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물
을 포함한다.
본 개시 내용의 예시적인 복수의 ddRNAi 구조물은:
(i) 서열번호 12에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 13에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물; 및
(ii) 서열번호 14에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 15에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물
을 포함한다.
본 개시 내용의 예시적인 복수의 ddRNAi 구조물은:
(i) 서열번호 10에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 11에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물;
(ii) 서열번호 12에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 13에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물; 및
(iii) 서열번호 14에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 서열 및 서열번호 15에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 이펙터 보체 서열을 포함하는 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물
을 포함한다.
본 명세서에 기재된 예에 따라, 복수 중 적어도 하나의 ddRNAi 구조물은 표 5에 기재된 shRNA를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 표 5에 기재된 shRNA를 인코딩하는 서열은 프로모터, 예를 들어 U6 또는 H1 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 표 5에 기재된 각각의 shRNA는 선택적으로 shRNA의 3' 말단에서 2개의 인접 우라실(UU)을, 예를 들어 RNA Pol III 프로모터로부터의 전사 종결의 결과로서 추가로 포함할 수 있다.
일 예에서, 본 개시 내용은 본 개시 내용의 shRNA를 인코딩하는 서열을 각각 포함하는, 둘 이상의 ddRNAi 구조물을 포함하는 복수의 ddRNAi 구조물을 제공한다. 예를 들어, 복수의 ddRNAi 구조물 각각은 프로모터, 예를 들어 U6 또는 H1 프로모터에 작동적으로 연결된 표 5에 기재된 shRNA를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
일 예에서, 복수의 ddRNA 구조물은:
(i) U6 프로모터, 예를 들어 U6-1 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 16에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열, 및 6개의 인접 티미딘 잔기를 포함하는 종결 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물; 및
(ii) U6 프로모터, 예를 들어 U6-9 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 18에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열, 및 6개의 인접 티미딘 잔기를 포함하는 종결 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물
을 포함한다.
일 예에서, 복수의 ddRNA 구조물은:
(i) U6 프로모터, 예를 들어 U6-1 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 16에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열, 및 6개의 인접 티미딘 잔기를 포함하는 종결 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물; 및
(ii) H1 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 20에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열, 및 5개의 인접 티미딘 잔기를 포함하는 종결 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물
을 포함한다.
일 예에서, 복수의 ddRNA 구조물은:
(i) U6 프로모터, 예를 들어 U6-9 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 18에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열, 및 6개의 인접 티미딘 잔기를 포함하는 종결 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물; 및
(ii) H1 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 20에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열, 및 5개의 인접 티미딘 잔기를 포함하는 종결 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물
을 포함한다.
일 예에서, 복수의 ddRNA 구조물은:
(i) U6 프로모터, 예를 들어 U6-1 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 16에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열, 및 6개의 인접 티미딘 잔기를 포함하는 종결 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물;
(ii) U6 프로모터, 예를 들어 U6-9 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 18에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열, 및 6개의 인접 티미딘 잔기를 포함하는 종결 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물; 및
(iii) H1 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 20에 나타낸 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 shRNA를 인코딩하는 서열, 및 5개의 인접 티미딘 잔기를 포함하는 종결 서열을 포함하는 ddRNAi 구조물
을 포함한다.
추가적으로, ddRNAi 구조물 또는 각각의 ddRNAi 구조물은 하나 이상의 복수의 클로닝 위치 및/또는 전략적으로 위치된 독특한 제한효소 위치를 포함할 수 있어서, 프로모터, shRNA 인코딩 서열 및/또는 종결자 성분이 쉽게 제거 또는 치환되도록 한다. ddRNAi 구조물 또는 ddRNAi 구조물 각각은 전략적으로 위치된 제한효소 위치 및/또는 상보성 접착성 말단을 이용하여 더욱 작은 올리고뉴클레오티드 성분으로부터 조립될 수 있다. 본 개시 내용에 따른 한 시도를 위한 기본 벡터는 (절대 조건은 아니지만) 모든 위치가 독특한 다중연결기(multilinker)를 갖는 플라스미드를 포함한다. 순차적으로, 각각의 프로모터는 그의 지정된 독특한 위치 사이에 삽입되어, 모두 가변성 배향을 가질 수 있는 하나 이상의 프로모터를 갖는, 기본 카세트를 초래한다. 다시 순차적으로, 어닐링된 프라이머 쌍은 각각의 개별 프로모터의 하류에 있는 독특한 위치 내로 삽입되며, 단일-발현, 이중-발현 또는 다중-발현 카세트 구조물을 초래한다. 삽입물은, 단일-발현, 이중-발현 또는 다중-발현 카세트 삽입물에 측접하는(flank) 2개의 독특한 제한효소 위치(동일하거나 상이한 것)를 이용하여, 예를 들어 AVV 골격 내로 이동될 수 있다.
각각의 구조물의 생성은 당업계에 알려진 임의의 적합한 유전공학 기법을 이용하여 달성될 수 있으며, 이는 PCR, 올리고뉴클레오티드 합성, 제한 엔도뉴클레아제 분해, 결찰, 형질전환, 플라스미드 정제, 및 DNA 서열분석의 표준 기법을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다. 구조물 또는 각각의 구조물이 바이러스성 구조물인 경우, 구조물은 예를 들어, ddRNAi 구조물을 바이러스성 입자 내로 패키지할 필요가 있는 서열 및/또는 ddRNAi 구조물의 표적 세포 유전체 내로의 통합을 가능하게 하는 서열을 포함한다. 일부 예에서, 바이러스 구조물 또는 각각의 바이러스 구조물은 바이러스의 복제 및 증식을 가능하게 하는 유전자를 추가적으로 포함하지만, 그러한 유전자는 트랜스 형으로(in trans) 공급될 것이다. 추가적으로 각각의 바이러스성 구조물은 천연 형태 또는 변경된 형태로 통합된, 유전자 또는 임의의 알려진 생물의 유전체로부터의 유전학적 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 바이러스성 구조물은 세균에서 구조물의 복제에 유용한 서열을 포함할 수 있다.
각각의 구조물은 추가의 유전학적 요소를 또한 포함할 수 있다. 구조물 내에 포함될 수 있는 요소의 유형은 어떤 방식으로든 한정되지 않으며, 당업자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 추가의 유전학적 요소는 리포터 유전자, 예컨대 GFP 또는 RFP와 같은 형광 마커 단백질에 대한 하나 이상의 유전자; 쉽게 분석되는 효소, 예컨대 베타-갈락토시다제, 루시페라제, 베타-글루쿠로니다제, 클로람페니칼 아세틸 트랜스퍼라제 또는 분비된 배아성 알카리 포스파타제; 또는 면역분석이 쉽게 가능한 단백질, 예컨대 호르몬 또는 시토카인을 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 구현예에서 이용될 수 있는 기타 다른 유전학적 요소는 세포에 선택적 성장 이점을 부여하는 단백질을 코딩하는 것들, 예컨대 아데노신 데아미나제, 아미노글리코딕 포스포트랜스퍼라제, 디하이드로폴레이트 리덕타제, 하이그로마이신-B-포스포트랜스퍼라제, 약물 내성 또는 영양요구체에서 없는 생합성 능력을 제공하는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다. 리포터 유전자가 구조물 또는 각각의 구조물과 함께 포함된 경우, 내부 리보솜 도입 위치(IRES) 서열이 포함될 수 있다. 일 예에서, 추가의 유전학적 요소는 독립적인 프로모터/인핸서와 작동적으로 연결되고, 이에 의해 제어된다. 세균 또는 세포 배양에서 구조물의 증식을 위한 적합한 복제 기원이 사용될 수 있다. 복제 기원의 서열은 일반적으로 ddRNAi 구조물 및 기타 다른 유전학적 서열과 구분된다. 그러한 복제 기원은 당업계에 알려져 있으며, pUC, ColE1, 2-미크론 또는 SV40 복제 기원을 포함한다.
발현 구조물
일 예에서, 본 개시 내용의 ddRNAi 구조물은 발현 구조물 내에 포함된다.
일 예에서, 발현 구조물은 발현 벡터이다.
일 예에서, 발현 벡터는, 예를 들어 당업계에서 알려진 바와 같은, 플라스미드이다. 일 예에서, 적합한 플라스미드 발현 벡터는 pAAV 벡터, 예를 들어, 자가-상보성 pAAV(pscAAV) 플라스미드 벡터 또는 단일-가닥 pAAV(pssAAV) 플라스미드 벡터이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 플라스미드는, 예를 들어 본 개시 내용의 하나 이상의 RNA의 발현을 유도하기 위하여 하나 이상의 RNA pol III 프로모터(들)를 포함할 수 있다. 발현 벡터 내 포함에 적합한 RNA pol III 프로모터가 본 명세서에 기재되었다.
일 예에서, 발현 벡터는 미니-서클 DNA이다. 미니-서클 DNA는 미국 특허 공보 2004/0214329에 기재되어 있다. 미니-서클 DNA는 지속적으로 높은 수준의 핵산 전사에 유용하다. 원형 벡터는 발현-사일런싱 세균 서열이 없는 것에 의해 특징지어진다. 예를 들어, 미니-서클 벡터는 복제 기원이 없고, 세균성 플라스미드에서 흔히 발견되는 약물 선발 마커, 예를 들어
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tet 등이 없다는 점에서 세균성 플라스미드 벡터와 상이하다. 결과적으로, 미니서클 DNA는 크기가 더 작게 되어 효율적인 전달을 가능하게 한다.
일 예에서, 발현 벡터는 바이러스성 벡터이다.
임의의 적절한 바이러스에 기초한 바이러스성 벡터는 본 개시 내용의 ddRNAi를 전달하는 데 사용될 수 있다. 추가적으로, 혼성 바이러스계가 사용될 수 있다. 바이러스성 전달계의 선택은 각종 파라미터, 예컨대 전달을 위해 표적화된 조직, 계의 형질도입 효율, 병원성, 면역학적 및 독성 문제 등에 따라 달라질 것이다.
유전자 치료에 사용되는 바이러스성 계의 일반적으로 사용되는 부류는 그들의 유전체가 숙주 세포 크로마틴 내로 통합하는지(레트로바이러스 및 렌티바이러스) 또는 주로 염색체외 에피솜으로서 세포 핵 내에서 지속되는 지의(아데노-연관 바이러스, 아데노바이러스 및 헤르페스바이러스) 여부에 따라 2개의 군으로 분류될 수 있다. 일 예에서, 본 개시 내용의 바이러스성 벡터는 숙주 세포의 크로마틴 내로 통합된다. 또 다른 예에서, 본 개시 내용의 바이러스성 벡터는 숙주 세포의 핵에서 염색체외 에피솜으로서 지속된다.
일 예에서, 바이러스성 벡터는 파보바이러스과(Parvoviridae) 유래이다. 파보바이러스는 대략 5000개 뉴클레오티드 길이의 유전체를 갖는 작은 단일-가닥의, 외피가 없는(non-enveloped) DNA 바이러스 과이다. 이 과의 성분들 중에는 아데노-연관 바이러스(AAV)가 포함된다. 일 예에서, 본 개시 내용의 바이러스성 벡터는 AAV이다. AAV는 생산적인 감염 사이클을 개시하고 유지하기 위해 다른 바이러스(통상적으로 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스)와의 동시감염을 일반적으로 요구하는 비독립성 파보바이러스이다. 그러한 헬퍼 바이러스의 부재 하에, AAV는 수용체-매개된 결합 및 내재화에 의해 표적 세포를 감염시키거나 형질도입하는 능력이 여전히 있으며, 비-분열 및 분열 세포 모두에서 핵을 침투한다. 자손 바이러스는 헬퍼 바이러스의 부재 하에 AAV 감염으로부터 생산되지 않기 때문에, 형질도입 범위는 바이러스를 이용하여 감염된 초기 세포에만 제한된다. 이러한 특징은 AAV가 본 개시 내용에 바람직한 벡터가 되도록 한다. 나아가, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 헤르페스 단순 바이러스와 달리, AAV는 인간 병원성 및 독성이 없는 것으로 나타난다(문헌[Kay, et al.,(2003) Nature. 424: 251]). 유전체는 정상적으로는 단지 2개의 유전자만을 인코딩하기 때문에, 전달 비히클로서 AAV가 4.5 단일 가닥 킬로베이스(kb)의 패키징 능에 의해 한정된다는 것은 놀라운 일이 아니다. 그러나, 이러한 크기 제한은 유전자 치료의 대체에 전달될 수 있는 유전자를 한정할 수 있지만, 이것이 shRNA와 같은 더욱 짧은 서열의 패키징 및 발현에 부정적인 영향을 미치지는 않는다.
일 예에서, 바이러스성 벡터는 아데노바이러스성(AdV) 벡터이다. 아데노바이러스는 26 kbp 내지 48 kbp 사이의 선형 유전체를 갖는 중간-크기의 이중-가닥, 외피가 없는 DNA 바이러스이다. 아데노바이러스는 수용체-매개된 결합 및 내재화에 의해 표적 세포에 들어가고 비-분열 및 분열 세포 모두에서 핵을 침투한다. 아데노바이러스는 생존 및 복제에 대해 숙주 세포에 크게 의존하며, 숙주의 복제 기구를 이용하여 척추동물형 세포의 핵 내에서 복제될 수 있다.
본 개시 내용의 ddRNAi 구조물과 함께 유용한 또 다른 바이러스성 전달계는 레트로바이러스과로부터의 바이러스에 기초한 계이다. 레트로바이러스는 2개의 독특한 특징에 의해 특징지어지는 단일-가닥 RNA 동물 바이러스를 포함한다. 첫번째로, 레트로바이러스의 유전체는, RNA의 2개의 복제물로 이루어지는 이배체이다. 두번째로, 이러한 RNA는 비리온-연관 효소 역전사제에 의해 이중-가닥 DNA로 전사된다. 이러한 이중-가닥 DNA 또는 프로바이러스는 이후 숙주 유전체 내로 통합될 수 있으며, 부모 세포로부터 자손 세포로 숙주 유전체의 안정하게 통합된 성분으로서 전달될 수 있다.
일부 예에서, 바이러스성 벡터는 렌티바이러스이다. 렌티바이러스 벡터는 소포성 스테아타이트 바이러스 당단백질(VSV-G)로 종종 슈도타이핑되고(pseudotyped), 인간 면역결핍 바이러스(HIV); 양에서 뇌염(비스나) 또는 폐렴을 유발하는 비산-매디(visan-maedi); 말에서 자가면역 용혈성 빈혈 및 뇌병증을 일으키는, 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV); 고양이에서 면역 결핍을 유발하는 고양이 면역결핍 바이러스(FIV); 소에서 임파선염 및 림프구증가증을 유발하는 소 면역결핍 바이러스(BIV); 및 인간이 아닌 영장류에서 면역결핍 및 뇌병증을 일으키는 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV)로부터 유도된다. HIV에 기초한 벡터는 일반적으로 부모 유전체의 5% 미만을 보유하고, 유전체의 25% 미만은 패키징 구조물 내로 혼입되며, 이는 복귀 복제-컴피턴트 HIV의 생성의 가능성을 최소화한다. 생물학적 안전성은 하류 긴-말단-반복 서열에서 조절 요소의 결실을 함유하는 자가-비활성화 벡터의 발달에 의해 추가로 증가되어, 벡터 기동(mobilization)에 요구되는 패키징 신호의 전사를 제거한다. 렌티바이러스 벡터의 이용에 대한 주요 장점들 중 하나는, 형질도입된 세포의 세포 분할 후에도 유전자 도입이 대부분의 조직 또는 세포 유형에서 지속된다.
본 개시 내용의 RNA를 발현하는 데 사용된 렌티바이러스-기반 구조물은 렌티바이러스의 5' 및 3' 긴 말단 반복부(LTRs)로부터의 서열을 포함한다. 일 예에서, 바이러스 구조물은 렌티바이러스로부터의 비활성화된 또는 자가-비활성화 3' LTR을 포함한다. 3' LTR은 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 자가-비활성화될 수 있다. 예를 들어, 3' LTR의 U3 요소는 그의 인핸서 서열, 예를 들어 TATA 박스, Sp1 및 NF-카파 B 자리의 결실을 함유한다. 3' LTR의 자가-비활성화 결과로서, 숙주 유전체 내로 통합된 프로바이러스는 비활성화된 5' LTR을 포함할 것이다. LTR 서열은 임의의 종으로부터의 임의의 렌티바이러스로부터의 LRT 서열일 수 있다. 렌티바이러스-기반 구조물은 또한 MMLV 또는 MSCV, RSV 또는 포유동물 유전자에 대한 서열을 포함할 수 있다. 추가적으로, 렌티바이러스성 5' LTR로부터의 U3 서열은 바이러스성 구조물에서 프로모터 서열로 대체될 수 있다. 이는 패키징 세포주로부터 회수된 바이러스의 역가를 증가시킬 수 있다. 인핸서 서열이 또한 포함될 수 있다.
당업자에게 알려진 기타 다른 바이러스성 또는 비-바이러스성 계는 본 발명의 ddRNAi 또는 핵산을 관심 대상의 세포로 전달하는 데 사용될 수 있으며, 유전자-결실된 아데노바이러스-트랜스포손 벡터(문헌 [Yant, et al., (2002) Nature Biotech. 20:999-1004] 참조); 신드비스 바이러스 또는 셈리키 삼림열 바이러스 유래 계(문헌 [Perri, et al., (2002) J. Virol. 74(20):9802-9807] 참조); 뉴캐슬 질병 바이러스 또는 센다이(Sendai) 바이러스 유래 계를 포함하지만 이로 한정되지는 않는다.
본 개시 내용의 RNA 또는 ddRNAi 구조물의 시험
세포 배양 모델
OPMD에 대한 세포 배양 모델로서 유용한 세포주의 예는 실시예 3에 나타낸 HEK293T 세포주(HEK293T, ATCC, Manassas, USA)로, 이는 정상의 Ala10-humanPABPN1-FLAG(Ala10) 또는 돌연변이 Ala17-humanPABPN1-FLAG(Ala17)를 발현하는 벡터로 형질감염되었으며, 후자는 OPMD의 특징이다.
OPMD에 대한 세포 배양 모델로서 유용한 세포주의 또 다른 예는 정상 Ala10-humanPABPN1-FLAG(Ala10) 또는 돌연변이 Ala17-humanPABPN1-FLAG(Ala17) 중 어느 하나를 발현하도록 안정하게 형질감염된 1차 마우스 근원세포(IM2) 세포주이다. 돌연변이 Ala17-humanPABPN1-FLAG(Ala17)를 안정하게 발현하는 예시적인 IM2 유도된 세포주는 실시예 3에 나타낸 H2kB-D7e 세포주이다. H2kB-D7e 세포주는 문헌 [Raz et al., (2011) American Journal of Pathology,179(4):1988-2000]에도 기재되어 있다.
OPMD의 세포 배양 모델에 적합한 기타 세포주는 당업계에 알려져 있으며, 예컨대 문헌 [Fan et al., (2001) Human Molecular Genetics, 10:2341-2351, Bao et al., (2002) The Journal of Biological Chemistry, 277:12263-12269, 및 Abu-Baker et al., (2003) Human Molecular Genetics,12:2609-2623]에 기재되어 있다.
본 명세서에서 예시된 바와 같이, 본 개시 내용의 RNA 또는 ddRNAi 구조물의 활성은 RNA 또는 ddRNAi 구조물을 세포로 투여하고, 이후 PABPN1 유전자에 의해 인코딩된 RNA 또는 단백질의 발현의 수준을 측정함으로써 결정된다. 예를 들어, 세포내의 PABPN1 유전자 발현은 RT-PCR, 정량 PCR, 준-정량 PCR, 또는 엄격한 조건 하에서, PABPN1에 특이적인 하나 이상의 프로브 또는 프라이머를 이용한, 제위치 혼성화 중 임의의 하나 이상에 의해 분석될 수 있다. 세포외 PABPN1은 PABPN1 DNA에 특이적인 하나 이상의 프로브 또는 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 또는 PABPN1 단백질에 대한 ELISA 중 어느 하나에 의해 분석될 수도 있다.
PABPN1 발현을 검출하기 위한 RT-PCR, 정량 PCR 또는 준-정량 PCR 기술에서 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드는 알려져 있으며 상업적으로 구매가능하다(Thermo Fisher). 그러나, PCR-기반 검출 방법에 유용한 폴리뉴클레오티드는 본 기술 분야에서 알려진 방법 및/또는 소프트웨어를 이용하여 PABPN1에 유용한 서열 정보를 기준으로 설계될 수 있다. 일 예에서, PABPN1 mRNA의 존재 또는 부재는 RT-PCR을 이용하여, 당업계에 알려진 표준 방법을 이용해서 검출될 수 있다. 일 예에서, PABPN1 폴리펩티드 또는 단백질의 존재 또는 부재 또는 상대적인 양은 임의의 하나 이상의 웨스턴 블롯팅, ELISA 또는 본 기술 분야에서 이용가능한 기타 표준 정량 또는 준정량 기술, 또는 그러한 기술의 조합을 이용하여 검출될 수 있다. PABPN1의 항체 인식에 의존한 기술이 고려되며, 본 명세서에서는 예를 들어 실시예 3 내지 실시예 5에 기재되어 있다. 일 예에서, PABPN1 폴리펩티드의 존재 또는 부재 또는 상대적 풍부함은, 포획된 PABPN1 폴리펩티드의 전기영동성 해상과 조합하여 PABPN1 폴리펩티드의 항체 포획을 포함하는 기술을 이용하여, 예를 들어 Isonostic?? Assay(Target Discovery, Inc.)를 이용하여 검출될 수 있다. PABPN1 단백질에 대한 항체는 상업적으로 구매가능하다.
형질감염 또는 형질도입 효능에서의 차이의 정규화를 위한 각종 수단 및 샘플 회수는 당업계에 알려져 있다.
본 발명의 RNA의 부재 하에서 mRNA 발현의 수준 또는 PABPN1에 의해 인코딩되는 단백질 또는 PABPN1 단백질의 핵 집합체의 양에 비해, mRNA의 발현의 수준 또는 PABPN1에 의해 인코딩되는 단백질을 감소시키거나 PABPN1 단백질의 핵 집합체의 존재를 감소시키는 본 발명의 RNA 또는 ddRNAi 구조물은, 내생의 PABPN1의 발현을 감소시키고, 내생의 PABPN1의 일부 또는 전부를 본 명세서에 설명된 바와 같은 OPMD의 원인이 되지 않는 PABPN1 단백질로 대체함으로써, 예를 들어 OPMD 치료와 같은 치료 적용에 유용한 것으로 여겨진다.
동물 모델
OPMD 연구를 위해 이용가능한 몇몇 작은 동물 모델이 존재하며, 이의 예는 문헌 [Uyama et al., (2005) Acta Myologica, 24(2):84-88 및 Chartier and Simonelig (2013) Drug Discovery Today: technologies, 10:e103-107]에 기재되어 있다. 예시적인 동물 모델이 본 명세서의 실시예 4 및 실시예 5에 기재된 A17.1 유전자이식 마우스 모델로, 이는 이전에 문헌 [Davies et al., (2005) Nature Medicine, 11:672-677 및 Trollet et al., (2010) Human Molecular Genetics, 19(11):2191-2207]에 기재되어 있다.
본 개시 내용의 RNA 또는 ddRNAi 구조물이 PABPN1 유전자에 의해 인코딩된 RNA 또는 단백질의 발현을 녹다운, 감소 또는 저해시키는 효과를 결정하는데, 상기 동물 모델 중 임의의 것이 사용될 수 있다.
세포내 및 세포외 PABPN1 유전자 발현의 분석 방법은 세포 모델과 관련하여 본 명세서에서 설명되었으며, 본 개시 내용의 이러한 예에 필요한 변경을 가하여 적용될 수 있다.
기능성 PABPN1의 대체를 위한 약제
일 예에서, 본 개시 내용은 기능성 PABPN1 단백질의 대체를 위한 약제를 세포 또는 동물에 제공한다. 기능성 PABPN1 단백질은 OPMD의 원인이 되지도, 본 개시 내용의 RNA(들)에 의해 표적화되는 mRNA 전사물에 의해 인코딩되지도 않을 것이다.
일 예에서, 세포 또는 동물에 대해 기능성 PABPN1 단백질의 대체를 위한 약제는 핵산, 예를 들어 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는, DNA 또는 cDNA이다. 예를 들어, 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 야생형 PABPN1 핵산에 상대적으로 하나 이상의 축중(degenerate) 또는 동요 염기 코돈 최적화될 수 있으며, 동일한 아미노산을 인코딩하지만 야생형 PABPN1 핵산에 비해 하나 이상의 축중 또는 동요 염기를 포함할 수 있어서, 기능성 PABPN1 단백질을 코딩하는 상응하는 mRNA 서열은 본 개시 내용의 RNA(들)에 의해 인식되지 않는다. 예를 들어, 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 코돈 최적화된 핵산은 본 개시 내용의 RNA(들)에 의해 표적된 영역 내에 있는 야생형 PABPN1 핵산에 비해 하나 이상의 축중 또는 동요 염기를 포함한다. 일 예에서, 하나 이상의 축중 또는 동요 염기 잔기는 본 개시 내용의 RNA의 씨드 영역 내에 존재한다.
일 예에서, 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 코돈 최적화되어 그의 상응하는 mRNA 서열은 본 개시 내용의 RNA(들)에 의해 인식되지 않는다. 예를 들어, 코돈 최적화된 핵산 서열에 의해 인코딩된 기능성 PABPN1 단백질은 서열번호 25에 나타낸 아미노산 서열, 즉 야생형 인간 PABPN1 단백질의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일 예에서, 기능성 PABPN1 단백질 예를 들어, 서열번호 25에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 PABPN1 단백질의 대체를 위한 약제는 서열번호 24에 나타낸 서열을 포함하는 핵산이다. 일 예에서, 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 코작 서열을 포함할 수도 있다.
일 예에서, 기능성 PABPN1 단백질은 에피토프 태그, 예를 들어 Myc-태그에 부착되거나 그를 포함할 수 있다. 예를 들어, Myc-태그를 포함하는 기능성 PABPN1 단백질은 서열번호 27에 나타낸 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 예에 따르면, 기능성 PABPN1 단백질의 대체를 위한 약제는 서열번호 26에 나타낸 서열을 포함하는 핵산일 수 있다.
일 예에서, 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 코돈-최적화된 핵산은 기능성 PABPN1 단백질의 발현에 적합한 프로모터에 작동적으로 연결된다. 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산과 함께 이용하기 적합한 일 예의 프로모터는 SpC512 프로모터이다. 그러나, 당업계에 알려진 임의의 적합한 프로모터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산과 함께 이용하는데 적합한 다른 프로모터가 US 20110212529 A1에 기재되어 있다.
본 명세서에 설명된 바와 같이, 본 개시 내용의 일부 예에서 유용한 프로모터는 조직 특이적 또는 세포 특이적일 수 있다.
일 예에서, 본 개시 내용의 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 코돈-최적화된 핵산은 기능성 PABPN1 단백질의 발현을 증가시키기 위한 하나 이상의 인핸서 및 그의 상응하는 mRNA 전사물을 추가적으로 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 이러한 예에서의 사용에 적합한 인핸서는 당업자에게 알려져 있을 것이다.
기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 예시적인 발현 벡터는 본 개시 내용의 RNA 및 ddRNAi 구조물의 맥락에서 설명되었으며, 이러한 예에 필요한 변경을 가하여 적용될 수 있다.
따라서, 일 예에서, 세포 또는 동물에 대해 기능성 PABPN1 단백질의 대체를 위한 약제는 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 코돈-최적화된 핵산을 포함하는 발현 벡터일 수 있다. 예를 들어, 본 개시 내용의 발현 벡터는 기능성 PABPN1 단백질, 예를 들어 서열번호 24에 나타낸 서열을 인코딩하는 코돈-최적화된 핵산 및 그의 발현을 위한 프로모터, 예를 들어 SpC512 프로모터를 포함할 수 있다. 일 예에서, 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 코돈 최적화된 핵산은 코작 서열을 포함할 수도 있다. 이에 따라, 본 개시 내용의 발현 벡터는 그의 5' 말단에서 코작 서열과 함께 서열번호 24에 나타낸 서열을 포함할 수 있다.
일 예에서, 예를 들어, 서열번호 25에 나타낸 서열을 갖는 기능성 PABPN1 단백질의 대체를 위한 약제는 서열번호 24에 나타낸 서열을 포함하거나 그로 이루어지는 코돈 최적화된 핵산이다. 일 예에서, 코돈 최적화된 핵산은 코작 서열을 추가로 포함한다. 따라서, 기능성 PABPN1 단백질의 대체를 위한 약제는 그의 5' 말단에서 코작 서열을 갖는 서열번호 24에 나타낸 서열을 포함하거나 그로 이루어지는 핵산일 수 있다.
일 예에서, 본 명세서에 나타낸 바와 같은 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 플라스미드 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 적합한 플라스미드 발현 벡터는 본 명세서에 설명되었으며 당 분야에서 알려져 있다. 일 예에서, 적합한 플라스미드 발현 벡터는 pAAV 벡터로, 예를 들어 pscAAV 플라스미드 벡터 또는 pssAAV 플라스미드 벡터이다.
일 예에서, 발현 벡터는 미니-서클 DNA이다. 미니-서클 DNA 벡터는 본 명세서에서 설명되었다.
일 예에서, 발현 벡터는 바이러스성 벡터이다. 예를 들어, 임의의 적절한 바이러스를 기초로 한 바이러스성 벡터는 본 개시 내용의 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 코돈 최적화된 핵산을 전달하는데 사용될 수 있다. 추가적으로, 하이브리드 바이러스성 계가 사용될 수 있다. 바이러스성 전달 계의 선택은 각종 파라미터, 예를 들어 전달을 위해 표적된 조직, 계의 형질도입 효율, 병원성, 면역학적 및 독성 염려 등에 따라 달라질 것이다.
유전자 물질의, 세포 또는 동물로의 전달을 위한 예시적인 바이러스성 계는 본 개시 내용의 RNA 및 ddRNAi 구조물의 맥락에서 기재되었으며, 본 실시예에 대해 필요한 변경을 가하여 적용되는 것으로 이해해야 한다.
일 예에서, 바이러스성 벡터는 AAV이다.
일 예에서, 바이러스성 벡터는 AdV 벡터이다.
일 예에서, 바이러스성 벡터는 렌티바이러스이다.
당업자에게 알려진 기타 바이러스성 또는 비-바이러스성 계는 본 개시 내용의 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 코돈-최적화된 핵산을, 유전자-결실된 아데노바이러스-트랜스포손 벡터를 포함하지만 이로 한정되지 않는, 관심 대상의 세포(문헌 [Yant, et al., (2002) Nature Biotech. 20:999-1004 참조]); 신드비스 바이러스 또는 셈리키 삼림열 바이러스로부터 유도된 계(문헌 [Perri, et al, (2002) J. Virol. 74(20):9802-07 참조]); 뉴캐슬 질병 바이러스 또는 센다이 바이러스로부터 유도된 계로 전달하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에 설명된 바와 같은 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 코돈-최적화된 핵산이 본 개시 내용의 ddRNAi 구조물로 제공되는 예에 따르면, 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 코돈 최적화된 핵산은 ddRNAi 구조물로서 동일한 발현 벡터 내로 포함될 수 있다.
본 개시 내용의 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 코돈-최적화된 핵산 및 본 개시 내용의 ddRNAi 구조물을 함께 제공하는 대안적인 예에서, 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 코돈-최적화된 핵산 및 ddRNAi 구조물은 상이한 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 코돈-최적화된 핵산 및 ddRNAi 구조물이 상이한 발현 벡터 내에 포함되는 경우, 개별적인 발현 벡터는 동일한 유형의 벡터 또는 상이한 유형의 벡터일 수 있다.
기능성 PABPN1을 위한 시험
세포 배양 모델
OPMD의 예시적인 세포 배양 모델은 본 명세서에서 설명되었으며, 실시예 3에서 설명된다. OPMD의 그러한 세포 배양 모델은, 본 개시 내용의 약제가, 내생의 PABPN1를 표적화하는 본 개시 내용의 하나 이상의 RNA의 존재 하에서, 기능성 PAPN1 단백질을 대체하는 능력을 평가하기 위하여 사용될 수 있다.
PABPN1 단백질의 존재 또는 부재 또는 상대적인 양을 검출하는 예시적인 방법은 설명되었으며, 본 실시예에 필요한 변경을 가하여 적용된다. 예를 들어, PABPN1 단백질의 존재 또는 부재 또는 상대적인 양은 웨스턴 블로팅, ELISA 또는 당업계에서 이용가능한 기타 표준 정량 또는 준정량 기술 중 임의의 하나 이상, 또는 그러한 기술의 조합을 이용하여 검출될 수 있다. PABPN1의 항체 인식에 의존하는 기술이 고려되며, 본 명세서에 설명된다(예컨대, 실시예 3에서). 돌연변이 및 기능성 PABPN1 단백질은, 적절한 단백질 태그, 예를 들어 myc 또는 플래그(flag) 태그를 이용하여 표현되어, 상업적으로 구매가능한 적절한 항체를 이용하여 돌연변이 및 기능성 PABPN1 단백질의 차등 검출을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 인간 PABPN1 단백질은 FLAG 태그로 표시될 수 있고, 서열번호 29에 나타낸 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 돌연변이와 기능성 PABPN1 단백질 모두의 존재 또는 부재 또는 상대량은, 본 개시 내용의 RNA와 본 개시 내용의 기능성 PABPN1 단백질을 대체하기 위한 약제를 이용하여 세포의 형질감염 또는 형질도입 후에 그 세포에서 독립적으로 검출될 수 있다.
일 예에서, PABPN1 폴리펩티드의 존재 또는 부재 또는 상대적 풍부는, 예를 들어 Isonostic's Assay(Target Discovery, Inc.)를 이용하여 포획된 PABPN1 폴리펩티드의 전기영동 해상과 함께 PABPN1 폴리펩티드의 항체 포획물을 포함하는 기술을 이용하여 검출될 수 있다. 항체는 PABPN1단백질에 대해 상업적으로 구매가능하다.
본 개시 내용의 RNA(들)의 존재 하에서(즉, 본 명세서에 기재된 RNAi 시약 존재 하에서) 세포 내 OPMD의 원인이 아닌 PABPN1 단백질을 발현하는 본 개시 내용의 약제는 OPMD를 치료하는데 유용한 것으로 여겨진다.
동물 모델
OPMD 연구를 위한 예시적인 동물 모델이 설명되어 있다. OPMD 연구를 위한 예시적인 동물 모델은 실시예 4 및 실시예 5에 또한 기재되어 있다.
상기 동물 모델 중 임의의 것이, 본 개시 내용의 RNA 또는 dRNAi 구조물 존재 하에 생체 내에서 기능성 PABPN1 단백질을 대체하기 위한 본 개시 내용의 약제의 효능을 결정하는데 사용될 수 있다.
세포내 및 세포외 PABPN1 발현 분석 방법은 세포 모델에 관하여 본 명세서에 기재되어 있으며, 본 개시 내용의 이러한 예에 필요한 변경을 가하여 적용하는 것으로 받아들여져야 할 것이다.
일 예에서, 실시예 5에 기재된 조직학 및 형태학적 분석은 본 개시 내용의 RNA 또는 ddRNAi 구조물 존재 하에서 생체 내에서 기능성 PABPN1 단백질을 대체하기 위하여 개시 내용의 약제의 효율을 결정하는데 사용될 수 있다. 생체 내에서 기능성 PABPN1 단백질을 대체하기 위하여 본 개시 내용의 약제의 효능을 결정하는데 사용될 수 있는 추가의 분석은 문헌 [Trollet et al., (2010) Human Molecular Genetics, 19(11): 2191-2207]에 기재되어 있다.
조성물 및 담체
일부 예에서, 본 개시 내용의 RNA 또는 ddRNAi 구조물 또는 발현 벡터는 조성물로 제공된다. 일부 예에서, 본 개시 내용의 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 조성물로 제공된다. 일부 예에서, 본 개시 내용의 RNA 또는 ddRNAi 구조물 또는 발현 벡터는 본 개시 내용의 기능성 PABPN1 단백질과 함께 조성물로 제공된다.
본 명세서에 설명된 바와 같이, 발현 벡터는 본 개시 내용의 ddRNAi 구조물을 단독으로 또는 본 개시 내용의 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 코돈-최적화된 핵산과 함께 포함할 수 있다. 발현 벡터 및/또는 이를 포함하는 조성물에 대한 본 명세서에서의 참고는 따라서, (i) 본 개시 내용의 ddRNAi 구조물을 포함하는 발현 벡터 또는 이를 포함하는 조성물; (ii) 본 개시 내용의 ddRNAi 구조물을 포함하는 발현 벡터 및 본 개시 내용의 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 코돈-최적화된 핵산 또는 이를 포함하는 조성물; 또는 (iii) 본 개시 내용의 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 코돈-최적화된 핵산을 포함하는 발현 벡터 또는 이를 포함하는 조성물을 포괄하는 것으로 이해되어야 할 것이다.
일 예에 따르면, 본 개시 내용의 조성물은 (i) 본 개시 내용의 ddRNAi 구조물을 포함하는 발현 벡터, 및 (ii) 본 개시 내용의 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 코돈-최적화된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함할 수 있다.
다르게는, 본 개시 내용의 조성물은 본 개시 내용의 ddRNAi 구조물을 포함하는 발현 벡터 및 본 개시 내용의 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 코돈-최적화된 핵산을 포함할 수 있다.
여전히 또 다른 예에서, 본 개시 내용의 ddRNAi 구조물을 포함하는 발현 벡터는 하나의 조성물로 제공될 수 있고, 본 개시 내용의 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 코돈-최적화된 핵산을 포함하는 발현 벡터는 예를 들어 함께 포장된 다른 조성물 내에서 제공될 수 있다.
본 개시 내용의 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 조성물은 RNA 또는 ddRNAi 구조물 또는 본 개시 내용의 발현 벡터의, 그의 투여 후 피험자의 근육으로의 전달에 적합한 담체를포함할 수 있다.
일부 예에서, 담체는 지질계 담체, 양이온성 담체 또는 리포좀 핵산 복합체, 리포좀, 미셀(micelle), 비로좀(virosome), 지질 나노입자 또는 이들의 혼합물이다.
일부 예에서, 담체는 생분해성 중합체-기반 담체여서, 양이온성 중합체-핵산 복합체가 형성된다. 예를 들어, 담체는 RNA 또는 ddRNAi 구조물 또는 본 개시 내용의 발현 벡터의 근육 세포로의 전달에 적합한 양이온성 중합체 미세입자일 수 있다. 세포로의 전달 조성물을 위한 양이온성 중합체의 이용은 당업계에 알려져 있으며, 예컨대 문헌 [Judge et al. (2005) Nature 25: 457-462]에 설명되어있고, 이의 내용은 참고문헌으로 본 명세서에 포함된다. 예시적인 양이온성 중합체계 담체는 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다. 예시적인 양이온성 중합체계 담체는 양이온성 DNA 결합 중합체로, 예컨대 폴리에틸렌이민이 있다. 본 개시 내용의 RNA 또는 ddRNA 구조물 또는 발현 벡터와의 복합체화 및 전달에 적합한 양이온성 중합체는 폴리(L-리신)(PLL), 키토산, PAMAM 덴드리머, 및 폴리(2-디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트(pDMAEMA)이다. 이들은 당업계에서 알려진 기타 적합한 양이온성 중합체이며, 이는 문헌 [Mastrobattista and Hennink, (2012) Nature Materials, 11:10-12, WO/2003/097107호 및 WO/2006/041617호]에 기재되어 있으며, 이의 전체 내용은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다. 그러한 담체 제제는 비경구 피하 주사, 정맥 주사 및 흡입을 포함하는 각종 전달 경로를 위해 개발되어 왔다.
추가의 예에서, 담체는 시클로덱스트린 중합체-핵산 복합체와 같은 시클로덱스트린계 담체이다.
추가의 예에서, 담체는 양이온성 펩티드-핵산 복합체와 같은 단백질계 담체이다.
또 다른 예에서, 담체는 지질 나노입자이다. 예시적인 나노입자는 예를 들어 US7514099에 기재되어 있다.
일부 예에서, 본 개시 내용의 RNA 또는 ddRNAi 또는 발현 구조물은 양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-C-DMA/DSPC(예를 들어, 40/48/2/10의 비율), 양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG/DSPC(예를 들어, 40/48/2/10의 비율), 또는 양이온성 지질/콜레스테롤/PEG-DMG(예를 들어, 60/38/2의 비율)을 포함하는 지질 나노입자 조성으로 조제된다. 일부 예에서, 양이온성 지질은 DMA 내 옥틸 CL, DMA 내 DL, L-278, DLinKC2DMA, 또는 MC3이다.
또 다른 예에서, 본 개시 내용의 RNA 또는 ddRNAi 또는 발현 구조물은 WO 2010/021865; WO 2010/080724; WO 2010/042877; WO 2010/105209 또는 WO 2011/022460에 기재된 임의의 양이온성 지질 제제를 이용하여 조제된다.
또 다른 예에서, 본 개시 내용의 RNA 또는 ddRNAi 또는 발현 구조물은 다른 화합물에 컨쥬게이트되거나, 다른 화합물과 복합체화되어, 예를 들어, RNA 또는 ddRNAi 또는 발현 구조물의 전달을 촉진한다. 그러한 컨쥬게이트의 비제한적인 예가 US 2008/0152661 및 US 2004/0162260(예를 들어, CDM-LBA, CDM-Pip-LBA, CDM-PEG, CDM-NAG, 등)에 기재되어 있다.
또 다른 예에서, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 본 개시 내용의 RNA 또는 ddRNAi 또는 발현 벡터에 공유결합적으로 부착된다. 부착된 PEG는 임의의 분자량, 예를 들어, 약 100 달톤(Da) 내지 약 50,000 달톤(Da)일 수 있다.
여전히 다른 예에서, 본 개시 내용의 RNA 또는 ddRNAi 구조물 또는 발현 벡터는 폴리(에틸렌 글리콜) 지질을 함유하는 표면-변경된 리포좀(PEG-변경된, 또는 장기-순환 리포좀 또는 스텔스(stealth) 리포좀)을 포함하는 예를 들어 WO 96/10391; WO 96/10390; 또는 WO 96/10392에 개시된 바와 같은, 담체와 함께 조제된다.
일부 예에서, 본 개시 내용의 RNA 또는 ddRNAi 구조물 또는 발현 벡터는 폴리에틸렌이민 또는 그의 유도체, 예컨대 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글리콜-N-아세틸갈락토사민(PEI-PEG-GAL) 또는 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글리콜-트리-N-아세틸갈락토사민(PEI-PEG-triGAL) 유도체와 함께 조제되거나 복합체화될 수도 있다.
기타 예에서, 본 개시 내용의 RNA 또는 ddRNAi 구조물 또는 발현 벡터는 미국 특허 출원 공보 2001/0007666에 기재된 바와 것들과 같은 막 파열제와 복합체화된다.
기타 담체는 시클로덱스트린(예를 들어, 문헌 [Gonzalez et al., (1999), Bioconjugate Chem., 10, 1068-1074]; 또는 WO 03/46185 참조), 폴리(락틱-코-글리콜)산(PLGA) 및 PLCA 미소구체를 포함한다(예를 들어, US 2002130430 참조).
조성물은 본 개시 내용의 RNA 또는 ddRNAi 구조물 또는 발현 벡터의 생물학적 안정성을 증가시키는 재료 및/또는 선택적으로 근세포로 국한시키는 능력 및/또는 근세포를 투과하는 조성물의 능력을 증가시키는 재료를 바람직하게 포함할 것이다. 본 개시 내용의 치료 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체(예를 들어, 생리학적 식염수) 내에서 투여될 수 있으며, 이는 투여 방법 및 경로, 및 표준 약학 실시의 기준으로 선택된다. 당업자는 본 개시 내용의 RNA 또는 ddRNAi 구조물 또는 발현 벡터를 포함하는 약학 조성물을 쉽게 조제할 수 있다. 일부 경우에서, 등장성 제제가 사용된다. 일반적으로, 등장성을 위한 첨가제는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토오스를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 인산염 완충 식염수와 같은 등장성 용액이 바람직하다. 안정화제는 젤라틴 및 알부민을 포함한다. 일부 예에서, 혈관수축제가 제제에 첨가된다. 본 개시 내용에 따른 조성물은 멸균 및 무-발열인자로 제공된다. 적합한 약학 담체 및 약학 제제에서의 사용을 위한 약학 필수성분은, 본 기술 분야 및 USP/NF에서 표준 교과서인, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (formerly Remington's Pharmaceutical Sciences), Mack Publishing Co.]에 기재되어 있다.
약학 조성물의 부피, 농도 및 제제, 및 투약 방법은, 염증 반응과 같은 독성을 최소화하면서, 세포 전달을 최대화하기 위해 특이적으로 조절될 수 있으며, 예를 들어 상응하는 낮은 농도의 활성 성분을 갖는 상대적으로 큰 부피(5 ml, 10 ml, 20 ml, 50 ml 이상) 뿐만 아니라 코르티코스테로이드와 같은 소염성 화합물의 포함이 바람직한 경우 이용될 수 있다.
본 개시 내용의 조성물은 임의의 적합한 경로에 의한 투여를 위해 조제될 수 있다. 예를 들어, 투여 경로는 근육내, 복강내, 피부내, 피하, 정맥내, 동맥내, 안내, 근육내, 복강내, 피부내, 피하, 정맥내, 동맥내, 안내 및 경구 뿐만 아니라 경피 또는 흡입에 의해 또는 좌약을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다. 예시적인 투여 경로는 정맥내(IV), 근육내(IM), 경구, 복강내, 피부내, 동맥내 및 피하 주사를 포함한다. 일 예에서, 본 개시 내용의 조성물은 IM 투여를 위해 조제된다. 그러한 조성물은 약학 적용에 유용하며, 적합한 멸균, 비-발열인자성 비히클, 예를 들어 주사용, 비경구 투여용, 예를 들어 IM, 정맥내(정맥내 관류 포함), SC 및 복강내 투여용 완충 식염수로 쉽게 조제될 수 있다. 일부 투여 경로, 예컨대 IM, IV 주사 또는 관류는 근육 조직으로의 효과적인 전달 및 ddRNAi 구조물 및/또는 본 개시 내용의 PABPN1을 인코딩하는 코돈-최적화된 핵산의 형질감염(transfection), 및 RNA 및/또는 그 안의 코돈-최적화된 핵산의 발현을 달성할 수 있다.
치료 방법
일 예에서, 본 개시 내용의 RNA 또는 ddRNAi 구조물 또는 발현 벡터 또는 조성물은 OPMD의 원인이 되는 PABPN1 단백질을 포함하는 내생의 PABPN1 단백질의 발현을 피험자에서 저해하는데 사용될 수 있다.
일 예에서, 본 개시 내용의 RNA 또는 ddRNAi 구조물 또는 발현 벡터 또는 조성물은 OPMD를 앓고 있는 피험자에서 OPMD를 치료하는데 사용될 수 있다. 유사하게, 본 개시 내용의 RNA 또는 ddRNAi 구조물 또는 발현 벡터 또는 조성물은 OPMD를 앓고 있거나 그에 대한 성향이 있는 피험자에서 OPMD의 하나 이상의 증상의 발생 또는 진전을 방지하는데 사용될 수 있다.
상기 예 각각에서, 본 개시 내용의 발현 벡터 및/또는 조성물은 본 개시 내용의 ddRNAi 구조물과 본 개시 내용의 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 코돈-최적화된 핵산을 모두 포함할 수 있다. 따라서, 발현 벡터 또는 조성물의 투여는 (i) OPMD의 원인이 되는 확장된 폴리알라닌로를 포함하는 PABPN1 단백질을 포함하는, 내생의 PABPN1의 발현을 억제, 감소 또는 녹다운시키고, (ii) 내생의 PABPN1의 발현을 저해, 감소 또는 녹다운시키는 RNA에 의해 표적화되지 않는 기능성 PABPN1 단백질의 발현을 제공하는데 효과적일 수 있다. 본 개시 내용의 조성물은 이에 따라 PABPN1 단백질 기능, 예를 들어 RNA의 전사후 가공을, 투여받는 세포 또는 동물에서 보존할 수 있다.
또 다른 예에서, OPMD의 치료는 (i) OPMD의 원인이 되는 PABPN1 단백질의 발현을 저해하기 위한 하나 이상의 약제, 및 (ii) 본 개시 내용의 PABPN1 단백질을 인코딩하는 코돈-최적화된 핵산 또는 그를 포함하는 조성물을 포함하는 발현 벡터를 피험자에게 별도로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 명세서에 설명된 바와 같이, OPMD의 원인이 되는 PABPN1 단백질의 발현을 저해하기 위한 하나 이상의 약제는 본 개시 내용의 RNA 또는 ddRNAi 구조물 또는 발현 벡터 또는 그를 포함하는 조성물일 수 있다. 피험자는 성분 (i) 및 (ii)를 함께, 동시에 또는 연속하여 투여받을 수 있다.
예를 들어, OPMD의 처리는 본 개시 내용의 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 코돈-최적화된 핵산을 피험자에게 투여하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 피험자는 OPMD의 원인이 되는 PABPN1 단백질의 발현을 억제하지만, 코돈-최적화된 핵산의 발현은 억제하지 않는 하나 이상의 약제를 미리 투여받는다. 예를 들어, 피험자는 RNA, 복수의 RNA, ddRNAi 구조물, 복수의 ddRNAi 구조물, 발현 벡터, 복수의 발현 벡터, 및/또는 본 개시 내용의 조성물을 이전에 투여받았을 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 투여 경로는, 근육내, 복강내, 피부내, 피하, 정맥내, 동맥내, 안내 및 경구 뿐만 아니라 경피 또는 흡입에 의해 또는 좌약을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다. 투여의 예시적인 경로는 정맥내(IV), 근육내(IM), 경구, 복강내, 피부내, 동맥내 및 피하 주사를 포함한다. 투여의 일부 경로, 예컨대 IM, IV 주사 또는 주입은 근육 조직으로의 효과적인 전달 및 본 개시 내용의 ddRNAi 구조물 및/또는 PABPN1을 인코딩하는 코돈-최적화된 핵산의 트랜스팩션, 및 RNA 및/또는 그 안의 코돈-최적화된 핵산의 발현을 달성할 수 있다.
당업자는 일상적 실험에 의해, OPMD를 앓고 있는 피험자를 치료하는데 요구될 수 있는 본 개시 내용의 RNA 또는 ddRNAi 구조물 또는 발현 벡터(들) 또는 조성물(들)의 효과적인, 비독성 양을 결정할 수 있을 것이다. 임의의 특정한 환자에 대해 치료 유효한 용량(dose) 수준은, 의약에서 공지된 기타 관련 인자들과 함께, 사용된 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반 건강, 성별 및 식이; 투여 시간; 투여 경로; 본 개시 내용의 RNA 또는 ddRNAi 구조물 또는 발현 벡터(들) 또는 조성물(들)의 격리(sequestration) 속도; 치료 기간을 포함하는 각종 인자들에 따라 달라질 것이다.
본 개시 내용의 RNA 또는 ddRNAi 구조물 또는 발현 벡터(들) 또는 조성물(들)의, OPMD의 원인이 되는 PABPN1 단백질의 발현을 감소 또는 저해하는 효능 및 OPMD의 원인이 되지 않는 기능성 PABPN1 단백질이 PABPN1 기능을 복구하기에 충분한 양으로 발현시키는 효능은 치료되는 피험자에서 근수축 특성 및/또는 연하 곤란을 평가함으로써 결정될 수 있다. 연하 능력 및 근수축 특성의 시험 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 연하 곤란은 비디오 투시검사, UGI 내시경술 또는 식도 계측검사 및 임피던스 시험을 이용하여 평가될 수 있다. OPMD의 임상적 특징을 평가하기 위한 기타 방법은 문헌 [Ruegg et al,. (2005) Swiss Medical Weekly, 135:574-586]에 기재되어 있다.
키트
본 개시 내용은 또한 키트 내에 본 개시 내용의 RNA 또는 ddRNAi 구조물 또는 발현 벡터(들) 또는 조성물(들)을 제공한다. 키트는 용기를 포함할 수 있다. 키트는 본 개시 내용의 RNA 또는 ddRNAi 구조물 또는 발현 벡터(들) 또는 조성물(들)을 통상적으로 그의 투여에 대한 사용설명서와 함께 포함한다. 일부 예에서, 키트는 본 개시 내용의 하나 초과의 RNA 또는 ddRNAi 또는 발현 벡터 또는 조성물을 포함한다. 일 예에서, 키트는 (i) 제1 키트 성분으로서, 본 개시 내용의 RNA 또는 ddRNAi 구조물 또는 발현 벡터(들) 또는 조성물(들), 및 (ii) 제2 키트 성분으로서, 본 개시 내용의 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 코돈-최적화된 핵산을 포함하는 발현 벡터 또는 그를 포함하는 조성물을 포함한다. 제1 및 제2 키트 성분은 키트 내에 함께 포장될 수 있다.
PABPN1 mRNA 전사물 내 표적 영역
영역 ID 영역 서열(5' - 3') 서열번호
영역 1 UUGAGGAGAAGAUGGAGGCUGAU 서열번호1
영역 2 AGGAAGAAGCUGAGAAGCUAA 서열번호2
영역 3 GAGGUAGAGAAGCAGAUGAAUAUGAGU 서열번호3
ssRNA
ssRNA ID 이펙터 서열(5' - 3') 서열번호
ssRNA1 AUCAGCCUCCAUCUUCUCCUCAA 서열번호4
ssRNA2 UUAGCUUCUCAGCUUCUUCCU 서열번호6
ssRNA3 ACUCAUAUUCAUCUGCUUCUCUACCUC 서열번호8
dsRNA 듀플렉스
dsRNA ID 이펙터(5' - 3') 서열번호 이펙터 보체(5' - 3') 서열번호
dsRNA1 AUCAGCCUCCAUCUUCUCCUCAA 서열번호4 UUGAGGAGAAGAUGGAGGCUGAU 서열번호5
dsRNA2 UUAGCUUCUCAGCUUCUUCCU 서열번호6 AGGAAGAAGCUGAGAAGCUAA 서열번호7
dsRNA3 ACUCAUAUUCAUCUGCUUCUCUACCUC 서열번호8 GAGGUAGAGAAGCAGAUGAAUAUGAGU 서열번호9
shRNA 듀플렉스
shRNA ID 이펙터(5' - 3') 서열번호 이펙터 보체(5' - 3') 서열번호
shRNA1 AUCAGCCUCCAUCUUCUCCUCAA 서열번호10 UUGAGGAGAAGAUGGAGGCUGAU 서열번호11
shRNA2 UUAGCUUCUCAGCUUCUUCCU 서열번호12 AGGAAGAAGCUGAGAAGCUAA 서열번호13
shRNA3 ACUCAUAUUCAUCUGCUUCUCUACCUC 서열번호14 GAGGUAGAGAAGCAGAUGAAUAUGAGU 서열번호15
shRNA
shRNA ID shRNA 서열(5' - 3') 서열번호
shRNA1 GAGGAGAAGAUGGAGGCUGAUCAAGAGAAUCAGCCUCCAUCUUCUCCUC 서열번호16
shRNA2 AUCAGCCUCCAUCUUCUCCUCCAAGAGAGAGGAGAAGAUGGAGGCUGAU 서열번호17
shRNA3 GGAAGAAGCUGAGAAGCUAACAAGAGAUUAGCUUCUCAGCUUCUUCC 서열번호18
shRNA4 UUAGCUUCUCAGCUUCUUCCCAAGAGAGGAAGAAGCUGAGAAGCUAA 서열번호19
shRNA5 GAGGUAGAGAAGCAGAUGAAUAUGAGUUCAAGAGACUCAUAUUCAUCUGCUUCUCUACCUC 서열번호20
shRNA6 CUCAUAUUCAUCUGCUUCUCUACCUCCAAGAGAGAGGUAGAGAAGCAGAUGAAUAUGAGU 서열번호21
실시예 1 - PABPN1을 표적화하는 dsRNA 및 shRNA의 설계
ddRNAi 구조물의 설계를 위한 잠재적 표적을 나타내는 서열을 공개적으로 이용가능한 siRNA 설계 알고리즘(Ambion, Promega, Invitrogen, Origene 및 MWG 포함)을 이용하여, PABPN1 mRNA 서열로부터 확인하였다: 인간, 소 및 마우스에서 보존된 서열이 선택되었다. 이들 상에서 siRNA가 시험관 내에서 합성 및 시험되었고, 3개의 활성 siRNA가 ddRNAi 구조물로의 전환을 위해 선택되었다. 이중가닥 RNA (dsRNA) 및짧은 헤어핀 RNA(shRNA)의 설계를 위한 표적으로서 선택되는 영역에 상응하는 mRNA 전사물이 표 1에 제시된다.
표 1에 기재된 표적 영역에 대해 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 dsRNA이 설계 및 확인되었다(표 3). 인간 PABPN1을 하향조절하기 위한 siRNA 서열의 스크리닝이 HeLa 세포 내에서 수행되었으며, 여기서 내생의 인간 PABPN1이 구조적으로 발현된다. siRNA의 형질감염은 올리고펙타민(Life Technologies)을 이용하여 실시되었다. 간략하게는, 형질감염 날에, 12개 웰 플레이트 내 매질을 항생제가 없는 무혈청 매질 400 ㎕ 및 올리고펙타민-siRNA 복합체 100 ㎕로 교체하였다. 100 ㎕의 올리고펙타민-siRNA 복합체에서, 7㎕의 Opti-Mem(Gibco) 내 3 ㎕의 올리고펙타민 및 87 ㎕의 Opti-Mem 내 60 pmol siRNA를 최종 부피 100 ㎕로 함께 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 형질감염한지 4시간 후, 30% FBS를 갖는 250 ㎕의 매질이 각각의 웰에 첨가되었다. 최종 siRNA 농도는 80 nM이었다. 형질감염한지 48시간 후 RNA 추출을 수행하였다. -표 1에 나타낸 표적 영역에 대해 시험된 모든 siRNA 서열은 HeLa 세포의 실질적인 녹다운을 보여주었다. siRNA 중, 상이한 정도의 효능을 보여주는 3개의 서열(표 3에서 dsRNA 1, 2 및 3)이 시험되었다. 이들은 건강한 개인 또는 OPMD에 걸린 개인으로부터의 인간 근원세포에서 또한 평가되었다. 간략하게는, 건강한 개인 또는 OPMD에 걸린 개인으로부터의 인간 근원세포는, 상기 기재된 방법에 따라 dsRNA1, dsRNA2 또는 dsRNA3을 이용하여 형질감염되었다. 정량 RT-PCR은 이후 수행되었으며, dsRNA 각각에 대해 현저한 수준의 녹다운을 보여주었다(도 1).
표 1에 기재된 표적 영역에 실질적으로 상보적인 이펙터 서열을 포함하는 dsRNA 1-3에 상응하는 shRNA가 설계 및 표 4에 제시된다. 표 4에서, 이펙터 서열, 스템 루프 서열 및 이펙터 보체 서열 각각을 포함한 shRNA에 대한 완전한 서열(5'-3' 배향)이 표 5에 제시된다.
실시예 2 - 자가-상보성 AAV-계 플라스미드 구조물 및 PABPN1을 표적화하는 shRNA를 발현하는 바이러스의 생성
PABPN1를 표적화하는 shRNA 중 하나 또는 3개를 발현하는 자가-상보성 아데노-연관 제2형 바이러스(scAAV2) 플라스미드(표 5에 제시됨)는, PABPN1을 표적화하는 단일 또는 3개의 shRNA를 scAAV2 골격 내로 서브클로닝함으로써 생성되었다.
간단하게는, H1 프로모터 제어 하에서 shRNA5(서열번호 20)를 코딩하는 DNA를 포함하는 단일 shRNA 구조물을 pAAV2 벡터 골격 내로 클로닝하였다(pAAV-shRNA5). shRNA1(서열번호 16), shRNA3(서열번호 18) 및 shRNA5(서열번호 20)를 코딩하는 DNA를 포함하는, 2개의 삼중 shRNA 구조물이 RNA 폴리머라제 III 프로모터 U61, U69 및 H1 각각의 제어 하에 또한 생산되고, pAAV2 벡터 골격 내로 클론되었다. 이들 삼중 구조물은 pAAV-shRNAx3-short(서열번호 22) 및 pAAV-shRNAx3-long(서열번호 23)이었다. 2개의 변이체는 모두 기재된 트리시스트론성 shRNA 구조물을 포함하였지만, pAAV-shRNAx3-long에서의 구조물은 또한 스터퍼(stuffer) DNA 서열을 또한 포함하여 AAV 패키징에 대한 최적의 삽입물 크기를 만들었다. 유사하게, HBV 폴리머라제 유전자(pAAV-HBVpol)에 대하여 shRNA를 발현하는 AAV 바이러스성 플라스미드는 대조구로서의 사용을 위해 구축되었다.
추가의 2개의 플라스미드가 생산되었으며, FLAG-태그된 돌연변이 인간 PABPN1을 코딩하는 하나는 7 알라닌-확장(pAAV mut-PABPN1-FLAG; 서열번호 27)을 포함하고, 다른 하나는 MYC 태그를 갖는 야생형 인간 PABPN1을 코딩하는 코돈-최적화된 서열을 포함한다(pAAV Opt-hPABPN1-MYC; 서열번호 26).
AAV 벡터 각각은 AAV8 캡시드에서 슈도타이핑에 의해 생산되었다.
재조합 슈도타이핑된 AAV 벡터 스톡(stock)이 이후 생성되었다. 간략하게는, HEK293T 세포를 10% FBS로 보충된 둘베코 변형 이글 배지 내 롤러 병 내에서 배양하고, 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 각각의 pAAV-shRNA 바이러스성 플라스미드가 본 실시예에 기재되었으며, pAAVhelpercap8 플라스미드(pDP8r) 또는 pAAVhelpercap9 플라스미드(pDP9rs)를 제조자 설명서에 따라 폴리에틸렌이민(PEI)과 복합체화하였다. 이중-형질감염은 HEK293T 세포 내에서 pAAV-shRNA5, pAAV-shRNAx3-short 또는 pAAV-shRNAx3-long 및 pDP8r(또는 pDP9rs) 중 하나를 이용하여 수행되었다. HEK293T 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 72 시간의 기간 동안 배양하였으며, 그 기간 후 세포를 용해시키고, 바이러스성 플라스미드 각각에 대해 scAAV shRNA-발현 입자를 요오딕산올(Sigma-Aldrich) 단계-구배 초원심분리에 의해 정제하였다. 벡터 유전체의 수는 점 블롯 혼성화 및 정성적 폴리머라제 연쇄 반응(Q-PCR)에 의한 정량화되었다.
바이러스성 플라스미드를 위해 지정된 pAAV-shRNA5, pAAV-shRNAx3-short, pAAV-shRNAx3-long, pAAV-HBVpol, pAAV mut-PABPN1-FLAG 및 pAAV Opt-hPABPN1-MYC를 위해, 상응하는 scAAV8 바이러스성 제제는 각각 지정된 scAAV8-shRNA5, scAAV8-shRNAx3-short, scAAV8-shRNAx3-long, scAAV8-HBVpol, ssAAV8 mut-PABPN1-FLAG 및 ssAAV9-Opt-hPABPN1-MYC였다.
실시예 3 - 시험관 내 PABPN1의 유전자 사일런싱
본 실시예는 실시예 2에서 생성된 PABPN1 pAAV-shRNA 플라스미드가 시험관 내에서 PABPN1의 발현을 녹다운하는 능력을 예증한다.
세포
인간 배아 신장 세포(HEK293T, ATCC, Manassas, USA)는 20mM HEPES, 10% 소태아 혈청(FBS) 및 2 mM 글루타민을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 배양되었다(PAA laboratories, Yeovil, UK).
온도-민감성 SV40 거대 T-항원(tsA58) 이식유전자로 불멸화되고, Immorto-Mouse H2kB-IM2(부모 세포주)로부터 유도된 1차 마우스 근원세포(클론 IM2) H2kB-WTA(인간 야생형 PABPN1을 코딩) 및 H2kB-D7e(7 알라닌-확장된 PABPN1 코딩)는 King's College London의 Dr Michael Antoniou에 의해 제공받았다. IM2 세포를, 20 mM HEPES, 2 mM 글루타민을 함유하고, 20% FBS, 0.5% 치킨 배아 추출물, 100 U/ml 페니실린-스트렙토마이신, 2 mmol/L L-글루타민 및 20 U/ml 인터페론-γ으로 보강된 DMEM 내에서 생장시켰다.
처리
간략하게는, HEK293T 세포를 3Х105 세포/웰로 접종하고, 다음날 pAAV-shRNA5, pAAV-shRNAx3-short 또는 pAAV-shRNAx3-long(4 ㎍/웰) 중 하나를 이용하여, AAV 플라스미드 발현 돌연변이 hPABPN1-FLAG(pAAV mut-PABPN1-FLAG)(4 ㎍/웰)(서열번호 27) 또는 코돈-최적화된 PABPN1(pAAV Opt-hPABPN1-MYC)(4 ㎍/웰)(서열번호 26) 없이 또는 이와 함께, 형질감염시켰다. 대조구로서, HEK293T 세포는 HBV 폴리머라제 유전자(4 ㎍/웰)에 대해 shRNA를 발현하는 pAAV-HBVpol 플라스미드로 형질감염되었다. HEK293T 세포는 48시간 동안 항생제 부재 하에서 DMEM 10% FCS 내 33℃에서 인큐베이션되었으며, 이 시간 후 세포를 수확하고, 웨스턴 블롯팅에 의한 분석을 위해 세포 용균물을 생성하였다.
유사하게, H2kB-D7e 마우스 근원세포(106 세포/웰)는 pAAV-HBVpol, AAV-shRNAx3-short 또는 pAAV-shRNAx3-long을 이용한 뉴클레오펙션(nucleofection)에 의해, 돌연변이 hPABPN1-FLAG 또는 Opt-hPABPN1-MYC (1 ㎍/웰)를 발현하는 AAV 플라스미드 없이 또는 이와 함께, 형질감염되었다. H2kB-D7e 마우스 근원세포는 이후 항생제 부재 하에 48시간 동안 DMEM 10% FCS 내 33℃에서 인큐베이션되었으며, 추가 72시간 동안 DMEM/5% 말 혈청 내에서의 인큐베이션에 의해 분화로 전환되었다. 형질감염후 5일, 근관세포를 수확하고, 웨스턴 블롯팅에 의한 분석을 위해 세포 용균물을 생성하였다.
웨스턴 블롯 분석
프로테아제 저해제 칵테일을 이용하여(Complete, Roche Diagnostics), NaCl 0.15 M, 0.1% SDS, 50 mM Tris (pH8), 2 mM EDTA 및 10% Triton-X-100을 함유하는 RIPA 버퍼 내에서 세포를 균질화함으로써 세포 용균물을 제조하였다.
단백질을 4% 내지 12% 비스-트리스 겔(Invitrogen) 상에서 분리하고, 니트로셀룰로오스 막 상(Hybond ECL membrane; Amersham Biosciences)으로 이동시켰으며, 이는 0.1 M PBS 내 5% 우유, 0.1% Tween-20 내에서 인큐베이션함으로써 차단시켰다. 니트로셀룰로오스 막(abcam, 1/10,000) 및 인간 GAPDH(abcam, 1/10,000) 또는 하우스-키핑 대조구로서 마우스 GAPDH(abcam, 1/2500)를 PABPN1(abcam, 1/10,000)에 대해 발생된 1차 항체로 염색시켰다.
pAAV mut-PABPN1-FLAG 벡터에 의해 발현된 확장된 돌연변이 PABPN1 단백질 및 pAAV opt-hPABPN1-MYC 벡터에 의해 코돈-최적화된 PABPN1 단백질을 검출하기 위하여, 니트로셀룰로오스 막을 항-FLAG 항체(Sigma, 1/10,000) 및 항-cMYC 항체(Abcam, 1/10,000) 각각으로 염색시켰다.
니트로셀룰로오스 막을 HRP-컨쥬게이트된 항-토끼 및 항-마우스 2차 항체(Sigma, 각각 1/2000 및 1/1000)와 함께 추가로 인큐베이션하였다. 면역반응성 밴드가 증진된 화학발광시약(ECL; Amersham Biosciences)을 이용하여 검출되었으며, 막은 ECL Hyperfilm(Amersham Biosciences)에 노출시킴으로써 시각화되었다.
ImageJ를 이용하여 GAPDH 대하여 PABPN1에 대한 총 녹다운의 정량화를 도 2에 나타낸다. 도 2에서 명백한 바와 같이, PABPN1 발현의 평균 40%, 90% 및 95% 녹다운은 각각 단일 shRNA 벡터(pAAV-shRNA5), 트리시스트론성-짧은 벡터(pAAV-shRNAx3-short) 및 트리시스트론성-긴 벡터(pAAV-shRNAx3-long)를 이용하여 달성되었다. 짧고(약 1 Kb 삽입물 크기) 및 긴(약 1.5 kb 삽입물 크기) 트리시스트론성 shRNA 구조물 둘 모두는, PABPN1 유전자 내 동일한 표적에 대한 서열 조성에서의 유사성으로 인하여, 유사한 범위의 PABPN1 녹다운의 결과를 초래하였다. 이와 관련하여, 스터퍼 서열의 pAAV-shRNAx3-긴 구조물로의 첨가는 PABPN1 녹다운 효율에 부정적인 영향을 미치지 않았다.
단일한 shRNA 벡터(pAAV-shRNA5) 및 두 트리시스트론성 벡터 모두(pAAV-shRNAx3-short 및 pAAV-shRNAx3-long) 돌연변이 PABPN1을 발현하는 pAAV mut-PABPN1-FLAG로 공동형질감염된 HEK293 세포에서 야생형 및 돌연변이 PABPN1를 녹다운 시킬 수 있었지만, 전체 녹다운은 단일 shRNA 구조물에서보다 3중 shRNA 구조물의 경우 더욱 통계적으로 유의하였다. 한편, 돌연변이 PABPN1을 발현하는 pAAV mut-PABPN1-FLAG 벡터 및 HBV 폴리머라제 유전자를 표적화하는 pAAV-HBV-pol 대조구 벡터로 공동형질감염된 HEK293 세포 내에서는 녹다운이 관찰되지 않았다(도 3a 및 도 3b).
나아가, 확장된 돌연변이 PABPN1 단백질을 발현하는 pAAV mut-PABPN1-FLAG로 공동-형질감염된 HEK293과 비교시, 코돈-최적화된 PABPN1를 발현하는 pAAV Opt-hPABPN1-MYC 벡터로 공동-형질감염된 세포는 양호한 수준의 PABPN1 단백질을 보여주었다. 이들 데이터는 코돈-최적화된 PABPN1 단백질이 단일 및 트리시스트론성 shRNA 구조물에 의해 발현된 shRNAdp 의한 분해에 저항성임을 예증한다(도 3a 및 도 3b). 이러한 관찰을 확인하기 위해, cMYC 항체는 cMYC 펩티드 태그를 포함하는 코돈-최적화된 PABPN1 단백질의 발현을 검출하는데 사용되었다(도 3c).
유사한 결과가 (i)pAAV-HBV-pol 대조구 벡터, (ii) 코돈-최적화된 PABPN1를 발현하는 pAAV Opt-hPABPN1-MYC 벡터, (iii) pAAV-shRNAx3-long 벡터, 또는 (iv) pAAV Opt-hPABPN1-MYC 벡터 및 pAAV-shRNAx3-long 벡터 중 어느 하나로 형질감염된 H2kB-D7e 마우스 근원세포에서 수득되었다. 도 4a 내지 도 4e로부터 명백한 바와 같이, pAAV-shRNAx3-long 벡터는 분화된 H2kB-D7e 마우스 근원세포에 의해 발현된 돌연변이 확장된 PABPN1 단백질을 녹다운 시킬 수 있는 반면, 코돈-최적화된 PABPN1 단백질은 트리시스트론성 shRNA 구조물에 의해 발현된 shRNAdp에 의한 분해에 저항성이었다.
모든 데이터는 평균 값 ± 평균 표준 편차로서 제시된다. 모든 통계 분석은 스튜던트 t-검정 또는 ANOVAs를 이용하여 수행되었으며, 차이는 *P < 0.05, **P< 0.01 또는 ***P < 0.001에서 유의한 것으로 여겨졌다.
이들 데이터에 근거하여, pAAV8-shRNAx3-long 구조물을 바이러스 생산 및 추가의 평가를 위해 취하였다.
실시예 4 - 내생의 PABPN1의 유전자 사일런싱 및 생체 내 코돈 최적화된 PABPN1로의 대체
본 실시예는 실시예 2에서 생성된 scAAV8-shRNAx3-long 재조합 바이러스가 생체 내에서 내생의 PABP1의 발현을 녹다운하는 능력 및 그의 코돈 최적화된 인간 PABPN1으로의 대체를 예증한다. 돌연변이 PABPN1의 녹다운의 생리학적 결과 및 유전자의 비-돌연변이된 형태를 이용한 대체 또한 예증된다.
처리
A17.1 유전자이식 마우스는 이전에 이미 기재되었다(문헌 [Davies, Wang et al., 2005, Trollet, Anvar et al., 2010]). A17.1 마우스 및 WT FvB 대조구는 이형접합체 담체 균주 A17.1(문헌 [Davies, Wang et al., 2005])과 교배함으로써 생성되었다. 마우스는 태어난지 4주 후, 소 PABPN1에 대해 유전자형 분석되었으며, 최소 질병 설비 내에 식품과 물을 임의제공하여 수용하였다(Royal Holloway-University of London).
간략하게는, 10주령 내지 12주령의 A17 마우스들을 처리 그룹에 1마리 내지 4마리 미만으로 배치하였다(치료 군 당 n=5). WT FvB 마우스들 또한 10주령 내지 12주령을 건강한 대조구로서 사용하고, 5마리 그룹으로 위치시켰다(n=5). 모든 마우스를 2% 내지 4% 이소플루레인으로 안락사시키고 다음과 같이 처리하였다:
그룹 1(A17): IM 주사에 의해 두 TA 근육 모두에, 2.5E+10 scAAV8-shRNAx3-long 바이러스성 입자를 함유하는 생리학적 식염수의 하나의 50 ㎕ 볼러스(bolus).
그룹 2(A17): IM 주사에 의해 두 TA 근육 모두에, (코돈-최적화된 hPABPN1를 발현하는) 1.3E+11 ssAAV9-Opt-hPABPN1 바이러스성 입자를 함유하는 생리학적 식염수의 하나의 50 ㎕ 볼러스.
그룹 3(A17): IM 주사에 의해 두 TA 근육 모두에, 2.5E+10 scAAV8-shRNAx3-long 바이러스성 입자 및 1.3E+11 ssAAV9-Opt-hPABPN1 바이러스성 입자를 함유하는 생리학적 식염수의 하나의 50 ㎕ 볼러스.
그룹 4(A17): 생리학적 식염수만의 하나의 50 ㎕ 볼러스.
그룹 5(FvB): 생리학적 식염수만의 하나의 50 ㎕ 볼러스.
근수축 특성
최대 등척성 및 비력을 포함하는, TA 근수축 특성의 측정을 이전에 문헌 [Trollet et al., (2010) Human Molecular Genetics, 19(11): 2191-2207]에 기재된 방법을 이용하여 주사 후 18 주에 수행하였다. 이들 데이타를 도 4에 나타낸다.
마우스들을 마취제 과다용량으로 희생시켰으며, 그 후 TA 근육을 힘줄을 따라 절제해내고, 칭량하고, 추가의 조직학적 및 분자적 분석을 위해 액체 질소-냉각된 아이소펜탄 내에서 급속 냉각시켰다.
PABPN1 mRNA 발현
총 RNA를 Trizol(Invitrogen)을 이용하여 제조자 설명서에 따라 골격근 샘플로부터 추출하였다. RNA 샘플을 ND-1000 NanoDrop 분광광도계(NanoDrop Technologies)를 이용하여 정량하였다. RNA 샘플을 ND-1000 NanoDrop 분광광도계(NanoDrop Technologies)를 이용하여 정량하였다. RNA(근육 생검을 위해 50 ng 내지 250 ng, 세포 펠렛을 위해 1 ㎍ 내지 3 ㎍)는 제조자 설명서에 따라 M-MLV 역전사효소(Invitrogen)를 이용하여 역전사하였다. SYBR 그린 믹스 버퍼(LightCycler® 480 Sybr green I Master)를 이용하여 9 ul의 총 반응 부피로 cDNA를 정량 PCR 반응에 사용하였다. PCR 반응은 다음과 같이 실시되었다: 95℃에서 8분에 이어 50회: 95℃에서 15초, 60℃에서 15초 및 72℃에서 15초. PCR 생성물의 특이성은, 65℃를 초 당 0.11℃로 97℃까지 증가시키는 프로그램을 이용하여 용융 곡선 분석에 의해 확인되었다.
각각의 mRNA의 발현 수준을 쥣과의 RPLP0 mRNA(거대 리보솜성 단백질, 서브유닛 PO) 발현 수준에 대해 정규화하였다. 발현 수준은 DDCt 방법에 따라 계산되었다.
RT-PCR 및 실시간 RT-PCR에 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다:
PABPN1-FWD 5'-TGACCCGGGGGACGGCGC-3'
PABPN1-REV 5'-ACTCGAGCTTTGATAGCTTCCAGC-3'
RPLP0-FWD 5'-GAGGACCTCACTGAGATTCGG-3'
PRLP0-REV 5'-TTCTGAGCTGGCACAGTGAC-3'
면역조직화학
PABPN1 단백질의 핵 집합체 존재를 검출하도록 마우스로부터 절제된 TA 근육(10 ㎛)의 섹션 상에서 면역조직화학이 수행되었다. 간략하게는, TA 근육의 섹션을 1 M KCl, 30 mM HEPES, 65 mM PIPES, 10 mM EDTA, 2 mM MgCl2(pH 6.9) 내에서 1시간 동안 인큐베이션하여 임의의 가용성 단백질을 제거하였다. 섹션을 0.1 M PBS, 0.1% Triton X100 내에서 1% 정상 염소 혈청으로 블록시키고 4℃에서 항-PABPN1 1차 항체에서 밤새 인큐베이션하고, 동일한 버퍼 내에서 1:200으로 희석시켰다. 섹션들을 이후 1시간 동안 실온에서 라미닌에 대한 항체와 함께, 그 후 실온에서 1시간 동안 실온에서 2차 항체와 함께 추가로 인큐베이션시켰다. 최종적으로 섹션을Hoechst로 염색하여 핵을 시각화하였다.
조직학 및 형태학적 분석
TA 근육(10 ㎛)의 일련의 횡측 크리오섹션(cryosection) 상에서 염색을 실시하였다. TA 근육을 근육 길이를 따라 10 개 내지 12 개의 상이한 간격에서 절단하고, 결정될 최대 단면적(CSA)이 측정되도록 하였다. 조직 형태학 및 섬유화와 결합 조직의 시각화의 평가를 위해, 근육의 횡측 섹션을 형광 하에서 추가의 실험을 위해 H&E 및 콜라겐 VI로 각각 염색하였다. 중심 핵화를 평가하기 위하여, 5개의 랜덤 영역을 각각의 섹션에서 평가하였다. 이미지는 Olympus BX60 현미경을 이용하여 시각화하였으며(Olympus Optical, Hamburg, Germany), CCD 카메라를 이용하여 디지털화하고(Photometrics CoolSNAP fx; Roper Scientific, Tucson, AZ, USA), MetaView 이미지 분석 시스템(Universal Imaging, Downington, PA, USA)을 이용하여 분석하였다. 이들 영역에서 섬유의 총 수를 계수하고 중심 핵화된 섬유의 수를 섬유의 총 수의 퍼센트로서 나타내었다(도 5).
웨스턴 블롯 분석
웨스턴 블롯 분석을 이후 조직 상에서 수행하여 PABPN1를 검출하였다. 간략하게는, RIPA 용액 내에서 프로테아제 저해제 칵테일과 함께 조직을 균질화함으로써 근육 용해물을 제조하였다(NaCl 0.15 M, HEPES 0.05 M, NP-40 1%, 나트륨 데혹시콜레이트 0.5%, SDS 0.10%, EDTA 0.01M). 단백질을 4% 내지 12% 비스-트리스 겔(Invitrogen) 상에서 분리하고, 니트로셀룰로오스 막(Hybond ECL 막; Amersham Biosciences) 상에서 이동시키고, 이를 0.1 M PBS 내 5% 우유, 0.1% Tween-20 중에서 인큐베이션함으로써 차단시켰다. 니트로셀룰로오스 막을 PABPN1(abcam, 1/10,000)에 대해 1차 항체 또는 하우스-키핑 대조구로서 마우스 빈쿨린(Sigma, 1/10,000)으로 염색하였다. 니트로셀룰로오스 막을 HRP-컨쥬게이트된 항-토끼 및 항-마우스 2차 항체(Sigma, 각각 1/2000 및 1/1000)로 추가로 인큐베이션시켰다. 면역반응성 밴드는 증진된 화학발광시약(ECL; Amersham Biosciences)으로 검출하였으며, 막을 ECL Hyperfilm(Amersham Biosciences)에 노출시킴으로써 시각화하였다.
모든 데이터는 평균(SEM)의 평균 값±표준 오차로서 제시된다(코호트 크기는 시험 당 언급됨). 모든 통계 분석은 스튜던트 t-검정을 이용하여 수행되었다. 차이는 *P < 0.05, **P< 0.01 또는 ***P < 0.001에서 유의한 것으로 여겨졌다.
결과
근육 질량(도 5b)은 4달의 처리에 걸쳐 회복되지 않은 한편, 전체 근육 강도(도 5a)는 개선된 것으로 보였으며, (i) 내생의 PABPN1을 표적화하는 3개의 shRNA를 발현하는 scAAV8-shRNAx3-long 바이러스 입자 및 (ii) shRNA에 의해 표적화되지 않은 대체 코돈-최적화된 인간 PABN1을 발현하는 ssAAV8 Opt-hPABPN1 바이러스성 입자(도 5)가 투여된 그룹 3의 마우스들의 경우, 특정 근육 강도(도 5c)가 정상화된 것으로 결정되었다.
도 6에 나타낸 웨스터 블롯 데이터로부터 명백한 것과 같이, scAAV8-shRNAx3-long 단독 투여 및 ssAAV9 opt hPABPN1-myc와 함께 투여된 A17 마우스는 식염수만을 투여받은 마우스에 비하여 현저히 감소된 수준의 돌연변이 확장된 PABPN1 단백질을 나타내었으며, 이는 scAAV-shRNAx3-long 바이러스 입자가 생체 내에서 내생의 돌연변이 PABPN1 단백질의 발현을 제어하는 능력을 예증하였다. 나아가, Myc-태그는 ssAAV9-optPABPN1-myc로 처리된 마우스 및 scAAV8-shRNAx3-long와 ssAAV9-opt hPABPN1-myc와 조합 처리된 마우스에서 균등하게 발현되었다.
정량 PCR은, 이들 결과가, scAAV8-shRNAx3-long이 식염수만이 투여된 마우스들에 비교하여 PABPN1 발현에서의 80% 녹다운을 결과로서 생성하였으며, ssAAV9 opt hPABPN1-myc와 조합되어 투여된 scAAV8-shRNAx3-long은 식염수만 투여된 마우스들에 비교하여 PABPN1 발현에서 90% 녹다운을 결과로서 생성하였음을 보여준다는 것을 확인시켜 주었다.
조직학 및 분자 분석은 내생의 PABPN1의 사일런싱이 핵 집합체를 거의 없애고(도 7a 및 도 7b), 중심 핵화된 섬유의 증가된 양에 의해 나타나는 바와 같은 근육 악화를 유도함을 보여주었다(도 8a, 도 8c). 이와 관련하여, FvB 마우스로부터의 근육핵이 실질적으로 집합체를 함유하지 않은 한편, 핵 집합체는 A17 마우스에서 35%의 근육핵 내에서 검출되었다. optPABPN1의 발현은 A17 마우스의 근육 내에서 불용성 집합체의 형성을 변경하지 않는 한편, scAAV8-shRNAx3-long을 이용한 처리는 집합체를 함유한 근육핵의 양을 10%로 감소시켰다. scAAV8-shRNAx3-long이 ssAAV9-opt hPABPN1-myc 발현 코돈 최적화된 PABPN1과 공동투여된 경우, 집합체를 함유하는 근육핵의 양은 단지 5%로 감소되었다. 그러나, 근육 악화는 코돈-최적화된 인간 PABPN1의 공동 발현에 의해 반전되는 것으로 나타났다.
scAAV8-shRNAx3-long 및 ssAAV9 opt hPABPN1-myc의 조합으로 처리된 A17 마우스들로부터의 근육에서, 식염수가 투여된 A17 마우스로부터의 근육에 비교하여 섬유증 조직에서의 현저한 감소가 관찰되었다(도 8b, 도 8d). 최종적으로 근섬유 단면적(CSA)의 분석은, scAAV-shRNAx3-long 단독의 주입이 근섬유의 CSA를 변경시키지는 않았지만, ssAAV9 Opt-hPABPN1-myc 단독 처리 또는 scAAV-shRNAx3-long과 조합한 처리는 근섬유 CSA를 현저히 증가시켰음을 나타내었다(도 8e 내지 도 8f).
종합적으로, 이들 데이터는 AAV에 의해 전달된 shRNAx3-long 구조물이 PABPN1을 생체 내에서 효율적으로 하향조절시키며 핵 집합체 형성을 크게 감소시킴을 보여준다. 중요하게는, 서열-최적화된 PABPN1이 생체 내에서 rAAV에 의해 발현되어 악화에 반응성이고, 근육 기능을 회복시키는 전사물을 생산하는 것으로 나타났다. 이를 종합하면, 이들 생체 내 데이터는 억제 및 대체 치료법이 OPMD에서 근육 기능을 회복하는데 효과적임을 예증한다.
SEQUENCE LISTING <110> Benitec Biopharma Limited <120> Reagents for treatment of Oculopharyngeal Muscular Dystrophy (OPMD) and use thereof <130> 177475 <150> US 62/322,745 <151> 2016-04-14 <160> 29 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 uugaggagaa gauggaggcu gau 23 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 aggaagaagc ugagaagcua a 21 <210> 3 <211> 27 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 gagguagaga agcagaugaa uaugagu 27 <210> 4 <211> 23 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Effector sequence for ssRNA1 and dsRNA1 <400> 4 aucagccucc aucuucuccu caa 23 <210> 5 <211> 23 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Effector complement sequence for dsRNA1 <400> 5 uugaggagaa gauggaggcu gau 23 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Effector sequence for ssRNA2 and dsRNA2 <400> 6 uuagcuucuc agcuucuucc u 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Effector complement sequence for dsRNA2 <400> 7 aggaagaagc ugagaagcua a 21 <210> 8 <211> 27 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Effector sequence for ssRNA3 and dsRNA3 <400> 8 acucauauuc aucugcuucu cuaccuc 27 <210> 9 <211> 27 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Effector complement sequence for dsRNA3 <400> 9 gagguagaga agcagaugaa uaugagu 27 <210> 10 <211> 23 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Effector sequence for shRNA1 and shRNA2 <400> 10 aucagccucc aucuucuccu caa 23 <210> 11 <211> 23 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Effector complement sequence for shRNA1 and shRNA2 <400> 11 uugaggagaa gauggaggcu gau 23 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Effector sequence for shRNA3 and shRNA4 <400> 12 uuagcuucuc agcuucuucc u 21 <210> 13 <211> 21 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Effector complement sequence for shRNA3 and shRNA4 <400> 13 aggaagaagc ugagaagcua a 21 <210> 14 <211> 27 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Effector sequence for shRNA5 and shRNA6 <400> 14 acucauauuc aucugcuucu cuaccuc 27 <210> 15 <211> 27 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Effector complement sequence for shRNA5 and shRNA6 <400> 15 gagguagaga agcagaugaa uaugagu 27 <210> 16 <211> 49 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> shRNA1 sequence <400> 16 gaggagaaga uggaggcuga ucaagagaau cagccuccau cuucuccuc 49 <210> 17 <211> 49 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> shRNA2 sequence <400> 17 aucagccucc aucuucuccu ccaagagaga ggagaagaug gaggcugau 49 <210> 18 <211> 47 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> shRNA3 sequence <400> 18 ggaagaagcu gagaagcuaa caagagauua gcuucucagc uucuucc 47 <210> 19 <211> 47 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> shRNA4 sequence <400> 19 uuagcuucuc agcuucuucc caagagagga agaagcugag aagcuaa 47 <210> 20 <211> 60 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> shRNA5 sequence <400> 20 gagguagaga agcagaugaa uaugagucaa gagacucaua uucaucugcu ucucuaccuc 60 <210> 21 <211> 60 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> shRNA6 sequence <400> 21 cucauauuca ucugcuucuc uaccuccaag agagagguag agaagcagau gaauaugagu 60 <210> 22 <211> 1068 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OPMD Triple construct short <400> 22 ctcgagacgc gtggtaccga gctcgctagc agcgcttacg tatttaaatg gcaggaagag 60 ggcctatttc ccatgattcc ttcatatttg catatacgat acaaggctgt tagagagata 120 attagaatta atttgactgt aaacacaaag atattagtac aaaatacgtg acgtagaaag 180 taataatttc ttgggtagtt tgcagtttta aaattatgtt ttaaaatgga ctatcatatg 240 cttaccgtaa cttgaaagta tttcgatttc ttggctttat atatcttgtg gaaaggacga 300 aacaccgagg agaagatgga ggctgatcaa gagaatcagc ctccatcttc tcctcttttt 360 tatgcgcacg tttaaacagg gcggtgcggc tcaggctctg ccccgcctcc ggggctattt 420 gcatacgacc atttccagta attcccagca gccaccgtag ctatatttgg tagaacaacg 480 agcactttct caactccagt caataactac gttagttgca ttacacattg ggctaatata 540 aatagaggtt aaatctctag gtcatttaag agaagtcggc ctatgtgtac agacatttgt 600 tccaggggct ttaaatagct ggtggtggaa ctcaatattc ggaagaagct gagaagctaa 660 caagagatta gcttctcagc ttcttccttt tttgtatacg atacctatca attcgaacgc 720 tgacgtcatc aacccgctcc aaggaatcgc gggcccagtg tcactaggcg ggaacaccca 780 gcgcgcgtgc gccctggcag gaagatggct gtgagggaca ggggagtggc gccctgcaat 840 atttgcatgt cgctatgtgt tctgggaaat caccataaac gtgaaatgtc tttggatttg 900 ggaatcttat aagttctgta tgagaccaca gatccccgag gtagagaagc agatgaatat 960 gagttcaaga gactcatatt catctgcttc tctacctctt tttgacacac gtcctgcagc 1020 gttaaccaat tgccacgggg ttggggtacc acgcgtgagc tcctcgag 1068 <210> 23 <211> 1527 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OPMD Triple construct long <400> 23 ctcgagacgc gtggtaccga gctcgctagc agcgcttacg tatttaaatg gcaggaagag 60 ggcctatttc ccatgattcc ttcatatttg catatacgat acaaggctgt tagagagata 120 attagaatta atttgactgt aaacacaaag atattagtac aaaatacgtg acgtagaaag 180 taataatttc ttgggtagtt tgcagtttta aaattatgtt ttaaaatgga ctatcatata 240 agatgggctt accgtaactt gaaagtattt cgatttcttg gctttatata tcttgtggaa 300 aggacgaaac accgaggaga agatggaggc tgatcaagag aatcagcctc catcttctcc 360 tcttttttac atcaggttgt ttttctgttt ttacatcagg ttgtttttct gtttggtttt 420 ttttttacac cacgtttata cgccggtgca cggtttacca ctgaaaacac ctttcatcta 480 caggtgatat cttttaacac aaataaaatg tagtagtcca tgcgcacgtt taaacaaggg 540 cggtgcggct caggctctgc cccgcctccg gggctatttg catacgacca tttccagtaa 600 ttcccagcag ccaccgtagc tatatttggt agaacaacga gcactttctc aactccagtc 660 aataactacg ttagttgcat tacacattgg gctaatataa atagaggtta aatctctagg 720 tcatttaaga gaagtcggcc tatgtgtaca gacatttgtt ccaggggctt taaatagctg 780 gtggtggaac tcaatattcg gaagaagctg agaagctaac aagagattag cttctcagct 840 tcttcctttt ttccattttc cctcccagaa acggaatctt gctctgttgc ccaggctgga 900 atgcaatggc gcgatcttag cttgttgcaa cctccgcctc ccgggttgaa gcgattctcc 960 tgcctcagcc tcccgagtag ctgggattat aaacatgcgc cagtatacga tacctatcaa 1020 ttcgaacgct gacgtcatca acccgctcca aggaatcgcg ggcccagtgt cactaggcgg 1080 gaacacccag cgcgcgtgcg ccctggcagg aagatggctg tgagggacag gggagtggcg 1140 ccctgcaata tttgcatgtc gctatgtgtt ctgggaaatc accataaacg tgaaatgtct 1200 ttggatttgg gaatcttata agttctgtat gagaccacag atccccgagg tagagaagca 1260 gatgaatatg agttcaagag actcatattc atctgcttct ctacctcttt ttaaacaaaa 1320 cgaaaccggg ccgggcgcgg tggttcacgc ctataatccc tgcactttgg gaggccgagg 1380 cgggcggatc acaaggtcag gaggtcgaga ccatccaggc taacacggtg aaaccccccc 1440 ccatctctac taaaaaaaaa aagacacacg tcctgcagcg ttaaccaatt gccacggggt 1500 tggggtacca cgcgtgagct cctcgag 1527 <210> 24 <211> 950 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Human codon-optimized PABpN1 cDNA sequence (with kozak sequence but without myc-tag) <400> 24 ccgctgccgc cgctgctgct gccgcagccg gcgctgccgg cggaagaggc agcggccctg 60 gcagacggcg gcatctggtc cctggcgccg gaggggaggc cggcgaaggc gcccctggcg 120 gagccggcga ctacggcaac ggcctggaaa gcgaggaact ggaacccgag gaactgctgc 180 tggaacctga gcccgagcca gagcccgagg aagagccccc taggccaaga gccccccctg 240 gcgccccagg accaggacca ggctctgggg caccaggctc tcaggaagag gaagaagagc 300 ccggcctcgt cgagggagac ccaggcgatg gcgctatcga agatcccgag ctggaagcca 360 tcaaggccag agtgcgggag atggaagagg aggccgaaaa attgaaagag ctgcagaacg 420 aagtcgaaaa acaaatgaac atgtcccccc ctcctggaaa tgctggccct gtgatcatga 480 gcatcgagga aaagatggaa gccgacgccc ggtctatcta cgtgggcaac gtggactacg 540 gcgccaccgc cgaagaactg gaagcccact ttcacggctg tggcagcgtg aaccgggtga 600 ccatcctgtg cgacaagttc agcggccacc ccaagggctt cgcctacatc gagttcagcg 660 acaaagaaag cgtgcggacc tctctggctc tcgacgagtc tctgttcagg ggaaggcaga 720 tcaaggtcat ccccaagcgg accaacaggc ccggcatcag caccaccgac agaggcttcc 780 ctagggctag gtacagagcc cggaccacca actacaacag cagcagaagc cggttctaca 840 gcggcttcaa ttctcggcct agaggcagag tgtaccgggg cagggccagg gccacctcct 900 ggtacagccc ctactgaacc tcctggtaca gcccctactg atgagatatc 950 <210> 25 <211> 306 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Human codon-optimized PABpN1 amino acid sequence (without Myc-tag) <400> 25 Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly 1 5 10 15 Arg Gly Ser Gly Pro Gly Arg Arg Arg His Leu Val Pro Gly Ala Gly 20 25 30 Gly Glu Ala Gly Glu Gly Ala Pro Gly Gly Ala Gly Asp Tyr Gly Asn 35 40 45 Gly Leu Glu Ser Glu Glu Leu Glu Pro Glu Glu Leu Leu Leu Glu Pro 50 55 60 Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Glu Glu Pro Pro Arg Pro Arg Ala Pro 65 70 75 80 Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gly Pro Gly Ser Gly Ala Pro Gly Ser Gln 85 90 95 Glu Glu Glu Glu Glu Pro Gly Leu Val Glu Gly Asp Pro Gly Asp Gly 100 105 110 Ala Ile Glu Asp Pro Glu Leu Glu Ala Ile Lys Ala Arg Val Arg Glu 115 120 125 Met Glu Glu Glu Ala Glu Lys Leu Lys Glu Leu Gln Asn Glu Val Glu 130 135 140 Lys Gln Met Asn Met Ser Pro Pro Pro Gly Asn Ala Gly Pro Val Ile 145 150 155 160 Met Ser Ile Glu Glu Lys Met Glu Ala Asp Ala Arg Ser Ile Tyr Val 165 170 175 Gly Asn Val Asp Tyr Gly Ala Thr Ala Glu Glu Leu Glu Ala His Phe 180 185 190 His Gly Cys Gly Ser Val Asn Arg Val Thr Ile Leu Cys Asp Lys Phe 195 200 205 Ser Gly His Pro Lys Gly Phe Ala Tyr Ile Glu Phe Ser Asp Lys Glu 210 215 220 Ser Val Arg Thr Ser Leu Ala Leu Asp Glu Ser Leu Phe Arg Gly Arg 225 230 235 240 Gln Ile Lys Val Ile Pro Lys Arg Thr Asn Arg Pro Gly Ile Ser Thr 245 250 255 Thr Asp Arg Gly Phe Pro Arg Ala Arg Tyr Arg Ala Arg Thr Thr Asn 260 265 270 Tyr Asn Ser Ser Arg Ser Arg Phe Tyr Ser Gly Phe Asn Ser Arg Pro 275 280 285 Arg Gly Arg Val Tyr Arg Gly Arg Ala Arg Ala Thr Ser Trp Tyr Ser 290 295 300 Pro Tyr 305 <210> 26 <211> 947 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Human codon-optimized PABpN1 cDNA sequence (with kozak sequence and Myc-tag) <400> 26 ccgctgccgc cgctgctgct gccgcagccg gcgctgccgg cggaagaggc agcggccctg 60 gcagacggcg gcatctggtc cctggcgccg gaggggaggc cggcgaaggc gcccctggcg 120 gagccggcga ctacggcaac ggcctggaaa gcgaggaact ggaacccgag gaactgctgc 180 tggaacctga gcccgagcca gagcccgagg aagagccccc taggccaaga gccccccctg 240 gcgccccagg accaggacca ggctctgggg caccaggctc tcaggaagag gaagaagagc 300 ccggcctcgt cgagggagac ccaggcgatg gcgctatcga agatcccgag ctggaagcca 360 tcaaggccag agtgcgggag atggaagagg aggccgaaaa attgaaagag ctgcagaacg 420 aagtcgaaaa acaaatgaac atgtcccccc ctcctggaaa tgctggccct gtgatcatga 480 gcatcgagga aaagatggaa gccgacgccc ggtctatcta cgtgggcaac gtggactacg 540 gcgccaccgc cgaagaactg gaagcccact ttcacggctg tggcagcgtg aaccgggtga 600 ccatcctgtg cgacaagttc agcggccacc ccaagggctt cgcctacatc gagttcagcg 660 acaaagaaag cgtgcggacc tctctggctc tcgacgagtc tctgttcagg ggaaggcaga 720 tcaaggtcat ccccaagcgg accaacaggc ccggcatcag caccaccgac agaggcttcc 780 ctagggctag gtacagagcc cggaccacca actacaacag cagcagaagc cggttctaca 840 gcggcttcaa ttctcggcct agaggcagag tgtaccgggg cagggccagg gccacctcct 900 ggtacagccc ctacgaacag aagctgatca gcgaggaaga tctgtga 947 <210> 27 <211> 316 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Human codon-optimized PABpN1 amino acid sequence (with Myc-tag) <400> 27 Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly 1 5 10 15 Arg Gly Ser Gly Pro Gly Arg Arg Arg His Leu Val Pro Gly Ala Gly 20 25 30 Gly Glu Ala Gly Glu Gly Ala Pro Gly Gly Ala Gly Asp Tyr Gly Asn 35 40 45 Gly Leu Glu Ser Glu Glu Leu Glu Pro Glu Glu Leu Leu Leu Glu Pro 50 55 60 Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Glu Glu Pro Pro Arg Pro Arg Ala Pro 65 70 75 80 Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gly Pro Gly Ser Gly Ala Pro Gly Ser Gln 85 90 95 Glu Glu Glu Glu Glu Pro Gly Leu Val Glu Gly Asp Pro Gly Asp Gly 100 105 110 Ala Ile Glu Asp Pro Glu Leu Glu Ala Ile Lys Ala Arg Val Arg Glu 115 120 125 Met Glu Glu Glu Ala Glu Lys Leu Lys Glu Leu Gln Asn Glu Val Glu 130 135 140 Lys Gln Met Asn Met Ser Pro Pro Pro Gly Asn Ala Gly Pro Val Ile 145 150 155 160 Met Ser Ile Glu Glu Lys Met Glu Ala Asp Ala Arg Ser Ile Tyr Val 165 170 175 Gly Asn Val Asp Tyr Gly Ala Thr Ala Glu Glu Leu Glu Ala His Phe 180 185 190 His Gly Cys Gly Ser Val Asn Arg Val Thr Ile Leu Cys Asp Lys Phe 195 200 205 Ser Gly His Pro Lys Gly Phe Ala Tyr Ile Glu Phe Ser Asp Lys Glu 210 215 220 Ser Val Arg Thr Ser Leu Ala Leu Asp Glu Ser Leu Phe Arg Gly Arg 225 230 235 240 Gln Ile Lys Val Ile Pro Lys Arg Thr Asn Arg Pro Gly Ile Ser Thr 245 250 255 Thr Asp Arg Gly Phe Pro Arg Ala Arg Tyr Arg Ala Arg Thr Thr Asn 260 265 270 Tyr Asn Ser Ser Arg Ser Arg Phe Tyr Ser Gly Phe Asn Ser Arg Pro 275 280 285 Arg Gly Arg Val Tyr Arg Gly Arg Ala Arg Ala Thr Ser Trp Tyr Ser 290 295 300 Pro Tyr Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 305 310 315 <210> 28 <211> 945 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Mutant human PABpN1 cDNA sequence (with FLAG tag) <400> 28 atggcggcgg cggcggcggc ggcagcagca gcgggggctg cgggcggtcg gggctccggg 60 ccggggcggc ggcgccatct tgtgcccggg gccggtgggg aggccgggga gggggccccg 120 gggggcgcag gggactacgg gaacggcctg gagtctgagg aactggagcc tgaggagctg 180 ctgctggagc ccgagccgga gcccgagccc gaagaggagc cgccccggcc ccgcgccccc 240 ccgggagctc cgggccctgg gcctggttcg ggagcccccg gcagccaaga ggaggaggag 300 gagccgggac tggtcgaggg tgacccgggg gacggcgcca ttgaggaccc ggagctggaa 360 gctatcaaag ctcgagtcag ggagatggag gaagaagctg agaagctaaa ggagctacag 420 aacgaggtag agaagcagat gaatatgagt ccacctccag gcaatgctgg cccggtgatc 480 atgtccattg aggagaagat ggaggctgat gcccgttcca tctatgttgg caatgtggac 540 tatggtgcaa cagcagaaga gctggaagct cactttcatg gctgtggttc agtcaaccgt 600 gttaccatac tgtgtgacaa atttagtggc catcccaaag ggtttgcgta tatagagttc 660 tcagacaaag agtcagtgag gacttccttg gccttagatg agtccctatt tagaggaagg 720 caaatcaagg tgatcccaaa acgaaccaac agaccaggca tcagcacaac agaccggggt 780 tttccacgag cccgctaccg cgcccggacc accaactaca acagctcccg ctctcgattc 840 tacagtggtt ttaacagcag gccccggggt cgcgtctaca ggggccgggc tagagcgaca 900 tcatggtatt ccccttacga ctacaaggac gacgatgaca agtga 945 <210> 29 <211> 314 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Mutant human PABpN1 amino acid sequence (with FLAG tag) <400> 29 Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly 1 5 10 15 Arg Gly Ser Gly Pro Gly Arg Arg Arg His Leu Val Pro Gly Ala Gly 20 25 30 Gly Glu Ala Gly Glu Gly Ala Pro Gly Gly Ala Gly Asp Tyr Gly Asn 35 40 45 Gly Leu Glu Ser Glu Glu Leu Glu Pro Glu Glu Leu Leu Leu Glu Pro 50 55 60 Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Glu Glu Pro Pro Arg Pro Arg Ala Pro 65 70 75 80 Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gly Pro Gly Ser Gly Ala Pro Gly Ser Gln 85 90 95 Glu Glu Glu Glu Glu Pro Gly Leu Val Glu Gly Asp Pro Gly Asp Gly 100 105 110 Ala Ile Glu Asp Pro Glu Leu Glu Ala Ile Lys Ala Arg Val Arg Glu 115 120 125 Met Glu Glu Glu Ala Glu Lys Leu Lys Glu Leu Gln Asn Glu Val Glu 130 135 140 Lys Gln Met Asn Met Ser Pro Pro Pro Gly Asn Ala Gly Pro Val Ile 145 150 155 160 Met Ser Ile Glu Glu Lys Met Glu Ala Asp Ala Arg Ser Ile Tyr Val 165 170 175 Gly Asn Val Asp Tyr Gly Ala Thr Ala Glu Glu Leu Glu Ala His Phe 180 185 190 His Gly Cys Gly Ser Val Asn Arg Val Thr Ile Leu Cys Asp Lys Phe 195 200 205 Ser Gly His Pro Lys Gly Phe Ala Tyr Ile Glu Phe Ser Asp Lys Glu 210 215 220 Ser Val Arg Thr Ser Leu Ala Leu Asp Glu Ser Leu Phe Arg Gly Arg 225 230 235 240 Gln Ile Lys Val Ile Pro Lys Arg Thr Asn Arg Pro Gly Ile Ser Thr 245 250 255 Thr Asp Arg Gly Phe Pro Arg Ala Arg Tyr Arg Ala Arg Thr Thr Asn 260 265 270 Tyr Asn Ser Ser Arg Ser Arg Phe Tyr Ser Gly Phe Asn Ser Arg Pro 275 280 285 Arg Gly Arg Val Tyr Arg Gly Arg Ala Arg Ala Thr Ser Trp Tyr Ser 290 295 300 Pro Tyr Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 305 310

Claims (60)

  1. 안구인두 근이영양증(OPMD)을 앓고 있는 피험자에서 그의 치료를 위한, 또는 피험체에서 OPMD의 원인이 되는 PABPN1 단백질의 발현을 억제하기 위한 약학 조성물로서,
    (a) 적어도 17개의 인접한 뉴클레오티드의 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열을 포함하는 헤어핀 RNA 간섭(RNAi) 분자를 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산으로서, 상기 이펙터 서열은 PABPN1 단백질에 상응하는 RNA 전사물의 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적이고, 여기서 RNA 전사물의 영역은 서열번호 3에 나타낸 것인, 핵산을 포함하는 DNA-지향 RNA 간섭(ddRNAi) 구조물;
    (b) 상기 ddRNAi 구조물에서의 상기 핵산에 의해 인코딩되는 상기 헤어핀 RNAi 분자에 의해 표적화되지 않는 mRNA 전사물을 갖는 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산으로서, 상기 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 코돈 최적화된 것인 핵산; 및
    (c) 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 것인 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 헤어핀 RNAi 분자는
    서열번호 8에 나타낸 이펙터 서열 및 서열번호 8에 나타낸 서열에 실질적으로 상보적인 이펙터 보체 서열을 포함하는 것인, 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 헤어핀 RNAi 분자는
    서열번호 8에 나타낸 이펙터 서열 및 서열번호 9에 나타낸 이펙터 보체 서열을 포함하는 것인 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 이펙터 서열과 이펙터 보체 서열 사이에 위치된 루프 서열을 포함하는 것인 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 헤어핀 RNAi 분자는 서열번호 20 또는 서열번호 21 에 나타낸 서열을 포함하는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)인 것인 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 헤어핀 RNAi 분자는 1차 miRNA(pri-miRNA) 백본을 포함하는 것인 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 헤어핀 RNAi 분자는 짧은 헤어핀 microRNA(shmiR) 분자인 것인 약학 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ddRNAi 구조물 내의 헤어핀 RNAi 분자를 인코딩하는 DNA 서열은 근육-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 약학 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 ddRNAi 구조물은
    적어도 17개의 인접한 뉴클레오티드의 이펙터 서열 및 이펙터 보체 서열을 포함하는 헤어핀 RNAi 분자를 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가적인 핵산으로서, 상기 이펙터 서열은 PABPN1 단백질에 상응하는 RNA 전사물의 상응하는 길이의 영역에 실질적으로 상보적인, 적어도 하나의 추가적인 핵산을 포함하고,
    상기 ddRNAi 구조물 내의 상기 핵산이 인코딩하는 헤어핀 RNAi 분자들은 서로 다른 이펙터 서열을 포함하는 것인, 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 ddRNAi 구조물 내의 헤어핀 RNAi 분자를 인코딩하는 각각의 DNA 서열은 근육-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인, 약학 조성물.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 상기 기능성 PABPN1 단백질은 서열번호 25에 나타낸 서열을 포함하거나;
    (ii) 상기 ddRNAi 구조물 및/또는 상기 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 발현 벡터 내에 포함되거나;
    (ⅲ) 상기 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 서열번호 24에 나타낸 것이거나; 또는
    (ⅳ) 상기 (i) 내지 (ⅲ)의 조합인 것인, 약학 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은, 상기 ddRNAi 구조물과 동일한 발현 벡터 내에 포함된 것인 약학 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산 및 상기 ddRNAi 구조물이 상이한 발현 벡터 내에 포함된 것인 약학 조성물.
  14. 제11항에 있어서,
    (i) 상기 발현 벡터는 아데노-연관 바이러스성(AAV) 벡터, 레트로바이러스성 벡터, 아데노바이러스성 벡터, 및 렌티바이러스성 벡터로부터 선택된 바이러스성 벡터이거나;
    (ii) 상기 ddRNAi 구조물 내의 헤어핀 RNAi 분자를 인코딩하는 각각의 DNA 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결거나;
    (iii) 상기 ddRNAi 구조물 내의 헤어핀 RNAi 분자를 인코딩하는 각각의 DNA 서열은 근육-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결되거나; 또는
    (iv) 상기 (i), (ii), 및 (iii)의 임의의 조합인 것인, 약학 조성물.
  15. 제12항에 있어서,
    (i) 상기 발현 벡터는 아데노-연관 바이러스성(AAV) 벡터, 레트로바이러스성 벡터, 아데노바이러스성 벡터 및 렌티바이러스성 벡터로부터 선택되는 바이러스성 벡터이거나;
    (ii) 상기 ddRNAi 구조물 내의 헤어핀 RNAi 분자를 인코딩하는 각각의 DNA 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되거나;
    (iii) 상기 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결되거나;
    (iv) 상기 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산, 및 상기 ddRNAi 구조물 내의 헤어핀 RNAi 분자를 인코딩하는 각각의 DNA 서열은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결되거나;
    (v) 상기 (ii), (iii), 및 (iv)의 임의의 조합이고, 상기 또는 각각의 프로모터는 근육 특이적 프로모터이거나; 또는
    (vi) 상기 (i) 내지 (v)의 임의의 조합인 것인, 약학 조성물.
  16. 제13항에 있어서,
    (i) 상기 발현 벡터는 아데노-연관 바이러스성(AAV) 벡터, 레트로바이러스성 벡터, 아데노바이러스성 벡터 및 렌티바이러스성 벡터로부터 선택되는 바이러스성 벡터이거나;
    (ii) 상기 ddRNAi 구조물 내의 헤어핀 RNAi 분자를 인코딩하는 각각의 DNA 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되거나;
    (iii) 상기 기능성 PABPN1 단백질을 인코딩하는 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결되거나;
    (iv) 상기 (ii) 및 (iii)의 임의의 조합이고, 여기서 각각의 프로모터는 근육 특이적 프로모터이거나; 또는
    (v) 상기 (i) 내지 (iv)의 임의의 조합인 것인, 약학 조성물.
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