JPWO2014119634A1 - 筋増加剤及びそれを含む医薬組成物 - Google Patents

Abstract

筋肥大の促進及び筋萎縮の治療剤の有効成分として、運動を伴うことなく筋増加を誘導し、かつ副作用の少ない新たな筋増加剤を開発し、提供することを目的とする。例えば、ＡＰＴまたはＵＴＰのようなＰ２Ｙ受容体アゴニストを含む、筋小胞体の膜上におけるイノシトール三リン酸受容体を直接的に又は間接的に活性化し、筋小胞体からのカルシウムイオンの放出を誘導する筋増加剤を提供する。

Description

本発明は、筋増加剤、筋萎縮を伴う障害又は疾患の治療又は予防用医薬組成物に関する。また本発明は、筋増加因子の分離方法に関する。

骨格筋重量は、タンパク質合成と分解のバランスによって制御されている（非特許文献１）。ギプス固定やベッドレスト等の筋不活動状態ではタンパク質合成の抑制及びタンパク質分解の促進によって筋タンパク質含有量が低下するため、結果として筋量が減少し、筋が萎縮してしまう（廃用性筋萎縮）。このような筋萎縮は、他にも微小重力下の宇宙飛行（非特許文献２）や、尾部懸垂（非特許文献３）等による筋不動化だけでなく、カヘキシア（非特許文献４）、老化（サルコペア）（非特許文献５）、ステロイド投与（非特許文献６）等によっても生ずる。

筋萎縮に対する治療法の開発は、日本をはじめ高齢化社会を迎える先進国において非常に大きな課題の一つとなっている。また、筋萎縮の軽減又は筋肥大の誘導を制御できれば、神経原性の筋萎縮を生じる筋萎縮性側索硬化症（非特許文献７）や、筋ジストロフィー（非特許文献８）のように筋萎縮を伴う疾患対しても有効な治療法の開発に結びつくことが期待される。

タンパク質合成を活性化させて筋肥大を誘導する方法は、筋萎縮に対する治療として期待が持たれる。しかしながら、一般的な運動療法によってタンパク質合成を活性化させる方法は、重度の筋萎縮を伴う患者や寝たきりの高齢者に対しては非常に困難である。それ故、運動を伴うことなく薬物によって筋萎縮の軽減、又は筋肥大を誘導する治療法が望まれる。

非特許文献９は、PI3K/Akt経路を活性化するIgf-1を投与することでタンパク質合成を活性化させる方法を開示している。しかし、Igf-1は心筋の肥大促進や癌細胞の増殖を促進するリスクがある。

一方、本発明者らは、骨格筋の不動化によってもたらされる筋萎縮において神経性一酸化窒素シンターゼ（nNOS）が深く関与しているという知見を得た（非特許文献３）。また、その後の研究によりnNOSは再負荷時における筋萎縮からの回復にも関与することを明らかにした。この結果はnNOSが筋萎縮のみならず、筋肥大も制御していることを示唆している。

さらに、本発明者らは、非特許文献１０並びに特許文献１及び２において、力学的負荷によりnNOSが活性化されると、NOとスーパーオキシドから生成されるペルオキシ亜硝酸（peroxynitrite）が、TRP（transient receptor potential protein）受容体ファミリーであるTRPV1を介して細胞内カルシウムイオン濃度を制御することによって筋肥大が促進されること、及びその細胞内カルシウムイオン濃度の上昇がmTORによるタンパク質合成経路の活性化とその後の筋肥大をもたらすこと、及びTRPV1アゴニストによって筋肥大を促進し、かつ筋萎縮を軽減できることを開示している。しかし、TRPV1の骨格筋での発現量は必ずしも高くなく、経口の場合は多量のTRPV1アゴニストを投与する必要がある。

特願2011-200716 特願2012-063182

Sandri, M., Physiology (Bethesda), 2008, 23: 160-170 Nikawa, T. et al., 2004, FASEB J, 18: 522-524 Suzuki, N. et al., 2007,Ｊ Clin Invest, 117: 2468-2476 Zhou, X. et al., 2010, Cell, 142: 531-543 Altun, M. et al., 2010, J Biol Chem, 285:39597-39608 Shimizu, N. et al., 2011, Cell Metab, 13:170-182 Suzuki, N. et al., 2010, J Neurol Sci, 294:95-101 Wehling, M. et al., 2001, J Cell Biol, 155: 123-131 Rommel, C., et al., 2001, Nat Cell Biol, 3(11): 1009-1013 Ito N., et al., 2013, Nat Med, 19 (1): 101-106

上記非特許文献１０並びに特許文献１及び２に記載の発明は、いずれもTRPV1を介した細胞内カルシウムイオン濃度の制御によるmTORの活性化に基づいた発明である。もしも、他のカルシウムイオンチャネルを介した細胞内カルシウムイオン濃度の制御によりTRPV1と同様にmTORを活性化することができれば、TRPV1アゴニスト以外の物質を用いた筋萎縮治療が可能となる。また、このような物質をTRPV1アゴニストと併用することで筋萎縮治療において相加的又は相乗的効果も期待できる。

そこで、本発明は、TRPV1以外のカルシウムイオンチャネルを介して作用する新たな筋増加剤の探索及びそれを有効成分として含む筋萎縮を伴う障害又は疾患の治療又は予防用医薬組成物の開発、並びに筋肥大の促進及び筋萎縮の治療のための新たな筋増加因子の分離方法を開発し、提供することを目的とする。

前記課題を解決するために、本発明者らは、細胞内に存在する既知のカルシウムイオンチャネルであるイノシトール三リン酸受容体（IP3R: inositol trisphosphate receptor、本明細書ではしばしば「IP3R」と表記する）について検証した。神経細胞では、細胞膜上に存在して核酸受容体として機能するP2Y受容体を介したPLC（phospholipase C）/IP3Rシグナル伝達経路が知られている（Ralevic, V. and Burnstock, G., 1998, Pharmacol Rev, 50: 413-492）。例えば、神経細胞では図１に示すように細胞膜上のP2Y受容体がATP又はUTPの結合によって活性化されると、細胞内シグナル伝達によって小胞体膜上に存在するIP3Rが活性化され、カルシウムイオンが放出される。一方、筋細胞では、筋小胞体膜上にIP3Rが存在することは知られているが（Powell JA, et al., 2001, J Cell Sci, 114: 3673-3683）、P2Y受容体を介したPLC/IP3Rシグナル伝達経路の生理学的機能については未解明であった。ところが、今回、本発明者らは、ヒラメ筋や腓腹筋の筋細胞においてもP2Y受容体を介したPLC/IP3Rシグナル伝達経路が筋小胞体からのカルシウムイオンの放出を誘導することによってTRPV1と同様にmTORを活性化し、筋肥大を促進できるという新たな知見を得、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下を提供する。

（１）筋細胞外から又は筋細胞内で作用して筋小胞体膜上のIP3Rを直接的に又は間接的に活性化し、筋小胞体からのカルシウムイオンの放出を誘導することを特徴とする筋増加剤。

（２）前記筋細胞が遅筋細胞である、（１）に記載の筋増加剤。

（３）筋増加剤がP2Y受容体アゴニストである、（１）又は（２）に記載の筋増加剤。

（４）前記P2Y受容体アゴニストがATP若しくはUTP又はその誘導体、その塩、又はその組み合わせである、（３）に記載の筋増加剤。

（５）筋増加剤がイノシトール三リン酸若しくはその塩、又はそのエステル若しくはそのプロドラッグである、（１）又は（２）に記載の筋増加剤。

（６）（１）〜（５）のいずれかに記載の筋増加剤を有効成分として含む、筋萎縮を伴う障害又は疾患の治療又は予防用医薬組成物。

（７）前記筋萎縮を伴う障害が廃用性筋萎縮、カヘキシア、サルコペア、及び微小重力下における筋萎縮からなる群から選択される、（６）に記載の医薬組成物。

（８）前記筋萎縮を伴う疾患が筋萎縮性側索硬化症、又は筋ジストロフィーである、（６）に記載の医薬組成物。

（９）筋増加剤の分離方法であって、（ａ）筋細胞を、被験物質及び／又は被験因子で処置するステップ、（ｂ）該筋細胞内のIP3Rの活性を測定するステップ、及び（ｃ）（ｂ）ステップの測定結果に基づいてIP3Rの活性を増大させる被験物質又は被験因子を筋増加剤として分離するステップを含む前記方法。

（１０）前記筋細胞が遅筋細胞である、（９）に記載の方法。

（１１）IP3Rの活性化の変化を、筋細胞内又は筋小胞体内のカルシウムイオン濃度の変化により測定する、（９）又は（１０）に記載の方法。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2013-015927号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。

本発明の筋増加剤によれば、IP3/Ca²⁺シグナル伝達経を介して作用する筋増加剤を提供できる。

本発明の医薬組成物によれば、TRPV1アゴニスト以外の筋増加剤を有効成分として含む筋萎縮を伴う障害又は疾患の治療又は予防用医薬組成物を提供できる。

本発明によれば、筋細胞におけるIP3/Ca²⁺シグナル伝達経を利用した新たな筋増加因子を分離することができる

既知P2Y/PLC/IP3Rシグナル伝達経路の概念図を示す。 各種核酸処理後のC2C12細胞内カルシウムイオン濃度の経時変化を示す図である。 図２Ａを定量化した図である。*：p＜0.05; ***：p＜0.001（以下、同じ） ATP濃度と細胞内カルシウムイオン濃度の関係を示す図である。 UTP濃度と細胞内カルシウムイオン濃度の関係を示す図である。**：p＜0.01（以下、同じ） ATPアナログとC2C12細胞内カルシウムイオン濃度の関係を示す図である。 Thapsigargin (tg)によるATP又はUTPによる細胞内カルシウムイオン濃度の上昇抑制を示す図である。 ATP又はUTPに加えてP2Y受容体阻害剤suramin又はPLC阻害剤阻害剤U73122で処理した後のC2C12細胞内カルシウムイオン濃度の経時変化を示す図である。 図３Ａを定量化した図である。 P2Y₂ siRNA処理したときのATP又はUTPによる細胞内カルシウム濃度の上昇抑制を示す図である。 IP3R阻害剤XeC処理したときのATP又はUTPによる細胞内カルシウム濃度の上昇抑制を示す図である。 ATP又はUTP処理によるC2C12細胞内のmTORの活性化をmTORの基質p70S6Kのリン酸化で示すウエスタンブロット図である。 ATP又はUTP処理による基質p70S6Kのリン酸化がmTORの活性由来であることをmTOR阻害剤rapamycinを用いて検証した結果を示すウエスタンブロット図である。 ATP又はUTP処理によってC2C12細胞内で活性化されたmTORとC2C12細胞内カルシウムイオン濃度の上昇との関連を細胞外カルシウムキレート剤EGTA又は細胞内カルシウムキレート剤BAPTA-AMを用いて検証した結果を示すウエスタンブロット図である。 P2Y受容体阻害剤suramin又はPLC阻害剤U73122を用いてATP又はUTP処理によるmTORの活性がP2Y/PLC経路を介していることを示すウエスタンブロット図である。 P2Y₂ siRNAを用いたATP又はUTP処理によるmTORの活性がP2Y/PLC経路を介していることを示すウエスタンブロット図である。 IP3R阻害剤XeCを用いたATP又はUTP処理によるmTORの活性がIP3Rを介していることを示すウエスタンブロット図である。 ATP又はUTP処理によりC2C12細胞内のMAPKが活性化されることを示すウエスタンブロット図である。 マウスへの運動（exercise）負荷若しくは過負荷（overload）、又はC2C12細胞へのATP又はUTP処理によってJunB遺伝子の発現量が増加することを示す図である。 C2C12細胞のATP処理によるJunBの発現の上昇がBAPTA-AM及びp44/42 MAPKの阻害剤U0126によって抑制されることを示す図である。 C2C12細胞のATP処理によるJunBタンパク質量の増加が、BAPTA-AM及びrapamycinによって抑制されることを示すウエスタンブロット図である。 ATP、BAPTA-AM又はrapamycinの投与によるヒラメ筋の筋重量の変化を示す図である。 ATP、BAPTA-AM又はrapamycinの投与による腓腹筋の筋重量の変化を示す図である。 UTP、BAPTA-AM又はrapamycinの投与によるヒラメ筋の筋重量の変化を示す図である。 後肢懸垂による脱負荷で誘導されたヒラメ筋の筋萎縮におけるATP又はUTPの治療効果を示す図である。 坐骨神経切除による除神経で誘導された腓腹筋の筋萎縮におけるATP又はUTPの治療効果を示す図である。 本明細書で開示された本発明の筋増加剤であるATP又はUTPによるP2Y/PLC/IP3Rシグナル伝達経路を介した筋細胞における筋肥大の作用機序を示す概念図である。 ATP又はUTP処理後のヒラメ筋由来の単一筋線維内のカルシウムイオン濃度の経時変化を示す図である。 ATPに加えて、P2Y受容体阻害剤suramin、PLC阻害剤阻害剤U73122、又はIP3R阻害剤XeCで処理した後のヒラメ筋由来の単一筋線維内のカルシウムイオン濃度の経時変化を示す図である。0Ca²⁺は、細胞外カルシウムの除去を示す。 ATP処理によるヒラメ筋由来の単一筋線維内のmTORの活性化をmTORの基質p70S6Kのリン酸化で示すウエスタンブロット図である。

１．筋増加剤
本発明の第１の態様は、筋増加剤に関する。以下、本発明を具体的に説明する。

１−１．構成
本態様の筋増加剤は、筋細胞に作用し、筋増加を誘導する物質である。

本発明において「筋増加」とは、筋肥大の促進、筋萎縮の抑制、筋力の増加若しくは筋力の維持のいずれか又はそれらの組合せを指す。

本発明において「筋肥大」とは、内在タンパク質量の増加に伴う単一筋線維重量又は断面積の増加による筋重量の増加といい、「筋肥大の促進」とは、単一筋線維中の内在タンパク質量の増加を促進することによって、その筋線維重量又は断面積の増加による筋重量の増加を促進することをいう。また「筋萎縮」とは、単一筋線維重量又は断面積が部分的に減少した状態を意味し、筋力低下を伴うものであり、「筋萎縮の軽減」とは、単一筋線維重量又は断面積の減少を阻止する又は減少の速度を遅くすること、あるいは減少した単一筋線維重量又は断面積を増加させることをいう。「筋力」とは、筋肉を収縮させる力（筋張力）であり、「筋力の増加又は維持」とは、その力が増加又は維持されることをいう。

本態様の筋増加剤は、筋細胞の細胞外から又は細胞内で作用して筋小胞体の膜上におけるイノシトール三リン酸受容体を直接的に又は間接的に活性化し、該筋小胞体からカルシウムイオンの放出によって筋増加を誘導する。

本発明における「筋細胞」は、骨格筋を構成する細胞を意味する。実質的に筋線維と同義であるが、本発明においては筋細胞に分化する前の筋芽細胞も包含する。なお、筋細胞は、遅筋細胞（遅筋線維）と速筋細胞（速筋線維）に大別できる。本発明において好ましい筋細胞は、遅筋細胞である。

「筋小胞体」は、筋細胞内に存在する特殊な滑面小胞体であって、内部にカルシウムイオンを貯蔵している。筋小胞体の膜上には後述するイノシトール三リン酸受容体が分布し、筋細胞内におけるカルシウムイオン濃度の制御に寄与している。

イノシトール三リン酸受容体（IP3R: inositol trisphosphate receptor）は、小胞体膜又は筋小胞体膜上に存在し、カルシウムイオンチャネルとして機能するイオンチャネル内蔵型受容体である。リガンドであるイノシトール三リン酸（イノシトール-1,4,5-三リン酸:IP3: inositol trisphosphate、本明細書ではしばしば「IP3」と表記する）の結合部位を有し、IP3の結合によって活性化されて小胞体膜又は筋小胞体から細胞質へカルシウムイオンを放出する。本発明において対象となるのは、特に筋小胞体膜上に存在するIP3Rである。

本発明の筋増加剤は、筋細胞外から作用して間接的にIP3Rを活性化する物質と、筋細胞内で作用して直接的に又は間接的にIP3Rを活性化する物質が含まれる。

筋細胞外から作用して間接的にIP3Rを活性化する物質には、例えば、筋細胞膜上に存在する受容体に結合して、筋細胞内のIP3/Ca²⁺シグナル伝達経路（PLC/IP3Rシグナル伝達経路、P2Y/PLC/IP3Rシグナル伝達経路を含む）を正に制御し、細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇することのできるリガンド分子、すなわち前記受容体アゴニストが挙げられる。ここでいう受容体は、筋細胞膜上に存在し、下流のIP3/Ca²⁺シグナル伝達経路を制御することができれば、その種類は特に限定しない。例えば、Gタンパク質共役型受容体であるP2Y受容体（P2Y₁受容体、P2Y₂受容体、P2Y₄受容体及びP2Y₆受容体を含む）、PAR-1等が挙げられる。好ましくはP2Y受容体である。P2Y受容体の場合、P2Y受容体アゴニストは、P2Y受容体を活性化する物質であれば特に限定はしない。例えば、ヌクレオチド、他の天然及び人工の低分子化合物が挙げられる。本発明において使用するP2Y受容体アゴニストは、好ましくはATP若しくはUTP又はそれらと同質の生理活性を有する誘導体、及びそれらの塩である。ATPの誘導体としては、例えば、ATPgammaS（ATPγS:アデノシン5’-0-(3-チオ三リン酸)）、2-MeSATP（2-(メチルチオ)アデノシン-5’-三リン酸）等が挙げられる。ATP、及び／又はUTPは生体内にも存在し、また生体内での代謝速度も速いことから副作用も少なく、特に好ましい。その他、ジクアホソル又はその塩のようなP2Y受容体作動剤であってもよい。筋細胞を前記受容体アゴニストで処理する場合、二以上の異なるアゴニストを組み合わせて使用してもよい。例えば、P2Y受容体アゴニストを使用する場合、前記ATP若しくはUTP又はその誘導体、その塩を組み合わせて使用することができる。

一方、筋細胞内で作用して間接的にIP3Rを活性化する物質には、例えば、筋細胞内でIP3/Ca²⁺シグナル伝達経路を正に制御する活性型シグナル伝達因子や、そのようなシグナル伝達因子を活性化する低分子化合物、化合物、ペプチド等が挙げられる。筋細胞内で作用して直接的にIP3Rを活性化する物質には、例えば、IP3若しくはその塩、又はそのエステル若しくはそのプロドラッグが挙げられる。

本態様の筋増加剤による筋増加は、前述のように筋増加剤が直接的又は間接的に筋細胞内のIP3Rを活性化して筋小胞体からカルシウムイオンの放出を誘導することによって引き起こされる。後述する実施例で示すように、IP3Rを介した筋細胞内のカルシウムイオン濃度の上昇によりmTORやMAPKが活性化される。実施例からMAPKの活性化は、筋肥大の促進に関与するJunBタンパク質（Raffaello, A., et al., 2010, J Cell Biol 191: 101-113）の発現を増強し、またmTORの活性化はJunBタンパク質翻訳を促進することが示唆されている。以上のように本態様の筋増加剤は、IP3/Ca²⁺シグナル伝達経路を介して筋細胞内のカルシウムイオン濃度を正に制御することで、筋肥大を促進し及び／又は筋萎縮を抑制すると思われる。

１−２．効果
本態様の筋増加剤によれば、IP3/Ca²⁺シグナル伝達経路を介して筋細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させることで、運動を伴うことなく筋肥大を誘導することができる。また、本態様の筋増加剤であるATP又はUTP等は細胞内にも存在し、代謝速度も速いことから副作用がほとんどないという利点を有する。

２．筋萎縮を伴う障害又は疾患の治療又は予防用医薬組成物
本発明の第２の態様は、筋萎縮を伴う障害又は疾患の治療又は予防用医薬組成物（以下、本明細書では単に「医薬組成物」と表記する）に関する。以下、本発明を具体的に説明する。

２−１．構成
２−１−１．有効成分
本態様の医薬組成物は、前記第１態様に記載の筋増加剤を有効成分として含む。本発明の一の医薬組成物中には、第１態様に記載の筋増加剤を一又は二以上含むことができる。また、第１態様に記載の筋増加剤以外の公知の他の筋増加剤の包含又は筋増加に有効な方法と組み合わせることができる。例えば、筋増加に必要な栄養素であるタンパク質の投与、該栄養素を筋に同化させるホルモン（成長ホルモン等）の投与、筋肉への負荷（例えば、軽度な運動、筋力トレーニング、加圧トレーニング）等と組み合わせてもよい。また、特願2012-063182に記載の一又は二以上の筋増加剤と組み合わせて一の医薬組成物中に包含させることもできる。

本態様の医薬組成物に配合される第１態様に記載の筋増加剤の量（含有量）は、その医薬組成物に包含される筋増加剤の種類及び／又はその有効量（投与量又は摂取量）、障害又は疾患の種類、薬物組成物の剤形、並びに後述する担体又は添加物の種類によって異なるため、それぞれの条件を勘案して適宜定めればよい。本明細書において「有効量」とは、医薬組成物において筋増加剤が有効成分としての機能を発揮する上で必要な量であって、かつそれを適用する生体に対して有害な副作用をほとんど又は全く付与しない量をいう。この有効量は、被験体の情報、投与経路、及び投与回数等の様々な条件によって変化し得る。ここで「被験体」とは、医薬組成物の適用対象となる生体をいう。例えば、ヒト、家畜（ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、ダチョウ等）、競走馬、愛玩動物（イヌ、ネコ、ウサギ等）、実験動物（マウス、ラット、モルモット、サル等）等が該当する。好ましくはヒトである（この場合、特に「被験者」という）。また、「被験体の情報」とは、薬物組成物を適用する生体の様々な個体情報であって、例えば、被験者の場合であれば、全身の健康状態、疾患・病害に罹患している場合にはその進行度や重症度、年齢、体重、性別、食生活、薬剤感受性、併用薬物の有無及び治療に対する耐性等を含む。筋増加剤の最終的な有効量、及びそれに基づいて算出される適用量は、個々の被験体の情報等に応じて、最終的には医師、歯科医師、又は獣医師等の判断によって決定される。このように本発明の医薬組成物における筋増加剤の含有量は、条件より異なるが、医薬組成物の一投与単位あたりにおける筋増加剤の含有量の具体例として、他の医薬の併用を必要としないヒト成人に対して、総重量を基準として0.01〜90重量％、好ましくは1〜50重量％である。筋増加剤の薬理効果を得る上で、医薬組成物の大量投与が必要な場合、被験体に対する負担軽減のために数回に分割して投与することもできる。例えば、通常成人1日当たりの筋増加剤の有効量を、1日1回又は数回に分けて、約1週間〜約1年間、好ましくは約1ヶ月〜約12ヶ月にわたり投与してもよい。

２−１−２．担体
本発明の医薬組成物は、必要に応じて薬学的に許容可能な担体を含むことができる。「薬学的に許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する添加剤をいう。例えば、溶媒、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤、ヒト血清アルブミン等が挙げられる。

溶媒には、例えば、水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る水溶液、又は薬学的に許容される有機溶剤のいずれであってもよい。水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液が挙げられる。補助剤としては、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム、その他にも低濃度の非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。

賦形剤には、例えば、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖、金属塩、クエン酸、酒石酸、グリシン、ポリエチレングリコール、プルロニック、カオリン、ケイ酸、又はそれらの組み合わせが挙げられる。

結合剤には、例えば、植物デンプンを用いたデンプン糊、ペクチン、キサンタンガム、単シロップ、グルコース液、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セラック、パラフィン、ポリビニルピロリドン又はそれらの組み合わせが挙げられる。

崩壊剤としては、例えば、前記デンプンや、乳糖、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド又はそれらの塩が挙げられる。

充填剤としては、ワセリン、前記糖及び／又はリン酸カルシウムが例として挙げられる。

乳化剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが例として挙げられる。

流動添加調節剤及び滑沢剤としては、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが例として挙げられる。

上記の他にも、必要であれば医薬において通常用いられる可溶化剤、懸濁剤、希釈剤、分散剤、界面活性剤、無痛化剤、安定剤、吸収促進剤、増量剤、付湿剤、保湿剤、湿潤剤、吸着剤、矯味矯臭剤、崩壊抑制剤、コーティング剤、着色剤、保存剤、防腐剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤、等張化剤等を適宜含むこともできる。

このような担体は、主として剤形形成を容易にし、また剤形及び薬剤効果を維持する他、有効成分である筋増加剤が生体内の酵素等によって分解を受け難くするために用いられるものであって、必要に応じて適宜使用すればよい。

２−１−３．剤形
本実施形態の医薬組成物の剤形は、有効成分である第１態様に記載の筋増加剤又は他の付加的な有効成分を不活化させず、投与後に生体内でその有効成分の薬理効果を発揮し得る形態であれば特に限定しない。また、医薬組成物の剤形は、投与法及び／又は処方条件によって異なる。一般に投与法は、経口投与と非経口投与に大別することができるが、医薬組成物はそれぞれの投与法に適した剤形にすればよい。例えば、経口投与に適した剤形としては、固形剤（錠剤、丸剤、舌下剤、カプセル剤、ドロップ剤、トローチ剤を含む）、顆粒剤、粉剤、散剤、液剤（内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤を含む）等が挙げられる。固形剤は、必要に応じて当該技術分野で公知の剤皮を施した剤形、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠にすることができる。また、非経口投与は全身投与及び局所投与に細分され、局所投与は組織内投与、経表皮投与、経粘膜投与及び経直腸的投与にさらに細分されるが、医薬組成物もそれぞれの投与法に適した剤形にすればよい。例えば、全身又は組織内投与に適した剤形としては、液剤である注射剤が挙げられる。経表皮投与又は経粘膜投与に適した剤形としては、液剤（塗布剤、点眼剤、点鼻剤、吸引剤を含む）、懸濁剤（乳剤、クリーム剤を含む）、粉剤（点鼻剤、吸引剤を含む）、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤、硬膏剤等を挙げることができる。経直腸的投与に適した剤形としては、坐剤等を挙げることができる。

本態様の医薬組成物は、後述の「２−２．対象障害及び疾患」の項で説明するように筋萎縮を伴う障害又は疾患の治療又は予防用として適用されることから、適用対象部位は原則骨格筋である。したがって、投与方法は、限定はされないが、対象骨格筋に直接投与する局所投与か循環系を介した全身投与が好ましく使用され得る。具体的には、例えば、筋肉内注射による局所投与、又は血管内注射（静脈内注射、動脈内注射を含む）若しくはリンパ管内注射等の循環器内投与が挙げられる。注射剤には、前記賦形剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、pH調節剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化すればよく、単位用量アンプル又は多用量容器の状態で提供される。

なお、上記各剤形の具体的な形状、大きさについては、いずれもそれぞれの剤形において当該分野で公知の剤形の範囲内にあればよく、特に限定はしない。

本発明の医薬組成物の製造方法については、当該技術分野の常法に従って製剤化すればよい。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Merck Publishing Co., Easton, Pa.)に記載された方法を参照することができる。

２−２．対象障害及び疾患
本態様の医薬組成物の治療又は予防の対象となる障害又は疾患は、筋萎縮を伴う障害又は疾患である。本明細書において「治療」とは、障害、又は罹患した疾患及び／又はそれに伴う症状を緩和又は除去することをいう。また本明細書において「予防」とは、障害の発生又は疾患の罹患を防ぐことをいう。筋萎縮を伴う障害には、例えば、ギプス固定やベッドレスト等の筋不活動状態によって生じる廃用性筋萎縮、悪性腫瘍、呼吸器等の慢性疾患に伴うカヘキシア、老化（サルコペア）、ステロイド投与による副作用及び宇宙空間での生活等の微小重力下における筋萎縮が挙げられる。また、筋萎縮を伴う疾患には、例えば、筋萎縮性側索硬化症、筋ジストロフィー、及び多発性筋炎が挙げられる。

２−３．効果
本態様の医薬組成物は、第１態様に記載の筋増加剤を有効成分として含むことから、運動を伴うことなく筋萎縮の進行の抑制による筋力維持及び／又は筋肥大による筋力回復又は筋力増強が可能となる。それ故、重度の筋萎縮を伴う患者や寝たきりの高齢者のようにリハビリテーション等の運動療法が困難な者に対して有用な治療剤となり得る。

３．筋増加用飲食品
本発明の第３の態様は、第１態様の筋増加剤を添加した筋増加用飲食品に関する。以下、本発明を具体的に説明する。

３−１．構成
本明細書において「筋増加用飲食品」とは、筋増加を目的とする食品及び飲料をいう。

ここで「飲食品」とは、栄養素を1種以上含む天然物及びその加工品をいい、特定保健用食品及び栄養機能食品のような保健機能食品や、健康食品を包含する。また、ヒトが摂食する一般的な食品のみならず、家畜、競争馬、愛玩動物及び実験動物のようなヒト以外の動物に給餌される飼料を含むあらゆる飲食物が包含される。

本態様の筋増加飲食品は、第１態様に記載の筋増加剤を一種又は二種以上配合する。筋増加飲食品における第１態様に記載の筋増加剤の配合量としては、筋増加飲食品の総量に対して第１態様に記載の筋増加剤の含有量が、例えば0.01〜90重量％となるように配合すればよい。効果が期待できる摂取量は年齢、体重、性別、症状の程度等を考慮して、個々の場合に応じて適宜決定される。摂取回数は一日に何回かに分けて摂取できるが、その場合は、回数に応じて量を分割することも可能である。また、副作用がないか又は少ないことから長期にわたり連続して摂取することが可能である。

第１態様に記載の筋増加剤を飲食品に配合する場合、固体状食品、ゼリー状食品、液状食品、カプセル状食品等様々な形態の食品に添加すればよい。ここで、固体状食品としては、パン生地、焼き菓子（せんべい、ビスケット、クッキー等）用生地、麺類、魚肉製品（かまぼこ、ちくわ等）、畜肉製品（ハム、ソーセージ等）、粉ミルク、ペットフード、飼葉等が挙げられる。また、ゼリー状食品としては、フルーツゼリー、コーヒーゼリー等が挙げられる。さらに、液状食品としては、茶、コーヒー、紅茶、清涼飲料、果実飲料、乳飲料、調味料等（マヨネーズ、ドレッシング、味付け調味液等）が挙げられる。カプセル状食品としては、ハードカプセル、ソフトカプセル等が挙げられる。

３−２．効果
本態様の筋増加用飲食品は、筋萎縮を伴う障害又は疾患を有する患者のみならず、健常個体であっても、ヒトであれば日常的な筋増加のための健康補助製品等として、また食肉用家畜であれば早期成長及び早期出荷を目的として、有用である。

４．筋増加因子の分離方法
本発明の第４の態様は、筋増加因子の分離方法に関する。後述する実施例で示すように、筋細胞内でIP3Rの活性化を介したIP3/Ca²⁺シグナル伝達経路を活性化すれば、薬理学的に筋肥大を誘導し又は筋萎縮を軽減することが可能である。したがって、本発明の分離方法によれば、被検物質処理による筋細胞内でのIP3Rの活性化に基づき、筋増加の薬理効果をもたらす新規筋増加因子を分離することができる。

４−１．構成
本態様において「筋増加因子」とは、筋増加をもたらし得る様々な因子の総称をいう。筋増加因子は、筋増加作用を有する物質（筋増加剤）、及び放射線、紫外線、炭素濃度、温度、圧力、振動等のような筋増加作用を有する環境因子を含む。

本態様の筋増加因子の分離方法は、（１）被験物質等処置ステップ、（２）IP3R活性測定ステップ、及び（３）筋増加因子分離ステップを必須のステップとして含む。また、必要に応じて（１）被験物質等処置ステップから（３）筋増加因子分離ステップまでを複数回繰り返すこともできる。さらに、必要に応じて（３）筋増加因子分離ステップ後に（４）インビボ確認ステップを選択ステップとして含んでもよい。

（１）被験物質等処置ステップ
本明細書において「被験物質等処置ステップ」とは、IP3Rを発現する筋細胞を被験物質及び／又は被験因子で処置するステップである。

本ステップで用いる「IP3Rを発現する筋細胞」は、筋小胞体膜上にIP3Rを発現している筋細胞であれば、その種類は特に問わない。好ましくは遅筋細胞である。株化された筋細胞、初代培養された筋細胞、継代培養された筋細胞等いずれであってもよい。このような筋細胞は、当技術分野で公知の方法に従って入手し調製することができ、又は市販の株細胞又は公に入手可能な細胞を使用することも可能である。例えば、C2C12（RCB0987、理研バイオリソースセンターセルバンク：筋芽細胞株）、HEK-293細胞（ヒトTRPV1を過剰に発現することが知られている）等を用いることができる。

本明細書において「被験物質」とは、本態様の筋増加因子の分離方法に供される物質であって、筋増加因子として期待される候補物質、すなわち筋増加剤候補物質をいう。

本ステップで用いる「被験物質」の種類は、特に限定されない。例えば、天然物質又は非天然物質が挙げられる。ここでいう「天然物質」とは、天然に存在する物質である。本発明では、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物（糖等）、ステロイド、グリコペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカン等が例として挙げられる。また「非天然物質」とは、天然に存在せず人工的に合成された物質である。本発明では、ペプチド擬態物、核酸分子（アプタマー、アンチセンス核酸、RNAi分子等）のような天然物質の合成アナログ又は誘導体の他、無機及び有機化合物ライブラリー又はコンビナトリアルライブラリー等のようにコンビナトリアルケミストリー技術等を用いて作製した低分子有機化合物等が例として挙げられる。一の被験物質は、単一分子から構成されるものの他、複数の物質から構成される複合体であってもよい。被験物質は、単一物質のみならず、二以上の異なる物質を組み合わせて用いることもできる。例えば、複数の被験物質集団で構成される被験物質ライブラリーであってもよい。このような被験物質ライブラリーとしては、例えば、合成化合物ライブラリー（コンビナトリアルライブラリー等）、ペプチドライブラリー（コンビナトリアルライブラリー等）等が挙げられる。

本明細書において「被験因子」とは、筋細胞に影響を及ぼし得る環境因子をいう。例えば、放射線、紫外線、炭素濃度、温度、圧力、振動等が挙げられる。

筋細胞を被験物質及び／又は被験因子で処置する方法は、その物質又は因子により異なる。例えば、被験物質であれば、通常、筋細胞と接触するように処置される。接触の条件は、被検物質の種類によって当該技術分野の公知の技術に基づいて決定することができる。例えば、被験物質を添加した培地中で筋細胞を培養する方法、被験物質を含む溶液中に筋細胞を浸漬する方法、被験物質を筋細胞上に積層する方法が挙げられる。また、被験因子であれば、通常、筋細胞を被験因子に曝露するように処置される。例えば、被験因子が存在する環境下で筋細胞培養する方法が挙げられる。

被験物質及び／又は被験因子の量（分量、濃度）又は強度、処置時間、回数等の条件は、必要に応じて適宜定めればよい。例えば、被験物質の希釈系列を調製する等して複数の用量を設定することができる。処置時間も適宜設定することができるが、例えば、1日から数週間、数ヶ月、数年の期間にわたって処置を行うこともできる。複数の物質及び／又は被験因子の相加作用、相乗作用等を検証する場合には、複数の被験物質及び／又は被験因子を組み合わせて処置してもよい。

（２）IP3R活性測定ステップ
本明細書において「IP3R活性測定ステップ」とは、前記被験物質等処置ステップで処置した筋細胞におけるIP3Rの活性を測定するステップである。

本ステップでは、被験物質等処置ステップ後、適当な時期にIP3Rの活性測定を行えばよい。例えば、被験物質等処置ステップ終了直後、30分後、1時間後、3時間後、5時間後、10時間後、15時間後、20時間後、24時間（1日）後、2〜10日後、10〜20日後、20〜30日後、1ヶ月〜6ヵ月後に測定を行う。

IP3Rの活性化は、当技術分野で公知の方法で測定することができる。例えば、筋細胞内のカルシウムイオン濃度の変化、又は筋小胞体内カルシウムイオン濃度の変化により測定する方法が挙げられる。具体的な方法としては、例えば、カルシウムイオンと結合することにより蛍光を発するFluo-4等を使用して、筋細胞内の蛍光強度を測定することにより筋細胞内のカルシウムイオン濃度を測定することができる（Gee K.R., et al., Cell Calcium. 2000,27(2):97-106）。

IP3Rの活性を測定する場合、例えば、被験物質及び／又は被験因子による処置前の筋細胞内のIP3R活性、又は同一条件で培養し、かつ被験物質及び／又は被験因子で処置していない対照用筋細胞のIP3R活性を対照活性として測定することが望ましい。対照活性の測定方法は、筋細胞を被験物質及び／又は被験因子で処置していないことを除けば、前記被験物質等処置ステップで処置した筋細胞に対して行う測定方法と同一の方法を用いればよい。

（３）筋増加因子分離ステップ
本明細書において「筋増加因子分離ステップ」とは、前記IP3R活性測定ステップにおける測定結果に基づいてIP3Rの活性を増大させる被験物質及び／又は被験因子を筋増加因子として分離するステップである。

IP3R活性の増大は、IP3R活性測定ステップにおける測定結果によって判定する。判定は、例えば、対照との統計学的な有意差に基づいて行うことができる。具体的には、被験物質及び／又は被験因子で処置した筋細胞におけるIP3R活性（測定活性）と前記対照活性とを比較して、測定活性が対照活性に対して統計学的に有意に増大している場合には、IP3Rの活性が増大したと判定すればよい。ここで「統計学的に有意」とは、測定活性と対照活性を統計学的に処理したときに有意差があることをいう。具体的には、例えば、危険率（有意水準）が5％、1％又は0.1％より小さい場合が挙げられる。検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の方法であれば、特に限定しない。例えば、スチューデント-t検定法、多重比較検定法を用いることができる。

あるいは判定は、測定閾値に基づいて行うこともできる。具体的には、測定活性が所定の閾値以上であればIP3Rの活性が増大したと判定すればよい。

IP3R活性測定ステップにおける測定結果によってIP3R活性が増大したと判定された場合、被験物質等処置ステップにおいて筋細胞の処置に用いた被験物質又は被験因子を筋増加因子として分離する。このとき被験物質等処置ステップで用いた被験物質又は被験因子が単一物質又は単一環境因子の場合には、その物質又は環境因子を筋増加因子と認定することができる。一方、被験物質等処置ステップにおいて被験物質ライブラリーのような二以上の異なる物質や被験物質及び被検因子との組み合わせで処置した場合、本ステップで分離された被験物質及び／又は被検因子は、少なくとも一つの筋増加因子を含む筋増加因子候補として分離される。この場合、本態様の分離方法における最初の一連のステップを一次分離工程として、一次分離工程の被験物質等処置ステップで用いた被験物質又は被験因子の一部を分離又は減じた被験物質又は被験因子（二次被験物質等）を用いて、二次分離工程として本態様の分離方法における一連のステップを再度実行する。二次分離工程においてもIP3R活性が増大したと判定された場合、二次被験物質等に目的の筋増加因子が含まれていることになる。このように被験物質等処置ステップで筋細胞を二以上の異なる物質や被験物質及び被検因子との組み合わせで処置した場合には、必要に応じて二次分離工程以降を繰り返し行い、筋増加因子候補を徐々に絞り込むことによって目的の筋増加因子を得ることができる。

（４）インビボ確認ステップ
本明細書において「インビボ確認ステップ」とは、筋増加因子分離ステップで分離された筋増加因子又は筋増加因子候補で動物を処置し、インビボでのIP3Rの活性化又は筋増加を確認するステップである。本ステップは、筋増加因子分離ステップ後に行う選択ステップであり、有効性の高い筋増加因子を分離する目的で、必要に応じて行えばよい。

前記動物には、実験動物を用いればよい。実験動物としては、後肢懸垂、除神経、デキサメタゾン投与等により筋萎縮が誘導されたモデル動物、好ましくはマウスを用いることができる。

本ステップでは、筋増加因子分離ステップで分離された筋増加因子又は筋増加因子候補を動物に投与して、その動物の筋細胞におけるIP3Rの活性化を測定し、動物において筋増加したか否かを判定すればよい。筋増加因子又は筋増加因子候補が動物において筋増加作用を有するか否かは、動物の種類等により異なるが、当該技術分野で公知の方法により適宜判定することができる。例えば、筋増加因子又は筋増加因子候補を実験動物等に投与した後、その動物から筋組織を採取し、筋重量、筋断面積、筋張力等を測定することによって、筋増加作用を確認することができる。

４−２．効果
本態様の分離方法によれば、筋細胞内でIP3/Ca²⁺シグナル伝達経路を介して筋肥大を誘導し又は筋萎縮を軽減する筋増加の薬理効果を有する新たな筋増加因子を分離することができる。

以下、本発明を実施例及び図面を用いて具体的に説明する。ただし、以下の実施例は、単なる例示であって、本発明を限定するものではない。

［実験例１］
（目的）
骨格筋細胞系列にもP2Y/PLC/IP3R経路が存在しているかを検証した。

（材料）
マウス筋芽細胞株であるC2C12細胞を用いた。リガンドとして用いた核酸は、ATP、UTP、TTP、CTP、GTP、ATPγS、2-MeS ATP、ADP、AMP及びadenosine（いずれもSigma-Aldrich）である。筋小胞体のカルシウムを枯渇剤には、2 μMのthapsigargin（tg） (Calbiochem)を用いた。

（方法）
C2C12 myotubeを各種核酸で処理し、calcium indicator Fluo-4を用いて細胞内カルシウムイオン濃度をモニタリングした。各核酸の濃度は、100 μMで処理した。ただし、濃度を振る実験では0.1、1、10、100又は1000μMのいずれかで行った（図示した濃度に従った）。細胞内カルシウムイオン濃度の計測には、以下の方法を用いた。まず、C2C12細胞を成長培地（DMEM，10%ウシ胎児血清，1%ペニシリン-ストレプトマイシン)で37℃にて、5% CO₂下で培養し、その後、分化培地（DMEM，2%ウマ血清，1%ペニシリン-ストレプトマイシン)で2日間培養して、筋分化を誘導した。続いて、筋分化を誘導したC2C12細胞を血清不含DMEMにて8時間培養し、その後、PSS溶液(140 mM NaCl，5 mM KCl，2.5 mM CaCl₂，1 mM MgCl₂，10 mM HEPES，10 mM glucose，pH 7.0)にて6時間以上培養した後、カルシウム指示薬であるFluo-4（DOJINDO)（4 μM）を添加して30分間室温で培養した。過剰なFluo-4を取り除き、37℃にて5分間培養した後、各核酸処理による蛍光強度の変化を倒立蛍光顕微鏡（Olympus）を用いて3秒おきに180秒後まで経時計測した。

ATP又はUTPによる細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が細胞外カルシウムの流入由来か、又はC2C12細胞内の筋小胞体からの放出由来かは、それぞれのカルシウムを除去又は枯渇させて検証した。細胞外カルシウムは、0 Ca²⁺溶液(140 mM NaCl，5 mM KCl，1 mM MgCl₂，10 mM HEPES，10 mM glucose，2 mM EGTA，pH 7.0)を細胞に添加して除去した。筋小胞体のカルシウムを枯渇させる場合には、Fluo-4と共に筋小胞体のカルシウムを枯渇させるthapsigarginを加えた。

2群間のデータの比較にはスチューデント-t検定を用いた。また、多群間比較には、ANOVA検定を行った後、Tukey's法による多群間検定を行った。データは平均値 ± 標準誤差を用いて示し、p ＜0.05を有意差ありと判定した。

（結果）
図２Ａ〜Ｆに結果を示す。図２Ａ及びＢに示すように、主要な核酸であるATP、UTP、CTP、TTP及びGTPの中で、ATP及びUTPにより細胞内カルシウムイオン濃度が上昇することが明らかとなった。また、図２Ｃ及びＤに示すように、細胞内カルシウムイオン濃度は、ATP又はUTPの濃度に依存して上昇するが、1000μMのような高濃度で処理すると、やや減少することも判明した。さらに、ATPγS、2-MeS ATP、ADP、AMP及びadenosineのようなATPアナログで処理した場合には、図２Ｅに示すようにATPγSと、弱いながらも2-MeS ATPで細胞内カルシウムイオン濃度の上昇がみられた。その上昇度はATP＞ATPγS＞2-MeS ATPの順であった。一方、ADP、AMP及びadenosineの処理では濃度上昇は認められなかった。また、図２Ｆに示すように、細胞外のカルシウムを除去しても、ATP又はUTPによる細胞内カルシウムイオン濃度の上昇は阻害されなかったのに対して、thapsigargin添加により細胞内カルシウムイオン濃度の上昇は阻害された。以上の結果から、骨格筋細胞においてもATP又はUTP処理によって筋小胞体からカルシウムイオンの放出が促進されることが判明した。

［実験例２]
（目的）
実験例１におけるATP又はUTPによる細胞内カルシウムイオン濃度の上昇がP2Y受容体及びPLC、及びIP3Rカルシウムイオンチャネルを介したものであることを検証した。

（材料）
基本材料は、実験例１に準じた。本実験例では、P2Y受容体阻害剤として100μMのsuramin （Sigma-Aldrich)を、PLC阻害剤として10μMのU73122（Sigma-Aldrich)を用いた。また、P2Y₂ siRNAはsigma-aldrichより購入した。使用した各P2Y₂ siRNAの塩基配列は以下の通りである。P2Y₂#1：5’-caaucauuuguacgugugatt-3’（配列番号１）、P2Y₂#2：5’-cuaaggacauucggcuauatt-3’（配列番号２）、P2Y₂#3：5’-gucuugacccgguacucuatt-3’ （配列番号３）。control siRNAも同様にSigma-Aldrichから購入した。IP3R阻害剤には2 μMのxestospongin C(XeC；Sigma-Aldrich)を用いた。

（方法）
基本操作は、実験例１に準じて行った。ここでは、ATP及びUTPにsuramin又はU73122を加えてC2C12を処理した。また、P2Y₂ siRNAを用いたP2Y₂遺伝子発現抑制において、siRNAのトランスフェクションにはjetPRIME (Polyplus)を用いた。具体的な方法については、添付のプロトコルに従った。

（結果）
図３Ａ〜Ｄに結果を示す。

図３Ａ及びＢに示すように、ATP又はUTPによる細胞内カルシウムイオン濃度の上昇は、suramin又はU73122の阻害剤の添加によって抑制された。また図３Ｃに示すように、siRNAによりP2Y₂の発現を抑制した結果、ATP又はUTPによる細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が抑制された。さらに、図３Ｄに示すように、ATP又はUTPによる細胞内カルシウムイオン濃度の上昇は、XeCによって阻害された。これらの結果から、骨格筋細胞においてもATP又はUTPによるP2Y/PLC/IP3R経路の活性化により、細胞内カルシウムイオン濃度が上昇することが立証された。

［実験例３］
（目的）
ATP又はUTPによる細胞内カルシウムイオン濃度の上昇の効果をex vivoで検討するため単離した骨格筋由来の単一筋線維においても、ATP又はUTPによる細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が確認できることを検証した。

（材料）
マウスは、C57BL/6マウス（12週齢：日本クレア)を用いた。リガンドとして用いた核酸は、ATP、UTP（いずれもSigma-Aldrich）である。実験例１のC2C12細胞に換えて、本実験例では、単一筋線維を用いた。

（方法）
基本的な方法は、実験例１の方法に準じた。単一筋線維の単離は、麻酔したマウスからヒラメ筋を摘出後、0.2% collagenase 1 in PSS溶液（140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2.5 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, 10 mM glucose, pH 7.0）にて37℃で1.5時間処理し、その後、ピペッティングによって筋線維をほぐした。ほぐれた筋線維から単一筋線維を単離し、4μMのFluo-4を添加することでカルシウム濃度測定に用いた。なお、Collagenase 1は、Worthington biochemical corporationより購入した。

（結果）
図８に結果を示す。主に遅筋細胞で構成されるヒラメ筋において、ATP又はUTP依存的な細胞内カルシウム濃度の上昇が観察された。この結果から、筋芽細胞株によるin vitroのみならず、マウス個体から摘出した単一筋線維によるex vivoにおいてもATP又はUTPの結合により細胞内カルシウムイオン濃度が上昇することが立証された。

［実験例４]
（目的）
実験例３における、ATP又はUTPによる単一筋線維での細胞内カルシウムイオン濃度の上昇がP2Y受容体及びPLC、及びIP3Rカルシウムイオンチャネルを介したものであることを検証した。

（材料）
基本材料は、実験例１〜３に準じた。リガンドにはATPを、またP2Y受容体阻害剤、PLC阻害剤、及びIP3R阻害剤は、実施例２と同様に、それぞれ100μMのsuramin （Sigma-Aldrich)、10μMのU73122（Sigma-Aldrich)、及び2 μMのxestospongin C(XeC；Sigma-Aldrich)を用いた。さらに、単一筋線維の細胞外カルシウムの除去には、0Ca²⁺溶液(140 mM NaCl，5 mM KCl，1 mM MgCl₂，10 mM HEPES，10 mM glucose，2 mM EGTA，pH 7.0)を用いた。

（方法）
単一筋線維は、12週齢C57BL/6マウスから摘出したヒラメ筋より、実験例３の方法に準じて調製した。また、他の基本操作は、実験例１及び２に準じて行った。

（結果）
図９に結果を示す。ATPによる細胞内カルシウム濃度の上昇は、P2Y受容体阻害剤（suramin）、PLC阻害剤（U73122）、及びIP3R阻害剤（XeC）によって抑制された。また細胞外のカルシウムを除去しても、ATPによる細胞内カルシウム濃度の上昇は阻害されなかった（0Ca²⁺）。これらの結果から、実験例３において単一筋線維で観察されたATP依存的な細胞内カルシウム濃度の上昇は、P2Y/PLC/IP3受容体経路を介して生じることが立証された。

［実施例１：P2Y受容体活性化による骨格筋細胞内のmTORの活性化]
（目的）
ATP又はUTPによる骨格筋細胞のP2Y/PLC/IP3R経路の活性化によりmTORが活性化されるか検証した。

（材料）
ウエスタンブロット用の一次抗体にはp70S6K抗体（#9202, Cell Signaling Technology）、p-p70S6K (Thr421/Ser424)抗体（#9204, Cell Signaling Technology）、p-p70S6K (Thr389)抗体（#9205, Cell Signaling Technology）、Akt抗体（#9272, Cell Signaling Technology）、p-Akt(Ser473)抗体（#9271, Cell Signaling Technology）及びp-Akt(Thr308)抗体（#9275, Cell Signaling Technology）を用いた。二次抗体には、ウサギ特異的HRP標識抗体（GE Healthcare）を用いた。また、mTOR阻害剤には0.1 μM rapamycin(Sigma-Aldrich)を用いた。細胞内カルシウムキレート剤には50 μMのBAPTA-AM(Calbiochem)を、細胞外カルシウムキレート剤には2 mMのEGTA(Sigma-Aldrich)を使用した。

（方法）
ATP又はUTPによるC2C12細胞の処理は、基本的には実験例１に準じて行い、必要に応じて追加添加物を加えた培地を用いて培養した。mTORの基質にはp70S6Kを用いた。

ウエスタンブロットは、以下の手順で行った。まず、C2C12細胞をサンプルバッファ（0.1% Triton X-100，50 mM HEPES(pH 7.4)，4 mM EGTA，10 mM EDTA，15 mM Na₄P₂O₇，100 mM glycerophosphate，25 mM NaF，5 mM Na₂VO₄及びコンプリートプロテアーゼ阻害剤カクテル (Roche)）でホモジナイズし、遠心分離（15,000g、10分間）後に上清を採取した。Coomassie Brilliant Blue G-250（BioRad）を用いてタンパク質濃度を測定した後、等量のサンプルローディングバッファー(30% glycerol，5% 2-mercaptoethanol，2.3% SDS，62.5 mM Tris-HCl (pH6.8) ，0.05% bromophenol blue)と混合し、60℃で15分間の熱変性を行った。30 μgをウエスタンブロットに供した。PVDF転写膜は、トリス緩衝生理食塩水（TBS）＋5%スキムミルク(雪印)でブロッキングを行い、一次抗体を用いて4℃で16時間のインキュベーションを行った。転写膜を0.1% Tween 20を含むトリス緩衝生理食塩水（TBST）で洗浄後、二次抗体でインキュベートを行った。再度TBSTで洗浄し、ECL Western Blotting Detection System（GE HealthCare, Buckinghamshire）で検出した。

（結果）
図４Ａ〜Ｆに結果を示す。

図４Ａに示すように、ATP又はUTP処理によりmTORの基質であるp70S6Kにおける389位（開始Metを1位とする。以下、同じ）のThr、421位のThr及び424位のSerのリン酸化が濃度依存的に上昇した。また、図４Ｂに示すように、ATP又はUTPによるp70S6Kのリン酸化はmTOR阻害剤であるrapamycinによって阻害された。これらの結果から、骨格筋細胞においてもATP又はUTPによってmTORが活性化することが明らかとなった。

ATP又はUTPによるmTORの活性化が細胞外又は細胞内のいずれのカルシウムイオン濃度の上昇を介して起こるのかを検討した結果、図４Ｃに示すように、ATP又はUTPによるp70S6Kのリン酸化は細胞外カルシウムキレートであるEGTAによってある程度抑制され、細胞内カルシウムキレートであるBAPTA-AMにより完全に抑制された。これらの結果から、筋小胞体からのカルシウムイオンの放出及び細胞外からのカルシウムイオンの流入の両方がmTORの活性化に関与していることが示唆された。

さらに、図４Ｄに示すように、ATP又はUTPによるp70S6Kのリン酸化は、P2Y受容体阻害剤であるsuramin、PLC阻害剤であるU73122によって抑制された。また、図４Ｅに示すように、P2Y₂ siRNAによるP2Y₂の発現抑制によってもATP又はUTPによるp70S6Kのリン酸化は抑制された。加えて、図４Ｆに示すように、IP3R阻害剤であるXeCによってもATP又はUTPによるp70S6Kのリン酸化は抑制された。これらの結果から、in vitroではATP又はUTPによる骨格筋細胞内のmTORの活性化は、P2Y/PLC/IP3R経路を介したものであることが示された。

［実施例２：P2Y活性化によるMAPKの活性化と下流遺伝子JunBの発現制御］
（目的）
細胞内カルシウムイオン濃度の上昇により、MAPKが活性化され、様々な下流遺伝子発現制御に関わることが報告されている（Hazzalin C.A. & Mahadevan L.C.,2002, Nat Rev Mol Cell Biol. 3(1):30-40）。そこで、ATP/UTPによる筋細胞内のカルシウムイオン濃度の上昇がmTOR以外のMAPK等の多様なシグナル分子を活性化するのか、またMAPKが活性化されるのであれば下流遺伝子が発現するのかを検証した。

（材料）
C2C12細胞又はC57BL/6マウス（12週齢：日本クレア)を用いた。

ウエスタンブロット用の一次抗体にはp44/42 MAPK用としてp-Erk1/2(Thr202/Tyr204)抗体（#9101, Cell Signaling Technology）、AMPKα用としてp-AMPKα(Thr172)抗体（#2535, Cell Signaling Technology）及びAMPKα抗体（#2603, Cell Signaling Technology）を、及びJunB抗体 (sc-46, Santa Cruz)を用いた。二次抗体には、ウサギ特異的HRP標識抗体（GE Healthcare）を用いた。また、MAPKの阻害剤には10 μMのU0126 (Sigma-Aldrich)を用いた。

（方法）
ATP又はUTPによるC2C12細胞の処理等は、基本的に実験例１に準じて行い、必要に応じて追加添加物を加えた培地を用いて培養した。また、ウエスタンブロットは、実施例１に記載の方法に準じた。

マウスへの運動負荷は、トレッドミル（MK-680S、室町機械）を用いた。初速5m/minにて5分走らせた後、1分毎に1m/minずつ速度を上げていき、速度20m/minまで速度を上げた。合計30分走らせた後、腓腹筋を麻酔下で切除し、回収した（Moresi, V. et al., 2010, Cell 143, 35-45）。対照群マウスには皮膚を切る偽手術を施した。

C2C12細胞へのATP又はUTPの投与、又はC57BL/6マウスへの過負荷(overload)、運動(exercise)及びによって活性化される遺伝子制御を網羅的に解析し、細胞内カルシウムイオン濃度によって制御され、筋肥大を促進し得る候補遺伝子を探索した。

（結果）
図５Ａ〜Ｄに結果を示す。

図５Ａに示すように、ATP又はUTP処理によりp-Erk1/2における202位のThr及び204位のThrのリン酸化が濃度依存的に上昇した。この結果から、骨格筋細胞においてもATP又はUTPによってMAPKが活性化することが明らかとなった。一方、AMPKのリン酸化の濃度依存的上昇は認められなかった。

MAPKの活性化は、様々な遺伝子発現制御に関与することから、筋細胞でのATP又はUTP処理によるMAPKの活性化は、下流遺伝子の転写制御にも関わっている。筋細胞において細胞内カルシウムイオン濃度によって制御され、筋肥大を促進し得る候補遺伝子を上記のように網羅的に探索した結果、図５Ｂに示すようにJunB遺伝子の発現量が増加することが明らかとなった。JunB遺伝子の発現は筋肥大を促進することが報告されている（Raffaello, A., et al., 2010, J Cell Biol, 191: 101-113）。また、図５Ｃに示すように、C2C12細胞のATP処理によるJunBの発現の上昇は、BAPTA-AM及びp44/42 MAPKの阻害剤であるU0126によって抑制された。これらの結果から、筋細胞において、ATP又はUTP処理によるP2Y/PLC/IP3R経路の活性化による細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を介してMAPK経路が活性化され、下流遺伝子であるJunBの発現が上昇することが明らかとなった。さらに、図５Ｄに示すように、筋細胞のATP処理によるJunBのタンパク質量の増加は、BAPTA-AM及びmTOR阻害剤であるrapamycinによって抑制されることが明らかとなった。この結果から、mTORはJunBの転写制御には関与しないが、その後のタンパク質翻訳経路に関与していることが示唆された。

［実施例３：ATP又はUTP投与による筋肥大の促進］
（目的）
本発明の筋増加剤であるATP又はUTPを廃用性筋萎縮誘導したマウスに投与することで筋肥大が促進されることを確認した。

（材料）
マウスは、C57BL/6マウス（12週齢：日本クレア)を用いた。

mTOR阻害剤には10μM rapamycin(Sigma-Aldrich)を、細胞内カルシウムキレート剤には50 μMのBAPTA-AM(Calbiochem)を使用した。

（方法）
マウスへのATP又はUTPの投与は、生理食塩水に溶解して調製した500 μMのATP又はUTP溶液を150μLで一日二回、一週間筋肉注射により投与した。

筋萎縮におけるATP又はUTPの治療効果を検討するため、脱負荷及び除神経による筋萎縮をそれぞれ坐骨神経切除及び後肢懸垂を行って誘導した。

マウスの廃用性筋萎縮は、後肢懸垂によって誘導した（Suzuki, N. et al., 2007, J Clin Invest 117, 2468-2476）。具体的には、マウスの後肢が床から1mm以上離れるように飼育した。2週間後、マウスより腓腹筋（gastrocnemius）、及びヒラメ筋(soleus)を摘出し、体重、筋重量を計測した。なお、腓腹筋は、ヒラメ筋と同様、他の骨格筋と比べて遅筋の割合が多い筋肉である。

また、マウスの神経原性筋萎縮は、坐骨神経切除によって誘導した（Moresi, V. et al., 2010, Cell, 143: 35-45）。坐骨神経切除して2週間後、マウスより腓腹筋、及びヒラメ筋を摘出し、筋重量を計測した。

さらに、マウスの代償性筋肥大は、共働筋切除によって誘導した。具体的には、前記マウスの腓腹筋、ヒラメ筋の腱を麻酔下で切除して誘導した（Adams, G. R. & Haddad, F., J Appl Physiol, 1996, 81:2509-2516）。対照群には皮膚を切る偽手術を施した。

（結果）
図６Ａ〜Ｅに結果を示す。

ATP又はUTPの投与により、ヒラメ筋(図６Ａ及びＣ)及び腓腹筋（図６Ｂ）の筋重量は増加した。このATPによる筋重量の増加は、BAPTA-AM又はrapamycinによって抑制された（図６Ａ、Ｂ、及びＣ）。

図６Ｄは、脱負荷によって生じたヒラメ筋の筋萎縮におけるATP又はUTPの治療効果を、図６Ｅは、除神経によって生じた腓腹筋の筋萎縮におけるATP又はUTPの治療効果を示す。いずれもATP又はUTPを投与していない対照群では筋萎縮が誘導されたが、ATP又はUTP投与群では筋重量の低下が減弱された。

以上の結果から、図７で示すように、ATP又はUTP等の本発明の筋増加剤は、筋細胞に投与することでP2Y/PLC/IP3Rシグナル伝達経路を介した細胞内カルシウムイオン濃度の制御によってmTOR及びMAPKを活性化し、JunBタンパク質の発現により筋肥大を促進し、筋萎縮を軽減できることが立証された。

［実施例４：P2Y受容体活性化による単一筋線維内でのmTORの活性化]
（目的）
単一筋線維において観察されたATPによるP2Y/PLC/IP3R経路の活性化でもmTORが活性化されることを確認した。

（材料）
試薬等は、基本的に実施例１に記載のものを用いた。具体的には、ウエスタンブロット用の一次抗体としてp70S6K抗体（#9202, Cell Signaling Technology）、p-p70S6K (Thr421/Ser424)抗体（#9204, Cell Signaling Technology）、p-p70S6K (Thr389)抗体（#9205, Cell Signaling Technology）、Akt抗体（#9272, Cell Signaling Technology）を用いた。二次抗体には、ウサギ特異的HRP標識抗体（GE Healthcare）を用いた。mTORの基質にはp70S6Kを用いた。

（方法）
本実施例で、リガンドにはATPを用いた。マウスへのATPの投与は、実施例３に記載の方法に従い、筋肉注射により行った。ATP投与したマウスからヒラメ筋由来の単一筋線維の単離は実験例３に記載の方法に従った。また他の基本操作は、実施例１に準じて行った。

（結果）
図１０に結果を示す。ATPを筋注した場合、mTORの基質であるp70S6Kにおける389位のThrのリン酸化が上昇した。これらの結果から、単一筋線維においてもATP依存的な細胞内カルシウム濃度の上昇及びその後のmTORの活性化が生じることが立証された。

なお、本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、そのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (11)

1. 筋細胞外から又は筋細胞内で作用して筋小胞体膜上のイノシトール三リン酸受容体を直接的に又は間接的に活性化し、筋小胞体からのカルシウムイオンの放出を誘導することを特徴とする筋増加剤。
2. 前記筋細胞が遅筋細胞である、請求項１に記載の筋増加剤。
3. P2Y受容体アゴニストである、請求項１又は２に記載の筋増加剤。
4. 前記P2Y受容体アゴニストがATP若しくはUTP又はその誘導体、その塩、又はその組み合わせである、請求項３に記載の筋増加剤。
5. イノシトール三リン酸若しくはその塩、又はそのエステル若しくはそのプロドラッグである、請求項１又は２に記載の筋増加剤。
6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の筋増加剤を有効成分として含む、筋萎縮を伴う障害又は疾患の治療又は予防用医薬組成物。
7. 前記筋萎縮を伴う障害が廃用性筋萎縮、カヘキシア、サルコペア、及び微小重力下における筋萎縮からなる群から選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
8. 前記筋萎縮を伴う疾患が筋萎縮性側索硬化症、又は筋ジストロフィーである、請求項６に記載の医薬組成物。
9. 筋増加剤の分離方法であって、
   （ａ）筋細胞を、被験物質及び／又は被験因子で処置するステップ、
   （ｂ）該筋細胞内のイノシトール三リン酸受容体の活性を測定するステップ、及び
   （ｃ）（ｂ）ステップの測定結果に基づいてイノシトール三リン酸受容体の活性を増大させる被験物質又は被験因子を筋増加剤として分離するステップ
   を含む前記方法。
10. 前記筋細胞が遅筋細胞である、請求項９に記載の方法。
11. イノシトール三リン酸受容体の活性化の変化を、筋細胞内又は筋小胞体内のカルシウムイオン濃度の変化により測定する、請求項９又は１０に記載の方法。

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