CN114908158A - Cdk1在晚期胃肠间质瘤的诊断和治疗中的应用 - Google Patents

Cdk1在晚期胃肠间质瘤的诊断和治疗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及CDK1在晚期胃肠间质瘤的诊断和治疗中的应用。具体地，本发明提供了一种CDK1基因、mRNA、cDNA、或蛋白或其检测试剂的用途，用作(i)检测晚期胃肠间质瘤的标志物；和/或(ii)用于制备检测晚期胃肠间质瘤的诊断试剂或试剂盒，并且本发明的CDK1基因或其蛋白的抑制剂可任选的与酪氨酸激酶抑制剂、和/或任选的其他预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤的药物联用，并且对晚期胃肠间质瘤的治疗有显著的协同效果。

Description

CDK1在晚期胃肠间质瘤的诊断和治疗中的应用
技术领域
本发明涉及肿瘤学和诊断领域。更具体地，本发明涉及CDK1在晚期胃肠间质瘤的诊断和治疗中的应用。
背景技术
胃肠间质瘤是胃肠最常见的间叶源性肿瘤。胃肠间质瘤依据有无转移分为原发和转移胃道间质瘤，原发胃道间质瘤依据病理学指标(肿瘤大小、每高倍视野有丝***数、解剖位置等)分为低危、中危和高危胃肠间质瘤，如高危间质瘤指发生转移复发的危险级别高。高危胃肠间质瘤和转移胃肠间质瘤统称为晚期胃肠间质瘤。临床上，不同危险级别的间质瘤治疗原则和方案不同。接受标准治疗方案后，临床仍然有部分中危甚至低危胃肠间质瘤的疗效不佳(体现为肿瘤复发甚至转移)。所以本领域迫切需要开发具有评估病人危险度级别价值的胃肠间质瘤的靶点。
此外，晚期胃肠间质瘤经常被误诊为其他的消化道肿瘤(如消化道平滑肌肿瘤、消化道神经鞘瘤等)，所以本领域需要开发具有鉴别诊断晚期胃肠间质瘤的靶点。
并且目前，对于接受靶向治疗的胃肠间质瘤患者来说，大部分患者都产生耐药。
因此，本领域迫切需要开发具有诊断和治疗作用的新靶点以及克服耐药和敏感的新方法。
发明内容
本发明的目的就是提供具有诊断和治疗作用的新靶点以及克服耐药和敏感的新方法。
本发明第一方面提供了一种CDK1基因、mRNA、cDNA、或蛋白或其检测试剂的用途，(i)用作检测晚期胃肠间质瘤的标志物；和/或(ii)用于制备检测晚期胃肠间质瘤的诊断试剂或试剂盒。
在另一优选例中，所述诊断试剂包括抗体、引物、探针、测序文库、核酸芯片(如DNA芯片)或蛋白质芯片。
在另一优选例中，所述的蛋白包括全长蛋白或蛋白片段。
在另一优选例中，所述的CDK1基因、mRNA、cDNA、或蛋白来源于哺乳动物，较佳地来源于啮齿动物(如小鼠、大鼠)、灵长动物和人，更佳地，来源于被诊断患有晚期胃肠间质瘤的患者。
在另一优选例中，所述CDK1基因、mRNA、cDNA、或蛋白来源于晚期胃肠间质瘤患者。
在另一优选例中，所述CDK1基因的登录号为NG_029877.1。
在另一优选例中，所述CDK1 mRNA的登录号为NM_001786。
在另一优选例中，所述CDK1蛋白的登录号为NP_001777。
在另一优选例中，所述检测是组织样本检测。
在另一优选例中，所述的检测包括免疫组化、免疫印迹、免疫共沉淀和荧光定量PCR方法检测。
在另一优选例中，所述的检测是测定早期胃肠间质瘤组织、或晚期胃肠间质瘤组织样品。
在另一优选例中，所述检测试剂包括CDK1的特异性抗体、CDK1的特异性结合分子、特异性扩增引物、探针或芯片。
在另一优选例中，所述检测试剂选自下组：抗体、引物、探针、测序文库、核酸芯片(如DNA芯片)、蛋白质芯片、或其组合。
在另一优选例中，所述的CDK1蛋白或其特异性抗体或特异性结合分子偶联有或带有可检测标记。
在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。
在另一优选例中，所述CDK1的特异性抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
在另一优选例中，所述CDK1蛋白还包括CDK1蛋白的衍生物。
在另一优选例中，所述CDK1蛋白的衍生物包括经修饰的CDK1蛋白、氨基酸序列与天然CDK1蛋白同源且具有天然CDK1蛋白活性的蛋白分子、含有CDK1 蛋白氨基酸序列的融合蛋白。
在另一优选例中，所述经修饰的CDK1蛋白是PEG化的CDK1蛋白。
在另一优选例中，所述“氨基酸序列与天然CDK1蛋白同源且具有天然CDK1 蛋白活性的蛋白分子”是指其氨基酸序列与CDK1蛋白相比具有≥85％的同源性，较佳地≥90％的同源性，更佳地≥95％的同源性，最佳地≥98％同源性；并且具有天然CDK1蛋白活性的蛋白分子。
在另一优选例中，所述诊断试剂或试剂盒还用于区分早期胃肠间质瘤和晚期胃肠间质瘤。
本发明第二方面提供了一种用于检测晚期胃肠间质瘤的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测CDK1基因、mRNA、cDNA、或蛋白的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测晚期胃肠间质瘤。
在另一优选例中，所述的检测晚期胃肠间质瘤指判断发生晚期胃肠间质瘤的可能性大小。
在另一优选例中，所述判断包括预先判断(预测)。
在另一优选例中，所述的检测CDK1基因、mRNA、cDNA、或蛋白的检测试剂包括：
(a).抗CDK1蛋白的特异性抗体；和/或
(b).特异性扩增CDK1的mRNA或cDNA的特异性引物。
在另一优选例中，所述检测是组织样本检测。
在另一优选例中，所述检测CDK1基因、mRNA、cDNA、或蛋白或其检测试剂可作为对照品或参照品。
在另一优选例中，所述诊断试剂盒还用于区分早期胃肠间质瘤和晚期胃肠间质瘤。
在另一优选例中，所述的标签或说明书注明所述试剂盒用于：
(a)检测晚期胃肠间质瘤；
(b)区分早期胃肠间质瘤和晚期胃肠间质瘤。
在另一优选例中，所述的检测对象为人或非人哺乳动物。
本发明第三方面提供了一种检测晚期胃肠间质瘤的方法，所述方法包括：
a)提供来自受试者的测试样品；
b)检测测试样品中CDK1蛋白的表达量E1；和
c)将步骤b)中所测定的CDK1蛋白的表达量与参比值进行比较，
其中所述样品中CDK1蛋白的表达量高于参比值，表明受试者患有晚期胃肠间质瘤。
在另一优选例中，所述的受试者为人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述测试样品为晚期胃肠间质瘤的细胞或组织。
在另一优选例中，所述参比值为截断值(cut-off值)。
在另一优选例中，所述参比值为样品中CDK1的相对表达水平。
在另一优选例中，所述参比值为5(RNA水平)。
在另一优选例中，通过RT-PCR或转录组测序检测样品中的CDK1 RNA的表达水平，免疫印迹或免疫组织化学检测样品中的CDK1蛋白的表达水平。
在另一优选例中，所述方法为非诊断和非治疗性的。
本发明第四方面提供了一种确定治疗方案的方法，包括：
a)提供来自受试者的测试样品；
b)检测测试样品中CDK1蛋白的表达水平；和
c)基于所述样品中的CDK1蛋白的表达水平来确定治疗方案。
在另一优选例中，所述的受试者为人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，当所述样品中CDK1蛋白的表达水平高于参比值，表明受试者患有晚期胃肠间质瘤，所述治疗方案包括CDK1抑制剂疗法、CDK1抑制剂与酪氨酸激酶抑制剂联用的疗法。
在另一优选例中，所述CDK1抑制剂疗法、CDK1抑制剂与酪氨酸激酶抑制剂联用的疗法选自下组：
CDK1抑制剂疗法：抗体、小分子化合物、microRNA、siRNA、shRNA、或其组合；
酪氨酸激酶抑制剂疗法：小分子化合物，选自下组：伊马替尼、舒尼替尼、瑞戈非尼、Avapritinib(BLU-285)、Ripretinib(DCC-2618)、或其组合。
在另一优选例中，当受试者患有晚期胃肠间质瘤时，所述治疗方案还包括 CDK1抑制剂疗法、CDK1抑制剂与酪氨酸激酶抑制剂联用的疗法；和其他治疗晚期胃肠间质瘤药物的联用。
在另一优选例中，所述其他治疗晚期胃肠间质瘤的药物选自下组：伊马替尼、舒尼替尼、瑞戈非尼、阿伐普利尼(Avapritinib，BLU-285)、瑞派替尼 (Ripretinib，DCC-2618)、或其组合。
本发明第五方面提供了一种CDK1基因或其蛋白的抑制剂的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于(a)抑制晚期胃肠间质瘤细胞的生长或增殖；和/或(b)预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤；和/或(c)提高晚期胃肠间质瘤细胞对酪氨酸激酶抑制剂的耐药性和敏感性。
在另一优选例中，所述CDK1基因或其蛋白的抑制剂选自下组：抗体、小分子化合物、microRNA、siRNA、shRNA、或其组合。
在另一优选例中，所述抑制剂包括抑制CDK1基因或其蛋白表达的抑制剂。
在另一优选例中，所述CDK1基因或其蛋白的抑制剂选自下组：RO-3306、
NU6027、Flavopiridol、AT7519、GW5074、Dinaciclib、JNJ-7706621、 AZD5438、BMS-265246、R547、CDKI-73、Alsterpaullone、SU9516、或其组合。
在另一优选例中，所述组合物包括药物组合物。
在另一优选例中，所述的组合物包括治疗有效量的CDK1基因或其蛋白的抑制剂，和药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物通过选自下组的用药方式进行给药：口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直肠灌注、鼻腔喷雾、口腔喷雾、皮肤局部或全身经皮用药。
在另一优选例中，所述的制剂选自下组：片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、喷雾剂。
本发明第六方面提供了一种药物组合物，包括：
(a1)CDK1基因或其蛋白的抑制剂；
(a2)酪氨酸激酶抑制剂；和
(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述药物组合物还包括：
(c)其他预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤的药物。
在另一优选例中，所述酪氨酸激酶抑制剂选自下组：伊马替尼、舒尼替尼、瑞戈非尼、Avapritinib(BLU-285)、Ripretinib(DCC-2618)、或其组合。
在另一优选例中，所述组分(a1)与组分(a2)的重量比为100:1-0.01:1，较佳地，10:1-0.1:1，更佳地，2:1-0.5:1。
在另一优选例中，所述药物组合物中，所述组分(a1)的含量为1％-99％，较佳地，10％-90％，更佳地，30％-70％。
在另一优选例中，所述药物组合物中，所述组分(a2)的含量为1％-99％，较佳地，10％-90％，更佳地，30％-70％。
在另一优选例中，所述药物组合物中，所述组分(c)的含量为1％-99％，较佳地，10％-90％，更佳地，30％-70％。
在另一优选例中，所述药物组合物中，所述组分(a1)和任选的组分(a2)和任选的组分(c)占所述药物组合物总重的0.01-99.99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型包括注射剂型、和口服剂型。
在另一优选例中，所述口服剂型包括片剂、胶囊剂、膜剂、和颗粒剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型包括缓释型剂型、和非缓释型剂型。
本发明第七方面提供了一种产品组合，包括：
(i)第一药物组合物，所述第一药物组合物含有(a)第一活性成分，所述第一活性成分为CDK1基因或其蛋白的抑制剂，以及药学上可接受的载体；和
(ii)第二药物组合物，所述第二药物组合物含有(b)第二活性成分，所述第二活性成分为酪氨酸激酶抑制剂，以及药学上可接受的载体；
其中，所述的第一药物组合物和第二药物组合物为不同的药物组合物，或同一药物组合物。
在另一优选例中，所述组分(i)与组分(ii)的重量比为100:1－0.01:1，较佳地，10:1－0.1:1，更佳地，2:1－0.5:1。
在另一优选例中，所述产品组合中，所述组分(i)的含量为1％－99％，较佳地，10％－90％，更佳地，30％－70％。
在另一优选例中，所述产品组合中，所述组分(ii)的含量为1％－99％，较佳地，10％－90％，更佳地，30％－70％。
在另一优选例中，所述产品组合中，所述组分(i)和组分(ii)占所述产品组合总重的0.01-99.99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型包括注射剂型、和口服剂型。
在另一优选例中，所述口服剂型包括片剂、胶囊剂、膜剂、和颗粒剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型包括缓释型剂型、和非缓释型剂型。
在另一优选例中，所述产品组合还含有CDK1的检测试剂或其试剂盒。
在另一优选例中，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测CDK1 基因、mRNA、cDNA、或蛋白的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测晚期胃肠间质瘤。
本发明第八方面提供了一种药盒，包括：
(a1)第一容器，以及位于所述第一容器中的CDK1基因或其蛋白的抑制剂，或含有CDK1基因或其蛋白的抑制剂的药物；
(b1)第二容器，以及位于所述第二容器中的酪氨酸激酶抑制剂，或含有酪氨酸激酶抑制剂的药物。
在另一优选例中，所述药盒还包括：
(c1)第三容器，以及位于所述第三容器中的其他预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤的药物，或含有其他预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤的药物的药物。
在另一优选例中，所述药盒还含有(d1)第四容器，以及位于所述第四容器的CDK1的检测试剂。
在另一优选例中，所述酪氨酸激酶抑制剂选自下组：伊马替尼、舒尼替尼、瑞戈非尼、Avapritinib(BLU-285)、Ripretinib(DCC-2618)、或其组合。
在另一优选例中，所述的第一容器和第二容器、第三容器、第四容器是相同或不同的容器。
在另一优选例中，所述的第一容器的药物是含CDK1基因或其蛋白的抑制剂的单方制剂。
在另一优选例中，所述的第二容器的药物是含酪氨酸激酶抑制剂的单方制剂。
在另一优选例中，所述的第三容器的药物是含其他预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤的药物的单方制剂。
在另一优选例中，所述药物的剂型为口服剂型或注射剂型。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有说明书。
在另一优选例中，所述说明书记载了选自下组的一个或多个说明：
(a)将CDK1基因或其蛋白的抑制剂用于(i)抑制晚期胃肠间质瘤细胞的生长或增殖；和/或(ii)预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤；和/或(iii)提高晚期胃肠间质瘤细胞对酪氨酸激酶抑制剂的耐药性和敏感性的方法；
(b)将CDK1基因或其蛋白的抑制剂与酪氨酸激酶抑制剂、和/或任选的其他预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤药物联用来(i)抑制晚期胃肠间质瘤细胞的生长或增殖；和/或(ii)预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤；和/或(iii)提高晚期胃肠间质瘤细胞对酪氨酸激酶抑制剂的耐药性和敏感性；
(c)检测晚期胃肠间质瘤患者的CDK1蛋白的表达水平，同时施用CDK1基因或其蛋白的抑制剂来(i)抑制晚期胃肠间质瘤细胞的生长或增殖；和/或(ii) 预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤；和/或(iii)提高晚期胃肠间质瘤细胞对酪氨酸激酶抑制剂的耐药性和敏感性的方法；
(d)检测晚期胃肠间质瘤患者的CDK1蛋白的表达水平，同时联用CDK1基因或其蛋白的抑制剂；和酪氨酸激酶抑制剂、和/或任选的其他预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤药物来(i)抑制晚期胃肠间质瘤细胞的生长或增殖；和/或(ii)预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤；和/或(iii)提高晚期胃肠间质瘤细胞对酪氨酸激酶抑制剂的耐药性和敏感性的方法。
本发明第九方面提供了一种本发明第六方面所述的药物组合物或本发明第七方面所述的产品组合或本发明第八方面所述的药盒的用途，用于制备(i) 抑制晚期胃肠间质瘤细胞的生长或增殖；和/或(ii)预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤；和/或(iii)提高晚期胃肠间质瘤细胞对酪氨酸激酶抑制剂的耐药性和敏感性的药物。
在另一优选例中，所述药物组合物中，CDK1基因或其蛋白的抑制剂的作用浓度为100-3000ng/ml，较佳地，200-1000ng/ml，更佳地，350-500ng/ml。
在另一优选例中，所述药物组合物中，所述酪氨酸激酶抑制剂的作用浓度为10-100000ng/ml，较佳地，100-10000ng/ml，更佳地，500-2000ng/ml。
在另一优选例中，所述药物组合物中，所述其他预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤的药物的作用浓度为10-100000ng/ml，较佳地，100-10000ng/ml，更佳地500-2000ng/ml。
在另一优选例中，所述药物组合物或药盒包括(a)CDK1基因或其蛋白的抑制剂；和(b)任选的酪氨酸激酶抑制剂；和(c)任选的其他预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤的药物；和(d)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述药物组合物或药盒中，所述CDK1基因或其蛋白的抑制剂；和(b)任选的酪氨酸激酶抑制剂；和(c)任选的其他预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤的药物占所述药物组合物或药盒总重的0.01-99.99wt％,较佳地 0.1-90wt％，更佳地1-80wt％。
本发明第十方面提供了一种预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤的方法，包括：
给需要的对象施用CDK1基因或其蛋白的抑制剂；或本发明第六方面所述的药物组合物或本发明第七方面所述的产品组合或本发明第八方面所述的药盒。
在另一优选例中，所述对象包括患有晚期胃肠间质瘤的人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物和灵长目动物，优选小鼠、大鼠、兔、猴。
在另一优选例中，所述CDK1基因或其蛋白的抑制剂的施用剂量为0.5-10mg /kg体重，较佳地为1-6mg/kg体重，最佳地为3-5mg/kg体重。
在另一优选例中，所述酪氨酸激酶抑制剂的施用剂量为1-600mg/kg体重，较佳地为2-60mg/kg体重，最佳地为3-10mg/kg体重。
在另一优选例中，所述其他预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤的药物的施用剂量为0.06-600mg/kg体重，较佳地为1-60mg/kg体重，最佳地为3-12mg/kg 体重。
在另一优选例中，所述CDK1基因或其蛋白的抑制剂的施用频率为2-5次/ 周，较佳地为3-4次/周。
在另一优选例中，所述酪氨酸激酶抑制剂的施用频率为5-20次/周，较佳地为10-15次/周。
在另一优选例中，所述其他预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤的药物的施用频率为3－15次/周，较佳地为6-10次/周。
在另一优选例中，所述CDK1基因或其蛋白的抑制剂的施用时间为20-90 天，较佳地为20-60天，最佳地为30-40天。
在另一优选例中，所述酪氨酸激酶抑制剂的施用时间为20-90天，较佳地为20-60天，最佳地为30-40天。
在另一优选例中，所述其他预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤的药物的施用时间为20-90天，较佳地为20-60天，最佳地为30-40天。
在另一优选例中，所述CDK1基因或其蛋白的抑制剂与任选的酪氨酸激酶抑制剂、和任选的其他预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤的药物同时或先后施用。
本发明第十一方面提供了一种体外非治疗性的抑制晚期胃肠间质瘤细胞的生长或增殖的方法，包括步骤：在CDK1基因或其蛋白抑制剂的存在下，培养晚期胃肠间质瘤细胞，从而抑制胃肠间质瘤细胞的生长或增殖。
在另一优选例中，所述CDK1基因或其蛋白抑制剂选自下组：抗体、小分子化合物、microRNA、siRNA、shRNA、或其组合。
在另一优选例中，所述晚期胃肠间质瘤细胞高表达CDK1蛋白。
在另一优选例中，所述方法还包括向晚期胃肠间质瘤细胞的培养体系中添加酪氨酸激酶抑制剂；和/或其他预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤的药物，从而抑制晚期胃肠间质瘤细胞的生长或增殖。
在另一优选例中，所述晚期胃肠间质瘤细胞为体外培养的细胞。
本发明第十二方面提供了一种筛选预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤的候选化合物的方法，所述方法包括步骤：
(a)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中CDK1的表达量(E1)和/或活性(A1)；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中CDK1的表达量(E0)和/ 或活性(A0)；
其中，如果测试组中细胞的CDK1的表达量(E1)和/或活性(A1)显著低于对照组，就表明该测试化合物是对CDK1的表达和/或活性有抑制作用的预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤的候选化合物。
在另一优选例中，所述的CDK1的表达量是通过荧光定量PCR或免疫组织化学或免疫印迹检测而得出的。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
(b)对于步骤(a)中获得的候选化合物，进一步测试其对晚期胃肠间质瘤细胞生长或增殖的抑制作用；和/或进一步测试其对CDK1基因是否有下调的作用。
在另一优选例中，在步骤(b)中包括步骤：测试组中，晚期胃肠间质瘤细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察晚期胃肠间质瘤细胞的数量和/或生长情况；在对照组中，在晚期胃肠间质瘤细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察晚期胃肠间质瘤细胞的数量和/或生长情况；其中，如果测试组中晚期胃肠间质瘤细胞的数量或生长速度小于对照组，就表明该测试化合物是对晚期胃肠间质瘤细胞的生长或增殖有抑制作用的预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤的候选化合物。
在另一优选例中，所述的方法包括步骤(c)：将步骤(a)中所确定的候选化合物施用于哺乳动物模型，测定其对哺乳动物的影响。
在另一优选例中，所述哺乳动物为患有晚期胃肠间质瘤的哺乳动物。
在另一优选例中，所述“显著低于”指E1/E0≤1/2,较佳地，≤1/3，更佳地≤1/4。
在另一优选例中，所述“显著低于”指A1/A0≤1/2,较佳地，≤1/3，更佳地≤1/4。
在另一优选例中，所述细胞包括晚期胃肠间质瘤细胞。
在另一优选例中，所述细胞为体外培养的细胞。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了(A)RNA-seq的火山图显示了早期和晚期GIST之间差异基因表达的模式。(B)晚期GIST细胞全基因组CRISPR筛选的模式图。(C)箱线图显示了不同倍增时sgRNA的分布。(D)在GIST430/654细胞的全基因组 CRISPR筛选中，每个基因的CRISPR得分排名。CDK1排名第二。在CRISPR筛选中分析的所有基因均以灰色标识，在整个转录组测序中鉴定的在晚期GIST 中高表达的568个基因均以黑色标识。
图2显示了(A)在GIST发现队列中CDK1，CDK4，CDK6和CDK9的表达情况(早期GIST n＝11，晚期n＝32)，相比于其他CDK，CDK1在晚期GIST 比早期GIST中显著高表达。(B)一旦CDK1在一个转移灶中高表达，其在同一个GIST病人的所有其他转移灶中都高表达。(C)Ki67是增殖的分子标记， CDK1和ki67表达是高度相关的(D)蛋白质印迹(n＝92)显示CDK1在早期GIST 中无/低表达，但在晚期GIST中频繁表达。(E)***固定石蜡包埋的GIST 临床样品中的免疫组织化学检测显示，晚期GIST中CDK1高表达，而早期GIST 中CDK1表达水平很低。(F)包含325个早期GIST和177个晚期GIST的组织芯片样本统计分析。CDK1的高表达与GIST的恶性程度高度相关。
图3显示了(A)通过qRT-PCR检测到伊马替尼耐药的GIST430/654和伊马替尼敏感的GIST-T1细胞系中CDK1敲低。(B)慢病毒介导的CDK1敲低短期内显著降低了GIST430/654和GIST-T1细胞的活力，通过CellTiter-Glo活力测定进行评估。(C)结晶紫染色显示CDK1敲低长期抑制GIST细胞增殖。 (D)CDK1敲低抑制GIST430/654和GIST-T1细胞的锚定非依赖性生长。(E) CDK1敲低抑制了GIST430/654和GIST-T1异种移植鼠的肿瘤生长。(F)细胞周期分析表明，CDK1敲低减少了GIST430/654和GIST-T1的S期和G2/M期的细胞比例，并增加了G0/G1期的细胞比例，导致G0/G1阻滞。(G)细胞衰老染色分析表明，CDK1敲低显著增加了GIST430/654和GIST-T1的衰老细胞的比例，促进了细胞衰老，这也是G0/G1细胞周期阻滞的原因之一。
图4显示了(A)通过免疫共沉淀和基于质谱的蛋白质组学鉴定与CDK1相互作用的蛋白质。用FLAG-CDK1慢病毒转导GIST430/654细胞，并使用FLAG 抗体进行下拉测定。该表显示了质谱图中的高可信度的蛋白，AKT1排名第二。 (B)验证PDK1正常和PDK1缺陷的GIST430/654细胞中AKT-CDK1相互作用。用FLAG-CDK1转导GIST430/654细胞，并使用FLAG抗体对细胞裂解液进行免疫共沉淀分析，然后使用AKT抗体进行免疫印迹，表明CDK1和AKT的结合不依赖于PDK1。(C)在PDK1正常的GIST430/654细胞中，使用AKT的抑制剂 MK-2206处理，抑制了CDK1与AKT的结合，并且降低了AKT的磷酸化水平。(D) 内源性CDK1在GIST430/654细胞系中与AKT强烈相互作用。用对照或CDK1抑制剂(RO-3306，1μM)处理的细胞CDK1和AKT IP免疫印迹。左，将细胞裂解物用CDK1抗体免疫沉淀，并用AKT抗体免疫印迹。右边，将细胞裂解液用 AKT抗体免疫沉淀，并用CDK1抗体免疫印迹。表明在GIST体系中，AKT1与CDK1相互作用。(E)体外相互作用分析也表明，CDK1与AKT有相互作用，并且在 RO-3306抑制时这种相互作用减弱。。(F)在293细胞中，外源导入FLAG-CDK1 和HA-AKT1后，免疫共沉淀显示CDK1和AKT1有强烈相互作用，并且CDK1促进AKT 308位苏氨酸和473位丝氨酸的磷酸化。(G)在PDK1敲除的GIST430/654 细胞中，外源导入FLAG-CDK1和HA-AKT1后，免疫共沉淀显示CDK1和AKT1有强烈相互作用，并且促进AKT 308位苏氨酸和473位丝氨酸的磷酸化。表明CDK1 可以不依赖于PDK1而单独激活AKT。(H)在GIST430/654和GIST-T1细胞中敲低CDK1，抑制了AKT磷酸化，诱导凋亡，降低了PCNA的表达。(I)用RO-3306 处理GIST430/654和GIST-T1细胞与CDK1敲低一样地抑制了AKT磷酸化，诱导凋亡，并且抑制细胞增殖。
图5显示了(A)GIST430/654中敲低CDK1后，回补AKT，弥补了CDK1敲低后抑制细胞活力的表型。通过CellTiter-Glo活力测定法评估GIST430/654 细胞的活力。(B)GIST430/654中敲低CDK1后，回补AKT，弥补了CDK1敲低后抑制细胞增殖的表型。通过结晶紫染色测定评估GIST430/654细胞增殖。(C) GIST430/654中敲低CDK1后，回补AKT，弥补了CDK1敲低后抑制细胞锚定不依赖的表型。通过软琼脂实验评估GIST430/654细胞锚定不依赖生长。(D)GIST430/654中敲低CDK1后，回补AKT，弥补了CDK1敲低后抑制异种移植鼠的肿瘤生长。表明CDK1通过AKT促使了GIST细胞的生长与增殖。
图6显示了(A)在GIST细胞系和GIST原代细胞中对CDK1抑制剂RO-3306 的CellTiter-Glo生长抑制测定。从没有CDK1表达的转移性GIST建立GIST-1， BJ是非转化的成纤维细胞系。RO-3306抑制伊马替尼敏感和耐药的GIST细胞系，不影响CDK1不表达的GIST原代细胞和成纤维细胞。(B)RO-3306对于伊马替尼耐药和伊马替尼敏感的GIST细胞的半数抑制浓度(IC50)。(C)免疫印迹显示GIST细胞以及GIST原代细胞中CDK1的表达水平。(D)免疫印迹显示RO-3306处理伊马替尼耐药和伊马替尼敏感的GIST细胞，不影响AKT的表达，但是显著降低AKT的磷酸化水平。(E-G)CDK1抑制剂对伊马替尼耐药的 GIST异种移植鼠的抗肿瘤活性。CDK1抑制剂处理伊马替尼耐药的病人来源的异种移植GIST肿瘤的小鼠，携带病人来源的异种移植GIST肿瘤的小鼠(ex 11+ ex 17)每2天以4mg/kg的RO-3306或每天两次以50mg/kg的伊马替尼治疗，减少了肿瘤体积以及肿瘤大小。并且CDK1抑制剂不影响伊马替尼耐药的GIST异种移植鼠的体重变化。(H)RO-3306和伊马替尼联合处理GIST-T1 细胞，比单独处理显著抑制GIST细胞生长。(I-K)RO-3306对伊马替尼敏感的GIST异种移植鼠的抗肿瘤活性。携带GIST-T1肿瘤的小鼠每2天以4mg/kg 的RO-3306或低剂量(25mg/kg)的伊马替尼每天口服两次，作为单一药物或联合治疗。CDK1抑制剂组合伊马替尼处理伊马替尼敏感的携带GIST-T1肿瘤的小鼠，减少了肿瘤体积以及肿瘤大小。并且CDK1抑制剂不影响伊马替尼敏感的GIST异种移植鼠的体重变化。表明CDK1抑制剂对伊马替尼耐药和伊马替尼敏感的晚期GIST具有抗肿瘤活性。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，在晚期胃肠间质瘤细胞或组织中的CDK1的基因或其蛋白的表达显著高于早期胃肠间质瘤组织中的 CDK1的基因或其蛋白的表达，因此，CDK1基因或其蛋白可用作检测晚期胃肠间质瘤的标志物。并且，申请人还意外的发现，CDK1基因或其蛋白的抑制剂可有效(a)抑制晚期胃肠间质瘤细胞的生长或增殖；和/或(b)预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤；和/或(c)提高晚期胃肠间质瘤细胞对酪氨酸激酶抑制剂的耐药性和敏感性，并且，CDK1基因或其蛋白的抑制剂可与酪氨酸激酶抑制剂、和/ 或任选的其他预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤的药物联用，并且对晚期胃肠间质瘤的治疗有显著的协同效果。在此基础上，本发明人完成了本发明。
如本所用，术语“RO-3306”的结构式为
Figure RE-GDA0003044994410000141
NU6027的结构式为
Figure RE-GDA0003044994410000142
Flavopiridol的结构式为
Figure RE-GDA0003044994410000143
AT7519的结构式为
Figure RE-GDA0003044994410000144
GW5074的结构式为
Figure RE-GDA0003044994410000145
Dinaciclib的结构式为
Figure RE-GDA0003044994410000146
JNJ-7706621的结构式为
Figure RE-GDA0003044994410000151
AZD5438的结构式为
Figure RE-GDA0003044994410000152
BMS-265246的结构式为
Figure RE-GDA0003044994410000153
R547的结构式为
Figure RE-GDA0003044994410000154
CDKI-73的结构式为
Figure RE-GDA0003044994410000155
Alsterpaullone的结构式为
Figure RE-GDA0003044994410000156
SU9516的结构式为
Figure RE-GDA0003044994410000157
Avapritinib(BLU-285)的结构式为
Figure RE-GDA0003044994410000161
DCC-2618的结构式为
Figure RE-GDA0003044994410000162
胃肠间质瘤
胃肠间质瘤是胃肠最常见的间叶源性肿瘤，临床上有症状的胃肠间质瘤好发于45岁以上的成年人，胃肠间质瘤可发生于整个消化道，但大多数发生于胃和小肠，临床间质瘤是最常见的肉瘤，年发病率为10-20/100万人。随着内镜技术及影像技术的进步，越来越多体积较小的胃肠间质瘤被发现。多项病理研究已经证实,直径小于1cm的微小胃肠间质瘤在中老年人中很常见，发现率可达35％,随着世界人口老年化的加剧，估计中国微小胃肠间质瘤患者达1亿人。
胃肠间质瘤主要发病机制是卡哈尔***中原癌基因KIT的激活突变，从而异常激活下游信号通路，主要包括MAPK通路和PI3K-AKT通路，使得细胞生存、生长和增殖失去控制。
晚期胃肠间质瘤
胃肠间质瘤依据有无转移分为原发胃肠间质瘤和转移胃肠间质瘤，原发胃肠间质瘤依据病理学指标(肿瘤大小、每高倍视野有丝***数、解剖位置等) 分为低危、中危和高危胃肠间质瘤，如高危胃肠间质瘤指转移复发的危险级别高。高危胃肠间质瘤和转移胃肠间质瘤统称为晚期胃肠间质瘤。晚期胃肠间质瘤预后差，临床急需治疗手段。约80％的胃肠间质瘤含有KIT激活突变，靶向KIT 癌蛋白的分子靶向治疗革新了进展期间质瘤的治疗方案，但胃肠间质瘤个体间的分子异质性导致不同的个体对靶向治疗的反应高度不一致。基因检测在预测胃肠间质瘤靶向治疗疗效及疾病预后等方面有重要作用。目前，对于接受靶向治疗的胃肠间质瘤患者来说，几乎所有患者都产生耐药，如何提高以伊马替尼为代表的靶向治疗药物的疗效是临床医学和基础医学急需解决的问题。
样品
本文中使用的术语“样品”或“样本”是指与受试者特异地相关联的材料，从其中可以确定、计算或推断出与受试者有关的特定信息。样品可以全部或部分由来自受试者的生物材料构成。样品也可以是以某种方式与受试者接触过的材料，这种接触方式使得对样品进行的测试可以提供与受试者有关的信息。样品也可以是已经与其它材料接触过的材料，这种其它材料不是受试者的，但是能够使第一材料随后被测试以确定与受试者有关的信息，例如样品可以是探针或解剖刀的清洗液。样品可以为接触受试者之外的生物材料源，只要本技术领域的专业人员仍然能够从样品确定与受试者有关的信息就行。
表达
如本文所用，术语“表达”包括mRNA从基因或基因部分的产生，并且包括由RNA或基因或基因部分所编码的蛋白质的产生，还包括与表达相关的检测物质的出现。例如，cDNA，结合配体(如抗体)与基因或其它寡核苷酸、蛋白质或蛋白质片段的结合以及结合配体的显色部分都包括在术语“表达”的范围内。因此，在免疫印迹如western印迹上半点密度的增加也处于以生物学分子为基础的术语“表达”的范围内。
参比值
如本文所用，术语“参比值”是指当与分析结果相比时与特定结果统计学相关的值。在优选的实施方案中，参比值是根据对比较CDK1蛋白的表达与已知的临床结果的研究进行的统计学分析来确定的。在本文的实施例部分中显示了一些这样的研究。但是，来自文献的研究和本文公开的方法的用户经验也可用于生产或调整参比值。参比值也可以通过考虑与患者的医疗史、遗传学、年龄和其它因素特别相关的情况和结果来确定。
在本发明中，所述参比值指截断值(cut-off值)，指晚期胃肠间质瘤细胞或组织中的CDK1的相对表达水平，优选相对表达水平为5(通过转录组测序的方法得到FPKM值，FPKM:Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments即每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments，从一定层面上反应RNA表达水平)
非晚期胃肠间质瘤的样品
如本文所用，术语“非晚期胃肠间质瘤样品”包括但不限于未患有晚期胃肠间质瘤的人群，晚期胃肠间质瘤患者的非晚期胃肠间质瘤组织。
CDK1蛋白和多核苷酸
在本发明中，术语“本发明蛋白”、“CDK1蛋白”、“CDK1多肽”可互换使用，都指具有CDK1氨基酸序列的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的CDK1蛋白。此外，该术语还包括全长的CDK1及其片段。本发明所指的 CDK1蛋白包括其完整的氨基酸序列、其分泌蛋白、其突变体以及其功能上活性的片段。
CDK1是细胞周期蛋白依赖性激酶1，起丝氨酸/苏氨酸激酶的作用，是细胞周期调控的关键参与者。在人类中，CDK1由CDC2基因编码。它对真核细胞周期的G1/S和G2/M相变必不可少。CDK1与细胞周期蛋白一起形成复合物，该复合物可磷酸化多种靶底物(在发芽酵母中已鉴定出75种以上)。该蛋白的磷酸化和去磷酸化在细胞周期控制中起着重要的调节作用。
人的CDK1蛋白全长为297个氨基酸(登录号为NP_001777)。鼠的CDK1蛋白全长为297个氨基酸(登录号为NP_031685)。
在本发明中，术语“CDK1基因”、“CDK1多核苷酸”可互换使用，都指具有CDK1核苷酸序列的核酸序列。
人CDK1基因的基因组全长23522bp(NCBI GenBank登录号为 NG_029877.1)，其转录产物mRNA序列全长1889bp(NCBI GenBank登录号为 NM_001786)。
鼠CDK1基因的基因组全长17767bp(NCBI GenBank登录号NC_000076.7)，其转录产物mRNA序列全长4362bp(NCBI GenBank登录号为NM_007659.4)。
人和鼠CDK1，在DNA水平的相似性为76.25％，蛋白序列相似性为96.97％。
需理解的是，当编码相同的氨基酸时，密码子中核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而产生保守的氨基酸取代时，核苷酸的变换也是可被接受的。
在得到了CDK1的氨基酸片段的情况下，可根据其构建出编码它的核酸序列，并且根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的CDK1核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA 分子(如载体)和细胞中。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的CDK1多肽。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码人CDK1多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，CDK1多核苷酸序列可***到重组表达载体中。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含CDK1编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞；动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA 转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
特异性抗体
在本发明中，术语“本发明抗体”和“抗CDK1的特异性抗体”可互换使用。
本发明还包括对人CDK1多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人CDK1基因产物或片段。较佳地，指那些能与人CDK1基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人CDK1蛋白的分子，也包括那些并不影响人CDK1蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人CDK1基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链 Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人CDK1基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人CDK1蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256；495,1975；Kohler 等人,Eur.J.Immunol.6：511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6：292, 1976；Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier,N.Y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断人CDK1蛋白功能的抗体以及不影响人CDK1蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人CDK1基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人CDK1基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗人CDK1蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测标本(尤其是组织样本或血清样本)中的人CDK1蛋白。
检测方法
利用CDK1在晚期胃肠间质瘤的细胞或组织中高表达的这一特点，本发明还提供了检测晚期胃肠间质瘤的方法。
在本发明的一个优选例中，本发明提供一种检测CDK1的高通量二代测序法以及Sanger测序、荧光定量PCR(qPCR)、免疫印迹、原位免疫荧光法(FISH) 和免疫组化等。
检测试剂盒
基于CDK1与晚期胃肠间质瘤的相关性，即CDK1存在于晚期胃肠间质瘤组织中，因此CDK1可以作为晚期胃肠间质瘤的一种诊断标志物。
本发明还提供了一种检测晚期胃肠间质瘤的试剂盒，它含有检测CDK1基因、mRNA、cDNA、或蛋白的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测晚期胃肠间质瘤。
其中，所述的标签或说明书注明所述试剂盒用于检测晚期胃肠间质瘤。
检测方法和试剂盒
本发明涉及定量和定位检测人CDK1蛋白水平或mRNA水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的人CDK1蛋白水平，可以用于诊断(包括辅助诊断)晚期胃肠间质瘤。
一种检测样品中是否存在CDK1蛋白的方法是利用CDK1蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与CDK1蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在CDK1蛋白。
CDK1蛋白或其多核苷酸可用于CDK1蛋白相关疾病的诊断和治疗。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或DNA芯片上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。抗CDK1的抗体可以固定在蛋白质芯片上，用于检测样品中的CDK1蛋白。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明首次发现，在晚期胃肠间质瘤细胞或组织中的CDK1的基因或其蛋白的表达显著高于正常组织中的CDK1的基因或其蛋白的表达，因此，CDK1 基因或其蛋白可用作检测晚期胃肠间质瘤的标志物。
(2)本发明首次发现，CDK1基因或其蛋白的抑制剂可有效(a)抑制晚期胃肠间质瘤细胞的生长或增殖；和/或(b)预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤；和/ 或(c)提高晚期胃肠间质瘤细胞对酪氨酸激酶抑制剂的耐药性和敏感性。
(3)本发明首次发现，CDK1基因或其蛋白的抑制剂可与酪氨酸激酶抑制剂、和/或任选的其他预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤的药物联用，并且对晚期胃肠间质瘤的治疗有显著的协同效果。
(4)本发明首次发现，CDK1在晚期胃肠间质瘤患者组织样品中高表达。
(5)本发明首次发现，CDK1促进胃肠间质瘤细胞的生长和增殖。
(6)本发明首次发现，抑制CDK1的表达或活性可抑制晚期胃肠间质瘤 (GIST)的生长和增殖。
(7)本发明首次发现，抑制CDK1的表达或活性可显著提高GIST对酪氨酸激酶抑制剂(比如伊马替尼)的耐药性和敏感性。
(8)本发明首次发现，CDK1通过AKT促进GIST生长和增殖。
(9)本发明首次发现，CDK1结合并且调节AKT磷酸化。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。
实施例1 全基因组CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)筛选发现，CDK1是晚期胃肠间质瘤(GIST)的靶点
为了寻找影响GIST细胞的功能基因，本研究利用CRISPR/Cas9对 GIST430/654细胞进行失活筛选。用GeCKOv2文库病毒以MOI约为0.4的效率感染GIST430/654细胞，嘌呤霉素(puromycin)筛选后将所有细胞分为2组，每组细胞数量不少于300×文库覆盖度。第一组提取细胞基因组DNA作为Day 0 对照，第二组连续培养15代后再提取细胞基因组DNA。将基因组DNA进行巢式 PCR对导入的sgRNA扩增，并引入barcodes序列，对扩增子进行深度大于300×的二代测序。根据CRISPR/Cas9失活筛选过程中sgRNA读数的变化，计算CRISPR genescore(CS)并以此反映基因重要程度。
实验步骤：
1)分析43个GIST样本的转录组数据(图2A-C)；
2)利用晚期GIST细胞系(GIST430/654)进行全基因组CRISPR筛选敲除抑制细胞增殖的基因；
3)综合利用转录组数据和CRISPR筛选数据筛选晚期GIST的弱点(图1A-D)。
实验结果如图1的A-D所示。
结果表明，有568个基因在晚期GIST中高表达，在早期GIST中低表达(图1A)；使用图(1B)的CRISPR screen的方法对晚期伊马替尼耐药的GIST430/654 细胞进行筛选；在15个群体倍增(PD)后，sgRNA的分布与PD0细胞相比发生了显著的变化，这表明该功能筛选符合设计(图1C)；在GIST430/654筛选结果中，CDK1的CS值排名第二(图1D)。总体表明CDK1是晚期胃肠间质瘤(GIST) 的潜在靶点。
实施例2 CDK1在晚期GIST中显著高表达
免疫印迹实验：向收获的样本或细胞蛋白中加入IP缓冲液，4度裂解过夜后，12000rpm离心30min，使用Quick StartTM Bradford 1×Dye Reagent (Bio-Rad；#5000205)对蛋白定量。电泳和蛋白质印迹使用标准技术进行。通过化学发光(Immobilon Western，Millipore Corporation，MA)检测杂交信号，并使用Amersham Imager 600成像仪(GEHealthcare；#29083461)捕获发光信号。
免疫组织化学：使用CDK1抗体(Santa Cruz#sc-54)对组织和肿瘤切片进行免疫组织化学。使用二甲苯脱蜡，并在一系列不同浓度的乙醇中洗涤。将玻片在柠檬酸盐缓冲液(pH 6)中通过微波煮沸12分钟。通过二氨基联苯胺染色观察免疫组织化学反应。
实验步骤：
1)在早期和晚期GIST中通过Western blotting检测CDK1表达水平(图2D)；
2)在早期和晚期GIST中通过免疫组织化学检测CDK1表达水平(图2E)；
3)通过502例GIST的组织芯片样本检测CDK1表达水平(图2F)。
实验结果如图2(A-F)所示。
结果表明，43个GIST样本RNA-seq结果显示，相对于其他CDK，只有CDK1 在晚期GIST中高表达(RNA水平)(图2A)；在一个病人的一个转移灶中发现CDK1 高表达，那么在其余的转移灶中也能发现CDK1高表达(图2B)；CDK1表达与KI67 表达是显著正相关的(图2C)；92个样本免疫印迹结果显示，在晚期GIST中表达水平的比例为38/52(72％)，显著高于早期GIST(蛋白水平)(图2D)；502个TMA 免疫组织化学芯片显示，CDK1高表达与GIST早晚期显著相关，在晚期GIST中高表达(图2，E-F)。3个队列均显示CDK1在晚期GIST中显著高表达。
实施例3 CDK1基因缺失抑制GIST生长和增殖
慢病毒包装：用聚乙烯亚胺(polyethylenime,PEI)介导293T细胞转染。细胞在转染前一天以适当的密度分盘至10cm培养皿中，细胞生长至大约70-90％时用无血清培养基换液，2小时后用PEI转染质粒。慢病毒包装质粒为9μg δ8.9和3.5μg vsv-g，目的质粒10μg。转染后4-6小时用完全培养基换液， 24、36、48、60小时后收集上清获取病毒液。
细胞活力检测：用CellTiter-Glo(CTG)试剂盒检测。将处理后的96孔板细胞于室温孵育30分钟，CTG试剂用PBS稀释4倍，细胞每孔加入100μL 稀释的CTG试剂，室温避光条件下置于摇床上混合2分钟将细胞裂解，再静置 10分钟后用酶标仪检测发光强度。
结晶紫实验：当6孔板细胞长至一定程度后，倒掉培养基，用PBS洗涤两次，每孔中加入4％多聚甲醛固定20min。重复PBS洗涤两次后，使用结晶紫染色液室温避光孵育30min。流水冲洗数次，置于光学显微镜下拍照计数统计。
软琼脂实验：当6孔板细胞长至一定程度后，倒掉培养基，加入1X MTT 染色液，置于5％CO2培养箱。2h后克隆染成蓝紫色，置于光学显微镜下拍照扫描。
细胞周期检测：培养的细胞制备成单细胞悬液，PBS洗涤后用75％乙醇于 -20℃固定，24小时后用PBS洗涤，加入RNase A，混匀置于37℃孵育30分钟，再加入碘化丙啶(propidium iodide,PI)对DNA染色，室温避光孵育30分钟后用流式细胞仪进行检测。
裸鼠异种移植实验：将获取的GIST细胞与基质胶按照1:1的比例混合均匀，使用注射器于BALB/c裸鼠腋窝皮下接种。每天观察小鼠生理状况，以及称量肿瘤大小。对于药物处理的小鼠，待肿瘤长至一定程度后，伊马替尼的剂量为每天两次，剂量为50mg/kg，RO-3306的剂量为每两天4mg/kg，经口灌胃30天。治疗30天后，杀死所有小鼠并收集肿瘤。肿瘤体积和肿瘤重量用于评估抗肿瘤活性。
SA-β-Gal细胞衰老检测实验：将慢病毒感染后的细胞培养至在显微镜下看到明显的细胞衰老状态时，弃去孔板中的培养基，使用PBS洗涤两次，4％多聚甲醛固定20min。流水冲洗两次，使用碧云天β-半乳糖苷酶活性检测试剂盒染色孵育过夜。弃去染色试剂，置于光学显微镜下观察拍照，拍摄照片为随机3个视野，人工统计染色的细胞，统计衰老百分比。
实验步骤：
1)构建CDK1基因慢病毒敲低载体；
2)包装慢病毒后感染GIST430/654和GIST-T1细胞；
3)用CellTiter-Glo(CTG)试剂盒检测细胞活力(图3A-B)；
4)免疫印迹检测CDK1敲低水平(图4H)；
5)通过结晶紫、软琼脂实验检测CDK1敲低细胞的增殖能力(图3C-D)；
6)流式细胞仪检测细胞周期各时期的比例，进而反映细胞增殖(图3F)；
7)将细胞注射至裸鼠皮下进行异种移植，定期观察检测肿瘤生长情况(图3E)；
8)细胞衰老试剂盒检测CDK1敲低后细胞的衰老水平(图3G)。
实验结果如图3(A-G)所示。
结果表明，CDK1敲低后，细胞活力实验、细胞锚定不依赖实验、结晶紫实验、裸鼠移植实验均显示抑制GIST细胞增殖(图3，A-E)；CDK1敲低后，因为促进了细胞衰老(图3，G)，从而使得细胞周期阻滞在G0/G1(图3，F)。因此，CDK1基因敲除后显著抑制GIST细胞生长和增殖，促进GIST衰老。
实施例4 CDK1结合且调节AKT的磷酸化
载体构建：通过分子克隆扩增全长AKT以及FLAG-CDK1，通过酶切连接方法，将其连入表达载体。
免疫沉淀质谱联用：用含有蛋白酶抑制剂(10μg/mL亮蛋白素，10μg/mL 抑肽酶和1mM苯基甲基磺酰氟)的IP缓冲液裂解细胞，将其与1μg抗FLAG 抗体和20μL蛋白G-琼脂糖(ThermoFisher#101242)混合过夜，并用SDS上样缓冲液煮沸洗脱。通过SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色(胶体蓝染色试剂盒， Invitrogen，#LC6025)检测洗脱的样品。对于质谱分析，将IP样品通过与 8M尿素和100mM Tris-Cl(pH 8.0)一起振摇洗脱，并进行质谱分析。
免疫共沉淀：用含有蛋白酶抑制剂的IP缓冲液(10μg/mL亮肽素，10 μg/mL抑肽酶和1mM苯基甲基磺酰氟)裂解细胞，将其与2μg抗-Flag抗体和20μL蛋白G-琼脂糖混合并孵育过夜。通过用SDS上样缓冲液煮沸来洗脱免疫沉淀物。通过蛋白质印迹分析IP样品和全细胞裂解液。
实验步骤：
1)构建FLAG-CDK1外源表达载体；
2)GIST430/654中过表达FLAG-CDK1，使用FLAG抗体拉下CDK1相互作用的蛋白，质谱鉴定(图4A)；
3)GIST430/654中过表达FLAG-CDK1，使用FLAG抗体下拉，验证相互作用蛋白AKT(图4D)；
4)GIST430/654中使用CDK1抑制剂RO-3306处理，验证CDK1特异性相互作用蛋白AKT(图4D)；
5)在体外结合实验中，CDK1抑制剂RO-3306孵育，并用CDK1抗体下拉，验证 CDK1相互作用蛋白AKT1(图4E)；
6)在293体系中，外源导入FLAG-CDK1和HA-AKT，使用FLAG抗体下拉，验证 CDK1和AKT相互作用(图4F)；
7)在PDK1正常和缺陷的GIST430/654细胞中，导入外源FLAG-CDK1，通过FLAG 抗体下拉，验证CDK1与AKT相互作用不依赖于PDK1(图4B)；
8)在PDK1正常的GIST430/654中，使用AKT抑制剂MK-2206处理细胞，使用FLAG抗体下拉，验证CDK1结合AKT，使用全细胞裂解液免疫印迹，显示抑制剂处理组降低AKT的磷酸化(图4C)；
9)在PDK1敲除的GIST430/654细胞中，外源导入FLAG-CDK1和HA-AKT1，使用FLAG下拉，验证相互作用蛋白AKT，免疫印迹显示，降低了AKT的磷酸化(图 4G)；
10)GIST430/654和GIST-T1中敲低CDK1或者使用CDK1抑制剂RO-3306，通过蛋白质印迹检测AKT/pAKT，PCNA和PARP等表达水平(图4H-I)；
实验结果如图4(A-I)所示。
结果表明，在GIST430/654中，使用抗体FLAG拉下的蛋白中，AKT1排名第二(图4A)；CDK1和AKT的结合不依赖于PDK1(图4B)；在PDK1正常的 GIST430/654细胞中，使用AKT的抑制剂MK-2206处理，抑制了CDK1与AKT的结合，并且降低了AKT的磷酸化水平(图4C)；在GIST细胞体系中，AKT1与 CDK1相互作用(图4D)；体外相互作用分析也表明，CDK1与AKT有相互作用 (图4E)；在293细胞体系中，AKT1与CDK1相互作用，并且CDK1促进AKT 308 位苏氨酸和473位丝氨酸的磷酸化(图4F)；在GIST430/654和GIST-T1细胞中敲低CDK1，抑制了AKT磷酸化，诱导凋亡，降低了PCNA的表达(图4G，H)；用RO-3306处理GIST430/654和GIST-T1细胞与CDK1敲低一样地抑制了AKT 磷酸化，诱导凋亡，并且抑制细胞增殖(图4I)。因此，CDK1结合且调节AKT 的磷酸化，且不依赖于PDK1，同时，CDK1敲低促进了凋亡。
实施例5 CDK1通过AKT促进GIST生长和增殖
免疫共沉淀：用含有蛋白酶抑制剂的IP缓冲液(10μg/mL亮肽素，10 μg/mL抑肽酶和1mM苯基甲基磺酰氟)裂解细胞，将其与2μg抗-Flag抗体和20μL蛋白G-琼脂糖混合并孵育过夜。通过用SDS上样缓冲液煮沸来洗脱免疫沉淀物。通过蛋白质印迹分析IP样品和全细胞裂解液。
实验步骤：
1)GIST430/654中敲低CDK1后回补AKT，通过CellTiter-Glo活力、结晶紫和软琼脂实验检测GIST生长和增殖(图5A-C)；
2)GIST430/654中敲低CDK1后回补AKT，通过裸鼠移植等体内实验检测GIST 生长和增殖(图5D)。
结果表明，回补AKT，弥补了CDK1敲低后抑制细胞活力的表型(图5A)；回补AKT，弥补了CDK1敲低后抑制细胞增殖的表型(图5B)；回补AKT，弥补了CDK1 敲低后抑制细胞锚定不依赖的表型(图5C)；回补AKT，弥补了CDK1敲低后抑制异种移植鼠的肿瘤生长(图5D)。因此，CDK1通过AKT促进GIST生长和增殖。
实施例6 CDK1抑制剂对伊马替尼耐药和伊马替尼敏感的晚期GIST的抗肿瘤活性
实验步骤：
1)用梯度浓度的RO-3306处理7种GIST细胞以及GIST原代细胞， CellTiter-Glo活力试剂盒检测细胞活力并统计半数抑制浓度(图6A-B)；
2)通过免疫印迹显示GIST细胞以及GIST原代细胞中CDK1表达水平(图6C)；
3)用RO-3306处理GIST细胞以及GIST原代细胞，免疫印迹显示AKT磷酸化水平下降(图6D)；
4)在GIST-T1细胞系中，使用RO-3306和伊马替尼联合处理，显著优于单一治疗(图6H)；
5)使用RO-3306或联合RO-3306和伊马替尼，检测对于病人来源异种移植鼠 (PDX)的肿瘤大小、体积以及对于小鼠的毒性作用(图6E-G，I-K)。
结果表明，RO-3306抑制伊马替尼敏感和耐药的GIST细胞系，不影响CDK1 不表达的GIST原代细胞和成纤维细胞(图6，A-B)；GIST细胞以及GIST原代细胞中CDK1的表达水平(图6C)；RO-3306处理伊马替尼耐药和伊马替尼敏感的GIST 细胞，不影响AKT的表达，但是显著降低AKT的磷酸化水平(图6D)；CDK1抑制剂抑制了伊马替尼耐药的GIST异种移植鼠的肿瘤体积和大小，并且无毒性作用(图 6，E-G)；CDK1抑制剂组合伊马替尼处理伊马替尼敏感的携带GIST-T1肿瘤的小鼠，减少了肿瘤体积以及肿瘤大小。并且CDK1抑制剂不影响伊马替尼敏感的GIST异种移植鼠的体重变化(图6，I-K)。因此，CDK1抑制剂对伊马替尼耐药和伊马替尼敏感的晚期GIST具有抗肿瘤活性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (11)

1.一种CDK1基因、mRNA、cDNA、或蛋白或其检测试剂的用途，其特征在于，(i)用作检测晚期胃肠间质瘤的标志物；和/或(ii)用于制备检测晚期胃肠间质瘤的诊断试剂或试剂盒。
2.一种用于检测晚期胃肠间质瘤的诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测CDK1基因、mRNA、cDNA、或蛋白的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测晚期胃肠间质瘤。
3.一种检测晚期胃肠间质瘤的方法，其特征在于，所述方法包括：
a)提供来自受试者的测试样品；
b)检测测试样品中CDK1蛋白的表达量E1；和
c)将步骤b)中所测定的CDK1蛋白的表达量与参比值进行比较，
其中，所述样品中CDK1蛋白的表达量高于参比值，表明受试者患有晚期胃肠间质瘤。
4.一种确定治疗方案的方法，其特征在于，包括：
a)提供来自受试者的测试样品；
b)检测测试样品中CDK1蛋白的表达水平；和
c)基于所述样品中的CDK1蛋白的表达水平来确定治疗方案。
5.一种CDK1基因或其蛋白的抑制剂的用途，其特征在于，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于(a)抑制晚期胃肠间质瘤细胞的生长或增殖；和/或(b)预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤；和/或(c)提高晚期胃肠间质瘤细胞对酪氨酸激酶抑制剂的耐药性和敏感性。
6.一种药物组合物，其特征在于，包括：
(a1)CDK1基因或其蛋白的抑制剂；
(a2)酪氨酸激酶抑制剂；和
(b)药学上可接受的载体。
7.一种产品组合，其特征在于，包括：
(i)第一药物组合物，所述第一药物组合物含有(a)第一活性成分，所述第一活性成分为CDK1基因或其蛋白的抑制剂，以及药学上可接受的载体；和
(ii)第二药物组合物，所述第二药物组合物含有(b)第二活性成分，所述第二活性成分为酪氨酸激酶抑制剂，以及药学上可接受的载体；
其中，所述的第一药物组合物和第二药物组合物为不同的药物组合物，或同一药物组合物。
8.一种药盒，其特征在于，包括：
(a1)第一容器，以及位于所述第一容器中的CDK1基因或其蛋白的抑制剂，或含有CDK1基因或其蛋白的抑制剂的药物；
(b1)第二容器，以及位于所述第二容器中的酪氨酸激酶抑制剂，或含有酪氨酸激酶抑制剂的药物。
9.一种权利要求6所述的药物组合物或权利要求7所述的产品组合或权利要求8所述的药盒的用途，其特征在于，用于制备(i)抑制晚期胃肠间质瘤细胞的生长或增殖；和/或(ii)预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤；和/或(iii)提高晚期胃肠间质瘤细胞对酪氨酸激酶抑制剂的耐药性和敏感性的药物。
10.一种体外非治疗性的抑制晚期胃肠间质瘤细胞的生长或增殖的方法，其特征在于，包括步骤：在CDK1基因或其蛋白抑制剂的存在下，培养晚期胃肠间质瘤细胞，从而抑制胃肠间质瘤细胞的生长或增殖。
11.一种筛选预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤的候选化合物的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(a)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中CDK1的表达量(E1)和/或活性(A1)；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中CDK1的表达量(E0)和/或活性(A0)；
其中，如果测试组中细胞的CDK1的表达量(E1)和/或活性(A1)显著低于对照组，就表明该测试化合物是对CDK1的表达和/或活性有抑制作用的预防和/或治疗晚期胃肠间质瘤的候选化合物。
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