JP2023516325A - 血中コレステロール低下用、心血管代謝疾患の予防又は治療用及び抗炎症用薬学的組成物 - Google Patents

血中コレステロール低下用、心血管代謝疾患の予防又は治療用及び抗炎症用薬学的組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＣＡＰ１とＰＣＳＫ９の間の結合阻害剤、ＣＡＰ１とレジスチンの間の結合阻害剤、又はＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤を有効成分として含む血中コレステロール低下用、心血管代謝疾患の予防又は治療用及び抗炎症用薬学的組成物などに関する。本発明は、ＣＡＰ１とＰＣＳＫ９の結合、ＣＡＰ１とレジスチンの結合、又はＣＡＰ１遺伝子の発現を抑制することによって、血中ＬＤＬコレステロールの数値を低減できる効果がある。したがって、本発明は、異常な血中コレステロールのレベルとそれに因って発病する各種心血管代謝疾患、例えば、脂質異常症、脳卒中、動脈硬化症などを治療し、炎症を抑制するための薬学的組成物などとして有用に使用できる。【選択図】図４ｓ

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り 令和１年８月１６日にウェブサイト（ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｅｕｒｈｅａｒｔｊ／ｅｈｚ５６６）にてオンライン出版論文“Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｈｅａｒｔ Ｊｏｕｒｎａｌ（２０２０）４１，ｐｐ．２３９－２５２”（タイトル：“Ｃｙｃｌａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ｉｓ ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐａｒｔｎｅｒ ｏｆ ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ ｔｙｐｅ－９ ａｎｄ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｂｙ ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ ｔｙｐｅ－９”を公開
本発明は、ＣＡＰ１とＰＣＳＫ９の間の結合阻害剤、ＣＡＰ１とレジスチンの間の結合阻害剤、又はＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤を有効成分として含む血中コレステロール低下用、心血管代謝疾患の予防又は治療用、抗炎症用薬学的組成物及びＣＡＰ１とＰＣＳＫ９又はレジスチンの間の結合レベルを測定する製剤を含む高コレステロール血症又は心血管代謝疾患の診断用組成物などに関する。
本出願は、２０２０年３月２日に出願された韓国特許出願第１０－２０２０－００２６０７３号に基づく優先権を主張し、当該出願の明細書及び図面に開示されたすべての内容は本出願に援用される。
ＰＣＳＫ９（Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ ｔｙｐｅ－９）は、ＬＤＬ（ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）受容体の内在化及びリソソーム分解（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を調節することによって、血漿ＬＤＬコレステロールのレベルを決定し、これによって、有望な治療標的になった。ＰＣＳＫ９抑制剤は、血漿ＬＤＬコレステロールのレベルを減少させ、改善された心血管結果を示した。しかしながら、ＰＣＳＫ９がＬＤＬ受容体の運命を決定する正確なメカニズムは明らかにされていない。ＬＤＬ受容体は、ＬＤＬコレステロールに結合した状態で細胞に入った後、エンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）でＬＤＬコレステロールから分離されて、細胞表面に再循環されるのに対し、ＬＤＬコレステロールは、分解のためにリソソームに送られる。これとは対照的に、ＰＣＳＫ９に結合した場合、ＬＤＬ受容体は、内在化され、未知のメカニズムを通した分解のために、リソソームに案内される。ＰＣＳＫ９は、プロテイナーゼＫ類似セリンプロテアーゼであるが、自己触媒的切断後、プロドメイン（ｐｒｏ－ｄｏｍａｉｎ；アミノ酸３２－１５２）の末端部分が触媒三残基（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒｉａｄ）を覆うことによって、さらなるタンパク質分解活性を防止する。ＰＣＳＫ９の触媒ドメインは、ＬＤＬ受容体と結合し、ＰＣＳＫ９のさらに他の部分、すなわちＣ末端システインリッチドメイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｒｉｃｈ ｄｏｍａｉｎ；ＣＲＤ）は、タンパク質複合体をリソソーム分解側にエスコートする推定膜結合タンパク質（ｐｕｔａｔｉｖｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）と相互作用すると疑われてきた。
一方、ＣＡＰ１は、細胞の形態、移動及びエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）に重要なアクチンフィラメントの動力学を調節することが知られており、従来の研究結果では、ＣＡＰ１がヒトレジスチン（ｒｅｓｉｓｔｉｎ）の受容体であることが報告されている。しかしながら、ＣＡＰ１がＰＣＳＫ９又はレジスチンと相互作用して脂質異常症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、脳卒中、動脈硬化症などを含む各種心血管代謝疾患においてＬＤＬコレステロールの濃度の調節に関与するかどうかは全く知られていない。
本発明者らは、ＣＡＰ１がＬＤＬ受容体の運命を決定するＰＣＳＫ９と直接結合して前記受容体の分解を誘導し、ＣＡＰ１とＰＣＳＫ９の間の結合又はＣＡＰ１とレジスチンの間の結合を抑制したり、ＣＡＰ１の発現を抑制する場合、ＬＤＬ受容体の分解が阻害されることによって、ＬＤＬコレステロールの数値を低減することができ、これと同時に、炎症が抑制されることを発見して、本発明を完成した。
したがって、本発明の目的は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１（Ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）と配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９（ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ ｔｙｐｅ－９）の間の結合阻害剤を有効成分として含む、血中コレステロール低下用組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤を有効成分として含む、血中コレステロール低下用組成物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９の間の結合阻害剤；（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤；又は（ｉｉｉ）前記（ｉ）及び（ｉｉ）の混合物を含む、心血管代謝疾患の予防、改善又は治療用組成物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９の間の結合阻害剤；（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と配列番号３のアミノ酸配列からなるレジスチン（ｒｅｓｉｓｔｉｎ）の間の結合阻害剤；及び（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤からなる群から選ばれる１種以上を有効成分として含む、抗炎症用薬学的組成物又は健康機能食品組成物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と；配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９又は配列番号３のアミノ酸配列からなるレジスチンの間の結合レベルを測定する製剤を含む、高コレステロール血症又は心血管代謝疾患の診断用組成物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、患者の試料のうち、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と；配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９又は配列番号３のアミノ酸配列からなるレジスチンの間の結合レベルを測定する段階を含む、高コレステロール血症又は心血管代謝疾患の診断方法又は診断のための情報提供方法を提供することにある。
また、本発明の目的は、高コレステロール血症又は心血管代謝疾患治療剤のスクリーニング方法を提供することにある。
しかしながら、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に明確に理解され得る。
本発明の目的を達成するために、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１（Ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）と配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９（ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ ｔｙｐｅ－９）の間の結合阻害剤を有効成分として含む、血中コレステロール低下用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９の間の結合阻害剤を個体に投与する段階を含む、血中コレステロール低下方法を提供する。
さらに、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９の間の結合阻害剤の血中コレステロール低下用途を提供する。
それだけでなく、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９の間の結合阻害剤の、血中コレステロール低下又は高コレステロール血症に対する予防又は治療に用いられる薬剤を生産するための用途を提供する。
本発明の一具現例において、前記結合阻害剤は、ＣＡＰ１又はＰＣＳＫ９に特異的に結合するタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、基質類似体、アプタマー及び抗体からなる群から選ばれる１種以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の他の具現例において、前記結合阻害剤は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１タンパク質又はその断片；及び免疫グロブリン重鎖のＦｃ断片を含む融合タンパク質でありうる。
本発明のさらに他の具現例において、前記融合タンパク質は、配列番号４又は配列番号６のアミノ酸配列からなるものであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記結合阻害剤は、ＣＡＰ１のＳＨ３（Ｓｒｃ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ３）結合ドメイン及びＰＣＳＫ９のシステインリッチドメイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｒｉｃｈ ｄｏｍａｉｎ；ＣＲＤ）からなる群から選ばれる一つ以上のドメインに結合するものであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記ＣＡＰ１のＳＨ３結合ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含んでもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記ＰＣＳＫ９のシステインリッチドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列からなってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記ＰＣＳＫ９のシステインリッチドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列からなるＭ１ドメインを含んでもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記ＰＣＳＫ９のシステインリッチドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列からなるＭ３ドメインを含んでもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記結合阻害剤は、ＣＡＰ１のＳＨ３結合ドメインに存在する３４Ｂ番アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）を含む部位に特異的に結合するものであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記結合阻害剤は、ＰＣＳＫ９のＭ１ドメインに存在する４９４番リシン（ｌｙｓｉｎｅ）を含む部位に特異的に結合するものであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記結合阻害剤は、ＰＣＳＫ９のＭ３ドメインに存在する６５９番アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）を含む部位に特異的に結合するものであってもよいが、これに限定されるものではない。
また、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤を有効成分として含む、血中コレステロール低下用薬学的組成物を提供する。
さらに、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤を個体に投与する段階を含む、血中コレステロール低下方法を提供する。
それだけでなく、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤の血中コレステロール低下用途を提供する。
さらに、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤の、血中コレステロール低下又は高コレステロール血症に対する予防又は治療に用いられる薬剤を生産するための用途を提供する。
本発明の一具現例において、前記発現抑制剤は、ＣＡＰ１遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合できるアンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム及びＰＮＡからなる群から選ばれる１種以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の他の具現例において、前記発現抑制剤は、配列番号８の塩基配列からなるｓｉＲＮＡであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記発現抑制剤は、配列番号９の塩基配列からなるｓｈＲＮＡであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記組成物は、ＬＤＬ（Ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）受容体の分解を抑制するものであってもよい。
本発明のさらに他の具現例において、前記コレステロールは、ＬＤＬコレステロールであってもよいが、これに限定されるものではない。
また、本発明は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９の間の結合阻害剤；（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤；又は（ｉｉｉ）前記（ｉ）及び（ｉｉ）の混合物を含む、血中コレステロール低下用健康機能食品組成物を提供する。
また、本発明は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９の間の結合阻害剤；（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤；又は（ｉｉｉ）前記（ｉ）及び（ｉｉ）の混合物を含む、心血管代謝疾患の予防又は治療用薬学的組成物又は心血管代謝疾患の予防又は改善用健康機能食品組成物を提供する。
さらに、本発明は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９の間の結合阻害剤；（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤；又は（ｉｉｉ）前記（ｉ）及び（ｉｉ）の混合物を含む組成物を個体に投与する段階を含む、心血管代謝疾患の予防又は治療方法を提供する。
それだけでなく、本発明は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９の間の結合阻害剤；（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤；又は（ｉｉｉ）前記（ｉ）及び（ｉｉ）の混合物を含む組成物の、心血管代謝疾患の予防又は治療用途を提供する。
さらに、本発明は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９の間の結合阻害剤；（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤；又は（ｉｉｉ）前記（ｉ）及び（ｉｉ）の混合物を含む組成物の、心血管代謝疾患の予防又は治療に用いられる薬剤を生産するための用途を提供する。
本発明の一具現例において、前記結合阻害剤は、ＣＡＰ１又はＰＣＳＫ９に特異的に結合するタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、基質類似体、アプタマー及び抗体からなる群から選ばれる１種以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の他の具現例において、前記結合阻害剤は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１タンパク質又はその断片；及び免疫グロブリン重鎖のＦｃ断片を含む融合タンパク質でありうる。
本発明のさらに他の具現例において、前記融合タンパク質は、配列番号４又は配列番号６のアミノ酸配列からなるものであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記発現抑制剤は、ＣＡＰ１遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合できるアンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム及びＰＮＡからなる群から選ばれる１種以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記発現抑制剤は、配列番号８の塩基配列からなるｓｉＲＮＡであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記発現抑制剤は、配列番号９の塩基配列からなるｓｈＲＮＡであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記心血管代謝疾患は、糖尿病、肥満、脂質異常症、脂肪肝、高血圧、痛風、脳卒中、動脈硬化症、心筋梗塞症、狭心症、末梢血管疾患及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる疾患であってもよいが、これに限定されるものではない。
また、本発明は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９の間の結合阻害剤；（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と配列番号３のアミノ酸配列からなるレジスチン（ｒｅｓｉｓｔｉｎ）の間の結合阻害剤；及び（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤からなる群から選ばれる１種以上を有効成分として含む、抗炎症用薬学的組成物を提供する。
本発明の一具現例において、前記（ｉ）の結合阻害剤は、ＰＣＳＫ９に特異的に結合するタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、基質類似体、アプタマー及び抗体からなる群から選ばれる１種以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の他の具現例において、前記（ｉｉ）の結合阻害剤は、レジスチンに特異的に結合するタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、基質類似体、アプタマー及び抗体からなる群から選ばれる１種以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記（ｉ）又は（ｉｉ）の結合阻害剤は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１タンパク質又はその断片；及び免疫グロブリン重鎖のＦｃ断片を含む融合タンパク質でありうる。
本発明のさらに他の具現例において、前記融合タンパク質は、配列番号４又は配列番号６のアミノ酸配列からなるものであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記（ｉｉｉ）の発現抑制剤は、ＣＡＰ１遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合できるアンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム及びＰＮＡからなる群から選ばれる１種以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の具現例において、前記組成物は、ＮＦ－κＢの活性を抑制することができる。
また、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と；配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９又は配列番号３のアミノ酸配列からなるレジスチンの間の結合レベルを測定する製剤を含む、高コレステロール血症又は心血管代謝疾患の診断用組成物を提供する。
また、本発明は、患者の試料のうち、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と；配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９又は配列番号３のアミノ酸配列からなるレジスチンの間の結合レベルを測定する段階を含む、高コレステロール血症又は心血管代謝疾患の診断方法又はその診断のための情報提供方法を提供する。
本発明の一具現例において、前記患者の試料は、肝組織、肝細胞、血液、血清、血漿、唾液、喀痰及び尿からなる群から選ばれるものであってもよいが、これに限定されるものではない。
また、本発明は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１タンパク質又はその断片；及び配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９タンパク質又はその断片、又は配列番号３のアミノ酸配列からなるレジスチンタンパク質又はその断片；を含む試料に被検物質を処理する段階；（ｂ）前記ＣＡＰ１；及びＰＣＳＫ９タンパク質又はその断片、又はレジスチンタンパク質又はその断片；間の結合レベルを測定する段階；及び（ｃ）前記結合レベルが対照群試料と比較して減少した被検物質を選別する段階を含む、高コレステロール血症又は心血管代謝疾患治療剤のスクリーニング方法を提供する。
本発明の一具現例において、前記（ｂ）段階の結合レベルの測定は、酵母ツーハイブリッド法（Ｙｅａｓｔ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ）、表面プラズモン共鳴法（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＳＰＲ）、免疫沈降法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、放射能免疫分析法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学、ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）及びフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）からなる群から選ばれるいずれか一つを用いて測定するものであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明によれば、ＰＣＳＫ９と直接結合してＬＤＬ受容体の生活周期を調節するＣＡＰ１がＰＣＳＫ９又はレジスチンと結合することを阻害したり、ＣＡＰ１遺伝子の発現を抑制することによって、コレステロール数値を調節することができる。したがって、本発明によるＣＡＰ１とＰＣＳＫ９又はレジスチンの間の結合阻害剤又はＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤などは、血中コレステロールの数値を低減することができ、これによって、血中コレステロールの異常レベルに関連したり、それに因って発病する各種心血管代謝疾患を治療するための組成物として有用に使用でき、また、ＮＦ－κＢの活性化の抑制を通した炎症抑制効果を奏することができる。
図１ａ～図１ｉは、ＣＡＰ１とＰＣＳＫ９が直接相互作用することを示す図である：（図１ａ）Ｃ５７／ＢＬ６野生型マウスの肝溶解物から内因性ＣＡＰ１又はＰＣＳＫ９の免疫沈降反応結果；（図１ｂ）ｍＦｃ－ｈＣＡＰ１及びｈＰＣＳＫ９－Ｈｉｓのファーウェスタンブロット分析結果；（図１ｃ）生細胞でｈＣＡＰ１とｈＰＣＳＫ９の間の相互作用を可視化した二分子蛍光補完分析結果；（図１ｄ）外因性組換えｈＰＣＳＫ９を処理したＨｅｐＧ２細胞でＣＡＰ１及びＰＣＳＫ９の共局在化を確認するための免疫蛍光染色結果（オーバーラップ係数：平均±標準偏差）；（図１ｅ）表面プラズモン共鳴を用いたｒｈＰＣＳＫ９とＣＡＰ１の間の直接結合分析の結果（平衡解離定数：１．０１μＭ）；（図１ｆ）ＨＥＫ２９３細胞でｈＰＣＳＫ９－Ｆｌａｇ及び野生型ＣＡＰ１又は各ＣＡＰ１突然変異体の共免疫沈降反応結果；（図１ｇ）ＨＥＫ２９３細胞でｈＰＣＳＫ９－Ｆｌａｇ及びＣＡＰ１ ＳＨ３ＢＤの共免疫沈降反応結果；（図１ｈ）ＨＥＫ２９３細胞で野生型ＰＣＳＫ９又はＣＲＤ欠失ＰＣＳＫ９突然変異体と野生型ｈＣＡＰ１の共免疫沈降反応結果；（図１ｉ）タンパク質－タンパク質ドッキングシミュレーション及び結合エネルギースコア分析を用いた複合体の３Ｄ分子モデリング。 図２ａ～図２ｃは、ＰＣＳＫ９の機能喪失突然変異体を用いた実験結果を示す図である：（図２ａ）ヒト血漿でＬＤＬコレステロールと関連していると知られた８個のＰＣＳＫ９－ＣＲＤ単一ヌクレオチド変異体に対する概略図；（図２ｂ）ＰＣＳＫ９に対する機能喪失突然変異体とＣＡＰ１の間の結合親和性実験結果；（図２ｃ）ＢＬＩｔｚシステムを使用したＰＣＳＫ９野生型及びその突然変異体とＣＡＰ１の相互作用に対する直接結合分析結果。 図３ａ～図３ｊは、ＣＡＰ１がＰＣＳＫ９によるＬＤＬ受容体の分解に必須であることを示す図である：（図３ａ）ＰＣＳＫ９によって誘導されたＬＤＬ受容体の分解がＣＡＰ１ ｓｉＲＮＡによって弱まることを示す図；（図３ｂ）ＣＡＰ１ ｓｉＲＮＡを処理したＨｅｐＧ２細胞でＨｉｓ－ｒｈＰＣＳＫ９を処理した後、ＬＤＬ受容体、ＰＣＳＫ９及びＣＡＰ１の分布を示す図；（図３ｃ）ＣＡＰ１欠損細胞で野生型ＣＡＰ１及びそれぞれの突然変異体の発現によってＬＤＬ受容体の分解程度を測定した結果；（図３ｄ）ＣＡＰ１＋／－マウスの各臓器別ＣＡＰ１発現量を比較した図；（図３ｅ）ＣＡＰ１＋／＋及びＣＡＰ１＋／－マウスでＬＤＬ受容体の発現レベルを比較した図；（図３ｆ）１６週間高脂肪食又は通常食を摂取したＣＡＰ１＋／－及びＣＡＰ＋／＋マウスで血漿コレステロール数値を測定した図；（図３ｇ）高脂肪食を供給したＣＡＰ＋／＋及びＣＡＰ＋／－マウスでプールされた血漿サンプルからＦＰＬＣ分画のコレステロールのレベルを示す図；（図３ｈ）ＣＡＰ１＋／－及びＣＡＰ１＋／＋マウスの肝でＰＣＳＫ９によって誘導されたＬＤＬ受容体の分解に対するウェスタンブロット分析結果（Ｐ、ｐｒｏ－ＰＣＳＫ９；Ｍ、ｍａｔｕｒｅ ＰＣＳＫ９）；（図３ｉ）ＥＬＩＳＡによって測定した血漿ｈＰＣＳＫ９のレベル；（図３ｊ）ＰＣＳＫ９を過発現させるか、過発現させないＣＡＰ１＋／－及びＣＡＰ１＋／＋マウスでの血漿コレステロールのレベル分析結果。 図４ａ～図４ｓは、ＣＡＰ１がＬＤＬ受容体のカベオリン依存性エンドサイトーシス及びリソソーム分解を媒介することを示す図である：（図４ａ～図４ｃ）ＨｅｐＧ２細胞に組換えｈＰＣＳＫ９を処理した後、ＬＤＬ受容体（緑色）、ＰＣＳＫ９（赤色）及びエンドソームマーカーＥＥＡ１又はリソソームマーカーＬＡＭＰ２（白色）で一連の免疫蛍光染色を行った結果；（図４ｄ）ＨｅｐＧ２細胞に組換えｈＰＣＳＫ９を処理して２４０分が経過した後、ＬＤＬ受容体（緑色）、ＰＣＳＫ９（赤色）及びリソソームマーカーＬＡＭＰ２（白色）で免疫蛍光染色を行った結果；（図４ｅ）ＣＡＰ１ ｓｉＲＮＡを処理したＨｅｐＧ２細胞にＰＣＳＫ９処理後、ＬＤＬ受容体、ＰＣＳＫ９及びＣＡＰ１の細胞分布を示す細胞膜分画化及びウェスタンブロット分析結果；（図４ｆ）図４ｅのウェスタンブロット結果を定量したグラフ；（図４ｇ）ＨｅｐＧ２細胞で組換えｈＰＣＳＫ９処理３０分後、ＬＤＬ受容体（緑色）とカベオリン１（上図で赤色）又はクラスリン（下図で赤色）の間の共局在化を比較した図；（図４ｈ及び図４ｉ）ＨｅｐＧ２細胞で組換えヒトＰＣＳＫ９を３０分間処理した後、クラスリン又はカベオリン－１とエンドソームマーカーＥＥＡ１の共局在化を示す図；（図４ｊ及び図４ｋ）ＨｅｐＧ２細胞でカベオリン又はクラスリンをノックダウンした場合、ＰＣＳＫ９によって誘導されたＬＤＬ受容体の分解に及ぼす影響を示す図；（図４ｌ）ＣＡＰ１、カベオリン－１又はクラスリンに対するｓｉＲＮＡを前処理したＨｅｐＧ２細胞でｈＰＣＳＫ９処理２４０分後、ＬＤＬ受容体（緑色）及びリソソームマーカーＬＡＭＰ２（赤色）で免疫蛍光染色を行った結果；（図４ｍ）ＨｅｐＧ２細胞でＥＧＦ（赤色）及びアルブミン（緑色）を免疫蛍光染色した図（ｓｃａｌｅ ｂａｒ、１０μｍ）；（図４ｎ）ＰＣＳＫ９過発現によって誘導されたＬＤＬ受容体の分解においてＣＡＰ１、カベオリン－１又はクラスリンのノックダウンによる影響を示す図；（図４ｏ）ＨｅｐＧ２細胞でＰＣＳＫ９処理１５分後、ＣＡＰ１ ｓｉＲＮＡ処理による透過電子顕微鏡イメージ（ｓｃａｌｅ ｂａｒ、０．５μｍ）；（図４ｐ）ＣＡＰ１とカベオリン－１の結合においてＳＨ３ＢＤが重要であることを示す図；（図４ｑ）野生型マウスの肝溶解物でカベオリン－１、ＬＤＬ受容体、ＣＡＰ１及びＰＣＳＫ９に対する免疫沈降分析結果；（図４ｒ）ＨｅｐＧ２細胞でＬＤＬコレステロールの処理４時間後、Ｒａｂ１１（赤色）、ＬＤＬ受容体（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）で免疫蛍光染色を行った結果；（図４ｓ）ＬＤＬ受容体がカベオラ依存性エンドサイトーシス及びＰＣＳＫ９によって誘導されたリソソーム分解を経る概略図。 図５ａ及び図５ｂは、ｍＦＣ－ＣＡＰ１が末梢血液単核球でＮＦ－κｐ６５サブユニットの活性化を抑制できることを示す図である：（図５ａ）組換えヒトレジスチン（ｒｈＲｅｓｉｓｔｉｎ）及び／又は濃度別ｍＦｃ－ＣＡＰ１の処理によるｐ６５のリン酸化の様相を確認したウェスタンブロット写真；（図５ｂ）ＰＣＳＫ９及び／又は濃度別ｍＦｃ－ＣＡＰ１の処理によるｐ６５のリン酸化の様相を確認したウェスタンブロット写真。 図６ａ～図６ｆは、ｍＦｃ－ＣＡＰ１が肝細胞でＬＤＬ受容体の保護効果、ＡＭＰＫ経路の活性化及びＮＦ－κの抑制効果があることを示す図である：（図６ａ）組換えヒトＰＳＣＫ９（ｒｈＰＣＳＫ９）及び／又は濃度別（０．１、１μｇ／ｍｌ）ｍＦｃ－ＣＡＰ１の処理によるＬＤＬ受容体の発現レベル、ｐＡＭＰＫ及びｐＡＣＣレベルを確認したウェスタンブロット写真（左）及びこれをそれぞれＧＡＰＤＨで定量化したグラフ（右）；（図６ｂ）ｒｈＰＣＳＫ９及び／又は濃度別（０．０１、０．１、１μｇ／ｍｌ）ｍＦｃ－ＣＡＰ１の処理によるＬＤＬ受容体の発現レベルを確認したウェスタンブロット写真（左）及びこれを定量化したグラフ（右）；（図６ｃ）ｒｈＲｅｓｉｓｔｉｎ及び／又は濃度別（５０、１５０、５００ｎｇ／ｍｌ）ｍＦｃ－ＣＡＰ１の処理によるＬＤＬ受容体の発現レベル、ｐ－ｐ６５及びｐＡＭＰＫのレベルを確認したウェスタンブロット写真（左）及びこれをそれぞれＧＡＰＤＨで定量化したグラフ（右）；（図６ｄ）ｒｈＲｅｓｉｓｔｉｎ及び／又は濃度別（１０、５０、５００ｎｇ／ｍｌ）ｍＦｃ－ＣＡＰ１の処理によるＬＤＬ受容体の発現レベルを確認したウェスタンブロット写真（左）及びこれを定量化したグラフ（右）；（図６ｅ）ＡＭＰＫをＡＩＣＡＲで刺激した後、ｒｈＲｅｓｉｓｔｉｎ及び／又は濃度別（５０、５００ｎｇ／ｍｌ）ｍＦｃ－ＣＡＰ１の処理によるｐＡＭＰＫ及びＬＤＬ受容体の発現レベルを確認したウェスタンブロット写真（左）及びこれをＧＡＰＤＨで定量化したグラフ；（図６ｆ）ｒｈＲｅｓｉｓｔｉｎ及び／又は濃度別（５０、１５０、５００ｎｇ／ｍｌ）ｍＦｃ－ＣＡＰ１の処理によるＬＤＬ受容体の発現レベルを確認したウェスタンブロット写真（左）及びこれを定量化したグラフ（右）。 図７は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）でｓｈＲＮＡを用いたＣＡＰ１遺伝子のノックダウン（ｋｎｏｃｋ－ｄｏｗｎ）によるＬＤＬコレステロールの吸収変化を確認した蛍光顕微鏡イメージ（上図）及び比較グラフ（下図）である。
本発明者らは、ＣＡＰ１をＰＣＳＫ９の新しい結合パートナーとして確認することによって、ＰＣＳＫ９によるＬＤＬ受容体のエンドサイトーシスに対する理解を広げた。
まず、本発明の一実施例では、ＣＡＰ１のＳＨ３ＢＤ（Ｓｒｃ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ３ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ）がＰＣＳＫ９のＣＲＤ（ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｒｉｃｈ ｄｏｍａｉｎ）と直接結合することを示した（実施例１参照）。
本発明の他の実施例では、ヒトＰＣＳＫ９で発見された二つの機能損失多型性（ｌｏｓｓ－ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）は、ＣＡＰ１との相互作用にあたって欠陥が存在することを確認した（実施例２参照）。
本発明のさらに他の実施例では、肝細胞でＣＡＰ1に対するｓｉＲＮＡだけでなく、血漿ＬＤＬコレステロールのレベルが低い異型接合ＣＡＰ１ノックアウトマウスでＰＣＳＫ９媒介性ＬＤＬ受容体の分解が防止されることを確認した（実施例３参照）。
本発明のさらに他の実施例では、ＣＡＰ１がカベオリン－１に結合し、次いで、ＰＣＳＫ９－ＬＤＬ受容体複合体をカベオラ依存性エンドサイトーシス及びリソソーム性分解に導くことを証明した（実施例４参照）。
本発明のさらに他の実施例では、ＣＡＰ１の競合的阻害剤としてｍＦｃ－ＣＡＰ１を製造し（実施例５参照）、これを末梢血液単核球及び肝細胞に処理して、ＬＤＬ受容体に対する保護効果及び体内ほぼすべての炎症反応の調節に関連したＮＦ－κＢの抑制効果を確認した（実施例６及び７参照）。
本発明のさらに他の実施例では、ＣＡＰ１をノックダウンしてその発現を抑制した場合、ＬＤＬコレステロールに対する吸収が抑制されることを確認した（実施例８参照）。
これによって、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１（Ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）と配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９（ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ ｔｙｐｅ－９）の間の結合阻害剤を有効成分として含む、血中コレステロール低下用薬学的組成物を提供する。
本明細書において使用される用語「ＣＡＰ１」は、「Ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ １」を意味するものであり、構造的、機能的な点から、三つのドメインに分けられる。第一に、高く保存されたカルボキシル末端ドメインは、単量体のアクチンと結合し、一般的な細胞形態学に必須である。第二に、ＣＡＰ１のアミノ末端ドメインは、酵母でアデニリルシクラーゼ（ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ）と相互作用する。第三に、中央に位置するプロリンリッチドメイン（ｐｒｏｌｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｄｏｍａｉｎ）は、特定タンパク質のＳＨ３（Ｓｒｃ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ３）ドメインと相互作用する。本発明によるＣＡＰ１は、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むか、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるか、配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなってもよい。例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。アミノ酸配列に対する「配列相同性の％」とは、二つの最適に配列された配列と比較領域を比較することによって確認され、比較領域でのアミノ酸配列の一部は、二つの配列の最適配列に対する参考配列（追加又は削除を含まない）に比べて追加又は削除（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。
本明細書において使用される用語「ＰＣＳＫ９」は、「ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ ｔｙｐｅ－９」を意味するものであり、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子は、染色体１ｐ３２．３上に位置し、２５，３７８ｂｐの長さを有する。これは、６９２個のアミノ酸をコードする１２個のエクソンを含有する。ＰＣＳＫ９タンパク質は、シグナルペプチド、プロドメイン、触媒ドメイン、及び３個のモジュール（Ｍ１、Ｍ２及びＭ３）で構成されたＣ末端システイン－ヒスチジンリッチドメインを含有する。本発明によるＰＣＳＫ９は、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むか、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるか、配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなってもよい。例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。アミノ酸配列に対する「配列相同性の％」の意味は前述した通りである。
本発明において、前記結合阻害剤は、ＣＡＰ１又はＰＣＳＫ９に特異的に結合するタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、基質類似体、アプタマー及び抗体からなる群から選ばれる１種以上であってもよいが、ＣＡＰ１又はＰＣＳＫ９に結合して、これらの相互作用を妨害できるすべての物質は、本発明の範囲に含まれる。
本明細書において使用される用語「ペプチド模倣体（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」は、ＣＡＰ１又はＰＣＳＫ９の結合ドメインに結合してＣＡＰ１とＰＣＳＫ９の間の結合を阻害するものである。ペプチド模倣体は、ペプチド又は非ペプチドであってもよく、ｐｓｉ結合のような、非ペプチド結合によって結合したアミノ酸で構成されることができる。また、構造的に制限された（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ペプチド、サイクリック模倣体（ｃｙｃｌｉｃ ｍｉｍｅｔｉｃｓ）、少なくとも一つのエキソサイクリックドメイン（ｅｘｏｃｙｃｌｉｃ ｄｏｍａｉｎ）、結合部分（結合アミノ酸）及び活性部位を含むサイクリック模倣体でありうる。ペプチド模倣体は、ＣＡＰ１又はＰＣＳＫ９タンパク質の二次構造特性と類似に構造化され、抗体又は水溶性受容体のような巨大な分子の抑制特性を模倣することができ、天然の拮抗剤と同等な効果で作用できる新規の小分子でありうる。
本明細書において使用される用語「抗体」は、タンパク質又はペプチド分子の抗原性部位に特異的に結合できるタンパク質性分子を意味するが、このような抗体は、各遺伝子を通常の方法によって発現ベクターにクローニングして前記マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質を得て、得られたタンパク質から通常の方法によって製造されることができる。
本明細書において使用される用語「アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）」は、所定の標的分子に対する結合活性を有する核酸分子を意味する。前記アプタマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）核酸又はこれらの混合物であってもよく、直鎖状又は環状の形態であってもよいが、概して前記アプタマーを構成するヌクレオチドの配列が短いほど化学合成及び大量生産がさらに容易であり、費用の面で優れているという長所があり、化学修飾が容易であり、生体内安定性に優れ、毒性が低いことが知られている。
本発明において、前記結合阻害剤は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１タンパク質又はその断片；及び免疫グロブリン重鎖のＦｃ断片を含む融合タンパク質でありうる。前記ＣＡＰ１タンパク質は、ＰＣＳＫ９と特異的に結合できる程度の断片、例えば、配列番号２で表されるＰＣＫＳ９の４２１番目のアミノ酸から６２９番目のアミノ酸部分に該当するシステインリッチドメイン（ｃｙｓｔｅｉｎ－ｒｉｃｈ ｄｏｍａｉｎ）に特異的に結合できる程度の断片であってもよく、前記断片は、ＣＡＰ１タンパク質のＳＨ３結合ドメイン全部又は一部を含むポリペプチドであってもよく、前記ポリペプチドの長さには制限がない。
前記Ｆｃ断片は、ヒトを含む哺乳類、例えば、サル、オランウータン、チンパンジー、マウス、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマなどの免疫グロブリン重鎖に由来するものであってもよく、好ましくは、ヒト又はマウスの免疫グロブリン重鎖に由来するものであってもよいが、これに限定されるものではない。前記Ｆｃ断片の配列は、本発明の技術分野における通常の知識を有する者が、体内ＣＡＰ１がＰＣＳＫ９又はレジスチンと結合することを阻害し、前記体内ＣＡＰ１の代わりにＰＣＳＫ９又はレジスチンと結合してこれらによって調節されるＬＤＬ受容体の分解を阻害するための目的を達成できる限度内で当該配列を適切に変形／修正して使用することができる。
また、前記Ｆｃ断片は、ＣＡＰ１タンパク質のＮ末端部分又は好ましくはＣ末端部分に結合されることができ、直接結合されるか、本発明の技術分野において広く知られたペプチドリンカー又はヒンジ（ｈｉｎｇｅ）を通じて間接的に連結されることができる。
また、本発明において前記融合タンパク質は、ヒト免疫グロブリン重鎖のＦｃ断片又はマウス免疫グロブリン重鎖のＦｃ断片がそれぞれ融合したＣＡＰ１タンパク質でありうる。この際、ヒト免疫グロブリン重鎖のＦｃ断片が融合したＣＡＰ１タンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列からなるか、配列番号５の塩基配列によってコード化されるものであってもよい。また、マウス免疫グロブリン重鎖のＦｃ断片が融合したＣＡＰ１タンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列からなるか、配列番号７の塩基配列によってコード化されるものであってもよい。前記融合タンパク質は、配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列の機能的同等物も、本発明の権利範囲に含まれ、前記機能的同等物とは、アミノ酸の付加、置換、又は欠失の結果、前記アミノ酸配列と少なくとも６０％以上、好ましくは、７０％以上、より好ましくは、８０％以上、最も好ましくは、９０％以上の配列相同性を有するものであり、前記配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を示すポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）を意味し、ＰＣＳＫ９に特異的に結合できるアミノ酸配列であれば、これに限定されない。
本発明者らは、ヒトＣＡＰ１タンパク質に免疫グロブリン重鎖のＦｃ断片がコンジュゲートされた融合タンパク質（Ｆｃ－ＣＡＰ１）を製造し、そのＬＤＬ受容体の保護効果を直接観察し、これによって、前記Ｆｃ－ＣＡＰ１は、血中ＬＤＬコレステロール数値を低下させることができることを確認した。
本発明において、前記結合阻害剤は、ＣＡＰ１のＳＨ３（Ｓｒｃ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ３）結合ドメイン及びＰＣＳＫ９のシステインリッチドメイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｒｉｃｈ ｄｏｍａｉｎ；ＣＲＤ）からなる群から選ばれる一つ以上のドメインに結合するものであってもよい。
この際、前記結合阻害剤が相互作用するＣＡＰ１のＳＨ３結合ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列からなるものであってもよいが、これに限定されるものではなく、例えば、前記アミノ酸配列は、ＳＨ３結合ドメインのＡｓｐ３４Ｂアミノ酸を含む、長さ３～２５０、３～２００、３～１５０、３～１００、３～５０、３～２５、３～１０、３～７又は３～５のアミノ酸部位に特異的に結合するものであってもよい。
本発明において、前記結合阻害剤は、ＣＡＰ１のＳＨ３結合ドメインに存在するＡｓｐ３４Ｂを含む部位に特異的に結合するものであってもよい。例えば、ＣＡＰ１のＳＨ３結合ドメイン内にＡｓｐ３４Ｂを含む部位に特異的に結合してＰＣＳＫ９との結合を阻害するものであってもよい。
また、本発明において、前記ＰＣＳＫ９のＣＲＤは、配列番号１１のアミノ酸配列からなるものであってもよい。前記ＣＲＤは、配列番号１２のアミノ酸配列からなるＭ１ドメイン又は配列番号１３のアミノ酸配列からなるＭ３ドメインを含む。
また、本発明において、前記結合阻害剤は、ＰＣＳＫ９のＭ１ドメインに存在する４９４番リシン（ｌｙｓｉｎｅ）を含む部位に特異的に結合するものであってもよい。例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列の４９４番目のアミノ酸を含む部位に特異的に結合してＰＣＳＫ９との結合を阻害するものであってもよい。
この際、前記結合阻害剤が結合するＰＣＳＫ９のＭ１ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を含んでもよいが、これに限定されるものではなく、例えば、前記アミノ酸配列の４２番目のアミノ酸（又は、配列番号２で表されるアミノ酸配列の４９４番目のアミノ酸）を含む、長さ３～７０、３～６０、３～５０、３～４０、３～３０、３～２５、３～２０、３～１５、３～１０、３～７又は３～５のアミノ酸部位に特異的に結合するものであってもよい。
また、本発明において、前記結合阻害剤は、ＰＣＳＫ９のＭ３ドメインに存在する６５９番アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）を含む部位に特異的に結合するものであってもよい。例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列の６５９番目のアミノ酸を含む部位に特異的に結合してＰＣＳＫ９との結合を阻害するものであってもよい。
この際、前記結合阻害剤が結合するＰＣＳＫ９のＭ３ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含んでもよいが、これに限定されるものではなく、例えば、前記アミノ酸配列の５６番目のアミノ酸（又は、配列番号２で表されるアミノ酸配列の６５９番目のアミノ酸）を含む、長さ３～８５、３～７５、３～６５、３～５５、３～４５、３～３５、３～２５、３～２０、３～１５、３～１０、３～７又は３～５のアミノ酸部位に特異的に結合するものであってもよい。
本発明の他の様態として、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤を有効成分として含む、血中コレステロール低下用薬学的組成を提供する。
本発明のさらに他の様態として、本発明は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９の間の結合阻害剤；（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤；又は（ｉｉｉ）前記（ｉ）及び（ｉｉ）の混合物を含む、血中コレステロール低下用健康機能食品組成物を提供する。
本発明において、前記ＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤は、ＣＡＰ１遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合できるアンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム及びＰＮＡからなる群から選ばれる１種以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、「発現抑制」は、ＣＡＰ１遺伝子の転写抑制及びタンパク質への翻訳抑制を含む意味である。また、遺伝子の発現が完全に停止したものだけでなく、発現が減少したものを含む。
本明細書において使用される用語「ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ」は、ＲＮＡ妨害又は遺伝子サイレンシング（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）を媒介するために、主に目的遺伝子から転写したｍＲＮＡに結合して、前記ｍＲＮＡの翻訳を阻害する核酸分子を意味する。前記ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、標的遺伝子の発現を翻訳レベルで抑制できるので、効率的な遺伝子ノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）方法又は遺伝子治療方法に使用できる。
本明細書において使用される用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、特定ｍＲＮＡの配列に相補的な核酸配列を含有しているＤＮＡ又はＲＮＡ又はこれらの誘導体を意味するが、ｍＲＮＡ内の相補的な配列に結合してｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害する効果を示すことができる。
本明細書において使用される用語「リボザイム」は、標的ＲＮＡ分子内特定ヌクレオチド配列を認識して部位特異的に切断させることによって、標的遺伝子のタンパク質発現を抑制することができる。
本明細書において使用される用語「ＰＮＡ」は、核酸模倣体、例えば、ＤＮＡ模倣体を意味し、ここで、デオキシリボースホスフェートバックボーンは、擬ペプチドバックボーンに置換され、単に元々４個のヌクレオ塩基が維持される。ＰＮＡの中性のバックボーンは、低いイオン性強度の条件下にＤＮＡ及びＲＮＡに特異的なハイブリッドを提供することが知られており、転写又は翻訳抑制を誘導したり複製を抑制して、遺伝子発現の配列特異的調節に対するアンチセンス又は抗原製剤として使用できる。
本発明において、前記発現抑制剤は、配列番号８の塩基配列からなるｓｉＲＮＡ、配列番号９の塩基配列からなるｓｈＲＮＡ、又はこれらの混合物であってもよいが、前記ｓｉＲＮＡ配列又はｓｈＲＮＡ配列は、本発明の技術分野における通常の知識を有する者がＣＡＰ１遺伝子の発現抑制（又はノックダウン）目的を達成できる限度内で適切に変形／修正して使用できる。
本発明において、前記コレステロールは、ＬＤＬコレステロールであってもよいが、これに限定されるものではない。例えば、ＬＤＬコレステロールを含む総コレステロールでありうる。
本発明において、前記組成物は、ＬＤＬ（Ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）受容体の分解を抑制するものであってもよい。ＣＡＰ１の発現又は活性を抑制すると、ＰＣＳＫ９によるＬＤＬ受容体の分解が抑制され、これによる結果として、血中ＬＤＬコレステロール数値を低減する効果がある。
本発明の他の様態として、本発明は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９の間の結合阻害剤；（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤；又は（ｉｉｉ）前記（ｉ）及び（ｉｉ）の混合物を含む、心血管代謝疾患の予防又は治療用薬学的組成物又は心血管代謝疾患の予防又は改善用健康機能食品組成物を提供する。
本発明において、前記結合阻害剤は、ＣＡＰ１又はＰＣＳＫ９に特異的に結合するタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、基質類似体、アプタマー及び抗体からなる群から選ばれる１種以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記結合阻害剤は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１タンパク質又はその断片；及び免疫グロブリン重鎖のＦｃ断片を含む融合タンパク質でありうる。前記融合タンパク質に対する事項は、前述した通りである。
また、本発明において前記発現抑制剤は、ＣＡＰ１遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合できるアンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム及びＰＮＡからなる群から選ばれる１種以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記発現抑制剤は、配列番号８の塩基配列からなるｓｉＲＮＡ、配列番号９の塩基配列からなるｓｈＲＮＡ、又はこれらの混合物であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記心血管代謝疾患は、糖尿病、肥満、脂質異常症、脂肪肝、高血圧、痛風、脳卒中、動脈硬化症、心筋梗塞症、狭心症、末梢血管疾患及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる疾患であってもよいが、血中コレステロール数値の異常又はそれに因って発生する病症であれば、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の様態として、本発明は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９の間の結合阻害剤；（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と配列番号３のアミノ酸配列からなるレジスチン（ｒｅｓｉｓｔｉｎ）の間の結合阻害剤；及び（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤からなる群から選ばれる１種以上を有効成分として含む、抗炎症用薬学的組成物を提供する。
本発明において、前記（ｉ）の結合阻害剤は、ＰＣＳＫ９に特異的に結合するタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、基質類似体、アプタマー及び抗体からなる群から選ばれる１種以上であってもよく、前記（ｉｉ）の結合阻害剤は、レジスチンに特異的に結合するタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、基質類似体、アプタマー及び抗体からなる群から選ばれる１種以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記（ｉ）又は（ｉｉ）の結合阻害剤は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１タンパク質又はその断片；及び免疫グロブリン重鎖のＦｃ断片を含む融合タンパク質でありうる。前記融合タンパク質は、配列番号４又は配列番号６のアミノ酸配列からなるものであってもよいが、これに限定されるものではない。
また、本発明において前記（ｉｉｉ）の発現抑制剤は、ＣＡＰ１遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合できるアンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム及びＰＮＡからなる群から選ばれる１種以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記組成物は、ＮＦ－κＢの活性を抑制することができる。
一方、本発明による薬学的組成物は、有効成分以外に、薬学的組成物として製造するために通常使用する適切な担体、賦形剤及び／又は希釈剤をさらに含んでもよい。また、通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態に剤形化して使用することができる。
前記組成物に含まれ得る担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、タルク、マグネシウム、ステアレート、及び鉱物油などがある。前記組成物を製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を使用して調製することができる。
本発明による薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与される。本発明において、「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスクの割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する感度、投与時間、投与経路及び排出率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素及びその他医学分野によく知られた要素によって決定されることができる。
上記した要素を全部考慮して副作用なしに最小限の量で最大効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは、当業者によって決定されることができる。具体的に、本発明による薬学的組成物の有効量は、患者の年齢、性別、状態、体重、体内での活性成分の吸収度、不活性率及び***速度、疾患の種類、併用される薬物によって変わることができる。
本発明の薬学的組成物は、個体に多様な経路で投与されることができる。例えば、経口投与、鼻腔内投与、経気管支投与、動脈注射、静脈注射、皮下注射、筋肉注射又は腹腔内注射によって投与されることができる。一日投与量は、一日に一回～数回に分けて投与することができる。
本明細書において使用される用語「個体」とは、疾患の予防、治療、治療増進又は耐性抑制を必要とする対象を意味する。例えば、前記個体は、ヒト、又は非ヒトである霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ及びウシを含む哺乳類でありうる。
本発明において、「予防」とは、目的とする疾患の発病を抑制したり遅延させるすべての行為を意味し、「治療」とは、本発明による薬学的組成物の投与によって目的とする疾患とそれによる代謝異常症状が好転したり有益に変更されるすべての行為を意味し、「改善」とは、本発明による組成物の投与によって目的とする疾患に関連したパラメーター、例えば症状の程度を減少させるすべての行為を意味する。
本発明において、本発明による組成物は、食品組成物として製造されることができ、食品組成物は、有効成分を食品にそのまま添加したり、他の食品又は食品成分と共に使用でき、通常の方法によって適切に使用できる。有効成分の混合量は、その使用目的（予防又は改善用）によって好適に決定されることができる。
前記食品組成物は、指示された割合で必須成分として前記有効成分を含有すること以外に、他の成分は特に限定されず、通常の飲料のように、様々な香味剤又は天然炭水化物などをさらなる成分として含有することができる。上述した天然炭水化物の例は、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖など；ジサッカライド、例えばマルトース、スクロースなど；及びポリサッカライド、例えば、デキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。上述したもの以外の香味剤として、天然香味剤（ソーマチン、ステビア抽出物、例えば、レバウディオサイドＡ、グリチルリチンなど）及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を有利に使用できる。前記天然炭水化物の割合は、当業者の選択によって適切に決定されることができる。
上記のほか、本発明の食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、ミネラル（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有することができる。このような成分は、独立して、又は組み合わせて使用できる。また、このような添加剤の比率は、当業者によって適切に選択できる。
本発明の食品組成物には、健康機能食品が含まれ得る。
本明細書において使用される用語「健康機能食品」とは、人体に有用な機能性を有する原料や成分を使用して錠剤、カプセル、粉末、顆粒、液状及び丸薬などの形態で製造及び加工した食品をいう。ここで、機能性とは、人体の構造及び機能に対して栄養素を調節したり、生理学的作用などのような保健用途に有用な効果を得ることを意味する。本発明の健康機能食品は、当業界において通常使用される方法によって製造可能であり、前記製造時には、当業界で通常添加する原料及び成分を添加して製造することができる。また、一般薬品とは異なって、食品を原料として薬品の長期服用時に発生しうる副作用などがない長所があり、携帯性に優れていて、本発明の健康機能食品は、抗代謝性疾患効果を増進させるための補助剤として摂取が可能である。
本発明の健康機能食品は、ＣＡＰ１とＰＣＳＫ９又はレジスチンの間の結合阻害剤又はＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤を含み、かつ、適切な食品補助剤をさらに含んでもよい。
本発明のさらに他の様態として、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と；配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９又は配列番号４のアミノ酸配列からなるレジスチンの間の結合レベルを測定する製剤を含む、高コレステロール血症又は心血管代謝疾患の診断用組成物を提供する。本明細書では、ＣＡＰ１とＰＣＳＫ９の結合が増加すると、ＬＤＬ受容体の分解が増加して、血中コレステロールの濃度が高まったり、反対に、Ｆｃ－ＣＡＰ１によってＣＡＰ１とレジスチンの結合が妨害される場合、ＬＤＬ受容体の分解が減少して、血中コレステロールの濃度が減少することを確認したところ、ＣＡＰ１とＰＣＳＫ９の結合レベル、又はＣＡＰ１とレジスチンの結合レベルを測定したとき、正常対照群と比較してさらに高い結合レベルを示した場合、高コレステロール血症又は心血管代謝疾患があると診断することができる。
本発明のさらに他の様態として、本発明は、患者の試料のうち、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と；配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９又は配列番号３のアミノ酸配列からなるレジスチンの間の結合レベルを測定する段階を含む、高コレステロール血症又は心血管代謝疾患の診断方法又は診断のための情報提供方法を提供する。
本発明において、前記患者の試料は、肝組織、肝細胞、血液、血清、血漿、唾液、喀痰及び尿からなる群から選ばれるものであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の様態として、本発明は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１タンパク質又はその断片；及び配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９タンパク質又はその断片、又は配列番号３のアミノ酸配列からなるレジスチンタンパク質又はその断片；を含む試料に被検物質を処理する段階；（ｂ）前記ＣＡＰ１；及びＰＣＳＫ９タンパク質又はその断片、又はレジスチンタンパク質又はその断片；間の結合レベルを測定する段階；及び（ｃ）前記結合レベルが対照群試料と比較して減少した被検物質を選別する段階を含む高コレステロール血症又は心血管代謝疾患治療剤のスクリーニング方法を提供する。
本発明において、前記（ｂ）段階の結合レベルの測定は、酵母ツーハイブリッド法（Ｙｅａｓｔ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ）、表面プラズモン共鳴法（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＳＰＲ）、免疫沈降法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、放射能免疫分析法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学、ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）及びフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）からなる群から選ばれるいずれか一つを用いて測定するものであってもよいが、ＣＡＰ１とＰＣＳＫ９の結合レベルを測定できるものであれば、これに限定されるものではない。
本明細書及び請求範囲に使用された用語や単語は、通常的又は事前的な意味に限定して解されるべきものではなく、発明者は、自分の発明を最も最善の方法で説明するために用語の概念を適切に定義することができるという原則に基づいて本発明の技術的思想に符合する意味と概念として解されなければならない。
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものであり、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
［実施例１．ＣＡＰ１はＰＣＳＫ９のＣＲＤ（ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｒｉｃｈ ｄｏｍａｉｎ）に直接結合する］
マウス肝組織で免疫沈降法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を用いてＣＡＰ１及びＰＣＳＫ９の間の物理的相互作用を確認した（図１ａ）。ファーウェスタンブロット（ｆａｒ－ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）分析のために、非還元条件下に精製されたｍＦｃ－ＣＡＰ１又はＨｉｓ－ＰＣＳＫ９をプレイ（ｐｒｅｙ）として使用し、それぞれに対するベイト（ｂａｉｔ）としてＨｉｓ－ＰＣＳＫ９又はｍＦｃ－ＣＡＰ１を使用した（図１ｂ）。生細胞で上記のような相互作用を可視化するために、各断片に融合したタンパク質間相互作用によって一緒に集まる蛍光タンパク質の二つの非蛍光断片の間の相補性に基づく二分子蛍光補完分析（Ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）を行った。これを通じて、ｈＣＡＰ１とｈＰＣＳＫ９の間の直接的な結合を明確に可視化した。図１ｃに示されたように、ＣＡＰ１及びＰＣＳＫ９がそれぞれの断片（ｐＶＣ１５５及びｐＶＮ１７３）に融合し、両方とも発現するとき、緑色蛍光が観察された（左パネル）。しかしながら、ヒトＣＡＰ１又はＰＣＳＫ９が単独で発現するとき、蛍光は検出されなかった（それぞれ中間及び右パネル）。
また、免疫蛍光染色（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を通じてＨｅｐＧ２細胞に組換えＰＣＳＫ９を処理した場合、細胞膜と細胞質基質（ｃｙｔｏｓｏｌ）でＰＣＳＫ９がＣＡＰ１及びＬＤＬ受容体とともに局在化されることを立証した（図１ｄ）。最後に、表面プラズモン共鳴法（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）ベースのシステムを利用して直接結合分析を行った結果、ＰＣＳＫ９の用量依存的にＣＡＰ１とＰＣＳＫ９の間の反応単位（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｎｉｔ）が増加することを確認した（図１ｅ）。
さらに、本発明者らは、ＰＣＳＫ９のＣＲＤがＣＡＰ１のＳＨ３ＢＤ（Ｓｒｃ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ３ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ）と結合するかどうかについてテストした。このために、ｗｔＰＣＳＫ９－Ｆｌａｇと下記のＣＡＰ１突然変異体を使用した試験管内共免疫沈降分析を行った：アデニリルシクラーゼ結合ドメイン欠失（ΔＡＣＢＤ）突然変異体、アクチン結合ドメイン欠失（ΔＡｃｔｉｎＢＤ）突然変異体及びＳＨ３ＢＤとＡｃｔｉｎＢＤ欠失（ΔＳＨ３ＢＤ ΔＡｃｔｉｎＢＤ）突然変異体。
その結果、図１ｆに示されたように、ＰＣＳＫ９は、ｗｔＣＡＰ１、ΔＡＣＢＤ突然変異体及びΔＡｃｔｉｎＢＤ突然変異体と相互作用したが、ΔＳＨ３ＢＤ ΔＡｃｔｉｎＢＤ突然変異体とは相互作用せず、これは、ＣＡＰ１がＳＨ３ＢＤを通じてＰＣＳＫ９に結合することを示唆する。また、図１ｇに示されたように、ＣＡＰ１のＳＨ３ＢＤは、ＰＣＳＫ９との相互作用に十分であることを確認した。ＣＡＰ１は、ｗｔＰＣＳＫ９とは結合したが、ＣＲＤ欠失ＰＣＳＫ９とはそうでなかった（図１ｈ）。
さらに、図１ｉに示されたように、タンパク質－タンパク質ドッキングシミュレーション及び結合エネルギースコア分析を用いた複合体の３Ｄ分子モデリング分析を通じてＣＡＰ１のＳＨ３ＢＤに存在するＡｓｐ３４ＢとＰＣＳＫ９－ＣＲＤのＭ１ドメインに存在するＬｙｓ４９４及びＭ３ドメインに存在するＡｒｇ６５９の間の相互作用が重要であることを確認した。
［実施例２．ＰＣＳＫ９機能損失突然変異体はＣＡＰ１と相互作用できない］
本発明者らは、ヒト遺伝子研究で発見されたよく知られた機能損失及び機能獲得変異を含むＰＣＳＫ９－ＣＲＤの部位特異的突然変異誘導（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって８個のＰＣＳＫ９点突然変異体（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｎｔｓ）を生成した（図２ａ；矢印は点突然変異の誘発地点）。ＨｅｐＧ２細胞でＰＣＳＫ９のＱ５４４Ｅ及びＨ６８３ｆｓ突然変異体は発現せず、これは、これらの突然変異体がタンパク質の発現又は安定性と関連があることを示唆する。
これとは対照的に、図２ｂに示されたように、ＰＣＳＫ９ ＣＲＤのＳ６６８Ｒ及びＧ６７０Ｅ突然変異体は良く発現したが、ＣＡＰ１との結合能力が深刻に損傷したことが免疫沈降によって確認された。このような結果は、ＰＣＳＫ９のＣＲＤがＣＡＰ１との結合にあたって重要であり、ＬＤＬ受容体タンパク質、すなわちＬＤＬコレステロールのレベルを調節するのに重要であることを示唆する。
ＰＣＳＫ９－ＣＲＤ突然変異とＣＡＰ１の直接的な相互作用に対するさらなる特徴を調べてみるために、本発明者らは、ＢＬＩｔｚシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ．，米国）を使用してＣＡＰ１に対するＰＣＳＫ９ ＷＴ、ＰＣＳＫ９ Ａ５１４Ｔ、ＰＣＳＫ９ Ｇ６７０Ｅ及びＰＣＳＫ９ Ｓ６６８ＲＧ６７０Ｅの結合親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を測定した。その結果、図２ｃに示されたように、ＰＣＳＫ９ Ａ５１４Ｔは、ＷＴ（野生型）に比べてさらに強い相互作用を示したのに対し、Ｇ６７０Ｅ及びＧ６７０ＥＳ６６８Ｒ突然変異体はさらに弱い相互作用を示した。
［実施例３．ＣＡＰ１はＰＣＳＫ９媒介性ＬＤＬ受容体の分解を誘導し、ＬＤＬコレステロールのレベルを増加させる］
（３．１．ｓｉＲＮＡを用いたＣＡＰ１発現抑制効果の研究）
ＨｅｐＧ２細胞でＰＣＳＫ９処理は、用量依存的にＬＤＬ受容体の分解を促進させる。本発明者らは、ＣＡＰ１の発現抑制がＬＤＬ受容体の分解に及ぼす影響を調べてみるために、ＣＡＰ１遺伝子をｓｉＲＮＡを用いて発現を抑制させた。ｓｉＲＮＡ配列は、下記の通りである：
ＣＡＰ１ ｓｉＲＮＡ、５′－ＡＡＡＣＣＧＡＧＴＣＣＴＣＡＡＡＧＡＧＴＡ－３′（配列番号８）。
その結果、図３ａに示されたように、ＣＡＰ１がｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＡＰ１）により枯渇すると、外因性ＰＣＳＫ９によるＬＤＬ受容体の分解が顕著に低下した。また、図３ｂに示された結果は、ＣＡＰ１ ｓｉＲＮＡが処理された細胞の細胞質基質でＨｉｓ－ｒｈＰＣＳＫ９を処理して３０分又は６０分後、全部ＬＤＬ受容体及び外因性ＨｉｓタグＰＣＳＫ９が少なく検出されることを立証する。
本発明者らは、過発現によってｗｔＣＡＰ１又はそれぞれのＣＡＰ１突然変異体を有するＣＡＰ１欠損細胞（ｓｉＣＡＰ１）を回復（ｒｅｓｃｕｅ）させ、ＰＣＳＫ９媒介性ＬＤＬ受容体の分解を調査した。その結果、図３ｃに示されたように、ｗｔＣＡＰ１及びΔａｃｔｉｎＢＤ突然変異体だけが減衰したＰＣＳＫ９媒介性ＬＤＬ受容体の分解を回復させ、前記結果は、ＳＨ３ＢＤ及びＡＣＢＤが外因性ＰＣＳＫ９媒介性ＬＤＬ受容体の分解に重要であることを示唆する。
（３．２．ＣＡＰ１ノックアウトマウスを用いたＣＡＰ１のＬＤＬ受容体の分解効果の研究）
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）でＣＡＰ１の役割を調べてみるために、ＴＡＬＥＮ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）を利用してＣＡＰ１エクソン３を標的化したＣＡＰ１ノックアウト（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）マウスを生成した。同型接合ノックアウトマウスは、胚１６．５日目に死亡したため、異種接合ノックアウトマウス（ＣＡＰ１＋／－マウス）を使用した。ＣＡＰ１＋／－マウスの臓器（ｏｒｇａｎｓ）は、最大約１６週まで野生型マウスの臓器と変わらないが、ＣＡＰ１のｍＲＮＡ及びタンパク質レベルは、ＣＡＰ１＋／－マウスの多様な臓器で顕著に減少することが示された（図３ｄ）。これによって、本発明者は、高脂肪食（ｈｉｇｈ－ｆａｔ ｄｉｅｔ）を摂取又は摂取しないＣＡＰ１＋／－マウス及びＣＡＰ１＋／＋マウスの肝でＬＤＬ受容体及びＰＣＳＫ９の発現レベルを比較した。ｒｔ－ＰＣＲを通したＬＤＬ受容体のｍＲＮＡ発現の調査では有意差を確認できなかったが、ＬＤＬ受容体のタンパク質レベルは、ＣＡＰ１＋／＋マウスよりもＣＡＰ１＋／－マウスで顕著に高かった（図３ｅ）。前記結果によって、高脂肪食下においてＣＡＰ１＋／－マウスは、野生型マウスと比較してさらに低い総コレステロールとＬＤＬコレステロール数値を有していることが確認された（図３ｆ）。血漿トリグリセリド（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ，ＴＧ）及び高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のコレステロールのレベルには有意差がなかった。
次に、本発明者らは、ＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）により血漿リポタンパク質を分別（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）することで、高脂肪食を摂取したＣＡＰ＋／＋マウスと比較してＣＡＰ１＋／－マウスでＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールのレベルが減少し、ＨＤＬコレステロールが大きい浮揚形態（ｌａｒｇｅ－ｂｕｏｙａｎｔ ｆｏｒｍ）に移動したことを確認した（図３ｇ）。
次いで、本発明者らは、ＣＡＰ１＋／－及びＣＡＰ１＋／＋マウスでアデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）を使用してＰＣＳＫ９を過発現させた後、ＬＤＬ受容体の発現レベル及びＬＤＬコレステロールのレベルを測定した。その結果、図３ｈ～図３ｊに示されたように、ＣＡＰ１異型ノックアウトマウスでは、ＰＣＳＫ９の形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）によるＬＤＬ受容体タンパク質の減少又は分解が防止されて、野生型動物に比べて改善されたコレステロールプロファイル（ｐｒｏｆｉｌｅ）を示した。このような結果は、ＣＡＰ１タンパク質がＰＣＳＫ９によるＬＤＬ受容体タンパク質の分解に必須であることを示す。
［実施例４．ＣＡＰ１はＰＣＳＫ９－ＬＤＬ受容体複合体のカベオラ依存性エンドサイトーシスを誘導してＬＤＬ受容体の分解を引き起こす］
ＬＤＬ受容体のＰＣＳＫ９媒介性分解は、リソソームプロテアーゼ抑制剤（Ｅ－６４ｄ）により独占的に遮断されたが、プロテアソーム（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ；ｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎ）又はオートファジー（ａｕｔｏｐｈａｇｙ；ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ）の抑制剤によって遮断されず、これは、ＬＤＬ受容体が、従来報告されたように、リソソーム経路によって分解されることを示唆する。このような発見は、また、Ｃｙ３染料がコンジュゲートされたＰＣＳＫ９（ＰＣＳＫ９－Ｃｙ３）を処理したＨｅｐＧ２細胞でＰＣＳＫ９－Ｃｙ３、エンドソームマーカーＥＥＡ１（ｅａｒｌｙ ｅｎｄｏｓｏｍｅ ａｎｔｉｇｅｎ １）及びリソソームマーカーＬＡＭＰ２（ｌｙｓｏｓｏｍｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）を有するＬＤＬ受容体を多様な時点で追跡することによって説明された。すなわち、ＰＣＳＫ９－Ｃｙ３処理後、３０分内に、ＥＥＡ１は、ＰＣＳＫ９及びＬＤＬ受容体とともに局在化（ｃｏ－ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）された（図４ａ）。次いで、６０分内にＰＣＳＫ９及びＬＤＬ受容体とともに局在化されるＬＡＭＰ２が現れた（図４ｂ）。これは、ＰＣＳＫ９及びＬＤＬ受容体が消えた２４０分まで増加した（図４ａ及び４ｃ）。このような初期エンドソーム形成でないリソソーム形成は、ＣＡＰ１枯渇によって遮断された（図４ｄ）。
ラフト（ｒａｆｔ）分離実験で、外因性ＰＣＳＫ９処理前の内因性ＰＣＳＫ９は、非ラフト分画にさらに多く分布した［ラフト（３６．８％）／非ラフト（６３．２％）］。外因性ＰＣＳＫ９処理後３０分内に、それは、主に脂質ラフト分画に含まれ［ラフト（５４．３％）／非ラフト（４５．７％）］、これは、カベオラ（ｃａｖｅｏｌａｅ）の形成に密接に関連していることである（図４ｅ及び図４ｆ）。膜分画でのＬＤＬ受容体発現は、ＰＣＳＫ９処理６０分後に減少した。しかしながら、ＣＡＰ１欠損細胞にＰＣＳＫ９を処理したにもかかわらず、ＰＣＳＫ９及びＬＤＬ受容体の発現パターンに有意な変化が現れなかった（図４ｅ及び図４ｆ）。
ＰＣＳＫ９による初期エンドソーム形成は、クラスリン（ｃｌａｔｈｒｉｎ）経路によって媒介されることが知られている。しかしながら、ＰＣＳＫ９処理は、クラスリンだけでなく、カベオリンと共に局在化されたエンドソームの数を増加させた（図４ｇ）。興味深いことに、強化したエンドソーム形成と関連して、ＰＣＳＫ９処理後のＣＡＰ１のノックダウンは、カベオリン－エンドソームを減少させたが、クラスリン－エンドソームを減少させていないし、このような結果は、ＣＡＰ１がＰＣＳＫ９－ＬＤＬ受容体複合体のクラスリン媒介エンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）でないカベオリン媒介エンドサイトーシスを誘導することを示唆する（図４ｈ及び図４ｉ）。
したがって、カベオリン又はクラスリンをノックダウンして、ＰＣＳＫ９の処理によるカベオリン及びクラスリン媒介ＬＤＬ受容体エンドサイトーシスをそれぞれ比較した。その結果、図４ｊに示されたように、カベオリン欠損細胞でＬＤＬ受容体は、ＰＣＳＫ９の処理にもかかわらず、分解されなかった。これと比較して、図４ｋに示されたように、クラスリン欠損細胞でＰＣＳＫ９の処理によって用量依存性方式でＬＤＬ受容体が分解されることを確認し、このような結果は、ＰＣＳＫ９媒介性ＬＤＬ受容体の分解がクラスリン非依存性であることを示唆する。
カベオリンがない場合、ＬＡＭＰ２は形成されることができず、ＬＤＬ受容体は、ＰＣＳＫ９によって分解されなかった。これに対し、クラスリンがない場合には、ＬＡＭＰ２が現れ、ＬＤＬ受容体は分解された（図４ｌ）。また、ＣＡＰ１のノックダウンは、ＬＡＭＰ２を生産することができず、これは、ＣＡＰ１がＰＣＳＫ９によるＬＤＬ受容体のカベオリン媒介分解に密接に関連していることを示唆する（図４ｌ）。
次に、本発明者らは、ＣＡＰ１の欠損によるＥＧＦ又はアルブミンのエンドサイトーシスに対する影響を評価した。ＥＧＦ及びその受容体複合体は、主にクラスリン依存性エンドサイトーシスによって内在化されるのに対し、アルブミンの吸収は、カベオラに依存することが知られている。その結果、図４ｍに示されたように、カベオリン依存性アルブミンエンドサイトーシスは、ＣＡＰ１の欠損によって非常に減少したのに対し、クラスリン依存性ＥＧＦ受容体エンドサイトーシスは、何の影響を受けなかった。
このような観察は、ＣＡＰ１がＰＣＳＫ９－ＬＤＬ受容体複合体のエンドサイトーシスだけでなく、一般的なカベオリン依存性エンドサイトーシスに関与することができることを示唆する。また、図４ｎに示されたように、内因性に過発現したＰＣＳＫ９によって媒介されたＬＤＬ受容体の分解は、ＣＡＰ１又はカベオリンに対するｓｉＲＮＡによって弱化された。また、電子顕微鏡分析は、ＰＣＳＫ９処理後、クラスリンでないカベオソーム（ｃａｖｅｏｓｏｍｅ）の形成のみがＣＡＰ１ ｓｉＲＮＡによって顕著に弱まることを示した（図４ｏ）。ＣＡＰ１がＰＣＳＫ９－ＬＤＬ受容体複合体をカベオソームに誘導するメカニズムは、ＣＡＰ１のＡＣ－ドメインとカベオリン－１の結合に基づく。免疫沈降実験で、ＬＤＬ受容体を含むＰＣＳＫ９は、ｗｔＣＡＰ１及びカベオリン－１との複合体を形成することができたが、ΔＳＨ３ＢＤ ΔａｃｔｉｎＢＤ又はΔＡＣＢＤ ＣＡＰ１のような突然変異体ＣＡＰ１の存在下では不可能であった（図４ｐ）。このような結果は、ＣＡＰ１のＳＨ３ＢＤは、ＰＣＳＫ９のＣＲＤとの結合に必須であることを証明するものである。
また、ＣＡＰ１のＡｃｔｉｎＢＤは、カベオリンとの結合に必要である。図４ｑに示されたように、野生型マウスの肝溶解物に対する免疫沈降分析は、カベオリンがＬＤＬ受容体、ＣＡＰ１及びＰＣＳＫ９に結合することを示した。さらに、マウス肝でＬＤＬ受容体－ＰＣＳＫ９－ＣＡＰ１複合体は、カベオリンと共に局在化された。ＬＤＬコレステロールを処理して１時間経過後、初期エンドソームマーカーＲａｂ５とともに染色されるＬＤＬ受容体エンドサイトーシスは、クラスリンｓｉＲＮＡ及びカベオリンｓｉＲＮＡの両方によって有意に減少した。ｓｉＲＮＡ減衰ＬＤＬ受容体分解経路にＰＣＳＫ９を遮断した場合、カベオリン媒介ＬＤＬ受容体エンドサイトーシスが有意に減少したのに対し、クラスリン媒介エンドサイトーシスには有意な変化がなかった。しかも、ＬＤＬコレステロール処理４時間後、再循環メカニズムに関連したＲａｂ１１とＬＤＬ受容体を共染色した場合、カベオリンｓｉＲＮＡを処理した場合と比較して、クラスリンｓｉＲＮＡを処理した場合、再循環ＬＤＬ受容体の量が顕著に減少した（図４ｒ）。
前記実施例１～４を通じて証明された結果を総合すると、図４ｓの概略図に示されたように、ＬＤＬ受容体は、ＬＤＬコレステロールと結合することによって、クラスリン依存性エンドサイトーシスによって細胞中に入り、その後、エンドソームの酸性ｐＨによってアロステリック解離（ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）が誘発されて、細胞表面に再生される。ＰＣＳＫ９は、また、クラスリン依存性エンドサイトーシスを促進するが、ＬＤＬ受容体のリソソーム分解を引き起こさない。しかしながら、ＬＤＬ受容体及びＰＣＳＫ９の複合体がＣＡＰ１と相互作用するとき、ＣＡＰ１がアクチン結合ドメインを通じてカベオリン－１に結合できるので、これらのタンパク質は、カベオリン依存性エンドサイトーシスによって細胞に入る。次いで、ＬＤＬ受容体－ＰＣＳＫ９－ＣＡＰ１複合体を含有するカベオリン被覆エンドソームは、分解のためにリソソームで誘導される。すなわち、ＣＡＰ１は、ＰＣＳＫ９の結合パートナーとしてカベオリン依存性ＬＤＬ受容体のエンドサイトーシス及びリソソーム性分解を媒介する必須の分子であることを最初に明らかにしたものである。
［実施例５．ＣＡＰ１の競合的阻害剤Ｆｃ－ＣＡＰ１の製造］
本発明によるｈＦｃ－ＣＡＰ１は、配列番号４のアミノ酸配列によってタンパク質合成メーカに依頼して作製した。ｍＦｃ－ＣＡＰ１の発現のために、ｐＣＥＰ４発現ベクターを用いた。
タンパク質の精製に使用したＥｘｐｉ２９３細胞の培養は、メーカー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）の培養方法を一部変形して使用した。より具体的に、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地に０．５Ｘ抗菌－抗真菌剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ；Ｇｉｂｃｏ、１５２４０－０６２、米国）を添加して、温度３７℃、ＣＯ２分圧７％、１４０ＲＰＭが維持される振とう器で培養した。ｍＦｃ－ＣＡＰ１プラスミド形質導入時、１ｍｌ当たり１×１０６細胞数で３００ｍｌを培養した。翌日、形質注入混合体［１５０ｍＭ ＮａＣｌ ３０ｍｌ＋６００μｇ（２μｇ／ｍｌ）ｍＦｃ－ＣＡＰ１プラスミド＋１２００μｇ ＰＥＩ］を作成して、常温で３０分間培養した後、ドロップ方式（ｄｒｏｐ ｗｉｓｅ ｍａｎｎｅｒ）で細胞に加えた。形質を注入した日から７日目、細胞と培地を３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄み液を回収した。前記回収した上澄み液は、濃縮後、カラムとｍＦｃビーズ（ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭ ＩｇＧ－Ｆｃ，ｍｓ）を用いてろ過し、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．８）を用いて順次にビーズから分離した。以後、ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）でタンパク質の発現程度を確認し、カラム（ＺｅｂａＴＭ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ）を用いてバッファーをＰＢＳで透析した。
上記のように分離・精製されたｍＦｃ－ＣＡＰ１は、下記の実施例６～８でＣＡＰ１とレジスチン又はＣＡＰ１とＰＣＳＫ９の間の結合阻害剤（又は抑制剤）として使用された。
［実施例６．末梢血液単核球でｍＦｃ－ＣＡＰ１はＮＦ－κＢ ｐ６５サブユニットの活性化を抑制する］
ヒト単核球細胞株ＴＨＰ－１細胞は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）社の培養方法によって１Ｘ抗菌－抗真菌剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ；Ｇｉｂｃｏ、１５２４０－０６２、米国）及び１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）を含有するＲＰＭＩ培地で温度３７℃、ＣＯ２分圧５％が維持される培養器で培養した。以後、ＴＨＰ－１細胞をＲＰＭＩ培地に希釈した後、各ｗｅｌｌ当たり１×１０６ｃｅｌｌｓで細胞を均一に加え、３７℃、５％ＣＯ２環境の培養器で２４時間の間培養した。
ＴＨＰ－１細胞に対する効果を最大化するために、０．１％ＦＢＳ ＲＰＭＩで３７℃、 ５％ＣＯ２条件で１６時間の間培養して、細胞の飢餓（ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）状態を誘導した。 その後、１μｇ／ｍｌの組換えヒト（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ；ｒｈ）ＰＣＳＫ９又は５０ｎｇ／ｍｌ組換えヒトレジスチン（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｒｅｓｉｓｔｉｎ；ｒｈＲｅｓｉｓｔｉｎ）を各濃度（０．１、０．５、２μｇ／ｍｌ）別にｍＦｃ－ＣＡＰ１と混合して３０分間事前培養した後、これをＴＨＰ－１細胞に３０分間処理した。以後、細胞溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ；ＣＳＴ，＃９８０３）を用いてＴＨＰ－１細胞からタンパク質を分離し、これをウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）で確認した。
その結果、図５ａに示されたように、ＴＨＰ－１でレジスチンの処理によってｐ６５サブユニットのＳ２７６位がリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）されて、ＮＦ－κの活性化を誘導するが、ｍＦｃ－ＣＡＰ１を共に処理したグループの場合、濃度依存的にｐ６５のリン酸化が抑制されることが確認された。ＰＣＳＫ９の場合、また、図５ｂに示されたように、ＴＨＰ－１でＰＣＳＫ９の処理によってｐ６５サブユニットのＳ２７６位がリン酸化され、ｍＦｃ－ＣＡＰ１を共に処理すると、濃度依存的にｐ６５のリン酸化が抑制されることを確認した。上記のような結果は、ＰＣＳＫ９によるＮＦ－κＢの活性化による炎症の誘導がｍＦｃ－ＣＡＰ１によって効果的に阻害されることを意味する。
［実施例７．肝細胞でｍＦｃ－ＣＡＰ１はＬＤＬ受容体の分解及びＮＦ－κＢの活性化を抑制し、ＡＭＰＫ経路の活性化を促進する］
（７．１．ＨｅｐＧ２ヒト肝がん細胞の培養）
ＨｅｐＧ２細胞は、ＡＴＣＣ社の培養方法によって１Ｘ抗菌－抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ）及び１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ）培地で温度３７℃、ＣＯ２分圧５％が維持される培養器で培養した。以後、ＨｅｐＧ２細胞をＤＭＥＭ培地に希釈した後、各ｗｅｌｌ当たり５×１０５ｃｅｌｌｓで細胞を均一に加え、３７℃、５％ＣＯ２環境の培養器で２４時間の間培養した。
（７．２．ｍＦｃ－ＣＡＰ１のＰＣＳＫ９媒介性ＬＤＬ受容体の保護効果及びＡＭＰＫ経路の活性化効果の確認）
ＨｅｐＧ２細胞を基本（ｂａｓａｌ）ＤＭＥＭとして３７℃、５％ＣＯ２培養器で６時間の間培養した。その後、前記細胞に２μｇ／ｍｌ組換えヒトＰＣＳＫ９と各濃度（０．１、１μｇ／ｍｌ又は０．０５、０．１５、０．５μｇ／ｍｌ）別にｍＦｃ－ＣＡＰ１を同時に４時間の間処理した。以後、細胞溶解バッファー（ＣＳＴ、＃９８０３）を用いてＨｅｐＧ２細胞からタンパク質を分離し、これを電気泳動した後、タンパク質をＰＶＤＦ膜（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）にトランスファーした後、各抗体を反応させた。
その結果、図６ａ及び図６ｂに示されたように、ＨｅｐＧ２細胞でＰＣＳＫ９を単独処理した場合、ＰＣＳＫ９によってＬＤＬ受容体の分解が促進され、ｍＦｃ－ＣＡＰ１を同時に処理した場合には、ＬＤＬ受容体に対する保護効果が濃度依存的に現れることを確認した。また、ｍＦｃ－ＣＡＰ１処理時、ＡＭＰＫが効果的にリン酸化され、これによって、ＡＣＣのリン酸化が抑制されることを確認した。
上記のような結果は、本発明によるｍＦｃ－ＣＡＰ１がＡＭＰＫ活性化を通じてＬＤＬ受容体分解を成功裏に抑制することができ、したがって、血中ＬＤＬコレステロールの数値を減少させるためのＬＤＬ受容体の保護効果があることを直接的に示すものである。
（７．３．ｍＦｃ－ＣＡＰ１のレジスチン媒介ＬＤＬ受容体の保護効果及びＮＦ－κ抑制効果の確認）
ＨｅｐＧ２細胞に５０ｎｇ／ｍｌのｒｈレジスチンと各濃度（０．１、１μｇ／ｍｌ又は０．０５、０．１５、０．５μｇ／ｍｌ）別にｍＦｃ－ＣＡＰ１を処理し、３７℃、５％ＣＯ２培養器で１２～１６時間の間培養した。以後、前記実施例７．２と同じ方法によってタンパク質を得て、電気泳動した後、それぞれに特異的な抗体と反応させた。
その結果、図６ｃ及び図６ｄに示されたように、ｍＦｃ－ＣＡＰ１とｒｈレジスチンを一晩中共同処理したとき、ｒｈレジスチンによるＬＤＬ受容体の分解レベルは比較的温和であることが示された。また、レジスチンによって活性化したｐ－ｐ６５は、ｍＦｃ－ＣＡＰ１の処理によって減少したのに対し、ｐＡＭＰＫは、ｍＦｃ－ＣＡＰ１処理によって活性化されることを確認した。
上記のような結果は、本発明によるｍＦｃ－ＣＡＰ１がレジスチンによるＬＤＬ受容体分解を抑制することができ、これは、ｐ６５のリン酸化の抑制及びＡＭＰＫの活性化によるものであることを確認したのであり、ＣＡＰ１の競合的阻害剤が血中ＬＤＬコレステロールの数値を減少させるためのＬＤＬ受容体の保護効果を有することを証明したのである。
（７．４．ｍＦｃ－ＣＡＰ１のレジスチン媒介ＬＤＬ受容体の保護効果及びＡＭＰＫ経路の活性化効果の確認）
培養中のＨｅｐＧ２細胞を基本ＤＭＥＭ培地に変えた後、３７℃、５％ＣＯ２培養器で６時間の間培養した。６時間後、ＡＭＰＫ活性剤であるＡＩＣＡＲ（５－ａｍｉｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ－４－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ ｒｉｂｏｓｉｄｅ）を１時間の間前処理した後、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈレジスチンと各濃度（０．０５、０．５μｇ／ｍｌ）別にｍＦｃ－ＣＡＰ１を４時間の間共に処理した。
その結果、図６ｅに示されたように、ＡＩＣＡＲによるＡＭＰＫの活性化がレジスチンによって抑制され、これは、ｍＦｃ－ＣＡＰ１の処理によってさらに活性化されることを確認した。
また、培養中のＨｅｐＧ２細胞を基本ＤＭＥＭ培地に変えた後、３７℃、５％ＣＯ２培養器で６時間の間培養し、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈレジスチンと各濃度（０．１、１μｇ／ｍｌ又は０．０５、０．１５、０．５μｇ／ｍｌ）別にｍＦｃ－ＣＡＰ１を同時に処理した場合、図６ｆに示されたように、ｒｈレジスチンの単独処理によってＬＤＬ受容体の分解が促進されたものが、ｍＦｃ－ＣＡＰ１の同時処理によって分解が抑制されることを確認した。
［実施例８．ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）でＣＡＰ１のノックダウン（ｋｎｏｃｋ－ｄｏｗｎ）はＬＤＬコレステロールの吸収を抑制する］
本発明によるｍＦｃ－ＣＡＰ１のＬＤＬコレステロール吸収抑制効果を直接確認するために、本発明者らは、ｓｈＲＮＡを用いてヒト臍帯静脈内皮細胞でのＣＡＰ１遺伝子発現を抑制させた。ＣＡＰ１遺伝子をターゲットするようにデザインされた下記の配列番号９のｓｈＣＡＰ１は、ｐＬＬ３．７レンチウイルスベクターのＨｐａＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位でクローニングして製造した。
ＣＡＰ１ ｓｈＲＮＡ、５′－ＡＧＡＴＧＴＧＧＡＴＡＡＧＡＡＧＣＡＴ－３′（配列番号９）。
血中ＬＤＬコレステロールは、動脈血管の内皮細胞を通過して動脈硬化を誘発することが知られている。これによって、本発明者らは、ｓｈＣＡＰ１を用いてＣＡＰ１の発現を抑制した場合、ＬＤＬコレステロールの吸収に変化が現れるかを確認した。その結果、図７に示されたように、静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣでＰＣＳＫ９を処理すると、ＬＤＬコレステロールが血管壁を通過して流入するが、この際、ＣＡＰ１をノックダウン（ｋｎｏｃｋ－ｄｏｗｎ）した血管内皮細胞では、ＬＤＬコレステロールが内皮細胞に入らないことが示された。上記のような結果は、ＣＡＰ１が動脈硬化を誘発できるＬＤＬコレステロールの細胞内吸収に重要な役割をし、したがって、ＣＡＰ１の結合阻害又は発現抑制を通じて動脈硬化を含む各種心血管代謝疾患を治療することができることを示唆する。
上述した本発明の説明は例示のためのもので、本発明が属する技術分野において通常の知識を有した者は、本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更しなくても他の具体的な形態に容易に変形が可能であることが理解できる。したがって、以上で記述した実施例は、全ての面で例示的なものであり、限定的ではないものと理解すべきである。
本発明によれば、ＰＣＳＫ９と直接結合してＬＤＬ受容体の生活周期を調節するＣＡＰ１がＰＣＳＫ９又はレジスチンと結合することを阻害したり、ＣＡＰ１遺伝子の発現を抑制することによって、コレステロール数値を調節することができる。したがって、本発明によるＣＡＰ１とＰＣＳＫ９又はレジスチンの間の結合阻害剤又はＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤などは、血中コレステロールの数値を低減することができ、これによって、血中コレステロールの異常レベルに関連したり、それによって発病する各種心血管代謝疾患を治療するための組成物として有用に使用でき、また、炎症抑制効果があるという点から産業的利用価値が大きいことが予想される。

Claims (47)

  1. 配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１（ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）と配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９（ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ ｔｙｐｅ－９）の間の結合阻害剤を有効成分として含む、血中コレステロール低下用薬学的組成物。
  2. 前記結合阻害剤が、ＣＡＰ１又はＰＣＳＫ９に特異的に結合するタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、基質類似体、アプタマー及び抗体からなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする、請求項１に記載の血中コレステロール低下用薬学的組成物。
  3. 前記結合阻害剤が、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１タンパク質又はその断片；及び免疫グロブリン重鎖のＦｃ断片を含む融合タンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の血中コレステロール低下用薬学的組成物。
  4. 前記融合タンパク質が、配列番号４又は配列番号６のアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項３に記載の血中コレステロール低下用薬学的組成物。
  5. 前記結合阻害剤が、ＣＡＰ１のＳＨ３（Ｓｒｃ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ３）結合ドメイン及びＰＣＳＫ９のシステインリッチドメイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｒｉｃｈ ｄｏｍａｉｎ；ＣＲＤ）からなる群から選ばれる一つ以上のドメインに結合することを特徴とする、請求項１に記載の血中コレステロール低下用薬学的組成物。
  6. 前記ＣＡＰ１のＳＨ３結合ドメインが、配列番号１０のアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項５に記載の血中コレステロール低下用薬学的組成物。
  7. 前記ＰＣＳＫ９のシステインリッチドメインが、配列番号１１のアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項５に記載の血中コレステロール低下用薬学的組成物。
  8. 前記ＰＣＳＫ９のシステインリッチドメインが、配列番号１２のアミノ酸配列からなるＭ１ドメインを含むことを特徴とする、請求項５に記載の血中コレステロール低下用薬学的組成物。
  9. 前記ＰＣＳＫ９のシステインリッチドメインが、配列番号１３のアミノ酸配列からなるＭ３ドメインを含むことを特徴とする、請求項５に記載の血中コレステロール低下用薬学的組成物。
  10. 前記結合阻害剤が、ＣＡＰ１のＳＨ３結合ドメインに存在する３４Ｂ番アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）を含む部位に特異的に結合することを特徴とする、請求項１に記載の血中コレステロール低下用薬学的組成物。
  11. 前記結合阻害剤が、ＰＣＳＫ９のＭ１ドメインに存在する４９４番リシン（ｌｙｓｉｎｅ）を含む部位に特異的に結合することを特徴とする、請求項１に記載の血中コレステロール低下用薬学的組成物。
  12. 前記結合阻害剤が、ＰＣＳＫ９のＭ３ドメインに存在する６５９番アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）を含む部位に特異的に結合することを特徴とする、請求項１に記載の血中コレステロール低下用薬学的組成物。
  13. 配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤を有効成分として含む、血中コレステロール低下用薬学的組成物。
  14. 前記発現抑制剤が、ＣＡＰ１遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合できるアンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム及びＰＮＡからなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする、請求項１３に記載の血中コレステロール低下用薬学的組成物。
  15. 前記発現抑制剤が、配列番号８の塩基配列からなるｓｉＲＮＡであることを特徴とする、請求項１３に記載の血中コレステロール低下用薬学的組成物。
  16. 前記発現抑制剤が、配列番号９の塩基配列からなるｓｈＲＮＡであることを特徴とする、請求項１３に記載の血中コレステロール低下用薬学的組成物。
  17. 前記組成物が、ＬＤＬ（Ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）受容体の分解を抑制することを特徴とする、請求項１又は１３に記載の血中コレステロール低下用薬学的組成物。
  18. 前記コレステロールが、ＬＤＬコレステロールであることを特徴とする、請求項１又は１３に記載の血中コレステロール低下用薬学的組成物。
  19. （ｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９の間の結合阻害剤；
    （ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤；又は
    （ｉｉｉ）前記（ｉ）及び（ｉｉ）の混合物を含む、血中コレステロール低下用健康機能食品組成物。
  20. （ｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９の間の結合阻害剤；
    （ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤；又は
    （ｉｉｉ）前記（ｉ）及び（ｉｉ）の混合物を含む、心血管代謝疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
  21. 前記結合阻害剤が、ＣＡＰ１又はＰＣＳＫ９に特異的に結合するタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、基質類似体、アプタマー及び抗体からなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする、請求項２０に記載の心血管代謝疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
  22. 前記結合阻害剤が、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１タンパク質又はその断片；及び免疫グロブリン重鎖のＦｃ断片を含む融合タンパク質であることを特徴とする、請求項２０に記載の心血管代謝疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
  23. 前記融合タンパク質が、配列番号４又は配列番号６のアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項２２に記載の心血管代謝疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
  24. 前記発現抑制剤が、ＣＡＰ１遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合できるアンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム及びＰＮＡからなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする、請求項２０に記載の心血管代謝疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
  25. 前記発現抑制剤が、配列番号８の塩基配列からなるｓｉＲＮＡであることを特徴とする、請求項２０に記載の心血管代謝疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
  26. 前記発現抑制剤が、配列番号９の塩基配列からなるｓｈＲＮＡであることを特徴とする、請求項２０に記載の心血管代謝疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
  27. 前記心血管代謝疾患が、糖尿病、肥満、脂質異常症、脂肪肝、高血圧、痛風、脳卒中、動脈硬化症、心筋梗塞症、狭心症、末梢血管疾患及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる疾患であることを特徴とする、請求項２０に記載の心血管代謝疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
  28. （ｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９の間の結合阻害剤；
    （ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤；又は
    （ｉｉｉ）前記（ｉ）及び（ｉｉ）の混合物を含む、心血管代謝疾患の予防又は改善用健康機能食品組成物。
  29. （ｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９の間の結合阻害剤；
    （ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と配列番号３のアミノ酸配列からなるレジスチン（ｒｅｓｉｓｔｉｎ）の間の結合阻害剤；及び
    （ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤からなる群から選ばれる１種以上を有効成分として含む、抗炎症用薬学的組成物。
  30. 前記（ｉ）の結合阻害剤が、ＰＣＳＫ９に特異的に結合するタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、基質類似体、アプタマー及び抗体からなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする、請求項２９に記載の抗炎症用薬学的組成物。
  31. 前記（ｉｉ）の結合阻害剤が、レジスチンに特異的に結合するタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、基質類似体、アプタマー及び抗体からなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする、請求項２９に記載の抗炎症用薬学的組成物。
  32. 前記（ｉ）又は（ｉｉ）の結合阻害剤が、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１タンパク質又はその断片；及び免疫グロブリン重鎖のＦｃ断片を含む融合タンパク質であることを特徴とする、請求項２９に記載の抗炎症用薬学的組成物。
  33. 前記融合タンパク質が、配列番号４又は配列番号６のアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項３２に記載の抗炎症用薬学的組成物。
  34. 前記（ｉｉｉ）の発現抑制剤が、ＣＡＰ１遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合できるアンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム及びＰＮＡからなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする、請求項２９に記載の抗炎症用薬学的組成物。
  35. 前記組成物が、ＮＦ－κＢの活性を抑制することを特徴とする、請求項２９に記載の抗炎症用薬学的組成物。
  36. 配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と；配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９又は配列番号３のアミノ酸配列からなるレジスチンの間の結合レベルを測定する製剤を含む、高コレステロール血症又は心血管代謝疾患の診断用組成物。
  37. 患者の試料のうち、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と；配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９又は配列番号３のアミノ酸配列からなるレジスチンの間の結合レベルを測定する段階を含む、高コレステロール血症又は心血管代謝疾患診断のための情報提供方法。
  38. 前記患者の試料が、肝組織、肝細胞、血液、血清、血漿、唾液、喀痰及び尿からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項３７に記載の高コレステロール血症又は心血管代謝疾患診断のための情報提供方法。
  39. 下記の段階を含む高コレステロール血症又は心血管代謝疾患治療剤のスクリーニング方法：
    （ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１タンパク質又はその断片；及び配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９タンパク質又はその断片、又は配列番号３のアミノ酸配列からなるレジスチンタンパク質又はその断片；を含む試料に被検物質を処理する段階；
    （ｂ）前記ＣＡＰ１；及びＰＣＳＫ９タンパク質又はその断片、又はレジスチンタンパク質又はその断片；間の結合レベルを測定する段階；及び
    （ｃ）前記結合レベルが対照群試料と比較して減少した被検物質を選別する段階。
  40. 配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１（ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）と配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９（ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ ｔｙｐｅ－９）の間の結合阻害剤を個体に投与する段階を含む、血中コレステロール低下方法。
  41. 配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１（ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）と配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９（ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ ｔｙｐｅ－９）の間の結合阻害剤の、血中コレステロール低下用途。
  42. 配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＣＡＰ１（ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）遺伝子の発現抑制剤を個体に投与する段階を含む、血中コレステロール低下方法。
  43. 配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＣＡＰ１（ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）遺伝子の発現抑制剤の、血中コレステロール低下用途。
  44. （ｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９の間の結合阻害剤；
    （ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤；又は
    （ｉｉｉ）前記（ｉ）及び（ｉｉ）の混合物を含む組成物を個体に投与する段階を含む、心血管代謝疾患の予防又は治療方法。
  45. （ｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９の間の結合阻害剤；
    （ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤；又は
    （ｉｉｉ）前記（ｉ）及び（ｉｉ）の混合物を含む組成物の、心血管代謝疾患の予防又は治療用途。
  46. （ｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９の間の結合阻害剤；
    （ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と配列番号３のアミノ酸配列からなるレジスチン（ｒｅｓｉｓｔｉｎ）の間の結合阻害剤；及び
    （ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤からなる群から選ばれる１種以上を有効成分として含む組成物を個体に投与する段階を含む、炎症抑制方法。
  47. （ｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＳＫ９の間の結合阻害剤；
    （ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＡＰ１と配列番号３のアミノ酸配列からなるレジスチン（ｒｅｓｉｓｔｉｎ）の間の結合阻害剤；及び
    （ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＣＡＰ１遺伝子の発現抑制剤からなる群から選ばれる１種以上を有効成分として含む組成物の、炎症抑制用途。
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