KR20220025917A - 삼중-특이적 결합 분자 및 그것의 사용 방법 - Google Patents

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KR20220025917A
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레슬리 에스. 죤슨
링 후앙
구루나드흐 레디 치칠리
칼파나 샤아
치아-잉 카오 람
스티븐 제임스 버크
리친 리우
폴 에이. 무어
에지오 본비니
바슈와티 바라트
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마크로제닉스, 인크.
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Abstract

본 발명은 삼중-특이적 결합 분자에 관한 것으로, 그것은 3개의 결합 도메인을 가짐으로써 3개의 에피토프에 대한 동조된 결합을 중재할 수 있는 다중-사슬 폴리펩티드 분자이다. 결합 도메인은 삼중-특이적 결합 분자가 어떠한 3개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있도록 선택될 수 있다. 그런 에피토프들은 동일한 항원의 에피토프들이거나 둘 또는 3개의 상이한 항원의 에피토프일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 그런 에피토프들 중 하나는 CD3에 결합할 수 있게 될 것이고, 그런 에피토프들 중 제 2는 CD8에 결합할 수 있게 될 것이며, 그런 에피토프들 중 제 3은 질환-관련 항원의 에피토프에 결합할 수 있게 될 것이다. 발명은 또한 신규한 ROR1-결합 항체, 뿐만 아니라 그것의 유도체 및 그런 조성물에 대한 용도를 제공한다.

Description

삼중-특이적 결합 분자 및 그것의 사용 방법{TRI-SPECIFIC BINDING MOLECULES AND METHODS OF USE THEREOF}
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 미국 특허 출원 번호 62/008,229 (2014년 6월 5일 출원됨; 계 류중) 62/004,571 (2014년 5월 29일 출원됨; 계류중) 및 62/107,824 (2015년 1월 26일 출원됨)에 대한 우선권을 주장하고, 이들 출원은 각각 본원에 전체 내용이 참조로 포함된다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 37 C.F.R. 1.821 (이하 참조)에 따라 하나 이상의 서열 목록을 포함하고, 그것은 컴퓨터-판독가능한 매체 (파일명: 1301_0114PCT_Sequence_Listing_ST25.txt, 2015년 5월 18일에 생성되고, 244,021 바이트의 크기를 가짐)에 개시되며, 그 파일은 본원에 전체 내용이 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 삼중-특이적 결합 분자에 관한 것으로, 그것은 3개의 결합 도메인을 가지고 그러므로 3개의 에피토프에 대한 동조된 결합 (coordinated binding)을 중재할 수 있는 다중-사슬 폴리펩티드 분자이다. 결합 도메인은 삼중-특이적 결합 분자가 어떠한 3개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있도록 선택될 수 있다. 그런 에피토프들은 둘 또는 3개의 상이한 항원들 중 동일한 항원 또는 에피토프의 에피토프일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 그런 에피토프들 중 하나는 CD3에 결합할 수 있을 것이고, 그런 에피토프들 중 제 2 에피토프는 CD8에 결합할 수 있을 것이며, 그런 에피토프들 중 제 3 에피토프는 질환-관련 항원의 에피토프에 결합할 수 있을 것이다. 발명은 또한 신규한 ROR1-결합 항체, 뿐만 아니라 그것들의 유도체 및 그런 조성물에 대한 용도를 제공한다.
I. 포유류 면역 시스템
포유류 면역 시스템은 예컨대 손상, 감염 및 신생물 형성을 포함하여 다양한 상태에 대한 방어로서 작용한다. 인간 및 다른 포유류가 병원체, 외래 물질 및 암 항원에 대한 면역학적 반응을 발달시키는 효율은 두 가지 특징에 기초한다: 항원 인식에 대한 면역 반응의 정교한 특이성, 및 동일한 항원으로의 재-활성화시 더 빠르고 보다 격렬한 반응을 허용하는 면역학적 기억 (Portol P. et al. (2009) "The TCR/CD3 Complex: Opening the Gate to Successful Vaccination," Current Pharmaceutical Design 15:3290-3300; Guy, C.S. et al. (2009) "Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR:CD3 Complex," Immunol Rev. 232(1):7-21).
포유류 면역 시스템은 두 개의 별도지만 상호관련된 시스템: 세포 및 체액 면역 시스템에 의해 중재된다. 일반적으로 말하면, 체액 시스템은 신체에 대해 외래인 것으로서 시스템에 의해 인식된 생성물과 조합하여 그것을 중화시키는 능력을 가지는 가용성 생성물 (항체 또는 면역글로불린)에 의해 중재된다. 대조적으로, 세포 면역 시스템은 "T 세포"로 불리는 특정 세포의 고정화를 포함한다. T 세포는 흉선으로부터 유도되고 조직, 림프계 및 순환계 사이를 순환하는 림프구이다. 외래 구조 (항원)의 존재 및 인식에 대한 반응으로, T 세포는 면역 반응을 개시하기 위해 "활성화"된다. 많은 경우에 이들 외래 항원들은 신생물 형성 또는 감염의 결과로서 숙주 세포 상에 발현된다. 비록 T 세포는 그 자체로는 항체를 분비하지는 않지만, 통상적으로 림프구의 제 2 부류, B 세포 (골수로부터 유도됨)에 의한 항체 분비에 요구된다. 중요하게도, T 세포는 한 항원을 다른 항원과 구별할 수 있게 되기 위해 보기 드문 면역학적 특이성을 나타낸다. T 세포의 두 유형, "T 헬퍼 세포" 및 "세포독성 T 세포"가 특히 관련된다.
T 헬퍼 세포는 그것들의 당단백질, CD4의 발현을 특징으로 한다 (즉 그것들은 "CD4+"임). CD4+ T 세포들은 대부분의 포유류 면역 및 자가면역 반응의 필수적인 조직자 (organizer)이다 (Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules," Immunolog. Res. 28(1):39-48). CD4+ T 세포들의 활성화는 항원 제공 세포 (예컨대 B 세포, 대식세포 또는 수지상 세포)의 표면에 배열되는 항원:주요 조직적합성 부류 II (MHC II) 분자 복합체와 나이브 (naive) CD4+ T T세포의 표면에 배열되는, 두 분자, 즉 T 세포 수용체 ("TCR") 및 CD3 세포-표면 수용체 리간드의 복합체 사이의 공동-자극성 상호작용을 통해 중재되는 것으로 밝혀졌다. 활성화된 T 헬퍼 세포는 표적 세포에 대한 염증성 반응을 중재할 수 있는 Th1 세포로 증식할 수 있다.
세포독성 T 세포들은 CD8의 발현을 특징으로 한다 (즉 그것들은 CD3+뿐 아니라 "CD8+"이다). CD8+ T 세포들의 활성화는 표적 세포의 표면에 배열되는 항원:주요 조직적합성 부류 I (MHC I) 분자 복합체와 CD8+ T 세포의 표면에 배열되는, CD8과 T 세포의 복합체 사이의 공동-자극성 상호작용을 통해 중재되는 것으로 밝혀졌다. 단지 특정 면역 시스템 세포에 의해서만 발현되는 MHC II 분자와 달리, MHC I 분자들은 매우 광범위하게 발현된다. 그러므로, 세포독성 T 세포들은 광범위한 세포 유형들에 결합할 수 있다. 활성화된 세포독성 T 세포들은 세포독소 퍼포린, 그랜자임 및 그라눌라이신의 방출을 통해 세포 살해를 중재한다. 퍼포린의 작용을 통해서, 그랜자임은 표적 세포의 세포질로 들어가고 그것들의 세린 프로테아제 기능이 표적화된 세포의 아폽토시스 (프로그래밍되어 있는 세포 사망)를 궁극적으로 유도하는 일련의 시스테인 프로테아제인 카스파제 캐스케이드를 촉발시킨다.
T 세포 수용체 ("TCR")는 α 및 β 사슬의 공유 결합된 이종이량체이다 ("TCRαβ"). 이들 사슬은 길이가 259 (α) 및 296 (β) 아미노산인 부류 I 막 폴리펩티드이다. CD3 분자는 5개의 뚜렷한 폴리펩티드 사슬 (CD3 γ 사슬, CD3 δ 사슬, 2개의 ε CD3 사슬 및 2개의 제타 사슬)로 구성된 T 세포 공-수용체이다. 개별적인 폴리펩티드 사슬들은 결합하여 3개의 이량체 (εγ, εδ, ζζ)의 복합체를 형성한다 (Wucherpfennig, K.W. et al. (2010) "Structural Biology Of The T Cell Receptor: Insights into Receptor Assembly, Ligand Recognition, And Initiation of Signaling," Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2(4):a005140; pages 1-14; Chetty, R. et al. (1994) "CD3: Structure, Function And The Role Of Immunostaining In Clinical Practice," J. Pathol. 173:303-307; Guy, C.S. et al. (2009) "Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR:CD3 Complex," Immunol Rev. 232(1):7-21; Call, M.E. et al. (2007) "Common Themes In The Assembly And Architecture Of Activating Immune Receptors," Nat. Rev. Immunol. 7:841-850; Weiss, A. (1993) "T Cell Antigen Receptor Signal Transduction: A Tale Of Tails And Cytoplasmic Protein-Tyrosine Kinases," Cell 73:209-212). CD3 복합체는 T 림프구의 활성화 신호를 생성하기 위하여 TCR과 결합한다. CD3이 없을 때, TCR은 적절하게 조립하지 못하고 분해된다 (Thomas, S. et al. (2010) "Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T Cell Receptor Gene Transfer," Immunology 129(2):170-177). CD3은 모든 성숙한 T 세포의 막에 결합하고, 실제로 다른 세포 유형에는 결합하지 않는 것으로 밝혀졌다 (Janeway, C.A. et al. (2005) In: Immunobiology: The Immune System In Health And Disease," 6th ed. Garland Science Publishing, NY, pp. 214-216; Sun, Z. J. et al. (2001) "Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3ε:γ Heterodimer," Cell 105(7):913-923; Kuhns, M.S. et al. (2006) "Deconstructing The Form And Function Of The TCR/CD3 Complex," Immunity. 2006 Feb;24(2):133-139 참조).
TCR 및 CD3 복합체는 CD3 ζ 사슬 제타 사슬 (T 세포 수용체 T3 제타 사슬 또는 CD247로서도 알려져 있음)과 함께 TCR 복합체를 포함한다 (van der Merwe, P.A. etc. (epub Dec. 3, 2010) "Mechanisms For T Cell Receptor Triggering," Nat. Rev. Immunol. 11:47-55; Wucherpfennig, K.W. et al. (2010) "Structural Biology of the T cell Receptor: Insights into Receptor Assembly, Ligand Recognition, and Initiation of Signaling," Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2:a005140). 복합체는 그것이 큰 수 (10)의 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 함유하기 때문에 특히 중요하다.
T 세포 활성화에는 두 가지 상호작용이 필요하다 (Viglietta, V. et al. (2007) "Modulating Co-Stimulation," Neurotherapeutics 4:666-675; Korman, A.J. et al. (2007) "Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy," Adv. Immunol. 90:297-339). 첫 번째 상호작용에서, 세포는 그 세포의 주요 조직적합성 복합체에 결합된 관련 표적 항원을 나타내서 나이브 T 림프구의 T 세포 수용체 ("TCR")에 결합할 수 있어야 한다. 두 번째 상호작용에서, 세포의 리간드는 T 림프구의 송-수용체에 결합하여야 한다 (Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules," Immunolog. Res. 28(1):39-48; Lindley, P.S. et al. (2009) "The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation," Immunol. Rev. 229:307-321). 두 가지 자극 신호를 모두 경험하는 T 세포는 그런 다음 사이토킨 (예컨대 인터류킨-2 및 인터류킨-12)에 반응할 수 있다. TCR 참여 (engagement) 중에 둘 다의 공-자극 신호가 없을 때, T 세포는 클론 무반응으로 언급되는, 기능적으로 무반응 상태에 들어간다 (Khawli, L.A. et al. (2008) "Cytokine, Chemokine, and Co-Stimulatory Fusion Proteins for the Immunotherapy of Solid Tumors," Exper. Pharmacol. 181:291-328). 병리적 상태에서, T 세포는 다양한 기관-특이적 자가면역 질환, 예컨대 제 1형 당뇨병, 류머티스성 관절염 및 다발성 경색의 핵심 주역이다 (Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules," Immunolog. Res. 28(1):39-48). E
적응성 면역반응을 이루도록 T 세포를 활성화하기 위해 두 개의 신호를 필요로 하는 것은 T 세포에 의해 인식될 수 있는 시스템에서의 위치에서 항원 제공 세포 상에 존재할 수 있는 자체-항원에 대한 반응을 피하기 위한 메커니즘을 제공하는 것으로 여겨진다. T 세포의 세포와의 접촉이 두 가지 필요한 신호 중 하나만의 생성을 초래하는 경우, T 세포는 활성화되지 못하고 적응성 면역 반응을 일어나지 않는다.
II. 항체 및 다른 에피토프-결합 분자
A. 항체
"항체"는 표적, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등에, 면역글로불린 분자의 가변 도메인에 위치한 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통하여 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에서 사용되는 그 용어는 무상 다클론성 또는 단클론성 항체뿐 아니라 그것들의 돌연변이, 자연 발생적인 변이체, 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 가지는 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화된 항체 및 키메라 항체, 및 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 어떠한 다른 변형된 형태를 포함한다. 본 출원의 전체를 통해, 항체의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 잔기들의 넘버링은 Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health Publication No. 91-3242에서와 같이 EU 색인에 따른다. 본원에서 사용되는 바, "항체의 항원-결합 단편"은 적어도 하나의 항원 인식 부위를 가지는 항체의 부분이다. 본원에서 사용되는 바, 그 용어는 단편들 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2 Fv) 및 단일-사슬 분자 (예컨대 scFv)를 포함한다.
천연 항체 (예컨대 IgG 항체)는 두 개의 중쇄와 복합체화된 두 개의 경쇄로 구성된다. 각각의 경쇄는 가변 도메인 (VL) 및 불변 도메인 (CL)을 함유한다. 각각의 중쇄는 가변 도메인 (VH), 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3) 및 CH1과 CH2 도메인 사이에 위치한 힌지 도메인을 함유한다. 그러므로 자연 발생적인 면역글로불린 (예컨대 IgG)의 기본적인 구조 단위는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 가지고 보통 약 150,000 Da의 당단백질로서 발현되는 4량체이다. 각 사슬의 아미노-말단 ("N") 부분은 항원 인식에 주로 기여하는 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각 사슬의 카르복시-말단 ("C") 부분은 불변 영역을 규정하고, 단일 불변 도메인을 가지는 경쇄와 중쇄는 통상 불변 도메인과 힌지 영역을 가진다. 그러므로 IgG 분자의 경쇄의 구조는 n-VL-CL-c이고 IgG 중쇄의 구조는 n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c이다 (여기서 H는 힌지 영역이고, n 및 c는 각각 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단을 나타낸다).
항원의 에피토프에 결합하는 무상, 미변형 항체 (예컨대 IgG 항체)의 능력은 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 상의 가변 도메인 (즉 각각 VL 도메인 및 VH 도메인)의 존재에 좌우된다. 항체 경쇄와 항체 중쇄의 상호작용 및, 특히 그것의 VL 및 VH 도메인의 상호작용은 항체의 에피토프-결합 부위들 중 하나를 형성한다. IgG 분자의 가변 영역은 에피토프와 접촉하는 잔기들을 함유한 상보성 결정 영역 (CDR), 및 프레임워크 절편 (FR)으로 언급되고, 일반적으로 구조를 유지하며 CDR 루프의 위치를 결정하여 그런 접촉을 허용하는 (비록 특정 프레임워크 잔기들이 또한 항원과 접촉할 수 있긴 하지만) 비-CDR 절편으로 구성된다. 그러므로, VL 및 VH 도메인은 구조 n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c를 가진다. 항체 경쇄의 제 1, 제 2 및 제 3 CDR인 (또는 그것들로서 작용할 수 있는) 폴리펩티드는 본원에서 각각 CDR L 1 도메인, CDR L 2 도메인 및 CDR L 3 도메인으로 표시된다. 유사하게, 항체 중쇄의 제 1, 제 2 및 제 3 CDR인 (또는 그것들로서 작용할 수 있는) 폴리펩티드는 본원에서 각각 CDR H 1 도메인, CDR H 2 도메인 및 CDR H 3 도메인으로 표시된다. 그러므로, 용어 CDRL1 도메인, CDRL2 도메인, CDRL3 도메인, CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인은 단백질에 통합될 때 그 단백질이 그런 단백질이 경쇄 및 중쇄를 가지는 항체이거나 또는 다이아바디 (diabody)이거나 단일-사슬 결합 분자 (예컨대 scFv, BiTe 등) 또는 단백질의 또 다른 유형인지의 여부에 관계없이 특이적 에피토프에 결합할 수 있게 되는 것을 유발하는 폴리펩티드에 대해 지시된다. 그런 항체들과는 대조적으로, scFv 구성물은 도메인들이 기능성 에피토프-결합 부위로의 두 개의 도메인의 자체-조립을 허용하기 위해 충분한 길이의 가요성 링커에 의해 분리되어 있는 단일 폴리펩티드 사슬에 함유된 항체의 VL 및 VH 도메인을 포함한다. VL 및 VH 도메인들의 자체-조립이 불충분한 길이 (약 12 아미노산 잔기 미만)의 링커로 인해 불가능하게 되는 경우, scFv 구성물 중 두 개는 2가 분자를 형성하기 위하여 서로와 상호작용할 수 있는데, 한 사슬의 VL은 다른 사슬의 VH와 결합된다 (Marvin et al. (2005) "Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies," Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658에서 개관됨).
진단에서의 알려져 있는 용도에 더불어, 항체들은 치료제로서 유용한 것으로 밝혀졌다. 최근 수십년 동안 항체의 치료적 잠재력에서 관심이 다시 부흥되었고, 항체들은 생명공학-유도된 약물의 선두 부류 중 하나가 되었다 (Chan, C.E. et al. (2009) "The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases," Singapore Med. J. 50(7):663-666). 거의 200개의 항체-기반 약물이 사용할 수 있도록 승인되었거나 개발 중에 있다.
용어 "단클론성 항체"는 균일한 항체 집단을 나타내는데, 단클론성 항체는 항원의 선택적 결합에 포함되는 아미노산들 (자연 발생 및 비-자연 발생)로 구성된다. 단클론성 항체들은 고도로 특이적이며, 단일 에피토프 (또는 항원성 부위)에 대해 지시된다. 용어 "단클론성 항체"는 무상 단클론성 항체 및 전-길이 단클론성 항체뿐 아니라, 그것들의 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2 Fv), 단일 사슬 (scFv), 그것들의 돌연변이, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화된 단클론성 항체, 키메라 단클론성 항체, 및 필요한 특이성 및 항원에 결합하는 능력의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 어떠한 다른 변형된 형태를 포함한다. 항체의 공급원 또는 그것이 만들어지는 방식 (예컨대 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 유전자이식 동물 등에 의해)과 관련하여 제한하고자 하는 의도는 없다. 그 용어는 상기에서 "항체"의 정의하에 기술된 단편등뿐 아니라 전체 면역글로불린을 포함한다. 단클론성 항체의 제조 방법은 기술분야에 공지되어 있다. 사용될 수 있는 한 방법은 Kohler, G. 등의 방법 (Kohler, G. et al. (1975) "Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity," Nature 256:495-497) 또는 그것의 변형이다. 전형적으로, 단클론성 항체들은 마우스, 래트 또는 토끼에서 개발된다. 항체들은 동물을 면역원성 양의 세포, 세포 추출물 또는 원하는 에피토프를 함유한 단백질 제제로 면역시킴으로써 제조된다. 면역원은, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 일차 세포, 배양된 셀라인, 암성 세포, 단백질, 펩티드, 핵산 또는 조직일 수 있다. 면역화에 사용된 세포들은 면역원으로서 사용되기 전에 일정 기간 동안 (예컨대 적어도 24시간) 배양될 수 있다. 세포들은 그 자체로 또는 비-변성 보조제, 예컨대 Ribi와 함께 면역원으로서 사용될 수 있다 (예컨대 Jennings, V.M. (1995) "Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production," ILAR J. 37(3):119-125 참조).
일반적으로, 세포들은 무상으로 유지되어야 하고 바람직하게는 면역원으로서 사용될 때 생존가능해야 한다. 무상 세포들은 항원이 면역화된 동물에 의해 파괴된 세포들보다 잘 검출되도록 허용할 수 있다. 변성 또는 너무 강한 보조제, 예컨대 프로이드 보조제의 사용은 세포를 파괴할 수 있고, 따라서 사용이 만류된다. 면역원은 주기적 간격으로 여러 번, 예컨대 2주마다, 또는 주마다 투여될 수 있고, 또는 동물에서의 생존성을 유지하기 위한 그런 방법으로 (예컨대 조직 재조합체로) 투여될 수 있다. 다르게는, 기존의 단클론성 항체들 및 원하는 병원성 에피토프에 대해 면역특이적인 어떠한 다른 동등한 항체들이 서열화되고 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 수단에 의해 재조합적으로 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 그런 항체는 서열화되고 그런 다음 폴리뉴클레오티드가 발현 또는 증식을 위한 벡터안에 클론된다. 관심의 항체를 코드화하는 서열은 숙주 세포의 벡터에서 유지될 수 있고 그런 다음 숙주 세포는 미래의 사용을 위해 연장되고 냉동될 수 있다. 그런 항체들의 폴리뉴클레오티드 서열은 키메라 항체, 인간화된 항체 또는 개화된 (caninized) 항체를 생성하기 위한, 또는 친화성 또는 항체의 다른 특징을 개선하기 위한 유전자 조작에 사용될 수 있다. 항체의 인간화의 일반적인 원리는 항체의 항원-결합 부분의 염기 서열을 보유하는 한편, 항체의 비-인간 나머지 부분을 인간 항체 서열과 바꾸는 것을 포함한다. 단클론성 항체를 인간화하기 위해서는 4개의 일반적 단계가 있다. 그것들은: (1) 출발하는 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 뉴클레오티드 및 예측된 아미노산 서열을 측정하는 단계, (2) 인간화된 항체 또는 개화된 항체를 디자인하는 단계, 즉 인간화 또는 개화 과정 중에 어떠한 항체 프레임워크 영역을 사용할 것인지 결정하는 단계 (3) 실제로 인간화 또는 개화 방법론/기법 및 (4) 인간화된 항체를 형질전환하고 발현시키는 단계. 예를 들면 미국 특허 번호 4,816,567; 5,807,715; 5,866,692; 및 6,331,415 참조.
그런 항체들의 에피토프-결합 도메인은 불변 도메인 위로 융합된 완전한 가변 도메인 또는 가변 도메인의 적절한 프레임워크 영역 위로 이식된 유일한 상보성 결정 영역 (CDR) 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 항원-결합 부위는 야생형이거나 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다. 이것은 인간 개체에서 면역원으로서의 불변 영역을 제거하지만, 외래 가변 영역에 대한 면역 반응의 가능성은 남아있다 (LoBuglio, A.F. et al. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224). 또 다른 접근법은 인간-유도된 불변 영역을 제공하는 것뿐 아니라, 가변 영역들을, 가능한 인간 형태에 밀접하게 그것을 개조하기 위해 변형하는 것에 집중한다. 중쇄 및 경쇄 둘 다의 가변 영역들은 주어진 종에서 상대적으로 보존되고 추정적으로 CDR에 대한 스캐폴딩을 제공하는 4개의 프레임워크 영역 (FR)이 양옆에 있는, 의문의 항원에 대한 반응이 다르고 결합 능력을 결정하는 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 함유하고 있는 것이 알려져 있다. 비-인간 항체들이 특정 항원과 관련하여 제조될 때, 가변 영역은 변형될 인간 항체에 존재하는 FR 상의 비-인간 항체로부터 유도된 CDR을 이식함으로써 "개조"되거나 "인간화"될 수 있다. 다양한 항체에 이 접근법을 적용하는 것은 문헌에 기록되어 있다: Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy," Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity," Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) "Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation," Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) "Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity," Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) "Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) "Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo," Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) "Humanized Antibodies For Antiviral Therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) "Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; and Co, M.S. et al. (1992) "Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen," J. Immunol. 148:1149-1154. 일부 구체예에서, 인간화된 항체들은 모든 CDR 서열을 보존한다 (예를 들어, 인간화된 마우스 항체는 마우스 항체들로부터의 모든 6개의 CDR을 함유한다). 다른 구체예에서, 인간화된 항체들은 원래의 항체와 관련하여 서열이 상이한 하나 이상 CDR (1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)의 CDR을 가진다.
B. 이중-특이적 항체, 다중-특이적 다이아바디 및 DART TM 다이아바디
천연 항체들은 단지 하나의 에피토프 종에 결합할 수 있지만 (즉 그것들은 "단일-특이적"임), 그 종의 다수의 복사물에 결합할 수 있다 (즉 그것들은 2가 또는 다중가를 나타낼 수 있다). 광범위한 재조합 이중-특이적 항체 포맷이 개발되었는데 (예컨대 PCT 공개 번호 WO 2008/003116, WO 2009/132876, WO 2008/003103, WO 2007/146968, WO 2007/146968, WO 2009/018386, WO 2012/009544, WO 2013/070565 참조), 그것들 중 대부분은 항체 코어 (IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM)를 항체 코어에 대해 또는 항체 코어 내에서 추가의 결합 단백질 (예컨대 scFv, VL VH 등)에 융합하기 위해, 또는 다수의 항체 부분을 융합하기 위해 또는 CH2-CH3 도메인과 같은 이종이량체화-촉진 도메인 또는 대체 폴리펩티드를 융합하기 위해 링커 펩티드를 사용한다 (WO 2005/070966, WO 2006/107786A WO 2006/107617A, WO 2007/046893). 전형적으로, 그런 접근법들은 절충과 균형을 포함한다. 예를 들어, PCT 공개 번호 WO 2013/174873, WO 2011/133886 및 WO 2010/136172에는 링커의 사용이 치료 환경에 문제점들을 유발할 수 있다는 것이 개시되고, CL 및 CH1 도메인이 그것들의 각각의 자연적 위치로부터 전환되고 (switched), VL 및 VH 도메인이 하나 이상의 항원에 결합하는 것을 허용하기 위해 다양화되어 있는 것이 교시된다 (WO 2008/027236; WO 2010/108127). 그러므로, 이들 문서에 개시된 분자들은 결합 특이성을 추가의 항원 종들에 결합하는 능력과 교환 (trade)한다. PCT 공개 번호 WO 2013/163427 및 WO 2013/119903에는 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질 부가물을 함유하도록 CH2 도메인을 변형시키는 것이 개시된다. 그 문헌은 CH2 도메인이 이펙터 기능을 중재하는 데 단지 최소 역할만을 하는 것으로 보인다고 지적한다. PCT 공개 번호 WO 2010/028797, WO2010028796 및 WO 2010/028795에는 그것의 Fc 도메인들이 추가의 VL 및 VH 도메인들로 대체되어서, 3-가 결합 분자를 형성하는 재조합 항체들이 개시된다. PCT 공개 번호 WO 2003/025018 및 WO2003012069에는 개별적인 사슬들이 scFv 도메인들을 함유하는 재조합 다이아바디들이 개시된다. PCT 공개 번호 WO 2013/006544에는 단일 폴리펩티드 사슬로서 합성된 후 단백질 가수분해되어 이종이량체 구조들을 생성하는 다중-가 Fab 분자들이 개시된다. 그러므로, 이들 문헌에 개시된 분자들은 이펙터 기능을 중재하는 능력의 전부 또는 일부를 추가의 항원에 결합하는 능력으로 교환한다. PCT 공개 번호 WO 2014/022540, WO 2013/003652, WO 2012/162583, WO 2012/156430, WO 2011/086091, WO 2007/075270, WO 1998/002463, WO 1992/022583 및 WO 1991/003493에는 항체 또는 항체 부분에 추가의 결합 도메인 또는 기능성 기들을 첨가하는 것이 개시된다 (예컨대 다이아바디의 항체 경쇄에의 첨가, 또는 추가의 VL 및 VH 도메인들의 항체 경쇄 및 중쇄에의 첨가, 또는 이종성 융합 단백질의 첨가 또는 다중 Fab 도메인들의 상호간의 교체). 그러므로, 이들 문헌에 개시된 분자들은 천연 항체 구조를 추가의 항원 종들에 결합하는 능력으로 교환한다.
기술분야에는 둘 이상의 상이한 에피토프 종들과 결합할 수 있다 (즉 2-가 또는 다중-가에 더불어 이중-특이성 또는 다중 특이성을 나타낼 수 있다)는 점에서 그런 천연 항체들과 상이한 다이아바디를 제조하는 능력에 대해 추가로 주지된다 (예컨대 Holliger et al. (1993) "'Diabodies': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; US 2004/0058400 (Hollinger et al.); US 2004/0220388 (Mertens et al.); Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672; WO 02/02781 (Mertens et al.); Olafsen, T. et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications," Protein Eng Des Sel. 17(1):21-27; Wu, A. et al. (2001) "Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single-chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange," Protein Engineering 14(2):1025-1033; Asano et al. (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain," Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) "Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy," Cancer Res. 69(12):4941-4944 참조).
다이아바디의 디자인은 단일-사슬 가변 도메인 단편 (scFv)의 구조를 기반으로 한다. 그런 분자들은 경쇄 및/또는 중쇄 가변 도메인들을 짧은 연결 펩티드를 통해 서로에 연결시킴으로써 만들어진다. Bird 등은 한 가변 도메인의 카르복시 말단과 다른 가변 도메인의 아미노 말단 사이에서 대략 3.5 nm를 잇는 연결 펩티드의 한 실례를 기술하였다 (Bird et al. (1988) "Single-Chain Antigen-Binding Proteins," Science 242:423-426). 다른 서열들의 링커들이 디자인되었고 사용되었다 (Bird et al. (1988) "Single-Chain Antigen-Binding Proteins," Science 242:423-426). 링커들은 계속해서 추가의 기능, 예컨대 약물의 부착 또는 고체 지지체에의 부착을 위해 변형될 수 있다. 단일-사슬 변이체들은 재조합적으로 또는 합성적으로 제조될 수 있다. scFv의 합성적 제조를 위해, 자동 합성기가 사용될 수 있다. scFv의 재조합 제조를 위해, scFv를 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 적합한 플라스미드가 적합한 숙주 세포, 즉 진핵, 예컨대 효모, 식물, 곤충 또는 포유류 세포에, 또는 원핵, 예컨대 대장균에 도입될 수 있다. 관심의 scFv를 코드화하는 폴리뉴클레오티드들은 폴리뉴클레오티드의 결찰과 같은 기본적인 조작에 의해 만들어질 수 있다. 그 결과의 scFv는 기술분야에 알려져 있는 표준 단백질 정제 기법들을 사용하여 분리될 수 있다.
미국 특허 번호 7,585,952 및 미국 특허 공개 번호 2010-0173978은 ErbB2에 면역특이적인 scFv 분자들에 관련된다. scFv 분자의 유형인 이중-특이적 T 세포 참여자 (engager)("BiTE")가 기술되었다 (WO 05/061547; Baeuerle, P et al. (2008) "BiTE: A New Class Of Antibodies That Recruit T Cells," Drugs of the Future 33:137-147; Bargou, et al. 2008) "Tumor Regression in Cancer Patients by Very Low Doses of a T Cell-Engaging Antibody," Science 321:974-977). 그런 분자들은 두 개의 항원-결합 도메인을 가지는 단일 폴리펩티드 사슬 분자로 구성되는데, 그 중 하나는 CD3 에피토프에 면역특이적으로 결합하고 제 2는 표적 세포의 표면에 존재하는 항원에 면역특이적으로 결합한다.
비-단일-특이적 다이아바디의 제공은 상이한 에피토프들을 발현하는 세포를 공동-결찰하고 공동-정위시키는 능력이라는 유의미한 장점을 제공한다. 그러므로 2가 다이아바디는 치료법 및 면역진단을 포함하여 광범위한 용도를 가진다. 2-가는 다양한 용도에서의 다이아바디의 디자인 및 엔지니어링의 거대한 유연성을 허용함으로써, 다량체 항원에 대한 증강된 결합력, 상이한 항원의 교차-결합 및 두 가지 표적 항원의 존재에 따른 특이적 세포 유형들에 대해 지시된 표적화를 제공한다. 증가된 원자가, 낮은 분해 속도 및 순환계로부터의 신속한 클리어런스 (~50 kDa 이하의 작은 크기의 다이아바디에 대한)에 기인하여, 기술분야에 공지되어 있는 다이아바디 분자들은 또한 종양 영상화 분야에서 특정 용도를 나타냈다 (Fitzgerald et al. (1997) "Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris," Protein Eng. 10:1221). 특히 중요한 것은 상이한 세포들의 공동-결찰, 예를 들면 세포독성 T 세포의 종양 세포에의 교차-결합이다 (Staerz et al. (1985) "Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells," Nature 314:628-631, and Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody," Protein Eng. 9:299-305).
다이아바디 에피토프-결합 도메인들은 T 림프구, 자연 살해 (NK) 세포 또는 다른 단핵 세포들 상에서 발현되는 CD3, CD16, CD32, CD64 등과 같은 어떠한 면역 이펙터 세포의 표면 결정기에 대해 지시될 수 있다. 많은 연구에서, 이펙터 세포 결정기, 예컨대 Fcγ 수용체 (FcγR)에 결합하는 다이아바디가 또한 이펙터 세포를 활성화시키는 것으로 밝혀졌다 (Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody," Protein Eng. 9:299-305; Holliger et al. (1999) "Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T-cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins," Cancer Res. 59:2909-2916; WO 2006/113665; WO 2008/157379; WO 2010/080538; WO 2012/018687; WO 2012/162068). 정상적으로, 이펙터 세포 활성화는 Fc-FcγR 상호작용을 통해 이펙터 세포에 대한 항원 결합된 항체의 결합에 의해 촉발된다; 그러므로, 이런 견지에서, 다이아바디 분자들은 그것들이 Fc 도메인을 포함하는 지의 여부와 관계없이 Ig-유사 기능성을 나타낼 수 있다 (예컨대 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 이펙터 기능 분석에서 분석되거나 본원에서 예시된 바와 같음 (예컨대 ADCC 분석)). 교차-결합 종양 및 이펙터 세포에 의해, 다이아바디는 이펙터 세포를 조양 세포와 근접한 곳으로 가져갈 뿐 아니라 효과적인 종양 사멸을 유도한다 (예컨대 Cao et al. (2003) "Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics," Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197 참조).
예를 들어, 미국 특허 번호 6,171,586은 2개의 항체를 그것들의 F(ab')2 단편을 얻기 위해 단백질 가수분해적으로 절단하고, 그런 단편들을 분자내 이황화 결합 형성을 방지하기 위한 조건하에서 환원시킨 후, 단편들을 혼합하여 이중-특이적 항체를 생성함으로써 이중-특이적 항체들을 제조하는 것에 관련된다. 미국 특허 번호 6,551,592; 6,994,853 및 8,277,806 및 PCT 공개 번호 WO 2012/156430, WO 2002/020039, WO 2000/018806 및 WO 1998/003670은 동시에 T 세포 및 종양 세포 상의 다른 항원들, 및 이중-특이적 항체의 Fc 부분을 통하여, 그런 수용체를 가지고 있는 세포들의 Fc 수용체에 결합할 수 있는 삼중-특이적 항체들의 제조와 관련된다. PCT 공개 번호 WO 2000/018806, WO 1998/003670 및 WO 2006/072152는 T 세포 및 다른 항원들에 동시에 결합할 수 있는 삼중-특이적 항체들의 제조에 관련된다. 미국 특허 공개 번호 2008-0057054에는 아밀로이드 베타 올리고머에 대한 결합 요소 및 경막 단백질 텔렌케팔린 (telencephalin)에 대한 결합 요소에 특이적인 이중-특이적 콘쥬게이트가 개시된다. 미국 특허 공개 번호 2010-0291112는 하나 (또는 두개)의 종양 항원(들) 및 이펙터 세포 항원 (예컨대 CD3, CD16 CD32, CD64 등)에 특이적으로 결합하는 이중-특이적 및 삼중-특이적 단일-사슬 Fv 분자들에 관련된다.
PCT 공개 번호 WO 1999/042597 및 WO 1998/006749에는 결합된 MHC 결합 펩티드가 있거나 없이, 인간 주요 조직적합성 복합체 결합 도메인을 포함하는 항체 유도체가 개시된다. PCT 공개 번호 WO 02/072141은 그것의 온-속도 (분자들을 표적화하기 위해 결합하는 속도) 및 오프-속도 (표적 분자들을 방출하는 속도)가 달라서 다른 그런 표적 분자에 대한 결합과 비교하여 한 표적에 우선적으로 결합하게 되는 다중-특이적 결합 분자들에 관련된다. 삼중-특이적 분자는, 예를 들어 항-CD3 또는 항-CD28인 일가의 제 1 부분, 및 질환에 걸린 표적 세포 또는 면역 세포 상의 하나 이상의 표적 리간드에 면역특이적으로 결합하는 이가의 면역 기능 발휘 부분을 포함하는 제 2 부분을 가지는 분자이다.
미국 특허 번호 7,695,936 및 특허 공개공보 2007/ 0196363은 두 개의 항체의 중쇄로부터 형성된 이중-특이적 항체에 관련되는데, 그 중 하나는 그것의 중쇄로 엔지니어링된 융기된 부분을 가지고 제 2는 그것의 중쇄로 엔지니어링된 상보하는 공동을 가진다. 그런 상보하는 "손잡이" 및 "구멍"의 존재는 동일한 항체의 2개의 중쇄를 함유하는 단일-특이적 동종-항체와 관련하여 이중-특이적 이종-항체 (각각의 그런 항체의 하나의 중쇄를 가짐)를 우선적으로 형성하는 것으로 교시된다. CD3 및 종양 세포 항원에 면역특이적인 것들을 포함하여, 다양한 이중-특이적 이종-항체들이 제안된다. CD3, CD8 및 CD37 (T 세포 증식의 조절에 포함된 B 세포상에서 우세하게 발현된 경막 단백질)에 면역특이적인 일부를 포함하여, 다양한 삼중-특이적 이종-항체들 또한 제안되지만 (Robak, T. et al. (2014) "Anti-CD37 Antibodies For Chronic Lymphocytic Leukemia," Expert Opin. Biol. Ther. 14(5):651-661), 그러나, 그것들의 생성 메커니즘 및 그것들의 구조의 개시는 제공되지 않는다.
PCT 공보 WO2012-162561은 각각이 개재된 CH2-CH3 도메인에 의해 분리되어 있는 2개의 다이아바디 구조 를 포함하는 2개의 폴리펩티드를 포함하는 이중-특이적, 4가 결합 분자에 관련된다. 그 문헌은 또한 폴리펩티드 사슬들 중 2개가 2개 항원에 대한 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인을 함유하고, 다른 2개의 폴리펩티드 사슬은 항원들에 대한 상보하는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인 및 말단 CH2-CH3 도메인을 함유하는 4개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 4가 결합 분자에 관련된다. 이중-특이적, 4가 결합 분자들은 그것들의 각각의 CH2-CH3 도메인의 회합 (association)을 통해 형성한다. 4개의 폴리펩티드 사슬 구성물에서, "경"쇄는 중쇄에 공유적으로 결합되지 않고, 따라서 불안정성을 유발한다 (Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Iike Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672 참조). 그 문헌은 그런 공유 결합을 제공하기 위해 사슬들이 변경되지만, 이중-특이성이 제거되는 댓가를 치뤄야 하는 제 3 구성물 (즉 분자는 단일-특이적임)을 개시한다. CD2, CD3, CD4, CD8, CD161, 케모카인 수용체, CD95, CCR5 등에 대해 특이성을 가지는 분자들이 개시된다. CD3 및 CD8 둘 다에 결합할 수 있는 이중-특이적 분자는 개시되지 않는다.
그러나, 상기 장점들은 가장 중요한 비용에 직면한다. 그런 비-단일-특이적 다이아바디의 형성은 둘 이상의 뚜렷하고 상이한 폴리펩티드의 성공적인 조립을 필요로 한다 (즉 그런 형성은 다이아바디가 상이한 폴리펩티드 사슬 종들의 이종이량체화를 통해 형성될 것을 필요로 한다). 이 사실은 동일한 폴리펩티드 사슬의 동종이량체화를 통해 형성되는 단일-특이적 다이아바디와 대조적이다. 적어도 2개의 다른 폴리펩티드 (즉 두 개의 폴리펩티드 종)가 비-단일-특이적 다이아바디를 형성하기 위해 제공되어야 하기 때문에, 그리고 그런 폴리펩티드의 동종이량체화가 비활성 분자를 유도하기 때문에 (Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588), 그런 폴리펩티드의 생성은 동일 종의 폴리펩티드 사이의 공유 결합을 방지하기 위한 그런 방식으로 이루어져야 한다 (Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588). 그러므로 기술분야에는 그런 폴리펩티드들의 비-공유적 회합이 교시되어 있다 (예컨대 Olafsen et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications," Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain," Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588; Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672 참조).
그러나, 기술분야는 비-공유적으로 회합된 폴리펩티드들로 구성된 이중-특이적 다이아바디가 불안정하고 비-기능적 단량체들로 쉽게 분해된다는 것을 인식하였다 (예컨대 Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672 참조).
이런 도전에 직면하여, 기술분야는 DART TM 로 명명된, 안정한, 공유적으로 결합된 이종이량체 비-단일-특이적 다이아바디를 개발하는 데 성공하였다 (예컨대 미국 특허 공개 번호 2013-0295121; 2010-0174053 및 2009-0060910; 유럽 특허 공개 번호 EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221 및 PCT 공개 번호 WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538; 및 Moore, P.A. et al. (2011) "Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma," Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. et al. (2010) "Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold," Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; Johnson, S. et al. (2010) "Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion," J. Mol. Biol. 399(3):436-449). 그런 다이아바디들은 둘 이상의 공유적으로 복합체화된 폴리펩티드를 포함하고 하나 이상의 시스테인 잔기를 이황화 결합이 형성되는 것을 허용하는 사용된 폴리펩티드 종의 각각으로 엔지니어링하고 그로써 2개의 폴리펩티드 사슬을 공유적으로 결합시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 그런 구성물의 C-말단에 시스테인 잔기를 첨가하는 것은 폴리펩티드 사슬 사이의 이황화 결합을 허용하여서, 결과적인 이종이량체를 2가 분자의 결합 특성을 간섭하지 않으면서 안정화시키는 것으로 밝혀졌다.
DARTTM 구체예들은 많이 있다. 가장 간단한 DARTTM 구체예의 2개의 폴리펩티드의 각각은 3개의 도메인을 포함한다 (도 1a). 제 1 폴리펩티드는: (i) 제 1 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VL1)의 결합 영역을 포함하는 제 1 도메인, (ii) 제 2 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VH2)의 결합 영역을 포함하는 제 2 도메인 및 (iii) 시스테인 잔기 (또는 시스테인-함유 도메인) 및 제 2 폴리펩티드 사슬과의 이종이량체화를 촉진하는 작용을 하는 이종이량체화-촉진 도메인을 함유하는 제 3 도메인을 포함한다 (도 1b). 제 3 도메인의 시스테인 잔기 (또는 시스테인-함유 도메인)는 다이아바디의 제 2 폴리펩티드에 대한 제 1 폴리펩티드 사슬의 공유 결합을 촉진하는 작용을 한다. 제 2 폴리펩티드는: (i) 상보하는 제 1 도메인 (VL2-함유 도메인), (ii) 상보하는 제 2 도메인 (VH1-함유 도메인) 및 (iii) 시스테인 잔기 (또는 시스테인-함유 도메인) 및, 임의로, 제 1 폴리펩티드 사슬과의 이종이량체화를 촉진하기 위해 제 1 폴리펩티드 사슬의 이종이량체화-촉진 도메인과 복합체를 형성하는 상보하는 이종이량체화-촉진 도메인을 함유한다. 제 2 폴리펩티드 사슬의 제 3 도메인의 시스테인 잔기 (또는 시스테인-함유 도메인)는 다이아바디의 제 1 폴리펩티드 사슬에 대한 제 2 폴리펩티드 사슬의 공유 결합을 촉진하는 작용을 한다. 그런 분자들은 안정하고, 강력하며 둘 이상의 항원에 동시에 결합하는 능력을 가진다. 그것들은 표적 항원들을 발현하는 세포들의 재-지시된 T 세포 중재된 살해를 촉진할 수 있다.
한 구체예에서, 제 1 및 제 2 폴리펩티드 각각의 제 3 도메인은 시스테인 잔기를 함유하는데, 그것은 이황화 결합을 통해 함께 폴리펩티드에 결합하도록 작용한다. 하나 또는 둘 다의 폴리펩티드의 제 3 도메인은 추가로 CH2-CH3 도메인의 서열을 가짐으로써, 다이아바디 폴리펩티드의 복합체 형성이 세포 (예컨대 B 림프구, 수지상 세포, 자연 살해 세포, 대식세포, 호중구, 호산성 세포, 호염기성 세포 및 비만 세포)의 Fc 수용체에 결합할 수 있는 Fc 도메인을 형성하게 된다 (도 2a 및 2b).
그런 분자들의 많은 변화가 기술되어 있다 (예컨대 미국 특허 공개 번호 2013-0295121; 2010-0174053 및2009-0060910; 유럽 특허 공개 번호 EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221 및 PCT 공개 번호 WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538 참조). 이들 Fc-함유 DART는 3개의 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다 (예컨대 도 2b). 그런 다이아바디의 제 1 폴리펩티드 사슬은 3개의 도메인을 함유한다: (i) VL1-함유 도메인, (ii) VH2-함유 도메인 및 (iii) 시스테인 잔기 (또는 시스테인-함유 도메인) 및 이종이량체화-촉진 도메인을 함유하는 도메인 및 (iv) 시스테인 잔기 (또는 시스테인-함유 도메인) 및 CH2-CH3 도메인. 그런 DARTTM의 제 2 폴리펩티드 사슬은: (i) VL2-함유 도메인, (ii) VH1-함유 도메인 및 (iii) 시스테인 잔기 (또는 시스테인-함유 도메인) 및 제 1 폴리펩티드 사슬과의 이종이량체화를 촉진하는 이종이량체화-촉진 도메인을 함유하는 도메인을 함유한다. 제 2 폴리펩티드 사슬의 제 3 도메인의 시스테인 잔기 (또는 시스테인-함유 도메인)는 다이아바디의 제 1 폴리펩티드 사슬에 대한 제 2 폴리펩티드 사슬의 공유 결합을 촉진하는 작용을 한다. 그런 DARTTM의 제 3 폴리펩티드 사슬은 시스테인 잔기 (또는 시스테인-함유 도메인) 및 CH2-CH3 도메인을 포함한다. 그러므로, 그런 DARTTM의 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 함께 결합하여 에피토프에 결합할 수 있는 VL1/VH1 결합 부위와, 뿐만 아니라 제 2 에피토프에 결합할 수 있는 VL2/포2 결합 부위를 형성한다. 제 1 및 제 2 폴리펩티드는 그것들의 각각의 제 3 도메인에 시스테인 잔기들을 포함하고 있는 이황화 결합을 통해 서로에 결합된다. 주지할 것은, 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬은 서로 복합체화하여 이황화 결합을 통해 안정화되는 Fc 도메인을 형성한다. 그런 다이아바디들은 증강된 효능을 가진다. 그런 Fc-함유 DART TM 는 두 가지 배향 중 어느 것이든 가질 수 있다 (표 1).
제 1 배향 제 3 사슬 NH2-CH2-CH3-COOH
제 1 사슬 NH2-VL1-VH2-Cys-이종이량체-촉진 도메인-CH2-CH3-COOH
제 2 사슬 NH2-VL2-VH1-Cys-이종이량체-촉진 도메인-COOH
제 2 배향 제 3 사슬 NH2-CH2-CH3-COOH
제 1 사슬 NH2-CH2-CH3-VL1-VH2-Cys-이종이량체-촉진 도메인-COOH
제 2 사슬 NH2-VL2-VH1-Cys-이종이량체-촉진 도메인-CDOOH
Ig-DART TM (도 3a 및 3b) 및 Fc-DART TM 다이아바디 (도 3c)로 명명된 보다 복잡한 DARTTM 다이아바디들도 기술되어 있다 (WO 2012/018687). Fc-DARTTM는 4개의 폴리펩티드 사슬을 가진다. 그런 다이아바디의 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬은 3개의 도메인을 가진다: (i) VL1-함유 도메인, (ii) VH2-함유 도메인 및 (iii) CH2-CH3 서열을 함유하는 도메인. Fc-DARTTM의 제 2 및 제 4 폴리펩티드는 (i) VL2-함유 도메인, (ii) VH1-함유 도메인 및 (iii) Fc-DARTTM 제 1 폴리펩티드 사슬과의 이종이량체화 및 공유 결합을 촉진하는 도메인을 함유한다. 제 3 및 제 4, 및 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 동일하거나 상이하여 단일-특이적, 이중-특이적 또는 사중-특이적인 4가 결합을 허용할 수 있다. 그런 보다 복잡한 DARTTM 분자는 또한 공유적으로 결합된 복합체를 형성하는 기능을 하는 시스테인-함유 도메인을 가진다. Fc-DARTTM 다이아바디는 CH1 및 CL 도메인을 함유한다.또 다른 구성물은, 4가 분자가 바람직하지만 Fc는 필요하지 않은 용도, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만, "TandAb"로도 언급되는 4가 탠덤 항체에 대해 기술분야에 공지되어 있는데 (예컨대 미국 특허 공개 번호 2005-0079170, 2007-0031436, 2010-0099853, 2011-020667 2013-0189263; 유럽 특허 공개 번호 EP 1078004, EP 2371866, EP 2361936 및 EP 1293514; PCT 공개 번호 WO 1999/057150, WO 2003/025018 및 WO 2013/013700), 그것들은 VH1, VL2, VH2 및 VL2 도메인을 각각 가지고 있는 두 개의 동일한 사슬의 동종-이량체화에 의해 형성된다.
III. 재-지시된 살해
상기에서 논의된 것과 같이, CD8, MHCI 및 T 세포 수용체 사이의 상호작용은 세포독성 T 세포의 활성화 및 그것들의 인근 세포 살해 능력을 유도한다. CD3 및 종양 항원에 결합하는 이중-특이적 다이아바디들은 세포독성 CD8+ T 세포를 종양 세포에 공동-정위시키는 데 사용되어 그런 세포들의 "재-지시된 살해"를 이룰 수 있다 (WO 2010/080538, WO 2012/018687, WO/2012/162068, US 2010/0174053; US 2013/0295121).
그러나, CD3+ T 세포를 종양 또는 병원체 세포의 유전자좌에 공동-정위시킴으로써 암 또는 감염성 질환을 치료하고자 하는 노력은 완전히 성공적이지 못하였다. CD3+ CD8+ 세포독성 T 세포 및 CD3+ CD4+ T 헬퍼 세포 둘 다에 결합하는 CD3을 표적으로 하는 항체들은 두 가지 그런 세포들의 활성화를 유도한다. 그러나, 활성화된 CD3+ CD4+ T 헬퍼 세포에 의해 생성된 사이토킨들은 심각한 부작용, 예컨대 생명-위협성 사이토킨 급습 (storm)에 기여한다 (Ferran, C. et al. (1990) "Cytokine-Related Syndrome Following Injection Of Anti-CD3 Monoclonal Antibody: Further Evidence For Transient In Vivo T Cell Activation," Eur. J. Immunol. 20:509-515). 추가로, 그런 항-CD3 항체들은 활성화시 사이토킨을 발현하고 (Johansson, Martina et al. (2003) "A Unique Population of Extrathymically Derived αβTCR + CD4 - CD8 - T Cells with Regulatory Functions Dominates the Mouse Female Genital Tract," J. Immunol. 170:1659-1666; Blank, C. et al. (2003) "Absence of Programmed Death Receptor 1 Alters Thymic Development and Enhances Generation of CD4/CD8 Double-Negative TCR-Transgenic T Cells," J. Immunol. 171:4574-4581; McIntyre, M.S.F. et al. (2011) "Consequences Of Double Negative Regulatory T Cell And Antigen Presenting Cell Interaction On Immune Response Suppression," Intl. Immunopharmacol. 11:597-603), CD3+ CD8+ T 세포에 의해 중재된 세포독성을 억제하는 (Hillhouse, E.E. (2013) "A Comprehensive Review Of The Phenotype And Function Of Antigen-Specific Immunoregulatory Double Negative T Cells," J. Autoimmun. 40:58-65) 다른 세포 유형, 이를테면 CD3+ CD4- CD8- 이중 네거티브 T 세포 등에 결합한다.
CD3을 표적으로 하는 항체들의 투여와 관련된 사이토킨 생성은 CD8과 종양 항원을 표적으로 하는 이중-특이적 항체들을 사용하여 피할 수 있을 것으로 제안되었다 (Michalk, I. et al. (2014) "Characterization of a Novel Single-Chain Bispecific Antibody for Retargeting of T Cells to Tumor Cells via the TCR Co-Receptor CD8," PLOS One 9(4):e95517, pages 1-8). 그러므로 항-CD8 항체들은 그것들이 단독으로 사용될 때 이펙터 기능을 유도할 수 있을 것인지를 측정하기 위하여 연구되었다. Clement 등은 시험한 7개의 항-인간 CD8 항체 중 6개가 CD8+ T 세포를 활성화하는 데는 실패하였지만, 그런 활성화는 매우 고농도 (10 내지 100 μg/mL)의 항-인간 CD8 항체 "OKT8"을 사용하여 이루어질 수 있다고 보고하였다 (Clement, M. et al. (2011) "Anti-CD8 Antibodies Can Trigger CD8 + T Cell Effector Function In The Absence Of TCR Engagement And Improve Peptide-MHCI Tetramer Staining," J. Immunol. 187(2):654-663). 2개의 CD8 분자에 대한 협력적인 결합이 그런 효과에 필요하였는데, OKT8 F(ab)'2 단편들은 그 효과를 중재할 수 있는 것으로 밝혀진 반면, OKT8 Fab는 그렇게 할 수 없는 것으로 밝혀졌다.
그러므로, 그런 연구들에도 불구하고, 항-CD4 또는 항-CD8 항체들의 사용에 집중된 사이토킨-중재된 독성은 전체적으로 이해되지 않았다. 연구 결과 항-CD3 항체의 투여시 볼 수 있는 사이토킨 독성은 CD3+ CD4+ T 세포를 고갈시키거나 CD3+ CD8+ T 세포를 삭제함으로써 제거되지 않는 것이 드러났다. 그러므로, CD3+ CD4+ T 세포 및 CD3+ CD8+ T 세포 둘 다 항-CD3 항체의 독성 효과에 기여하고, 전체 효과를 중재하기 위해 상대적으로 적은 수의 세포가 필요하다 (Finck, B.K. et al. (1992) "The Role Of T-Cell Subsets In The Response To Anti-CD3 Monoclonal Antibodies," Clin Immunol Immunopathol. 1992 Dec;65(3):234-41).
더욱이, CD8과 종양 항원을 표적으로 하는 이중-특이적 항체는 CD3+ CD8+T 세포 및 종양 세포에 특이적이지 않으며, 오히려 CD8+ 세포 및 종양 세포에만 특이적이다. 특히, 자연 살해 (NK) 세포의 CD3- CD8+ 하위세트는 그런 항체에 의해 표적화될 수 있다. 대부분의 NK 세포를 대표하는 그런 세포는 사이토킨의 강력한 생산자이고 그것들의 활성화는 사이토킨 급습에 기여하는 것 같다. CD3- CD8+ NK 세포는 HIV-1-감염된 침팬지에서 IFN-γ의 일차적인 공급원이다 (Rodriquez, A.R. et al. (2007) "Influence Of Interleukin-15 On CD8+ Natural Killer Cells In Human Immunodeficiency Virus Type 1-Infected Chimpanzees," J. Gen. Virol. 88:641-651).
따라서, 모든 선행 진보에도 불구하고, 특히 더 낮은 치료적 농도에서, 암세포 또는 병원체-감염 세포를 공격하기 위해 신체의 면역 시스템을 더욱 격렬하게 지시할 수 있는 향상된 조성물에 대한 요구가 여전히 남아 있다. 아래에서 상세하게 설명되는 것과 같이, 본 발명은 (1) CD3의 에피토프, (2) CD8의 에피토프 및 (3) 표적 세포 (특히 암세포 또는 병원체-감염 세포) 상에 발현되는 질환-관련 항원의 에피토프에 결합하는 삼중-특이적 결합 분자를 제공함으로써 이런 요구를 해소한다.
발명의 요약
본 발명은 3개의 결합 도메인을 가지고 그로써 3개의 에피토프에 대한 동조된 결합을 중재할 수 있는 다중-사슬 폴리펩티드 분자인, 삼중-특이적 결합 분자에 관한 것이다. 결합 도메인은 삼중-특이적 결합 분자가 어떠한 3개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있도록 선택될 수 있다. 그런 에피토프는 동일한 항원의 에피토프거나 둘 또는 3개의 상이한 항원의 에피토프일 수 있다. 발명은 또한 신규한 ROR1-결합 항체, 뿐만 아니라 그것의 유도체 및 그런 조성물에 대한 용도를 제공한다.
본 발명은 특히 3개의 에피토프가 그런 에피토프들 중 하나 또는 두개가 면역 시스템 세포, 특히 세포독성 림프구 면역 시스템 세포 (CTL)의 에피토프(들)이 되도록 선택되고, 나머지 에피토프(들)은 질환-관련 항원의 에피토프(들)인 그런 삼중-특이적 결합 분자들의 구체예에 관련된다. 그런 특히 바람직한 삼중-특이적 결합 분자들은 질환-관련 항원을 발현하는 세포에 세포독성 림프구 세포를 정위할 수 있고, 그로써 질환-관련 항원을 발현하는 세포들을 살해하는 것을 용이하게 할 수 있다. 질환-관련 항원은 암 항원이거나, 또는 병원체 (예컨대 박테리아, 진균, 바이러스 또는 원생동물) 감염의 특징인 항원일 수 있다. 보다 구체적으로, 발명은 (1) CD3의 에피토프, (2) CD8의 에피토프 및 (3) 질환-관련 항원의 에피토프에 대한 동조된 결합을 중재할 수 있는 그런 삼중-특이적 결합 분자들에 관련된다. CD3 및 CD8, 및 질환-관련 항원에 대한 결합에 의해, 그런 분자들은 세포독성 T 세포를 질환-관련 항원을 제공하는 세포에 공동-정위시켜서, 그런 T 세포의 활성화 및 질환-관련 항원을 발현하는 세포들에 맞서는 세포독성 반응의 개시를 유도한다.
상세하게 설명하면, 발명은 3개의 상이한 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 삼중-특이적 결합 분자를 제공하고, 이때 결합 분자는 함께 공유적으로 복합체화된 4개의 상이한 폴리펩티드 사슬을 포함하고
(I) 제 1 항원에 존재하는 에피토프 I에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항원-결합 도메인 I 및 제 2 항원에 존재하는 에피토프 II에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항원-결합 도메인 II, 이때 항원-결합 도메인 I 및 항원-결합 도메인 II는 둘 다 다이아바디-형 결합 도메인이고;
(II) 제 3 항원에 존재하는 에피토프 III에 면역특이적으로 결합할 수 있는 비-다이아바디-형 항원-결합 도메인 III; 및
(III) 2개의 CH2-CH3 도메인의 서로에의 회합에 의해 형성된 Fc 도메인을 포함하고,
제 1, 제 2 및 제 3 항원은 동일한 항원이거나, 또는 독립적으로 동일하거나 서로 상이한 항원들이다.
발명은 특히 그런 삼중-특이적 결합 분자의 구체예에 관련되는데, 이때 에피토프 I, 에피토프 II 또는 에피토프 III 중 하나는 세포 수용체의 에피토프이다.
발명은 추가적으로 그런 삼중-특이적 결합 분자들의 구체예들에 관련되는데, 이때 에피토프 I, 에피토프 II 또는 에피토프 III 중 하나는 질환-관련 항원의 에피토프이다 (및 특히 질환-관련 항원은 암세포의 표면에 배열된 암 항원이거나, 또는 병원체 또는 병원체-감염 세포의 표면에 배열된 병원체 항원이다).
발명은 추가적으로 그런 삼중-특이적 결합 분자들의 구체예들에 관련되는데, 이때 Fc 도메인은 세포 표면에 배열된 Fc 수용체에 결합할 수 있다.
발명은 특히 그런 삼중-특이적 결합 분자들의 구체예들에 관련되는데, 이때 에피토프 I, 에피토프 II 또는 에피토프 III 중 하나는 CD3의 에피토프이고, 에피토프 I, 에피토프 II 또는 에피토프 III 중 제 2는 CD8의 에피토프이며, 에피토프 I, 에피토프 II 또는 에피토프 III 중 제 3는 질환-관련 항원의 에피토프이고, 삼중-특이적 결합 분자들의 항원-결합 도메인 I, II 및 III은 세포독성 T 세포 및 질환-관련 항원을 발현하는 세포의 동조된 결합을 중재한다. 발명은 특히 그런 삼중-특이적 결합 분자들의 구체예들에 관련되는데, 이때 CD3, CD8은 T 세포의 표면에 배열되고 질환-관련 항원은 암 세포, 병원체 또는 병원체-감염 세포의 표면에 배열되며, 면역특이적 결합은 CD3 및 CD8, 및 질환-관련 항원을 공동-정위하기에 충분하고, 그로써 질환-관련 항원-배열 세포에 맞서 CD8-배열 T 세포의 활성화를 용이하게 한다.
발명은 추가적으로 상기-기술된 삼중-특이적 결합 분자들의 구체예들에 관련되는데, 이때 비-다이아바디-형 결합 도메인 III은 에피토프 III에 면역특이적으로 결합할 수 있는 Fab-형 결합 도메인 (VLIII/VHIII)을 포함하고, 분자는:
(A) (I) N-말단에서 C-말단 방향으로:
(1) 3개의 에피토프 중 제 1에 결합할 수 있는 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VLI);
(2) 3개의 에피토프 중 제 2에 결합할 수 있는 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VHII);
(3) (a) 제 1 시스테인-함유 도메인; 및 이종이량체-촉진 도메인; 또는
(b) 시스테인-함유 이종이량체-촉진 도메인;
(5) 제 2 시스테인-함유 도메인; 및
(6) IgG의 CH2 및 CH3 도메인
을 포함하거나; 또는
(II) N-말단에서 C-말단 방향으로:
(1) 제 1 시스테인-함유 도메인;
(2) IgG의 CH2 및 CH3 도메인;
(3) 3개의 에피토프 중 제 1에 결합할 수 있는 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VLI);
(4) 3개의 에피토프 중 제 2에 결합할 수 있는 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VHII);
(5) (a) 제 2 시스테인-함유 도메인; 및 이종이량체-촉진 도메인; 또는
(b) 시스테인-함유 이종이량체-촉진 도메인
을 포함하는 제 1 폴리펩티드 사슬;
(B) N-말단에서 C-말단 방향으로:
(1) 3개의 에피토프 중 제 2에 결합할 수 있는 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VLII);
(2) 3개의 에피토프 중 제 1에 결합할 수 있는 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VHI);
(3) (a) 제 1 시스테인-함유 도메인; 및 이종이량체-촉진 도메인; 또는
(b) 시스테인-함유 이종이량체-촉진 도메인
을 포함하는 제 2 폴리펩티드 사슬로서, 이때 제 2 폴리펩티드 사슬의 이종이량체-촉진 도메인은 제 1 폴리펩티드 사슬의 이종이량체-촉진 도메인에 상보하는 제 2 폴리펩티드 사슬;
(C) N-말단에서 C-말단 방향으로:
(1) 3개의 에피토프 중 제 3에 결합할 수 있는 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VHIII); 및
(2) CH1 도메인, 시스테인-함유 힌지 도메인 및 IgG의 CH2-CH3 도메인
을 포함하는 제 3 폴리펩티드 사슬; 및
(D) N-말단에서 C-말단 방향으로:
(1) 3개의 에피토프 중 제 3에 결합할 수 있는 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VLIII); 및
(2) 시스테인-함유 경쇄 불변 도메인 (CL)
을 포함하는 제 4 폴리펩티드 사슬을 포함하며;
(i) VLI 및 VHI 도메인은 회합하여 에피토프 I에 결합할 수 있는 도메인을 형성하고;
(ii) VLII 및 VHII 도메인은 회합하여 에피토프 II에 결합할 수 있는 도메인을 형성하며;
(iii) VLIII 및 VHIII 도메인은 회합하여 에피토프 III에 결합할 수 있는 도메인을 형성하고;
(iv) 제 1 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인 및 제 3 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인은 회합하여 Fc 도메인을 형성하며;
(v) 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 서로에 공유적으로 결합되고;
(vi) 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬은 서로에 공유적으로 결합되며; 및
(vii) 제 3 및 제 4 폴리펩티드 사슬은 서로에 공유적으로 결합된다.
발명은 추가적으로 상기-기술된 삼중-특이적 결합 분자들의 구체예들에 관련되는데,
(A) 이종이량체-촉진 도메인은 E-코일이고 상보하는 이종이량체-촉진 도메인은 K-코일이거나; 또는
(B) 이종이량체-촉진 도메인은 K-코일이고 상보하는 이종이량체-촉진 도메인은 E-코일이다.
발명은 추가적으로 상기-기술된 삼중-특이적 결합 분자들의 구체예들에 관련되는데,
(A) 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인들은 각각 SEQ ID NO:6의 서열을 가져서, 그것들의 회합으로부터 형성된 Fc 도메인은 정상적인 FcγR-중재된 이펙터 기능을 나타내거나; 또는
(B) 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인은 SEQ ID NO:6의 서열과 관련하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 가져서, 그것들의 회합으로부터 형성된 Fc 도메인은 변경된 FcγR-중재된 이펙터 기능을 나타낸다.
발명은 추가적으로 상기-기술된 삼중-특이적 결합 분자들의 구체예들에 관련되는데, 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인은 서로 상이하며 SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:8로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진다.
발명은 추가적으로 상기-기술된 삼중-특이적 결합 분자들의 구체예들에 관련되는데,
(A) 에피토프 I, 에피토프 II 및 에피토프 III은 각각 CD3의 에피토프, CD8의 에피토프 및 질환-관련 항원의 에피토프이거나;
(B) 에피토프 I, 에피토프 II 및 에피토프 III은 각각 CD3의 에피토프, 질환-관련 항원의 에피토프 및 CD8의 에피토프이거나;
(C) 에피토프 I, 에피토프 II 및 에피토프 III은 각각 CD8의 에피토프, CD3의 에피토프 및 질환-관련 항원의 에피토프이거나;
(D) 에피토프 I, 에피토프 II 및 에피토프 III은 각각 CD8의 에피토프, 질환-관련 항원의 에피토프 및 CD3의 에피토프이거나;
(E) 에피토프 I, 에피토프 II 및 에피토프 III은 각각 질환-관련 항원의 에피토프, CD3의 에피토프 및 CD8의 에피토프이거나; 또는
(F) 에피토프 I, 에피토프 II 및 에피토프 III은 각각 질환-관련 항원의 에피토프, CD8의 에피토프 및 CD3의 에피토프이다.
발명은 추가적으로 상기-기술된 삼중-특이적 결합 분자들의 구체예들에 관련되는데,
(A) CD3의 에피토프는 항체 OKT3, M291, YTH12.5, CD3 mAb 1 또는 CD3 mAb 2에 의해 인지된 CD3 에피토프이거나; 또는
(B) CD8의 에피토프는 항체 TRX2 또는 OKT8에 의해 인지된 CD8 에피토프이다.
발명은 추가적으로 상기-기술된 삼중-특이적 결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물에 관련된다.
발명은 추가적으로 유효량의 상기-기술된 약학 조성물을 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법에 관련되며, 이때 질환-관련 항원은 암 항원이다.
발명은 추가적으로 제 15항의 유효량의 약학 조성물을 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 병원체의 존재와 관련된 질환의 치료 방법에 관련되며, 이때 질환-관련 항원은 병원체 항원이다.
발명은 추가적으로 항-ROR1 항체 또는 ROR1-결합 단편에 관련되며, 이때 항체는
(A) SEQ ID NO:117의 서열을 가지는 CDRL1, SEQ ID NO:118의 서열을 가지는 CDRL2 및 SEQ ID NO:119의 서열을 가지는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 도메인; 및
(B) SEQ ID NO:120의 서열을 가지는 CDRH1, SEQ ID NO:121의 서열을 가지는 CDRH2 및 SEQ ID NO:122의 서열을 가지는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
발명은 추가적으로 그런 항-ROR1 항체 또는 그것의 ROR1-결합 단편의 구체예들에 관련되는데, 이때 항체는 SEQ ID NO:51의 서열을 가지는 경쇄 가변 도메인을 가진다. 발명은 추가적으로 그런 항-ROR1 항체 또는 그것의 ROR1-결합 단편의 구체예들에 관련되는데, 이때 항체는 SEQ ID NO:52의 서열을 가지는 중쇄 가변 도메인을 가지거나, 또는 SEQ ID NO:51의 서열을 가지는 경쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:52의 서열을 가지는 중쇄 가변 도메인 둘 다를 가진다.
발명은 추가적으로 다이아바디, BiTe 또는 그런 항-ROR1 항체들 중 어느 것의 ROR1 결합 단편을 포함하는 단일-사슬 항체에 관련된다.
발명은 추가적으로 상기-기술된 항-ROR1 항체들 또는 그것들의 ROR1-결합 단편들 중 어느 것과 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물에 관련된다. 발명은 추가적으로 유효량의 그런 약학 조성물을 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 방법에 관련된다.
도 1a 및 1b는 DARTTM 다이아바디의 도메인을 나타낸 다이아그램을 도시한다. 도 1a는 기본적인 DARTTM 다이아바디의 도메인을 나타낸 다이아그램을 도시한다. 도 1b는 각각 동일한 명암을 사용하여 도시된 동일한 에피토프를 인식하는 이종이량체-촉진 도메인 VL 및 VH 도메인을 가지는, 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 공유적으로 결합된 다이아바디의 개략도를 제시한다.
도 2a 및 2b는 각각 CH2 및 CH3 도메인을 가지거나 (도 2a) 단지 하나만이 CH2 및 CH3 도메인을 가져서 (도 2b), 회합된 사슬이 자연적으로 발생하는 Fc 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 공유적으로 결합된 다이아바디의 개략도를 제시한다. 동일한 에피토프를 인식하는 VL 및 VH 도메인은 동일한 명암을 사용하여 도시된다.
도 3a 내지 3c는 2쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성된 4가 다이아바디를 도시하는 개략도를 제시한다. 쌍들은 상이하고, 따라서 두 개의 에피토프 각각에 대하여 2가인 이중-특이적 분자를 초래하며, 이때 한 에피토프는 DR5의 에피토프이고 다른 하나는 이펙터 세포의 표면에 존재하는 분자의 에피토프이다. 각 쌍의 한 폴리펩티드는 CH2 및 CH3 도메인을 가져서, 회합된 사슬들이 자연적으로 발생하는 Fc 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 Fc 도메인을 형성한다. 동일한 에피토프를 인식하는 VL 및 VH 도메인은 동일한 명암을 사용하여 도시된다. 단지 한 쌍만의 에피토프 (동일한 명암으로 도시됨)가 DR5에 결합할 수 있다. 도 3a는 Ig 다이아바디를 도시한다. 도 3b는 E-코일 및 K-코일 이종이량체-촉진 도메인을 함유하는 Ig 다이아바디를 도시한다. 도 3c는 항체 CH1 및 CL 도메인을 함유하는 Fc-DARTTM 다이아바디를 도시한다. 표시 "VL1" 및 "VH1"은 각각 "제 1" 에피토프에 결합하는 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 표시한다. 유사하게, 표시 "VL2" 및 "VH2"는 각각 "제 2" 에피토프에 결합하는 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 표시한다.
도 4a 내지 4l은 바람직한 삼중-특이적 결합 분자의 도메인들을 나타내는 다이아그램을 제시한다. 도 4a 및 4b는 각각, 삼중-특이적 결합 분자의 비-다이아바디-형 결합 도메인이 Fab-형 결합 도메인 또는 T 세포 수용체 결합 도메인인 바람직한 삼중-특이적 결합 분자의 도메인들을 개략적으로 도시한다. 도 4c 및 4d는 각각, 비-다이아바디-형 결합 도메인이 Fab-형 결합 도메인 또는 T 세포 수용체-형 결합 도메인인 상이한 도메인 배향을 가지는 바람직한 삼중-특이적 결합 분자의 도메인들을 개략적으로 도시한다. 도 4e 내지 4j는 3개의 폴리펩티드 사슬을 가지는 유사한 분자들을 도시한다. 분자는 힌지 및 CL 도메인을 포함하거나 (도 4e, 4h) 또는 대체 링커 펩티드를 함유할 수 있다 (도 4f, 4i). 도 4k 및 4l은 5개의 폴리펩티드 사슬을 가지는 유사한 분자들을 도시한다.
도 5a 내지 5d는 A498 표적 세포 (도 5a), JIMT-1 표적 세포 (도 5b), CD5+/CD4- 게이팅된 (gated) PBMC (도 5c) 및 CD5+/CD4+ 게이팅된 PBMC (도 5d)에 결합하는 B7-H3 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 능력을 도시한다.
도 6a 내지 6c는 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 표적 세포의 재-지시된 살해를 중재하는 능력을 증명한다. 도 6a는 JIMT-1 세포의 세포 용해의 루시페라제 분석의 결과를 나타낸다. 도 6b는 JIMT-1 세포의 세포독성의 LDH 분석의 결과를 나타낸다. 도 6c는 A498 세포의 세포독성의 LDH 분석의 결과를 나타낸다.
도 7a 내지 7d는 JIMT-1 세포와 함께 인큐베이션될 때 T 세포 활성화를 중재하는 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 능력을 증명한다 (도 7a: CD4/CD69 T 세포; 도 7b: CD4/CD25 T 세포; 도 7c: CD8/CD69 T 세포; 도 7d: CD8/CD25 T 세포).
도 8a 내지 8d는 A498 세포와 함께 인큐베이션될 때 T 세포 활성화를 중재하는 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 능력을 증명한다 (도 8a: CD4/CD69 T 세포; 도 8b: CD4/CD25 T 세포; 도 8c: CD8/CD69 T 세포; 도 8d: CD8/CD25 T 세포).
도 9a 및 9b는 증가하는 농도의 B7-H3 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자 또는 B7-H3 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자의 함수로서의 인간 PMBC의 CD5+ CD4+ 게이팅된 (도 9a) 또는 CD5+ CD4- 게이팅된 (도 9b) 세포 집단을 도시한다. B7-H3 X CD3 DARTTM (Fc 도메인이 있거나 없음)이 대조표준으로서 사용되었다.
도 10a 내지 10c는 B7-H3 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 삼중-특이적 결합 분자의 세포독성에 미치는 상이한 CD8 결합 도메인의 효과를 도시한다.
도 11a 내지 11c는 CD3 결합 도메인에 대한 부위 A, 부위 B 또는 부위 C를 선택함으로써 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 결합을 조절하는 능력을 증명한다. 사용된 삼중-특이적 결합 분자는 질환-관련 항원, B7-H3에 면역특이적으로 결합할 수 있다. 세포독성은 루시페라제 분석을 사용하여 측정된다.
도 12a 내지 12c는 LDH 분석을 사용하여 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자에 의해 중재된 세포독성에 미치는 위치 선택 (부위 A, 부위 B 또는 부위 C)의 효과를 증명한다.
도 13a 내지 13e는 B7-H3 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자, CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 / B7-H3 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자 및 B7-H3 mAb 1 / CD8 mAb 1 / CD3 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자를 사용하여 세포독성에 미치는 위치 변화의 효과를 도시한다. Fc 도메인을 가지는 B7-H3 X CD3 DARTTM이 대조표준으로서 사용되었다.
도 14a 및 14b는 CD5+ CD4+ 세포 (도 14a) 및 CD5+ CD4- 세포 (도 14b) 두 세포에 대해 크게 감소된 결합을 보이는, 부위 C에서의 CD3 결합 도메인의 대체를 도시한다.
도 15a 및 15b는 증가하는 농도의 5T4 mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자 또는 5T4 mAb2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자의 함수로서의 인간 PMBC의 CD5+ CD4+ 게이팅된 (도 15a) 또는 CD5+ CD4- 게이팅된 (도 15b) 세포 집단을 도시한다. 5T4 X CD3 DARTTM (Fc 도메인이 있거나 없음)이 대조표준으로서 사용되었다.
도 16a 내지 16c는 세포독성에 미치는 위치 변화의 관찰된 효과가 사용된 CD8 결합 도메인에 좌우되지 않았음을 도시한다.
도 17a 내지 17c는 ROR1을 발현하는 표적 세포의 재-지시된 살해를 중재하는 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 능력을 증명한다.
도 18a 내지 18c는 가용성, 고정된 gp140 단백질 (도 18a), 인간 CD3 (도 18b) 및 gp140 단백질과 인간 CD3 둘 다 (도 18c)에 결합하는, HIV mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 및 HIV mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 능력을 도시한다.
도 19a 내지 19c는 대조 삼중-특이적 결합 분자 (도 19c)에 대조적으로 HIV env-발현 HEK293/D375 세포에 결합하는, HIV mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 및 HIV mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 능력을 도시한다.
도 20a 및 20b는 인간 PBMC의 CD5+/CD5- 세포 집단에 대해 특이적 결합을 나타내기 위해 결합하는 HIV mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 및 HIV mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 능력을 도시한다.
도 21a 내지 21f는 테트라사이클린의 존재 또는 부재하에 Jurkat 세포에 미치는 HIV mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 또는 HIV mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자에 의해 중재된 세포독성 활성을 도시한다. 도 21e 및 21f는 대조 항-RSV 항체 (팔리비주맙 (Palivizumab); RSV mAb 1) 삼중-특이적 결합 분자의 세포독성 활성을 나타낸다.
도 22a 및 22b는 정제된 pan T 세포 및 HIV mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 or HIV mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자와 함께 인큐베이션한 후 1일 및 2일째에 살아있는 HIV env-발현 Jurkat 522 FY 세포의 백분율을 도시한다.
도 23a 내지 23c는 CD4+, CD8+ 또는 pan T 세포를 사용하여 HIV env-발현 Jurkat 522 FY 세포에 미치는 HIV mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 CTL 활성의 평가 결과를 도시한다.
도 24a 내지 24c는 CD4+, CD8+ 또는 pan T 세포를 사용하여 HIV env-발현 Jurkat 522 FY 세포에 미치는 HIV mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 CTL 활성의 평가 결과를 도시한다.
도 25a 내지 25c는 CD3 mAb 2 결합 도메인 (도 25a), 및 그것의 CD3 mAb 2 로우 (Low)(도 25b) 및 CD3 mAb 2 패스트 (Fast)(도 25c) 친화성 변이체를 가지는 DARTTM 분자에 대한 결합의 동역학을 도시한다.
도 26a 및 26b는 증가하는 농도의 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자, 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 로우 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자 및 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 패스트 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 함수로서의 인간 PMBC의 CD5+ CD4+ 게이팅된 (도 26a) 또는 CD5+ CD4- 게이팅된 (도 26b) 세포 집단을 도시한다.
도 27a 내지 27c는 LDH 분석을 사용하여 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 세포독성에 미치는 CD3 mAb 변이체 (CD3 mAb 2 로우 및 CD3 mAb 2 패스트)의 효과를 도시한다.
도 28a 내지 28f는 증가하는 농도의 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자, 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 로우 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자 및 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 패스트 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 존재하에 공여자 1로부터의 PBMC로부터 방출된 IFN-γ (도 28a), TNF-α (도 28b), IL-10 (도 28c), IL-6 (도 28d), IL-4 (도 28e) 및 IL-2 (도 28f)의 수준을 도시한다.
도 29a 내지 29f는 증가하는 농도의 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자, 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 로우 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자 및 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 패스트 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 존재하에 공여자 2로부터의 PBMC로부터 방출된 IFN-γ (도 28a), TNF-α (도 28b), IL-10 (도 28c), IL-6 (도 28d), IL-4 (도 28e) 및 IL-2 (도 28f)의 수준을 도시한다.
본 발명은 3개의 결합 도메인을 가지고 그러므로 3개의 에피토프에 대한 동조된 결합을 중재할 수 있는 다중-사슬 폴리펩티드 분자인 삼중-특이적 결합 분자에 관련된다. 결합 도메인은 삼중-특이적 결합 분자가 어떠한 3개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있도록 선택될 수 있다. 그런 에피토프들은 동일한 항원의 에피토프들 또는 둘 또는 3개의 상이한 항원들의 에피토프들일 수 있다. 발명은 또한 신규한 RPR1-결합 항체, 뿐만 아니라 그것의 유도체 및 그런 조성물에 대한 용도를 제공한다.
I. 일반적 기법 및 일반적 정의
본 발명의 실시는, 다르게 표시되지 않는 한, 기술분야의 숙련도 내에 있는, 분자 생물학 (재조합 기법을 포함함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 종래 기법들을 사용할 것이다. 그런 기법들은 문헌에서 전체적으로 설명된다. 예컨대, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition (Sambrook et al. Eds., 2001) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications (Methods in Molecular Biology), Herdewijn, P., Ed., Humana Press, Totowa, NJ; Oligonucleotide Synthesis (Gait, M.J., Ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press, Totowa, NJ; Cell Biology: A Laboratory Notebook (Cellis, J.E., Ed., 1998) Academic Press, New York, NY; Animal Cell Culture (Freshney, R.I., Ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (Mather, J.P. and Roberts, P.E., Eds., 1998) Plenum Press, New York, NY; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (Doyle, A. et al., Eds., 1993-8) John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.) New York, NY; Weir's Handbook of Experimental Immunology (Herzenberg, L.A. et al. Eds. 1997) Wiley-Blackwell Publishers, New York, NY; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller, J.M. et al. Eds., 1987) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., Eds., 1987) Greene Pub. Associates, New York, NY; PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, K. et al., Eds., 1994) Birkhauser, Boston MA; Current Protocols in Immunology (Coligan, J.E. et al., eds., 1991) John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Short Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, 1999) Hoboken, NJ; Immunobiology 7 (Janeway, C.A. et al. 2007) Garland Science, London, UK; Antibodies (P. Finch, 1997) Stride Publications, Devoran, UK; Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., 1989) Oxford University Press, USA, New York NY); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (Shepherd, P. et al. Eds., 2000) Oxford University Press, USA, New York NY; Using Antibodies: A Laboratory Manual (Harlow, E. et al. Eds., 1998) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; The Antibodies (Zanetti, M. et al. Eds. 1995) Harwood Academic Publishers, London, UK); and DeVita, Hellman, and Rosenberg's Cancer: Principles & Practice of Oncology, Eighth Edition, DeVita, V. et al. Eds. 2008, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA.
II. 본 발명의 바람직한 삼중-특이적 결합 분자
A. 결합 능력
본 발명의 바람직한 삼중-특이적 결합 분자는 3개의 상이한 에피토프에 동조적으로 및 동시에 결합할 수 있다. 본 발명의 그런 바람직한 삼중-특이적 결합 분자는:
(I) 제 1 항원에 존재하는 "에피토프 I"에 면역특이적으로 결합할 수 있는 "결합 도메인 I" 및 제 1 항원에 존재하는 "에피토프 II"에 면역특이적으로 결합할 수 있는 "결합 도메인 II", 여기서 상기 결합 도메인 I 및 결합 도메인 II는 둘 다 "다이아바디-형 결합 도메인"이고;
(II) 제 3 항원에 존재하는 "에피토프 III"에 면역특이적으로 결합할 수 있는 "비-다이아바디-형" "결합 도메인 III"; 및
(III) 두 개의 CH2-CH3 도메인이 서로에 복합체화함으로써 형성된 Fc 도메인을 포함한다.
전형적으로, 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자는 각각이 아미노 말단과 카르복실 말단을 가지는 4개의 상이한 폴리펩티드 사슬을 포함하겠지만 (도 4a 내지 4d, 도 5a 및 도 5b 참조), 분자들은 그런 폴리펩티드 사슬을 서로에 융합함으로써 (예컨대 펩티드 결합을 통해) 또는 그런 폴리펩티드 사슬을 추가의 폴리펩티드 사슬을 형성하기 위해 나눔으로써 더 적거나 더 많은 수의 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다. 도 4e 내지 4j는 본 발명의 이런 측면을 3개의 폴리펩티드 사슬을 가지는 그런 분자들을 개략적으로 도시함으로써 예시한다. 도 4k 및 4l은 본 발명의 이런 측면을 5개의 폴리펩티드 사슬을 가지는 그런 분자들을 개략적으로 도시함으로써 예시한다.
비록 그런 삼중-특이적 결합 분자가 특히 바람직하긴 하지만, 발명은 추가로 구체적으로, 그 중 2개는 암 항원에 대해 지시된 결합 특이성이고, 하나는 이펙터 세포 항원에 대해 지시된 결합 특이성인, 3개의 결합 특이성을 가지는 분자를 제조하기에 충분한 결합 도메인들의 어떠한 조합이든지 포함하는 삼중-특이적 결합 분자를 포함한다. 그러므로, 예를 들어, 발명은 3개의 Fab-형 결합 도메인을 포함하는 삼중-특이적 결합 분자, 하나의 2가, 이중-특이적 항체 도메인 (예를 들면 2개의 상이한 경쇄 및 2 개의 상이한 중쇄를 복합체화함으로써 형성됨) 및 하나의 Fab-형 결합 도메인을 포함하는 삼중-특이적 결합 분자, 2개의 2가, 이중-특이적 항체 도메인 (예를 들면 4개의 상이한 경쇄 및 2 개의 상이한 중쇄를 복합체화함으로써 형성됨)을 포함하지만, 항체 도메인 중 하나는 비활성이 된 삼중-특이적 결합 분자, 등을 포함한다.
용어 "폴리펩티드", "폴리펩티드 사슬" 및 "펩티드"는 본원에서 어떠한 길이의 아미노산, 그러나 특히 3, 5, 10, 15, 20 또는 25 아미노산 잔기보다 큰 길이의 아미노산의 중합체로, 이때 2개, 보다 바람직하게는 모든 아미노산 잔기가 아미드 (펩티드) 결합 (-NH-C(O)-)을 통해 결합되어 있는 중합체를 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 그러나 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산에 의해 방해될 수 있다. 용어는 또한 자연적으로 또는 개입에 의해; 예를 들면 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 어떠한 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 성분과의 콘쥬게이션에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 또한 그 정의에는, 예를 들면 아미노산의 하나 이상의 유사체 (이를테면 예를 들어 비자연 아미노산 등을 포함함), 뿐만 아니라 기술분야에 알려져 있는 다른 변형들을 함유하는 폴리펩티드도 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드는 단일-사슬로서 또는 복합체화된 사슬로서 발생할 수 있다.
"다이아바디-형 결합 도메인"은 다이아바디, 특히 DART® 다이아바디의 에피토프-결합 도메인이다. 용어 "다이아바디" 및 "DART® 다이아바디"는 상기에서 논의되었고, 바람직하게 공유 상호작용을 통해 서로와 복합체를 형성하여 적어도 2개의 에피토프 결합 부위를 형성하고, 그것들은 동일하거나 상이한 에피토프를 인식할 수 있는 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 분자를 나타낸다. 다이아바디 또는 DART® 다이아바디의 폴리펩티드 사슬 중 2개는 각각 면역글로불린 경쇄 가변 영역 및 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하지만, 이들 영역은 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 상호작용하지 않는다 (즉 그것들은 상호간에 "상보하는"이 아니다). 오히려, 다이아바디 또는 DART® 다이아바디 사슬들 중 하나 (예컨대 제 1)의 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 상이한 (예컨대 제 2) 다이아바디 또는 DART® 다이아바디 폴리펩티드 사슬의 면역글로불린 경쇄 가변 영역과 상호작용하여 에피토프 결합 부위를 형성한다. 유사하게, 다이아바디 또는 DART® 다이아바디 폴리펩티드 사슬들 중 하나 (예컨대 제 1)의 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 상이한 (예컨대 제 2) 다이아바디 또는 DART® 다이아바디 폴리펩티드 사슬의 면역글로불린 중쇄 가변 영역과 상호작용하여 에피토프 결합 부위를 형성한다. DART® 다이아바디 분자는 다음의 문헌들에서 개시된다: 미국 특허 공개 번호 2013-0295121; 2010-0174053 및 2009-0060910; 유럽 특허 공개 번호.EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221 및 PCT 공개 번호 WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538; WO 2006/113665, WO 2008/157379 및 Moore, P.A. et al. (2011) "Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma," Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. et al. (2010) "Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bi-specific Antibody Scaffold," Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; 및 Johnson, S. et al. (2010) "Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion," J. Mol. Biol. 399(3):436-449.
결합 도메인 III은 바람직하게 "비-다이아바디-형" 결합 도메인으로, 그것은 결합 도메인 III이 다이아바디-형 결합 도메인의 구조를 갖지 않는 것을 나타내기 위해 의도된다. 바람직하게, 결합 도메인 III은 Fab-형 결합 도메인 또는 수용체-형 결합 도메인인 비-다이아바디-형 결합 도메인이다. 본원에서 사용되는 용어 "Fab-형 결합 도메인"은 면역글로불린 경쇄의 VL 도메인과 면역글로불린 중쇄의 상보하는 VH 도메인의 상호작용에 의해 형성된 에피토프-결합 도메인을 나타낸다. Fab-형 결합 도메인은 Fab-형 결합 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩티드 사슬이 단지 단일 에피토프-결합 도메인만을 포함하는 반면, 다이아바디-형 결합 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩티드 사슬은 적어도 2개의 에피토프-결합 도메인을 포함한다는 점에서 다이아바디-형 결합 도메인과 상이하다. 그러므로, 본원에서 사용되는 Fab-형 결합 도메인은 다이아바디-형 결합 도메인과 구별된다. 본원에서 사용되는 용어 "수용체-형 결합 도메인"은 2개의 폴리펩티드의 상호작용에 의해 형성된 세포 수용체의 에피토프-결합 도메인을 나타낸다. 수용체-형 결합 도메인은 본원에서 T 세포 수용체 알파 사슬의 가변 도메인과 T 세포 수용체 베타 사슬의 가변 도메인의 상호작용으로부터 형성된 T 세포 수용체-형 결합 도메인을 참조로 예시된다. 그런 T 세포 수용체 결합 도메인은 MHC의 맥락에서 나타낸 펩티드를 인식하고 따라서 세포내 에피토프들을 인식할 수 있다. 비록 발명이 그런 수용체-형 결합 도메인들과 관련하여 예시되지만, T 세포 수용체-형 결합 도메인 이외의 수용체-형 결합 도메인들도 사용될 수 있고 본 발명에 포함되는 것이 인지될 것이다. 수용체-형 결합 도메인을 가지는 수용체들의 다른 실례들은 IL-2 수용체, IL-4 수용체, IL-7 수용체, IL-9 수용체, IL-15 수용체, IL-21 인슐린 수용체 및 흉선 기질 림포포이에틴을 포함한다.
본 발명의 삼중-특이적 결합 분자는 그러므로 4가 결합 분자, 예컨대 2가 항체의 이량체화로부터 생성된 것들과 구별되며, 바람직하게는 3 및 4개가 아닌 결합 도메인을 가진다. 아래에서 논의되는 것과 같이, 본 발명의 삼중특이적 분자들은 추가의 결합 도메인 (예컨대 알부민-결합 도메인, FcγR-결합 도메인 등)을 가질 수 있다.그런 추가의 결합 도메인들은 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 3개의 결합 분자들 중 하나로서 여겨지거나 카운트되는 것으로 의도되지 않는다.
본원에서 폴리펩티드와 관련하여 사용되는 용어 "회합" 또는 "회합하는"은 (예컨대 하나의 다이아바디 폴리펩티드의 다른 것에 대한, 면역글로불린 경쇄의 면역글로불린 중쇄에 대한, 하나의 CH2-CH3 도메인의 다른 CH2-CH3 도메인에 대한, 등등) 폴리펩티드들의 비-공유 연합을 나타내기 위해 의도된다. 용어 "복합체" 또는 "복합체화"는 폴리펩티드들의 공유 연합을 나타내기 위해 의도된다.
본원에서 사용되는 것과 같이, 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 결합 도메인들은 그것의 결합 도메인들 중 적어도 2개 및 결합 도메인들 중 적어도 전부가 그것들의 각각의 인식된 에피토프 또는 결합 리간드에 동시에 결합될 수 있다면 "동조된 결합"을 중재한다고 말할 수 있다. 그런 결합은 동시적일 수 있다. 그러나, 본 발명의 한 측면은 그런 결합 도메인이 그것들의 인식된 에피토프에 결합하는 "온" 및/또는 "오프" 속도를 변형시키는 것에 관련된다. 여기서 사용되는 결합의 "온 속도"는 그런 결합 도메인들이 에피토프를 인식하고 그것들의 인식된 에피토프에 결합을 시작하는 친화성의 척도이다. 대조적으로, 결합의 "오프 속도"는 결합 도메인:에피토프 복합체의 안정성의 정도의 척도이다. 결합의 "온" 및/또는 "오프"속도는 결합 도메인의 CDR의 아미노산 서열을 변경시킴으로써 변형될 수 있다. 아래에서 논의되는 것과 같이, 어떠한 CDR 변형과 관계없이, 본 발명의 분자들의 동조된 결합의 정도는 그것들의 결합 도메인의 형태를, 특별한 결합 도메인 (즉 VLx/VHx 도메인)이 결합 도메인 III으로서 또는 결합 도메인 III에 대해 내부 또는 외부 다이아바디-형 결합 도메인으로서 존재하도록 바꿈으로써 조절될 수 있다 (하기에서 상세하게 논의됨).
본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 결합 도메인의 온- 및 오프-속도는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법들, 예를 들면 Biacore® 분석에 의해 쉽게 측정될 수 있다 (Jason-Moller, L. et al. (2006) "Overview Of Biacore Systems And Their Applications," Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 19:Unit 19.13; Swanson, S.J. (2005) "Characterization Of An Immune Response," Dev. Biol. (Basel). 122:95-101; Buijs, J. et al. (2005) "SPR-MS In Functional Proteomics," Brief Funct. Genomic Proteomic. 4(1):39-47; Karlsson, R. et al. (2004) "SPR For Molecular Interaction Analysis: A Review Of Emerging Application Areas," J. Mol. Recognit. 17(3):151-161; Van Regenmortel, M.H. (2003) "Improving The Quality Of BIACORE-Based Affinity Measurements," Dev. Biol. (Basel) 112:141-151; Malmqvist, M. (1999) "BIACORE: An Affinity Biosensor System For Characterization Of Biomolecular Interactions," Biochem. Soc. Trans. 27(2):335-340; Malmqvist, M. et al. (1997) "Biomolecular Interaction Analysis: Affinity Biosensor Technologies For Functional Analysis Of Proteins," Curr. Opin. Chem. Biol. 1(3):378-383; Fivash, M. et al. (1998) "Biacore For Macromolecular Interaction," Curr. Opin. Biotechnol. 9(1):97-101; Malmborg, A.C. et al. (1995) "Biacore As A Tool In Antibody Engineering," J. Immunol. Methods. 183(1):7-13). 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 결합 도메인의 온- 및 오프-속도는 그런 결합 도메인을 코드화하는 핵산 분자들의 무작위 또는 지시된 돌연변이생성에 의해 쉽게 변경될 수 있고, 이어서 그런 변경된 결합 동역학을 나타내는 돌연변이된 단백질들을 코드화하는 능력에 대해 회수된 핵산 분자들의 기본적인 스크리닝이 이어진다.
본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 결합 도메인은 에피토프에 "면역특이적" 방식으로 결합한다. 본원에서 사용되는 것과 같이, 항체, 다이아바디 또는 다른 에피토프-결합 분자는 만약 그것이 다른 분자 (즉 에피토프)의 영역에 보다 빈번하게, 보다 신속하게, 더 긴 기간 동안 및/또는 더 큰 친화성으로 다른 에피토프들과 관련하여 그 에피토프와 반응하거나 결합한다면, "면역특이적으로" 결합하는 것이라 말할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체는 이 바이러스 에피토프에, 그것이 다른 바이러스 에피토프 또는 비-바이러스 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 것보다 더 큰 친화성, 결합력으로, 보다 쉽게 및/또는 더 긴 기간 동안 결합하는 항체이다. 또한 이 정의를 읽음으로써, 예를 들어 제 1 표적에 면역특이적으로 결합하는 항체 (또는 부분 또는 에피토프)는 제 2 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있거나 그렇지 못할 수 있다. 그 자체로, "특이적 결합"은 본질적으로는 독점적인 결합을 (비록 그것을 포함할 수는 있지만) 필요로 하지 않는다. 일반적으로, 반드시 그런 것은 아니나, 결합에 대한 언급은 "특이적" 결합을 의미한다. 2 개의 분자는 만약 결합이 그것들의 각각의 리간드에 결합하는 수용체들과의 특이성을 나타낸다면, "물리특이적" 방식으로 서로에 결합할 수 있는 것으로 말할 수 있다.
그러므로, 가장 간단한 구체예에서, 본 발명의 바람직한 결합 분자들은 3개의 상이한 에피토프들에 대한 동조된 결합을 중재할 수 있는 적어도 삼중-특이적인 것이다. 중요하게도, 그런 분자들은 항원에 결합할 수 있는 적어도 3개의 "부위": 결합 도메인 III으로부터 가장 멀리 위치한 "외부" 다이아바디-형 결합 도메인, 결합 도메인 III에 가장 가까이 위치한 "내부" 다이아바디-형 결합 도메인 및 결합 도메인 III 자체를 가진다. 그런 도메인들의 위치는 각각 부위 A, 부위 B 및 부위 C로서 표시된다 (도 4a 내지 4d).
에피토프 I, II 및 III에 결합하는 결합 도메인들은 서로 상이하도록 선택된다. 그러나, 에피토프 I, II 및 III은 동일한 항원의 에피토프, 2개의 상이한 항원들의 에피토프 또는 3개의 상이한 항원들의 에피토프일 수 있다. 그러므로 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자는 1, 2 또는 3개의 상이한 항원 분자들에 동조적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자는 어떠한 가능한 에피토프 및 어떠한 가능한 항원과 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자는 이펙터 세포 (예컨대 CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD22, CD32B, CD64, B 세포 수용체 (BCR), T 세포 수용체 (TCR) 및 NKG2D 수용체)의 에피토프, 또는 세포독성 T 세포의 에피토프 (예컨대 세포독성 T 세포에 존재하는 CD8) 또는 질환-관련 항원의 에피토프에 결합하는 1, 2 또는 3개의 결합 도메인 또는 그런 잠재적인 결합 도메인들의 어떠한 조합을 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 "질환-관련 항원"은 "병원체-감염된" 세포 또는 "암세포"에서 특징적으로 발현되지만, 정상 세포에서는 특징적으로 발현되지 않는 항원이다.
본원에서 사용되는 용어 "병원체-감염된" 세포는 박테리아 (예컨대 대장균, 클로스트리디움 디피실(C. difficile), 살로넬라 타이피뮤리움(Salmonella thyphimurium), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 나이세리아 고노로에아(Neisseria gonorrhoeae), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 헤모필루스 인플루엔자(Hemophilus influenzae), 쉬겔라 다이센테리아(Shigella dysenteriae), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 및 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia) 등), 진균 (예컨대 칸디다(Candida), 아스페르길루스(Aspergillus), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 코키다이오이데스(Coccidioides), 히스토플라스마(Histoplasma), 뉴모시스티스(Pneumocystis), 스타키보트리스(Stachybotrys)등), 원생동물 (아메바(Amoebozoa), 엑스카바타(Excavata), 크로말베올라타(Chromalveolata), 엔타메바(Entamoeba), 플라스모디움(Plasmodium), 기아르디아(Giardia), 트리파노소마(Trypanosoma), 코키디아(Coccidia), 베스노이티아(Besnoitia), 다이크로코엘리움(Dicrocoelium), 레이쉬마니아(Leishmania) 등) 또는 바이러스 (특히 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, B 바이러스 (마카인 허피스바이러스 I), BK 바이러스, 분야바이러스, 치쿤구니야(chikungunya) 바이러스, 콕삭키(cocksackie) 바이러스, 코로나바이러스, 사이토메갈로바이러스, 동부형 말 뇌막염 바이러스, 에볼라 바이러스, 엔테로바이러스, 엡스타인-바르 바이러스, 한타바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, 단순 포진 바이러스 1, 단순 포진 바이러스 2, 인간 발포 바이러스, 인간 포진 바이러스 3, 인간 포진 바이러스 5, 인간 포진 바이러스 6, 인간 포진 바이러스 7, 인간 면역결핍 바이러스, 인간 유두종 바이러스, 인간 β-백혈병 바이러스, 인간 T 세포 백혈병 바이러스 I, 인간 T 세포 백혈병 바이러스 II, 인플루엔자 바이러스, JC 바이러스, JEV, 카포시 육종-관련 포진바이러스, 라사 바이러스, 림프구성 융모성 수막염 바이러스, 마버그 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 니파 바이러스, 노로바이러스, 노워크 바이러스, 오르토레오바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 파르보바이러스, 소아마비 바이러스, 광견병 바이러스, 레오바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 리노바이러스, 리프트 밸리열 바이러스, 로타바이러스, 풍진 바이러스, 천연두 바이러스, 세인트루이스 뇌막염 바이러스, 바리올라 메이저(variola major) 바이러스, 바리올라 마이너 바이러스, 대상포진 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 서부형 말 뇌막염 바이러스 또는 황색열 바이러스)에 의해 감염된 세포를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "암세포"는 다음의 악성 세포를 나타낸다: 부신 종양, AIDS-관련 암, 포상 연부 육종(alveolar soft part sarcoma), 성상세포 종양, 방광암, 골암, 뇌 및 척수암, 전이성 뇌종양, 유방암, 경동맥 소체 종양, 경부암, 연골 육종, 척색종, 난염성 신장 세포 암종, 명세포 암종, 대장암, 결장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 조직결합성 소원형세포 종양, 뇌질피복 세포증, 유윙 종양, 골외 점액성 연골육종, 골섬유 불완전 형성증, 섬유성 골이형성, 담낭 또는 담관암, 위암, 임신성 영양 질환, 생식 세포 종양, 두경부암, 간세포 암종, 섬세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방육종/악성 지방종성 종양, 간암, 림프종, 폐암, 수모세포종, 흑색종, 수막종, 다발성 내분비 신생물 형성, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 신경모세포종, 신경내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유두 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아과 암, 말초신경초 종양, 크롬친화세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후방 포도막 흑색종, 희귀성 혈액장애, 전이성 신장암, 횡문근양 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연조직 육종, 편평세포암, 위암, 활액막 육종, 고환암, 흉선 암종, 흉선종, 전이성 갑상선암 또는 자궁암.
암세포에 의해 특징적으로 발현되는 항원들의 실례는 "암 항원", 예컨대 유방암 항원, 난소암 항원, 전립선암 항원, 경부암 항원, 췌장 암종 항원, 폐암 항원, 방광암 항원, 대장암 항원, 고환암 항원, 교아세포종 암항원, B 세포 악성과 관련된 항원, 다발성 골수종과 관련된 항원, 비-호지킨 림프종과 관련된 항원 또는 만성 림프구성 백혈병과 관련된 항원을 포함한다. 암세포에 의해 특징적으로 발현된 항원들의 실례는 다음 항원들을 포함한다: 대장암 항원 19.9; 위암 뮤신 항원 4.2; 결장암종 항원 A33 (Almqvist, Y. 2006, Nucl Med Biol. Nov;33(8):991-998); ADAM-9 (미국 특허 공개 번호 2006/0172350; PCT 공개 번호 WO 06/084075); AFP 태아 종양 항원-알파-태아단백질 (Malaguarnera, G. et al. (2010) "Serum markers of hepatocellular carcinoma," Dig. Dis. Sci. 55(10):2744-2755); ALCAM (PCT 공개 번호 WO 03/093443); BAGE (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84); 베타-카테닌 (Prange W. et al. 2003 J Pathol. 201(2):250-9); CA125 (Bast, R.C. 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본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 가변 경쇄 도메인, 가변 중쇄 도메인, 항체 경쇄 또는 항체 중쇄를 제공하기 위해 사용될 수 있는 질환-관련 항원의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체들의 예를 표 2에 나타낸다.
항체 명칭 질환-관련 항원 치료 표적 적용
3F8 Gd2 신경아세포종
8H9 B7-H3 신경아세포종, 육종, 전이성 뇌암
아바고보맙 CA-125 난소암
아브식시맙 CD41 혈소판 응집 억제제
악토수맙 클르스트리디움 디피실 클로스트리디움 디피실 감염
아달리무맙 TNF-A 류머티스성 관절염, 크론병, 판형 건성, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 청소년 특발성 관절염, 신생아 용혈성 질환
아데카투무맙 Epcam 전립선 및 유방암
아두카누맙 Beta-아밀로이드 알츠하이머 질환
아펠리모맙 TNF-A 패혈증
아푸투주맙 CD20 림프종
알라시주맙 VEGFR2 암
Ald518 Il-6 류머티스성 관절염
알렘투주맙 CD52 다발성 경색
알리로쿠맙 NARP-1 고콜레스테롤혈증
알투모맙 CEA 결장암
아마툭시맙 메조텔린 암
아나투모맙
마페나톡스		 TAG-72 비-소세포성 폐 암종
아니프롤루맙 인터페론 A/B 수용체 전신성 홍반성 낭창
안루킨주맙 IL-13 암
아폴리주맙 HLA-DR 혈액암
아르시투모맙 CEA 위장암
아셀리주맙 L-셀렉틴 (CD62L) 심각하게 손상된 환자
아티누맙 RTN4 암
아틀리주맙 IL-6 수용체 류머티스성 관절염
아토롤리무맙 붉은털 원숭이 인자 신생아 용혈성 질환
바피네우주맙 베타-아밀로이드 알츠하이머 질환
바실릭시맙 CD25 장기 이식 거부반응의 방지
바비툭시맙 포스파티딜세린 암, 바이러스 감염
벡투모맙 CD22 비-호지킨 림프종 (검출)
벨리무맙 BAFF 비-호지킨 림프종
벤랄리주맙 CD125 천식
베르틸리무맙 CCL11 (에오탁신-1) 심각한 알레르기 장애
베실레소맙 CEA-관련 항원 염증성 병변 및 전이 (검출)
베바시주맙 VEGF-A 전이성 암, 미숙아 망막증
베즐로톡수맙 클로스트리디움 디피실 클로스트리디움 디피실 감염
바이시로맙 피브린 II, 베타 사슬 혈전 색전증 (검출)
바이마그루맙 ACVR2B 미오스타틴 억제제
바이바투주맙 CD44 V6 편평세포 암종
블리나투모맙 CD19 암
블로소주맙 SOST 골다공증
브렌툭시맙 CD30 (TNFRSF8) 혈액암
브리아키누맙 IL-12, IL-23 건선, 류머티스성 관절염, 염증성 장 질환, 다발성 경색
브로달루맙 IL-17 염증성 질환
카나키누맙 IL-1 류머티스성 관절염
칸투주맙 메르탄신 뮤신 카낙 (canag) 결장암
칸투주맙 MUC1 암
카플라시주맙 VWF 암
카프로맙 전립선 암종 세포 전립선암 (검출)
카를루맙 MCP-1 종양학/면역 표시
카투막소맙 Epcam, CD3 난소암, 악성 복수, 위암
Cc49 Tag-72 종양 검출
세르톨리주맙 TNF-A 크론병
세툭시맙 EGFR 전이성 결장암 및 두경부암
Ch.14.18 측정되지 않음 신경아세포종
시타투주맙 Epcam 난소암 및 기타 고체 종양
식수투무맙 IGF-1 수용체 고체 종양
클라자키주맙 오릭토라구스 쿠니큘루스 류머티스성 관절염
클리바투주맙 MUC1 췌장암
코나투무맙 TRAIL-R2 암
콘시주맙 TFPI 출혈
크레네주맙 1-40-B-아밀로이드 알츠하이머 질환
Cr6261 인플루엔자 A 헤마글루티닌 감염성 질환/인플루엔자 A
다세투주맙 CD40 혈액암
다클리주맙 CD25 난소 이식 거부반응의 방지
달로투주맙 인슐린-유사 성장 인자 I 수용체 암
다라투무맙 CD38 암
뎀시주맙 DLL4 암
데노수맙 RANKL 골다공증, 골 전이
데투모맙 B-림프종 세포 림프종
도를리모맙 아리톡스 측정되지 않음 암
드로지투맙 DR5 암
둘리고투맙 HER3 암
두필루맙 IL4 아토피 질환
두시기투맙 ILGF2 암
에크로멕시맙 GD3 강글리오시드 악성 흑색종
에쿨리주맙 C5 발작성 야간 혈색소뇨증
에도바코맙 내독소 그람-음성균에 의해 유발된 패혈증
에드로콜로맙 Epcam 결장 암종
에팔리주맙 LFA-1 (CD11a) 건선 (T 세포 이동 차단)
에푼구맙 Hsp90 침입성 칸디다 감염
엘델루맙 인터페론-감마-유도 단백질 크론병, 궤양성 대장염
엘로투주맙 SLAMF7 다발성 경색
엘실리모맙 IL-6 암
에나바투주맙 TWEAK 수용체 암
엔리모맙 ICAM-1 (CD54) 암
에노키주맙 IL9 천식
에노티쿠맙 DLL4 암
엔시툭시맙 5AC 암
에피투모맙 시툭세탄 에피시알린 암
에프라투주맙 CD22 암, SLE
에를리주맙 ITGB2 (CD18) 심장마비, 뇌졸중, 외상 쇼크
에르투막소맙 HER2/Neu, CD3 유방암
에타라시주맙 인티그린 Avβ3 흑색종, 전립선암, 난소암
에트롤리주맙 인티그린 A7 B7 염증성 장 질환
에볼로쿠맙 PCSK9 저콜레스테롤혈증
엑스비비루맙 B형 간염 표면 항원 B형 간염
파놀레소맙 CD15 맹장염 (진단)
파랄리모맙 인터페론 수용체 암
파를레투주맙 폴레이트 수용체 1 난소암
파시누맙[51] HNGF 암
FbtaO5 CD20 만성 림프구성 백혈병
펠비주맙 호흡기 합포체 바이러스 호흡기 합포체 바이러스 감염
페자키누맙 IL-22 류머티스성 관절염, 건선
피클라투주맙 HGF 암
피기투무맙 IGF-1 수용체 부신피질 암종, 비-소세포 폐 암종
플란보투맙 TYRP1 (글리코단백질 75) 흑색종
폰톨리주맙 IFN-γ 크론병
포라비루맙 광견병 바이러스
글리코단백질		 광견병 (예방)
프레솔리무맙 TGF-B 특발성 폐 섬유증, 국소분절 사구체 경화증, 암
풀라누맙 NGF 통증
푸툭시맙 EGFR 암
갈릭시맙 CD80 B 세포 림프종
가니투맙 IGF-I 암
간테네루맙 베타-아밀로이드 알츠하이머 질환
가빌리모맙 CD147 (Basigin) 이식편-대-숙주 질환
겜투주맙 오조가미신 CD33 급성 골수성 백혈병
게보키주맙 IL-1β 당뇨병
기렌툭시맙 탄산 탈수효소 9 (CA-IX) 명세포 신장 세포 암종[64]
글렘바투무맙 베도틴 GPNMB 흑색종, 유방암
골리무맙 TNF-A 류머티스성 관절염, 건성성 관절염, 강직성 척추염
고밀릭시맙 CD23 (Ige 수용체) 알레르기성 천식
구셀쿠맙 IL13 건선
이브리투모맙 티욱세탄 CD20 비-호지킨 림프종
이크루쿠맙 VEGFR-1 암
이고보맙 CA-125 난소암 (진단)
Imab362 Cldn18.2 위장 선암종 및 췌장 종양
임가투주맙 EGFR 암
인클라쿠맙 셀렉틴 P 암
인다툭시맙 라브탄신 SDC1 암
인플릭시맙 TNF-A 류머티스성 관절염, 강직성 척추염, 건선선 관절염, 건선, 크론병, 궤양성 대장염
인테투무맙 CD51 고체 종양 (전립선암, 흑색종)
이놀리모맙 CD25 (IL-2 수용체의 A사슬) 이식편-대-숙주 질환
이노투주맙 오조가미신 CD22 암
이필리무맙 CD152 흑색종
이라투무맙 CD30 (TNFRSF8) 호지킨 림프종
이톨리주맙 CD6 암
이세키주맙 IL-17A 자가면역 질환
켈릭시맙 CD4 만성 천식
라베투주맙 CEA 결장암
람브롤리주맙 PDCD1 항신생물제
람팔리주맙 CFD 암
레브리키주맙 IL-13 천식
레말레소맙 NCA-90 (과립구 항원) 진단제
레르델리무맙 TGF Beta 2 녹내장 수술 후 흉터 감소
렉사투무맙 TRAIL-R2 암
리비비루맙 B형 간염 표면 항원 B형 간염
리겔리주맙 IGHE 암
린투주맙 CD33 암
리릴루맙 KIR2D 암
로델시주맙 PCSK9 고콜레스테롤혈증
로르보투주맙 CD56 암
루카투무맙 CD40 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종
루밀릭시맙 CD23 만성 림프구성 백혈병
마파투무맙 TRAIL-R1 암
마르게툭시맙 Ch4d5 암
마브릴리무맙 GMCSF 수용체 A-사슬 류머티스성 관절염
마투주맙 EGFR 결장, 폐 및 위암
메폴리주맙 IL-5 천식 및 백혈구 질환
메텔리무맙 TGF 베타 1 전신성 경화증
밀라투주맙 CD74 다발성 골수종 및 다른 혈액 악성
민레투모맙 TAG-72 암
미투모맙 GD3 강글리오시드 소세포 폐 암종
모가물리주맙 CCR4 암
모롤리무맙 붉은털 원숭이 인자 암
모타비주맙 호흡기 합포체 바이러스 호흡기 합포체 바이러스 (방지)
목세투모맙 파수도톡스 CD22 암
무로모납-CD3 CD3 장기 이식 거부반응의 방지
나콜로맙 타페나톡스 C242 항원 결장암
나밀루맙 CSF2 암
납투모맙 에스타페나톡스 5T4 비-소세포 폐 암종, 신장 세포 암종
나르나투맙 RON 암
나탈리주맙 인티그린 A4 다발성 경색, 크론병
네바쿠맙 내독소 패혈증
네시투무맙 EGFR 비-소세포 폐 암종
네렐리모맙 TNF-A 암
네스바쿠맙 안지오포이에틴 2 암
니모투주맙 EGFR 편평세포 암종, 두경부암, 비인두암, 교종
니몰루맙 Igg4 암
노페투모맙 메르펜탄 측정되지 않음 암
오카라투주맙 CD20 암
오크렐리주맙 CD20 류머티스성 관절염, 홍반선 낭창
오둘리모맙 LFA-1 (CD11a) 장기 이식 거부반응의 방지, 면역학적 질환
오파투무맙 CD20 만성 림프구성 백혈병
올라라투맙 PDGF-R A 암
올로키주맙 IL6 암
오나르투주맙 인간 분산 인자 수용체 키나아제 암
온툭시주맙 TEM1 암
오포르투주맙 모나톡스 Epcam 암
오레고보맙 CA-125 난소암
오르티쿠맙 Oxldl 암
오틀레르투주맙 CD37 암
옥셀루맙 OX-40 천식
오자네주맙 NOGO-A ALS 및 다발성 경색
오조랄리주맙 TNF-A 염증
파기박시맙 리포테이코산 패혈증 (스타필로코쿠스)
팔리비주맙 호흡기 합포체 바이러스의 F 단백질 호흡기 합포체 바이러스 (방지)
파니투무맙 EGFR 결장암
판코맙 MUC1의 종양 특이적 글리코실화 난소암
파노바쿠맙 슈도모나스 아에루기노사 슈도모나스 아에루기노사 감염
파르사투주맙 EGFL7 암
파스콜리주맙 IL-4 천식
파테클리주맙 LTA TNF
파트리투맙 HER3 암
펨투모맙 MUC1 암
페라키주맙 IL17A 천식
페르투주맙 HER2/Neu 암
펙셀리주맙 C5 심장 수술의 부작용의 감소
피딜리주맙 PD-1 암 및 감염성 질환
피나투주맙 베도틴 CD22 암
핀투모맙 선암종 항원 선암종
플라쿨루맙 인간 TNF 암
폴라투주맙 베도틴 CD79B 암
포네주맙 인간 베타-아밀로이드 알츠하이머 질환
프리톡사시맙 대장균 시가 독소 유형-1 암
프리투무맙 비멘틴 뇌암
Pro 140 Ccr5 HIV 감염
퀼리주맙 IGHE 암
라코투모맙 N-글리콜릴뉴라민산 암
라드레투맙 피브로넥틴 엑스트라 도메인-B 암
라피비루맙 광견병 바이러스
글리코단백질		 광견병 (예방)
라무시루맙 VEGFR2 고체 종양
라니비주맙 VEGF-A 황반 변성 (습식 형)
락시바쿠맙 안트락스 독소, 보호 항원 탄저병 (예방 및 치료)
레가비루맙 사이토메갈로바이러스
글리코단백질 B		 사이토메갈로바이러스 감염
게슬리주맙 IL-5 기도, 피부 및 위장관의 염증
릴로투무맙 HGF 고체 종양
리툭시맙 CD20 림프종, 백혈병, 일부 자가면역 장애
로바투무맙 IGF-1 수용체 암
롤레두맙 RHD 암
로모소주맙 스켈로스틴 골다공증
론탈리주맙 IFN-α 전신성 홍반성 낭창
로벨리주맙 CD11, CD18 출혈성 쇼크
루플리주맙 CD154 (CD40L) 류머티스 질환
사말리주맙 CD200 암
사릴루맙 IL6 류머티스성 관절염, 강직성 척추염
사투모맙 펜데티드 TAG-72 암
세쿠키누맙 IL-17A 포도막염, 류머티스성 관절염, 건선
세리바누투맙 ERBB3 암
세톡사시맙 대장균 시가 독소 유형-1 암
세비루맙 사이토메갈로바이러스 사이토메갈로바이러스 감염
시브로투주맙 FAP 암
Sgn-CD19a CD19 급성 림프구성 백혈병 및 B 세포 비-호지킨 림프종
Sgn-CD33a CD33 급성 골수성 백혈병
시팔리무맙 IFN-A SLE, 피부근염, 다발성 근염
시툭시맙 IL-6 암
시무투주맙 LOXL2 섬유증
시플리주맙 CD2 건선, 이식편-대-숙주 질환 (방지)
시루쿠맙 IL-6 류머티스성 관절염
솔라네주맙 베타-아밀로이드 알츠하이머 질환
솔리토맙 Epcam 암
소네프시주맙 스핑고신-1-포스페이트 맥락막 및 망막 신생혈관 형성
손투주맙 에피시알린 암
스타물루맙 미오스타틴 근이영양증
술레소맙 NCA-90 (과립구 항원) 골수염
수비주맙 HIV-1 바이러스 감염
타바루맙 BAFF B 세포 암
타마투주맙 테락세탄 알파-태아단백질 암
타도시주맙 인티그린 AIIBβ3 경피적 관상동맥 중재술
타네주맙 NGF 통증
타플리투모맙 팝톡스 CD19 암
테피바주맙 클럼핑 인자 A 스타필로코쿠스 아우레우스 감염
텔리모맙 측정되지 않음 암
테나투모맙 테나신 C 암
테닐릭시맙 CD40 암
테프로투무맙 CD221 혈액 종양
티실리무맙 CTLA-4 암
틸드라키주맙 IL23 면역학적으로 중재된 염증성 장애
티가투주맙 TRAIL-R2 암
Tnx-650 Il-13 호지킨 림프종
토실리주맙 IL-6 수용체 류머티스성 관절염
토랄리주맙 CD154 (CD40L) 류머티스성 관절염, 낭창 신염
토시투모맙 CD20 여포성 림프종
토베투맙 CD140a 암
트랄로키누맙 IL-13 천식
트라스투주맙 HER2/Neu 유방암
TrbsO7 Gd2 흑색종
트레멜리무맙 CTLA-4 암
투코투주맙 셀모로이킨 Epcam 암
투비루맙 B형 간염 바이러스 만성 B형 간염
DNQMFFLXNRTLAKQ MS4A1 암
우렐루맙 4-1BB 암
우르톡사주맙 대장균 대장균에 의해 유발된 설사
우스테키누맙 IL-12, IL-23 다발성 경색, 건선, 건선성 관절염
반티크투맙 꼬아진 수용체 암
바파릭시맙 AOC3 (VAP-1) 암
바텔리주맙 ITGA2 암
베돌리주맙 인티그린 A4β7 크론병, 궤양성 대장염
벨투주맙 CD20 비-호지킨 림프종
베팔리모맙 AOC3 (VAP-1) 염증
베센쿠맙 NRP1 암
볼로식시맙 인티그린 A5β1 고체 종양
보르세투주맙 CD70 암
보투무맙 종양 항원 CTAA16.88 결장 종양
잘루투무맙 EGFR 두경부의 편평세포 암종
자툭시맙 HER1 암
지랄리무맙 CD147 암
졸리모맙 아리톡스 CD5 전신성 홍반성 낭창, 이식편-대-숙주 질환
질환-관련 항원은 병원체-감염 세포에서 또는 암세포에서 특징적으로 발현되고 프로세싱되어 MHC 복합체의 맥락에서 세포 표면에 나타날 수 있지만, 정상 세포에서는 특징적으로 발현되지 않는다. 그런 펩티드 단편을 인식하는 항체들은 기술분야에 공지되어 있거나 WO 2002/014870에 기술된 것들을 포함하여, 잘 알려진 방법을 사용하여 생성될 수 있다.본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 폴리펩티드는 그런 항체들의 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 도메인 (그런 분자들의 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬의 경우) 또는 중쇄 또는 경쇄 (그런 분자들의 제 3 및 제 4 폴리펩티드 사슬의 경우)를 함유하도록 적응될 수 있다. 그러므로, 상기-기술된 항체들은 부위 A, 부위 B 또는 부위 C가 그런 질환-관련 항원들의 에피토프에 결합할 수 있는, 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
B. 바람직한 구조적 속성
전형적으로, 본 발명 분자들의 삼중-특이적 결합 분자들은 각각이 아미노 말단 및 카르복실 말단을 가지는 4개의 상이한 폴리펩티드 사슬을 포함할 것이지만 (도 4a 내지 4d 참조), 분자들은 그런 폴리펩티드 사슬을 서로에 융합시킴으로써 (예컨대 펩티드 결합을 통해) 또는 그런 폴리펩티드 사슬을 나누어 추가의 폴리펩티드 사슬을 형성함으로써, 또는 더 적은 또는 추가의 폴리펩티드 사슬과 이황화 결합을 통해 결합시킴으로써 더 적거나 더 많은 수의 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다. 도 4e 내지 4j는 본 발명의 이런 측면을 3개의 폴리펩티드 사슬을 가지는 그런 분자들을 개략적으로 도시함으로써 예시한다. 도 4k 및 4l은 본 발명의 이런 측면을 5개의 폴리펩티드 사슬을 가지는 그런 분자들을 개략적으로 도시함으로써 예시한다.
그런 분자들의 다양한 면역글로불린 도메인들은 어떠한 아이소타입 또는 알로타입, 이를테면, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 IgA, IgD, IgG, IgE 및 IgM의 면역글로불린으로부터 유도될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 하기에서 논의되는 것과 같이 그런 면역글로불린들은 IgG 면역글로불린으로부터 유도된다. 특정 구체예에서, 사용된 IgG 아이소타입은 IgG1이지만, 다른 아이소타입의 IgG (예컨대 IgG2, IgG3 또는 IgG4 또는 그것들의 알로타입)도 사용될 수 있다. IgG4 Fc 도메인이 사용될 때, 본 발명은 Kabat에서 설명된 것과 같이 EU에 의해 넘버링되는 바 (Lu et al., (2008) "The Effect Of A Point Mutation On The Stability Of Igg4 As Monitored By Analytical Ultracentrifugation," J. Pharmaceutical Sciences 97:960-969), 가닥 교환의 발생을 줄이기 위해 S228P와 같은 안정화 돌연변이의 도입을 포함한다. 기술분야에 알려져 있는 다른 안정화 돌연변이들이 IgG4 Fc 도메인에 도입될 수 있다 ((Peters, P et al., (2012) "Engineering an Improved IgG4 Molecule with Reduced Disulfide Bond Heterogeneity and Increased Fab Domain Thermal Stability," J. Biol. Chem., 287:24525-24533; PCT Patent Publication No: WO 2008/145142). N297A, L234A, L235A 및 D265A 치환이 이펙터 기능이 바람직한 상황에서 이펙터 기능을 없애기 때문에, 이들 치환은 바람직하게는 사용되지 않을 것이다.
도 4a 내지 4d는 바람직한 삼중-특이적 결합 분자의 도메인들을 다이아그램으로 나타낸다. 도 4a 및 4b는 각각, 비-다이아바디-형 결합 도메인이 Fab-형 결합 도메인 또는 수용체-형 결합 도메인인 바람직한 삼중-특이적 결합 분자의 도메인들을 개략적으로 도시한다. 도 4c 및 4d는 각각, 비-다이아바디-형 결합 도메인이 Fab-형 결합 도메인 또는 수용체-형 결합 도메인인 상이한 도메인 배향을 가지는 바람직한 삼중-특이적 결합 분자의 도메인들을 개략적으로 도시한다.
상기에서 표시된 것과 같이, 그런 예시적인 바람직한 삼중-특이적 결합 분자의 도메인들에 의해 결합된 에피토프 I, 에피토프 II 또는 에피토프 III 중 하나는 질환-관련 항원의 에피토프일 수 있다. 가장 바람직하게, 질환-관련 항원의 그런 에피토프에 결합하는 그런 예시적인 바람직한 삼중-특이적 결합 분자의 결합 도메인은 Fab-형 결합 도메인이다. 본 발명의 그런 삼중-특이적 결합 분자의 폴리펩티드들은 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 도메인 (그런 분자들의 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬의 경우) 또는 중쇄 또는 경쇄 (그런 분자들의 제 3 및 제 4 폴리펩티드 사슬의 경우)를 함유하도록 적응될 수 있다. 그러므로, 그런 항체들은 부위 A, 부위 B 또는 부위 C가 그런 질환-관련 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
1. 바람직한 제 1 폴리펩티드 사슬
본 발명의 바람직한 삼중-특이적 결합 분자의 제 1 폴리펩티드 사슬은 에피토프 I에 결합할 수 있는 가변 경쇄 도메인 (VL I ), 에피토프 II에 결합할 수 있는 가변 중쇄 도메인 (VH II ), 시스테인 잔기 또는 시스테인-함유 도메인 및 이종이량체-촉진 도메인 및 CH2-CH3 도메인을 포함할 것이다.
제 1 폴리펩티드의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인이 상이한 에피토프들을 향해 지시되기 때문에, 그것들은 에피토프 I 또는 에피토프 II 중 어느 하나에 결합할 수 있는 결합 도메인을 형성하기 위해 함께 결합할 수 없다. 제 1 폴리펩티드의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인은 이들 도메인의 회합을 실질적으로 방지하기에 충분히 짧은 개재 링커 펩티드에 의해 서로 떨어져 있다. "링커 1"로 명명된, 예시적인 링커는 서열 (SEQ ID NO:1): GGGSGGGG를 가진다.
제 1 폴리펩티드의 가변 중쇄 도메인 및 그 폴리펩티드의 이종이량체-촉진 도메인은 바람직하게는 1, 2, 3 또는 그 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 개재된 링커 펩티드에 의해 서로 떨어져 있다. 바람직한 시스테인-함유 도메인 ("링커 2")은 SEQ ID NO:2: GGCGGG의 서열을 가진다. 아래에서 기술되는 것과 같이, 시스테인-함유 이종이량체-촉진 도메인이 사용될 수 있다.
그러므로 일부 구체예에서, 하나 이상의 잔기 (또는 시스테인-함유 도메인, 예컨대 시스테인-함유 펩티드 링커)는 2개의 그런 폴리펩티드 사슬에 함께 공유적으로 결합하기 위해 제 1 폴리펩티드 사슬에 (및/또는 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 제 2, 제 3, 제 4 또는 추가의 폴리펩티드 사슬에) 통합될 것이고, 반면, 동등한 구체예에서 그런 시스테인 잔기(들)은 동일한 결과를 이루기 위하여, 이종이량체-촉진 도메인 안으로 또는 또 다른 도메인 안으로 통합될 수 있다.
제 1 폴리펩티드의 이종이량체-촉진 도메인 및 제 2 폴리펩티드의 이종이량체-촉진 도메인은 동조적으로 선택된다. 도메인들은 서로 상이하며 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬의 회합을 촉진하기 위하여 서로와 결합하도록 디자인된다. 예를 들어, 이종이량체-촉진 도메인들 중 하나는 pH 7에서 음전하를 가지도록 엔지니어링될 것이고, 한편 두 개의 폴리펩티드 사슬 중 다른 것은 pH 7에서 양전하를 가지도록 엔지니어링될 것이다. 그런 하전된 도메인들의 존재는 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사이의 회합을 촉진하고, 그로써 이종이량체화를 조성한다. 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬에 사용된 도메인들이 그런 사슬들 사이의 이종이량체화를 조성하기 위해 서로 다른 한, 어떤 이종이량체-촉진 도메인이 어떤 사슬에 제공되는 지는 중요하지 않다.
바람직한 구체예에서, 제 1 폴리펩티드 사슬의 이종이량체-촉진 도메인은 "E-코일" 도메인 (SEQ ID NO:3): E VAAL E K E VAAL E K E VAAL E K E VAAL E K 또는 "K-코일" 도메인 (SEQ ID NO:4): K VAAL K E K VAAL K E K VAAL K E K VAAL K E 중 어느 하나이다. 보다 바람직하게, 제 1 폴리펩티드 사슬은 "E-코일" 도메인을 가질 것이다. 제 1 폴리펩티드 사슬은 유일한 단일한 그런 코일 분리기를 함유할 수 있거나, 또는 하나 이상의 그런 코일 분리기 (에컨대 2개의 분리기)를 함유할 수 있고 동일한 전하, 바람직하게는 반대 전하일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 제 1 폴리펩티드 사슬의 이종이량체-촉진 도메인은 그것의 글루타메이트 잔기가 pH 7에서 음전하를 형성할 4개의 탠덤 "E-코일" 나선 도메인 (SEQ ID NO:3: E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K) 또는 그것의 라이신 잔기가 pH 7에서 양전하를 형성할 4개의 탠덤 "K-코일" 도메인 (SEQ ID NO:4: K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E) 중 어느 것을 포함할 것이다. 그런 하전된 도메인들의 존재는 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬 사이의 회합을 촉진하고, 그로써 이종이량체화를 조성한다. 특히 바람직한 것은 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4의 4개의 탠덤 "E-코일" 나선 도메인 중 하나가 시스테인 잔기: E VAAC E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:115)를 함유하도록 변형되어 있거나 또는 SEQ ID NO:4의 4개의 탠덤 "K-코일" 나선 도메인 중 하나가 시스테인 잔기: K VAAC K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:116)를 함유하도록 변형되어 있는 이종이량체-촉진 도메인이다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 E-코일 및 K-코일 도메인들은 다음 문헌들에 개시되어 있다: Woolfson, D.N. (2005) "The Design Of Coiled-Coil Structures And Assemblies," Adv. Prot. Chem. 70:79-112, Straussman, R. et al. (2007) "Kinking the Coiled Coil - Negatively Charged Residues at the Coiled-Coil Interface," J. Molec. Biol. 366:1232-1242; Apostolovic, B. et al. (2008) "pH-Sensitivity of the E3/K3 Heterodimeric Coiled Coil," Biomacromolecules 9:3173-3180; Arndt, K.M. et al. (2001) "Helix-stabilized Fv (hsFv) Antibody Fragments: Substituting the Constant Domains of a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled-Coil Domain," J. Molec. Biol. 312:221-228; Steinkruger, J.D. et al. (2012) "The d'--d--d′' Vertical Triad is Less Discriminating Than the a'--a--a' Vertical Triad in the Antiparallel Coiled-Coil Dimer Motif," J. Amer. Chem. Soc. 134(5):2626-2633; Ghosh, T.S. et al. (2009) "End-To-End And End-To-Middle Interhelical Interactions: New Classes Of Interacting Helix Pairs In Protein Structures," Acta Crystallographica D65:1032-1041; Grigoryan, G. et al. (2008) "Structural Specificity In Coiled-Coil Interactions," Curr. Opin. Struc. Biol. 18:477-483; Boucher, C. et al. (2010) "Protein Detection By Western Blot Via Coiled-Coil Interactions," Analytical Biochemistry 399:138-140; Cachia, P.J. et al. (2004) "Synthetic Peptide Vaccine Development: Measurement Of Polyclonal Antibody Affinity And Cross-Reactivity Using A New Peptide Capture And Release System For Surface Plasmon Resonance Spectroscopy," J. Mol. Recognit. 17:540-557; De Crescenzo, G.D. et al. (2003) "Real-Time Monitoring of the Interactions of Two-Stranded de novo Designed Coiled-Coils: Effect of Chain Length on the Kinetic and Thermodynamic Constants of Binding," Biochemistry 42:1754-1763; Tripet, B. et al. (2002) "Kinetic Analysis of the Interactions between Troponin C and the C-terminal Troponin I Regulatory Region and Validation of a New Peptide Delivery/Capture System used for Surface Plasmon Resonance," J. Molec. Biol. 323:345-362; 및 Zeng, Y. et al. (2008) "A Ligand-Pseudoreceptor System Based On de novo Designed Peptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With Altered Tropism," J. Gene Med. 10:355-367.
바람직하게, 제 1 폴리펩티드 사슬의 사용된 이종이량체-촉진 도메인 및 CH2-CH3 도메인은 이종이량체-촉진 도메인에 향상된 안정화를 제공하는 개재되는 시스테인-함유 링커 펩티드에 의해 서로 떨어져 있다. 바람직한 시스테인-함유 링커 펩티드 ("링커 3")는 아미노산 서열 (SEQ ID NO:5): DKTHTCPPCP를 가진다.
야생형 CH2-CH3 도메인의 아미노산 서열은 다음과 같다 (위치는 Kabat 등에서와 같이 (Kabat et al. (1992) Sequences Of Proteins Of Immunological Interest, National Institutes of Health Publication No. 91-3242) EU 색인에서와 같다 (SEQ ID NO:6):
Figure pat00001
일부 발현 시스템에서 CH3 도메인의 C-말단 아미노산 잔기는 번역후에 제거될 수 있다. 따라서, CH3 도메인의 C-말단 잔기는 임의의 아미노산 잔기이다.
제 1 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인은 제 3 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인과의 사이에 이종이량체화를 촉진하기 위하여 바람직하게 변형될 것이다 (하기 참조). 예를 들어, 아미노산 치환 (바람직하게는 '손잡이'를 형성하는 벌키한 측면기를 포함하는 아미노산, 예컨대 트립토판으로의 치환)은 제 1 폴리펩티드 사슬의 CH2 또는 CH3 도메인에 도입되어서 입체적 간섭이 유사하게 돌연변이된 도메인과의 상호작용을 방지하고 상보하는, 또는 수용하는 돌연변이가 엔지니어링되어 있는 (예컨대 글리신으로의 치환) 도메인, 즉 '구멍'과 쌍을 이루도록 돌연변이된 도메인을 강요하게 될 것이다. 그런 돌연변이 세트는 다이아바디 분자를 포함하는 폴리펩티드의 어떠한 쌍으로 엔지니어링되고, 나아가 상기 쌍의 폴리펩티드 사슬들의 어떠한 부분으로 엔지니어링될 수 있다. 동종이량체화를 뛰어넘어 이종이량체화를 선호하도록 단백질을 엔지니어링하는 방법은, 특히 면역글로불린-유사 분자의 엔지니어링과 관련하여 기술분야에 잘 알려져 있고, 본원에 포함된다 (예컨대 미국 특허 번호 7,695,936 및 특허 공개 2007/ 0196363, Ridgway et al. (1996) "'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization," Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) "Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library," J. Mol. Biol. 270: 26-35, and Xie et al. (2005) "A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis," J. Immunol. Methods 296:95-101; 이 문헌들은 각각 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨). 바람직한 손잡이는 변형 T366W를 함유하도록 천연 IgG Fc 도메인을 변형시킴으로써 생성된다. 바람직한 구멍은 변형 T366S, L368A 및 Y407V를 함유하도록 천연 IgG Fc 도메인을 변형시킴으로써 생성된다. 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자를 정제하는 것을 보조하기 위하여, 구멍 돌연변이를 함유하는 폴리펩티드 사슬은 추가적으로 단백질 A 결합 부위를 제거하기 위해 위치 435에서 치환 (H435R)을 포함한다. 그러므로, 구멍 돌연변이를 함유하는 폴리펩티드의 동종이량체는 단백질 A에 결합하지 않을 것인 반면, 이종이량체를 함유하는 손잡이와 구멍의 결과로서 형성되는 삼중-특이적 결합 분자는 손잡이 돌연변이를 함유하는 폴리펩티드 사슬의 단백질 A 결합 부위를 통해 단백질 A와 결합하는 능력을 보유할 것이다.
제 1 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인은 바람직하게는 Fc의 Fc 수용체에의 결합을 감소시키거나 없애기 위해 변형될 수 있다. 그런 돌연변이는 기술분야에 잘 알려져 있고 위치 234, 235, 265 및 297에서 치환을 포함한다 (미국 특허 번호 5,624,821 참조). 바람직한 치환은 L234A 및 L235A, D265A 및 N297Q 중 하나 이상을 포함한다.
그러므로 바람직하게, 제 1 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인은 "손잡이-포함" 서열 (SEQ ID NO:7):
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK
PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT
LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL
TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHN H YTQKS LSLSPGK
또는 단백질 A 결합을 없애기 위해 H435R 치환을 가지는 "구멍-포함" 서열 (SEQ ID NO:8):
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK
PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT
LPPSREEMTK NQVSL S C A VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL V SKL
TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHN R YTQKS LSLSPGK
를 가질 것이다.
제 1 폴리펩티드 사슬은 "손잡이-포함" CH2-CH3 서열, 예컨대 SEQ ID NO:7의 서열을 가지는 것이 바람직하다.
앞으로 인지되는 것과 같이, "구멍-포함" CH2-CH3 도메인 (예컨대 SEQ ID NO:8)은 제 1 폴리펩티드 사슬에 사용될 수 있고, 그 경우 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (예컨대 SEQ ID NO:7)은 제 3 폴리펩티드 사슬에 사용될 수 있을 것이다.
그러므로, 요약하면, 본 발명의 바람직한 삼중-특이적 결합 분자의 바람직한 제 1 폴리펩티드 사슬은 다음 도메인 및 링커를 포함할 것이다: (VL I 도메인)-(링커 1)-(VH II 도메인)-(시스테인-함유 도메인 (링커 2))-(E-코일 이종이량체-촉진 도메인)-(링커 3)-(손잡이-포함 CH2-CH3 도메인) 또는 (VL I 도메인)-(링커 1)─(VH II 도메인)-(링커 2)-(시스테인-함유 E-코일 이종이량체-촉진 도메인)-(링커 3)-(손잡이-포함 CH2-CH3 도메인 또는 (VL I 도메인)-(링커 1)─(VH II 도메인)-(링커 2)─(시스테인-함유 E-코일 이종이량체-촉진 도메인)-(링커 3)-(손잡이-포함 CH2-CH3 도메인).
2. 바람직한 제 2 폴리펩티드 사슬
그런 바람직한 삼중-특이적 결합 분자의 제 2 폴리펩티드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 에피토프 II에 결합할 수 있는 가변 경쇄 도메인 (VL II ), 에피토프 I에 결합할 수 있는 가변 중쇄 도메인 (VH I ), 시스테인 잔기 또는 시스테인-함유 도메인 및 이종이량체-촉진 도메인을 포함할 것이다.
제 2 폴리펩티드의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인은 상이한 에피토프들을 향해 지시되기 때문에, 그것들은 에피토프 I 또는 에피토프 II 중 어느 하나에 결합할 수 있는 결합 도메인을 형성하기 위해 함께 결합할 수 없다. 제 2 폴리펩티드의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인은 이들 도메인의 회합을 실질적으로 방지하기 위해 충분히 짧은 개재하는 링커 펩티드에 의해 서로 떨어져 있다. 서열 (SEQ ID NO:1): GGGSGGGG를 가지는 "링커 1"은 이 목적에 대한 예시적인 링커이다.
제 1 폴리펩티드 사슬의 경우에서와 같이, 제 2 폴리펩티드의 가변 중쇄 도메인 및 그 폴리펩티드의 이종이량체-촉진 도메인은 1, 2, 3 또는 그 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 개재하는 시스테인-함유 도메인에 의해 바람직하게 서로로부터 떨어져 있다. 서열 (SEQ ID NO:2) GGCGGG를 가지는 "링커 2"는 이 목적에 대한 예시적인 링커이다. 그런 시스테인 잔기는 제 1 폴리펩티드의 가변 중쇄 도메인과 그 폴리펩티드의 이종이량체-촉진 도메인을 분리시키는 시스테인-함유 스페이서 펩티드의 시스테인 잔기와 이황화 결합을 형성할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 제 1 및 제 2 폴리펩티드는 서로에 공유적으로 결합된다. 다르게는, 상기 기술된 것과 같은 시스테인-함유 이종이량체-촉진 도메인이 사용될 수 있다.
상기에서 논의된 것과 같이, 제 2 폴리펩티드 사슬의 이종이량체-촉진 도메인은 제 1 폴리펩티드 사슬의 이종이량체-촉진 도메인과 동조하기 위하여 선택된다. 그러므로, 바람직한 구체예에서, 제 1 폴리펩티드 사슬의 이종이량체-촉진 도메인은 "K-코일" 도메인 (예컨대 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:116) 또는 "E-코일" 도메인 (예컨대 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:115) 중 어느 하나이다. 제 1 폴리펩티드 사슬은 바람직하게 "E-코일" 도메인을 가질 것이기 때문에, 제 2 폴리펩티드 사슬은 바람직하게 "K-코일" 도메인을 가질 것이다.
제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 다이아바디의 폴리펩티드 사슬이기 때문에, 그것들은 에피토프 I을 인식하고 면역특이적으로 결합하는 도메인 I 결합 도메인 (VLA/VHA) 및 에피토프 II를 인식하고 면역특이적으로 결합하는 도메인 II 결합 도메인 (VLB/VHB)을 형성하기 위하여 함께 결합할 수 있다.
그러므로, 요약하면, 본 발명의 바람직한 삼중-특이적 결합 분자의 바람직한 제 2 폴리펩티드 사슬은 다음의 도메인 및 링커를 포함할 것이다: (VL II 도메인)-(링커 1)─(VH I 도메인)-(시스테인-함유 도메인 (링커 2))-(K-코일 이종이량체-촉진 도메인) 또는 (VL II 도메인)-(링커 1)─(VH I 도메인)-(링커 2)─(시스테인-함유 K-코일 이종이량체-촉진 도메인).
3. 바람직한 제 3 폴리펩티드 사슬
본 발명의 바람직한 삼중-특이적 결합 분자의 제 3 폴리펩티드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 결합 도메인, 임의로 CH1-힌지 도메인을 포함할 수 있는 시스테인-함유 도메인 및 CH2-CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드이다. 본 발명의 바람직한 삼중-특이적 결합 분자의 제 3 폴리펩티드 사슬의 결합 도메인은 에피토프 III에 결합할 수 있는 가변 중쇄 도메인 (VH III )일 수 있고, 그 경우, 본 발명의 바람직한 삼중-특이적 결합 분자의 제 4 폴리펩티드 사슬 (하기 논의됨)은 에피토프 III에 결합할 수 있는 가변 경쇄 도메인 (VL III )을 포함하는 폴리펩티드여서, 결합 도메인은 에피토프 III을 가지는 항원에 면역특이적으로 결합할 수 있다. 다르게는, 본 발명의 바람직한 삼중-특이적 결합 분자의 제 3 폴리펩티드 사슬의 결합 도메인은 T 세포 수용체-형 결합 도메인을 포함할 수 있고, 그 경우, 본 발명의 바람직한 삼중-특이적 결합 분자의 제 4 폴리펩티드 사슬 (하기 논의됨)은 상보하는 T 세포 수용체-형 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드여서, 2개의 폴리펩티드 사슬의 상호작용은 세포의 표면에 배열된 MHC 복합체에서 나타난 항원 분자에 물리특이적으로 결합할 수 있는 결합 도메인을 형성하게 된다. 제 3 폴리펩티드 사슬은 자연적으로 발생하는 항체들로부터 분리될 수 있다. 다르게는, 재조합적으로 구성될 수 있다. 예시적인 CH1 도메인은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:9):
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKV
를 가지는 인간 IgG1 CH1 도메인이다.
예시적인 힌지 도메인은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:10): EPKSCDKTHTCPPCP를 가지는 인간 IgG1 힌지 도메인이다. 앞으로 인지되는 것과 같이, 예시적인 힌지 도메인은 사슬내 공유 결합에 참여할 수 있는 다중 시스테인 잔기를 포함한다 (Elkabetz et al. (2005) "Cysteines In CH1 Underlie Retention Of Unassembled Ig Heavy Chains," J. Biol. Chem. 280:14402-14412). 다르게는, 상이한 시스테인-함유 도메인이 사용될 수 있다 (예컨대 아미노산 서열: VEPKSC (SEQ ID NO:12), AEPKSC (SEQ ID NO:127), GVEPKSC (SEQ ID NO:133) 또는 GGCGGG (SEQ ID NO:2)를 가지는 펩티드).
야생형 CH2-CH3 도메인이 사용될 수 있긴 하지만, 상기에서 기술된 대로, 제 1 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인과의 이종이량체화를 촉진하는 변형된 CH2-CH3 도메인을 사용하는 것이 바람직하다.
그러므로 바람직하게, 제 3 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인은 그것의 아미노산 서열이 제 1 폴리펩티드에 사용된 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:7)에 상보하는 "구멍-포함" CH2-CH3 도메인일 것이다. 상기에서 논의된 것과 같이, 구멍-포함 CH2-CH3 도메인은 바람직하게 단백질 A 결합 부위를 제거하기 위하여 위치 435에서 치환 (H435R)을 포함해야 한다. 제 3 폴리펩티드에 대한 H435R을 가지는 예시적인 "구멍-포함" CH2-CH3 도메인은 SEQ ID NO:8이다.
앞으로 인지하게 되는 바, "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (예컨대 SEQ ID NO:7)은 제 3 폴리펩티드 사슬에 사용될 수 있었고, 그 경우 "구멍-포함" CH2-CH3 도메인 (예컨대 SEQ ID NO:8)은 제 1 폴리펩티드 사슬에 사용될 것이다.
본 발명의 바람직한 삼중-특이적 결합 분자의 제 3 (및 제 4) 폴리펩티드 사슬이 각각 T 세포 수용체-형 결합 도메인의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 구체예에서, 부류 I MHC의 맥락에서 세포 표면에 나타난 항원을 인식하였다. 그런 T 세포 수용체-형 결합 도메인을 제조하는 방법은 기술분야에 잘 알려져 있다 (예컨대 US2012/0294874A1).
그러므로, 요약하면, 본 발명의 바람직한 삼중-특이적 결합 분자의 제 3 폴리펩티드 사슬은 다음의 도메인 및 링커를 포함할 것이다: (VH III 도메인)-(시스테인-함유 도메인 (임의로 CH1 도메인 및/또는 힌지 도메인)-(구멍-포함 CH2-CH3 도메인) 또는 (수용체-형 결합 도메인; 그것의 제 1 또는 제 2 폴리펩티드)-(시스테인-함유 도메인 (임의로 CH1 도메인 및/또는 힌지 도메인)-(구멍-포함 CH2-CH3 도메인).
4. 바람직한 제 4 폴리펩티드 사슬
본 발명의 바람직한 삼중-특이적 결합 분자의 제 4 폴리펩티드 사슬은 수용체-형 결합 도메인 (제 3 및 제 4 폴리펩티드 사슬이 수용체-형 결합 도메인을 형성함) 또는, 보다 바람직하게는, 에피토프 III에 면역특이적으로 결합하는 및/또는 제 3 폴리펩티드 사슬의 결합 도메인에 상보하는 상기-표시된 항체의 경쇄의 폴리펩티드 부분 중 어느 하나이다.
그러므로, 제 3 및 제 4 폴리펩티드가 Fab-형 결합 도메인을 형성하는 경우, 그런 제 4 폴리펩티드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 에피토프 III에 결합할 수 있는 가변 경쇄 도메인 (VL III ), 및 제 3 폴리펩티드 사슬에의 공유 결합을 촉진하기 위한 시스테인-함유 도메인 또는 결합 도메인 및 제 3 폴리펩티드 사슬에의 공유 결합을 촉진하기 위한 그런 시스테인-함유 도메인을 포함한다. 그런 시스테인-함유 도메인은 CL 도메인 또는 그것의 시스테인-함유 부분, 예컨대 (SEQ ID NO:11) FNRGEC 또는 (SEQ ID NO:128) GFNRGEC 또는 링커, 예컨대 링커 2 (서열 (SEQ ID NO:2) GGCGGG를 가짐)일 수 있다. 그런 링커 2와 이황화 결합을 형성하는 예시적인 시스테인-함유 도메인은 아미노산 서열 VEPKSC (SEQ ID NO:12) 또는 힌지 도메인을 포함한다.
제 4 폴리펩티드 사슬은 자연적으로 발생하는 항체들로부터 분리될 수 있다. 다르게는, 재조합적으로 구성될 수 있다. 바람직한 CL 도메인은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:13):
RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD
SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC
를 가지는 인간 IgG1 카파 도메인이다.
다르게는, 예시적인 CL 도메인은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:14):
QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP TECS
를 가지는 인간 IgG1 CL 람다2 도메인이다.
주지하게 되는 것처럼, 제 4 폴리펩티드 사슬의 CL 도메인 또는 다른 시스테인-함유 도메인은 제 3 폴리펩티드 사슬의 시스테인-함유 도메인 (예컨대 CH1 도메인)의 시스테인 잔기에 공유적으로 결합할 수 있는 시스테인 잔기를 포함하고 그로써 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 제 3 및 제 4 폴리펩티드 사슬들은 서로에 대해 공유적으로 복합체를 형성한다.
추가적으로, 제 1 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인의 시스테인 잔기들은 제 3 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인의 시스테인 잔기들과 이황화 결합을 형성할 수 있다. 그로써 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬은 서로에 공유적으로 결합된다.
그러므로, 요약하면, 본 발명의 바람직한 삼중-특이적 결합 분자의 제 4 폴리펩티드 사슬은 다음의 도메인 및 링커를 포함할 것이다: (VL III 도메인)-(시스테인-함유 도메인 (임의로 CL 도메인)) 또는 (수용체-형 결합 도메인; 그것의 제 1 또는 제 2 폴리펩티드)-(시스테인-함유 도메인 (임의로 CL 도메인)).
C. 대체 제 1 폴리펩티드 사슬
한 구체예에서, 상기-기술된 도메인의 배향은 N-말단에서 C-말단 방향으로일 것이다. 그러나, 본 발명은 또한 그것의 변이를 포함하며, 이때 제 1 폴리펩티드 사슬의 도메인들의 배향은 다음과 같다: NH 2 -(손잡이-포함 CH3-CH2 도메인)-(VL I 도메인)-(링커 1)─(VH II 도메인)-(시스테인-함유 도메인 링커 2)-(E-코일 이종이량체-촉진 도메인). 바람직하게, 시스테인-함유 도메인은 그런 CH2-CH3 도메인에 대해 N-말단에 존재한다. 예시적인 펩티드의 서열은 (SEQ ID NO:5): DKTHTCPPCP이지만, 대체 링커, 예컨대 EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:129) 또는 LEPKSSDKTHTCPPCP; SEQ ID NO:130)도 사용될 수 있다. 바람직하게 이런 구체예에서, CH3 도메인은 개재하는 펩티드 링커, 예컨대 (SEQ ID NO:15): APSSS의 아미노산 서열, 보다 바람직하게는 아미노산 서열 (SEQ ID NO:16) APSSSPME를 가지는 링커에 의해 VLI 도메인으로부터 떨어져 있지만, 대체 링커, 예컨대 ASTKG (SEQ ID NO:131), LEPKSS (SEQ ID NO:132), GGC 또는 GGG도 사용될 수 있다.
D. 알부민-결합 도메인
WO 2012/018687에 개시된 것과 같이, 다이아바디의 생체 내 약물동역학적 특성을 향상시키기 위하여, 다이아바디는 다이아바디의 하나 이상의 말단에서 혈청-결합 단백질의 폴리펩티드 부분을 함유하도록 변형될 수 있다. 그런 고려사항은 또한 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자에도 적용될 수 있다. 가장 바람직하게, 혈청-결합 단백질의 폴리펩티드 부분이 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자 안으로 통합되는 것이 바람직할 때, 그런 폴리펩티드는 삼중-특이적 결합 분자의 폴리펩티드 사슬들 중 하나의 C-말단에 놓이게 될 것이다.
알부민은 혈장의 가장 풍부한 단백질이고 인간에서 19일의 반감기를 가진다. 알부민은 그것이 다른 단백질에 비-공유적으로 결합하는 것을 허용함으로써 혈청 반감기를 연장시키는 여러 소분자 결합 부위를 가진다. 스트렙토코쿠스 스트레인 G148의 단백질 G의 알부민-결합 도메인 3 (ABD3)은 안정한 3중-나선 번들을 형성하는 46개의 아미노산 잔기로 구성되고 넓은 알부민-결합 특이성을 나타낸다 (Johansson, M.U. et al. (2002) "Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules," J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120). 그러므로, 다이아바디의 생체 내 약물동역학적 특성을 향상시키기 위하 혈청-결합 단백질의 특히 바람직한 폴리펩티드 부분은 스트렙토코코스 단백질 G로부터의 알부민-결합 도메인 (ABD), 보다 바람직하게는 스트렙토코쿠스 스트레인 G418의 알부민-결합 도메인 3 (ABD3)(SEQ ID NO:123): LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALP이다.
WO 2012/162068 (본원에 참조로 포함됨)에 개시된 것과 같이, SEQ ID NO:123의 "탈면역된" 변이체는 MHC 부류 II 결합을 약화시키거나 제거하는 능력을 가진다. 조합적인 돌연변이 결과를 기반으로, 다음의 치환들의 조합이 그런 탈면역된 알부민-결합 도메인을 형성하기 위해 바람직한 것으로 여겨진다: 66S/70S +71A; 66S/70S +79A; 64A/65A/71A+66S; 64A/65A/71A+66D; 64A/65A/71A+66E; 64A/65A/79A+66S; 64A/65A/79A+66D; 64A/65A/79A+66E. 변이체 ABD는 변형 L64A, I65A 및 D79A 또는 변형 N66S, T70S 및 D79A를 가진다. 아미노산 서열: LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKN A 64 A 65NNAKT VEGVKALI A 79E ILAALP (SEQ ID NO:124) 또는 아미노산 서열: LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLI S 66NAK S 70 VEGVKALI A 79E ILAALP (SEQ ID NO:125)을 가지는 변이체 탈면역된 ABD가 실질적으로 야생형 결합을 나타내면서 약화된 MHC 부류 II 결합을 제공하는 그런 탈면역되 알부민-결합 도메인으로서 특히 바람직하다. 비록 그런 알부민-결합 도메인이 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 어떠한 폴리펩티드 사슬에 통합될 수 있지만, 그런 도메인을 (E-코일 (또는 K-코일) 도메인과 알부민-결합 도메인 (바람직하게는 탈면역된 알부민-결합 도메인) 사이에 개입하는 링커를 통해) 제 1 또는 제 3 폴리펩티드 사슬의 E-코일 (또는 K-코일) 도메인의 C-말단에 위치시키는 것이 바람직하다. 그런 링커에 대한 바람직한 서열은 SEQ ID NO:126: GGGS이다.
E. Fc 도메인의 기능성
한 구체예에서, 제 1 폴리펩티드 사슬의 CH2-CH3 도메인 및 제 3 폴리펩티드의 CH2-CH3 도메인은 Fc 수용체에 실질적으로 결합할 수 없는 Fc 도메인 (즉 야생형 Fc 도메인의 정도의 10% 미만의 결합)을 형성하기 위해 복합체를 형성할 것이다. 다르게는, 그런 분자들의 Fc 도메인은 생리적 조건하에서 Fc 수용체에 결합할 수 있어서, 그런 삼중-특이적 결합 분자가 4개의 분자 (에피토프 I, 에피토프 II 및 에피토프 III, 및 Fc 수용체)에 대한 동조된 결합을 중재할 수 있는 4가-특이적이 될 것이다. 가장 바람직하게, Fc 수용체에 결합할 수 있는 그런 분자들은 추가적으로 Fc 수용체-의존성 이펙터 기능을 중재할 것이다.
발명은 또한 비슷한 야생형 Fc 도메인에 비하여 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함하는 변이체 Fc 도메인을 포함하는 분자들을 포함한다. 변이체 Fc 도메인을 포함하는 분자들은 정상적으로 야생형 Fc 도메인을 포함하는 분자들과 관련하여 변경된 표현형을 가진다. 변이체 표현형은 NK 의존성 또는 대식세포 의존성 분석으로 분석되는 바, 변경된 혈청 반감기, 변경된 안정성, 세포 효소들에 대한 변경된 민감성 또는 변경된 이펙터 기능으로서 발현될 수 있다. 이펙터 기능을 변경하는 것으로서 확인된 Fc 도메인 변형들은 기술분야에 알려져 있고, 이를테면 활성화 수용체 (예컨대 FcγRIIA (CD16A))에 대한 결합을 증가시키고 억제 수용체 (예컨대 FcγRIIB (CD32B))에 대한 결합을 감소시키는 변형을 포함한다 (예컨대 Stavenhagen, J.B. et al. (2007) "Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors," Cancer Res. 57(18):8882-8890 참조). CD32B에 대한 간소된 결합 및/또는 CD16A에 대한 증가된 결합을 가지는 인간 IgG1 Fc 도메인들의 예시적인 변이체는 F243L, R292P, Y300L, V305I 또는 P296L 치환을 함유한다. 이들 아미노산 치환은 인간 IgG1 Fc 도메인에 어떠한 조합으로든 존재할 수 있다. 한 구체예에서, 인간 IgG1 Fc 도메인 변이체는 F243L, R292P 및 Y300L 치환을 함유한다. 다른 구체예에서, 인간 IgG1 Fc 도메인 변이체는 F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P296L 치환을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 인간 IgG1 Fc 도메인 변이체는 N297Q 치환, L234A 및 L235A 치환 또는 D265A 치환을 함유하는데, 이들 돌연변이가 FcR 결합을 없애기 때문이다.
III. 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 예시: CD3 및 CD8의 에피토프 및 질환-관련 항원의 에피토프에 결합하는 결합 도메인을 가지는 삼중-특이적 결합 분자
상기에서 진술한 것과 같이, 본 발명은 특히 3개의 에피토프가 그런 에피토프 중 하나 또는 2개가 면역 시스템 세포, 특히 세포독성 림프구 면역 시스템 세포 (CTL)의 에피토프(들)이고, 나머지 에피토프(들)은 질환-관련 항원의 에피토프(들)이 되도록 선택된 삼중-특이적 결합 분자의 구체예에 관련된다. 그런 삼중-특이적 결합 분자의 특히 바람직한 구체예에서, 그런 분자의 결합 도메인들은 에피토프 I, 에피토프 II 또는 에피토프 III이 CD3의 에피토프이고, 에피토프 I, 에피토프 II 또는 에피토프 III의 제 2가 CD8의 에피토프이며, 에피토프 I, 에피토프 II 또는 에피토프 III의 제 3이 질환-관련 항원의 에피토프가 되도록 선택되며, 여기서 그런 삼중-특이적 결합 분자의 결합 도메인 I, II 및 III은 세포독성 T 세포 및 질환-관련 항원을 발현하는 세포의 동조된 결합을 중재한다. 그런 삼중-특이적 결합 분자는 세포독성 림프구 세포를 질환-관련 항원을 발현하는 세포에 위치시킬 수 있고, 그로써 질환-관련 항원을 발현하는 세포를 살해하는 것을 용이하게 할 수 있다. 질환-관련 항원은 암 항원이거나, 또는 병원체 (예컨대 박테리아, 진균, 바이러스 또는 원생동물) 감염의 특징인 항원일 수 있다. 보다 구체적으로, 발명은 (1) CD3의 에피토프, (2) CD8의 에피토프 및 (3) 질환-관련 항원의 에피토프에 대한 동조된 결합을 중재할 수 있는 그런 삼중-특이적 결합 분자에 관련된다. CD3 및 CD8에의 결합 및 질환-관련 항원에의 결합에 의해, 그런 분자들은 세포독성 T 세포를 질환-관련 항원을 제공하는 세포에 공동-위치시킴으로써 그런 T 세포의 활성화 및 그 질환-관련 항원을 발현하는 세포에 대한 세포독성 반응의 개시를 유도한다.
항-CD3 또는 항-CD8 항체의 중쇄들은 본 발명의 그런 예시적인 삼중-특이적 결합 분자의 제 3 폴리펩티드 사슬로서 사용될 수 있다. 마찬가지로, 그런 항체들의 경쇄들은 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 제 4 폴리펩티드 사슬로서 사용될 수 있다. 다르게는, 그런 항체들의 경쇄 가변 도메인들 및/또는 중쇄 가변 도메인들은 그런 제 3 및 제 4 폴리펩티드 사슬을 이루기 위해 다른 면역글로불린 불변 영역과 조합될 수 있다. 그러므로, 그런 항체들은 부위 C가 CD3 또는 CD8에 결합할 수 있는 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
유사하게, 그런 가변 도메인들은 그것의 부위 A가 CD3 또는 CD8에 결합할 수 있거나, 부위 B가 CD3 또는 CD8에 결합할 수 있는 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자를 제조하기 위하여 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 제 1 및 제 3 폴리펩티드의 가변 도메인 부분에 통합될 수 있다.
1. 예시적인 항-CD3 항체들
하기에 제공된 예시적인 항-CD3 또는 항-CD8 항체들 중 어느 것이든지 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 CD3 또는 CD8 결합 도메인들을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
OKT3
OKT3 경쇄 가변 도메인 (SEQ ID NO:17) (CDR은 밑줄로 표시됨):
QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTC SASSSVS YMN WYQQKSG TSPKRWIY DT SKLAS GVPAH
FRGSGSGTSY SLTISGMEAE DAATYYC QQW SSNPFTF GSG TKLEINR.
OKT3 중쇄 가변 도메인 (SEQ ID NO:18) (CDR은 밑줄로 표시됨):
QVQLQQSGAE LARPGASVKM SCKASGYTFT RYTMH WVKQR PGQGLEWIG Y INPSRGYTNY
NQKFKD KATL TTDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCAR YY DDHYCL DYWG QGTTLTVSSA
KTTAPSVYPL APVCGDTTGS SVTLGCLVKG YFPEPVTLTW NSGSLSSGVH TFPAVLQSDL
YTLSSSVTVT SS.
M291
M291 경쇄 가변 도메인 (SEQ ID NO:19) (CDR은 밑줄로 표시됨):
DIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTC SASSSVS YMN WYQQKSG TSPKRWTY DT SKLAS GVPAR
FSGSGSGTSY SLTISSMEAE DADTYYC QQW SSNPPT FGSG TKLEIK.
M291 중쇄 가변 도메인 (SEQ ID NO:20) (CDR은 밑줄로 표시됨):
QVQLQQSGAE LARPGASVKM SCKASGYTFI SYTMH WVKQR PGQGLEWIG Y INPRSGYTHY
NQKLKD KATL TADKSSSSAY MQLSSLTSED SAVYYCAR SA YYDYDGFAY W GQGTLVTVSA.
YTH12.5
YTH12.5 경쇄 가변 도메인 (SEQ ID NO:21) (CDR은 밑줄로 표시됨):
MGWSCIILFL VATATGVHSD IQLTQPNSVS TSLGSTVKLS C TLSSGNIEN NYVH WYQLYE
GRSPTTMIY D DDKRPD GVPD RFSGSIDRSS NSAFLTIHNV AIEDEAIYFC HSYVSSFNV F
GGGTKLTVLR.
YTH12.5 중쇄 가변 도메인 (SEQ ID NO:22) (CDR은 밑줄로 표시됨):
MGWSCIILFL VATATGVHSE VQLLESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFTF SS FPMA WVRQAP
GKGLEWVS TI STSGGRTYYR DSVKG RFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCAK FRQ
YSGGFDY WGQ GTLVTVSS.
인간화된 항-CD3 항체 1 ("CD3 mAb 1") (US2014/0099318A1)
CD3 mAb 1 경쇄 가변 도메인 (SEQ ID NO:23) 변이체 1 (CDR은 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC SASSSVS YMN WYQQKPG KAPKRLIY DS SKLAS GVPSR
FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYC QQW SRNPPT FGGG TKVEIK.
CD3 mAb 1 경쇄 가변 도메인 (SEQ ID NO:24) 변이체 2 (CDR은 밑줄로 표시됨):
DVVMTQSPAI MSAFPGEKVT ITC SASSSVS YMN WYQQKPG KAPKRWIY DS SKLAS GVPSR
FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYC QQW SRNPPT FGGG TKVEIK.
CD3 mAb 1 중쇄 가변 도메인 (SEQ ID NO:25) 변이체 1 (CDR은 밑줄로 표시됨):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT RSTMH WVRQA PGQGLEWIG Y INPSSAYTNY
NQKFKD RVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAS PQ VHYDYNGFPY WGQGTLVTVS S
인간화된 항-CD3 항체 2 ("CD3 mAb 2") (US2014/0099318A1)
CD3 mAb 2 경쇄 가변 도메인 (SEQ ID NO:26) (CDR은 밑줄로 표시됨):
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCR SSTGAVT TSNYAN WVQQ KPGQAPRGLI G GTNKRAP WT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWV F GGGTKLTVLG.
CD3 mAb 2 중쇄 가변 도메인 (SEQ ID NO:27) (CDR은 밑줄로 표시됨):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT
YYADSVKD RF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAY WGQGTL
VTVSS.
CD3 mAb 2 중쇄 가변 도메인 D65G 변이체 (SEQ ID NO:28) (CDR은 밑줄로 표시됨):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT
YYADSVKG RF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAY WGQGTL VTVSS
2. 예시적인 항-CD8 항체
OKT8 ("CD8 mAb 1")
OKT8 경쇄 가변 도메인 (SEQ ID NO:29) (CDR은 밑줄로 표시됨):
DIVMTQSPAS LAVSLGQRAT ISC RASESVD SYDNSLMH WY QQKPGQPPKV LIY LASNLES
GVPARFSGSG SRTDFTLTID PVEADDAATY YC QQNNEDPY T FGGGTKLEI KR.
OKT8 중쇄 가변 도메인 (SEQ ID NO:30) (CDR은 밑줄로 표시됨):
QVQLLESGPE LLKPGASVKM SCKA SGYTFT DYNMH WVKQS HGKSLEWIG Y IYPYTGGTGY
NQKFKN KATL TVDSSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCARNF RYTYWYFDVW GQGTTVTVSS.
TRX2 ("CD8 mAb 2")
TRX2 경쇄 가변 도메인 (SEQ ID NO:31) (CDR은 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KGSQDIN NYLA WYQQKP GKAPKLLIY N TDILHT GVPS
RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYC YQ YNNGYT FGQG TKVEIK.
TRX2 중쇄 가변 도메인 (SEQ ID NO:32) (CDR은 밑줄로 표시됨):
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS DFGMN WVRQA PGKGLEWVA L IYYDGSNKFY
ADSVKG RFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAK PH YDGYYHFFDS WGQGTLVTVS S.
3. 질환-관련 항원의 에피토프에 결합하는 예시적인 결합 도메인
(a) HIV gp41
예시적인 질환-관련 항원은 HIV gp41이다. 예시적인 gp41 항체는 7B2 ("HIV mAb 1")이다.
7B2 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:35):
DIVMTQSPDS LAVSPGERAT IHCK SSQTLL YSSN NRHSIA WYQQRPGQPP KLLLYWASMR
LSGVPDRFSG S GSGTD FTLT INNLQAEDVA IYYCHQY SSH PPT FGHGTRV EIK.
7B2 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:36):
QVQLVQSGGG VFKPGGSLRL SCE ASGFTFT EY YMTWVRQA PGKGLEWLAY ISKNGEYSKY
SPSSNGRFTI SR DNAKNS VF LQLDRLSADD TAVYYCAR AD GLTYFSELLQ YIFDL WGQGA
RVTVSS.
(b) HIV gp120
제 2의 예시적인 질환-관련 항원은 HIV gp120이다. 예시적인 gp120 항체는 A32 ("HIV mAb 2")이다.
A32 VL 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:33):
QSALTQPPSA SGSPGQSVTI SCTGTSSDVG GYNYVSWYQH HPGKAPKLII SEVNNRPSGV
PDRFSGSKSG NTASLTVSGL QAEDEAEYYC SSYTDIHNFV FGGGTKLTVL.
VH 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:34):
QVQLQESGPG LVKPSQTLSL SCTVSGGSSS SGAHYWSWIR QYPGKGLEWI GYIHYSGNTY
YNPSLKSRIT ISQHTSENQF SLKLNSVTVA DTAVYYCARG TRLRTLRNAF DIWGQGTMVT
VSS.
(c) RSV 글리코단백질 F
추가의 예시적인 질환-관련 항원은 RSV 글리코단백질 F이다. 예시적인 항-RSV 글리코단백질 F 항체는 팔리비주맙 ("RSV mAb 1")이다.
팔리비주맙 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:37):
DIQMTQSPST LSASVGDRVT ITCRASQSVG YMHWYQQKPG KAPKLLIYDT SKLASGVPSR
FSGSGSGTEF TLTISSLQPD DFATYYCFQG SGYPFTFGGG TKLEIK.
팔리비주맙 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:38):
QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMSVGWIR QPPGKALEWL ADIWWDDKKD
YNPSLKSRLT ISKDTSKNQV VLKVTNMDPA DTATYYCARS MITNWYFDVW GAGTTVTVSS.
(d) B7-H3
특히 바람직한 예시적인 질환-관련 항원은 B7-H3으로, 그것은 다양한 암세포 (예컨대 신경아세포종, 위, 난소 및 비-소세포 폐 암 등)에서 발현된다. B7-H3 단백질 발현은 종양 셀라인에서 면역조직학적으로 검출된다 (Chapoval, A. et al. (2001) "B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production," Nature Immunol. 2:269-274; Saatian, B. et al. (2004) "Expression Of Genes For B7-H3 And Other T Cell Ligands By Nasal Epithelial Cells During Differentiation And Activation," Amer. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 287:L217-L225; Castriconi et al. (2004) "Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(34):12640-12645); Sun, M. et al. (2002) "Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes," J. Immunol. 168:6294-6297). mRNA 발현은 심장, 신장, 고환, 폐, 간, 췌장, 전립선, 대장 및 골아 세포에서 발견되지 않았다 (Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands," Genome Biol. 6:223.1-223.7). 단백질 수준에서, B7-H3은 인간 간, 폐, 방광, 고환, 전립선, 유방, 태반 및 림프양 기관에서 발견된다 (Hofmeyer, K. et al. (2008) "The Contrasting Role Of B7-H3," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278). B7-H3에 결합하는 예시적인 항체들은 인간화된 "BRCA84D," "BRCA69D" 및 "PRCA157"을 포함한다 (WO 2011/109400). 예시적인 경쇄 및 중쇄 가변은 다음의 서열을 가진다 (CDR은 밑줄로 표시됨):
예시적인 인간화된 BRCA84D-5VL 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:39):
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITC KASQNVD TNVA WYQQKP GQAPKALIY S ASYRYS GVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YNNYPFT FGQ GTKLEIK.
예시적인 인간화된 BRCA84D-2VH 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:40):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAAS GFTFS SFGMH WVRQA PGKGLEWVA Y ISSDSSAIYY
ADTVK GRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAVYYCGR GR ENIYYGSRLD Y WGQGTTVTV SS.
예시적인 BRCA69D ("B7-H3 mAb 1") 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:41):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQDIS NYLN WYQQKP GKAPKLLIY Y TSRLHS GVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYC QQ GNTLPPT FGG GTKLEIK.
예시적인 BRCA69D ("B7-H3 mAb 1") 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:42):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKAS GYTFT SYWMQ WVRQA PGQGLEWMG T IYPGDGDTRY
TQKFK GRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARRG IPRLWYFDVW GQGTTVTVSS.
예시적인 PRCA157 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:43):
DIQMTQSPAS LSVSVGETVT ITC RASESIY SYLA WYQQKQ GKSPQLLVY N TKTLPE GVPS
RFSGSGSGTQ FSLKINSLQP EDFGRYYC QH HYGTPPW TFG GGTNLEIK.
예시적인 PRCA157 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:44):
EVQQVESGGD LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SYGMS WVRQT PDKRLEW VAT INSGGSNTYY
PDSLKG RFTI SRDNAKNTLY LQMRSLKSED TAMYYCAR HD GGAMDY WGQG TSVTVSS.
(e) A33 종양 항원
A33 종양 항원은 또 다른 예시적인 질환-관련 항원이다. 예시적인 인간화된 항-A33 항체 ("gpA33 mAb 1")의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:45)이다:
QIVLTQSPAI MSASPGERVT MTC SARSSIS FMY WYQQKPG SSPRLLIY DT SNLAS GVPVR
FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYC QQW SSYPLT FGSG TKLELKR.
그런 예시적인 인간화된 항-A33 (gpA33 mAb 1) 항체의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:46)이다:
QVQLQQSGPE LVKPGASVKI SCKAS GYTFS GSWMN WVKQR PGQGLEWIG R IYPGDGETNY
NGKFKD KATL TADKSSTTAY MELSSLTSVD SAVYFCAR IY GNNVYFDV WG AGTTVTVSS.
(f) 5T4 종양 항원
5T4 종양 항원은 또 다른 예시적인 질환-관련 항원이다. 예시적인 인간화된 항-5T4 mAb 1 항체 ("5T4 mAb 1")의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:47)이다:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQGIS NYLA WFQQKP GKAPKSLIY R ANRLQS GVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYC LQ YDDFPWT FGQ GTKLEIK.
그런 예시적인 인간화된 5T4 mAb 1의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:48)이다:
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKAS GYTFT SFWMH WVRQA PGQGLEWMG R IDPNRGGTEY
NEKAKS RVTM TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAG GN PYYPMDY WGQ GTTVTVSS.
제 2 예시의 인간화된 5T4 mAb 2 항체 ("5T4 mAb 2")의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:49)이다:
DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISC RSSQSIV YSNGNTYLE W YLQKPGQSPK LLIY KVSNRF
S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYC FQGSHVP FT FGSGTKLE IK.
그런 제 2 예시의 인간화된 5T4 mAb 2의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:50)이다:
QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKAS GYTFT SYWIT WVKQR PGQGLEWIG D IYPGSGRANY
NEKFKS KATL TVDTSSSTAY MQLSSLTSED SAVYNCAR YG PLFTTVVDPN SYAMDY WGQG
TSVTVSS.
(g) ROR1 항원
ROR1 종양 항원은 또 다른 예시적인 질환-관련 항원이다. 예시적인 항-ROR1 항체들은 항체 2A2 (WO 2010/124188), R11 (WO 2012/075158) 및 R12 (WO 2012/075158)를 포함한다.
2A2 항체의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:53)이다:
DIVMTQSQKI MSTTVGDRVS ITC KASQNVD AAVA WYQQKP GQSPKLLIY S ASNRYT GVPD
RFTGSGSGTD FTLTISNMQS EDLADYFC QQ YDIYPYT FGG GTKLEIK.
2A2 항체의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:54)이다:
QVQLQQSGAE LVRPGASVTL SCKASGYTFS DYEMH WVIQT PVHGLEWIG A IDPETGGTAY
NQKFKG KAIL TADKSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCTG YY DYDSFTY WGQ GTLVTVSA.
R11 항체의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:55)이다:
ELVMTQTPSS TSGAVGGTVT INC QASQSID SNLA WFQQKP GQPPTLLIY R ASNLAS GVPS
RFSGSRSGTE YTLTISGVQR EDAATYYC LG GVGNVSYRTS FGGGTEVVVK.
R11 항체의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:56)이다:
QSVKESEGDL VTPAGNLTLT CTASGSDIN D YPIS WVRQAP GKGLEWIG FI NSGGSTWYAS
WVKG RFTISR TSTTVDLKMT SLTTDDTATY FCAR GYSTYY GDFNI WGPGT LVTISS.
R12 항체의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:57)이다:
ELVLTQSPSV SAALGSPAKI TC TLSSAHKT DTID WYQQLQ GEAPRYLMQV QSD GSYTKRP
GVPDRFSGSS SGADRYLIIP SVQADDEADY YC GADYIGGY V FGGGTQLTV TG.
R12 항체의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:58)이다:
QEQLVESGGR LVTPGGSLTL SCKASGFDFS AYYMS WVRQA PGKGLEWIA T IYPSSGKTYY
ATWVNG RFTI SSDNAQNTVD LQMNSLTAAD RATYFCAR DS YADDGALFNI WGPGTLVTIS S.
본 발명의 한 측면 (하기에서 상세하게 논의됨)은 보다 바람직한 인간화된 항-ROR1 항체 ("ROR1 mAb 1")의 제공이다. 이 보다 바람직한 ROR1 mAb 1은 다음 서열 (SEQ ID NO:51)을 가지는 경쇄 가변 도메인을 가진다:
QLVLTQSPSA SASLGSSVKL TC TLSSGHKT DTID WYQQQP GKAPRYLMK L EGSGSY NKGS
GVPDRFGSGS SSGADRYLTI SSLQSEDEAD YYC GTDYPGN YL FGGGTQLT VL.
그런 보다 바람직한 인간화된 ROR1 mAb 1의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:52)이다:
QEQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAAS GFTFS DYYMS WVRQA PGKGLEWVA T IYPSSGKTYY
ADSVKG RFTI SSDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR DS YADDAALFDI WGQGTTVTVS S.
IV. 결합 부위의 선택: 부위 A, 부위 B 및 부위 C
상기에서 표시된 것과 같이, 본 발명의 바람직한 삼중-특이적 결합 분자는 결합 도메인 III으로부터 가장 멀리 있는 "외부" 다이아바디-형 결합 도메인 (부위 A), 결합 도메인 III에 가장 가까이 있는 "내부" 다이아바디-형 결합 도메인 (부위 B) 및 결합 도메인 III 자체 (부위 C)를 가지는 적어도 삼중-특이적이다. 본원에서 사용되는 바, "X/Y/Z"와 같은 삼중-특이적 결합 분자의 기술은 X 결합 도메인이 부위 A에 있고, Y 결합 도메인이 부위 B에 있으며 Z 결합 도메인이 부위 C에 있는 것을 가리킨다. 예를 들어, 삼중-특이적 결합 분자 표시 "B7-H3 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1"은 B7-H3 mAb 1 가변 도메인이 삼중-특이적 결합 분자의 부위 A를 차지하고, CD3 mAb 2 가변 도메인이 삼중-특이적 결합 분자의 부위 B를 차지하며 CD8 mAb 1 가변 도메인이 부위 C를 차지하는 것을 가리킨다.
본 발명은 그러므로 그런 부위들의 어떤 것이 특정한 바람직한 에피토프에 결합하는 데 사용될 것인지에 대한 선택을 허용한다. 특히 CD3, CD8 및 질환-관련 항원에 결합하는 삼중-특이적 결합 분자로 그런 선택을 안내하는 한 가지 인자는 트로고사이토시스 (trogocytosis)의 효과 및 바람직성의 고려를 포함한다. "트로고사이토시스"는 세포가 그것을 통해 접촉하는 세포의 세포막의 부분을 획득할 수 있는 과정이다 (Masuda, S. et al. (2013) "Possible Implication Of Fc γ Receptor-Mediated Trogocytosis In Susceptibility To Systemic Autoimmune Disease," Clin. Dev. Immunol. 2013: Article ID 345745, 6 pages); Dhainaut, M. et al. (2014) "Regulation of Immune Reactivity by Intercellular Transfer," Front Immunol. 5:112; Ahmed, K.A. et al. (2011) "Mechanisms Of Cellular Communication Through Intercellular Protein Transfer," J. Cell. Mol. Med. 15(7):1458-1473; Ahmed, K.A. et al. (2008) "Intercellular Trogocytosis Plays An Important Role In Modulation Of Immune Responses," Cell. Mol. Immunol. 5(4):261-269; LeMaoult, J. et al. (2007) "Exchanges Of Membrane Patches (Trogocytosis) Split Theoretical And Actual Functions Of Immune Cells," Hum. Immunol. 68(4):240-243; Caumartin. J. et al. (2006) "Intercellular Exchanges Of Membrane Patches (Trogocytosis) Highlight The Next Level Of Immune Plasticity," Transpl. Immunol. 17(1):20-22).
동족 MHC 부류 I 리간드의 트로고사이토시스에 의한 획득은 세포독성 T 림프구가 다른 세포독성 T 세포의 살해 ("형제살해")를 중재하는 "획득된 Treg" 세포가 되는 것을 유도하고, 그로써 CD8+ 세포의 클리어런스에 기여한다 (D'Acquisto, F. et al. (2011) "CD3 + CD4 - CD8 - (Double Negative) T Cells: Saviours Or Villains Of The Immune Response?" Biochem. Pharmacol. 82:333-340; Joly, E. et al. (2003) "What Is Trogocytosis And What Is Its Purpose?" Nat. Immunol. 4:815-; Hudrisier, D. et al. (2007) "Capture Of Target Cell Membrane Components Via Trogocytosis Is Triggered By A Selected Set Of Surface Molecules On T Or B Cells," J. Immunol. 178:3637-3647).
부위 C 위치로서 CD3 결합 도메인을 가지는 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자는 항-CD3 항체의 속성을 가지고, 마찬가지로 부위 C 위치로서 CD8 결합 도메인을 가지는 그런 삼중-특이적 결합 분자는 항-CD8 항체의 속성을 가진다. 항-CD8 항체 (T 세포의 CD8 분자에 결합됨)의 Fc 도메인에 결합되는 Fc 수용체를 가지는 호중구, 단핵세포 또는 대식세포는 트로고사이토시스를 통해 T 세포로부터 그 자체로 항체 및 결합된 CD8 분자를 전달할 수 있고, 그런 다음 신속하게 항체를 내재화할 수 있는 것으로 밝혀졌다; 방관자 분자, 예컨대 TCR 및 CD3 또한 이 과정으로 전달될 수 있다 (Masuda, S. et al., (2013) "Possible Implication of Fcg Receptor-Mediated Trogocytosis in Susceptibility to Systemic Autoimmune Disease," Clin. Develop. Immunol. 2013:Article ID 345745, 6 pages).
CD3 및 CD8의 구조는 CD3이 세포막에 가까이 놓여있는 한편, CD8은 세포막으로부터 멀리 뻗어 있다는 점에서 상이하다. 그러므로 항-CD3 항체에 의한 CD3의 Fc 수용체 트로고사이토시스는 항-CD8 항체에 의한 CD8의 Fc 수용체 트로고사이토시스보다 더 효과적일 것이라고 예상된다.
이런 현상은 그것의 CD3 결합 도메인이 부위 C에 위치한, CD3, CD8 및 질환-관련 항원에 결합하는 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자가 CD3 결합 도메인이 부위 A 또는 부위 B에 위치한 유사한 삼중-특이적 결합 분자보다 더 적은 세포독성을 나타낼 것임을 가리킨다. 그러므로, 부위 C 위치에 (부위 A 또는 B 중 어느 하나와 반대로) CD3 결합 도메인을 놓는 것을 선택함으로써, 당업자는 세포독성의 정도를 조절할 수 있다. 추가적으로, 당업자는 바람직한 세포독성 정도를 얻기 위해 "부위 C" 및 "부위 A (또는 B)" CD3의 혼합물을 함유하는 약학 조성물을 화합할 수 있다.
V. 항-ROR1 mAb 1 항체
상기에서 표시된 것과 같이, 본 출원의 한 측면은 경쇄 가변 도메인이 다음의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:51):
QLVLTQSPSA SASLGSSVKL TC TLSSGHKT DTID WYQQQP GKAPRYLMK L EGSGSY NKGS
GVPDRFGSGS SSGADRYLTI SSLQSEDEAD YYC GTDYPGN YL FGGGTQLT VL을 가지고,
중쇄 가변 도메인이 다음의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:52):
QEQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAAS GFTFS DYYMS WVRQA PGKGLEWVA T IYPSSGKTYY
ADSVKG RFTI SSDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR DS YADDAALFDI WGQGTTVTVS S를 가지는 고도로 바람직한 인간화된 항-ROR1 항체 ("ROR1 mAb 1")의 제공이다.
그런 ROR1 mAb 1 항체의 경쇄 가변 도메인의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 서열은 다음과 같다:
경쇄 가변 도메인 CDRL1 (SEQ ID NO:117): TLSSGHKTDTID
경쇄 가변 도메인 CDRL2 (SEQ ID NO:118): LEGSGSY
경쇄 가변 도메인 CDRL3 (SEQ ID NO:119): GTDYPGNYL.
그런 ROR1 mAb 1 항체의 중쇄 가변 도메인의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3의 서열은 다음과 같다:
중쇄 가변 도메인 CDRH1 (SEQ ID NO:120): GFTFSDYYMS
중쇄 가변 도메인 CDRH2 (SEQ ID NO:121): TIYPSSGKTYYADSVKG
중쇄 가변 도메인 CDRH3 (SEQ ID NO:122): DSYADDAALFDI.
ROR1 mAb 1 항체는 세포독성을 증가시켰고 선행기술의 항-ROR1 항체들 (예컨대 항-ROR1 항체 R12)와 관련하여 면역원성이 적다.
발명은 그런 서열들뿐 아니라, 그런 경쇄 가변 도메인 (SEQ ID NO:51, CDR은 밑줄로 표시됨)의 1, 2 또는 3개의 CDR을 가지거나 또는 그런 중쇄 가변 도메인 (SEQ ID NO:52; CDR은 밑줄로 표시됨)의 1, 2 또는 3개의 CDR을 가지며, ROR1에 면역특이적으로 결합하는 무상 ROR1 mAb 1 항체 유도체들 (그것들의 키메라 또는 인간화된 유도체 포함함)을 포함한다. 보다 바람직하게, 그렇게 포함된 항체들, 키메라 항체들 및 인간화된 항체들은 그런 경쇄 가변 도메인 (SEQ ID NO:51, CDR은 밑줄로 표시됨)의 1, 2 또는 3개의 CDR을 가지거나 또는 그런 중쇄 가변 도메인 (SEQ ID NO:52; CDR은 밑줄로 표시됨)의 1, 2 또는 3개의 CDR을 가지며, ROR1에 면역특이적으로 결합할 것이다. 가장 바람직하게, 그렇게 포함된 항체들, 키메라 항체들 및 인간화된 항체들은 그런 경쇄 가변 도메인의 3개의 모든 CDR 및 그런 중쇄 가변 도메인의 3개의 모든 CDR을 가질 것이며 ROR1에 면역특이적으로 결합할 수 있다.
발명은 추가적으로 그렇게 포함된 ROR1 mAb 1 항체의 단편들 및 유도체, 이를테면 Fab, Fab', F(ab')2 Fv), 단일-사슬 (ScFv), "BiTE®", "DARTTM" 다이아바디 분자들, 그것들의 돌연변이체, 자연적으로 발생하는 변이체 및 융합 단백질을 포함하고, 그것들은 모두 1, 2 또는 3개의 경쇄 가변 도메인 CDR, 또는 1, 2 또는 3개의 중쇄 가변 도메인 CDR 또는 1, 2 또는 3개의 경쇄 가변 도메인 CDR과 또한 1, 2 또는 3개의 중쇄 가변 도메인 CDR을 포함하며, ROR1에 면역특이적으로 결합할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 그런 ROR1 mAb 1 항체 또는 그것들의 단편 또는 유도체들은 변이체 Fc 도메인을 가질 수 있다. Fc 도메인의 변형은 정상적으로 변경된 표현형, 예를 들면 변경된 혈청 반감기, 변경된 안정성, 세포 효소들에 대한 변경된 민감성 또는 변경된 이펙터 기능을 유도한다. 예를 들어 암을 치료하는데 있어 항체의 유효성을 증강시키기 위하여, 이펙터 기능과 관련하여 발명의 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이펙터 기능의 감소 또는 제거는 특정 경우에, 예를 들어 그것의 작용 메커니즘이 차단 또는 길항작용을 포함하지만 표적 항원을 포함하고 있는 세포의 살해는 아닌 항체의 경우에 바람직하다. 증가된 이펙터 기능은 일반적으로 비바람직한 세포, 예컨대 종양 및 외래 세포들에 대해 지시될 때 바람직한데, 이때 FcγR은 저 수준, 예를 들면 종양 특이적 B 세포에서 저 수준의 FcγRIIB로 발현된다 (예컨대 비-호지킨 림프종, CLL 및 버킷 림프종). 상기 구체예들에서, 부여된 또는 증강된 이펙터 기능 활성을 가지는 발명의 분자들은 이펙터 기능 활성의 증강된 효능이 바람직한 질환, 장애 또는 감염의 치료 및/또는 방지에 유용하다.
특정 구체예에서, 그런 ROR1 mAb 1 항체 또는 그것들의 단편 또는 유도체들은 Fc 도메인의 아미노산들에 대한 하나 이상의 변형을 포함하며, 그것은 하나 이상의 FcγR 수용체에 대한 그런 분자의 Fc 도메인의 친화성 및 결합력을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 그런 ROR1 mAb 1 항체 또는 그것들의 단편 또는 유도체들은 하나 이상의 FcγR 수용체에 대한 그런 분자의 Fc 도메인의 친화성 및 결합력을 증가시키는 Fc 도메인의 아미노산들에 대한 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 분자들은 상기 변이체가 Fc 도메인을 포함하지 않거나 야생형 Fc 도메인을 포함하는 분자와 관련하여, 증가된 ADCC 활성 및/또는 FcγRIIA에 대한 증가된 결합을 부여하거나 중재하는 변이체 Fc 도메인을 포함한다. 대체 구체예에서, 분자들은 상기 변이체가 Fc 도메인을 포함하지 않거나 야생형 Fc 도메인을 포함하는 분자와 관련하여, 감소된 ADCC 활성 (또는 다른 이펙터 기능) 및/또는 FcγRIIA에 대한 증가된 결합을 부여하거나 중재하는 변이체 Fc 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 발명은 변이체 Fc 도메인을 포함하는 그런 ROR1 mAb 1 항체 또는 그것들의 단편 또는 유도체들을 포함하며, 그 변이체 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인을 포함하는 비슷한 분자와 관련하여 어떠한 FcγR에 대한 검출 가능한 결합을 나타내지 않는다. 다른 구체예에서, 발명은 변이체 Fc 도메인을 포함하는 그런 ROR1 mAb 1 항체 또는 그것들의 단편 또는 유도체들을 포함하며, 그 변이체 Fc 도메인은 단일 FcγR, 바람직하게는 FcγRIIA, FcγRIIB 또는 FcγRIIIA 중 하나에만 결합한다.
그런 ROR1 mAb 1 항체 또는 그것들의 단편 또는 유도체들은 활성화 및/또는 억제성 Fcγ 수용체에 대한 변경된 친화성을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 항체 또는 분자는 야생형 Fc 도메인을 포함하는 비슷한 분자와 관련하여, FcγRIIB에 대한 증가된 친화성 및 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대한 감소된 친화성을 가지는 변이체 Fc 도메인을 포함한다. 다른 구체예에서, 그런 ROR1 mAb 1 항체 또는 그것들의 단편 또는 유도체들은 야생형 Fc 도메인을 포함하는 비슷한 분자와 관련하여, FcγRIIB에 대한 감소된 친화성 및 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대한 증가된 친화성을 가지는 변이체 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 그런 ROR1 mAb 1 항체 또는 그것들의 단편 또는 유도체들은 야생형 Fc 도메인을 포함하는 비슷한 분자와 관련하여, FcγRIIB에 대한 감소된 친화성 및 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대한 감소된 친화성을 가지는 변이체 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 그런 ROR1 mAb 1 항체 또는 그것들의 단편 또는 유도체들은 야생형 Fc 도메인을 포함하는 비슷한 분자와 관련하여, FcγRIIB에 대한 변하지 않는 친화성 및 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대한 감소된 (또는 증가된) 친화성을 가지는 변이체 Fc 도메인을 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 발명은 면역글로불린이 증강된 이펙터 기능, 예컨대 ADCC를 가지도록 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대한 변경된 친화성을 가지는 변이체 Fc 도메인을 포함하는 그런 ROR1 mAb 1 항체 또는 그것들의 단편 또는 유도체들을 포함한다. 이펙터 세포 기능의 비-제한적 실례는 ADCC, 항체 의존성 세포 식세포작용, 옵소닌화, 옵소닌성 식세포작용, 세포 결합, 로세팅 (rosetting), C1q 결합 및 CDC를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 친화성 또는 이펙터 기능의 변경은 야생형 Fc 도메인을 포함하는 비슷한 분자와 관련하여, 적어도 2-배, 바람직하게는 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 6-배, 적어도 7-배, 적어도 8-배, 적어도 9-배, 적어도 10-배, 적어도 50-배 또는 적어도 100-배이다. 발명의 다른 구체예에서, 변이체 Fc 도메인은 하나 이상의 FcR에 야생형 Fc 도메인을 포함하는 비슷한 분자와 관련하여 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225% 또는 250% 더 큰 친화성으로 특이적으로 결합한다. 그런 측정은 생체 내 또는 시험관 내 분석에서 이루어질 수 잇고, 바람직한 구체예에서는 ELISA 또는 표면 플라스몬 공명 분석과 같은 시험관 내 분석일 수 있다.
상이한 구체예에서, 그런 ROR1 mAb 1 항체 또는 그것들의 단편 또는 유도체들은 변이체가 FcγR 수용체의 적어도 한 가지의 활성을 아고나이즈하거나, 또는 FcγR 수용체의 적어도 한 가지의 활성을 길항하는 그런 변이체 Fc 도메인을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 분자들은 FcγRIIB의 하나 이상의 활성, 예를 들면 B 세포 수용체-중재된 신호화, B 세포의 활성화, B 세포 증식, 항체 생성, B 세포의 세포내 칼슘 유입, 세포 주기 진전, FcγRI 신호화의 FcγRIIB-중재된 억제, FcγRIIB의 인산화, SHIP 보충, SHIP 인산화 및 Shc와의 회합, 또는 FcγRIIB 신호 전환 경로에서 하나 이상의 하류 분자들 (예컨대 MAP 키나아제, JNK, p38 또는 Akt)의 활성을 아고나이즈 (또는 길항)하는 변이체를 포함한다. 다른 구체예에서, 분자들은 FcεRI의 하나 이상의 활성, 예를 들면 비만 세포 활성화, 칼슘 고정, 탈과립화, 사이토킨 생성 또는 세로토닌 방출을 아고나이즈 (또는 길항)하는 변이체를 포함한다.
특정 구체예에서, 그런 ROR1 mAb 1 항체 또는 그것들의 단편들은 둘 이상의 IgG 아이소타입 (예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)으로부터 Fc 도메인-포함 도메인을 포함한다. 다양한 IgG 아이소타입은 예를 들면 문헌들에 기술된 것과 같이, 그것들의 힌지 및/또는 Fc 도메인들의 아미노산 서열의 차이로 인해 혈청 반감기, 보충물-고정, FcγR 결합 친화성 및 이펙터 기능 활성 (예컨대 ADCC, CDC 등)을 포함한 상이한 물리적 및 기능적 특성들을 나타낸다 (Flesch, B.K. and Neppert, J. (1999) "Functions Of The Fc Receptors For Immunoglobulin G," J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156; Chappel, M.S. et al. (1993) "Identification Of A Secondary Fc Gamma RI Binding Site Within A Genetically Engineered Human IgG Antibody," J. Biol. Chem. 33:25124-25131; Chappel, M.S. et al. (1991) "Identification Of The Fc Gamma Receptor Class I Binding Site In Human IgG Through The Use Of Recombinant IgG1/IgG2 Hybrid And Point-Mutated Antibodies," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:9036-9040; Bruggemann, M. et al. (1987) "Comparison Of The Effector Functions Of Human Immunoglobulins Using A Matched Set Of Chimeric Antibodies," J. Exp. Med 166:1351-1361). 이 유형의 변이체 Fc 도메인은 Fc-중재된 이펙터 기능 및/또는 결합 활성에 영향을 미치기 위해, 단독으로 사용되거나, 또는 아미노산 변형과 함께 사용될 수 있다. 그것과 함께, 아미노산 변형 및 IgG 힌지/Fc 도메인은 유사한 기능성 (예컨대 FcγRIIA에 대해 증가된 친화성)을 나타낼 수 있고 야생형 Fc 도메인을 포함하는 발명의 분자와 관련하여, 발명의 분자의 이펙터 기능성을 조절하기 위하여 중독적으로, 또는 보다 바람직하게는 상조적으로 작용할 수 있다. 다른 구체예에서, 아미노산 변형 및 IgG Fc 도메인은 반대의 기능성 (예컨대 각각 FcγRIIA에 대해 증가된 및 감소된 친화성)을 나타낼 수 있고, Fc 도메인을 포함하지 않거나 또는 동일한 아이소타입의 야생형 Fc 도메인을 포함하는 발명의 분자와 관련하여, 발명의 분자의 특이적인 기능성을 선택적으로 완화시키거나 감소시키기 위하여 작용할 수 있다.
바람직한 특정 구체예에서, 그런 ROR1 mAb 1 항체 또는 그것들의 단편들은 변이체 Fc 도메인을 포함하고, 상기 변이체 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인과 관련하여 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하여서, 그 분자는 FcR에 대한 변경된 친화성을 가지게 되고, 단 상기 변이체 Fc 도메인은 Sondermann, P. 등에 의해 개시된 것들과 같은 (Sondermann, P. et al. (2000) "The 3.2-A Crystal Structure Of The Human IgG1 Fc Fragment-Fc GammaRIII Complex," Nature 406:267-273) Fc-FcR 상호작용의 결정학상의 및 구조적 분석을 기반으로 하여 FcγR과의 직접적인 접촉을 만드는 위치에서 치환을 갖지 않아야 한다. FcγR과의 직접적인 접촉을 만드는 Fc 도메인 내의 위치들의 실례는 아미노산 잔기 234 내지 239 (힌지 도메인), 아미노산 잔기 265 내지 269 (B/C 루프), 아미노산 잔기 297 내지 299 (C'/E 루프) 및 아미노산 산지 327 내지 332 (F/G 루프)이다. 일부 구체예에서, 발명의 분자들은 구조적 및 결정학상의 분석을 기반으로 FcγR과의 직접적인 접촉을 만들지 않는, 예컨대 Fc-FcγR 결합 부위 내에 있지 않는, 적어도 하나의 잔기의 변형을 포함하는 변이체 Fc 도메인들을 포함한다.
변이체 Fc 도메인들은 기술분야에 잘 알려져 있고, 어떠한 공지된 Fc 변이체든지, 기능적으로 분석된, 예컨대 NK 의존성 또는 대식세포 의존성 분석으로 분석되는 바 Fc 도메인 (또는 그것들의 일부)을 포함하는 그런 ROR1 mAb 1 항체들 또는 그것들의 단편들에 의해 나타난 이펙터 기능을 부여하거나 변형시키기 위해 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, 이펙터 기능을 변경시키는 것으로서 확인된 Fc 도메인 변이체들은 PCT 공개 번호 WO 04/063351; WO 06/088494; WO 07/024249; WO 06/113665; WO 07/021841; WO 07/106707; WO 2008/140603에 개시되어 있고, 그 문헌들에 개시된 어떠한 적합한 변이체든지 본 분자들에 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 그런 ROR1 mAb 1 항체들 또는 그것들의 단편들은 하나 이상의 부위에 하나 이상의 아미노산 변형을 가지는 변이체 Fc 도메인을 포함하며, 그 변형(들)은 억제하는 FcγR (예컨대 FcγRIIB)과 관련하여 활성화 FcγR (예컨대 FcγRIA 또는 FcγRIIIA)에 대한 변이체 Fc 도메인의 친화성 비율을 (야생형 Fc 도메인과 관련하여) 변경시킨다.
Figure pat00002
Fc 변이체가 1보다 큰 친화성 비율을 가지는 경우, 발명의 방법은 FcγR에 의해 중재된 이펙터 세포 기능 (예컨대 ADCC)의 증강된 효능이 바람직한 경우, 예컨대 암 또는 감염성 질환의 경우, 질환, 장애 또는 감염의 치료적 또는 예방적 치료 또는 그것들의 증상의 완화를 제공하는 데 특별히 사용될 수 있다. Fc 변이체가 1보다 작은 친화성 비율을 가지는 경우, 발명의 방법은 FcγR에 의해 중재된 이펙터 세포 기능의 감소된 효능이 바람직한 경우, 예컨대 자가면역 또는 염증성 장애의 경우, 질환 또는 장애의 치료적 또는 예방적 치료 또는 그것들의 증상의 완화를 제공하는 데 특별히 사용될 수 있다. 하기 표 3은 친화성 비율이 1보다 크거나 작은 경우의 예시적인 단일, 이중, 삼중, 사중 및 오중 돌연변이를 열거한 것이고, 이들 변형에 관련된 더 많은 정보는 PCT 공개 번호 WO 04/063351; WO 06/088494; WO 07/024249; WO 06/113665; WO 07/021841; WO 07/106707; WO 2008/140603에서 찾아볼 수 있다.
친화성 비율에 의해 열거된 예시적인 단일 및 다중 돌연변이들
비율 단일 이중 삼중 사중 오중
> 1 F243L
D270E
R292G
R292P		 F243L & R292P
F243L & Y300L
F243L & P396L
D270E & P396L
R292P & Y300L
R292P & V305I
R292P & P396L
Y300L & P396L
P396L & Q419H		 F243L, P247L & N421K
F243L, R292P & Y300L
F243L, R292P & V305I
F243L, R292P & P396L
F243L, Y300L & P396L
P247L, D270E & N421K
R255L, D270E & P396L
D270E, G316D & R416G
D270E, K392T & P396L
D270E, P396L & Q419H
V284M, R292L & K370N
R292P, Y300L & P396L		 L234F, F243L, R292P & Y300L
L235I, F243L, R292P & Y300L
L235Q, F243L, R292P & Y300L
F243L, P247L, D270E & N421K
F243L, R255L, D270E & P396L
F243L, D270E, G316D & R416G
F243L, D270E, K392T & P396L
F243L, D270E, P396L & Q419H
F243L, R292P, Y300L, & P396L
F243L, R292P, V305I & P396L
P247L, D270E, Y300L & N421K
R255L, D270E, R292G & P396L
R255L, D270E, Y300L & P396L
D270E, G316D, P396L & R416G		 L235V, F243L, R292P, Y300L & P396L
L235P, F243L, R292P, Y300L & P396L
F243L, R292P, V305I, Y300L & P396L
< 1 Y300L
P396L		 F243L & P396L
P247L & N421K
R255L & P396L
R292P & V305I

K392T & P396L
P396L & Q419H		 F243L, R292P & V305I
특정 구체예에서, 변이체 Fc 도메인에서, 위치 235, 240, 241, 243, 244, 247, 262, 263, 269, 298, 328 또는 330 중 어떠한 위치에서의 어떠한 아미노산 변형 (예컨대 치환) 및 바람직하게는 다음 잔기들: A240, I240, L241, L243, H244, N298, I328 또는 V330 중 하나 이상. 상이한 특정 구체예에서, 변이체 Fc 도메인에서, 위치 268, 269, 270, 272, 276, 278, 283, 285, 286, 289, 292, 293, 301, 303, 305, 307, 309, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439 중 어떠한 위치에서의 어떠한 아미노산 변형 (또는 치환) 및 바람직하게는 다음의 잔기들: H280, Q280, Y280, G290, S290, T290, Y290, N294, K295, P296, D298, N298, P298, V298, I300 또는 L300 중 하나 이상.바람직한 구체예에서, 변경된 친화성으로 FcγR에 결합하는 변이체 Fc 도메인에서, 위치 255, 256, 258, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 320, 322, 326, 329, 330, 332, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 359, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439 중 어떠한 위치에서의 어떠한 아미노산 변형 (예컨대 치환). 바람직하게, 변이체 Fc 도메인은 다음 잔기들 중 어느 것을 가진다: A256, N268, Q272, D286, Q286, S286, A290, S290, A298, M301, A312, E320, M320, Q320, R320, E322, A326, D326, E326, N326, S326, K330, T339, A333, A334, E334, H334, L334, M334, Q334, V334, K335, Q335, A359, A360 또는 A430.
상이한 구체예에서, 감소된 친화성으로 FcγR에 (그것의 Fc 도메인을 통해) 결합하는 변이체 Fc 도메인에서, 위치 252, 254, 265, 268, 269, 270, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 또는 439 중 어느 위치에서의 어떠한 아미노산 변형 (예컨대 치환).
상이한 구체예에서, 증강된 친화성으로 FcγR에 (그것의 Fc 도메인을 통해) 결합하는 변이체 Fc 도메인에서, 위치 280, 283, 285, 286, 290, 294, 295, 298, 300, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 331, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398 또는 430 중 어느 위치에서의 어떠한 아미노산 변형 (예컨대 치환). 상이한 구체예에서, 증강된 친화성으로 FcγR에 결합하는 변이체 Fc 도메인에서, 다음의 잔기들 중 어떠한 잔기: A255, A256, A258, A267, A268, N268, A272, Q272, A276, A280, A283, A285, A286, D286, Q286, S286, A290, S290, M301, E320, M320, Q320, R320, E322, A326, D326, E326, S326, K330, A331, Q335, A337 또는 A430.
바람직한 변이체는 다음의 어떠한 위치에서의 하나 이상의 변형을 포함한다: 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 271, 273, 275, 281, 284, 291, 296, 297, 298, 299, 302, 304, 305, 313, 323, 325, 326, 328, 330 또는 332.
특히 바람직한 변이체는 다음 A 내지 AI 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함한다:
Figure pat00003
또한 보다 특히 바람직한 변이체는 다음의 1 내지 105 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함한다:
Figure pat00004
Figure pat00005
한 구체예에서, 그런 ROR1 mAb 1 항체 또는 그것들의 단편들은 Fc 도메인에 적어도 하나의 변형을 가지는 변이체 Fc 도메인을 포함할 것이다. 특정 구체예에서, 변이체 Fc 도메인은 L235V, F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396L로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 포함하며, 상기 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 색인의 넘버링이다. 특정 구체예에서, 변이체 Fc 도메인은 다음을 포함한다:
(A) F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396L로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환;
(B) (1) F243L 및 P396L;
(2) F243L 및 R292P; 및
(3) R292P 및 V305I
로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 2개의 치환;
(C) (1) F243L, R292P 및 Y300L;
(2) F243L, R292P 및 V305I;
(3) F243L, R292P 및 P396L; 및
(4) R292P, V305I 및 P396L
로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 3개의 치환;
(D) (1) F243L, R292P, Y300L 및 P396L; 및
(2) F243L, R292P, V305I 및 P396L
로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 4개의 치환; 또는
(E) (1) F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396L; 및
(2) L235V, F243L, R292P, Y300L 및 P396L
로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 5개의 치환.
다른 특정 구체예에서, 변이체 Fc 도메인은:
(A) F243L, R292P, 및 Y300L;
(B) L235V, F243L, R292P, Y300L 및 P396L; 또는
(C) F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396L의 치환을 포함한다.
다른 구체예에서, 그런 ROR1 mAb 1 항체 또는 그것들의 단편들은 기술분야에 공지된 어떠한 Fc 변이체, 예컨대 Jefferis, R. et al. (2002) "Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR: Current Models," Immunol. Lett. 82:57-65; Presta, L.G. et al. (2002) "Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function," Biochem. Soc. Trans. 30:487-90; Idusogie, E.E. et al. (2001) "Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement," J. Immunol. 166:2571-75; Shields, R.L. et al. (2001) "High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1 For Fc Gamma RI, Fc Gamma RII, Fc Gamma RIII, And FcRn And Design Of IgG1 Variants With Improved Binding To The Fc gamma R," J. Biol. Chem. 276:6591-6604; Idusogie, E.E. et al. (2000) "Mapping Of The C1q Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc," J. Immunol. 164:4178-84; Reddy, M.P. et al. (2000) "Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4," J. Immunol. 164:1925-1933; Xu, D. et al. (2000) "In Vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies," Cell. Immunol. 200:16-26; Armour, K.L. et al. (1999) "Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities," Eur. J. Immunol. 29:2613-24; Jefferis, R. et al. (1996) "Modulation Of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions," Immunol. Lett. 54:101-04; Lund, J. et al. (1996) "Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains," J. Immunol. 157:4963-4969; Hutchins et al. (1995) "Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-1H," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92:11980-84; Jefferis, R. et al. (1995) "Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation," Immunol. Lett. 44:111-17; Lund, J. et al. (1995) "Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors," FASEB J. 9:115-19; Alegre, M.L. et al. (1994) "A Non-Activating "Humanized" Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo," Transplantation 57:1537-1543; Lund et al. (1992) "Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma R11," Mol. Immunol. 29:53-59; Lund et al. (1991) "Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG," J. Immunol. 147:2657-2662; Duncan, A.R. et al. (1988) "Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG," Nature 332:563-564; 미국 특허 번호 5,624,821; 5,885,573; 6,194,551; 7,276,586; 및 7,317,091; 및 PCT 공개 번호 WO 00/42072 및 PCT WO 99/58572에 개시된 것들을 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 그런 ROR1 mAb 1 항체 또는 그것들의 단편들은 추가로 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함하여서, 하나 이상의 탄수화물 부분이 분자에 공유적으로 부착되게 할 수 있다. 바람직하게, Fc 도메인에 하나 이상의 글리코실화 부위 및/또는 하나 이상의 변형을 가지는 그런 ROR1 mAb 1 항체 또는 그것들의 단편들은, 미변형 ROR1 mAb 1 항체 또는 그것들의 단편들에 비하여, 증강된 항체 중재된 이펙터 기능, 예컨대 증강된 ADCC 활성을 부여하거나 가진다. 일부 구체예에서, 발명은 추가로 직접 또는 간접적으로 Fc 도메인의 탄수화물 부분과 상호작용하는 것으로 알려진 아미노산들, 이를테면, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 위치 241, 243, 244, 245, 245, 249, 256, 258, 260, 262, 264, 265, 296, 299 및 301에서의 아미노산들의 하나 이상의 변형을 포함하는 그런 ROR1 mAb 1 항체 또는 그것들의 단편들을 포함한다. 직접 또는 간접적으로 Fc 도메인의 탄수화물 부분과 상호작용하는 아미노산들은 기술분야에 알려져 있다. 예컨대 Jefferis, R. et al. (1995) "Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation," Immunol. Lett. 44:111-17 참조.
다른 구체예에서, 발명은 하나 이상의 글리코실화 부위를 분자의 하나 이상의 부위에 도입에 의하여, 바람직하게는 분자의 기능성, 예컨대 항원 또는 FcR을 표적화하기 위한 결합 활성을 변경시키지 않으면서 변형된 그런 ROR1 mAb 1 항체 또는 그것들의 단편들을 포함한다. 글리코실화 부위는 발명의 분자의 가변 및/또는 불변 영역 안에 도입될 수 있다. 본원에서 사용되는, "글리코실화 부위"는 올리고당 (즉 함께 연결되어 있는 둘 이상의 단순 당을 함유하는 탄수화물)이 특이적으로 및 공유적으로 부착될 항체에 어떠한 특수한 아미노산 서열을 포함한다. 올리고당 측쇄는 전형적으로 N- 또는 O-연쇄의 어느 하나를 통해 항체의 골격에 연결된다. N-연결된 글리코실화는 아스파라긴 잔기의 측쇄에의 올리고당 부분의 부착을 나타낸다. O-연결된 글리코실화는 하이드록시아미노산, 예컨대 세린, 트레오닌에 대한 올리고당 부분의 부착을 나타낸다. 그런 ROR1 mAb 1 항체 또는 그것들의 단편들은 N-연결된 및 O-연결된 글리코실화 부위를 포함하여, 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함할 수 있다. 기술분야에 공지되어 있는 N-연결된 또는 O-연결된 글리코실화를 위한 어떠한 글리코실화 부위든지 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예시적인 N-연결된 글리코실화 부위는 아미노산 서열: Asn-X-Thr/Ser이고, 이때 X는 어떠한 아미노산일 수 있고 Thr/Ser는 트레오닌 또는 세린을 나타낸다. 그런 부위 또는 부위들은 본 발명에 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법들을 사용하여 발명의 분자 안에 도입될 수 있다 (예를 들면 In vitro Mutagenesis, Recombinant DNA: A Short Course, J. D. Watson, et al. W.H. Freeman and Company, New York, 1983, chapter 8, pp. 106-116 참조, 전체 내용이 참조로 본원에 포함됨). 글리코실화 부위를 그런 ROR1 mAb 1 항체 또는 그것들의 단편들에 도입시키기 위한 예시적인 방법은 분자의 아미노산을 변형 또는 돌연변이시켜서 원하는 Asn-X-Thr/Ser 서열이 얻어지도록 하거나, 또는 그런 서열을 가지는 핵산 분자를 코드화하는 ROR1 mAb 1 항체를 발현시키는 것을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 발명은 글리코실화 부위를 첨가하거나 결실시킴으로써 그런 ROR1 mAb 1 항체 또는 그것들의 단편들의 탄수화물 함량을 변형시키는 방법을 포함한다. 항체들 (및 항체 도메인, 예컨대 Fc 도메인을 포함하는 분자들)의 탄수화물 함량을 변형시키는 방법은 기술분야에 잘 알려져 있고 발명에 포함된다. 예컨대 미국 특허 번호 6,218,149; EP 0 359 096 B1; 미국 특허 공개 번호 US 2002/0028486; WO 03/035835; 미국 특허 공개 번호 2003/0115614; 미국 특허 번호 6,218,149; 미국 특허 번호 6,472,511; 문헌들은 모두 참조로 전체 내용이 본원에 포함됨. 다른 구체예에서, 발명은 분자의 하나 이상의 내인성 탄수화물 부분을 결실시킴으로써 그런 ROR1 mAb 1 항체 또는 그것들의 단편들의 탄수화물 함량을 변형시키는 방법을 포함한다. 특정 구체예에서, 발명은 297에 인접한 위치들을 변형시킴으로써, 항체의 Fc 도메인의 글리코실화 부위를 이동시키는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 발명은 위치 296을 변형시켜서 위치 297이 아닌 위치 296이 글리코실화되는 것을 포함한다.
이펙터 기능은 PCT 공개 번호 WO 04/063351; WO 06/088494; WO 07/024249; WO 06/113665; WO 07/021841; WO 07/106707; WO 2008/140603에 기술된 것들과 같은 기법에 의해, 또는 다른 수단에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)은 Fc 도메인에 도입될 수 있고, 그로써 이 영역에서 사슬간 이황화 결합 형성이 허용됨으로써 향상된 내재화 능력 및/또는 증가된 보충물-중재된 세포 살해 및 ADCC를 가지는 동종이량체 항체의 생성이 초래된다. Caron, P.C. et al. (1992) "Engineered Humanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies," J. Exp. Med. 176:1191-1195; Shopes, B. (1992) "A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced Cytolytic Activity," J. Immunol. 148(9):2918-2922 참조. 증강된 항종양 활성을 가지는 동종이량체 항체들은 또한 문헌 (Wolff, E.A. et al. (1993) "Monoclonal Antibody Homodimers: Enhanced Antitumor Activity In Nude Mice," Cancer Research 53:2560-2565)에 기술된 이종이중기능성 교차-결합제를 사용하여 제조될 수 있다. 다르게는, 이중 Fc 도메인을 가지는 항체가 엔지니어링될 수 있고 그로써 증강된 보체 용해 및 ADCC 능력을 가질 수 있다 (Stevenson, G.T. et al. (1989) "A Chimeric Antibody With Dual Fc Domains (bisFabFc) Prepared By Manipulations At The IgG Hinge," Anti-Cancer Drug Design 3:219-230).
CDR 잔기의 단일 아미노산 변화가 기능성 결합의 손실을 초래할 수 있다는 사실 (Rudikoff, S. etc. (1982) "Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-Binding Specificity," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79(6):1979-1983)은 대체 기능성 CDR 서열들을 체계적으로 확인하기 위한 수단을 제공한다. 그런 변이체 CDR을 얻기 위한 한 가지 바람직한 방법에서, 치환된 아미노산 잔기를 가지는 CDR을 생성하기 위해 CDR을 코드화하는 폴리뉴클레오티드가 돌연변이된다 (예를 들면 무작위 돌연변이생성 또는 부위-특정 방법 (예컨대 도련변이된 유전자좌를 코드화하는 프라이머들을 사용한 중합효소 사슬-중재된 증폭)에 의해). 원래의 (기능성) CDR 서열의 관련 잔기의 동일성을 치환된 (비-기능성) 변이체 CDR 서열의 동일성과 비교함으로써, 그 치환에 대한 BLOSUM62.iij 치환 점수가 확인될 수 있다. BLOSUM 시스템은 위임된 배열에 대한 서열의 데이터베이스를 분석함으로써 생성된 아미노산 치환의 매트릭스를 제공한다 (Eddy, S.R. (2004) "Where Did The BLOSUM62 Alignment Score Matrix Come From?," Nature Biotech. 22(8):1035-1036; Henikoff, J.G. (1992) "Amino acid substitution matrices from protein blocks," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:10915-10919; Karlin, S. et al. (1990) "Methods For Assessing The Statistical Significance Of Molecular Sequence Features By Using General Scoring Schemes," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87:2264-2268; Altschul, S.F. (1991) "Amino Acid Substitution Matrices From An Information Theoretic Perspective," J. Mol. Biol. 219, 555-565). 현재, 가장 진보된 BLOSUM 데이터베이스는 BLOSUM62 데이터베이스 (BXLOSUM62.iij)이다. 하기 표 4는 BXLOSUM62.iij 치환 점수를 나타낸다 (점수가 높을수록 치환은 더 보존적이고 그로써 치환은 기능에 아무 영향을 미치지 않을 것으로 보인다). 만약 예를 들어 그 결과의 CDR을 포함하는 항원-결합 단편이 ROR1에 결합하지 못한다면, 그때에는 BLOSUM62.iij 치환 점수가 불충분하게 보존적인 것으로 보이고, 더 높은 치환 점수를 가지는 새로운 후보 치환이 선택되고 생성된다. 그러므로, 예를 들어, 만약 원래의 잔기가 글루타메이트 (E)이고, 비-기능성 치환체 잔기가 히스티딘 (H)이었다면, BLOSUM62.iij 치환 점수는 0일 것이고, 보다 보존적인 변화 (예컨대 아스파테이트, 아스파라긴, 글루타메이트 또는 라이신에 대한)가 바람직하다.
A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V
A +4 -1 -2 -2 0 -1 -1 0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 +1 0 -3 -2 0
R -1 +5 0 -2 -3 +1 0 -2 0 -3 -2 +2 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3
N -2 0 +6 +1 -3 0 0 0 +1 -3 -3 0 -2 -3 -2 +1 0 -4 -2 -3
D -2 -2 +1 +6 -3 0 +2 -1 -1 -3 -4 -1 -3 -3 -1 0 -1 -4 -3 -3
C 0 -3 -3 -3 +9 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1
Q -1 +1 0 0 -3 +5 +2 -2 0 -3 -2 +1 0 -3 -1 0 -1 -2 -1 -2
E -1 0 0 +2 -4 +2 +5 -2 0 -3 -3 +1 -2 -3 -1 0 -1 -3 -2 -2
G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 +6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2 0 -2 -2 -3 -3
H -2 0 +1 -1 -3 0 0 -2 +8 -3 -3 -1 -2 -1 -2 -1 -2 -2 +2 -3
I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 +4 +2 -3 +1 0 -3 -2 -1 -3 -1 +3
L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 +2 +4 -2 +2 0 -3 -2 -1 -2 -1 +1
K -1 +2 0 -1 -3 +1 +1 -2 -1 -3 -2 +5 -1 -3 -1 0 -1 -3 -2 -2
M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 +1 +2 -1 +5 0 -2 -1 -1 -1 -1 +1
F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 +6 -4 -2 -2 +1 +3 -1
P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 +7 -1 -1 -4 -3 -2
S +1 -1 +1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 +4 +1 -3 -2 -2
T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 +1 +5 -2 -2 0
W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 +1 -4 -3 -2 +11 +2 -3
Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 +2 -1 -1 -2 -1 +3 -3 -2 -2 +2 +7 -1
V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 +3 +1 -2 +1 -1 -2 -2 0 -3 -1 +4
그러므로 발명은 향상된 CDR을 확인하기 위한 무작위 돌연변이생성의 사용을 포함한다. 파지 디스플레이 기술이 CDR 친화성을 증가 (또는 감소)시키기 위해 대신 사용될 수 있다. 친화성 성숙으로서 언급되는 이 기술은 돌연변이생성 또는 "CDR 워킹 (walking)"을 사용하고 재-선택은 초기 또는 원래 항체와 비교할 때 항원에 대한 더 높은 (또는 더 낮은) 친화성으로 결합하는 CDR을 가지는 항체들을 확인하기 위해 표적 항원 또는 그것의 항원성 단편을 사용한다 (예컨대 Glaser et al. (1992) J. Immunology 149:3903 참조). 단일 뉴클레오티드보다 전체 코돈을 돌연변이시키는 것은 아미노산 돌연변이의 반(semi)-무작위 레퍼토리를 초래한다. 각각 단일 CDR의 단일 아미노산 변경만큼 상이하고 각 CDR 잔기에 대한 각각의 가능한 아미노산 치환을 나타내는 변이체들을 함유하는 변이체 클론들의 풀 (pool)로 구성되는 라이브러리가 구성될 수 있다. 항원에 대한 증가된 (또는 감소된) 결합 친화성을 가지는 돌연변이들은 고정된 돌연변이들을 표지된 항원과 접촉시킴으로써 스크리닝될 수 있다. 기술분야에 알려져 있는 어떠한 스크리닝 방법이든지 항원에 대한 증가된 또는 감소된 친화성을 가지는 돌연변이 항체들을 확인하기 위해 사용될 수 잇다 (예컨대 ELISA)(Wu et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 95:6037; Yelton et al., 1995, J. Immunology 155:1994 참조). 경쇄를 무작위화하는 CDR 워킹이 사용되는 것도 가능하다 (Schier et al., 1996, J. Mol. Bio. 263:551 참조).그런 친화성 돌연변이를 이루기 위한 방법은 예를 들면 다음 문헌들에 기술되어 있다: Krause, J.C. et al. (2011) "An Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture Enhances Function Of A Human Antibody," MBio. 2(1) pii: e00345-10. doi: 10.1128/mBio.00345-10; Kuan, C.T. et al. (2010) "Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMB Recombinant Immunotoxins Targeting Malignant Gliomas And Melanomas," Int. J. Cancer 10.1002/ijc.25645; Hackel, B.J. et al. (2010) "Stability And CDR Composition Biases Enrich Binder Functionality Landscapes," J. Mol. Biol. 401(1):84-96; Montgomery, D.L. et al. (2009) "Affinity Maturation And Characterization Of A Human Monoclonal Antibody Against HIV-1 gp41," MAbs 1(5):462-474; Gustchina, E. et al. (2009) "Affinity Maturation By Targeted Diversification Of The CDR-H2 Loop Of A Monoclonal Fab Derived From A Synthetic Naive Human Antibody Library And Directed Against The Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41 Yields A Set Of Fabs With Improved HIV-1 Neutralization Potency And Breadth," Virology 393(1):112-119; Finlay, W.J. et al. (2009) "Affinity Maturation Of A Humanized Rat Antibody For Anti-RAGE Therapy: Comprehensive Mutagenesis Reveals A High Level Of Mutational Plasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions," J. Mol. Biol. 388(3):541-558; Bostrom, J. et al. (2009) "Improving Antibody Binding Affinity And Specificity For Therapeutic Development," Methods Mol. Biol. 525:353-376; Steidl, S. et al. (2008) "In Vitro Affinity Maturation Of Human GM-CSF Antibodies By Targeted CDR-Diversification," Mol. Immunol. 46(1):135-144; and Barderas, R. et al. (2008) "Affinity maturation of antibodies assisted by in silico modeling," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 105(26):9029-9034. 실례로서, 다중-웰 플레이트가 선택된 ROR1 mAb 1 항체 (예컨대 카보네이트 완충액 중의 100 ng/웰, 실온에서 2시간 동안)로 코팅될 수 있고 계속해서 1/10의 희석률로 첨가된 가용성 ROR1과 함께 인큐베이션되고 실온에서 16시간 동안 인큐베이션되거나 PBS-T-BSA에 50 ng/ml의 농도로 희석된다 (각 웰에 0.05 ml이 첨가되고 적어도 2시간 동안 실온에서 인큐베이션된다). 그런 다음 플레이트는 세척되고 PBS-T-BSA에 0.5 μg/ml에서 출발하는 재조합 항체들의 희석액을 첨가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션된다. 포획된 항원에 대한 재조합 항체들의 결합이 그런 다음, 예를 들면 항-인간 IgG-HRP 콘쥬게이트 및 TMB 기질을 사용하여 측정된다. 색 발달을 희석된 황산을 사용하여 중지시킨 후, 플레이트는 450 nM에서 판독되고 더 높은 친화성 항체들이 확인된다 (예컨대 미국 특허 번호 7,351,803 참조).
VI. 약학 조성물
한 구체예에서, 본 발명은 질환-관련 항원의 존재를 특징으로 하는 암 또는 질환의 치료를 위한 약학 조성물을 포함한다. 그런 조성물은 약학 조성물의 제조에 유용한 벌크 약물 조성물 (예컨대 불순하거나 비-멸균 조성물) 및 단위 단위용량 형태의 제조에 사용될 수 있는 약학 조성물 (즉 대상 또는 환자에게 투여하기에 적합한 조성물)을 포함한다. 그런 조성물은 예방적으로 또는 치료적으로 유효량의 본 발명의 변형된 다이아바디, 또는 그런 제제들의 조합 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 바람직하게, 발명의 조성물은 예방적으로 또는 치료적으로 유효량의 발명의 하나 이상의 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 발명은 또한 그런 변형된 다이아바디 및 특별한 질환 항원에 특이적인 제 2 치료 항체와, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 유익한 또는 원하는 결과, 이를테면 및 바람직하게는 유익한 또는 원하는 임상적 결과를 얻기 위한 접근법을 나타낸다. 그런 유익한 또는 원하는 임상적 결과는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 다음 중 하나 이상을 포함한다: 감염된 세포 또는 다른 질환 세포의 증식의 감소 (또는 파괴), 질환으로부터 유발된 증상의 감소, 질환으로 고생하는 것들의 삶의 질의 증가, 질환을 치료하기 위해 필요한 다른 의약의 용량의 감소, 질환의 진전의 지연 및/또는 동반 동물 수용체의 생존의 연장.
특정 구체예에서, 용어 "약학적으로 허용되는"은 미연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인된 또는 미국 약전 또는 동물, 보다 구체적으로는 인간에서 사용하기 위한 다른 일반적으로 인지된 약전에 열거된 것을 의미한다 (예컨대 Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2012) Allen, Loyd V., Jr. (Ed.) 22nd Edition, Pharmaceutical Press, London UK 참조). 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보조제 (예컨대 프로인트 보조제 (완전 및 불완전)), 부형제 또는 비히클을 나타낸다. 그런 약학적 담체는 멸균 액체, 예컨대 물 및 오일, 이를테면 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 예컨대 땅콩 오일, 대두유, 미네랄 오일, 참기름 등일 수 있다. 물은 약학 조성물이 정맥 내로 투여될 때 바람직한 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로오스 및 글리세롤 용액이 또한 액체 담체로서, 특히 주사 가능한 용액에 대해 사용될 수 있다. 적합한 약학적 부형제는 전분, 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카겔, 스테아르산 나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은, 필요하다면 또한 미량의 습윤 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀션, 정제, 환, 캡슐, 분말, 지속성 방출 제형 등의 형태를 취할 수 있다.
일반적으로, 발명의 조성물의 성분들은 별도로 또는 함께 단위 단위용량 형태로, 예를 들면 건조한 동결건조 분말 또는 수분이 없는 농축물로서 밀폐 밀봉된 용기, 예컨대 활성제의 양을 표시하는 앰풀 또는 봉지로 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 조성물은 멸균된 약학 등급의 물 또는 식염수를 함유하고 있는 주입 병으로 제공될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰풀이 제공되어 성분들이 투여 전에 혼합될 수 있게 된다.
발명의 조성물은 중성 또는 염 형태로서 제형될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 음이온으로 형성되ㅎ는 것들, 예컨대 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유도된 것들, 및 양이온으로 형성된 것들, 예컨대 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 철 수산화물, 아이소프로필아민, 트라이에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 것들을 포함한다.
발명은 또한 본 발명의 변형된 다이아바디를 함유하는 하나 이상의 용기를 단독으로 또는 그런 약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 추가로, 질환의 치료를 위해 유용한 하나 이상의 다른 예방 또는 치료제가 또한 약학적 팩 또는 키트에 포함될 수 있다. 발명은 또한 발명의 약학 조성물의 하나 이상의 성분들로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 의약 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 공지사항이 정부 기관에 의해 처방된 형태로 그런 용기(들)과 임의로 결합되며, 그 공지사항은 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매의 기관에 의한 승인을 반영한다.
본 발명은 상기 방법에 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 한 구체예에서, 키트는 발명의 하나 이상의 분자들을 포함한다. 다른 구체예에서, 키트는 질환-관련 항원의 존재를 특징으로 하는 암 또는 질환의 치료에 유용한 하나 이상의 다른 예방 또는 치료제를, 하나 이상의 용기에 더 포함한다. 또 다른 구체예에서, 키트는 하나 이상의 질환-관련 항원에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 다이아바디를 더 포함한다. 특정 구체예에서, 다른 예방 또는 치료제는 화학요법제이다. 또 다른 구체예에서, 예방 또는 치료제는 생물학적 또는 호르몬 치료제이다.
VII. 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 제조 방법
본 발명의 삼중-특이적 결합 분자는 가장 바람직하게는, 기술분야에 잘 알려져 있는, 그런 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 분자의 재조합 발현을 통해 제조된다.
발명의 폴리펩티드는 고체-상 (phase) 펩티드 합성을 사용하여 편리하게 제조될 수 있다 (Merrifield, B. (1986) "Solid Phase Synthesis," Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A. (1985) "General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15):5131-5135; Ganesan, A. (2006) "Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century," Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10).
대체 구체예에서, 항체는 기술분야에 알려져 있는 어떠한 방법이든지 사용하여 재조합적으로 제조되고 발현될 수 있다. 항체들은 먼저 숙주 동물로부터 만들어진 항체들을 분리하고, 유전자 서열을 얻고, 그 유전자 서열을 사용하여 항체를 숙주 세포 (예컨대 CHO 세포)에서 재조합적으로 발현시킴으로써 재조합적으로 제조될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 방법은 식물 (예컨대 담배)에서 또는 유전자 도입된 우유에서 항체 서열을 발현시키는 것이다. 식물 또는 우유에서 항체들을 재조합적으로 발현시키기에 적합한 방법들은 문헌에 개시되어 있다 (예를 들면 Peeters et al. (2001) "Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants," Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) "Human Antibodies From Transgenic Mice," Int. Rev. Immunol 13:65-93; 및 Pollock et al.(1999) "Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies," J. Immunol Methods 231:147-157 참조). 항체들의 유도체, 예컨대 키메라, 인간화된, 단일-사슬 등을 제조하기에 적합한 방법들은 기술분야에 알려져 있다. 또 다르게는, 항체들은 파지 디스플레이 기술에 의해 재조합적으로 제조될 수 있다 (예를 들어 미국 특허 번호 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; 6,265,150; 및 Winter, G. et al. (1994) "Making Antibodies By Phage Display Technology," Annu. Rev. Immunol. 12.433-455 참조).
관심의 항체들 또는 단백질은 기술분야의 숙련자들에게 잘 알려져 있는 에드만 분해 (Edman degradation)에 의해 서열화될 수 있다. 질량 분석법 또는 에드만 분해로부터 생성된 펩티드 정보는 관심의 단백질을 클론하기 위해 사용된 프로브들 또는 프라이머들을 디자인하기 위해 사용될 수 있다.
관심의 단백질을 클로닝하는 대체 방법은 관심의 항체 또는 단백질을 발현하는 세포에 대해 정제된 단백질 또는 그것의 부분들을 사용하여 "패닝 (panning)"하는 것에 의한다. "패닝" 과정은 제 2 세포 유형에서 원하는 cDNA를 발현 또는 과잉-발현하는 조직 또는 세포로부터 cDNA를 얻고, 제 2 세포 유형의 형질전환된 세포들을 원하는 단백질에 대한 특이적 결합에 대해 스크리닝함으로써 수행될 수 있다. "패닝"에 의해 세포-표면 단백질을 코딩하는 포유류 유전자들을 클로닝하는 데 사용된 방법에 대한 상세한 설명은 기술분야에서 찾아볼 수 있다 (예를 들면 Aruffo, A. et al. (1987) "Molecular Cloning Of A CD28 cDNA By A High-Efficiency COS Cell Expression System," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:8573-8577 및 Stephan, J. et al. (1999) "Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation," Endocrinol. 140:5841-5854 참조).
항체를 코드화하는 cDNA, 및 다른 펩티드 아고니스트, 길항체 및 조절자들은 기술분야의 표준 방법을 따라 특별한 세포 유형으로부터의 mRNA를 역전사함으로써 얻어질 수 있다. 구체적으로, mRNA는 Sambrook 등이 설명한 (상기 동일) 과정을 따라 다양한 용해 효소 또는 화학적 용액을 사용하여 분리되거나 또는 제조업체 (예컨대 Qiagen, Invitrogen, Promega)에 의해 제공된 수반된 지시사항을 따라 상업적으로 입수 가능한 핵산-결합 수지들에 의해 추출될 수 있다. 그런 다음 합성된 cDNA는 발현 벡터 안에 도입되어 제 2 유형의 세포에서 관심의 항체 또는 단백질이 생성될 수 있다. 발현 벡터는 에피솜으로서 또는 염색체 DNA의 통합 부분으로서 숙주 세포에서 복제되어야 하는 것으로 시사된다. 적합한 발현 벡터는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 플라스미드, 바이러스 벡터, 이를테면 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스 및 코스미드를 포함한다.
관심의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터는 많은 적절한 수단, 이를테면 일렉트로포레이션, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산 칼슘, DEAE-덱스트란 또는 다른 물질을 사용하는 트랜스펙션; 미세사출 폭발 (microprojectile bombardment); 리포펙션; 및 감염 (예컨대 벡터가 백시니아 바이러스와 같은 감염체인 경우) 중 어떠한 것에 의해 숙주 세포 안에 도입될 수 있다. 도입시키는 벡터 또는 폴리뉴클레오티드의 선택은 자주 숙주 세포의 특징에 좌우될 것이다.
이종성 DNA를 과잉-발현할 수 있는 어떠한 숙주 세포든지 관심의 항체, 폴리펩티드 또는 단백질을 코드화하는 유전자를 분리하는 목적에 대해 사용될 수 있다. 적합한 포유류 숙주 세포의 비-제한적 실례는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, COS, HeLa 및 CHO 세포를 포함한다. 바람직하게, 숙주 세포는, 존재하는 경우 숙주 세포에서 관심의 해당하는 내인성 항체 또는 단백질의 그것보다 약 5-배 더 높은, 보다 바람직하게는 10-배 더 높은, 보다 바람직하게는 20-배 더 높은, 보다 바람직하게는 50-배 더 높은, 보다 바람직하게는 100-배 더 높은 수준으로 cDNA를 발현한다. 원하는 단백질에 대한 특이적 결합에 대해 숙주 세포를 스크리닝하는 것은 바람직하게는 면역분석 또는 FACS에 의해 이루어진다. 관심의 항체 또는 단백질을 과잉-발현하는 세포는 이 방법으로 확인될 수 있다.
이제 원래의 펩티드 아고니스트, 길항체 또는 조절자 분자와 관련하여 결과적인 단백질의 아미노산 서열의 첨가, 결실 또는 변화를 코드화하는 돌연변이 펩티드 아고니스트, 길항체 및 조절자를 제조하기 위해 사용될 수 있는 다양한 기법들이 또한 활용 가능하다.
발명은 특성에 유의미하게 영향을 미치지 않는 발명의 삼중-특이적 결합 분자에 대한 변형 및 증강된 또는 감소된 활성을 가지는 변이체를 포함한다. 폴리펩티드의 변형은 기술분야에서는 기본적으로 실시된다. 변형된 폴리펩티드의 실례는 기능적 활성을 유의미하게 유해하게 변화시키지 않는 아미노산 잔기들의 보존성 치환, 아미노산의 하나 이상의 결실 또는 첨가, 또는 화학적 유사체의 용도를 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 서로에 대해 보존적으로 치환될 수 있는 아미노산 잔기들은, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 다음을 포함한다: 글리신/알라닌; 발린/아이소로이신/로이신; 아스파라긴/글루타민; 아스파르트산/글루탐산; 세린/트레오닌; 라이신/아르기닌 및 페닐알라닌/타이로신. 이들 폴리펩티드는 또한 글리코실화된 및 비-글리코실화된 폴리펩티드, 뿐만 아니라 다른 번역후 변형, 예컨대, 예를 들면 상이한 당으로의 글리코실화, 아세틸화 및 인산화를 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게, 아미노산 치환은 보존성일 것이다, 즉 치환된 아미노산은 원래의 아미노산의 것과 같은 유사한 화학적 특성을 가질 것이다. 그런 보존성 치환은 기술분야에 알려져 있고, 그것들의 실례는 상기에서 제공되었다. 아미노산 변형은 하나 이상의 아미노산을 변화시키거나 변형시키는 것으로부터 영역, 예컨대 가변 도메인의 완전한 재디자인하는 것에 이르기까지 다양할 수 있다. 가변 도메인의 변화는 결합 친화성 및/또는 특이성을 변경시킬 수 있다. 변형의 다른 방법은 기술분야에 알려져 있는 커플링 기법들, 이를테면, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 효소적 수단, 산화성 치환 및 킬레이트화를 사용하는 것을 포함한다. 변형은 예를 들면, 면역분석을 위한 표지의 부착, 예컨대 방사성 면역분석을 위한 방사성 부분의 부착을 위해 사용될 수 있다. 변형된 폴리펩티드는 기술분야에서 수립된 과정을 사용하여 제조되고 기술분야에 공지된 표준 분석을 사용하여 스크리닝될 수 있다.
발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드 및 항체들로부터의 하나 이상의 단편 또는 영역을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 한 구체예에서, 가변 경쇄 영역의 적어도 10개의 연속 아미노산 및 가변 중쇄 영역의 적어도 10개의 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 다른 구체예에서, 융합 폴리펩티드는 이종성 면역글로불린 불변 영역을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 융합 폴리펩티드는 공중에 기탁된 하이브리도마로부터 제조된 항체의 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 함유한다. 본 발명의 목적에 대해, 항체 융합 단백질은 원하는 바이러스 에피토프 또는 면역 이펙터 세포의 원하는 활성화 수용체에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 폴리펩티드 도메인 또는 그런 활성화 수용체 및 천연 분자에서 부착되지 않는 다른 아미노산 서열, 예를 들면 이종성 서열 또는 다른 영역으로부터의 상동성 서열을 가지는 면역 이펙터 세포의 표면에 존재하는 단백질을 함유한다.
발명은 본 발명의 항체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 기술분야에 공지된 과정들에 의해 제조될 수 있다. 폴리펩티드는 항체의 단백질 가수분해 또는 다른 분해에 의해, 상기 기술된 것과 같은 재조합 방법 (즉 단일 또는 융합 폴리펩티드)에 의해 또는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 항체의 폴리펩티드, 특히 약 50 아미노산까지의 더 짧은 폴리펩티드는 화학적 합성에 의해 편리하게 제조된다. 화학적 합성 방법은 기술분야에 알려져 있고 상업적으로 입수 가능하다. 예를 들어, 그런 폴리펩티드는 고체-상 방법을 사용하여 자동화된 폴리펩티드 합성기에 의해 제조될 수 있었다.
VIII. 발명의 조성물의 용도
본 발명은 약학 조성물을 포함하여, 발명의 삼중-특이적 결합 분자, 그런 분자로부터 유도된 폴리펩티드, 그런 분자 또는 폴리펩티드를 코드화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 본원에 기술된 다른 제제들을 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명의 삼중-특이적 결합 분자는 3개의 에피토프에 동조적으로 결합하는 능력을 가지고, 따라서 그런 에피토프를 포함하는 진단, 화학적 분리 및 치료제에 실질적으로 사용된다. 예를 들어, 그런 분자들은 샌드위치 면역분석에서 시약으로서 사용될 수 있다.
그런 삼중-특이적 결합 분자가 질환-관련 항원의 에피토프에 결합하는 구체예에서, 그런 분자들은 그런 질환-관련 항원의 발현과 관련된 또는 그것을 특징으로 하는 질환 또는 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 그러므로, 제한 없이, 그런 분자들을 포함하는 약학 조성물은 암, 및 병원체 (예컨대 박테리아, 진균, 바이러스 또는 원생동물) 감염에 의해 유발된 질환의 진단 또는 치료에 사용될 수 있다.
IX. 투여 방법
본 발명의 조성물은 유효량의 발명의 약학 조성물을 대상에게 투여함으로써 질환, 장애 또는 감염과 관련된 하나 이상의 증상의 치료, 예방 및 개선을 위해 제공될 수 있다. 바람직한 측면으로, 그런 조성물은 실질적으로 정제된다 (즉, 실질적으로 조성물의 효과를 제한하거나 바람직하지 않은 부작용을 유발하는 물질들이 없다). 특정 구체예에서, 대상은 동물, 바람직하게는 비-영장류 (예컨대 소, 말, 고양이, 개, 설치류 등) 또는 영장류 (예컨대 사이노몰구스 원숭이와 같은 원숭이, 인간 등)와 같은 포유류이다. 바람직한 구체예에서, 대상은 인간이다.
다양한 전달 시스템이 알려져 있고 발명의 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있는데, 예를 들면 리포솜에의 캡슐화, 미소입자, 미소캡슐, 항체 또는 융합 단백질을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-중재된 엔도사이토시스 (예컨대 Wu et al. (1987) "Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System," J. Biol. Chem. 262:4429-4432 참조), 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서의 핵산의 구성 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 투여 방법은, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 비경구 투여 (예컨대 피내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내 및 피하), 경막 외 및 점막 경유 (예컨대 비강 내 및 경구 경로)를 포함한다. 특정 구체예에서, 발명의 분자들은 근육 내로, 정맥 내로 또는 피하로 투여된다. 조성물은 어떠한 편리한 경로에 의하여, 예를 들면 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점액피부 라이닝 (예컨대 구강 점막, 직장 및 소장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고 다른 생물학적 활성 제제들과 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신적이거나 국소적일 수 있다. 또한, 폐 투여가, 예컨대 흡입기 또는 분무기, 및 에어로졸화제로의 제형의 사용에 의해 또한 사용될 수 있다. 예컨대 미국 특허 번호 6,019,968; 5,985, 320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; 및 4,880,078; 및 PCT 공개 번호 WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; 및 WO 99/66903 참조 (이것들은 각각 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨).
본 발명은 또한 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자가 그런 분자들의 양을 표시하는 앰풀 또는 봉지와 같은 밀폐 밀봉된 용기에 패키징될 수 있다는 것을 제공한다. 한 구체예에서, 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자는 밀폐 밀봉된 용기 안의 건조한 멸균된 동결건조 분말로서 또는 수분 없는 농축물로서 공급될 수 있고, 대상에게 투여하기에 적절한 농도로, 예컨대 물 또는 식염수를 사용하여 복원될 수 있다. 바람직하게 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자는 밀폐 밀봉된 용기 안의 건조한 멸균 동결건조 분말로서 적어도 5 μg, 보다 바람직하게는 적어도 10 μg, 적어도 15 μg, 적어도 25 μg, 적어도 50 μg, 적어도 100 μg 또는 적어도 200 μg의 단위 단위용량으로 공급된다.
본 발명의 동결건조된 삼중-특이적 결합 분자는 그것의 원래의 용기에 2 내지 8℃에서 저장되어야 하고, 분자들은 복원된 후 12시간 이내, 바람직하게는 6시간 이내, 5시간 이내, 3시간 이내 또는 1시간 이내에 투여되어야 한다. 대체 구체예에서, 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자는 분자, 융합 단백질 또는 콘쥬게이트된 분자의 양 및 농도를 표시하는 밀폐 밀봉된 용기 안에 액체 형태로 공급된다. 바람직하게, 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 액체 형태는 분자가 최소한 1 μg/ml, 보다 바람직하게는 적어도 2.5 μg/ml, 적어도 5 μg/ml, 적어도 10 μg/ml, 적어도 50 μg/ml 또는 적어도 100 μg/ml의 농도로 존재하는 밀폐 밀봉된 용기로 공급된다.
본원에서 사용되는, 약학 조성물의 "유효량"은, 한 구체예에서, 제한 없이, 질환으로부터 유발된 증상을 감소시키는 것, 감염의 증상 (예컨대 바이러스 로드, 열, 통증, 패혈증 등) 또는 암의 증상 (예컨대 암세포의 증식, 종양 존재, 종양 전이 등)을 을 약화시키고, 그로써 질환으로 고생하는 것들의 삶의 질을 증가시키고, 질환을 치료하기 위해 필요한 다른 의약의 용량을 감소시키며, 표적화 및/또는 내재화를 통해서와 같은 다른 의약의 효과를 증강시키고, 질환의 진전을 지연시키며, 및/또는 개체의 생존을 연장시키는 것을 포함하여 유익한 또는 원하는 결과를 이루기에 충분한 양이다.
유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적에 대해, 약물, 화합물 또는 약학 조성물의 유효량은, 직접 또는 간접적으로, 바이러스 존재의 증식 (또는 그것의 효과)를 감소시키고 바이러스 질환의 발달을 감소 및/또는 지연시키기에 충분한 양이다. 일부 구체예에서, 약물, 화합물 또는 약학 조성물의 유효량은 또 다른 약물, 화합물 또는 약학 조성물과 조합하여 이루어지거나 그렇지 않을 수 있다. 그러므로, "유효량"은 하나 이상의 화학요법제를 투여한다는 맥락에서 고려될 수 있고, 단일 제제는, 만약 하나 이상의 다른 제제와 함께 바람직한 결과가 이루어질 수 있거나 이루어진다면 유효량으로 주어진 것으로 여겨질 수 있다. 개체가 다른 것을 필요로 하면, 각 성분의 유효량의 최적 범위의 측정은 기술분야의 숙련도 내에서 이루어진다. 항체 투여에 대한 전형적인 단위용량은 0.1 내지 100 mg/kg/체중의 하나 이상의 단위 용량을 포함한다.
장애와 관련된 하나 이상의 증상의 치료, 방지 또는 개선에 효과적일 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 양은 표준 임상 기법에 의해 측정될 수 있다. 제형에 사용될 정확한 양은 또한 투여 경로 및 상태의 심각성에 따라 좌우될 것이고, 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효량은 시험관 내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다. 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자에 대해, 환자에게 투여된 단위용량은 전형적으로 대상의 체중의 적어도 약 0.01 μg/kg/일, 적어도 약 0.05 μg/kg/일, 적어도 약 0.1 μg/kg/일, 적어도 약 0.2 μg/kg/일, 적어도 약 0.5 μg/kg/일, 적어도 약 1 μg/kg/일, 적어도 약 2 μg/kg/일, 적어도 약 5 μg/kg/일, 적어도 약 10 μg/kg/일, 적어도 약 20 μg/kg/일, 적어도 약 50 μg/kg/일, 적어도 약 0.1 mg/kg/일 또는 그 이상이다.
바람직하게, 환자에게 투여된 단위용량은 대상 체중의 약 0.01 μg/kg/일 내지 약 0.1 mg/kg/일, 보다 바람직하게는, 약 0.01 μg/kg/일 내지 약 50 μg/kg/일, 보다 바람직하게는, 약 0.01 μg/kg/일 내지 약 50 μg/kg/일, 보다 바람직하게는, 약 0.01 μg/kg/일 내지 약 10 μg/kg/일, 보다 바람직하게는, 약 0.01 μg/kg/일 내지 약 1 μg/kg/일, 보다 바람직하게는, 약 0.01 μg/kg/일 내지 약 0.5 μg/kg/일, 보다 바람직하게는, 약 0.01 μg/kg/일 내지 약 0.1 μg/kg/일 또는 그 이상이다. 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 단위용량 및 투여 빈도는 예컨대, 예를 들면 지질화와 같은 변형에 의해 삼중-특이적 결합 분자의 흡수 및 조직 침투를 증강시킴으로써 감소되거나 변경될 수 있다.
다른 구체예에서, 환자는 발명에 포함된 그런 예방적 또는 치료적 유효량의 삼중-특이적 결합 분자의 1회 이상의 용량을 포함하는 치료 양생법이 투여되는데, 이때 치료 양생법은 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일에 걸쳐 투여된다. 특정 구체예에서, 치료 양생법은 발명에 포함된 예방적 또는 치료적 유효량의 삼중-특이적 결합 분자의 용량을 간헐적으로 투여하는 것을 포함한다 (예를 들어, 주어진 주간의 1일, 2일, 3일 및 4일에 용량을 투여하는 것과 동일한 주간의 5일, 6일 및 7일에 발명에 포함된 예방적 또는 치료적 유효량의 삼중-특이적 결합 분자의 용량을 투여하지 않는 것). 전형적으로, 치료에는 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 과정이 있다. 각 과정은 동일한 양생법이거나 상이한 양생법일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 투여된 용량은 발명에 포함된 삼중-특이적 결합 분자의 예방적 또는 치료적 유효량이 매일 이루어질 때까지 양생법의 제 1의 1/4, 제 1의 절반 또는 제 1의 2/3 또는 3/4을 초과하여 확대된다 (예컨대 4 과정 치료의 제 1, 제 2 또는 제 3 양생법을 초과함).
한 구체예에서, 환자에게 투여될 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 단위용량은 단일 제제 요법으로서 사용하기 위해 계산될 수 있다. 다른 구체예에서 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자는 다른 치료 조성물과 함께 사용되고 환자에게 투여되는 단위용량은 그런 삼중-특이적 결합 분자가 단일 제제 요법으로서 사용되는 때보다 낮다.
특정 구체예에서, 발명의 약학 조성물은 치료가 필요한 지역에 국소적으로 투여되는 것이 바람직할 수 있다; 이것은 예를 들면, 제한하는 것이 아닌, 국소 주입, 주사 또는 이식에 의해 이루어질 수 있고, 상기 이식은 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴성 물질, 이를테면 막, 예컨대 실라스틱 막 또는 섬유로 된 것이다. 바람직하게, 발명의 분자를 투여할 때 그 분자를 흡수하지 않는 물질을 사용하기 위한 배려가 취해져야 한다.
다른 구체예에서, 조성물은 소포체, 특히 리포솜으로 전달될 수 있다 (Langer (1990) "New Methods Of Drug Delivery," Science 249:1527-1533); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353- 365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 3 17-327 참조; 일반적으로 전술 참조).
또 다른 구체예에서, 조성물은 제어된 방출 또는 지속성 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 기술분야의 숙련자에게 알려져 있는 어떠한 기법이든지 발명의 하나 이상의 분자를 포함하는 지속성 방출 제형을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 예컨대 미국 특허 번호 4,526,938; PCT 공개 WO 91/05548; PCT 공개 WO 96/20698; Ning et al. (1996) "Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; 및 Lam et al. (1997) "Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760 참조. 이것들은 각각 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다. 한 구체예에서, 펌프가 제어된 방출 시스템에 사용될 수 있다 (Langer, supra; Sefton, (1987) "Implantable Pumps," CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwald et al. (1980) "Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis," Surgery 88:507-516; 및 Saudek et al. (1989) "A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery," N. Engl. J. Med. 321:574-579 참조). 다른 구체예에서, 중합체 물질이 항체의 제어된 방출을 이루기 위해 사용될 수 있다 (예컨대 Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Levy et al. (1985) "Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate," Science 228:190-192; During et al. (1989) "Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization," Ann. Neurol. 25:351-356; Howard et al. (1989) "Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits," J. Neurosurg. 7(1):105-112); 미국 특허 번호 5,679,377; 미국 특허 번호 5,916,597; 미국 특허 번호 5,912,015; 미국 특허 번호 5,989,463; 미국 특허 번호 5,128,326; PCT 공개 번호 WO 99/15154; 및 PCT 공개 번호 WO 99/20253 참조). 지속성 방출 제형에 사용된 중합체의 실례는, 그것들에 한정되지 않지만, 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리코라이드 (PLG), 다가무수물, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락타이드 (PLA), 폴리(락타이드-코-글리코라이드) (PLGA) 및 폴리오르토에스테르를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 제어된 방출 시스템은 치료 표적 (예컨대 폐)에 가깝게 위치될 수 있고, 그로써 단지 전신 용량의 부분만을 필요로 한다 (예컨대 Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984) 참조). 또 다른 구체예에서, 제어된 방출 이식편으로서 유용한 중합체 조성물은 Dunn 등에 따라 사용된다 (U.S. 5,945,155 참조). 이 특별한 방법은 중합체 시스템으로부터 생체활성 물질의 인시튜-제어된 방출의 치료 효과를 기반으로 한다. 이식은 일반적으로 치료적 치료를 필요로 하는 환자의 신체의 어느 곳에서든지 발생할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 비-중합체 지속성 전달 시스템이 사용되고, 그로써 대상의 신체에서 비-중합체 이식편은 약물 전달 시스템으로서 사용된다. 신체에 이식될 때, 이식편의 유기 용매는 조성물로부터 주변의 조직 유체로 소멸되거나, 분산되거나 또는 침출되고, 비-중합체 물질은 점차적으로 응집되거나 침전되어 고형, 미소공성 매트릭스를 형성한다 (U.S. 5,888,533 참조).
제어된 방출 시스템은 Langer에 의해 개관에서 논의된다 (Langer (1990), "New Methods Of Drug Delivery," Science 249:1527-1533). 기술분야의 숙련자에 공지된 어떠한 기법이든지 발명의 하나 이상의 치료제를 포함하는 지속성 방출 제형을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 예컨대 미국 특허 번호 4,526,938; 국제 공개 번호 WO 91/05548 및 WO 96/20698; Ning et al. (1996) "Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; 및 Lam et al. (1997) "Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760 참조. 이들 문헌은 각각 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다.
발명의 조성물이 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자를 코드화하는 핵산인 특정 구체예에서, 핵산은 생체 내에서 그것의 코딩된 삼중-특이적 결합 분자의 발현을 촉진하기 위해, 그것을 예컨대 레트로바이러스 벡터를 사용하여 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 구성하고 투여하여서 그것이 세포 내적인 것이 되게 함으로써 (미국 특허 번호 4,980,286 참조), 또는 직접적인 주입에 의해, 또는 마이크로입자 폭발 (예컨대 유전자 총; Biolistic, Dupont)을 사용함으로써, 또는 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 형질전환제로의 코팅에 의해, 또는 핵에 들어가는 것으로 알려져 있는 호메오박스(homeobox)-유사 펩티드에 연결시켜 투여함으로써 (예컨대 Joliot et al. (1991) "Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1864-1868 참조), 등등의 방법에 의해 투여될 수 있다. 다르게는, 핵산은 상동 재조합에 의해 세포 내로 도입될 수 있고 발현을 위해 숙주 세포 DNA 내에 통합될 수 있다.
본 발명의 치료적 또는 예방적 유효량의 삼중-특이적 결합 분자로 대상을 치료하는 것은 단일 치료를 포함하고 또는, 바람직하게는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 바람직한 실례에서, 대상은 약 1 내지 10주, 바람직하게는 2 내지 8주, 보다 바람직하게는 약 3 내지 7주, 더욱 바람직하게는 약 4, 5 또는 6주 동안 주 1회 발명의 분자로 치료된다. 다른 구체예에서, 발명의 약학 조성물은 1일에 1회, 1일에 2회 또는 3회 투여된다. 또 다른 구체예에서, 약학 조성물은 주 1회, 주 2회, 2주마다 1회, 월 1회, 6주마다 1회, 2개월마다 1회, 1년에 2회 또는 1년에 1회 투여된다. 또한 치료를 위해 사용된 분자의 유효한 단위용량은 특정 치료 과정에 걸쳐 증가하거나 감소할 수 있다는 것이 인지될 것이다.
이제 일반적으로 발명을 기술하였고, 발명은 다음의 실시예를 참조로 하여 더욱 쉽게 이해될 것이다. 그런 실시예는 예시에 의해 제공되고 명시되지 않는 한 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1
예시적인 항-CD3, 항-CD8, 항-B7-H3 삼중-특이적 결합 분자의 제조 및 특성
CD8+ T 세포에 대해 더 큰 특이성 및 더 강력한 재-지시된 살해를 나타낼 치료 분자를 개발하기 위하여, CD3, CD8 및 질환-관련 항원에 동조적으로 결합하는 능력을 가지는 삼중-특이적 결합 분자를 구성하였다. 제조된 삼중-특이적 결합 분자는 생체 내에서 삼중-특이적 결합 분자의 반감기를 증대시키기 위하여 Fc 도메인을 추가로 가졌다. 삼중-특이적 결합 분자의 일반적인 구조는 도 4a 내지 4d에 나타낸다. 질환-관련 항원 B7-H3에 특이적인 예시적인 삼중-특이적 결합 분자를 구성하였다. 삼중-특이적 결합 분자는 삼중-특이적 결합 분자 내의 결합 도메인의 상대적인 위치를 표시하기 위하여 B7-H3 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1로 명명한다. B7-H3 결합 도메인은 부위 A 도메인 위치를 차지하고, CD3 결합 도메인은 부위 B 위치를 차지하며, CD8 결합 도메인은 부위 C 위치를 차지한다 (도 4a). B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자는 4개의 상이한 폴리펩티드 사슬로 구성되었다 (표 5).
폴리펩티드 사슬 도메인 결합 친화성
1 VL(B7-H3 mAb 1)-VH(CD3 mAb 2)-E-코일-(CH2-CH3) 경쇄: B7-H3
중쇄: CD3
2 VL(CD3 mAb 2)-VH(B7-H3 mAb 1)-K-코일 경쇄: CD3
중쇄: B7-H3
3 중쇄 CD8 mAb 1 CD8
4 경쇄 CD8 mAb 1 CD8
B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:59)이다:DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLHSGVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV
ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS
VKDRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS
GGCGGGEVAA LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV
SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV
SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF
SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK.
제 1 폴리펩티드 사슬에서, VL(B7-H3 mAb 1)은 SEQ ID NO:41의 아미노산 서열을 가지고, VH(CD3 mAb 2)는 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 가지며, E-코일은 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 가지고, (CH2-CH3)은 SEQ ID NO:7의 "손잡이-포함" 아미노산 서열의 아미노산 서열을 가진다.
B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:60)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV
QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTSY WMQWVRQAPG QGLEWMGTIY PGDGDTRYTQ
KFKGRVTITA DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCARRGIP RLWYFDVWGQ GTTVTVSSGG
CGGGKVAALK EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE.
제 2 폴리펩티드 사슬에서, VL(CD3 mAb 2)는 SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 가지고, VH(B7-H3 mAb 1)은 SEQ ID NO:42의 아미노산 서열을 가지며, K-코일은 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 가진다.
B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 3 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:61)이다:
EVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCTASGFNIK DTYIHFVRQR PEQGLEWIGR IDPANDNTLY
ASKFQGKATI TADTSSNTAY MHLCSLTSGD TAVYYCGRGY GYYVFDHWGQ GTTLTVSSAS
TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL
YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS
VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT
KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK.
제 3 폴리펩티드 사슬에서, 사용된 CD8 mAb 1 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열, 힌지 도메인, CH1 도메인 및 단백질 A 결합 부위를 제거하기 위해 H435R 치환을 가지는 "구멍-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:8)을 가진다.
B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 4 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:62)이다:
DVQINQSPSF LAASPGETIT INCRTSRSIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS GSTLQSGIPS
RFSGSGSGTD FTLTISGLEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA GTKLELRRTV AAPSVFIFPP
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC.
제 4 폴리펩티드 사슬에서, 사용된 CD8 mAb 1 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:29의 아미노산 서열 및 카파 경쇄 불변 도메인을 가진다.
발현된 B7H3 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자를 MSA 수지 위에 로딩하였고, 10mM NaPO4 (pH6); 10mM NaPO4, 1M NaCl (pH6) 및 10mM NaPO4 (pH6)으로 세척하였다. 폴리펩티드를 수지로부터 50 mM 글리신 (pH 3)을 사용하여 용출하고 1 M 트리스 (pH 8)로 중화하였다. 발현은 1.7mg/L인 것으로 나타났다; 삼중-특이적 결합 분자 제제는 0.6 mg/ml이었고, 0.42 mg의 최종 수율을 가졌다.
B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 특성을 B7-H3 X CD3 DART 및 Fc 도메인을 가지는 B7-H3 X CD3 DART와 비교하였다. 도 5a 및 5b에서 알 수 있는 것과 같이, B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자는 B7-H3 X CD3 DART 및 Fc 도메인을 가지는 B7-H3 X CD3 DART와 비교하여 유사한 표적 세포 결합을 나타냈다 (A498 세포 (도 5a); JIMT-1 (도 5b)). 그러나, 도 5c 및 5d에 나타난 것과 같이, B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자는 CD4+ T 세포와 비교하여 CD8+ T 세포에 대해 크게 증강된 결합을 증명하였다.
본 발명의 표적 세포의 재-지시된 살해를 중재하는 B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 능력을 증명하기 위하여, 그런 분자들을 T 세포 및 JIMT-1 또는 A498 표적 세포의 존재하에 인큐베이션하였다. JIMT-1 세포는 트라스투주맙-내성 암종 셀라인이다 (Tanner, M. et al. (2004) "Characterization Of A Novel Cell Line Established From A Patient With Herceptin-Resistant Breast Cancer," Mol. Cancer Ther. 3(12):1585-1592). A498 셀라인은 신장 세포 암종 셀라인이다 (Gogh, J. (1978) "Cultivation, Characterization, And Identification Of Human Tumor Cells With Emphasis On Kidney, Testis, And Bladder Tumors," Natl. Cancer Inst. Monogr. 49:5-9). 도 6a 내지 6c에서 알 수 있는 것과 같이, 표적 세포의 재-지시된 살해가 관찰되었다. 예상 외로, 그런 살해는 해당하는 B7-H3 X CD3 DART 및 Fc 도메인을 가지는 B7-H3 X CD3 DART에 대해 관찰된 것보다 실질적으로 더 강력하였다. 관찰된 재-지시된 살해를 표 6에 요약한다.
결합 분자 재-지시된 살해
JIMT-1 세포 A498 세포
분석 LDH LDH 루시페라제 LDH LDH
최대 살해 (%) EC50 (pM) EC50 (pM) 최대 살해 (%) EC50 (pM)
B7-H3 X CD3 DART TM 60.72 27 22 61.95 11
Fc 도메인을 가지는
B7-H3 X CD3 DART TM 		59.95 343 245 63.2 168
B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자 54.88 0.4 0.6 53.5 4
도 7a 내지 7d는 JIMT-1 세포와의 인큐베이션 후에 T 세포 활성화를 중재하는 B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 능력을 도시한다. 도 8a 내지 8d는 A498 세포와의 인큐베이션 후에 T 세포 활성화를 중재하는 B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 능력을 도시한다. 둘 다의 경우에, 그런 활성화는 예상 외로 비교용 B7-H3 X CD3 DARTTM 및 Fc 도메인을 가지는 B7-H3 X CD3 DARTTM로 관찰된 활성화보다 월등하였다. 표 7은 EC50 결과를 요약한 것이다.
종양
세포 		T 세포
하위세트 		DART와 비교한 B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 EC50 값
DART TM Fc 도메인을 가지는 DART TM 삼중-특이적 결합 분자
A498 CD4/CD69 51 95 75
CD4/CD25 75 291 22
CD8/CD69 70 185 4
CD8/CD25 115 339 4
CTL 10 48 4
JIMT-1 CD4/CD69 116 339 253
CD4/CD25 257 1034 185
CD8/CD69 70 185 3
CD8/CD25 140 678 37
CTL 7 68 1
발현된 B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자는 CD4+ T 세포와 비교하여 CD8+ 이펙터 세포를 사용하여 훨씬 더 큰 (13-배) 세포용해 활성을 나타냈다. B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자는 또한 DARTTM와 비교하여 이펙터로서 'pan' T 세포를 사용하여 크게 증가된 (85-배) 전체 효능을 나타냈다.실시예 2
재-지시된 세포독성에 미치는 CD8 결합 도메인의 효과
CD8 특이성의 효과를 평가하기 위하여, 질환-관련 항원 B7-H3에 특이적인 제 2 삼중-특이적 결합 분자를 상이한 CD8 항체 가변 도메인 서열을 활용하여 구성하였다. B7-H3 가변 도메인 특이성 및 CD3 가변 도메인 특이성은 B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자를 구성하기 위해 사용한 것들과 동일하였다. 삼중-특이적 결합 분자를 B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2로 명명하고 4개의 상이한 폴리펩티드 사슬로 구성되었다 (표 8).
폴리펩티드 사슬 도메인 결합 친화성
1 VL(B7-H3 mAb 1)-VH(CD3 mAb 2)-E-코일-(CH2-CH3) 경쇄: B7-H3
중쇄: CD3
2 VL(CD3 mAb 2)-VH(B7-H3 mAb 1)-K-코일 경쇄: CD3
중쇄: B7-H3
3 중쇄 CD8 mAb 2 CD8
4 경쇄 CD8 mAb 2 CD8
B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자의 제 1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:63)이다:DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLHSGVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV
ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS
VKDRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS
GGCGGGEVAA LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV
SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV
SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF
SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK.
B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자의 제 2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:64)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV
QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTSY WMQWVRQAPG QGLEWMGTIY PGDGDTRYTQ
KFKGRVTITA DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCARRGIP RLWYFDVWGQ GTTVTVSSGG
CGGGKVAALK EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE.
B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자의 제 3 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:65)이다:
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS DFGMNWVRQA PGKGLEWVAL IYYDGSNKFY
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPH YDGYYHFFDS WGQGTLVTVS
SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS
SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPEAAG
GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY
NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRE
EMTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL VSKLTVDKSR
WQQGNVFSCS VMHEALHNRY TQKSLSLSPG K.
B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자의 제 4 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:66)이다:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKGSQDIN NYLAWYQQKP GKAPKLLIYN TDILHTGVPS
RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYCYQ YNNGYTFGQG TKVEIKRTVA APSVFIFPPS
DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL
SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC.
B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 (상기 기술된 구성 및 서열) 또는 B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자의 T 세포에 결합하는 능력을 비교하기 위하여, 건강한 공여자의 인간 PBMC를 Ficoll로 정제하고, PBS로 2회 세척한 후 10% 인간 AB 혈청을 함유한 FACS 완충액에 재-현탁하고 실온에서 20분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 회전시키고 FACS 완충액에 4 x 106 세포/mL 세포로 재-현탁하였다. 50 μl의 연속적으로 적정된 B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 또는 B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자 또는 DARTTM (B7-H3 X CD3 또는 Fc 도메인을 가지는 B7-H3 X CD3)을 96-웰 심층 플레이트의 웰에 첨가하였다. 그런 다음 0.01% 나트륨 아지드를 함유하는 FACS 완충액에 잘 혼합된 세포 50 μL (4 x 106 세포/mL)를 해당하는 세포에 첨가하고 피펫을 사용하여 철저하게 혼합하였다. 플레이트를 암실에서 약 45분 동안 2 내지 8℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝났을 때, 세포를 300 μL의 FACS를 각 웰에 첨가함으로써 2회 세척하고, 플레이트를 1,200 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 버렸다. 세포 펠릿을 0.01% 나트륨 아지드를 함유하는 FACS 완충액에 PE-콘쥬게이트된 염소 항-인간 Fcγ 1:500 희석된, CD5-APC 및 CD4-PerCP5.5의 혼합물 100 μL에 재-현탁하고, 암실에서 약 45분 동안 2 내지 8℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝났을 때, 세포를 세척하고, FACS 완충액으로 재-현탁하고, BD Caliber 유동 세포분석기로 분석하였다. 세포는 CD5+ CD4+ (도 9a) 또는 CD5+ CD4- (도 9b)에 대해 게이팅되었다. CD8 특이성을 가졌거나 결핍된 결합 분자들과 비교하여 CD5+ CD4- 집단에 대해 분별염색을 관찰하였다.
B7-H3 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 세포독성을 B7-H3 mAb1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자의 그것과 비교하였다. 루시페라제 분석 및 LDH 분석 둘 다를 사용하였다. 두 분석의 결과는 일치하였다. 2개의 삼중-특이적 결합 분자는 활성화 CD8+ T 세포 또는 pan T 세포 집단의 존재하에 동등한 재-지시된 세포독성을 유발하였다. CD8 mAb 1 결합 도메인을 가지는 삼중-특이적 결합 분자는 B7H3 X CD3 DART와 비교하여 CD8+ 세포 집단 또는 pan T 세포의 존재하에 더 큰 재-지시된 세포독성을 나타냈다 (도 10a 내지 10c).
CD8+ 대 CD4+ 이펙터 세포에 대한 EC50의 증가 (60-배) 또한 B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자와 비교하여 B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자에 대해 관찰되었다. B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자에 대해, 100-배 더 큰 EC50의 감소를 초래하는 증가된 효능은 pan T 세포가 이펙터 세포로서 사용되었을 때 관찰되었다.
실시예 3
재-지시된 세포독성에 미치는 도메인 위치의 효과
삼중-특이적 결합 분자 내에 있는 주어진 결합 도메인 (CD3, CD8 및 질환-관련 항원)에 대한 위치 (부위 A, 부위 B 및 부위 C)의 효과를 평가하기 위하여, 여러 개의 추가의 삼중-특이적 결합 분자를 구성하였다. 표 9는 삼중-특이적 결합 분자와 다양한 결합 도메인 (CD3, CD8 및 질환-관련 항원)의 위치 (부위 A, 부위 B 및 부위 C)를 보여준다.
삼중-특이적 결합 분자 부위 A 부위 B 부위 C
B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1
삼중-특이적 결합 분자 		B7-H3 mAb 1 CD3 mAb 2 CD8 mAb 1
CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 / B7-H3 mAb 1
삼중-특이적 결합 분자 		CD3 mAb 2 CD8 mAb 1 B7-H3 mAb 1
B7-H3 mAb 1/ CD8 mAb 1 / CD3 mAb 2
삼중-특이적 결합 분자 		B7-H3 mAb 1 CD8 mAb 1 CD3 mAb 2
B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 구성 및 서열은 상기에서 기술하였다. 추가의 2개의 삼중-특이적 결합 분자 (CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 / B7-H3 mAb 1 및 B7-H3 mAb 1/ CD8 mAb 1 / CD3 mAb 2)에 대해, B7-H3 가변 도메인 특이성, CD3 가변 도메인 특이성 및 CD8 가변 도메인 특이성은 B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자를 구성하기 위해 사용한 것들과 동일하였다. CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 / B7-H3 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자는 4개의 상이한 폴리펩티드 사슬로 구성되었다 (표 10).
폴리펩티드 사슬 도메인 결합 친화성
1 VL(CD3 mAb 2)-VH(CD8 mAb 1)-E-코일-(CH2-CH3) 경쇄: CD3
중쇄: CD8
2 VL(CD8 mAb 1)-VH(CD3 mAb 2)-K-코일 경쇄: CD8
중쇄: CD3
3 중쇄 B7-H3 mAb 1 B7-H3
4 경쇄 B7-H3 mAb 1 B7-H3
CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 / B7-H3 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:67)이다:DVQINQSPSF LAASPGETIT INCRTSRSIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS GSTLQSGIPS
RFSGSGSGTD FTLTISGLEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA GTKLELRGGG SGGGGEVQLV
ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS
VKGRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS
GGCGGGEVAA LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV
SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV
SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF
SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK.
CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 / B7-H3 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:68)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV
QLQQSGAELV KPGASVKLSC TASGFNIKDT YIHFVRQRPE QGLEWIGRID PANDNTLYAS
KFQGKATITA DTSSNTAYMH LCSLTSGDTA VYYCGRGYGY YVFDHWGQGT TLTVSSGGCG
GGKVAALKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE.
CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 / B7-H3 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 3 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:69)이다:
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQWVRQA PGQGLEWMGT IYPGDGDTRY
TQKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARRG IPRLWYFDVW GQGTTVTVSS
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGG
PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE
MTKNQVSLSC AVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLV SKLTVDKSRW
QQGNVFSCSV MHEALHNRYT QKSLSLSPGK.
CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 / B7-H3 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 4 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:70)이다:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLHSGVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC.
B7-H3 mAb 1/ CD8 mAb 1 / CD3 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자는 4개의 상이한 폴리펩티드 사슬로 구성되었다 (표 11).
폴리펩티드 사슬 도메인 결합 친화성
1 VL(B7-H3 mAb 1)-VH(CD8 mAb 1)-E-코일-(CH2-CH3) 경쇄: B7-H3
중쇄: CD8
2 VL(CD8 mAb 1)-VH(B7-H3 mAb1)-K-코일 경쇄: CD8
중쇄: B7-H3
3 중쇄 CD3 mAb 2 CD3
4 경쇄 CD3 mAb 2 CD3
B7-H3 mAb 1/ CD8 mAb 1 / CD3 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자의 제 1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:71)이다:DVQINQSPSF LAASPGETIT INCRTSRSIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS GSTLQSGIPS
RFSGSGSGTD FTLTISGLEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA GTKLELRGGG SGGGGQVQLV
QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMQ WVRQAPGQGL EWMGTIYPGD GDTRYTQKFK
GRVTITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CARRGIPRLW YFDVWGQGTT VTVSSGGCGG
GEVAALEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEKG GGDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK
DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV
LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL
VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM
HEALHNHYTQ KSLSLSPGK.
B7-H3 mAb 1/ CD8 mAb 1 / CD3 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자의 제 2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:72)이다:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLHSGVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG GTKLEIKGGG SGGGGEVQLQ
QSGAELVKPG ASVKLSCTAS GFNIKDTYIH FVRQRPEQGL EWIGRIDPAN DNTLYASKFQ
GKATITADTS SNTAYMHLCS LTSGDTAVYY CGRGYGYYVF DHWGQGTTLT VSSGGCGGGK
VAALKEKVAA LKEKVAALKE KVAALKE.
B7-H3 mAb 1/ CD8 mAb 1 / CD3 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자의 제 3 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:73)이다:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT
YYADSVKDRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KSTSGGTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA
VLQSSGLYSL SSVVTVPSSS LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KRVEPKSCDK THTCPPCPAP
EAAGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR
EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP
PSREEMTKNQ VSLSCAVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLVSKLTV
DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNRYTQKSLS LSPGK.
B7-H3 mAb 1/ CD8 mAb 1 / CD3 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자의 제 4 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:74)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG RTVAAPSVFI
FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS
TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC.
이 연구의 결과는 도 11a 내지 11c, 도 12a 내지 12c, 도 13a 내지 13e 및 표 26에 나타낸다. 도 11a 내지 11c 및 도 12a 내지 12c는 독립적으로, CD3 결합 도메인을 삼중-특이적 결합 분자의 부위 C에 놓는 것이 분자의 세포독성을 감소시키는 것을 증명한다. 도 13a 내지 13e는 감소된 세포독성이 CD4+, CD8+ 또는 pan T 세포 중 어느 것이 사용되었는지와 관계없이 관찰된 것을 보여준다.
도 14a 및 도 14b에 나타난 것과 같이, 부위 C에 CD3 결합 도메인을 배치한 것은 CD5+ CD4+ 세포 (도 14a) 및 CD5+ CD4- 세포 (도 14b) 둘 다에 대한 결합을 크게 감소시켰다. 그러나, 주지할 것은, CD3 결합 도메인의 배치와 관계없이, 모든 삼중-특이적 결합 분자가 재-지시된 세포독성을 중재할 수 있었다는 것이다.
실시예 4
예시적인 항-CD3, 항-CD8, 항-5T4 삼중-특이적 결합 분자의 제조 및 특성
질환-관련 항원 5T4에 특이적인 추가의 예시적인 삼중-특이적 결합 분자를 구성하였다. 5T4 mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자는 4개의 상이한 폴리펩티드 사슬로 구성되었다 (표 12).
폴리펩티드 사슬 도메인 결합 친화성
1 VL(5T4 mAb 2)-VH(CD3 mAb 2)-E-코일-(CH2-CH3) 경쇄: 5T4
중쇄: CD3
2 VL(CD3 mAb 2)-VH(5T4 mAb 2)-K-코일 경쇄: CD3
중쇄: 5T4
3 중쇄 CD8 mAb 1 CD8
4 경쇄 CD8 mAb 1 CD8
5T4 mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:75)이다:DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSIV YSNGNTYLEW YLQKPGQSPK LLIYKVSNRF
SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHVP FTFGSGTKLE IKGGGSGGGG
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT
YYADSVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL
VTVSSGGCGG GEVAALEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEKG GGDKTHTCPP CPAPEAAGGP
SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS
TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM
TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK.
5T4 mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:76)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV
QLQQPGAELV KPGASVKMSC KASGYTFTSY WITWVKQRPG QGLEWIGDIY PGSGRANYNE
KFKSKATLTV DTSSSTAYMQ LSSLTSEDSA VYNCARYGPL FTTVVDPNSY AMDYWGQGTS
VTVSSGGCGG GKVAALKEKV AALKEKVAAL KEKVAALKE.
5T4 mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 3 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:77)이다:
EVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCTASGFNIK DTYIHFVRQR PEQGLEWIGR IDPANDNTLY
ASKFQGKATI TADTSSNTAY MHLCSLTSGD TAVYYCGRGY GYYVFDHWGQ GTTLTVSSAS
TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL
YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS
VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT
KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK.
5T4 mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 4 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:78)이다:
DVQINQSPSF LAASPGETIT INCRTSRSIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS GSTLQSGIPS
RFSGSGSGTD FTLTISGLEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA GTKLELRRTV AAPSVFIFPP
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC.
5T4 mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자는 4개의 상이한 폴리펩티드 사슬로 구성되었다 (표 13).
폴리펩티드 사슬 도메인 결합 친화성
1 VL(5T4 mAb 2)-VH(CD3 mAb 2)-E-코일-(CH2-CH3) 경쇄: 5T4
중쇄: CD3
2 VL(CD3 mAb 2)-VH(5T4 mAb 2)-K-코일 경쇄: CD3
중쇄: 5T4
3 중쇄 CD8 mAb 2 CD8
4 경쇄 CD8 mAb 2 CD8
5T4 mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자의 제 1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:79)이다:DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSIV YSNGNTYLEW YLQKPGQSPK LLIYKVSNRF
SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHVP FTFGSGTKLE IKGGGSGGGG
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT
YYADSVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL
VTVSSGGCGG GEVAALEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEKG GGDKTHTCPP CPAPEAAGGP
SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS
TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM
TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK.
5T4 mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자의 제 2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:80)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV
QLQQPGAELV KPGASVKMSC KASGYTFTSY WITWVKQRPG QGLEWIGDIY PGSGRANYNE
KFKSKATLTV DTSSSTAYMQ LSSLTSEDSA VYNCARYGPL FTTVVDPNSY AMDYWGQGTS
VTVSSGGCGG GKVAALKEKV AALKEKVAAL KEKVAALKE.
5T4 mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자의 제 3 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:81)이다:
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS DFGMNWVRQA PGKGLEWVAL IYYDGSNKFY
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPH YDGYYHFFDS WGQGTLVTVS
SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS
SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPEAAG
GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY
NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRE
EMTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL VSKLTVDKSR
WQQGNVFSCS VMHEALHNRY TQKSLSLSPG K.
5T4 mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자의 제 4 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:82)이다:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKGSQDIN NYLAWYQQKP GKAPKLLIYN TDILHTGVPS
RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYCYQ YNNGYTFGQG TKVEIKRTVA APSVFIFPPS
DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL
SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC.
5T4 mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 및 5T4 mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자를 상기 기술한 것과 같이 발현시키고 정제하였다. CD5+/CD4+ 게이팅된 및 CD5+/CD4- 게이팅된 인간 PBMC에 결합하는 이들 2개의 삼중-특이적 결합 분자의 능력을 Fc 도메인을 가지는 5T4 X CD3 DART의 그것과 비교하였다. 도 15a 및 15b에 나타낸 것과 같이, 5T4 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 및 5T4 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자는 CD4+ T 세포 (도 15a)와 비교하여 CD8+ T 세포 (도 15b)에 대한 결합을 크게 증가시킨 것으로 나타났다.
표적 세포의 재지시된 살해를 중재하는 5T4 mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 and 5T4 mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자의 능력을 증명하기 위하여, 그런 분자들을 T 세포 및 JIMT-1 표적 세포의 존재하에 인큐베이션하였다. 도 16a 내지 16c에 나타낸 것과 같이, 표적 세포들의 재-지시된 살해가 관찰되었다. 상기 기술된 B7-H3 삼중-특이적 결합 분자에 대해 관찰된 것과 같이, 살해는 Fc 도메인을 가지는 해당하는 5T4 X CD3 DART에 대해 관찰된 것보다 실질적으로 더 강력하였다. 마찬가지로, B7-H3 삼중-특이적 결합 분자에 대해 관찰된 것과 같이, 상이한 CD8 가변 도메인의 사용은 CD8+ T 세포를 표적 세포로 재-지시하는 5T4 삼중-특이적 결합 분자의 능력에 아무 영향도 미치지 않았다. 5T4 mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자는 또한 고도로 활성인 것으로 나타났고, CD8+ 대 CD4+ 이펙터 세포를 사용하여 훨씬 더 큰 CTL 활성을 증명하였다 (23-배 더 낮은 EC50). 5T4 mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자는 5T4 X CD3 DARTTM과 비교하여 pan T 세포 이펙터를 사용하여 22-배 더 강력하였고 5T4 mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자는 25-배 더 강력하였다.
실시예 5
예시적인 항-CD3, 항-CD8, 항-ROR1 삼중-특이적 결합 분자의 특성
질환-관련 항원 ROR1에 특이적인 추가의 예시적인 삼중-특이적 결합 분자를 구성하였다. ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자는 4개의 상이한 폴리펩티드 사슬로 구성되었다 (표 14).
폴리펩티드 사슬 도메인 결합 친화성
1 VL(ROR1 mAb 1)-VH(CD3 mAb 2)-E-코일-(CH2-CH3) 경쇄: ROR1
중쇄: CD3
2 VL(CD3 mAb 2)-VH(ROR1 mAb 1)-K-코일 경쇄: CD3
중쇄: ROR1
3 중쇄 CD8 mAb 1 CD8
4 경쇄 CD8 mAb 1 CD8
ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:83)이다:QLVLTQSPSA SASLGSSVKL TCTLSSGHKT DTIDWYQQQP GKAPRYLMKL EGSGSYNKGS
GVPDRFGSGS SSGADRYLTI SSLQSEDEAD YYCGTDYPGN YLFGGGTQLT VLGGGGSGGG
GEVQLVESGG GLVQPGGSLR LSCAASGFTF STYAMNWVRQ APGKGLEWVG RIRSKYNNYA
TYYADSVKGR FTISRDDSKN SLYLQMNSLK TEDTAVYYCV RHGNFGNSYV SWFAYWGQGT
LVTVSSGGCG GGEVAALEKE VAALEKEVAA LEKEVAALEK GGGDKTHTCP PCPAPEAAGG
PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE
MTKNQVSLWC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK.
ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:84)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQE
QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGFTFSDY YMSWVRQAPG KGLEWVATIY PSSGKTYYAD
SVKGRFTISS DNAKNSLYLQ MNSLRAEDTA VYYCARDSYA DDAALFDIWG QGTTVTVSSG
GCGGGKVAAL KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKE.
ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 3 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:85)이다:
EVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCTASGFNIK DTYIHFVRQR PEQGLEWIGR IDPANDNTLY
ASKFQGKATI TADTSSNTAY MHLCSLTSGD TAVYYCGRGY GYYVFDHWGQ GTTLTVSSAS
TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL
YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS
VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT
KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPG.
ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 4 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:86)이다:
DVQINQSPSF LAASPGETIT INCRTSRSIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS GSTLQSGIPS
RFSGSGSGTD FTLTISGLEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA GTKLELRRTV AAPSVFIFPP
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC.
ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자는 4개의 상이한 폴리펩티드 사슬로 구성되었다 (표 15).
폴리펩티드 사슬 도메인 결합 친화성
1 VL(ROR1 mAb 1)-VH(CD3 mAb 2)-E-코일-(CH2-CH3) 경쇄: ROR1
중쇄: CD3
2 VL(CD3 mAb 2)-VH(ROR1 mAb 1)-K-코일 경쇄: CD3
중쇄: ROR1
3 중쇄 CD8 mAb 2 CD8
4 경쇄 CD8 mAb 2 CD8
ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자의 제 1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:87)이다:QLVLTQSPSA SASLGSSVKL TCTLSSGHKT DTIDWYQQQP GKAPRYLMKL EGSGSYNKGS
GVPDRFGSGS SSGADRYLTI SSLQSEDEAD YYCGTDYPGN YLFGGGTQLT VLGGGGSGGG
GEVQLVESGG GLVQPGGSLR LSCAASGFTF STYAMNWVRQ APGKGLEWVG RIRSKYNNYA
TYYADSVKGR FTISRDDSKN SLYLQMNSLK TEDTAVYYCV RHGNFGNSYV SWFAYWGQGT
LVTVSSGGCG GGEVAALEKE VAALEKEVAA LEKEVAALEK GGGDKTHTCP PCPAPEAAGG
PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE
MTKNQVSLWC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK.
ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자의 제 2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:88)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQE
QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGFTFSDY YMSWVRQAPG KGLEWVATIY PSSGKTYYAD
SVKGRFTISS DNAKNSLYLQ MNSLRAEDTA VYYCARDSYA DDAALFDIWG QGTTVTVSSG
GCGGGKVAAL KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKE.
ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자의 제 3 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:89)이다:
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS DFGMNWVRQA PGKGLEWVAL IYYDGSNKFY
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPH YDGYYHFFDS WGQGTLVTVS
SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS
SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPEAAG
GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY
NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRE
EMTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL VSKLTVDKSR
WQQGNVFSCS VMHEALHNRY TQKSLSLSPG K.
ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자의 제 4 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:90)이다:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKGSQDIN NYLAWYQQKP GKAPKLLIYN TDILHTGVPS
RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYCYQ YNNGYTFGQG TKVEIKRTVA APSVFIFPPS
DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL
SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC.
ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 및 ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자의 특성을 Fc 도메인을 함유하는 ROR1 X CD3 DARTTM의 그것과 비교하였다. DARTTM 및 ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 및 ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자를 ROR1 항원에 결합하는 항-ROR1 단클론성 항체, ROR1 mAb 1로부터의 Fv 서열을 사용하여 구성하였다.
2개의 ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 및 ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자 및 DART는 모두 JIMT1-luc 및 A549 표적 세포에 대한 CTL 분석에서 활성이었다. 그러나, ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 및 ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자는 CD8+ T 세포 및 pan T 세포 이펙터로 극적으로 증가된 활성을 나타냈다.
ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 및 ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 삼중-특이적 결합 분자의 표적 세포의 재-지시된 살해를 중재하는 능력을 루시페라제 분석 및 LDH 분석 둘 다를 사용하여 측정하였다. 두 경우에 모두 재-지시된 살해가 관찰되었다. 도 17a 내지 17c는 루시페라제 분석을 사용하여 측정된 표적 세포의 재-지시된 살해를 나타낸다. 결과는 표 16에 요약한다.
삼중-특이적 결합 분자 EC50 비율
이펙터 세포 CD4
CD8

CD4
CD8

Pan T
CD4 CD8 Pan T
JIMT-1 LUC 표적 세포 (루시페라제 분석)
ROR1 X CD3 DART TM 0.45 0.4064 0.3931 1.1 1.0 1.0
ROR 1 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1
삼중-특이적 결합 분자 		0.131 0.0009 0.0015 145.3 131.3 262.1
ROR 1 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2
삼중-특이적 결합 분자 		0.174 0.0011 0.0016 158.0 142.7 245.7
JIMT-1 LUC 표적 세포 (LDH 분석)
ROR1 X CD3 DART TM 0.291 0.7761 0.7643 0.4 1.0 1.0
ROR 1 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1
삼중-특이적 결합 분자 		0.095 0.0017 0.0053 55.9 149.0 144.2
ROR 1 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2
삼중-특이적 결합 분자 		0.277 0.0021 0.0057 131.8 351.3 134.1
A549
ROR1 X CD3 DART TM 0.762 0.468 0.5305 1.6 1.0 1.0
ROR 1 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1
삼중-특이적 결합 분자 		0.879 0.0102 0.0231 86.2 53.0 23.0
ROR 1 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2
삼중-특이적 결합 분자 		1.257 0.009 0.0126 139.7 85.8 42.1
실시예 6예시적인 항-CD3, 항-CD8, 항-Env 삼중-특이적 결합 분자의 특성
질환-관련 항원 HIV (gp140 항원)에 특이적인 추가의 예시적인 삼중-특이적 결합 분자를 구성하였다. HIV mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자는 4개의 상이한 폴리펩티드 사슬로 구성되었다 (표 17).
폴리펩티드 사슬 도메인 결합 친화성
1 VL(HIV mAb 1)-VH(CD3 mAb 2)-E-코일-(CH2-CH3) 경쇄: HIV
중쇄: CD3
2 VL(CD3 mAb 2)-VH(HIV mAb 1)-K-코일 경쇄: CD3
중쇄: HIV
3 중쇄 CD8 mAb 1 CD8
4 경쇄 CD8 mAb 1 CD8
HIV mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:91)이다:DIVMTQSPDS LAVSPGERAT IHCKSSQTLL YSSNNRHSIA WYQQRPGQPP KLLLYWASMR
LSGVPDRFSG SGSGTDFTLT INNLQAEDVA IYYCHQYSSH PPTFGHGTRV EIKGGGSGGG
GEVQLVESGG GLVQPGGSLR LSCAASGFTF STYAMNWVRQ APGKGLEWVG RIRSKYNNYA
TYYADSVKGR FTISRDDSKN SLYLQMNSLK TEDTAVYYCV RHGNFGNSYV SWFAYWGQGT
LVTVSSASTK GEVAACEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEKG GGDKTHTCPP CPAPEAAGGP
SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS
TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM
TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK.
HIV mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:92)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV
QLVQSGGGVF KPGGSLRLSC EASGFTFTEY YMTWVRQAPG KGLEWLAYIS KNGEYSKYSP
SSNGRFTISR DNAKNSVFLQ LDRLSADDTA VYYCARADGL TYFSELLQYI FDLWGQGARV
TVSSASTKGK VAACKEKVAA LKEKVAALKE KVAALKE.
HIV mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 3 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:93)이다:
EVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCTASGFNIK DTYIHFVRQR PEQGLEWIGR IDPANDNTLY
ASKFQGKATI TADTSSNTAY MHLCSLTSGD TAVYYCGRGY GYYVFDHWGQ GTTLTVSSAS
TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL
YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS
VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT
KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPG.
HIV mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 4 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:94)이다:
DVQINQSPSF LAASPGETIT INCRTSRSIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS GSTLQSGIPS
RFSGSGSGTD FTLTISGLEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA GTKLELRRTV AAPSVFIFPP
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC.
HIV mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자는 4개의 상이한 폴리펩티드 사슬로 구성되었다 (표 18).
폴리펩티드 사슬 도메인 결합 친화성
1 VL(HIV mAb 2)-VH(CD3 mAb 2)-E-코일-(CH2-CH3) 경쇄: HIV
중쇄: CD3
2 VL(CD3 mAb 2)-VH(HIV mAb 2)-K-코일 경쇄: CD3
중쇄: HIV
3 중쇄 CD8 mAb 1 CD8
4 경쇄 CD8 mAb 1 CD8
HIV mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:95)이다:QSALTQPPSA SGSPGQSVTI SCTGTSSDVG GYNYVSWYQH HPGKAPKLII SEVNNRPSGV
PDRFSGSKSG NTASLTVSGL QAEDEAEYYC SSYTDIHNFV FGGGTKLTVL GGGSGGGGEV
QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGFTFSTY AMNWVRQAPG KGLEWVGRIR SKYNNYATYY
ADSVKGRFTI SRDDSKNSLY LQMNSLKTED TAVYYCVRHG NFGNSYVSWF AYWGQGTLVT
VSSASTKGEV AACEKEVAAL EKEVAALEKE VAALEKGGGD KTHTCPPCPA PEAAGGPSVF
LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR
VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN
QVSLWCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN
VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK.
HIV mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:96)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV
QLQESGPGLV KPSQTLSLSC TVSGGSSSSG AHYWSWIRQY PGKGLEWIGY IHYSGNTYYN
PSLKSRITIS QHTSENQFSL KLNSVTVADT AVYYCARGTR LRTLRNAFDI WGQGTLVTVS
SASTKGKVAA CKEKVAALKE KVAALKEKVA ALKE.
HIV mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 3 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:97)이다:
EVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCTASGFNIK DTYIHFVRQR PEQGLEWIGR IDPANDNTLY
ASKFQGKATI TADTSSNTAY MHLCSLTSGD TAVYYCGRGY GYYVFDHWGQ GTTLTVSSAS
TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL
YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS
VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT
KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPG.
HIV mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 4 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:98)이다:
DVQINQSPSF LAASPGETIT INCRTSRSIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS GSTLQSGIPS
RFSGSGSGTD FTLTISGLEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA GTKLELRRTV AAPSVFIFPP
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC.
인간 면역결핍 바이러스 (HIV)의 gp140 항원에 결합할 수 있는 결합 도메인을 가지는 삼중-특이적 결합 분자 (즉 HIV mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자 및 HIV mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자)를 제조하였다.
예비 단계로서, HIV mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 및 HIV mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 능력을 평가하였다. 0.2 M 탄산염-중탄산염 완충액 (pH 9.4) 중의 JR-FL 스트레인 gp140 단백질 2 μg/ml을 고체 지지체 위에 코팅한 후, 삼중-특이적 결합 분자 (5 μg/ml의 출발 농도, 이어서 1:2 연속 희석)와 함께 인큐베이션하였다. 분석이 끝날 때, 결합을 3% 우혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 인산염 완충된 식염수 (PBS)로 차단하였다. 결합을 양고추냉이 과산화효소 (HRP)에 콘쥬게이트되어 있는 항-인간 IgG를 사용하여 ELISA (pico (ThermoScientific-Pierce)에 의하여 검출하였다. 분석을 또한 CD3에 결합하는 분자의 능력을 평가하기 위하여 고정된 인간 CD3 (2 μg/ml)와 함께 사용하였다. 둘 다의 삼중-특이적 결합 분자는 가용성, 고정된 gp140 단백질 (도 18a) 및 인간 CD3 (도 18b)에 결합할 수 있는 것으로 나타났다. 샌드위치 ELISA를 수행하여 삼중-특이적 결합 분자가 gp140 및 CD3 둘 다에 동조적으로 결합할 수 있음을 증명하였다. 이 목적에 대해, 0.2 M 탄산염-중탄산염 완충액 (pH 9.4) 중의 JR-FL 스트레인 gp140 단백질 2 μg/ml을 고체 지지체 위로 코팅한 후, 삼중-특이적 결합 분자 (5 μg/ml의 출발 농도, 이어서 1:2 연속 희석)와 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 비오틴으로 표지된 인간 CD3을 첨가하였다 (0.5 μg/ml). 결합을 스트렙트아비딘-HRP 콘쥬게이트를 사용하여 ELISA (pico (ThermoScientific-Pierce)에 의해 검출하였다. 도 18c는 삼중-특이적 결합 분자가 gp140 및 CD3 둘 다에 동조적으로 결합할 수 있음을 보여준다.
삼중-특이적 결합 분자는 HIV env 단백질을 발현하는 세포의 표면에 결합할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 발명의 이런 측면을 증명하기 위하여, 독시사이클린 유도하에 HIV env-발현 HEK293/D375 세포를 삼중-특이적 결합 분자와 함께 인큐베이션하였다. 결합의 검출을 비오티닐화된 항-인간 Fc 항체 및 스트렙트아비딘-APC를 사용하여 수행하였다. 도 19a 내지 19c에서 나타난 것과 같이, 둘 다의 삼중-특이적 결합 분자는 대조 삼중-특이적 결합 분자와 대조적으로 HEK293/D375 세포에 결합할 수 있는 것으로 나타났다 (도 19c).
그런 삼중-특이적 결합 분자의 HIV-감염 세포의 재-지시된 살해를 중재하는 능력을 증명하기 위하여, 그런 분자들의 PBMC에 결합하는 능력을 평가하였다. 인간 혈액을 ACK 용해 완충액으로 용해시키고, PBS로 2회 세척한 후, 10% 인간 AB 혈청을 함유한 FACS 완충액에 재-현탁하고 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 세포를 원심분리에 의해 펠릿화하고 FACS 완충액에 재-현탁하였다 (4 x 106 세포/mL). 50 μL의 연속 적정된 삼중-특이적 결합 분자를 96-웰 심층 플레이트의 웰에 첨가하였다. 그런 후, 0.01% 나트륨 아지드를 함유하는 FACS 완충액에 잘 혼합된 세포 50 μL (4 x 106 세포/mL)를 해당하는 세포에 첨가하고 피펫을 사용하여 철저하게 혼합하였다. 플레이트를 암실에서 약 45분 동안 2 내지 8℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝났을 때, 세포를 300 μL의 FACS를 각 웰에 첨가함으로써 2회 세척하고, 플레이트를 1,200 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 버렸다. 세포 펠릿을 0.01% 나트륨 아지드를 함유하는 FACS 완충액에 제조된 염소 항-인간 IgG Fcγ-PE, CD5-APC 및 CD4-PerCP5.5의 혼합물 100 μL에 재-현탁하고, 세포를 암실에서 약 45분 동안 2 내지 8℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝났을 때, 세포를 세척하고, FACS 완충액으로 재-현탁하고, BD Caliber 유동 세포분석기로 분석하였다. 도 20a 및 20b에서 나타난 것과 같이, 삼중-특이적 분자들은 CD5+/CD4- 세포 집단에 특이적 결합을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
삼중-특이적 결합 분자를 37℃에서 24시간 동안 테트라사이클린의 존재 또는 부재하에 HIV env-발현 Jurkat 522 FY 세포 및 pan T 세포의 존재하에 인큐베이션하였고, 세포독성을 LDH 분석을 사용하여 측정하였다. 도 21a 내지 21f에서 나타난 것과 같이, 삼중-특이적 결합 분자는 실질적인 세포독성을 중재하였다.
세포독성 분석을 정제된 pan T 세포 및 HIV env-발현 Jurkat 522 FY 세포를 사용하여 수행하였고 살아있는 세포의 퍼센트를 측정하였다. 이 분석의 결과를 도 22a 및 22b에 나타낸다.
CD4+, CD8+ 또는 pan T 세포를 사용하여 HIV env-발현 Jurkat 522 FY 세포에 미치는 삼중-특이적 결합 분자의 CTL 활성을 평가하였다. HIV mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자에 관련된 이 평가의 결과는 도 23a 내지 23c에 나타낸다. HIV mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자와 관련된 이 평가의 결과는 도 24a 내지 24c에 나타낸다. 표 19는 그 결과를 요약한 것이다.
Jurkat 세포 522FY
(표적 세포 w/o 결합 분자로부터의 LDH MR과 관련된 % 세포독성)
HIV mAb 1,
CD3 mAb 2
DART TM 		HIV mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1
삼중-특이적 결합 분자 		HIV mAb 2,
CD3 mAb 2
DART TM 		HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1
삼중-특이적 결합 분자
EC 50, nM E max, % EC 50, nM E max, % EC 50, nM E max, % EC 50, nM E max, %
CD4
0.67 13 0.36 15 0.25 9 0.45 8
CD8
0.20 18 0.00781 37 0.052 16 0.00040 27
Pan T
0.31 19 0.044 38 0.26 16 0.0015 23
표적:이펙터 세포의 비율을 변화시킬 때의 영향을 평가하였다. 표 20은 얻어진 결과를 요약한 것이다.
Jurkat 세포 522FY
(표적 세포 w/o 결합 분자로부터의 LDH MR에 관련된 % 세포독성)
HIV mAb 1 결합 도메인 HIV mAb 2 결합 도메인
E/T = 5:1 E/T = 10:1 E/T = 5:1 E/T = 10:1
EC50
nM		 Emax
%		 EC50
nM		 Emax
%		 EC50
nM		 Emax
%		 EC50
nM		 Emax
%
DART TM 0.076 26 0.066 27 0.00057 24 0.00061 25
DART TM 0.0092 15 0.0066 15 0.0058 15 0.0054 15
삼중-특이적 결합 분자 0.00019 22 0.00029 24 0.00032 25 0.00026 24
CD4+, CD8+ 또는 pan T 세포를 사용하여 HIV env-발현 HEK293 세포에 미치는 삼중-특이적 결합 분자의 CTL 활성을 평가하였다. 이 평가의 결과를 표 21에 요약한다.
표덕 세포 w/o 삼중-특이적 결합 분자로부터의 LDH MR에 관련된 % 세포독성
HEK293 D371 세포 HEK293 D375 세포
HIV mAb 1,
CD3 mAb 2
DARTTM 		HIV mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1
삼중-특이적 결합 분자		 HIV mAb 2,
CD3 mAb 2
DARTTM 		HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1
삼중-특이적 결합 분자
EC 50, nM E max, % EC 50, nM E max, % EC 50, nM E max, % EC 50, nM E max, %
CD4
0.45 0.64 3.16 1.12 0.15 0.14 0.84 0.18
CD8
0.029 0.0062 1.77 0.0043 0.018 0.0012 1.00 0.0020
Pan T
0.082 0.025 2.06 N/A 0.042 0.0085 1.08 N/A
실시예 7CD3 결합 도메인 친화성 변이체들의 비교
상기에서 주지된 것과 같이, 본 발명의 삼중-특이적 결합 분자의 CD3, CD8 또는 질환-관련 항원-결합 도메인은 보다 바람직한 결합 특성을 가지는 결합 도메인을 분리하기 위해 돌연변이될 수 있다. CD3 mAb 2 결합 도메인에 그런 돌연변이생성을 수행하였고 2개의 친화성 변이체 (CD3 mAb 2 로우 및 CD3 mAb 2 패스트)를 분리하였다.
항-인간 CD3 mAb 2 로우의 가변 경쇄 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:99)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TC RSSTGAVT TSNYAN WVQQ KPGQAPRGLI G GTNKRAP WT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWV F GGGTKLTVLG.
항-인간 CD3 mAb 2 로우의 가변 중쇄 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:100)이다:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAAS GFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT
YYADSVKG RF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVT WFAY WGQGTL
VTVSS.
항-인간 CD3 mAb 2 패스트의 가변 경쇄 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:101)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TC RSSTGAVT TSNYAN WVQQ KPGQAPRGLI G GTNKRAP WT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWV F GGGTKLTVLG.
항-인간 CD3 mAb 2 패스트의 가변 중쇄 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:102)이다:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAAS GFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT
YYADSVKG RF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HKNFGNSYVT WFAY WGQGTL
VTVSS.
도 25a 내지 25c는 이들 변이체에 대한 결합의 동역학을 도시한다. CD3 mAb 2 로우 (도 25a)는 저친화성 변이체인 한편, CD3 mAb 2 패스트 (도 25b)는 야생형 CD3 mAb 2에 비교하여 더 빠른 오프 속도를 가진다 (도 25c).
CD3 결합 특성의 효과를 평가하기 위하여, 2개의 CD3 결합 도메인 돌연변이를 사용하였다. 질환-관련 항원 5T4에 특이적인 3개의 삼중-특이적 결합 분자를 야생형 CD3 mAb 2 가변 도메인 서열, CD3에 대한 저친화성을 가진 CD3 mAb 2 가변 도메인 서열 및 야생형 친화성을 갖지만 더 빠른 오프 속도를 가진 CD3 mAb 2 가변 도메인 서열을 사용하여 구성하였다. 5T4 가변 도메인 특이성과 CD8 가변 도메인 특이성은 3개의 삼중-특이적 결합 분자 사이에서 동일하였다. 첫 번째 삼중-특이적 결합 분자를 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1로 명명하고 4개의 상이한 폴리펩티드 사슬로 구성되었다 (표 22).
폴리펩티드 사슬 도메인 결합 친화성
1 VL(5T4 mAb 1)-VH(CD3 mAb 2)-E-코일-(CH2-CH3) 경쇄: 5T4
중쇄: CD3
2 VL(CD3 mAb 2)-VH(5T4 mAb 1)-K-코일 경쇄: CD3
중쇄: 5T4
3 중쇄 CD8 mAb 1 CD8
4 경쇄 CD8 mAb 1 CD8
5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:103)이다:DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS NYLAWFQQKP GKAPKSLIYR ANRLQSGVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCLQ YDDFPWTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV
ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS
VKGRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS
GGCGGGEVAA LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV
SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV
SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF
SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK.
5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:104)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV
QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTSF WMHWVRQAPG QGLEWMGRID PNRGGTEYNE
KAKSRVTMTA DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCAGGNPY YPMDYWGQGT TVTVSSGGCG
GGKVAALKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE.
5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 3 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:105)이다:
EVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCTASGFNIK DTYIHFVRQR PEQGLEWIGR IDPANDNTLY
ASKFQGKATI TADTSSNTAY MHLCSLTSGD TAVYYCGRGY GYYVFDHWGQ GTTLTVSSAS
TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL
YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS
VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT
KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK.
5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 4 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:106)이다:
DVQINQSPSF LAASPGETIT INCRTSRSIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS GSTLQSGIPS
RFSGSGSGTD FTLTISGLEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA GTKLELRRTV AAPSVFIFPP
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC.
제 2 삼중-특이적 결합 분자는 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 로우 / CD8 mAb 1로 명명하고 4개의 상이한 폴리펩티드 사슬로 구성되었다 (표 23).
폴리펩티드 사슬 도메인 결합 친화성
1 VL(5T4 mAb 1)-VH(CD3 mAb 2 로우)-E-코일-(CH2-CH3) 경쇄: 5T4
중쇄: CD3
2 VL(CD3 mAb 2 로우)-VH(5T4 mAb 1)-K-코일 경쇄: CD3
중쇄: 5T4
3 중쇄 CD8 mAb 1 CD8
4 경쇄 CD8 mAb 1 CD8
5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 로우 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:107)이다:DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS NYLAWFQQKP GKAPKSLIYR ANRLQSGVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCLQ YDDFPWTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV
ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS
VKGRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVTWFAYW GQGTLVTVSS
ASTKGEVAAC EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS
VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS
LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS
CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK.
5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 로우 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:108)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV
QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTSF WMHWVRQAPG QGLEWMGRID PNRGGTEYNE
KAKSRVTMTA DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCAGGNPY YPMDYWGQGT TVTVSSASTK
GKVAACKEKV AALKEKVAAL KEKVAALKE.
5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 로우 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 3 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:109)이다:
EVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCTASGFNIK DTYIHFVRQR PEQGLEWIGR IDPANDNTLY
ASKFQGKATI TADTSSNTAY MHLCSLTSGD TAVYYCGRGY GYYVFDHWGQ GTTLTVSSAS
TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL
YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS
VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT
KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK.
5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 로우 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 4 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:110)이다:
DVQINQSPSF LAASPGETIT INCRTSRSIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS GSTLQSGIPS
RFSGSGSGTD FTLTISGLEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA GTKLELRRTV AAPSVFIFPP
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC.
제 3 삼중-특이적 결합 분자는 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 패스트/ CD8 mAb 1로 명명되고 4개의 상이한 폴리펩티드 사슬로 구성되었다 (표 24).
폴리펩티드 사슬 도메인 결합 친화성
1 VL(5T4 mAb 1)-VH(CD3 mAb 2 패스트)-E-코일-(CH2-CH3) 경쇄: 5T4
중쇄: CD3
2 VL(CD3 mAb 2 패스트)-VH(5T4 mAb 1)-K-코일 경쇄: CD3
중쇄: 5T4
3 중쇄 CD8 mAb 1 CD8
4 경쇄 CD8 mAb 1 CD8
5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 패스트 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 1 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:111)이다:DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS NYLAWFQQKP GKAPKSLIYR ANRLQSGVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCLQ YDDFPWTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV
ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS
VKGRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHKNFG NSYVTWFAYW GQGTLVTVSS
ASTKGEVAAC EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS
VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS
LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS
CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK.
5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 패스트 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 2 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:112)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV
QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTSF WMHWVRQAPG QGLEWMGRID PNRGGTEYNE
KAKSRVTMTA DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCAGGNPY YPMDYWGQGT TVTVSSASTK
GKVAACKEKV AALKEKVAAL KEKVAALKE.
5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 패스트 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 제 3 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:113)이다:
EVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCTASGFNIK DTYIHFVRQR PEQGLEWIGR IDPANDNTLY
ASKFQGKATI TADTSSNTAY MHLCSLTSGD TAVYYCGRGY GYYVFDHWGQ GTTLTVSSAS
TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL
YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS
VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT
KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK.
5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 패스트 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의제 4 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:114)이다:
DVQINQSPSF LAASPGETIT INCRTSRSIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS GSTLQSGIPS
RFSGSGSGTD FTLTISGLEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA GTKLELRRTV AAPSVFIFPP
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC.
건강한 공여자의 인간 PBMC를 상기 기술한 것과 같이 처리하고 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자, 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 로우 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자 및 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 패스트 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자와 함께 인큐베이션하였다. 5T4 X CD3 DARTTM (야생형, 로우 및 패스트 CD3 특이성을 가짐)을 대조표준으로서 사용하였다. 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 로우 / CD8 mAb 1 및 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 패스트 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자는 CD3에 대해 변경된 친화성 및 결합 동역학을 나타내는 돌연변이된 CD3 결합 도메인을 함유한다.
삼중-특이적 결합 분자는 DARTTM 대조표준보다 CD5+ CD4+ 세포에 대해 더 약한 결합을 나타내지만 (도 26a), CD5+ CD4- 세포에 대해 훨씬 더 강한 결합을 나타내는 (도 26b) 것으로 밝혀졌다.
도 27a 내지 27c는 LDH 분석을 사용하여 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 세포독성에 미치는 CD3 mAb 변이체의 효과를 나타낸다. 유사한 결과는 루시페라제 분석을 사용하여 5T4 mAb 1 결합 도메인 대신 B7-H3 결합 도메인을 가지는 삼중-특이적 결합 분자로 얻어졌다. 그 결과는 CD3 mAb 2 로우 삼중-특이적 결합 분자가 최소한의 세포독성을 나타냈지만, CD3 mAb 2 패스트 삼중-특이적 결합 분자는 CD8+ T 세포 및 pan T 세포를 사용하여, CD4+ T 세포를 사용할 때보다 훨씬 더 큰 정도로 세포독성을 나타냈음을 보여준다.
사이토킨 프로파일에 미치는 삼중-특이적 결합 분자의 효과를 평가하기 위하여, 2개의 공여체로부터의 PBMC를 증가하는 농도의 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자, 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 로우 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자 및 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 패스트 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 존재하에 24시간 동안 인큐베이션하였다. 6개의 사이토킨 (IFN-γ, TNF-α, IL-10, IL-6, IL-4 및 IL-2)의 수준을 측정하였다. 그 결과를 도 28a 내지 28f (공여체 1) 및 도 29a 내지 29f (공여체 2)에 나타낸다. 결과들은 놀랍게도 CD3만을 표적으로 하고 CD8+ T 세포에 대해서는 선택적이지 않은 DARTTM과 비교하여 PBMC로부터 방출된 사이토킨들의 극적인 증가를 보였다.
5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자는 DARTTM에 유사한 효능을 나타냈는데, 이펙터로서 pan T 세포를 사용하여, DARTTM에 대한 1.3 pM에 비교하여 1 pM ECRO을 나타냈다. DARTTM의 활성은 이미 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 다에 대해 최대였다. 삼중-특이적 결합 분자는 CD8+ 집단을 향해 활성을 이동시키지 않고 CD4+ 집단으로부터 멀어지지 않는데, 그것은 사이토킨, 특히 IL-2 및 TNFα 방출의 관점에서 유익하다.
비록 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 로우 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자가 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 결합할 수 있지만, 세포의 또는 세포에 의한 세포용해를 재지시하는 능력은 돌연변이되지 않은 CD3 mAb 2 결합 도메인과 비교하여 크게 감소되었다. 다른 한편으로 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 패스트 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자는 CTL 활성을 보유하였는데, 특히 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자 (EC50에 7-배 차이)에 비교하여 CD4+ T 세포에 비교된/관한 CD8+ T 세포가 그렇다 (EC50에 75-배 차이). 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 패스트/ CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자에 대한 EC50은 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 삼중-특이적 결합 분자의 그것과 유사하였지만 (2.8 대 1.3 pM), CD4+ 대 CD8+ T 세포 표적화의 극적인 차이는 인간 PBMC 배양물에서 5T4 X CD3 DARTTM으로 관찰된 사이토킨 방출을 실제로 제거하였다.
실시예 8
예시적인 삼중-특이적 결합 분자의 EC50의 요약
요약하면, 일련의 14개의 삼중-특이적 결합 분자를 구성하였고 (표 25), 각각은 2개의 다이아바디-형 결합 도메인 (부위 A 및 부위 B) 및 하나의 Fab-형 결합 도메인 (부위 C)을 가진다.
명칭 결합 도메인
부위 A 부위 B 부위 C
B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 B7-H3 CD3 CD8
CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 / B7-H3 mAb 1 CD3 CD8 B7-H3
B7-H3 mAb 1/ CD8 mAb 1 / CD3 mAb 2 B7-H3 CD8 CD3
B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 B7-H3 CD3 CD8
5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 5T4 CD3 CD8
5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 로우 / CD8 mAb 1 5T4 CD3 로우 CD8
5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 패스트 / CD8 mAb 1 5T4 CD3 패스트 CD8
5T4 mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 5T4 CD3 CD8
5T4 mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 5T4 CD3 CD8
팔리비주맙 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 RSV CD3 CD8
ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 ROR1 CD3 CD8
ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2 ROR1 CD3 CD8
HIV mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 HIV CD3 CD8
HIV mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 HIV CD3 CD8
그런 삼중-특이적 결합 분자의 EC50 데이터는 표 26에 요약한다 (표적 세포: JIMT1-luc; 이펙터:표적 세포 비율 5:1). 일부 경우에 (표 26에서 NR로서 나타냄), EC50은 최대 살해에 도달하지 않았기 때문에 데이터로부터 계산할 수 없었다.
표적 결합 분자 EC50 (nM) DART
CD4/
CD8에 대해 		DART
EC50 w/PanT에 대해
CD8+ CD4+ PanT CD4/
CD8
B7H3 B7-H3 / CD3 mAb 2
DART TM 		0.5090 1.1370 0.6943 2.2 1.0 1.0
B7-H3 / CD8 mAb 1
DART TM 		NR NR NR - - -
B7-H3 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1
삼중-특이적 결합 분자 		0.0054 0.0721 0.0082 13.3 5.9 85.1
B7-H3 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2
삼중-특이적 결합 분자 		0.0051 0.3138 0.0058 61.5 27.5 119.7
CD3 mAb 2/ CD8 mAb 2 / B7-H3 mAb 1
삼중-특이적 결합 분자 		0.0053 0.1055 0.0113 19.8 8.9 61.4
B7-H3 mAb 1 / CD8 mAb 2 / CD3 mAb 2
삼중-특이적 결합 분자 		0.4125 1.1030 0.5347 2.7 1.2 1.3
5T4 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 DART TM 0.0012 0.0013 0.0013 1.1 1.0 1.0
5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1
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5T4 mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2
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RSV Palivizumab / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1
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ROR1 ROR1 / CD3 mAb 2
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ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8 mAb 2
삼중-특이적 결합 분자 		0.0021 0.2767 0.0057 131.8 351.3 134.1
본 명세서에서 언급된 모든 공개물 및 특허는 각각의 개별적인 공개물 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 전체 내용이 참조로 포함된 것을 나타내는 것과 동일한 정도로 참조로 본원에 포함된다. 발명이 그것의 특정 구체예들과 관련하여 기술된 한편으로, 추가의 변형이 가능하고, 일반적으로, 본 개시로부터의 그런 일탈을 포함하여 발명의 원리를 따르는 발명의 어떠한 변화, 용도 또는 적응을, 발명이 속하는 기술분야 내에서 공지되거나 관습적인 실시의 범위 안에 있는 것으로서 및 지금까지 설명된 본질적인 특징들에도 적용될 수 있는 것으로서 포함하는 것으로 의도된 것임이 인지될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> MacroGenics, Inc. Johnson, Leslie S. S. Huang, Ling S. Reddy Chichili, Gurunadh S. Shah, Kalpana Lam, Chia-Ying Kao Burke, Stephen James Liu, Liqin Moore, Paul A. Bonvini, Ezio Barat, Bhaswati <120> Tri-Specific Therapeutic Binding Molecules and Methods of Use Thereof <130> 1301.0114PCT <150> US 62/107,824 <151> 2015-01-26 <150> US 62/008,229 <151> 2014-06-05 <150> US 62/004,571 <151> 2014-05-29 <160> 133 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 1 <400> 1 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cysteine-Containing Domain ("Linker 2") <400> 2 Gly Gly Cys Gly Gly 1 5 <210> 3 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E-Coil Heterodimer-Promoting Domain <400> 3 Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val 1 5 10 15 Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys 20 25 <210> 4 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K-Coil Heterodimer-Promoting Domain <400> 4 Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val 1 5 10 15 Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu 20 25 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Polypeptide Chain of Exemplary 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 Low / CD8 mAb 1 Tri--Specific Binding Molecule (Heavy Chain CD8 mAb 1) <400> 109 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Phe Val Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Leu Tyr Ala Ser Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Cys Ser Leu Thr Ser Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Arg Gly Tyr Gly Tyr Tyr Val Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys 355 360 365 Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 110 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fourth Polypeptide Chain of Exemplary 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 Low / CD8 mAb 1 Tri--Specific Binding Molecule (Light Chain CD8 mAb 1) <400> 110 Asp Val Gln Ile Asn Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ala Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Thr Ser Arg Ser Ile Ser Gln Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Asn Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 111 <211> 503 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of Exemplary 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 Fast / CD8 mAb 1 Tri--Specific Binding Molecule (VL(5T4 mAb 1)-VH(CD3 mAb 2 Fast)-E-Coil-(CH2-CH3)) <400> 111 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asp Phe Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 115 120 125 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 130 135 140 Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 145 150 155 160 Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr 165 170 175 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser 180 185 190 Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr 195 200 205 Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Lys Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val 210 215 220 Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 240 Ala Ser Thr Lys Gly Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala 245 250 255 Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu 260 265 270 Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 275 280 285 Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 290 295 300 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 305 310 315 320 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 325 330 335 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 340 345 350 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 355 360 365 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 370 375 380 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 385 390 395 400 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 405 410 415 Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 420 425 430 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 435 440 445 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 450 455 460 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 465 470 475 480 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 485 490 495 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 500 <210> 112 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Polypeptide Chain of Exemplary 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 Fast / CD8 mAb 1 Tri--Specific Binding Molecule (VL(CD3 mAb 2 Fast)-VH(5T4 mAb 1)-K-Coil) <400> 112 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu 115 120 125 Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly 130 135 140 Tyr Thr Phe Thr Ser Phe Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 145 150 155 160 Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Asn Arg Gly Gly Thr 165 170 175 Glu Tyr Asn Glu Lys Ala Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys 180 185 190 Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 195 200 205 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Asn Pro Tyr Tyr Pro Met Asp 210 215 220 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 225 230 235 240 Gly Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys 245 250 255 Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu 260 265 <210> 113 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Third Polypeptide Chain of Exemplary 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 Fast / CD8 mAb 1 Tri--Specific Binding Molecule (Heavy Chain CD8 mAb 1) <400> 113 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Phe Val Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Leu Tyr Ala Ser Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Cys Ser Leu Thr Ser Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Arg Gly Tyr Gly Tyr Tyr Val Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys 355 360 365 Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 114 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fourth Polypeptide Chain of Exemplary 5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 Fast / CD8 mAb 1 Tri--Specific Binding Molecule (Light Chain CD8 mAb 1) <400> 114 Asp Val Gln Ile Asn Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ala Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Thr Ser Arg Ser Ile Ser Gln Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Asn Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 115 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cysteine-Containing E-Coil Heterodimer-Promoting Domain <400> 115 Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val 1 5 10 15 Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys 20 25 <210> 116 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cysteine-Containing K-Coil Heterodimer-Promoting Domain <400> 116 Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val 1 5 10 15 Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu 20 25 <210> 117 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-ROR1 mAb 1 Light Chain Variable Domain CDRL1 <400> 117 Thr Leu Ser Ser Gly His Lys Thr Asp Thr Ile Asp 1 5 10 <210> 118 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-ROR1 mAb 1 Light Chain Variable Domain CDRL2 <400> 118 Leu Glu Gly Ser Gly Ser Tyr 1 5 <210> 119 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-ROR1 mAb 1 Light Chain Variable Domain CDRL3 <400> 119 Gly Thr Asp Tyr Pro Gly Asn Tyr Leu 1 5 <210> 120 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-ROR1 mAb 1 Heavy Chain Variable Domain CDRH1 <400> 120 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 10 <210> 121 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-ROR1 mAb 1 Heavy Chain Variable Domain CDRH2 <400> 121 Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 122 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-ROR1 mAb 1 Heavy Chain Variable Domain CDRH3 <400> 122 Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Ala Ala Leu Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 123 <211> 46 <212> PRT <213> Streptococcus dysgalactiae <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(46) <223> Albumin-Binding Domain 3 (ABD3) of Protein G of Streptococcus Strain G148 <400> 123 Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asp Asn Ala Lys Ser Ala Glu 20 25 30 Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 124 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant Deimmunized Albumin-Binding Domain 3 (ABD3) of Protein G of Streptococcus Strain G148 <400> 124 Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Ala Ala Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Lys Ala Leu Ile Ala Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 125 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant Deimmunized Albumin-Binding Domain 3 (ABD3) of Protein G of Streptococcus Strain G148 <400> 125 Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Ser Asn Ala Lys Ser Val Glu 20 25 30 Gly Val Lys Ala Leu Ile Ala Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 126 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide Linker <400> 126 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 127 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cysteine-Containing Domain <400> 127 Ala Glu Pro Lys Ser Cys 1 5 <210> 128 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cysteine-Containing Variant of Portion of Human CL Domain <400> 128 Gly Phe Asn Arg Gly Glu Cys 1 5 <210> 129 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alternative Cysteine-Containing Linker Peptide ("Linker 3") <400> 129 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 130 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alternative Cysteine-Containing Linker Peptide ("Linker 3") <400> 130 Leu Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 131 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide Linker <400> 131 Ala Ser Thr Lys Gly 1 5 <210> 132 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide Linker <400> 132 Leu Glu Pro Lys Ser Ser 1 5 <210> 133 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant of Cysteine-Containing Portion of Human IgG Hinge Domain <400> 133 Gly Val Glu Pro Lys Ser Cys 1 5

Claims (23)

  1. 3개의 상이한 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 삼중-특이적 결합 분자로서, 상기 결합 분자는 함께 공유적으로 복합체화된 4개의 상이한 폴리펩티드 사슬을 포함하고,
    (I) 제 1 항원에 존재하는 에피토프 I에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항원-결합 도메인 I 및 제 2 항원에 존재하는 에피토프 II에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항원-결합 도메인 II, 이때 상기 항원-결합 도메인 I 및 상기 항원-결합 도메인 II는 둘 다 다이아바디-형 결합 도메인이고;
    (II) 제 3 항원에 존재하는 에피토프 III에 면역특이적으로 결합할 수 있는 비-다이아바디-형 항원-결합 도메인 III; 및
    (III) 2개의 CH2-CH3 도메인의 서로에의 회합에 의해 형성된 Fc 도메인
    을 포함하며,
    상기 제 1, 제 2 및 제 3 항원은 동일한 항원이거나, 또는 독립적으로 상기 항원들의 다른 것과 동일하거나 상이한, 삼중-특이적 결합 분자.
  2. 제 1항에 있어서, 에피토프 I, 에피토프 II 또는 에피토프 III 중 하나는 세포 수용체의 에피토프인 것을 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 에피토프 I, 에피토프 II 또는 에피토프 III 중 하나는 질환-관련 항원의 에피토프인 것을 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 질환-관련 항원은 암세포의 표면에 배열된 암 항원인 것을 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 질환-관련 항원은 병원체 또는 병원체-감염 세포의 표면에 배열된 병원체 항원인 것을 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 세포의 표면에 배열된 Fc 수용체에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자.
  7. 제 3항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 에피토프 I, 에피토프 II 또는 에피토프 III 중 하나는 CD3의 에피토프이고, 에피토프 I, 에피토프 II 또는 에피토프 III 중 제 2는 CD8의 에피토프이며, 에피토프 I, 에피토프 II 또는 에피토프 III 중 제 3은 상기 질환-관련 항원의 에피토프이고, 삼중-특이적 결합 분자의 항원-결합 도메인 I, II 및 III은 세포독성 T 세포 및 질환-관련 항원을 발현하는 세포의 동조된 결합을 중재하는 것을 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 CD3, 상기 CD8은 T 세포의 표면에 배열되고, 상기 질환-관련 항원은 암세포, 병원체 또는 병원체-감염 세포의 표면에 배열되며, 상기 면역특이적 결합은 상기 CD3 및 상기 CD8, 및 상기 질환-관련 항원을 공동-정위시키기에 충분하고, 그로써 상기 질환-관련 항원-배열 세포에 대해 상기 CD8-배열 T 세포의 활성화를 용이하게 하는 것을 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-다이아바디-형 결합 도메인 III은 상기 에피토프 III에 면역특이적으로 결합할 수 있는 상기 Fab-형 결합 도메인 (VLIII/VHIII)을 포함하며, 상기 분자는:
    (A) (I) N-말단에서 C-말단 방향으로:
    (1) 상기 3개의 에피토프 중 제 1에 결합할 수 있는 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VLI);
    (2) 상기 3개의 에피토프 중 제 2에 결합할 수 있는 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VHII);
    (3) (a) 제 1 시스테인-함유 도메인; 및
    이종이량체-촉진 도메인; 또는
    (b) 시스테인-함유 이종이량체-촉진 도메인;
    (5) 제 2 시스테인-함유 도메인; 및
    (6) IgG의 CH2 및 CH3 도메인
    을 포함하거나; 또는
    (II) N-말단에서 C-말단 방향으로:
    (1) 제 1 시스테인-함유 도메인;
    (2) IgG의 CH2 및 CH3 도메인;
    (3) 상기 3개의 에피토프 중 제 1에 결합할 수 있는 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VLI);
    (4) 상기 3개의 에피토프 중 제 2에 결합할 수 있는 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VHII);
    (5) (a) 제 2 시스테인-함유 도메인; 및
    이종이량체-촉진 도메인; 또는
    (b) 시스테인-함유 이종이량체-촉진 도메인
    을 포함하는 제 1 폴리펩티드 사슬;
    (B) N-말단에서 C-말단 방향으로:
    (1) 상기 3개의 에피토프 중 상기 제 2에 결합할 수 있는 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VLII);
    (2) 상기 3개의 에피토프 중 상기 제 1에 결합할 수 있는 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VHI);
    (3) (a) 제 1 시스테인-함유 도메인; 및
    이종이량체-촉진 도메인; 또는
    (b) 시스테인-함유 이종이량체-촉진 도메인
    을 포함하는 제 2 폴리펩티드 사슬로서, 이때 상기 제 2 폴리펩티드 사슬의 상기 이종이량체-촉진 도메인은 상기 제 1 폴리펩티드 사슬의 상기 이종이량체-촉진 도메인에 상보하는 제 2 폴리펩티드;
    (C) N-말단에서 C-말단 방향으로:
    (1) 상기 3개의 에피토프 중 제 3에 결합할 수 있는 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인 (VHIII); 및
    (2) CH1 도메인, 시스테인-함유 힌지 도메인 및 IgG의 CH2-CH3 도메인
    을 포함하는 제 3 폴리펩티드 사슬; 및
    (D) N-말단에서 C-말단 방향으로:
    (1) 상기 3개의 에피토프 중 상기 제 3에 결합할 수 있는 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인 (VLIII); 및
    (2) 시스테인-함유 경쇄 불변 도메인 (CL)
    을 포함하는 제 4 폴리펩티드 사슬
    을 포함하며;
    (i) 상기 VLI 및 VHI 도메인은 회합하여 상기 에피토프 I에 결합할 수 있는 도메인을 형성하고;
    (ii) 상기 VLII 및 VHII 도메인은 회합하여 상기 에피토프 II에 결합할 수 있는 도메인을 형성하며;
    (iii) 상기 VLIII 및 VHIII 도메인은 회합하여 상기 에피토프 III에 결합할 수 있는 도메인을 형성하고;
    (iv) 상기 제 1 폴리펩티드 사슬의 상기 CH2-CH3 도메인 및 상기 제 3 폴리펩티드 사슬의 상기 CH2-CH3 도메인은 회합하여 Fc 도메인을 형성하며;
    (v) 상기 제 1 및 제 2 폴리펩티드 사슬은 서로에 공유적으로 결합되고;
    (vi) 상기 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬은 서로에 공유적으로 결합되며; 및
    (vii) 상기 제 3 및 제 4 폴리펩티드 사슬은 서로에 공유적으로 결합되는
    것을 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자.
  10. 제 9항에 있어서,
    (A) 상기 이종이량체-촉진 도메인은 E-코일이고 상기 상보하는 이종이량체-촉진 도메인은 K-코일이거나; 또는
    (B) 상기 이종이량체-촉진 도메인은 K-코일이고 상기 상보하는 이종이량체-촉진 도메인은 E-코일인 것을 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자.
  11. 제 9항 또는 제 10항에 있어서,
    (A) 상기 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬의 상기 CH2-CH3 도메인들은 각각 SEQ ID NO:6의 서열을 가져서, 그것들의 회합으로부터 형성된 Fc 도메인은 정상적인 FcγR-중재된 이펙터 기능을 나타내거나; 또는
    (B) 상기 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬의 상기 CH2-CH3 도메인은 SEQ ID NO:6의 서열과 관련하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하여서, 그것들의 회합으로부터 형성된 Fc 도메인은 변경된 FcγR-중재된 이펙터 기능을 나타내는 것을 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자.
  12. 제 9항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 및 제 3 폴리펩티드 사슬의 상기 CH2-CH3 도메인은 서로 상이하며 SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:8로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자.
  13. 제 9항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
    (A) 상기 에피토프 I, 에피토프 II 및 에피토프 III은 각각 CD3의 에피토프, CD8의 에피토프 및 상기 질환-관련 항원의 에피토프이거나;
    (B) 상기 에피토프 I, 에피토프 II 및 에피토프 III은 각각 CD3의 에피토프, 상기 질환-관련 항원의 에피토프 및 CD8의 에피토프이거나;
    (C) 상기 에피토프 I, 에피토프 II 및 에피토프 III은 각각 CD8의 에피토프, CD3의 에피토프 및 상기 질환-관련 항원의 에피토프이거나;
    (D) 상기 에피토프 I, 에피토프 II 및 에피토프 III은 각각 CD8의 에피토프, 상기 질환-관련 항원의 에피토프 및 CD3의 에피토프이거나;
    (E) 상기 에피토프 I, 에피토프 II 및 에피토프 III은 각각 상기 질환-관련 항원의 에피토프, CD3의 에피토프 및 CD8의 에피토프이거나; 또는
    (F) 상기 에피토프 I, 에피토프 II 및 에피토프 III은 각각 상기 질환-관련 항원의 에피토프, CD8의 에피토프 및 CD3의 에피토프인 것을 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자.
  14. 제 7항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
    (A) CD3의 상기 에피토프는 항체 OKT3, M291, YTH12.5, CD3 mAb 1 또는 CD3 mAb 2에 의해 인지된 CD3 에피토프이거나; 또는
    (B) CD8의 상기 에피토프는 항체 TRX2 또는 OKT8에 의해 인지된 CD8 에피토프인 것을 특징으로 하는 삼중-특이적 결합 분자.
  15. 제 7항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 삼중-특이적 결합 분자와, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물.
  16. 제 15항의 약학 조성물의 유효량을 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법으로서, 상기 질환-관련 항원은 상기 암 항원인 방법.
  17. 제 15항의 약학 조성물의 유효량을 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 병원체의 존재와 관련된 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 질환-관련 항원은 상기 병원체 항원인 방법.
  18. 항-ROR1 항체 또는 ROR1-결합 단편으로서, 상기 항체는:
    (A) SEQ ID NO:117의 서열을 가지는 CDRL1, SEQ ID NO:118의 서열을 가지는 CDRL2 및 SEQ ID NO:119의 서열을 가지는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 도메인; 및
    (B) SEQ ID NO:120의 서열을 가지는 CDRH1, SEQ ID NO:121의 서열을 가지는 CDRH2 및 SEQ ID NO:122의 서열을 가지는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-ROR1 항체 또는 ROR1-결합 단편.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 항체는 SEQ ID NO:51의 서열을 가지는 경쇄 가변 도메인을 가지는 것을 특징으로 하는 항-ROR1 항체 또는 그것의 ROR1-결합 단편.
  20. 제 18항 또는 제 19항에 있어서, 상기 항체는 SEQ ID NO:52의 서열을 가지는 중쇄 가변 도메인을 가지는 것을 특징으로 하는 항-ROR1 항체 또는 그것의 ROR1-결합 단편.
  21. 제 18항 내지 제 20항 중 어느 한 항의 ROR1 결합 단편을 포함하는 다이아바디, BiTe 또는 단일-사슬 항체.
  22. 제 19항 내지 제 21항 중 어느 한 항의 항-ROR1 항체 또는 그것의 ROR1-결합 단편, 및 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물.
  23. 제 22항의 약학 조성물의 유효량을 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법.
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