KR20150013188A

KR20150013188A - 다중특이적 항체

Info

Publication number: KR20150013188A
Application number: KR1020147032719A
Authority: KR
Inventors: 라파엘라 카스톨디; 알렉산더 하스; 크리스챤 클레인; 볼프강 쉐퍼; 클라우디오 수스트만
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2012-05-24
Filing date: 2013-05-22
Publication date: 2015-02-04
Also published as: BR112014026990A2; EP2855531A1; CN104379604A; US20150166670A1; WO2013174873A1; JP2015520168A; HK1203517A1; CA2869529A1; MX2014014162A; RU2014149681A

Abstract

본 발명은 인간 HER1, 인간 HER2 및 인간 HER3에 결합하는 2가 다중특이적 항체, 특히 2가 삼중특이적 항체, 이의 제조 및 용도에 관한 것이다.

Description

다중특이적 항체{MULTISPECIFIC ANTIBODIES}

본 발명은 인간 HER1, 인간 HER2 및 인간 HER3에 결합하는 신규한 2가 다중특이적 항체, 특히 삼중특이적 또는 사중특이적 항체, 특히 2가 삼중특이적 항체, 이의 제조 및 용도에 관한 것이다.

유전자조작된 단백질, 예컨대 2개의 상이한 항원에 결합할 수 있는 이중특이적 항체는 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 이중특이적 결합 단백질은 세포 융합, 화학 접합 또는 재조합 DNA 기법을 사용하여 생성될 수 있다.

최근에 매우 다양한 재조합 이중특이적 항체 형태, 예를 들면, IgG 항체 형태와 단일쇄 도메인의 융합에 의한 4가 이중특이적 항체가 개발되었다(예를 들면, 문헌[Coloma, M.J., et al., Nature Biotech 15 (1997) 159-163]; 국제 특허출원 공개 제 2001/077342 호 및 문헌[Morrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234] 참조).

또한, 항체 코어 구조(IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM)가 더 이상 보유되어 있지 않은 여러 다른 새로운 형태, 예컨대, 2개 이상의 항원에 결합할 수 있는 2가 항체, 3가 항체, 4가 항체, 미니바디 및 여러 단일쇄 형태(scFv, Bis-scFv)가 개발되었다(문헌[Holliger, P., et al., Nature Biotech 23 (2005) 1126-1136]; 문헌[Fischer, N., and Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14]; 문헌[Shen, J., et al., J. Immunol. Methods 318 (2007) 65-74]; 문헌[Wu, C., et al., Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297]).

모든 이러한 형태들은 항체 코어(IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM)를 추가 결합 단백질(예를 들면, scFv)에 융합시키거나, 예를 들면, 2개의 Fab 단편 또는 scFv를 융합시키기 위해 연결기(linker)를 사용한다(문헌[Fischer, N., Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14]). 연결기는 이중특이적 항체의 유전자조작을 위한 이점을 갖는 것이 분명하지만, 또한 치료 설정에 문제를 야기할 수 있다. 실제로, 이러한 외부 펩티드는 연결기 자체 또는 단백질과 연결기 사이의 교차점에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 뿐만 아니라, 이러한 펩티드의 유연한 특성은 불량한 항체 안정성, 응집 및 증가된 면역성을 잠재적으로 야기하는 단백질분해 절단을 하기 더욱 쉽게 한다. 또한, 천연 항체와의 고도의 유사성을 유지함으로써, Fc 부분을 통해 매개되는 이펙터(effector) 기능, 예컨대, 보체 의존적 세포독성(CDC) 또는 항체 의존적 세포의 세포독성(ADCC)을 보유하기를 원할 수 있다.

따라서, 이상적으로, 인간 서열로부터 최소 변이를 갖는 천연 항체(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM)와 일반적인 구조가 매우 유사한 이중특이적 항체를 개발하는 것이 하나의 목적이어야 한다.

국제특허출원공개 제 2009/080251 호, 제 2009/080252 호, 제 2009/080253 호, 제 2009/080254 호 및 문헌[Schaefer, et al., PNAS 108(2011) 11187-11192]은 이중특이적 2가 항체에 관한 것이다.

국제특허출원공개 제 2008/027236 호, 제 2010/108127 호 및 문헌[Bostrom, J., et al., Science 323(2009) 1610-1614]은 가변 중쇄 및 경쇄 도메인 VH 및 VL을 다양화하여 이중 특이성을 도입하는 방법에 관한 것이다. 국제특허출원공개 제 2010/136172 호는 삼중특이적 또는 사중특이적 항체에 관한 것이지만, 이는 3가 또는 4가이고, 국제특허출원공개 제 2007/146959 호는 판 세포 표면 수용체-특이적 치료법에 관한 것이다.

이 기법은 IgG-유사 구조 및 IgG-유사 분자량을 갖는 3 또는 4개 항원에 대한 재조합 다중특이적 항체를 용이하게 개발하기 위한 기초로서 적절하지 않다. 아직까지 추가 융합된 결합 도메인 없이 천연 2가 항체와 유사한 구조를 갖는 2가 삼중특이적 또는 사중특이적 항체를 생성할 수 없었다.

본 발명은,

(A)(a) 제 1 항원 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 경쇄 및 중쇄, 및

(b) 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체된, 제 3 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄; 또는

(B)(a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 경쇄 및 중쇄, 및

(b) 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체된, 제 2 항원 및 제 3 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄; 또는

(C)(a) 제 1 항원 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 경쇄 및 중쇄, 및

(b) 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체된, 제 3 항원 및 제 4 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄

를 포함하는, 2가 삼중특이적 또는 사중특이적 항체인 다중특이적 항체에 관한 것이다.

일 실시양태에서 다중특이적 항체는 2가 삼중특이적 또는 사중특이적 항체이다.

일 실시양태에서 다중특이적 항체는 삼중특이적이고,

(b) 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체된, 제 2 항원 및 제 3 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄

를 포함한다.

일 실시양태에서 다중특이적 항체는 (A) 제 1 항원이 인간 HER1이고, 제 2 항원이 인간 HER3이고, 제 3 항원이 인간 HER2이거나; (B) 제 1 항원이 인간 HER2이고, 제 2 항원이 인간 HER1이고, 제 3 항원이 인간 HER3이다.

일 실시양태에서 다중특이적 항체는 (A) 제 1 항원이 인간 HER1이고, 제 2 항원이 인간 HER3이고, 제 3 항원이 인간 cMET이거나; (B) 제 1 항원이 인간 cMET이고, 제 2 항원이 인간 HER1이고, 제 3 항원이 인간 HER3이다.

일 실시양태에서 다중특이적 항체는 사중특이적이고,

(a) 제 1 항원 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 경쇄 및 중쇄, 및

를 포함한다.

일 실시양태에서 다중특이적 항체는 (B)의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄에서 가변 도메인 VL 및 VH이 서로 대체되고 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체되는 것이다.

일 실시양태에서 다중특이적 항체는 (B)의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄에서 (오직) 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되는 것이다.

일 실시양태에서 다중특이적 항체는 (B)의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄에서 (오직) 불변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되는 것이다.

일 실시양태에서 다중특이적 항체는 (a)의 전장 항체의 중쇄의 CH3 도메인 및 (b)의 전장 항체의 개질된 중쇄의 CH3 도메인이 항체 CH3 도메인 사이의 원래의 계면을 포함하는 계면에서 서로 만나고, 상기 계면이 삼중특이적 또는 사중특이적 항체의 형성을 촉진하도록 변경되고, 이때

(i) 삼중특이적 또는 사중특이적 항체 내의 다른 중쇄의 CH3 도메인의 원래의 계면과 만나는 한 중쇄의 CH3 도메인의 원래의 계면 내에서, 아미노산 잔기가 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체됨으로써, 다른 중쇄의 CH3 도메인의 계면 내의 공동에 위치할 수 있는 돌출부가 한 중쇄의 CH3 도메인의 계면 내에서 발생되도록 한 중쇄의 CH3 도메인이 변경되고,

(ii) 삼중특이적 또는 사중특이적 항체 내의 제 1 CH3 도메인의 원래의 계면과 만나는 제 2 CH3 도메인의 원래의 계면 내에서, 아미노산 잔기가 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체됨으로써, 제 1 CH3 도메인의 계면 내의 돌출부가 위치할 수 있는 공동이 제 2 CH3 도메인의 계면 내에서 발생되도록 다른 중쇄의 CH3 도메인이 변경된다.

일 실시양태에서 다중특이적 항체는, 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 상기 아미노산 잔기가 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기가 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T) 및 발린(V)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.

일 실시양태에서 다중특이적 항체는, 2개의 CH3 도메인이 2개의 CH3 도메인 사이에 이황화 가교가 형성될 수 있도록 각각의 CH3 도메인의 상응하는 위치에서 아미노산으로서 시스테인(C)을 도입하여 추가로 변경되는 것이다.

본 발명의 추가 실시양태는,

(I)(A)(a) 제 1 항원 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 경쇄 및 중쇄, 및

를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계;

(II) 상기 항체 분자를 합성하도록 하는 조건하에 숙주 세포를 배양하는 단계; 및

(III) 상기 배양물로부터 상기 항체 분자를 회수하는 단계

를 포함하는, 본 발명에 따른 다중특이적 항체의 제조 방법이다.

본 발명은 본 발명에 따른 다중특이적 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다.

본 발명은 본 발명에 따른 다중특이적 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 추가로 포함한다.

본 발명의 추가 실시양태는,

를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.

본 발명의 추가 실시양태는 조성물, 바람직하게는 본 발명에 따른 항체의 약학 또는 진단 조성물이다.

본 발명의 추가 실시양태는 본 발명에 따른 항체 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물이다.

본 발명의 추가 실시양태는 본 발명에 따른 치료 효과량의 항체를 치료를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는, 상기 환자의 치료 방법이다.

IgG-유사 구조 및 IgG-유사 분자량을 갖는 3 또는 4개 항원에 대한 다중특이적 항체를 제공하는 것이 처음이다.

본 발명에 따라, 목적하지 않은 부산물에 비해 목적한 다중특이적 항체의 비는 2개 전장 항체 아암(arm)의 중쇄 및 경쇄(HC/LC)의 오직 하나의 쌍(예를 들면, VH 도메인과 VL 도메인의 대체/교환, 또는 CH1 도메인과 CL 도메인의 대체/교환; 또는 VH 및 CH1 도메인과 VH 및 VL 도메인 둘다의 대체/교환)에서 특정 도메인을 대체시켜 개선될 수 있다. 이 방식에서 경쇄와 목적하지 않은 기능 장애 부산물을 야기하는 잘못된 중쇄의 목적하지 않는 짝짓기오류(VH¹과 VH² 및/또는 VH²와 VH¹의 짝짓기 오류)가 감소될 수 있다(도 3 참조).

도 1은 전형적인 순서로 가변 및 불변 도메인을 포함하는 중쇄 및 경쇄의 2개의 쌍을 갖는 제 1 항원 1에 특이적으로 결합하는 CH4 도메인이 없는 전장 항체의 구조를 도시한다.
도 2a 내지 2d는 전장 항체 경쇄/중쇄에서 VL/VH 도메인 및/또는 CL/CH1 도메인을 대체시켜 (CH3 도메인의 추가적인 크놉-대-홀 개질이 있고/없는) 경쇄 및 중쇄 짝짓기오류를 막는, 본 발명에 따른 상이한 삼중특이적 또는 사중특이적 항체의 구조를 도시한다.
도 2a는 (a) 제 1 항원 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 (예를 들면, 다양화된 VH¹ 및 VL¹을 갖는) 전장 항체의 경쇄 및 중쇄; 및 (b) 제 3 항원에 특이적으로 결합하는 (VH² 및 VL²를 갖는) 전장 항체의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄를 포함하고, 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체되는, 삼중특이적 항체이다.
도 2b는 2개의 중쇄에 예시적인 CH3 개질을 갖는("크놉-대-홀") (a) 제 1 항원 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 (예를 들면, 다양화된 VH¹ 및 VL¹을 갖는) 전장 항체의 경쇄 및 중쇄; 및 (b) 제 3 항원에 특이적으로 결합하는 (VH² 및 VL²를 갖는) 전장 항체의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄를 포함하고, 이때 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되고 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체되는, 삼중특이적 항체이다.
도 2c는 2개의 중쇄에 예시적인 CH3 개질을 갖는("크놉-대-홀"), (a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 (VH¹ 및 VL¹을 갖는) 전장 항체의 경쇄 및 중쇄; 및 (b) 제 2 항원 및 제 3 항원에 특이적으로 결합하는 (예를 들면, 다양화된 VH² 및 VL²를 갖는) 전장 항체의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄를 포함하고, 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되는 삼중특이적 항체이다.
도 2d는 (a) 제 1 항원 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 (예를 들면, 다양화된 VH¹ 및 VL¹을 갖는) 전장 항체의 경쇄 및 중쇄; 및 (b) 제 3 항원 및 제 4 항원에 특이적으로 결합하는 (예를 들면, 다양화된 VH² 및 VL²를 갖는) 전장 항체의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄를 포함하고, 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체되는, 사중특이적 항체이다.
도 3a는 이중-친화성(크로스맵 원리)을 요약하여 도시한다. 교차 기법은 1개의 Fab 아암에서 1개의 항원을 인식하는 중쇄, 경쇄 조합을 위해 사용되었다.
도 3b는 1개 Fab 아암에서 2개 항원을 인식하는 중쇄, 경쇄 조합을 위해 사용된 교차 기법이다. 이황화 안정화(중쇄 1: S354C, T366W; 중쇄 2: T366S, L368A, Y407V, Y349C)를 비롯한 크놉-대-홀 기법은 어느 하나의 조합을 위해 사용될 수 있다.
도 4는 (VH¹과 VH² 및/또는 VH²와 VH¹의 짝짓기오류를 야기하는) 경쇄 및 중쇄 짝짓기오류로 인한 목적하지 않은 기능 장애 부산물의 구조를 도시한다.
도 5a는 중쇄 구성물을 클로닝하기 위해 사용된 진핵 발현 벡터를 나타낸다.
도 5b는 경쇄 구성물을 클로닝하기 위해 사용된 진핵 벡터를 나타낸다.
도 6a는 VEGF-HER2-DAF 시험 발현의 분석적 HPLC의 결과이다. 단백질 A 면역침전된 물질의 생물학적 복제물 1(A, C, E) 및 생물학적 복제물 2(B, D, F)(K:H = 형질감염된 플라스미드의 크놉-대-홀 비).
도 6b는 VEGF-HER2-DAF 발현의 SDS-PAGE를 도시한다. 2개의 동일한 샘플은 단백질 A의 기술적 복제(NR: 비-환원 조건; Red: 환원 조건)의 분석을 나타낸다.
도 6c는 분석 HPLC 중 용리 시간 및 크기를 상호비교하는 표지 단백질을 도시한다.
도 7a는 VEGF-HER2-DAF-xAng2 시험 발현의 분석적 HPLC의 결과이다. 단백질 A 면역침전된 물질의 생물학적 복제물 1(A, C, E) 및 생물학적 복제물 2(B, D, F)(K:H = 형질감염된 플라스미드의 크놉 대 홀).
도 7b는 VEGF-HER2-DAF-xAng2 발현의 SDS-PAGE를 도시한다. 2개의 동일한 샘플은 단백질 A 면역침전된 물질의 기술적 복제(NR: 비-환원 조건; Red: 환원 조건)의 분석을 나타낸다.
도 8a는 VEGF-HER2-DAF-xHER1-HER3 DAF 시험 발현의 분석 HPLC 결과이다. (A, (b)는 생물학적 복제물 1 및 2이다.
도 8b는 VEGF-HER2-DAF-xHER1-HER3 DAF 발현의 SDS-PAGE를 도시한다. (A, (b)는 A에 나타낸 분석 HPLC의 복제 분석물이다(NR: 비-환원 조건; Red: 환원 조건).
도 9는 KiH HER1-HER3 DAF-xHER2 발현의 SDS-PAGE를 도시한다(NR: 비-환원 조건; Red: 환원 조건).
도 10a 및 10b는 삼중특이적 항체 KiH HER1-HER3 DAF-xHER2를 이용한 증식 분석을 도시한다. (a) A431을 30 ㎍/㎖의 삼중특이적 항체 또는 대조군 IgG 항체로 항온처리하였다. 항체 첨가 후 5 일째에, ATP-반출 분석을 수행하였다(세포 역가 글로(Cell Titer Glow), 프로메가(Promega)). (b) A431을 30 ㎍/㎖의 지시된 항체로 항온처리하였다. 항체 첨가 후 5 일째에, ATP 방출 분석을 수행하였다(세포 역가 글로, 프로메가).
도 11a 및 11b는 삼중특이적 항체 KiH HER1-HER3 DAF-xHER2를 이용한 증식 분석을 도시한다. MDA-MB-175 VII 세포를 삼중특이적 항체 KiH HER1-HER3 DAF-xHER2 또는 대조군 IgG 항체의 일련의 희석물로 항온처리하였다. 항체 첨가 후 5 일째에, ATP 방출 분석을 수행하였다(세포 역가 글로, 프로메가).
도 12a 내지 12c는 KiH HER1-HER3 DAF-xHER2 또는 각각의 모 항체의 결합 운동을 도시한다. 제 1 주입 및 제 2 주입은 ErbB 수용체 엑토도메인 첨가물의 순서를 나타낸다.
도 13은 A431 상피암 세포에서 삼중특이적 HER1-HER3 DAF-xHER2 항체의 ADCC 유도를 도시한다. 단일 패널의 이미지 넓이는 170.83 μm이다. 상부는 CMFDA 표지된 종양 세포에 상응하는 조질물이다(일반적으로 녹색 채널로 나타냄). 하부는 PKH26 표지된 천연 살해 세포에 상응하는 조질물이다(일반적으로 적색 채널로 나타냄).

본 발명은,

(b) 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체되, 제 3 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄; 또는

를 포함하는, 다중특이적 항체에 관한 것이다.

일 실시양태에서 다중특이적 항체는 삼중특이적이고,

를 포함한다.

일 실시양태에서 다중특이적 항체는 사중특이적이고,

를 포함한다.

일 실시양태에서 다중특이적 항체는 (B)의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄에서 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되고 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체된다.

일 실시양태에서 다중특이적 항체는 (B)의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄에서 (오직) 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체된다.

일 실시양태에서 다중특이적 항체는 (B)의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄에서 (오직) 불변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체된다.

본 발명에 따라, 경쇄와 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 "잘못된" 중쇄의 짝짓기오류로 인한 목적하지 않은 부산물에 비해 목적한 다중특이적 항체의 비(도 3 참조)는 중쇄 및 경쇄(HC/LC)의 오직 하나의 쌍 중 특정 도메인을 대체시켜 개선될 수 있다. 반면에, 2개의 전장 HC/LC 쌍 중 첫 번째는 본질적으로 변화되지 않고 남겨지고, 2개의 전장 HC/LC 쌍 중 두 번째는 하기 대체로 개질된다:

- 경쇄 : 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 상기 항체의 가변 중쇄 도메인 VH에 의한 가변 경쇄 도메인 VL의 대체, 및/또는 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 상기 항체의 불변 중쇄 도메인 CH1에 의한 불변 경쇄 도메인 CL의 대체, 및

- 중쇄 : 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 상기 항체의 가변 경쇄 도메인 VL에 의한 가변 중쇄 도메인 VH의 대체, 및/또는 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 상기 항체의 불변 경쇄 도메인 CL에 의한 불변 중쇄 도메인 CH1의 대체.

따라서, 본 발명에 따라 생성된 다중특이적 항체는 하기를 포함하는 인공 항체이다:

(A)(a) 제 1 항원 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄, 및

(b) 제 3 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄

를 포함하고, (제 3 항원에 특이적으로 결합하는 항체의) 상기 경쇄는 VL 대신에 가변 도메인 VH를 함유하고/하거나 CL 대신에 불변 도메인 CH1을 함유하고, (제 3 항원에 특이적으로 결합하는 항체의) 상기 중쇄는 VH 대신에 가변 도메인 VL을 함유하고/하거나 CH1 대신에 불변 도메인 CL을 함유하거나;

(B)(a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄, 및

(b) 제 2 항원 및 제 3 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄

를 포함하고, (제 2 항원 및 제 3 항원에 특이적으로 결합하는 항체의) 상기 경쇄는 VL 대신에 가변 도메인 VH를 함유하고/하거나 CL 대신에 불변 도메인 CH1을 함유하고, (제 2 항원 및 제 3 항원에 특이적으로 결합하는 항체의) 상기 중쇄는 VH 대신에 가변 도메인 VL을 함유하고/하거나 CH1 대신에 불변 도메인 CL을 함유하거나;

(C)(a) 제 1 항원 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄, 및

(b) 제 3 항원 및 제 4 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄

를 포함하고, (제 3 항원 및 제 4 항원에 특이적으로 결합하는 항체의) 상기 경쇄는 VL 대신에 가변 도메인 VH를 함유하고/하거나 CL 대신에 불변 도메인 CH1을 함유하고, (제 3 항원 및 제 4 항원에 특이적으로 결합하는 항체의) 상기 중쇄는 VH 대신에 가변 도메인 VL을 함유하고/하거나 CH1 대신에 불변 도메인 CL을 함유한다.

본 발명의 추가의 양상에서, 목적하지 않은 부산물에 비해 목적한 2가 다중특이적 항체의 상기 개선된 비는 삼중특이적 또는 사중특이적 항체 내의 제 1 항원 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 상기 전장 항체의 CH3 도메인의 개질에 의해 추가로 개선될 수 있다.

따라서, 본 발명의 일 바람직한 실시양태에서 본 발명에 따른 (중쇄 및 개질된 중쇄 중) 상기 삼중특이적 또는 사중특이적 항체의 CH3 도메인은 예를 들면, 국제특허출원공개 제 96/027011 호, 문헌[Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9(1996) 617-621] 및 문헌[Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16(1998) 677-681]에 여러 예로 상세하게 기재된 "크놉-대-홀" 기법으로 변경될 수 있다. 이 방법에서, 2개의 CH3 도메인의 교차 표면이 변경되어 이러한 2개의 CH3 도메인을 함유하는 중쇄 모두의 헤테로이량체화를 증가시킨다. (2개의 중쇄의) 2개의 CH3 도메인 중 하나는 "크놉"일 수 있는 반면, 다른 하나는 "홀"이다. 또한, 이황화 가교의 도입은 헤테로이량체를 안정화시키고(문헌[Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16(1998) 677-681]; 문헌[Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270(1997) 26-35]), 수율을 증가시킨다.

따라서, 본 발명의 일 양상에서 상기 삼중특이적 또는 사중특이적 항체는 또한 (a)의 전장 항체의 중쇄의 CH3 도메인 및 (b)의 전장 항체의 개질된 중쇄의 CH3 도메인이 항체 CH3 도메인 사이의 원래의 계면을 포함하는 계면에서 서로 만나고,

상기 계면이 삼중특이적 또는 사중특이적 항체의 형성을 촉진하도록 변경되고, 이때

(i) 삼중특이적 또는 사중특이적 항체 내의 다른 중쇄의 CH3 도메인의 원래의 계면과 만나는 한 중쇄의 CH3 도메인의 원래의 계면 내에서, 아미노산 잔기가 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체됨으로써, 다른 중쇄의 CH3 도메인의 계면 내의 공동에 위치할 수 있는 돌출부가 한 중쇄의 CH3 도메인의 계면 내에서 발생되도록 한 중쇄의 CH3 도메인이 변경되고;

바람직하게는, 보다 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 상기 아미노산 잔기는 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)으로 구성된 군으로부터 선택된다.

바람직하게는, 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 상기 아미노산 잔기는 알라닌(A), 세린(S), 쓰레오닌(T) 및 발린(V)으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 한 양상에서, 두 CH3 도메인 사이의 이황화 가교가 형성될 수 있도록 각각의 CH3 도메인의 상응하는 위치에서 아미노산으로서 시스테인(C)을 도입함으로써 두 CH3 도메인을 추가로 변경시킨다.

바람직한 일 실시양태에서 삼중특이적 또는 사중특이적 항체는 "크놉 쇄"의 CH3 도메인 내의 T366W 돌연변이, 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인 내의 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함한다. 예를 들면, Y349C 돌연변이를 "크놉 쇄"의 CH3 도메인 내로 도입하고 E356C 돌연변이 또는 S354C 돌연변이를 "홀 쇄"의 CH3 도메인 내로 도입함으로써 CH3 도메인 사이의 추가 쇄간 이황화 가교도 사용할 수 있다(문헌[Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681]).

따라서, 또 다른 바람직한 실시양태에서 삼중특이적 또는 사중특이적 항체는 2개의 CH3 도메인 중 하나의 CH3 도메인 내에 Y349C 및 T366W 돌연변이를 포함하고, 상기 2개의 CH3 도메인 중 다른 CH3 도메인 내에 E356C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함하거나, 삼중특이적 또는 사중특이적 항체는 2개의 CH3 도메인 중 하나의 CH3 도메인 내에 Y349C 및 T366W 돌연변이를 포함하고, 상기 2개의 CH3 도메인 중 다른 CH3 도메인 내에 S354C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함한다(카바트의 EU 지수에 따른 넘버링). 그러나, 유럽 특허출원 제1 870 459 A1호에 기재된 다른 크놉-대-홀 기법도 대안적으로 또는 추가적으로 이용될 수 있다. 삼중특이적 또는 사중특이적 항체에 대한 바람직한 예는 "크놉 쇄"의 CH3 도메인 내의 R409D, K370E 돌연변이 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인 내의 D399K, E357K 돌연변이이다(언제나 카바트의 EU 지수에 따른 넘버링).

또 다른 바람직한 실시양태에서 삼중특이적 또는 사중특이적 항체는 "크놉 쇄"의 CH3 도메인 내의 T366W 돌연변이, 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인 내의 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함하고, "크놉 쇄"의 CH3 도메인 내의 R409D, K370E 돌연변이 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인 내의 D399K, E357K 돌연변이를 추가로 포함한다.

또 다른 바람직한 실시양태에서 삼중특이적 또는 사중특이적 항체는 2개의 CH3 도메인 중 하나의 CH3 도메인 내의 Y349C 및 T366W 돌연변이, 및 상기 CH3 도메인 중 다른 CH3 도메인 내의 S354C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함하거나, 상기 삼중특이적 또는 사중특이적 항체는 2개의 CH3 도메인 중 하나의 CH3 도메인 내의 Y349C 및 T366W 돌연변이, 및 상기 CH3 도메인 중 다른 CH3 도메인 내의 S354C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함하고, "크놉 쇄"의 CH3 도메인 내의 R409D, K370E 돌연변이 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인 내의 D399K, E357K 돌연변이를 추가로 포함한다.

일 실시양태에서 다중특이적 항체는,

(A) 제 1 항원이 인간 HER1이고, 제 2 항원이 인간 HER3이고, 제 3 항원이 인간 HER2이거나;

(B) 제 1 항원이 인간 HER2이고, 제 2 항원이 인간 HER1이고, 제 3 항원이 인간 HER3이다.

일 실시양태에서 다중특이적 항체는 서열번호 4, 9, 13 및 18의 아미노산 서열을 포함한다.

일 실시양태에서 다중특이적 항체는 2가 삼중특이적 항체이고,

(a) 인간 HER1 및 인간 HER3에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 경쇄 및 중쇄, 및

(b) 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄

를 포함하고, 이때 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체된다.

일 실시양태에서 인간 HER1, 인간 HER3 및 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 2가 삼중특이적 항체는 서열번호 4, 9, 13 및 18의 아미노산 서열을 포함한다.

일 실시양태에서 인간 HER1, 인간 HER3 및 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 2가 삼중특이적 항체는 서열번호 4, 9, 13 및 18의 아미노산 서열을 포함하고, 항체는 하기 특징을 갖는다:

i) 항체는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 KD 1.7E-08 [M]의 친화성을 갖는 인간 HER1(엑토도메인 ECD)에 결합한다;

ii) 항체는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 KD 4.4E-09 [M]의 친화성을 갖는 인간 HER2(엑토도메인 ECD)에 결합한다;

iii) 항체는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 KD 1.8E-09 [M]의 친화성을 갖는 인간 HER2(엑토도메인 ECD)에 결합한다;

iv) 항체는 동시에 인간 HER1 및 인간 HER2에 결합하거나, 동시에 인간 HER3 및 인간 HER2에 결합할 수 있다.

일 실시양태에서 인간 HER1, 인간 HER3 및 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 2가 삼중특이적 항체는 서열번호 4, 9, 13 및 18의 아미노산 서열을 포함하고, 항체는 하기 특징 중 하나 이상을 갖는다:

i) 항체는 50 ㎍/㎖의 농도에서 85% 이상 MDA-MB-175 유방암 세포의 성장을 억제한다;

ii) 항체는 30 ㎍/㎖의 농도에서 50% 이상 (HER1을 발현하는) A431 상피암 세포의 성장을 억제한다;

iii) 항체는 A431 상피암 세포 중 ADCC를 유도함으로써 2.5 시간 이내에 암 세포의 약 100%를 제거한다.

일 실시양태에서 인간 HER1, 인간 HER3 및 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 2가 삼중특이적 항체는 서열번호 4, 9, 13 및 18의 아미노산 서열을 포함하고, 이때 항체는 Asn297(카밧에 따른 넘버링)에서 당쇄로 글리코실화되고, 상기 당쇄 내의 푸코스의 양은 65% 이하이다(또다른 실시양태에서 상기 당쇄 내의 푸코스의 양은 5% 내지 65%이고, 일 실시양태에서 20% 내지 40%이다).

일 실시양태에서 다중특이적 항체는 서열번호 4, 10, 13 및 19의 아미노산 서열을 포함한다.

용어 "전장 항체"는 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄로 이루어진 항체를 나타낸다(도 1 참조). 전장 항체의 중쇄는 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 불변 중쇄 도메인 1(CH1), 항체 힌지 영역(HR), 항체 중쇄 불변 도메인 2(CH2) 및 항체 중쇄 불변 도메인 3(CH3)의 N-말단에서 C-말단 방향으로 이루어진 폴리펩티드(VH-CH1-HR-CH2-CH3으로서 약칭됨)이고; 임의적으로 하위부류 IgE의 항체의 경우 항체 중쇄 불변 도메인 4(CH4)이다. 바람직하게는 전장 항체의 중쇄는 VH, CH1, HR, CH2 및 CH3의 N-말단에서 C-말단 방향으로 이루어진 폴리펩티드이다. 전장 항체의 경쇄는 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL)의 N-말단에서 C-말단 방향으로 이루어진 폴리펩티드(VL-CL로서 약칭됨)이다. 항체 경쇄 불변 도메인(CL)은 κ(카파) 또는 λ(람다)일 수 있다. 전장 항체 쇄는 CL 도메인과 CH1 도메인 사이(즉, 경쇄와 중쇄 사이) 및 전장 항체 중쇄의 힌지 영역 사이에 상호-폴리펩티드 이황화 가교를 통해 함께 연결된다. 전형적인 전장 항체의 예는 천연 항체, 예컨대 IgG(예를 들면, IgG1 및 IgG2), IgM, IgA, IgD 및 IgE이다. 본 발명에 따른 전장 항체는 단일 종, 예를 들면, 인간으로부터일 수 있거나, 상기 항체는 키메라된 또는 인간화된 항체이다.

본 발명에 따른 전장 항체는 VH 및 VL의 쌍으로 형성된 각각의 2개의 항원 결합 부위를 포함하고, 이는 모두 (a) 1개의 단일 항원, 또는 (b) 2개의 상이한 항원에 특이적으로 결합한다(하기 참조). 상기 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단은 상기 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에서 마지막 아미노산을 나타낸다.

2개의 상이한 항원(예를 들면, 제 1 항원 및 제 2 항원, 또는 제 3 항원 및 제 4 항원)에 특이적으로 결합하는 전장 항체(또는 전장 항체의 경쇄 및 중쇄)는 예를 들면, 참고로서 본원에 모두 혼입된 국제특허출원공개 제 2008/027236 호, 제 2010/108127 호 및 문헌[Bostrom, J., et al., Science 323(2009) 1610-1614]에 기재된 바와 같은 기법을 이중 특이성에 도입하기 위해 전장 항체의 가변 중쇄 및 경쇄 도메인 VH 및 CL을 다양화하여 수득될 수 있다. 예를 들면, 제 1 항원 및 제 2 항원에 결합하는 이중 특이성을 갖는 생성된 VH 및 VL은 본 발명에 따른 다중특이성의 1개의 아암에서 사용될 수 있는 반면, 다른 아암은 제 3 항원(또는 제 3 항원 및 제 4 항원)에 특이적이다. 다양화된 VL 및 VH가 동시에 제 1 에피토프 및 제 2 에피토프에 결합할 수 있거나 상호 배타적으로 예를 들면, VEGF/HER2, VEGF-A/HER2, HER2/DR5, VEGF-A/PDGF, HER1/HER2, CD20/BR3, VEGF-A/VEGF-C, VEGF-C/VEGF-D, TNF-α/TGF-베타, TNF-α/IL-2, TNF-α/IL-3, TNF-α/IL-4, TNF-α/IL-5, TNF-α/IL-6, TNF-α/IL-8, TNF-α/IL-9, TNF-α/IL-10, TNF-α/IL-11, TNF-α/IL-12, TNF-α/IL-13, TNF-α/IL- 14, TNF-α/IL-15, TNF-α/IL-16, TNF-α/IL-17, TNF-α/IL-18, TNF-α/IL-19, TNF-α/IL-20, TNF-α/IFN-α, TNF-α/CD4, VEGF/IL-8, VEGF/MET, VEGFR/MET 수용체, HER2/Fc, HER2/HER3, HER1/HER2, HER1/HER3, EGFR/HER4, TNF-α/IL-3, TNF-α/IL-4, IL-13/CD40L, IL4/CD40L, TNF-α/ICAM-1, TNFR1AL-IR, TNFR1/IL-6R 및 TNFR1/IL-18R로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "결합 부위" 또는 "항원 결합 부위"는 리간드(예를 들면, 이의 항원 또는 항원 단편)가 실제로 결합하고 항체로부터 유도된(또는 이중특이적 전장 항체의 경우 2개의 리간드, 예를 들면 제 1 및 제 2 항원 결합) 항체 분자의 영역을 의미한다. "항원 결합 부위"는 VH/VL의 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 쌍을 포함한다.

목적한 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위는 (a) 항원에 대하여 공지된 항원으로부터, 또는 (b) 특히 항원 단백질 또는 핵산 또는 이의 단편을 사용하는 드노보 면역화 방법에 의해, 또는 파지 디스플레이에 의해 수득된 신규한 항체 또는 항체 단편으로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, 제 1 항원 및 제 2 항원에 결합하는 이중 특이적 항체를 목적한 경우, 제 1 항원에 결합하는 수득된 항체의 VH 및 VL은 참고로서 본원에 모두 혼입된 국제특허출원공개 제 2008/027236 호, 제 2010/108127 호 및 문헌[Bostrom, J., et al., Science 323(2009) 1610-1614]에 기재된 바와 같이 개질되어야 한다/다양화되어야 한다.

본 발명의 항체의 항원 결합 부위는 항원에 대한 결합 부위의 친화성에 다양하게 기여하는 6개의 상보성 결정 영역(CDR)을 함유한다. 3개의 중쇄 가변 도메인 CDR(CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 및 3개의 경쇄 가변 도메인 CDR(CDRL1, CDRL2 및 CDRL3)이 존재한다. CDR 및 골격 영역(FR)의 규모는 상기 영역이 서열들 사이의 가변성에 따라 정의되어 있는 아미노산 서열의 축적된 데이터베이스와의 비교에 의해 측정된다. 보다 적은 CDR로 구성된 기능성 항원 결합 부위(즉, 결합 특이성이 3개, 4개 또는 5개의 CDR에 의해 결정됨)도 본 발명의 범위 내에 포함된다.

항체 특이성은 항원의 특정 에피토프에 대한 항체의 선택적인 인식을 지칭한다. 예를 들면, 천연 항체는 단일특이성이다. 이중특이적 항체는 2개의 상이한 항원-결합 특이성을 갖는 항체이다. 삼중특이적 항체는 3개의 상이한 항원-결합 특이성을 갖는 본 발명에 따른 항체이다. 본 발명에 따른 사중특이적 항체는 4개의 상이한 항원-결합 특이성을 갖는 항체이다.

항체가 하나 이상의 특이성을 갖는 경우, 인식된 에피토프는 단일 항원, 또는 하나 이상의 항원과 연관될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "단일특이성" 항체는 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 각각의 하나 이상의 결합 부위를 갖는 항체를 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "원자가"는 항체 분자 중 결합 부위의 특정한 수의 존재를 나타낸다. 예를 들면, 천연 항체 또는 본 발명에 따른 전장 항체는 2개의 결합 부위를 갖고 2가이다. 일 실시양태에서 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 2가이다. 일 실시양태에서 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 2가 삼중특이적 또는 2가 사중특이적이다.

본 발명의 전장 항체는 하나 이상의 면역글로불린 부류의 면역글로불린 불변 영역이다. 면역글로불린 부류는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 이소타입을 포함하고, IgG 및 IgA의 경우, 이의 하위유형을 포함한다. 바람직한 실시양태에서 본 발명의 전장 항체는 IgG 유형 항체의 불변 도메인 구조를 갖는다.

본원에서 사용된 용어 "단일클론 항체" 또는 "단일클론 항체 조성물"은 단일 아미노산 조성물의 항체 분자 제제를 지칭한다.

용어 "키메라 항체"는 통상적으로 재조합 DNA 기법에 의해 제조된, 하나의 공급원 또는 종으로부터 유래된 가변 영역, 즉 결합 영역, 및 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 항체를 지칭한다. 뮤린 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메라 항체가 바람직하다. 본 발명에 의해 포괄되는 "키메라 항체"의 다른 바람직한 형태는 본 발명에 따른 특성, 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합과 관련된 특성을 발생시키도록 불변 영역이 모 항체의 불변 영역으로부터 변형되어 있거나 변화되어 있는 키메라 항체이다. 이러한 키메라 항체는 "부류 전환된 항체"로도 지칭된다. 키메라 항체는 면역글로불린 가변 영역을 코딩하는 DNA 분절, 및 면역글로불린 불변 영역을 코딩하는 DNA 분절을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 생성물이다. 보편적인 재조합 DNA 기법 및 유전자 형질감염 기법을 수반하는 키메라 항체의 제조 방법은 당업계에서 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855], 미국특허 제 5,202,238 호 및 제 5,204,244 호를 참조한다.

용어 "인간화된 항체"는 골격 또는 "상보성 결정 영역(CDR)"이 모 면역글로불린의 특이성에 비해 상이한 특이성을 갖는 면역글로불린의 CDR을 포함하도록 변형되어 있는 항체를 지칭한다. 바람직한 실시양태에서 뮤린 CDR을 인간 항체의 골격 영역 내로 이식하여 "인간화된 항체"를 제조한다. 예를 들면, 문헌[Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327] 및 문헌[Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270]을 참조한다. 본 발명에 의해 포괄되는 "인간화된 항체"의 다른 형태는 본 발명에 따른 특성, 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합과 관련된 특성을 발생시키도록 불변 영역이 모 항체의 불변 영역으로부터 추가로 변형되어 있거나 변화되어 있는 인간화된 항체이다.

본원에서 사용된 용어 "인간 항체"는 인간 생식세포주 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 인간 항체는 당업계의 기술 수준에서 잘 공지되어 있다(문헌[van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374]). 인간 항체는 면역화 시 내인성 면역글로불린 생성의 부재 하에 인간 항체의 전체 레파토리 또는 선택된 항체를 생성할 수 있는 형질전환 동물(예를 들면, 마우스) 내에서도 생성될 수 있다. 이러한 생식세포주 돌연변이체 마우스 내로의 인간 생식세포주 면역글로불린 유전자 분석의 전달은 항원 공격 시 인간 항체를 생성할 것이다(예를 들면, 문헌[Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555], 문헌[Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258], 및 문헌[Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40] 참조). 또한, 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리 내에서도 생성될 수 있다(문헌[Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388]; 문헌[Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597]). 콜(Cole)과 그의 동료들 및 보에르너(Boerner)와 그의 동료들의 기법들도 인간 단일클론 항체의 제조를 위해 이용될 수 있다(문헌[Cole, et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss (1985) p.77]; 및 문헌[Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95]). 본 발명에 따른 키메라 항체 및 인간화된 항체에 대해 이미 언급된 바와 같이, 본원에서 사용된 용어 "인간 항체"는 예를 들면, "부류 전환", 즉 Fc 부분의 변경 또는 돌연변이(예를 들면, IgG1에서 IgG4로의 돌연변이 및/또는 IgG1/IgG4 돌연변이)에 의해 본 발명에 따른 특성, 특히 C1q 결합 및/또는 FcR 결합과 관련된 특성을 발생시키도록 불변 영역에서 변형되어 있는 이러한 항체도 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 모든 인간 항체들, 예컨대, 숙주 세포, 예컨대, NS0 또는 CHO 세포로부터 단리되거나 인간 면역글로불린 유전자에 대한 형질전환 동물(예를 들면, 마우스)로부터 단리된 항체, 또는 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현시킨 항체를 포함하기 위한 것이다. 이러한 재조합 인간 항체는 재배열된 형태로 가변 영역 및 불변 영역을 갖는다. 본 발명에 따른 재조합 인간 항체는 생체내 체세포 과다돌연변이에 이용되었다. 따라서, 재조합 항체의 VH 영역 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식세포주 VH 및 VL 서열로부터 유래되거나 상기 서열과 관련되어 있지만 생체내 인간 항체 생식세포주 레파토리 내에서 천연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.

본원에서 사용된 "가변 도메인"(경쇄의 가변 도메인(VL) 및 중쇄의 가변 도메인(VH))은 항체와 항원의 결합에 직접적으로 관여하는 경쇄와 중쇄로 구성된 각각의 쌍을 의미한다. 가변 인간 경쇄 및 중쇄의 도메인은 동일한 일반 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 골격(FR) 영역들을 포함하고, 이 영역들의 서열들은 넓게 보존되어 있고 3개의 "초가변 영역"(또는 상보성 결정 영역, CDR)에 의해 연결되어 있다. 상기 골격 영역들은 β-시트 입체구조를 채택하고, CDR은 β-시트 구조를 연결하는 루프를 형성할 수 있다. 각각의 쇄 내의 CDR들은 골격 영역들에 의해 그들의 3차원적 구조를 유지하고 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역은 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화성에 있어서 특히 중요한 역할을 수행하므로 본 발명의 추가 양태를 제공한다.

본원에서 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "항체의 항원 결합 부분"은 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기들을 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터 유래된 아미노산 잔기를 포함한다. "골격" 또는 "FR" 영역은 본원에서 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 영역이다. 따라서, 항체의 경쇄 및 중쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각각의 쇄 상의 CDR은 이러한 골격 아미노산에 의해 분리된다. 특히, 중쇄의 CDR3은 항원 결합에 가장 많이 기여하는 영역이다. CDR 및 FR 영역은 문헌[Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Publication No. 91-3242, Bethesda, MD (1991)]의 표준 정의에 따라 결정된다.

본원에서 사용된 용어 "결합"/"특이적으로 결합하는 것"/"특이적으로 결합하는"은 정제된 야생형 항원을 사용하는 시험관내 분석, 바람직하게는 플라스몬 공명 분석(비아코어(BIAcore), 지이 헬쓰케어(GE healthCare), 스웨덴 웁살라 소재)에서 항원의 에피토프와 항체의 결합을 지칭한다. 결합 친화성은 용어 k_a(항체/항원 복합체로부터의 항체의 결합을 위한 속도 상수), k_D(해리 상수) 및 K_D(k_D/k_a)에 의해 정의된다. 일 실시양태에서 결합 또는 특이적 결합은 10^-8 mol/ℓ 이하, 바람직하게는 10^-9 내지 10^-13 mol/ℓ의 결합 친화성(K_D)을 의미한다.

따라서, 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 바람직하게는 10^-8 mol/l 미만, 바람직하게는 10^-9 내지 10^-13 mol/l의 결합 친화성(K_D)을 갖는 특이적인 각각의 항원에 특이적으로 결합한다.

용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩티드 결정인자를 포함한다. 일부 실시양태에서 에피토프 결정인자는 분자의 화학적 활성 표면 기, 예컨대, 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설폰일을 포함하고, 일부 실시양태에서 특이적 3차원적 구조적 특징 및/또는 특이적 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 영역이다.

특정 실시양태에서 항체는, 항체가 단백질 및/또는 거대분자의 복합체 혼합물에서 그의 표적 항원을 우선적으로 인식하는 경우, 항원에 특이적으로 결합한다고 기재된다.

추가 실시양태에서 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 상기 전장 항체가 인간 IgG1 하위부류, 또는 돌연변이 L234A 및 L235A를 갖는 인간 IgG1 하위부류인 것이다. 추가 실시양태에서 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 상기 전장 항체가 인간 IgG2 하위부류인 것이다. 추가 실시양태에서 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 상기 전장 항체가 인간 IgG3 하위부류인 것이다. 추가 실시양태에서 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 상기 전장 항체가 인간 IgG4 하위부류, 또는 추가 돌연변이 S228P 및 L235E을 갖는 인간 IgG4 하위부류인 것이다. 일 실시양태에서 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 상기 전장 항체가 인간 IgG1 하위부류, 또는 추가 돌연변이 S228P를 갖는 인간 IgG4 하위부류인 것이다.

본원에서 본 발명에 따른 다중특이적 항체가 개선된 특징, 예컨대 생물학적 또는 약리학적 활성, 약동학적 특성 또는 독성을 가짐을 발견하였다. 상기 항체는 예를 들면, 암과 같은 질병의 치료를 위해 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "불변 영역"은 가변 영역 이외의 항체의 도메인 전부를 의미한다. 불변 영역은 항원의 결합에 직접적으로 관여하지 않지만 다양한 이펙터 기능을 나타낸다. 항체는 그들의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라 부류 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 분류되고, 이들 중 여러 부류가 하위부류, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 항체의 상이한 부류들에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다. 모든 5종의 항체 부류들에서 발견될 수 있는 경쇄 불변 영역(CL)은 κ(카파) 및 λ(람다)로 지칭된다.

본원에서 사용된 용어 "인간 기원으로부터 유래된 불변 영역"은 하위부류 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 인간 항체의 불변 중쇄 영역, 및/또는 불변 경쇄 카파 또는 람다 영역을 의미한다. 이러한 불변 영역은 당업계의 기술 수준에서 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 카밧(Kabat, E.A.)에 의해 기재되어 있다(예를 들면, 문헌[Johnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218] 및 문헌[Kabat, E.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788] 참조).

IgG4 하위부류의 항체들이 감소된 Fc 수용체(FcγRIIIa) 결합을 보이지만, 다른 IgG 하위부류의, 항체들은 강력한 결합을 보인다. 그러나, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297(Fc 탄수화물의 상실), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 및 His435는 변경되는 경우, 감소된 Fc 수용체 결합도 제공하는 잔기이다(문헌[Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604], 문헌[Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119], 문헌[Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324] 및 유럽특허 제 0 307 434 호).

일 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 IgG1 항체에 비해 감소된 FcR 결합을 갖는다. 따라서, 전장 모 항체는 FcR 결합과 관련하여 S228, L234, L235 및/또는 D265에서 돌연변이를 갖고/갖거나 PVA236 돌연변이를 함유하는 IgG4 하위부류 또는 IgG1 또는 IgG2 하위부류의 항체이다. 일 실시양태에서 전장 모 항체 중 돌연변이는 S228P, L234A, L235E 및/또는 PVA236이다. 또다른 실시양태에서 전장 모 항체 중 돌연변이는 IgG4에서 S228P 및 L235E이고, IgG1에서 L234A 및 L235A이다.

항체의 불변 영역은 ADCC(항체-의존 세포-매개된 세포독성) 및 CDC(보체-의존 세포독성)에 직접 수반된다. 보체 활성(CDC)은 대부분의 IgG 항체 하위부류의 불변 영역에 보체 인자 C1q를 결합하여 개시된다. 항체에 C1q의 결합은 소위 말하는 결합 부위에서 정의된 단백질-단백질 상호작용에 의해 야기된다. 상기 불변 영역 결합 부위는 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127(1981) 2555-2560], 문헌[Bunkhouse, R. and Cobra, J.J., Mol. Immunol. 16(1979) 907-917], 문헌[Burton, D.R., et al., Nature 288(1980) 338-344], 문헌[Thomason, J.E., et al., Mol. Immunol. 37(2000) 995-1004], 문헌[Idiocies, E.E., et al., J. Immunol. 164(2000) 4178-4184], 문헌[Hearer, M., et al., J. Virol. 75(2001) 12161-12168], 문헌[Morgan, A., et al., Immunology 86(1995) 319-324] 및 유럽특허 제 0 307 434 호에 기재되어 있다. 상기 불변 영역 결합 부위는 예를 들면, 아미노산 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329(카밧의 EU 지수에 따른 넘버링)이다.

"EU 넘버링 시스템" 또는 "(카밧에 따른) EU 지수"는 일반적으로 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 잔기 도는 위치를 지칭할 때 사용된다(예를 들면, EU 지수는 참고로서 본원에 명백하게 혼입된 문헌[Kabat, E.A., et al., Sequence of proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health Publication No. 91-3242, Bethesda, MD(1991)]에 보고되었다).

용어 "항체-의존 세포의 세포독성(ADCC)"은 효과기 세포의 존재하에 본 발명에 따른 항체에 의한 인간 표적 세포의 용해를 지칭한다. ADCC는 바람직하게는 항원 발현 세포의 제제를 효과기 세포, 예컨대 신선하게 단리된 PBMC 또는 연막(buffy coat), 예컨대 단핵구 또는 천연 살해(NK) 세포, 또는 영구적으로 성장하는 NK 세포주로부터 정제된 효과기 세포의 존재하에 본 발명에 따른 항체로 처리하여 측정된다.

용어 "보체-의존 세포독성(CDC)"은 대부분의 IgG 항체 하위부류의 Fc 부분에 대한 보체 인자 C1q의 결합에 의해 개시된 과정을 나타낸다. 항체에 C1q의 결합은 소위 말하는 결합 부위에서 정의된 단백질-단백질 상호작용에 의해 야기된다. 상기 Fc 부분 결합 부위는 당해 분야에 공지되어 있다(상기 참조). 상기 Fc 부분 결합 부위는 예를 들면, 아미노산 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329(카밧의 EU 지수에 따른 넘버링)이다. 하위부류 IgG1, IgG2 및 IgG3의 항체는 일반적으로 C1q 및 C3 결합을 비롯한 보체 활성을 나타내지만, IgG4는 보체 시스템을 활성화하지 않고, C1q 및/또는 C3 결합을 하지 않는다.

단클론 항체의 세포-매개된 효과기 작용은 문헌[Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17(1999) 176-180] 및 미국특허 제 6,602,684 호에 기재된 바와 같이 이의 이의 올리고당 성분을 조작하여 강화될 수 있다. 가장 통상적으로 사용된 치료 항체인 IgG1 유형 항체는 각각의 CH2 도메인의 Asn297에서 보존된 N-연결된 글리코실화를 갖는 당단백질이다. Asn297에 부착된 2개의 복합 바이안테너리 올리고당은 CH2 도메인 사이에 매립되어, 폴리펩티드 주쇄와 광범위한 접촉을 형성하고, 이의 존재는 효과기 작용, 예컨대 항체 의존 세포의 세포독성(ADCC)을 매개하기 위해 항체에 필수적이다(문헌[Lifely, M., R., et al., Glycobiology 5(1995) 813-822], 문헌[Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163(1998) 59-76], 문헌[Wright, A., and Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15(1997) 26-32]). 문헌[Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17(1999) 176-180] 및 국제특허출원공개 제 99/54342 호는 항체의 시험관내 ADCC 활성을 유의하게 증가시키는 이등분한 올리고당의 형성을 촉매화하는 글리코실트랜스퍼라아제인 β(1,4)-N-아세틸글루코사민일트랜스퍼라아제 III("GnTIII")의 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현을 나타낸다. Asn297의 조성물에서 변화는 탄수화물의 또는 이의 제거가 또한 FcγR 및 C1q에 대한 결합에 영향을 끼친다(문헌[Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17(1999) 176-180], 문헌[Davies, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 74(2001) 288-294], 문헌[Mimura, Y., et al., J. Biol. Chem. 276(2001) 45539-45547], 문헌[Radaev, S., et al., J. Biol. Chem. 276(2001) 16478-16483], 문헌[Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276(2001) 6591-6604], 문헌[Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 277(2002) 26733-26740] 및 문헌[Simmons, L.C., et al., J. Immunol. Methods 263(2002) 133-147]).

단클론 항체의 세포-매개된 효과기 작용을 강화하기 위한 방법은 예를 들면, 국제특허출원공개 제 2005/018572 호, 제 2006/116260 호, 제 2006/114700 호, 제 2004/065540 호, 제 2005/011735 호, 제 2005/027966 호, 제 1997/028267 호, 미국특허 제 2006/0134709 호, 제 2005/0054048 호, 제 2005/0152894 호, 국제특허출원공개 제 2003/035835 호, 제 2000/061739 호에 보고되었다.

본 발명의 일 바람직한 실시양태에서, 삼중특이적 또는 사중특이적 항체는 (항체가 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위부류의 Fc 부분, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG3 하위부류의 Fc 부분을 포함하는 경우) Asn297에서 당으로 글리코실화되고, 이때 상기 당쇄 내의 푸코스의 양은 65% 이하이다(카밧에 따른 넘버링). 또다른 실시양태에서 상기 당쇄 내의 푸코스의 양은 5% 내지 65%, 바람직하게는 20% 내지 40%이다. 또다른 실시양태에서 상기 당쇄 내의 푸코스 양은 0% 사이이다. 본 발명에 따른 "Asn297"은 Fc 영역 중 약 위치 297에 위치된 아미노산 아스파라긴을 의미한다. 항체의 주요하지 않은 서열 변이에 기초하여, Asn297은 또한 위치 297의 업스트림 또는 다운스트림, 즉, 위치 294와 300 사이의 일부 아미노산(일반적으로 ±3 아미노산을 초과하지 않음)에 위치될 수 있다. 일 실시양태에서 본 발명에 따른 글리코실화된 항체는 인간 IgG1 하위부류, 돌연변이 L234A 및 L235A를 갖는 인간 IgG1 하위부류, 또는 IgG3 하위부류이다. 추가 실시양태에서 N-글리코실뉴라민산(NGNA)의 양은 상기 당쇄 내의 1% 미만이고/이거나, N-말단 α-1,3-갈락토스의 양은 상기 당쇄 내의 1% 미만이다. 당쇄는 바람직하게는 CHO 세포에서 재조합적으로 발현된 항체의 Asn297에 부착된 N-연결된 글리칸의 특징을 나타낸다.

용어 "당쇄는 CHO 세포에서 재조합적으로 발현된 항체의 Asn297에 부착된 N-연결된 글리칸의 특징을 나타낸다"는 본 발명에 따른 전장 모 항체의 Asn297에서 당쇄가 예를 들면, 국제특허출원공개 제 2006/103100 호에 보고된 바와 같이 개질되지 않은 CHO 세포에서 발현된 동일한 항체의 푸코스 잔기를 제외하고 동일한 구조 및 당 잔기 서열을 가짐을 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "NGNA"는 당 잔기 N-글리코실뉴라민산을 나타낸다.

인간 IgG1 또는 IgG3의 글리코실화는 Asn297에서 2개 이하의 Gal 잔기로 종결된 코어 푸코실화된 바이안테너리 복합 올리고당 글리코실화로서 발생한다. IgG1 또는 IgG3 하위부류의 인간 불변 중쇄 영역은 문헌[Kabat, E.A., et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health Publication No. 91-3242, Bethesda, MD(1991)], 문헌[Bruggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166(1987) 1351-1361], 및 문헌[Love, T.W., et al., Methods Enzymol. 178(1989) 515-527]에 상세하게 보고되어 있다. 이들 구조는 말단 Gal 잔기의 양에 따라 G0, G1(α-1,6- 또는 α-1,3-), 또는 G2 글리칸 잔기로서 지칭된다(문헌[Raju, T.S., Bioprocess Int. 1(2003) 44-53]). 항체 Fc 부분의 CHO 유형 글리코실화는 예를 들면, 문헌[Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14(1997) 201-207]에 기재되어 있다. 비-당개질된 CHO 숙주 세포에서 재조합적으로 발현된 항체는 일반적으로 85% 이상의 양으로 Asn297에서 푸코실화된다. 전장 모 항체의 개질된 올리고당은 하이브리드 또는 착체일 수 있다. 바람직하게는 이등분된 감소된/비-푸코실화된 올리고당은 하이브리드이다. 또다른 실시양태에서, 이등분된 감소된/비-비-푸코실화된 올리고당은 착체이다.

본 발명에 따라 "푸코스의 양"은 MALDI-TOF 질량 분석으로 측정되고 평균 값으로서 계산된 Asn297에 부착된 모든 당구조(예를 들면, 착체, 하이브리드 및 고-만노스 구조)의 합과 관련된, Asn297에서 당쇄 내의 상기 당의 양을 의미한다. 푸코스의 상대량은 MALDI-TOF에 의해 N-글리코시다아제 F로 처리된 샘플 중 동정된 모든 당구조(예를 들면, 각각 착제, 하이브리드 및 올리고- 및 고-만노스 구조)에 관한% 푸코스-함유 구조이다.

본 발명에 따른 항체는 재조합 수단에 의해 제조된다. 따라서, 본 발명의 한 양상은 본 발명에 따른 항체를 코딩하는 핵산이고, 추가 양상은 본 발명에 따른 항체를 코딩하는 상기 핵산을 포함하는 세포이다. 재조합 생성 방법은 당업계의 기술 수준에서 널리 공지되어 있고 원핵세포 또는 진핵세포 내에서 단백질을 발현시키는 단계, 후속적으로 항체를 단리하는 단계 및 통상적으로 약학적으로 허용가능한 순도까지 정제하는 단계를 포함한다. 숙주 세포 내에서 전술된 바와 같은 항체를 발현시키기 위해, 각각의 변형된 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 핵산을 표준 방법으로 발현 벡터 내로 삽입한다. 발현은 적절한 원핵 또는 진핵 숙주 세포, 예컨대, CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, PER.C6 세포, 효모 또는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포 내에서 수행되고, 항체는 세포(용해 후 상청액 또는 세포)로부터 회수된다. 항체의 일반적인 재조합 제조 방법은 당업계의 기술 수준에서 잘 공지되어 있고 예를 들면, 평론 문헌[Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202]; 문헌[Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282]; 문헌[Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161]; 문헌[Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880]에 기재되어 있다.

본 발명에 따른 삼중특이적 또는 사중특이적 항체는 보편적인 면역글로불린 정제 절차, 예를 들면, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지로부터 적절하게 분리된다. 단일클론 항체를 코딩하는 DNA 및 RNA는 보편적인 절차의 이용에 의해 용이하게 단리되고 시퀀싱된다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA 및 RNA의 공급원으로서 사용될 수 있다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터 내로 삽입한 후, 상기 발현 벡터를 달리 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포, 예컨대, HEK293 세포, CHO 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜 상기 숙주 세포 내에서 재조합 단일클론 항체의 합성을 수득할 수 있다.

삼중특이적 또는 사중특이적 항체의 아미노산 서열 변이체(또는 돌연변이체)는 적절한 뉴클레오티드 변화를 항체 DNA 내로 도입하여 제조하거나, 뉴클레오티드 합성을 통해 제조한다. 그러나, 이러한 변형은 매우 한정된 범위, 예를 들면 상기 기재된 바와 같은 범위 내에서만 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 전술된 항체 특징, 예컨대, IgG 동종형 및 항원 결합을 변경시키지 않지만 재조합 제조의 수율 또는 단백질 안정성을 개선시킬 수 있거나 정제를 촉진할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "숙주 세포"는 본 발명에 따른 항체를 발생시키기 위해 개조될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템을 의미한다. 일 실시양태에서 HEK293 세포 및 CHO 세포가 숙주 세포로서 사용된다. 본원에서 사용된 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고, 모든 이러한 명칭들은 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 전달의 횟수와 관계없이 일차 대상체 세포 및 이로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한, 모든 자손들은 의도적 돌연변이 또는 우연한 돌연변이로 인해 DNA 함량 면에서 정확히 동일하지 않을 수 있다는 것도 이해된다. 형질전환된 모 세포에서 스크리닝된 기능 또는 생물학적 활성과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손이 포함된다. 별개의 명칭이 의도되는 경우, 이는 본원으로부터 명백할 것이다.

NS0 세포 내에서의 발현은 예를 들면, 문헌[Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123] 및 문헌[Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270]에 기재되어 있다. 일시적 발현은 예를 들면, 문헌[Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9]에 기재되어 있다. 가변 도메인의 클로닝은 문헌[Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837], 문헌[Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289] 및 문헌[Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87]에 기재되어 있다. 바람직한 일시적 발현 시스템(HEK293)은 문헌[Schlaeger, E.-J., and Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83] 및 문헌[Schlaeger, E.-J., J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199]에 기재되어 있다.

원핵세포에 적합한 조절 서열은 예를 들면, 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 인핸서 및 폴리아데닐화 신호를 사용하는 것으로 공지되어 있다.

핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 놓여 있을 때 "작동가능하게 연결"되어 있다. 예를 들면, 전구-서열 또는 분비 리더에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구-단백질로서 발현되는 경우 상기 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되어 있고, 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있고, 리보좀 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치된 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 일반적으로, "작동가능하게 연결"은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 존재하고 분비 리더의 경우 인접하여 판독 프레임으로 존재한다는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접하여 존재할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 라이게이션(ligation)에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(adaptor) 또는 연결기가 보편적인 관행에 따라 사용된다.

항체의 정제는 알칼리/SDS 처리, CsCl 결합, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계에서 잘 공지된 기타 방법을 포함하는 표준 기법들을 이용하여, 세포 성분 또는 다른 오염물질, 예를 들면, 다른 세포 핵산 또는 단백질을 제거하기 위해 수행된다. 문헌[Ausubel, F., et al., (ed). Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)]을 참조한다. 다양한 방법들, 예컨대, 미생물 단백질을 사용하는 친화성 크로마토그래피(예를 들면, 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피(예를 들면, 양이온 교환(카복시메틸 수지), 음이온 교환(아미노 에틸 수지) 및 혼합 방식 교환), (예를 들면, 베타-머캡토에탄올 및 다른 SH 리간드를 사용하는) 티오필릭(thiophilic) 흡착, (예를 들면, 페닐-세파로스, 아자-아레노필릭(aza-arenophilic) 수지 또는 m-아미노페닐보론산을 사용하는) 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피, (예를 들면, Ni(II)-친화성 및 Cu(II)-친화성 물질을 사용하는) 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 전기영동 방법(예컨대, 겔 전기영동, 모세관 전기영동)이 잘 확립되어 있고 단백질 정제를 위해 널리 이용되고 있다(문헌[Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102]).

본 발명의 한 양상은 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물이다. 본 발명의 또 다른 양상은 약학 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도이다. 본 발명의 추가 양상은 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물의 제조 방법이다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 약학 담체와 함께 제제화된 본 발명에 따른 항체를 함유하는 조성물, 예를 들면, 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시양태는 암의 치료를 위한 본 발명에 따른 다중특이적 항체이다.

본 발명의 또 다른 양상은 암의 치료를 위한 약학 조성물이다.

본 발명의 또 다른 양상은 암 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도이다.

본 발명의 또 다른 양상은 본 발명에 따른 항체를 암 치료가 필요한 환자에게 투여하여 암을 앓는 환자를 치료하는 방법이다.

본원에서 사용된 "약학 담체"는 생리학적으로 상용가능한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제, 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 (예를 들면, 주사 또는 관주에 의한) 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 상피 투여에 적합하다.

본 발명의 조성물은 당업계에서 공지된 다양한 방법들에 의해 투여될 수 있다. 당업자에 의해 인식될 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 화합물을 일부 투여 경로로 투여하기 위해, 상기 화합물을 그의 불활성화를 방지하는 물질로 코팅하거나 상기 화합물을 그의 불활성화를 방지하는 물질과 함께 공투여할 필요가 있을 수 있다. 예를 들면, 적절한 담체, 예를 들면, 리포좀 또는 희석제 중의 상기 화합물을 대상체에게 투여할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 희석제는 식염수 및 완충제 수용액을 포함한다. 약학 담체는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 약학 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에서 공지되어 있다.

본원에서 사용된 어구 "비경구 투여" 및 "비경구 투여된"은 통상적으로 주사에 의한 장 투여 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 제한 없이 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관내, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 관주를 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "암"은 증식성 질환, 예컨대, 림프종, 림프구성 백혈병, 폐암, 비소세포폐암(NSCL), 세기관지세포폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 영역의 암, 위장암, 위암, 결장암, 유방암, 자궁암, 난관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육아종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신장세포암종, 신우암종, 중피종, 간세포암, 담관암, 중추신경계(CNS)의 신생물, 척추 종양, 뇌간아교종, 다형성아교모세포종, 성상아교세포종, 슈반세포종(schwanoma), 뇌실막종, 수모세포종, 수막종, 편평세포암종, 뇌하수체선종 및 유윙(Ewings) 육종(상기 암들 중 임의의 암의 난치성 버전, 또는 상기 암들 중 하나 이상의 암의 조합을 포함함)을 지칭한다.

이들 조성물은 보조제, 예컨대, 방부제, 습윤화제, 유화제 및 분산제도 함유할 수 있다. 미생물의 존재 예방은 상기 멸균 절차, 및 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등의 포함에 의해 보장될 수 있다. 등장화제, 예컨대, 당, 염화나트륨 등을 상기 조성물 내에 포함시키는 것도 바람직할 수 있다. 또한, 흡수를 지연시키는 물질, 예컨대, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 주사가능한 약학 제형의 연장된 흡수를 야기할 수 있다.

선택된 투여 경로와 관계없이, 적합한 수화된 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물 및/또는 본 발명의 약학 조성물은 당업자에게 공지된 보편적인 방법에 의해 약학적으로 허용가능한 투약 제형으로 제형화된다.

본 발명의 약학 조성물에서 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성을 나타내지 않으면서 구체적인 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 요구되는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 변경될 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 구체적인 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용될 구체적인 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 사용되는 구체적인 조성물과 조합 사용되는 다른 약제, 화합물 및/또는 물질, 치료될 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 과거 병력, 및 의학 분야에서 잘 공지된 기타 요인들을 포함하는 다양한 약동학적 요인들에 의해 좌우될 것이다.

조성물은 멸균되어야 하고 조성물이 주사기에 의해 전달될 수 있을 정도의 유동성을 나타내어야 한다. 물 이외에, 담체는 바람직하게는 등장성 완충 식염수 용액이다.

적절한 유동성은 예를 들면, 코팅제, 예컨대, 레시틴의 사용, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우, 등장화제, 예를 들면, 당, 폴리알코올, 예컨대, 만니톨 또는 소르비톨, 및 염화나트륨을 상기 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "형질전환"은 벡터/핵산이 숙주 세포 내로 전달되는 과정을 지칭한다. 강력한 세포벽 장벽을 갖지 않은 세포가 숙주 세포로서 사용되는 경우, 형질감염은 예를 들면, 문헌[Graham, and Van der Eh, Virology 52 (1978) 549ff]에 기재된 바와 같은 인산칼슘 침전 방법에 의해 수행된다. 그러나, DNA를 세포 내로 도입하는 다른 방법, 예를 들면, 핵 주입 또는 원형질체 융합도 이용될 수 있다. 원핵세포 또는 실질적인 세포벽 구축물을 함유하는 세포가 사용되는 경우, 예를 들면, 하나의 형질감염 방법은 문헌[Cohen, F.N., et al., PNAS. 69 (1972) 7110 et seq]에 기재된 바와 같은 염화칼슘을 사용하는 칼슘 처리이다.

본원에서 사용된 "발현"은 핵산이 mRNA로 전사되는 과정, 및/또는 전사된 mRNA(전사체로도 지칭됨)가 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 후속적으로 번역되는 과정을 지칭한다. 전사체 및 코딩된 폴리펩티드는 유전자 생성물로서 총칭된다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래된 경우, 진핵세포 내에서의 발현은 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.

"벡터"는 삽입된 핵산 분자를 숙주 세포 내로 및/또는 숙주 세포 사이에 전달하는 핵산 분자, 특히 자가 복제하는 핵산 분자이다. 상기 용어는 주로 세포 내로의 DNA 또는 RNA의 삽입(예를 들면, 염색체 삽입)을 위해 작용하는 벡터, 주로 DNA 또는 RNA의 복제를 위해 작용하는 복제 벡터, 및 DNA 또는 RNA의 전사 및/또는 번역을 위해 작용하는 발현 벡터를 포함한다. 기재된 작용 중 하나 초과의 작용을 제공하는 벡터도 포함된다.

"발현 벡터"는 적절한 숙주 세포 내로 도입되는 경우 폴리펩티드로 전사되고 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드이다. "발현 시스템"은 통상적으로 원하는 발현 생성물을 제공하도록 기능할 수 있는 발현 벡터를 포함하는 적합한 숙주 세포를 지칭한다.

또한 본 발명의 추가 양상은,

(b) 제 3 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 경쇄 및 중쇄; 또는

(b) 제 2 항원 및 제 3 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 경쇄 및 중쇄; 또는

(b) 제 3 항원 및 제 4 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 경쇄 및 중쇄

를 포함하는 다중특이적 항체이고, 이때 중쇄의 N-말단은 펩티드 연결기를 통해 경쇄의 C-말단에 연결된다.

본원에서 사용된 용어 "펩티드 연결기"는 바람직하게는 합성 유래의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 의미한다. 본 발명에 따른 이들 펩티드는 펩티드 연결기를 통해 경쇄의 C-말단을 (제 2 항원에 특이적으로 결합하는) 제 2 전장 항체의 중쇄의 N-말단에 연결하는 데에 사용된다. 제 2 전장 항체 중쇄 및 경쇄 내의 펩티드 연결기는 30개 이상의 아미노산으로 이루어진 길이, 바람직하게는 32 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다. 일 실시양태에서 펩티드 연결기는 32 내지 40개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다. 일 실시양태에서 상기 연결기는 (G_xS)_nG_m이고, 이때 G는 글리신이고, S는 세린이고, x는 3이고, n은 8, 9 또는 10이고, m은 0, 1, 2 또는 3이거나, x는 4이고, n은 6, 7 또는 8이고, m은 0, 1, 2 또는 3이고; 바람직하게는 x는 4이고, n은 6 또는 7이고, m은 0, 1, 2 또는 3이고; 보다 바람직하게는 x는 4이고, n은 7이고, m은 2이다. 일 실시양태에서 상기 연결기는 (G₄S)₆G₂이다.

이러한 다중특이적 항체의 일 실시양태는 실시예 표 1: 서열번호 4, 11 및 13의 아미노산 서열을 포함하는 삼중특이적 HER1/HER3-scFab-IGF1R에 제공된다.

하기 실시예, 서열목록 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되고, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 특허청구범위 내에 기재되어 있다. 본 발명의 사상을 벗어나지 않으면서 전술된 절차를 변형시킬 수 있다는 것이 이해될 것이다.

아미노산 서열의 설명

서열번호 1: HC/크놉/HER2/VEGF

서열번호 2: HC/홀/HER2/VEGF

서열번호 3: HC/크놉/HER1/HER3

서열번호 4: HC/홀/HER1/HER3

서열번호 5: HC/홀/xAng2

서열번호 6: HC/크놉/xAng2

서열번호 7: HC/홀/xIGF1R

서열번호 8: HC/홀/xHER3

서열번호 9: HC/홀/xHER2

서열번호 10: HC/홀/xcMet

서열번호 11: HC/홀/scFabIGF1R

서열번호 12: HC/홀/xHER1/HER3

서열번호 13: LC/HER1/HER3

서열번호 14: LC/HER2/VEGF

서열번호 15: LC/xAng2

서열번호 16: LC/xIGF1R

서열번호 17: LC/xHER3

서열번호 18: LC/xHER2

서열번호 19: LC/xcMet

서열번호 20: LC/xHER1/HER3

하기에서 본 발명의 실시양태가 열거된다:

1. (A)(a) 제 1 항원 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 경쇄 및 중쇄, 및

를 포함하는 2가 삼중특이적 또는 사중특이적 항체인, 다중특이적 항체.

2. 제 1 실시양태에 있어서,

항체가 2가 삼중특이적 또는 사중특이적 항체인 다중특이적 항체.

3. 제 1 실시양태에 있어서,

항체가 삼중특이적이고,

를 포함하는, 다중특이적 항체.

4. 제 3 실시양태에 있어서,

(A)에서 제 1 항원이 인간 HER1이고, 제 2 항원이 인간 HER3이고, 제 3 항원이 인간 HER2이거나;

(B)에서 제 1 항원이 인간 HER2이고, 제 2 항원이 인간 HER1이고, 제 3 항원이 인간 HER3인, 다중특이적 항체.

5. 제 1 실시양태에 있어서,

항체가 2가 삼중특이적 항체이고,

(b) 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체된, 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄

를 포함하는, 다중특이적 항체.

6. 제 5 실시양태에 있어서,

항체가 서열번호 4, 9, 13 및 18의 아미노산 서열을 포함하는 다중특이적 항체.

7. 제 3 실시양태에 있어서,

(A)에서 제 1 항원이 인간 HER1이고, 제 2 항원이 인간 HER3이고, 제 3 항원이 인간 cMET이거나;

(B)에서 제 1 항원이 인간 cMET이고, 제 2 항원이 인간 HER1이고, 제 3 항원이 인간 HER3인, 다중특이적 항체.

8. 제 1 항에 있어서,

항체가 사중특이적이고,

를 포함하는, 다중특이적 항체.

9. 제 1 실시양태 내지 제 5 실시양태, 제 7 실시양태 및 제 8 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서,

(B)의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄에서 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되고 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체되는, 다중특이적 항체.

10. 제 1 실시양태 내지 제 5 실시양태, 제 7 실시양태 및 제 8 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서,

(B)의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄에서 (오직) 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되는, 다중특이적 항체.

11. 제 1 실시양태 내지 제 5 실시양태, 제 7 실시양태 및 제 8 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서,

(B)의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄에서 (오직) 불변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되는, 다중특이적 항체.

12. 제 1 실시양태 내지 제 11 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서,

(a)의 전장 항체의 중쇄의 CH3 도메인, 및 (b)의 전장 항체의 개질된 중쇄의 CH3 도메인이 항체 CH3 도메인 사이의 원래의 계면을 포함하는 계면에서 서로 만나고;

(ii) 삼중특이적 또는 사중특이적 항체 내의 제 1 CH3 도메인의 원래의 계면과 만나는 제 2 CH3 도메인의 원래의 계면 내에서, 아미노산 잔기가 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체됨으로써, 제 1 CH3 도메인의 계면 내의 돌출부가 위치할 수 있는 공동이 제 2 CH3 도메인의 계면 내에서 발생되도록 다른 중쇄의 CH3 도메인이 변경되는, 다중특이적 항체.

13. 제 12 실시양태에 있어서,

보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기가 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기가 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T) 및 발린(V)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 다중특이적 항체.

14. 제 12 실시양태 또는 제 13 실시양태에 있어서,

2개의 CH3 도메인 사이에 이황화 가교가 형성될 수 있도록 각 CH3 도메인의 상응하는 위치에서 아미노산으로서 시스테인(C)의 도입에 의해 추가로 변경되는, 다중특이적 항체.

15. (I)(A)(a) 제 1 항원 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 경쇄 및 중쇄, 및

(II) 상기 항체 분자의 합성을 허용하는 조건하에 숙주 세포를 배양하는 단계; 및

(III) 상기 배양물로부터 상기 항체 분자를 회수하는 단계

를 포함하는, 제 1 실시양태 내지 14 실시양태 중 어느 한 실시양태에 따른 다중특이적 항체의 제조 방법.

16. 제 1 실시양태 내지 제 14 실시양태 중 어느 한 실시양태에 따른 다중특이적 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산.

17. 제 1 실시양태 내지 제 14 실시양태 중 어느 한 실시양태에 따른 다중특이적 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터.

18. 제 17 실시양태에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.

19. 제 1 실시양태 내지 제 14 실시양태 중 어느 한 실시양태에 따른 항체의 조성물, 바람직하게는 약학 또는 진단 조성물.

20. 제 1 실시양태 내지 제 14 실시양태 중 어느 한 실시양태에 따른 항체 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물.

21. 제 1 실시양태 내지 제 14 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서,

암의 치료에 사용하기 위한 항체.

22. 암의 치료용 약제의 제조를 위한 제 1 실시양태 내지 제 14 실시양태 중 어느 한 실시양태에 따른 항체의 용도.

23. 제 1 실시양태 내지 제 14 실시양태 중 어느 한 실시양태에 따른 치료 효과량의 항체를 치료를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는, 상기 환자의 치료 방법.

24. 제 1 실시양태 내지 제 14 실시양태 중 어느 한 실시양태에 따른 치료 효과량의 항체를 암을 앓고 있는 환자에게 투여함을 포함하는, 상기 환자의 치료 방법.

실시예

재료 및 방법

재조합 DNA 기법

문헌[Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 기재된 표준 방법을 이용하여 DNA를 조작하였다. 제조자의 지시에 따라 분자생물학적 시약들을 사용하였다.

DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이타 관리

인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드에 관한 일반적인 정보는 문헌[Kabat, E.A., et al., Sequence of proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health Publication No 913242, Bethesda (1991)]에 주어진다. 항체 쇄의 아미노산은 EU 넘버링에 따라 넘버링된다(문헌[Edelman, G.M., et al., PNAS 63 (1969) 78-85]; 문헌[Kabat, E.A., et al., Sequence of proteins of Immunological Interest, 5th ed., NIH Publication No 91-3242 (1991)]). 서열 생성, 맵핑, 분석, 주석 및 예시를 위해 GCG(제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 소프트웨어 팩키지 버전 10.2 및 인포맥스(Infomax) 벡터 NTI 어드반스 스위트 버전 8.0을 사용하였다.

DNA 서열

세퀴서브(SequiServe, 독일 바테르스테텐 소재) 및 젠아트 아게(Geneart AG, 독일 레겐스부르크 소재)에서 수행된 이중 가닥 서열로 DNA 서열을 측정하였다.

유전자 시퀀싱

자동화된 유전자 합성에 의한 합성 올리고뉴클레오티드 및 PCR 생성물로부터 젠아트 아게(독일 레겐스부르크 소재)에 의해 목적한 유전자 분절을 제조하였다. 하나의 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위에 의해 측면 배치된 유전자 분절을 pGA18(ampR) 플라스미드로 클로닝하였다. 플라스미드 DNA를 형질전환된 세균으로부터 정제하고 UV 분광법으로 농도를 측정하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 서열을 DNA 서열로 확인하였다.

발현 플라스미드의 구성

발현 플라스미드를 암호화하는 모든 중쇄 및 경쇄의 구성을 위해 로슈(Roche) 발현 벡터를 사용하였다. 벡터는 하기 원소로 구성된다:

- 선택 마커로서 하이그로마이신 내성 유전자;

- 앱스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus; EBV)의 복제 기원인 oriP;

- 에스케리키아 콜라이에서 상기 플라스미드를 복제시키는 벡터 pUC18로부터의 복제 기원;

- 에스케리키아 콜라이에서 암피실린 내성을 부여하는 β-락타마아제 유전자;

- 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)로부터의 즉각적인 초기 인핸서 및 프로모터; 및

- 인간 1-면역글로불린 폴리아데닐화("폴리 A") 신호 서열.

중쇄 또는 경쇄 뿐만 아니라 CH-CL 교차를 갖는 크로스맵 구성물을 포함하는 면역글로불린 유전자를 유전자 합성에 의해 제조하고 기재된 바와 같은 pGA18(ampR) 플라스미드로 클로닝하였다. 가변 중쇄 구성물을 cds의 5' BamHI 업스트림 및 CH1 도메인에 위치된 3' KpnI 제한 부위를 사용하는 방향성 클로닝에 의해 구성하였다. 가변 경쇄 구성물을 VL 및 CL을 포함하는 유전자 합성에 의해 정렬하고 cds의 5' BamHI 업스트림 및 정지 코돈의 다운스트림에 위치된 3' XbaI 제한 부위를 사용하는 방향성 클로닝에 의해 구성하였다. 크로스맵 항체를 완전 암호화 서열(VL-CH1 또는 VH-CL-CH2-CH3)의 유전자 합성 또는 암호화 서열 중 독특한 제한 부위를 사용한 부분적 유전자 합성에 의해 구성하였다. 교차된 경쇄(VL-CH1)의 경우, 5' BamHI 및 3' XbaI 제한 부위를 갖는 전체 cds를 포괄하는 유전자 합성만을 정렬하였다. 중쇄 벡터의 CH2 도메인에서 독특한 3' XhoI 제한 부위만을 갖는 중쇄 구성물을 5' BamHI 제한 부위 갖는 방향성 클로닝에 사용하였다. 최종 발현 벡터를 에스케리키아 콜라이 세포로 형질전환시키고, 발현 플라스미드 DNA를 단리하고(미니프렙(Miniprep)), 제한 효소 분석 및 DNA 시퀀싱에 이용하였다. 정확한 클론을 LB-Amp 배지(150 ㎖)에서 배양하고, 다시 플라스미드 DNA를 단리하고(미니프렙) 서열 무결성을 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.

HEK293 세포에서 면역글로불린 변이체의 일시적 발현

재조합 면역글로불린 변이체를 제조자(인비트로겐(Invitrogen), 미국 소재)의 설명서에 따라 프리스타일(FreeStyle: 상표) 293 발현 시스템을 사용하여 인간 배아 신장 293-F 세포를 일시적 형질감염하여 발현시켰다. 소 규모 실험 발현을 위해, 0.5 x 10⁶ HEK293F 세포/㎖(30 ㎖)를 형질감염 하루 전에 시딩하였다. 다음 날, 플라스미드 DNA(배양 부피 ㎖ 당 DNA ㎍)를 옵티(Opti)-MEM(등록상표) I 환원 혈청 배지(1.2 ㎖, 인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)와 혼합한 후 추가 293펙틴(Fectin: 상표) 형질감염 시약(40 ㎕, 인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)을 첨가하였다. 혼합물을 15 분 동안 실온에서 항온처리하고, 세포에 적가하였다. 형질감염 후 1 일째에, 각각의 플라스크를 L-글루타민(300 ㎕, 200 mM, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 독일 스타인하임 소재) 및 L-아스파라긴, HyPep 1510, 암모늄-Fe(III) 시트레이트, 에타놀아민, 미량 원소, D-글루코스, RDMI 무함유 프리스타일 배지를 함유하는 공급물7(600 ㎕)을 공급하였다. 형질감염 후 3 일째에, 자동화된 세포 생존력 분석기(바이-셀(Vi-CELL: 상표) XR, 베크만 코울터(Beckman Coulter), 미국 캘리포니아주 풀러톤 소재) 및 글루코스 미터(아쿠-첵(Accu-CHEK: 등록상표) 센서 컴포트(로슈 디아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH), 독일 만하임 소재)를 사용하여 배지의 세포 농도, 생존력 및 글루코스 농도를 측정하였다. 또한 각각의 플라스크에 L-글루타민(300 ㎕), 비-필수 아미노산 용액(300 ㎕, 판(PAN: 상표), 바이오테크(Biotech), 독일 아이덴바흐 소재), 나트륨 피루베이트(300 ㎕, 100 mM, 깁코(Gibco), 인비트로겐), 공급물7(1.2 ㎖) 및 5 g/L까지의 글루코스(D-(+)-글루코스 용액(45%, 시그마)를 공급하였다. 최종적으로, 형질감염 후 6 일째에, 항체를 X3R 멀티퓨즈(Multifuge)(헤라에우스(Heraeus), 영국 버킹엄셔 소재)에서 3500 rpm으로 15 분 동안 상온에서 원심분리하여 모으고, 상청액을 스테리플립(Steriflip) 필터 장치(0.22 mm 밀리포어 익스프레스 플러스(Millipore Express PLUS) PES 막, 밀리포어(Millipore), 미국 매사추세츠주 베드포드 소재)를 통해 멸균 여과하고 추가 사용할 때까지 -20℃에서 저장하였다.

이중특이적 항체 및 대조군 항체의 정제

단백질 A-세파로스(상표)(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재)를 사용하는 친화성 크로마토그래피 및 수퍼덱스200 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 세포 배양물 상청액으로부터 2가 삼중특이적 또는 사중특이적 항체 및 대조군 항체를 정제하였다. 요약하건대, 멸균 여과된 세포 배양물 상청액을 PBS 완충제(10 mM Na₂HPO₄, 1 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4)에 의해 평형화된 하이트랩 단백질 A HP 컬럼(5 ㎖)에 적용하였다. 비결합된 단백질을 평형화 완충제로 세척하였다. 항체 및 항체 변이체를 0.1 M 시트레이트 완충제(pH 2.8)로 용출하고, 단백질 함유 분획을 1 M 트리스(0.1 ㎖, pH 8.5)로 중화시켰다. 용출된 단백질 분획을 모으고 아미콘 울트라 원심분리 필터 장치(MWCO: 30 K, 밀리포어)로 3 ㎖의 부피까지 농축하고, 완충제(20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0)에 의해 평형화된 수퍼덱스200 하이로드(HiLoad) 120 ㎖ 16/60 겔 여과 컬럼(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재) 상에 적재하였다. 정제된 이중특이적 항체 및 대조군 항체를 5% 고분자량 응집체 미만으로 함유하는 분획을 모으고 -80℃에서 1.0 mg/㎖ 분취액으로서 저장하였다.

단백질 정량

단백질을 미리 패킹된 포로스(Poros: 등록상표)A 단백질 A 컬럼(어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems), 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)이 장착된 자동화된 울티메이트(Ultimate) 3000 시스템(디오넥스(Dionex), 독일 이드스타인 소재)을 사용하여 친화성 크로마토그래피로 정량하였다. 모든 샘플을 완충액 A(0.2 M Na₂HPO₄ㆍ[2H₂O], pH 7.4)에 로딩하고 완충액 B(0.1 M 시트르산, 0.2 M NaCl, pH 2.5)로 용리하였다. 단백질 농도를 측정하기 위해, 모든 샘플에 대하여 1.62의 흡광 계수를 사용하였다.

정제된 단백질의 분석

정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 광학 밀도(OD) 280 nm에서 측정하여 결정하였다. 이중특이적 항체 및 대조군 항체의 순도 및 분자량을 환원제(5 mM 1,4-다이티오트레이톨)의 존재 및 부재하에 SDS-PAGE로 분석하고, 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색하였다. 누페이지(NuPAGE: 등록상표) 겔 시스템(인비트로겐, 미국 소재)을 제조자의 설명서(4 내지 20% 트리스-글리신 겔)에 따라 사용하였다. 이중특이적 항체 샘플 및 대조군 항체 샘플의 응집물 함량을 25℃에서 200 mM KH₂PO₄, 250 mM KCl, pH 7.0 영동 완충액 중 수퍼덱스(Superdex) 200 분석 크기-배제 컬럼(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재)을 사용하여 고성능 SEC로 분석하였다. 단백질(25 ㎍)을 0.5 ㎖/분의 유속으로 컬럼 위에 주입하고 50 분에 걸쳐서 등용매 용리하였다. 환원된 이중특이적 항체 경쇄 및 중쇄의 아미노산 주쇄의 무결성을 펩티드-N-글리코시다아제 F(로슈 몰레큘라 바이오케미칼스(Roche Molecular Biochemicals))로 효소 처리하여 N-글리칸을 제거한 후 나노전기분무(NanoElectrospray) Q-TOF 질량 분석에 의해 검증하였다.

소 규모 분석을 위한 면역침강법

단백질(30 ㎍)을 5% 트윈(Tween: 등록상표)20(PBST, pH 7.4, 플루카 애날리티칼(Fluka Analytical), 독일 스타인하임 소재)이 보충된 PBS에서 모든 샘플에 대한 총 반응 부피가 동일하도록 희석하였다. 다이나비드(Dynabead: 등록상표) 단백질 A(126 ㎕; 1 ㎕ 다이나비드 결합력 당 0.24 ㎍ 인간 IgG, 인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)를 첨가하고, 용액을 90 내지 120 분 동안 실온에서 항온처리하고, 자기 비드에 연결된 단백질 A에 인간 IgG Fc를 결합시키기 위해 20 rpm으로 항온처리하였다(1.4 ㎖ 총 반응 부피). 비드를 PBST(1 ㎖)로 3회 세척하고, 30 초 동안 0.4 x g에서 원심분리하여 용액을 튜브 바닥에 모았다. 상청액을 버리고, 다이나비드를 100 mM 시트레이트(30 ㎕, pH 3)(시트르산 일수화물, 시그마)로 항원처리하여 단백질을 용리하였다. 이후 용액을 2 M 트리스(3 ㎕, pH 9)(피셔 사이언티픽(Fisher Scientific))로 중성화하였다.

분석 HPLC

항체를 TSK-겔 G3000SW 겔 여과 컬럼(7.5 mm ID x 30 cm, 토소하스 코포레이션(TosoHaas Corp.), 미국 펜실베니아주 몽고메리힐 소재)이 장착된 아질런트(Agilent) HPLC 1100(아질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies), 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)을 사용하여 분석하였다. 용리된 단백질(18 ㎕)을 완충액 A(300 mM NaCl 중 0.05 M K₂HPO₄/KH₂PO₄, pH 7.5) 중 컬럼 위에 로딩하고 크기에 따라 분리하였다.

환원 및 비-환원 SDS - PAGE

용리된 단백질(7 ㎕)을 2x 샘플 완충액(누페이지(등록상표) LDS 샘플 완충액, 인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)과 혼합하고, 추가 용리된 단백질(7 ㎕)을 10% 환원제(누페이지(등록상표) 샘플 환원제, 인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)를 함유하는 2x 샘플 완충액과 혼합하였다. 샘플을 0℃로 10 분 동안 가열하고, 프리-캐스트 누페이지(등록상표) 4 내지 12% 비스트리스(BisTris) 겔(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재) 위에 로딩하였다. 겔을 45 분 동안 200V 및 125 mA에서 영동하였다. 이후 겔을 밀리포어(Millipore) 물로 3회 세척하고, 심플리블루(SimplyBlue: 상표) 세이프스테인(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)으로 염색하였다. 겔을 밀리포어 물에서 밤새 탈색하였다.

세포주

A431을 4 mM L-글루타민, 0.1 mM 비-필수 아미노산 및 10% 열 비활성 소 태아 혈청(깁코)이 보충된 RPMI 1640 배지(깁코)에서 유지하였다. MDA-MB 175 VII 세포를 글루타맥스(GlutaMax)가 보충된 DMEM/F12 배지(깁코)에서 유지하였다. 세포주의 증식은 표준 세포 배양 프로토콜을 따랐다.

표면 플라즈몬 공명

모든 실험을 비아코어 T100(지이 헬쓰케어)으로 수행하였다. 실험 결과를 T100 대조군 및 평가 소프트웨어 팩키지(지이 헬스케어, v2.03)를 사용하여 분석하였다. 분석 포맷은 CM5-칩 상의 '멀티 사이클 운동' 측정이었다. 분석할 항체를 아민 커플링된 항-인간 IgG-Fc 항체(지이 헬쓰케어 BR-1008-39)를 통해 포획하였다. DAF 및 퍼투주맙을 기준 대조군으로서 사용하였다. 농도 시리즈를 사용하여, 각 항원(인간 HER1, HER2 및 HER3 엑토도메인)의 7개 증가 농도를 각각 주입하였다. 37℃에서 각각의 MAbs<HerX>에 결합하는 HerX의 운동 특징화: 표준 운동을 비아코어 평가 소프트웨어에 의해 (c = 0 nM 및 FC1 = 블랭크 표면에 대한) 이중 기준을 갖는 랭뮤어 1:1 결합 모델을 사용하여 결합 상 및 분리 상에 대한 표면 플라즈몬 공명 신호의 관찰된 신호 경로를 맞추어 평가하였다. 영동 완충액은 PBST이었다. 희석 완충액은 BSA(c = 1 mg/㎖)를 함유하는 PBST이었다. 약 c = 1 nM, 유속 5 ㎕/분, 시간 72 초의 농도로 유동 세포 2, 3 및 4에서 MAbs<HerX>를 포획하였다. 분석 샘플: 50 ㎕/분의 유속에서 HerX의 7개 증가하는 농도를 180 초 결합 시간 동안 주입하였다(c = 1.23 내지 900 nM, 희석 인자 3). 분리 시간: 1800 초. 각 농도를 중복하여 분석하였다. 각 사이클에 120 초의 접촉 시간 및 50 ㎕/분의 유속으로 3 M MgCl₂(제조업체에서 권장)를 사용한 후 최종 재생을 수행하였다. 동시 결합의 분석: HER2/HER3, HER3/HER2 또는 HER1/HER2를 각각 180 초의 접촉 시간으로 이중 주입 방식을 사용하여 연속하여 주입하였다. 항원 농도를 운동 실험에서 관찰된 바와 같이 포화에서 각 학원에 대하여 선택하였다. 대조군으로서 동일한 항원의 2차 주입은 반응 수준을 올리지 않았고, 평형에 도달되었음을 입증하였다. 분리를 최소화하기 위해 25℃의 온도를 선택하였다. 각 조합에 대하여 삼중으로 측정하였다. 유속 30 ㎖/분, 2개 주입물을 사용한 이중 주입, 각 180 초.

본 발명에 따른 다양한 다중특이적 항체는 개념을 평가하기 위해 고안되었다(하기 표 1 참조). 전형적으로 본 발명에 따른 다양한 다중특이적 항체는 (각각의 서열에서 보여질 수 있는 바와 같이) CH3 도메인에서 크놉-대-홀 개질을 포함한다.

[표 1]

본 발명에 따른 다중특이적 항체의 고안: 수는 서열 목록에서와 같은 서열 수를 나타낸다(x는 경쇄 및 중쇄 CH1 및 CL이 교환되었음을 나타낸다).

[표 1-1]

수는 서열 목록에서와 같은 서열 수를 나타낸다.

실시예 1

크놉-대-홀 VEGF - HER2 DAF (이중 친화성 항체)의 분석

VEGF-HER2-DAF는 종래 문헌에 기재되어 있다(문헌[Bostrom, J., et al., Science 323(2009) 1610-1614]). 크놉-대-홀 기법이 VEGF-HER2-DAF의 발현을 방해하지 않음을 증명하기 위해, 본 발명자들은 이 항체의 중쇄에서 "크놉-대-홀"(KiH) 아미노산 교환을 조작하였다(중쇄 1: T366W; 중쇄 2: T366S, L368A, Y407V). 추가적으로, 이 항체의 CH3 도메인에 이황화 가교를 도입하였다(중쇄 1: S354C; 중쇄 2: Y349C).

초기 실험에서, 3개의 상이한 크놉 중쇄:홀 중쇄 비(K:H 비)를 형질감염시켰다(서열번호 1, 2, 14): K:H=1:1, K:H=1.2:1 및 K:H=1.5:1. 하기 표 2에서, 시험 발현의 상청액 중 IgG 수율을 나타내었다.

[표 2]

VEGF-HER2-DAF 시험 발현의 총 IgG 수율의 완전 항체, 응집물 및 불완전 항체의 분획율(%)(각 피크의% 면적을 통해 계산됨).

VEGF-HER2-DAF 모에 대하여, K:H=1.5:1 비는 가장 높은 IgG 농도를 나타내고, 이후 K:H=1:1 및 K:H=1.2:1(크놉 중쇄:홀 중쇄) 비를 나타내었다. K:H=1.2:1 비에 대하여, 복제물 2는 매우 낮은 IgG 농도를 함유하였다. 이는 아마도 복제물 1의 발현에 사용된 세포에 비해 이 배치의 세포의 낮은 생존력 때문이다. VEGF-HER2-DAF 실험 발현(표 2, 도 6a), 및 환원 및 비-환원 SDS-PAGE(도 6b)의 분석 HPLC는 증가된 크놉 중쇄를 갖는 K:H 비에 비해 K:H=1:1 비에 대한 가장 낮은 부산물 및 가장 많은 양의 목적한 완전 항체를 입증하였다. 크놉 쇄에서 증가는 불완전 항체의 증가와 관련된다. 시험 발현의 분석을 가속화하기 위해, 모든 SDS-PAGE를 오직 살균 여과 및 면역침전에 의해 정제된 상청액으로 수행하였다. 크기-배제 크로마토그래피를 생략하였다. 완전 항체의 크기는 146 kDa이고, 중쇄 글리코실화로 인해 명백하게 더 높은 분자량이 관찰되었다. 분석 HPLC에서, 주요 피크는 약 8.8 분에서 용리되었고, 완전 항체의 예측된 크기에 상응한다(도 6c). 따라서, 본 발명자들은 성공적으로 크놉-대-홀을 사용하여 VEGF-HER2-DAF를 생성할 수 있었다.

실시예 2

KiH VEGF - HER2 DAF - xAng2 의 분석

"크놉-대-홀"(KiH) 개념이 VEGF-HER2-DAF 포맷을 방해하지 않았음을 나타내는 VEGF-HER2-DAF의 분석 후, 본 발명자들은 1개 항체에서 DAF 및 크로스맵 포맷과 함께 제공하는 삼중특이적 항체를 생성하는 것을 목표로 하였다(도 3a 및 3b). 이를 위해 VEGF-HER2-DAF-xAng2 항체는 3개의 크놉 중쇄:홀 중쇄 비(K:H 비) 1:1, 1.2:1 및 1.5:1을 나타내었다(서열번호 1, 5, 14 및 15). 증가하는 크놉 쇄와 함께, 상청액 중 IgG 수율은 감소하는 경향을 나타내었다(표 3).

[표 3]

VEGF-HER2-DAF-xAng2 시험 발현의 총 IgG 수율의 완전 항체, 응집물 및 불완전 항체의 분획율(%)(각 피크의% 면적을 통해 계산됨).

분석 HPLC 및 SDS-PAGE 분석은 K:H=1.5:1이 최고 생성물:부산물 비를 제공함을 입증하였다. 플라스미드를 암호화하는 크놉 쇄의 증가량은 분석 HPLC에서 관찰된 바와 같이 불완전 항체를 덜 야기하였다(도 7a 및 표 3). K:H=1:1 및 K:H=1.2:1 비의 비-환원 SDS-PAGE에서(도 7b), 5개 밴드는 완전 항체, 1개 경쇄 손실 항체, 2 쌍의 중쇄, 불완전 항체 및 아마도 2쌍의 경쇄(각각 146 kDa, 122 kDa, 100 kDa, 73 kDa 및 46 kDa, 글리코실화 없음)를 나타낸다. 특징화는 이론적인 분자량에 기초하였다. 분석 HPLC는 응집물(6.6 분), 완전 항체(8.8 분) 및 추정된 경쇄 이량체(10.5 분, 및 도 7a)에 상응하는 피크를 갖는 본 발견을 확인하였다. VEGF-HER2-DAF 뿐만 아니라 VEGF-HER2-DAF-xAng2는 일시적 발현으로 발현되었고, 정규 항체의 범위로 수득되었다(표 4).

[표 4]

프롯(Prot) A 침전 및 HPLC 정량에 의해 측정된 IgG 농도

실시예 3

KiH HER2 - VEGF DAF - xHER1 - HER3 DAF 의 분석

또한, 1개 항체 포맷 내에 2개 이중-친화성 항체를 혼합하는 것이 가능하다. 이 접근과 함께, 2개 Fab 아암 및 정규 IgG 주쇄를 갖는 사중특이적 항체를 생성하는 것이 본질적으로 가능하다. 크놉-대-홀 기법을 사용하여 중쇄를 구별하고, HER1-HER3 이중 친화성 Fab 아암을 중쇄와 경쇄 사이에 CH1-CL 교환으로 교차시켰다(서열번호 1, 12, 14, 20). 중쇄에 대하여 1.2:1 및 경쇄에 대하여 1:1의 고정된 K:H 비를 사용하였다. 환원 겔에서, 2개의 상이한 경쇄가 (약 25 kDa에서) 구별될 수 있다. 중쇄는 환원 조건하에 약 50 kDa에서 일치한다. 비-환원 조건하에, 약간의 얼룩짐을 전장 항체 밴드(약 150 kDa)에서 관찰할 수 있고, 두번째 우성 밴드를 약 110 kDa에서 볼 수 있다(도 8a 및 8b). 분석 HPLC가 균일한 밴드를 증명하는 바와 같이, 불완전 이황화 가교 형성을 나타낼 수 있다. 추가적으로, 임의의 종래 크기-배제 정제 없이 상청액의 면역침전임이 중요하다. 2개의 독립적인 생물학적 발현에 대한 평균 원시 발현 값은 59.7 ㎍/㎖ 및 111.5 ㎍/㎖이었다.

실시예 4

KiH HER1 - HER3 DAF - xHER2 의 분석

또다른 실시예에서, 본 발명자들은 ErbB 패밀리 원 HER1(EGFR), HER2(ErbB2) 및 HER3(HER3)에 결합할 수 있는 삼중특이적 항체를 생성하였다. 크놉-대-홀 기법을 사용하여 중쇄를 구별하고, HER2 Fab 아암을 중쇄와 경쇄 사이에 CH1-CL 교환으로 교차시켰다(서열번호 4, 9, 13, 18). 중쇄에 대하여 1.2:1 및 경쇄에 대하여 1:1의 고정된 K:H 비를 사용하였다. 환원 겔에서, 2개의 상이한 경쇄를 (약 25 kDa에서) 구별할 수 있다. 2개의 독립적인 발현에서 이 항체의 평균 발현 수율은 91.7 ㎍/㎖ 및 99.1 ㎍/㎖이었다.

실시예 5

KiH HER1 - HER3 DAF - xHER2 를 이용한 증식 분석

상피암 세포주 A431은 높은 수준의 EGFR을 발현할 뿐만 아니라 HER2 및 HER3은 A431 상피암 세포에서 발현된다. 특히 EGFR의 억제가 상기 세포주에서 증식에 영향을 끼침이 공지되어 있다. 삼중특이적 항체 KiH HER1-HER3 DAF-xHER2(서열번호 4, 9, 13 및 18)의 특히 EGFR 부분의 효능을 평가하기 위해, 증식 분석을 치료 항체 또는 대조군 IgG(JI, #015-000-003) 항체의 존재 또는 부재하에 상기 세포주로 수행하였다. 4000개 세포를 1% 소 태아 혈청(FCS)이 보충된 100 ㎕ 성장 배지를 포함하는 96-웰 세포 배양 플레이트의 웰 당 시딩하였다. 다음 날, 치료 항체를 함유하는 혈청 감소된(1% FCS) 배지(20 ㎕)를 첨가하여 최종 농도 30 ㎍/㎖의 항체를 수득하였다. 세포를 추가 5일 동안 성장시켜 ATP 방출 분석(세포 역가 글로, 프로메가)을 수행하였다. 발광을 프레이트 판독기(테칸(TECAN))에 기록하였다. 삼중특이적 항체는 이 세포주에서 53.6±2.7%의 우세한 항-증식 효과를 가졌다(도 10).

실시예 6

KiH HER1 - HER3 DAF - xHER2 를 이용한 증식 분석

유방암 세포주 MDA-MB-175 VII은 ErbB 패밀리 원 HER2 및 HER3을 발현하고 오토크린 헤레구린 루프(autocrine heregulin loop)를 번식한다. 삼중특이적 항체의 HER2 및 HER3 부분의 효능을 평가하기 위해, 상기 세포주에서 증식 분석을 수행하였다. 20,000개 세포를 10% FCS를 함유하는 성장 배지(100 ㎕)를 포함하는 96-웰 세포 배양 플레이트의 웰 당 시딩하였다. 다음 날, 치료 항체를 함유하는 전cp 성장 배지(20 ㎕)를, 최종 항체 농도가 희석 시리즈와 동일한 방식으로 첨가하였다(도 11). 추가 5 일 동안 계속 성장시킨 후, ATP 방출 분석을 수행하였다(세포 역가 글로, 프로메가). 발광을 프레이트 판독기(테칸)에 기록하였다. 삼중특이적 항체는 약물-의존 방식으로 성장이 억제되었고 50 ㎍/㎖에서 92.1±0.3%의 최대 억제에 도달하였다.

실시예 7(또한 도 12a, 12b 및 12c 참조)

KiH HER1 - HER3 DAF - xHER2 의 결합 운동

삼중특이적 항체 KiH HER1-HER3 DAF-xHER2(서열번호 4, 9, 13 및 18)의 결합 운동 또는 각각의 모 항체의 결합 운동을 표면 플라즈몬 공명으로 측정하였다. 이를 위해, HEK-293F에서 생성된 ErbB 수용체 엑토도메인(ECD)을 정제하고 분석물로서 사용하여 친화성 및 동시 결합 특징을 측정하였다. 친화성 데이타는 HER1 ECD, HER2 ECD 및 HER3 ECD에 결합하는 이들의 KiH HER1-HER3 DAF-xHER2, 모 DAF 및 퍼투주맙의 비교가능한 운동 프로필을 분명하게 나타내었다(표 5).

[표 5]

37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 결합 운동

이어서, 본 발명자들은 항원이 수용체 엑토도메인의 연속적 주입에 의해 동시에 결합할 수 있는지에 대한 의문을 설명하였다. 요약하면, 본 발명자들은 KiH HER1-HER3 DAF-xHER2가 동시에 HER1/HER2 또는 HER3/HER2의 항원 조합에 결합할 수 있음을 설명하였다. 반대 순서로 주입된 경우, KiH HER1-HER3 DAF-xHER2가 또한 동시에 항원 주입의 순서로부터 독립적으로 2개 항원과 결합할 수 있는 HER2 및 HER3의 조합을 나타내었다. 퍼투주맙은 예측된 바와 같이 오직 HER2와 결합한다. DAF 항체는 예측된 바와 같이 HER1 또는 HER3과 결합한다(도 12a 내지 12c).

실시예 8(또한 도 13 참조)

A431 상피암 세포에서 KiH HER1 - HER3 DAF - xHER2 항체에 의한 종양 세포 사멸 및 ADCC 유도

삼중특이적 KiH HER1-HER3 DAF-xHER2 항체(서열번호 4, 9, 13 및 18)의 ADCC 과정 및 종양 세포 사멸을 이미지화하기 위해, A431 상피 암종 세포를 유리 커버클라스 상에서 성장시키고 녹색 생존력 마커(CMFDA)로 표지하였다. 다음에, 적색 막 염색(PKH26)으로 염색된 NK92 천연 살해 세포를 3개의 HER 원(HER1, HER2 및 HER3)에 대하여 유도된 항체 KiH HER1-HER3 DAF-xHER2와 함께 종양 세포 상부에 첨가하였다. 가열된 단계 공급 CO₂ 및 습기 상에서 63x/1.2NA 수침 렌즈를 사용하여 LEICA SP5x 백색광 레이저 공초점 현미경으로 이미지화를 수행하였다. 항체/NK 세포를 첨가하자마자 몇 분 이내에, 살해 세포는 종양을 공격하기 시작하였다. 이는 Fc-RIII(CD16) 수용체를 통해 종양이 항체와 결합하는 상호작용에 의해 매개된다. 이는, 세포용해 과립(퍼포린 및 그랜자임을 방출함)이 녹색 형광(= 생존력 마커)의 손실에 의해 입증된 바와 같이 종양 세포의 빠른 용해를 야기하는 종양 세포 표면 쪽으로 어떻게 유도되는지를 분명하게 나타낼 수 있다. 항체의 3중 결합 형태로 매개되는 격렬하고 빠른 공격이 주목할만하다. 2.5 시간 이내에 사실상 전체 종양 매스가 제거되었다. 결과는 도 13에 나타내었다.

실시예 9

KPL -4 또는 A431 종양 세포에서 당조작된 아푸코실화된 삼중특이적 KiH HER1 -HER3 DAF - xHER2 항체(5% 내지 65% 푸코스의 양) 및 시험관내 ADCC(1 ㎍/㎖ specLysis%)

당조작된 아푸코실화된 버전의 항체 KiH HER1-HER3 DAF-xHER2(서열번호 4, 9, 13 및 18)를, HEK293 또는 CHO 세포에서 4:1:1(항체 벡터:GnT-III 발현 벡터:골지 만노시다아제 II 발현 벡터)의 비로 다수의 플라스미드(항체 발현에 대한 플라스미드, 융합 GnTIII 폴리펩티드 발현(GnT-III 발현 벡터)에 대한 플라스미드 및 만노시다아제 II 발현(골지 만노시다아제 II 발현 벡터)에 대한 플라스미드)에 공-형질감염하여 제조하였다.

전체 항체 중쇄 및 경쇄 DNA 서열을 MPSV 프로모터의 조절 및 합성 폴리A 부위의 업스트림하에 포유류 발현 벡터(경쇄에 대한 벡터 및 중쇄에 대한 벡터)로 서브클로닝하였고, 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 갖는다. 항체를 칼슘 포스페이트-형질감염 접근법을 사용하여 HEK293-EBNA 세포 또는 CHO 세포를 항체 중쇄 및 경쇄 발현 벡터로 공-형질감염시켜 생성하였다. 기하급수적으로 성장하는 HEK293-EBNA 세포를 칼슘 포스페이트 방법으로 형질감염시켰다. 당조작된 항체를 생성하기 위해, 세포를 4:1:1(항체 벡터:GnT-III 발현 벡터:골지 만노시다아제 II 발현 벡터)의 비로 다수의 플라스미드(항체 발현에 대한 플라스미드, 융합 GnTIII 폴리펩티드 발현(GnT-III 발현 벡터)에 대한 플라스미드 및 만노시다아제 II 발현(골지 만노시다아제 II 발현 벡터)에 대한 플라스미드)에 공-형질감염시켰다. 세포를 10% FCS로 보충된 DMEM 배양 배지를 사용하여 T 플라스크 내에서 단층 배양을 부착함으로써 성장시키고, 세포가 50 내지 80% 포화상태가 될 때 형질감염시켰다. T150 플라스크의 형질감염을 위해, 1500만 개 세포를 24 시간 시딩한 후 FCS(최종 10% V/V에서)로 보충된 25 ㎖ DMEM 배양 배지에 형질감염시키고, 세포를 37℃에서 5% CO₂ 대기압으로 밤새 항온처리기에서 방치하였다. 생성될 모든 항체를 위해, DNA, CaCl₂ 및 물의 용액을 총 플라스미드 벡터 DNA(188 ㎍, 4:1:1(항체 벡터:GnT-III 발현 벡터:골지 만노시다아제 II 발현 벡터)의 비에서 다수의 플라스미드, 항체 발현에 대한 플라스미드, GnTIII 폴리펩티드 발현(GnT-III 발현 벡터)에 대한 플라스미드 및 만노시다아제 II 발현(골지 만노시다아제 II 발현 벡터)에 대한 플라스미드), 최종 부피의 물(938 ㎕) 및 1 M CaCl₂ 용액(938 ㎕)과 혼합하여 제조하였다. 이 용액에, 50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na₂HPO₄ 용액(1876 ㎕)을 pH 7.05에서 첨가하고, 즉시 10 초 동안 혼합하고, 실온에서 20 초 동안 두었다. 현탁액을 2% FCS가 보충된 DMEM(46 ㎖)으로 희석하고, 기존의 배지 대신에 2개 T150 플라스크에 나눴다.

세포를 37℃, 5% CO₂에서 약 17 내지 20 시간 동안 항온처리한 후, 배지를 10% FCS가 보충된 DMEM(25 ㎖)로 대체하였다. 적합한 배양 배지를 형질감염 후 7 일째에 15 분 동안 210 x g에서 원심분리하여 모으고, 용액을 살균 여과하고(0.22 μm 필터), 0.01% w/v의 최종 농도의 나트륨 아지드를 첨가하고, 4℃에서 유지하였다.

분비된 아푸코실화된 항체를 정제하고, 항체의 Fc 영역에 부착된 올리고당을 예를 들면, MALDI/TOF-MS(예를 들면, 국제특허출원공개 제 2008/077546 호에 기재된 바와 같음)로 분석하였다. 상기 분석을 위해, 올리고당을 PVDF 막 위에 고정된 항체 또는 용액 중 항체와 함께 PNGaseF 소화에 의해 항체로부터 효소적으로 방출하였다. 방출된 올리고당을 함유하는 생성된 소화 용액을 MALDI/TOF-MS 분석으로 직접 제조하거나, EndoH 글리코시다아제로 추가 소화시킨 후 MALDI/TOF-MS 분석으로 샘플을 제조하였다. Asn297에서 당쇄 내의 푸코스의 분석된 양은 65 내지 5%이다.

표적 세포(KPL4 유방암 암종 세포 또는 A431 상피암 세포, RPMI1640 + 2 mM L-알라닐-L-글루타민 + 10% FCS에서 배양)를 급속 생장기에서 트립신/EDTA(깁코 번호 25300-054)로 수집하였다. 세척 단계 및 세포 수 및 생존력 체크 후, 요구된 분취액을 칼세인이 장착된 세포 항온처리기(인비트로겐 번호 C3100MP; 1 바이알을 배지(5 ㎖) 중 5 Mio 세포를 위해 DMSO(50 ㎕)에 재현탁하였다)에서 30 분 동안 37℃에서 표지하였다. 이후, 세포를 AIM-V 배지로 3회 세척하고, 세포 수 및 생존력을 체크하고, 세포 수를 0.3 Mio/㎖로 조정하였다.

반면에, 효과기 세포로서 PBMC(말초 혈액 단핵구 세포)를 제조자의 프로토콜(세척 단계: 각각 10 분 동안 400 g에서 1회 및 350 g에서 2회)에 따라 밀도 구배 원심분리(히스토파크(Histopaque)-1077, 시그마 번호 H8889)에 의해 제조하였다. 세포 수 및 생존력을 체크하고 세포 수를 15 Mio/㎖로 조정하였다.

칼세인-염색된 표적 세포(100 ㎕)를 환저 96-웰 플레이트에 놓고, 희석된 아푸코실화된 항체(50 ㎕; Mab205.10.1, Mab205.10.2, Mab205.10.3, 하기 제조 참조)를 첨가하고, 효과기 세포(50 ㎕)를 첨가하였다. 일부 실험에서, 표적 세포를 10 mg/㎖ 레디뮨(Redimune)의 농도로 레디뮨(등록상표) NF 액체(제트엘비 베흐링(ZLB Behring))와 혼합하였다.

대조군으로서 항체 없이 표적 세포 및 효과기 세포를 공-배양함으로써 측정된 자발적인 용해, 및 오직 표적 세포의 1% 트리톤 X100 용해에 의해 측정된 최대 용해를 제공한다. 플레이트를 가습 세포 항온처리기에서 4 시간 동안 37℃에서 항온처리하였다.

표적 세포의 사멸을 제조자의 설명서에 따른 세포독성 검출 키트(LDH 검출 키트, 로슈 번호 1 644 793)를 사용하여 손상된 세포로부터 LDH(락테이트 데하이드로게나아제) 방출을 측정하여 추정하였다. 요약하면, 각 세포로부터의 상청액(100 ㎕)을 투명한 평편 바닥 96-웰 플레이트에서 키트로부터의 기질(100 ㎕)과 혼합하였다. 기질의 색 반응의 V_최대 값을 10 분 이상 동안 490 nm에서 ELISA로 측정하였다. 특이적 항체-매개된 사멸의 백분율을 하기 식으로 계산하였다:

((A-SR)/(MR-SR)) x 100

상기 식에서,

A는 특이적 항체 농도에서 V_최대의 평균이고, SR은 자발적 방출의 V_최대의 평균이고, MR은 최대 방출의 V_최대의 평균이다.

추가 판독으로서, 온전한 표적 세포를 보레이트 완충액(5 mM 나트륨 보레이트 + 0.1% 트리톤)에 용해하고 형광 플레이트 판독기에서 칼세인 형광을 측정하여 온전한 표적 세포의 칼세인 보유율을 추정하였다.

실시예 10

생체내 항-종양 효능

항체 KiH HER1-HER3 DAF-xHER2(서열번호 4, 9, 13 및 18)의 생체내 항-종양 효능을 SCID 베이지 또는 누드 마우스에 이식된 다양한 종양 기원(예를 들면, 폐암, SCCHN, 유방암 및 췌장암)의 모델에 기초하여 세포 및 단편에서 검출할 수 있다. 일 예는 A431 상피암 세포 이종이식 모델이다.

A431 상피암 세포는 세포 표면에서 HER1, 및 또한 HER2 및 HER3을 발현한다. A431 세포를 대수 생장기에서 표준 세포 배양 조건하에 유지하였다. 10,000 개 세포를 SCID 베이지 마우스에 접종하였다. 종양이 수립된 후 치료를 시작하였고, 100 내지 150 mm³의 크기에 도달하였다. 마우스를 예를 들면, 20 mg/kg의 항체/마우스 로딩 용량으로 처리한 10 mg/kg의 항체/마우스로 1 주일 처리하였다. 종양 부피를 둘째 주에 측정하고, 동물 무게를 동시에 모니터링하였다.

<110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Multispecific antibodies <130> 31005 WO <140> PCT/EP2013/060529 <141> 2013-05-22 <150> EP12169340.2 <151> 2012-05-24 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HC/knob/Her2/VEGF <400> 1 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile 35 40 45 Ser Gly Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Ser Glu Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Val Gly Val Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 145 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Lys Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Val Gly Val Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 210 215 220 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 245 250 255 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 260 265 270 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 275 280 285 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 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Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu 35 40 45 Ser Gly Asp Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Gly Glu Ile Ser Ala Ala Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ser Arg Val Ser Phe Glu Ala Ala Met Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 145 150 155 160 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 180 185 190 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 195 200 205 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 210 215 220 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 225 230 235 240 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 245 250 255 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 260 265 270 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 275 280 285 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 290 295 300 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 305 310 315 320 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 325 330 335 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 340 345 350 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 355 360 365 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 370 375 380 Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 385 390 395 400 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 405 410 415 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 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Leu Thr Lys Asn 370 375 380 Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 385 390 395 400 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 405 410 415 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys 420 425 430 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 435 440 445 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 450 455 460 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 5 <211> 482 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HC/hole/xAng2 <400> 5 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu 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Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser 100 105 110 Lys Trp Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ser Lys 115 120 125 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 130 135 140 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 145 150 155 160 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 165 170 175 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 195 200 205 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 210 215 220 Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 <210> 17 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LC/xHer3 <400> 17 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val 20 25 30 Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val 35 40 45 Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Gln Ser Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 145 150 155 160 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 165 170 175 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 180 185 190 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 195 200 205 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 210 215 220 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 235 <210> 18 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LC/xHer2 <400> 18 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val 35 40 45 Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile 100 105 110 Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser 115 120 125 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 130 135 140 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 145 150 155 160 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 165 170 175 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 180 185 190 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 195 200 205 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 210 215 220 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 <210> 19 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LC/xcMet <400> 19 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 Leu Tyr Thr Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 100 105 110 Cys Gln Gln Tyr Tyr Ala Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 115 120 125 Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 145 150 155 160 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 165 170 175 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 180 185 190 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 195 200 205 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 210 215 220 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 235 <210> 20 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LC/xHer1/Her3 <400> 20 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile 35 40 45 Ala Thr Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Glu Pro 100 105 110 Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser 115 120 125 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 130 135 140 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 145 150 155 160 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 165 170 175 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 180 185 190 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 195 200 205 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 210 215 220 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230

Claims

(A)(a) 제 1 항원 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 경쇄 및 중쇄, 및
(b) 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체된, 제 3 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄; 또는
(B)(a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 경쇄 및 중쇄, 및
(b) 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체된, 제 2 항원 및 제 3 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄; 또는
(C)(a) 제 1 항원 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 경쇄 및 중쇄, 및
(b) 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체된, 제 3 항원 및 제 4 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄
를 포함하는, 2가 삼중특이적 또는 사중특이적 항체인, 다중특이적 항체.
제 1 항에 있어서,
항체가 삼중특이적이고,
(A)(a) 제 1 항원 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 경쇄 및 중쇄, 및
(b) 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체된, 제 3 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄; 또는
(B)(a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 경쇄 및 중쇄, 및
(b) 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체된, 제 2 항원 및 제 3 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄
를 포함하는, 다중특이적 항체.
제 2 항에 있어서,
(A)에서 제 1 항원이 인간 HER1이고, 제 2 항원이 인간 HER3이고, 제 3 항원이 인간 HER2이거나;
(B)에서 제 1 항원이 인간 HER2이고, 제 2 항원이 인간 HER1이고, 제 3 항원이 인간 HER3인, 다중특이적 항체.
제 1 항에 있어서,
항체가 2가 삼중특이적 항체이고,
(a) 인간 HER1 및 인간 HER3에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 경쇄 및 중쇄, 및
(b) 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체된, 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄
를 포함하는, 다중특이적 항체.
제 4 항에 있어서,
항체가 서열번호 4, 9, 13 및 18의 아미노산 서열을 포함하는 다중특이적 항체.
제 3 항에 있어서,
(A)에서 제 1 항원이 인간 HER1이고, 제 2 항원이 인간 HER3이고, 제 3 항원이 인간 cMET이거나;
(B)에서 제 1 항원이 인간 cMET이고, 제 2 항원이 인간 HER1이고, 제 3 항원이 인간 HER3인, 다중특이적 항체.
제 1 항에 있어서,
항체가 사중특이적이고,
(a) 제 1 항원 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 경쇄 및 중쇄, 및
(b) 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체된, 제 3 항원 및 제 4 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄
를 포함하는, 다중특이적 항체.
제 1 항 내지 제 4 항, 제 6 항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
(B)의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄에서 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되고 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체된, 다중특이적 항체.
제 1 항 내지 제 4 항, 제 6 항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
(B)의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄에서 (오직) 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체된, 다중특이적 항체.
제 1 항 내지 제 4 항, 제 6 항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
(B)의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄에서 (오직) 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체된, 다중특이적 항체.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a)의 전장 항체의 중쇄의 CH3 도메인 및 (b)의 전장 항체의 개질된 중쇄의 CH3 도메인이 항체 CH3 도메인 사이의 원래의 계면을 포함하는 계면에서 서로 만나고;
상기 계면이 삼중특이적 또는 사중특이적 항체의 형성을 촉진하도록 변경되고, 이때 상기 변경은,
(i) 삼중특이적 또는 사중특이적 항체 내의 다른 중쇄의 CH3 도메인의 원래의 계면과 만나는 한 중쇄의 CH3 도메인의 원래의 계면 내에서, 아미노산 잔기가 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체됨으로써, 다른 중쇄의 CH3 도메인의 계면 내의 공동(cavity)에 위치할 수 있는 돌출부(protuberance)가 한 중쇄의 CH3 도메인의 계면 내에서 발생되도록 한 중쇄의 CH3 도메인이 변경되고,
(ii) 삼중특이적 또는 사중특이적 항체 내의 제 1 CH3 도메인의 원래의 계면과 만나는 제 2 CH3 도메인의 원래의 계면 내에서, 아미노산 잔기가 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체됨으로써, 제 1 CH3 도메인의 계면 내의 돌출부가 위치할 수 있는 공동이 제 2 CH3 도메인의 계면 내에서 발생되도록 다른 중쇄의 CH3 도메인이 변경되는 것인, 다중특이적 항체.
제 11 항에 있어서,
보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기가 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기가 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T) 및 발린(V)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 다중특이적 항체.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
2개의 CH3 도메인이 2개의 CH3 도메인 사이에 이황화 가교가 형성될 수 있도록 각 CH3 도메인의 상응하는 위치에서 아미노산으로서 시스테인(C)의 도입에 의해 추가로 변경되는, 다중특이적 항체.
(I)(A)(a) 제 1 항원 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 경쇄 및 중쇄, 및
(b) 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체된, 제 3 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄; 또는
(B)(a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 경쇄 및 중쇄, 및
(b) 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체된, 제 2 항원 및 제 3 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄; 또는
(C)(a) 제 1 항원 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 경쇄 및 중쇄, 및
(b) 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체된, 제 3 항원 및 제 4 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 개질된 경쇄 및 개질된 중쇄
를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계;
(II) 상기 항체 분자의 합성을 허용하는 조건하에 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(III) 상기 배양물로부터 상기 항체 분자를 회수하는 단계
를 포함하는, 제 1 항 내지 13 항 중 어느 한 항에 따른 다중특이적 항체의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 다중특이적 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 다중특이적 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터.
제 16 항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 항체의 조성물, 바람직하게는 약학 또는 진단 조성물.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
암의 치료에 사용하기 위한 항체.
암의 치료용 약제의 제조를 위한 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 치료 효과량의 항체를 치료를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는, 상기 환자의 치료 방법.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 치료 효과량의 항체를 암을 앓고 있는 환자에게 투여함을 포함하는, 상기 환자의 치료 방법.