TWI718098B - 三特異性結合分子及其使用方法 - Google Patents

三特異性結合分子及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
TWI718098B
TWI718098B TW104117564A TW104117564A TWI718098B TW I718098 B TWI718098 B TW I718098B TW 104117564 A TW104117564 A TW 104117564A TW 104117564 A TW104117564 A TW 104117564A TW I718098 B TWI718098 B TW I718098B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
domain
cdr
epitope
chain variable
seq
Prior art date
Application number
TW104117564A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201625695A (zh
Inventor
萊斯利 強生
玲 黃
古蘭那達瑞迪 齊齊李
坎帕納 尚
郭家穎
史蒂芬詹姆士 柏克
劉麗勤
保羅 摩爾
愛利歐 波維尼
巴斯娃緹 巴拉特
Original Assignee
美商宏觀基因股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=54699839&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TWI718098(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 美商宏觀基因股份有限公司 filed Critical 美商宏觀基因股份有限公司
Publication of TW201625695A publication Critical patent/TW201625695A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI718098B publication Critical patent/TWI718098B/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2815—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
    • C07K2318/20—Antigen-binding scaffold molecules wherein the scaffold is not an immunoglobulin variable region or antibody mimetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

一種三特異性結合分子，其是具備三個結合結構域的多鏈多肽分子，因此能夠介導與三個表位的配位結合。此些結合結構域受選，以使得三特異性結合分子能夠結合任何三個不同表位。此些表位可以是相同抗原的表位或兩個或三個不同抗原的表位。在一些實施方式中，第一個表位能夠結合CD3，第二個表位能夠結合CD8，和第三個表位能夠結合疾病相關的抗原的表位。此外，更提供一種新的ROR1結合抗體、其衍生物以及此些組合物的用途。

Description

三特異性結合分子及其使用方法
本發明涉及三特異性結合分子，其是具備三個結合結構域的多鏈多肽分子，因此能夠介導與三個表位的配位結合。此些結合結構域受選而使得三特異性結合分子能夠結合任何三個不同表位。此些表位可以是相同抗原的表位，或兩個或三個不同抗原的表位。在一些實施方式中，第一個表位能夠結合CD3，第二個表位能夠結合CD8，和第三個表位能夠結合疾病相關的抗原的表位。此外，本發明也涉及新的ROR1結合抗體，以及其衍生物和這樣的組合物的用途。
I.哺乳動物免疫系統
哺乳動物免疫系統用作抵抗各種病況，包括例如損傷、感染和瘤形成的防禦。人和其他哺乳動物發展對病原體、外源物質和癌症抗原的免疫應答的效率取決於兩個特徵：對抗原識別的免疫應答的精巧的特異性，和當用相同的抗原再啟動時允許更快和更強力應答的免疫記憶(參見Portolés,P.等(2009)“The TCR/CD3 Complex：Opening the Gate to Successful Vaccination,”Current Pharmaceutical Design 15：3290-3300；Guy,C.S.等(2009)“Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR：CD3 Complex,”Immunol Rev.232(1)：7-21)。
哺乳動物免疫系統由下述兩個分開但是相互關聯的系統介導：細胞和體液免疫系統。一般而言，體液系統由可溶性產物(抗體或免疫球蛋白)介導，此可溶性產物具有結合並中和被系統識別為身體外源的產物的能力。相反，細胞免疫系統涉及動員某些細胞，稱為“T細胞”，其具有各種治療作用。T細胞是淋巴細胞，其源自胸腺，並且在組織、淋巴系統和循環系統之間迴圈。回應外源結構(抗原)的存在和識別，T細胞被“啟動”，以啟動免疫應答。在許多情況下，這些外源抗原由於瘤形成或感染而在宿主細胞上表達。儘管T細胞它們本身不分泌抗體，但是它們對於通過第二類淋巴細胞--B細胞(其源自骨髓)的抗體分泌通常是必要的。關鍵地，T細胞展示非凡的免疫特異性，以便能夠區分一個抗原與另一個抗原)。兩種類型的T細胞--“T輔助細胞”和“細胞毒性T細胞”尤其相關。
T輔助細胞特徵在於它們的糖蛋白，CD4的表達(即，它們是“CD4+”)。CD4+ T細胞是大部分哺乳動物免疫和自體免疫應答的主要組織者(參見Dong,C.等(2003)“Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules,”Immunolog.Res.28(1)：39-48)。已經發現CD4+ T細胞的啟動通過排列於抗原呈遞細胞(比如B細胞、巨噬細胞或樹突細胞)的表面上的抗原：II類主要組織相容性(MHC II)分子複合物和排列於初始CD4+ T細胞的表面上的兩個分子--T細胞受體(“TCR”)和CD3細胞表面受體配體的複合物之間的共刺激相互作用而被介導。啟動的T輔助細胞能夠增殖成Th1細胞，其能夠介導對靶細胞的炎症反應。
細胞毒性T細胞特徵在於它們對CD8的表達(即，它們是“CD8+”以及CD3+)。已經發現CD8+ T細胞的啟動通過排列於靶細胞的 表面上的抗原：I類主要組織相容性(MHC I)分子複合物和排列於CD8+ T細胞表面上的CD8和T細胞受體複合物之間的共刺激相互作用而被介導。與僅僅由某些免疫系統細胞表達的MHC II分子不同，MHC I分子被非常廣泛地表達。因此，細胞毒性T細胞能夠結合各種細胞類型。啟動的細胞毒性T細胞通過它們釋放細胞毒素穿孔蛋白、粒酶和粒溶素(granulysin)而介導細胞殺傷。通過穿孔蛋白的作用，粒酶進入靶細胞的細胞質，並且它們的絲氨酸蛋白酶功能觸發胱天蛋白酶級聯，其是最終導致靶細胞的細胞凋亡(程式性細胞死亡)的一系列半胱氨酸蛋白酶。
T細胞受體(“TCR”)是α和β鏈的共價連接的異源二聚體(“TCRαβ”)。這些鏈是長度為259(α)和296(β)個氨基酸的I類膜多肽。CD3分子是T細胞共受體，由五條不同的多肽鏈組成(CD3 γ鏈、CD3 δ鏈、兩條CD3 ε鏈和兩條ζ鏈)。獨立的多肽鏈締合，以形成三個二聚體的複合物(εγ、εδ、ζζ)(參見Wucherpfennig,K.W.等(2010)“Structural Biology Of The T Cell Receptor：Insights into Receptor Assembly,Ligand Recognition,And Initiation of Signaling,”Cold Spring Harb.Perspect.Biol.2(4)：a005140；1-14頁；Chetty,R.等(1994)“CD3：Structure,Function And The Role Of Immunostaining In Clinical Practice,”J.Pathol.173：303-307；Guy,C.S.等(2009)“Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR：CD3 Complex,”Immunol Rev.232(1)：7-21；Call,M.E.等(2007)“Common Themes In The Assembly And Architecture Of Activating Immune Receptors,”Nat.Rev.Immunol.7：841-850；Weiss,A.(1993)“T Cell Antigen Receptor Signal Transduction：A Tale Of Tails And Cytoplasmic Protein-Tyrosine Kinases,”Cell 73：209-212)。CD3複合物與TCR結 合以便在T淋巴細胞中產生啟動信號。在缺少CD3的情況下，TCR不能適當組裝，並被降解(參見Thomas,S.等(2010)“Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T Cell Receptor Gene Transfer,”Immunology 129(2)：170-177)。發現CD3結合所有成熟T細胞的膜，並且事實上不結合其他細胞類型的膜(參見Janeway,C.A.等(2005)在以下中：Immunobiology：THE IMMUNE SYSTEM IN HEALTH AND DISEASE,”第6版，Garland Science Publishing,NY,214-216頁；Sun,Z.J.等(2001)“Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3ε：γ Heterodimer,”Cell 105(7)：913-923；Kuhns,M.S.等(2006)“Deconstructing The Form And Function Of The TCR/CD3 Complex,”Immunity.2006年2月；24(2)：133-139)。
TCR和CD3複合物以及CD3 ζ鏈ζ鏈(也稱為T細胞受體T3 ζ鏈或CD247)包括TCR複合物(參見van der Merwe,P.A.等(2010年12月3日電子公開)“Mechanisms For T Cell Receptor Triggering,”Nat.Rev.Immunol.11：47-55；Wucherpfennig,K.W.等(2010)“Structural Biology Of The T Cell Receptor：Insights into Receptor Assembly,Ligand Recognition,And Initiation of Signaling,”Cold Spring Harb.Perspect.Biol.2：a005140)。複合物非常重要，因為其包含大量的(十個)免疫受體酪氨酸基的啟動基序(ITAMs)。
兩種相互作用對於T細胞啟動是必要的(參見Viglietta,V.等(2007)“Modulating Co-Stimulation,”Neurotherapeutics 4：666-675；Korman,A.J.等(2007)“Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy,”Adv.Immunol.90：297-339)。在第一相互作用中，細胞必須展示結合細胞主要組織相容性複合物的相關靶抗原，從而其可結合初始T淋巴細胞的T細胞受體(“TCR”)。在第二相互作用中，細胞的配體必須結合T淋巴細胞的共受體(參見Dong,C.等(2003)“Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules,”Immunolog.Res.28(1)：39-48；Lindley,P.S.等(2009)“The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation,”Immunol.Rev.229：307-321)。經歷兩種刺激信號的T細胞然後能夠響應細胞因數(比如白介素-2和白介素-12)。在TCR結合期間缺少兩種共刺激信號的情況下，T細胞進入功能上無應答的狀態，稱為克隆無能(參見Khawli,L.A.等(2008)“Cytokine,Chemokine,and Co-Stimulatory Fusion Proteins for the Immunotherapy of Solid Tumors,”Exper.Pharmacol.181：291-328)。在病理學狀態下，T細胞是各種器官特異性自身免疫性疾病，比如I型糖尿病、類風濕性關節炎和多發性硬化症的關鍵參與者(參見Dong,C.等(2003)“Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules,”Immunolog.Res.28(1)：39-48)。
認為啟動T細胞需要兩種信號以便它們實現適應性免疫應答提供了這樣一種機制：避免對在系統中其可能被T細胞識別的位置可能存在於抗原呈遞細胞上的自體抗原的應答。在T細胞與細胞的接觸導致產生兩種必要的信號中的僅僅一種信號的情況下，T細胞不被啟動並且不發生適應性免疫應答。
II．抗體和其他表位結合分子
A.抗體
“抗體”是免疫球蛋白分子，其能夠通過位於免疫球蛋白分 子的可變結構域中的至少一個抗原識別位點特異性結合靶，比如碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽等。如本文所使用，該術語不僅僅包括完整的多克隆或單克隆抗體，而且也包括其突變體、天然存在的變體、包括具有需要的特異性的抗原識別位元點的抗體部分的融合蛋白、人源化的抗體、和嵌合抗體、以及包括具有必要特異性的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其他修飾結構。遍及本申請，抗體輕鏈和重鏈的氨基酸殘基的編號是根據EU索引，如在以下中：Kabat等(1992)SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST，國立衛生研究院公開號91-3242。如本文所使用，“抗體的抗原結合片段”是抗體的具有至少一個抗原識別位元點的部分。如本文所使用，此術語包括片段(例如，Fab、Fab’、F(ab’)2 Fv)和單鏈分子(例如，scFv)。
天然抗體(比如IgG抗體)由與兩條重鏈複合的兩條輕鏈組成。每條輕鏈包含可變結構域(VL結構域)和固定結構域(CL結構域)。每條重鏈包含可變結構域(VH結構域)、三個固定結構域(CH1、CH2和CH3結構域)和位於CH1和CH2結構域之間的鉸鏈結構域。因此，天然存在的免疫球蛋白(例如，IgG)的基礎結構單元是具有兩條輕鏈和兩條重鏈的四聚體，通常表示為約150,000Da的糖蛋白。每條鏈的氨基末端(“N-末端”)部分包括具有約100至110或更多個氨基酸的可變區，其主要負責抗原識別。每條鏈的羧基末端(“C-末端”)部分限定固定區，其中輕鏈具有單個固定結構域和重鏈通常具有三個固定結構域和鉸鏈區。因此，IgG分子的輕鏈結構是n-VL-CL-c和IgG重鏈的結構是n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c(其中H是鉸鏈區，並且n和c分別表示多肽的N-末端和C-末端)。
完整的、未修飾的抗體(例如，IgG抗體)結合抗原的表位 的能力取決於免疫球蛋白輕鏈和重鏈上是否存在可變結構域(即，分別為VL結構域和VH結構域)。抗體輕鏈和抗體重鏈的相互作用，尤其地，其VL和VH結構域的相互作用形成抗體的表位結合位點中的一個。IgG分子的可變區由互補決定區(CDR)和非CDR區段組成，此互補決定區(CDR)包含接觸表位的殘基和此非CDR區段被稱為框架區段(FR)，其一般維持結構和確定CDR環的定位，以便允許這樣的接觸(儘管某些框架殘基也可接觸抗原)。因此，VL和VH結構域具有結構n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c。作為(或可用作)抗體輕鏈的第一、第二和第三CDR的多肽在本文分別命名為CDR L 1結構域、CDR L 2結構域和CDR L 3結構域。類似地，作為(或可用作)抗體重鏈的第一、第二和第三CDR的多肽在本文分別命名為CDR H 1結構域、CDR H 2結構域和CDR H 3結構域。因此，術語CDRL1結構域、CDRL2結構域、CDRL3結構域、CDRH1結構域、CDRH2結構域和CDRH3結構域指多肽，其在摻入到蛋白質中時，使得此蛋白質能夠結合特異性表位，無論這樣的蛋白質是否是具有輕鏈和重鏈的抗體或雙抗體或單鏈結合分子(例如，scFv，BiTe等)，或是另一類型的蛋白質。與這樣的抗體相反，scFv構建物包括包含在單個多肽鏈中的抗體的VL和VH結構域，其中結構域被足夠長的靈活接頭分開，允許兩個結構域自組裝成功能性表位結合位點。在由於不足長度的接頭(小於約12個氨基酸殘基)而導致VL和VH結構域的自組裝是不可能的情況下，兩個scFv構建物可彼此相互作用形成二價分子，其中一條鏈的VL結構域締合另一條鏈的VH結構域(參見Marvin等(2005)“Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies,”Acta Pharmacol.Sin.26：649-658)。
除了它們在診斷中的已知用途，已經顯示抗體可用作治療 劑。過去數十年已經看到對抗體治療潛能的興趣的復興，並且抗體已經成為一類重要的源自生物技術的藥物(參見Chan,C.E.等(2009)“The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Disedses,”Singapore Med.J.50(7)：663-666)。接近200種基於抗體的藥物已經被批准使用或正在開發。
術語“單克隆抗體”指同質性(homogenous)抗體群體，其中單克隆抗體由參與抗原的選擇性結合的氨基酸(天然存在的和非天然存在的)組成。單克隆抗體是高度特異性的，針對單個表位(或抗原位點)。術語“單克隆抗體”不僅僅包括完整的單克隆抗體和全長單克隆抗體，而且也包括其片段(比如Fab、Fab’、F(ab’)2 Fv)、單鏈(scFv)，其突變體、包括抗體部分的融合蛋白、人源化的單克隆抗體、嵌合單克隆抗體，和包括具有必要特異性和結合抗原能力的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其他修飾結構。就抗體來源或製備其的方式(例如，通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達、轉基因動物等)而言不期望受到限制。此術語包括完整的免疫球蛋白以及上面根據定義“抗體”描述的片段。製備單克隆抗體的方法是本領域已知的。可採用的一種方法是Kohler,G.等的方法(1975)“Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity,”Nature 256：495-497或其改良方法。典型地，單克隆抗體在小鼠、大鼠或兔子中開發。通過用包含期望的表位的免疫原量的細胞、細胞提取物或蛋白製品免疫動物而產生抗體。免疫原可以是，但不限於原代細胞、培養的細胞系、癌細胞、蛋白質、肽、核酸或組織。用於免疫的細胞可培養一段時間(例如，至少24小時)，然後它們用作免疫原。細胞可通過它們本身或結合非變性佐劑比如Ribi用作免疫原(參見Jennings,V.M.(1995)“Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production,”ILAR J.37(3)：119-125)。
一般而言，當用作免疫原時，細胞應保持完整和優選地能存活。相比於破裂的細胞，完整的細胞可允許抗原被免疫的動物更好地檢測。變性或烈性佐劑，例如，弗氏佐劑的使用，可使細胞破裂，因此，其應用受阻。免疫原可以週期性間隔被多次施用，諸如兩週一次或一週一次，或者可以維持在動物(例如，在組織重組體中)中的生存力這樣的方式被施用。可選地，對於期望的致病表位是免疫特異性的現有單克隆抗體和任意其他等價抗體可被測序並通過本領域中已知的任意手段重組產生。在一個實施方式中，對這樣的抗體測序，然後將多核苷酸序列克隆至載體用於表達或增殖。編碼感興趣的抗體的序列可在宿主細胞中保持在載體中，並且，可然後擴張和冷凍宿主細胞用於將來的使用。這樣的抗體的多核苷酸序列可被用於遺傳操作，以產生嵌合抗體、人源化的抗體或犬源化(caninized)的抗體，或改善抗體的親和性，或其他特徵。人源化抗體的一般原理涉及保留抗體的抗原結合部分的基礎序列，同時用人抗體序列交換抗體的非人剩餘部分。使單克隆抗體人源化大體上有四個步驟：(1)測定起始抗體輕鏈和重鏈可變結構域的核苷酸和預測的氨基酸序列；(2)設計人源化的抗體或犬源化的抗體，即，確定在人源化或犬源化過程期間使用哪個抗體框架區；(3)實際人源化或犬源化方法/技術；和(4)轉染和表達人源化的抗體。參見美國專利號4,816,567、5,807,715、5,866,692和6,331,415。
這樣的抗體的表位結合結構域可包括融合在固定結構域上的完整可變結構域或僅僅包括移植在可變結構域中適當的框架區上的互補決定區(CDR)。抗原結合位點可以是野生型的或被一個或多個氨基酸取代而修飾。這消除了固定區在人個體中作為免疫原，但是仍存在 對外源可變區的免疫應答的可能性(參見LoBuglio,A.F.等(1989)“Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man：Kinetics And Immune Response,”Proc.Natl.Acad.Sci.(美國)86：4220-4224)。另一方法不僅僅關注提供源自人的固定區，而且也修飾可變區以便重塑它們盡可能接近人形式。已知重鏈和輕鏈二者的可變區包含三個互補決定區(CDR)，其回應所討論的抗原而改變並且決定結合能力，其由四個框架區(FR)側接，此些框架區在給定的物種中相對保守並且推測為CDR提供支架材料(scaffolding)。當就具體的抗原製備非人抗體時，可變區可通過將源自非人抗體的CDR移植在待修飾的人抗體中存在的FR上被“重塑”或”人源化”。下述文獻已經報導了此方法應用於各種抗體：Sato,K.等(1993)Cancer Res 53：851-856.Riechmann,L.等(1988)“Reshaping Human Antibodies for Therapy,”Nature 332：323-327；Verhoeyen,M.等(1988)“Reshaping Human Antibodies：Grafting An Antilysozyme Activity,”Science 239：1534-1536；Kettleborough,C.A.等(1991)“Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting：The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation,”Protein Engineering 4：773-3783；Maeda,H.等(1991)“Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity,”Human Antibodies Hybridoma 2：124-134；Gorman,S.D.等(1991)“Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody,”Proc.Natl.Acad.Sci.(美國)88：4181-4185；Tempest,P.R.等(1991)“Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo,”Bio/Technology 9：266-271；Co,M.S.等(1991)“Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,”Proc.Natl.Acad.Sci.(美國)88：2869-2873；Carter,P.等(1992)“Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy,”Proc.Natl.Acad.Sci.(美國)89：4285-4289；和Co,M.S.等(1992)“Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen,”J.Immunol.148：1149-1154。在一些實施方式中，人源化的抗體保留所有的CDR序列(例如，包含來自小鼠抗體的所有六個CDR的人源化的小鼠抗體)。在其他實施方式中，人源化的抗體具有序列相對於原始抗體不同的一個或多個CDR(一、二、三、四、五或六個)。
B.雙特異性抗體、多特異性雙抗體和DART TM 雙抗體
天然抗體僅僅能夠結合一個表位種類(即，它們是“單特異性的”)，儘管它們可能夠結合此種類的多個拷貝(即，它們可展示二效價或多效價)。已經開發了各種重組雙特異性抗體形式(參見PCT公開號WO 2008/003116、WO 2009/132876、WO 2008/003103、WO 2007/146968、WO 2007/146968、WO 2009/018386、WO 2012/009544、WO 2013/070565)，其大部分使用接頭肽，以將抗體核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)融合至抗體核心的或其中的進一步結合的蛋白(例如，scFv，VL VH等)，或融合多個抗體部分或將(例如兩個Fab片段或scFv)融合至異源二聚化-促進結構域比如CH2-CH3結構域或可選的多肽(參見PCT公開號WO 2005/070966、WO 2006/107786A WO 2006/107617A、WO 2007/046893)。典型地，這樣的方法涉及折中和權衡。例如，PCT公開號WO 2013/174873、WO 2011/133886和WO 2010/136172公開了接頭的使用可在治療情形中引起問題，並且教導了三特異性抗體，其中CL和CH1結構域由它們各自的天然位置被交換 以及VL和VH結構域已經被多樣化(參見PCT公開號WO 2008/027236、WO 2010/108127)，以允許它們結合多於一個抗原。因此，這些文件中公開的分子用結合特異性換取結合另外抗原種類的能力。PCT公開號WO 2013/163427和WO 2013/119903公開了修飾CH2結構域，以包含包括結合結構域的融合蛋白加合物。此些文件敘述了CH2結構域可能在介導效應子功能中僅起到最小的作用。PCT公開號WO 2010/028797、WO2010028796和WO 2010/028795公開了重組抗體，其Fc結構域已經用另外的VL和VH結構域取代，以便形成三價結合分子。PCT公開號WO 2003/025018和WO2003012069公開了重組雙抗體，其單條鏈包含scFv結構域。PCT公開號WO 2013/006544公開多價Fab分子，其作為單條多肽鏈被合成並且然後進行蛋白酶解以產生異源二聚結構。因此，這些文件中公開的分子用所有或一些介導效應子功能的能力換取結合另外抗原種類的能力。PCT公開號WO 2014/022540、WO 2013/003652、WO 2012/162583、WO 2012/156430、WO 2011/086091、WO 2007/075270、WO 1998/002463、WO 1992/022583和WO 1991/003493公開了添加另外的結合結構域或官能團至抗體或抗體部分(例如，添加雙抗體至抗體的輕鏈，或添加另外的VL和VH結構域至抗體的輕鏈和重鏈，或添加異源融合蛋白或彼此連接的多個Fab結構域)。因此，這些文件中公開的分子用天然抗體結構換取結合另外的抗原種類的能力。
現有技術已經另外敘述了產生雙抗體的能力，此雙抗體與這樣的天然抗體的不同之處在於能夠結合兩個或更多個不同表位種類(即，除了雙效價或多效價之外還展示雙特異性或多特異性)(參見Holligcr等(1993)“‘Diabodies’：Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,”Proc.Natl.Acad.Sci.(美國)90：6444-6448；US 2004/0058400(Hollinger等)；US 2004/0220388(Mertens等)；Alt等(1999)FEBS Lett.454(1-2)：90-94；Lu,D.等(2005)“A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20)：19665-19672；WO 02/02781(Mertens等)；Olafsen,T.等(2004)“Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,”Protein Eng Des Sel.17(1)：21-27；Wu,A.等(2001)“Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single-chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange,”Protein Engineering 14(2)：1025-1033；Asano等(2004)“A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,”Abstract 3P-683,J.Biochem.76(8)：992；Takemura,S.等(2000)“Construction Of A Diabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8)：583-588；Baeuerle,P.A.等(2009)“Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy,”Cancer Res.69(12)：4941-4944)。
雙抗體的設計是基於單鏈可變結構域片段(scFv)的結構。這樣的分子通過經短連接肽彼此連接輕鏈和/或重鏈可變結構域而製備。Bird等(1988)(“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,”Science 242：423-426)描述了連接肽的例子，其在一個可變結構域的羧基末端和 另一可變結構域的氨基末端之間橋跨約3.5nm。已經設計和使用了其他序列的接頭(Bird等(1988)“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,”Science 242：423-426)。接頭可進而被修飾用於另外的功能，比如藥物的附著或附著至固體載體。可經重組或經合成產生單鏈變體。對於合成產生scFv，可使用自動合成儀。對於重組產生scFv，包含編碼scFv的多核苷酸的適當質粒可被引入適當的宿主細胞--真核細胞比如酵母細胞，植物細胞，昆蟲細胞或哺乳細胞，或原核細胞比如大腸埃希氏菌(E.coli)。編碼scFv的多核苷酸可通過常規的操作比如多核苷酸的連接而製備。所得scFv可使用本領域已知的標準蛋白質純化技術分離。
美國專利號7,585,952和美國專利公開號2010-0173978涉及對ErbB2免疫特異性的scFv分子。已經描述了雙特異性T細胞連接子(engager)(“BiTEs”)，其是一類scFv分子(參見WO 05/061547；Baeuerle,P等(2008)“BiTE：A New Class Of Antibodies That Recruit T Cells,”Drugs of the Future 33：137-147；Bargou，等2008)“Tumor Regression in Cancer Patients by Very Low Doses of a T Cell-Engaging Antibody,”Science 321：974-977)。這樣的分子由具有兩個抗原結合結構域的單個多肽鏈分子組成，其中一個抗原結合結構域免疫特異性結合CD3表位和其第二個免疫特異性結合靶細胞表面上存在的抗原。
提供非單特異性雙抗體提供了明顯的優勢：共連接和共定位表達不同表位的細胞的能力。二價雙抗體因此具有寬的應用範圍，包括治療和免疫診斷。二價允許在各種應用中在設計和工程化雙抗體時更大的靈活性，提供對多聚體抗原的增強的抗體親抗原性，交聯不同的抗原，和依賴於兩個靶抗原的存在引導靶向特定的細胞類型。由於它們增 加的效價，低解離速率和從迴圈的快速清除(對於~50kDa或更低的小尺寸雙抗體)，本領域已知的雙抗體分子也已經顯示在腫瘤成像領域的具體用途(參見Fitzgerald等(1997)“Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,”Protein Eng.10：1221)。尤其重要的是不同細胞的共連接，例如，細胞毒性T細胞與腫瘤細胞的交聯(參見Staerz等(1985)“Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells,”Nature 314：628-631，和Holliger等(1996)“Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,”Protein Eng.9：299-305)。
雙抗體表位結合結構域可以針對任何免疫效應細胞比如CD3、CD16、CD32、CD64等的表面決定簇，此免疫效應細胞在T淋巴細胞、天然殺傷細胞(NK)細胞或其他單核細胞上表達。在許多研究中，也發現結合效應細胞決定簇例如Fcγ受體(FcγR)的雙抗體啟動效應細胞(參見Holliger等(1996)“Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,”Protein Eng.9：299-305；Holliger等(1999)“Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T-cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins,”Cancer Res.59：2909-2916；WO 2006/113665、WO 2008/157379、WO 2010/080538、WO 2012/018687、WO 2012/162068)。通常，通過經Fc-FcγR相互作用使結合抗原的抗體結合效應細胞激發效應細胞啟動；因此，在這方面，雙抗體分子可展示Ig樣功能，這不依賴於它們是否包括Fc結構域(例如， 如在本領域已知的或本文列舉的任何效應功能試驗中所分析的(例如，ADCC試驗))。通過交聯腫瘤和效應細胞，雙抗體不僅僅使效應細胞接近腫瘤細胞而且導致有效的腫瘤殺傷(參見Cao等(2003)“Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics,”Adv.Drug.Deliv.Rev.55：171-197)。
例如，美國專利號6,171,586涉及如下產生雙特異性抗體：通過蛋白酶解切割兩個抗體，以獲得它們的F(ab’)2片段，在用於防止分子間二硫鍵形成的條件下還原這樣的片段，並且然後混合片段，以產生雙特異性抗體)。美國專利號6,551,592、6,994,853和8,277,806和PCT公開號WO 2012/156430、WO 2002/020039、WO 2000/018806和WO 1998/003670涉及產生三特異性抗體，其能夠同時結合腫瘤細胞上的T細胞和其他抗原，並且，經雙特異性抗體的Fc部分結合具有這樣的受體的細胞的Fc受體。PCT公開號WO 2000/018806、WO 1998/003670和WO 2006/072152涉及產生能夠同時結合T細胞和其他抗原的三特異性抗體。美國專利公開號2008-0057054公開了雙特異性綴合物，其對於針對澱粉狀蛋白β寡聚物的結合元件和針對跨膜蛋白質端腦蛋白(telencephalin)的結合元件是特異性的。美國專利公開號2010-0291112涉及雙特異性和三特異性單鏈Fv分子，其特異性結合一個(或兩個)腫瘤抗原和效應細胞抗原(比如CD3、CD16、CD32、CD64等)。
PCT公開號WO 1999/042597和WO 1998/006749公開了抗體衍生物，其包括人主要組織相容性複合物結合結構域，有或沒有結合的MHC結合肽。PCT公開號WO 02/072141涉及多特異性結合分子，其結合速率(on-rate)(它們結合靶分子的速率)和解離速率(off-rate)(它 們釋放靶分子的速率)不同，以便相比它們與另一這樣的靶分子的結合優選結合一個靶。三特異性分子，例如這樣的分子，其具有作為抗CD3或抗CD28抗體的單價第一部分和第二部分，此第二部分包括發揮二價免疫功能的部分，其免疫特異性結合靶患病細胞或免疫細胞上的一個或多個靶配體。
美國專利號7,695,936和專利公開2007/0196363涉及由兩個抗體的重鏈形成的雙特異性抗體，其中一個抗體具有工程化至其重鏈的突出(protuberance)和其第二個具有工程化至其重鏈的互補的腔。這樣互補的“杵(knob)”和“臼(hole)”的存在教導相對於包含相同抗體的兩個重鏈的單特異性同源抗體，優選形成雙特異性異源抗體(具有每個這樣的抗體的一個重鏈)。提出了各種雙特異性異源抗體，包括對CD3和腫瘤細胞抗原免疫特異性的那些。也提出了各種三特異性異源抗體，包括對下述免疫特異性的一些三特異性異源抗體：CD3、CD8和CD37(主要在參與T細胞增殖調節的B細胞上表達的跨膜蛋白質(參見Robak,T.等(2014)“Anti-CD37 Antibodies For Chronic Lymphocytic Leukemia,”Expert Opin.Biol.Ther.14(5)：651-661)，但是，沒有提供它們產生的機制也沒有公開它們的結構。
PCT公開WO2012-162561涉及雙特異性、四價結合分子，其包括兩個多肽，其每個多肽包括兩個雙抗體結構，由間插CH2-CH3結構域分開。此文件也涉及由四個多肽鏈組成的四價結合分子，其中多肽鏈中的兩個包含兩個抗原的輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域，和其中其他兩個多肽鏈包含抗原的互補的重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域和末端CH2-CH3結構域。通過它們各自CH2-CH3結構域的締合形成雙特異性、四價結合分子。在四個多肽鏈構建物中，”輕”鏈不 是共價結合至重鏈，因此導致不穩定(參見Lu,D.等(2005)“A Fully Human Recombinant IgG-like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20)：19665-19672)。此文件公開了第三構建物，其中鏈被改變，以提供這樣的共價鍵合，但是代價是消除了它們的雙特異性(即，分子是單特異性的)。公開了對CD2、CD3、CD4、CD8、CD161、趨化因數受體、CD95、CCR5等具有特異性的分子。未公開能夠結合CD3和CD8二者的雙特異性分子。
但是，上述優勢需要顯著的成本。形成這樣的非單特異性雙抗體需要成功組裝兩個或更多個有區別的和不同多肽(即，這樣的形成需要通過異源二聚化不同的多肽鏈種類形成雙抗體)。此事實與單特異性的雙抗體相反，其通過相同多肽鏈的同二聚化形成。因為必須提供至少兩個不同的多肽(即，兩個多肽種類)以便形成非單特異性雙抗體，並且因為這樣的多肽的同二聚化導致無活性的分子(參見Takemura,S.等(2000)“Construction Of A Diabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8)：583-588)，產生這樣的多肽必須以防止相同種類的多肽之間的共價結合的方式完成(參見Takemura,S.等(2000)“Construction Of A Diabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8)：583-588)。所以現有技術教導了非共價締合這樣的多肽(參見Olafsen等(2004)“Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,”Prot.Engr.Des.Sel.17：21-27； Asano等(2004)“A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,”摘要3P-683，J.Biochem.76(8)：992；Takemura,S.等(2000)“Construction Of A Diabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8)：583-588；Lu,D.等(2005)“A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20)：19665-19672)。
但是，現有技術已經認識到由非共價締合的多肽組成的雙特異性雙抗體不穩定並且容易解離成非功能性單體(參見Lu,D.等(2005)“A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20)：19665-19672)。
面對此挑戰，現有技術已經成功開發了穩定、共價結合的異源二聚非單特異性雙抗體，稱為DARTs TM (參見美國專利公開號2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910；歐洲專利公開號EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221和PCT公開號WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538；和Moore,P.A.等(2011)“Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,”Blood 117(17)：4542-4551；Veri,M.C.等(2010)“Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B)Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,”Arthritis Rheum.62(7)：1933-1943；Johnson,S.等(2010)“Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion,”J.Mol.Biol.399(3)：436-449)。這樣的雙抗體包括兩個或更多個共價複合的多肽並且涉及將一個或多個半胱氨酸殘基工程化至每個採用的多肽種類，這允許形成二硫鍵並且從而共價鍵合兩個多肽鏈。例如，添加半胱氨酸殘基至這樣的構建物的C-末端已經顯示允許多肽鏈之間的二硫鍵合，穩定所得異源二聚體而不干擾二價分子的結合特徵。
有許多DARTTM實施方式。最簡單DARTTM實施方式的兩個多肽的每一個包括三個結構域(圖1A)。第一多肽包括：(i)第一結構域(VL1)，其包括第一免疫球蛋白的輕鏈可變結構域的結合區；(ii)第二結構域(VH2)，其包括第二免疫球蛋白的重鏈可變結構域的結合區；和(iii)第三結構域，其包含半胱氨酸殘基(或包含半胱氨酸的結構域)和異源二聚化-促進結構域，其用於促進與第二多肽鏈的異源二聚化(圖1B)。第三結構域的半胱氨酸殘基(或包含半胱氨酸的結構域)用於促進雙抗體的第一多肽鏈與第二多肽鏈的共價鍵合。第二多肽包含：(i)互補的第一結構域(包含VL2的結構域)；(ii)互補的第二結構域(包含VH1的結構域)；和(iii)第三結構域，其包含半胱氨酸殘基(或包含半胱氨酸的結構域)和，任選地，互補的異源二聚化-促進結構域，其與第一多肽鏈的異源二聚化-促進結構域複合，以便促進與第一多肽鏈的異源二聚化。第二多肽鏈的第三結構域的半胱氨酸殘基(或包含半胱氨酸的結構域)用於促進雙抗體的第二多肽鏈與第一多肽鏈的共價鍵合。這樣的分子是穩定、 有效力的並且能夠同時結合兩個或更多個抗原。它們能夠促進重定向T細胞介導的表達靶抗原的細胞的殺傷。
在一個實施方式中，第一和第二多肽的第三結構域每個包含半胱氨酸殘基，其用於將多肽經二硫鍵結合在一起。多肽中的一個或兩個的第三結構域可另外具有CH2-CH3結構域的序列，使得雙抗體多肽的複合形成Fc結構域，其能夠結合細胞(比如B淋巴細胞、樹突細胞、天然殺傷細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜伊紅粒細胞、嗜鹼性粒細胞和肥大細胞)的Fc受體(圖2A-2B)。
已經描述了這樣的分子的許多變型(參見美國專利公開號2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910；歐洲專利公開號EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221和PCT公開號WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538)。這些具有Fc的DARTTM可包括三條多肽鏈(例如，圖2B)。這樣的雙抗體的第一多肽鏈包含三個結構域：(i)包含VL1的結構域、(ii)包含VH2的結構域、(iii)包含半胱氨酸殘基的結構域(或包含半胱氨酸的結構域)和異源二聚化-促進結構域、和(iv)半胱氨酸殘基(或包含半胱氨酸的結構域和CH2-CH3結構域。這樣的DARTTM的第二多肽鏈包含：(i)包含VL2的結構域、(ii)包含VH1的結構域、和(iii)包含半胱氨酸殘基的結構域(或包含半胱氨酸的結構域)和異源二聚化-促進結構域，其促進與第一多肽鏈的異源二聚化。第二多肽鏈的第三結構域的半胱氨酸殘基(或包含半胱氨酸的結構域)用於促進雙抗體的第二多肽鏈與第一多肽鏈的共價結合。這樣的DARTTM的第三多肽包括半胱氨酸殘基(或包含半胱氨酸的結構域)和CH2-CH3結構域。因此，這樣的DARTTM的第一和第二多肽鏈締合在一起形成能夠結合表位的VL1/VH1結合位點以及能夠結合第二 表位的VL2/VH2結合位點。第一和第二多肽通過在它們各自第三結構域中涉及半胱氨酸殘基的二硫鍵彼此結合。注意，第一和第三多肽鏈彼此複合形成經二硫鍵穩定的Fc結構域。這樣的雙抗體具有增強的效力。這樣具有Fc的DART TM可具有兩個取向之一(表1)：
Figure 104117564-A0305-02-0024-1
已經描述了甚至更複雜的DARTTM雙抗體，稱為Ig-DART TM(圖3A-3B)和Fc-DART TM 雙抗體(圖3C)(參見WO 2012/018687)。Fc-DARTsTM具有四條多肽鏈。這樣的雙抗體的第一和第三多肽鏈包含三個結構域：(i)包含VL1的結構域、(ii)包含VH2的結構域、和(iii)包含CH2-CH3序列的結構域。Fc-DARTTM的第二和第四多肽包含：(i)包含VL2的結構域、(ii)包含VH1的結構域、和(iii)促進與Fc-DARTTM的第一多肽鏈的異源二聚化和共價結合的結構域。第三和第四可以相同或不同，以及第一和第二多肽鏈可以相同或不同，以便允許是單特異性的、雙特異性的或四特異性的四價結合。這樣更複雜的DARTTM分子也具有包含半胱氨酸的結構域，其用於形成共價結合的複 合物。Fc-DARTTM雙抗體包含CH1和CL結構域。
可選的構建物是本領域已知的，用於其中期望四價分子但是不需要Fc的應用，包括但不限於四價串聯抗體，也稱為“TandAbs”(參見美國專利公開號2005-0079170、2007-0031436、2010-0099853、2011-020667 2013-0189263；歐洲專利公開號EP 1078004、EP 2371866、EP 2361936和EP 1293514；PCT公開號WO 1999/057150、WO 2003/025018和WO 2013/013700)，其通過兩個相同鏈的同二聚化形成，每條鏈各具有VH1、VL2、VH2和VL2結構域。
III.重定向殺傷
如上所討論，CD8、MHC I和T細胞受體之間的相互作用導致細胞毒性T細胞的啟動和它們殺傷附近細胞的能力。結合CD3和腫瘤抗原的雙特異性雙抗體可用於共定位細胞毒性CD8+ T細胞至腫瘤細胞，實現這樣的細胞的“重定向殺傷”(參見WO 2010/080538、WO 2012/018687、WO/2012/162068、US 2010/0174053、US 2013/0295121)。
但是，通過將CD3+ T細胞共定位至腫瘤或病原體細胞的基因座治療癌症或傳染性疾病的嘗試還未完全成功。靶向CD3的抗體結合CD3+ CD8+細胞毒性T細胞和結合CD3+ CD4+ T輔助細胞，導致兩種這樣的細胞的啟動。但是，通過啟動CD3+ CD4+ T輔助細胞產生的細胞因數，造成嚴重的副作用，例如，威脅生命的細胞因數風暴(參見Ferran,C.等(1990)“Cytokine-Related Syndrome Following Injection Of Anti-CD3 Monoclonal Antibody：Further Evidence For Transient In Vivo T Cell Activation,”Eur.J.Immunol.20：509-515)。另外，這樣的抗CD3抗體結合其他細胞類型，包括在啟動時表達細胞因數的CD3+ CD4-CD8-雙陰性T細胞等(參見Johansson,Martina等(2003)“A Unique Population of Extrathymically Derived αβTCR + CD4 - CD8 - T Cells with Regulatory Functions Dominates the Mouse Female Genital Tract,”J.Immunol.170：1659-1666；Blank,C.等(2003)“Absence of Programmed Death Receptor 1 Alters Thymic Development and Enhances Generation of CD4/CD8 Double-Negative TCR-Transgenic T Cells,”J.Immunol.171：4574-4581；Mclntyre,M.S.F.等(2011)“Consequences Of Double Negative Regulatory T Cell And Antigen Presenting Cell Interaction On Immune Response Suppression,”Intl.Immunopharmacol.11：597-603)，並且此些細胞類型抑制CD3+ CD8+ T細胞介導的細胞毒性(參見Hillhouse,E.E.(2013)“A Comprehensive Review Of The Phenotype And Function Of Antigen-Specific Immunoregulatory Double Negative T Cells,”J.Autoimmun.40：58-65)。
已經建議與施用靶向CD3的抗體相關的細胞因數產生可使用靶向CD8和腫瘤抗原的雙特異性抗體而避免(參見Michalk,I.等(2014)“Characterization of a Novel Single-Chain Bispecific Antibody for Retargeting of T Cells to Tumor Cells via the TCR Co-Receptor CD8,”PLOS One 9(4)：e95517，1-8頁)。所以已經研究了抗CD8抗體，以確定當單獨使用時，它們是否能夠誘導效應子功能。Clement,M.等報導了測試的七個抗人CD8抗體中的六個不能啟動CD8+ T細胞，但是這樣的啟動可使用非常高濃度(10-100μg/mL)的抗人CD8抗體“OKT8”實現(參見Clement,M.等(2011)“Anti-CD8 Antibodies Con Trigger CD8 + T Cell Effector Function In The Absence Of TCR Engagement And Improve Peptide-MHCI Tetromer Staining,”J.Immunol.187(2)：654-663)。對於這樣的作用協同結合兩個CD8分子是必要的，因為發現OKT8 F(ab)’2片段能夠介導此作用，而發現OKT8 Fab不能夠這樣做。
因此，儘管這樣的研究，還未充分理解致力於抗CD4或抗CD8抗體使用的細胞因數介導的毒性。研究已經揭示了在施用抗CD3抗體時看到的細胞因數毒性未通過消耗CD3+ CD4+ T細胞或通過缺失CD3+ CD8+ T細胞而被消除。因此，CD3+ CD4+ T細胞和CD3+ CD8+ T細胞造成抗CD3抗體的毒性作用，和介導完全的作用需要相對較少的細胞(參見Finck,B.K.等(1992)“The Role Of T-Cell Subsets In The Response To Anti-CD3 Monoclonal Antibodies,”Clin Immunol Immunopathol.1992 Dec；65(3)：234-41)。
而且，靶向CD8和腫瘤抗原的雙特異性抗體對於CD3+ CD8+ T細胞和腫瘤細胞不是特異的，而是僅僅對CD8+細胞和腫瘤細胞是特異性的。尤其，天然殺傷細胞(NK)的CD3-CD8+亞類被這樣的抗體靶向。代表大部分NK細胞的這樣的細胞是細胞因數的有效產生者並且它們的啟動可能產生細胞因數風暴。CD3-CD8+ NK細胞是感染HIV-1的黑猩猩中的IFN-γ的主要來源(參見Rodriquez,A.R.等(2007)“Influence Of Interleukin-15 On CD8+ Natural Killer Cells In Human Immunodeficiency Virus Type 1-Infected Chimpanzees,”J.Gen.Virol.88：641-651)。
從而，儘管所有之前的進步，仍需要改善的組合物，其能夠更強力引導身體的免疫系統攻擊癌症細胞或感染病原體的細胞，尤其 以更低的治療性濃度。
如下面詳細描述，本發明通過提供三特異性結合分子解決了上述需要。此三特異性結合分子可結合：(1)CD3的表位、(2)CD8的表位和(3)在靶細胞(尤其癌症細胞，或感染病原體的細胞)上表達的疾病相關的抗原的表位，並且介導細胞毒性T細胞與呈遞疾病相關抗原的細胞的配位結合。
本發明涉及一種三特異性結合分子，其是具有三個結合結構域的多鏈多肽分子，因此能夠介導與三個表位的配位結合。可選擇結合結構域，以便三特異性結合分子能夠結合任何三個不同表位。這樣的表位可以是相同抗原的表位或兩個或三個不同抗原的表位。本發明也涉及一種新的ROR1結合抗體，以及其衍生物和這樣的組合物的用途。
在一些實施方式中，選擇三個表位，以便這樣的表位中的一個或兩個是免疫系統細胞，尤其是細胞毒性淋巴細胞免疫系統細胞(CTL)的表位(一個或多個)，和其中剩餘的表位(一個或多個)是疾病相關的抗原的表位(一個或多個)。這樣尤其優選的三特異性結合分子能夠將細胞毒性淋巴細胞定位至表達疾病相關的抗原的細胞，並且從而促進殺傷表達疾病相關的抗原的細胞。疾病相關的抗原可以是癌症抗原，或可以是以病原體(例如，細菌、真菌、病毒或原生動物)感染為特徵的抗原。更具體地，三特異性結合分子能夠介導與以下的配位結合：(1)CD3的表位、(2)CD8的表位和(3)疾病相關的抗原的表位。通過結合CD3和CD8以及結合疾病相關的抗原，這樣的分子將細胞毒性T細胞共定位至呈遞疾病相關的抗原的細胞，導致啟動這樣的T細胞和啟動針對表達疾 病相關的抗原的細胞的細胞毒性應答。
詳細地，此三特異性結合分子能夠免疫特異性結合三個不同的表位，其中結合分子包括共價複合在一起的四條不同的多肽鏈，並且包括：(I)抗原結合結構域I，其能夠免疫特異性結合第一抗原上存在的表位I，和抗原結合結構域II，其能夠免疫特異性結合第二抗原上存在的表位II，其中抗原結合結構域I和抗原結合結構域II都是雙抗體型結合結構域；(II)非雙抗體型抗原結合結構域III，其能夠免疫特異性結合第三抗原上存在的表位III；和(III)Fc結構域，其通過兩個CH2-CH3結構域的彼此締合而形成。
其中，第一、第二和第三抗原是相同的抗原，或獨立地與抗原中的另一個相同或不同。
在一些實施方式中，表位I、表位II和表位III其中之一是細胞受體的表位。
在一些實施方式中，表位I、表位II和表位III其中之一是疾病相關的抗原的表位(尤其地，其中疾病相關的抗原是癌症抗原，其排列於癌症細胞的表面，或是病原體抗原，其排列於病原體或感染病原體的細胞的表面)。
在一些實施方式中，Fc結構域能夠結合排列在細胞表面上的Fc受體。
在一些實施方式中，表位I、表位II和表位III其中的第一個是CD3的表位，表位I、表位II和表位III其中的第二個是CD8的表位，和表位I、表位II和表位III其中的第三個是疾病相關的抗原的表位，和其中三特異性結合分子的抗原結合結構域I、II和III介導細胞毒性T細胞和表達疾病相關抗原的細胞的配位結合。本發明尤其涉及這樣的三特異 性結合分子的實施方式，其中CD3、CD8排列在T細胞的表面上和其中疾病相關的抗原排列在癌症細胞、病原體或感染病原體的細胞的表面上，和其中免疫特異性結合足夠共定位CD3和CD8以及疾病相關的抗原，從而促進針對排列疾病相關的抗原的細胞啟動排列CD8的T細胞。
在一些實施方式中，非雙抗體型結合結構域III包括Fab型結合結構域(VLIII/VHIII)，其能夠免疫特異性結合表位III，其中分子包括：(A)第一多肽鏈、(B)第二多肽鏈、(C)第三多肽鏈、和(D)第四多肽鏈。(A)第一多肽鏈(I)在N-末端至C-末端方向包括：(1)免疫球蛋白的輕鏈可變結構域(VLI)，其能夠結合三個表位中的第一個；(2)免疫球蛋白的重鏈可變結構域(VHII)，其能夠結合三個表位中的第二個；(3)(a)第一包含半胱氨酸的結構域和異源二聚體-促進結構域、或(b)包含半胱氨酸的異源二聚體-促進結構域；(5)第二包含半胱氨酸的結構域；和(6)IgG的CH2和CH3結構域。或者，(A)第一多肽鏈亦可是(II)在N-末端至C-末端方向包括：(1)第一包含半胱氨酸的結構域；(2)IgG的CH2和CH3結構域；(3)免疫球蛋白的輕鏈可變結構域(VLI)，其能夠結合三個表位中的第一個；(4)免疫球蛋白的重鏈可變結構域(VHII)，其能夠結合三個表位中的第二個；(5)(a)第二包含半胱氨酸的結構域和異源二聚體-促進結構域、或(b)包含半胱氨酸的異源二聚體-促進結構域。(B)第二多肽鏈，其在N-末端至C-末端方向包括：(1)免疫球蛋白的輕鏈可變結構域(VLII)，其能夠結合三個表位中的第二個；(2)免疫球蛋白的重鏈可變結構域(VHI)，其能夠結合三個表位中的第一個；(3)(a)第一包含半胱氨酸的結構域和異源二聚體-促進結構域、或(b)包含半胱氨酸的異源二聚體-促進結構域；其中第二多肽鏈的異源二聚體-促進結構域與第一多肽鏈的異源二聚體-促進結構域互補。(C)第三多肽鏈，其在N-末端至C-末端 方向包括：(1)免疫球蛋白的重鏈可變結構域(VHIII)，其能夠結合三個表位中的第三個；和(2)CH1結構域、包含半胱氨酸的鉸鏈結構域和IgG的CH2-CH3結構域。(D)第四多肽鏈，其在N-末端至C-末端方向包括：(1)免疫球蛋白的輕鏈可變結構域(VLIII)，其能夠結合三個表位中的第三個；和(2)包含半胱氨酸的輕鏈固定結構域(CL)。其中，(i)VLI和VHI結構域締合形成能夠結合表位I的結構域；(ii)VLII和VHII結構域締合形成能夠結合表位II的結構域；(iii)VLIII和VHIII結構域締合形成能夠結合表位III的結構域；(iv)第一多肽鏈的CH2-CH3結構域和第三多肽鏈的CH2-CH3結構域締合形成Fc結構域；(v)第一和第二多肽鏈彼此共價結合；(vi)第一和第三多肽鏈彼此共價結合；和(vii)第三和第四多肽鏈彼此共價結合。
在一些實施方式中，(A)異源二聚體-促進結構域是E-螺旋和互補的異源二聚體-促進結構域是K-螺旋；或(B)異源二聚體-促進結構域是K-螺旋和互補的異源二聚體-促進結構域是E-螺旋。
在一些實施方式中，(A)第一和第三多肽鏈的CH2-CH3結構域各具有序列SEQ ID NO：6，以便由它們締合形成的Fc結構域展示正常的FcγR介導的效應子功能；或(B)第一和第三多肽鏈的CH2-CH3結構域包括相對於SEQ ID NO：6的序列的至少一個氨基酸取代，以便由它們締合形成的Fc結構域展示改變的FcγR介導的效應子功能。
在一些實施方式中，其中第一和第三多肽鏈的CH2-CH3結構域彼此不同並且具有選自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。
在一些實施方式中，(A)表位I、表位II和表位III分別是CD3的表位、CD8的表位和疾病相關的抗原的表位；(B)表位I、表位II和表 位III分別是CD3的表位、疾病相關的抗原的表位和CD8的表位；(C)表位I、表位II和表位III分別是CD8的表位、CD3的表位和疾病相關的抗原的表位；(D)表位I、表位II和表位III分別是CD8的表位、疾病相關的抗原的表位和CD3的表位；(E)表位I、表位II和表位III分別是疾病相關的抗原的表位、CD3的表位和CD8的表位；或(F)表位I、表位II和表位III分別是疾病相關的抗原的表位、CD8的表位和CD3的表位。
在一些實施方式中：(A)CD3的表位是由抗體OKT3、M291、YTH12.5、CD3 mAb 1或CD3 mAb 2識別的CD3表位；或(B)CD8的表位是由抗體TRX2或OKT8識別的CD8表位。
本發明另外涉及一種藥學組合物，其包括上述三特異性結合分子和藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
本發明另外涉及一種治療癌症的方法，其包括向需要其的個體施用有效量的上述藥學組合物，其中疾病相關的抗原是癌症抗原。
本發明另外涉及一種治療與病原體的存在相關的疾病方法，其包括向需要其的個體施用有效量的權利要求15的藥學組合物，其中疾病相關的抗原是病原體抗原。
本發明另外涉及一種抗ROR1抗體，或ROR1結合片段，其中抗體包括：(A)輕鏈可變結構域，其包括CDRL1，其具有序列SEQ ID NO：117，CDRL2，其具有序列SEQ ID NO：118，和CDRL3，其具有序列SEQ ID NO：119；和(B)重鏈可變結構域，其包括CDRH1，其具有序列SEQ ID NO：120，CDRH2，其具有序列SEQ ID NO：121，和CDRH3，其具有序列SEQ ID NO：122。
在一些實施方式中，抗體具有輕鏈可變結構域，其具有序列SEQ ID NO：51。本發明另外涉及這樣的抗ROR1抗體或其ROR1結 合片段的實施方式，其中抗體具有重鏈可變結構域，其具有序列SEQ ID NO：52，或同時具有具有序列SEQ ID NO：51的輕鏈可變結構域和具有序列SEQ ID NO：52的重鏈可變結構域。
本發明另外涉及一種雙抗體、BiTe或單鏈抗體，其包括任何這些權利要求抗ROR1抗體的ROR1結合片段。
本發明另外涉及一種藥學組合物，其包括任何上述抗ROR1抗體或其ROR1結合片段和藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。本發明另外涉及治療癌症的方法，其包括向需要其的個體施用有效量的這樣的藥學組合物。
VL:結構域
VL1:結構域
VL2:結構域
VH:結構域
VH1:結構域
VH2:結構域
CH1:結構域
CH2:結構域
CH3:結構域
CL:結構域
[圖1A-1B]顯示DARTTM雙抗體的結構域。圖1A為基本的DARTTM雙抗體的結構域的示意圖。圖1B為由兩條多肽鏈組成的共價結合的雙抗體的示意圖，其中每條多肽鏈各具有識別相同表位的異源二聚體-促進結構域VL和VH結構域--使用相同的陰影顯示。
[圖2A-2B]提供了由兩條多肽鏈組成的共價結合的雙抗體的示意圖，每條多肽鏈具有CH2和CH3結構域(圖2A)或其中僅僅一條多肽鏈具有CH2和CH3結構域(圖2B)，以便締合的鏈形成Fc結構域，其包括天然存在的Fc結構域的全部或一部分。於此，使用相同的陰影顯示識別相同表位的VL和VH結構域。
[圖3A-3C]提供了顯示由兩對多肽鏈組成的四價雙抗體的示意圖。此些多肽鏈對是不同的，因此產生雙特異性分子，其對於兩個表位中的每一個而言是二價的，其中一個表位是DR5的表位和另一個表位是效應細胞的表面上存在的分子的表位。每個對的一個多肽具有CH2和CH3結 構域，以便締合的鏈形成Fc結構域，其包括天然存在的Fc結構域的全部或一部分。使用相同的陰影顯示識別相同表位的VL和VH結構域。僅僅一對表位(用相同的陰影顯示)能夠結合DR5。圖3A顯示Ig雙抗體。圖3B顯示Ig雙抗體，其包含E-螺旋和K-螺旋異源二聚體-促進結構域。圖3C顯示Fc-DARTTM雙抗體，其包含抗體CH1和CL結構域。符號“VL1”和“VH1”分別表示結合“第一”表位的輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域。類似地，符號“VL2”和“VH2”分別表示結合“第二”表位的輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域。
[圖4A-4L]提供了優選的三特異性結合分子的結構域的圖示。圖4A和4B分別示意性地圖示了優選的三特異性結合分子的結構域，其中三特異性結合分子的非雙抗體型結合結構域是Fab型結合結構域或T細胞受體結合結構域。圖4C和4D分別示意性地圖示了優選的具有不同的結構域取向的三特異性結合分子的結構域，其中非雙抗體型結合結構域是Fab型結合結構域或T細胞受體型結合結構域。圖4E-4J描繪了具有三條多肽鏈的分子。分子可具有鉸鏈和CL結構域(圖4E、4H)或可包含可選的接頭肽(圖4F、4I)。圖4K-4L描繪了具有五條多肽鏈的類似的分子。
[圖5A-5D]顯示B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子結合A498靶細胞(圖5A)和JIMT-1靶細胞(圖5B)、CD5+/CD4-門控PBMC(圖5C)和CD5+/CD4+門控PBMC(圖5D)的能力。
[圖6A-6C]顯示了根據本發明一實施方式的三特異性結合分子介導重定向殺傷靶細胞的能力。圖6A顯示了細胞裂解JIMT-1細胞的螢光素酶試驗的結果。圖6B顯示了JIMT-1細胞的細胞毒性的LDH試驗的結果。圖6C顯示了A498細胞的細胞毒性的LDH試驗的結果。
[圖7A-7D]顯示了根據本發明一實施方式的三特異性結合分子在用 JIMT-1細胞(圖7A：CD4/CD69 T細胞；圖7B：CD4/CD25 T細胞；圖7C：CD8/CD69 T細胞；圖7D：CD8/CD25 T細胞)溫育時介導T細胞啟動的能力。
[圖8A-8D]顯示了根據本發明一實施方式的三特異性結合分子在用A498細胞(圖8A：CD4/CD69 T細胞；圖8B：CD4/CD25 T細胞；圖8C：CD8/CD69 T細胞；圖8D：CD8/CD25 T細胞)溫育時介導T細胞啟動的能力。
[圖9A-9B]顯示人PMBC的CD5+ CD4+門控的(圖9A)或CD5+ CD4-門控的(圖9B)細胞群，其隨著增加濃度的B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子或B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子而變化。B7-H3 X CD3 DARTTM(有和沒有Fc結構域)用作對照。
[圖10A-10C]顯示了不同的CD8結合結構域對B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8三特異性結合分子的細胞毒性的作用。
[圖11A-11C]顯示了通過選擇針對CD3結合結構域的位元點A、位點B或位點C調節根據本發明一實施例的三特異性結合分子結合的能力。採用的三特異性結合分子能夠免疫特異性結合疾病相關的抗原，B7-H3。使用螢光素酶試驗測量細胞毒性。
[圖12A-12C]使用LDH試驗表明了位置選擇(位點A、位點B或位點C)對由根據本發明一實施方式的三特異性結合分子介導的細胞毒性的作用。
[圖13A-13E]使用B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子、CD3 mAb 2/CD8 mAb 1/B7-H3 mAb 1三特異性結合分子和B7-H3 mAb 1/CD8 mAb 1/CD3 mAb 2三特異性結合分子顯 示了位置變化對細胞毒性的作用。具有Fc結構域的B7-H3 X CD3 DARTTM用作對照。
[圖14A-14B]在位點C佈置CD3結合結構域，大大降低了與CD5+ CD4+細胞(圖14A)和CD5+ CD4-細胞(圖14B)二者的結合。
[圖15A-15B]顯示人PMBC的CD5+ CD4+門控的(圖15A)或CD5+ CD4-門控的(圖15B)細胞群，其隨著增加濃度的5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子或5T4 mAb2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子而變化。5T4 X CD3 DARTTM(有和沒有Fc結構域)用作對照。
[圖16A-16C]顯示了位置變化對細胞毒性的觀察作用不取決於採用的CD8結合結構域。
[圖17A-17C]顯示了根據本發明一實施方式的三特異性結合分子介導重定向殺傷表達ROR1的靶細胞的能力。
[圖18A-18C]顯示了HIV mAb1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1和HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子結合可溶性、固定的gp140蛋白質(圖18A)、人CD3(圖18B)和gp140蛋白質和人CD3(圖18C)二者的能力。
[圖19A-19C]顯示了HIV mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1和HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子，與對照三特異性結合分子相比(圖19C)，結合表達HIV env的HEK293/D375細胞的能力。
[圖20A-20B]顯示了HIV mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1和HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子結合以展示對人PBMC的CD5+/CD5-細胞群體的特異性結合的能力。
[圖21A-21F]顯示了由HIV mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1或HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子在存在或沒有四環素的情況下(圖21A-21B；圖21C-21D)對Jurkat細胞介導的細胞毒性活性。圖21E-21F顯示了對照抗RSV抗體(帕利珠單抗(Palivizumab)；RSV mAb 1)三特異性結合分子的細胞毒性活性。
[圖22A-22B]顯示了在用純化的全(pan)T細胞和HIV mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1或HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子溫育之後1天和2天時，活的表達HIV env的Jurkat 522 FY細胞的百分數。
[圖23A-23C]顯示了使用CD4+、CD8+或全T細胞評估HIV mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子對表達HIV env的Jurkat 522 FY細胞的CTL活性的結果。
[圖24A-24C]顯示了使用CD4+、CD8+或全T細胞評估HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子對表達HIV env的Jurkat 522 FY細胞的CTL活性的結果。
[圖25A-25C]顯示了具有CD3 mAb 2結合結構域的DARTTM分子(圖25A)和其CD3 mAb 2Low(低)(圖25B)和CD3 mAb 2Fast(快速)(圖25C)親和性變體的結合動力學。
[圖26A-26B]顯示了人PMBC的CD5+ CD4+門控的(圖26A)或CD5+ CD4-門控的(圖26B)細胞群，其隨著增加濃度的5T4 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子、5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Low/CD8 mAb 1三特異性結合分子和5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Fast/CD8 mAb 1三特異性結合分子的變化而變化。5T4 X CD3 DARTTM(以野生型，Low和Fast CD3特異性作為對照。
[圖27A-27C]顯示了使用LDH試驗，CD3 mAb變體(CD3 mAb 2 Low和CD3 mAb 2 Fast)對5T4 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的細胞毒性的作用。
[圖28A-28F]顯示了在存在增加濃度的5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 /CD8 mAb 1三特異性結合分子、5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Low/CD8 mAb 1三特異性結合分子和5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Fast/CD8 mAb 1三特異性結合分子的情況下，從來自供體1的PBMC釋放的IFN-γ(圖28A)、TNF-α(圖28B)、IL-10(圖28C)、IL-6(圖28D)、IL-4(圖28E)和IL-2(圖28F)的水準。
[圖29A-29F]顯示了在存在增加濃度的5T4 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子、5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Low/CD8 mAb 1三特異性結合分子和5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Fast/CD8 mAb 1三特異性結合分子的情況下，從來自供體2的PBMC釋放的IFN-γ(圖29A)、TNF-α(圖29B)、IL-10(圖29C)、IL-6(圖29D)、IL-4(圖29E)和IL-2(圖29F)的水準。
本申請要求美國專利申請號62/008,229(2014年6月5日提交；未決)、62/004,571(2014年5月29日提交；未決)和62/107,824(2015年1月26日提交)的優先權，其每一篇申請均通過引用以其整體併入本文。
本發明涉及三特異性結合分子，其是具有三個結合結構域的多鏈多肽分子，因此能夠介導與三個表位的配位結合。可選擇結合結構域以便三特異性結合分子能夠結合任何三個不同表位。這樣的表位可 以是相同抗原的表位或兩個或三個不同抗原的表位。本發明也涉及新的ROR1結合抗體，以及其衍生物和這樣的組合物的用途。
I.一般技術和一般定義
除非另外指出，否則本發明任一實施方式的實踐將採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的常規的技術，其在本領域的技術範圍內。在下述文獻中充分闡釋了這樣的技術，比如：MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第三版(Sambrook等Eds.,2001)Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY；OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS：METHODS AND APPLICATIONS(Methods in Molecular Biology),Herdewijn,P.,Ed.,Humana Press,Totowa,NJ；OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS(Gait,M.J.,Ed.,1984)；METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Humana Press,Totowa,NJ；CELL BIOLOGY：A LABORATORY NOTEBOOK(Cellis,J.E.,Ed.,1998)Academic Press,New York,NY；ANIMAL CELL CULTURE(Freshney,R.I.,Ed.,1987)；INTRODUCTION TO CELL AND TISSUE CULTURE(Mather,J.P.and Roberts,P.E.,Eds.,1998)Plenum Press,New York,NY；CELL AND TISSUE CULTURE：LABORATORY PROCEDURES(Doyle,A.等，Eds.,1993-8)John Wiley and Sons,Hoboken,NJ；METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press,Inc.)New York,NY；WEIR’S HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY(Herzenberg,L.A.等Eds.1997)Wiley-Blackwell Publishers,New York,NY；GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS(Miller,J.M.等Eds.,1987) Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,F.M.等，Eds.,1987)Greene Pub.Associates,New York,NY；PCR：THE POLYMERASE CHAIN REACTION,(Mullis,K.等，Eds.,1994)Birkhäuser,Boston MA；CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(Coligan,J.E.等，eds.,1991)John Wiley and Sons,Hoboken,NJ；SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(John Wiley and Sons,1999)Hoboken,NJ；IMMUNOBIOLOGY 7(Janeway,C.A.等2007)Garland Science,London,UK；Antibodies(P.Finch,1997)Stride Publications,Devoran,UK；ANTIBODIES：A PRACTICAL APPROACH(D.Catty.,ed.,1989)Oxford University Press,USA,New York NY)；MONOCLONAL ANTIBODIES：A PRACTICAL APPROACH(Shepherd,P.等Eds.,2000)Oxford University Press,USA,New York NY；USING ANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL(Harlow,E.等Eds.,1998)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；THE ANTIBODIES(Zanetti,M.等Eds.1995)Harwood Academic Publishers,London,UK)；和DEVITA,HELLMAN,AND ROSENBERG'S CANCER：PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY,EIGHTH EDITION,DeVita,V.等Eds.2008,Lippincott Williams & Wilkins,Philadelphia,PA。
II.本發明優選的三特異性結合分子
A．結合能力
在一些實施方式中，三特異性結合分子能夠協同和同時結合三個不同的表位。其中，三特異性結合分子包括：(I)“結合結構域I”和“結合結構域II”、(II)“非雙抗體型”“結合結構域III”、以及(III)Fc結構域。
(I)“結合結構域I”，其能夠免疫特異性結合第一抗原上存在的“表位I”，和“結合結構域II”，其能夠免疫特異性結合第二抗原上存在的“表位II”，其中此結合結構域I和此結合結構域II都是“雙抗體型結合結構域”；(II)“非雙抗體型”“結合結構域III”，其能夠免疫特異性結合第三抗原上存在的“表位III”；和(III)Fc結構域，其通過兩個CH2-CH3結構域彼此複合而形成。
典型地，在一些實施方式中，三特異性結合分子包括四條不同多肽鏈，每條鏈各具有氨基末端和羧基末端(見圖4A-4D、圖5A和圖5B)，但是，通過彼此融合這樣的多肽鏈(例如，經肽鍵)或通過將這樣的多肽鏈分開形成另外的多肽鏈，分子可包括更少或更多數量的多肽鏈。圖4E-4J通過示意性描繪這樣的具有三條多肽鏈的分子。圖4K-4L通過示意性描繪具有五條多肽鏈的分子。
儘管這樣的三特異性結合分子是特別優選的，但是在另一些實施方式中，另外具體考慮這樣的三特異性結合分子：其包括足以產生具有三種結合特異性的分子的結合結構域的任何組合，其中兩種特異性是針對癌症抗原的結合特異性，並且，一種特異性是針對效應細胞抗原的結合特異性。因此，例如，三特異性結合分子包括三個Fab型結合 結構域；三特異性結合分子包括一個二價、雙特異性抗體結構域(通過例如複合兩個不同輕鏈和兩個不同重鏈形成)和一個Fab型結合結構域；三特異性結合分子包括兩個二價、雙特異性抗體結構域(通過例如複合四個不同的輕鏈和兩個不同的重鏈形成)，但是使其中一個抗體結構域無活性等。
術語“多肽”、“多肽鏈”和“肽”在本文中可互換使用，指任何長度--但是尤其是長度大於3、5、10、15、20或25個氨基酸殘基--的氨基酸的聚合物，其中兩個，更優選地，所有氨基酸殘基經醯胺(肽)鍵(-NH-C(O)-)連接。但是，聚合物可以是線性的或分支的，其可包括修飾的氨基酸，並且其可被非氨基酸中斷。此術語也包括經天然修飾的或通過干預修飾的氨基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、糖基化、脂質化(lipidation)、乙醯化、磷酸化或任何其他操作或修飾，比如結合標籤組分。同樣包括在定義中的是，例如，多肽，其包含一個或多個氨基酸的類似物(包括，例如，非天然氨基酸等)以及本領域已知的其他修飾。本發明的多肽可作為單鏈或複合的鏈存在。
“雙抗體型結合結構域”是雙抗體，尤其是DART®雙抗體的表位結合結構域。術語“雙抗體”和“DART®雙抗體”已經在上面討論了，其指這樣的分子：其包括優選地通過共價相互作用彼此複合的至少兩條多肽鏈，以形成至少兩個表位結合位點，其可識別相同的或不同的表位。雙抗體或DART®雙抗體的多肽鏈中的兩條均包括免疫球蛋白輕鏈可變區和免疫球蛋白重鏈可變區，但是這些區域不相互作用形成表位結合位點(即，它們不是相互“互補的”)。相反，雙抗體或DART®雙抗體鏈中的一個(例如，第一)的免疫球蛋白重鏈可變區與不同的(例如，第二)雙抗體或DART®雙抗體多肽鏈的免疫球蛋白輕鏈可變區相互作 用，形成表位結合位點。類似地，雙抗體或DART®雙抗體多肽鏈中的一個(例如，第一)的免疫球蛋白輕鏈可變區與不同的(例如，第二)雙抗體或DART®雙抗體多肽鏈的免疫球蛋白重鏈可變區相互作用，形成表位結合位點。DART®雙抗體分子公開在下述文獻中：美國專利公開號2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910；歐洲專利公開號EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221；和PCT公開號WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538、WO 2006/113665、WO 2008/157379；和Moore,P.A.等(2011)“Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,”Blood 117(17)：4542-4551；Veri,M.C.等(2010)“Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb(CD32B)Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,”Arthritis Rheum.62(7)：1933-1943；和Johnson,S.等(2010)“Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion,”J.Mol.Biol.399(3)：436-449。
結合結構域III優選地是“非雙抗體型”結合結構域，其旨在表示結合結構域III不具有雙抗體型結合結構域的結構。優選地，結合結構域III是非雙抗體型結合結構域，其是Fab型結合結構域或受體型結合結構域。如本文所使用，術語“Fab型結合結構域”指這樣的表位結合結構域，其通過免疫球蛋白輕鏈的VL結構域和免疫球蛋白重鏈的互補的VH結構域的相互作用形成。Fab型結合結構域與雙抗體型結合結構域的不同之處在於形成Fab型結合結構域的兩個多肽鏈僅僅包括單 個表位結合結構域，而形成雙抗體型結合結構域的兩個多肽鏈包括至少兩個表位結合結構域。因此，如本文所使用Fab型結合結構域與雙抗體型結合結構域不同。如本文所使用，術語“受體型結合結構域”指通過兩個多肽的相互作用形成的細胞受體的表位結合結構域。本文通過參考T細胞受體型結合結構域例證了受體型結合結構域，此T細胞受體型結合結構域通過T細胞受體α鏈的可變結構域和T細胞受體β鏈的可變結構域相互作用而形成。這樣的T細胞受體結合結構域識別在MHC背景下展示的肽，因此能夠識別細胞內表位。儘管本發明參考這樣的受體型結合結構域得以闡釋，但是應認識到也可採用T細胞受體型結合結構域之外的受體型結合結構域，並且其包括在本發明中。具有受體型結合結構域的受體的其他例子包括IL-2受體、IL-4受體、IL-7受體、IL-9受體、IL-15受體、IL-21胰島素受體和胸腺基質淋巴細胞生成素。
因此，根據本發明的任一實施方式的三特異性結合分子與四價結合分子比如由二價抗體二聚化產生的那些四價結合分子不同，並且優選地具備三個而不是四個結合結構域。如下面所討論，本發明的三特異性分子可具有另外的結合結構域(比如白蛋白-結合結構域、FcγR-結合結構域等)。這樣另外的結合結構域不旨在被視為或考慮是本發明的三特異性結合分子的三個結合結構域之一。
如本文所使用，術語“締合(association)”或“締合(assoiating)”，就多肽(例如，一個雙抗體多肽與另一雙抗體多肽締合、免疫球蛋白輕鏈與免疫球蛋白重鏈締合、一個CH2-CH3結構域與另一CH2-CH3結構域締合等)而言，旨在表示多肽的非共價結合。術語”複合(complexes)”或“複合(complexing)”旨在表示多肽的共價結合。
如本文所使用，如果至少其兩個結合結構域，優選地，其所有的結合結構域，能夠同時結合它們各自識別的表位或結合配體，則認為三特異性結合分子的結合結構域介導“配位結合(coordinated binding)”。這樣的結合可以是同時的。但是，本發明的一個方面涉及修飾這樣的結合結構域結合它們識別的表位的”結合速率”和/或“解離速率”。如本文所使用，結合的“結合速率(on rate)”適對這樣的結合結構域識別和啟動與它們識別表位的結合的親和性的度量。相反，結合的“解離速率”是對結合結構域：表位複合物穩定性程度的度量。結合的”結合速率”和/或“解離速率”可通過改變結合結構域的CDR的氨基酸序列修飾。如下面所討論，不依賴於任何CDR修飾，本發明分子的配位結合的程度可通過改變它們的結合結構域的構型來調節，從而具體的結合結構域(即，VLx/VHx結構域)作為結合結構域III而存在或作為相對於結合結構域III的內部或外部雙抗體型結合結構域(下面詳細討論)而存在。
根據本發明任一實施方式的三特異性結合分子的結合結構域的結合速率和解離速率可容易通過本領域熟知的方法測量，例如通過下述方法測量：Biacore®分析(Jason-Moller,L.等(2006)“Overview Of Biacore Systems And Their Applications,”Curr.Protoc.Protein Sci.Chapter 19：Unit 19.13；；Swanson,S.J.(2005)“Characterization Of An Immune Response,”Dev.Biol.(Basel).122：95-101；；Buijs,J.等(2005)“SPR-MS In Functional Proteomics,”Brief Funct.Genomic Proteomic.4(1)：39-47；Karlsson,R.等(2004)“SPR For Molecular Interaction Analysis：A Review Of Emerging Application Areas,”J.Mol.Recognit.17(3)：151-161；Van Regenmortel,M.H.(2003)“Improving The Quality Of BIACORE-Based Affinity Measurements,”Dev.Biol.(Basel)112：141-151；Malmqvist,M.(1999)“BIACORE：An AffinityBiosensor System For Characterization Of Biomolecular Interactions,”Biochem.Soc.Trans.27(2)：335-340；Malmqvist,M.等(1997)“Biomolecular Interaction Analysis：Affinity Biosensor Technologies For Functional Analysis Of Proteins,”Curr.Opin.Chem.Biol.1(3)：378-383；Fivash,M.等(1998)“Biacore For Macromolecular Interaction,”Curr.Opin.Biotechnol.9(1)：97-101；Malmborg,A.C.等(1995)“Biacore As A Tool In Antibody Engineering,”J.Immunol.Methods.183(1)：7-13)。根據本發明任一實施方式的三特異性結合分子的結合結構域的結合速率和解離速率可容易通過如下方式改變：編碼這樣的結合結構域的核酸分子的隨機或定向誘變，隨後針對它們編碼展示這樣的改變結合動力學的突變蛋白質的能力，常規篩選收穫的核酸分子。
根據本發明任一實施方式的三特異性結合分子的結合結構域以“免疫特異性”方式結合表位。如本文所使用，如果其相對於可選的表位，與此表位更頻繁、更快速地以更大的持續時間和/或以更大的親和性反應或締合，則認為抗體、雙抗體或其他表位結合分子“免疫特異性”結合另一分子的區域(即，表位)。例如，免疫特異性結合病毒表位的抗體是這樣的抗體：與其免疫特異性結合其他病毒表位或非病毒表位相比，此抗體以更大的親和性、抗體親抗原性、更容易和/或以更持久的時間結合此病毒表位。通過閱讀此定義，應理解，例如，免疫特異性結合第一靶的抗體(或部分或表位)可能或可能不特異性或優選結合第二靶。因此，“特異性結合”不一定要求(儘管其可包括)排他性結合。一般而言， 但是不一定，提及結合則意味著”特異性”結合。如果，這樣的結合展示受體結合它們各自配體的特異性，則認為兩個分子能夠彼此以“生理特異性”方式結合。
因此，在它們最簡單的實施方式中，優選的結合分子是至少三特異性的--能夠介導與三個不同表位的配位結合。顯著地，這樣的分子具有能夠結合抗原的至少三個“位點”：“外部”雙抗體型結合結構域，其距離結合結構域III最遠；“內部”雙抗體型結合結構域，其距離結合結構域III最近；和結合結構域III本身。這樣的結構域的位置分別命名為位點A、位點B和位點C(圖4A-4D)。
選擇彼此不同的結合表位I、II和III的結合結構域。但是，表位I、II和III可以是相同抗原的表位、兩個不同抗原的表位或三個不同抗原的表位。因此，根據本發明任一實施方式的三特異性結合分子可能夠協同結合1、2或3個不同的抗原分子。對於任何可能的表位和任何可能的抗原，可採用根據本發明任一實施方式的三特異性結合分子。例如，三特異性結合分子可具有1、2或3個結合結構域，其結合效應細胞的表位(例如，CD2、CD3、CD16、CD19、CD20、CD22、CD32B、CD64、B細胞受體(BCR)、T細胞受體(TCR)和NKG2D受體)，或結合細胞毒性T細胞的表位(例如，細胞毒性T細胞上存在的CD8)或結合疾病相關的抗原的表位，或這樣的可能結合結構域的任何組合。
如本文所使用，“疾病相關的抗原”是在“感染病原體的”細胞或“癌症細胞”上特徵性表達但是在正常細胞上不是特徵性表達的的抗原。
如本文所使用，術語“感染病原體的”細胞指已經被下述感染的細胞：細菌(例如，大腸埃希氏菌、艱難梭菌(C.difficile)、傷寒沙 門氏菌(Salmonella thyphimurium)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)、流感嗜血桿菌(Hemophilus influenzae)、痢疾志賀菌(Shigella dysenteriae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)和肺炎鏈球菌等(Streptococcus pneumonia))，真菌(例如，念珠菌屬(Candida)、曲黴菌屬(Aspergillus)、隱球菌屬(Cryptococcus)、球孢子菌屬(Coccidioides)、組織胞漿菌屬(Histoplasma)、肺孢菌屬(Pneumocystis)、葡萄穗黴菌屬(Stachybotrys)等)、原生動物(變形蟲類(Amoebozoa)、古蟲類(Excavata)、囊泡藻類(Chromalveolata)、內變形蟲類(Entamoeba)、瘧原蟲屬(Plasmodium)、賈第蟲(Giardia)、錐體蟲屬(Trypanosoma)、球蟲亞綱(Coccidia)、貝諾屬(Besnoitia)、岐腔屬(Dicrocoelium)、利什曼蟲屬(Leishmania)等)或病毒(尤其是腺病毒、腺伴隨病毒、B病毒(恒河猴皰疹病毒I型(macacine herpesvirus I))、BK病毒、布尼亞病毒、切昆貢亞(chikungunya)病毒、柯薩奇(cocksackie)病毒、冠狀病毒、巨細胞病毒、東部馬腦炎(eastern equine encephalitis)病毒、埃博拉病毒、腸道病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒、漢坦病毒(hantavirus)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒，單純性皰疹病毒1型、單純性皰疹病毒2型、人泡沫病毒(human foamy virus)、人皰疹病毒3型、人皰疹病毒5型、人皰疹病毒6型、人皰疹病毒7型、人免疫缺陷病毒、人乳頭瘤病毒、人β-嗜淋巴細胞病毒、人T細胞白血病病毒I型、人T細胞白血病病毒II型、流感病毒、JC病毒、JEV、卡波西氏肉瘤相關的皰疹病毒、拉沙病毒、淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病 毒、瑪律堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、尼帕病毒(Nipah virus)、諾如病毒(norovirus)、諾瓦克(Norwalk)病毒、正呼腸孤病毒(orthoreovirus)、副流感病毒、細小病毒、脊髓灰質炎病毒(poliovirus)、狂犬病病毒、呼腸病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、裂谷熱病毒、輪狀病毒、風疹病毒、天花病毒、聖路易腦炎病毒、重型天花病毒(variola major virus)、卡菲爾痘病毒(variola minor virus)、水痘-皰疹病毒(vericella-zoster virus)、西尼祿病毒、西部馬腦炎病毒或黃熱病病毒)。
如本文所使用，術語“癌症細胞”指下述的惡性細胞：腎上腺腫瘤、AIDS相關的癌症、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞腫瘤、膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌、轉移性腦腫瘤、乳腺癌、頸動脈體腫瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色細胞腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、成纖維細胞性小圓細胞腫瘤、室管膜瘤、尤文氏腫瘤、骨外黏液樣軟骨肉瘤、不完全性骨纖維生成、骨纖維發育不良、膽囊或膽管癌、胃癌、妊娠滋養層疾病、生殖細胞腫瘤、頭頸癌、肝細胞癌、胰島細胞腫瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌、白血病、脂瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、多發性內分泌瘤形成、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、成神經細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺腫瘤、兒科癌症(pediatric cancer)、末梢神經鞘腫瘤、嗜鉻細胞瘤(phaeochromocytoma)、垂體腫瘤、***癌、後眼色素層(posterious uveal)黑素瘤、罕見的血液疾病、腎轉移性癌、杆狀(rhabdoid)腫瘤、橫紋肌肉瘤(rhabdomvsarcoma)、肉瘤、皮膚癌、 軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌或子宮癌。
由癌症細胞特徵性表達的抗原的例子包括“癌症抗原”比如乳腺癌抗原、卵巢癌抗原、***癌抗原、宮頸癌抗原、胰腺癌抗原、肺癌抗原、膀胱癌抗原、結腸癌抗原、睾丸癌抗原、膠質母細胞瘤癌症抗原、與B細胞惡性腫瘤相關的抗原、與多發性骨髓瘤相關的抗原、與非霍奇金淋巴瘤相關的抗原，或與慢性淋巴細胞白血病相關的抗原。由癌症細胞特徵性表達的示例性抗原包括下述抗原：結腸癌抗原19.9、胃癌黏蛋白抗原4.2；結直腸癌抗原A33(參見Almqvist,Y.2006，Nucl Med Biol.Nov；33(8)：991-998)；ADAM-9(參見美國專利公開號2006/0172350、PCT公開號WO 06/084075)；AFP癌胚抗原-甲胎蛋白(參見Malaguarnera,G.等(2010)“Serum markers of hepatocellular carcinoma,”Dig.Dis.Sci.55(10)：2744-2755)；ALCAM(參見PCT公開號WO 03/093443)；BAGE(參見Bodey,B.2002 Expert Opin Biol Ther.2(6)：577-84)；β-聯蛋白(參見Prange W.等2003 J Pathol.201(2)：250-9)；CA125(參見Bast,R.C.Jr.等2005 Int J Gynecol Cancer 15 Suppl 3：274-81)；羧肽酶M(參見美國專利公開號2006/0166291)；B1(參見Egloff,A.M.等2006，Cancer Res.66(1)：6-9)；CD5(參見Calin,G.A.等2006 Semin Oncol.33(2)：167-73；CD19(參見Troussard,X.等1998 Hematol Cell Ther.40(4)：139-48)；CD20(參見Thomas,D.A.等2006 Hematol Oncol Clin North Am.20(5)：1125-36)；CD20(參見Cang,S.等(2012)”Novel CD20 Monoclonal Antibodies For Lymphoma Therapy,”J.Hematol.Oncol.5：64 pp.1-9)；CD22(參見Kreitman,R.J.2006 AAPS J. 18；8(3)：E532-51)；CD23(參見Rosati,S.等2005 Curr Top Microbiol Immunol.5；294：91-107)；CD25(參見Troussard,X.等1998 Hematol Cell Ther.40(4)：139-48)；CD27(參見Bataille,R.2006 Haematologica 91(9)：1234-40)；CD28(參見Bataille,R.2006 Haematologica 91(9)：1234-40)；CD30(參見Muta,H.等(2013)“CD30：From Basic Research To Cancer Therapy,”Immunol.Res.57(1-3)：151-158)；CD33(參見Walter,R.B.等(2012)“Acute myeloid leukemia stem cells and CD33-targeted immunotherapy,”Blood 119(26)：6198-6208)；CD36(參見Ge,Y.2005 Lab Hematol.11(1)：31-7)；CD40/CD154(參見Messmer,D.等2005 Ann N Y Acad Sci.1062：51-60)；CD45(參見Jurcic,J.G.2005 Curr Oncol Rep.7(5)：339-46)；CD56(參見Bataille,R.2006 Haematologica 91(9)：1234-40)；CD46(參見美國專利號7,148,038；PCT公開號WO 03/032814；Russell,S.等(2004)“CD46：A Complement Regulator And Pathogen Receptor That Mediates Links Between Innate And Acquired Immune Function,”Tissue Antigens 64(2)：111-118)；CD52(參見Hoelzer,D.等(2013)“Targeted therapy with monoclonal antibodies in acute lymphoblastic leukemia,”Curr.Opin.Oncol.25(6)：701-706)；CD79a/CD79b(參見Troussard,X.等1998 Hematol Cell Ther.40(4)：139-48；Chu P.G.等2001 Appl Immunohistochem Mol Morphol.9(2)：97-106)；CD103(參見Troussard,X.等1998 Hematol Cell Ther.40(4)：139-48)；CD317(參見Palma,G.等(2012)“Plasmacytoids Dendritic Cells Are A Therapeutic Target In Anticancer Immunity,”Biochim.Biophys.Acta.1826(2)：407-414)； CDK4(參見Lee,Y.M.等2006 Cell Cycle 5(18)：2110-4)；CEA(參見carcinoembryonic antigen；Mathelin,C.2006 Gynecol Obstet Fertil.34(7-8)：638-46；Tellez-Avila,F.I.等2005 Rev Invest Clin.57(6)：814-9)；CEACAM5和CEACAM6(參見PCT公開號WO 2011/034660；Zheng,C.等(2011)“A Novel Anti-CEACAM5 Monoclonal Antibody,CC4,Suppresses Colorectal Tumor Growth and Enhances NK Cells-Mediated Tumor Immunity,”PLoS One 6(6)：e21146，pp.1-11)；CO17-1A(參見Adkins,J.C.等(1998)“Edrecolomab(Monoclonal Antibody 17-1A),”Drugs 56(4)：619-626；CO-43(血型Leb)和CO-514(血型Lea)(參見Garratty,G.(1995)“Blood Group Antigens As Tumor Markers,Parasitic/Bacterial/Viral Receptors,And Their Association With Immunologically Important Proteins,”Immunol.Invest.24(1-2)：213-232)；CTLA-1和CTLA-4(參見Peggs,K.S.等2006 Curr Opin Immunol.18(2)：206-13)；細胞角蛋白8(參見PCT公開號WO 03/024191)；抗原D1.1(參見Dao,T.等(2009)“Identification Of A Human Cyclin D1-Derived Peptide That Induces Human Cytotoxic CD4 T Cells,”PLoS One.4(8)：e6730)；DR5(參見Abdulghani,J.等(2010)“TRAIL Receptor Signaling And Therapeutics,”Expert Opin.Ther.Targets 14(10)：1091-1108；Andera,L.(2009)“Signaling Activated By The Death Receptors Of The TNFR Family,”Biomed.Pap.Med.Fac.Univ.Palacky Olomouc Czech.Repub.153(3)：173-180；Carlo-Stella,C.等(2007)“Targeting TRAIL Agonistic Receptors for Cancer Therapy,”Clin,Cancer 13(8)：2313-2317；Chaudhari,B.R.等(2006)“Following the TRAIL to Apoptosis,”Immunologic Res.35(3)：249-262)；E1系列(血型B)；EGF-R(表皮生長因數受體)(參見Adenis,A.等2003 Bull Cancer.90 Spec No：S228-32)；肝配蛋白受體(尤其EphA2)(參見美國專利號7,569,672；PCT公開號WO 06/084226)；Erb(ErbB1；ErbB3；ErbB4)(參見Zhou,H.等2002 Oncogene 21(57)：8732-40；Rimon,E.等2004Int J Oncol.24(5)：1325-38)；肺腺癌抗原F3(參見Greulich,H.等(2012)”Functional analysis of receptor tyrosine kinase mutations in lung cancer identifies oncogenic extracellular domain mutations of ERBB2,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)109(36)：14476-14481)；抗原FC10.2(參見Loveless,W.等(1990)“Developmental Patterning Of The Carbohydrate Antigen FC10.2 During Early Embryogenesis In The Chick,”Development 108(1)：97-106)；GAGE(GAGE-1；GAGE-2)(參見Akcakanat,A.等2006 Int J Cancer.118(1)：123-8)；GD2/GD3/GD49/GM2/GM3(參見Livingston,P.O.等2005 Cancer Immunol Immunother.54(10)：1018-25)；GICA 19-9(參見Herlyn等(1982)“Monoclonal Antibody Detection Of A Circulating Tumor-Associated Antigen.I.Presence Of Antigen In Sera Of Patients With Colorectal,Gastric,And Pancreatic Carcinoma,”J.Clin.Immunol.2：135-140)；gp37(參見人白血病T細胞抗原((Bhattacharya-Chatterjee等(1988)“Idiotype Vaccines Against Human T Cell Leukemia.II.Generation And Characterization Of A Monoclonal Idiotype Cascade(Ab1,Ab2,and Ab3),”J.Immunol.141：1398-1403)；gp75(黑素瘤抗原)(參見Vijayasardahl等(1990) “The Melanoma Antigen Gp75 Is The Human Homologue Of The Mouse B(Brown)Locus Gene Product,”J.Exp.Med.171(4)：1375-1380)；gp100(參見Lotem，M.等2006 J Immunother.29(6)：616-27)；HER-2/neu(參見Kumar,Pal S等2006 Semin Oncol.33(4)：386-91)；人B-淋巴瘤抗原-CD20(參見Reff等(1994)“Depletion Of B Cells In Vivo By A Chimeric Mouse Human Monoclonal Antibody To CD20,”Blood 83：435-445)；人乳脂肪球(milk fat globule)抗原；人乳頭瘤病毒-E6/人乳頭瘤病毒-E7(參見DiMaio,D.等2006 Adv Virus Res.66：125-59)；HMW-MAA(高分子量黑素瘤抗原)(參見Natali等(1987)“Immunohistochemical Detection Of Antigen In Human Primary And Metastatic Melanomas By The Monoclonal Antibody 140.240 And Its Possible Prognostic Significance,”Cancer 59：55-63；Mittelman等(1990)“Active Specific Immunotherapy In Patients With Melanoma.A Clinical Trial With Mouse Antiidiotypic Monoclonal Antibodies Elicited With Syngeneic Anti-High-Molecular-Weight-Melanoma-Associated Antigen Monoclonal Antibodies,”J.Clin.Invest.86：2136-2144)；I抗原(分化抗原)(參見Feizi(1985)“Demonstration By Monoclonal Antibodies That Carbohydrate Structures Of Glycoproteins And Glycolipids Are Onco-Developmental Antigens,”Nature 314：53-57)諸如在胃腺癌發現的I(Ma)；整聯蛋白α-V-β-6整聯蛋白β6(ITGB6)(參見PCT公開號WO 03/087340)；JAM-3(參見PCT公開號WO 06/084078)；白介素-13受體α2(IL13Rα2)(參見Bodhinayake,I.等(2014)“Targeting A Heterogeneous Tumor：The Promise Of The Interleukin-13 Receptor α2,”Neurosurgery 75(2)：N18-9)；JAM-3(參見PCT公開號WO 06/084078)；KID3(參見PCT公開號WO 05/028498)；KID3(參見PCT公開號WO 05/028498)；KID31(參見PCT公開號WO 06/076584)；KID31(參見PCT公開號WO 06/076584)；KS 1/4全癌抗原(參見Perez等(1989)“Isolation And Characterization Of A cDNA Encoding The Ks1/4 Epithelial Carcinoma Marker,”J.Immunol.142：3662-3667；Möller等(1991)“Bispecific-Monoclonal-Antibody-Directed Lysis Of Ovarian Carcinoma Cells By Activated Human T Lymphocytes,”Cancer Immunol.Immunother.33(4)：210-216；Ragupathi,G.2005 Cancer Treat Res.123：157-80)；KS 1/4全癌抗原(參見Perez等(1989)“Isolation And Characterization Of A cDNA Encoding The Ks1/4 Epithelial Carcinoma Marker,”J.Immunol.142：3662-3667；Möller等(1991)“Bispecific-Monoclonal-Antibody-Directed Lysis Of Ovarian Carcinoma Cells By Activated Human T Lymphocytes,”Cancer Immunol.Immunother.33(4)：210-216；Ragupathi,G.2005 Cancer Treat Res.123：157-80)；KSA(17-1A)(參見Ragupathi,G.2005 Cancer Treat Res.123：157-80)；人肺癌抗原L6和L20(參見Hellström等(1986)“Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinoma,”Cancer Res.46：3917-3923)；LEA(參見Velázquez-Márquez,N.等(2012)“Sialyl Lewis x expression in cervical scrapes of premalignant lesions,”J.Biosci.37(6)：999-1004)；LUCA-2(參見美國專利公開號2006/0172349；PCT公開號WO 06/083852)；M1：22：25：8、M18、 M39(參見Cambier,L.等(2012)“M19 Modulates Skeletal Muscle Differentiation And Insulin Secretion In Pancreatic B-Cells Through Modulation Of Respiratory Chain Activity,”PLoS One 7(2)：e31815；Pui,C.H.等(1991)“Characterization of childhood acute leukemia with multiple myeloid and lymphoid markers at diagnosis and at relapse,”Blood 78(5)：1327-1337)；MAGE(MAGE-1；MAGE-3)(參見Bodey,B.2002 Expert Opin Biol Ther.2(6)：577-84)；MART(參見Kounalakis,N.等2005 Curr Oncol Rep.7(5)：377-82；Myl、MUC-1(參見Mathelin,C.2006 Gynecol Obstet Fertil.34(7-8)：638-46)；MUM-1(參見Castelli,C.等2000 J Cell Physiol.182(3)：323-31)；N-乙醯葡糖氨基轉移酶(參見Dennis,J.W.1999 Biochim Biophys Acta.6；1473(1)：21-34)；新糖蛋白(neoglycoprotein)(參見Legendre,H.等(2004)“Prognostic Stratification Of Dukes B Colon Cancer By A Neoglycoprotein,”Int.J.Oncol.25(2)：269-276)；NS-10；OFA-1和OFA-2(參見Takahashi,M.(1984)“A Study On Clinical Significance Of Oncofetal Antigen-1 In Gynecologic Tumors,”Nihon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi.36(12)：2613-2618)；制瘤素M(制瘤素受體β)(參見美國專利號7,572,896；PCT公開號WO 06/084092)；p15(參見Gil,J.等2006 Nat Rev Mol Cell Biol.7(9)：667-77)；PSA(***特異性抗原)(參見Cracco,C.M.等2005 Minerva Urol Nefrol.57(4)：301-11)；PSMA(參見Ragupathi,G.2005 Cancer Treat Res.123：157-80)；PEMA(多態上皮黏蛋白抗原)(參見Chu,N.J.等(2015)“Nonviral Oncogenic Antigens and the Inffammatory Signals Driving Early Cancer Development as Targets for Cancer Immunoprevention,”Clin.Cancer Res.21(7)：1549-1557)；PIPA(參見美國專利號7,405,061；PCT公開號WO 04/043239)；***酸性磷酸鹽(參見Tailor等(1990)“Nucleotide Sequence Of Human Prostatic Acid Phosphatase Determined From A Full-Length cDNA Clone,”Nucl.Acids Res.18(16)：4928)；R24(參見Zhou,M.等(2008)“Constitutive Overexpression Of A Novel 21 Kda Protein By Hodgkin Lymphoma And Aggressive Non-Hodgkin Lymphomas,”Mol.Cancer 7：12)；ROR1(參見美國專利號5,843,749；Rabbani,H.等(2010)“Expression Of ROR1 In Patients With Renal Cancer--A Potential Diagnostic Marker,”Iran Biomed.J.14(3)：77-82)；鞘脂(參見Hakomori,S.(1998)“Cancer-Associated Glycosphingolipid Antigens：Their Structure,Organization,And Function,”Acta Anat.(Basel)161(1-4)：79-90)；SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4(參見Muramatsu,T.等(2004)“Carbohydrate Antigens Expressed On Stem Cells And Early Embryonic Cells,”Glycoconj.J.21(1-2)：41-45)；sTn(參見Holmberg,L.A.2001 Expert Opin Biol Ther.1(5)：881-91)；源自T細胞受體的肽(參見Edelson(1998)“Cutaneous T-Cell Lymphoma：A Model For Selective Immunotherapy,”Cancer J Sci Am.4：62-71)；T 5 A 7 (參見Hogg,R.J.等(1991)“A monoclonal antibody exhibiting reactivity with both X-hapten-and lactose-bearing glycolipids,”Tissue Antigens 37(1)：33-38)；TAG-72(參見Yokota等(1992)“Rapid Tumor Penetration Of A Single-Chain Fv And Comparison With Other Immunoglobulin Forms,”Cancer Res.52：3402-3408)； TL5(血型A)(參見Gooi,H.C.等(1983)“Monoclonal antibody reactive with the human epidermal-growth-factor receptor recognizes the blood-group-A antigen,”Biosci.Rep.3(11)：1045-1052)；TNF受體(TNF-α受體、TNF-ß受體或TNF-γ受體(參見van Horssen,R.等2006 Oncologist.11(4)：397-408；Gardnerova,M.等2000 Curr Drug Targets.1(4)：327-64)；TRA-1-85(血型H)(參見Williams,B.P.等(1988)“Biochemical and genetic analysis of the OKa blood group antigen,”Immunogenetics 27(5)：322-329)；轉鐵蛋白受體(參見美國專利號7,572,895；PCT公開號WO 05/121179)；TSTA腫瘤特異性移植抗原(參見Hellström等(1985)“Monoclonal Antibodies To Cell Surface Antigens Shared By Chemically Induced Mouse Bladder Carcinomas,”Cancer.Res.45：2210-2188)；VEGF-R(參見O’Dwyer.P.J.2006 Oncologist.11(9)：992-8)；和Y半抗原，Ley(Durrant,L.G.等(1989)“Development Of An ELISA To Detect Early Local Relapse Of Colorectal Cancer,”Br.J.Cancer 60(4)：533-537)。
可用於提供任一實施方式的三特異性結合分子的可變輕鏈結構域、可變重鏈結構域、抗體輕鏈或抗體重鏈的、免疫特異性結合疾病相關的抗原表位的示例性抗體提供在表2中。
Figure 104117564-A0305-02-0058-2
Figure 104117564-A0305-02-0059-3
Figure 104117564-A0305-02-0060-4
Figure 104117564-A0305-02-0061-5
Figure 104117564-A0305-02-0062-6
Figure 104117564-A0305-02-0063-7
Figure 104117564-A0305-02-0064-8
Figure 104117564-A0305-02-0065-9
Figure 104117564-A0305-02-0066-10
Figure 104117564-A0305-02-0067-11
Figure 104117564-A0305-02-0068-12
Figure 104117564-A0305-02-0069-13
Figure 104117564-A0305-02-0070-14
Figure 104117564-A0305-02-0071-15
Figure 104117564-A0305-02-0072-16
Figure 104117564-A0305-02-0073-17
Figure 104117564-A0305-02-0074-18
Figure 104117564-A0305-02-0075-19
Figure 104117564-A0305-02-0076-20
Figure 104117564-A0305-02-0077-21
Figure 104117564-A0305-02-0078-22
Figure 104117564-A0305-02-0079-23
Figure 104117564-A0305-02-0080-24
Figure 104117564-A0305-02-0081-25
Figure 104117564-A0305-02-0082-26
Figure 104117564-A0305-02-0083-27
Figure 104117564-A0305-02-0084-28
Figure 104117564-A0305-02-0085-29
Figure 104117564-A0305-02-0086-30
疾病相關的抗原可在感染病原體的細胞或癌症細胞中特徵性表達並且在MHC複合物的背景下在細胞表面上被處理和展示，但是不在正常細胞中特徵性表達。識別這樣的肽片段的抗體是本領域已知的或可使用熟知的方法產生，包括WO 2002/014870中描述的那些。
根據本發明任一實施方式的三特異性結合分子的多肽可適於包含這樣的抗體的輕鏈可變結構域或重鏈可變結構域(這樣的分子的第一和第二多肽鏈的情況)或重鏈或輕鏈(這樣的分子的第三和第四多肽鏈的情況)。因此，上述抗體可用於產生根據本發明任一實施方式的 三特異性結合分子，其位點A、位點B或位點C能夠結合這樣的疾病相關的抗原的表位。
B.優選的結構屬性
典型地，根據本發明任一實施方式的三特異性結合分子包括四條不同的多肽鏈，其各具有氨基末端和羧基末端(見圖4A-4D)，但是，通過彼此融合這樣的多肽鏈(例如，經肽鍵)或通過將這樣的多肽鏈分開形成另外的多肽鏈，或通過經二硫鍵締合更少或另外的多肽鏈，分子可包括更少或更多數量的多肽鏈。圖4E-4J通過示意性描繪具有三條多肽鏈的這樣的分子。圖4K-4L通過示意性描繪具有五條多肽鏈的分子。
這樣的分子的各種免疫球蛋白結構域可源自任何同種型或同種異型的免疫球蛋白，包括但不限於IgA、IgD、IgG、IgE和IgM。在優選的實施方式中，如下面所討論，這樣的免疫球蛋白源自IgG免疫球蛋白。在具體的實施方式中，使用的IgG同種型是IgG1，但是可採用其他同種型的IgG(例如，IgG2、IgG3或IgG4或其同種異型)。當使用IgG4 Fc結構域時，更包括引入穩定突變比如S228P，其通過如Kabat中闡釋的EU索引編號(參見Lu等，(2008)“The Effect Of A Point Mutation On The Stability Of Igg4 As Monitored By Analytical Ultracentrifugation,”J.Pharmaceutical Sciences 97：960-969)，以減少鏈交換的發生。可將本領域已知的其他穩定突變引入IgG4 Fc結構域(參見Peters,P等，(2012)“Engineering an Improved IgG4 Molecule with Reduced Disulfide Bond Heterogeneity and Increased Fab Domain Thermal Stability,”J.Biol.Chem.,287：24525-24533；PCT專利公開號：WO 2008/145142)。因為N297A、L234A、L235A和 D265A取代消除了效應子功能，在期望效應子功能的情況下，優選不採用這些取代。
圖4A-4D提供了優選的三特異性結合分子的結構域的示意圖。圖4A和4B分別示意性圖示了優選的三特異性結合分子的結構域，其中非雙抗體型結合結構域是Fab型結合結構域或受體型結合結構域。圖4C和4D分別示意性圖示了具有不同的結構域取向的優選的三特異性結合分子的結構域，其中非雙抗體型結合結構域是Fab型結合結構域或受體型結合結構域。
如上面所示，由這樣的示例性優選的三特異性結合分子的結合結構域結合的表位I、表位II或表位III之一可以是疾病相關的抗原的表位。最優選地，結合這樣的疾病相關的抗原的表位的這樣的示例性優選的三特異性結合分子的結合結構域是Fab型結合結構域。本發明的這樣的三特異性結合分子的多肽可適於包含可變輕鏈結構域或可變重鏈結構域(這樣的分子的第一和第二多肽鏈的情況)或重鏈或輕鏈(在這樣的分子的第三和第四多肽鏈的情況下)。因此，這樣的抗體可用於產生根據本發明任一實施方式的三特異性結合分子，其位點A、位點B或位點C能夠結合這樣的疾病相關的抗原的表位。
1.優選的第一多肽鏈
優選的三特異性結合分子的第一多肽鏈包括能夠結合表位I的可變輕鏈結構域(VL I )、能夠結合表位II的可變重鏈結構域(VH II )、半胱氨酸殘基或包含半胱氨酸的結構域和異源二聚體-促進結構域和CH2-CH3結構域。
因為第一多肽的可變輕鏈結構域和可變重鏈結構域針對不同表位，它們不能締合在一起形成能夠結合表位I或表位II的結合結 構域。第一多肽的可變輕鏈結構域和可變重鏈結構域通過間插接頭肽彼此間隔開，此間插接頭肽足夠短以基本上防止這些結構域的締合。示例性接頭--稱為“接頭1”--具有序列(SEQ ID NO：1)：GGGSGGGG。
第一多肽的可變重鏈結構域和此多肽的異源二聚體-促進結構域優選地通過包含1、2、3或更多個半胱氨酸殘基的間插接頭肽而彼此間隔開。優選的包含半胱氨酸的結構域(“接頭2”)具有的序列為SEQ ID NO：2：GGCGGG。可選地，或另外，可使用包含半胱氨酸的異源二聚體-促進結構域，如下面描述的。
因此，在一些實施方式中，一個或多個半胱氨酸殘基(或包含半胱氨酸的結構域，比如包含半胱氨酸的肽接頭)被併入到第一多肽鏈(和/或併入到三特異性結合分子的第二、第三、第四或另外的多肽鏈)中，以便將兩個這樣的多肽鏈共價結合在一起，而在等同的實施方式中，這樣的半胱氨酸殘基(一個或多個)可被併入到異源二聚體-促進結構域，或併入另一結構域以便實現相同的結果。
協同選擇第一多肽的異源二聚體-促進結構域和第二多肽的異源二聚體-促進結構域。結構域彼此不同並且被設計為彼此締合以便促進第一和第二多肽鏈的締合。例如，異源二聚體-促進結構域中的一個被工程化以在pH 7具有負電荷，而兩條多肽鏈中的另一條被工程化，以在pH 7具有正電荷。這樣帶電荷的結構域的存在促進第一和第二多肽之間的締合，因此促進異源二聚化。哪個異源二聚體-促進結構域被提供至哪條鏈不重要，只要在第一和第二多肽鏈上採用的結構域不同以便促進這樣的鏈之間的異源二聚化。
優選地，第一多肽鏈的異源二聚體-促進結構域是“E-螺旋”結構域(SEQ ID NO：3)： E VAAL E K E VA AL E K E VAAL E K E VAAL E K，或“K-螺旋”結構域(SEQ ID NO：4)： K VAAL K E K VA AL K E K VAAL K E K VAAL K E。更優選地，第一多肽鏈具備“E-螺旋”結構域。第一多肽鏈可包含僅僅單個這樣的螺旋分隔子，或其可包含大於一個這樣的螺旋分隔子(例如，兩個分隔子)並且可以是相同電荷，優選地具有相反電荷。
優選地，第一多肽鏈的異源二聚體-促進結構域包括四個串聯“E-螺旋”螺旋狀結構域(SEQ ID NO：3： E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K)，其谷氨酸殘基在pH 7形成負電荷，或包括四個串聯“K-螺旋”結構域(SEQ ID NO：4： K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E)，其賴氨酸殘基在pH 7形成正電荷。這樣的帶電荷結構域的存在促進第一和第二多肽鏈之間的締合，並且因此促進異源二聚化。尤其優選的是這樣的異源二聚體-促進結構域：其中四個串聯的具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的“E-螺旋”螺旋狀結構域之一ID NO：ID NO：已經被修飾以包含半胱氨酸殘基： E VAA
Figure 104117564-A0305-02-0090-81
E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K(SEQ ID NO：115)或其中四個串聯的具有SEQ ID NO：4的“K-螺旋”螺旋狀結構域ID NO：之一已經被修飾以包含半胱氨酸殘基： K VAA
Figure 104117564-A0305-02-0090-80
K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E(SEQ ID NO：116)。下面另公開了其他可採用的E-螺旋和K-螺旋結構域：Woolfson,D.N.(2005)“The Design Of Coiled-Coil Structures And Assemblies,”Adv.Prot.Chem.70：79-112；Straussman,R.等(2007)“Kinking the Coiled Coil-Negatively Charged Residues at the Coiled-coil Interface,”J.Molec.Biol.366：1232-1242；Apostolovic,B.等(2008)“pH-Sensitivity of the E3/K3 Heterodimeric Coiled Coil,”Biomacromolecules 9：3173-3180；Arndt,K.M.等(2001)“Helix-stabilized Fv(hsFv)Antibody Fragments：Substituting the Constant Domains of a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled-coil Domain,”J.Molec.Biol.312：221-228；Steinkruger,J.D.等(2012)“The d'--d--d' Vertical Triad is Less Discriminating Than the a'--a--a' Vertical Triad in the Antiparallel Coiled-coil Dimer Motif,”J.Amer.Chem.Soc.134(5)：2626-2633；Ghosh,T.S.等(2009)“End-To-End And End-To-Middle Interhelical Interactions：New Classes Of Interacting Helix Pairs In Protein Structures,”Acta Crystallographica D65：1032-1041；Grigoryan,G.等(2008)“Structural Specificity In Coiled-Coil Interactions,”Curr.Opin.Struc.Biol.18：477-483；Boucher,C.等(2010)“Protein Detection By Western Blot Via Coiled-Coil Interactions,”Analytical Biochemistry 399：138-140；Cachia,P.J.等(2004)“Synthetic Peptide Vaccine Development：Measurement Of Polyclonal Antibody Affinity And Cross-Reactivity Using A New Peptide Capture And Release System For Surface Plasmon Resonance Spectroscopy,”J.Mol.Recognit.17：540-557；De Crescenzo,G.D.等(2003)“Real-Time Monitoring of the Interactions of Two-Stranded de novo Designed Coiled-Coils：Effect of Chain Length on the Kinetic and Thermodynamic Constants of Binding,”Biochemistry 42：1754-1763；Tripet,B.等(2002)“Kinetic Analysis of the Interactions between Troponin C and the C-terminal Troponin I Regulatory Region and Validation of a New Peptide Delivery/Capture System used for Surface Plasmon Resonance,”J.Molec.Biol.323：345-362；和Zeng,Y.等(2008)“A Ligand-Pseudoreceptor System Based On de novo Designed Peptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With Altered Tropism,”J.Gene Med.10：355-367。
優選地，採用的第一多肽鏈的異源二聚體-促進結構域和CH2-CH3結構域通過包含半胱氨酸的間插接頭肽而彼此間隔開，此接頭肽為異源二聚體-促進結構域提供改善的穩定性。優選的包含半胱氨酸的接頭肽(“接頭3”)具有氨基酸序列(SEQ ID NO：5)：DKTHTCPPCP。
野生型CH2-CH3結構域的氨基酸序列如下(如在以下文獻中的EU索引中進行定位：Kabat等(1992)SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST，國立衛生研究院(National Institutes of Health)公開號91-3242)(SEQ ID NO：6)：
Figure 104117564-A0305-02-0092-31
在一些表達系統中，CH3結構域的C-末端氨基酸殘基可被翻譯後去除。因此，CH3結構域的C-末端殘基是任選的氨基酸殘基。
第一多肽鏈的CH2-CH3結構域優選地被修飾，以促進第 三多肽鏈的CH2-CH3結構域之間的異源二聚化(如下所述)。例如，可將氨基酸取代(優選地用包括形成‘杵’的大側基例如色氨酸的氨基酸進行取代)引入第一多肽鏈的CH2或CH3結構域中，以便空間干擾防止與類似突變的結構域相互作用並且迫使突變的結構域與其中已經工程化引入了互補的或適應性突變的結構域，即，‘臼’(例如，用甘氨酸進行取代)配對。這樣的突變組可被工程化到任何對的包括雙抗體分子的多肽中，而且，進一步地，可被工程化到此對的多肽鏈的任何部分。進行蛋白質工程以相對於同二聚化更偏愛異源二聚化的方法是本領域熟知的--尤其就免疫球蛋白樣分子的工程化而言，並且包括在本文中(參見美國專利號7,695,936和專利公開2007/0196363，Ridgway等(1996)“‘Knobs-Into-Holes’Engineering Of Aniibody CH3 Domains For Heavy Chain Heierodimerizaiion,”Protein Engr.9：617-621；Atwell等(1997)“Siable Heierodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,”J.Mol.Biol.270：26-35；和Xie等(2005)“A New Format Of Bispecific Antibody：Highly Efficient Heterodimerization,Expression And Tumor CellLysis,”J.Immunol.Methods 296：95-101；其每一篇通過引用以其整體併入本文)。通過修飾天然IgG Fc結構域以包含修飾T366W而產生優選的杵。通過修飾天然IgG Fc結構域以包含修飾T366S、L368A和Y407V而產生優選的臼。為了有助於純化本發明的三特異性結合分子，包含臼突變的多肽鏈另外包括在435位的取代(H435R)，以去除蛋白A結合位點。因此，包含臼突變的多肽的同二聚體不結合蛋白A，而由於包含異源二聚體的杵和臼形成的三特異性結合分子經在包含杵突變的多肽鏈上的蛋白A結合位點將保持其結合蛋白A 的能力。
第一多肽鏈的CH2-CH3結構域優選地被修飾，以減少或消除Fc與Fc受體的結合。這樣的突變是本領域熟知的並且包括在234、235、265和297位的取代(參見美國專利號5,624,821)。優選的取代包括L234A和L235A，D265A和N297Q中的一個或多個。
因此，優選地，第一多肽鏈的CH2-CH3結構域具有“攜帶杵的”序列(SEQ ID NO：7)：
Figure 104117564-A0305-02-0094-32
或具有具有H435R取代以消除蛋白A結合的“攜帶臼的”序列(SEQ ID NO：8)：
Figure 104117564-A0305-02-0094-33
優選地，第一多肽鏈具有“攜帶杵的”CH2-CH3序列，比如SEQ ID NO：7的序列。
如將認識到，可在第一多肽鏈中採用“攜帶臼的”CH2-CH3結構域(例如，SEQ ID NO：8)，在此情況下，將在第三多肽鏈中採用“攜帶杵的”CH2-CH3結構域(例如，SEQ ID NO：7)。
因此，三特異性結合分子的第一多肽鏈優選地包括結構域和接頭：(VLI結構域)-(接頭1)-(VHII結構域)-(包含半胱氨酸的結構域)-(接頭2)-(E-螺旋異源二聚體-促進結構域)-(接頭3)-(攜帶杵的CH2-CH3結構域)、或(VLI結構域)-(接頭1)-(VHII結構域)-(接頭2)-(包含半胱氨酸的E-螺旋異源二聚體-促進結構域)-(接頭3)-(攜帶杵的CH2-CH3結構域)。
2.優選的第二多肽鏈
這樣優選的三特異性結合分子的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括能夠結合表位II的可變輕鏈結構域(VL II )、能夠結合表位I的可變重鏈結構域(VH I )、半胱氨酸殘基或包含半胱氨酸的結構域和異源二聚體-促進結構域。
因為第二多肽的可變輕鏈結構域和可變重鏈結構域針對不同表位，它們不能締合在一起形成能夠結合表位I或表位II的結合結構域。第二多肽的可變輕鏈結構域和可變重鏈結構域通過足夠短以基本上防止這些結構域締合的間插接頭肽而彼此間隔開。具有序列(SEQ ID NO：1)：GGGSGGGG的“接頭1”是用於此目的的示例性接頭。
如在第一多肽鏈的情況下，第二多肽的可變重鏈結構域和此多肽的異源二聚體-促進結構域優選地通過包含1、2、3或更多個半胱氨酸殘基的包含半胱氨酸的間插結構域而彼此間隔開。具有序列(SEQ ID NO：2)GGCGGG的“接頭2”是用於此的示例性接頭。這樣的半胱氨酸殘基可與包含半胱氨酸的間隔肽中的半胱氨酸殘基形成二硫 鍵，此間隔肽分開第一多肽的可變重鏈結構域和此多肽的異源二聚體-促進結構域。因此，三特異性結合分子的第一和第二多肽彼此共價結合。可選地，可使用包含半胱氨酸的異源二聚體-促進結構域，如上所述。
如上所討論，選擇第二多肽鏈的異源二聚體-促進結構域，以便與第一多肽鏈的異源二聚體-促進結構域協同作用。因此，在優選的實施方式中，第一多肽鏈的異源二聚體-促進結構域是“K-螺旋”結構域(例如，SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：116)或“E-螺旋”結構域(例如，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：115)。因為第一多肽鏈優選地具備“E-螺旋”結構域，所以第二多肽鏈優選地包含“K-螺旋”結構域。
因為第一和第二多肽鏈是雙抗體的多肽鏈，它們能夠締合在一起形成識別和免疫特異性結合表位I的結構域I結合結構域(VLA/VHA)，和識別和免疫特異性結合表位II的結構域II結合結構域(VLB/VHB)。
因此，總之，三特異性結合分子的第二多肽鏈優選地包括結構域和接頭：(VLII結構域)-(接頭1)-(VHI結構域)-(包含半胱氨酸的結構域)-(接頭2)-(K-螺旋異源二聚體-促進結構域)、或(VLII結構域)-(接頭1)-(VHI結構域)-(接頭2)-(包含半胱氨酸的K-螺旋異源二聚體-促進結構域)。
3.優選的第三多肽鏈
優選的三特異性結合分子的第三多肽鏈是這樣的多肽：其在N-末端至C-末端方向上包括結合結構域、可任選地包括CH1-鉸鏈結構域的包含半胱氨酸的結構域和CH2-CH3結構域。本發明優選的三特異性結合分子的第三多肽鏈的結合結構域可以是能夠結合表位III的 可變重鏈結構域(VH III )，在此情況下，本發明優選的三特異性結合分子的第四多肽鏈(下面討論)是包括能夠結合表位III的可變輕鏈結構域(VL III )的多肽，以便結合結構域能夠免疫特異性結合具備表位III的抗原。可選地，本發明優選的三特異性結合分子的第三多肽鏈的結合結構域可包括T細胞受體型結合結構域，在此情況下，本發明優選的三特異性結合分子的第四多肽鏈(下面討論)是包括互補的T細胞受體型結合結構域的多肽，以便兩個多肽鏈的相互作用形成能夠生理特異性結合排列在細胞表面上的MHC複合物中呈現的抗原分子的結合結構域。第三多肽鏈可從天然存在的抗體分離。可選地，其可被重組構建。示例性CH1結構域是人IgG1 CH1結構域，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO：9)：
Figure 104117564-A0305-02-0097-34
示例性鉸鏈結構域是人IgG1鉸鏈結構域，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO：10)：EPKSCDKTHTCPPCP。如將認識到，示例性鉸鏈結構域包括多個半胱氨酸殘基(Elkabetz等(2005)“Cysteines In CH1 Underlie Retention Of Unassembled Ig Heavy Chains,”J.Biol.Chem.280：14402-14412)，其可參與鏈間共價鍵合。可選地，可採用不同的包含半胱氨酸的結構域(例如，具有以下氨基酸序列的肽：VEPKSC(SEQ ID NO：12)、AEPKSC(SEQ ID NO：127)，GVEPKSC(SEQ ID NO：133)或GGCGGG(SEQ ID NO：2))。
儘管可採用野生型CH2-CH3結構域，但是，如上所述，優選採用修飾的CH2-CH3結構域，其促進與第一多肽鏈的CH2-CH3結構域的異源二聚化。
因此，優選地，第三多肽鏈的CH2-CH3結構域是“攜帶臼的”CH2-CH3結構域，其氨基酸序列與第一多肽中採用的“攜帶杵的”CH2-CH3結構域(SEQ ID NO：7)互補。如上所討論，攜帶臼的CH2-CH3結構域優選地應包括在435位的取代(H435R)，以去除蛋白A結合位點。對於第三多肽，具有H435R取代的示例性“攜帶臼的”CH2-CH3結構域是SEQ ID NO：8。
如將認識到，在第三多肽鏈中可採用“攜帶杵的”CH2-CH3結構域(例如，SEQ ID NO：7)，在此情況下，在第一多肽鏈中採用“攜帶臼的”CH2-CH3結構域(例如，SEQ ID NO：8)。
在其中本發明優選的三特異性結合分子的第三(和第四)多肽鏈各包括T細胞受體型結合結構域多肽鏈的實施方式中，其在I類MHC背景下識別在細胞表面上呈現的抗原。產生這樣的T細胞受體型結合結構域的方法是本領域熟知的(例如，US2012/0294874A1)。
因此，三特異性結合分子的第三多肽鏈優選地包括結構域和接頭：(VH III 結構域)-(包含半胱氨酸的結構域(任選地CH1結構域和/或鉸鏈結構域)-(攜帶臼的CH2-CH3結構域)，或(受體型結合結構域；其第一或第二多肽)-(包含半胱氨酸的結構域(任選地CH1結構域和/或鉸鏈結構域)-(攜帶臼的CH2-CH3結構域)。
4.優選的第四多肽鏈
優選的三特異性結合分子的第四多肽鏈是受體型結合結構域的多肽(其中第三和第四多肽鏈形成受體型結合結構域)，或更優選地，是上述抗體的輕鏈的多肽部分，其免疫特異性結合表位III和/或其與第三多肽鏈的結合結構域互補。
因此，在第三和第四多肽形成Fab型結合結構域的情況下，這樣的第四多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括能夠結合表位III的可變輕鏈結構域(VL III )和用於促進與第三多肽鏈共價結合的包含半胱氨酸的結構域，或結合結構域和用於促進與第三多肽鏈共價結合的這樣的包含半胱氨酸的結構域。這樣的包含半胱氨酸的結構域可以是CL結構域，或其包含半胱氨酸的部分，比如(SEQ ID NO：11)FNRGEC或(SEQ ID NO：128)GFNRGEC或接頭比如接頭2(具有序列(SEQ ID NO：2)GGCGGG。與這樣的接頭2形成二硫鍵的包含半胱氨酸的示例性結構域包括氨基酸序列VEPKSC(SEQ ID NO：12)或鉸鏈結構域。
第四多肽鏈可從天然存在的抗體分離。可選地，其可被重組構建。優選的CL結構域是人IgG1 CLκ結構域，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO：13)：
Figure 104117564-A0305-02-0099-35
可選地，示例性CL結構域是人IgG1 CL λ 2結構域，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO：14)：
Figure 104117564-A0305-02-0099-36
如將注意到，第四多肽鏈的CL結構域或其他包含半胱氨酸的結構域包括半胱氨酸殘基，其能夠共價結合第三多肽鏈的包含半胱氨酸的結構域(例如，CH1結構域)的半胱氨酸殘基，從而彼此共價複合 本發明的三特異性結合分子的第三和第四多肽鏈。因此第三和第四多肽鏈彼此共價結合。
另外，第一多肽鏈的CH2-CH3結構域的半胱氨酸殘基可與第三多肽鏈的CH2-CH3結構域的半胱氨酸殘基形成二硫鍵。因此第一和第三多肽鏈彼此共價結合。
因此，三特異性結合分子的第四多肽鏈優選地包括結構域和接頭：(VL III 結構域)-(包含半胱氨酸的結構域(任選地CL結構域)，或(受體型結合結構域；其第一或第二多肽)-(包含半胱氨酸的結構域(任選地CL結構域)。
C.可選的第一多肽鏈
在一個實施方式中，上述結構域的取向為N-末端至C-末端方向。但是，也考慮其變化，其中第一多肽鏈的結構域的取向是：NH 2 -(攜帶杵的CH3-CH2結構域)-(VL I 結構域)-(接頭1)-(VH II 結構域)-(包含半胱氨酸的結構域接頭2)-(E-螺旋異源二聚體-促進結構域)。優選地，包含半胱氨酸的結構域存在於這樣的CH2-CH3結構域的N-末端。示例性肽的序列是(SEQ ID NO：5)：DKTHTCPPCP，但是，可採用可選的接頭，例如，EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：129)或LEPKSSDKTHTCPPCP；SEQ ID NO：130)。在此實施方式中，優選地，CH3結構域通過間插肽接頭與VLI結構域間隔開，此間插肽接頭比如具有氨基酸序列(SEQ ID NO：15)：APSSS，更優選地，具有氨基酸序列(SEQ ID NO：16)APSSSPME的接頭，但是，可採用可選的接頭，例如，ASTKG(SEQ ID NO：131)、LEPKSS(SEQ ID NO：132)、GGC或GGG。
D.白蛋白-結合結構域
如WO 2012/018687中公開，為了改善雙抗體的體內藥物代謝動力學特性，雙抗體可被修飾，以在雙抗體的一個或多個末端包含血清-結合蛋白的多肽部分。這樣的考慮也適合本發明的三特異性結合分子。最優選地，當期望將血清-結合蛋白的多肽部分併入本發明的三特異性結合分子時，這樣的多肽部分將被安置於三特異性結合分子的一條多肽鏈的C-末端。
白蛋白是血漿中最豐富的蛋白質並且在人中的半衰期為19天。白蛋白具有數個小分子結合位點，允許其非共價結合其他蛋白質，從而延長它們的血清半衰期。的鏈球菌屬(Streptococcus)菌株G148的蛋白質G的白蛋白-結合結構域3(ABD3)由形成穩定的三-螺旋束的46個氨基酸殘基組成，並且具有寬的白蛋白-結合特異性(參見Johansson,M.U.等(2002)“Structure,Specificity,And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules,”J.Biol.Chem.277(10)：8114-8120)。因此，用於改善雙抗體體內藥物代謝動力學特性的、尤其優選的血清-結合蛋白的多肽部分是來自鏈球菌蛋白質G的白蛋白-結合結構域(ABD)，和更優選地，鏈球菌屬菌株G148的蛋白質G的白蛋白-結合結構域3(ABD3)(SEQ ID NO：123)：LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALP。
如WO 2012/162068(通過參考併入本文)中公開，SEQ ID NO：123的“去免疫化的(deimmunized)”變體具有減弱或消除II類MHC結合的能力。基於組合突變結果，考慮下述取代組合是用於形成這樣的去免疫化的白蛋白-結合結構域的優選的取代：66S/70S +71A；66S/70S +79A；64A/65A/71A+66S；64A/65A/71A+66D； 64A/65A/71A+66E；64A/65A/79A+66S；64A/65A/79A+66D；64A/65A/79A+66E。變體ABD具有修飾L64A、I65A和D79A或修飾N66S、T70S和D79A。具有氨基酸序列：LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKN A 64 A 65NNAKT VEGVKALI A 79E ILAALP(SEQ ID NO：124)，或氨基酸序列：LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLI S 66NAK S 70VEGVKALI A 79E ILAALP(SEQ ID NO：125)的變異的去免疫化的ABD是尤其優選的，因為這樣的去免疫化白蛋白-結合結構域展示基本上野生型的結合，同時提供減弱的II類MHC結合。儘管這樣的白蛋白-結合結構域可被併入到本發明的三特異性結合分子的任何多肽鏈中，但是優選將這樣的結構域佈置於第一或第三多肽鏈的E-螺旋(或K-螺旋)結構域的C-末端(經間插在E-螺旋(或K-螺旋)結構域和白蛋白-結合結構域(其優選地是去免疫化白蛋白-結合結構域)之間的接頭)。對於這樣的接頭，優選的序列是SEQ ID NO：126：GGGS。
E. Fc結構域的功能
在一個實施方式中，第一多肽鏈的CH2-CH3結構域和第三多肽的CH2-CH3結構域複合形成基本上不能夠結合Fc受體的Fc結構域(即，以小於10%野生型Fc結構域的程度進行結合。可選地，這樣的分子的Fc結構域能夠在生理學條件下結合Fc受體，從而這樣的三特異性結合分子是四特異性的，能夠介導與四個分子的配位結合(表位I、表位II和表位III和Fc受體)。最優選地，能夠結合Fc受體的這樣的分子另外介導Fc受體-依賴性效應子功能。
三特異性結合分子包括變異的Fc結構域，相對於可比較的野生型Fc結構域，此變異的Fc結構域包括一個或多個氨基酸取代、***或缺失。包括變異的Fc結構域的分子相對於包括野生型Fc結構域的 分子通常具有改變的表型。變異的表型可表現為改變的血清半衰期、改變的穩定性、改變的對細胞酶的易感性或改變的效應子功能，如在NK依賴性或巨噬細胞依賴性試驗中測定的。鑒定為改變效應子功能的Fc結構域修飾是本領域已知的，包括增加與啟動受體(例如，FcγRIIA(CD16A))結合的修飾和降低與抑制受體(例如，FcγRIIB(CD32B))結合的修飾(參見Stavenhagen,J.B.等(2007)“Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors,”Cancer Res.57(18)：8882-8890)。具有y與CD32B降低的結合和/或與CD16A增加的結合的人IgG1 Fc結構域的示例性變體包含F243L、R292P、Y300L、V305I或P296L取代。這些氨基酸取代可以任何組合出現在人IgG1 Fc結構域中。在一個實施方式中，人IgG1 Fc結構域變體包含F243L、R292P和Y300L取代。在另一實施方式中，人IgG1 Fc結構域變體包含F243L、R292P、Y300L、V305I和P296L取代。在另一實施方式中，人IgG1 Fc結構域變體包含N297Q取代、L234A和L235A取代或D265A取代，因為這些突變消除了FcR結合。
III.三特異性結合分子的例證：具有結合CD3和CD8的表位和結合疾病相關的抗原的表位的結合結構域的三特異性結合分子
如上述，在一些實施方式中，在三特異性結合分子選擇三個表位，使得這樣的表位中的一個或兩個是免疫系統細胞的表位(一個或多個)，尤其是細胞毒性淋巴細胞免疫系統細胞(CTL)的表位(一個或多個)，並且，其中剩餘的表位(一個或多個)是疾病相關的抗原的表位(一個或多個)。在一些實施方式中，三特異性結合分子的結合結構域使得 表位I、表位II和表位III其中的第一個是CD3的表位，表位I、表位II和表位III其中的第二個是CD8的表位，和表位I、表位II和表位III其中的第三個是疾病相關的抗原的表位，其中這樣的三特異性結合分子的結合結構域I、II和III介導細胞毒性T細胞和表達疾病相關抗原的細胞的配位結合。這樣的三特異性結合分子能夠將細胞毒性淋巴細胞定位至表達疾病相關的抗原的細胞，和從而利於殺傷表達疾病相關的抗原的細胞。疾病相關的抗原可以是癌症抗原，或可以是特徵為病原體(例如，細菌、真菌、病毒或原生動物)感染的抗原。更具體地，本發明涉及這樣的三特異性結合分子，其能夠介導與以下的配位結合：(1)CD3的表位、(2)CD8的表位、和(3)疾病相關的抗原的表位。通過結合CD3和CD8和結合疾病相關的抗原，這樣的分子將細胞毒性T細胞共定位至呈遞疾病相關的抗原的細胞，導致這樣的T細胞的啟動和針對表達疾病相關的抗原的細胞的細胞毒性應答的啟動。
抗CD3或抗CD8抗體的重鏈可被採用作為根據本發明任一實施方式的示例性三特異性結合分子的第三多肽鏈。同樣地，這樣的抗體的輕鏈可被採用作為根據本發明任一實施方式的三特異性結合分子的第四多肽鏈。可選地，這樣的抗體的輕鏈可變結構域和/或重鏈可變結構域可結合其他免疫球蛋白固定區以獲得這樣的第三和第四多肽鏈。因此，這樣的抗體可用於產生根據本發明任一實施方式的三特異性結合分子，其位點C能夠結合CD3或CD8。
類似地，這樣的可變結構域可併入到根據本發明任一實施方式的三特異性結合分子的第一和第三多肽的可變結構域部分，從而產生根據本發明任一實施方式的三特異性結合分子，其位點A能夠結合CD3或CD8，或其位點B能夠結合CD3或CD8。
1.示例性抗CD3抗體
可採用下面提供的任何示例性抗CD3或抗CD8抗體製備根據本發明任一實施方式的三特異性結合分子的CD3或CD8結合結構域。
《OKT3》
OKT3輕鏈可變結構域(SEQ ID NO：17)(CDR以底線顯示)：
Figure 104117564-A0305-02-0105-37
OKT3重鏈可變結構域(SEQ ID NO：18)(CDR以底線顯示)：
Figure 104117564-A0305-02-0105-38
《M291》
M291輕鏈可變結構域(SEQ ID NO：19)(CDR以底線顯示)：
Figure 104117564-A0305-02-0105-39
M291重鏈可變結構域(SEQ ID NO：20)(CDR以底線顯示)：
Figure 104117564-A0305-02-0106-40
《YTH12.5》
YTH12.5輕鏈可變結構域(SEQ ID NO：21)(CDR以底線顯示)：
Figure 104117564-A0305-02-0106-41
YTH12.5重鏈可變結構域(SEQ ID NO：22)(CDR以底線顯示)：
Figure 104117564-A0305-02-0106-42
《人源化的抗CD3抗體1(“CD3 mAb 1”)(參見US2014/0099318A1)》
CD3 mAb 1輕鏈可變結構域(SEQ ID NO：23)變體1(CDR以底線顯示)：
Figure 104117564-A0305-02-0107-43
CD3 mAb 1輕鏈可變結構域(SEQ ID NO：24)變體2(CDR以底線顯示)：
Figure 104117564-A0305-02-0107-44
CD3 mAb 1重鏈可變結構域(SEQ ID NO：25)變體1(CDR以底線顯示)：
Figure 104117564-A0305-02-0107-45
《人源化的抗CD3抗體2(“CD3 mAb 2”)(參見US2014/0099318A1)》
CD3 mAb 2輕鏈可變結構域(SEQ ID NO：26)(CDR以底線顯示)：
Figure 104117564-A0305-02-0107-46
CD3 mAb 2重鏈可變結構域(SEQ ID NO：27)(CDR以底線顯示)：
Figure 104117564-A0305-02-0108-47
CD3 mAb 2重鏈可變結構域D65G變體(SEQ ID NO：28)(CDR以底線顯示)：
Figure 104117564-A0305-02-0108-48
2.示例性抗CD8抗體
《OKT8(“CD8 mAb 1”)》
OKT8輕鏈可變結構域(SEQ ID NO：29)(CDR以底線顯示)：
Figure 104117564-A0305-02-0108-49
OKT8重鏈可變結構域(SEQ ID NO：30)(CDR以底線顯示)：
Figure 104117564-A0305-02-0108-50
《TRX2(“CD8 mAb 2”)》
TRX2輕鏈可變結構域(SEQ ID NO：31)(CDR以底線顯示)：
Figure 104117564-A0305-02-0109-51
TRX2重鏈可變結構域(SEQ ID NO：32)(CDR以底線顯示)：
Figure 104117564-A0305-02-0109-52
3.結合疾病相關的抗原的表位的示例性結合結構域
(a)HIV gp41
示意性疾病相關的抗原是HIV gp41。示例性gp41抗體是7B2(“HIV mAb 1”)。
7B2輕鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO：35)：
Figure 104117564-A0305-02-0109-53
7B2重鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO：36)：
Figure 104117564-A0305-02-0109-54
(b)HIV gp120
第二示意性疾病相關的抗原是HIV gp120。示例性gp120抗體是A32(“HIV mAb 2”)。
A32 VL輕鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO：33)：
Figure 104117564-A0305-02-0110-55
A32 VH重鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO：34)：
Figure 104117564-A0305-02-0110-56
(c)RSV糖蛋白F
另外的示意性疾病相關的抗原是RSV糖蛋白F。示例性抗RSV糖蛋白F抗體是帕利珠單抗(“RSV mAb 1”)。
帕利珠單抗輕鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO：37)：
Figure 104117564-A0305-02-0110-57
帕利珠單抗重鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO：38)：
Figure 104117564-A0305-02-0111-58
(d)B7-H3
尤其優選的示意性疾病相關的抗原是B7-H3，其在各種癌症細胞上表達(例如，成神經細胞瘤、胃癌、卵巢癌和非小細胞肺癌等)。已經在腫瘤細胞系中免疫組織學檢測到B7-H3蛋白質表達(Chapoval,A.等(2001)“B7-H3：A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production,”Nature Immunol.2：269-274；Saatian,B.等(2004)“Expression Of Genes For B7-H3 And Other T Cell Ligands By Nasal Epithelial Cells During Differentiation And Activation,”Amer.J.Physiol.Lung Cell.Mol.Physiol.287：L217-L225；Castriconi等(2004)“Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis,”Proc.Natl.Acad.Sci.(美國)101(34)：12640-12645)；Sun,M.等(2002)“Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes,”J.Immunol.168：6294-6297)。已經在心臟、腎、睾丸、肺、肝、胰腺、***、結腸和成骨細胞細胞中發現了mRNA表達(參見Collins,M.等(2005)“The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands,”Genome Biol.6：223.1-223.7)。在蛋白質水準，在人肝、肺、膀胱、睾丸、***、***、胎盤和淋巴器官中發現B7-H3(參見Hofmeyer,K.等(2008)“The Contrasting Role Of B7-H3,”Proc.Natl.Acad.Sci.(美國)105(30)：10277-10278)。結合B7-H3的示意性抗體包括人源化的 “BRCA84D”、“BRCA69D”和“PRCA157”(參見WO 2011/109400)。示例性輕鏈和重鏈可變鏈具有下述序列(CDR以底線顯示)。
示例性人源化的BRCA84D-5VL輕鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO：39)：
Figure 104117564-A0305-02-0112-59
示例性人源化的BRCA84D-2VH重鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO：40)：
Figure 104117564-A0305-02-0112-60
示例性BRCA69D(“B7-H3 mAb 1”)輕鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO：41)：
Figure 104117564-A0305-02-0112-61
示例性BRCA69D(“B7-H3 mAb 1”)重鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO：42)：
Figure 104117564-A0305-02-0112-62
示例性PRCA157輕鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO：43)：
Figure 104117564-A0305-02-0113-63
示例性PRCA157重鏈可變結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO：44)：
Figure 104117564-A0305-02-0113-64
(e)A33腫瘤抗原
A33腫瘤抗原是另一示意性疾病相關的抗原。示例性人源化的抗A33抗體(“gpA33 mAb 1”)的輕鏈可變結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO：45)：
Figure 104117564-A0305-02-0113-65
這樣的示例性人源化的抗A33(gpA33 mAb 1)抗體的重鏈可變結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO：46)：
Figure 104117564-A0305-02-0113-66
(f)5T4腫瘤抗原
5T4腫瘤抗原是另一示意性疾病相關的抗原。示例性人源化的抗5T4 mAb 1抗體(“5T4 mAb 1”)的輕鏈可變結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO：47)：
Figure 104117564-A0305-02-0114-67
這樣的示例性人源化的5T4 mAb 1的重鏈可變結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO：48)：
Figure 104117564-A0305-02-0114-68
第二示例性人源化的5T4 mAb 2抗體(“5T4 mAb 2”)的輕鏈可變結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO：49)：
Figure 104117564-A0305-02-0114-69
這樣的第二示例性人源化的5T4 mAb 2的重鏈可變結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO：50)：
Figure 104117564-A0305-02-0114-70
(g)ROR1抗原
ROR1腫瘤抗原是另一示意性疾病相關的抗原。示例性抗ROR1抗體包括抗體2A2(參見WO 2010/124188)、R11(參見WO 2012/075158)和R12(參見WO 2012/075158)。
2A2抗體的輕鏈可變結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO：53)：
Figure 104117564-A0305-02-0115-71
2A2抗體的重鏈可變結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO：54)：
Figure 104117564-A0305-02-0115-72
R11抗體的輕鏈可變結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO：55)：
Figure 104117564-A0305-02-0115-73
R11抗體的重鏈可變結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO：56)：
Figure 104117564-A0305-02-0115-74
R12抗體的輕鏈可變結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO：57)：
Figure 104117564-A0305-02-0116-75
R12抗體的重鏈可變結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO：58)：
Figure 104117564-A0305-02-0116-79
在另一個方面(下面詳細討論)中，提供了一種人源化的抗ROR1抗體(“ROR1 mAb 1”)。優選地，ROR1 mAb 1的輕鏈可變結構域具有序列(SEQ ID NO：51)：
Figure 104117564-A0305-02-0116-77
這樣的更優選的人源化的ROR1 mAb 1的重鏈可變結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO：52)：
Figure 104117564-A0305-02-0116-78
IV.結合位點：位點A、位點B和位點C的選擇
如上述，優選地，三特異性結合分子至少是三特異性的， 其具有“外部”雙抗體型結合結構域(位點A)，其距離結合結構域III最遠；“內部”雙抗體型結合結構域(位點B)，其距離結合結構域III最近；和結合結構域III本身(位點C)。如本文所使用，三特異性結合分子比如“X/Y/Z”的描述指示X結合結構域是在位點A，Y結合結構域是在位點B和Z結合結構域是在位點C。例如，三特異性結合分子命名“B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1”指示B7-H3 mAb 1可變結構域佔據三特異性結合分子的位點A，CD3 mAb 2可變結構域佔據位元點B和CD8 mAb 1可變結構域佔據三特異性結合分子的位點C。
因此允許選擇這樣的位點中的哪一個用於結合具體的期望的表位。指導這樣選擇的一個因素，尤其結合CD3、CD8和疾病相關的抗原的三特異性結合分子，涉及考慮胞啃(trogocytosis)的作用和對其的期望。“胞啃”是細胞可獲取一部分接觸細胞的細胞膜的過程(參見Masuda,S.等(2013)“Possible Implication Of Fc γ Receptor-Mediated Trogocytosis In Susceptibility To Systemic Autoimmune Disease,”Clin.Dev.Immunol.2013：文章ID 345745，6頁)；Dhainaut,M.等(2014)“Regulation of Immune Reactivity by Intercellular Transfer,”Front Immunol.5：112；Ahmed,K.A.等(2011)“Mechanisms Of Cellular Communication Through Intercellular Protein Transfer,”J.Cell.Mol.Med.15(7)：1458-1473；Ahmed,K.A.等(2008)“Intercellular Trogocytosis Plays An Important Role In Modulation Of Immune Responses,”Cell.Mol.Immunol.5(4)：261-269；LeMaoult,J.等(2007)“Exchanges Of Membrane Patches(Trogocytosis)Split Theoretical And Actual Functions Of Immune Cells,”Hum.Immunol.68(4)：240-243；Caumartin.J.等 (2006)“Intercellular Exchanges Of Membrane Patches(Trogocytosis)Highlight The Next Level Of Immune Plasticity,”Transpl.Immunol.17(1)：20-22)。
通過胞啃採集相關的I類MHC配體誘導細胞毒性T淋巴細胞成為“獲取的Treg”細胞，其介導殺傷(“殘殺”)其他細胞毒性T細胞，從而有助於清除CD8+細胞(參見D’Acquisto,F.等(2011)“CD3 + CD4 - CD8 - (Double Negative)T Cells：Saviours Or Villains Of The Immune Response？”Biochem.Pharmacol.82：333-340；Joly,E.等(2003)“What Is Trogocytosis And What Is Its Purpose？”Nat.Immunol.4：815-；Hudrisier,D.等(2007)“Capture Of Target Cell Membrane Components Via Trogocytosis Is Triggered By A Selected Set Of Surface Molecules On T Or B Cells,”J.Immunol.178：3637-3647)。
在一些實施方式中，具備CD3結合結構域作為其位元點C位置的三特異性結合分子具有抗CD3抗體的屬性，並且類似地具備CD8結合結構域作為其位元點C位置的這樣的三特異性結合分子具有抗CD8抗體的屬性。已經顯示具有結合抗CD8抗體(已經結合T細胞的CD8分子)的Fc結構域的Fc受體的嗜中性粒細胞、單核細胞或巨噬細胞能夠經胞啃將抗體和結合的CD8分子從T細胞轉移至其本身並且然後能夠快速內化抗體；旁觀者(bystander)分子，比如TCR和CD3也可在此過程中轉移(參見Masuda,S.等，(2013)“Possible Implication of Fcg Receptor-Mediated Trogocytosis in Susceptibility to Systemic Autoimmune Disease,”Clin.Develop.Immunol.2013：文章ID 345745，6頁)。
CD3和CD8的結構不同在於CD3靠近細胞膜，而CD8進一步從細胞膜伸展。因此預期，CD3通過抗CD3抗體的Fc受體胞啃比CD8通過抗CD8抗體的Fc受體胞啃更有效。
此現象指示，CD3結合結構域位於位元點C位置上的結合CD3、CD8和疾病相關的抗原的本發明的三特異性結合分子將展示比CD3結合結構域位於位元點A或位點B上的類似三特異性結合分子更少的細胞毒性。因此，通過選擇將CD3結合結構域佈置於位元點C位置上(與位點A或B相反)，可調節細胞毒性的程度。另外，可使包含“位點C”和“位點A(或B)”CD3的混合物的藥學組合物複合(compound)，以便獲得優選程度的細胞毒性。
V.抗ROR1 mAb 1抗體
如上述，在另一個方面中，更提供了一種人源化的抗ROR1抗體(“ROR1 mAb 1”)，其輕鏈可變結構域具有氨基酸序列(SEQ ID NO：51)：
Figure 104117564-A0305-02-0119-80
和其重鏈可變結構域具有氨基酸序列(SEQ ID NO：52)：
Figure 104117564-A0305-02-0119-81
這樣的ROR1 mAb 1抗體的輕鏈可變結構域的CDRL1、CDRL2和CDRL3的序列是：輕鏈可變結構域CDRL1(SEQ ID NO：117)：TLSSGHKTDTID、輕鏈可變結構域CDRL2(SEQ ID NO：118)：LEGSGSY、輕鏈可變結構域CDRL3(SEQ ID NO：119)：GTDYPGNYL。
這樣的ROR1 mAb 1抗體的重鏈可變結構域的CDRH1、CDRH2和CDRH3的序列是：重鏈可變結構域CDRH1(SEQ ID NO：120)：GFTFSDYYMS、重鏈可變結構域CDRH2(SEQ ID NO：121)：TIYPSSGKTYYADSVKG、重鏈可變結構域CDRH3(SEQ ID NO：122)：DSYADDAALFDI。
ROR1 mAb 1抗體介導增加的細胞毒性並且相對於現有技術抗ROR1抗體(例如，抗ROR1抗體R12)免疫原性較小。
不僅僅包括這樣的序列，而也包括完整的ROR1 mAb 1抗體衍生物(包括其嵌合或人源化的衍生物)，其具有這樣的輕鏈可變結構域的CDR中的1、2或3個(SEQ ID NO：51，CDR以底線顯示)或這樣的重鏈可變結構域的CDR中的1、2或3個(SEQ ID NO：52；CDR以底線顯示)，並且其免疫特異性結合ROR1。更優選地，這樣被包括的抗體、嵌合抗體和人源化的抗體具有這樣的輕鏈可變結構域的CDR中的1、2或3個(SEQ ID NO：51，CDR以底線顯示)並且也具備這樣的重鏈可變結構域的CDR中的1、2或3個(SEQ ID NO：52；CDR以底線顯示)，並且免疫特異性結合ROR1。最優選地，這樣被包括的抗體、嵌合抗體和人源化的抗體具有這樣的輕鏈可變結構域的所有3個CDR，和這樣的重鏈可變結構域的所有3個CDR，並且能夠免疫特異性結合ROR1。
另外，被包括的ROR1 mAb 1抗體的片段和衍生物，其包括Fab、Fab’、F(ab’)2 Fv、單鏈(ScFv)，“BiTEs®”、“DARTTM” 雙抗體分子，其突變體、天然存在的變體和融合蛋白，其均包括輕鏈可變結構域CDR中的1、2或3個、或重鏈可變結構域CDR中的1、2或3個、或輕鏈可變結構域CDR中的1、2或3個以及重鏈可變結構域CDR中的1、2或3個，並且其能夠免疫特異性結合ROR1。
在優選的實施方式中，ROR1 mAb 1抗體或它們的片段或衍生物可具有變異的Fc結構域。Fc結構域的修飾通常導致改變的表型，例如改變的血清半衰期、改變的穩定性、改變的對細胞酶的易感性或改變的效應子功能。就效應子功能而言，可期望修飾抗體，以便增強例如抗體治療癌症的效力。在某些情況下，例如在作用機制涉及阻斷或拮抗但是不殺傷攜帶靶抗原的細胞的抗體的情況下，期望降低或消除效應子功能。當針對非期望的細胞，比如腫瘤和外源細胞時，通常期望增加效應子功能，其中FcγRs以低水準表達，例如，具有低水準FcγRIIB的腫瘤特異性B細胞(例如，非霍奇金淋巴瘤、CLL和伯基特淋巴瘤)。在此實施方式中，具有賦予的或增強效應子功能活性的根據本發明任一實施方式的分子可用於治療和/或預防其中期望增強效應子功能活性的效力的疾病、病症或感染。
在某些實施方式中，ROR1 mAb 1抗體或它們的片段或衍生物包括對Fc結構域氨基酸的一個或多個修飾，其降低這樣的分子的Fc結構域對一個或多個FcγR受體的親和性和抗體親抗原性。在其他實施方式中，ROR1 mAb 1抗體或它們的片段或衍生物可包括對Fc結構域的氨基酸的一個或多個修飾，其增加這樣的分子的Fc結構域對一個或多個FcγR受體的親和性和抗體親抗原性。在其他實施方式中，分子包括變異的Fc結構域，其中此變異相對於不包括Fc結構域或包括野生型Fc結構域的分子賦予或介導增加的ADCC活性和/或對FcγRIIA 增加的結合。在可選的實施方式中，分子包括變異的Fc結構域，其中此變異相對於不包括Fc結構域或包括野生型Fc結構域的分子，賦予或介導降低的ADCC活性(或其他效應子功能)和/或對FcγRIIB增加的結合。
在一些實施方式中，ROR1 mAb 1抗體或它們的片段或衍生物，其包括變異的Fc結構域，此變異的Fc結構域相對於包括野生型Fc結構域的可比較的分子不顯示對任何FcγR的可檢測的結合。在其他實施方式中，這樣的ROR1 mAb 1抗體或它們的片段或衍生物，其包括變異的Fc結構域，此變異的Fc結構域僅僅結合單個FcγR，優選地FcγRIIA、FcγRIIB，或FcγRIIIA中之一。
ROR1 mAb 1抗體或它們的片段或衍生物可包括對啟動和/或抑制Fcγ受體的改變的親和力。在一個實施方式中，抗體或分子包括變異的Fc結構域，其相對於具有野生型Fc結構域的可比較的分子，對於FcγRIIB具有增加的親和性和對於FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有降低的親和性。在另一實施方式中，ROR1 mAb 1抗體或它們的片段或衍生物可包括變異的Fc結構域，其相對於具有野生型Fc結構域的可比較的分子，對於FcγRIIB具有降低親和性和對於FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有增加的親和性。在又另一實施方式中，ROR1 mAb 1抗體或它們的片段或衍生物包括變異的Fc結構域，其相對於具有野生型Fc結構域的可比較的分子，對於FcγRIIB具有降低的親和性和對於FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有降低的親和性。在又另一實施方式中，ROR1 mAb 1抗體或它們的片段或衍生物可包括變異的Fc結構域，其相對於具有野生型Fc結構域的可比較的分子，對於FcγRIIB具有不變親和性和對於FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有降低的(或增加)親和性。
在某些實施方式中，ROR1 mAb 1抗體或它們的片段或衍生物，其包括變異的Fc結構域，具有對於FcγRIIIA和/或FcγRIIA改變的親和性，使得免疫球蛋白具有增強的效應子功能，例如，ADCC。效應細胞功能的非限制性例子包括ADCC，抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)、吞噬、調理作用、調理吞噬、細胞結合、蓮座(rosetting)、C1q結合和CDC。
在優選的實施方式中，相對於包括野生型Fc結構域的可比較的分子，親和性或效應子功能的改變是至少2倍，優選地至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍。在本發明的其他實施方式中，相對於包括野生型Fc結構域的分子，變異的Fc結構域以至少65%，優選地至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、125%、150%、175%、200%、225%或250%更大的親和性特異性結合一個或多個FcR。這樣的測量可以是體內或體外試驗，並且，在優選的實施方式中，是體外試驗比如ELISA或表面等離子共振試驗。
在不同的實施方式中，ROR1 mAb 1抗體或它們的片段或衍生物包括變異的Fc結構域，其中此變異激動(agonize)FcγR受體的至少一種活性，或拮抗FcγR受體的至少一種活性。在優選的實施方式中，分子包括變體，其激動(或拮抗)FcγRIIB的一個或多個活性，例如，B細胞受體介導的信號傳導、B細胞的啟動、B細胞增殖、抗體產生、B細胞的細胞內鈣流入、細胞週期進程、FcγRIIB介導的FcεRI信號傳導的抑制、FcγRIIB的磷酸化、SHIP募集、SHIP磷酸化和與Shc的締合，或激動(或拮抗)FcγRIIB信號轉導途徑中一個或多個下游分子(例如，MAP激酶、JNK、p38或Akt)的活性。在另一實施方式中，分子 包括變體，其激動(或拮抗)FcεRI的一個或多個活性，例如，肥大細胞啟動、鈣動員、脫粒、細胞因數產生或血清素釋放。
在某些實施方式中，ROR1 mAb 1抗體或它們的片段包括來自兩個或更多個IgG同種型(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)的包含Fc結構域的結構域。各種IgG同種型展示不同的物理和功能特性，包括血清半衰期，補體活化，FcγR結合親和力和效應子功能活性(例如ADCC、CDC等)，原因是它們鉸鏈和/或Fc結構域的氨基酸序列的差異，例如如在以下文獻中描述的：Flesch,B.K.和Neppert,J.(1999)“Functions Of The Fc Receptors For Immunoglobulin G,”J.Clin.Lab.Anal.14：141-156；Chappel,M.S.等(1993)“Identification Of A Secondary Fc Gamma RI Binding Site Within A Genetically Engineered Human IgG Antibody,”J.Biol.Chem.33：25124-25131；Chappel,M.S.等(1991)“Identification Of The Fc Gamma Receptor Class IBinding Site In Human IgG Through The Use Of Recombinant IgG1/IgG2 Hybrid And Point-Mutated Antibodies,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88：9036-9040；Brüggemann,M.等(1987)“Comparison Of The Effector Functions Of Human Immunoglobulins Using A Matched Set Of Chimeric Antibodies,”J.Exp.Med 166：1351-1361。此類型的變異的Fc結構域可單獨使用，或結合氨基酸修飾使用，以影響Fc介導的效應子功能和/或結合活性。氨基酸修飾和IgG鉸鏈/Fc結構域的組合可展示類似的功能(例如，對於FcγRIIA的增加的親和性)並且可另外地或，更優選地，協同作用，以相對於包括野生型Fc結構域的分子，修飾分子的效應子功能。在其他實施方式中，氨基酸修飾和IgG Fc結構域可展示相反的功能(例如，分別增加和降低對於FcγRIIA 的親和性)並且可用於相對於不包括Fc結構域或包括相同同種型的野生型Fc結構域的分子，選擇性調和或降低分子的特定功能。
在優選的具體實施方式中，ROR1 mAb 1抗體或它們的片段包括變異的Fc結構域，其中此變異的Fc結構域相對於野生型Fc結構域包括至少一個氨基酸修飾，使得分子具有對於FcR改變的親和性，前提是此變異的Fc結構域基於Fc-FcR相互作用的晶體學和結構分析比如Sondermann,P.等(2000)“The 3.2-A Crystal Structure Of The Human IgG1 Fc Fragment-Fc GammaRIII Complex,”Nature 406：267-273中公開的那些，在直接接觸FcγR的位置沒有取代。Fc結構域中直接接觸FcγR的位置的例子是氨基酸殘基234-239(鉸鏈結構域)、氨基酸殘基265-269(B/C環)、氨基酸殘基297-299(C’/E環)和氨基酸殘基327-332(F/G環)。在一些實施方式中，本發明的分子包括變異的Fc結構域，其包括基於結構和晶體學分析不直接接觸FcγR--例如不在Fc-FcγR結合位點中--的至少一個殘基的修飾。
變異的Fc結構域是本領域熟知的，並且和任何已知的Fc變體可在任一實施方式中使用，以賦予或修飾ROR1 mAb 1抗體或包括Fc結構域(或其部分)的它們的片段展示的效應子功能，如在功能上分析的，例如，在NK依賴性或巨噬細胞依賴性試驗中。例如，鑒定為改變效應子功能的Fc結構域變體公開在下述文獻中：PCT公開號WO 04/063351、WO 06/088494、WO 07/024249、WO 06/113665、WO 07/021841、WO 07/106707、WO 2008/140603，並且其中公開的任何適當的變體可用於本分子。
在某些實施方式中，ROR1 mAb 1抗體或它們的片段包括變異的Fc結構域，其在一個或多個位點中具有一個或多個氨基酸修飾， 此修飾(一個或多個)改變(相對於野生型Fc區)變異Fc區與啟動FcγR(諸如FcγRIIA或FcγRIIIA)相對於抑制性FcγR(諸如FcγRIIB)的親和性比：
Figure 104117564-A0305-02-0126-83
在Fc變體的親和力的比大於1的情況下，本發明的方法在提供期望增強FcγR介導的效應細胞功能(例如，ADCC)的效力的疾病、病症或感染--例如，癌症或感染疾病--的治療性或預防性治療或改善其症狀方面尤其有用，。在Fc變體的親和力的比小於1的情況下，本發明的方法在提供期望降低FcγR介導的效應細胞功能的效力疾病或病症--例如，自身免疫或炎症病症--的治療性或預防性治療或改善其症狀方面尤其有用。表3根據它們的親和力的比是否大於或小於1列舉了示例性單、雙、三、四和五個突變，並且有關這些突變的更多資訊可見PCT公開號WO 04/063351、WO 06/088494、WO 07/024249、WO 06/113665、WO 07/021841、WO 07/106707、WO 2008/140603。
Figure 104117564-A0305-02-0126-82
Figure 104117564-A0305-02-0127-84
Figure 104117564-A0305-02-0128-85
Figure 104117564-A0305-02-0129-86
在具體的實施方式中，在變異的Fc結構域中，任何氨基酸修飾(例如，取代)在下述任何位置：235、240、241、243、244、247、262、263、269、298、328，或330，和優選地一個或多個下述殘基：A240、I240、L241、L243、H244、N298、I328或V330。在不同的具體實施方式中，在變異的Fc結構域中，任何氨基酸修飾(例如，取代)在下述任何位置：268、269、270、272、276、278、283、285、286、289、292、293、301、303、305、307、309、331、333、334、335、 337、338、340、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438或439，和優選地一個或多個下述殘基：H280、Q280、Y280、G290、S290、T290、Y290、N294、K295、P296、D298、N298、P298、V298、I300或L300。
在優選的實施方式中，在以改變的親和性結合FcγR的變異的Fc結構域中，任何氨基酸修飾(例如，取代)在下述任何位置：255、256、258、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、300、301、303、305、307、309、312、320、322、326、329、330、332、331、333、334、335、337、338、339、340、359、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438或439。優選地，變異的Fc結構域具有任何下述殘基：A256、N268、Q272、D286、Q286、S286、A290、S290、A298、M301、A312、E320、M320、Q320、R320、E322、A326、D326、E326、N326、S326、K330、T339、A333、A334、E334、H334、L334、M334、Q334、V334、K335、Q335、A359、A360或A430。
在不同的實施方式中，在以降低的親和性結合FcγR(經其Fc結構域)的變異的Fc結構域中，任何氨基酸修飾(例如，取代)在下述任何位置：252、254、265、268、269、270、278、289、292、293、294、295、296、298、300、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438或439。
在不同的實施方式中，在以增強的親和性結合FcγR(經其Fc結構域)的變異的Fc結構域中，任何氨基酸修飾(例如，取代)在下 述任何位置：280、283、285、286、290、294、295、298、300、301、305、307、309、312、315、331、333、334、337、340、360、378、398，或430。在不同的實施方式中，在以增強的親和性結合FcγRIIA的變異的Fc結構域中，任何下述殘基：A255、A256、A258、A267、A268、N268、A272、Q272、A276、A280、A283、A285、A286、D286、Q286、S286、A290、S290、M301、E320、M320、Q320、R320、E322、A326、D326、E326、S326、K330、A331、Q335、A337或A430。
優選的變體包括在下述任何位置的一個或多個修飾：228、230、231、232、233、234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、271、273、275、281、284、291、296、297、298、299、302、304、305、313、323、325、326、328、330或332。
尤其優選的變體包括選自A-AI組的一個或多個修飾：
Figure 104117564-A0305-02-0131-87
Figure 104117564-A0305-02-0132-88
Figure 104117564-A0305-02-0133-89
仍更尤其優選的變體包括選自1-105組的一個或多個修飾：
Figure 104117564-A0305-02-0133-90
Figure 104117564-A0305-02-0134-91
Figure 104117564-A0305-02-0135-92
Figure 104117564-A0305-02-0136-93
Figure 104117564-A0305-02-0137-95
在一個實施方式中，ROR1 mAb 1抗體或它們的片段包括變異的Fc結構域，其在Fc結構域中具有至少一個修飾。在某些實施方式中，變異的Fc結構域包括選自下述的至少一個取代：L235V、F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L，其中此編號是如在Kabat中的EU索引的編號。在具體的實施方式中，變異的Fc結構域包括：(A)選自下述的至少一個取代：F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L；(B)選自下述的至少兩個取代：(1)F243L和P396L；(2)F243L和R292P；和(3)R292P和V305I；(C)選自下述的至少三個取代：(1)F243L、R292P和Y300L；(2)F243L、R292P和V305I；(3)F243L、R292P和P396L；和(4)R292P、V305I和P396L；(D)選自下述的至少四個取代：(1)F243L、R292P、Y300L和P396L；和(2)F243L、R292P、V305I和P396L；或(E)選自下述的至少五個取代：(1)F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L；和(2)L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L。
在另一具體的實施方式中，變異的Fc結構域包括下述取代：(A)F243L、R292P和Y300L；(B)L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L；或(C)F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L。
在其他實施方式中，ROR1 mAb 1抗體或它們的片段可具有本領域已知的任何Fc變體，比如下述文獻中公開那些：Jefferis,R.等(2002)“Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR：Current Models,”Immunol.Lett.82：57-65；Presta,L.G.等(2002)“Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function,” Biochem.Soc.Trans.30：487-90；Idusogie,E.E.等(2001)“Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement,”J.Immunol.166：2571-75；Shields,R.L.等(2001)“High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1 For Fc Gamma RI,Fc Gamma RII,Fc Gamma RIII,And FcRn And Design Of IgG1 Variants With Improved Binding To The Fc gamma R,”J.Biol.Chem.276：6591-6604；Idusogie,E.E.等(2000)“Mapping Of The C1q Binding Site On Rituxan,A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc,”J.Immunol.164：4178-84；Reddy,M.P.等(2000)“Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4,”J.Immunol.164：1925-1933；Xu,D.等(2000)“In Vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies,”Cell.Immunol.200：16-26；Armour,K.L.等(1999)“Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities,”Eur.J.Immunol.29：2613-24；Jefferis,R.等(1996)“Modulation Of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions,”Immunol.Lett.54：101-04；Lund,J.等(1996)“Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains,”J.Immunol.157：4963-4969；Hutchins等(1995)“Improved Biodistribution,Tumor Targeting,And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-1H,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)92：11980-84；Jefferis,R.等(1995)“Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors：The Role Of Glycosylation,”Immunol.Lett.44：111-17；Lund,J.等(1995)“Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors,”FASEB J.9：115-19；Alegre,M.L.等(1994)“A Non-Activating "Humanized" Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo,”Transplantation 57：1537-1543；Lund等(1992)“Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma R11,”Mol.Immunol.29：53-59；Lund等(1991)“Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG,”J.Immunol.147：2657-2662；Duncan,A.R.等(1988)“Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG,”Nature 332：563-564；美國專利號5,624,821、5,885,573、6,194,551、7,276,586；和7,317,091；和PCT公開WO 00/42072和PCT WO 99/58572。
在一些實施方式中，ROR1 mAb 1抗體或它們的片段可進一步包括一個或多個糖基化位點，以便一個或多個碳水化合物部分共價連接至分子。優選地，相比未修飾的ROR1 mAb 1抗體或片段，在Fc結構域具有一個或多個糖基化位點和/或一個或多個修飾的這樣的ROR1 mAb 1抗體或它們的片段賦予或具有增強的抗體介導效應子功能，例如，增強的ADCC活性。在一些實施方式中，ROR1 mAb 1抗體或它們的片段，其包括一個或多個已知直接或間接與Fc結構域的碳 水化合物部分相互作用的氨基酸修飾，包括但不限於在下述位置的氨基酸：241、243、244、245、245、249、256、258、260、262、264、265、296、299和301。直接或間接與Fc結構域的碳水化合物部分相互作用的氨基酸是本領域已知的，參見Jefferis,R.等(1995)“Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors：The Role Of Glycosylation,”Immunol.Lett.44：111-17。
在另一實施方式中，ROR1 mAb 1抗體或它們的片段，其已經通過將一個或多個糖基化位點引入分子的一個或多個位點而被修飾，優選地不改變分子的功能，例如，與靶抗原或FcγR的結合活性。糖基化位點可引入本發明分子的可變區和/或固定區。如本文所使用，“糖基化位點”包括與寡糖(即，包含兩個或更多個連接在一起的單糖的碳水化合物)特異性和共價連接的抗體中任何具體的氨基酸序列。寡糖側鏈通常經N-或O-鍵連接至抗體的骨架。N-連接的糖基化指寡糖部分連接至天冬醯胺殘基的側鏈。O-連接的糖基化指寡糖部分連接至羥基氨基酸，例如，絲氨酸、蘇氨酸。這樣的ROR1 mAb 1抗體或它們的片段可包括一個或多個糖基化位點，包括N-連接和O-連接的糖基化位點。本領域已知的用於N-連接的或O-連接的糖基化的任何糖基化位元點可根據本發明使用。示例性N-連接的糖基化位點是氨基酸序列：Asn-X-Thr/Ser，其中X可以是任何氨基酸和Thr/Ser指示蘇氨酸或絲氨酸。這樣的一個或多個位點可使用本發明所屬領域熟知的方法引入根據本發明任一實施方式的分子(參見In vitro Mutagenesis,Recombinant DNA：A Short Course,J.D.Watson等W.H.Freeman and Company,New York,1983，第8章，106-116頁，其通過引用以其整體併入本文)。用於將糖基化位點引入ROR1 mAb 1抗體或它們的 片段的示例性方法可包括：修飾或突變分子的氨基酸序列從而獲得期望的Asn-X-Thr/Ser序列，或表達具有這樣序列的編碼ROR1 mAb 1抗體的核酸分子。
在一些實施方式中，通過添加或刪除糖基化位點，修飾ROR1 mAb 1抗體或它們的片段的碳水化合物含量的方法。修飾抗體(和包括抗體結構域，例如Fc結構域，的分子)的碳水化合物含量的方法是本領域熟知的，並且包括在本發明內，參見美國專利號6,218,149、EP 0 359 096 B1；美國公開號US 2002/0028486、WO 03/035835、美國公開號2003/0115614、美國專利號6,218,149、美國專利號6,472,511；其所有均通過引用以其整體併入本文。在其他實施方式中，通過刪除分子的一個或多個內源碳水化合物部分而修飾ROR1 mAb 1抗體或它們的片段的碳水化合物含量的方法。在具體的實施方式中，通過修飾臨近297的位置而移動抗體Fc結構域的糖基化位點。在具體的實施方式中，修飾296位以便296位而不是297位被糖基化。
可通過比如下面描述的那些技術修飾效應子功能：PCT公開號WO 04/063351、WO 06/088494、WO 07/024249、WO 06/113665、WO 07/021841、WO 07/106707、WO 2008/140603，或通過其他方式。例如，可在Fc結構域中引入半胱氨酸殘基(一個或多個)，從而允許在此區域中的鏈間二硫鍵形成，導致產生可具有改善的內化能力和/或增強的補體介導的細胞殺傷和ADCC的同二聚抗體。參見Caron,P.C.等(1992)“Engineered Humanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies,”J.Exp.Med.176：1191-1195；Shopes, B.(1992)“A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced Cytolytic Activity,”J.Immunol.148(9)：2918-2922。 也可使用如Wolff,E.A.等(1993)“Monoclonal Antibody Homodimers：Enhanced Antitumor Activity In Nude Mice,”Cancer Research 53：2560-2565中描述的異雙官能交聯劑製備具有增強的抗腫瘤活性的同二聚抗體。可選地，抗體可被工程化，其具有雙Fc結構域並且可從而具有增強的補體分解和ADCC能力(參見Stevenson,G.T.等(1989)“A Chimeric Antibody With Dual Fc Domains(bisFabFc)Prepared By Manipulations At The IgG Hinge,”Anti-Cancer Drug Design 3：219-230)。
CDR殘基的單個氨基酸改變可導致喪失功能的結合的事實(參見Rudikoff,S.等。(1982)“Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-Binding Specificity,”Proc.Natl.Acad.Sci.(美國)79(6)：1979-1983)提供了系統鑒定可選的功能CDR序列的手段。在用於獲得這樣的變異CDR的一個優選方法中，對編碼CDR的多核苷酸進行誘變(例如經隨機誘變或通過位點定向方法(例如，用編碼突變的基因座的引物進行聚合酶鏈介導的擴增))，以產生具有取代的氨基酸殘基的CDR。通過比較原始(功能)CDR序列的相關殘基的同一性(identity)與取代的(非功能)變體CDR序列的同一性，可鑒定此取代的BLOSUM62.iij取代分數。BLOSUM系統提供了通過分析用於可信比對的序列的資料庫而產生的氨基酸取代的矩陣(參見Eddy,S.R.(2004)“Where Did The BLOSUM62 Alignment Score Matrix Come From？,”Nature Biotech.22(8)：1035-1036；Henikoff,J.G.(1992)“Amino acid substitution matrices from protein blocks,”Proc. Natl. Acad.Sci.(美國)89：10915-10919；Karlin,S.等(1990)“Methods For Assessing The Statistical Significance Of Molecular Sequence Features By Using General Scoring Schemes,”Proc.Natl.Acad.Sci.(美國)87：2264-2268；Altschul,S.F.(1991)“Amino Acid Substitution Matrices From An Information Theoretic Perspective,”J.Mol.Biol.219,555-565)。目前，最先進的BLOSUM資料庫是BLOSUM62資料庫(BLOSUM62.iij)。表4顯示了BLOSUM62.iij取代分數(分數越高取代越保守，因此取代越可能不影響功能)。例如，如果包括所得CDR的抗原結合片段不能結合ROR1，那麼BLOSUM62.iij取代分數視為不足夠保守，並且選擇和產生具有更高取代分數的新的候選取代。因此，例如，如果原始殘基是谷氨酸(E)，和非功能取代殘基是組氨酸(H)，那麼BLOSUM62.iij取代分數是0，並且更高保守的改變(比如對天冬氨酸鹽、天冬醯胺、穀氨醯胺或賴氨酸的改變)是優選的。
Figure 104117564-A0305-02-0143-97
Figure 104117564-A0305-02-0144-98
因此，考慮使用隨機誘變鑒定改善的CDR。噬菌體展示技術可選地用於增加(或降低)CDR親和性。稱為親和力成熟(affinity maturation)的此技術採用誘變或“CDR步移(walking)”，並且重新選擇使用靶抗原或其抗原片段鑒定具有當與初始或親代抗體比較時，以更高(或更低)親和性結合抗原的CDR的抗體(見，例如Glaser等(1992)J.Immunology 149：3903)。使整個密碼子而不是單個核苷酸進行誘變導致氨基酸突變的半隨機的庫(repertoire)。可構建由變異克隆的庫組成的文庫，此變異克隆每個通過在單一CDR中的單個氨基酸改變而不同，並且其包含表示對於每個CDR殘基的每個可能的氨基酸取代的變體。可通過使固定的突變體接觸標記抗原來篩選對於抗原具有增加的(或降低的)結合親和力的突變體。本領域已知的任何篩選方法可用於鑒定對於抗原具有增加的或降低的親和性的突變抗體(例如，ELISA)(參見Wu等1998,Proc.Natl.Acad.Sci.(美國)95：6037；Yelton等，1995,J. Immunology 155：1994)。可能使用使輕鏈隨機化的CDR步移(參見Schier等，1996,J.Mol.Bio.263：551)。
完成這種親和力成熟的方法描述在例如下述中：Krause,J.C.等(2011)“An Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture Enhances Function Of A Human Antibody,”MBio.2(1)pii：e00345-10.doi：10.1128/mBio.00345-10；Kuan,C.T.等(2010)“Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMB Recombinant Immunotoxins Targeting Malignant Gliomas And Melanomas,”Int.J.Cancer 10.1002/ijc.25645；Hackel,B.J.等(2010)“Stability And CDR Composition Biases Enrich Binder Functionality Landscapes,”J.Mol.Biol.401(1)：84-96；Montgomery,D.L.等(2009)“Affinity Maturation And Characterization Of A Human Monoclonal Antibody Against HIV-1 gp41,”MAbs 1(5)：462-474；Gustchina,E.等(2009)“Affinity Maturation By Targeted Diversification Of The CDR-H2 Loop Of A Monoclonal Fab Derived From A Synthetic Naïve Human Antibody Library And Directed Against The Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41 Yields A Set Of Fabs With Improved HIV-1 Neutralization Potency And Breadth,”Virology 393(1)：112-119；Finlay,W.J.等(2009)“Affinity Maturation Of A Humanized Rat Antibody For Anti-RAGE Therapy：Comprehensive Mutagenesis Reveals A High Level Of Mutational Plasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions,”J.Mol.Biol.388(3)：541-558；Bostrom,J.等(2009)“Improving Antibody Binding Affinity And Specificity For Therapeutic Development,”Methods Mol.Biol.525：353-376；Steidl,S.等(2008)“In Vitro Affinity Maturation Of Human GM-CSF Antibodies By Targeted CDR-Diversification,”Mol.Immunol.46(1)：135-144；和Barderas,R.等(2008)“Affinity maturation of antibodies assisted by in silico modeling,”Proc.Natl.Acad.Sci.(美國)105(26)：9029-9034。作為例子，可用選擇的ROR1 mAb 1抗體塗覆多孔板(例如，碳酸鹽緩衝液中100ng/孔，在室溫下2hrs)和隨後用1/10稀釋的可溶性ROR1溫育並且在室溫下溫育16小時或在PBS-T-BSA中稀釋至50ng/ml的濃度(0.05ml添加至每個孔並且在室溫下溫育至少2h)。然後沖洗板，並且然後添加在PBS-T-BSA中以0.5μg/ml開始的重組抗體的稀釋物，並且在室溫下溫育1小時。然後使用，例如，抗人IgG-HRP綴合物和TMB底物測量重組抗體與捕獲的抗原的結合。在使用稀釋硫酸停止顯色之後，在450nM下讀取板並且鑒定更高的親和性抗體(見，例如，美國專利號7,351,803)。
VI.藥學組合物
在一個實施方式中，一種用於治療特徵在於存在疾病相關的抗原的癌症或疾病的藥學組合物，其包括用於製造藥學組合物的散裝藥物組合物(例如，不純的或非無菌組合物)和可用於製備單位劑型的藥學組合物(即，適於施用至受試者或患者的組合物)。此組合物包括預防或治療有效量的本發明的修飾雙抗體，或這樣的劑和藥學上可接受的載體的組合。優選地，此組合物包括預防或治療有效量的一種或多種分子和藥學上可接受的載體。在一個實施方式中，一種藥學組合物和藥學上可接受的載體，此藥學組合物包括這樣修飾的雙抗體和對具體的疾病抗原具有特異性的第二治療性抗體。
如本文所使用，術語“治療(treatment)”或“治療(treating)”表示獲得有益的或期望的結果的途徑，此有益的或期望的結果包括並且優選地是有益的或期望的臨床結果。這樣的有益的或期望的臨床結果包括但不限於下述的一個或多個：減少(或破壞)受感染細胞或其他患病的細胞的增殖、減輕由於疾病產生的症狀，提高遭受疾病的那些的生活品質、減少治療疾病需要的其他藥物治療的劑量、延遲疾病的進展，和/或延長陪伴(companion)動物接受者的生存。
在具體的實施方式中，術語“藥學上可接受的”表示被聯邦或國家政府的管理機構批准，或列舉在美國藥典中或其他通常認可的用於動物，尤其是人的藥典中(參見Remington：The Science和Practice of Pharmacy(2012)Allen,Loyd V.,Jr。.(Ed.)22nd Edition,Pharmaceutical Press,London UK)。術語“載體”指稀釋劑、佐劑(例如，弗氏佐劑(完全的和不完全的)、賦形劑或利用其施用治療劑的媒介。這樣的藥學載體可以是無菌液體，比如水和油，包括石油、動物、蔬菜或合成起源的那些，比如花生油、大豆油、礦物質油、芝麻油等。當靜脈內施用藥學組合物時，水是優選的載體。鹽水溶液和水性右旋糖和丙三醇溶液可也可用作液體載體，尤其用於可注射的溶液。適當的藥學賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉、丙三醇、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果期望，組合物也可包含少量的濕潤劑或乳化劑，或pH緩衝劑。這些組合物可為下述形式：溶液、懸液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、粉末、緩釋製劑等。
一般而言，分別或以單位劑型混合在一起來提供本發明組合物的成分，例如，在密封容器比如指示活性劑的量的安瓿或袋 (sachette)中作為乾燥凍幹粉末或無水濃縮物。在組合物通過輸注施用的情況下，其可用包含無菌藥學級的水或鹽水的輸注瓶進行分配。在通過注射施用組合物的情況下，可提供用於注射的無菌水或鹽水的安瓿，從而可混合成分然後施用。
根據本發明任一實施方式的組合物可配製為中性或鹽形式。藥學上可接受的鹽包括但不限於用陰離子形成的那些，比如衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，和用陽離子形成的那些，比如衍生自鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的那些。
在一些實施方式中，一種藥學包裝或試劑盒，其包括一個或多個包含前述之修飾的雙抗體--單獨的或結合這樣的藥學上可接受的載體--的容器。另外，用於治療疾病的一種或多種其他預防劑或治療劑可也包括在藥學包裝或試劑盒中。本發明也提供了藥學包裝或試劑盒，其包括填充根據本發明任一實施方式的藥學組合物的一種或多種成分的一個或多個容器。任選地與這樣的容器(一個或多個)結合的可以是監管藥物製劑或生物製品的製造、使用或售賣的政府管理局規定的形式的公告(notice)，此公告反映管理局對用於人施用的製造、使用或售賣的批准。
在一些實施方式中，一種可用於上述方法的試劑盒，其包括前述的一種或多種分子。在另一實施方式中，試劑盒進一步包括用於治療特徵在於存在疾病相關的抗原的癌症或疾病一種或多種其他預防劑或治療劑，其在一個或多個容器中。在另一實施方式中，試劑盒進一步包括結合一個或多個疾病相關的抗原的一種或多種抗體或雙抗體。在某些實施方式中，其他預防劑或治療劑是化療劑。在其他實施方式中， 預防劑或治療劑是生物或激素治療劑。
VII.產生本發明的三特異性結合分子的方法
三特異性結合分子最優選地通過重組表達編碼這樣的多肽的核酸分子產生，如本領域熟知的。
前述之多肽可便利地使用固相肽合成而被方便地製備(參見Merrifield,B.(1986)“Solid Phase Synthesis,”Science 232(4748)：341-347；Houghten,R.A.(1985)“General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides：Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids,”Proc.Natl.Acad. Sci.(U.S.A.)82(15)：5131-5135；Ganesan,A.(2006)“Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century,”Mini Rev.Med.Chem.6(1)：3-10)。
可選地，可使用本領域已知的任何方法重組製備和表達抗體。可如下重組製備抗體：首先分離從宿主動物製備的抗體、獲得基因序列和使用基因序列在宿主細胞(例如，CHO細胞)中重組表達抗體。可採用的另一方法是在植物(例如，煙草)或轉基因奶中表達抗體序列。已經公開了在植物或奶中重組表達抗體的適當的方法(參見Peeters等(2001)“Production Of Antibodies And AntibodyFragments In Plants,”Vaccine 19：2756；Lonberg,N.等(1995)“Human Antibodies From Transgenic Mice,”Int.Rev.Immunol 13：65-93；和Pollock等(1999)“Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies,”J.Immunol Methods 231：147-157)。製備抗體衍生物，例如，嵌合的、人源化的，單鏈的等的適當的方法是本領域已知的。在另一可選方案中，抗體可通過噬菌體展示技術重組製備(參 見美國專利號5,565,332、5,580,717、5,733,743、6,265,150和Winter,G.等(1994)“Making Antibodies By Phage Display Technology,”Annu.Rev.Immunol.12.433-455)。
可通過Edman降解法對感興趣的抗體或蛋白質測序，此Edman降解法對於本領域技術人員是熟知的。由質譜或Edman降解法產生的肽資訊可用於設計探針或引物，其被用於克隆感興趣的蛋白質。
克隆感興趣的蛋白質的可選的方法是通過使用純化蛋白質或其部分“淘洗”表達感興趣的抗體或蛋白質的細胞。“淘洗”程式可如下述：從在第二細胞類型中表達或過表達期望的cDNA的組織或細胞獲得cDNA文庫，和篩選特異性結合期望蛋白質的第二細胞類型的轉染的細胞。用於通過“淘洗”克隆編碼細胞-表面蛋白質的哺乳基因的方法的詳細描述可見於現有技術(參見Aruffo,A.等(1987)“Molecular Cloning Of A CD28 cDNA By A High-Efficiency COS Cell Expression System,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)84：8573-8577和Stephan,J.等(1999)“Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development：Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation,”Endocrinol.140：5841-5854)。
可根據現有技術的標準方法通過從具體的細胞類型逆轉錄mRNA獲得編碼抗體和其他肽激動劑、拮抗劑和調諧劑的cDNA。具體而言，可使用各種裂解酶或化學溶液根據上文Sambrook等闡釋的程式分離mRNA，或通過商業上可得的核酸-結合樹脂根據製造商提供的伴隨說明書提取mRNA(例如，Qiagen,Invitrogen,Promega)。然後將合成的cDNA引入表達載體，以在第二類型細胞中產生感興趣的抗體或蛋白質。暗示表達載體在宿主細胞中必須是可複製的--作為游離 體(episome)或作為染色體DNA的不可缺少的部分。適當的表達載體包括但不限於質粒、病毒載體，包括腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉錄病毒和黏粒。
包含感興趣的多核苷酸的載體可通過許多適當的方式中的任意方式被引入宿主細胞，此適當方式包括電穿孔，採用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質進行轉染；微彈轟擊(microprojectile bombardment)；脂轉染；和感染(例如，在載體是感染劑比如牛痘病毒的情況下)。引入載體或多核苷酸的選擇通常取決於宿主細胞的特徵。
任何能夠過表達異源DNA的宿主細胞均可用於分離編碼感興趣的抗體、多肽或蛋白質的基因的目的。適當的哺乳宿主細胞的非限制性例子包括但不限於COS、HeLa和CHO細胞。優選地，相比於宿主細胞中相應的感興趣的內源抗體或蛋白質(如果存在)，宿主細胞以高約5倍，更優選地高10倍，更優選地高20倍、更優選地高50倍或更優選地高100倍的水準表達cDNA。優選地通過免疫試驗或FACS實現對特異性結合期望的蛋白質的宿主細胞的篩選。由此可鑒定過表達感興趣的抗體或蛋白質的細胞。
各種技術也是可用的，其現在可用以產生突變肽激動劑、拮抗劑和調諧劑，其相對於親代肽激動劑、拮抗劑或調諧劑分子編碼所得蛋白質的氨基酸序列中的添加、缺失或改變。
在一些實施方式中，一種對根據本發明任一實施方式的三特異性結合分子的修飾和具有增強的或降低的活性的變體，此修飾不顯著影響它們的特性。多肽的修飾是現有技術的常規實踐。修飾的多肽的例子包括具有氨基酸殘基的保守取代的多肽，不顯著不利改變功能活性 的氨基酸的一個或多個缺失或添加，或使用化學類似物。可彼此保守取代的氨基酸殘基包括但不限於：甘氨酸/丙氨酸；纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸；天冬醯胺/穀氨醯胺；天冬氨酸/谷氨酸；絲氨酸/蘇氨酸；賴氨酸/精氨酸；和苯丙氨酸/酪氨酸。這些多肽也包括糖基化和非糖基化的多肽，以及具有其他翻譯後修飾的多肽，比如例如用不同糖的糖基化、乙醯化和磷酸化。優選地，氨基酸取代是保守的，即，取代的氨基酸應具備與原始氨基酸類似的化學特性。這樣的保守取代是本領域已知的，並且上面已經提供了例子。氨基酸修飾的範圍可從改變或修飾一個或多個氨基酸到區域，比如可變結構域的完全重新設計(redesign)。可變結構域的改變可改變結合親和力和/或特異性。修飾的其他方法包括使用本領域已知的偶聯技術，包括但不限於酶促方式、氧化取代和螯合作用。修飾可用於，例如，連接用於免疫試驗的標籤，比如連接用於放射免疫分析的放射性部分。使用現有技術確立的程式製備修飾的多肽並且可使用本領域已知的標準試驗篩選。
在一些實施方式中，一種融合蛋白，其包括來自本發明多肽和抗體的一個或多個片段或區域。在一個實施方式中，一種融合多肽，其包括可變輕鏈區的至少10個連續氨基酸和可變重鏈區的至少10個氨基酸。在另一實施方式中，融合多肽包含異源免疫球蛋白固定區。在另一實施方式中，融合多肽包含由公共保藏的雜交瘤產生的抗體的輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域。為了本發明的目的，抗體融合蛋白包含一個或多個多肽結構域和在天然分子中未連接的另一氨基酸序列，例如，來自另一區域的異源序列或同源的序列，此多肽結構域特異性結合期望的病毒表位或期望的免疫效應細胞的啟動受體或表達這樣的啟動受體的免疫效應細胞表面上存在的蛋白質。
在一些實施方式中，一種多肽，其包括根據本發明任一實施方式之抗體的氨基酸序列。此多肽可通過本領域已知的程式製備。可如下產生多肽：抗體的蛋白酶解或其他降解、如上述的重組方法(即，單個或融合多肽)或化學合成。抗體的多肽，尤其多達約50個氨基酸的短多肽，便利地通過化學合成製備。化學合成的方法是本領域已知的並且是商業上可得的。例如，這樣的多肽可通過採用固相方法的自動多肽合成儀產生。
VIII.本發明的組合物的用途
本發明涉及一種藥學組合物，其包括根據本發明任一實施方式的三特異性結合分子、源自這樣的分子的多肽、包括編碼這樣的分子或多肽的序列的多核苷酸和如本文所描述的其他劑。
根據本發明任一實施方式的三特異性結合分子能夠協同結合三個表位，因此主要用於診斷、化學分離和與這樣的表位相關的療法。例如，這樣的分子可在夾心免疫測試中用作試劑。
在三特異性結合分子結合疾病相關的抗原的表位的實施方式中，這樣的分子可用於治療與這樣的疾病相關抗原的表達相關或特徵在於這樣的疾病相關抗原的表達的疾病或病況。因此，不受限制的，包括這樣的分子的藥學組合物可用於診斷或治療癌症和由病原體(例如，細菌、真菌、病毒或原生動物)感染造成的疾病。
IX.施用方法
通過向受試者施用有效量的根據本發明任一實施方式的藥學組合物，此組合物可被提供用於治療、預防和改善與疾病、病症或感染相關的一個或多個症狀。在優選的方面中，此組合物基本上是純化的(即，基本上不含限制其作用或產生非期望的副作用的物質)。在具體 的實施方式中，受試者是動物，優選哺乳動物比如非靈長類(例如，牛、馬、貓科動物、犬科動物、齧齒動物等)或靈長類(例如，猴比如，食蟹猴、人等)。在優選的實施方式中，受試者是人。
各種遞送系統是已知的並且可用於施用本發明的組合物，例如，封裝在脂質體中、微粒、微膠囊、能夠表達抗體或融合蛋白的重組細胞、受體介導的內吞作用(參見Wu等(1987)“Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System,”J.Biol.Chem.262：4429-4432)，構建作為逆轉錄病毒或其他載體一部分的核酸等。
施用根據本發明任一實施方式的三特異性結合分子的方法包括但不限於腸胃外施用(例如，皮內、肌內、腹膜內、靜脈內和皮下)、硬膜外和粘膜(例如，鼻內和口服途徑)。在具體的實施方式中，肌內、靜脈內或皮下施用本發明的分子。可通過任何方便的途徑施用組合物，例如，通過輸注或丸劑注射，通過經上皮或黏膜皮膚被覆(lining)(例如口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)吸收，並且可以與其他生物活性劑一起施用。施用可以是全身性的或局部的。另外，可也採用肺部施用，例如，通過使用吸入器或噴霧器，和具有氣霧化試劑的製劑。參見美國專利號6,019,968、5,985，320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；和PCT公開號WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，其每一篇通過引用以其整體併入本文。
在一些實施方式中，根據本發明任一實施方式的三特異性結合分子可包裝在密封容器比如指示這樣的分子的量的安瓿或袋中。在一個實施方式中，三特異性結合分子被供應作為密封容器中的乾燥滅菌 凍幹粉末或無水濃縮物並且可，例如，用水或鹽水重構至適當的濃度用於施用至受試者。優選地，三特異性結合分子被供應作為密封容器中的乾燥無菌凍幹粉末，單位劑量為至少5μg，更優選地至少10μg、至少15μg、至少25μg、至少50μg、至少100μg或至少200μg。
凍幹的三特異性結合分子應在它們的原始容器中在2和8℃之間儲存並且分子應在重構之後的12小時內，優選地6小時內、5小時內、3小時內或1小時內施用。在可選的實施方式中，三特異性結合分子以液體形式供應在指示分子、融合蛋白或綴合分子的量和濃度的密封容器中。優選地，液體形式的三特異性結合分子被供應在密封容器中，其中分子存在的濃度為至少1μg/ml，更優選地至少2.5μg/ml、至少5μg/ml、至少10μg/ml、至少50μg/ml或至少100μg/ml。
如本文所使用，在一個實施方式中，“有效量”的藥學組合物是足夠實現有益的或期望的結果的量，包括但不限於臨床結果比如減輕由於疾病造成的症狀、減輕感染的症狀(例如，病毒量、發燒、疼痛，膿毒症等)或癌症的症狀(例如，癌細胞的增殖、腫瘤存在、腫瘤轉移等)，從而提高遭受疾病的那些的生活品質、減少治療疾病需要的其他藥物的劑量、加強另一藥物的作用--比如經靶向和/或內化、延遲疾病的進展和/或延長個體的生存。
有效量可在一次或多次施用中施用。有效量的藥物、化合物或藥學組合物是這樣的量：此量足夠直接或間接減少病毒存在的增殖(或作用)和減輕和/或延遲病毒疾病的發展。在一些實施方式中，有效量的藥物、化合物或藥學組合物可能或不能實現結合另一藥物、化合物或藥學組合物。因此，“有效量”可在施用一種或多種化療劑的背景下考慮，並且如果結合一種或多種其他試劑，期望的結果可以或得以實現， 則單個試劑可視為以有效量給予。儘管個體需要不同，測定每種組分的有效量的最佳範圍仍在現有技術的範圍內。對於抗體施用，典型的劑量包括在0.1-至100mg/kg/體重之間的一個或多個單位劑量。
有效治療、預防或改善與病症相關的一個或多個症狀的根據本發明任一實施方式的三特異性結合分子的量可通過標準臨床技術來測定。製劑中採用的精確劑量也取決於施用的途徑和病況的嚴重性，並且應根據從業者的判斷和每個患者的情況決定。有效的劑量可從源自體外或動物模型測試系統的劑量回應曲線外推。對於本發明的三特異性結合分子，施用至患者的劑量按受試者的體重計，通常至少約0.01μg/kg/天、至少約0.05μg/kg/天、至少約0.1μg/kg/天、至少約0.2μg/kg/天、至少約0.5μg/kg/天、至少約1μg/kg/天、至少約2μg/kg/天、至少約5μg/kg/天、至少約10μg/kg/天、至少約20μg/kg/天、至少約50μg/kg/天、至少約0.1mg/kg/天或更多。
優選地，施用至患者的劑量按受試者的體重計，在約0.01μg/kg/天和約0.1mg/kg/天之間，更優選地，約0.01μg/kg/天和約50μg/kg/天之間，更優選地，約0.01μg/kg/天和約50μg/kg/天之間，更優選地，約0.01μg/kg/天和約10μg/kg/天之間，更優選地，約0.01μg/kg/天和約1μg/kg/天之間，更優選地，約0.01μg/kg/天和約0.5μg/kg/天之間，和更優選地，約0.01μg/kg/天和約0.1μg/kg/天之間。施用根據本發明任一實施方式的三特異性結合分子的劑量和頻率可通過修飾比如例如脂化增強三特異性結合分子的吸收和組織滲透而降低或改變。
在另一實施方式中，患者施用的治療方案包括一個或多個劑量的這樣的預防或治療有效量的三特異性結合分子，其中治療方案在 2天、3天、4天、5天、6天或7天內施用。在某些實施方式中，治療方案包括間歇地施用預防或治療有效量的三特異性結合分子的劑量(例如，在給定周的第1天、第2天、第3天和第4天施用劑量並且在相同周的第5天、第6天和第7天不施用預防或治療有效量的三特異性結合分子的劑量)。典型地，有1、2、3、4、5或更多個治療療程。每個療程可以是相同的方案或不同的方案。
在另一實施方式中，施用的劑量在四分之一、二分之一或三分之二或四分之三的方案(一個或多個)內(例如，在4個治療療程的第一、第二、或協力廠商案內)內逐漸上升直到實現每日預防或治療有效量的三特異性結合分子。
在一個實施方式中，可計算施用至患者的根據本發明任一實施方式的三特異性結合分子的劑量用作單一試劑療法。在另一實施方式中，根據本發明任一實施方式的三特異性結合分子結合其他治療性組合物使用，並且施用至患者的劑量比這樣的三特異性結合分子用作單一試劑療法時更低。
在具體的實施方式中，可期望局部施用根據本發明任一實施方式的藥學組合物至需要治療的區域；這可通過，但不限於例如如下方式實現：局部輸注、通過注射、或通過植入體，此植入體是多孔的、非多孔的、或膠狀材料，包括膜，比如矽橡膠膜(sialastic)或纖維。優選地，當施用根據本發明任一實施方式的分子時，必須注意使用不吸收此分子的材料。
在另一實施方式中，組合物可在小泡，尤其是脂質體中遞送(參見Langer(1990)“New Methods Of Drug Delivery,”Science 249：1527-1533)；Treat等，在Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer(傳染病和癌症療法中的脂質體)中，Lopez-Berestein和Fidler(eds.),Liss,New York,353-365頁(1989)；Lopez-Berestein，同上，317-327頁；一般見上)。
在又另一實施方式中，組合物可在控釋或緩釋系統中遞送。本領域技術人員已知的任何技術可用於產生包括根據本發明任一實施方式的一個或多個分子的緩釋製劑。參見美國專利號4,526,938；PCT公開WO 91/05548、PCT公開WO 96/20698；Ning等(1996)“Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,”Radiotherapy & Oncology 39：179-189；Song等(1995)“Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions,”PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50：372-397；Cleek等(1997)“Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,”Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24：853-854；和Lam等(1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,”Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24：759-760，其各通過引用以其整體併入本文。在一個實施方式中，泵可用於控釋系統中(參見Langer，同上；Sefton,(1987)“Implantable Pumps,”CRC Crit.Rev.Biomed.Eng.14：201-240；Buchwald等(1980)“Long-Term,Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis,”Surgery 88：507-516；和Saudek等(1989)“A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery,”N.Engl.J.Med.321：574-579)。在另一實施方式中，聚合物材料可用於實現抗體的控釋(參見Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),CRC Pres.,Boca Raton,Florida(1974)；ControlledDrug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen and Ball(eds.),Wiley New York(1984)；Levy等(1985)“Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate,”Science 228：190-192；During 等(1989)“Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant：In Vivo Characterization,”Ann.Neurol.25：351-356；Howard等(1989)“Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits,”J.Neurosurg.7(1)：105-112)；美國專利號5,679,377、美國專利號5,916,597、美國專利號5,912,015、美國專利號5,989,463、美國專利號5,128,326；PCT公開號WO 99/15154；和PCT公開號WO 99/20253)。在緩釋製劑中使用的聚合物的例子包括但不限於聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物(poly(ethylene-co-vinyl acetate))、聚(甲基丙烯酸)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚酐，聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯基醇)、聚丙烯醯胺，聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、聚交酯-乙交酯共聚物(PLGA)和聚原酸酯(polyorthoeste)。在又另一實施方式中，控釋系統可放置在治療性靶(例如，肺)附近，因此僅僅需要一部分全身性劑量(參見Goodson，在Medical Applications of Controlled Release中，同上，vol.2,pp.115-138(1984))。在另一實施方式中，根據Dunn等使用用作控釋移植物的聚合組合物(見美國 5,945,155)。具體的方法基於來自聚合物系統的生物活性材料的原位-控釋的療效。植入可一般發生在患者需要治療性治療的身體內的任何地方。在另一實施方式中，使用非聚合物持續遞送系統，由此受試者身體中的非聚合物植入物被用作藥物遞送系統。當植入身體時，植入物的有機溶劑將從組合物消散，分散或滲漏到周圍組織流體中，並且非聚合材料逐漸凝聚或沉澱形成固體、多微孔基質(參見美國5,888,533)。
Langer的綜述(1990,“New Methods Of Drug Delivery,”Science 249：1527-1533)討論了控釋系統。本領域技術人員已知的任何技術可用於產生包括根據本發明任一實施方式的一種或多種治療劑的緩釋製劑。參見美國專利號4,526,938；國際公開號WO 91/05548和WO 96/20698；Ning等(1996)““Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,”Radiotherapy & Oncology 39：179-189；Song等(1995)“Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions,”PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50：372-397；Cleek等(1997)“Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,”Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24：853-854；和Lam等(1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,”Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24：759-760，其每一篇通過引用以其整體併入本文。
在其中根據本發明任一實施方式的組合物是編碼根據本發明任一實施方式的三特異性結合分子的核酸的情況下的具體實施方式中，通過將其構建為適當的核酸表達載體的一部分並且施用其從而其 變成是細胞內的，例如，通過使用逆轉錄病毒載體(參見美國專利號4,980,286)，或通過直接注射，或通過使用微粒轟擊(例如，基因槍；生物彈道技術(Biolistic)，Dupont)，或用脂質或細胞-表面受體或轉染試劑塗覆，或通過將其連接至已知進入核的同源框樣肽施用(參見Joliot等(1991)“Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88：1864-1868)等，核酸可被體內施用以促進其編碼的三特異性結合分子的表達。可選地，可以將核酸引入細胞內並通過同源重組整合到宿主細胞DNA中，以進行表達。
用治療或預防性有效量的根據本發明任一實施方式的三特異性結合分子治療受試者可包括單一治療或，優選地，可包括一系列治療。在優選的實施例中，受試者用根據本發明任一實施方式的分子每週治療一次，持續約1至10周，優選地2至8周，更優選地約3至7周，甚至更優選地持續約4、5或6周。在其他實施方式中，每天一次、每天兩次或每天三次施用根據本發明任一實施方式的藥學組合物。在其他實施方式中，每週一次、每週兩次、每兩週一次、每月一次、每六週一次、每兩個月一次、每年兩次或每年一次施用藥學組合物。也認識到用於治療的有效劑量的分子可在具體的治療療程內增加或降低。
現已經大體上描述了本發明的實施方式，通過參考下述實施例其更容易理解。這樣的實施例通過示例的方式提供，並且不旨在限制本發明，除非另外指出。
實施例1
示例性抗CD3、抗CD8、抗B7-H3三特異性結合分子的產生和特性
為了開發展示對CD8+ T細胞更大特異性和更有效的重定向殺傷的治療性分子，構建具有能夠協同結合CD3、CD8和疾病相關的抗原的三特異性結合分子。產生的三特異性結合分子另外具備Fc結構域，以增強三特異性結合分子體內的半衰期。三特異性結合分子的通式結構顯示在圖4A-4D中。構建了對疾病相關的抗原B7-H3特異性的示例性三特異性結合分子。三特異性結合分子稱為B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb1，以表示三特異性結合分子中結合結構域的相關位置。B7-H3結合結構域佔據位元點A位置，CD3結合結構域佔據位元點B位置和CD8結合結構域佔據位元點C位置(圖4A)。B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子由四條不同的多肽鏈組成(表5)。
Figure 104117564-A0305-02-0162-100
B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：59)：
Figure 104117564-A0305-02-0162-101
Figure 104117564-A0305-02-0163-102
在第一多肽鏈中，VL(B7-H3 mAb 1)具有氨基酸序列SEQ ID NO：41，VH(CD3 mAb 2)具有氨基酸序列SEQ ID NO：27，E-螺旋具有氨基酸序列SEQ ID NO：3和(CH2-CH3)具有SEQ ID NO：7的“攜帶杵的”氨基酸序列的氨基酸序列。
B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：60)：
Figure 104117564-A0305-02-0163-103
在第二多肽鏈中，VL(CD3 mAb 2)具有氨基酸序列SEQ ID NO：26，VH(B7-H3 mAb 1)具有氨基酸序列SEQ ID NO：42，和K-螺旋具有氨基酸序列SEQ ID NO：4。
B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：61)：
Figure 104117564-A0305-02-0164-104
在第三多肽鏈中，採用的CD8 mAb 1重鏈可變結構域的氨基酸序列具有SEQ ID NO：30的氨基酸序列、鉸鏈結構域、CH1結構域和“攜帶臼的”CH2-CH3結構域，其具有H435R取代，以去除蛋白A結合位點(SEQ ID NO：8)。
B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：62)：
Figure 104117564-A0305-02-0165-105
在第四多肽鏈中，採用CD8 mAb 1輕鏈可變結構域的氨基酸序列具有SEQ ID NO：29的氨基酸序列和κ輕鏈固定結構域。
將表達的B7H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子載入到MSA樹脂上，用10mM NaPO4(pH6)；10mM NaPO4、1M NaCl(pH6)和10mM NaPO4(pH6)沖洗。用50mM甘氨酸(pH3)從樹脂洗脫多肽，並且用1M Tris(pH8)中和。發現表達是1.7mg/L；三特異性結合分子製劑是0.6mg/ml，具有的終產量為0.42mg。
比較B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的特性與具有Fc結構域的B7-H3 X CD3 DART和B7-H3 X CD3 DART的特性。如圖5A-5B中顯示，B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子相比具有Fc結構域的B7-H3 X CD3 DART和B7-H3 X CD3 DART顯示類似的靶細胞結合(A498細胞(圖5A)；JIMT-1(圖5B))。但是，如圖5C-5D中顯示，B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子相比CD4+ T細胞顯示對CD8+ T細胞的大大提高的結合。
為了顯示本發明的B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子介導重定向殺傷靶細胞的能力，在存在T細 胞和JIMT-1或A498靶細胞的情況下溫育這樣的分子。JIMT-1細胞是曲妥珠單抗抗性癌系(參見Tanner,M.等(2004)“Characterization Of A Novel Cell Line Established From A Patient With Herceptin-Resistant Breast Cancer,”Mol.Cancer Ther.3(12)：1585-1592)。A498細胞系是腎細胞癌細胞系(Gogh,J.(1978)“Cultivation,Characterization,And Identification Of Human Tumor Cells With Emphasis On Kidney,Testis,And Bladder Tumors,”Natl.Cancer Inst.Monogr.49：5-9)。如圖6A-6C中顯示，觀察到了對靶細胞的重定向殺傷。出人意料地，這些殺傷實質上比針對具有Fc結構域的相應的B7-H3 X CD3 DART和B7-H3 X CD3 DART觀察到的殺傷更有效。觀察的重定向殺傷總結在表6中。
Figure 104117564-A0305-02-0166-106
Figure 104117564-A0305-02-0167-107
圖7A-7D顯示了B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子在用JIMT-1細胞溫育之後介導T細胞啟動的能力。圖8A-8D顯示了B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子在用A498細胞溫育之後介導T細胞啟動的能力。在兩種情況下，這樣的啟動出人意料地優於用具有Fc結構域的可比較的B7-H3 X CD3 DARTTM和B7-H3 X CD3 DARTTM觀察的啟動。表7總結了EC50結果。
Figure 104117564-A0305-02-0167-108
表達的B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子使用CD8+效應細胞相比CD4+效應細胞展示大得多的(13倍)溶細胞活性。相比DARTTM，使用‘全’T細胞作為效應子，B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子也展示大大增加的(85倍)總體效力。
實施例2
CD8結合結構域對重定向的細胞毒性的作用
為了評估CD8特異性的作用，利用不同CD8抗體可變結構域序列構建針對疾病相關的抗原B7-H3特異性的第二個三特異性結合分子。B7-H3可變結構域特異性和CD3可變結構域特異性與用於構建B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的那些相同。三特異性結合分子稱為B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2並且由四條不同的多肽鏈組成(表8)。
Figure 104117564-A0305-02-0168-110
B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：63)：
Figure 104117564-A0305-02-0169-111
B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：64)：
Figure 104117564-A0305-02-0169-112
B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：65)：
Figure 104117564-A0305-02-0170-113
B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子的第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：66)：
Figure 104117564-A0305-02-0170-114
為了比較B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1(結構和序列如上述)或B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子結合T細胞的能力，用Ficoll純化健康的供體的人PBMC，用PBS沖洗兩次，並且再懸浮在包含10%人AB血清的FACS緩衝液 中，並且在室溫下溫育20分鐘，使細胞旋降(spin down)並且將4 x 106細胞/mL細胞再懸浮在FACS緩衝液中。50μl連續滴定的B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1或B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子或DARTTM(具有Fc結構域的B7-H3 X CD3或B7-H3 X CD3)被添加至96孔深板的孔中。然後將包含0.01%氮化鈉的FACS緩衝液中50μL(4 x 106細胞/mL)的充分混合的細胞添加至相應的孔並且使用移液管充分混合。在暗處2-8℃下溫育板約45分鐘。溫育結束時，通過添加300μL的FACS緩衝液至每個孔沖洗細胞兩次，在1,200rpm下使板離心5分鐘，並丟棄上清液。在包含0.01%氮化鈉的FACS緩衝液中，將細胞小球再懸浮在1：500稀釋的PE綴合山羊抗人Fcγ、CD5-APC和CD4-PerCP5.5的100μL混合物中，並且在暗處2-8℃下溫育約45分鐘。溫育結束時，用FACS緩衝液沖洗細胞，再懸浮，並且用BD Caliber流式細胞儀進行分析。將細胞門控(gated)至CD5+ CD4+(圖9A)或CD5+ CD4-(圖9B)。相比具備或缺少CD8特異性的結合分子，在CD5+ CD4-群體上觀察差別染色。
比較B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的細胞毒性與B7-H3 mAb1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子的細胞毒性。採用螢光素酶試驗和LDH試驗。兩個試驗的結果一致。兩個三特異性結合分子在存在啟動CD8+ T細胞或全T細胞群的情況下造成等同的重定向的細胞毒性。相比B7H3 X CD3 DART，具有CD8 mAb 1結合結構域的三特異性結合分子在存在CD8+細胞群或全T細胞的情況下展示更大的重定向的細胞毒性(圖10A-10C)。
相比B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子，對於B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子也觀察到CD8+對CD4+效應細胞的EC50的增加(60倍)。對於B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子，當全T細胞用作效應細胞時，觀察導致大於100倍的EC50下降的增加的效力。
實施例3
結構域位置對重定向的細胞毒性的作用
為了評估三特異性結合分子中給定結合結構域(CD3、CD8和疾病相關抗原)的位置(位點A、位點B和位點C)的作用，構建了數個另外的三特異性結合分子。表9顯示了具有各種結合結構域(CD3、CD8和疾病相關的抗原)的三特異性結合分子和位置(位點A、位點B和位點C)。
Figure 104117564-A0305-02-0172-115
上面描述了B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的結構和序列。對於另外兩個三特異性結合分子(CD3 mAb 2/CD8 mAb 1/B7-H3 mAb 1和B7-H3 mAb 1/CD8 mAb 1/CD3 mAb 2)，B7-H3可變結構域特異性，CD3可變結構域特異性和 CD8可變結構域特異性與用於構建B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的那些相同。CD3 mAb 2/CD8 mAb 1/B7-H3 mAb 1三特異性結合分子由四條不同的多肽鏈組成(表10)。
Figure 104117564-A0305-02-0173-116
CD3 mAb 2/CD8 mAb 1/B7-H3 mAb 1三特異性結合分子的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：67)：
Figure 104117564-A0305-02-0173-117
Figure 104117564-A0305-02-0174-118
CD3 mAb 2/CD8 mAb 1/B7-H3 mAb 1三特異性結合分子的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：68)：
Figure 104117564-A0305-02-0174-119
CD3 mAb 2/CD8 mAb 1/B7-H3 mAb 1三特異性結合分子的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：69)：
Figure 104117564-A0305-02-0174-120
Figure 104117564-A0305-02-0175-121
CD3 mAb 2/CD8 mAb 1/B7-H3 mAb 1三特異性結合分子的第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：70)：
Figure 104117564-A0305-02-0175-122
B7-H3 mAb 1/CD8 mAb 1/CD3 mAb 2三特異性結合分子由四條不同的多肽鏈組成(表11)。
Figure 104117564-A0305-02-0175-123
B7-H3 mAb 1/CD8 mAb 1/CD3 mAb 2三特異性結合分子的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：71)：
Figure 104117564-A0305-02-0176-124
B7-H3 mAb 1/CD8 mAb 1/CD3 mAb 2三特異性結合分子的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：72)：
Figure 104117564-A0305-02-0176-125
B7-H3 mAb 1/CD8 mAb 1/CD3 mAb 2三特異性結合分子的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：73)：
Figure 104117564-A0305-02-0177-127
B7-H3 mAb 1/CD8 mAb 1/CD3 mAb 2三特異性結合分子的第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：74)：
Figure 104117564-A0305-02-0177-126
此研究的結果顯示在圖11A-11C、圖12A-12C、圖13A-13E和表26中。圖11A-11C和圖12A-12C獨立地顯示了將CD3結合結構域放置在三特異性結合分子的位點C降低了分子的細胞毒 性。圖13A-13E顯示了觀察到降低的細胞毒性，無論是採用CD4+、CD8+還是全T細胞。
如圖14A-14B中所顯示，在位點C佈置CD3結合結構域，大大降低了與CD5+CD4+細胞(圖14A)和CD5+ CD4-細胞(圖14B)二者的結合。但是，注意，無論CD3結合結構域的佈置如何，所有的三特異性結合分子均能夠介導重定向的細胞毒性。
實施例4
示例性抗CD3，抗CD8，抗5T4三特異性結合分子的產生和特性
構建了對疾病相關的抗原5T4特異性的另外的示例性三特異性結合分子。5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子由四條不同的多肽鏈組成(表12)。
Figure 104117564-A0305-02-0178-128
5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：75)：
Figure 104117564-A0305-02-0179-129
5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：76)：
Figure 104117564-A0305-02-0179-130
Figure 104117564-A0305-02-0180-131
5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：77)：E
Figure 104117564-A0305-02-0180-132
5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：78)：
Figure 104117564-A0305-02-0180-133
5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子由四條不同的多肽鏈組成(表13)。
Figure 104117564-A0305-02-0181-135
5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：79)：
Figure 104117564-A0305-02-0181-134
Figure 104117564-A0305-02-0182-136
5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：80)：
Figure 104117564-A0305-02-0182-137
5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：81)：
Figure 104117564-A0305-02-0182-138
Figure 104117564-A0305-02-0183-139
5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子的第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：82)：
Figure 104117564-A0305-02-0183-140
如上述表達和純化5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1和5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子。比較這兩個三特異性結合分子結合CD5+/CD4+門控和CD5+/CD4-門控人PBMC的能力與具有Fc結構域的5T4 X CD3 DART的那些的能力。如圖15A-15B中顯示，相比CD4+T細胞(圖15A)，5T4/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1和5T4/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子顯示對CD8+ T細胞的大大增加的結合(圖15B)。
為了顯示5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1和5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子介導重定向殺傷靶細胞的能力，這樣的分子在存在T細胞和JIMT-1靶細胞的情況下被溫育。如圖16A-16C中所顯示，觀察到了靶細胞的重定向殺傷。如上述對於B7-H3三特異性結合分子觀察到的，相比對於包含Fc結構域的相應5T4 X CD3 DART觀察到的，殺傷實質上更有效。同樣地，如對於B7-H3三特異性結合分子觀察到的，使用不同的CD8可變結構域對 5T4三特異性結合分子重定向CD8+ T細胞至靶細胞的能力沒有作用。也發現5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子非常有活性，並且使用CD8+對CD4+效應細胞顯示更大的CTL活性(23倍更低的EC50)。相比5T4 X CD3 DARTTM，使用全T細胞效應子，5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子為22倍更有效，並且5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子是25倍更有效。
實施例5
示例性抗CD3、抗CD8、抗ROR1三特異性結合分子的特性
構建了對疾病相關的抗原ROR1具有特異性的另外示例性三特異性結合分子。ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子由四條不同的多肽鏈組成(表14)。
Figure 104117564-A0305-02-0184-141
ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：83)：
Figure 104117564-A0305-02-0185-142
ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：84)：
Figure 104117564-A0305-02-0185-143
ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：85)：
Figure 104117564-A0305-02-0186-144
ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：86)：
Figure 104117564-A0305-02-0186-145
ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子由四條不同的多肽鏈組成(表15)。
Figure 104117564-A0305-02-0186-146
Figure 104117564-A0305-02-0187-147
ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：87)
Figure 104117564-A0305-02-0187-148
ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：88)：
Figure 104117564-A0305-02-0188-149
ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：89)：
Figure 104117564-A0305-02-0188-150
ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子的第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：90)：
Figure 104117564-A0305-02-0189-151
比較ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1和ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子的特性與包含Fc結構域的ROR1 X CD3 DARTTM的特性。使用來自結合ROR-1抗原的抗ROR1單克隆抗體ROR1 mAb 1的Fv序列構建DARTTM和ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1和ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子。
兩個ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1和ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子和DART在CTL試驗中都針對JIMT1-luc和A549靶細胞是有活性的。但是，ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1和ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子用CD8+ T細胞和全T細胞效應子展示明顯增加的活性。
使用螢光素酶試驗和LDH試驗測量ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1和ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特異性結合分子介導重定向殺傷靶細胞的能力。在兩種情況下，觀察到了重定向殺傷。圖17A-17C顯示對靶細胞的重定向殺傷，如使用螢光素酶試驗測量的。結果總結在表16中。
表16
Figure 104117564-A0305-02-0190-152
Figure 104117564-A0305-02-0191-153
實施例6
示例性抗CD3、抗CD8、抗Env三特異性結合分子的特性
構建對疾病相關的抗原HIV(gp140抗原)具有特異性的另外示例性三特異性結合分子。HIV mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子由四條不同的多肽鏈組成(表17)。
Figure 104117564-A0305-02-0191-154
HIV mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：91)：
Figure 104117564-A0305-02-0191-155
Figure 104117564-A0305-02-0192-156
HIV mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子多肽的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：92)：
Figure 104117564-A0305-02-0192-157
HIV mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：93)：
Figure 104117564-A0305-02-0192-158
Figure 104117564-A0305-02-0193-159
HIV mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第四多肽鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO：94)：
Figure 104117564-A0305-02-0193-160
HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子由四條不同的多肽鏈組成(表18)。
Figure 104117564-A0305-02-0193-161
Figure 104117564-A0305-02-0194-162
HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第一多肽鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO：95)：
Figure 104117564-A0305-02-0194-165
HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：96)：
Figure 104117564-A0305-02-0194-164
Figure 104117564-A0305-02-0195-166
HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：97)：
Figure 104117564-A0305-02-0195-167
HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：98)：
Figure 104117564-A0305-02-0195-168
Figure 104117564-A0305-02-0196-169
製備具有夠結合人免疫缺陷病毒(HIV)的gp140抗原的結合結構域的三特異性結合分子(即，HIV mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子和HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子)。
作為初始步驟，評估HIV mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1和HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的能力。0.2M碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液(pH 9.4)中2μg/ml的JR-FL菌株gp140蛋白質被塗布在固體載體上，然後用三特異性結合分子溫育(開始濃度為5μg/ml，隨後1：2進行連續稀釋)。試驗結束時，用包含3%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)阻斷結合。使用其已經綴合辣根過氧化物酶(HRP)的抗人IgG，通過ELISA(pico(ThermoScientific-Pierce)檢測結合。試驗也與固定的人CD3(2μg/ml)一起使用，以便評估分子結合CD3的能力。發現兩個三特異性結合分子能夠結合可溶的、固定的gp140蛋白質(圖18A)和結合人CD3(圖18B)。進行夾心ELISA，以證明三特異性結合分子能夠配位結合gp140和CD3二者。為了此，0.2M碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液(pH 9.4)中的2μg/ml的JR-FL菌株gp140蛋白質被塗布在固體載體上，然後用三特異性結合分子溫育(開始濃度為5μg/ml，隨後1：2進行連續稀釋)。然後添加用生物素標記的人CD3(0.5μg/ml)。使用鏈黴抗生物素-HRP綴合物，通過ELISA(pico(ThermoScientific-Pierce)檢測結合。圖18C顯示三特異性結合分子，其能夠配位結合gp140和CD3二者。
發現三特異性結合分子能夠結合表達HIV env蛋白質的細胞的表面。為了顯示本發明的此方面，在多西環素誘導下表達HIV env的HEK293/D375細胞用三特異性結合分子溫育。使用生物素化的抗人Fc抗體和鏈黴抗生物素-APC進行結合的檢測。如圖19A-19C中顯示，發現與對照三特異性結合分子相反，兩個三特異性結合分子都能夠結合HEK293/D375細胞(圖19C)。
為了顯示這樣的三特異性結合分子介導重定向殺傷HIV-感染細胞的能力，評估這樣的分子結合PBMC的能力。用ACK裂解緩衝液裂解人血液，用PBS沖洗2X並且再懸浮在包含10%人AB血清的FACS緩衝液中，並且在室溫下溫育20分鐘。其後，通過離心使細胞成小球，並且再懸浮(4 x 106細胞/mL)在FACS緩衝液中。50μL的連續滴定的三特異性結合分子被添加至96孔深板的孔中。然後，將包含0.01%氮化鈉的FACS緩衝液中50μL的細胞(4 x 106細胞/mL)充分混合的細胞添加至相應的孔，並且使用移液管充分混合。在暗處2-8℃下溫育板約45分鐘。溫育結束時，通過添加300μL的FACS緩衝液至每個孔沖洗細胞兩次，板在1,200rpm下離心5分鐘，並丟棄上清液。將細胞小球再懸浮於在包含0.01%氮化鈉的FACS緩衝液中製備的山羊抗人IgG Fcγ-PE、CD5-APC和CD4-PerCP5.5的100μL混合物中，並且細胞在暗處2-8℃下溫育約45分鐘。溫育結束時，沖洗細胞，用FACS緩衝液再懸浮，並且用BD Caliber流式細胞儀進行分析。如圖20A-20B中所顯示，發現三特異性結合分子展示對CD5+/CD4-細胞群體的特異性結合。
在存在或沒有四環素的情況下，三特異性結合分子在37℃在存在表達HIV env的Jurkat 522 FY細胞和全T細胞的情況下溫育 24小時，並且使用LDH試驗測量細胞毒性。如圖21A-21F中顯示，三特異性結合分子介導大量的細胞毒性。
使用純化全T細胞和表達HIV env的Jurkat 522 FY細胞進行細胞毒性分析，並且測量活細胞的百分數。此分析的結果顯示在圖22A-22B中。
使用CD4+、CD8+或全T細胞，評估三特異性結合分子對表達HIV env的Jurkat 522 FY細胞的CTL活性。針對HIV mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子，此評估的結果顯示在圖23A-23C中。針對HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子，此評估的結果顯示在圖24A-24C中。表19總結了結果。
Figure 104117564-A0305-02-0198-170
Figure 104117564-A0305-02-0199-171
評估不同比或靶：效應細胞的影響。表20總結了獲得的結果。
Figure 104117564-A0305-02-0199-172
使用CD4+、CD8+或全T細胞，也評估三特異性結合分子對表達HIV env的HEK293細胞的CTL活性。此評估的結果總結在表21中。
表21(相對於來自靶細胞w/o三特異性結合分子的LDH MR的%細胞毒性)
Figure 104117564-A0305-02-0200-173
實施例7
CD3結合結構域親和性變體的比較
如上述，根據本發明任一實施方式的三特異性結合分子的CD3、CD8或疾病相關的抗原結合結構域可以被突變，以便分離具有更期望的結合特徵的結合結構域。使CD3 mAb 2結合結構域進行這樣的誘變，並且分離兩個親和性變體(CD3 mAb 2 Low和CD3 mAb 2 Fast)。
抗人CD3 mAb 2 Low的可變輕鏈結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO：99)：
Figure 104117564-A0305-02-0201-177
抗人CD3 mAb 2 Low的可變重鏈結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO：100)：
Figure 104117564-A0305-02-0201-176
抗人CD3 mAb 2 Fast的可變輕鏈結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO：101)：
Figure 104117564-A0305-02-0201-175
抗人CD3 mAb 2 Fast的可變重鏈結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO：102)：
Figure 104117564-A0305-02-0201-174
圖25A-25C顯示這些變體的結合的動力學。CD3 mAb 2 Low(圖25A)是低親和性變體，而CD3 mAb 2 Fast(圖25B)相對於野生型CD3 mAb 2具有更快的解離速率(圖25C)。
為了評估CD3結合特徵的作用，使用兩個CD3結合結構域突變體。利用野生型CD3 mAb 2可變結構域序列、對於CD3具有低親和性的CD3 mAb 2可變結構域序列和具有野生型親和性但是更快的解離速率的CD3 mAb 2可變結構域序列構建了三個對疾病相關的抗原5T4具有特異性的三特異性結合分子。5T4可變結構域特異性和CD8可變結構域特異性在三個三特異性結合分子之間相同。第一個三特異性結合分子稱為5T4 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1，並且由四條不同的多肽鏈組成(表22)。
Figure 104117564-A0305-02-0202-178
5T4 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：103)：
Figure 104117564-A0305-02-0202-179
Figure 104117564-A0305-02-0203-180
5T4 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：104)：
Figure 104117564-A0305-02-0203-181
5T4 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：105)：
Figure 104117564-A0305-02-0203-182
Figure 104117564-A0305-02-0204-183
5T4 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：106)：
Figure 104117564-A0305-02-0204-184
第二個三特異性結合分子稱為5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Low/CD8 mAb 1，並且由四條不同的多肽鏈組成(表23)。
Figure 104117564-A0305-02-0204-185
Figure 104117564-A0305-02-0205-186
5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Low/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：107)：
Figure 104117564-A0305-02-0205-187
5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Low/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：108)：
Figure 104117564-A0305-02-0205-188
Figure 104117564-A0305-02-0206-189
5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Low/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：109)：
Figure 104117564-A0305-02-0206-190
5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Low/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：110)：
Figure 104117564-A0305-02-0206-191
Figure 104117564-A0305-02-0207-192
第三個三特異性結合分子稱為5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Fast/CD8 mAb 1，並且由四條不同的多肽鏈組成(表24)。
Figure 104117564-A0305-02-0207-194
5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Fast/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：111)：
Figure 104117564-A0305-02-0207-193
Figure 104117564-A0305-02-0208-195
5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Fast/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：112)：
Figure 104117564-A0305-02-0208-196
5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Fast/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：113)：
Figure 104117564-A0305-02-0208-197
Figure 104117564-A0305-02-0209-198
5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Fast/CD8 mAb 1三特異性結合分子的第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO：114)：
Figure 104117564-A0305-02-0209-199
如上述處理健康供體的人PBMC，並且用5T4 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子、5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Low/CD8 mAb 1三特異性結合分子和5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Fast/CD8 mAb 1三特異性結合分子溫育。5T4 X CD3 DARTTM(具有野生型、Low和Fast CD3特異性)用作對照。5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Low/CD8 mAb 1和5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Fast/CD8 mAb 1三特異性結合分子包含突變的CD3結合結構域，其展示對於CD3改變的親和性和結合動力學。
相比DARTTM對照，發現三特異性結合分子展示對CD5+ CD4+細胞更弱的結合(圖26A)，但是對CD5+ CD4-細胞更強的結合(圖26B)。
使用LDH試驗，圖27A-27C顯示CD3 mAb變體對5T4 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的細胞毒性的作用。使用螢光素酶試驗並且用使B7-H3結合結構域代替5T4 mAb 1結合結構域的三特異性結合分子，獲得類似的結果。結果顯示，CD3 mAb 2 Low三特異性結合分子展示最小的細胞毒性，但是CD3 mAb 2 Fast三特異性結合分子用CD8+ T細胞和全T細胞比用CD4+ T細胞展示更大程度的細胞毒性。
為了評估三特異性結合分子對細胞因數特徵的作用，在存在增加濃度的5T4 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子、5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Low/CD8 mAb 1三特異性結合分子和5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Fast/CD8 mAb 1三特異性結合分子的情況下溫育來自兩個供體的PBMC 24小時。測量六個細胞因數(IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-6，IL-4和IL-2)的水準。結果顯示在圖28A-28F(供體1)和圖29A-29F(供體2)中。結果令人吃驚地顯示，相比僅僅靶向CD3並且對CD8+ T細胞無選擇性的DARTTM，從PBMC釋放的細胞因數的急劇下降。
使用全T細胞作為效應子，5T4 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子展示與DARTTM類似的效力，1pM EC50相比DARTTM的1.3pM。DARTTM的活性對於CD4+和CD8+ T細胞可能已經最大。三特異性結合分子的確使活性朝著CD8+群體偏移並且遠離CD4+群體，就細胞因數釋放，尤其是IL-2和TNFα而言，這是有益的。
儘管5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Low/CD8 mAb 1三特異性結合分子能夠結合CD4+和CD8+ T細胞，但是相比非突變的CD3 mAb 2結合結構域，其重定向這些細胞的細胞溶解的能力或由這些細胞進行細胞溶解的能力大大降低。相比5T4 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子(EC50的7倍差異)，5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Fast/CD8 mAb 1三特異性結合分子另一方面保持CTL活性，尤其用CD8+ T細胞相比/相對於CD4+ T細胞(EC50的75倍差異)。5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Fast/CD8 mAb 1三特異性結合分子的EC50與5T4 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特異性結合分子的類似(2.8對1.3pM)，但是CD8+對CD4+ T細胞靶向的顯著不同實際上消除了用人PBMC培養中的5T4 X CD3 DARTTM觀察的細胞因數釋放。
實施例8
示例性三特異性結合分子的EC50資料總結
總之，構建了一系列的14種三特異性結合分子(表25)，每個具有兩個雙抗體型結合結構域(位點A和位點B)，和一個Fab型結合結構域(位點C)。
Figure 104117564-A0305-02-0211-200
Figure 104117564-A0305-02-0212-201
這樣的三特異性結合分子的EC50資料總結在表26中(靶細胞：JIMT1-luc；效應子：靶細胞比5：1)。在一些情況下(如表26中NR顯示)，EC50可能無法從資料計算，因為未實現最大殺傷。
Figure 104117564-A0305-02-0212-202
Figure 104117564-A0305-02-0213-203
Figure 104117564-A0305-02-0214-204
Figure 104117564-A0305-02-0215-205
Figure 104117564-A0305-02-0216-206
本說明書中提到的所有出版物和專利通過參考以如同每個出版物或專利申請具體和單獨說明通過引用以其整體併入相同的程度併入本文。儘管已經結合其具體的實施方式描述了本發明，但是應當理解，其能夠進一步修飾並且本申請旨在覆蓋本發明的任何變型、用途 或改編，此變型、用途或改編大體上遵循本發明原則並且包括這樣的與本公開的偏離，如同其在本發明所屬領域的已知或常規實施範圍內和如同其可應用於上文闡釋的本質特徵一樣。
VL‧‧‧結構域
VL1‧‧‧結構域
VL2‧‧‧結構域
VH‧‧‧結構域
VH1‧‧‧結構域
VH2‧‧‧結構域
CH1‧‧‧結構域
CH2‧‧‧結構域
CH3‧‧‧結構域
CL‧‧‧結構域

Claims (17)

  1. 一種能夠免疫特異性結合三個不同的表位的三特異性結合分子，包括：(I)共價複合在一起的四條不同的多肽鏈；(II)能夠免疫特異性結合第一抗原上存在的表位I的抗原結合結構域I、能夠免疫特異性結合第二抗原上存在的表位II的抗原結合結構域II、和能夠免疫特異性結合第三抗原上存在的表位III的抗原結合結構域III；和(III)Fc結構域，其中：(A)第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：(VLI結構域)-(接頭1)-(VHII結構域)-(接頭2)-(異源二聚體-促進結構域)-(接頭3)-(CH2-CH3結構域)；(B)第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：(VLII結構域)-(接頭1)-(VHI結構域)-(接頭2)-(異源二聚體-促進結構域)；(C)第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：(VHIII結構域)-(包含半胱氨酸的結構域)-(CH2-CH3結構域)；(D)第四多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括：(VLIII結構域)-(包含半胱氨酸的結構域)；(E)該VLI結構域是能夠結合表位I的免疫球蛋白的輕鏈可變結構域，該VHI結構域是能夠結合表位I的免疫球蛋白的重鏈可變結構域，該VLII結構域是能夠結合表位II的免疫球蛋白的輕鏈可變結構域，該VHII結構域是能夠結合表位II的免疫球蛋白的重鏈可變結構域，該VLIII結構域是能夠結合表位III的免疫球蛋白的輕鏈可變結構域，並且該VHIII結構域是能夠結合表位III的免疫球蛋白的重鏈可變結構域； (F)該VLI結構域和該VHI結構域締合形成該抗原結合結構域I，該VLII結構域和該VHII結構域締合形成該抗原結合結構域II，該VLIII結構域和該VHIII結構域締合形成該抗原結合結構域III，並且該第一多肽鏈的該CH2-CH3結構域和該第三多肽鏈的該CH2-CH3結構域締合形成該Fc結構域，該抗原結合結構域I和該抗原結合結構域II為雙抗體型結合結構域、且該抗原結合結構域III為非雙抗體型結合結構域；(G)該第一抗原、該第二抗原和該第三抗原是相同的抗原，或獨立地與該第一抗原、該第二抗原和該第三抗原中的另一抗原相同或不同；(H)該第一多肽鏈和該第二多肽鏈彼此共價結合；該第一多肽鏈和該第三多肽鏈彼此共價結合；和該第三多肽鏈和該第四多肽鏈彼此共價結合；和(I)該接頭1包括序列SEQ ID NO：1；該接頭2包括序列SEQ ID NO：2或131；該接頭3包括序列SEQ ID NO：5或GGG；該第一多肽鏈上的該異源二聚體-促進結構域是E-螺旋結構域，並且該第二多肽鏈上的該異源二聚體-促進結構域是K-螺旋結構域；或該第一多肽鏈上的該異源二聚體-促進結構域是K-螺旋結構域，並且該第二多肽鏈上的該異源二聚體-促進結構域是E-螺旋結構域，該E-螺旋結構域獨立地包括序列SEQ ID NO：3或115，和該K-螺旋結構域獨立地包括序列SEQ ID NO：4或116；和該包含半胱氨酸的結構域獨立地包括序列SEQ ID NO：2、5、10、11、12、127、128、129、130或133。
  2. 如請求項1所述的三特異性結合分子，其中該第三多肽鏈包含CH1結構域，並且該第四多肽鏈包含CL結構域。
  3. 如請求項2所述的三特異性結合分子，其中該CH1結構域包括序列SEQ ID NO：9；和該CL結構域包括序列SEQ ID NO：13或14。
  4. 如請求項1所述的三特異性結合分子，其中：第一多肽鏈的該CH2-CH3結構域是攜帶杵的CH2-CH3結構域，並且該第三多肽鏈的該CH2-CH3結構域是攜帶臼的CH2-CH3結構域；或者該第三多肽鏈的該CH2-CH3結構域是攜帶杵的CH2-CH3結構域，並且該第一多肽鏈的該CH2-CH3結構域是攜帶臼的CH2-CH3結構域。
  5. 如請求項4所述的三特異性結合分子，其中：該第一多肽鏈和該第三多肽鏈的該CH2-CH3結構域包括至少一個相對於SEQ ID NO：6的氨基酸取代，並且由它們締合形成的該Fc結構域展示改變的FcγR介導的效應子功能。
  6. 如請求項5所述的三特異性結合分子，其中該第一多肽鏈和該第三多肽鏈的該CH2-CH3結構域包括：(A)選自由F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L組成的組中的一個取代；(B)選自由以下組成的組中的兩個取代：(1)F243L和P396L；(2)F243L和R292P；和(3)R292P和V305I；(C)選自由以下組成的組中的三個取代：(1)F243L、R292P和Y300L；(2)F243L、R292P和V305I；(3)F243L、R292P和P396L；和 (4)R292P、V305I和P396L；(D)選自由以下組成的組中的四個取代：(1)F243L、R292P、Y300L和P396L；和(2)F243L、R292P、V305I和P396L；或(E)選自由以下組成的組中的五個取代：(1)F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L；和(2)L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L。
  7. 如請求項4所述的三特異性結合分子，其中：該攜帶杵的CH2-CH3結構域包括序列SEQ ID NO：7，和該攜帶臼的CH2-CH3結構域包括序列SEQ ID NO：8。
  8. 如請求項1所述的三特異性結合分子，其中：當該接頭2包括序列SEQ ID NO：131時，SEQ ID NO：115的該E-螺旋結構域或SEQ ID NO：116的該K螺旋結構域與該接頭2相鄰；當該接頭2包括序列SEQ ID NO：2時，SEQ ID NO：3的該E-螺旋結構域或SEQ ID NO：4的該K-螺旋結構域與該接頭2相鄰；或當該接頭2包括序列SEQ ID NO：2時，SEQ ID NO：115的該E-螺旋結構域或SEQ ID NO：116的該K-螺旋結構域與該接頭2相鄰。
  9. 如請求項1所述的三特異性結合分子，其中表位I、II或III中的一個是：CD2、CD3、CD16、CD19、CD20、CD22、CD32B、CD64、B細胞受體(BCR)、T細胞受體(TCR)或NKG2D受體的表位；或CD8的表位；或疾病相關的抗原的表位，其中： 該疾病相關的抗原是選自結腸癌抗原19.9；胃癌黏蛋白抗原4.2；結直腸癌抗原A33；ADAM-9；AFP癌胚抗原-甲胎蛋白；ALCAM；B7-H3；BAGE；β-聯蛋白；CA125；羧肽酶M；B1；CD5；CD19；CD20；CD22；CD23；CD25；CD27；CD28；CD30；CD33；CD36；CD40/CD154；CD45；CD56；CD46；CD52；CD79a/CD79b；CD103；CD317；CDK4；CEA癌胚抗原；CEACAM5和CEACAM6；CO-43(血型Leb)和CO-514(血型Lea)；CTLA-1和CTLA-4；細胞角蛋白8；DR5；E1系列(血型B)；EGF-R表皮生長因數受體；肝配蛋白受體(EphA2)；Erb(ErbB1；ErbB3；ErbB4)；肺腺癌抗原F3；抗原FC10.2；GAGE(GAGE-1；GAGE-2)；GD2/GD3/GD49/GM2/GM3；GICA 19-9；gp37(人白血病T細胞抗原)；gp75(黑素瘤抗原)；gp100；HER-2/neu；人B-淋巴瘤抗原-CD20；人乳脂肪球抗原；人乳頭瘤病毒-E6/人乳頭瘤病毒-E7；HMW-MAA(高分子量黑素瘤抗原)；I抗原(分化抗原)；在胃腺癌中發現的I(Ma)；整聯蛋白α-V-β-6整聯蛋白β6(ITGB6)；白介素-13受體α2(IL13Rα2)；JAM-3；KID3；KID31；KSA(17-1A)；人肺癌抗原L6和L20；LEA；LUCA-2；M1：22：25：8；M18、M39；MAGE(MAGE-1；MAGE-3)；MART；Myl、MUC-1；MUM-1；N-乙醯葡糖氨基轉移酶；NS-10；OFA-1和OFA-2；制瘤素M(制瘤素受體β)；p15；PSA(***特異性抗原)；PSMA；PEMA(多態上皮黏蛋白抗原)；PIPA；***酸性磷酸鹽；R24；ROR1；SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4；sTn；源自T細胞受體的肽；T5A7；組織抗原37；TAG-72；TL5(血型A)；TNF受體(TNF-α受體、TNF-ß受體或TNF-γ受體)；TRA-1-85(血型H)；轉鐵蛋白受體；TSTA腫瘤特異性移植抗原；VEGF-R；Ley；或5T4的癌症抗原；或者 該疾病相關的抗原是選自病毒、和/或人類免疫缺陷病毒(HIV)或者呼吸道合胞體病毒(RSV)、和/或HIV gp41，HIV gp120或者RSV糖蛋白F的在病原體的表面或感染病原體的細胞的表面上的病原體抗原。
  10. 如請求項9所述的三特異性結合分子，其中：(A)該表位I、該表位II和該表位III分別是CD3的表位、CD8的表位和該疾病相關的抗原的表位；(B)該表位I、該表位II和該表位III分別是CD3的表位、該疾病相關的抗原的表位和CD8的表位；(C)該表位I、該表位II和該表位III分別是CD8的表位、CD3的表位和該疾病相關的抗原的表位；(D)該表位I、該表位II和該表位III分別是CD8的表位、該疾病相關的抗原的表位和CD3的表位；(E)該表位I、該表位II和該表位III分別是該疾病相關的抗原的表位、CD3的表位和CD8的表位；或(F)該表位I、該表位II和該表位III分別是該疾病相關的抗原的表位、CD8的表位和CD3的表位。
  11. 如請求項10所述的三特異性結合分子，其中：該表位I、表位II或表位III中的一個是CD3的表位，並且能夠免疫特異性結合CD3的表位的抗原結合結構域：(a)包括SEQ ID NO：17的輕鏈可變結構域和SEQ ID NO：18的重鏈可變結構域，或包括包含含有SASSSVSYMN的CDRL1、含有DTSKLAS的CDRL2和含有QQWSSNPFTF的CDRL3的輕鏈可變結構域和包含含有RYTMH的CDRH1、含 有YINPSRGYTNYNQKFKD的CDRH2和含有YYDDHYCL的CDRH3的重鏈可變結構域；(b)包括SEQ ID NO：19的輕鏈可變結構域和SEQ ID NO：20的重鏈可變結構域，或包括包含含有SASSSVSYMN的CDRL1、含有DTSKLAS的CDRL2和含有QQWSSNPPT的CDRL3的輕鏈可變結構域和包含含有SYTMH的CDRH1、含有YINPRSGYTHYNQKLKD的CDRH2和含有SAYYDYDGFAY的CDRH3的重鏈可變結構域；(c)包括SEQ ID NO：21的輕鏈可變結構域和SEQ ID NO：22的重鏈可變結構域，或包括包含含有TLSSGNIENNYVH的CDRL1、含有DDDKRPD的CDRL2和含有HSYVSSFNV的CDRL3的輕鏈可變結構域和包含含有SSFPMA的CDRH1、含有TISTSGGRTYYRDSVKG的CDRH2和含有FRQYSGGFDY的CDRH3的重鏈可變結構域；(d)包括SEQ ID NO：23的輕鏈可變結構域和SEQ ID NO：25的重鏈可變結構域，或包括包含含有SASSSVSYMN的CDRL1、含有DSSKLAS的CDRL2和含有QQWSRNPPT的CDRL3的輕鏈可變結構域和包含含有RSTMH的CDRH1、含有YINPSSAYTNYNQKFKD的CDRH2和含有PQVHYDYNGFPY的CDRH3的重鏈可變結構域；(e)包括SEQ ID NO：24的輕鏈可變結構域和SEQ ID NO：25的重鏈可變結構域，或包括包含含有SASSSVSYMN的CDRL1、含有DSSKLAS的CDRL2和含有QQWSRNPPT的CDRL3的輕鏈可變結構域和包含含有RSTMH的CDRH1、含有YINPSSAYTNYNQKFKD的CDRH2和含有PQVHYDYNGFPY的CDRH3的重鏈可變結構域； (f)包括SEQ ID NO：26的輕鏈可變結構域和SEQ ID NO：27的重鏈可變結構域，或包括包含含有SSTGAVTTSNYAN的CDRL1、含有GTNKRAP的CDRL2和含有ALWYSNLWV的CDRL3的輕鏈可變結構域和包含含有TYAMN的CDRH1、含有IRSKYNNYATYYADSVKD的CDRH2和含有HGNFGNSYVSWFAY的CDRH3的重鏈可變結構域；(g)包括SEQ ID NO：26的輕鏈可變結構域和SEQ ID NO：28的重鏈可變結構域，或包括包含含有SSTGAVTTSNYAN的CDRL1、含有GTNKRAP的CDRL2和含有ALWYSNLWV的CDRL3的輕鏈可變結構域和包含含有TYAMN的CDRH1、含有IRSKYNNYATYYADSVKG的CDRH2和含有HGNFGNSYVSWFAY的CDRH3的重鏈可變結構域；或者(h)包括SEQ ID NO：101的輕鏈可變結構域和SEQ ID NO：102的重鏈可變結構域，或包括包含含有RSSTGAVTTSNYAN的CDRL1、含有GTNKRAP的CDRL2和含有ALWYSNLWV的CDRL3的輕鏈可變結構域和包含含有GFTFSTYAMN的CDRH1、含有RIRSKYNNYATYYADSVKG的CDRH2和含有HKNFGNSYVTWFAY的CDRH3的重鏈可變結構域。
  12. 如請求項10所述的三特異性結合分子，其中該表位I、表位II或表位III中的一個是CD8的表位，並且能夠免疫特異性結合CD8的表位的抗原結合結構域：(a)包括SEQ ID NO：29的輕鏈可變結構域和SEQ ID NO：30的重鏈可變結構域；或者(b)包括SEQ ID NO：31的輕鏈可變結構域和SEQ ID NO：32的重鏈可變結構域，或包括包含含有KGSQDINNYLA的CDRL1、含有NTDILHT的CDRL2和含 有YQYNNGYT的CDRL3的輕鏈可變結構域和包含含有DFGMN的CDRH1、含有LIYYDGSNKFYADSVKG的CDRH2和含有PHYDGYYHFFDS的CDRH3的重鏈可變結構域。
  13. 如請求項10所述的三特異性結合分子，其中表位I、表位II或表位III中的一個是B7-H3、A33、5T4或ROR1的表位，並且能夠免疫特異性結合B7-H3,A33,5T4或ROR1的該表位的抗原結合結構域：(a)包括SEQ ID NO：39的輕鏈可變結構域和SEQ ID NO：40的重鏈可變結構域，或包括包含含有KASQNVDTNVA的CDRL1、含有SASYRYS的CDRL2和含有QQYNNYPFT的CDRL3的輕鏈可變結構域和包含含有GFTFSSFGMH的CDRH1、含有YISSDSSAIYYADTVK的CDRH2和含有GRENIYYGSRLDY的CDRH3的重鏈可變結構域；(b)包括SEQ ID NO：41的輕鏈可變結構域和SEQ ID NO：42的重鏈可變結構域，或包括包含含有RASQDISNYLN的CDRL1、含有YTSRLHS的CDRL2和含有QQGNTLPPT的CDRL3的輕鏈可變結構域和包含含有SYWMQ的CDRH1、含有TIYPGDGDTRYTQKFK的CDRH2和含有RGIPRLWYFDV的CDRH3的重鏈可變結構域；(c)包括SEQ ID NO：43的輕鏈可變結構域和SEQ ID NO：44的重鏈可變結構域，或包括包含含有RASESIYSYLA的CDRL1、含有NTKTLPE的CDRL2和含有QHHYGTPPW的CDRL3的輕鏈可變結構域和包含含有SYGMS的CDRH1、含有VATINSGGSNTYYPDSLKG的CDRH2和含有HDGGAMDY的CDRH3的重鏈可變結構域； (d)包括SEQ ID NO：45的輕鏈可變結構域和SEQ ID NO：46的重鏈可變結構域，或包括包含含有SARSSISFMY的CDRL1、含有DTSNLAS的CDRL2和含有QQWSSYPLT的CDRL3的輕鏈可變結構域和包含含有GYTFSGSWMN的CDRH1、含有RIYPGDGETNYNGKFKD的CDRH2和含有IYGNNVYFDV的CDRH3的重鏈可變結構域；(e)包括SEQ ID NO：47的輕鏈可變結構域和SEQ ID NO：48的重鏈可變結構域，或包括包含含有RASQGISNYLA的CDRL1、含有RANRLQS的CDRL2和含有LQYDDFPWT的CDRL3的輕鏈可變結構域和包含含有GYTFTSFWMH的CDRH1、含有RIDPNRGGTEYNEKAKS的CDRH2和含有GNPYYPMDY的CDRH3的重鏈可變結構域；(f)包括SEQ ID NO：49的輕鏈可變結構域和SEQ ID NO：50的重鏈可變結構域，或包括包含含有RSSQSIVYSNGNTYLE的CDRL1、含有KVSNRFS的CDRL2和含有FQGSHVPFT的CDRL3的輕鏈可變結構域和包含含有GYTFTSYWIT的CDRH1、含有DIYPGSGRANYNEKFKS的CDRH2和含有YGPLFTTVVDPNSYAMDY的CDRH3的重鏈可變結構域；(g)包括SEQ ID NO：51的輕鏈可變結構域和SEQ ID NO：52的重鏈可變結構域，或包括包含含有TLSSGHKTDTID的CDRL1、含有LEGSGSY的CDRL2和含有GTDYPGNYL的CDRL3的輕鏈可變結構域和包含含有GFTFSDYYMS的CDRH1、含有TIYPSSGKTYYADSVKG的CDRH2和含有DSYADDAALFDI的CDRH3的重鏈可變結構域；(h)包括SEQ ID NO：53的輕鏈可變結構域和SEQ ID NO：54的重鏈可變結構域，或包括包含含有KASQNVDAAVA的CDRL1、含有SASNRYT的CDRL2和 含有QQYDIYPYT的CDRL3的輕鏈可變結構域和包含含有DYEMH的CDRH1、含有AIDPETGGTAYNQKFKG的CDRH2和含有YYDYDSFTY的CDRH3的重鏈可變結構域；(i)包括SEQ ID NO：55的輕鏈可變結構域和SEQ ID NO：56的重鏈可變結構域，或包括包含含有QASQSIDSNLA的CDRL1、含有RASNLAS的CDRL2和含有LGGVGNVSYRTS的CDRL3的輕鏈可變結構域和包含含有DYPIS的CDRH1、含有FINSGGSTWYASWVKG的CDRH2和含有GYSTYYGDFNI的CDRH3的重鏈可變結構域；或者(j)包括SEQ ID NO：57的輕鏈可變結構域和SEQ ID NO：58的重鏈可變結構域，或包括包含含有TLSSAHKTDTID的CDRL1、含有GSYTKRP的CDRL2和含有GADYIGGYV的CDRL3的輕鏈可變結構域和包含含有AYYMS的CDRH1、含有TIYPSSGKTYYATWVNG的CDRH2和含有DSYADDGALFNI的CDRH3的重鏈可變結構域。
  14. 如請求項10所述的三特異性結合分子，其中表位I、表位II或表位III中的一個是HIV gp41的、HIV gp120的或者RSV糖蛋白F的表位，並且能夠免疫特異性結合HIV gp41的、HIV gp120的或者RSV糖蛋白F的該表位的抗原結合結構域包括：輕鏈可變結構域SEQ ID NO：33和重鏈可變結構域SEQ ID NO：34，輕鏈可變結構域SEQ ID NO：35和重鏈可變結構域SEQ ID NO：36，或輕鏈可變結構域SEQ ID NO：37和重鏈可變結構域SEQ ID NO：38。
  15. 如請求項10所述的三特異性結合分子，其中表位I是HIV的表位、表位II是CD3的表位和表位III是CD8的表位，或者表位I是CD3的表位、表位II是HIV的表位和表位III是CD8的表位。
  16. 一種藥學組合物，其包括如請求項1-15中的任一項所述的三特異性結合分子，和藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
  17. 一種如請求項1-15中任一項所述的三特異性結合分子或者如請求項16所述的藥學組合物在製造用於治療癌症或病原體感染的藥物中的用途。
TW104117564A 2014-05-29 2015-05-29 三特異性結合分子及其使用方法 TWI718098B (zh)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462004571P 2014-05-29 2014-05-29
US62/004,571 2014-05-29
US201462008229P 2014-06-05 2014-06-05
US62/008,229 2014-06-05
US201562107824P 2015-01-26 2015-01-26
US62/107,824 2015-01-26

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201625695A TW201625695A (zh) 2016-07-16
TWI718098B true TWI718098B (zh) 2021-02-11

Family

ID=54699839

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW108132334A TWI747041B (zh) 2014-05-29 2015-05-29 三特異性結合分子及其使用方法
TW104117564A TWI718098B (zh) 2014-05-29 2015-05-29 三特異性結合分子及其使用方法
TW104117567A TWI707872B (zh) 2014-05-29 2015-05-29 特異性結合多種癌症抗原的三特異性結合分子和其使用方法
TW110138455A TW202208442A (zh) 2014-05-29 2015-05-29 能夠免疫特異性結合5t4或ror1的表位的結合分子、其藥物組合物、其用途及其核酸組合物
TW108131956A TWI742423B (zh) 2014-05-29 2015-05-29 特異性結合多種癌症抗原的三特異性結合分子和其使用方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW108132334A TWI747041B (zh) 2014-05-29 2015-05-29 三特異性結合分子及其使用方法

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW104117567A TWI707872B (zh) 2014-05-29 2015-05-29 特異性結合多種癌症抗原的三特異性結合分子和其使用方法
TW110138455A TW202208442A (zh) 2014-05-29 2015-05-29 能夠免疫特異性結合5t4或ror1的表位的結合分子、其藥物組合物、其用途及其核酸組合物
TW108131956A TWI742423B (zh) 2014-05-29 2015-05-29 特異性結合多種癌症抗原的三特異性結合分子和其使用方法

Country Status (25)

Country Link
US (5) US10633440B2 (zh)
EP (3) EP3152235B1 (zh)
JP (5) JP6685934B2 (zh)
KR (3) KR20220025917A (zh)
CN (4) CN113416252A (zh)
AP (1) AP2016009586A0 (zh)
AU (4) AU2015266880B2 (zh)
BR (2) BR112016027893A2 (zh)
CA (2) CA2950008C (zh)
CL (2) CL2016003040A1 (zh)
EA (1) EA035419B9 (zh)
ES (2) ES2856839T3 (zh)
IL (2) IL249269B (zh)
MA (1) MA40069A (zh)
MX (3) MX2016015398A (zh)
NZ (2) NZ726514A (zh)
PE (2) PE20170766A1 (zh)
PH (2) PH12016502369A1 (zh)
PL (2) PL3152235T3 (zh)
RU (2) RU2718692C2 (zh)
SG (4) SG10201913324PA (zh)
TN (1) TN2016000525A1 (zh)
TW (5) TWI747041B (zh)
WO (2) WO2015184207A1 (zh)
ZA (1) ZA201607995B (zh)

Families Citing this family (171)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9963510B2 (en) 2005-04-15 2018-05-08 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
KR102211837B1 (ko) 2013-01-14 2021-02-03 젠코어 인코포레이티드 신규한 이형이량체 단백질
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
EP3721902A1 (en) 2013-03-14 2020-10-14 The Scripps Research Institute Targeting agent antibody conjugates and uses thereof
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
CA3093606A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins for induction of t cells
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
PE20210107A1 (es) 2013-12-17 2021-01-19 Genentech Inc Anticuerpos anti-cd3 y metodos de uso
CA2939556A1 (en) * 2014-02-14 2015-08-20 Andrew S. Chi Improved methods for the treatment of vascularizing cancers
KR20230022270A (ko) 2014-03-28 2023-02-14 젠코어 인코포레이티드 Cd38 및 cd3에 결합하는 이중특이적 항체
ES2962694T3 (es) 2014-05-02 2024-03-20 Momenta Pharmaceuticals Inc Composiciones y procedimientos relacionados con construcciones de Fc manipuladas
KR20220025917A (ko) * 2014-05-29 2022-03-03 마크로제닉스, 인크. 삼중-특이적 결합 분자 및 그것의 사용 방법
NZ730348A (en) 2014-09-26 2024-03-22 Macrogenics Inc Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding cd19 and cd3, and uses thereof
WO2016054101A1 (en) 2014-09-29 2016-04-07 Duke University Bispecific molecules comprising an hiv-1 envelope targeting arm
MX2017006250A (es) 2014-11-14 2017-11-17 Hoffmann La Roche Moleculas de union a antigeno que comprenden un trimero de ligando de la familia de tnf.
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
JP2017536830A (ja) 2014-11-26 2017-12-14 ゼンコー・インコーポレイテッドＸｅｎｃｏｒ、 Ｉｎｃ． Ｃｄ３及びｃｄ３８に結合するヘテロ二量体抗体
EP3223845B1 (en) 2014-11-26 2021-05-19 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cd20
WO2016105450A2 (en) 2014-12-22 2016-06-30 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
EP3245231B1 (en) 2015-01-16 2020-08-12 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for ror1
RU2017129236A (ru) * 2015-01-26 2019-03-07 Макродженикс, Инк. Мультивалентные молекулы, содержащие dr5-связывающие домены
WO2016141387A1 (en) 2015-03-05 2016-09-09 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
EP3277305B1 (en) 2015-03-31 2021-07-21 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a trimeric tnf family ligand
WO2016187594A1 (en) 2015-05-21 2016-11-24 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecific binding proteins and methods of use
TWI773646B (zh) 2015-06-08 2022-08-11 美商宏觀基因股份有限公司 結合lag-3的分子和其使用方法
WO2016204966A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
EP3112381A1 (en) * 2015-07-01 2017-01-04 FONDAZIONE IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori Bispecific antibodies for use in cancer immunotherapy
WO2017011413A1 (en) * 2015-07-10 2017-01-19 Duke University Bispecific molecules comprising an hiv-1 envelope targeting arm
WO2017011414A1 (en) * 2015-07-10 2017-01-19 Duke University Bispecific molecules comprising an hiv-1 envelope targeting arm
GEP20227419B (en) 2015-07-30 2022-10-10 Macrogenics Inc Pd-1-binding molecules and methods of use thereof
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
CA3001941A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Nbe-Therapeutics Ag Anti-ror1 antibodies
CN116333125A (zh) * 2015-10-30 2023-06-27 银河生物技术有限责任公司 结合死亡受体4和死亡受体5的抗体
CN108699136B (zh) 2015-12-07 2022-03-18 Xencor股份有限公司 结合cd3和psma的异二聚抗体
WO2017106061A1 (en) * 2015-12-14 2017-06-22 Macrogenics, Inc. Bispecific molecules having immunoreactivity with pd-1 and ctla-4, and methods of use thereof
EP3395834A4 (en) * 2015-12-24 2019-10-23 XDCExplorer (Shanghai) Co., Ltd. ANTI-TPBG ANTIBODIES AND ITS PREPARATION METHOD, CONJUGATED AND USE THEREOF
BR112018014615A2 (pt) 2016-01-20 2018-12-11 The Scripps Research Institute composições de anticorpo para ror1 e métodos relacionados
EP3405493A1 (en) * 2016-01-22 2018-11-28 Janssen Biotech, Inc. Anti-ror1 antibodies, ror1 x cd3 bispecific antibodies, and methods of using the same
US20170233472A1 (en) 2016-02-17 2017-08-17 Macrogenics, Inc. ROR1-Binding Molecules, and Methods of Use Thereof
US20220153833A1 (en) * 2016-03-02 2022-05-19 Momenta Pharmaceuticals, Inc. METHODS RELATED TO ENGINEERED Fc CONSTRUCTS
BR112018071105A2 (pt) * 2016-04-15 2019-02-26 Macrogenics, Inc. conjugado de droga e anticorpo, molécula de ligação, composição farmacêutica e uso
EP3243836A1 (en) * 2016-05-11 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG C-terminally fused tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules
WO2017201488A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Harpoon Therapeutics, Inc. Single domain serum albumin binding protein
US10544221B2 (en) 2016-05-20 2020-01-28 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
KR102462084B1 (ko) 2016-05-23 2022-11-02 모멘타 파머슈티컬스 인코포레이티드 유전자 조작 Fc 작제물에 관한 조성물 및 방법
MX2018014950A (es) 2016-06-07 2019-04-25 Macrogenics Inc Terapia de combinacion.
WO2017218707A2 (en) 2016-06-14 2017-12-21 Xencor, Inc. Bispecific checkpoint inhibitor antibodies
WO2018005706A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
EP3478718A4 (en) * 2016-07-01 2020-07-29 Paracrine Therapeutics AB METHOD AND COMPOSITIONS FOR INHIBITING PDGF-CC
EP3484516A4 (en) * 2016-07-14 2020-03-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center MULTIPLE CONSTRUCTIONS OF BI-SPECIFIC LINK AREAS HAVING A DIFFERENT EPITOPE LINK TO TREAT CANCER
WO2018045110A1 (en) 2016-08-30 2018-03-08 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
WO2018053328A1 (en) * 2016-09-16 2018-03-22 Duke University Bispecific molecules comprising an hiv-1 envelope targeting arm
US10501543B2 (en) 2016-10-14 2019-12-10 Xencor, Inc. IL15/IL15Rα heterodimeric Fc-fusion proteins
JP7136468B2 (ja) * 2016-11-08 2022-09-13 ユニバーシティ オブ マイアミ 抗セクレトグラニンｉｉｉ（ｓｃｇ３）抗体およびその使用
US11466094B2 (en) 2016-11-15 2022-10-11 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-CD20/anti-CD3 bispecific antibodies
WO2018098354A1 (en) 2016-11-23 2018-05-31 Harpoon Therapeutics, Inc. Prostate specific membrane antigen binding protein
EP3544629A4 (en) 2016-11-23 2020-06-17 Harpoon Therapeutics, Inc. TRISPECIFIC PROTEINS CIBLANG PSMA AND METHODS OF USE
US11242402B2 (en) * 2016-12-23 2022-02-08 Macrogenics, Inc. ADAM9-binding molecules, and methods of use thereof
CN108264561B (zh) * 2016-12-30 2021-09-10 惠和生物技术(上海)有限公司 一种结合cd19、cd3和t细胞负共刺激分子的三功能分子及其应用
FR3061716B1 (fr) * 2017-01-06 2019-05-17 Elsalys Biotech Nouveaux composes ciblant le cd160 humain
JP7146771B2 (ja) 2017-01-06 2022-10-04 モメンタ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 操作されたＦｃコンストラクトに関する組成物及び方法
AU2018219887A1 (en) 2017-02-08 2019-08-22 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
MX2019009541A (es) * 2017-02-10 2019-12-16 Dragonfly Therapeutics Inc Proteinas que se unen a psma, nkg2d y cd16.
CA3235295A1 (en) 2017-02-20 2018-08-23 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding her2, nkg2d and cd16
SG11201907753TA (en) 2017-02-24 2019-09-27 Macrogenics Inc Bispecific binding molecules that are capable of binding cd137 and tumor antigens, and uses thereof
CN111148760A (zh) * 2017-02-27 2020-05-12 卡拉斯医疗有限公司 抗体构建体和治疗癌症的方法
KR20200130514A (ko) * 2017-02-27 2020-11-18 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. Caix, ano1, 메소텔린, trop2, cea, 또는 클라우딘-18.2를 표적화하는 다중특이적 결합 단백질
US11535668B2 (en) 2017-02-28 2022-12-27 Harpoon Therapeutics, Inc. Inducible monovalent antigen binding protein
US10730954B2 (en) 2017-05-12 2020-08-04 Harpoon Therapeutics, Inc. MSLN targeting trispecific proteins and methods of use
CN113896792A (zh) 2017-05-12 2022-01-07 哈普恩治疗公司 间皮素结合蛋白质
CN111278455A (zh) * 2017-05-23 2020-06-12 蜻蜓疗法股份有限公司 结合nkg2d、cd16和肿瘤相关抗原的蛋白质
CA3064743A1 (en) * 2017-05-23 2018-11-29 Dragonfly Therapeutics, Inc. A protein binding nkg2d, cd16 and ror1 or ror2
KR20200010429A (ko) * 2017-05-23 2020-01-30 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. Nkg2d, cd16 및 종양-연관 항원에 결합하는 단백질
AR112257A1 (es) 2017-06-21 2019-10-09 Gilead Sciences Inc Anticuerpos multiespecíficos dirigidos al vih-1 gp120 y cd3 humana, composiciones que los comprende, ácido nucleico, vector y célula huésped relacionados, método para producirlos, método para detectar células que expresan gp120 y cd3, kit de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo que se une a gp120 y método para producirlos
CN110891650A (zh) * 2017-06-25 2020-03-17 西雅图免疫公司 制导和导航控制蛋白及其制造和使用方法
AU2018291497A1 (en) 2017-06-30 2020-01-16 Xencor, Inc. Targeted heterodimeric Fc fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra and antigen binding domains
GB201710838D0 (en) 2017-07-05 2017-08-16 Ucl Business Plc Bispecific antibodies
GB201710836D0 (en) 2017-07-05 2017-08-16 Ucl Business Plc ROR1 Car T-Cells
GB201710835D0 (en) 2017-07-05 2017-08-16 Ucl Business Plc ROR1 Antibodies
WO2019016381A1 (en) * 2017-07-20 2019-01-24 Nbe-Therapeutics Ag MULTISPECIFIC ANTIBODY PRODUCT BINDING TO DIFFERENT ROR1 EPITOPES
SG11202000846WA (en) 2017-08-07 2020-02-27 Nbe Therapeutics Ag Anthracycline-based antibody drug conjugates having high in vivo tolerability
BR112020003050A2 (pt) * 2017-08-16 2020-09-01 Dragonfly Therapeutics, Inc. proteínas de ligação a nkg2d, cd16, e egfr, hla-e, ccr4 ou pd-l1
MX2020003856A (es) 2017-10-13 2020-08-13 Harpoon Therapeutics Inc Proteinas de union a antigenos de maduracion de celulas b.
MX2020003915A (es) * 2017-10-13 2020-10-08 Harpoon Therapeutics Inc Proteinas trispecificas y metodos de uso.
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
US11312770B2 (en) 2017-11-08 2022-04-26 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-PD-1 sequences
AU2018370853A1 (en) * 2017-11-21 2020-05-21 Novartis Ag Trispecific binding molecules against tumor-associated antigens and uses thereof
BR112020011810A2 (pt) 2017-12-12 2020-11-17 Macrogenics, Inc. molécula de ligação cd16 x antígeno de doença, composição farmacêutica, uso da composição farmacêutica, e método para o tratamento de uma doença
CN109912714B (zh) * 2017-12-12 2021-02-19 深圳宾德生物技术有限公司 抗cd317单克隆抗体6h2h5及其应用
KR20200100098A (ko) 2017-12-19 2020-08-25 젠코어 인코포레이티드 조작된 il-2 fc 융합 단백질
CN109957026A (zh) * 2017-12-22 2019-07-02 成都恩沐生物科技有限公司 共价多特异性抗体
AU2019218959A1 (en) * 2018-02-08 2020-09-03 Genentech, Inc. Bispecific antigen-binding molecules and methods of use
PE20220278A1 (es) 2018-02-08 2022-02-25 Dragonfly Therapeutics Inc Dominios variables de anticuerpos que se dirigen al receptor nkg2d
CN110129369B (zh) * 2018-02-09 2023-10-13 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心 一种嵌合抗原受体基因工程载体、免疫细胞及其应用
SG11202007572VA (en) 2018-02-15 2020-09-29 Macrogenics Inc Variant cd3-binding domains and their use in combination therapies for the treatment of disease
SG11202007945UA (en) * 2018-02-20 2020-09-29 Dragonfly Therapeutics Inc Multi-specific binding proteins that bind cd33, nkg2d, and cd16, and methods of use
CN110305211A (zh) 2018-03-20 2019-10-08 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 Gipr抗体及其与glp-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用
AU2019243665B2 (en) 2018-03-30 2023-06-01 Merus N.V. Multivalent antibody
US10982006B2 (en) 2018-04-04 2021-04-20 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
US10654944B2 (en) * 2018-04-10 2020-05-19 Y-Biologics Inc. Cell engaging binding molecules
CN110357960A (zh) * 2018-04-10 2019-10-22 广州爱思迈生物医药科技有限公司 抗体及抗体改造方法
MX2020011027A (es) * 2018-04-17 2021-01-15 Invenra Inc Constructos de anticuerpos biespecíficos trivalentes.
EP3781598A1 (en) 2018-04-18 2021-02-24 Xencor, Inc. Tim-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and tim-3 antigen binding domains
AU2019256539A1 (en) 2018-04-18 2020-11-26 Xencor, Inc. PD-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra Fc-fusion proteins and PD-1 antigen binding domains and uses thereof
JP2021524451A (ja) * 2018-05-18 2021-09-13 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 最適化済みｇｐ４１結合分子及びその使用
EA202092839A1 (ru) 2018-05-24 2021-02-12 Янссен Байотек, Инк. Агенты, связывающиеся с psma, и виды их применения
AU2019297451A1 (en) 2018-07-03 2021-01-28 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
CN112789291A (zh) * 2018-08-08 2021-05-11 蜻蜓疗法股份有限公司 结合nkg2d、cd16和肿瘤相关抗原的蛋白质
EP3849610A4 (en) * 2018-09-14 2022-12-07 Kindred Biosciences, Inc. ANTI-IL4 RECEPTOR ANTIBODIES FOR VETERINARY USE
CA3114038A1 (en) 2018-09-25 2020-04-02 Harpoon Therapeutics, Inc. Dll3 binding proteins and methods of use
WO2020063673A1 (zh) 2018-09-30 2020-04-02 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗b7h3抗体-依喜替康类似物偶联物及其医药用途
EP3861016A2 (en) 2018-10-03 2021-08-11 Xencor, Inc. Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
EP3891181A4 (en) * 2018-12-04 2022-08-17 Novartis AG BINDING MOLECULES AGAINST CD3 AND USES THEREOF
KR102113302B1 (ko) * 2018-12-24 2020-05-20 원광대학교산학협력단 상보성결정부 기반 조류 인플루엔자 바이러스의 h5 아형에 특이적으로 결합하는 펩티드 및 이의 용도
CA3125345A1 (en) * 2019-01-04 2020-07-09 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
WO2020150282A1 (en) * 2019-01-18 2020-07-23 Askgene Pharma Inc. Pd-l1 specific monoclonal antibodies for disease treatment and diagnosis
MX2021009242A (es) * 2019-01-31 2021-10-26 Sanofi Biotechnology Anticuerpo anti-receptor de il-6 para tratar la artritis juvenil idiopatica.
CA3132185A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind enpp3 and cd3
JP2022529985A (ja) 2019-04-19 2022-06-27 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗ｐｓｍａ／ｃｄ３抗体で前立腺癌を治療する方法
JP7137696B2 (ja) 2019-05-14 2022-09-14 プロヴェンション・バイオ・インコーポレイテッド １型糖尿病を予防するための方法および組成物
CN112111012B (zh) * 2019-06-20 2023-07-04 成都恩沐生物科技有限公司 共价多特异性抗体
JP2023500869A (ja) * 2019-11-06 2023-01-11 アムジェン リサーチ （ミュニック） ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 増殖性疾患での使用のための多重標的化抗原結合分子
US11845799B2 (en) 2019-12-13 2023-12-19 Genentech, Inc. Anti-Ly6G6D antibodies and methods of use
MX2022007404A (es) * 2019-12-18 2022-09-19 Janssen Biotech Inc Materiales y metodos para direccionamiento biologico in vivo.
BR112022016541A2 (pt) * 2020-02-20 2022-11-16 Win Therapeutics Inc Moléculas de ligação bispecíficas gd2 e b7h2 e métodos de uso
EP4106806A1 (en) 2020-02-21 2022-12-28 Harpoon Therapeutics, Inc. Flt3 binding proteins and methods of use
AU2021238320A1 (en) * 2020-03-18 2022-09-22 Elanco Us Inc. Anti-IL4 receptor antibodies for veterinary use
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
WO2021231969A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind msln and cd3
EP4192872A1 (en) * 2020-08-05 2023-06-14 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding nkg2d, cd16 and egfr
KR102607909B1 (ko) 2020-08-19 2023-12-01 젠코어 인코포레이티드 항-cd28 조성물
US20230331844A1 (en) * 2020-10-12 2023-10-19 Greffex, Inc. Antibody constructs to target t cell responses to sars-cov protein expressing cells, their design and uses
UY39467A (es) 2020-10-13 2022-04-29 Janssen Biotech Inc Inmunidad mediada por células t de bioingeniería, materiales y otros métodos para modular el grupo de diferenciación iv y / o viii
KR20230104256A (ko) * 2020-11-06 2023-07-07 암젠 인크 증가된 선택성의 다중표적화 이중특이적 항원 결합 분자
TW202242121A (zh) 2021-01-11 2022-11-01 美商薩那生物科技公司 靶向cd8之病毒載體之用途
US20240059789A1 (en) 2021-01-28 2024-02-22 Janssen Biotech, Inc. Psma binding proteins and uses thereof
WO2022192403A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
JP2024509274A (ja) 2021-03-10 2024-02-29 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｇｐｃ３に結合するヘテロ二量体抗体
BR112023019458A2 (pt) * 2021-03-24 2023-12-05 Janssen Biotech Inc Proteínas que compreendem domínios de ligação ao antígeno de cd3 e usos dos mesmos
CN113488112A (zh) * 2021-06-10 2021-10-08 五邑大学 一种共价结合预测方法及装置
WO2023011273A1 (zh) * 2021-08-02 2023-02-09 盛禾(中国)生物制药有限公司 一种多特异性抗原结合蛋白及其应用
WO2023020315A1 (zh) * 2021-08-19 2023-02-23 南京吉盛澳玛生物医药有限公司 靶向pd-l1/pd-1的抗体及其应用
US20230310605A1 (en) 2021-10-28 2023-10-05 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing cells expressing ror1-binding protein
WO2023086772A1 (en) 2021-11-12 2023-05-19 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind to b7h3 and nkg2d
WO2023114949A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Sana Biotechnology, Inc. Methods and systems of particle production
WO2023133595A2 (en) 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2023150647A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Sana Biotechnology, Inc. Methods of repeat dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2023164510A1 (en) 2022-02-23 2023-08-31 Xencor, Inc. Anti-cd28 x anti-psma antibodies
WO2023164627A1 (en) 2022-02-24 2023-08-31 Xencor, Inc. Anti-cd28 x anti-msln antibodies
WO2023164640A1 (en) 2022-02-24 2023-08-31 Xencor, Inc. Anti-cd28 x anti-trop2 antibodies
WO2023193015A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Sana Biotechnology, Inc. Cytokine receptor agonist and viral vector combination therapies
TW202406571A (zh) 2022-04-13 2024-02-16 美商建南德克公司 莫蘇妥珠單抗之醫藥組成物及其使用方法
WO2023201309A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Xencor, Inc. Antibodies that bind pd-l1, pd-l2 and/or cd28
WO2024026377A1 (en) 2022-07-27 2024-02-01 Sana Biotechnology, Inc. Methods of transduction using a viral vector and inhibitors of antiviral restriction factors
WO2024027828A1 (en) * 2022-08-05 2024-02-08 Chimagen Biosciences, Ltd Multi-specific antibodies targeting a dimerizable tumor antigen and an immunostimulatory antigen
WO2024040195A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering
WO2024044655A1 (en) 2022-08-24 2024-02-29 Sana Biotechnology, Inc. Delivery of heterologous proteins
WO2024059174A1 (en) * 2022-09-14 2024-03-21 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for treating cancer
WO2024064838A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Sana Biotechnology, Inc. Lipid particles comprising variant paramyxovirus attachment glycoproteins and uses thereof
WO2024064952A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells overexpressing c-jun
WO2024064958A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells
WO2024077174A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5601819A (en) * 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US20100174053A1 (en) * 2005-04-15 2010-07-08 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US20100291112A1 (en) * 2007-07-10 2010-11-18 Christian Kellner Recombinant, Single-Chain, Trivalent Tri-Specific or Bi-Specific Antibody Derivatives
US20140099318A1 (en) * 2011-05-21 2014-04-10 Macrogenics, Inc. CD3-Binding Molecules Capable of Binding to Human and Non-Human CD3

Family Cites Families (197)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5985A (en) 1848-12-26 Pianoforte-action
US320A (en) 1837-07-31 John dainty
US3862925A (en) 1973-07-05 1975-01-28 American Home Prod Preparation of somatotropin release inhibiting factor and intermediates therefor
US3842067A (en) 1973-07-27 1974-10-15 American Home Prod Synthesis of(des-asn5)-srif and intermediates
JPS5726506B2 (zh) 1974-03-08 1982-06-04
US4105603A (en) 1977-03-28 1978-08-08 The Salk Institute For Biological Studies Peptides which effect release of hormones
DE3378250D1 (en) 1982-04-22 1988-11-24 Ici Plc Continuous release formulations
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5128326A (en) 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2 Inc Geänderte antikörper.
US4880078A (en) 1987-06-29 1989-11-14 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust muffler
DE68928427T2 (de) 1988-09-15 1998-06-04 Univ Columbia Antikörper mit modifiziertem Kohlenhydratgehalt und Verfahren zur Herstellung und Verwendung
CA2018248A1 (en) 1989-06-07 1990-12-07 Clyde W. Shearman Monoclonal antibodies against the human alpha/beta t-cell receptor, their production and use
WO1991003493A1 (en) 1989-08-29 1991-03-21 The University Of Southampton Bi-or trispecific (fab)3 or (fab)4 conjugates
WO1991005548A1 (en) 1989-10-10 1991-05-02 Pitman-Moore, Inc. Sustained release composition for macromolecular proteins
EP0550436A1 (en) 1989-11-06 1993-07-14 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Protein microspheres and methods of using them
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
AU666852B2 (en) 1991-05-01 1996-02-29 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine A method for treating infectious respiratory diseases
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
GB9112536D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
GB9115364D0 (en) 1991-07-16 1991-08-28 Wellcome Found Antibody
US5843749A (en) 1991-07-26 1998-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ehk and Ror tyrosine kinases
CA2078539C (en) 1991-09-18 2005-08-02 Kenya Shitara Process for producing humanized chimera antibody
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5912015A (en) 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9225453D0 (en) 1992-12-04 1993-01-27 Medical Res Council Binding proteins
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
US5885573A (en) 1993-06-01 1999-03-23 Arch Development Corporation Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
US6180377B1 (en) 1993-06-16 2001-01-30 Celltech Therapeutics Limited Humanized antibodies
UA40577C2 (uk) 1993-08-02 2001-08-15 Мерк Патент Гмбх Біспецифічна молекула, що використовується для лізису пухлинних клітин, спосіб її одержання, моноклональне антитіло (варіанти), фармацевтичний препарат, фармацевтичний набір (варіанти), спосіб видалення пухлинних клітин
WO1996020698A2 (en) 1995-01-05 1996-07-11 The Board Of Regents Acting For And On Behalf Of The University Of Michigan Surface-modified nanoparticles and method of making and using same
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
US6265150B1 (en) 1995-06-07 2001-07-24 Becton Dickinson & Company Phage antibodies
JP2000507912A (ja) 1995-08-31 2000-06-27 アルカームズ コントロールド セラピューティックス，インコーポレイテッド 作用剤の徐放性組成物
US5736152A (en) 1995-10-27 1998-04-07 Atrix Laboratories, Inc. Non-polymeric sustained release delivery system
US5942328A (en) 1996-02-29 1999-08-24 International Business Machines Corporation Low dielectric constant amorphous fluorinated carbon and method of preparation
WO1997032572A2 (en) 1996-03-04 1997-09-12 The Penn State Research Foundation Materials and methods for enhancing cellular internalization
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
EP0922111B1 (en) 1996-07-23 2004-12-01 Tanox Pharma B.V. Induction of t cell tolerance using a soluble molecule that can simultaneously block two costimulatory pathways
ES2221065T3 (es) 1996-08-16 2004-12-16 The President And Fellows Of Harvard College Proteinas de fusion de clase ii del mhc, solubles, monovalentes o polivalentes, y sus usos.
DK0826696T3 (da) 1996-09-03 2002-09-23 Gsf Forschungszentrum Umwelt Anvendelse af bi- og trispecifikke antistoffer til inducering af en tumorimmunitet
PT954282E (pt) 1997-01-16 2005-06-30 Massachusetts Inst Technology Preparacao de particulas para inalacao
EP1007569B1 (en) 1997-02-11 2009-04-08 Immunomedics, Inc. Stimulation of an immune response with antibodies labeled with the alpha-galactosyl epitope
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
DE19725586C2 (de) 1997-06-17 1999-06-24 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verfahren zur Herstellung von Zellpräparaten zur Immunisierung mittels heterologer intakter bispezifischer und/oder trispezifischer Antikörper
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
EP1054984A1 (en) 1998-02-19 2000-11-29 President And Fellows Of Harvard College Monovalent, multivalent, and multimeric mhc binding domain fusion proteins and conjugates, and uses therefor
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
AU747231B2 (en) 1998-06-24 2002-05-09 Alkermes, Inc. Large porous particles emitted from an inhaler
ES2212638T3 (es) 1998-09-25 2004-07-16 Lindhofer, Horst, Dr. Utilizacion de celulas tumorales en tiempo escalonado en combinacion con anticuerpos intactos para la inmunizacion.
WO2000018806A1 (de) 1998-09-25 2000-04-06 Horst Lindhofer Bispezifische und trispezifische antikörper, die spezifisch mit induzierbaren oberflächenantigenen als operationelle zielstrukturen reagieren
PL209786B1 (pl) 1999-01-15 2011-10-31 Genentech Inc Przeciwciało zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgG1, przeciwciało wiążące czynnik wzrostu śródbłonka naczyń oraz immunoadhezyna
US7232889B2 (en) 1999-03-08 2007-06-19 Genentech, Inc. PRO300 antibodies
ES2347762T3 (es) * 2000-04-28 2010-11-04 Mannkind Corporation Sincronizacion de epitopos en celulas que presentan antigenos.
CA2410551A1 (en) 2000-06-30 2002-01-10 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw (Vib) Heterodimeric fusion proteins
ES2290171T3 (es) 2000-08-14 2008-02-16 N.V. Organon Uso de anticuerpos contra complejos de peptidos mch especificos.
DE10043437A1 (de) 2000-09-04 2002-03-28 Horst Lindhofer Verwendung von trifunktionellen bispezifischen und trispezifischen Antikörpern zur Behandlung von malignem Aszites
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7931897B2 (en) 2001-02-07 2011-04-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Therapeutic agent for hematopoietic tumors
US20050118164A1 (en) 2001-03-09 2005-06-02 William Herman Targeted ligands
CN1294148C (zh) 2001-04-11 2007-01-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 环状单链三特异抗体
ITRM20010408A1 (it) 2001-07-10 2003-01-10 Univ Napoli Federico Ii Mini-anticorpo umano citotossico per cellule tumorali che esprimono il recettore erbb2.
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
DE60124912T2 (de) 2001-09-14 2007-06-14 Affimed Therapeutics Ag Multimerische, einzelkettige, Tandem-Fv-Antikörper
WO2003024191A2 (en) 2001-09-21 2003-03-27 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to cancer-associated antigen cytokeratin 8 and methods of use thereof
JP4347694B2 (ja) 2001-10-16 2009-10-21 レイベン バイオテクノロジーズ，インコーポレイティド 癌関連抗原ｃｄ４６に結合する抗体およびその使用方法
WO2003035835A2 (en) 2001-10-25 2003-05-01 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
GB0126378D0 (en) 2001-11-02 2002-01-02 Oxford Biomedica Ltd Antigen
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
WO2003100033A2 (en) 2002-03-13 2003-12-04 Biogen Idec Ma Inc. ANTI-αvβ6 ANTIBODIES
WO2003087340A2 (en) 2002-04-12 2003-10-23 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to integrin alpha-v-beta-6 and methods of use thereof
AU2003225294A1 (en) 2002-05-03 2003-11-17 Raven Biotechnologies, Inc. Alcam and alcam modulators
ATE525398T1 (de) 2002-05-10 2011-10-15 Medimmune Inc Epha2 monoklonale antikörper und deren anwendungsverfahren
DE60334453D1 (de) 2002-05-30 2010-11-18 Macrogenics Inc Cd16a bindungsproteine und verwendung zur behandlung von immunkrankheiten
CA2505633A1 (en) 2002-11-13 2004-05-27 Raven Biotechnologies, Inc. Antigen pipa and antibodies that bind thereto
US7960512B2 (en) 2003-01-09 2011-06-14 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
JP2006524039A (ja) 2003-01-09 2006-10-26 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 変異型Ｆｃ領域を含む抗体の同定および作製ならびにその利用法
EP1664082B1 (en) 2003-09-18 2014-03-05 MacroGenics West, Inc. Kid3 and anti-kid3 antibodies
AU2004293182B2 (en) 2003-11-28 2010-02-18 Amgen Research (Munich) Gmbh Compositions comprising polypeptides
US7235641B2 (en) 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
ES2364147T3 (es) 2004-01-16 2011-08-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Polipéptidos de fusión capaces de activar receptores.
CN100376599C (zh) 2004-04-01 2008-03-26 北京安波特基因工程技术有限公司 基因工程重组抗cea抗cd3抗cd28线性单链三特异抗体
EP1765870A2 (en) 2004-06-03 2007-03-28 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to fc gamma receptor i (cd64)
WO2005121179A2 (en) 2004-06-07 2005-12-22 Raven Biotechnologies, Inc. Transferrin receptor antibodies
US7829758B2 (en) 2004-08-18 2010-11-09 Vib Vzw Modulation of plant cell number
PE20060817A1 (es) 2004-09-10 2006-10-10 Wyeth Corp Anticuerpos anti-5t4 humanizados y conjugados anticuerpo anti-5t4/calicheamicina
US20080057054A1 (en) 2004-09-13 2008-03-06 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnol Modulation of Phagocytosis in Neurons
AU2005335714B2 (en) 2004-11-10 2012-07-26 Macrogenics, Inc. Engineering Fc antibody regions to confer effector function
BG65954B1 (bg) 2005-01-05 2010-07-30 Чавдар ВАСИЛЕВ Средство за селективно подтискане активността на патологични автореактивни в-клетки
CA2593786A1 (en) 2005-01-12 2006-07-20 Raven Biotechnologies, Inc. Kid31 and antibodies that bind thereto
CA2596115A1 (en) 2005-01-31 2006-08-10 Raven Biotechnologies, Inc. Luca2 and antibodies that bind thereto
US20060171952A1 (en) 2005-02-02 2006-08-03 Mather Jennie P JAM-3 and antibodies that bind thereto
CA2596273C (en) 2005-02-02 2017-11-14 Raven Biotechnologies, Inc. Adam-9 modulators
JP5328156B2 (ja) 2005-02-03 2013-10-30 マクロジェニックス ウエスト， インコーポレイテッド オンコスタチンｍレセプターに対する抗体
MX2007009403A (es) 2005-02-04 2007-10-02 Raven Biotechnologies Inc Anticuerpos que se unen a epha2 y metodos para usar los mismos.
AU2006232310B9 (en) 2005-04-06 2011-07-21 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Improved stably tethered structures of defined compositions with multiple functions or binding specificities
AU2006232920B2 (en) 2005-04-06 2011-09-29 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses
US9296816B2 (en) 2005-04-15 2016-03-29 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US9963510B2 (en) 2005-04-15 2018-05-08 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
WO2006133145A2 (en) * 2005-06-06 2006-12-14 Caprion Pharmaceuticals, Inc. Tat-007 and methods of assessing and treating cancer
CN102875681A (zh) 2005-07-08 2013-01-16 拜奥根Idec马萨诸塞公司 抗-αvβ6抗体及其用途
SI2573114T1 (sl) 2005-08-10 2016-08-31 Macrogenics, Inc. Identifikacija in inženiring protiteles z variantnimi fc regijami in postopki za njih uporabo
JP2012228248A (ja) * 2005-08-19 2012-11-22 Abbott Lab 二重可変ドメイン免疫グロブリン及びその使用
MY169746A (en) 2005-08-19 2019-05-14 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
CA2607056C (en) 2005-10-19 2015-11-24 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for generating bioactive assemblies of increased complexity and uses
CA2633486C (en) 2005-12-16 2015-02-03 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies
EP1820513A1 (en) * 2006-02-15 2007-08-22 Trion Pharma Gmbh Destruction of tumor cells expressing low to medium levels of tumor associated target antigens by trifunctional bispecific antibodies
BRPI0707824A2 (pt) * 2006-02-15 2011-05-10 Imclone Systems Inc proteÍna de ligaÇço a antÍgeno, e, mÉtodos de neutralizaÇço da ativaÇço de um receptor de tirosina quinase, de inibiÇço de angiogÊnese, de reduÇço de crescimento de tumor e de produÇço de uma proteÍna de ligaÇço a antÍgeno
CA2644903A1 (en) 2006-03-10 2007-09-20 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant heavy chains and methods of using same
EP1994055B1 (en) 2006-03-10 2014-07-02 Wyeth LLC Anti-5t4 antibodies and uses thereof
MX2008015524A (es) 2006-06-12 2009-01-13 Trubion Pharmaceuticals Inc Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora.
AT503889B1 (de) 2006-07-05 2011-12-15 Star Biotechnologische Forschungs Und Entwicklungsges M B H F Multivalente immunglobuline
AT503902B1 (de) 2006-07-05 2008-06-15 F Star Biotech Forsch & Entw Verfahren zur manipulation von immunglobulinen
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
AU2007299843B2 (en) 2006-09-18 2012-03-08 Xencor, Inc Optimized antibodies that target HM1.24
EP2094730A4 (en) 2006-12-07 2010-08-04 Mayo Foundation METHODS AND MATERIALS ASSOCIATED WITH ANTI-AMYLOID ANTIBODIES
US8652466B2 (en) 2006-12-08 2014-02-18 Macrogenics, Inc. Methods for the treatment of disease using immunoglobulins having Fc regions with altered affinities for FcγRactivating and FcγRinhibiting
CA2688275A1 (en) 2007-05-31 2008-12-04 Genmab A/S Stable igg4 antibodies
JP2010190572A (ja) 2007-06-01 2010-09-02 Sapporo Medical Univ ＩＬ１３Ｒａ２に対する抗体およびこれを含む診断・治療薬
CN107226864A (zh) 2007-06-21 2017-10-03 宏观基因有限公司 共价双抗体及其用途
AU2008293885A1 (en) * 2007-07-13 2009-03-05 The John Hopkins University B7-DC variants
JP2010535032A (ja) * 2007-07-31 2010-11-18 メディミューン，エルエルシー 多重特異性エピトープ結合性タンパク質およびその用途
EP2190469B1 (en) 2007-09-04 2015-02-25 Compugen Ltd. Polypeptides and polynucleotides, and uses thereof as a drug target for producing drugs and biologics
AU2008339576B2 (en) * 2007-12-21 2014-05-22 Medimmune Limited Binding members for interleukin-4 receptor alpha (IL-4Ralpha)
EP2113255A1 (en) 2008-05-02 2009-11-04 f-star Biotechnologische Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. Cytotoxic immunoglobulin
CA2735193A1 (en) 2008-08-26 2010-03-11 Macrogenics, Inc. T-cell receptor antibodies and methods of use thereof
WO2010028797A1 (en) 2008-09-10 2010-03-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Multivalent antibodies
WO2010028795A1 (en) 2008-09-10 2010-03-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Multivalent antibodies
WO2010028796A1 (en) 2008-09-10 2010-03-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Trispecific hexavalent antibodies
KR20110104032A (ko) 2008-12-19 2011-09-21 마크로제닉스, 인크. 공유결합형 디아바디 및 이의 용도
SG174378A1 (en) 2009-03-20 2011-10-28 Genentech Inc Bispecific anti-her antibodies
EP2241576A1 (en) 2009-04-17 2010-10-20 Trion Pharma Gmbh Use of trifunctional bispecific antibodies for the treatment of tumors associated with CD133+/EpCAM+ cancer stem cells
WO2010124188A1 (en) 2009-04-23 2010-10-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-human ror1 antibodies
JP5719354B2 (ja) 2009-05-27 2015-05-20 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 三重又は四重特異性抗体
KR102010827B1 (ko) 2009-06-26 2019-08-14 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체
US8277919B2 (en) 2009-07-23 2012-10-02 VMO Systems, Inc. Reflective coating for an optical disc
EP2478110B1 (en) 2009-09-16 2016-01-06 Immunomedics, Inc. Class i anti-cea antibodies and uses thereof
US20110070227A1 (en) 2009-09-18 2011-03-24 Anna-Marie Novotney-Barry Treatment of Autoimmune and Inflammatory Diseases
UY32914A (es) 2009-10-02 2011-04-29 Sanofi Aventis Anticuerpos que se usan específicamente al receptor epha2
CN102812043A (zh) 2009-11-19 2012-12-05 新加坡国立大学 用于制备t细胞受体样单克隆抗体的方法及其用途
GB201000467D0 (en) 2010-01-12 2010-02-24 Ucb Pharma Sa Antibodies
PL2361936T3 (pl) 2010-02-25 2016-10-31 Cząsteczka wiążąca antygen i jej zastosowania
US20110206672A1 (en) 2010-02-25 2011-08-25 Melvyn Little Antigen-Binding Molecule And Uses Thereof
JP5998060B2 (ja) 2010-03-04 2016-09-28 マクロジェニクス，インコーポレーテッド Ｂ７−ｈ３と反応性のある抗体、その免疫学的に活性なフラグメントおよびその使用
TWI586806B (zh) 2010-04-23 2017-06-11 建南德克公司 異多聚體蛋白質之製造
WO2011163401A2 (en) 2010-06-22 2011-12-29 Neogenix Oncology, Inc. Colon and pancreas cancer specific antigens and antibodies
EP2407487A1 (en) * 2010-07-14 2012-01-18 F-Star Biotechnologische Forschungs - und Entwicklungsges. M.B.H. Multispecific modular antibody
EP2596114A4 (en) 2010-07-14 2014-01-08 Amgen Inc IMMUNOGLOBULIN WITH DOMAIN INSERTION
MX339622B (es) * 2010-08-02 2016-06-02 Macrogenics Inc Diacuerpos covalentes y sus usos.
CA2818992C (en) 2010-12-01 2021-05-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric rabbit/human ror1 antibodies
GB201020995D0 (en) * 2010-12-10 2011-01-26 Bioinvent Int Ab Biological materials and uses thereof
US20120195900A1 (en) 2010-12-22 2012-08-02 Abbott Laboratories Tri-variable domain binding proteins and uses thereof
WO2013119903A1 (en) 2012-02-10 2013-08-15 Research Corporation Technologies, Inc. Fusion proteins comprising immunoglobulin constant domain-derived scaffolds
AU2012235817B2 (en) 2011-04-01 2016-03-10 Wyeth Llc Antibody-drug conjugates
ES2703780T3 (es) 2011-05-17 2019-03-12 Trion Res Gmbh Preparación de una vacuna que contiene anticuerpos trifuncionales con propiedades potenciadoras de la inmunogenicidad del antígeno
CA2836873C (en) 2011-05-21 2019-10-22 Macrogenics, Inc. Deimmunized serum-binding domains and their use for extending serum half-life
DK2714738T3 (en) * 2011-05-24 2019-01-28 Zyngenia Inc MULTIVALENT AND MONOVALENT MULTISPECIFIC COMPLEXES AND THEIR APPLICATIONS
WO2012162583A1 (en) 2011-05-26 2012-11-29 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Design and construction of novel multivalent antibodies
WO2012167067A1 (en) 2011-06-03 2012-12-06 Kraft Foods Global Brands Llc Snacks from cheese
WO2013003647A2 (en) 2011-06-28 2013-01-03 Sea Lane Biotechnologies, Llc Multispecific stacked variable domain binding proteins
US20140155581A1 (en) 2011-07-06 2014-06-05 Medimmune, Llc Methods For Making Multimeric Polypeptides
UA117901C2 (uk) * 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
BR112014001573B8 (pt) 2011-07-22 2022-11-08 Affimed Therapeutics Ag Molécula fv ao antígeno multivalente
JP2014533929A (ja) 2011-09-23 2014-12-18 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハー ５ｔ４およびｃｄ３に対する二重特異的結合性分子
JP2014533249A (ja) 2011-11-07 2014-12-11 メディミューン，エルエルシー 多重特異性を持つ多価結合タンパク質およびその使用
WO2013068874A1 (en) 2011-11-11 2013-05-16 Pfizer Inc. Antibody-drug conjugates
WO2013163427A1 (en) 2012-04-25 2013-10-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Antibodies to treat hiv-1 infection
MX2014014162A (es) 2012-05-24 2015-02-04 Hoffmann La Roche Anticuerpos multiespecificos.
AU2013285355A1 (en) * 2012-07-06 2015-01-29 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
US20150203591A1 (en) 2012-08-02 2015-07-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutivalent antigen-binding proteins
WO2014072888A1 (en) 2012-11-07 2014-05-15 Pfizer Inc. Anti-il-13 receptor alpha 2 antibodies and antibody-drug conjugates
EP2948475A2 (en) 2013-01-23 2015-12-02 AbbVie Inc. Methods and compositions for modulating an immune response
EP2840091A1 (en) * 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific diabodies that are capable of binding gpA33 and CD3 and uses thereof
EP2839842A1 (en) * 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding CD123 and CD3 and uses thereof
EP2930188A1 (en) 2014-04-13 2015-10-14 Affimed Therapeutics AG Trifunctional antigen-binding molecule
KR20220025917A (ko) 2014-05-29 2022-03-03 마크로제닉스, 인크. 삼중-특이적 결합 분자 및 그것의 사용 방법
RU2017129236A (ru) * 2015-01-26 2019-03-07 Макродженикс, Инк. Мультивалентные молекулы, содержащие dr5-связывающие домены
TWI773646B (zh) * 2015-06-08 2022-08-11 美商宏觀基因股份有限公司 結合lag-3的分子和其使用方法
GEP20227419B (en) * 2015-07-30 2022-10-10 Macrogenics Inc Pd-1-binding molecules and methods of use thereof
PE20181066A1 (es) * 2015-08-17 2018-07-04 Macrogenics Inc Diacuerpos monovalentes biespecificos que son capaces de unirse a b7-h3 y cd3, y usos de los mismos
SG11201907753TA (en) * 2017-02-24 2019-09-27 Macrogenics Inc Bispecific binding molecules that are capable of binding cd137 and tumor antigens, and uses thereof
BR112020011810A2 (pt) 2017-12-12 2020-11-17 Macrogenics, Inc. molécula de ligação cd16 x antígeno de doença, composição farmacêutica, uso da composição farmacêutica, e método para o tratamento de uma doença
SG11202007572VA (en) 2018-02-15 2020-09-29 Macrogenics Inc Variant cd3-binding domains and their use in combination therapies for the treatment of disease
JP2021524451A (ja) 2018-05-18 2021-09-13 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 最適化済みｇｐ４１結合分子及びその使用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5601819A (en) * 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US20100174053A1 (en) * 2005-04-15 2010-07-08 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US20100291112A1 (en) * 2007-07-10 2010-11-18 Christian Kellner Recombinant, Single-Chain, Trivalent Tri-Specific or Bi-Specific Antibody Derivatives
US20140099318A1 (en) * 2011-05-21 2014-04-10 Macrogenics, Inc. CD3-Binding Molecules Capable of Binding to Human and Non-Human CD3

Also Published As

Publication number Publication date
EP3152235B1 (en) 2021-08-25
CL2016003040A1 (es) 2018-05-11
TWI747041B (zh) 2021-11-21
PH12016502370A1 (en) 2017-02-20
AU2019204236A1 (en) 2019-07-04
AU2019204236B2 (en) 2021-07-22
PE20170765A1 (es) 2017-07-04
ES2856839T3 (es) 2021-09-28
US20200199223A1 (en) 2020-06-25
US11820818B2 (en) 2023-11-21
TWI742423B (zh) 2021-10-11
US20170204176A1 (en) 2017-07-20
US20240117036A1 (en) 2024-04-11
JP2017519744A (ja) 2017-07-20
JP6685934B2 (ja) 2020-04-22
RU2718692C2 (ru) 2020-04-13
JP2017519743A (ja) 2017-07-20
TW201945399A (zh) 2019-12-01
US20170198045A1 (en) 2017-07-13
TW201625696A (zh) 2016-07-16
EA035419B1 (ru) 2020-06-10
ZA201607995B (en) 2019-05-29
KR20170012347A (ko) 2017-02-02
EP3148580A4 (en) 2018-02-21
EA035419B9 (ru) 2020-08-07
JP2021073224A (ja) 2021-05-13
SG10201913324PA (en) 2020-03-30
KR102364383B1 (ko) 2022-02-17
AU2018260975A1 (en) 2018-11-29
CA2950572C (en) 2022-12-06
EP3148580A1 (en) 2017-04-05
PL3152235T3 (pl) 2022-01-17
TW201625695A (zh) 2016-07-16
TW202208442A (zh) 2022-03-01
US10633440B2 (en) 2020-04-28
ES2890079T3 (es) 2022-01-17
CN106573050A (zh) 2017-04-19
EP3954703A2 (en) 2022-02-16
US20200207850A1 (en) 2020-07-02
AU2015266797A1 (en) 2016-12-15
RU2016151721A3 (zh) 2018-12-26
NZ726520A (en) 2018-12-21
CA2950008C (en) 2023-09-26
US11697684B2 (en) 2023-07-11
CA2950572A1 (en) 2015-12-03
SG11201609917PA (en) 2016-12-29
EP3152235A1 (en) 2017-04-12
CA2950008A1 (en) 2015-12-03
CN106414497B (zh) 2021-07-27
EP3148580B1 (en) 2021-01-20
CN106573050B (zh) 2021-09-24
AU2018260975B2 (en) 2020-10-29
KR102355609B1 (ko) 2022-01-27
IL249269A0 (en) 2017-02-28
JP2020117520A (ja) 2020-08-06
US10647768B2 (en) 2020-05-12
EP3152235A4 (en) 2018-01-24
TW201946934A (zh) 2019-12-16
WO2015184203A1 (en) 2015-12-03
BR112016027912A2 (pt) 2018-02-20
EP3954703A3 (en) 2022-05-18
PL3148580T3 (pl) 2021-07-12
RU2016151721A (ru) 2018-07-03
CL2016003050A1 (es) 2017-07-07
BR112016027893A2 (pt) 2017-10-24
KR20220025917A (ko) 2022-03-03
AU2015266880B2 (en) 2019-03-21
RU2020111366A (ru) 2020-04-20
SG10201913680PA (en) 2020-03-30
PE20170766A1 (es) 2017-07-04
CN113549153A (zh) 2021-10-26
WO2015184207A1 (en) 2015-12-03
EA201692504A1 (ru) 2017-05-31
AU2015266797B2 (en) 2018-09-27
MX2016015398A (es) 2017-02-22
AU2015266797C1 (en) 2019-04-04
MX2016015479A (es) 2017-03-23
KR20170012351A (ko) 2017-02-02
IL249266A0 (en) 2017-02-28
IL249269B (en) 2021-01-31
AU2015266880A1 (en) 2016-12-15
JP2020072664A (ja) 2020-05-14
JP6647222B2 (ja) 2020-02-14
MA40069A (fr) 2021-04-14
MX2020014221A (es) 2021-03-09
SG11201609912TA (en) 2016-12-29
AP2016009586A0 (en) 2016-11-30
IL249266B (en) 2021-06-30
CN106414497A (zh) 2017-02-15
CN113416252A (zh) 2021-09-21
TN2016000525A1 (en) 2018-04-04
TWI707872B (zh) 2020-10-21
PH12016502369A1 (en) 2017-02-20
NZ726514A (en) 2019-01-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI718098B (zh) 三特異性結合分子及其使用方法
TWI788327B (zh) 能夠結合cd137和腫瘤抗原的雙特異性結合分子及其用途
JP7432363B2 (ja) Ｃｄ３結合抗体
TWI691509B (zh) Ｐｄ-１結合分子和其使用方法
JP6282717B2 (ja) 共有結合型ダイアボディ及びその使用
TWI773646B (zh) 結合lag-3的分子和其使用方法
JP5964300B2 (ja) 共有結合型ダイアボディおよびその使用
TWI706960B (zh) 能夠結合cd19和cd3的雙特異性雙抗體及其用途
JP2017137320A (ja) 脱免疫化血清結合ドメイン及び血清半減期を延長するためのその使用
JP2019517539A (ja) 併用療法
KR20180086250A (ko) Pd-1 및 ctla-4과의 면역반응성을 가진 이중특이적 분자, 및 이것의 사용 방법
TW201627322A (zh) 抗-ｄｒ５抗體和包括其ｄｒ５-結合結構域的分子
CN111787949A (zh) 变体cd3-结合结构域及其在用于治疗疾病的组合疗法中的用途
TWI814758B (zh) 雙特異性ｃｄ１６-結合分子及其在疾病治療中的用途
RU2805648C2 (ru) Биспецифические связывающие молекулы, способные связывать cd137 и опухолевые антигены, и варианты их применения