BG65954B1

BG65954B1 - Средство за селективно подтискане активността на патологични автореактивни в-клетки

Info

Publication number: BG65954B1
Application number: BG109003A
Authority: BG
Inventors: Чавдар ВАСИЛЕВ; Андрей ЧОРБАНОВ
Original assignee: Чавдар ВАСИЛЕВ; Андрей ЧОРБАНОВ
Priority date: 2005-01-05
Filing date: 2005-01-05
Publication date: 2010-07-30
Also published as: WO2006072152A2; BG109003A; WO2006072152A3; EP1844075A2

Abstract

Изобретението се отнася до средство за селективно подтискане активността на патологични автореактивни В-клетки при автореактивни заболявания. По своята същност представлява химерна молекула, състояща се от носител имуноглобулин G и два синтетични компонента, първият от които се свързва специфично към инхибиращия повърхностен рецептор СD22, а вторият - към имуноглобулиновите рецептори на В-клетките, разпознаващи избран автоантиген.

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до средство за селективно потискане активността на патологични автореактивни В клетки при автоимунни заболявания.

Предшестващо състояние на техниката

Известно е, че поради съчетание на недостатъчно изяснени генетични фактори и на въздействия от окръжаващата среда, при около 2 % от хората се развиват различни автоимунни заболявания. При тях имунната система започва да атакува собствените си органи и тъкани със специфични автоантитела или с автореактивни 'Tлимфоцити. В резултат на тази автоимунна атака се отключва възпалителен процес, който в повечето случаи води до унищожаване или до сериозно увреждане на прицелния орган или тъкан. В зависимост от броя на атакуваните органи, автоимунните заболявания се разделят на системни и органо-специфични. Съвременните противовъзпалителни и имуносупресивни средства само забавят развитието на тези болести, но не повлияват тяхната първопричина. Освен това тези лечебни препарати имат и вредни странични въздействия.

Логична мишена за терапевтична интервенция при автоимунни заболявания са патологичните автореактивни В клетки. Известно е, че при мишки линия (NZB х NZW)F1, които спонтанно развиват подобно на лупус заболяване, свързаните с него автоантитела се секретират от В-1 клетките. Продължителното и избирателно отстраняване на тези клетки от най-ранна възраст предотвратява развитието на гломерулонефрита и значително увеличава продължителността на живота при тези животни /1/. Този подход не е ефективен при пациенти с лупус и при мишки от линията MRL/Ipr, също развиващи спонтанно лупусоподобно заболяване, тъй като анти-ДНК специфичните В клетки при тях са от типа В-2.

Изследванията на Courts, S. М. et al., 1996 и Furie, R., et al., 2001 показват, че за избирателното инактивиране на патологични В клетки може да се предизвика едносигнална анергия по антигенспецифичен начин. За тази цел повърхностният имуноглобулинов рецептор на В клетките се ангажира със структура, която съдържа олиговалентни В клетъчни епитопи, имобилизирани върху неимуногенен носител. Такава структура не трябва да съдържа Т клетъчни епитопи. Пример за такъв В клетъчен толероген е LJP394, който in vivo инактивира В клетките, специфични за нативната ДНК при BXSB мишки, развиващи спонтанна, наподобяваща лупус болест. Прилагането на този имуномодулатор удължава преживяемостга им и води до потискане на бъбречното увреждане. LJP394 вече е показал обещаващи резултати и при втората фаза от клиничните изпитания /2,3/.

BG 108155 описва средство за селективно потискане на патологични автореактивни В клетки, което представлява химерна антитялова молекула, свързваща се едновременно както към имуноглобулиновите рецептори на В-лимфоцитите със специфичност към ДНК, така и към потискащите рецептори от типа FcraMaRIIB. Действието на това средство се ограничава до В-клетките, експресиращи имуноглобулинови рецептори от IgG изотип. В нито един от цитираните документи, обаче, не се споменава за рецептора CD22, използван като прицелна молекула за имунотерапевтично въздействие.

От друга страна, добре известен е потискащият ефект на повърхностния рецептор CD22 върху функциите на В-лимфоцитите /4-6/. Все още не е ясно кой е физиологичният му лиганд, но е установено, че рецепторът се свързва с полизахариди с крайна 2,6 сиалова киселина. Когато В-лимфоцитът е в неактивирано състояние, CD22 е в неактивна (маскирана) форма /7/. Специфичните към ДНК В клетки са несъмнено активирани при автоимунно заболяване (лупус) и техният повърхностен рецептор CD22 е в състояние да взаимодейства със своите естествени или целенасочено синтезирани лиганди. Рецепторът е съставен от седем домена от имуноглобулинов тип, експресирани на клетъчната повърхност, а в цитоплазмената си опашка съдържа сигнални мотиви, отговорни за предаването на инхибиращ вътреклетъчен сигнал. Известно е, че когато се въздейства едновремен

65954 Bl но върху CD22 посредством неговият лиганд или с моноклонално антитяло и с мембранния имуноглобулинов рецептор от изотип IgM на същата В клетка, нейната активност се потиска /8, 9/.

Декапептидът с аминокиселинна последователност DWEYSVWLSN е известен с това, че наподобява в антигенно отношение нативната ДНК. Доказано е, че той се разпознава от патологичните миши IgG антитела срещу нативната ДНК и при имунизиране на мишки с пептида се индуцира синтезата на антитела със същата специфичност и се наблюдават типичните за лупуса бъбречни увреждания /10/.

Техническа същност на изобретението

По своята същност изобретението представлява химерна молекула, която потиска селективно активността на патологични автореактивни клетки посредством въздействие върху техния инхибиращ рецептор CD22.

За селективното потискане на патологичните ДНК-специфични клетки, съгласно изобретението, е създадено средство, представляващо химерна молекула от носител миши имуноглобулин G, състояща се от два отделни синтетични компонента, единият от които се свързва специфично с инхибиращия повърхностен рецептор CD22, а другият - с имуноглобулиновите рецептори на В клетките с анти-ДНК специфичност (фиг. 1).

Първият от тези два синтетични компонента представлява предварително модифициран синтетичен пептид от 10 аминокиселини, поспециално пегпвдьт DWEYSVWLSN (SEQ IDNO. 1) /10/, който в антигенно отношение наподобява нативна ДНК и към чийто С-край е добавен линкер, представляващ хексаметиленова група.

Вторият синтетичен компонент, участващ в химерната молекула, съгласно изобретението представлява също предварително модифициран синтетичен пептид, по-специално пентапептидът GGPGG (SEQ ID NO. 2) с прибавен към неговия N-край олигозахариден SIN епитоп /11/, съдържащ свободен краен сиалов остатък. Към Скрая на този синтетичен пептид е добавен линкер, представляващ хексаметиленова група. От своя страна пентапептидът GGPGG е свързан ковалентно чрез хексаметиленов диаминен линкер към смола за твърдофазов синтез. За пентапеп тида се свързва епитопът SIN (търговски продукт на Calbiochem, Darmstadt, DE) посредством сериновия остатък на последния, като сиаловият остатък остава свободен. Новосинтезираният синтетичен пептид има следния схематичен вид (фигура 2).

Като молекули-носители са използвани мише моноклонално IgG2a антитяло, получено от хибридома IP 2-11-1, растяща върху синтетична безсерумна хранителна среда СНО или пул от миши имуноглобулини G, получени от смес на серуми на здрави мишки (получена от проф.

G. Lazslo, Университет Otvos, Будапеща).

Имуноглобулиновата фракция от синтетичната хранителна среда се пречиства чрез преципитация с амониев сулфат, а тази от смесения серум - чрез преципитация с амониев сулфат и последващо фракциониране върху имуноафинитетна колона, съдържаща имобилизиран протеин G (търговски продукт на фирмата Pharmacia).

Свързването на моноклоналните или поликлонални миши имуноглобулини G с модифицираните синтетични пептиди DWEYSVWLSN и STN-носещ пептид, се осъществява посредством познати методи със свързващ реактив 1етил-3(3'-диметиламинопропил) карбоимидин.НС1 (EDC)/12/.

За целта предварително се изготвя разтвор от всеки пептид в диметилформамид/ фосфатен буфер и на EDC във фосфатен буфер pH 6,0. Към разтвора на имуноглобулините се добавя разтвор на пептидите и EDC, реакционната смес се инкубира с постоянно разбъркване и се диализира срещу фосфат-буфериран физиологичен разтвор с pH 7.0. Полученият разтвор се концентрира, използвайки ултрафилтрация. Той съдържа химерната антитялова молекула, съставена от мишия имуноглобулинов носител, от епитопа STN, свързващ се с CD22 и от модифицирания пептид DWEYSVWLSN.

Белтъчното съдържание на разтвора се определя спектрофотометрично при 280 nm. Чистотата на получената химера се анализира с използването на SDS-PAGE при нередуциращи условия.

Възможността на полученото химерно моноклонално антитяло, съгласно изобретението, да се свързва специфично с рецептора CD22 и да потиска селективно патологични ДНК-специфични В клетки (фиг. 3), е изследвана в in vivo екс

65954 Bl перименти върху животни, развиващи спонтанно автоимунно заболяване, по-специално системен лупус. Количеството на отделения с урината белтък (мярка за бъбречното увреждане при лупус) се определя със стандартни сухи тестове (Bayer, UK). Здравото животно не отделя белтък в урината си и неговото присъствие свидетелства за наличието на болестен процес на бъбреците. Проведените изследвания in vivo доказват, че химерната молекула, съгласно изобретението, се свързва специфично с рецептора CD22 и потиска патологичните ДНК-специфични В клетки, като по този начин отслабва активността на болестния автоимунен процес. Прилагането на химерата съгласно изобретението на животни със системен лупус води до по-късно начало на заболяването, до потискане развитието на бъбречното усложнение и до удължаване на живота им (фиг. 4 и 5).

Пояснение на приложените фигури

Фигура 1 представлява схематичен вид на конструираната химерна молекула.

Фигура 2 представя схема на модифицирания STN епитоп.

Фигура 3 илюстрира инхибиращите клетъчната активност вътреклетъчни сигнали след едновременното свързване на имуноглобулиновия с CD22 рецептора на повърхността на прицелните В-лимфоцити.

Фигура 4 показва нива на протеинурията при млади MRL/Ipr мишки, третирани с химерни молекули съгласно изобретението. С бели стълбчета са означени средните нива и стандартно отклонение на лекуваните с химерата мишки, а с черни - тези на контролните (** р<0.01; ♦ р<0.05, нечифтен t-тест).

Фигура 5 показва, че приложението на химерната молекула води до достоверно удължаване времето на преживяване при мишките MRL/ Ipr с автоимунно заболяване (спонтанен лупус). С квадрати е означено преживяването на животните от опитната група, а с триъгълници - това на контролите (* р<0.05, нечифтен t-тест).

Примери за изпълнение на изобретението

Изобретението се характеризира със следните примерни изпълнения, без да го ограничават.

Пример 1. Получаване на модифицирани синтетични пептиди

За получаването на средството за селективно потискане активността на патологични автореактивни В клетки, съгласно изобретението, се използва предварително модифициран синтетичен пептид GGPGG (SEQ ID NO. 2) със свързан към неговия N-край олигозахариден STN епитоп (закупен от Calbiochem, Darmstadt, DE) със свободен краен сиалов остатък. Към С-края на синтетичния пептид е включен линкер, представляващ хексаметиленова група. Синтезата се осъществява с използване на Fmoc-метод /13/.

Използва се описан в литературата синтетичен пептид от 10 аминокиселини DWEYSVWLSN (SEQ ID NO. 1) /10/, който наподобява в антигенно отношение двойноверижна ДНК. Към неговия С-край също се добавя линкер, представляващ хексаметиленова група.

Пример 2. Конструиране на химерната имуноглобулинова молекула

Двата модифицирани пептида се подлагат на пречистване чрез HPLC /14/, след което се осъществява свързването им към получените по описаните методи моноклонални или поликлонални миши имуноглобулини G. За целта предварително се изготвя разтвор на 0,4 mg от всеки пептид в диметилформамид/фосфатен буфер в съотношение 1:9 и на EDC във фосфатен буфер pH 6,0-0,3 mg/ml. Към разтвора на имуноглобулините се добавя разтвор на пептидите и EDC и обемът се довежда до 150 ml с фосфатен буфер pH 6,0. Реакционната смес се инкубира в продължение на 16 h при 4°С с постоянно разбъркване. След това тя се диализира при 4°С за 16 h срещу 200 обема фосфат-буфериран физиологичен разтвор с pH 7,0. Полученият разтвор се концентрира до краен обем 20 ml, използвайки ултрафилтрация през филтри с големина на порите 5 kDa (от Amicon, Millipore Corp.). Той съдържа химерната антитялова молекула, съставена от мишия имуноглобулинов носител, от епитопа STN, свързващ се с CD22 и от модифицирания пептид DWEYSVWLSN (фигура 1).

Пример 3. Определяне на ефекта от при

65954 Bl ложението нахимерната молекула върху мишки с развито автоимунно заболяване, по-специално със спонтанен лупус.

С получената химерна молекула се третира група от женски MRL/Ipr мишки на 6-седмична възраст. Всяка мишка получава по 20 microg от химерата два пъти седмично по венозен път. Контролната група животни получава венозни инжекции с фосфат-буфериран физиологичен разтвор. Мишките от тази инбредна линия развиват спонтанно на около 7-9-седмична възраст заболяване, много близко до системната автоимунна болест лупус еритематозус при човека. Заболяването на животните завършва по правило с необратимо бъбречно увреждане, което причинява смъртта им.

Количеството на отделения с урината белтък (мярка за бъбречното увреждане при лупус) се определя със стандартни сухи тестове (Bayer, UK). Здравото животно не отделя белтък в урината си и неговото присъствие свидетелства за наличието на болестен процес на бъбреците. Приложението на химерната молекула, съгласно изобретението забавя момента на поява и отслабва нивото на албуминурията (фиг. 4). Приложението на същото средство показва също достоверно удължаване живота на лупусните мишки (фиг. 5).

Claims

Патентни претенции

1. Средство за селективно потискане активността на патологични автореактивни В клетки, характеризиращо се с това, че представлява химерна молекула, състояща се от носител имуноглобулин G и два синтетични компонента, първият от които се свързва специфично към инхибиращия повърхностен рецептор CD22, а вторият - към имуноглобулиновите рецептори на В клетките, разпознаващи избран автоантиген.
2. Средство съгласно претенция 1, характеризиращо се с това, че първият от двата синтетични компонента е съставен от пептида DWEYSVWLSN (SEQ ID NO. 1) и хексаметиленова група в С-края.
3. Средство съгласно претенция 1, характеризиращо се с това, че вторият синтетичен компонент е съставен от пептида GGPGG (SEQ ID NO. 2) с STN епитоп в N-края и хексаметилено ва група в С-края.
4. Средство съгласно претенция 3, характеризиращо се с това, че STN епитопът притежава свободен краен сиалов остатък.
5. Приложение на средство съгласно претенции от 1 до 4 за производство на медикамент за селективно потискане активността на патологични автореактивни В клетки.