TW202035453A - Pd-l1-結合分子及其用於治療疾病的用途 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及能夠結合至PD-L1的PD
-L1
-結合分子，如單特異性抗體和其表位結合片段，和能夠結合至PD-L1的表位和CD137的表位二者的多特異性結合分子(PD-L1 x CD137
結合分子) (例如，雙特異性抗體、雙特異性雙抗體、BiTE、三價結合分子等等)。本發明還涉及包含這種分子的藥物組合物。發明還包括這種分子在治療疾病，特別地癌症或與被抑制的免疫系統的存在相關的或通過被抑制的免疫系統的存在表徵的疾病或病況中的用途。
Description
[相關申請的交叉引用]
本申請案主張美國專利申請案62/760,400 (在2018年11月13日提交；申請中)和62/721,984 (在2018年8月23日提交；申請中)的優先權，每個申請均通過引用以其全部併入本文。
[序列表的引用]
本申請案按照37 C.F.R. 1.821以及下面條款包括一個或多個序列表，其以電腦可讀介質(檔案名：1301_0159PCT_ST25.txt，創建於2019年8月13日，大小為236,330個位元組)公開，該文檔通過引用以其全部併入本文。
本發明涉及能夠結合至PD-L1的PD
-L1
-結合分子，如單特異性抗體和其表位結合片段，以及能夠結合至PD-L1的表位和CD137的表位二者的多特異性結合分子(PD-L1 x CD137
結合分子) (例如，雙特異性抗體、雙特異性雙抗體、BiTE、三價結合分子等)。本發明還涉及包含這種分子的藥物組合物。本發明還包括這種分子在治療疾病、特別地癌症，或與被抑制的免疫系統的存在相關的或通過被抑制的免疫系統的存在表徵的疾病或病況中的用途。
I. 哺乳動物免疫系統
哺乳動物免疫系統充當抵禦各種病況包括例如，損傷、感染和瘤形成的防衛。人和其它哺乳動物形成對病原體、外來物質和癌抗原的免疫學應答的效率取決於兩種特徵：免疫應答對抗原識別的高度特異性以及在用相同抗原重新啟動後允許更快且更強的應答的免疫學記憶(Portolés, P.等(2009) “The TCR/CD3 Complex: Opening the Gate to Successful Vaccination
,” Current Pharmaceutical Design 15:3290-3300；Guy, C.S.等(2009) “Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR:CD3 Complex
,” Immunol Rev. 232(1):7-21；Topalian, S.L.等(2015) “Immune Checkpoint Blockade: A Common Denominator Approach to Cancer Therapy
,” Cancer Cell 27:450-461)。
在健康個體中，免疫系統處於靜息狀態，受到一系列不同抑制性受體和受體配體抑制。在識別到癌抗原、微生物病原體或過敏原後，大量啟動受體和受體配體被觸發以誘導免疫系統的啟動。這種啟動導致巨噬細胞、天然殺傷(NK)細胞和抗原特異性的細胞毒性的T-細胞的啟動，並且促進各種細胞因數的釋放，其全部具有對抗所察覺到的對受試者健康的威脅的作用(Dong, C.等(2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules
,” Immunolog. Res. 28(1):39-48；Viglietta, V.等(2007) “Modulating Co-Stimulation
,” Neurotherapeutics 4:666-675；Korman, A.J.等(2007) “Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy
,” Adv. Immunol. 90:297-339)。當抗衡抑制性免疫信號勝過啟動免疫信號時，免疫系統能夠返回到其正常靜息狀態。
因此，癌症的疾病狀態(以及甚至傳染性疾病的疾病狀態)可被認為反映出未能充分啟動受試者的免疫系統。這種失敗可反映啟動免疫信號的展示不足，或者它可反映減弱受試者中的抑制性免疫信號的能力不足。在一些情況下，研究者已經確定癌症細胞可以拉攏(co-opt)免疫系統以避免被免疫系統檢測到(Topalian, S.L.等(2015) “Immune Checkpoint Blockade: A Common Denominator Approach to Cancer Therapy
,” Cancer Cell 27:450-461)。
哺乳動物免疫系統由兩種獨立但相互關聯的系統：體液免疫系統和細胞免疫系統介導。一般而言，體液系統由B 細胞
產生的可溶性分子（抗體或免疫球蛋白）介導。這種分子具有與已經被識別為身體外來的抗原結合並中和已經被識別為身體外來的抗原的能力。細胞免疫系統涉及起多種治療作用的被稱為“T- 細胞
”的某些細胞的轉移(mobilization)。T-細胞是在胸腺中成熟並在組織、淋巴系統和循環系統之間迴圈的淋巴細胞。回應於外來結構（抗原）的存在和識別，T-細胞被“啟動
”以啟動免疫應答。在許多情況下，這些外來抗原由於瘤形成或感染而在宿主細胞上表達。儘管T細胞自身不分泌抗體，但它們通常是第二類淋巴細胞“B 細胞
”（其源自骨髓）分泌抗體所需的。關鍵地，T細胞展示非同尋常的免疫特異性以能夠將一種抗原與另一種抗原相區分。
兩種相互作用是T-細胞啟動所需的(Viglietta, V. 等 (2007) “Modulating Co-Stimulation
,” Neurotherapeutics 4:666-675；Korman, A.J. 等 (2007) “Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy
,” Adv. Immunol. 90:297-339)。在第一種相互作用中，細胞必須呈遞(display)結合至細胞的I類或II類主要組織相容性複合物(“MHC
”)的相關靶抗原，以便它能結合初始T淋巴細胞的T-細胞受體(“TCR
”)。儘管幾乎所有細胞類型可充當抗原呈遞細胞，但是一些細胞諸如巨噬細胞
、B 細胞
和樹突狀細胞
專門呈遞外來抗原並且是“專業的”“抗原呈遞細胞
”。結合至抗原呈遞細胞的MHC I分子的抗原的免疫學檢測導致細胞毒性T-細胞的產生。結合至抗原呈遞細胞的MHC II分子的抗原的免疫學檢測導致細胞毒性T-細胞的產生。在第二種相互作用中，抗原呈遞細胞的配體必須結合T-細胞的共受體 (Dong, C. 等 (2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules
,” Immunolog. Res. 28(1):39-48；Lindley, P.S. 等 (2009) “The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation
,” Immunol. Rev. 229:307-321)。經歷兩種刺激信號的T-細胞然後能夠對細胞因數（諸如白細胞介素-2和白細胞介素-12）作出回應。
在TCR接合（TCR engagement）期間沒有兩種共刺激信號的情況下，T-細胞進入功能性無應答狀態，被稱為“克隆無能
” (Khawli, L.A. 等 (2008) “Cytokine, Chemokine, and Co-Stimulatory Fusion Proteins for the Immunotherapy of Solid Tumors
,” Exp. Pharmacol. 181:291-328)。在病理狀態下，T-細胞是各種器官特異性自身免疫疾病諸如I型糖尿病、類風濕性關節炎和多發性硬化的關鍵參與者(Dong, C. 等 (2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules
,” Immunolog. Res. 28(1):39-48)。
這種免疫“檢查點”途徑在抗微生物或抗過敏免疫應答期間在保持自我耐受性（即，防止受試者對他的/她的自身細胞發起免疫系統攻擊（“自身免疫”反應））以及限制附帶的組織傷害方面是重要的。當T細胞的接觸導致產生兩種必需信號中的僅僅一種時，T細胞不被啟動，且不發生適應性免疫應答。因此，T細胞啟動的“雙信號”機制為免疫系統提供了一種避免不期望的應答的方法，所述不期望的應答例如對自身抗原的應答，其將另外導致對受試者的自身細胞的免疫系統攻擊（“自身免疫”反應）。
II. 細胞免疫系統的PD-1、PD-L1和其他細胞表面分子
免疫系統的細胞的特徵在於它們的特定糖蛋白細胞表面分子的表達。這種分子和其它細胞分子之間的相互作用觸發、維持或抑制細胞的免疫應答。
抗原呈遞細胞的B7.1 (CD80
)和B7.2 (CD86
)配體和CD4+
T淋巴細胞的CD28
和CTLA-4
受體之間的結合對免疫應答所需的第二種相互作用特別重要 (Sharpe, A.H. 等 (2002) “The B7-CD28 Superfamily
,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126; Dong, C. 等 (2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules
,” Immunolog. Res. 28(1):39-48; Lindley, P.S. 等 (2009) “The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation
,” Immunol. Rev. 229:307-321)。B7.1或B7.2與CD28的結合刺激T-細胞啟動；B7.1或B7.2與CTLA-4的結合抑制這種啟動 (Dong, C. 等 (2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules
,” Immunolog. Res. 28(1):39-48; Lindley, P.S. 等 (2009) “The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation
,” Immunol. Rev. 229:307-321; Greenwald, R.J. 等 (2005) “The B7 Family Revisited
,” Ann. Rev. Immunol. 23:515-548)。CD28在T-細胞的表面上是組成性表達 (Gross, J., 等 (1992) “Identification And Distribution Of The Costimulatory Receptor CD28 In The Mouse
,” J. Immunol. 149:380–388)，而T-細胞啟動後CTLA-4表達迅速地上調 (Linsley, P. 等 (1996) “Intracellular Trafficking Of CTLA4 And Focal Localization Towards Sites Of TCR Engagement
,” Immunity 4:535–543)。由於CTLA-4是較高親和力受體 (Sharpe, A.H. 等 (2002) “The B7-CD28 Superfamily
,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126; Topalian, S.L. 等 (2015) “Immune Checkpoint Blockade: A Common Denominator Approach to Cancer Therapy
,” Cancer Cell 27:450-461)，結合首先啟動T-細胞增殖（通過CD28），然後抑制它（通過CTLA-4的新生表達），從而抑制不再需要增殖時的作用。
程式性死亡-1 (“PD-1
,”也稱為“CD279”)是廣泛地負調節免疫應答的擴增的CD28/CTLA-4家族的T-細胞調節劑的I型膜蛋白成員 (Ishida, Y. 等 (1992) “Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death
,” EMBO J. 11:3887-3895；美國專利申請公開號2007/0202100、2008/0311117、2009/00110667；美國專利號6,808,710、7,101,550、7,488,802、7,635,757、7,722,868；PCT公開號WO 01/14557)。因此，PD-1的表達起抑制免疫系統的作用。
儘管PD-1和CTLA-4都提供抑制免疫信號，但是通過PD-1提供的信號在疾病的過程中稍後增強，並且可以通過限制疾病回應的T-細胞的最初產生(“爆發”)大幅度減少免疫應答。同樣地，PD-1可以將潛在有效的T-細胞應答部分轉化為耐受性之一 (Topalian, S.L. 等 (2015) “Immune Checkpoint Blockade: A Common Denominator Approach to Cancer Therapy
,” Cancer Cell 27:450-461)。
PD-1系統的受體-配體相互作用似乎比CD28/CTLA-4系統的相互作用更複雜。PD-1在啟動的T-細胞、B-細胞和單核細胞的細胞表面上表達 (Agata, Y. 等 (1996) “Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And B Lymphocytes
,” Int. Immunol. 8(5):765-772; Yamazaki, T. 等 (2002) “Expression Of Programmed Death 1 Ligands By Murine T-Cells And APC
,” J. Immunol. 169:5538-5545)且以低水準在天然殺傷(NK) T-細胞中表達(Nishimura, H. 等 (2000) “Facilitation Of Beta Selection And Modification Of Positive Selection In The Thymus Of PD-1-Deficient Mice
,” J. Exp. Med. 191:891-898; Martin-Orozco, N. 等 (2007) “Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity
,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298)。
PD-1的細胞外區域由與CTLA-4中的等同結構域具有23%同一性的單一的免疫球蛋白(IgV)結構域組成 (Martin-Orozco, N. 等 (2007) “Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity
,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298)。細胞外IgV結構域之後是跨膜區域和細胞內尾部。細胞內尾部包含位於基於免疫受體酪氨酸的抑制基序和基於免疫受體酪氨酸的轉換基序中的兩個磷酸化位點，這表明PD-1負調節TCR信號 (Ishida, Y. 等 (1992) “Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death
,” EMBO J. 11:3887-3895; Blank, C. 等 (2006) “Contribution Of The PD-L1/PD-1 Pathway To T-Cell Exhaustion: An Update On Implications For Chronic Infections And Tumor Evasion Cancer
,” Immunol. Immunother. 56(5):739-745)。
PD-1通過結合PD-L1
和PD-L2
(也稱為B7-H1和B7-DC)介導其對免疫系統的抑制 (Flies, D.B. 等 (2007) “The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity
,” J. Immunother. 30(3):251-260；美國專利號6,803,192、7,794,710；美國專利公開號2005/0059051、2009/0055944、2009/0274666、2009/0313687；PCT公開號WO 01/39722、WO 02/086083)。
PD-L1和PD-L2在許多類型的人和鼠組織如心臟、胎盤、肌肉、胎肝、脾臟、淋巴結和胸腺以及鼠肝臟、肺、腎、胰腺的胰島細胞和小腸的表面上廣泛表達 (Martin-Orozco, N. 等 (2007) “Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity
,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298)。在人中，已經在人內皮細胞(Chen, Y. 等 (2005) “Expression of B7-H1 in Inflammatory Renal Tubular Epithelial Cells
,” Nephron. Exp. Nephrol. 102:e81-e92; de Haij, S. 等 (2005) “Renal Tubular Epithelial Cells Modulate T-Cell Responses Via ICOS-L And B7-H1
” Kidney Int. 68:2091-2102; Mazanet, M.M. 等 (2002) “B7-H1 Is Expressed By Human Endothelial Cells And Suppresses T-Cell Cytokine Synthesis
,” J. Immunol. 169:3581-3588)、心肌 (Brown, J.A. 等 (2003) “Blockade Of Programmed Death-1 Ligands On Dendritic Cells Enhances T-Cell Activation And Cytokine Production
,” J. Immunol. 170:1257-1266)、合胞滋養層(syncyciotrophoblasts) (Petroff, M.G. 等 (2002) “B7 Family Molecules: Novel Immunomodulators At The Maternal-Fetal Interface
,” Placenta 23:S95-S101) 中發現B7-H1蛋白表達。分子也由一些組織的駐留型巨噬細胞、已經通過干擾素(IFN)-γ或腫瘤壞死因數(TNF)-α啟動的巨噬細胞表達 (Latchman, Y. 等 (2001) “PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T-Cell Activation
,” Nat. Immunol 2:261-268)，並且在腫瘤中表達(Dong, H. (2003) “B7-H1 Pathway And Its Role In The Evasion Of Tumor Immunity
,” J. Mol. Med. 81:281-287)。
已經發現PD-1和PD-L1之間的相互作用為T-細胞和B-細胞提供關鍵的負共刺激信號(Martin-Orozco, N. 等 (2007) “Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity
,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298)並作為細胞死亡誘導物發揮作用 (Ishida, Y. 等 (1992) “Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death
,” EMBO J. 11:3887-3895; Subudhi, S.K. 等 (2005) “The Balance Of Immune Responses: Costimulation Verse Coinhibition
,” J. Molec. Med. 83:193-202)。更具體地，已發現低濃度的PD-1受體和PD-L1之間的相互作用導致抑制信號的傳遞，所述抑制信號強烈抑制抗原特異性CD8+ T細胞的增殖；在較高濃度下，與PD-1的相互作用不抑制T-細胞增殖，但明顯減少多種細胞因數的產生 (Sharpe, A.H. 等 (2002) “The B7-CD28 Superfamily
,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126)。已經發現，通過靜息和先前啟動的CD4和CD8 T-細胞以及甚至來自臍帶血的初始T-細胞的T-細胞增殖和細胞因數產生受可溶性B7-H1-Fc融合蛋白的抑制 (Freeman, G.J. 等 (2000) “Engagement Of The PD-1 Immunoinhibitory Receptor By A Novel B7 Family Member Leads To Negative Regulation Of Lymphocyte Activation
,” J. Exp. Med. 192:1-9; Latchman, Y. 等 (2001) “PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T-Cell Activation
,” Nature Immunol. 2:261-268; Carter, L. 等 (2002) “PD-1:PD-L Inhibitory Pathway Affects Both CD4(+) and CD8(+) T-cells And Is Overcome By IL-2
,” Eur. J. Immunol. 32(3):634-643; Sharpe, A.H. 等 (2002) “The B7-CD28 Superfamily
,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126)。
PD-1和PD-L1在抑制T-細胞啟動和增殖中的作用已經表明，這些生物分子可以用作治療炎症和癌症的治療靶標。能夠結合PD-1或PD-L1的分子具有阻止PD-1與PD-L1結合的潛力，因此具有阻止PD-1：PD-L1相互作用引起的抑制免疫系統的能力。
因此，已經提出使用抗-PD-1抗體和抗-PD-L1抗體來治療感染和腫瘤以及上調適應性免疫應答(參見，例如美國專利公開號2010/0040614、2010/0028330、2004/0241745、2008/0311117、2009/0217401；美國專利號7,521,051、7,563,869、7,595,048；PCT公開號WO 2004/056875、WO 2008/083174和WO 2017/019846)。已經報導了能夠特異性結合PD-L1的抗體 (Wang, Y. 等 (2018) “Regulation of PD-L1: Emerging Routes for Targeting Tumor Immune Evasion
,” Front. Pharmacol. 9:536; 第1-13頁; Mahoney, K.M. 等 (2015) “The Next Immune-Checkpoint Inhibitors: PD-1/PD-L1 Blockade in Melanoma
,” Clin. Ther. 37(4):764-782; Chen, J. 等 (2016) “Regulation Of PD-L1: A Novel Role Of Pro-Survival Signalling In Cancer
,” Ann. Oncol. 27(3):409-416; Gong, X. 等 (2017) “Combined Radiotherapy and Anti-PD-L1 Antibody Synergistically Enhances Antitumor Effect in Non-Small Cell Lung Cancer
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,” Curr. Opin. Obstet. Gynecol. 28(2):142-147)；還參見美國專利號10,034,939、10,011,656、9,988,452、9,980,956、9,938,345、9,885,721、9,873,740、9,845,356、9,815,897、9,789,183、9,709,568、9,683,048、9,669,078、9,624,298、 9,546,206、9,358,289、9,273,135、9,212,224、9,175,082、9,067,998、9,045,545、8,952,136、8,741,295、8,735,553、8,552,154、8,354,509、8,217,149、8,168,179、8,008,449、7,943,743、7,722,868、7,709,214和7,488,802；美國專利公開號2013/0017199和2014/0044738；和PCT公開號WO 2004/004771、WO 2004/056875、WO 2004/072286、WO 2006/121168、WO 2007/005874、WO 2008/083174、WO 2009/014708、WO 2009/073533和WO 2012/135408 )。
III. CD137
CD137
(也稱為“4-1BB
”和“TNF 受體超家族成員 9
” (“TNFRSF9
”))是腫瘤壞死因數受體超家族的共刺激受體成員，介導CD28-依賴性和獨立性的T-細胞共刺激 (Croft, M. (2009) “The Role Of TNF Superfamily Members In T-Cell Function And Diseases
,” Nat. Rev. Immunol. 9:271-285; Yonezawa, A. 等 (2015) “Boosting Cancer Immunotherapy With Anti-CD137 Antibody Therapy
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,” Clin. Pharmacol. 5:47-53; Chen, L. 等 (2013) “Molecular Mechanisms Of T Cell Co-Stimulation And Coinhibition
,” Nat. Rev. Immunol. 13:227-242; Yao S. 等 “Advances In Targeting Cell Surface Signaling Molecules For Immune Modulation
,” Nat. Rev. Drug Discov. 12:130-146)。
CD137由免疫系統的T細胞、天然殺傷(NK)細胞、樹突細胞(DC)、B細胞和其他細胞誘導地表達 (Vinay, D.S. 等 (2015) “Therapeutic Potential Of Anti-CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibodies, Expert Opinion On Therapeutic Targets
,” DOI:10.1517/14728222.2016.1091448; 第1-14頁; Wang, C. 等 (2009) “Immune Regulation By 4-1BB And 4-1BBL: Complexities And Challenges
,” Immunol. Rev. 229:192-215; Melero, I. 等 (2008) “Multilayered Action Mechanisms Of CD137 (4-1BB)-Targeted Immunotherapies
,” Trends Pharmacol Sci. 29:383-390)。該蛋白是包括具有短的N-端細胞質部分、跨膜區域和擁有3個富含半胱氨酸的基序的細胞外結構域的255個氨基酸的蛋白。
通過其配體CD137L(4-1BBL；TNFSF9) ——儘管非排他地，CD137L主要在抗原呈遞細胞（APC）上表達——連接CD137，引起各種T細胞應答，如細胞擴增、細胞因數分泌增加和預防啟動誘導的細胞死亡 (Qian, Y. 等 (2015) “CD137 Ligand-Mediated Reverse
SignalingInhibits Proliferation And Induces Apoptosis In Non-Small Cell Lung Cancer
,” Med. Oncol. 32:44;第1-10頁; Thum, E. 等 (2009) “CD137, Implications In Immunity And Potential For Therapy
,” Front. Biosci. (Landmark Ed). 14:4173-4188)。因此，這種連接用於啟動免疫系統。然而，CD137和CD137L之間的順式-相互作用也強烈地下調CD137L的表達 (Kwon, B. (2015) “Is CD137 Ligand (CD137L) Signaling a Fine Tuner of Immune Responses?
,” Immune Network. 15(3): 121-124)。因此，CD137配體用於控制CD137-介導的免疫系統啟動的程度和動力學。
顯著地，在人NK細胞上表達的CD137在與已經結合腫瘤細胞的抗腫瘤抗體(即，結合腫瘤抗原的抗體)結合後被上調(Houot, R. 等 (2012) “Boosting Antibody-Dependent Cellular
CytotoxicityAgainst Tumor Cells With A CD137 Stimulatory Antibody
,” Oncoimmunology. 1:957-958; Lin, W. 等 (2008) “Fc-Dependent Expression Of CD137 On Human NK Cells: Insights Into “Agonistic” Effects Of Anti-CD137 Monoclonal Antibodies
,” Blood 112(3):699-707; Wei, H. 等 (2014) “Dual Targeting Of CD137 Co-Stimulatory And PD-1 Co-Inhibitory Molecules For Ovarian Cancer Immunotherapy
,” OncoImmunology 3:e28248; 第1-3頁)。
這種認知已導致了對CD137免疫特異性的抗體可用於啟動免疫系統且從而為癌症提供治療的提議 (Melero I. 等 (1997) “Monoclonal Antibodies Against The 4-1BB T-Cell Activation Molecule Eradicate Established Tumors
,” Nat Med. 3:682-385; Sun, Y. 等 (2002) “Costimulatory Molecule-Targeted Antibody Therapy Of A Spontaneous Autoimmune Disease
,” Nature Med. 8:1405-1413; Mittler, R.S. 等 (2004) “Anti-CD137 Antibodies In The Treatment Of Autoimmune Disease And Cancer
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SpontaneousCancer
,” OncoImmunology 3:2, e27812, 第1-4頁; Takeda, K. 等 (2007) “Combination Antibody-Based Cancer Immunotherapy
,” Cancer Sci. 98(9):1297-1302)。抗-CD137抗體在美國專利號2014/0274909、2013/0280265、2013/0273078、2013/0071403、2012/0058047、2011/0104049、2011/0097313、2008/0166336、2008/0019905、2006/0188439、2006/0182744、2006/0121030和2003/0223989中公開。
本領域已經認識到提供涉及對CD137特異性的結合分子和對PD-L1特異性的結合分子的組合免疫療法的益處(參見，例如Thadi, A. 等 (2018) “Early Investigations and Recent Advances in Intraperitoneal Immunotherapy for Peritoneal Metastasis
,” Vaccines (Basel) 6(3) pii: E54. doi: 10.3390/vaccines6030054; Cabo, M. 等 (2017) “Trial Watch: Immunostimulatory Monoclonal Antibodies For Oncological Indications
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,” Clin. Cancer Res. 23(18):5326-5328. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-17-1799; Dempke, W.C.M. 等 (2017) “Second- And Third-Generation Drugs For Immuno-Oncology Treatment-The More The Better?
” Eur. J. Cancer 74:55-72; Homet Moreno, B. 等 (2015) “Combined Treatment With Dabrafenib And Trametinib With Immune-Stimulating Antibodies For BRAF Mutant Melanoma
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,” Oncoimmunology 3:e27812; Morales-Kastresana, A. 等 (2013) “Combined Immunostimulatory Monoclonal Antibodies Extend Survival In An Aggressive Transgenic Hepatocellular Carcinoma Mouse Model
,” Clin. Cancer Res. 19(22):6151-6162)。
然而，儘管所有這些先前的進展，仍然需要能夠更有力地引導身體免疫系統攻擊癌細胞或病原體感染細胞的改善的組合物。儘管適應性免疫系統可以是針對癌症和疾病的有效防禦機制，但它常常受到在腫瘤微環境中由PD-L1和CD137的減少/缺失的共刺激活性介導的免疫抑制/逃避機制的阻礙。此外，在腫瘤環境中由腫瘤細胞、免疫細胞和基質細胞表達的共抑制分子可以絕對性地減弱針對癌細胞的T細胞應答。
如下面詳細描述的，本發明通過提供新型的抗人PD-L1抗體和能夠結合人PD-L1的表位和人CD137的表位以便能夠共連接(co-ligate)表達PD-L1和CD137的細胞的PD-L1 x CD137
雙特異性結合分子來解決這種需求。不受任何特定方法的限制，這種共定位被認為用於刺激免疫細胞(通過這些細胞的CD137結合至PD-L1 x CD137
雙特異性結合分子），同時減弱或阻斷PD-L1結合至PD-1的能力，從而減弱或阻斷PD-L1-PD-1結合時發生的免疫系統抑制。本發明的PD-L1 x CD137
雙特異性結合分子的屬性允許這種雙特異性分子在刺激免疫系統中具有實用性，特別是在治療癌症以及與抑制的免疫系統的存在相關的疾病和病況中具有實用性。本發明針對這些和其他目的。
本發明針對能夠結合至PD-L1的PD
-L1
-結合分子，如單特異性抗體及其表位結合片段，以及能夠結合至PD-L1的表位和CD137的表位二者的多特異性結合分子(例如，雙特異性抗體、雙特異性雙抗體、BiTE、三價結合分子等)。本發明還針對包含這種分子的藥物組合物。本發明還包括這種分子在治療疾病、特別地癌症，或與被抑制的免疫系統的存在相關的或通過被抑制的免疫系統的存在表徵的疾病或病況中的用途。
詳細地，本發明提供能夠結合人PD-L1的表位的PD
-L1
-結合分子，其中PD-L1-
結合分子包括包含CDRH
1、CDRH
2和CDRH
3的PD-L1-結合重鏈可變結構域和包含CDRL
1、CDRL
2和CDRL
3的PD-L1-結合輕鏈可變結構域；以及其中：
(A) (1) PD-L1-結合重鏈可變結構域CDRH
1、CDRH
2和CDRH
3是PD-L1 MAB-2 VH
(SEQ ID NO:63
)的重鏈CDR；和
(2) PD-L1-結合輕鏈可變結構域CDRL
1、CDRL
2和CDRL
3是PD-L1 MAB-2 VL
(SEQ ID NO:67
)的輕鏈CDR；
(B) (1) PD-L1-結合重鏈可變結構域CDRH
1、CDRH
2和CDRH
3是PD-L1 MAB-3 VH
(SEQ ID NO:73
)的重鏈CDR；和
(2) PD-L1-結合輕鏈可變結構域CDRL
1、CDRL
2和CDRL
3是PD-L1 MAB-3 VL
(SEQ ID NO:77
)的輕鏈CDR；
或
(C) (1) PD-L1-結合重鏈可變結構域CDRH
1、CDRH
2和CDRH
3是PD-L1 MAB-1 VH
(SEQ ID NO:55
)的重鏈CDR；和
(2) PD-L1-結合輕鏈可變結構域CDRL1、CDRL2和CDRL3是PD-L1 MAB-1 VL
(SEQ ID NO:59
)的輕鏈CDR。
本發明另外涉及這種包含PD-L1-結合重鏈可變結構域的PD-L1-
結合分子的實施方式，所述PD-L1-結合重鏈可變結構域包含氨基酸序列：
(A)hPD-L1 MAB-2 VH1
(SEQ ID NO:71
)；或
(B)hPD-L1 MAB-3 VH1
(SEQ ID NO:81
)。
本發明另外涉及這種包含PD-L1-結合輕鏈可變結構域的PD-L1
-結合分子的實施方式，所述PD-L1-結合輕鏈可變結構域包含氨基酸序列：
(A)hPD-L1 MAB-2 VL
(SEQ ID NO:72
)；或
(B)hPD-L1 MAB-3 VL1
(SEQ ID NO:82
)。
本發明另外涉及所有上述PD-L1-
結合分子的實施方式，其中該分子是抗體或其表位結合片段。
本發明另外涉及這種PD-L1 x CD137
結合分子，其中PD-L1 x CD137
結合分子包含上述PD-L1-結合重鏈可變結構域中的任一個和上述PD-L1-結合輕鏈可變結構域中的任一個。
本發明另外涉及這種PD-L1 x CD137
結合分子的實施方式，其中PD-L1 x CD137
結合分子包括包含CDRH
1、CDRH
2和CDRH
3的CD137-結合重鏈可變結構域和包含CDRL
1、CDRL
2和CDRL
3的CD137-結合輕鏈可變結構域；以及其中：
(A) (1) CD137-結合重鏈可變結構域CDRH
1、CDRH
2和CDRH
3是CD137 MAB-1 VH
(SEQ ID NO:90
)的重鏈CDR；和
(2) CD137-結合輕鏈可變結構域CDRL
1、CDRL
2和CDRL
3是CD137 MAB-1 VL
(SEQ ID NO:94
)的輕鏈CDR；
(B) (1) CD137-結合重鏈可變結構域CDRH
1、CDRH
2和CDRH
3是hCD137 MAB-1 VH1
(SEQ ID NO:99
)、hCD137 MAB-1 VH1A
(SEQ ID NO:100
)、hCD137 MAB-1 VH1B
(SEQ ID NO:102
)、hCD137 MAB-1 VH1C
(SEQ ID NO:104
)、hCD137 MAB-1 VH1D
(SEQ ID NO:106
)、hCD137 MAB-1 VH1E
(SEQ ID NO:108
)、hCD137 MAB-1 VH1F
(SEQ ID NO:109
)或hCD137 MAB-1 VH1G
(SEQ ID NO:110
)的重鏈CDR；和
(2) CD137-結合輕鏈可變結構域CDRL
1、CDRL
2和CDRL
3是hCD137 MAB-1 VL1
(SEQ ID NO:112)
、hCD137 MAB-1 VL2
(SEQ ID NO:114)
、hCD137 MAB-1 VL3
(SEQ ID NO:115)
、hCD137 MAB-1 VL4
(SEQ ID NO:116)
、hCD137 MAB-1 VL5
(SEQ ID NO:117)
、hCD137 MAB-1 VL6
(SEQ ID NO:118)
、hCD137 MAB-1 VL7
(SEQ ID NO:120)
、hCD137 MAB-1 VL8
(SEQ ID NO:121)
、hCD137 MAB-1 VL9
(SEQ ID NO:122)
、hCD137 MAB-1 VL10
(SEQ ID NO:123)
、hCD137 MAB-1 VL11
(SEQ ID NO:125)
、hCD137 MAB-1 VL12
(SEQ ID NO:127)
、hCD137 MAB-1 VL13
(SEQ ID NO:128)
、hCD137 MAB-1 VL14
(SEQ ID NO:129)
或hCD137 MAB-1 VL15
(SEQ ID NO:131)
的輕鏈CDR；
或
(C) (1) CD137-結合重鏈可變結構域CDRH
1、CDRH
2和CDRH
3是CD137 MAB-2 VH
(SEQ ID NO:133
)的重鏈CDR；和
(2) CD137-結合輕鏈可變結構域CDRL
1、CDRL
2和CDRL
3是CD137 MAB-2 VL
(SEQ ID NO:135
)的輕鏈CDR。
本發明另外涉及這種包含CD137-結合重鏈可變結構域的PD-L1 x CD137
結合分子的實施方式，所述CD137-結合重鏈可變結構域包含氨基酸序列：
(A)hCD137 MAB-1 VH1
(SEQ ID NO:99
)；
(B)hCD137 MAB-1 VH1A
(SEQ ID NO:100
)；
(C)hCD137 MAB-1 VH1B
(SEQ ID NO:102
)；
(D)hCD137 MAB-1 VH1C
(SEQ ID NO:104
)；
(E)hCD137 MAB-1 VH1D
(SEQ ID NO:106
)；
(F)hCD137 MAB-1 VH1E
(SEQ ID NO:108
)；
(G)hCD137 MAB-1 VH1F
(SEQ ID NO:109
)；
(H)hCD137 MAB-1 VH1G
(SEQ ID NO:110
)；或
(I)hCD137 MAB-2 VH1
(SEQ ID NO:139
)。
本發明另外涉及這種包含CD137-結合輕鏈可變結構域的PD-L1 x CD137
結合分子的實施方式，所述CD137-結合輕鏈可變結構域包含氨基酸序列：
(A)hCD137 MAB-1 VL1
(SEQ ID NO:112)
；
(B)hCD137 MAB-1 VL2
(SEQ ID NO:114)
；
(C)hCD137 MAB-1 VL3
(SEQ ID NO:115)
；
(D)hCD137 MAB-1 VL4
(SEQ ID NO:116)
；
(E)hCD137 MAB-1 VL5
(SEQ ID NO:117)
；
(F)hCD137 MAB-1 VL6
(SEQ ID NO:118)
;
(G)hCD137 MAB-1 VL7
(SEQ ID NO:120)
；
(H)hCD137 MAB-1 VL8
(SEQ ID NO:121)
；
(I)hCD137 MAB-1 VL9
(SEQ ID NO:122)
；
(J)hCD137 MAB-1 VL10
(SEQ ID NO:123)
；
(K)hCD137 MAB-1 VL11
(SEQ ID NO:125)
；
(L)hCD137 MAB-1 VL12
(SEQ ID NO:127)
；
(M)hCD137 MAB-1 VL13
(SEQ ID NO:128)
；
(N)hCD137 MAB-1 VL14
(SEQ ID NO:129)
；
(O)hCD137 MAB-1 VL15
(SEQ ID NO:131)
；
(P)hCD137 MAB-2 VL1
(SEQ ID NO:141
)；或
(Q)CD137 MAB-2 VL2
(SEQ ID NO:142
)。
本發明另外涉及所有這種PD-L1 x CD137
結合分子的實施方式，其中該分子是包含2條、3條、4條或5條多肽鏈的攜帶Fc區的雙特異性四價雙抗體，其中多肽鏈形成共價結合的複合物。
本發明另外涉及所有這種PD-L1 x CD137
結合分子的實施方式，其中該分子是攜帶Fc區的雙特異性三價分子，並且包含三條或四條多肽鏈，其中多肽鏈形成共價結合的複合物。
本發明另外涉及所有這種PD-L1 x CD137
結合分子的實施方式，其中該分子包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型的Fc區和任選地其中該分子進一步包含鉸鏈結構域。
本發明另外涉及所有這種PD-L1 x CD137
結合分子的實施方式，其中Fc區是包含減少變體Fc區對FcγR的親和力和/或增加血清半衰期的一種或多種氨基酸修飾的變體Fc區，更具體地，其中修飾包含選自由以下組成的組中的至少一個氨基酸取代：
(1) L234A、L235A；
(2) L234A和L235A；
(3) M252Y、M252Y和S254T；
(4) M252Y和T256E；
(5) M252Y、S254T和T256E；或
(6) K288D和H435K；
其中編號是如Kabat中的EU索引的編號。
本發明另外涉及所有這種PD-L1 x CD137
結合分子的實施方式，其中PD-L1 x CD137
結合分子包含：
(a)SEQ ID NO:178
、SEQ ID NO:179
、SEQ ID NO:176
和SEQ ID NO:177
；
(b)SEQ ID NO:175
、SEQ ID NO:166
、SEQ ID NO:176
和SEQ ID NO:177
；
(c)SEQ ID NO:169
、SEQ ID NO:170
、SEQ ID NO:173
和SEQ ID NO:174 ；
或
(d)SEQ ID NO:169
、SEQ ID NO:170
、SEQ ID NO:171
和SEQ ID NO:172
。
本發明另外涉及藥物組合物，其包含上述PD-L1-
結合分子中的任何一種或上述PD-L1 x CD137
結合分子中的任何一種和生理學上可接受的載體。
本發明另外涉及這種藥物組合物在治療與被抑制的免疫系統的存在相關或以被抑制的免疫系統的存在表徵的疾病或病況中的用途。
本發明另外涉及這種藥物組合物在治療與腫瘤抗原的表達相關或以腫瘤抗原的表達表徵的疾病或病況中的用途。
本發明另外涉及提高腫瘤靶向劑的活性的方法，所述方法包括施用與上述PD-L1-
結合分子或PD-L1 x CD137
結合分子的任何一種組合的腫瘤靶向劑。
本發明另外涉及這種方法的實施方式，其中腫瘤靶向劑是特異性結合腫瘤抗原的抗體、或是包含其腫瘤抗原結合部分的分子。
本發明另外涉及治療與被抑制的免疫系統相關的疾病或病況或以腫瘤抗原(TA)的表達表徵的疾病或病況的方法，所述方法包括向有需要的受試者施用上述PD-L1-
結合分子或PD-L1 x CD137
結合分子的任何一種。
本發明另外涉及所有這種方法的實施方式，其中與腫瘤抗原的表達相關或特徵在於腫瘤抗原的表達的疾病或病況是癌症，尤其其中癌症選自由以下組成的組：膀胱癌、乳腺癌、結腸直腸癌、血液癌、胃癌、成膠質細胞瘤、腎癌、肺癌、黑素瘤、成神經細胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、咽癌(pharyngeal cancer)、***癌、直腸癌、腎細胞癌、橫紋肌肉瘤和頭頸癌。
本發明涉及能夠結合至PD-L1的PD
-L1
-結合分子，如單特異性抗體和其表位結合片段，和能夠結合至PD-L1的表位和CD137的表位二者的多特異性結合分子(例如，雙特異性抗體、雙特異性雙抗體、BiTE、三價結合分子等)。本發明還涉及包含這種分子的藥物組合物。本發明還包括這種分子在治療疾病，特別地癌症或與被抑制的免疫系統的存在相關的或通過被抑制的免疫系統的存在表徵的疾病或病況中的用途。
I. 抗體和其他結合分子
抗體
是能夠通過位於免疫球蛋白分子的可變區域中的至少一個“表位結合位點
”特異性結合至分子如碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽等(“抗原”)的靶區域(“表位元”)的免疫球蛋白分子。如本文使用的，術語“抗體 (antibody)
”和“抗體 (antibodies)
”是指單克隆抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體、合成抗體、嵌合抗體、多克隆抗體、駱駝化抗體(camelized antiboes)、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、Fab片段、F(ab’)片段、二硫鍵連接的雙特異性Fv(sdFv)、胞內抗體和任意上述的表位結合片段。具體地，術語“抗體”包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，包含表位結合位點的分子。免疫球蛋白分子可以具有任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類別(例如，IgG1
、IgG2
、IgG3
、IgG4
、IgA1
和IgA2
)或亞類。抗體能夠“免疫特異性地結合
”至多肽或蛋白或非蛋白分子，這是由於在這類分子上存在特定的結構域或部分或構象(“表位
”)。如本文使用的，“抗體的表位結合片段
”意在表示能夠免疫特異性結合至表位的抗體的一部分。如本文使用的，這類術語涵蓋片段(如Fab、Fab'、F(ab')2
Fv)和單鏈(scFv)，以及雙抗體的表位元結合結構域。如本文使用的，如果抗體或其表位結合片段相對於可替選的表位與該表位更頻繁地、更迅速地、以更長的持續時間和/或以更大的親和力或親合力反應或締合，則該抗體或其表位結合片段被稱為“免疫特異性地
”結合至另一分子的區域(即，表位元)。通過閱讀該定義也可以理解，例如，免疫特異性地結合第一靶標的抗體或其表位結合片段可以或不可以特異性地或優先地結合至第二靶標。包含表位的分子可具有免疫原性的活性，使得其在動物中引發抗體產生響應；這種分子被稱為“抗原
”。天然抗體能夠結合至僅一個表位種類(即它們是 “單特異性
”)，但是它們可以結合該種類的多個拷貝(即，展現出“二價
”或“多價
”)。
術語“單克隆抗體
”是指同源的抗體群體，其中單克隆抗體包括涉及抗原的選擇性結合的氨基酸(天然存在的或非天然存在的)。單克隆抗體是高度特異性的、針對單個表位(或抗原位點)。術語“單克隆抗體”不僅涵蓋完整的單克隆抗體和全長單克隆抗體，而且也涵蓋其片段(如Fab、Fab'、F(ab')2
Fv)、單鏈(scFv)、其突變體、包含抗體部分的融合蛋白、人源化的單克隆抗體、嵌合單克隆抗體和包括結合抗原所需特異性和能力的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其它修飾構型。就抗體的來源或其製備的方式(例如，通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達、轉基因動物等)而言，其不旨在是限制性的。該術語包括完整的免疫球蛋白以及根據“抗體”的定義上面描述的片段等。製備單克隆抗體的方法是本領域已知的。可採用的一種方法是Kohler, G.等(1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity
,” Nature 256:495-497的方法或其改良。典型地，單克隆抗體在小鼠、大鼠或兔中開發。通過用免疫原性量的細胞、細胞提取物或包含期望表位的蛋白製劑免疫動物而產生抗體。可替選地，對於期望的致病表位是免疫特異性的現有的單克隆抗體和任意其它等效抗體可通過本領域中已知的任意方式進行測序並重組生產。在一個實施方式中，對這樣的抗體測序，然後將多核苷酸序列克隆到載體中用於表達或增殖。編碼感興趣的抗體的序列可在宿主細胞內保持在載體中，然後可擴增和冷凍宿主細胞，用於將來的使用。這類抗體的多核苷酸序列可用於遺傳操控，以產生本發明的單特異性或多特異性(例如，雙特異性、三特異性和四特異性)分子以及親和力優化的嵌合抗體、人源化抗體和/或犬源化(caninized)抗體，以改善抗體的親和力或其它特徵。
過去幾十年已經看出對抗體的治療潛力的關注的復蘇，並且抗體已經變成生物技術衍生的藥物的主導類別之一(Chan, C.E.等(2009) “The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases
,” Singapore Med. J. 50(7):663-666)。超過200種的基於抗體的藥物已經批准使用或在開發中。
A. 抗體的一般結構屬性
天然存在的免疫球蛋白(例如，IgG)的基本結構單元是由兩條較短“輕鏈
”與兩條較長的“重鏈
”複合組成的四聚物，並且通常表達為約150,000 Da的糖蛋白。每條鏈是包括包含“可變結構域
”的氨基端(“N- 端
”)部分和包含至少一個“恒定結構域
”的羧基端(“C- 端
”)部分。IgG輕鏈包括單個“輕鏈可變結構域
”(“VL
”)和單個“輕鏈恒定結構域
”(“CL
”)。因此，IgG分子的輕鏈的結構是n-VL-CL-c
(其中n和c分別代表多肽的N-端和C-端)。IgG重鏈包括單個“重鏈可變結構域
” (“VH
”)、三個“重鏈恒定結構域
” (“CH1
”、“CH2
”和“CH3
”)和位於CH1
和CH2
結構域之間的“鉸鏈
”區(“H
”)。因此，IgG重鏈的結構是n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c
(其中n和c分別代表多肽的N-端和C-端)。完整的、未修飾的抗體(例如，IgG抗體)結合抗原表位元的能力取決於可變結構域的存在和序列。
1. 恒定結構域 (a) 輕鏈恒定結構域
優選的CL結構域是人IgG CL κ結構域。示例性人CL κ結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:1
)：
RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC
可替選地，示例性CL結構域是人IgG CL λ結構域。示例性人CL λ結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:2
)：
QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP
TECS
(b) 重鏈CH1結構域
示例性CH1結構域是人IgG1 CH1結構域。示例性人IgG1 CH1結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:3
)：
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV
示例性CH1結構域是人IgG2 CH1結構域。示例性 人IgG2 CH1結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:4
)：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV
示例性CH1結構域是人IgG3 CH1結構域。示例性人IgG3 CH1結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:5
)：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YTCNVNHKPS NTKVDKRV
示例性CH1結構域是人IgG4 CH1結構域。示例性人IgG4 CH1結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:6
)：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV
(c) 重鏈鉸鏈區
示例性鉸鏈區是人IgG1鉸鏈區。示例性人IgG1 鉸鏈區的氨基酸序列是(SEQ ID NO:7
)：
EPKSCDKTHT CPPCP
另一個示例性鉸鏈區是人IgG2鉸鏈區。示例性人IgG2鉸鏈區的氨基酸序列是(SEQ ID NO:8
)：
ERKCCVECPP CP
另一個示例性鉸鏈區是人IgG3鉸鏈區。示例性人IgG3鉸鏈區的氨基酸序列是(SEQ ID NO:9
)：
ELKTPLGDTT HTCPRCPEPK SCDTPPPCPR CPEPKSCDTP PPCPRCPEPK SCDTPPPCPR CP
另一個示例性鉸鏈區是人IgG4鉸鏈區。示例性人IgG4鉸鏈區的氨基酸序列是(SEQ ID NO:10
)：
ESKYGPPCPS CP
如本文所述，IgG4鉸鏈區可以包含穩定的突變，如S228P取代(按照Kabat中規定的EU索引進行編號)。示例性穩定的IgG4鉸鏈區的氨基酸序列是(SEQ ID NO:11
)：
ESKYGPPCPP CP
(d) 重鏈CH2和CH3結構域
兩條重鏈的CH2和CH3結構域相互作用以形成被細胞的Fc 受體
識別的IgG抗體的“Fc 區
”，Fc 受體
包括但不限於Fc γ受體(FcγR)
。如本文使用的，使用術語“Fc 區
”來限定IgG重鏈的C-端區。Fc區的一部分(包括涵蓋完整的Fc區的部分)在本文是指 “Fc 結構域
”。如果Fc區的氨基酸序列相對於其他IgG同種型與該同種型最同源，則認為Fc區具有特定的IgG同種型、類別或亞類。除其已知的在診斷中的用途外，抗體還顯示可用作治療劑。
示例性人IgG1的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:12
)：
231 240 250 260 270 280
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSPG X
如通過Kabat中所示的EU索引所編號，其中X是賴氨酸(K)或不存在。
示例性人IgG2的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:13
)：
231 240 250 260 270 280
APPVA-GPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQFNSTF RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDISVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSPG X
如通過Kabat中所示的EU索引所編號，其中X
是賴氨酸(K)或不存在。
示例性人IgG3的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:14
)：
231 240 250 260 270 280
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFKWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQYNSTF RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NIFSCSVMHE
440 447
ALHNRFTQKS LSLSPG X
如通過Kabat中所示的EU索引所編號，其中X
是賴氨酸(K)或不存在。
示例性人IgG4的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:15
)：
231 240 250 260 270 280
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS
340 350 360 370 380
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSLG X
如通過Kabat中所示的EU索引所編號，其中X
是賴氨酸(K)或不存在。
貫穿本申請說明書，IgG重鏈的恒定區中的殘基的編號是按照Kabat等的Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，公共衛生署(Public Health Service), NH1, MD (1991) (“Kabat
”)中EU索引的編號，其通過引用明確地併入本文。術語“如 Kabat 中的 EU 索引
”指人IgG1 EU抗體的恒定結構域的編號。
在抗體恒定區內在許多不同位置(例如，Fc位置，包括但不限於通過Kabat中所示的EU索引所編號的位置270、272、312、315、356和358)已經觀察到多態性，並且因此在所展示的序列和現有技術中的序列之間可存在輕微差異。已經很好地表徵了人免疫球蛋白的多態形式。目前，18 Gm異型是已知的：G1m (1、2、3、17)或G1m (a、x、f、z)、G2m (23)或G2m (n)、G3m (5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28)或G3m (b1、c3、b3、b0、b3、b4、s、t、g1、c5、u、v、g5) (Lefranc等“The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis Of Structure, Function And Regulation.
” Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990)；Lefranc, G.等1979, Hum. Genet.: 50, 199-211)。具體地，考慮本發明的抗體可併入任何免疫球蛋白基因的任何同種異型(allotype)、異種型(isoallotype)或單體型(haplotype)，並且不限於本文提供的序列的同種異型、異種型或單體型。而且，在一些表達系統中，CH3結構域的C-端氨基酸殘基(上文粗體表示的)可被翻譯後去除。因此，在本發明的PD-L1 x CD137
結合分子中，CH3結構域的C-端殘基是任選的氨基酸殘基。具體地，通過本發明涵蓋的是沒有CH3結構域的C-端殘基的PD-L1 x CD137
結合分子。同樣具體地，本發明涵蓋的是包含CH3結構域的C-端賴氨酸殘基的這種構建體。
2. 可變結構域
IgG分子的可變結構域由三個“互補決定區
”(“CDR
”)以及稱為“框架區
”(“FR
”)的間插非-CDR區段組成，CDR包含抗體的將與表位接觸的氨基酸殘基，FR大體上保持CDR環(loop)的結構和確定CDR環的定位以允許這種接觸(儘管某些框架殘基也可以接觸表位)。因此，VL和VH結構域具有結構n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c
。CDR的氨基酸序列確定抗體是否將能夠結合至特定的表位。抗體輕鏈與抗體重鏈的相互作用，具體地，它們的VL和VH結構域的相互作用形成抗體的表位結合位點。
來自免疫球蛋白的成熟的重鏈和輕鏈的可變結構域的氨基酸是通過鏈中氨基酸的位置命名。Kabat (SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 第五版. 公共衛生署, NH1, MD (1991))描述了關於抗體的許多氨基酸序列、鑒定了每個亞組的氨基酸共有序列並且為每個氨基酸指定殘基編號，並且通過Kabat定義鑒定CDR和FR (應理解，通過Chothia, C. & Lesk, A. M.被定義((1987) “Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins
,” J. Mol. Biol. 196:901-917) 定義的CDRH
1提前五個殘基開始；在某些情況下，下文定義的抗體的CDRH
1結構域是如通過Chothia定義的CDRH
1)。Kabat的編號方案可通過參照保守氨基酸將考慮中的抗體與Kabat中的共有序列之一比對而擴展至不包括在其綱要中的抗體。用於指定殘基編號的該方法在本領結構域中已經變成標準化，並且易於鑒定在包括嵌合或人源化變體的不同抗體中在等同位置處的氨基酸。例如，在人抗體輕鏈的位置50處的氨基酸佔據與小鼠抗體輕鏈的位置50處的氨基酸等同的位置。因此，在VL和VH 結構域內在其CDR開始和結束的的位置被明確地定義並且可以通過檢測VL和VH結構域的序列確認(參見，例如Martin, C.R. (2010) “Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains
,” In: ANTIBODY ENGINEERING VOL. 2 (Kontermann, R. and Dübel, S. (eds.), Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 第3章 (第33-51頁))。
是(或可以用作)抗體輕鏈的第一、第二和第三CDR的多肽在本文中分別命名為：CDRL
1 結構域
、CDRL
2 結構域
和CDRL
3 結構域
。類似地，是(或可以用作)抗體重鏈的第一、第二和第三CDR的多肽在本文中分別命名為：CDRH
1 結構域
、CDRH
2 結構域
和CDRH
3 結構域
。因此，術語CDRL
1結構域、CDRL
2結構域、CDRL
3結構域、CDRH
1結構域、CDRH
2結構域和CDRH
3結構域涉及這樣的多肽：當其併入到蛋白中時，引起該蛋白能夠結合至特定表位，而無論這種蛋白是具有輕鏈和重鏈的抗體或是雙抗體或單鏈結合分子(例如，scFv、BiTe等)，或是另一類型蛋白。因此，如本文所使用的，術語“表位結合片段
”意指能夠免疫特異性地結合表位的分子的片段或部分。表位結合片段可包含抗體的VL或VH結構域，或抗體的任意1個、2個、3個、4個或5個CDR結構域，或者可包含抗體的全部6個CDR結構域，並且，儘管能夠免疫特異性地結合這種表位，但對不同於這種抗體的表位的這種表位可展示免疫特異性、親和力或選擇性。然而，優選地表位結合片段將包含這種抗體的全部6個CDR結構域。抗體的表位結合片段可為單個多肽鏈 (例如，scFv)，或可包括兩條或更多條多肽鏈，其各自具有氨基末端和羥基末端(例如，雙抗體、Fab片段、Fab2
片段等)。除非特別指出，否則本文所述的蛋白分子的結構域的順序是以“N- 端至 C- 端
”方向。
B. 抗體的人源化
本發明尤其涵蓋包含人源化抗體的VL和/或VH結構域的結合分子(包括抗體和雙抗體)。優選地，這種抗體是人源化抗體。單克隆抗體通常在如小鼠或兔的非人物種中進行製備。這種抗體的可變結構域和/或恒定結構域可被識別為免疫原，從而誘發針對它們的免疫應答。然而，這類分子可以通過引入一個或多個氨基酸取代被“人源化”以使得這類抗體更像由人產生的抗體，從而減少或消除它們的免疫原性。
術語“人源化
”抗體指通常使用重組技術製備的嵌合分子，其具有來自非人物種的免疫球蛋白的表位結合位點和剩餘的基於人免疫球蛋白的結構和/或序列的分子的免疫球蛋白結構。這種抗體的可變結構域的多核苷酸序列可用於遺傳操縱以產生這種衍生物並且改善這種抗體的親和力或其它特徵。人源化抗體的一般原則涉及保留抗體的表位元元結合部分的基本序列，同時用人抗體序列交換該抗體的非人剩餘部分。人源化單克隆抗體有四個常規步驟。這些步驟是：(1)確定起始抗體輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域的核苷酸和預測的氨基酸序列；(2)設計人源化抗體或犬源化抗體，即決定在人源化或犬源化期間使用哪個抗體框架區；(3)實際的人源化或犬源化方法論/技術；和(4)人源化抗體的轉染和表達。參見，例如美國專利號4,816,567、5,807,715、5,866,692和6,331,415。
已經描述了包含源自非人免疫球蛋白的表位結合位點的許多人源化抗體分子，包括具有齧齒動物可變結構域或修飾的齧齒動物可變結構域和與人恒定結構域融合的它們相關的互補決定區(CDR)的嵌合抗體(參見，例如Winter等(1991) “Man-made Antibodies
,” Nature 349:293-299；Lobuglio等(1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response
,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989)；Shaw等(1987) “Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen
,” J. Immunol. 138:4534-4538；和Brown等(1987) “Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody
,” Cancer Res. 47:3577-3583)。其它參考文獻描述了在與適當的人抗體恒定結構域融合之前移植到人支撐框架區(FR)中的齧齒動物CDR(參見，例如Riechmann, L.等(1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy
,” Nature 332:323-327；Verhoeyen, M.等(1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity
,” Science 239:1534-1536；和Jones等(1986) “Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse
,” Nature 321:522-525)。另一參考文獻描述了通過重組修飾的齧齒動物框架區支撐的齧齒動物CDR。參見，例如歐洲專利公開號519,596。這些“人源化
”分子被設計為使得對齧齒動物抗人抗體分子的不期望的免疫應答最小化，該不期望的免疫應答限制了這些部分在人接受者中治療應用的持續時間和效力。也可使用人源化抗體的其它方法，其公開在以下文獻中：Daugherty等(1991) “Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins
,” Nucl. Acids Res. 19:2471-2476和美國專利號6,180,377、6,054,297、5,997,867和5,866,692。在一些實施方式中，人源化抗體保留全部的CDR序列(例如，包含來自小鼠抗體的全部六個CDR的人源化小鼠抗體)。在其他實施方式中，人源化抗體相對於原抗體具有序列不同的一個或多個(一個、兩個、三個、四個、五個或六個)CDR。
C. 雙特異性抗體、多特異性雙抗體和DART®
雙抗體
如上所述，天然抗體能夠結合至僅一種表位種類，儘管它們可以結合其種類的多個拷貝。本領域已經認識到生產雙特異性抗體的需要，並且已經開發了多種重組雙特異性抗體形式來生產這種雙特異性抗體(參見，例如PCT公開號WO 2008/003116、WO 2009/132876、WO 2008/003103、WO 2007/146968、WO 2009/018386、WO 2012/009544、WO 2013/070565)。大多數這類方法使用連接體肽以將另外的結合結構域(例如，scFv、VL、VH等)與抗體核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)融合或融合到抗體核心內，或者以使多個抗體結合部分(例如，兩個Fab片段或scFv) 彼此融合。可替選的形式使用連接體肽以將結合蛋白(例如，scFv、VL、VH等)與二聚結構域如CH2-CH3結構域或可替選的多肽融合(WO 2005/070966、WO 2006/107786A、WO 2006/107617A、WO 2007/046893)。典型地，這種方法涉及妥協(compromises)和權衡(trade-offs)。例如，PCT公開號WO 2013/174873、WO 2011/133886和WO 2010/136172公開了連接體的使用可能引起治療設置中的問題並且教導了這樣的三特異性抗體：其中CL和CH1結構域從各自天然位置轉換以及VL和VH結構域已經被多樣化(WO 2008/027236、WO 2010/108127)，以允許它們結合至多於一個的抗原。從而，在這些檔中公開的分子以結合特異性換取結合另外的抗原種類的能力。PCT公開號WO 2013/163427和WO 2013/119903公開了修飾CH2結構域以包含包括結合結構域的融合蛋白加合物(Adduct)。檔指出CH2結構域可能在介導效應子功能中僅起到最小的作用。PCT公開號WO 2010/028797、WO2010028796和WO 2010/028795公開了其Fc區已經用另外的VL和VH結構替換以形成三價結合分子的重組抗體。PCT公開號WO 2003/025018和WO2003012069公開其單個鏈包含scFv結構域的重組雙抗體。PCT公開號WO 2013/006544公開了多價Fab分子，其被合成為單個多肽鏈且然後經歷蛋白水解以產生異源二聚體結構。因此，在這些檔中公開的分子以介導效應子功能的能力的全部或一些換取結合另外的抗原種類的能力。PCT公開號WO 2014/022540、WO 2013/003652、WO 2012/162583、WO 2012/156430、WO 2011/086091、WO 2008/024188、WO 2007/024715、WO 2007/075270、WO 1998/002463、WO 1992/022583和WO 1991/003493公開了將另外的結合結構域或官能團添加至抗體或抗體部分(例如，添加雙抗體至抗體的輕鏈、或添加另外的VL和VH結構域至抗體的輕鏈和重鏈、或添加異源融合蛋白或將多個Fab結構域彼此連接)。因此，在這些檔中公開的分子以天然的抗體結構換取結合另外的抗原種類的能力。
本領域還已經指出在能夠結合兩個或更多個不同表位種類方面(即，除了二價或多價外，還展示出雙特異性或多特異性)產生不同於天然抗體的雙抗體
的能力(參見，例如Holliger 等 (1993) “’Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,
” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; US 2004/0058400 (Hollinger 等); US 2004/0220388 (Mertens 等)；Alt 等 (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94；Lu, D. 等 (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity
,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672; WO 02/02781 (Mertens 等)；Olafsen, T. 等 (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications
,” Protein Eng Des Sel. 17(1):21-27；Wu, A. 等 (2001) “Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange
,” Protein Engineering 14(2):1025-1033; Asano 等 (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain
,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992；Takemura, S. 等 (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,
” Protein Eng. 13(8):583-588；Baeuerle, P.A. 等 (2009) “Bispecific T cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy
,” Cancer Res. 69(12):4941-4944)。
提供非單特異性“雙抗體
”對抗體帶來了顯著的優勢：共連接和共定位表達不同表位的細胞的能力。因此，雙特異性雙抗體具有包括治療和免疫診斷的廣泛的應用。雙特異性使雙抗體在各種應用中的設計和工程化允許極大的靈活性，從而提供增強的對多聚體抗原的親和力、不同抗原的交聯、以及依賴於靶抗原二者的存在對特定細胞類型的定向靶向。由於它們的二價、低解離速率和從迴圈中的快速清除(對於小尺寸的雙抗體，等於或低於~50 kDa)，本領域已知的雙抗體分子也已顯示在腫瘤成像領域的特殊用途(Fitzgerald等(1997)“Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,”
Protein Eng. 10:1221)。
然而，這種非單特異性雙抗體的形成需要成功組裝兩個或更多個獨特的且不同的多肽 (即，這種形成需要通過不同多肽鏈種類的異源二聚化來形成雙抗體)。該事實與單特異性雙抗體相反，單特異性雙抗體是通過相同多肽鏈的同源二聚化形成。因為必須提供至少兩個不同的多肽(即，兩個多肽種類)以便形成非單特異性雙抗體，並且因為這類多肽的同源二聚化導致不活躍的分子(Takemura, S. 等 (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,
” Protein Eng. 13(8):583-588)，故這類多肽的產生必須以解決相同種類的多肽之間的共價鍵合的方式完成(即，以使它們同源二聚化最小化) (Takemura, S. 等 (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,
” Protein Eng. 13(8):583-588)。因此，現有技術已教導這類多肽的非共價締合(參見，例如Olafsen 等 (2004)“Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,”
Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27；Asano 等 (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,
” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992；Takemura, S. 等 (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,
” Protein Eng. 13(8):583-588；Lu, D. 等(
2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity
,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672)。
然而，本領域已經認識到包括非共價締合的多肽的雙特異性雙抗體是不穩定的並且易於解離為非功能性的單個多肽鏈單體(參見，例如Lu, D. 等(
2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like
BispecificAntibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity
,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672)。
面對這一挑戰，本領域已經成功開發出被稱作DART®
雙抗體的穩定的、共價鍵合的異源二聚化非單特異性雙抗體，參見，例如Chichili, G.R. 等 (2015) “A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates
,” Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82；Johnson, S. 等 (2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-Cell Depletion
,” J. Molec. Biol. 399(3):436-449；Veri, M.C. 等 (2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIB (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold
,” Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943；Moore, P.A. 等 (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T cell Killing Of B-Cell Lymphoma
,” Blood 117(17):4542-4551；美國專利號8,044,180、8,133,982、8,669,349、8,778,339、8,795,667、8,802,091、9,587,021和PCT公開號WO 2006/113665、WO 2008/157379、WO 2010/027797、WO 2010/080538、WO 2011/109400、 WO 2012/018687、WO 2012/162067、WO 2012/162068、WO 2014/159940、WO 2015/021089、WO 2015/026892和WO 2015/026894)。這種雙抗體包含兩條或更多條共價複合的多肽並且涉及將一個或多個半胱氨酸殘基工程化進入每個採用的多肽種類中。例如，已經顯示半胱氨酸殘基添加至這種構建體的C-端以允許多肽鏈之間的二硫鍵鍵合，從而穩定化所得的異源二聚體且不受二價的分子的結合特徵的干擾。
最簡單的DART®
雙抗體包括兩條多肽鏈，每條多肽鏈包括三個結構域(圖 1
)。第一多肽鏈包括：(i)包含第一免疫球蛋白的輕鏈可變結構域的結合區的結構域(VL1)，(ii)包含第二免疫球蛋白的重鏈可變結構域的結合區的第二結構域(VH2)，和(iii)用來促進與第二多肽鏈的異源二聚化並且將雙抗體的第一多肽鏈共價結合至第二多肽鏈的第三結構域(“異源二聚體促進結構域
”)。第二多肽鏈包含互補的第一結構域(VL2結構域)、互補的第二結構域(VH1結構域)和與第一多肽鏈的第三結構域複合以促進異源二聚化和與第一多肽鏈的共價鍵合的第三結構域(“異源二聚體促進結構域
”)。這種分子是穩定的、強效的並且具有同時結合兩個或更多個抗原的能力。在一個實施方式中，第一多肽鏈和第二多肽鏈的第三結構域各自包含半胱氨酸(“©
”)殘基，其用於通過二硫鍵將多肽結合在一起。多肽鏈中的一條或兩條的第三結構域可另外地具有CH2-CH3結構域的序列，以使雙抗體多肽的複合形成能夠結合至細胞(如B淋巴細胞、樹突細胞、天然殺傷細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞和肥大細胞)的Fc受體的Fc結構域。已經描述了這種分子的許多變型(參見，例如和PCT公開號WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538、WO 2006/113665)並且在本文提供。
儘管有這樣的成功，但通過仔細考慮和設置在多肽鏈中採用的結構域，可以進一步改善為治療用途優化的穩定的、功能性異源二聚化的、非單特異性雙抗體的製備。因此，本發明涉及提供特異性的多肽，其尤其設計成通過共價鍵合形成能夠同時結合PD-L1的表位和CD137的表位的穩定的和在治療上有用的異源二聚化雙抗體和異源二聚化Fc雙抗體。
II. 本發明優選的PD-L1 x CD137結合分子的成分
本發明的PD-L1 x CD137
結合分子包括多肽，並且可以包括兩條、三條、四條或多於四條的多肽鏈。如本文使用的，術語“包括 (composed of)
”意指開放式的，使得包括兩條多肽鏈的本發明的PD-L1 x CD137
結合分子可以具有另外的多肽鏈。這種鏈可以與結合分子的另一條多肽鏈具有相同的序列，或可以與結合分子的任何其他多肽鏈的序列不同。
A. 優選的“連接體”肽
本發明的PD-L1 x CD137
結合分子的多肽包括在“連接體”肽之前、在“連接體”肽之後和/或彼此連接的“連接體”肽如連接體 1 、連接體 2
、連接體 3
等的結構域。根據本文提供的教導，儘管本發明使用某些優選的“連接體”肽，可替選的連接體可以易於被鑒定和應用以獲得PD-L1 x CD137
結合分子。
最優選地，分隔多肽鏈的這種VL和VH 結構域的連接體 1
的長度被選擇以基本上或完全阻止這種VL和VH結構域彼此結合(例如，長度為12個或更少的氨基酸殘基)。因此，第一多肽鏈的VL1
和VH2
結構域基本上或完全不能夠彼此結合，並且不形成能夠基本上結合至第一或第二抗原的表位結合位點。同樣地，第二多肽鏈的VL2
和VH1
結構域基本上或完全不能夠彼此結合，並且不形成能夠基本上結合至第一或第二抗原的表位結合位點。優選的間插間隔子肽(連接體 1
)具有序列(SEQ ID NO:16
)：GGGSGGGG，其太短以至於不允許相同多肽鏈的VL和VH結構域複合在一起(與較長的間插間隔子肽相反，其應用以產生scFv分子(例如，GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:17
))。
連接體 2
的目的是使多肽鏈的VH結構域與該多肽鏈的任選存在的異源二聚體-促進結構域隔開。各種連接體中的任何一個可以被用於連接體 2
的目的。這種連接體 2
的優選的序列具有氨基酸序列：GGCGGG (SEQ ID NO:18
)，其擁有可以用於通過二硫鍵使第一和第二多肽鏈彼此共價鍵合的半胱氨酸殘基；或ASTKG (SEQ ID NO:19
)，其源自IgG CH1 結構域。因為連接體 2
ASTKG (SEQ ID NO:19
)不擁有這種半胱氨酸，故這種連接體 2
的用途優選地與含半胱氨酸的異源二聚體-促進結構域如SEQ ID NO:38 的
E-螺旋或SEQ ID NO:39 的
K-螺旋的用途相關(參見以下)。
連接體 3
的一個目的是使多肽鏈的異源二聚體-促進結構域與該多肽鏈的Fc結構域隔開。第二目的是提供含半胱氨酸的多肽結構域。各種連接體中的任何一個可用於連接體 3
的目的。這種連接體 3
的優選序列具有氨基酸序列：DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:20
)。對於連接體 3 的
另一個優選的序列具有氨基酸序列：GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:21
)。
連接體 4
的目的是使Fc區的CH2-CH3結構域(“Fc 結構域
”) 的C-端與VL結構域N-端隔開。各種連接體中的任何一個可用於連接體 4
的目的。對於這種連接體 4 的
優選序列具有氨基酸序列：APSSS (SEQ ID NO:22
)或氨基酸序列APSSSPME (SEQ ID NO:23
)或氨基酸序列GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:24
)。
本發明的攜帶Fc區的分子可包括另外的/可替選的間插間隔子肽(連接體)，通常這種連接體將併入異源二聚體-促進結構域(例如，E-螺旋或K-螺旋)和CH2-CH3結構域之間和/或併入CH2-CH3結構域和可變結構域(即，VH或VL)之間。典型地，另外的連接體將包括3-20個氨基酸殘基且可任選地包含IgG鉸鏈區的全部或部分(優選地IgG鉸鏈區的含半胱氨酸的部分)。可用於本發明的雙特異性攜帶Fc區的雙抗體分子中的連接體包括：GGC、GGG、ASTKG (SEQ ID NO:19
)、DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:20
)、APSSS (SEQ ID NO:22
)、APSSSPME (SEQ ID NO:23
)、GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:24
)、LGGGSG (SEQ ID NO:25
)、GGGS (SEQ ID NO:26
)、LEPKSS (SEQ ID NO:27
)、VEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO:28
)、LEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO:29
)。為易於克隆，LEPKSS (SEQ ID NO:27
)可代替GGG或GGC使用。另外地，氨基酸GGG或LEPKSS (SEQ ID NO:27
) 可以緊隨DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:20)
之後以形成替選的連接體：GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:21
)和LEPKSSDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:30
)。本發明的雙特異性攜帶Fc區的分子可併入IgG鉸鏈區，如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體的IgG鉸鏈區，或其部分。
B. 優選的異源二聚體-促進結構域
如上所述，本發明的PD-L1 x CD137
結合分子的形成涉及兩條或更多條不同的多肽鏈的組裝(即，異源二聚化)。第一多肽鏈和第二多肽鏈的異源二聚體的形成可以通過包括“異源二聚體 - 促進結構域
”驅動。異源二聚體-促進結構域可以為一條多肽鏈上的IgG鉸鏈區的結構域(或衍生自鉸鏈區的多肽，如，例如GVEPKSC (SEQ ID NO:31
)、VEPKSC (SEQ ID NO:32
)或AEPKSC (SEQ ID NO:33
))，和另一條多肽鏈上的CL結構域(或衍生自CL 結構域的多肽，如，例如GFNRGEC (SEQ ID NO:34
)或FNRGEC (SEQ ID NO:35
)) (US2007/0004909)。
然而，更優選地，本發明的異源二聚體-促進結構域將包括具有相反電荷的串聯重複的螺旋結構域，例如“E-螺旋”螺旋形的結構域(SEQ ID NO:36
： E
VAAL E
K- E
VAAL E
K- E
VAAL E
K- E
VAAL E
K)，它們的谷氨酸殘基在pH 7時將形成負電荷，同時，其他的異源二聚體-促進結構域將包括四個串聯“K-螺旋”結構域(SEQ ID NO:37
: K
VAAL K
E- K
VAAL K
E- K
VAAL K
E- K
VAAL K
E)，它們的賴氨酸殘基在pH 7時形成正電荷。這種帶電的結構域的存在促使第一多肽和第二多肽之間的締合，從而促進異源二聚化。在另一個優選的實施方式中，利用這樣的異源二聚體-促進結構域，其中SEQ ID NO:36
的四個串聯“E-螺旋”螺旋形的結構域中的一個已被修飾為包含半胱氨酸殘基： E
VAA C E
K- E
VAAL E
K- E
VAAL E
K- E
VAAL E
K (SEQ ID NO:38
)。同樣地，在另一個優選的實施方式中，利用這樣的異源二聚體-促進結構域，其中SEQ ID NO:37
的四個串聯“K-螺旋”螺旋形的結構域中的一個已經被修飾為包含半胱氨酸殘基： K
VAA C K
E- K
VAAL K
E- K
VAAL K
E- K
VAAL K
E (SEQ ID NO:39
)。
C. 多肽鏈的共價鍵合
本發明的PD-L1 x CD137
結合分子被工程化，以便成對的其多肽鏈通過沿著其長度定位的一個或多個半胱氨酸殘基彼此共價結合來產生共價締合的分子複合物中。這種半胱氨酸殘基可以被引入到使多肽的VL和VH結構域隔開的間插連接體中。可替選地，連接體 2
或連接體 3
、或可替選的連接體可包含半胱氨酸殘基。最優選地，含螺旋的異源二聚體-促進結構域的一個或多個螺旋結構域將包含氨基酸取代，其併入如在SEQ ID NO:38
或SEQ ID NO:39
中的半胱氨酸殘基。
D. 優選的Fc結構域
本發明的攜帶Fc區的PD-L1 x CD137
結合分子的Fc結構域可包含完整的Fc區(例如，完整的IgG Fc區)或僅完整的Fc區的片段。因此，本發明的攜帶Fc區的PD-L1 x CD137
結合分子的Fc結構域可包括完整的Fc區的CH2結構域的部分或全部和/或CH3結構域的部分或全部，或可包含變體CH2和/或變體CH3序列(其可包括，例如相對於完整的Fc區的CH2或CH3結構域的一個或多個***和/或一個或多個缺失)。本發明的雙特異性Fc雙抗體的Fc結構域可包含非Fc多肽部分、或可包含非天然完整的Fc區的部分、或包含CH2和/或CH3結構域的非天然存在的取向(如，例如兩個CH2 結構域或兩個CH3結構域、或在N-端至C-端方向上與CH2 結構域連接的CH3結構域等)。
雖然，本發明的攜帶Fc區的PD-L1 x CD137
結合分子的Fc結構域可包含天然存在的Fc結構域的氨基酸序列，優選地形成這種Fc結構域的CH2-CH3結構域包含一個或多個取代，使得所得的Fc結構域展現出與FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)降低的(例如，少於如果具有含天然存在的Fc區的氨基酸序列的Fc結構域的這種分子所呈現的結合的50%、少於40%、少於30%、少於20%或少於10%)的結合，或基本上無可檢測到的結合(相對於通過野生型Fc區展現出的結合)。能夠介導這種改變的結合的Fc變體和突變體形式在本領域是眾所周知的，並且包括在選自由234、235、265和297組成的組的一個或多個位置處的氨基酸取代，其中所述編號是如在Kabat中EU索引的編號(參見，例如美國專利號5,624,821，通過參考併入本文)。在一個實施方式中，本發明的攜帶Fc區的分子的第一和/或第三多肽鏈的CH2-CH3結構域包括取代：L234A、L235A、D265A、N297Q和N297G中的任何1個、2個、3個或4個。可替選地，利用天然存在的Fc區的CH2-CH3結構域，其固有地展現出與FcγRIIIA (CD16a)減少的結合(或基本上沒有結合)和/或減少的效應子功能(相對於由野生型IgG1 Fc區(SEQ ID NO:12
)呈現的結合和效應子功能)。在具體的實施方式中，本發明的攜帶Fc區的分子包含IgG2 Fc區 (SEQ ID NO:13
)或IgG4 Fc區 (SEQ ID:NO:15
)。當利用IgG4 Fc區時，本發明也涵蓋引入穩定的突變，如上面所述的鉸鏈區 S228P取代(參見，例如，SEQ ID NO:11
)。
在優選的實施方式中，本發明攜帶Fc區的PD-L1 x CD137
結合分子採用的CH2-CH3結構域包括在位置234處用丙氨酸的取代和在位置235處用丙氨酸的取代，其中所述編號是如在Kabat中EU索引的編號 (SEQ ID NO:40
)：
APE AA
GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X
其中，X是賴氨酸(K)或不存在。
包含Fc區的蛋白的血清半衰期可以通過增加Fc區對FcRn的結合親和力而增加。如本文使用的術語“半衰期”指分子的藥代動力學的特性，其是分子施用後分子的平均存活時間的度量。半衰期可表達為從受試者(例如，人患者或其他哺乳動物)的身體或其特定的部位(compartment)中去除已知量的分子的百分之五十(50%)所需的時間，例如，在血清中測量的，即迴圈半衰期，或在其他組織中測量。通常，半衰期的增加導致在對施用分子的迴圈中平均停留時間(MRT)的增加。
在一些實施方式中，本發明的攜帶Fc區的PD-L1 x CD137
結合分子包含變體Fc區，其中相對於野生型Fc區，所述變體Fc區包含至少一個氨基酸修飾，使得所述分子具有增加的半衰期(相對於包含野生型Fc區的分子)。在一些實施方式中，本發明的攜帶Fc區的PD-L1 x CD137
結合分子包含變體IgG Fc區，其中所述變體Fc區包含半衰期延長的氨基酸取代。在本領域已知能夠增加攜帶Fc區的分子的半衰期的許多氨基酸取代，參見例如在美國專利號6,277,375、7,083,784、7,217,797、8,088,376；和PCT公開號WO 98/23289、WO 2009/058492和WO 2010/033279中描述的氨基酸取代，其通過引用整體併入本文。具有提高半衰期的攜帶Fc區的PD-L1 x CD137
結合分子可包含選自：T250Q、M252Y、S254T、T256E、K288D、T307Q、V308P、A378V、M428L、N434A、H435K和Y436I中的兩個或更多個取代，其中所述編號是如在Kabat中EU索引的編號。
具體地，採用的CH2-CH3結構域可包含以下取代：
(A) M252Y、S254T和T256E；
(B) M252Y和S254T；
(C) M252Y和T256E；
(D) T250Q和M428L；
(E) T307Q和N434A；
(F) A378V和N434A；
(G) N434A和Y436I；
(H) V308P和N434A；或
(I) K288D和H435K，
其中所述編號是如在Kabat中EU索引的編號。
對於CH2和CH3結構域的優選序列包含三個氨基酸取代：M252Y/S254T/T256E (“YTE取代”)，其顯著地提高血清半衰期 (Dall’Acqua, W.F. 等 (2006) “Properties of Human IgGs Engineered for Enhanced Binding to the Neonatal Fc Receptor (FcRn)
,” J. Biol. Chem. 281(33):23514-23524)，如在SEQ ID NO:41
或SEQ ID NO:42
中，其為IgG1 CH2-CH3結構域的變體，或如在SEQ ID NO:43
中，其為IgG4 CH2-CH3結構域的變體：SEQ ID NO:41:
APELLGGPSV FLFPPKPKDT L Y
I T
R E
PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X
其中，X是賴氨酸(K)或不存在。SEQ ID NO:42:
APE AA
GGPSV FLFPPKPKDT L Y
I T
R E
PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X
其中，X是賴氨酸(K)或不存在。SEQ ID NO:43:
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT L Y
I T
R E
PEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG X
其中，X是賴氨酸(K)或不存在。
本發明也涵蓋包含變體Fc結構域的攜帶Fc區的PD-L1 x CD137
結合分子，其展現出改變的效應子功能、改變的血清半衰期、改變的穩定性、改變的對細胞酶的敏感性、或改變的效應子功能，如在NK依賴性或巨噬細胞依賴性測試中測定的等。本領域已知被鑒定為改變效應子功能的Fc結構域修飾，其包括增加與啟動的受體結合的修飾(例如，FcγRIIA (CD16A)和減少與抑制性受體結合的修飾(例如，FcγRIIB (CD32B) (參見，例如，Stavenhagen, J.B. 等 (2007) “Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors
,” Cancer Res. 57(18):8882-8890)。具有與CD32B的減少結合和/或與CD16A的增加結合的人IgG1 Fc結構域的示例性變體包含F243L、R292P、Y300L、V305I或P296L取代。這些氨基酸取代可以任何組合存在於人IgG1 Fc結構域中。在一個實施方式中，人IgG1 Fc結構域變體包含F243L、R292P和Y300L取代，其中所述編號是如在Kabat中EU索引的編號。在另一個實施方式中，人IgG1 Fc結構域變體包含F243L、R292P、Y300L、V305I和P296L取代，其中所述編號是如在Kabat中EU索引的編號。
本發明的PD-L1 x CD137
結合分子的CH2和/或CH3結構域在序列上不需要是一致的，並且有利地被修飾以促進兩條攜帶CH2-CH3的多肽鏈之間的異源二聚化。例如，氨基酸取代(優選地，用包含形成“ 杵 (knob) ”
的龐大側基的氨基酸取代，例如色氨酸取代)可被引入到CH2或CH3結構域中，使得空間干擾將防止與類似突變的結構域的相互作用，並且將迫使突變的結構域與互補的或適應性的突變已經被工程化到其中的結構域、即“ 臼 (hole) ”
(例如，用甘氨酸取代)配對。這樣的突變組可被工程化進入任意對的多肽中，其包含雙特異性攜帶Fc區的雙抗體分子，並且進一步被工程化進入所述對的多肽鏈的任意部分中。相對於同源二聚化，支持異源二聚化的蛋白工程化方法是本領域眾所周知的，特別是關於免疫球蛋白樣的分子的工程化方面，並且涵蓋在本文中(參見，例如，Ridgway 等 (1996)“‘Knobs-Into-Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,”
Protein Engr. 9:617-621, Atwell 等 (1997)“Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,”
J. Mol. Biol. 270: 26-35, 和Xie 等 (2005)“A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,”
J. Immunol. Methods 296:95-101；各個檔在此通過引用以其全部內容併入本文)。在一個實施方式中，杵被工程化進入第一多肽鏈的CH2-CH3結構域中並且臼被工程化進入第三多肽鏈的CH2-CH3結構域中。因此，杵將有助於通過它們的CH2和/或CH3結構域而阻止第一多肽鏈的兩個分子同源二聚化。由於該實施方式的第三多肽鏈優選地包含臼取代，故其將具有與第一多肽鏈異源二聚化的能力以及與它本身同源二聚化的能力(然而，這種同源二聚化不形成擁有表位結合位點的分子)。優選的杵通過修飾天然的IgG Fc結構域以包含修飾T366W而形成。優選的臼通過修飾天然的IgG Fc結構域以包含修飾T366S、L368A和Y407V而形成。為了有助於從包含第一和第三多肽鏈的異源二聚體的最終的雙特異性的攜帶Fc區的雙抗體純化第三多肽鏈同源二聚體，第三多肽鏈的CH2和CH3結構域的蛋白A結合位點優選地通過在位置435處的氨基酸取代(H435R)而突變。從而，第三多肽鏈同源二聚體將不會結合至蛋白A，然而，適當地組裝的雙特異性的攜帶Fc區的雙抗體將通過在第一多肽鏈上的蛋白A結合位點保持其結合蛋白A的能力。
SEQ ID NO:44
、SEQ ID NO:45
和SEQ ID NO:46
提供了可以用在本發明的PD-L1 x CD137
結合分子中的“ 攜帶杵
”的CH2和CH3結構域的示例性優選的序列：SEQ ID NO:44
:
APE AA
GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL W
C L
VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL Y
SKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHN H
YTQKS LSLSPG X
其中X是賴氨酸(K)或不存在，SEQ ID NO:45
:
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT L Y
I T
R E
PEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSL W
C L
VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHN H
YTQKS LSLSLG X
其中X是賴氨酸(K)或不存在，SEQ ID NO:46
:
APE AA
GGPSV FLFPPKPKDT L Y
I T
R E
PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL W
C L
VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHN H
YTQKS LSLSPG X
其中X是賴氨酸(K)或不存在。
SEQ ID NO:47
、SEQ ID NO:48
和SEQ ID NO:49
提供了可以用在本發明的PD-L1 x CD137
結合分子中的“ 攜帶臼的 ”
CH2和CH3結構域的示例性優選的序列：SEQ ID NO:47
:
APE AA
GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL S
C A
VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL V
SKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHN R
YTQKS LSLSPG X
其中X是賴氨酸(K)或不存在，SEQ ID NO:48
:
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT L Y
I T
R E
PEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSL S
CA V
K GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL V
SRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHN R
YTQKS LSLSLG X
其中X是賴氨酸(K)或不存在，SEQ ID NO:49
:
APE AA
GGPSV FLFPPKPKDT L Y
I T
R E
PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL S
C A
VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL V
SKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHN R
YTQKS LSLSPG X
其中X是賴氨酸(K)或不存在。
如將注意到，SEQ ID NO:45
和48
的CH2-CH3結構域是IgG4結構域，而SEQ ID NO:44 、 46 、 47
和49
的CH2-CH3結構域是IgG1結構域。SEQ ID NO:44 、 46 、 47
和49
包括在位置234處用丙氨酸的取代和在位置235處用丙氨酸的取代，因此形成呈現出對於FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)的減少的結合(或基本上沒有結合)的Fc結構域(相對於通過野生型Fc區(SEQ ID NO:12
) 呈現的結合)。而且，本發明特別地涵蓋的是缺乏上文指示的C-端賴氨酸殘基的PD-L1 x CD137
結合分子構建體。
在上述的實施方式中，第一多肽鏈將具有“攜帶杵的”CH2-CH3序列，如SEQ ID NO:44
的序列。然而，將意識到，“攜帶臼的”CH2-CH3結構域(例如，SEQ ID NO:47
)可以在第一多肽鏈中採用，在這種情況下，“攜帶杵的”CH2-CH3結構域(例如，SEQ ID NO:44
)可以在第三多肽鏈中採用。
E. 白蛋白結合結構域
如在WO 2012/018687中公開的，為了改善雙抗體的體內藥代動力學的特性，雙抗體可被修飾以在雙抗體的一個或多個末端包含血清結合蛋白的多肽部分。這種考慮也可適用於本發明的三特異性結合分子。最優選地，當血清結合蛋白的多肽部分被期望併入本發明的三特異性結合分子中時，這種多肽部分將被安裝在三特異性結合分子的多肽鏈之一的C-端。
白蛋白是在血漿中最豐富的蛋白，並且在人中具有19天的半衰期。白蛋白擁有數個小分子結合位點，其允許白蛋白與其他蛋白非共價結合從而延長了它們的血清半衰期。鏈球菌(Streptococcus)菌株G148的蛋白G的白蛋白結合結構域3(ABD3)由形成穩定的三螺旋束的46個氨基酸殘基組成並且具有廣泛的白蛋白結合特異性(Johansson, M.U. 等 (2002) “Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Module
s,” J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120)。從而，用於改善雙抗體的體內藥代動力學特性的血清結合蛋白的特別優選的多肽部分是來自鏈球菌蛋白G的白蛋白結合結構域(ABD)，並且更優選地是鏈球菌菌株G148的蛋白G的白蛋白結合結構域3 (ABD3) (SEQ ID NO:50
):
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLINNAKT VEGVKALIDE ILAALP。
如在WO 2012/162068中公開的(通過引用併入本文)，SEQ ID NO:50
的“去免疫
”變體具有減弱或消除MHC II類結合的能力。基於組合的突變結果，下述的取代組合被認為是用於形成這種去免疫白蛋白-結合結構域的優選的取代：N66S/T70S+V71A、N66S/T70S+D79A、L64A/I65A/V71A+N66S、L64A/I65A/V71A+N66D、L64A/I65A/V71A+N66E、L64A/I65A/D79A+N66S、L64A/I65A/D79A+N66D、L64A/I65A/D79A+N66E或N66D/T70S/V71A。具有減弱或消除MHC II類結合的能力的另外的變體ABD擁有修飾L64A、I65A和D79A，或修飾N66S、T70S和D79A。具有SEQ ID NO:51 、 52 、 53 或 180
的氨基酸序列的變體去免疫ABD是特別優選的，因為這種去免疫白蛋白結合結構域展現出基本上野生型的結合，同時提供減弱的MHC II類結合：SEQ ID NO:51
:
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLI D 66
NAK S 70 A 71
EGVKALIDE ILAALPSEQ ID NO:52
:
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKN A 64 A 65
NNAKT VEGVKALI A 79
E ILAALPSEQ ID NO:53
:
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLI S 66
NAK S 70
VEGVKALI A 79
E ILAALPSEQ ID NO:180
:
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKN A 64 A 65
NNAKT A 71
EGVKALIDE ILAALP
儘管這種白蛋白-結合結構域可併入到本發明的三特異性結合分子的任何多肽鏈中，但優選地將這種結構域定位在第一或第三多肽鏈的E螺旋(或K螺旋)結構域的C-端(通過間插在E-螺旋(或K-螺旋)結構域和白蛋白結合結構域(其為優選地去免疫白蛋白結合結構域)之間的連接體)。對於這種連接體優選的序列是SEQ ID NO:26
: GGGS。
III. 本發明的優選的PD-L1 x CD137結合分子的結構
如在圖 3A- 圖 3E
中提供的，本發明的雙抗體可包含四條不同的鏈。這種雙抗體的第一和第三多肽鏈包含三個結構域：(i)含VL1的結構域、(ii)含VH2的結構域、(iii)異源二聚體-促進結構域和(iv)含CH2-CH3序列的結構域。第二和第四多肽鏈包含：(i)含VL2的結構域、(ii)含VH1的結構域和(iii)異源二聚體-促進結構域，其中異源二聚體-促進結構域促進第一/第三多肽鏈與第二/第四多肽鏈的二聚化。第三和第四多肽鏈的VL和/或VH結構域和第一和第二多肽鏈的VL和/或VH結構域可以是相同或不同的，以便允許單特異性的、雙特異性的或四特異性的四價結合。符號“VL3
”和“VH3
”分別表示結合這種雙抗體的“第三”表位元的可變輕鏈結構域和可變重鏈結構域。類似地，符號“VL4
”和“VH4
” 分別表示結合這種雙抗體的“第四”表位元的可變輕鏈結構域和可變重鏈結構域。本發明的代表性四鏈攜帶Fc區的雙抗體的多肽鏈的一般結構提供在表 1
中：
HPD = 異源二聚體-促進結構域
| 表1 | ||
| 雙特異性 | 第二鏈 | NH2 -VL2-VH1-HPD-COOH |
| 第一鏈 | NH2 -VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH | |
| 第一鏈 | NH2 -VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH | |
| 第二鏈 | NH2 -VL2-VH1-HPD-COOH | |
| 四特異性 | 第二鏈 | NH2 -VL2-VH1-HPD-COOH |
| 第一鏈 | NH2 -VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH | |
| 第三鏈 | NH2 -VL3-VH4-HPD-CH2-CH3-COOH | |
| 第四鏈 | NH2 -VL4-VH3-HPD-COOH |
在具體實施方式中，本發明的雙抗體是雙特異性的、四價的(即擁有四個表位結合位點)、攜帶Fc區的雙抗體(圖 3A- 圖 3E
)，其包括總計四條多肽鏈。本發明的雙特異性的、四價的、攜帶Fc區的雙抗體包含對於PD-L1免疫特異性的兩個表位結合位點(其可以能夠結合至PD-L1的相同表位或PD-L1的不同表位)，和對CD137特異性的兩個表位結合位點(其可以能夠結合至CD137的相同表位或CD137的不同表位)。
在進一步的實施方式中，雙特異性的攜帶Fc區的雙抗體可包含總計五條多肽鏈。在特定的實施方式中，所述五條多肽鏈中的兩條具有相同的氨基酸序列。這種雙抗體的第一多肽鏈包含：(i)含VH1的結構域、(ii)含CH1的結構域和(iii)含CH2-CH3序列的結構域。第一多肽鏈可以為抗體的包含VH1和重鏈恒定區的重鏈。這種雙抗體的第二和第五多肽鏈包含：(i)含VL1的結構域和(ii)含CL的結構域。這種雙抗體的第二和/或第五多肽鏈可以為抗體的包含與第一/第三多肽鏈的VH1互補的VL1的輕鏈。第一、第二和/或第五多肽鏈可以從天然存在的抗體分離。可替選地，它們可以被重組構建。這種雙抗體的第三多肽鏈包含：(i)含VH1的結構域、(ii)含CH1的結構域、(iii)含CH2-CH3序列的結構域、(iv)含VL2的結構域、(v)含VH3的結構域和(vi)異源二聚體-促進結構域，其中異源二聚體-促進結構域促進第三鏈與第四鏈的二聚化。這種雙抗體的第四多肽包含：(i)含VL3的結構域、(ii)含VH2結構域和(iii)促進與雙抗體的第三多肽鏈異源二聚化和共價結合的結構域。
因此，這種雙抗體的第一和第二多肽鏈、以及第三和第五多肽鏈締合在一起以形成能夠結合第一表位的兩個VL1/VH1結合位點。這種雙抗體的第三和第四多肽鏈締合在一起以形成能夠結合至第二表位的VL2/VH2結合位點、以及能夠結合至第三表位的VL3/VH3結合位點。第一和第三多肽通過在它們各自的恒定區中涉及半胱氨酸殘基的二硫鍵彼此鍵合。特別地，第一和第三多肽鏈彼此複合以形成Fc區。這種雙抗體具有增強的功效。圖 5A
示意這種雙抗體的結構。將理解，VL1/VH1、VL2/VH2和VL3/VH3結構域可以相同或不同，以便允許單特異性的、雙特異性的或三特異性的結合。對多肽鏈的VL和VH結構域進行選擇以便形成對期望的表位特異性的VL/VH結合位點。通過多肽鏈的締合形成的VL/VH結合位點可以是相同或不同的，以便允許單特異性的、雙特異性的、三特異性的或四特異性的四價結合。具體地，VL和VH 結構域可以被選擇，使得雙特異性雙抗體可以包含針對第一表位的兩個結合位點和針對第二表位的兩個結合位點(圖 5B- 圖 5C
)，或針對第一表位的三個結合位點和針對第二表位的一個結合位點，或針對第一表位的兩個結合位點、針對第二表位的一個結合位點和針對第三表位的一個結合位點(圖 5A
)。本發明的代表性的五鏈攜帶Fc區的雙抗體的多肽鏈的一般結構在表 2
中提供：
HPD = 異源二聚體-促進結構域
| 表2 | ||
| 雙特異性(2x2) | 第二鏈 | NH2 -VL1-CL-COOH |
| 第一鏈 | NH2 -VH1-CH1-CH2-CH3-COOH | |
| 第三鏈 | NH2 -VH1-CH1-CH2-CH3-VL2-VH2-HPD-COOH | |
| 第五鏈 | NH2 -VL1-CL-COOH | |
| 第四鏈 | NH2 -VL2-VH2-HPD-COOH | |
| 雙特異性(3x1) | 第二鏈 | NH2 -VL1-CL-COOH |
| 第一鏈 | NH2 -VH1-CH1-CH2-CH3-COOH | |
| 第三鏈 | NH2 -VH1-CH1-CH2-CH3-VL1-VH2-HPD-COOH | |
| 第五鏈 | NH2 -VL1-CL-COOH | |
| 第四鏈 | NH2 -VL2-VH1-HPD-COOH | |
| 三特異性(2x1x1) | 第二鏈 | NH2 -VL1-CL-COOH |
| 第一鏈 | NH2 -VH1-CH1-CH2-CH3-COOH | |
| 第三鏈 | NH2 -VH1-CH1-CH2-CH3-VL2-VH3-HPD-COOH | |
| 第五鏈 | NH2 -VL1-CL-COOH | |
| 第四鏈 | NH2 -VL3-VH2-HPD-COOH |
在具體實施方式中，本發明的雙抗體是雙特異性的、四價的(即擁有四個表位結合位點)、攜帶Fc區的雙抗體，其包括具有針對第一表位的兩個結合位點和針對第二表位的兩個結合位點的總計五條多肽鏈。在一個實施方式中，本發明的雙特異性的、四價的、攜帶Fc區的雙抗體包含對PD-L1免疫特異性的兩個表位結合位點(其可以能夠結合至PD-L1的相同表位或PD-L1的不同表位)，和對CD137特異性的兩個表位結合位點(其可以能夠結合至CD137的相同表位或CD1371的不同表位)。
本發明的進一步實施方式涉及雙特異性的、三價結合分子，其包含Fc區，並且能夠同時地結合至第一表位、第二表位和第三表位，其中這種表位中的至少一個與另一個是不相同的。因此，這種雙特異性雙抗體包含能夠結合至第一表位的“VL1
”/“VH1
”結構域、能夠結合至第二表位的“VL2
”/“VH2
”結構域和能夠結合至第三表位的“VL3
”/“VH3
”結構域。在一個實施方式中，這種表位元中的一個或兩個是PD-L1的表位，並且這種表位的另一個 (或其他)是CD137。這種雙特異性的三價結合分子包含三個表位結合位點，其中兩個是提供結合位點A和結合位點B的雙抗體型結合結構域，並且其中之一是提供結合位點C的非雙抗體型結合結構域(參見，例如圖 6A-6I
，和PCT申請號：PCT/US15/33081和PCT/US15/33076)。
典型地，本發明的三價結合分子將包含四條不同的多肽鏈(參見圖 6A- 圖 6E
)，然而，所述分子可包含更少或更多數量的多肽鏈，例如通過將這種多肽鏈彼此融合(例如，通過肽鍵)或通過將這種多肽鏈分開以形成另外的多肽鏈，或通過二硫鍵締合更少或另外的多肽鏈。圖 6F- 圖 6I
通過示意性描繪具有三條多肽鏈的這種分子例證本發明的這個方面。如在圖 6A- 圖 6I
中提供的，本發明的三價結合分子可具有可替選的取向，其中雙抗體型結合結構域是N-端(圖 6A
-圖 6C 、圖 6F
和圖 6G
)或C-端(圖 6E
、圖 6H
和圖 6I
)至Fc區。
在某些實施方式中，本發明的這種三價結合分子的第一多肽鏈包含：(i)含 VL1 的結構域
、(ii)含VH2
的結構域、(iii)異源二聚體-促進結構域和(iv)含CH2-CH3序列的結構域。如表 3
中呈現的，VL1和VL2結構域定位成N-端或C-端至含CH2-CH3的結構域( 圖 6A- 圖 6C 、圖 6F
和圖 6G)
。這個實施方式的第二多肽鏈包含：(i)含VL2的結構域、(ii)含VH1的結構域和(iii)異源二聚體-促進結構域。這個實施方式的第三多肽鏈包含：(i)含VH3的結構域、(ii)含CH1的結構域和(iii) 含CH2-CH3序列的結構域。第三多肽鏈可以為抗體的包含VH3和重鏈恒定區的重鏈。這個實施方式的第四多肽包含：(i)含VL3的結構域和(ii)含CL的結構域。第四多肽鏈可以為抗體的包含與第三多肽鏈的VH3互補的VL3的輕鏈。第三或第四多肽鏈可以從天然存在的抗體分離。可替選地，它們可以通過重組、合成或通過其他方式構建。
這種三價結合分子的第三和第四多肽鏈締合在一起以形成能夠結合至第三表位的VL3/VH3結合位點。將理解， VL1/VH1、VL2/VH2和VL3/VH3結構域可以相同或不同，以便允許單特異性、雙特異性或三特異性的結合。
如上所述，本發明的三價結合分子可包含三條多肽。包含三條多肽鏈的三價結合分子可以通過連接第四多肽N-端的結構域與第三多肽的含VH3的結構域獲得。可替選地，利用包含以下三個結構域的本發明的三價結合分子的第三多肽鏈：(i)含VL3的結構域、(ii)含VH3的結構域和(iii) 含CH2-CH3序列的結構域，其中VL3和VH3通過間插間隔子肽彼此隔開，該間插間隔子肽足夠長 (至少9個或更多個氨基酸殘基)以便允許這些結構域締合以形成表位結合位點(例如，SEQ ID NO:17
)。
本發明的代表性三價結合分子的多肽鏈的一般結構是在圖 6A- 圖 6F
中和表 3
中提供：
HPD = 異源二聚體-促進結構域
| 表3 | ||
| 四鏈 第一取向 | 第二鏈 | NH2 -VL2-VH1-HPD-COOH |
| 第一鏈 | NH2 -VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH | |
| 第三鏈 | NH2 -VH3-CH1-CH2-CH3-COOH | |
| 第四鏈 | NH2 -VL3-CL-COOH | |
| 四鏈 第二取向 | 第二鏈 | NH2 -VL2-VH1-HPD-COOH |
| 第一鏈 | NH2 -CH2-CH3--VL1-VH2-HPD COOH | |
| 第三鏈 | NH2 -VH3-CH1-CH2-CH3-COOH | |
| 第四鏈 | NH2 -VL3-CL-COOH | |
| 三鏈 第一取向 | 第二鏈 | NH2 -VL2-VH1-HPD-COOH |
| 第一鏈 | NH2 -VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH | |
| 第三鏈 | NH2 -VL3-VH3-HPD-CH2-CH3-COOH | |
| 三鏈 第二取向 | 第二鏈 | NH2 -VL2-VH1-HPD-COOH |
| 第一鏈 | NH2 -CH2-CH3-VL1-VH2-HPD COOH | |
| 第三鏈 | NH2 -VL3-VH3-HPD-CH2-CH3-COOH |
將理解，VL1/VH1、VL2/VH2和VL3/VH3結構域可以相同或不同，以便允許單特異性、雙特異性或三特異性的結合。然而，如本文提供的，這些結構域優選地被選擇，以便結合PD-L1 CD137。本發明的一個實施方式涉及雙特異性三價結合分子，其包含針對PD-L1的一個表位結合位點和針對CD137的兩個表位結合位點(其可以能夠結合至CD137的相同表位和CD137的不同表位)。
IV. 對PD-L1免疫特異性的示例性抗體
如上所討論的，本發明涉及能夠結合至PD-L1、PD-1的天然配體的單特異性和多特異性分子。代表性人PD-L1分子(NCBI序列NP_001254635.1，包括預測的18個氨基酸信號序列)具有氨基酸序列(SEQ ID NO:54)
：
MRIFAVFIFM TYWHLLNAPY NKINQRILVV DPVTSEHELT CQAEGYPKAE VIWTSSDHQV LSGKTTTTNS KREEKLFNVT STLRINTTTN EIFYCTFRRL DPEENHTAEL VIPELPLAHP PNERTHLVIL GAILLCLGVA LTFIFRLRKG RMMDVKKCGI QDTNSKKQSD THLEET
依照本發明可使用的對人PD-L1免疫特異性的示例性抗體包括新型的鼠抗體：“PD-L1 MAB-1
”、“PD-L1 MAB-2
”和“PD-L1 MAB-3
”和其人源化變體。以下提供這種新型的抗體的可變結構域和CDR結構域的氨基酸序列。可用在生成本發明的PD-L1 x CD137
雙特異性結合分子的可替選的抗PD-L1抗體包括“阿特珠單抗 (atezolizumab )
”、“阿維魯單抗 (avelumab)
”和“度伐單抗 (durvalumab)
”，各自最近被批准用於人。阿特珠單抗(以Genentech, Inc.的TECENTRIQ®銷售)是具有修飾的IgG1和κ恒定區的人源化單克隆抗體(參見，例如，美國專利號9,873,740)。具有阿特珠單抗的可變結構域的抗體在本文被命名為“PD-L1 MAB-A
”。阿維魯單抗(以EMD Serono, Inc.的BAVENCIO®銷售)是具有IgG1/λ恒定區的完全的人單克隆抗體(參見，例如美國專利號9,873,740)。具有阿維魯單抗的可變結構域的抗體在本文被命名為“PD-L1 MAB-B
”。度伐單抗(以Astrazeneca的IMFINZI®銷售)是具有修飾的IgG1和κ恒定區的完全的人單克隆抗體(參見，例如美國專利號8,779,108)。具有度伐單抗的可變結構域的抗體在本文被命名為“PD-L1 MAB-C
”。以下提供PD-L1 MAB-A
、PD-L1 MAB-B
和PD-L1 MAB-C
的VH和VL的氨基酸序列。阿特珠單抗(WHO藥物資訊，2015，推薦的INN：列表74，29(3)：387)、度伐單抗(WHO藥物資訊，2015，推薦的INN：列表74，29(3)：393-394)和阿維魯單抗(WHO藥物資訊，2016，推薦的INN：列表74，30(1)：100-101)的完整重鏈和輕鏈的氨基酸序列在本領域是已知的。其他的抗人PD-L1抗體可使用具有以上提供的PD-L1氨基酸序列作為免疫原獲得。
1. PD-L1 MAB-1
PD-L1 MAB-1
的VH結構域(PD-L1 MAB-1 VH
)的氨基酸序列是(SEQ ID NO:55
) (CDRH
殘基以底線顯示)：
QVQLKQSGPG LVQPSQSLSI TCTVSGFSLT NYGVH
WVRQS PGKGLEWLG M IWRGGSTEYN AAFMS
RLSIT KDNSKSQVFF KMSSLQAGDT AIYYCAK IGF YAMDY
WGQGT SVTVSS
PD-L1 MAB-1 VH
的CDRH
的氨基酸序列是：
CDRH
1 (SEQ ID NO:56
): NYGVH
CDRH
2 (SEQ ID NO:57
): MIWRGGSTEYNAAFMS
CDRH
3 (SEQ ID NO:58
): IGFYAMDY
PD-L1 MAB-1
的VL結構域(PD-L1 MAB-1 VL
)的氨基酸序列是(SEQ ID NO:59
) (CDRL
殘基以底線顯示)：
SIVMTQTPKF LLVSAGDRVT ITC KASQSVS NDVA
WYQQKP GQSPKLLIY Y ASNRCT
GVPD RLTGSGYGTD FTFTISTVQA EDLAVYFC QQ DYSSPYT
FGG GTKLEIK
PD-L1 MAB-1 VL
的CDRL
的氨基酸序列是：
CDRL
1 (SEQ ID NO:60
): KASQSVSNDVA
CDRL
2 (SEQ ID NO:61
): YASNRCT
CDRL
3 (SEQ ID NO:62
): QQDYSSPYT
2. PD-L1 MAB-2
PD-L1 MAB-2
的VH結構域(PD-L1 MAB-2 VH
)的氨基酸序列是(SEQ ID NO:63
) (CDRH
殘基以底線顯示)：
EVKLVESGGG LVQPGGSLKL SCAASGFTFS SYTMS
WVRQT PERRLEWVA Y ISIGGGTTYY PDTVKG
RFTI SRDNAKNTLYL QMSSLKSED TAMYYCAR QG LPYYFDY
WGQ GTTLTVSS
PD-L1 MAB-2 VH
的CDRH
的氨基酸序列是：
CDRH
1 (SEQ ID NO:64
): SYTMS
CDRH
2 (SEQ ID NO:65
): YISIGGGTTYYPDTVKG
CDRH
3 (SEQ ID NO:66
): QGLPYYFDY
PD-L1 MAB-2
的VL結構域(PD-L1 MAB-2 VL
)的氨基酸序列是(SEQ ID NO:67
) (CDRL
殘基以底線顯示)：
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITC KASQDVN TAVA
WYQQKP GQSPKLLIY W ASTRHT
GVPD RFTGSGSGTD FTLTISSVQA EDLALYYC QQ HYNTPLT
FGA GTKLELK
PD-L1 MAB-2 VL
的CDRL
的氨基酸序列是：
CDRL
1 (SEQ ID NO:68
): KASQDVNTAVA
CDRL
2 (SEQ ID NO:69
): WASTRHT
CDRL
3 (SEQ ID NO:70
): QQHYNTPLT
3. hPD-L1 MAB-2
抗體PD-L1 MAB-2
被人源化和優化以生成一個優選的在文中被命名為“h PD-L1 MAB-2 VH1
”的人源化VH結構域和一個優選的在文中被命名為“h PD-L1 MAB-2 VL1
”的人源化VL結構域。與人源化VH結構域配對的人源化VL 結構域一般被稱為“hPD-L1 MAB-2
”，並且人源化VL/VH結構域的特定組合參照具體的VH/VL結構域被提及，例如，包含結合結構域hPD-L1 MAB-2 VH1
和hPD-L1 MAB-2 VL1
的分子被具體地稱為“hPD-L1 MAB-2 (1.1)
”。以下提供人源化VH和VL結構域的氨基酸序列。
hPD-L1 MAB-2
的VH結構域(hPD-L1 MAB-2 VH1
)的氨基酸序列是(SEQ ID NO:71
) (CDRH
殘基以底線顯示)：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYTMS
WVRQA PGKGLEWVA Y ISIGGGTTYY PDTVKG
RFTI SRDNAKNTLY LQMNSLKTED TAVYYCAR QG LPYYFDY
WGQ GTLVTVSS
hPD-L1 MAB-2
的VL結構域(hPD-L1 MAB-2 VL1
)的氨基酸序列是(SEQ ID NO:72
) (CDRL
殘基以底線顯示)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KASQDVN TAVA
WYQQKP GKAPKLLIY W ASTRHT
GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ HYNTPLT
FGQ GTKVEIK
4. PD-L1 MAB-3
PD-L1 MAB-3
的VH結構域(PD-L1 MAB-3 VH
)的氨基酸序列是(SEQ ID NO:73
) (CDRH
殘基以底線顯示)：
DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFTFS SFGMH
WVRQA PEKGLEWVA Y ISSGSSIIFY ADTVKG
RFTI SRDNPKNTLF LQMTSLRSED TAMYYCAR EI TTAPFAY
WGQ GTLVTVSA
PD-L1 MAB-3 VH
的CDRH
的氨基酸序列是：
CDRH
1 (SEQ ID NO:74
): SFGMH
CDRH
2 (SEQ ID NO:75
): YISSGSSIIFYADTVKG
CDRH
3 (SEQ ID NO:76
): EITTAPFAY
PD-L1 MAB-3
的VL結構域(PD-L1 MAB-3 VL
)的氨基酸序列是(SEQ ID NO:77
) (CDRL
殘基以底線顯示)：
SIVMTQTPTF LLVSAGDRVT ITC KASQSVS SDVA
WYQQKP GQSPKLLIY Y ASNRYT
GVPD RFTGSGYGTD FTFTISTVQT EDLAVYFC HQ DYSSPFT
FGS GTKLEIK
PD-L1 MAB-3 VL
的CDRL
的氨基酸序列是：
CDRL
1 (SEQ ID NO:78
): KASQSVSSDVA
CDRL
2 (SEQ ID NO:79
): YASNRYT
CDRL
3 (SEQ ID NO:80
): HQDYSSPFT
5. hPD-L1 MAB-3
抗體PD-L1 MAB-3
被人源化和優化以生成一個優選的在文中被命名為“h PD-L1 MAB-3 VH1
”的人源化VH結構域和一個優選的在文中被命名為“h PD-L1 MAB-3 VL1
”的人源化VL結構域。與人源化VH結構域配對的人源化VL 結構域一般被稱為“hPD-L1 MAB-3
”，並且人源化VL/VH結構域的特定組合通過參照具體的VH/VL結構域被提及，例如包含hPD-L1 MAB-3 VH1
和hPD-L1 MAB-3 VL1
的結合結構域被具體地稱為“hPD-L1 MAB-3 (1.1)
”。以下提供人源化VH和VL結構域的氨基酸序列。
hPD-L1 MAB-3
的VH結構域(hPD-L1 MAB-3 VH1
)的氨基酸序列是(SEQ ID NO:81
) (CDRH
殘基以底線顯示)：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMH
WVRQA PGKGLEWVA Y ISSGSSIIFY ADTVKG
RFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAR EI TTAPFAY
WGQ GTLVTVSS
hPD-L1 MAB-3
的VL結構域(hPD-L1 MAB-3 VL1
)的氨基酸序列是(SEQ ID NO:82
) (CDRL
殘基以底線顯示)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KASQSVS SDVA
WYQQKP GKAPKLLIY Y ASNRYT
GVPS RFSGSGYGTD FTFTISSLQP EDIATYYC HQ DYSSPFT
FGQ GTKLEIK
6. 阿特珠單抗 (hPD-L1 MAB-A)
阿特珠單抗(PD-L1 MAB-A
)的VH結構域(PD-L1 MAB-A VH
)的氨基酸序列是(SEQ ID NO:83
) (CDRH
殘基以底線顯示)：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DSWIH
WVRQA PGKGLEWVA W ISPYGGSTYY ADSVKG
RFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCAR RH WPGGFDY
WGQ GTLVTVSS
PD-L1 MAB-A 的
VL結構域(PD-L1 MAB-A VL
)的氨基酸序列是(SEQ ID NO:84
) (CDRL
殘基以底線顯示)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQDVS TAVA
WYQQKP GKAPKLLIY S ASFLYS
GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YLYHPAT
FGQ GTKVEIK
7. 阿維魯單抗(hPD-L1 MAB-B)
阿維魯單抗(PD-L1 MAB-B
)的VH結構域(PD-L1 MAB-B VH
)的氨基酸序列是(SEQ ID NO:85
) (CDRH
殘基以底線顯示)：
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYIMM
WVRQA PGKGLEWVS S IYPSGGITFY ADTVKG
RFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAR IK LGTVTTVDY
W GQGTLVTVSS
PD-L1 MAB-B
的VL結構域(PD-L1 MAB-B VL
)的氨基酸序列是(SEQ ID NO:86
) (CDRL
殘基以底線顯示)：
QSALTQPASV SGSPGQSITI SC TGTSSDVG GYNYVS
WYQQ HPGKAPKLMI Y DVSNRPS
GV SNRFSGSKSG NTASLTISGL QAEDEADYYC SSYTSSSTRV
FGTGTKVTVL G
8. 度伐單抗(hPD-L1 MAB-C)
度伐單抗(PD-L1 MAB-C
)的VH結構域(PD-L1 MAB-C VH
)的氨基酸序列是(SEQ ID NO:87
) (CDRH
殘基以底線顯示)：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYWMS
WVRQA PGKGLEWVA N IKQDGSEKYY VDSVKG
RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR EG GWFGELAFDY
WGQGTLVTVS S
PD-L1 MAB-C
的VL結構域(PD-L1 MAB-C VL
)的氨基酸序列是(SEQ ID NO:88
) (CDRL
殘基以底線顯示)：
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSC RASQRVS SSYLA
WYQQK PGQAPRLLIY DASSRAT
GIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYC Q QYGSLPWT
FG QGTKVEIK
如以上提供的，本發明特別地包括和涵蓋PD-L1 x CD137
結合分子，其包含PD-L1 MAB-1
、PD-L1 MAB-2
(尤其是hPD-L2 MAB-2
的那些)
、PD-L1 MAB-3
(尤其是hPD-L1 MAB-3
的那些)
、PD-L1 MAB A
、PD-L1 MAB-B
、PD-L1 MAB C
中的任一者，或本文提供的或本領域已知的其他抗PL-L1抗體中的任一者的VL和/或VH結構域、和/或VL區的CDRL
中的1個、2個或全部3個和/或VH結構域的CDRH
中的1個、2個或全部3個；和更優選地，擁有這種抗PD-L1單克隆抗體的VL區的CDRL
中的1個、2個或全部3個和/或VH結構域的CDRH
中的1個、2個或全部3個。
V. 對CD137免疫特異性的示例性抗體
如上所討論的，本發明涉及能夠結合至CD137的多特異性分子，CD137為介導CD28依賴性和非依賴性的T細胞共同刺激的共同刺激受體。代表性人CD137多肽(NCBI序列NP_001552，包括23氨基酸信號序列)具有氨基酸序列(SEQ ID NO:89
):
MGNSCYNIVA TLLLVLNFER TRSLQDPCSN CPAGTFCDNN RNQICSPCPP NSFSSAGGQR TCDICRQCKG VFRTRKECSS TSNAECDCTP GFHCLGAGCS MCEQDCKQGQ ELTKKGCKDC CFGTFNDQKR GICRPWTNCS LDGKSVLVNG TKERDVVCGP SPADLSPGAS SVTPPAPARE PGHSPQIISF FLALTSTALL FLLFFLTLRF SVVKRGRKKL LYIFKQPFMR PVQTTQEEDG CSCRFPEEEE
GGCEL
可用於生成本發明的PD-L1 x CD137雙特異性結合分子的對人CD137免疫特異性的示例性抗體包括新型的鼠抗體：“CD137 MAB-1
”和“CD137 MAB-2
”。這些抗體和它們的人源化變體僅當交聯時展示出激動劑活性 (即刺激T細胞)。以下提供了這種抗體的可變結構域的氨基酸序列。另外，已經描述抗CD137抗體，包括“烏瑞魯單抗 ( urelumab
)”和“烏托魯單抗 ( utomilumab
)”，其目前在人臨床試驗中被評估。烏瑞魯單抗(也稱為BMS-663513)是具有IgG4和κ恒定區的完全的人單克隆抗體(參見，例如，美國專利號8,137,667)。具有烏瑞魯單抗的可變結構域的抗體本文被命名“CD137 MAB-A
”。烏瑞魯單抗是組成型激動劑 (即其甚至在不存在交聯的情況下也具有激動劑活性)並且對於本發明的PD-L1 x CD137
雙特異性結合分子不是優選的。然而，它為有用的對照。烏托魯單抗(也稱為PF-05082566)是具有IgG2和λ恒定區的完全的人單克隆抗體(參見，例如，美國專利號8,337,850)。具有烏托魯單抗的可變結構域的抗體本文被命名為“CD137 MAB-B
”。烏瑞魯單抗(WHO藥物資訊，2011，推薦的INN：列表66, 25(3):334)和烏托魯單抗(WHO藥物資訊，2017，推薦的INN：列表77, 31(1):140-141) 的完整的重鏈和輕鏈的氨基酸序列在本領域是已知的。其他的抗人CD137抗體可使用具有以上提供的CD137氨基酸序列的蛋白作為免疫原而獲得。
1. CD137 MAB-1
CD137 MAB-1
是新型的鼠單克隆抗體。CD137 MAB-1
的VH結構域(CD137 MAB-1 VH
)的氨基酸序列是(SEQ ID NO:90
) (CDRH
殘基以底線顯示)：
QVQLQQPGAE LVRPGASVKL SCKASGYTFT SYWIN
WVKQR PGQGLEWIG N IYPSDSYTNY NQKFKD
KATL TVDKSSSTAY MQLSSPTSED SAVYYCTR DY GSSYSFDY
WG QGTTLTVSS
CD137 MAB-1 VH
的CDRH
的氨基酸序列是：
CDRH
1 (SEQ ID NO:91
): SYWIN
CDRH
2 (SEQ ID NO:92
): NIYPSDSYTNYNQKFKD
CDRH
3 (SEQ ID NO:93
): DYGSSYSFDY
CD137 MAB-1
的VL結構域(CD137 MAB-1 VL
)的氨基酸序列是(SEQ ID NO:94
) (CDRL
殘基以底線顯示)：
DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISC RPSQDIS NYLN
WYQQKP DGTVKLLIY Y TSRLRS
GVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFC QQ GDTLPYT
FGG GTKLEIK
CD137 MAB-1 VL
的CDRL
的氨基酸序列是：
CDRL
1 (SEQ ID NO:95
): RPSQDISNYLN
CDRL
2 (SEQ ID NO:96
): YTSRLRS
CDRL
3 (SEQ ID NO:97
): QQGDTLPYT
具有包含L234A/L235A Fc突變的IgG1/κ人重鏈和輕鏈恒定區(參見，例如SEQ ID NOs:40
、42 、 44 和 46-49
)和鼠VH/VL結構域的嵌合衍生物被生成(命名：chCD137 MAB-1
)且用於在以下實施例中描述的多個功能測試中。
2. hCD137 MAB-1
CD137 MAB-1
的VH和VL結構域被人源化、隨後優化和/或去免疫以產生一組本文被命名為“hCD137 MAB-1 VH1
”、“hCD137 MAB-1 VH1A
”、“hCD137 MAB-1 VH1B
”、“hCD137 MAB-1 VH1C
”、“hCD137 MAB-1 VH1D
”、“hCD137 MAB-1 VH1E
”、“hCD137 MAB-1 VH1F
”和“hCD137 MAB-1 VH1G
”的八個優選的人源化VH結構域；和本文被命名為“hCD137 MAB-1 VL1
”、“hCD137 MAB-1 VL2
”、“hCD137 MAB-1 VL3
”、“hCD137 MAB-1 VL4
”、“hCD137 MAB-1 VL5
”、“hCD137 MAB-1 VL6
”、“hCD137 MAB-1 VL7
”、“hCD137 MAB-1 VL8
”、“hCD137 MAB-1 VL9
”、“hCD137 MAB-1 VL10
”、“hCD137 MAB-1 VL11
”、“hCD137 MAB-1 VL12
”、“hCD137 MAB-1 VL13
”、“hCD137 MAB-1 VL14
”和“hCD137 MAB-1 VL15
”的十五個優選的人源化VL結構域。人源化VL結構域的任一個可與人源化VH結構域配對。因此，包含與人源化VH結構域配對的人源化VL結構域之一的任何結合結構域通常被稱為“hCD137 MAB-1
”，並且人源化VL/VH結構域的特定組合通過參照具體的VH/VL結構域被提及，例如包含hCD137 MAB-1 VH1D
和hCD137 MAB-1 VL3
的結合結構域被特別地稱為“hCD137 MAB-1 (1D.3)
”。
因此，本發明特別地考慮CD137 結合分子，其包含在表 4
中列舉的hCD137 VH/VL結構域的120個hCD137 MAB-1
對中的任一者。
| 表4 ：hCD137 MAB-1 分子 | |||||
| 編號 | hCD137 VH 結構域 | hCD137 VL 結構域 | 編號 | hCD137 VH 結構域 | hCD137 VL 結構域 |
| 1 | MAB-1 VH1 | MAB-1 VL1 | 65 | MAB-1 VH1 | MAB-1 VL9 |
| 2 | MAB-1 VH1A | MAB-1 VL1 | 66 | MAB-1 VH1A | MAB-1 VL9 |
| 3 | MAB-1 VH1B | MAB-1 VL1 | 67 | MAB-1 VH1B | MAB-1 VL9 |
| 4 | MAB-1 VH1C | MAB-1 VL1 | 68 | MAB-1 VH1C | MAB-1 VL9 |
| 5 | MAB-1 VH1D | MAB-1 VL1 | 69 | MAB-1 VH1D | MAB-1 VL9 |
| 6 | MAB-1 VH1E | MAB-1 VL1 | 70 | MAB-1 VH1E | MAB-1 VL9 |
| 7 | MAB-1 VH1F | MAB-1 VL1 | 71 | MAB-1 VH1F | MAB-1 VL9 |
| 8 | MAB-1 VH1G | MAB-1 VL1 | 72 | MAB-1 VH1G | MAB-1 VL9 |
| 9 | MAB-1 VH1 | MAB-1 VL2 | 73 | MAB-1 VH1 | MAB-1 VL10 |
| 10 | MAB-1 VH1A | MAB-1 VL2 | 74 | MAB-1 VH1A | MAB-1 VL10 |
| 11 | MAB-1 VH1B | MAB-1 VL2 | 75 | MAB-1 VH1B | MAB-1 VL10 |
| 12 | MAB-1 VH1C | MAB-1 VL2 | 76 | MAB-1 VH1C | MAB-1 VL10 |
| 13 | MAB-1 VH1D | MAB-1 VL2 | 77 | MAB-1 VH1D | MAB-1 VL10 |
| 14 | MAB-1 VH1E | MAB-1 VL2 | 78 | MAB-1 VH1E | MAB-1 VL10 |
| 15 | MAB-1 VH1F | MAB-1 VL2 | 79 | MAB-1 VH1F | MAB-1 VL10 |
| 16 | MAB-1 VH1G | MAB-1 VL2 | 80 | MAB-1 VH1G | MAB-1 VL10 |
| 17 | MAB-1 VH1 | MAB-1 VL3 | 81 | MAB-1 VH1 | MAB-1 VL11 |
| 18 | MAB-1 VH1A | MAB-1 VL3 | 82 | MAB-1 VH1A | MAB-1 VL11 |
| 19 | MAB-1 VH1B | MAB-1 VL3 | 83 | MAB-1 VH1B | MAB-1 VL11 |
| 20 | MAB-1 VH1C | MAB-1 VL3 | 84 | MAB-1 VH1C | MAB-1 VL11 |
| 21 | MAB-1 VH1D | MAB-1 VL3 | 85 | MAB-1 VH1D | MAB-1 VL11 |
| 22 | MAB-1 VH1E | MAB-1 VL3 | 86 | MAB-1 VH1E | MAB-1 VL11 |
| 23 | MAB-1 VH1F | MAB-1 VL3 | 87 | MAB-1 VH1F | MAB-1 VL11 |
| 24 | MAB-1 VH1G | MAB-1 VL3 | 88 | MAB-1 VH1G | MAB-1 VL11 |
| 25 | MAB-1 VH1 | MAB-1 VL4 | 89 | MAB-1 VH1 | MAB-1 VL12 |
| 26 | MAB-1 VH1A | MAB-1 VL4 | 90 | MAB-1 VH1A | MAB-1 VL12 |
| 27 | MAB-1 VH1B | MAB-1 VL4 | 91 | MAB-1 VH1B | MAB-1 VL12 |
| 28 | MAB-1 VH1C | MAB-1 VL4 | 92 | MAB-1 VH1C | MAB-1 VL12 |
| 29 | MAB-1 VH1D | MAB-1 VL4 | 93 | MAB-1 VH1D | MAB-1 VL12 |
| 30 | MAB-1 VH1E | MAB-1 VL4 | 94 | MAB-1 VH1E | MAB-1 VL12 |
| 31 | MAB-1 VH1F | MAB-1 VL4 | 95 | MAB-1 VH1F | MAB-1 VL12 |
| 32 | MAB-1 VH1G | MAB-1 VL4 | 96 | MAB-1 VH1G | MAB-1 VL12 |
| 33 | MAB-1 VH1 | MAB-1 VL5 | 97 | MAB-1 VH1 | MAB-1 VL13 |
| 34 | MAB-1 VH1A | MAB-1 VL5 | 98 | MAB-1 VH1A | MAB-1 VL13 |
| 35 | MAB-1 VH1B | MAB-1 VL5 | 99 | MAB-1 VH1B | MAB-1 VL13 |
| 36 | MAB-1 VH1C | MAB-1 VL5 | 100 | MAB-1 VH1C | MAB-1 VL13 |
| 37 | MAB-1 VH1D | MAB-1 VL5 | 101 | MAB-1 VH1D | MAB-1 VL13 |
| 38 | MAB-1 VH1E | MAB-1 VL5 | 102 | MAB-1 VH1E | MAB-1 VL13 |
| 39 | MAB-1 VH1F | MAB-1 VL5 | 103 | MAB-1 VH1F | MAB-1 VL13 |
| 40 | MAB-1 VH1G | MAB-1 VL5 | 104 | MAB-1 VH1G | MAB-1 VL13 |
| 41 | MAB-1 VH1 | MAB-1 VL6 | 105 | MAB-1 VH1 | MAB-1 VL14 |
| 42 | MAB-1 VH1A | MAB-1 VL6 | 106 | MAB-1 VH1A | MAB-1 VL14 |
| 43 | MAB-1 VH1B | MAB-1 VL6 | 107 | MAB-1 VH1B | MAB-1 VL14 |
| 44 | MAB-1 VH1C | MAB-1 VL6 | 108 | MAB-1 VH1C | MAB-1 VL14 |
| 45 | MAB-1 VH1D | MAB-1 VL6 | 109 | MAB-1 VH1D | MAB-1 VL14 |
| 46 | MAB-1 VH1E | MAB-1 VL6 | 110 | MAB-1 VH1E | MAB-1 VL14 |
| 47 | MAB-1 VH1F | MAB-1 VL6 | 111 | MAB-1 VH1F | MAB-1 VL14 |
| 48 | MAB-1 VH1G | MAB-1 VL6 | 112 | MAB-1 VH1G | MAB-1 VL14 |
| 49 | MAB-1 VH1 | MAB-1 VL7 | 113 | MAB-1 VH1 | MAB-1 VL15 |
| 50 | MAB-1 VH1A | MAB-1 VL7 | 114 | MAB-1 VH1A | MAB-1 VL15 |
| 51 | MAB-1 VH1B | MAB-1 VL7 | 115 | MAB-1 VH1B | MAB-1 VL15 |
| 52 | MAB-1 VH1C | MAB-1 VL7 | 116 | MAB-1 VH1C | MAB-1 VL15 |
| 53 | MAB-1 VH1D | MAB-1 VL7 | 117 | MAB-1 VH1D | MAB-1 VL15 |
| 54 | MAB-1 VH1E | MAB-1 VL7 | 118 | MAB-1 VH1E | MAB-1 VL15 |
| 55 | MAB-1 VH1F | MAB-1 VL7 | 119 | MAB-1 VH1F | MAB-1 VL15 |
| 56 | MAB-1 VH1G | MAB-1 VL7 | 120 | MAB-1 VH1G | MAB-1 VL15 |
| 57 | MAB-1 VH1 | MAB-1 VL8 | |||
| 58 | MAB-1 VH1A | MAB-1 VL8 | |||
| 59 | MAB-1 VH1B | MAB-1 VL8 | |||
| 60 | MAB-1 VH1C | MAB-1 VL8 | |||
| 61 | MAB-1 VH1D | MAB-1 VL8 | |||
| 62 | MAB-1 VH1E | MAB-1 VL8 | |||
| 63 | MAB-1 VH1F | MAB-1 VL8 | |||
| 64 | MAB-1 VH1G | MAB-1 VL8 |
以下提供了人源化VH和VL 結構域和各自的CDR的氨基酸序列。
本文被稱為“h CD137 MAB-1 VH
”的hCD137 MAB-1
的人源化VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:98)
(CDRH
殘基以底線顯示)：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWIN
WVX1
QA
PGQGLEWX2
G N IYPSDSYTNY NQKFKD
KATI TADKSTSTAY
MELSSLRSED TAVYYCTR DY GSX3
YSX4
X5
X6
WG QGTTVTVSS
其中：X1
是K或R；X4
是F、M或Y；X2
是I或A；X5
是D、H、S或N；和X3
是S或A；X6
是Y、T、P、L或V。
hCD137 MAB-1 VH1
的氨基酸序列是(SEQ ID NO:99
) (CDRH
殘基以底線顯示；注意CDRH
3具有序列DYGSSYSFDY (SEQ ID NO:93
))：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWIN
WVKQA PGQGLEWIG N IYPSDSYTNY NQKFKD
KATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCTR DY GSSYSFDY
WG QGTTVTVSS
hCD137 MAB-1 VH1A
的氨基酸序列是(SEQ ID NO:100)
(CDRH
殘基以底線顯示；注意CDRH
3具有序列DYGSAYSFHP (SEQ ID NO:101
)：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWIN
WVKQA PGQGLEWIG N IYPSDSYTNY NQKFKD
KATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCTR DY GSAYSFHP
WG QGTTVTVSS
hCD137 MAB-1 VH1B
的氨基酸序列是(SEQ ID NO:102)
(CDRH
殘基以底線顯示；注意CDRH
3具有序列DYGSAYSMST (SEQ ID NO:103
))：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWIN
WVKQA PGQGLEWIG N IYPSDSYTNY NQKFKD
KATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCTR DY GSAYSMST
WG QGTTVTVSS
hCD137 MAB-1 VH1C
的氨基酸序列是(SEQ ID NO:104)
(CDRH
殘基以底線顯示；注意CDRH
3具有序列DYGSAYSYSL (SEQ ID NO:105
))：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWIN
WVKQA PGQGLEWIG N IYPSDSYTNY NQKFKD
KATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCTR DY GSAYSYSL
WG QGTTVTVSS
hCD137 MAB-1 VH1D
的氨基酸序列是(SEQ ID NO:106)
(CDRH
殘基以底線顯示；注意CDRH
3具有序列DYGSSYSYNV (SEQ ID NO:107
))：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWIN
WVKQA PGQGLEWIG N IYPSDSYTNY NQKFKD
KATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCTR DY GSSYSYNV
WG QGTTVTVSS
hCD137 MAB-1 VH1E
的氨基酸序列是(SEQ ID NO:108)
(CDRH
殘基以底線顯示；注意CDRH
3具有序列DYGSAYSMST (SEQ ID NO:103
))：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWIN
WVRQA PGQGLEWIG N IYPSDSYTNY NQKFKD
KATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCTR DY GSAYSMST
WG QGTTVTVSS
hCD137 MAB-1 VH1F
的氨基酸序列是(SEQ ID NO:109)
(CDRH
殘基以底線顯示；注意CDRH
3具有序列DYGSAYSMST (SEQ ID NO:103
))：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWIN
WVKQA PGQGLEWAG N IYPSDSYTNY NQKFKD
KATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCTR DY GSAYSMST
WG QGTTVTVSS
hCD137 MAB-1 VH1G
的氨基酸序列是(SEQ ID NO:110)
(CDRH
殘基以底線顯示；注意CDRH
3具有序列DYGSAYSMST (SEQ ID NO:103
))：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWIN
WVRQA PGQGLEWAG N IYPSDSYTNY NQKFKD
KATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCTR DY GSAYSMST
WG QGTTVTVSS
本文被稱為“hCD137 MAB-1 VL
”的hCD137 MAB-1
的人源化VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:111)
(CDRL
殘基以底線顯示)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC X1
X2
SQDIS NYLN
WYQQKPX3
X4
TX5
KLLX6
Y Y TX7
RX8
RS
GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT
FGQ GTKLEIK
其中：X1
是R或Q；X5
是V或A；X2
是P或A；X6
是I或A；X3
是D或G；X7
是S、T或G；和X4
是G或K；X8
是L或A。
hCD137 MAB-1 VL1
的氨基酸序列是(SEQ ID NO:112
) (CDRL
殘基以底線顯示；注意殘基CDRL
2具有序列YTSRLRS (SEQ ID NO:113
))：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RPSQDIS NYLN
WYQQKP DGTVKLLIY Y TSRLRS
GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT
FGQ GTKLEIK
hCD137 MAB-1 VL2
的氨基酸序列是(SEQ ID NO:114
) (CDRL
殘基以底線顯示；注意CDRL
2具有序列YTSRLRS (SEQ ID NO:113
))：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RPSQDIS NYLN
WYQQKP GGTVKLLIY Y TSRLRS
GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT
FGQ GTKLEIK
hCD137 MAB-1 VL3
的氨基酸序列是(SEQ ID NO:115
) (CDRL
殘基以底線顯示；注意CDRL
2具有序列YTSRLRS (SEQ ID NO:113
))：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RPSQDIS NYLN
WYQQKP DKTVKLLIY Y TSRLRS
GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT
FGQ GTKLEIK
hCD137 MAB-1 VL4
的氨基酸序列是(SEQ ID NO:116
) (CDRL
殘基以底線顯示；注意CDRL
1具有序列QASQDISNYLN (SEQ ID NO:113
)和CDRL
2具有序列YTSRLRS (SEQ ID NO:96
))：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC QASQDIS NYLN
WYQQKP DKTVKLLIY Y TSRLRS
GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT
FGQ GTKLEIK
hCD137 MAB-1 VL5
的氨基酸序列是(SEQ ID NO:117
) (CDRL
殘基以底線顯示；注意CDRL
2具有序列YTSRLRS (SEQ ID NO:96
))：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RPSQDIS NYLN
WYQQKP DKTAKLLIY Y TSRLRS
GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT
FGQ GTKLEIK
hCD137 MAB-1 VL6
的氨基酸序列是(SEQ ID NO:118
) (CDRL
殘基以底線顯示；注意CDRL
2具有序列YTSRARS (SEQ ID NO:119
))：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RPSQDIS NYLN
WYQQKP DKTVKLLIY Y TSRARS
GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT
FGQ GTKLEIK
hCD137 MAB-1 VL7
的氨基酸序列是(SEQ ID NO:120
) (CDRL
殘基以底線顯示；注意CDRL
2具有序列YTSRLRS (SEQ ID NO:96
))：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC QASQDIS NYLN
WYQQKP DKTAKLLIY Y TSRLRS
GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT
FGQ GTKLEIK
hCD137 MAB-1 VL8
的氨基酸序列是(SEQ ID NO:121
) (CDRL
殘基以底線顯示；注意CDRL
2具有序列YTSRARS (SEQ ID NO:119
))：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC QASQDIS NYLN
WYQQKP DKTAKLLIY Y TSRARS
GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT
FGQ GTKLEIK
hCD137 MAB-1 VL9
的氨基酸序列是(SEQ ID NO:122
) (CDRL
殘基以底線顯示；注意CDRL
2具有序列YTSRARS (SEQ ID NO:119
))：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC QASQDIS NYLN
WYQQKP DKTVKLLIY Y TSRARS
GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT
FGQ GTKLEIK
hCD137 MAB-1 VL10
的氨基酸序列是(SEQ ID NO:123
) (CDRL
殘基以底線顯示；注意CDRL
2具有序列YTTRLRS (SEQ ID NO:124
))：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RPSQDIS NYLN
WYQQKP DKTVKLLIY Y TTRLRS
GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT
FGQ GTKLEIK
hCD137 MAB-1 VL11
的氨基酸序列是(SEQ ID NO:125
) (CDRL
殘基以底線顯示；注意CDRL
2具有序列YTGRLRS (SEQ ID NO:126
))：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RPSQDIS NYLN
WYQQKP DKTVKLLIY Y TGRLRS
GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT
FGQ GTKLEIK
hCD137 MAB-1 VL12
的氨基酸序列是(SEQ ID NO:127
) (CDRL
殘基以底線顯示；注意CDRL
2具有序列YTTRLRS (SEQ ID NO:124
))：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RPSQDIS NYLN
WYQQKP DKTVKLLA
Y Y TTRLRS
GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT
FGQ GTKLEIK
hCD137 MAB-1 VL13
的氨基酸序列是(SEQ ID NO:128
) (CDRL
殘基以底線顯示；注意CDRL
2具有序列YTGRLRS (SEQ ID NO:126
))：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RPSQDIS NYLN
WYQQKP DKTVKLLAY Y TGRLRS
GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT
FGQ GTKLEIK
hCD137 MAB-1 VL14
的氨基酸序列是(SEQ ID NO:129
) (CDRL
殘基以底線顯示；注意CDRL
2具有序列YTTRARS (SEQ ID NO:130
))：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC QASQDIS NYLN
WYQQKP DKTVKLLIY Y TTRARS
GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT
FGQ GTKLEIK
hCD137 MAB-1 VL15
的氨基酸序列是(SEQ ID NO:131
) (CDRL
殘基以底線顯示；注意CDRL
2具有序列YTGRARS (SEQ ID NO:132
))：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC QASQDIS NYLN
WYQQKP DKTVKLLIY Y TGRARS
GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT
FGQ GTKLEIK
鼠的人源化、優化的和去免疫的CD137 MAB-1 VH和VL結構域(以上加底線的)的CDR在表 5
中概述。應理解，來源於CD137 MAB-1的CD137結合結構域可包含CDRL
1、CDRL
2、CDRL
3、CDRH
1、CDRH
2和CDRH
3，其中各個CDR獨立地選自以下表 5
中提供的相應的CDR。可替選地，來源於CD137 MAB-1的CD137結合結構域可包含VH結構域和VL結構域，其中各自獨立地選自表 5
中提供的VL和VH結構域。
3. CD137 MAB-2
| 表 5 ： CD137 MAB-1 CDR 和可變結構域 | |||||
| CDR | 序列 | SEQ ID NO: | |||
| CDRH 1 | SYWIN | 91 | |||
| CDRH 2 | NIYPSDSYTNYNQKFKD | 92 | |||
| CDRH 3 | DYGSSYSFDY | 93 | |||
| DYGSAYSFHP | 101 | ||||
| DYGSAYSMST | 103 | ||||
| DYGSAYSYSL | 105 | ||||
| DYGSSYSYNV | 107 | ||||
| CDRL 1 | RPSQDISNYLN | 95 | |||
| QASQDISNYLN | 113 | ||||
| CDRL 2 | YTSRLRS | 96 | |||
| YTSRARS | 119 | ||||
| YTTRLRS | 124 | ||||
| YTGRLRS | 126 | ||||
| YTTRARS | 130 | ||||
| YTGRARS | 132 | ||||
| CDRL 3 | QQGDTLPYT | 97 | |||
| 重鏈可變結構域 | |||||
| 結構域 | SEQ ID NO: | 結構域 | SEQ ID NO: | ||
| hCD137 MAB-1 VH1 | 99 | hCD137 MAB-1 VH1D | 106 | ||
| hCD137 MAB-1 VH1A | 100 | hCD137 MAB-1 VH1E | 108 | ||
| hCD137 MAB-1 VH1B | 102 | hCD137 MAB-1 VH1F | 109 | ||
| hCD137 MAB-1 VH1C | 104 | hCD137 MAB-1 VH1G | 110 | ||
| 輕鏈可變結構域 | |||||
| 結構域 | SEQ ID NO: | 結構域 | SEQ ID NO: | ||
| hCD137 MAB-1 VL1 | 112 | hCD137 MAB-1 VL9 | 122 | ||
| hCD137 MAB-1 VL2 | 114 | hCD137 MAB-1 VL10 | 123 | ||
| hCD137 MAB-1 VL3 | 115 | hCD137 MAB-1 VL11 | 125 | ||
| hCD137 MAB-1 VL4 | 116 | hCD137 MAB-1 VL12 | 127 | ||
| hCD137 MAB-1 VL5 | 117 | hCD137 MAB-1 VL13 | 128 | ||
| hCD137 MAB-1 VL6 | 118 | hCD137 MAB-1 VL14 | 129 | ||
| hCD137 MAB-1 VL7 | 120 | hCD137 MAB-1 VL15 | 131 | ||
| hCD137 MAB-1 VL8 | 121 | ||||
CD137 MAB-2
是新型的鼠單克隆抗體。CD137 MAB-2
的VH結構域(CD137 MAB-2 VH
)的氨基酸序列是(SEQ ID NO:133
) (CDRH
殘基以底線顯示)：
QVQLQQPGAE LVRPGASVKL SCKASGYTFT SYWIN
WVKQR PGQGLEWIG N IYPSDSYTNY DQKFKD
KATL TVDKSSSTAY MQLSSPTSED SAVYYCTK SG EYGKIGYYAM DY
WGQGTSVT VSS
CD137 MAB-2 VH
的CDRH
的氨基酸序列是：
CDRH
1 (SEQ ID NO:91
): SYWIN
CDRH
2 (SEQ ID NO:92
): NIYPSDSYTNYDQKFKD
CDRH
3 (SEQ ID NO:134
): SGEYGKIGYYAMDY
CD137 MAB-2
的VL結構域(CD137 MAB-2 VL
)的氨基酸序列是(SEQ ID NO:135
) (CDRL
殘基以底線顯示)：
DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISC RASQDIS NYLN
WYQQKP DGTVKLLIY Y TSRLHS
GVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFC QQ GNTLPYT
FGG GTKLEIK
CD137 MAB-2 VL
的CDRL
的氨基酸序列是：
CDRL
1 (SEQ ID NO:136
): RASQDISNYLN
CDRL
2 (SEQ ID NO:137
): YTSRLHS
CDRL
3 (SEQ ID NO:138
): QQGNTLPYT
具有包含L234A/L235A Fc突變的IgG1/κ人重鏈和輕鏈恒定區(參見，例如，SEQ ID NOs:40
、42 、 44 和 46-49
)和鼠VH/VL 結構域的嵌合衍生物，被生成(被命名：chCD137 MAB-2
)並且用於以下實施例中描述的多個功能性測試中。
4. hCD137 MAB-2
抗體CD137MAB-2
被人源化和優化以產生一組本文被命名為“hCD137 MAB-2 VH1
”的一個優選的人源化VH結構域；和本文被命名為“hCD137 MAB-2 VL1
”和“hCD137 MAB-2 VL2
”的兩個優選的人源化VL結構域。人源化VL結構域的任何一個可與人源化VH結構域配對。因此，包含與人源化VH結構域配對的人源化VL結構域之一的任何結合結構域通常被稱為“hCD137 MAB-2
”，並且人源化VL/VH結構域的特定組合通過參照具體的VH/VL結構域被提及，例如包含hCD137 MAB-2 VH1
和hCD137 MAB-2 VL2
的結合結構域被特別地稱為“hCD137 MAB-2 (1.2)
”。以下提供了人源化VH和VL結構域的氨基酸序列。
本文被稱為“hCD137 MAB-2 VH1
”的hCD137 MAB-2
的人源化VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:139
) (CDRH
殘基以底線顯示)：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWIN
WVRQA PGQGLEWMG N IYPSDSYTNY DQKFKD
RVTM TRDTSTSTVY MELSSLRSED TAVYYCTK SG EYGKIGYYAM DY
WGQGTTVT VSS
本文被稱為“hCD137 MAB-2 VL
”的hCD137 MAB-2
的人源化VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:140)
(CDRL
殘基以底線顯示)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQDIS NYLN
WYQQKP DKTVKLLIY Y TSRLHS
GVPS RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDIATYX1
C QQ GNTLPYT
FGQ GTKLEIK
其中X1
是F或Y。
hCD137 MAB-2 VL1
的氨基酸序列是(SEQ ID NO:141
) (CDRL
殘基以底線顯示)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQDIS NYLN
WYQQKP DKTVKLLIY Y TSRLHS
GVPS RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDIATYFC QQ GNTLPYT
FGQ GTKLEIK
hCD137 MAB-2 VL2
的氨基酸序列是(SEQ ID NO:142
) (CDRL
殘基以底線顯示)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQDIS NYLN
WYQQKP DKTVKLLIY Y TSRLHS
GVPS RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDIATYYC QQ GNTLPYT
FGQ GTKLEIK
5. 烏瑞魯單抗(CD137 MAB-A)
烏瑞魯單抗(CD137 MAB-A
)的VH結構域(CD137 MAB-A VH
)的氨基酸序列是(SEQ ID NO:143)
(CDRH
殘基以底線顯示)：
QVQLQQWGAG LLKPSETLSL TCAVYGGSFS GYYWS
WIRQS PEKGLEWIG E INHGGYVTYN PSLES
RVTIS VDTSKNQFSL KLSSVTAADT AVYYCAR DYG PGNYDWYFDL
WGRGTLVTVS S
烏瑞魯單抗(CD137 MAB-A
)的VL結構域(CD137 MAB-A VL
)的氨基酸序列是(SEQ ID NO:144)
(CDRL
殘基以底線顯示)：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASQSVS SYLA
WYQQKP GQAPRLLIY D ASNRAT
GIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYC QQ RSNWPPALT
F GGGTKVEIK
6. 烏托魯單抗(CD137 MAB-B)
烏托魯單抗(CD137 MAB-B
)的VH結構域(CD137 MAB-B VH
)的氨基酸序列是(SEQ ID NO:145)
(CDRH
殘基以底線顯示)：
EVQLVQSGAE VKKPGESLRI SCKGSGYSFS TYWIS
WVRQM PGKGLEWMG K IYPGDSYTNY SPSFQG
QVTI SADKSISTAY LQWSSLKASD TAMYYCAR GY GIFDY
WGQGT LVTVSS
烏托魯單抗(CD137 MAB-B
)的VL結構域(CD137 MAB-B VL
)的氨基酸序列是(SEQ ID NO:146)
(CDRL
殘基以底線顯示)：
SYELTQPPSV SVSPGQTASI TC SGDNIGDQ YAH
WYQQKPG QSPVLVIY QD KNRPS
GIPER FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYC ATY TGFGSLAV
FG GGTKLTVL
本發明特別地包括和涵蓋PD-L1 x CD137
結合分子，其包含CD137 MAB-1
(尤其是hCD137 MAB-1
的那些)、CD137 MAB-2
(尤其是hCD137 MAB-2
的那些)、CD137 MAB-B
或本領域已知的其他抗-CD137抗體(優選地在沒有交聯的情況下具有最小的激動劑活性的抗-CD137抗體)中的任一者的VL和/或VH結構域、和/或VL區的CDRL
中的1個、2個或全部3個和/或VH結構域的CDRH
中的1個、2個或全部3個；和更優選地，擁有這種抗-CD137單克隆抗體的VL區的CDRL
中的1個、2個或全部3個和/或VH結構域的CDRH
中的1個、2個或全部3個。
VI. 示例性PD-L1 x CD137結合分子
本發明的優選的PD-L1 x CD137
結合分子是雙特異性雙抗體和三叉戟(trident)分子。這種雙抗體包括2條、3條、4條、5條或多於5條的多肽鏈，並且通過涉及不同多肽鏈的一個或多個共價鍵穩定。同樣優選的是多特異性三叉戟分子，其包括4條、5條或多於5條的多肽鏈，並且通過涉及不同多肽鏈的一個或多個共價鍵穩定。本發明通過提供四種雙特異性DART®雙抗體DART-A
、DART-B
、DART-C
和DART-D
和三種多特異性TRIDENT™分子例證了這種PD-L1 x CD137
結合分子。
1. DART-A
DART-A
是包括五條多肽鏈的雙特異性雙抗體，並且能夠結合至PD-L1和CD137。在圖 5A
中示意性描述，其中其VL1和VH1是PD-L1 MAB-A
阿特珠單抗(atexolizumab)的對應的結合結構域和VL2、VH2、VL3和VH3是CD137 MAB-B
(烏托魯單抗)的對應的結合結構域(參見，圖 5B
)。因此，DART-A
具有兩個PD-L1 MAB-A
(阿特珠單抗)結合位點和兩個CD137 MAB-B
(烏托魯單抗)結合位點。
DART-A
的第一多肽鏈具有氨基酸序列(SEQ ID NO:147
)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DSWIHWVRQA PGKGLEWVAW ISPYGGSTYY ADSVKGRFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCARRH WPGGFDYWGQ GTLVTVSS
AS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRV EPKS CDKTHTCPPC P
APEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK
因此
，DART-A
的第一多肽鏈在N-端至C-端方向包含PD-L1 MAB-A
(阿特珠單抗)的VH結構域(SEQ ID NO:83
，加底線的)、人IgG1 CH1結構域(SEQ ID NO:3
)、人IgG1鉸鏈結構域(SEQ ID NO:7
，加底線的)和“含有臼”的人CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:47
)。
DART-A
的第二和第五多肽鏈是相同的且具有氨基酸序列(SEQ ID NO:148
)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASFLYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YLYHPATFGQ GTKVEIK
RTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
因此，DART-A
的第二和第五多肽鏈在N-端至C-端方向包含PD-L1 MAB-A
(阿特珠單抗)的VL結構域(SEQ ID NO:84
，加底線的)和人CL κ結構域(SEQ ID NO:1
)。
DART-A
的第三多肽鏈具有氨基酸序列(SEQ ID NO:149
)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DSWIHWVRQA PGKGLEWVAW ISPYGGSTYY ADSVKGRFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCARRH WPGGFDYWGQ GTLVTVSS
AS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRV EPKS CDKTHTCPPC P
APEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLWCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG GGG SGGGSGGG
SY ELTQPPSVSV SPGQTASITC SGDNIGDQYA HWYQQKPGQS PVLVIYQDKN RPSGIPERFS GSNSGNTATL TISGTQAMDE ADYYCATYTG FGSLAVFGGG TKLTVL GGGS GGGG
EVQLVQ SGAEVKKPGE SLRISCKGSG YSFSTYWISW VRQMPGKGLE WMGKIYPGDS YTNYSPSFQG QVTISADKSI STAYLQWSSL KASDTAMYYC ARGYGIFDYW GQGTLVTVSS GGCGGG
EVAA LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEK
因此，DART-A
的第三多肽鏈在N-端至C-端方向包含PD-L1 MAB-A
(阿特珠單抗)的VH結構域(SEQ ID NO:83
，加底線的)、人IgG1 CH1結構域(SEQ ID NO:3
)、人IgG1鉸鏈結構域(SEQ ID NO:7
，加底線的)、“攜帶杵”的人CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:44
)、連接體(SEQ ID NO:24
，加底線的)、CD137 MAB-B
(烏托魯單抗)的VL結構域(SEQ ID NO:146
)、連接體1 (SEQ ID NO:16
，加底線的)、CD137 MAB-B
(烏托魯單抗)的VH結構域(SEQ ID NO:145
)、連接體2 (SEQ ID NO:18
，加底線的)和E-螺旋異源二聚體-促進結構域(SEQ ID NO:36
)。
DART-A
的第四多肽鏈具有氨基酸序列(SEQ ID NO:150
)：
SYELTQPPSV SVSPGQTASI TCSGDNIGDQ YAHWYQQKPG QSPVLVIYQD KNRPSGIPER FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCATY TGFGSLAVFG GGTKLTVL GG GSGGGG
EVQL VQSGAEVKKP GESLRISCKG SGYSFSTYWI SWVRQMPGKG LEWMGKIYPG DSYTNYSPSF QGQVTISADK SISTAYLQWS SLKASDTAMY YCARGYGIFD YWGQGTLVTV SS GGCGGG
KV AALKEKVAAL KEKVAALKEK VAALKE
因此，DART-A
的第四多肽鏈在N-端至C-端方向包含CD137 MAB-B
(烏托魯單抗)的VL結構域(SEQ ID NO:146
)、連接體1 (SEQ ID NO:16
，加底線的)、CD137 MAB-B
(烏托魯單抗)的VH結構域(SEQ ID NO:145
)、連接體2 (SEQ ID NO:18
，加底線的)和K-螺旋異源二聚體-促進結構域(SEQ ID NO:37
)。
2. DART-B
DART-B
是包括五條多肽鏈的雙特異性雙抗體，並且能夠結合至PD-L1和CD137。在圖5A中示意性描述，其中其VL1和VH1是PD-L1 MAB-A
(阿特珠單抗)的對應的結合結構域和VL2、VH2、VL3和VH3是hCD137 MAB-1 (1D.3)
的對應的結合結構域(參見，圖 5B
)。因此，DART-B
具有兩個PD-L1 MAB-A
結合位點和兩個hCD137 MAB-1 (1D.3)
結合位點。
DART-B
的第一多肽鏈具有與DART-A
的第一多肽鏈相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:147
)。因此，DART-B
的第一多肽鏈在N-端至C-端方向包含PD-L1 MAB-A
(阿特珠單抗)的VH結構域、人IgG1 CH1結構域、人IgG1鉸鏈結構域和“含有臼”的人CH2-CH3結構域。
DART-B
的第二和第五多肽鏈具有與DART-A
的第二和第五多肽鏈相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:148
)。因此，DART-B
的第二和第五多肽鏈在N-端至C-端方向包含PD-L1 MAB-A
(阿特珠單抗)的VL結構域和人CL κ結構域(SEQ ID NO:1
)。
DART-B
的第三多肽鏈具有氨基酸序列(SEQ ID NO:151
)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DSWIHWVRQA PGKGLEWVAW ISPYGGSTYY ADSVKGRFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCARRH WPGGFDYWGQ GTLVTVSS
AS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRV EPKS CDKTHTCPPC P
APEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLWCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG GGG SGGGSGGG
DI QMTQSPSSLS ASVGDRVTIT CRPSQDISNY LNWYQQKPDK TVKLLIYYTS RLRSGVPSRF SGSGSGTDFT FTISSLQPED IATYFCQQGD TLPYTFGQGT KLEIK GGGSG GGG
QVQLVQS GAEVKKPGAS VKVSCKASGY TFTSYWINWV KQAPGQGLEW IGNIYPSDSY TNYNQKFKDK ATITADKSTS TAYMELSSLR SEDTAVYYCT RDYGSSYSYN VWGQGTTVTV SS GGCGGG
EV AALEKEVAAL EKEVAALEKE VAALEK
因此，DART-B
的第三多肽鏈在N-端至C-端方向包含PD-L1 MAB-A
(阿特珠單抗)的VH結構域 (SEQ ID NO:83
，加底線的)、人IgG1 CH1結構域(SEQ ID NO:3
)、人IgG1鉸鏈結構域(SEQ ID NO:7
，加底線的)、“攜帶杵”的人CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:44
)、連接體(SEQ ID NO:24
，加底線的)、
VL結構域hCD137 MAB-1 VL3
(SEQ ID NO:115
)、連接體1 (SEQ ID NO:16
，加底線的)、VH結構域hCD137 MAB-1 VH1D
(SEQ ID NO:106
)、連接體2 (SEQ ID NO:18
，加底線的)和E-螺旋異源二聚體-促進結構域(SEQ ID NO:36
)。
DART-B
的第四多肽鏈具有氨基酸序列(SEQ ID NO:152
)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIK GGG SGGGG
QVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSSYS YNVWGQGTTV TVSS GGCGGG
KVAALKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
因此，DART-B
的第四多肽鏈在N-端至C-端方向包含VL結構域hCD137 MAB-1 VL3
(SEQ ID NO:115
)、連接體1(SEQ ID NO:16
，加底線的)、VH結構域hCD137 MAB-1 VH1D
(SEQ ID NO:106
)、連接體2 (SEQ ID NO:18
，加底線的)和K-螺旋異源二聚體-促進結構域(SEQ ID NO:37
)。
3. DART-C
DART-C
是包括五條多肽鏈的雙特異性雙抗體，並且能夠結合至PD-L1和CD137。在圖5A中示意性描述，其中其VL1和VH1是PD-L1 MAB-3
的對應的結合結構域和VL2、VH2、VL3和VH3是hCD137 MAB-1 (1D.3)
的對應的結合結構域(參見，圖 5B
)。因此，DART-C
具有兩個PD-L1 MAB-3
結合位點和CD137 MAB-1 (1D.3)
結合位點。
DART-C
的第一多肽鏈具有氨基酸序列(SEQ ID NO:153
)： DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PEKGLEWVAY ISSGSSIIFY ADTVKGRFTI SRDNPKNTLF LQMTSLRSED TAMYYCAREI TTAPFAYWGQ GTLVTVSA
AS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRV EPKS CDKTHTCPPC P
APEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK
因此，DART-C
的第一多肽鏈在N-端至C-端方向包含PD-L1 MAB-3 的
VH結構域 (SEQ ID NO:73
，加底線的)、人IgG1 CH1結構域(SEQ ID NO:3
)、人IgG1 鉸鏈結構域(SEQ ID NO:7
，加底線的)和“含有臼”的人CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:47
)。
DART-C
的第二和第五多肽鏈是相同的且具有氨基酸序列(SEQ ID NO:154
)： SIVMTQTPTF LLVSAGDRVT ITCKASQSVS SDVAWYQQKP GQSPKLLIYY ASNRYTGVPD RFTGSGYGTD FTFTISTVQT EDLAVYFCHQ DYSSPFTFGS GTKLEIK
RTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
因此，DART-C
的第二和第五多肽鏈在N-端至C-端方向包含PD-L1 MAB-3
的VL結構域(SEQ ID NO:77
，加底線的)和人CL κ結構域(SEQ ID NO:1
)。
DART-C
的第三多肽鏈具有氨基酸序列(SEQ ID NO:155
)： DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PEKGLEWVAY ISSGSSIIFY ADTVKGRFTI SRDNPKNTLF LQMTSLRSED TAMYYCAREI TTAPFAYWGQ GTLVTVSA
AS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRV EPKS CDKTHTCPPC P
APEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLWCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG GGG SGGGSGGG
DI QMTQSPSSLS ASVGDRVTIT CRPSQDISNY LNWYQQKPDK TVKLLIYYTS RLRSGVPSRF SGSGSGTDFT FTISSLQPED IATYFCQQGD TLPYTFGQGT KLEIK GGGSG GGG
QVQLVQS GAEVKKPGAS VKVSCKASGY TFTSYWINWV KQAPGQGLEW IGNIYPSDSY TNYNQKFKDK ATITADKSTS TAYMELSSLR SEDTAVYYCT RDYGSSYSYN VWGQGTTVTV SS GGCGGG
EV AALEKEVAAL EKEVAALEKE VAALEK
因此，DART-C
的第三多肽鏈在N-端至C-端方向包含PD-L1 MAB-3
的VH結構域(SEQ ID NO:73
，加底線的)、人IgG1 CH1結構域(SEQ ID NO:3
)、人IgG1鉸鏈結構域(SEQ ID NO:7
，加底線的)、“攜帶杵”的人CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:44
)、連接體(SEQ ID NO:24
，加底線的)、VL結構域hCD137 MAB-1 VL3
(SEQ ID NO:115
)、連接體1 (SEQ ID NO:16
，加底線的)、VH結構域hCD137 MAB-1 VH1D
(SEQ ID NO:106
)、連接體2 (SEQ ID NO:18
，加底線的)和E-螺旋異源二聚體-促進結構域(SEQ ID NO:36
)。
DART-C
的第四多肽鏈與DART-B
的第四多肽鏈具有相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:152
)。因此，DART-C
的第四多肽鏈在N-端至C-端方向包含VL結構域hCD137 MAB-1 VL3
、連接體1、VH結構域hCD137 MAB-1 VH1D
、連接體2和K-螺旋異源二聚體-促進結構域。
4. DART-D
DART-D
是包括五條多肽鏈的雙特異性雙抗體，並且能夠結合至PD-L1和CD137。在圖5A中示意性描述，其中其VL1和VH1是PD-L1 MAB-2
的對應的結合結構域和VL2、VH2、VL3和VH3是hCD137 MAB-1 (1D.3)
的對應的結合結構域(參見，圖 5B
)。因此，DART-C
具有兩個PD-L1 MAB-2
結合位點和兩個CD137 MAB-1 (1D.3)
結合位點。
DART-D
的第一多肽鏈具有氨基酸序列(SEQ ID NO:156
)： EVKLVESGGG LVQPGGSLKL SCAASGFTFS SYTMSWVRQT PERRLEWVAY ISIGGGTTYY PDTVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMSSLKSED TAMYYCARQG LPYYFDYWGQ GTTLTVSS
AS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRV EPKS CDKTHTCPPC P
APEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK
因此，DART-D
的第一多肽鏈在N-端至C-端方向包含PD-L1 MAB-2 的
VH結構域 (SEQ ID NO:63
，加底線的)、人IgG1 CH1結構域(SEQ ID NO:3
) 、人IgG1鉸鏈結構域(SEQ ID NO:7
，加底線的)和“含有臼”的人CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:47
)。
DART-D
的第二和第五多肽鏈是相同的且具有氨基酸序列(SEQ ID NO:157
)： DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GQSPKLLIYW ASTRHTGVPD RFTGSGSGTD FTLTISSVQA EDLALYYCQQ HYNTPLTFGA GTKLELK
RTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
因此，DART-D
的第二和第五多肽鏈在N-端至C-端方向包含PD-L1 MAB-2
的VL結構域(SEQ ID NO:67
，加底線的)和人CL κ結構域(SEQ ID NO:1
)。
DART-D
的第三多肽鏈具有氨基酸序列(SEQ ID NO:158
)： EVKLVESGGG LVQPGGSLKL SCAASGFTFS SYTMSWVRQT PERRLEWVAY ISIGGGTTYY PDTVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMSSLKSED TAMYYCARQG LPYYFDYWGQ GTTLTVSS
AS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRV EPKS CDKTHTCPPC P
APEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLWCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG GGG SGGGSGGG
DI QMTQSPSSLS ASVGDRVTIT CRPSQDISNY LNWYQQKPDK TVKLLIYYTS RLRSGVPSRF SGSGSGTDFT FTISSLQPED IATYFCQQGD TLPYTFGQGT KLEIK GGGSG GGG
QVQLVQS GAEVKKPGAS VKVSCKASGY TFTSYWINWV KQAPGQGLEW IGNIYPSDSY TNYNQKFKDK ATITADKSTS TAYMELSSLR SEDTAVYYCT RDYGSSYSYN VWGQGTTVTV SS GGCGGG
EV AALEKEVAAL EKEVAALEKE VAALEK
因此，DART-D
的第三多肽鏈在N-端至C-端方向包含PD-L1 MAB-2
的VH結構域(SEQ ID NO:63
，加底線的)、人IgG1 CH1結構域(SEQ ID NO:3
) 、人IgG1鉸鏈結構域(SEQ ID NO:7
，加底線的)、“攜帶杵”的人CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:44
)、連接體(SEQ ID NO:24
，加底線的)、VL結構域hCD137 MAB-1 VL3
(SEQ ID NO:115
)、連接體1 (SEQ ID NO:16
，加底線的)、VH結構域hCD137 MAB-1 VH1D
(SEQ ID NO:106
)、連接體2 (SEQ ID NO:18
，加底線的)和E-螺旋異源二聚體-促進結構域(SEQ ID NO:36
)。
DART-D
的第四多肽鏈與DART-B
和DART-C
的第四多肽鏈具有相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:152
)。因此，DART-D
第四多肽鏈在N-端至C-端方向包含VL結構域hCD137 MAB-1 VL3
、連接體1、VH結構域hCD137 MAB-1 VH1D
、連接體2和K-螺旋異源二聚體-促進結構域。
5. DART-F
DART-F
是包括五條多肽鏈的雙特異性雙抗體，並且能夠結合至PD-L1和CD137。在圖5A中示意性描述，其中其VL1和VH1是hCD137 MAB-1 (1B.3)
的對應的結合結構域和VL2、VH2、VL3和VH3是hPD-L1 MAB-3 (1.1)
的對應的結合結構域(參見，圖 5C
)。因此，DART-F
具有兩個hCD137 MAB-1 (1B.3)
結合位點和兩個hPD-L1 MAB-3 (1.1)
結合位點。
DART-F
的第一多肽鏈具有氨基酸序列(SEQ ID NO:169
)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWINWVKQA PGQGLEWIGN IYPSDSYTNY NQKFKDKATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCTRDY GSAYSMSTWG QGTTVTVSS
A STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRV EPK SCDKTHTCPP CP
APEAAGGP SVFLFPPKPK DTLYITREPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNRYTQ KSLSLSPGK
因此，DART-F
的第一多肽鏈在N-端至C-端方向包含VH結構域hCD137 MAB-1 VH1B
(SEQ ID NO:102
，加底線的)、人IgG1 CH1結構域(SEQ ID NO:3
)、人IgG1鉸鏈結構域(SEQ ID NO:7
，加底線的)和包括YTE取代的“含有臼”的人CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:49
)。
DART-F
的第二和第五多肽鏈是相同的且具有氨基酸序列(SEQ ID NO:170
)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIK
RTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
因此，DART-F
的第二和第五多肽鏈在N-端至C-端方向包含hCD137 MAB-1 VL3
的VL結構域(SEQ ID NO:115
，加底線的)和人CL κ結構域(SEQ ID NO:1
)。
DART-F
的第三多肽鏈具有氨基酸序列(SEQ ID NO:171
)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWINWVKQA PGQGLEWIGN IYPSDSYTNY NQKFKDKATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCTRDY GSAYSMSTWG QGTTVTVSS
A STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRV EPK SCDKTHTCPP CP
APEAAGGP SVFLFPPKPK DTLYITREPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPG GG GSGGGSGGG
D IQMTQSPSSL SASVGDRVTI TCKASQSVSS DVAWYQQKPG KAPKLLIYYA SNRYTGVPSR FSGSGYGTDF TFTISSLQPE DIATYYCHQD YSSPFTFGQG TKLEIK GGGS GGGG
EVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSSFGMHW VRQAPGKGLE WVAYISSGSS IIFYADTVKG RFTISRDNAK NTLYLQMNSL RAEDTAVYYC AREITTAPFA YWGQGTLVTV SS GGCGGG
EV AALEKEVAAL EKEVAALEKE VAALEK
因此，DART-F
的第三多肽鏈在N-端至C-端方向包含VH結構域hCD137 MAB-1 VH1B
(SEQ ID NO:102
，加底線的)、人IgG1 CH1結構域(SEQ ID NO:3
)、人IgG1鉸鏈結構域(SEQ ID NO:7
，加底線的)、包括YTE取代的“攜帶杵”的人CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:46
)、連接體(SEQ ID NO:24
，加底線的)、VL結構域hPD-L1 MAB-3 VL1
(SEQ ID NO:82
)、連接體1 (SEQ ID NO:16
，加底線的)、VH結構域hPD-L1 MAB-3 VH1
(SEQ ID NO:81
)、連接體2 (SEQ ID NO:18
，加底線的)和E-螺旋異源二聚體-促進結構域(SEQ ID NO:36
)。
DART-F
的第四多肽鏈具有氨基酸序列(SEQ ID NO:172
)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQSVS SDVAWYQQKP GKAPKLLIYY ASNRYTGVPS RFSGSGYGTD FTFTISSLQP EDIATYYCHQ DYSSPFTFGQ GTKLEIK GGG SGGGG
EVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSSFGMH WVRQAPGKGL EWVAYISSGS SIIFYADTVK GRFTISRDNA KNTLYLQMNS LRAEDTAVYY CAREITTAPF AYWGQGTLVT VSS GGCGGG
K VAALKEKVAA LKEKVAALKE KVAALKE
因此，DART-F
的第四多肽鏈在N-端至C-端方向包含VL結構域hPD-L1 MAB-3 VL1
(SEQ ID NO:82
)、連接體1 (SEQ ID NO:16
，加底線的)、VH結構域hPD-L1 MAB-3 VH1
(SEQ ID NO:81
)、連接體2 (SEQ ID NO:18
，加底線的)和K-螺旋異源二聚體-促進結構域(SEQ ID NO:37
)。
6. DART-G
DART-G
是包括五條多肽鏈的雙特異性雙抗體，並且能夠結合至PD-L1和CD137。在圖5A中示意性描述，其中其VL1和VH1是hCD137 MAB-1 (1B.3)
的對應的結合結構域和VL2、VH2、VL3和VH3是hPD-L1 MAB-2 (1.1)
的對應的結合結構域(參見，圖 5C
)。因此，DART-G
具有兩個hCD137 MAB-1 (1B.3)
結合位點和兩個hPD-L1 (1.1) MAB-2
結合位點。
DART-G
的第一多肽鏈具有與DART-F
的第一多肽鏈相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:169
)。因此，DART-G
的第一多肽鏈在N-端至C-端方向包含VH結構域hCD137 MAB-1 VH1B
、人IgG1 CH1 結構域、人IgG1鉸鏈結構域和包括YTE取代的“含有臼”的人CH2-CH3結構域。
DART-G
的第二和第五多肽鏈具有與DART-F
的第二和第五多肽鏈相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:170
)。因此，DART-G
的第二和第五多肽鏈在N-端至C-端方向包含hCD137 MAB-1 VL3 的
VL結構域和人CL κ結構域。
DART-G
的第三多肽鏈具有氨基酸序列(SEQ ID NO:173
)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWINWVKQA PGQGLEWIGN IYPSDSYTNY NQKFKDKATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCTRDY GSAYSMSTWG QGTTVTVSS
A STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRV EPK SCDKTHTCPP CP
APEAAGGP SVFLFPPKPK DTLYITREPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPG GG GSGGGSGGG
D IQMTQSPSSL SASVGDRVTI TCKASQDVNT AVAWYQQKPG KAPKLLIYWA STRHTGVPSR FSGSGSGTDF TLTISSLQPE DFATYYCQQH YNTPLTFGQG TKVEIK GGGS GGGG
EVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSSYTMSW VRQAPGKGLE WVAYISIGGG TTYYPDTVKG RFTISRDNAK NTLYLQMNSL KTEDTAVYYC ARQGLPYYFD YWGQGTLVTV SS GGCGGG
EV AALEKEVAAL EKEVAALEKE VAALEK
因此，DART-G
的第三多肽鏈在N-端至C-端方向包含VH結構域hCD137 MAB-1 VH1B
(SEQ ID NO:102
，加底線的)、人IgG1 CH1結構域(SEQ ID NO:3
)、人IgG1鉸鏈結構域(SEQ ID NO:7
，加底線的)、包括YTE取代的“攜帶杵”的人CH2-CH3結構域 (SEQ ID NO:46
)、連接體(SEQ ID NO:24
，加底線的)、VL結構域hPD-L1 MAB-2 VL1
(SEQ ID NO:72
)、連接體1 (SEQ ID NO:16
，加底線的)、VH結構域hPD-L1 MAB-2 VH1
(SEQ ID NO:71
)、連接體2 (SEQ ID NO:18
，加底線的)和E-螺旋異源二聚體-促進結構域(SEQ ID NO:36
)。
DART-G
的第四多肽鏈具有氨基酸序列(SEQ ID NO:174
)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQSVS SDVAWYQQKP GKAPKLLIYY ASNRYTGVPS RFSGSGYGTD FTFTISSLQP EDIATYYCHQ DYSSPFTFGQ GTKLEIK GGG SGGGG
EVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSSFGMH WVRQAPGKGL EWVAYISSGS SIIFYADTVK GRFTISRDNA KNTLYLQMNS LRAEDTAVYY CAREITTAPF AYWGQGTLVT V SSGGCGGG
K VAALKEKVAA LKEKVAALKE KVAALKE
因此，DART-G
的第四多肽鏈在N-端至C-端方向包含VL結構域hPD-L1 MAB-2 VL1
(SEQ ID NO:72
)、連接體1 (SEQ ID NO:16
，加底線的)、VH結構域hPD-L1 MAB-2 VH1
(SEQ ID NO:71
)、連接體2 (SEQ ID NO:18
，加底線的)和K-螺旋異源二聚體-促進結構域(SEQ ID NO:37
)。
7. TRIDENT-C
TRIDENT-C
是包括四條多肽鏈的多特異性結合分子，並且能夠結合至PD-L1和CD137。在圖 6A
中示意性描述，其中其VL1和VH1是PD-L1 MAB-3
的對應的結合結構域和VL2、VH2、VL3和VH3是hCD137 MAB-1 (1D.3)
的對應的結合結構域(參見，例如圖 6B
)。因此，TRIDENT-C
具有一個PD-L1 MAB-2
結合位點和兩個CD137 MAB-1 (1D.3)
結合位點。
TRIDENT-C
的第一多肽鏈與DART-C
的第一多肽鏈具有相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:153
)。因此，TRIDENT-C
的第一多肽鏈在N-端至C-端方向包含PD-L1 MAB-3 的
VH結構域 (SEQ ID NO:73
，加底線的)、人IgG1 CH1結構域(SEQ ID NO:3
)、人IgG1鉸鏈結構域(SEQ ID NO:7
，加底線的)和“含有臼”的人CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:47
)。
TRIDENT-C
的第二多肽鏈與DART-C
的第二多肽鏈具有相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:154
)。因此，TRIDENT-C
的第二多肽鏈在N-端至C-端方向包含PD-L1 MAB-3
的VL結構域和人CL κ結構域。
TRIDENT-C
的第三多肽鏈具有氨基酸序列(SEQ ID NO:159
)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIK GGG SGGGG
QVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSSYS YNVWGQGTTV TVSS ASTKG
E VAACEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEK GGG DKTHTCPPCP
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
因此，TRIDENT-C
的第三多肽鏈在N-端至C-端方向包含VL結構域hCD137 MAB-1 VL3
(SEQ ID NO:115
)、連接體1 (SEQ ID NO:16
，加底線的)、VH結構域hCD137 MAB-1 VH1D
(SEQ ID NO:106
)、連接體(SEQ ID NO:19
，加底線的)、含半胱氨酸的E-螺旋異源二聚體-促進結構域(SEQ ID NO:38
)、連接體(SEQ ID NO:21
，加底線的)和“攜帶杵”的人CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:44
)。
TRIDENT-C
的第四多肽鏈具有氨基酸序列(SEQ ID NO:160
)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIK GGG SGGGG
QVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSSYS YNVWGQGTTV TVSS ASTKG
K VAACKEKVAA LKEKVAALKE KVAALKE
因此，TRIDENT-C
的第四多肽鏈在N-端至C-端方向包含VL結構域hCD137 MAB-1 VL3
(SEQ ID NO:115
)、連接體1 (SEQ ID NO:16
，加底線的)、VH結構域hCD137 MAB-1 VH1D
(SEQ ID NO:106
)、連接體(SEQ ID NO:19
，加底線的)和含半胱氨酸的K-螺旋異源二聚體-促進結構域(SEQ ID NO:39
)。
8. TRIDENT-D
TRIDENT-D
是包括四條多肽鏈的多特異性結合分子，並且能夠結合至PD-L1和CD137。在圖6A中示意性描述，其中其VL1和VH1是PD-L1 MAB-2
的對應的結合結構域和VL2、VH2、VL3和VH3是hCD137 MAB-1 (1D.3)
的對應的結合結構域(參見，例如圖 6B
)。因此，TRIDENT-C
具有一個PD-L1 MAB-2
結合位點和兩個CD137 MAB-1 (1D.3)
結合位點。
TRIDENT-D
的第一多肽鏈與DART-D
的第一多肽鏈具有相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:156
)。因此，TRIDENT-D
的第一多肽鏈在N-端至C-端方向包含PD-L1 MAB-2 的
VH結構域、人IgG1 CH1結構域、人CH1鉸鏈結構域和“含有臼”的人CH2-CH3結構域。
TRIDENT-D
的第二多肽鏈與DART-D
的第二多肽鏈具有相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:157
)。因此，TRIDENT-D
的第二多肽鏈在N-端至C-端方向包含PD-L1 MAB-2
的VL結構域和人CL κ結構域。
TRIDENT-D 的
第三多肽鏈與TRIDENT C
的第三多肽鏈具有相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:159
)。因此，TRIDENT-D
的第三多肽鏈在N-端至C-端方向包含VL結構域hCD137 MAB-1 VL3
、連接體1、VH結構域hCD137 MAB-1 VH1D
、連接體、含半胱氨酸的E-螺旋異源二聚體-促進結構域、連接體和 “攜帶杵”的人CH2-CH3結構域。
TRIDENT-D
的第四多肽鏈與TRIDENT C
的第四多肽鏈具有相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:160
)。因此，TRIDENT-D
的第四多肽鏈在N-端至C-端方向包含VL結構域hCD137 MAB-1 VL3
、連接體1、VH結構域hCD137 MAB-1 VH1D
、連接體和含半胱氨酸的K-螺旋異源二聚體-促進結構域。
9. TRIDENT-E
TRIDENT-E
是包括四條多肽鏈的多特異性結合分子，並且能夠結合至PD-L1和CD137。在圖6A中示意性描述，其中其VL1和VH1是hPD-L1 MAB-3 (1.1)
的對應的結合結構域和VL2、VH2、VL3和VH3是hCD137 MAB-1(1E.15)
的對應的結合結構域。因此TRIDENT-E
具有一個hPD-L1 MAB-3 (1.1)
結合位點和兩個CD137 MAB-1 (1E.15)
結合位點。
TRIDENT-E
的第一多肽鏈具有氨基酸序列(SEQ ID NO:165
)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY ISSGSSIIFY ADTVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAREI TTAPFAYWGQ GTLVTVSS
AS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRV EPKS CDKTHTCPPC P
APEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK
因此，TRIDENT-E
的第一多肽鏈在N-端至C-端方向包含VH結構域hPD-L1 MAB-3 VH1
(SEQ ID NO:81
，加底線的)、人IgG1 CH1結構域(SEQ ID NO:3
)、人IgG1鉸鏈結構域(SEQ ID NO:7
，加底線的)和“含有臼”的人CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:47
)。
TRIDENT-E
的第二多肽鏈具有氨基酸序列(SEQ ID NO:166
)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQSVS SDVAWYQQKP GKAPKLLIYY ASNRYTGVPS RFSGSGYGTD FTFTISSLQP EDIATYYCHQ DYSSPFTFGQ GTKLEIK
RTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
因此，TRIDENT-E
的第二多肽鏈在N-端至C-端方向包含hPD-L1 MAB-3 VL1
的VL結構域 (SEQ ID NO:82
，加底線的)和人CL κ結構域(SEQ ID NO:1
)。
TRIDENT-E
的第三多肽鏈具有氨基酸序列(SEQ ID NO:167
)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQASQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TGRARSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIK GGG SGGGG
QVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVRQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSAYS MSTWGQGTTV TVSS ASTKG
E VAACEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEK GGG DKTHTCPPCP
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
因此，TRIDENT-E
的第三多肽鏈在N-端至C-端方向包含VL結構域hCD137 MAB-1 VL15
(SEQ ID NO:131
)、連接體1 (SEQ ID NO:16
，加底線的)、VH結構域hCD137 MAB-1 VH1E
(SEQ ID NO:108
)、連接體(SEQ ID NO:19
，加底線的)、含半胱氨酸的E-螺旋異源二聚體-促進結構域(SEQ ID NO:38
)、連接體(SEQ ID NO:21
，加底線的)和“攜帶杵”的人CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:44
)。
TRIDENT-E
的第四多肽鏈具有氨基酸序列(SEQ ID NO:168
)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQASQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TGRARSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIK GGG SGGGG
QVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVRQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSAYS MSTWGQGTTV TVSS ASTKG
K VAACKEKVAA LKEKVAALKE KVAALKE
因此，TRIDENT-E
的第四多肽鏈在N-端至C-端方向包含VL結構域hCD137 MAB-1 VL15
(SEQ ID NO:131
)、連接體1 (SEQ ID NO:16
，加底線的)、VH結構域hCD137 MAB-1 VH1E
(SEQ ID NO:108
)、連接體(SEQ ID NO:19
，加底線的)和含半胱氨酸的K-螺旋異源二聚體-促進結構域(SEQ ID NO:39
)。
10. TRIDENT F
TRIDENT-F
是包括四條多肽鏈的多特異性結合分子，並且能夠結合至PD-L1和CD137。在圖6A中示意性描述，其中其VL1和VH1是hPD-L1 MAB-3 (1.1)
的對應的結合結構域和VL2、VH2、VL3和VH3是hCD137 MAB-1 (1B.3)
的對應的結合結構域(參見，例如，圖 6B
)。因此，TRIDENT-F
具有一個hPD-L1 MAB-3 (1.1)
結合位點和兩個CD137 MAB-1 (1B.3)
結合位點。
TRIDENT-F
的第一多肽鏈具有氨基酸序列(SEQ ID NO:175
)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY ISSGSSIIFY ADTVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAREI TTAPFAYWGQ GTLVTVSS
AS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRV EPKS CDKTHTCPPC P
APEAAGGPS VFLFPPKPKD TLYITREPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK
因此，TRIDENT-F
的第一多肽鏈在N-端至C-端方向包含VH結構域hPD-L1 MAB-3 VH1
(SEQ ID NO:81
，加底線的)、人IgG1 CH1結構域(SEQ ID NO:3
)、人IgG1鉸鏈結構域(SEQ ID NO:7
，加底線的)和包括YTE取代的“含有臼”的人CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:49
)。
TRIDENT-F
的第二多肽鏈與TRIDENT-E
的第二多肽鏈具有相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:167
)。因此，TRIDENT-F
的第二多肽鏈在N-端至C-端方向包含hPD-L1 MAB-3 VL1
的VL結構域和人CL κ結構域。
TRIDENT-F
的第三多肽鏈具有氨基酸序列(SEQ ID NO:176
)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIK GGG SGGGG
QVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSAYS MSTWGQGTTV TVSS ASTKG
E VAACEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEK GGG DKTHTCPPCP
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
因此，TRIDENT-F
的第三多肽鏈在N-端至C-端方向包含VL結構域hCD137 MAB-1 VL3
(SEQ ID NO:115
)、連接體1 (SEQ ID NO:16
，加底線的)、VH結構域hCD137 MAB-1 VH1B
(SEQ ID NO:102
)、連接體(SEQ ID NO:19
，加底線的)、含半胱氨酸的E-螺旋異源二聚體-促進結構域(SEQ ID NO:38
)、連接體(SEQ ID NO:21
，加底線的)和包括YTE取代的“攜帶杵”的人CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:46
)。
TRIDENT-F
的第四多肽鏈具有氨基酸序列(SEQ ID NO:177
)：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIK GGG SGGGG
QVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSAYS MSTWGQGTTV TVSS ASTKG
K VAACKEKVAA LKEKVAALKE KVAALKE
因此，TRIDENT-F
的第四多肽鏈在N-端至C-端方向包含VL結構域hCD137 MAB-1 VL3
(SEQ ID NO:115
)、連接體1 (SEQ ID NO:16
，加底線的)、VH結構域hCD137 MAB-1 VH1B
(SEQ ID NO:102
)、連接體(SEQ ID NO:19
，加底線的)和含半胱氨酸的K-螺旋異源二聚體-促進結構域(SEQ ID NO:39
)。
11. TRIDENT G
TRIDENT-G
是包括四條多肽鏈的多特異性結合分子，並且能夠結合至PD-L1和CD137。在圖6A中示意性描述，其中其VL1和VH1是hPD-L1 MAB-3 (1.1)
的對應的結合結構域和VL2、VH2、VL3和VH3是hCD137 MAB-1 (1B.3)
的對應的結合結構域(參見，例如，圖 6B
)。因此，TRIDENT-G
具有一個hPD-L1 MAB-3 (1.1)
結合位點和兩個CD137 MAB-1 (1B.3)
結合位點。
TRIDENT-G
的第一多肽鏈具有氨基酸序列(SEQ ID NO:178
)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYTMSWVRQA PGKGLEWVAY ISIGGGTTYY PDTVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMNSLKTED TAVYYCARQG LPYYFDYWGQ GTLVTVSS
AS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRV EPKS CDKTHTCPPC
PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLYITREPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK
因此，TRIDENT-G
的第一多肽鏈在N-端至C-端方向包含VH結構域hPD-L1 MAB-2 VH1
(SEQ ID NO:71
，加底線的)、人IgG1 CH1結構域(SEQ ID NO:3
)、人IgG1鉸鏈結構域(SEQ ID NO:7
，加底線的)和包括YTE取代的“含有臼”的人CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:49
)。
TRIDENT-G
的第二多肽鏈具有氨基酸序列(SEQ ID NO:179
)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW ASTRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYNTPLTFGQ GTKVEIK
RTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
因此，TRIDENT-G
的第二多肽鏈在N-端至C-端方向包含hPD-L1 MAB-2 VL1
的VL結構域 (SEQ ID NO:72
，加底線的)和人CL κ結構域(SEQ ID NO:1
)。
TRIDENT-G
的第三多肽鏈與TRIDENT F
的第三多肽鏈具有相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:176
)。因此，TRIDENT-G
的第三多肽鏈在N-端至C-端方向包含VL結構域hCD137 MAB-1 VL3
、連接體1、VH結構域hCD137 MAB-1 VH1B
、連接體、含半胱氨酸的E-螺旋異源二聚體-促進結構域、連接體和包括YTE取代的“攜帶杵”的人CH2-CH3結構域。
TRIDENT-G
的第四多肽鏈與TRIDENT F 的
第四多肽鏈具有相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:177
)。因此，TRIDENT-G
的第四多肽鏈在N-端至C-端方向包含VL結構域hCD137 MAB-1 VL3
、連接體1、VH結構域hCD137 MAB-1 VH1B
、連接體和含半胱氨酸的K-螺旋異源二聚體-促進結構域。
VII. 示例性PD-L1 x CD137結合分子的匯總
表 6
匯總了在以下實施例中產生的和表徵的本發明優選的PD-L1 x CD137
結合分子的結構域屬性。
| 表 6 ： 優選的 PD-L1 x CD137 結合分子的 結構域 屬性 | |||||
| 名稱 ( 鏈的數目) | 親代的mAbs | Fc 結構域 | 鏈編號 | SEQ ID NO. | 其他成分 |
| DART-A (5 條鏈 ) | PD-L1 MAB-A CD137 MAB-B | IgG1 (AA) (杵/臼) | 1 | 147 | CL/CH1和E/K螺旋 |
| 2/5 | 148 | ||||
| 3 | 149 | ||||
| 4 | 150 | ||||
| DART-B (5 條鏈 ) | PD-L1 MAB-A hCD137 MAB-1 (1D.3) | IgG1 (AA) (杵/臼) | 1 | 147 | CL/CH1和E/K螺旋 |
| 2/5 | 148 | ||||
| 3 | 151 | ||||
| 4 | 152 | ||||
| DART-C (5 條鏈 ) | PD-L1 MAB-3 hCD137 MAB-1 (1D.3) | IgG1 (AA) (杵/臼) | 1 | 153 | CL/CH1和E/K螺旋 |
| 2/5 | 154 | ||||
| 3 | 155 | ||||
| 4 | 152 | ||||
| DART-D (5 條鏈 ) | PD-L1 MAB-2 hCD137 MAB-1 (1D.3) | IgG1 (AA) (杵/臼) | 1 | 156 | CL/CH1和E/K螺旋 |
| 2/5 | 157 | ||||
| 3 | 158 | ||||
| 4 | 152 | ||||
| DART-F (5 條鏈 ) | hCD137 (1B.3) hPD-L1 MAB 3 (1.1) | IgG1 (AA) (杵/臼) | 1 | 169 | CL/CH1和E/K螺旋 |
| 2/5 | 170 | ||||
| 3 | 171 | ||||
| 4 | 172 | ||||
| DART-G (5 條鏈 ) | hCD137 (1B.3) hPD-L1 MAB 2 (1.1) | IgG1 (AA) (杵/臼) | 1 | 169 | CL/CH1和E/K螺旋 |
| 2/5 | 170 | ||||
| 3 | 173 | ||||
| 4 | 174 | ||||
| TRIDENT-C (4 條鏈 ) | PD-L1 MAB-3 hCD137 MAB-1 (1D.3) | IgG1 (AA) (杵/臼) | 1 | 153 | CL/CH1和E/K螺旋 |
| 2 | 154 | ||||
| 3 | 159 | ||||
| 4 | 160 | ||||
| TRIDENT-D (4 條鏈 ) | PD-L1 MAB-2 hCD137 MAB-1 (1D.3) | IgG1 (AA) (杵/臼) | 1 | 156 | CL/CH1和E/K螺旋 |
| 2 | 157 | ||||
| 3 | 159 | ||||
| 4 | 160 | ||||
| TRIDENT-E (4 條鏈 ) | hPD-L1 MAB-3 (1.1) hCD137 MAB-1 (1E.15) | IgG1 (AA) (杵/臼) | 1 | 165 | CL/CH1和E/K螺旋 |
| 2 | 166 | ||||
| 3 | 167 | ||||
| 4 | 168 | ||||
| TRIDENT-F (4 條鏈 ) | hPD-L1 MAB-3 (1.1) hCD137 MAB-1 (1B.3) | IgG1 (AA) (杵/臼) | 1 | 175 | CL/CH1和E/K螺旋 |
| 2 | 166 | ||||
| 3 | 176 | ||||
| 4 | 177 | ||||
| TRIDENT-G (4 條鏈 ) | hPD-L1 MAB-2 (1.1) hCD137 MAB-1 (1B.3) | IgG1 (AA) (杵/臼) | 1 | 178 | CL/CH1和E/K螺旋 |
| 2 | 179 | ||||
| 3 | 176 | ||||
| 4 | 177 |
包含可替選的PD-L1和/或CD137表位結合位點的另外的PD-L1 x CD137
結合分子可易於通過併入不同的VH和VL結構域產生。如上述提供的，本發明特別地包括和涵蓋PD-L1 x CD137
結合分子，其包含本文提供的或本領域已知的抗PL-L1和/或抗CD137抗體中任一者的VL和/或VH 結構域，和/或VL區的CDRL
中的1個、2個或全部3個，和/或VH結構域的CDRH
中的1個、2個或全部3個。優選地，本發明的PD-L1 x CD137
結合分子將包括人或人源化的VL和/或VH結構域，如hPD-L2 MAB-2
和hPD-L1 MAB-3
、hCD137 MAB-1
和hCD137 MAB-2
的那些。
VIII. 對照結合分子
為了更有意義地證明本發明的CD137 x TA
結合分子的特性，以下給出了對照抗體，其VL和VH結構域可以用來產生攜帶Fc區的對照雙抗體和其他對照結合分子。
抗螢光素抗體4-4-20 (Gruber, M. 等 (1994) “Efficient Tumor Cell Lysis Mediated By A Bispecific Single Chain Antibody Expressed In Escherichia coli,” J. Immunol. 152(11):5368-5374；Bedzyk, W.D. 等 (1989) “Comparison Of Variable Region Primary Structures Within An Anti-Fluorescein Idiotype Family,” J. Biol. Chem. 264(3): 1565-1569)是合適的對照抗體、雙抗體。以下為抗螢光素抗體4-4-20的可變輕鏈結構域和可變重鏈結構域的氨基酸序列：
以下顯示抗螢光素抗體4-4-20的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:161
) (CDRH
殘基以底線顯示)：
EVKLDETGGG LVQPGRPMKL SCVASGFTFS DYWM
NWVRQS PEKGLEWVA Q IRNKPYNYET YYSDSVKG
RF TISRDDSKSS VYLQMNNLRV EDMGIYYCTG SYYGMDY
WGQ GTSVTVSS
以下顯示抗螢光素抗體4-4-20的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:162
) (CDRL
殘基以底線顯示)：
DVVMTQTPFS LPVSLGDQAS ISC RSSQSLV HSNGNTYLR
W YLQKPGQSPK VLIY KVSNRF S
GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFC SQSTHVP W
TFGGGTKLE IK
帕利珠單抗(Palivizumab) (參見，例如，蛋白質資料庫(Protein Data Bank, PDB) ID No. 2HWZ)是針對在RSV的F蛋白的A抗原位點中的表位的人源化單克隆抗體(IgG)，並且是適合的對照抗體，其VL和VH結構域可以用於生產對照雙抗體和其他對照結合分子。可替選的抗-RSV糖蛋白F抗體包括莫維珠單抗(motavizumab) (參見，例如PDB ID No. 3IXT)和帕利珠單抗的變體，其被工程化以從輕鏈的CDR 1中去除半胱氨酸殘基。帕利珠單抗的變體用於生成以下對照分子。
以下顯示帕利珠單抗的變體的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:163
) (CDRH
殘基以底線顯示)：
QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMSVG
WIR QPPGKALEWL ADIWWDDKKD YNPSLKS
RLT ISKDTSKNQV VLKVTNMDPA DTATYYCAR S MITNWYFDV
W GAGTTVTVSS
以下顯示帕利珠單抗的變體的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:164
) (CDRL
殘基以底線顯示)：
DIQMTQSPST LSASVGDRVT ITC RASQSVG YMH
WYQQKPG KAPKLLIY DT SKLAS
GVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPD DFATYYC FQG SGYPFT
FGGG TKLEIK
表 7
顯示製備的攜帶Fc區的對照分子的屬性：
IX. 藥物組合物
| 表7 ：對照分子的結構域屬性 | |||
| 名稱 ( 鏈的數目) | 親代的mAb | Fc 結構域 | 其他成分 |
| DART-1 (5 條鏈) | 變體帕利珠單抗 CD137 MAB-B | IgG1 (AA) (杵/臼) | 與DART-A相同，除了包括代替PD-L1 MAB-A 的VH/VL的變體帕利珠單抗的VH/VL外 |
| TRIDENT-1 | 變體帕利珠單抗 CD137 MAB-1 (1C.3) | IgG1 (AA) (杵/臼) | 與TRIDENT-C 結構相同，除了包括代替PD-L1 MAB-3 的VH/VL的變體帕利珠單抗的VH/VL和包括替代CD137 MAB-1 VH1D的CD137 MAB-1 VH1C外 |
本發明的組合物包括可用於製造藥物組合物的原料藥(bulk drug)組合物(例如，不純的或非滅菌的組合物)和可用於製備單位劑型的藥物組合物(即，適合施用給受試者或患者的組合物)。這種組合物包含本發明的PD-L1-
結合分子或PD-L1 x CD137
結合分子和藥學上可接受的載體。優選地，本發明的組合物包含本發明的預防有效量或治療有效量的PD-L1單特異性抗體、或PD-L1 x CD137
雙特異性的攜帶Fc區的雙抗體或PD-L1 x CD137
多特異性TRIDENT™分子，和藥學上可接受的載體。
本發明還涵蓋包含這樣的藥物組合物，其包含本發明的PD-L1
單特異性抗體、PD-L1 x CD137
雙特異性的攜帶Fc區的雙抗體或PD-L1 x CD137
多特異性TRIDENT™和對刺激免疫應答有效的一種或多種另外的分子(例如，免疫檢查點抑制劑)和/或與特異性結合對於至少一種特定的腫瘤抗原特異性的腫瘤抗原的一種或多種例外的分子(例如，腫瘤特異性單克隆抗體或雙抗體)組合，和藥學上可接受的載體。
在具體實施方式中，術語“藥學上可接受的”意味著通過聯邦或州政府的監管機構許可的或列於美國藥典或其他通常獲得認可的藥典中，用於動物，特別是用於人類。術語“載體”指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑(例如，Freund輔助劑(完全的和不完全的)、賦形劑或媒介(vehicle)。這種藥學上的載體可以為無菌液體。當通過靜脈注射施用藥物組合物時，如生理鹽水溶液、水性葡萄糖和甘油溶液的水性載體是優選的。
通常，本發明的組合物的組分被單獨提供或以單位劑型混合在一起，例如，作為在指示活性劑的量的氣密密封容器如安瓿或袋(sachette)中的乾燥凍乾粉或無水濃縮物。在通過輸注施用組合物的情況下，組合物可以用含有無菌的藥物級水或生理鹽水的輸注瓶分配。在通過注射施用組合物的情況下，可以提供注射用無菌水或生理鹽水的安瓿，以便可以在施用前混合所述成分。
本發明也提供包括一個或多個容器的藥物包(pack)或試劑盒，所述容器包含單獨的本發明的PD-L1 x CD137
結合分子或具有其他試劑，優選地具有藥學上可接受的載體。另外，對疾病的治療有用的一種或多種其他預防的或治療的試劑也可以包括在藥物包或試劑盒中。本發明也提供包括一個或多個用一種或多種本發明的藥物組合物的組分填充的容器的藥物包或試劑盒。任選地與這類容器關聯的可以是以由管理藥物或生物製品的製造、使用或銷售的政府機構規定的形式的告示(notice)，所述告示反映了管理機構許可用於人類施用的製造、使用或銷售。
試劑盒可包括本發明的PD-L1- 結合分子
或PD-L1 x CD137
結合分子。試劑盒可進一步包括在一個或多個容器中的對癌症的治療有用的一種或多種其他的預防和/或治療的試劑；和/或試劑盒可進一步包括一種或多種結合一種或多種腫瘤抗原(TA)的細胞毒性抗體。在某些實施方式中，其他預防或治療的試劑是化學治療劑。在其他的實施方式中，預防或治療的試劑是生物治療劑或激素治療劑。
X. 施用方法
本發明的組合物可提供通過向受試者施用有效量的本發明的分子或者包含本發明的分子的藥物組合物來治療、預防和改善與癌症或其他疾病或障礙相關的一種或多種症狀。在優選的方面中，這種組合物基本上是純的(即基本上不含限制其效果或產生不期望的副作用的物質)。在具體實施方式中，受試者是動物，優選哺乳動物，如非靈長類(例如牛科動物、馬、貓科動物、犬科動物、齧齒動物等)或靈長類(例如，猴子如食蟹猴、人等)。在優選的實施方式中，受試者是人。
多種遞送系統是已知的且可以用於施用本發明的分子和組合物，例如，包封入脂質體、微粒、微膠囊、能夠表達抗體或融合蛋白的重組細胞、受體介導的內吞作用(參見，例如Wu等(1987)“Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System,”
J. Biol. Chem. 262:4429-4432)，作為逆轉錄病毒或其他載體(vector)的一部分的核酸構建等。
本發明的分子的施用方法包括但不限於腸胃外施用(例如，皮內、肌內、腹膜內、靜脈內和皮下)、硬膜外和黏膜(例如，鼻內和口服路徑)。在具體實施方式中，肌內、靜脈內或皮下施用本發明的PD-L1 x CD137
結合分子。組合物可以通過任何方便的路徑例如通過輸注或彈丸注射施用，並且可以與其他生物活性試劑一起施用。施用可以是全身的或局部的施用。
本發明還提供本發明的PD-L1 x CD137
結合分子被包裝在指示分子的量的氣密密封容器，如安瓿或袋中。在一個實施方式中，本發明的PD-L1 x CD137
結合分子作為乾燥滅菌的凍乾粉或無水濃縮物提供在氣密密封容器中並且可以例如用水或生理鹽水重構至適當的濃度，以施用至受試者。優選地，本發明的PD-L1 x CD137
結合分子作為乾燥滅菌的凍乾粉提供在氣密密封容器中。
本發明的凍乾的PD-L1 x CD137
結合分子應在它們的初始容器中在2°C和8°C之間儲存並且該分子應在重構之後的12小時內、優選地6小時內、5小時內、3小時內或1小時內施用。在可替選的實施方式中，本發明的PD-L1 x CD137
結合分子以液體形式提供在指示分子、融合蛋白或綴合分子的量和濃度的氣密密封容器中。優選地，本發明的液體形式的PD-L1 x CD137
結合分子提供在氣密密封容器中。
可通過標準臨床技術確定有效治療、預防或改善與障礙相關的一種或多種症狀的本發明的組合物的量。配製中採用的精確劑量也取決於施用的路徑和病症的嚴重性，並且應根據醫師的判斷和每個患者的情況決定。有效的劑量可根據源自體外或動物模型測試系統的劑量回應曲線外推。
如本文使用的，在一個實施方式中，藥物組合物的“有效量
”是足夠實現有益的或期望的結果的量，所述結果包括但不限於臨床結果，如減輕疾病引起的症狀、緩解疾病的症狀(例如，癌症細胞的增殖、腫瘤存在、腫瘤轉移等)，從而提高患有疾病的那些受試者的生活品質、減少治療疾病需要的其它藥物的劑量、增強另一藥物的效果(如經靶向和/或內化)、延遲疾病的進展和/或延長個體的存活。
這種有效量可在一次或多次施用中施用。為了該發明的目的，藥物、化合物或藥物組合物的有效量是足夠直接地或間接地降低存在病毒的增殖(或效果)和降低和/或延遲疾病(例如癌症)的發展的量。在一些實施方式中，藥物、化合物或藥物組合物的有效量可以或可以不結合另一藥物、化合物或藥物組合物而實現。因此，“有效量”可在施用一種或多種化療劑的背景下考慮，並且如果結合一種或多種其他試劑，可以實現或實現期望的結果，則可以考慮以有效量給予單一試劑。儘管個體需求不同，但是確定每種成分的有效量的最佳範圍在本領域技術人員的範圍內。
施用給患者的本發明的PD-L1 x CD137
結合分子的劑量可以被計算用作單一試劑治療。可替選地，本發明的PD-L1 x CD137
結合分子可以與其他治療組合物結合使用，以便施用給患者的劑量是比當所述分子用作單一試劑治療時低。
XI. 本發明的組合物的用途
本發明的PD-L1 x CD137
結合分子具有刺激免疫細胞的能力(通過結合這種細胞的CD137分子)和減弱或阻止PD-L1分子結合至PD-1的能力的能力(通過結合至表達PD-L1的細胞的PD-L1)。因此，沒有限制地，包括這種分子的藥物組合物可用在通過細胞免疫系統的PD-1−PD-L1-介導的抑制表徵的癌症的治療中。這種癌症包括通過癌細胞的存在表徵的那些癌症，包括但不限於下述的癌細胞：急性髓細胞性白血病、腎上腺腫瘤、與愛滋病(AIDS)相關的癌症、肺泡樣軟組織肉瘤、星形細胞腫瘤、膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈體腫瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、發色團腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、促結締織增生性小圓形細胞腫瘤、室管膜瘤、尤文氏腫瘤(Ewing's tumor)、骨外黏液樣軟骨肉瘤、骨成纖維發生不全、骨纖維發育異常、膽囊或膽管癌、胃癌、妊娠滋養細胞疾病、生殖細胞腫瘤、頭頸癌、肝細胞癌、成膠質細胞瘤、胰島細胞瘤、卡波濟肉瘤(Kaposi’s Sarcoma)、腎癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑色素瘤、腦膜瘤、惡性間皮瘤、多發性內分泌腫瘤、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合症、神經母細胞瘤、神經內分泌腫瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、咽癌、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀旁腺腫瘤、兒科癌症、神經鞘膜腫瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體瘤、***癌、後葡萄膜黑色素瘤(posterious uveal melanoma)、罕見的血液系統障礙、腎細胞癌、腎轉移性癌、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌症或子宮癌。
具體地，本發明的PD-L1 x CD137
結合分子可用於治療頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)、膀胱癌、乳腺癌、結直腸癌、胃癌、成膠質細胞瘤、腎癌、包括非小細胞肺癌(NSCLC)的肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、咽癌、***癌、腎細胞癌以及包括成神經細胞瘤和橫紋肌肉瘤的兒童時期的小圓藍色細胞腫瘤。
本發明的PD-L1 x CD137
結合分子可另外地用於製造治療上述病狀的藥物。
如本文所示，本發明的PD-L1 x CD137
結合分子提高腫瘤靶向劑的活性。因此，本發明的PD-L1 x CD137
結合分子可另外地用於與其他腫瘤靶向劑組合，其他腫瘤靶向劑包括但不限於能夠結合由癌細胞特徵性表達的細胞表面分子(“腫瘤抗原
”或“TA
”)的抗體、抗體的抗原結合片段(例如scFv、Fab、F(ab)2等、TandAb等)、多特異性結合分子(例如雙抗體、雙特異性抗體、三價結合分子等)。
可被本發明的這種PD-L1 x CD137
結合分子結合的示例性腫瘤抗原(“TA
”)包括但不限於結腸癌抗原19.9
、癌胚蛋白5T4
、胃癌黏蛋白抗原 4.2
、結直腸腫瘤抗原A33
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識別這種腫瘤抗原的抗體是本領域已知的或可以使用眾所周知的方法生成，包括在WO 2002/014870中描述的那些。包括能夠結合腫瘤抗原的VL和VH結構域以及它們的序列或多肽鏈可從而應用在本發明的PD-L1 x CD137
結合分子的構建中的示例性抗體在表 8
中列出。在下麵給出用於結合幾種腫瘤抗原的抗體的示例性的VH和VL結構域。
| 表 8 | ||
| 抗體名稱 | 腫瘤抗原 | 治療靶應用 |
| 3F8 | Gd2 | 成神經細胞瘤 |
| 8H9 | B7-H3 | 成神經細胞瘤、肉瘤、轉移性腦癌 |
| 阿巴伏單抗(Abagovomab) | CA-125 | 卵巢癌 |
| 阿德木單抗(Adecatumumab) | Epcam | ***癌和乳腺癌 |
| 阿托珠單抗(Afutuzumab) | CD20 | 淋巴瘤 |
| 阿賽珠單抗(Alacizumab) | VEGFR2 | 癌症 |
| 阿妥莫單抗(Altumomab) | CEA | 結直腸癌 |
| 阿麥妥昔(Amatuximab) | 間皮素 | 癌症 |
| 麻安莫單抗(Anatumomab Mafenatox) | TAG-72 | 非小細胞肺癌 |
| 阿尼魯單抗(Anifrolumab) | 干擾素Α/Β受體 | 系統性紅斑狼瘡 |
| 安蘆珠單抗(Anrukinzumab) | IL-13 | 癌症 |
| 阿泊珠單抗(Apolizumab) | HLA-DR | 血液癌症 |
| 阿西莫單抗(Arcitumomab) | CEA | 胃腸癌症 |
| 阿提努單抗(Atinumab) | RTN4 | 癌症 |
| 貝妥莫單抗(Bectumomab) | CD22 | 非霍奇金淋巴瘤(檢測) |
| 貝利木單抗(Belimumab) | BAFF | 非霍奇金淋巴瘤 |
| 貝伐珠單抗(Bevacizumab) | VEGF-A | 轉移癌，早產兒視網膜病 |
| 比伐珠單抗(Bivatuzumab) | CD44 V6 | 鱗狀細胞癌 |
| 博納吐單抗(Blinatumomab) | CD19 | 癌症 |
| 本妥昔單抗(Brentuximab) | CD30 (TNFRSF8) | 血液癌症 |
| 坎妥珠單抗(Cantuzumab) | MUC1 | 癌症 |
| 莫坎妥珠單抗(Cantuzumab Mertansine) | 黏蛋白Canag | 結直腸癌 |
| 卡普賽珠單抗(Caplacizumab) | VWF | 癌症 |
| 卡羅單抗(Capromab) | ***癌細胞 | ***癌(檢測) |
| 卡蘆單抗(Carlumab) | MCP-1 | 腫瘤學/免疫指征 |
| 卡妥索單抗(Catumaxomab) | Epcam、CD3 | 卵巢癌、惡性腹水、胃癌 |
| Cc49 | 標籤-72 | 腫瘤檢測 |
| 西妥昔單抗(Cetuximab) | EGFR | 轉移性結直腸癌和頭頸癌 |
| Ch.14.18 | 未確定的 | 成神經細胞瘤 |
| 西他土珠單抗(Citatuzumab) | Epcam | 卵巢癌和其他實體腫瘤 |
| 西妥木單抗(Cixutumumab) | IGF-1受體 | 實體腫瘤 |
| 克立瓦妥珠單抗(Clivatuzumab) | MUC1 | 胰腺癌 |
| 可那木單抗(Conatumumab) | TRAIL-R2 | 癌症 |
| 達西珠單抗(Dacetuzumab) | CD40 | 血液癌症 |
| 達洛珠單抗(Dalotuzumab) | 胰島素樣生長因數I受體 | 癌症 |
| 達雷木單抗(Daratumumab) | CD38 | 癌症 |
| 登西珠單抗(Demcizumab) | DLL4 | 癌症 |
| 地莫單抗(Detumomab) | B-淋巴瘤細胞 | 淋巴瘤 |
| 卓齊妥單抗(Drozitumab) | DR5 | 癌症 |
| 度利戈妥單抗(Duligotumab) | HER3 | 癌症 |
| 杜氏圖單抗 (Dusigitumab) | ILGF2 | 癌症 |
| 依美昔單抗(Ecromeximab) | GD3神經節苷脂 | 惡性黑素瘤 |
| 依庫珠單抗(Eculizumab) | C5 | 陣發性睡眠性血紅蛋白尿症 |
| 依決洛單抗(Edrecolomab) | Epcam | 結直腸癌 |
| 依洛珠單抗(Elotuzumab) | SLAMF7 | 多發性骨髓瘤 |
| 艾西莫單抗(Elsilimomab) | IL-6 | 癌症 |
| 依納妥珠單抗(Enavatuzumab) | TWEAK受體 | 癌症 |
| 恩莫單抗(Enlimomab) | ICAM-1 (CD54) | 癌症 |
| 依諾吉珠單抗(Enokizumab) | IL9 | 哮喘 |
| 依諾蘇單抗(Enoticumab) | DLL4 | 癌症 |
| 恩司昔單抗(Ensituximab) | 5AC | 癌症 |
| 西依匹莫單抗(Epitumomab Cituxetan) | 上皮唾蛋白(Episialin) | 癌症 |
| 依帕珠單抗(Epratuzumab) | CD22 | 癌症、SLE |
| 厄馬索單抗(Ertumaxomab) | HER2/Neu，CD3 | 乳腺癌 |
| 艾達珠單抗(Etaracizumab) | 整聯蛋白Αv β3 | 黑素瘤、***癌、卵巢癌 |
| 法拉莫單抗(Faralimomab) | 干擾素受體 | 癌症 |
| 法勒珠單抗(Farletuzumab) | 葉酸鹽受體1 | 卵巢癌 |
| 法西努單抗(Fasinumab) | HNGF | 癌症 |
| Fbta05 | CD20 | 慢性淋巴細胞性白血病 |
| 菲拉妥珠單抗(Ficlatuzumab) | HGF | 癌症 |
| 芬妥木單抗(Figitumumab) | IGF-1受體 | 腎上腺皮質癌、非小細胞肺癌 |
| 夫蘭妥單抗(Flanvotumab) | TYRP1 (糖蛋白75) | 黑素瘤 |
| 芳妥珠單抗(Fontolizumab) | IFN-γ | 克羅恩氏病 |
| 瑞索利木單抗(Fresolimumab) | TGF-Β | 特發性肺纖維化、局灶性節段性腎小球硬化症、癌症 |
| 伏妥昔單抗(Futuximab) | EGFR | 癌症 |
| 加利昔單抗(Galiximab) | CD80 | B細胞淋巴瘤 |
| 甘尼妥單抗(Ganitumab) | IGF-I | 癌症 |
| 吉妥珠單抗-奧佐米星(Gemtuzumab Ozogamicin) | CD33 | 急性骨髓性白血病 |
| 吉伏珠單抗(Gevokizumab) | IL-1β | 糖尿病 |
| 吉瑞昔單抗(Girentuximab) | 碳酸酐酶9 (CA-IX) | 透明細胞腎細胞癌 |
| 格萊木單抗-維多汀(Glembatumumab Vedotin) | GPNMB | 黑素瘤、乳腺癌 |
| 戈利木單抗(Golimumab) | TNF-Α | 風濕性關節炎、牛皮癬關節炎、關節強硬性脊椎炎 |
| 替伊莫單抗(Ibritumomab Tiuxetan) | CD20 | 非霍奇金淋巴瘤 |
| 艾盧蘇單抗(Icrucumab) | VEGFR-1 | 癌症 |
| 伊戈伏單抗(Igovomab) | CA-125 | 卵巢癌(診斷) |
| Imab362 | Cldn18.2 | 胃腸腺癌和胰臟腫瘤 |
| 英加妥珠單抗(Imgatuzumab) | EGFR | 癌症 |
| 英拉蘇單抗(Inclacumab) | 選擇素P | 癌症 |
| 拉-英達西單抗(Indatuximab Ravtansine) | SDC1 | 癌症 |
| 伊珠單抗-奧佐米星(Inotuzumab Ozogamicin) | CD22 | 癌症 |
| 英妥木單抗(Intetumumab) | CD51 | 實體腫瘤(***癌症、黑素瘤) |
| 伊匹木單抗(Ipilimumab) | CD152 | 黑素瘤 |
| 伊妥木單抗(Iratumumab) | CD30 (TNFRSF8) | 霍奇金淋巴瘤 |
| 伊曲珠單抗(Itolizumab) | CD6 | 癌症 |
| 拉貝珠單抗(Labetuzumab) | CEA | 結直腸癌 |
| 蘭羅利珠單抗 (Lambrolizumab) | PDCD1 | 抗腫瘤劑 |
| 蘭帕利珠單抗(Lampalizumab) | CFD | 癌症 |
| 來沙木單抗(Lexatumumab) | TRAIL-R2 | 癌症 |
| 利韋單抗(Libivirumab) | 乙型肝炎表面抗原 | 乙型肝炎 |
| 利格利珠單抗(Ligelizumab) | IGHE | 癌症 |
| 林妥珠單抗(Lintuzumab) | CD33 | 癌症 |
| 利瑞魯單抗(Lirilumab) | KIR2D | 癌症 |
| 洛妥珠單抗(Lorvotuzumab) | CD56 | 癌症 |
| 魯卡木單抗(Lucatumumab) | CD40 | 多發性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤 |
| 魯昔單抗(Lumiliximab) | CD23 | 慢性淋巴細胞性白血病 |
| 馬帕木單抗(Mapatumumab) | TRAIL-R1 | 癌症 |
| 瑪格妥昔單抗 (Margetuximab) | Ch4d5 | 癌症 |
| 馬妥珠單抗(Matuzumab) | EGFR | 結直腸癌、肺癌和胃癌 |
| 米拉珠單抗 (Milatuzumab) | CD74 | 多發性骨髓瘤和其他血液學惡性腫瘤 |
| 明瑞莫單抗(Minretumomab) | TAG-72 | 癌症 |
| 米妥莫單抗(Mitumomab) | GD3神經節苷脂 | 小細胞肺癌 |
| 莫加珠單抗(Mogamulizumab) | CCR4 | 癌症 |
| 莫羅木單抗(Morolimumab) | 獼猴因數 | 癌症 |
| 帕蘇托-莫塞妥莫單抗(Moxetumomab Pasudotox) | CD22 | 癌症 |
| 他那可單抗(Nacolomab Tafenatox) | C242抗原 | 結直腸癌 |
| 奈米布單抗(Namilumab) | CSF2 | 癌症 |
| 他那莫單抗(Naptumomab Estafenatox) | 5T4 | 非小細胞肺癌、腎細胞癌 |
| 納那妥單抗(Narnatumab) | RON | 癌症 |
| 奈巴庫單抗(Nebacumab) | 內毒素 | 敗血症 |
| 奈昔木單抗(Necitumumab) | EGFR | 非小細胞肺癌 |
| 奈瑞莫單抗(Nerelimomab) | TNF-Α | 癌症 |
| 耐斯伐庫單抗(Nesvacumab) | 血管生成素2 | 癌症 |
| 尼妥珠單抗(Nimotuzumab) | EGFR | 鱗狀細胞癌、頭頸癌、鼻咽癌、神經膠質瘤 |
| 尼魯單抗 (Nivolumab) | PD-1 | 癌症 |
| 莫坦-諾非妥莫單抗(Nofetumomab Merpentan) | 未確定的 | 癌症 |
| 奧卡拉妥珠單抗(Ocaratuzumab) | CD20 | 癌症 |
| 奧法妥木單抗(Ofatumumab) | CD20 | 慢性淋巴細胞性白血病 |
| 奧拉妥單抗(Olaratumab) | PDGF-R Α | 癌症 |
| 奧洛珠單抗(Olokizumab) | IL6 | 癌症 |
| 奧納妥珠單抗(Onartuzumab) | 人散射因數受體激酶 | 癌症 |
| 昂妥昔珠單抗(Ontuxizumab) | TEM1 | 癌症 |
| 莫-奧珠單抗(Oportuzumab monatox) | Epcam | 癌症 |
| 奧戈伏單抗(Oregovomab) | CA-125 | 卵巢癌 |
| 奧替庫單抗(Orticumab) | Oxldl | 癌症 |
| 奧樂妥珠單抗(Otlertuzumab) | CD37 | 癌症 |
| 帕尼單抗(Panitumumab) | EGFR | 結直腸癌 |
| 帕尼庫單抗(Pankomab) | MUC1的腫瘤特異性糖基化 | 卵巢癌 |
| 巴薩妥珠單抗(Parsatuzumab) | EGFL7 | 癌症 |
| 帕曲妥單抗(Patritumab) | HER3 | 癌症 |
| 派姆單抗(Pembrolizumab) | PD-1 | 癌症 |
| 培妥莫單抗(Pemtumomab) | MUC1 | 癌症 |
| 培拉珠單抗(Perakizumab) | IL17A | 關節炎 |
| 帕妥株單抗(Pertuzumab) | HER2/Neu | 癌症 |
| 皮地珠單抗 (Pidilizumab) | PD-1 | 癌症和傳染病 |
| 皮那妥珠單抗-維多汀(Pinatuzumab Vedotin) | CD22 | 癌症 |
| 平妥莫單抗(Pintumomab) | 腺癌抗原 | 腺癌 |
| 普拉庫魯單抗(Placulumab) | 人TNF | 癌症 |
| 泊拉妥珠單抗-維多汀(Polatuzumab Vedotin) | CD79B | 癌症 |
| 普立托昔單抗(Pritoxaximab) | 大腸桿菌志賀氏毒素類型-1 | 癌症 |
| 普立妥木單抗(Pritumumab) | 波形蛋白 | 腦癌 |
| 奎利珠單抗(Quilizumab) | IGHE | 癌症 |
| 雷妥莫單抗(Racotumomab) | N-羥乙醯神經氨糖酸(N-Glycolylneuraminic Acid) | 癌症 |
| 雷得妥單抗(Radretumab) | 纖連蛋白額外結構域-B | 癌症 |
| 雷莫蘆單抗(Ramucirumab) | VEGFR2 | 實體腫瘤 |
| 利妥木單抗(Rilotumumab) | HGF | 實體腫瘤 |
| 利妥昔單抗(Rituximab) | CD20 | 淋巴瘤、白血病(Leukemias)、一些自身免疫性障礙 |
| 羅妥木單抗(Robatumumab) | IGF-1受體 | 癌症 |
| 羅度單抗(Roledumab) | RHD | 癌症 |
| 沙馬珠單抗(Samalizumab) | CD200 | 癌症 |
| 沙妥莫單抗噴地肽(Satumomab Pendetide) | TAG-72 | 癌症 |
| 司裡班妥單抗(Seribantumab) | ERBB3 | 癌症 |
| 司托昔抗(Setoxaximab) | 大腸桿菌志賀氏毒素類型-1 | 癌症 |
| Sgn-CD19a | CD19 | 急性成淋巴細胞性白血病和B細胞非-霍奇金淋巴瘤 |
| Sgn-CD33a | CD33 | 急性髓細胞樣白血病 |
| 西羅珠單抗(Sibrotuzumab) | FAP | 癌症 |
| 司妥昔單抗(Siltuximab) | IL-6 | 癌症 |
| 索利托單抗(Solitomab) | Epcam | 癌症 |
| 松妥珠單抗(Sontuzumab) | 上皮唾蛋白 | 癌症 |
| 他巴魯單抗(Tabalumab) | BAFF | B細胞癌 |
| 替他珠單抗(Tacatuzumab Tetraxetan) | 甲胎蛋白 | 癌症 |
| 帕-他莫單抗(Taplitumomab Paptox) | CD19 | 癌症 |
| 替莫單抗(Telimomab) | 未確定的 | 癌症 |
| 替妥莫單抗(Tenatumomab) | 生腱蛋白C | 癌症 |
| 替奈昔單抗(Teneliximab) | CD40 | 癌症 |
| 替妥木單抗(Teprotumumab) | CD221 | 血液腫瘤 |
| 替昔木單抗(Ticilimumab) | CTLA-4 | 癌症 |
| 替加珠單抗(Tigatuzumab) | TRAIL-R2 | 癌症 |
| Tnx-650 | Il-13 | 霍奇金淋巴瘤 |
| 托西莫單抗(Tositumomab) | CD20 | 濾泡淋巴瘤 |
| 托維妥單抗(Tovetumab) | CD140a | 癌症 |
| 曲妥珠單抗(Trastuzumab) | HER2/Neu | 乳腺癌 |
| Trbs07 | Gd2 | 黑素瘤 |
| 曲美木單抗(Tremelimumab) | CTLA-4 | 癌症 |
| 西莫白介素單抗(Tucotuzumab Celmoleukin) | Epcam | 癌症 |
| 優利妥昔單抗(Ublituximab) | MS4A1 | 癌症 |
| 烏瑞魯單抗(Urelumab) | 4-1BB | 癌症 |
| 萬替妥單抗(Vantictumab) | 捲曲受體(Frizzled Receptor) | 癌症 |
| 伐利昔單抗(Vapaliximab) | AOC3 (VAP-1) | 癌症 |
| 伐特珠單抗(Vatelizumab) | ITGA2 | 癌症 |
| 維妥珠單抗(Veltuzumab) | CD20 | 非霍奇金淋巴瘤 |
| 維森庫單抗(Vesencumab) | NRP1 | 癌症 |
| 伏洛昔單抗(Volociximab) | 整聯蛋白Α5β1 | 實體腫瘤 |
| 伏司妥珠單抗 (Vorsetuzumab) | CD70 | 癌症 |
| 伏妥昔單抗(Votumumab) | 腫瘤抗原CTAA16.88 | 結直腸腫瘤 |
| 紮蘆木單抗(Zalutumumab) | EGFR | 頭頸的鱗狀細胞癌 |
| 紮妥昔單抗(Zatuximab) | HER1 | 癌症 |
| 齊拉木單抗(Ziralimumab) | CD147 | 癌症 |
特別預期的，腫瘤靶向劑可結合TA
和在T細胞上表達的表位，包括例如CD3
和/或CD8
。示例性腫瘤靶向劑包括但不限於結合TA
和CD3
的分子(“TA x CD3
”)。示例性TA x CD3
結合分子(例如雙特異性抗體DART®分子、BiTe®分子、TandAbs等)以及可以以這種組合使用的製造所述結合分子的方法是本領域眾所周知的(參見例如，WO 2013/026835、WO 2013/158856、WO 2014/047231、WO 2014/110601、WO 2014/131711、WO 2015/026894、WO 2015/026892、WO 2015/184203、WO 2016/036937、WO 2016/182751、WO 2017/091656、WO 2017/142928、WO 2017/118675)。
如本文提供的，使用本發明的PD-L1 x CD137
結合分子可以導致PD-1的上調。然而，進一步添加抑制PD-1的抑制活性的試劑(“PD-1/PD-L1 檢查點抑制劑
”)下調PD-1的表達，以及進一步提高腫瘤靶向劑如TA x CD3
結合分子的活性。
當應用這種組合時，具體地考慮一種或多種分子可以“同時地”施用給受試者(例如，可以在施用腫瘤靶向劑(例如，TA x CD3
結合分子)時同時施用PD-L1 x CD137
結合分子，和/或一種或多種的分子可以“依次地”施用(例如施用PD-L1 x CD137
結合分子並且過一段時間施用腫瘤靶向劑(例如TA x CD3
結合分子)或反之亦然。
XII. 本發明的具體實施方式
現在已經大體上描述了本發明，通過參考以下編號的實施方式(“E
”)將更容易理解本發明，除非另有說明，否則這些實施方式是作為示例提供的並且不意欲限制本發明：E1
. 一種能夠結合人PD-L1的表位的PD-L1-
結合分子，其中PD-L1-
結合分子包括包含CDRH
1、CDRH
2和CDRH
3的PD-L1-結合重鏈可變結構域和包含CDRL
1、CDRL
2和CDRL
3的PD-L1-結合輕鏈可變結構域；以及其中：
(A) (1) PD-L1-結合重鏈可變結構域CDRH
1、CDRH
2和CDRH
3是PD-L1 MAB-2 VH
(SEQ ID NO:63
)的重鏈CDR；和
(2) PD-L1-結合輕鏈可變結構域CDRL
1、CDRL
2和CDRL
3是PD-L1 MAB-2 VL
(SEQ ID NO:67
) 的輕鏈CDR；
(B) (1) PD-L1-結合重鏈可變結構域CDRH
1、CDRH
2和CDRH
3是PD-L1 MAB-3 VH
(SEQ ID NO:73
)的重鏈CDR；和
(2) PD-L1-結合輕鏈可變結構域CDRL
1、CDRL
2和CDRL
3是PD-L1 MAB-3 VL
(SEQ ID NO:77
)的輕鏈CDR；
(C) (1) PD-L1-結合重鏈可變結構域CDRH
1、CDRH
2和CDRH
3是PD-L1 MAB-1 VH
(SEQ ID NO:55
)的重鏈CDR；和
(2) PD-L1-結合輕鏈可變結構域CDRL
1、CDRL
2和CDRL
3是PD-L1 MAB-1 VL
(SEQ ID NO:59
)的輕鏈CDR；
(D) (1) PD-L1-結合重鏈可變結構域CDRH
1、CDRH
2和CDRH
3是hPD-L1 MAB-2 VH1
(SEQ ID NO:71
)的重鏈CDR；和
(2) PD-L1-結合輕鏈可變結構域CDRL
1、CDRL
2和CDRL
3是hPD-L1 MAB-2 VL1
(SEQ ID NO:72
)的輕鏈CDR；
或
(E) (1) PD-L1-結合重鏈可變結構域CDRH
1、CDRH
2和CDRH
3是hPD-L1 MAB-3 VH1
(SEQ ID NO:81
)的重鏈CDR；和
(2) PD-L1-結合輕鏈可變結構域CDRL
1、CDRL
2和CDRL
3是PD-L1 MAB-3 VL1
(SEQ ID NO:82
)的輕鏈CDR。E2
.E1
所述的PD-L1-
結合分子，其包括PD-L1-結合重鏈可變結構域，PD-L1-結合重鏈可變結構域包含氨基酸序列：
(A)hPD-L1 MAB-2 VH1
(SEQ ID NO:71
)、
(B)hPD-L1 MAB-3 VH1
(SEQ ID NO:81
)、
(C)PD-L1 MAB-1 VH
(SEQ ID NO:55
)、
(D)PD-L1 MAB-2 VH
(SEQ ID NO:63
)或
(E)PD-L1 MAB-3 VH
(SEQ ID NO:73
)。E3
.E1
所述的PD-L1-
結合分子，其包括PD-L1-結合輕鏈可變結構域，PD-L1-結合輕鏈可變結構域包含氨基酸序列：
(A)hPD-L1 MAB-2 VL1
(SEQ ID NO:72
)、
(B)hPD-L1 MAB-3 VL1
(SEQ ID NO:82
)、
(C)PD-L1 MAB-1 VL
(SEQ ID NO:59
)、
(D)PD-L1 MAB-2 VL
(SEQ ID NO:67
)或
(E)PD-L1 MAB-3 VL
(SEQ ID NO:77
)。E4
.E1
-E3
中任一項所述的PD-L1-
結合分子，其中分子是抗體或其表位結合片段。E5.
能夠結合人CD137的表位和人PD-L1的表位的PD-L1 x CD137
結合分子，特別地其中所述PD-L1 x CD137
結合分子包括E1
-E4
中任一項中的PD-L1-結合重鏈可變結構域和PD-L1-結合輕鏈可變結構域。E6
.E5
所述的PD-L1 x CD137
結合分子，其中PD-L1 x CD137
結合分子包括包含CDRH
1、CDRH
2和CDRH
3的CD137-結合重鏈可變結構域和包含CDRL
1、CDRL
2和CDRL
3的CD137-結合輕鏈可變結構域；以及其中：
(A) (1) CD137-結合重鏈可變結構域CDRH
1、CDRH
2和CDRH
3是CD137 MAB-1 VH
(SEQ ID NO:90
)的重鏈CDR；和
(2) CD137-結合輕鏈可變結構域CDRL
1、CDRL
2和CDRL
3是CD137 MAB-1 VL
(SEQ ID NO:94
)的輕鏈CDR；
(B) (1) CD137-結合重鏈可變結構域CDRH
1、CDRH
2和CDRH
3是hCD137 MAB-1 VH1
(SEQ ID NO:99
)、hCD137 MAB-1 VH1A
(SEQ ID NO:100
)、hCD137 MAB-1 VH1B
(SEQ ID NO:102
)、hCD137 MAB-1 VH1C
(SEQ ID NO:104
)、hCD137 MAB-1 VH1D
(SEQ ID NO:106
)、hCD137 MAB-1 VH1E
(SEQ ID NO:108
)、hCD137 MAB-1 VH1F
(SEQ ID NO:109
)或hCD137 MAB-1 VH1G
(SEQ ID NO:110
)的重鏈CDR；和
(2) CD137-結合輕鏈可變結構域CDRL
1、CDRL
2和CDRL
3是hCD137 MAB-1 VL1
(SEQ ID NO:112)
、hCD137 MAB-1 VL2
(SEQ ID NO:114)
、hCD137 MAB-1 VL3
(SEQ ID NO:115)
、hCD137 MAB-1 VL4
(SEQ ID NO:116)
、hCD137 MAB-1 VL5
(SEQ ID NO:117)
、hCD137 MAB-1 VL6
(SEQ ID NO:118)
、hCD137 MAB-1 VL7
(SEQ ID NO:120)
、hCD137 MAB-1 VL8
(SEQ ID NO:121)
、hCD137 MAB-1 VL9
(SEQ ID NO:122)
、hCD137 MAB-1 VL10
(SEQ ID NO:123)
、hCD137 MAB-1 VL11
(SEQ ID NO:125)
、hCD137 MAB-1 VL12
(SEQ ID NO:127)
、hCD137 MAB-1 VL13
(SEQ ID NO:128)
、hCD137 MAB-1 VL14
(SEQ ID NO:129)
或hCD137 MAB-1 VL15
(SEQ ID NO:131)
的輕鏈CDR；
(C) (1) CD137-結合重鏈可變結構域CDRH
1、CDRH
2和CDRH
3是CD137 MAB-2 VH
(SEQ ID NO:133
)的重鏈CDR；和
(2) CD137-結合輕鏈可變結構域CDRL
1、CDRL
2和CDRL
3是CD137 MAB-2 VL
(SEQ ID NO:135
)的輕鏈CDR；
或
(D) (1) CD137-結合重鏈可變結構域CDRH
1、CDRH
2和CDRH
3是hCD137 MAB-2 VH1
(SEQ ID NO:139
)的重鏈CDR；和
(2) CD137-結合輕鏈可變結構域CDRL
1、CDRL
2和CDRL
3是CD137 MAB-2 VL1
(SEQ ID NO:141
)的輕鏈CDR或CD137 MAB-2 VL2
(SEQ ID NO:142
)的輕鏈CDR。E7
.E6
所述的PD-L1 x CD137
結合分子，其包括CD137-結合重鏈可變結構域，CD137-結合重鏈可變結構域包含氨基酸序列：
(A)hCD137 MAB-1 VH1
(SEQ ID NO:99
)、
(B)hCD137 MAB-1 VH1A
(SEQ ID NO:100
)、
(C)hCD137 MAB-1 VH1B
(SEQ ID NO:102
)、
(D)hCD137 MAB-1 VH1C
(SEQ ID NO:104
)、
(E)hCD137 MAB-1 VH1D
(SEQ ID NO:106
)、
(F)hCD137 MAB-1 VH1E
(SEQ ID NO:108
)、
(G)hCD137 MAB-1 VH1F
(SEQ ID NO:109
)、
(H)hCD137 MAB-1 VH1G
(SEQ ID NO:110
)、
(I)hCD137 MAB-2 VH1
(SEQ ID NO:139
)、
(J)CD137 MAB-1 VH
(SEQ ID NO:90
)或
(K)CD137 MAB-2 VH
(SEQ ID NO:133
)。E8
.E6
或E7
所述的PD-L1 x CD137
結合分子，其包括CD137-結合輕鏈可變結構域，CD137-結合輕鏈可變結構域包含氨基酸序列：
(A)hCD137 MAB-1 VL1
(SEQ ID NO:112)
、
(B)hCD137 MAB-1 VL2
(SEQ ID NO:114)
、
(C)hCD137 MAB-1 VL3
(SEQ ID NO:115)
、
(D)hCD137 MAB-1 VL4
(SEQ ID NO:116)
、
(E)hCD137 MAB-1 VL5
(SEQ ID NO:117)
、
(F)hCD137 MAB-1 VL6
(SEQ ID NO:118)
、
(G)hCD137 MAB-1 VL7
(SEQ ID NO:120)
、
(H)hCD137 MAB-1 VL8
(SEQ ID NO:121)
、
(I)hCD137 MAB-1 VL9
(SEQ ID NO:122)
、
(J)hCD137 MAB-1 VL10
(SEQ ID NO:123)
、
(K)hCD137 MAB-1 VL11
(SEQ ID NO:125)
、
(L)hCD137 MAB-1 VL12
(SEQ ID NO:127)
、
(M)hCD137 MAB-1 VL13
(SEQ ID NO:128)
、
(N)hCD137 MAB-1 VL14
(SEQ ID NO:129)
、
(O)hCD137 MAB-1 VL15
(SEQ ID NO:131)
、
(P)hCD137 MAB-2 VL1
(SEQ ID NO:141
)、
(Q)hCD137 MAB-2 VL2
(SEQ ID NO:142
)、
(R)CD137 MAB-1 VL
(SEQ ID NO:94
)或
(S)CD137 MAB-2 VL
(SEQ ID NO:135
)。E9
.E5
-E8
中任一項所述的PD-L1 x CD137
結合分子，其中分子是包含2、3、4或5條多肽鏈的雙特異性四價的攜帶Fc區的雙抗體，其中多肽鏈形成共價結合的複合物。E10
.E5
-E8
中任一項所述的PD-L1 x CD137
結合分子，其中分子是雙特異性攜帶Fc區的三價分子並且包含三或四條多肽鏈，其中多肽鏈形成共價結合的複合物。E11
.E9
-E10
中任一項所述的PD-L1 x CD137
結合分子，其中分子包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型的Fc區。E12
.E9
-E11
中任一項所述的PD-L1 x CD137
結合分子，其中分子進一步包含鉸鏈結構域。E13
.E9
-E12
中任一項所述的PD-L1 x CD137
結合分子，其中分子包含變體Fc區，變體Fc區包含：
(a) 減少變體Fc區對FcγR的親和力的一個或多個氨基酸修飾；和/或
(b) 提高變體Fc區的血清半衰期的一個或多個氨基酸修飾。E14
.E13
所述的PD-L1 x CD137
結合分子，其中減少變體Fc區對FcγR的親和力的修飾包括L234A；L235A；或L234A和235A的取代，其中所述編號是如在Kabat中EU索引的編號。E15
.E13
或E14
所述的PD-L1 x CD137
結合分子，其中提高變體Fc區的血清半衰期的修飾包括M252Y；M252Y和S254T；M252Y和T256E；M252Y、S254T和T256E；或K288D和H435K的取代，其中所述編號是如在Kabat中EU索引的編號。E16
.E5
-E15
中任一項所述的PD-L1 x CD137
結合分子，其中所述分子包含：
(a)SEQ ID NO:178
、SEQ ID NO:179
、SEQ ID NO:176
和SEQ ID NO:177
；
(b)SEQ ID NO:175
、SEQ ID NO:166
、SEQ ID NO:176
和SEQ ID NO:177
；
(c)SEQ ID NO:169
、SEQ ID NO:170
、SEQ ID NO:173
和SEQ ID NO:174 ；
或
(d)SEQ ID NO:169
、SEQ ID NO:170
、SEQ ID NO:171
和SEQ ID NO:172
。E17
. 一種藥物組合物，包含E1
-E4
中任一項所述的PD-L1-結合分子或E5
-E16
中任一項所述的PD-L1 x CD137
結合分子、和生理學上可接受的載體。E18
.E17
的藥物組合物在治療與被抑制的免疫系統存在相關或以被抑制的免疫系統存在表徵的疾病或病況中的用途。E19
.E17
的藥物組合物在治療與腫瘤抗原的表達相關或以腫瘤抗原的表達表徵的疾病或病況中的用途。E20
.E17
的藥物組合物在治療癌症中的用途。E21
. 一種提高腫瘤靶向劑的活性的方法，其包括與E1
-E4
中任一項所述的PD-L1-結合分子或E5
-E16
中任一項所述的PD-L1 x CD137
結合分子組合施用腫瘤靶向劑。E22
.E21
的方法，其中腫瘤靶向劑是特異性結合至腫瘤抗原的抗體，或包含其腫瘤抗原結合部分的分子。E23.
一種治療與被抑制的免疫系統相關或以腫瘤抗原的表達表徵的疾病或病況的方法，其包括向有需要的受試者施用E1
-E4
中任一項所述的PD-L1-結合分子或E5
-E16
中任一項所述的PD-L1 x CD137
結合分子。E24
.E23
所述的方法，其中與腫瘤抗原的表達相關或以腫瘤抗原的表達表徵的疾病或病況是癌症。E25
.E18-E20
或E24
中任一項所述的方法，其中癌症選自由以下組成的組：膀胱癌、乳腺癌、結直腸癌、胃癌、成膠質細胞瘤、血液癌、腎癌、肺癌、黑素瘤、神經母細胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、咽癌、***癌、腎細胞癌、直腸癌、橫紋肌肉瘤和頭頸癌。
實施例
已經總體上描述了本發明之後，通過參考下列實施例將更容易理解本發明，下列實施例通過例證的方式提供並且不意欲限制本發明，除非另有指明。
實施例1PD-L1- 結合分子
對一組對人PD-L1特異性的鼠單克隆抗體篩選展現高親和力結合的抗體。被命名為“PD-L1 MAB-1
”、“PD-L1 MAB-2
”和“PD-L1 MAB-3
”的三種抗體被選作進一步研究。上面描述了這種抗體的VL和VH結構域的氨基酸序列。具有包括L234A/L235A Fc突變的IgG1/κ人重鏈和輕鏈恒定區 (參見，例如SEQ ID NO:40
、42 、 44 和 46-49
)和鼠VH/VL結構域的嵌合衍生物(分別命名為：chPD-L1 MAB-1
、chPD-L1 MAB-2
和chPD-L1 MAB-3
) 被生成並在幾種功能測試中評估。也生成具有相同的人恒定區但結合無關的抗原的同種型對照(命名為“hIgG1
”)，以及具有阿特珠單抗(命名為“PD-L1 MAB-A
”)、阿維魯單抗(被命名為“PD-L1 MAB-B
”)和度伐單抗(被命名為“PD-L1 MAB-C
”)的VH/VL結構域的參考抗體。上面描述了這種參考抗體的VL和VH結構域的氨基酸序列。結合至細胞表面上表達的 PD-L1
評估抗體chPD-L1 MAB-1
、chPD-L1 MAB-2
和chPD-L1 MAB-3
與參考抗體PD-L1 MAB-A
的結合至在Caki-2 (PD-L1++
)透明細胞腎細胞癌(ccRCC)細胞的表面上表達的PD-L1和結合至表達PD-L1的CHO細胞(CHO/PD-L1) (PD-L1++++
)的表面的能力。簡言之，將100 μL的表達PD-L1的細胞(1.0 x 106
個細胞/mL)和100 μL的系列稀釋(3倍稀釋)的抗-PD-L1抗體或對照抗體添加至微量滴定測試板的每個孔中、混合並在室溫(“RT
”)下孵育45 min。用FACS緩衝液洗滌細胞，然後添加第二抗體(山羊抗-人-FITC)至每個孔中，在這之後，混合成分並將孔在RT孵育30 min。洗滌細胞並將其重懸在100 μL FACS 緩衝液中，並且通過流式細胞術 (BD LSR Fortessa或FACSCanto II) 分析細胞事件集合。通過FloJo v10進行資料分析。在圖 7A- 圖 7B
中顯示代表性的結合曲線。結果示出所有測試的抗-PD-L1抗體展現出PD-L1阻斷活性。PD-L1 阻斷活性
在Jurkat-luc-NFAT/CHO/PD-L1螢光素酶報告基因測試中，檢查chPD-L1 MAB-1
、chPD-L1 MAB-2
和chPD-L1 MAB-3
和參考抗體PD-L1 MAB-A
用於對抗PD-1/PD-L1軸(即，阻斷PD-1/PD-L1相互作用並且防止T-細胞應答的下調)的能力。在該測試中，抗體(或其他測試物品)用於阻斷在CHO細胞上表達的PD-L1和在MNFAT-luc2/PD-1 Jurkat報告細胞上表達的PD-1之間的相互作用的能力導致螢光素酶基因表達。因此，PD-1–PD-L1相互作用的阻斷被看作為螢光素酶活性的增加。
為了進行這樣的調查研究，將表達PD-L1的CHO細胞(CHO/PD-L1)以40,000/孔鋪在100 μL的培養基(DMEM/F12+10% FBS+200 μg/mL 潮黴素B+250 μg/mL G418)中並且孵育過夜。第二天，移除培養基，並以125,000細胞/孔將在50 μL測試緩衝液(RPMI + 2% FBS)中的NFAT-luc2/PD-1 Jurkat細胞(Promega)和抗-PD-1抗體(3倍系列稀釋) 添加至每個孔中且在37°C孵育6小時。然後，將80 μL的BioGlo底物 (Promega) 添加至每個孔，並將板在室溫下孵育另外的5-10分鐘，在酶標儀 (例如Victor Plate Reader)中測量發光性。在圖 8
中示出代表性的飽和曲線。結果示出所有測試的抗-PD-L1抗體展現出PD-L1阻斷活性。SEB 再刺激測試
金黃色釀膿葡萄球菌
(Staphylococcus aureus)腸毒素型B (“SEB
”)是能夠啟動在SEB-反應供體中大部分的T細胞(5-30%)的微生物超級抗原。SEB結合在肽結合槽外的MHC II且因此是MHC II依賴性的，但是不受限制的和TCR-介導的。T-細胞的SEB-刺激導致SEB反應中寡克隆T-細胞增殖和細胞因數產生。在SEB-刺激的48小時內，PMBC上調PD-1，其中在第5天看到進一步的增強，用SEB-刺激在96-孔板中第二次培養之後。在PBMC的SEB-刺激之後，包括PD-1的免疫檢查點蛋白的上調限制再刺激後的細胞因數釋放。檢查抗-PD-L1抗體chPD-L1 MAB-1
、chPD-L1 MAB-2
和chPD-L1 MAB-3
，和參照抗體PD-L1 MAB-A
、PD-L1 MAB-B
、PD-L1 MAB-C
通過檢查點抑制用於增強細胞因數釋放的能力。
為了進行這樣的調查研究，根據製造商的說明書，使用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare)密度梯度離心方法從在健康供體的知情同意下獲得的全血(Biological Specialty Corporation)純化PBMC，然後根據製造商的說明書，使用Dynabeads®Untouched人T細胞試劑盒 (Life Technologies)純化T細胞。在T-75大燒瓶中，將純化的PBMC與1 ng/mL的SEB (Sigma-Aldrich)在RPMI-培養基+10%加熱滅活的FBS+1%青黴素/鏈黴素中培養3天(初步刺激)。在第一輪SEB-刺激結束時，用培養基洗滌PBMC兩次，並且立即以培養基中1 x 105
細胞/孔的濃度將其與1 ng/mL的SEB(二次刺激)和IgG對照或抗-PD-L1抗體(0.04 nM至1 nM；3倍系列稀釋)一起鋪在96-孔組織培養板中，培養另外2天。在第二次刺激結束時，根據製造商的說明書，使用用於IFNγ的人DuoSet ELISA試劑盒(R&D系統)收穫上清液用於測量細胞因數分泌。圖 9
示出來自SEB-刺激的(0.25 ng/mL)代表性反應供體的PBMC的代表性IFNγ 分泌物的分佈。結果顯示所有測試的抗-PD-L1抗體展現出檢查點抑制活性，如增強的細胞因數釋放所例證的。
實施例2PD-L1 x CD137 雙特異性分子
生成示例性PD-L1 x CD137
四價雙特異性分子，DART-A
、DART-B
、DART-C
、DART-G
和DART-F
。此外，生成示例性PD-L1 x CD137
三價分子TRIDENT-C
、TRIDENT-D
、TRIDENT-E
、TRIDENT-F
和TRIDENT-G
。以上討論了這些分子和某些雙特異性對照分子的結構域屬性 (參見表 6- 表 7
)。與DART-A–DART-D相比，DART-G和DART-F的PD-L1和CD137結合結構域處於相對的位置(對比圖 5B
和圖 5C
)。表徵PD-L1 x CD137
雙特異性分子的細胞表面結合、PD-L1阻斷和CD137刺激。細胞表面結合
評估PD-L1 x CD137
雙特異性分子DART-A
、DART-B
、DART-C
、DART-D
、DART-G
、DART-F
、TRIDENT-C
、TRIDENT-D
、TRIDENT-E
、TRIDENT-G
、TRIDENT-F
、相應的親本的(嵌合的或人源化的)抗-PD-L1和抗-CD137抗體以及陰性對照：hIgG1
(不相關的抗體作為同種型對照)、DART-1
(RSV x CD137)和TRIDENT-1
(RSV x CD137)的用於結合至表達PD-L1的CHO細胞(CHO/PD-L1) (PD-L1++++
)的表面和表達CD137的CHO細胞(CHO/CD137)的表面的能力。為了完成這點，基本上如上所述進行FACS分析，除了使用山羊抗-人-APC第二抗體外。圖 10A
示出親本的PD-L1抗體(PD-L1 MAB-A
、chPD-L1 MAB-2
和chPD-L1 MAB-3
)與CHO/PD-L1細胞的代表性的結合曲線。圖 10B
示出親本的抗-CD137抗體(CD137 MAB-A
、CD137 MAB-B
和chCD137 MAB-1
)與CHO/CD137細胞的代表性的結合曲線。圖 11A- 圖 11L
提供代表性的結合曲線，其示出所有的PD-L1 x CD137
雙特異性分子能夠有效地結合在細胞表面上表達的PD-L1 (圓形填充的)和CD137 (方塊形填充的)二者。PD-L1 阻斷
基本上如上所述，在進行的Jurkat-luc-NFAT/CHO/PD-L1螢光素酶報告測試中檢查DART-A
、DART-B
、DART-C
、DART-D
、DART-F
、DART-G
、TRIDENT-C
、TRIDENT-D
、TRIDENT-E
、TRIDENT-F
、TRIDENT-G
、相應親本的抗-PD-L1抗體(PD-L1 MAB-A
、chPD-L1 MAB-2
、hPD-L1 MAB-2 (1.1)
、chPD-L1 MAB-3
和hPD-L1 MAB-3 (1.1)
)以及陰性對照：hIgG1
和DART-1
用於對抗PD-1/PD-L1軸(即，阻斷PD-1/PD-L1相互作用並且防止T細胞應答的下調)的能力，除了使用山羊抗-人-APC第二抗體外。在圖 12A- 圖 12F
中示出代表性的飽和曲線。結果顯示，所有測試的雙特異性分子展現出PD-L1阻斷活性。擁有兩個PD-L1結合位點的四價分子相對於三價分子展現出較大的PD-L1阻斷活性。CD137 刺激活性
DART-A
、DART-B
、DART-C
、DART-D
、DART-F
、DART-G
、TRIDENT-C
、TRIDENT-D
、TRIDENT-E
、TRIDENT-F
、TRIDENT-G
、chCD137 MAB-1
、CD137 MAB-A
、PD-L1 MAB-A
和陰性對照：hIgG1
和DART-1
用於介導在表達CD137的報告細胞系(Jurkat-NF-κB-Luc)中NF/kB路徑的靶標依賴性信號轉導的能力通過增加的螢光素酶表達來證明，該螢光素酶表達在具有不同水準的PD-L1表達的靶細胞的存在下觀察。CD137 MAB-A
具有對抗活性，並且在這些檢測中是陽性對照。
為了進行這樣的調查，用4x105
CHO/PD-L1細胞(PD-L1++++
)、Caki-2細胞(PD-L1++
)、JIMT-1細胞(PD-L1++
)、N87細胞(PD-L1+
)或對照CHO細胞(PD-L1-
)靶細胞預先接種在共培養微量滴定板中，並且在37°C孵育過夜。在第2天，在增加被測分子濃度的存在下，將4x104
過表達CD137的Jurkat-NF-κB-Luc報告細胞添加至包含靶細胞的孔中以及沒有靶細胞的對照板中。在37°C孵育板4小時。然後將BioGlo底物(Promega) 添加至每個孔中並在室溫孵育板另外的5-10分鐘，信號轉導通過以發光相對光單位(RLU)作為讀數的發光測量。
結果(圖 13A- 圖 13H
)示出了PD-L1 x CD137
雙特異性分子以PD-L1-依賴性方式介導T-細胞信號轉導。在超生理學的PD-L1表達水準(CHO/PD-L1)，所有雙特異性雙抗體都表現出相似的CD137啟動分佈。在較低PD-L1表達水準，三價分子相對於四價分子展現出較大的CD137刺激活性。不受任何特定機制的束縛，該發現可能是由於在該測試中在這些條件下的最佳PD-L1利用引起。
激動劑CD137 MAB-A
抗體展現出獨立於PD-L1表達的活性，並且是在沒有靶細胞的情況下唯一展現活性的分子。
實施例3原代細胞測試
PD-L1 x CD137雙特異性分子的活性另外通過三種原代細胞培養測試來表徵：原代T細胞、SEB再刺激和MLR測試。原代 T 細胞測試
在存在表達不同水準的PD-L1的靶細胞和不存在CD137配體的情況下，評估CD137 MAB-A
、PD-L1 MAB-A
和陰性對照：hIgG1
和DART-1
各自用於誘導來自T細胞的細胞因數(例如IFN-γ、TNF-α)釋放(即它們的激動劑活性)的能力。對於這種評估，將人泛(pan)T細胞(根據製造商的方案，使用磁珠無接觸人T細胞試劑盒(Dynabeads Untouched Human T cells Kit( Invitrogen Cat# 11344D)從供體PBMC純化)重懸於在測試培養基中並且放置在組織培養箱中過夜。CHO/PD-L1 (PD-L1++++
)細胞、Caki-2 (PD-L1++
)細胞和對照CHO (PD-L1-
)細胞從培養物中獲得。洗滌後，將4 x 104
細胞預接種在平底明亮的96-孔板中並且放置在組織培養箱中過夜。第二天，使用Beckman Coulter Vi-Cell計數器通過台盼藍排除法測定靜息(rested)的人泛T細胞的密度和活力並且調整至2 x 106
細胞/mL的密度。次日，丟棄上層清液並且將50 µL的系列稀釋的測試物品(抗體、雙抗體、三價分子等)、以2.0 x 106
珠/mL的 50 µL的預先洗滌的磁珠αCD3 (REF 11151D； Thermo Fisher Scientific的Invitrogen)、以2.0 x 106
細胞/mL的50 µL/孔的人泛T細胞和50 µL的測試培養基添加至測試板的每個孔中。在板上每個孔的最終體積是200 µL。對於不含測試物品或α CD3珠的對照孔，添加測試培養基以使總體積達到200 µL，並將板在組織培養箱中孵育72小時。然後從每個孔收集上清液，並且根據製造商的說明書，使用來自R&D系統的細胞因數ELISA試劑盒(人IL-2 DuoSet ELISA (Cat：DY202)、人IFN-γ DuoSet ELISA (Cat：DY285))測量釋放的細胞因數IFN-γ和IL-2。ELISA方法利用試劑盒提供。使用Microsoft Excel 和SoftMax Pro進行資料分析以外推細胞因數水準，其以直條圖(prism)繪製。IFN-γ釋放的代表性的圖在圖 14A- 圖 14C
中示出。
此外，在移除已經用於上述細胞因數分析的上清液後，通過FACS分析CHO/PD-L1共培養樣品。簡言之，為了測試物品與細胞的結合和CD137、PD-1和 HLA-DR(作為啟動的標記物)的表達，檢查CD4+
和CD8+
T細胞。CD8+
細胞的FACS分析的代表性圖在圖 15A
(測試物品結合(平均螢光強度))、圖 15B
(HLA-DR表達(陽性CD8+
細胞%))、圖 15C
(CD137表達(陽性CD8+
細胞%)和圖 15D
(PD-1表達(陽性CD8+
細胞%))中示出。
在進一步研究中，基本上如所述的，在存在表達不同水準的PD-L1的靶細胞和不存在CD137配體的情況下，對於每一測試物品以及JIMT-1 (PD-L1++)細胞或CHO (PD-L1-
)細胞使用從6.67 nM開始的1/5系列稀釋，評估DART-C
、TRIDENT-E
、抗體chCD137 MAB-1
和hPD-L1 MAB-3 (1.1)
單獨地和組合以及陰性對照hIgG1
的用於誘導來自T細胞的細胞因數(例如IFN-γ)釋放的能力(即它們的激動劑活性)。在圖 16A- 圖 16B
中示出IFN-γ釋放的代表性圖。此外，在移除已經用於上述細胞因數分析的上清液後，通過FACS分析JIMT-1共培養樣品。簡言之，通過大小/細微性限制以富集JIMT-1的所有細胞用於檢查PD-L1表達，並且檢查CD3+
T細胞的CD137的表達。在圖 16C
中示出FACS分析的代表性圖。在其他研究中，基本上如所述，在不存在CD137配體的情況下，對於每一測試物品以及JIMT-1 (PD-L1++)細胞或CHO (PD-L1-
)細胞使用從1 µg/mL開始的1/5系列稀釋，評估DART-F
、DART-G
、TRIDENT-F
、TRIDENT-G
、抗-PD-L1抗體hPD-L1 MAB-2 (1.1)
、hPD-L1 MAB-3 (1.1)
單獨地或與CD137 MAB-A
組合，以及陰性對照hIgG1
的用於誘導來自T細胞的細胞因數(例如IFN-γ)釋放的能力(即它們的激動劑活性)。在圖 16D- 圖 16E
中示出IFN-γ釋放的代表性圖。
在這些測試中，PD-L1 x CD137
雙特異性分子和對抗CD137 MAB-A
以PD-L1-依賴性方式介導T-細胞信號轉導(以IFN-γ釋放例證的)，其中模式與CD137報告測試的結果非常相似。PD-L1 MAB-A
、hPD-L1 MAB-2 (1.1)
、hPD-L1 MAB-3 (1.1)
、CD137 MAB-3
；hPD-L1 MAB-3 (1.1)
和CD137 MAB-3
的組合；hPD-L1 MAB-2 (1.1)
和CD137 MAB-A
的組合；hPD-L1 MAB-3 (1.1)
和CD137 MAB-A
的組合；以及陰性對照(hIgG、DART-1)都沒有展現出任何活性。
該評估的結果示出，所有PD-L1 x CD137
雙特異性分子和抗-CD137和抗-PD-L1抗體都被發現結合至T細胞(比抗-PD-L1 mAb更少)。PD-L1 x CD137
雙特異性分子與CD137 MAB-A
和PD-L1 MAB-A
相比展現出大得多的T細胞啟動活性 (以HLA-DR表達例證的)。如通過FACS分析測量的，PD-L1 x CD137
雙特異性分子增加CD137的表達至與激動劑CD137 MAB-A
相當的水準，雙特異性分子增加PD-1的表達至與PD-L1 MAB-A
相當的水準，和雙特異性分子增加PD-L1的表達。SEB 刺激測試
在SEB再刺激測試中，檢查PD-L1 x CD137
雙特異性分子：DART-A
、DART-B
、DART-C
、DART-D
、TRIDENT-C
、TRIDENT-D
、參考抗體CD137 MAB-A
、PD-L1 MAB-A
單獨或組合(在指示的濃度添加每種抗體)，和陰性對照：hIgG1
和DART-1
的用於通過檢查點抑制增加細胞因數釋放的能力。除了測試物品的濃度外，基本上如上所述進行SEB再刺激測試。
在圖 17
中示出SEB-刺激的(1 ng/mL)來自代表性反應供體的PBMC的代表性的IFNγ分泌物分佈。結果示出PD-L1 x CD137
雙特異性分子展現出檢查點抑制活性，以增強的細胞因數釋放例證。包含新型PD-L1 MAB-1
、PD-L1 MAB-2
和/或CD137 MAB-A
的PD-L1 x CD137
雙特異性分子，特別是對PD-L1和CD137中每一個具有兩個結合位點的那些，與以抗-PD-L1和抗-CD137抗體單獨或組合的處理相比展現出優異的檢查點抑制。MLR 測試
評估PD-L1 x CD137
雙特異性分子DART-A
、DART-B
、DART-C
、DART-D
、TRIDENT-C
、TRIDENT-D
，參考抗體CD137 MAB-A
、PD-L1 MAB-A
單獨和組合，和陰性對照：IgG1
和DART-1
的用於增強混合淋巴細胞反應(MLR
)的應答的能力。通過用GM-CSF (100 ng/ml)和IL-4 (10 ng/ml)處理CD14+
單核細胞(使用Miltenyi陽性選擇試劑盒從來自供體A的人PBMC中分離的)生成單核細胞衍生的樹突狀細胞，然後培養細胞7天。在第7天，收穫細胞並將其鋪在96-孔板且培養24 h。在第8天，CD4+
T-細胞(使用Myltenyi試劑盒通過陰性選擇從供體B中分離的)與單核細胞衍生的樹突狀細胞以1：5比例共鋪板，以25 nM、5 nM、1 nM、0.2 nM和0.04 nM添加測試物品，並且將細胞培養3天。在72-120小時後，根據製造商的說明書，使用商業的細胞因數ELISA試劑盒測量在培養物上清液中的細胞因數(IL-2和INF-γ)的水準。在圖 18A- 圖 18B
中示出來自代表性供體的IL-2和INF- γ分泌分佈。
在其他研究中，基本上如所述的，對於每一測試物品使用從5 µg/mL開始的1/5系列稀釋，評估DART-F
、DART-G
、TRIDENT-F
、TRIDENT-G
、抗-PD-L1抗體hPD-L1 MAB-2 (1.1)
、hPD-L1 MAB-3 (1.1)
單獨或與CD137 MAB-A
組合和陰性對照hIgG1
的用於增加混合淋巴細胞反應(MLR
)的應答的能力。在圖 18C
中示出來自代表性供體的IL-2分泌分佈。
結果示出，PD-L1 x CD137
雙特異性分子，特別是對於PD-L1和CD137中每一個具有兩個結合位點的那些，與以單獨或組合的抗體治療相比，展現出優異的MLR應答的增強(以細胞因數釋放例證)。
實施例4PD-L1 x CD137 雙特異性分子在組合中的研究
如上所述，本發明的PD-L1 x CD137
雙特異性分子可以增強T-細胞擴增和啟動。已知結合至腫瘤抗原(TA
)和結合至CD3的雙特異性分子(例如，DART雙抗體、BiTE®分子等等) (即TA x CD3
雙特異性分子)介導表達TA的靶細胞的T細胞重定向殺死，和刺激T-細胞擴增和啟動(參見，例如PCT公開號WO 2017/030926、WO 2016/048938和WO 2015/026892)。使用能夠結合腫瘤抗原 B7-H3 (即TA是B7-H3，以便採用的分子是B7-H3 x CD3
雙特異性分子)或腫瘤抗原5T4 (即TA是5T4，以便採用的分子是5T4 x CD3
雙特異性分子)的示例性TA x CD3
雙特異性分子，評估本發明的PD-L1 x CD137
雙特異性分子通過這種腫瘤靶向劑增強T-細胞啟動的能力。
使用細胞毒性T淋巴細胞(CTL)測試，評價示例性的PD-L1 x CD137
雙特異性分子DART-C
和TRIDENT-C
、對應的親本抗體PD-L1 MAB-3
單獨或與CD137 MAB-1
組合，和陰性對照hIgG1
的用於增強由B7-H3 x CD3
雙抗體介導的T-細胞啟動和介導細胞殺死的能力。
因此，在1 µg/mLDART-C
、TRIDENT-C
、PD-L1 MAB-3
、PD-L1 MAB-3
/CD137 MAB-1
或hIgG1
和增加濃度的B7-H3 x CD3
雙抗體存在的情況下，以3:1的效應子：靶標(E:T)比例將泛T效應細胞與JIMT-1或Caki-2靶細胞孵育。在孵育結束時，通過測量乳酸脫氫酶(LDH
)由受損細胞向培養基中的釋放來確定細胞毒性。使用定量測量LDH的釋放的CytoTox 96®非放射性細胞毒性測試試劑盒(Promega)進行這些測試。基本上如上所述，還評估上清液的釋放的IFN-γ、TNF-α。
在另一個研究中，使用細胞毒性T淋巴細胞(CTL)測試，評估示例性PD-L1 x CD137
雙特異性分子DART-C
和TRIDENT-E
的用於增強由5T4 x CD3
雙抗體介導的T-細胞啟動的能力。基本上如上面描述的，使用這種分子或與CD137 MAB-1
組合的hPD-L1 MAB-3 (1.1)
，或陰性對照hIgG1
進行毒性T淋巴細胞(CTL)測試，除了泛T效應細胞用表達5T4的RKO靶細胞孵育外。基本上如上所述，在孵育結束時還評估上清液釋放的IFN-γ、TNF-α。
與B7-H3 x CD3
雙抗體的組合的代表性的殺死和啟動曲線(如以IFN-γ的釋放為例)在圖 19A- 圖 19D
中示出，並且與5T4 x CD3
雙抗體的組合的啟動曲線(如以IFN-γ的釋放為例)在圖 19E
中示出。結果證明本發明的PD-L1 x CD137
雙特異性分子能夠增加由TA x CD3
雙特異性分子介導的T-細胞啟動。
在另一個研究中，使用BioMAP®腫瘤學系統(通過DiscoverX/ Eurofins Pharma Discovery Services進行)，在體外腫瘤微環境模型中檢查DART-D
和TRIDENT-D
、相應的親本抗體PD-L1 MAB-2
，單獨地或與CD137 MAB-1
組合和陰性對照hIgG1
的用於增強免疫反應的能力。
簡言之，HT-29結直腸細胞用纖維母細胞和PBMC培養以重現基質微環境，並且在用20、6.7、2.2或0.7 nM的抗體組合、PD-L1 x CD137
雙特異性分子或媒介對照處理之後，測量IFN-γ、IL-2和TNF-α的表達。如在圖 20
中示出，PD-L1 x CD137
雙特異性分子刺激免疫反應(以細胞因數的釋放例證)至比兩個分離的抗體的組合更大的程度。
實施例5T 細胞啟動基因圖譜
檢測PD-L1 MAB-3
、與 CD137 MAB-A 組合的 PD-L1 MAB-3
、PD-L1 x CD137
雙特異性分子DART-C
或hIgG1
對照處理的T細胞的基因表達圖譜。簡言之，通過同種異體的APC (在通過用GM-CSF + IL-4的7天培養從原代人單核細胞體外生成的)刺激從新鮮地純化的人PBMC中分離的CD4+ T細胞約72 h。在刺激後，CD4+細胞從APC分離並且溶解用於mRNA提取。使用Illumina的HiSeq 2500平臺通過150c配對的末端協議進行高通量測序。使用Strand套裝軟體進行序列比對和差異表達分析。對於每個基因，在圖 21C
中報告超過該基因的最低值的倍數增加的表達。
在圖 21A- 圖 21C
中呈現的卞氏圖表(Venn diagram)中匯總來自兩個供體的結果。圖 21A
提供了相對於hIgG1
-處理的細胞發現上調的基因的數量。在用PD-L1 MAB-3
單獨處理的T細胞中，發現82個基因展現出增強的(＞1.8 x)表達。在已經用PD-L1 MAB-3
和CD137 MAB-A
的組合處理的T細胞中，另外的27個基因展現出增強的表達。用PD-L1 x CD137
雙特異性分子DART-C
處理的T細胞展現出另外13個基因的增強表達。圖 21B- 圖 21C
提供被發現展現出改變的表達的選擇基因的特徵(identity)。在圖 21B
中以底線示出的基因表明編碼細胞內分子的基因。在圖 21C
中證明瞭在PD-L1 x CD137
雙特異性分子處理後呈現增加表達的選擇基因的熱圖。這些資料證實相對於兩個單獨的抗體的組合本發明的PD-L1 x CD137
雙特異性分子誘導獨特的基因表達圖譜。
實施例6體內研究
如上所述，本發明的PD-L1 x CD137
雙特異性分子能夠體外增強由TA x CD3
雙特異性分子介導的T-細胞啟動。在人PBMC-重構的鼠異種移植模型中，體內測試示例性的PD-L1 x CD137
雙特異性分子TRIDENT-E
用於增強示例性TA x CD3
雙特異性分子5T4 x CD3
雙抗體的抗腫瘤活性的能力。簡言之，在研究日(SD) 0，將新鮮分離的PBMC(8 x 106
)眶後注射到NOD.Cg-Prkdcscid H2-K1tm1Bpe H2-D1tm1Bpe Il2rgtm1Wjl/SzJ小鼠中。在SD8，皮下注射1：1混合的RKO結腸癌細胞(5 x 106
)與基質膠。在SD5，用OKT4處理小鼠，並且在SD14，用5T4 x CD3
雙抗體(以50µg/kg每週兩次)處理(IV)，並且開始TRIDENT-E
處理(每週以1 mg/kg)。用卡尺每週兩次測量腫瘤生長(N=8/組)。如在圖 22
中示出，PD-L1 x CD137
雙特異性和TA x CD3
二者在測試的濃度對腫瘤生長呈現出僅最小的抑制。然而，TRIDENT-E
和5T4 x CD3
雙抗體的組合顯著地抑制腫瘤生長。該研究證明與TA x CD3
雙特異性分子組合的PD-L1 x CD137
雙特異性分子能夠體內抑制腫瘤生長。
本說明書中提及的所有出版物和專利以相同的程度通過引用併入本文，如同每個單獨的出版物或專利申請被明確且單獨地指出以其全部內容通過引用併入一樣。儘管本發明已經結合其具體實施方式進行了描述，但是應當理解它能進一步改變，並且本申請意欲涵蓋本發明的任何變化、用途或改變，其總體上遵循本發明的原理並且包括落入本發明所屬領域內的已知或慣用實踐內的並且可適用於前文所提出的實質特徵的這種偏離。
無
圖 1A- 圖 1B
提供包括兩條多肽鏈的具有兩個表位結合位點的代表性共價結合的雙抗體的示意圖，每條多肽鏈具有E-螺旋或K-螺旋異源二聚體-促進結構域(下面提供可替選的異源二聚體-促進結構域)。半胱氨酸殘基可存在於連接體中(圖 1A
)和/或異源二聚體-促進結構域中(圖 1B
)。半胱氨酸殘基的另外的構型在圖 6B- 圖 6D
中提供。識別相同表位元的VL和VH結構域使用相同的陰影或填充圖案顯示。在這個圖中以及在所有圖中提供結合分子結構域的示意性展示中的波浪線(WWW)代表一種或多種任選的異源二聚體-促進結構域，其是優選地存在的。
圖 2
提供包括兩條多肽鏈的具有兩個表位結合位點的代表性共價結合的雙抗體分子的示意圖，每條多肽鏈具有CH2和CH3結構域，使得締合的鏈形成Fc區的全部或部分(“攜帶 Fc 區的
”)。識別相同表位元的VL和VH結構域使用相同的陰影或填充圖案顯示。
圖 3A- 圖 3E
提供顯示包括兩對多肽鏈(即，總共四條多肽鏈)的具有四個表位結合位點的代表性共價結合的四價雙抗體的示意圖。每一對中的一條多肽擁有CH2和CH3結構域，使得締合的鏈形成Fc區的全部或部分。識別相同表位元的VL和VH結構域使用相同的陰影或填充圖案顯示。兩對多肽鏈可以相同。在這種實施方式中，其中兩對多肽鏈是相同的並且VL和VH結構域識別不同表位元(如在圖 3A- 圖 3B
中顯示)，所得分子擁有四個表位結合位點並且關於每個結合的表位是雙特異性的和二價的。在這種實施方式中，其中VL和VH結構域識別相同表位元(例如，相同VL結構域CDR和相同VH結構域CDR被用於兩條鏈上)，所得分子擁有四個表位結合位點並且關於單個表位是單特異性的和四價的。可替選地，兩對多肽可以是不同的。在這種實施方式中，其中兩對多肽鏈是不同的並且每對多肽的VL和VH結構域識別不同表位元(如在圖 3C
中通過不同的陰影或圖案顯示)，所得分子擁有四個表位結合位點並且關於每個結合的表位是四特異性的和單價的。圖 3A
顯示攜帶Fc區的雙抗體，其包含包括半胱氨酸殘基的肽異源二聚體-促進結構域。圖 3B
顯示攜帶Fc區的雙抗體，其包含包括半胱氨酸殘基的E-螺旋和K-螺旋異源二聚體-促進結構域以及連接體(具有任選的半胱氨酸殘基)。圖 3C
顯示攜帶Fc區的雙抗體，其包含抗體CH1和CL結構域。圖 3D- 圖 3E
示意如何選擇在圖 3B
中顯示的結合結構域可以導致具有對PD-L1表位特異性的兩個結合位點和對CD137的表位特異性的兩個結合位點的PD-L1 x CD137
結合分子。圖 3D-3E
示意可以如何選擇結構域以產生具有不同取向的PD-L1 x CD137
結合分子(即，圖 3D
採用VL CD137結構域作為結合分子的VL1結構域、VH CD137結構域作為結合分子的VH1結構域、VL PD-L1結構域作為結合分子的VL2結構域和VH PD-L1結構域作為結合分子的VH2結構域。而圖 3E
採用VL PD-L1結構域作為結合分子的VL1結構域、VH PD-L1結構域作為結合分子的VH1結構域、VL CD137結構域作為結合分子的VL2結構域和VH CD137結構域作為結合分子的VH2結構域)。如下面提供，通過多肽鏈的締合形成的VL/VH結合位點可以是相同的或不同的，以允許單特異性、雙特異性、三特異性或四特異性的四價結合。
圖 4A- 圖 4B
提供包括三條多肽鏈的具有兩個表位結合位點的代表性共價結合的雙抗體分子的示意圖。該多肽鏈中的兩條擁有CH2和CH3結構域，使得締合的鏈形成Fc區的全部或部分。包含VL和VH結構域的多肽鏈進一步包含異源二聚體-促進結構域。識別相同表位元的VL和VH結構域使用相同的陰影或填充圖案顯示。
圖 5A- 圖 5C
提供包括五條多肽鏈的具有四個表位結合位點的代表性共價結合的結合分子的示意圖。圖 5A
顯示這種五鏈結合分子的一般結構。該多肽鏈中的兩條擁有CH2和CH3結構域，使得締合的鏈形成包括Fc區的全部或部分的Fc區。包含連接的VL和VH結構域的多肽鏈進一步包含異源二聚體-促進結構域。半胱氨酸殘基可存在於連接體中和/或異源二聚體-促進結構域中(參見，例如圖 6B-6D
)。識別相同表位元的VL和VH結構域使用相同的陰影或填充圖案顯示。圖 5B
顯示一個五鏈PD-L1 x CD137
結合分子的結構，其中在圖 5A
中顯示的可變結構域已經被選擇以產生擁有對PD-L1特異性的兩個非雙抗體型結合結構域和對CD137特異性的兩個雙抗體型結合結構域的所得PD-L1 x CD137
結合分子。圖 5C
顯示可替選的五鏈PD-L1 x CD137
結合分子的結構，其中在圖 5A
中顯示的可變結構域已經被選擇以產生擁有對CD137特異性的兩個非雙抗體型結合結構域和對PD-L1特異性的兩個雙抗體型結合結構域的所得PD-L1 x CD137
結合分子。將理解，通過適當的選擇在圖 5A
中顯示的結合結構域，結合結構域中的任何三個可被選擇以結合CD137的表位。同樣地，結合結構域中的任何三個可被選擇以結合PD-L1的表位。如下面提供的，通過多肽鏈的締合形成的VL/VH結合位點可以是相同的或不同的，以允許單特異性、雙特異性、三特異性或四特異性的四價結合。
圖 6A- 圖 6I
提供具有三個表位結合位點的代表性攜帶Fc區的三價結合分子的示意圖。圖 6A
示意性地示例包含具有不同結構域取向的兩個雙抗體型結合結構域和Fab型結合結構域的三價結合分子的結構域，其中雙抗體型結合結構域為N-端至Fc區。在圖 6A
中，異源二聚體-促進E-螺旋和K-螺旋包含能夠使締合的多肽鏈彼此共價結合的半胱氨酸殘基；在可替換的實施方式中，半胱氨酸殘基併入連接體中，在仍其他的實施方式中，半胱氨酸殘基併入螺旋和連接體二者中(參見，例如在圖 6B- 圖 6D
和圖 6F- 圖 6G
中框出的替代構型)。圖 6B
顯示示例性的PD-L1 x CD137
結合分子的結構，其中在圖 6A
中顯示的可變結構域已經被選擇以產生擁有對PD-L1特異性的非雙抗體型結合結構域和對CD137特異性的兩個雙抗體型結合結構域的所得PD-L1 x CD137
結合分子。圖 6C- 圖 6D
顯示示例性的PD-L1 x CD137
結合分子的結構，其中在圖 6A
中顯示的可變結構域已經被選擇以產生擁有對CD137特異性的非雙抗體型結合結構域、對PD-L1特異性的雙抗體型結合結構域和對CD137特異性的第二雙抗體型結合結構域的所得PD-L1 x CD137
結合分子。圖 6E
示意性地示例包含具有不同結構域取向的兩個雙抗體型結合結構域和Fab型結合結構域的三價結合分子的結構域，其中雙抗體型結合結構域為C-端至Fc區。在圖 6A- 圖 6E
中的分子包含四條鏈。圖 6F
和圖 6G
分別示意性地示例三價結合分子的結構域，其包含兩個雙抗體型結合結構域N-端至Fc區；以及Fab型結合結構域，其中輕鏈和重鏈通過多肽間隔子連接，或scFv型結合結構域。在圖 6H
和圖 6I
中的三價結合分子分別示意性地示例三價結合分子的結構域，其包含兩個雙抗體型結合結構域C-端至Fc區；以及Fab型結合結構域，其中輕鏈和重鏈通過多肽間隔子連接，或scFv型結合結構域。在圖 6F
-圖 6I
中的三價結合分子包含三條鏈。識別相同表位元的VL和VH結構域使用相同的陰影或填充圖案顯示。
圖 7A-7B
顯示嵌合抗體chPD-L1 MAB-1
、chPD-L1 MAB-2
和chPD-L1 MAB-3
以及參考抗體PD-L1 MAB-A
用以結合至Caki-2 (PD-L1++
)透明細胞腎細胞癌(ccRCC)細胞的表面上表達的PD-L1(圖 7A
)以及結合至表達PD-L1的 CHO細胞的表面(CHO/PD-L1) (PD-L1++++
)(圖 7B
)的能力的代表性結合曲線。
圖 8
顯示相對於參考抗體PD-L1 MAB-A
，由chPD-L1 MAB-1
、chPD-L1 MAB-2
和chPD-L1 MAB-3
引起的PD-1–PD-L1相互作用阻斷的Jurkat-luc-NFAT/CHO/PD-L1螢光素酶報告測試的代表性飽和曲線。在該檢測系統中，PD-1–PD-L1相互作用的阻斷導致螢光素酶活性增加。
圖 9
顯示代表性的IFNγ分泌分佈，其反映抗-PD-L1抗體chPD-L1 MAB-1
、chPD-L1 MAB-2
和chPD-L1 MAB-3
以及參考抗體PD-L1 MAB-A
、PD-L1 MAB-B
、PD-L1 MAB-C
通過檢查點抑制來增強從來自代表性應答供體的SEB-刺激的(0.25 ng/mL)PBMC的細胞因數釋放的能力。
圖 10A- 圖 10B
提供PD-L1抗體和抗-CD137抗體與CHO細胞的代表性結合曲線。圖 10A
顯示PD-L1抗體與CHO/PD-L1細胞的代表性結合曲線。圖 10B
顯示抗-CD137抗體與CHO/CD137細胞的代表性結合曲線。
圖 11A- 圖 11L
提供顯示所有PD-L1 x CD137
雙特異性分子能夠有效地結合至在細胞表面上表達的PD-L1和CD137二者的代表性結合曲線(圖 11A
：DART-A
；圖 11B
：DART-C
；圖 11C
：DART-D
；圖 11D
：DART-F
；圖 11E
：DART-G
；圖 11F
：對照 DART-1 (RSV x CD137)
；圖 11G
：TRIDENT-C
；圖 11H
：TRIDENT-D
；圖 11I
：TRIDENT-E
；圖 11J
：TRIDENT-F
；圖 11K
：TRIDENT-G
；圖 11L
：對照 TRIDENT-1 (RSV x CD137)
；¢：CD137結合；：PD-L1結合。
圖 12A- 圖 12F
顯示通過基於PD-L1 MAB-A
的分子(PD-L1 MAB-A
、DART-A
和DART-B
) (圖 12A
)；通過基於chPD-L1 MAB-2
的分子(chPD-L1 MAB-2
、DART-D
和TRIDENT-D
) (圖 12B
)；通過基於hPD-L1 MAB-2 (1.1)
的分子(hPD-L1 MAB-2 (1.1)
、DART-G
和TRIDENT-G
) (圖 12C
)；通過基於chPD-L1 MAB-3
的分子(chPD-L1 MAB-3
、DART-C
和TRIDENT-C
) (圖 12D
)和通過基於hPD-L1 MAB-3 (1.1)
的分子(hPD-L1 MAB-3 (1.1)
和TRIDENT-E
) (圖 12E
)、(hPD-L1 MAB-3 (1.1)
、DART-F
和TRIDENT-F
) (圖 12E
)、(hPD-L1 MAB-3 (1.1)
、DART-G
和TRIDENT-G
) (圖 12F
))引起的PD-L1阻斷的Jurkat-luc-NFAT/CHO/PD-L1螢光素酶報告檢測的代表性飽和曲線。陰性對照：hIgG1
和DART-1
的飽和曲線在圖12A-圖12F的每幅圖中顯示。
圖 13A- 圖 13H
顯示在CHO/PD-L1細胞(PD-L1++++
) (圖 13A
)、Caki-2細胞(PD-L1++
) (圖 13B
)、N87 (PD-L1+
) (圖 13C
)、JIMT-1細胞(PD-L1++
) (圖 13E
和圖 13G
)或對照CHO細胞(PD-L1-
) (圖 13D
、圖 13F
和圖 13H
)的存在下，DART-A
、DART-B
、DART-C
、DART-D
、DART-G
、DART-F
、TRIDENT-C
、TRIDENT-D
、TRIDENT-E
、TRIDENT-G
、TRIDENT-F
、CD137 MAB-A 、 chCD137 MAB-1
和PD-L1 MAB-A
介導在表達CD137的報告細胞系(Jurkat-NF-κB-Luc)中NF/kB路徑的靶標依賴性信號轉導的能力的代表性圖。陰性對照：DART-1
和/或hIgG1
的活性在每個圖中顯示。
圖 14A- 圖 14C
顯示用DART-A
、DART-B
、DART-C
、DART-D
、TRIDENT-C
、TRIDENT-D
、CD137 MAB-A
、PD-L1 MAB-A
或陰性對照：hIgG1
和DART-1
孵育後，由CHO/PD-L1 (PD-L1++++
)細胞(圖 14A
)、Caki-2 (PD-L1++
)細胞(圖 14B
)和對照CHO (PD-L1-
)細胞(圖 14C
) 引起的IFN-γ釋放的代表性圖。每個呈現的資料數列包括5列，從左至右反映了以濃度為0.00067 nM、0.0067 nM、0.067 nM、0.67 nM和6.7 nM的測試物品獲得的結果。
圖 15A- 圖 15D
顯示已經結合至DART-A
、DART-B
、DART-C
、DART-D
、TRIDENT-C
、TRIDENT-D
、CD137 MAB-A
、PD-L1 MAB-A
或陰性對照：hIgG1
和DART-1
的CD8+
T細胞的FACS分析的代表性圖 (圖 15A
(測試物品結合(平均螢光強度))；圖 15B
(HLA-DR表達(陽性CD8+
細胞%))；圖 15C
(CD137表達(陽性CD8+
細胞%)；圖 15D
(PD-1表達(陽性CD8+
細胞%)))。每個呈現的資料數列包括5列，從左至右反映了以濃度為0.00067 nM、0.0067 nM、0.067 nM、0.67 nM和6.7 nM的測試物品獲得的結果。
圖 16A- 圖 16E
顯示用包含hPD-L1 MAB-3 (1.1)
或hPD-L1 MAB-2 (1.1)
結合結構域的分子孵育後，IFN-γ釋放和CD137和PD-L1的細胞表面表達的代表性圖。hPD-L1 MAB-3 (1.1)
；chCD137 MAB-1
；hPD-L1 MAB-3 (1.1)
和chCD137 MAB-1
的組合；DART-C
；TRIDENT-E
或陰性對照hIgG1
(圖 16A-16C
)。DART-F
、DART-G
、TRIDENT-F
、TRIDENT-G
、hPD-L1 MAB-2 (1.1)
、hPD-L1 MAB-3 (1.1)
單獨地或與CD137 MAB-A
組合，或陰性對照hIgG1
(圖 16D-16E
)。通過JIMT-1 (PD-L1++
)細胞(圖 16A
和圖 16D
)和對照CHO (PD-L1-
)細胞(圖 16B
和16E
)的IFN-γ釋放、在CD3+細胞上的CD137表達和在對於JIMT-1富集的共培養細胞上的PD-L1表達，如通過FACS測定(圖 16C
)。每個呈現的資料數列包括5列，從左至右反映了從6.67 nM或1 µg/mL開始的1/5系列稀釋，如所指示的。
圖 17
顯示用PD-L1 x CD137
雙特異性分子：DART-A
、DART-B
、DART-C
、DART-D
、TRIDENT-C
、TRIDENT-D
；參考抗體CD137 MAB-A
、PD-L1 MAB-A
地單獨和組合；以及陰性對照：hIgG1
和DART-1
孵育後，來自源自代表性應答供體的SEB-刺激的(0.25 ng/mL)PBMC的代表性IFNγ分泌分佈。每個呈現的資料數列包括5列，從左至右反映了用濃度為0.04 nM、0.2 nM、1 nM、5 nM和25 nM的測試物品獲得的結果。
圖 18A- 圖 18C
顯示在混合淋巴細胞反應(MLR
)中IL-2 (圖 18A
和圖 18C
)和INF- γ (圖 18B
)的分泌分佈，其中在DART-A
、DART-B
、DART-C
、DART-D
、DART-G
、DART-F
、TRIDENT-C
、TRIDENT-D
、TRIDENT-F
、TRIDENT-G
、參考抗體：CD137 MAB-A
、PD-L1 MAB-A
單獨地或組合，人源化抗-PD-L1抗體：hPD-L1 MAB-2 (1.1)
、hPD-L1 MAB-3 (1.1)
單獨地或與CD137 MAB-A
組合，或陰性對照：hIgG1
和DART-1 的
存在下，CD4+
T細胞與單核細胞衍生的人樹突細胞共同鋪板(co-plate)。用於每種檢測的單核細胞衍生的人樹突細胞已經從代表性供體的PBMC中分離出來。
圖 19A- 圖 19E
顯示在B7-H3 x CD3
雙抗體和DART-C
、TRIDENT-C
、PD-L1 MAB-3
、PD-L1 MAB-3
/CD137 MAB-1
或hIgG1
(圖 19A- 圖 19D
)或5T4 x CD3
雙抗體和DART-C
、TRIDENT-E
、hPD-L1 MAB-3
、hPD-L1 MAB-3
/CD137 MAB-1
或hIgG1
(圖 19E
)的存在下，對於JIMT-1細胞(圖 19A
、圖 19B
)、Caki-2細胞(圖 19C
、圖 19D
)和RKO細胞(圖 19E
)的代表性殺死(圖 19A
、圖 19C
)和γ干擾素(IFN-γ)的啟動曲線(圖 19B
、圖 19D- 圖 19E
)。
圖 20
顯示在代表性的體外腫瘤微環境檢測中(StroHT29腫瘤細胞)，在DART-D
、TRIDENT-D
、hPD-L1 MAB-2
/CD137 MAB-1
或媒介對照的存在下，幾種細胞因數(IFN-γ、IL-2和TNF-α)的表達的對數變化(log change)。
圖 21A- 圖 21C
呈現用PD-L1 MAB-3
、PD-L1 MAB-3
與CD137 MAB-A
組合、PD-L1 x CD137
雙特異性分子DART-C
或hIgG1
對照處理的T細胞的基因表達譜。圖 21A
提供相對於hIgG1
處理的細胞被發現上調的基因的數量的卞氏圖表(Venn Diagram)。在用PD-L1 MAB-3
單獨處理的T細胞中發現82個基因上調。已經用PD-L1 MAB-3
和CD137 MAB-A
的組合處理的T細胞中另外的27個基因上調。用PD-L1 x CD137
雙特異性分子DART-C
處理的T細胞，呈現出另外的13個基因的上調表達。在圖 21B
中呈現的卞氏圖表提供被發現呈現改變的表達的所選擇的基因的特點，以及圖 21C
提供被發現呈現改變的表達的所選擇的基因的熱圖(heat map) (如範圍從黑色至淺色所示，以表明增加的上調表達，值是該基因最低表達水準的倍數增加)。顯示呈現上調表達的基因。在圖 21B
中以底線顯示的基因表示編碼細胞內分子的基因。
圖 22
顯示相對於鼠PBMC重構的異種移植模型中的單獨的分子或媒介對照，代表性PD-L1 x CD137
雙特異性分子(TRIDENT-E)
與代表性TA x CD3
雙特異性分子(5T4 x CD3
雙抗體) 組合用以在體內預防或抑制RKO結腸癌細胞的腫瘤生長或發育的能力。
Claims (25)
- 一種PD-L- 結合分子，其能夠結合至人PD-L1的表位，其中所述PD-L1- 結合分子包括包含CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3的PD-L1-結合重鏈可變結構域和包含CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3的PD-L1-結合輕鏈可變結構域，並且其中： (A) (1) 所述PD-L1-結合重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是PD-L1 MAB-2 VH (SEQ ID NO:63 )的重鏈CDR；和 (2) 所述PD-L1-結合輕鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是PD-L1 MAB-2 VL (SEQ ID NO:67 )的輕鏈CDR； (B) (1) 所述PD-L1-結合重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是PD-L1 MAB-3 VH (SEQ ID NO:73 )的重鏈CDR；和 (2) 所述PD-L1-結合輕鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是PD-L1 MAB-3 VL (SEQ ID NO:77 )的輕鏈CDR； 或 (C) (1) 所述PD-L1-結合重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是PD-L1 MAB-1 VH (SEQ ID NO:55 )的重鏈CDR；和 (2) 所述PD-L1-結合輕鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是PD-L1 MAB-1 VL (SEQ ID NO:59 )的輕鏈CDR。
- 如請求項1所述的PD-L1- 結合分子 ，其包括PD-L1-結合重鏈可變結構域，所述PD-L1-結合重鏈可變結構域包含氨基酸序列： (A)hPD-L1 MAB-2 VH1 (SEQ ID NO:71 )；或 (B)hPD-L1 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:81 )。
- 如請求項1所述的PD-L1- 結合分子 ，其包括PD-L1-結合輕鏈可變結構域，所述PD-L1-結合輕鏈可變結構域包含氨基酸序列： (A)hPD-L1 MAB-2 VL (SEQ ID NO:72 )；或 (B)hPD-L1 MAB-3 VL1 (SEQ ID NO:82 )。
- 如請求項1-3中任一項所述的PD-L1 -結合分子，其中所述分子是抗體或其表位結合片段。
- 一種PD-L1 x CD137 結合分子，其能夠結合至人CD137的表位和人PD-L1的表位，其中所述PD-L1x CD137 結合分子包含請求項1-4中任一項中的PD-L1-結合重鏈可變結構域和PD-L1-結合輕鏈可變結構域。
- 如請求項5所述的PD-L1 x CD137 結合分子，其中所述PD-L1x CD137 結合分子包括包含CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3的CD137-結合重鏈可變結構域和包含CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3的CD137-結合輕鏈可變結構域；並且其中： (A) (1) 所述CD137-結合重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-1 VH (SEQ ID NO:90 )的重鏈CDR；和 (2) 所述CD137-結合輕鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-1 VL (SEQ ID NO:94 )的輕鏈CDR； (B) (1) 所述CD137-結合重鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hCD137 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:99 )、hCD137 MAB-1 VH1A (SEQ ID NO:100 )、hCD137 MAB-1 VH1B (SEQ ID NO:102 )、hCD137 MAB-1 VH1C (SEQ ID NO:104 )、hCD137 MAB-1 VH1D (SEQ ID NO:106 )、hCD137 MAB-1 VH1E (SEQ ID NO:108 )、hCD137 MAB-1 VH1F (SEQ ID NO:109 )或hCD137 MAB-1 VH1G (SEQ ID NO:110 )的重鏈CDR；和 (2) 所述CD137-結合輕鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hCD137 MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:112) 、hCD137 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:114) 、hCD137 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:115) 、hCD137 MAB-1 VL4 (SEQ ID NO:116) 、hCD137 MAB-1 VL5 (SEQ ID NO:117) 、hCD137 MAB-1 VL6 (SEQ ID NO:118) 、hCD137 MAB-1 VL7 (SEQ ID NO:120) 、hCD137 MAB-1 VL8 (SEQ ID NO:121) 、hCD137 MAB-1 VL9 (SEQ ID NO:122) 、hCD137 MAB-1 VL10 (SEQ ID NO:123) 、hCD137 MAB-1 VL11 (SEQ ID NO:125) 、hCD137 MAB-1 VL12 (SEQ ID NO:127) 、hCD137 MAB-1 VL13 (SEQ ID NO:128) 、hCD137 MAB-1 VL14 (SEQ ID NO:129) 或hCD137 MAB-1 VL15 (SEQ ID NO:131) 的輕鏈CDR； 或 (C) (1) 所述CD137-結合重鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-2 VH (SEQ ID NO:133 )的重鏈CDR；和 (2) 所述CD137-結合輕鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-2 VL (SEQ ID NO:135 )的輕鏈CDR。
- 如請求項6所述的PD-L1 x CD137 結合分子，其包括CD137-結合重鏈可變結構域，所述CD137-結合重鏈可變結構域包含氨基酸序列： (A)hCD137 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:99 )； (B)hCD137 MAB-1 VH1A (SEQ ID NO:100 )； (C)hCD137 MAB-1 VH1B (SEQ ID NO:102 )； (D)hCD137 MAB-1 VH1C (SEQ ID NO:104 )； (E)hCD137 MAB-1 VH1D (SEQ ID NO:106 )； (F)hCD137 MAB-1 VH1E (SEQ ID NO:108 )； (G)hCD137 MAB-1 VH1F (SEQ ID NO:109 )； (H)hCD137 MAB-1 VH1G (SEQ ID NO:110 )；或 (I)hCD137 MAB-2 VH1 (SEQ ID NO:139 )。
- 如請求項6或7所述的PD-L1 x CD137 結合分子，其包括CD137-結合輕鏈可變結構域，所述CD137-結合輕鏈可變結構域包含氨基酸序列： (A)hCD137 MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:112) ； (B)hCD137 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:114) ； (C)hCD137 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:115) ； (D)hCD137 MAB-1 VL4 (SEQ ID NO:116) ； (E)hCD137 MAB-1 VL5 (SEQ ID NO:117) ； (F)hCD137 MAB-1 VL6 (SEQ ID NO:118) ； (G)hCD137 MAB-1 VL7 (SEQ ID NO:120) ； (H)hCD137 MAB-1 VL8 (SEQ ID NO:121) ； (I)hCD137 MAB-1 VL9 (SEQ ID NO:122) ； (J)hCD137 MAB-1 VL10 (SEQ ID NO:123) ； (K)hCD137 MAB-1 VL11 (SEQ ID NO:125) ； (L)hCD137 MAB-1 VL12 (SEQ ID NO:127) ； (M)hCD137 MAB-1 VL13 (SEQ ID NO:128) ； (N)hCD137 MAB-1 VL14 (SEQ ID NO:129) ； (O)hCD137 MAB-1 VL15 (SEQ ID NO:131) ； (P)hCD137 MAB-2 VL1 (SEQ ID NO:141 )；或 (Q)hCD137 MAB-2 VL2 (SEQ ID NO:142 )。
- 如請求項5-8中任一項所述的PD-L1 x CD137 結合分子，其中所述分子是包含2條、3條、4條或5條多肽鏈的雙特異性四價攜帶Fc區的抗體，其中所述多肽鏈形成共價結合的複合物。
- 如請求項5-8中任一項所述的PD-L1 x CD137 結合分子，其中所述分子是雙特異性攜帶Fc區的三價分子且包含三條或四條多肽鏈，其中所述多肽鏈形成共價結合的複合物。
- 如請求項9-10中任一項所述的PD-L1 x CD137 結合分子，其中所述分子包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型的Fc區。
- 如請求項9-11中任一項所述的PD-L1 x CD137 結合分子，其中所述分子進一步包含鉸鏈結構域。
- 如請求項9-12中任一項所述的PD-L1 x CD137 結合分子，其中所述分子包含變體Fc區，所述變體Fc區包含： (a) 減小所述變體Fc區對FcγR的親和力的一個或多個氨基酸修飾；和/或 (b) 提高所述變體Fc區的血清半衰期的一個或多個氨基酸修飾。
- 如請求項13所述的PD-L1 x CD137 結合分子，其中減小所述變體Fc區對FcγR的親和力的所述修飾包含L234A；L235A；或L234A和L235A的取代，其中所述編號是如在Kabat中EU索引的編號。
- 如請求項13或14中任一項所述的PD-L1 x CD137 結合分子，其中提高所述變體Fc區的血清半衰期的所述修飾包含M252Y；M252Y和S254T；M252Y和T256E；M252Y、S254T和T256E；或K288D和H435K的取代，其中所述編號是如在Kabat中EU索引的編號。
- 如請求項5-15中任一項所述的PD-L1 x CD137 結合分子，其中所述分子包含： (a)SEQ ID NO:178 、SEQ ID NO:179 、SEQ ID NO:176 和SEQ ID NO:177 ； (b)SEQ ID NO:175 、SEQ ID NO:166 、SEQ ID NO:176 和SEQ ID NO:177 ； (c)SEQ ID NO:169 、SEQ ID NO:170 、SEQ ID NO:173 和SEQ ID NO:174 ； 或 (d)SEQ ID NO:169 、SEQ ID NO:170 、SEQ ID NO:171 和SEQ ID NO:172 。
- 一種藥物組合物，包含如請求項1-4中任一項所述的PD-L1- 結合分子或如請求項5-16中任一項所述的PD-L1 x CD137 結合分子， 和生理學上可接受的載體。
- 如請求項17所述的藥物組合物在治療與被抑制的免疫系統的存在相關或以被抑制的免疫系統的存在表徵的疾病或病況中的用途。
- 如請求項17所述的藥物組合物在治療與腫瘤抗原的表達相關或以腫瘤抗原的表達表徵的疾病或病況中的用途。
- 如請求項17所述的藥物組合物在治療癌症中的用途。
- 一種提高腫瘤靶向劑的活性的方法，包含與如請求項1-4中任一項所述的PD-L1- 結合分子或如請求項5-16中任一項所述的PD-L1 x CD137 結合分子組合施用腫瘤靶向劑。
- 如請求項21所述的方法，其中所述腫瘤靶向劑是特異性結合至腫瘤抗原的抗體或包含其腫瘤抗原結合部分的分子。
- 一種治療與被抑制的系統相關或以腫瘤抗原的表達表徵的疾病或病況的方法，包括向有需要的受試者施用如請求項1-4中任一項所述的PD-L1- 結合分子或如請求項5-16中任一項所述的PD-L1 x CD137 結合分子。
- 如請求項23所述的方法，其中與所述腫瘤抗原的表達相關或以腫瘤抗原的表達表徵的所述疾病或病況是癌症。
- 如請求項18-20或24中任一項所述的方法，其中所述癌症選自由以下組成的組：膀胱癌、乳腺癌、結直腸癌、胃癌、成膠質細胞瘤、血液癌、腎癌、肺癌、黑素瘤、神經母細胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、咽癌、***癌、直腸癌、腎細胞癌、橫紋肌肉瘤和頭頸癌。
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