KR20180038045A - B7-h3과 cd3에 결합할 수 있는 이중특이적 1가 디아바디, 및 그것의 사용 - Google Patents

B7-h3과 cd3에 결합할 수 있는 이중특이적 1가 디아바디, 및 그것의 사용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 디아바디, 및 특히 B7-H3과 CD3에 동시에 결합할 수 있는 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 이중특이적 1가 Fc 디아바디를 함유하는 제약학적 조성물에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 암 및 다른 질환 및 상태의 치료에서 이러한 디아바디의 사용을 위한 방법에 관한 것이다.

Description

B7-H3과 CD3에 결합할 수 있는 이중특이적 1가 디아바디, 및 그것의 사용
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 미국특허출원 일련번호 제62/206,051호(2015년 8월 17일자 제출; 계류중) 및 제62/280,318호(2016년 1월 19일자 제출)의 우선권을 주장하며, 이 출원들은 각각 그 전문이 여기 참고로 포함된다.
서열목록의 참조
본 출원은 37 C.F.R. 1.821 et seq.에 따라서 하나 이상의 서열목록을 포함하며, 이들은 컴퓨터-판독가능한 매체에 개시되고(파일명: 1301-0123PCT_ST25.txt, 2016년 8월 10일자 작성, 크기 70,481바이트), 이 파일은 그 전체가 여기 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은 B7-H3의 에피토프에 특이적인 하나의 결합 부위 및 CD3의 에피토프에 특이적인 하나의 결합 부위를 지닌 이중특이적 1가 디아바디에 관한 것이다(즉, "B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 디아바디"). 가장 바람직하게, 이러한 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 디아바디는 3개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어지며, B7-H3의 에피토프에 특이적인 하나의 결합 부위와 CD3의 에피토프에 특이적인 하나의 결합 부위를 지니고, 추가로 면역글로불린 Fc 도메인을 포함한다(즉, "B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디"). 본 발명의 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 B7-H3와 CD3에 동시에 결합할 수 있다. 본 발명은 이러한 이중특이적 1가 Fc 디아바디를 함유하는 제약학적 조성물에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 암 및 다른 질환 및 상태의 치료에서 이러한 디아바디의 사용을 위한 방법에 관한 것이다.
I. B7 수퍼패밀리 및 B7-H3
종양의 성장 및 전이는 숙주의 면역감시를 피하고 숙주의 방어기전을 극복하는 능력에 크게 의존한다. 대부분의 종양은 숙주 면역시스템에 의해 다양한 정도로 인식될 수 있는 항원을 발현하지만, 많은 경우 이펙터 T 세포의 비효과적인 활성화 때문에 불충분한 면역 반응이 도출된다(Khawli, L.A. et al. (2008) "Cytokine , Chemokine, and Co-Stimulatory FusionProteins for the Immunotherapy of Solid Tumors," Exper. Pharmacol. 181:291-328).
B7-H3은 면역글로불린 분자의 B7 수퍼패밀리의 멤버이다. B7 수퍼패밀리의 멤버는 면역글로불린-V-유사 도메인 및 면역글로불린-C-유사 도메인을 지닌다(예를 들어, 각각 IgV 및 IgC)(Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126). B7-수퍼패밀리 멤버의 IgV 및 IgC 도메인은 각각 단일 엑손에 의해 암호화되며, 리더 서열, 경막 및 세포질 도메인을 암호화하는 추가의 엑손이 존재한다. 세로질 도메인은 19 내지 62개 아미노산 잔기 길이 범위로 짧고, 다중 엑손에 의해 암호화될 수 있다(Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands," Genome Biol. 6:223.1-223.7). B7-수퍼패밀리의 멤버는 세포 표면에서 백-투-백, 비-공유 호모다이머를 형성할 것이 예상되며, 이러한 다이머는 B7-1(CD80) 및 B7-2(CD86)과 관련하여 밝혀졌다. B7-1(CD80) 및 B7-2(CD86)는 자극성 CD28 수용체와 억제성 CTLA-4(CD152) 수용체에 대한 이중 특이성을 갖는 것으로 나타난다(Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Super-family," Nature Rev. Immunol. 2:116-126).
B7-H3(CD276)은 주된 사람 형태가 2개의 세포외 탠덤 IgV-IgC 도메인(즉, IgV-IgC-IgV-IgC)을 함유한다는 점에서 독특하다(Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands," Genome Biol. 6:223.1-223.7). 처음에는 단지 2개의 Ig 도메인(IgV-IgC)을 포함한다고 생각되었지만(Chapoval, A. et al. (2001) "B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN -γ Production" Nature Immunol. 2:269-274; Sun, M. et al.(2002) "Characterization of Mouse and human B7-H3 Genes," J. Immunol. 168:6294-6297), 4개의 면역글로불린 세포외 도메인 변이체("4Ig-B7-H3")가 이 단백질의 더욱 흔한 사람 형태인 것으로 밝혀졌다(Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126). 그러나, 천연 뮤린 형태는 2Ig이며, 그것과 사람 4Ig 형태는 유사한 기능을 나타낸다(Hofmeyer, K. et al. (2008) "The Contrasting Role Of B7-H3," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278). 4Ig-B7-H3 분자는 암세포의 자연살해 세포-매개 세포용해를 억제한다(Castriconi, R. et al. (2004) "Identification Of 4Ig -B7-H3 As A Neuroblastoma -Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(34):12640-12645). 사람 B7-H3의 2Ig 형태는 활성화된 T 세포 상에서 잠정적 수용체에 결합함으로써 T 세포 활성화 및 IFN-γ 생성을 촉진한다고 밝혀졌다(Chapoval, A. et al. (2001) "B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN -γ Production," Nature Immunol. 2:269-274; Xu, H. et al. (2009) "MicroRNA miR -29 Modulates Expression of Immunoinhibitory Molecule B7-H3: Potential Implications for Immune Based Therapy of human Solid Tumors," Cancer Res. 69(15):5275-6281). B7-H4 및 B7-H3은 둘 다 종양 세포 상에서 발현되었을 때 면역 기능의 효능 있는 억제인자이다(Flies, D.B. et al. (2007) "The New B7s : Playing a Pivotal Role in TumorImmunity," J. Immunother. 30(3):251-260).
B7-H3의 작용 방식은 복합적이며, 이 단백질은 T 세포 공-자극 및 공-억제를 모두 매개한다(Hofmeyer, K. et al. (2008) "The Contrasting Role Of B7-H3," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278; Martin-Orozco, N. et al. (2007) "Inhibitory Costimulation and Anti-Tumor Immunity" Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298; Subudhi, S.K. et al. (2005) "The Balance Of Immune Responses: Costimulation Verse Coinhibition," J. Mol. Med. 83:193-202). B7-H3은 TREM-유사 전사체 2(TLT-2)에 결합하고 T 세포 활성화를 공-자극할 뿐만 아니라, 아직 확인되지 않은 수용체(들)에도 결합하여 T 세포의 공-억제를 매개한다. 또한, B7-H3은, 미지의 수용체(들)과의 상호작용을 통해서 자연살해 세포 및 골아세포성 세포를 억제하는 억제인자이다(Hofmeyer, K. et al. (2008) "The Contrasting Role Of B7-H3," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278). 억제는 T 세포 수용체(TCR)가 유전자 전사를 조절하는 주요 신호화 경로의 멤버들과의 상호작용을 통해서 작동할 수 있다(예를 들어, NFTA, NF-κB, 또는 AP-1 인자).
B7-H3은 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식을 공-자극한다. 또한, B7-H3은 IFN-γ 생성 및 CD8+ 세포용해 활성을 자극한다(Chapoval, A. et al. (2001) "B7-H3: A Co-stimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN -γ Production," Nature Immunol. 2:269-274; Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126). 그러나, 이 단백질은 또한 NFAT(활성화 T 세포를 위한 핵 인자), NF-κB(핵 인자 카파 B), 및 AP-1(활성화인자 단백질-1) 인자를 통해서 작용하여 T 세포 활성화를 억제할 수도 있다(Yi. K.H. et al. (2009) "Fine TuningThe Immune Response Through B7-H3 and B7-H4," Immunol. Rev. 229:145-151). B7-H3은 Th1, Th2, 또는 Th17을 생체내 억제한다고도 생각된다(Prasad, D.V. et al. (2004) "Murine B7-H3 Is A Negative Regulator Of T Cells," J. Immunol. 173:2500-2506; Fukushima, A. et al. (2007) "B7-H3 Regulates The Development Of Experimental Allergic Conjunctivitis In Mice," Immunol. Lett. 113:52-57; Yi. K.H. et al. (2009) "Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 and B7-H4," Immunol. Rev. 229:145-151). 몇몇 독립적인 연구는 사람 악성 종양 세포가 B7-H3 단백질의 발현에 현저한 증가를 나타낸다는 것과 이런 증가된 발현이 증가된 질환 중증도와 관련되었음을 밝혔는데(Zang, X. et al. (2007) "The B7 Family and Cancer Therapy: Costimulation and Coinhibition," Clin. Cancer Res. 13:5271-5279), 이것은 B7-H3이 종양에 의해 면역 회피 경로로서 이용된다는 것을 시사한다(Hofmeyer, K. et al. (2008) "The Contrasting Role Of B7-H3," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278).
T 세포 수용체(예를 들어, CD28)에 결합하는 B7 분자의 능력을 차단하는 분자는 면역시스템을 억제하며, 자가면역 질환을 위한 치료제로 제안되었다(Linsley, P.S. et al. (2009) "The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Co-Stimulation," Immunolog. Rev. 229:307-321). 항-4Ig-B7-H3 항체로 치료된 4Ig-B7-H3을 발현하는 신경아세포종 세포는 NK 세포에 더욱 민감했다. 그러나, 4Ig-B7-H3에 대해 발생된 모든 보고된 항체는 B7-H3의 2개의 Ig-유사 형태에도 결합했기 때문에 상기 활성이 단지 4Ig-B7-H3 형태에 대한 항체 때문인지의 여부는 불분명하다(Steinberger, P. et al. (2004) "Molecular Characterization of Human 4Ig -B7-H3, a Member of the B7 Family with Four Ig-Like Domains," J. Immunol. 172(4): 2352-2359 및 Castriconi et al.(2004) "Identification Of 4Ig -B7-H3 As A Neuro -blastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(34):12640-12645).
B7-H3은 휴지중인 B 또는 T 세포, 단구, 또는 수지상세포에서는 발현되지 않지만, IFN-γ에 의해 수지상세포에서, GM-CSF에 의해 단구에서 유도된다(Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126). B7-H3에 결합하는 수용체(들)는 충분히 특성화되지 않았다. 초기 연구는 하나의 이러한 수용체는 활성화 후 T 세포 상에서 빠르게 일시적으로 상향조절될 필요가 있음을 시사했다(Loke, P. et al. (2004) "Emerging Mechanisms Of Immune Regulation: The Extended B7 Family and Regulatory T Cells." Arthritis Res. Ther. 6:208-214). 최근, 골수양 세포에서 발현된 TREM-유사 전사체 2(TLT-2, 또는 TREML2) 수용체(King, R.G. et al. (2006) "Trem -Like Transcript 2 Is Expressed On Cells Of The Myeloid/ Granuloid and B Lymphoid Lineage and Is Up-Regulated In Response To Inflammation," J. Immunol. 176:6012-6021; Klesney-Tait, J. et al. (2006) "The TREM Receptor Family and Signal Integration," Nat. Immunol. 7:1266-1273; Yi. K.H. et al. (2009) "Fine TuningThe Immune Response Through B7-H3 and B7-H4," Immunol. Rev. 229:145-151)가 B7-H3에 결합할 수 있고, 이로써 특히 CD8+ T 세포의 활성화를 공-자극하는 것으로 밝혀졌다(Zang, X. et al.(2003) "B7x: A Widely Expressed B7 Family Member That Inhibits T Cell Activation," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 100:10388-10392; Hashiguchi, M. et al. (2008) "Triggering Receptor Expressed On Myeloid Cell-Like Transcript 2 ( TLT -2) Is A Counter-Receptor For B7-H3 and Enhances T Cell Responses," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10495-10500; Hofmeyer, K. et al.(2008) "The Contrasting Role Of B7-H3," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278).
신경아세포종 세포 상에서의 발현에 더하여, 사람 B7-H3은 또한 다양한 다른 암세포(예를 들어, 위암, 난소암 및 비-소세포 폐암)에서도 발현된다고 알려져 있다. B7-H3 단백질 발현은 종양 셀라인에서 면역조직학적으로 검출되었다(Chapoval, A. et al. (2001) "B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production," Nature Immunol. 2:269-274; Saatian, B. et al. (2004) "Expression Of Genes For B7-H3 and Other T Cell Ligands By Nasal Epithelial Cells During Differentiation and Activation" Amer. J. Physiol. LungCell. Mol. Physiol. 287:L217-L225; Castriconi et al. (2004) "Identification Of 4Ig -B7-H3 As A Neuroblastoma -Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(34):12640-12645); Sun,M. et al. (2002) "Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes," J. Immunol. 168:6294-6297). B7-H3의 mRNA 발현은 심장, 신장, 고환, 폐, 간, 췌장, 전립선, 결장, 및 골아세포 세포에서 발견되었다(Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands," Genome Biol. 6:223.1-223.7). 단백질 수준에서는 B7-H3이 사람의 간, 폐, 방광, 고환, 전립선, 유방, 태반, 및 림프양 장기에서 발견된다(Hofmeyer, K. et al. (2008) "The Contrasting Role Of B7-H3," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278).
II. CD3
CD3는 네 개의 별개의 사슬로 구성된 T 세포 공수용체이다(Wucherpfennig, K.W. et al. (2010) "Structural Biology Of The T-Cell Receptor: Insights Into Receptor Assembly, Ligand Recognition, And Initiation Of Signaling," Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2(4):a005140; pages 1-14; Chetty, R. et al. (1994) "CD3: Structure, Function, And Role Of Immunostaining In Clinical Practice," J. Pathol. 173(4):303-307; Guy, C.S. et al.(2009) "Organization Of Proximal Signal Initiation At The TCR:CD3 Complex, " Immunol. Rev. 232(1):7-21).
포유동물에서, 복합체는 CD3γ 사슬, CD3δ 사슬, 및 두 개의 CD3ε 사슬을 함유한다. 이 사슬들은 T 림프구에서 활성화 신호를 발생시키기 위해 T 세포 수용체 (TCR)로 공지되어 있는 분자와 회합한다(Smith-Garvin, J.E. et al. (2009) "T Cell Activation," Annu. Rev. Immunol. 27:591-619). CD3의 부재 하에, TCR은 적절하게 조립되지 않고 분해된다(Thomas, S. et al. (2010) "Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer," Immunology 129(2): 170-177). CD3는 모든 성숙한 T 세포의 막에 결합된 채로 발견되고, 다른 세포 유형에서는 거의 발견되지 않는다(Janeway, C.A. et al. (2005) In: Immunobiology: The Immune System In Health And Disease," 6th ed. Garland Science Publishing, NY, pp. 214- 216; Sun, Z. J. et al. (2001) "Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3ε:γ Heterodimer," Cell 105(7):913-923; Kuhns, M.S. et al. (2006) "Deconstructing The Form And Function Of The TCR /CD3 Complex," Immunity. 2006 Feb; 24(2):133-139 참조).
T 세포에서 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 불변 CD3ε 신호전달 구성요소는 T 세포 및 종양 세포 사이의 면역학적 시냅스의 형성을 강제하기 위한 표적으로 사용되었다. CD3 및 종양 항원의 동시-개입은 T 세포를 활성화시켜서, 종양 항원을 발현하는 종양 세포의 용해를 유발한다(Baeuerle et al. (2011) "Bispecific T Cell Engager For Cancer Therapy," In:Bispecific Antibodies, Kontermann, R.E. (Ed.) Springer-Verlag; 2011:273-287). 이 방법은 이중-특이적 항체가 종양 세포에 대한 높은 특이성으로 T 세포 구획과 광범위하게 상호작용하게 하고 세포-표면 종양 항원의 광범위한 어레이에 널리 적용 가능하다.
III. 항체 및 다른 결합 분자
항체는 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치한, 적어도 하나의 에피토프-결합 부위를 통해 분자의 표적 영역("에피토프"), 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 폴리펩타이드 등("항원")에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어는 온전한 다클론성 또는 단클론성 항체뿐만 아니라, 그것의 돌연변이, 자연 발생한 변이체, 원하는 특이성의 에피토프-결합 부위를 가진 항체 일부를 포함하는 융합 단백질, 사람화된 항체, 및 키메라 항체, 및 원하는 특이성의 에피토프-결합 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 배열을 포함한다.
온전하고, 변형되지 않은 항체(예를 들어, IgG 항체)의, 항원의 에피토프에 결합하는 능력은 면역글로불린 경 및 중 폴리펩타이드 사슬 상의 가변 도메인(즉, 각각 VL 및 VH 도메인, 종합하여 "가변 영역")의 존재에 따른다. 각 VH 및 VL은 아미노-말단에서부터 카복시-말단으로 3개의 상보성 결정 영역(CDR) 도메인과 4개의 FR 도메인으로 이루어지며, 이들은 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순서로 되어 있다. CDR의 아미노산 서열은 항체가 특정 에피토프에 결합할 수 있을 것인지 여부를 결정한다. 항체 경쇄와 항체 중쇄의 상호작용 및, 특히, 각각 별개의 폴리펩타이드 상에 존재하는, 그들의 VL 및 VH 도메인의 상호작용은 항체의 에피토프 결합 부위 중 하나를 형성한다. 반대로, scFv 구조는 단일 폴리펩타이드 사슬에 함유된 항체의 VL 및 VH 도메인을 포함하며 도메인은 기능적 에피토프 결합 부위로 두 도메인의 자가-조립을 허용하기에 충분한 길이의 플렉시블(flexible) 링커로 분리된다. VL 및 VH 도메인의 자가-조립이 링커의 불충분한 길이(약 12개 미만의 아미노산 잔기의 링커) 때문에 불가능해지는 경우, 두 scFv 분자는 서로 상호작용하여 하나의 분자의 VL이 나머지 분자의 VH와 회합한 2가 "디아바디" 분자를 형성할 수 있다(Marvin et al.(2005) "Recombinant Approaches To IgG -Like Bispecific Anti-bodies," Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658에서 재검토됨).
천연 항체는 단 하나의 에피토프 종에 결합할 수 있지만(즉, 단일-특이적), 그것들은 상기 종의 다수의 카피에 결합할 수 있다(즉, 2가 또는 다원자가를 나타냄). 다양한 재조합 이중-특이적 항체 포맷이 개발되었고(예를 들어, PCT 공개 번호 제WO2008/003116호, 제WO2009/132876호, 제WO2008/003103호, 제WO2007/146968호, 제WO2009/018386호, 제WO2012/009544호, 제WO2013/070565호 참조), 이것들 중 대부분은 링커 펩타이드를 사용하여 추가의 결합 도메인(예를 들어, scFv, VL, VH 등)을 항체 코어(IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM)에, 또는 그 내부에서 추가의 결합 단백질(예를 들어, scFv)에 융합시키거나, 또는 다수의 항체 결합 부분을 서로 융합시킨다(예를 들어, 두 Fab 단편 또는 scFv). 대안적인 포맷은 링커 펩타이드를 사용하여 결합 단백질(예를 들어, scFv, VL, VH 등)을 이량화 도메인, 예컨대 CH2-CH3 도메인 또는 대안적인 폴리펩타이드에 융합시킨다(제WO2005/070966호, 제WO 2006/107786A호, 제WO2006/107617A호, 제WO2007/046893호). 전형적으로, 이러한 방법은 타협과 절충을 수반한다. 예를 들어, PCT 공개 번호 제WO2013/174873호, 제WO2011/133886호 및 제WO2010/136172호는 링커의 사용이 치료 설정에서 문제를 유발할 수도 있고, CL 및 CH1 도메인이 그것들 각각의 자연적 위치로부터 스위치되고 VL 및 VH 도메인이 다양화되어(제WO2008/027236호; 제WO2010/108127호) 하나 이상의 항원에 결합하게 하는 삼중-특이적 항체를 교시한다는 것을 개시한다. 따라서, 이들 문서에서 개시된 분자는 추가적인 항원 종에 결합하는 능력에 대한 결합 특이성을 가진다. PCT 공개 번호 제WO2013/163427호 및 제WO2013/119903호는 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질 부가물을 함유하도록 CH2 도메인을 변형시키는 것을 개시한다. 문서는 CH2 도메인이 효과기 기능을 매개하는데 최소한의 역할만을 할 가능성이 있음을 언급한다. PCT 공개 번호 제WO2010/028797호, 제WO2010/028796호 및 제WO2010/028795호는 3가 결합 분자를 형성하기 위해 Fc 영역이 추가적인 VL 및 VH 도메인으로 대체된 재조합 항체를 개시한다. PCT 공개 번호 제WO2003/025018호 및 제WO2003/012069호는 개개의 사슬이 scFv 도메인을 함유하는 재조합 디아바디를 개시한다. PCT 공개 번호 제WO2013/006544호는 단일 폴리펩타이드 사슬로 합성된 다음 헤테로다이머 구조를 수득하기 위해 단백질 가수분해되는 다원자가 Fab 분자를 개시한다. 따라서, 이들 문서에서 개시된 분자들은 추가의 항원 종에 결합하는 능력에 대하여 효과기 기능을 매개하는 능력 모두 또는 그 일부를 가진다. PCT 공개 번호 제WO2014/022540호, 제WO2013/003652호, 제WO2012/162583호, 제WO2012/156430호, 제WO2011/086091호, 제WO2008/024188호, 제WO2007/024715호, 제WO2007/075270호, 제WO1998/002463호, 제WO1992/022583호 및 제WO1991/003493호는 추가적인 결합 도메인 또는 작용기를 항체 또는 항체 일부에 추가하는 것(예를 들어, 디아바디를 항체의 경쇄에 추가하는 것, 또는 추가적인 VL 및 VH 도메인을 항체의 경쇄 및 중쇄에 추가하는 것, 또는 이종 기원 융합 단백질 또는 연쇄 다중 Fab 도메인을 서로에게 추가하는 것)을 개시한다. 따라서, 이들 문서에서 개시된 분자는 추가적인 항원 종에 결합하는 능력에 대하여 고유한 항체 구조를 가진다.
당업계는 추가적으로 둘 이상의 다른 에피토프 종에 결합할 수 있다는 점에서(즉, 2가 또는 다원자가 이외에 이중-특이성 또는 다중특이성을 나타냄) 천연 항체와는 다른 디아바디를 생산하는 능력을 언급한다(예를 들어, Holliger et al. (1993) "'Diabodies ': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments," Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.) 90:6444-6448; US 2004/0058400 (Hollinger et al.); US 2004/0220388 (Mertens et al.); Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG -Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672; WO 02/02781(Mertens et al.); Olafsen, T. et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti- CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radio-labeling For Tumor Targeting Applications," Protein Eng Des Sel. 17(1):21-27; Wu, A. et al.(2001) "Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv -Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange," Protein Engineering 14(2):1025-1033; Asano et al.(2004) "A Diabody For Cancer Immuno -therapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain" Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) "Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy," Cancer Res. 69(12):4941-4944 참조).
특히, 안정한 공유 결합된 헤테로다이머 비-1특이적 디아바디가 설명되었다(예를 들어, Chichili, G.R. et al. (2015) "A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity and Safety In Nonhuman Primates," Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82; Johnson, S. et al. (2010) "Effector Cell Recruitment With Novel Fv -Based Dual- AffinityRe -Targeting Protein Leads To Potent TumorCytolysis and InVivo B-Cell Depletion" J. Molec. Biol. 399(3):436-449; Veri, M.C. et al. (2010) "Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb ( CD32B ) Inhibitory FunctionWith A Novel Bispecific Antibody Scaffold," Arthritis Rheum. 62(7):1933-43; Moore, P.A. et al. (2011) "Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T cell Killing Of B-Cell Lymphoma," Blood 117(17):4542-4551; 미국특허 8,044,180; 8,133,982; 8,187,593; 8,193,318; 8,530,627; 8,669,349; 8,778,339; 8,784,808; 8,795,667; 8,802,091; 8,802,093; 8,946,387; 8,968,730; 및 8,993,730; 미국 특허 공개 2009/0060910; 2010/0174053; 2011/0081347; 2011/0097323; 2011/0117089; 2012/0009186; 2012/ 0034221;2012/0141476; 2012/0294796; 2013/0149236; 2013/0295121; 2014/0017237; 및 2014/0099318; 유럽 특허 EP 1868650; EP 2158221; EP 2247304; EP 2252631; EP 2282770; EP 2328934; EP 2376109; EP 2542256; EP 2601216; EP 2714079; EP 2714733; EP 2786762; EP 2839842; EP 2840091; 및 PCT 공개 WO 2006/113665; WO 2008/157379; WO 2010/027797; WO 2010/033279; WO 2010/080538; WO 2011/109400; WO 2012/018687; WO 2012/162067; WO 2012/162068; WO 2014/159940; WO 2015/ 021089; WO 2015/026892; 및 WO 2015/026894 참조).
이러한 성공에도 불구하고, 치료적 사용에 최적화된 안정한 기능적 헤테로다이머 비-1특이적 디아바디는 주의 깊은 고려와 폴리펩타이드 사슬에 이용된 도메인의 배치에 의해 더 개선될 수 있다. 따라서, 본 발명은 공유 결합을 통해서 B7-H3과 CD3에 동시에 결합할 수 있는 안정하며 치료적으로 유용한 헤테로다이머 디아바디 및 헤테로다이머 Fc 디아바디를 형성하도록 특별히 설계된 특이적 폴리펩타이드의 제공에 관한 것이다.
본 발명은 B7-H3의 에피토프에 특이적인 하나의 결합 부위 및 CD3의 에피토프에 특이적인 하나의 결합 부위를 지닌 이중특이적 1가 디아바디에 관한 것이다(즉, "B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 디아바디"). 가장 바람직하게, 이러한 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 디아바디는 3개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어지며, B7-H3의 에피토프에 특이적인 하나의 결합 부위와 CD3의 에피토프에 특이적인 하나의 결합 부위를 지니고, 추가로 면역글로불린 Fc 도메인을 포함한다(즉, "B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디"). 본 발명의 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 B7-H3와 CD3에 동시에 결합할 수 있다. 본 발명은 이러한 이중특이적 1가 Fc 디아바디를 함유하는 제약학적 조성물에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 암 및 다른 질환 및 상태의 치료에서 이러한 디아바디의 사용을 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명은 특히 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디에 관한 것이다. 본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 B7-H3의 에피토프에 특이적인 하나의 결합 부위와 CD3의 에피토프에 특이적인 하나의 결합 부위를 형성하기 위해 헤테로다이머 방식으로 서로 회합한 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. 따라서, 본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 그것이 B7-H3의 에피토프의 단지 하나의 카피와 CD3의 에피토프의 단지 하나의 카피에만 결합할 수 있다는 점에서는 1가이지만, 단일 디아바디가 B7-H3의 에피토프와 CD3의 에피토프에 동시에 결합할 수 있다는 점에서는 이중특이적이다.
본 발명의 바람직한 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 3개의 폴리펩타이드 사슬("제1", "제2" 및 "제3" 폴리펩타이드 사슬)을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬이 서로 공유 결합되고, 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬이 서로 공유 결합된다.
상세하게, 본 발명은 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디를 제공하며, 상기 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 B7-H3의 에피토프 및 CD3의 에피토프에 특이적 결합할 수 있고, IgG Fc 도메인을 지니며, 상기 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 제1 폴리펩타이드 사슬, 제2 폴리펩타이드 사슬 및 제3 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬은 서로 공유 결합되며, 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬은 서로 공유 결합되고,
I. 제1 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로:
A. 도메인 IA: 도메인 IA는
(1) B7-H3(VLB7 -H3) 또는 CD3(VLCD3)에 결합할 수 있는 VL 도메인을 포함하는 하위-도메인(IA1); 및
(2) B7-H3(VHB7 -H3) 또는 CD3(VHCD3)에 결합할 수 있는 VH 도메인을 포함하는 하위-도메인(IA2)을 포함하며,
여기서 하위-도메인 IA1 및 IA2는 12개 이하의 아미노산 잔기의 폴리펩타이드 링커에 의해 서로 분리되고 대등하게 선택됨으로써,
(a) 하위-도메인 IA1은 B7-H3(VLB7 -H3)에 결합할 수 있는 VL 도메인을 포함하고, 하위-도메인 IA2는 CD3(VHCD3)에 결합할 수 있는 VH 도메인을 포함하도록 선택되거나; 또는
(b) 하위-도메인 IA1은 CD3(VHCD3)에 결합할 수 있는 VL 도메인을 포함하고, 하위-도메인 IA2는 B7-H3(VHB7 -H3)에 결합할 수 있는 VH 도메인을 포함하도록 선택된다; 및
B. 헤테로다이머-촉진 도메인에 연결된 폴리펩타이드 링커를 포함하는, 선택적으로 존재하는 도메인 IB;
C. 항체의 CH2-CH3 도메인에 연결된 폴리펩타이드 링커를 포함하는, 도메인 IC를 포함하고,
II. 제2 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로:
A. 도메인 IIA: 도메인 IIA는
(1) B7-H3(VLB7 -H3) 또는 CD3(VLCD3)에 결합할 수 있는 VL 도메인을 포함하는 하위-도메인(IIA1); 및
(2) B7-H3(VHB7 -H3) 또는 CD3(VHCD3)에 결합할 수 있는 VH 도메인을 포함하는 하위-도메인(IIA2)을 포함하며,
여기서 하위-도메인 IIA1 및 IIA2는 12개 이하의 아미노산 잔기의 폴리펩타이드 링커에 의해 서로 분리되고 대등하게 선택됨으로써,
(a) 하위-도메인 IA1이 B7-H3(VLB7 -H3)에 결합할 수 있는 VL 도메인을 포함할 때, 하위-도메인 IIA1은 CD3(VHCD3)에 결합할 수 있는 VL 도메인을 포함하도록 선택되고, 하위-도메인 IIA2는 B7-H3(VHB7 -H3)에 결합할 수 있는 VH 도메인을 포함하도록 선택되며;
(b) 하위-도메인 IA1이 CD3(VLCD3)에 결합할 수 있는 VL 도메인을 포함할 때, 하위-도메인 IIA1은 B7-H3(VLB7 -H3)에 결합할 수 있는 VL 도메인을 포함하도록 선택되고, 하위-도메인 IIA2는 CD3(VHCD3)에 결합할 수 있는 VH 도메인을 포함하도록 선택된다;
B. 헤테로다이머-촉진 도메인에 연결된 폴리펩타이드 링커를 포함하는, 선택적으로 존재하는 도메인 IIB를 포함하고,
III. 제3 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로 항체의 CH2-CH3 도메인에 연결된 폴리펩타이드 링커를 포함하는 도메인 IIIC를 포함하며;
여기서:
(A) (1) 선택적으로 존재하는 도메인 IB 및 선택적으로 존재하는 도메인 IIB 중 적어도 하나가 존재하고, 존재하는 도메인 IB 또는 IIB는 양전하 또는 음전하를 갖거나; 또는
(2) 선택적으로 존재하는 도메인 IB와 선택적으로 존재하는 도메인 IIB가 둘 다 존재하며, 여기서:
(i) 도메인 1B 및 도메인 IIB 중 하나는 양전하를 가진 헤테로다이머-촉진 도메인을 가지고, 도메인 1B 및 도메인 IIB 중 나머지 하나는 음전하를 가진 헤테로다이머-촉진 도메인을 갖거나; 또는
(ii) 도메인 1B 및 도메인 IIB 중 하나는 아미노산 서열 GVEPKSC(SEQ ID NO: 6) 또는 VEPKSC(SEQ ID NO:7)을 포함하는 헤테로다이머-촉진 도메인을 가지고, 도메인 1B 및 도메인 IIB 중 나머지 하나는 아미노산 서열 GFNRGEC(SEQ ID NO:8) 또는 FNRGEC(SEQ ID NO:9)를 포함하는 헤테로다이머-촉진 도메인을 가지며;
(B) VLB7 -H3과 VHB7 -H3은 상호작용하여 B7-H3의 에피토프에 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인을 형성하고, VLCD3과 VHCD3은 CD3의 에피토프에 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인을 형성하고;
(C) 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬의 CH2-CH3 도메인은 Fc 수용체에 결합할 수 있는 Fc 도메인을 형성한다.
더 나아가, 본 발명은 사람화된 영장류 B7-H3 및 CD3의 둘 다와 교차-반응할 수 있는 이러한 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디의 구체예에 관한 것이다.
본 발명은 특히
(A) 제1 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:53의 아미노산 서열을 가지고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:55의 아미노산 서열을 가지며, 제3 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 갖거나; 또는
(B) 제1 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:59의 아미노산 서열을 가지고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:60의 아미노산 서열을 가지며, 제3 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 갖거나; 또는
(C) 제1 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:61의 아미노산 서열을 가지고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:62의 아미노산 서열을 가지며, 제3 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 갖거나;
(D) 제1 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:63의 아미노산 서열을 가지고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:64의 아미노산 서열을 가지며, 제3 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 갖는, 이러한 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디의 구체예에 관한 것이다.
본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 바람직하게 A498(신장암), JIMT-1/Luc(유방암), A375(흑색종); 22Rv1(전립선암), Detroit562(인두암), DU145(전립선암); BxPC3(췌장암), SKMES-1(폐암), 및 U87(교모세포종)로 구성되는 군으로부터 선택된 표적 사람 종양 셀라인을 이용한 분석에서 사람 T 세포를 사용하고 이펙터 세포로서 정제된 사람 일차 T 세포를 사용하여 1:1, 5:1, 또는 10:1의 이펙터 세포 대 T 세포의 비에서 표적 종양 세포의 전가(redirected) 살해를 매개할 수 있다.
이러한 분석에서, 표적 종양 세포 살해는, 세포 사멸시 세포로부터 방출된 LDH의 효소 활성이 정량적으로 측정되는 락테이트 탈수소효소(LDH) 방출 분석을 사용하여, 또는 루시페라제 상대적 광 단위(RLU)가 녹색형광단백질(GFP)과 루시페라제 수용체 유전자를 둘 다 발현하도록 조작된 표적 세포의 상대적 생육성을 나타내는 판독값인 루시페라제 분석에 의해 측정된다. 이러한 전가 살해에서 관찰된 EC50은 약 1.5 ㎍/mL 이하, 약 1.0 ㎍/mL 이하, 약 500 ng/mL 이하, 약 300 ng/mL 이하, 약 200 ng/mL 이하, 약 100 ng/mL 이하, 약 50 ng/mL 이하이다.
본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 바람직하게 5:1의 비로 22Rv1(사람 전립선암) 또는 A498(사람 신장암) 종양 세포 및 활성화된 사람 T 세포와 함께 NOD/SCID 마우스에 이러한 분자가 도입된 공-혼합 이종이식편에서 사람 종양 성장의 억제를 매개할 수 있다. 추가로, 또는 대안으로서, 본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 암컷 NSG B2m-/- 마우스의 이종이식편 모델에서 사람 종양 성장의 억제를 매개하고 및/또는 항-종양 활성을 나타낼 수 있으며, 여기서 마우스는
(A) 제-1일에 복강내(IP) 주사에 의해 사람 PBMC(1 x 107)가 이식되고, 제0일에 Detroit(사람 인두암 종양 세포(5 x 106))가 피내(ID) 이식되며, 제20, 22, 23, 26, 28, 30, 33, 35, 및 37일에 디아바디가 투여되거나; 또는
(B) 제0일에 A498(사람 신장암 종양 세포(5 x 106))가 피내(ID) 이식되고, 제13일에 복강내(IP) 주사에 의해 사람 PBMC(1 x 107)가 이식되며, 제33, 35, 36, 39, 41, 43, 46, 48, 및 50일에 디아바디가 투여된다.
바람직하게, 본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 약 1.0 mg/kg 초과하는 농도, 약 1 mg/kg의 농도, 약 0.5 mg/kg의 농도, 약 0.25 mg/kg의 농도, 약 0.1 mg/kg의 농도, 약 0.05 mg/kg의 농도, 약 0.02 mg/kg의 농도, 약 0.01 mg/kg의 농도, 또는 약 0.005 mg/kg의 농도, 또는 0.005 mg/kg 미만의 농도로 제공되었을 때 이러한 이종이식편 모델에서 종양 성장을 억제할 수 있다.
추가로, 본 발명은 제약으로서 사용하기 위한 상기 설명된 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디 중 어느 것을 제공한다.
추가로, 본 발명은 B7-H3의 발현과 관련되거나 그것을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료에서, 또는 B7-H3의 발현과 관련되거나 그것을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료하는 방법에서 사용하기 위한 상기 설명된 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디 중 어느 것을 제공하며, 여기서 B7-H3의 발현과 관련되거나 그것을 특징으로 하는 질환 또는 상태는 암이고, 더 구체적으로 암은 급성 골수성 백혈병, 부신 종양, AIDS- 관련 암, 치조 연부 육종, 성상 세포 종양, 방광암, 골암, 뇌척수암, 전이성 뇌종양, 유방암, 경동맥 소체 종양, 자궁경부암, 연골육종, 척삭종, 혐색소성 신장세포 암종, 투명세포 암종, 결장암, 결장직장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 결합조직성 소원형세포종양, 상의세포종, 유잉 종양, 골외 점액성 연골육종, 골성 불완전 섬유원증, 뼈의 섬유 이형성증, 담낭 또는 담즙관 암, 위암, 임신성 영양막 질환, 생식세포 종양, 두경부암, 간세포 암종, 교모세포종, 섬세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방 육종/악성 지방종성 종양, 간암, 림프종, 폐암, 수모세포종, 흑색종, 수막종, 악성 중피종, 다발성 내분비 신생물, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 신경아세포종, 신경내분비 종양, 비-소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 인두암, 유두 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아암, 말초신경집 종양, 갈색세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후방 포도막 흑색종, 희귀 혈액학적 장애, 신장세포 암종, 신장의 전이성 암, 간상소체 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연조직 육종, 편평세포암, 위암, 활액 육종, 고환암, 흉선 암종, 흉선종, 갑상선의 전이성 암, 및 자궁암으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
도 1은 Fc 영역을 포함하지 않는 2개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 공유 회합된 이중특이적 1가 디아바디의 구조를 예시한다. 폴리펩타이드 사슬들은 시스테인("C") 잔기들 사이에 형성된 이황화물 결합을 통해서 서로 공유 회합된다.
도 2a 및 2b는 본 발명의 3개 사슬 이중특이적 1가 Fc 디아바디의 제1, 제2 및 제3 폴리펩타이드 사슬의 두 버전의 구조를 예시한다(버전 1, 도 2a; 버전 2, 도 2b). 폴리펩타이드 사슬은 시스테인("C) 잔기들 사이에 형성된 이황화물 결합을 통해서 서로 공유 회합된다.
도 3a-3j는 A498(신장암)(도 3a), JIMT-1/Luc(유방암)(도 3b), A375(흑색종)(도 3c), 22Rv1(전립선암)(도 1d), Detroit562(인두암)(도 1e), DU145(전립선암)(도 3f), BxPC-3(췌장암)(도 3g), SKMES-1(폐암)(도 3h), U87(교모세포종)(도 3i) 및 Raji(B-림프종)(도 3j) 셀라인의 FACS 히스토그램을 도시한다. 점선은 동형 대조군 PE-표지된 항체로 염색된 세포를 나타내고, 실선은 항-B7-H3-PE 항체로 염색된 세포를 나타낸다.
도 4a-4e는 B7-H3-발현 표적 암 셀라인(도 4a-4d) 또는 사람 일차 T 세포(도 4e)에 대한 항-EK-코일 항체 형광의 FACS 히스토그램을 도시한다. DART는 10 ㎍/mL의 농도로 B7-H3-발현 암 셀라인(A498(도 4a), JIMT-1/Luc(도 4b), Detroit562(도 4c), 또는 22Rv1(도 4d)) 또는 사람 일차 T 세포(도 4e)에 첨가되었고 30분 동안 인큐베이션되었다. APC-스트렙타비딘과 혼합된 바이오틴-콘쥬게이트 항-EK-코일 항체와 함께 더 인큐베이션한 후 DART-A 세포 표면 결합에 대해 FACS에 의해 세포가 분석되었다. 실선은 세포 상에서 DART-A 결합 프로파일을 나타낸다. 바이오틴-콘쥬게이트 항-EK-코일 항체로부터 세포에 대한 비-특이적 염색은 점선으로 표시된다.
도 5a-5l은 B7-H3-발현 셀라인(A498(도 5a), JIMT-1/Luc(도 5b-5c), A375(도 5d), U87(도 5e), DU145(도 5f), BxPC-3(도 5g), SKMES-1(도 5h), Detroit562(도 5i) 및 22Rv1(도 5j)) 및 B7-H3-음성 셀라인(CHO(도 5k) 및 Raji(도 5l))에 대한 DART-A-매개 세포독성의 용량-반응 곡선을 도시한다. DART-A 또는 대조군 DART는 상이한 종양 셀라인 및 일차 사람 T 세포와 함께 약 24시간 동안 5:1의 이펙터 세포:표적 세포(E:T) 비에서 시험관내 인큐베이션되었다. 모든 셀라인에 대해 LDH 방출 분석을 사용하여 세포독성 퍼센트가 평가되었다(도 5a-5b 및 5d-5l). 또한, 세포독성은 JIMT-1/Luc 셀라인에 대해 LUM 분석을 사용하여 측정되었다(도 5c). 다수의 도너로부터의 T 세포를 사용한 다수의 실험으로부터 대표적 데이터가 도시된다. DART-A: ●; 대조군 DART: ■
도 6a-6f는 10:1(도 6a 및 6b), 5:1(도 6c 및 6d) 및 1:1(도 6e 및 6f)의 E:T 비에서 A498 세포(도 6a, 6c 및 6e) 및 A375 세포(도 6b, 6d 및 6f)의 DART-A-매개 전가 살해를 도시한다. 세포독성은 LDH 분석에 의해 결정되었다. DART-A: ●; 대조군 DART: ■
도 7a-7e는 이펙터 세포로서 정제된 T 세포 및 A498 표적 세포와 함께 24시간 동안 10:1의 E:T 세포비에서 인큐베이션 후 DART-A-매개 전가 표적 세포 살해의 용량-반응 곡선(도 7a) 및 CD4+(도 7b 및 7d) 및 CD8+(도 7c 및 7e) T 세포 상에서 T 세포 활성화 마커 CD25(도 7b 및 7c) 및 CD69(도 7d 및 7e)의 유도를 도시한다. DART-A: ●; 대조군 DART: ■. T 세포 + A498 세포: ▼; T 세포 단독 ▲
도 8a-8b는 B7-H3-양성 표적 세포의 존재하에 DART-A-매개 T 세포 증식을 도시한다. 72시간(도 8a) 또는 96시간(도 8b) 동안 10 ㎍/mL에서 DART-A(두꺼운 선) 또는 대조군 DART(얇은 채워진 선)의 존재하에 10:1의 E:T 비에서 CFSE-표지된 사람 일차 1 세포와 A498 표적 세포의 공-배양 후 FACS 분석에 의해 사람 일차 T 세포의 증식이 평가되었다.
도 9a-9d는 이펙터 세포로서 정제된 사람 일차 T 세포 및 B7-H3-발현 CHO 표적 세포와 함께 24시간 동안 5:1의 E:T 세포비에서 인큐베이션 후 DART-A가 사람(도 9a) 및 사이노몰거스 원숭이(도 9b) B7-H3-발현 CHO 세포에 효과적으로 결합하며, 사람(도 9c) 및 사이노몰거스 원숭이(도 9d) B7-H3-발현 CHO 세포의 전가 살해를 매개한다는 것을 도시한다. 세포독성은 LDH 분석을 사용하여 측정되었다. DART-A: ●; 대조군 DART: ■
도 10a-10b는 DART-A가 사이노몰거스 원숭이 및 사람 일차 T 세포에 결합할 수 있다는 것을 도시한다. DART-A는 10 ㎍/mL로 사이노몰거스 원숭이(도 10a) 또는 사람(도 10b) PBMC에 첨가되었고, 세포는 4℃에서 30분 동안 인큐베이션되고, 이후 APC-스트렙타비딘과 혼합된 바이오틴-콘쥬게이트 항-EK-코일 항체와 함께 2차 인큐베이션되었다. 게이트 작동 총 조합된 CD4+ 및 CD8+ 세포 상에서 DART-A T 세포 표면 결합(두꺼운 선)에 대해 FACS에 의해 세포가 분석되었다. 바이오틴-콘쥬게이트 항-EK-코일 2차 항체로부터 세포에 대한 비-특이적 염색은 얇은 선/음영을 가진 얇은 선으로 표시된다.
도 11a-11c는 30:1의 E:T 비에서 사이노몰거스 원숭이 PBMC를 사용하여 B7-H3-양성 표적 셀라인 JIMT-1/Luc(도 11a 및 11b) 및 A498(도 11c)의 DART-A-매개 전가 살해를 도시한다. 세포독성은 LUM 분석(도 11a)이나 LDH 분석(도 11b 및 11c)를 사용하여 측정되었다. DART-A: ●; 대조군 DART: ■
도 12는 활성화된 사람 T 세포의 존재하에 22Rv1 종양 세포가 이식된 마우스에서 DART-A에 의한 종양 성장의 억제를 도시한다. 암컷 NOD/SCID 마우스(n = 8/그룹)에 제0일에 활성화된 사람 T 세포(1 x 106)와 공-혼합된 22Rv1 종양 세포(5 x 106)가 SC 이식되었고, 이후 총 4회 용량 IV 투여로서 제0, 1, 2 및 3일에 비히클 대조군(●), 대조군 DART(○), 또는 DART-A 0.5 mg/kg(■), 0.1 mg/kg(▲), 0.02 mg/kg(▼) 또는 0.004 mg/kg(◆)로 치료되었다. 종양 부피는 그룹 평균±SEM으로 표시된다.
도 13은 활성화된 사람 T 세포의 존재하에 A498 종양 세포가 이식된 마우스에서 DART-A에 의한 종양 성장의 억제를 도시한다. 암컷 NOD/SCID 마우스(n = 8/그룹)에 제0일에 활성화된 사람 T 세포(1 x 106)와 공-혼합된 A498 종양 세포(5 x 106)가 SC 이식되었고, 이후 총 4회 용량 IV 투여로서 제0, 1, 2 및 3일에 비히클 대조군(●), 대조군 DART 0.5 mg/kg(○), 또는 DART-A 0.5 mg/kg(■), 0.1 mg/kg (▲), 0.02 mg/kg(▼) 또는 0.004 mg/kg(◆)로 치료되었다. 종양 부피는 그룹 평균±SEM으로 표시된다.
도 14는 A498 종양 세포가 이식되고 사람 이펙터 세포와 함께 재구성된 NSG B2m-/- 마우스에서 DART-A의 항-종양 활성을 도시한다. 암컷 NSG B2m-/- 마우스(n = 7/그룹)에 제0일에 A498 종양 세포(5 x 106 세포)를 ID 이식하고, 제13일에 사람 PBMC(1 x 107)를 IP 이식했다. 다음에, 그룹은 제33, 35, 36, 39, 41, 43, 46, 48, 및 50일에 비히클 대조군(●), 대조군 DART 0.5 mg/kg(○), 또는 DART-A 1 mg/kg (■), 0.1 mg/kg(▲), 0.01 mg/kg(▼) 또는 0.001 mg/kg(◆)로 치료되었다. 종양 부피는 그룹 평균±SEM으로 표시된다.
도 15는 Detroit562 종양 세포가 이식되고 사람 이펙터 세포와 함께 재구성된 NSG B2m-/- 마우스에서 DART-A의 항-종양 활성을 도시한다. 암컷 NSG B2m-/- 마우스(n = 8/그룹)에 제0일에 Detroit562 종양 세포(5 x 106 세포)를 ID 이식하고, 제-1일에 사람 PBMC(1 x 107)를 IP 이식했다. 다음에, 그룹은 총 9회 용량 IV 투여로서 제20, 22, 23, 26, 28, 30, 33, 35, 및 37일에 비히클 대조군(●), 대조군 DART 0.5 mg/kg(○), 또는 DART-A 1 mg/kg(■), 0.5 mg/kg(▲), 0.25 mg/kg(▼) 또는 0.1 mg/kg(◆)로 치료되었다. 종양 부피는 그룹 평균±SEM으로 표시된다.
도 16a-16b는 Detroit562 종양 세포가 이식되고 사람 이펙터 세포와 함께 재구성된 NSG MHC11-/- 마우스에서 DART-A의 항-종양 활성을 도시한다. MHC11-/- 마우스(n = 7/비히클 대조군; 7/그룹 I; 및 5/그룹 II)에 Detroit562 종양 세포(5 x 106 세포)를 제0일에 ID 이식하고, 사람 PBMC(1 x 107 세포)를 IP 이식했다. 다음에, 그룹은 비히클 대조군(●), 또는 DART-A 0.5 mg/kg(▲)로 치료되었다. 그룹 I(도 16a)는 제15, 22, 29, 36 및 43일에 IV 투여된 5회 용량을 받았다. 그룹 II(도 16b)는 제15, 29 및 43일에 IV 투여된 3회 용량을 받았다. 종양 부피는 그룹 평균±SEM으로 표시된다.
도 17은 사이노몰거스 원숭이에서 DART-A 및 DART-B의 약동학적 프로파일을 도시한다. 사이노몰거스 원숭이의 그룹(n = 2/그룹; 1M/1F)에 0.5 mg/kg의 1회 용량이 투여되었고, 이후 3주마다 1.0 mg/kg 용량의 DART-A 또는 DART-B가 총 4회 용량으로 IV 투여되었다. 4마리 시험 동물의 각각에서 DART-A(실선) 및 DART-B(점선)의 혈청 농도가 연구 과정에 걸쳐서 플롯팅된다.
본 발명은 B7-H3의 에피토프에 특이적인 하나의 결합 부위 및 CD3의 에피토프에 특이적인 하나의 결합 부위를 지닌 이중특이적 1가 디아바디(즉, "B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 디아바디")에 관한 것이다. 가장 바람직하게는, 이러한 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 디아바디는 3개의 폴리펩타이드 사슬로 구성되고, B7-H3의 에피토프에 특이적인 하나의 결합 부위 및 CD3의 에피토프에 특이적인 하나의 결합 부위를 지니며, 추가로 면역글로불린 Fc 도메인을 포함한다 (즉, "B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디"). 본 발명의 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 B7-H3 및 CD3에 동시에 결합할 수 있다. 본 발명은 이러한 이중특이적 1가 Fc 디아바디를 함유하는 제약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 암 및 다른 질환 및 상태의 치료에서 이러한 디아바디의 사용을 위한 방법에 관한 것이다.
I. 항체 및 다른 결합 분자
A. 항체
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 가변 도메인을 지닌 임의의 분자를 포함한다("에피토프-결합 부위"). 따라서, 이 용어는 온전한 다클론성 또는 단클론성 항체뿐 아니라, 이것들의 돌연변이, 자연 발생한 변이체, 이러한 에피토프-결합 부위를 포함하는 융합 단백질, 사람화된 항체, 및 키메라 항체, 및 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성형태를 포함한다. 본 출원 전반에 걸쳐, 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 영역의 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health Publication No. 91-3242에서와 같이 EU 인덱스에 따른다. 본원에서 사용된 바와 같이, "항체의 에피토프-결합 단편"은 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체의 부분을 표시한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 이러한 용어는 단편들(예컨대 Fab, Fab', F(ab')2 Fv), 및 단일 사슬(scFv), 뿐만 아니라 디아바디의 에피토프-결합 도메인을 포함한다.
용어 "단클론성 항체"는 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 균질한 항체 집단을 말한다. 용어 "단클론성 항체"는 항체의 공급원 또는 항체가 제조되는 방식(예를 들어, 하이브리도마(hybridoma), 파지 선택, 재조합 발현, 트랜스제닉 동물에서의 생성 등에 의한)에 관하여 제한하려는 의도는 아니다. 단클론성 항체의 제조 방법은 업계에 공지되어 있다. 이용될 수 있는 한 가지 방법은 Kohler, G. et al. (1975) "Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity," Nature 256:495-497의 방법 또는 그 변형이다. 전형적으로, 단클론성 항체는 마우스, 래트 또는 토끼에서 발달된다. 항체는 원하는 에피토프를 함유하는 세포, 세포 추출물, 또는 단백질 조제물의 면역원성 양으로 동물을 면역화시킴으로써 생산된다. 면역원은 제한되는 것은 아니지만, 1차 세포, 배양된 세포주, 암 세포, 단백질, 펩타이드, 핵산, 또는 조직일 수 있다. 면역화에 사용된 세포는 면역원으로서 사용 전에 일정한 기간(예를 들어, 적어도 24시간) 동안 배양될 수도 있다. 세포는 그 자체로 또는 비-변성 보조제, 예컨대 Ribi와 조합하여 면역원으로 사용될 수도 있다. 일반적으로, 세포는 면역원으로 사용될 때 온전하게 유지되어야 하며 바람직하게는 살아있어야 한다. 온전한 세포는 면역화된 동물에 의해 파열된 것들보다 항원이 더 잘 검출되게 할 수 있다. 변성 또는 엄격한 보조제, 예를 들어, 프로인트 보조제(Freund's adjuvant)의 사용은 세포를 파열시킬 수도 있으며 그러므로 낙심한다. 면역원은 주기적인 간격, 예컨대 격주, 또는 매주 여러 번 투여될 수도 있거나, 동물의 생존력을 유지하기 위한 이러한 방법으로(예를 들어, 조직 재조합으로) 투여될 수도 있다. 대안으로, 기존의 단클론성 항체 및 원하는 병원성 에피토프에 면역특이적인 임의의 다른 동등한 항체는 업계에 공지된 임의의 수단으로 시퀀싱되고 재조합에 의해 생산될 수 있다. 한 구체예에서, 이러한 항체가 시퀀싱된 다음 폴리뉴클레오타이드 서열이 발현 또는 증식을 위해 벡터로 클로닝된다. 원하는 항체를 암호화하는 서열은 숙주 세포 내 벡터에서 유지될 수도 있고 그 이후 숙주 세포는 미래의 사용을 위해 확장되고 냉동될 수 있다. 이러한 항체의 폴리뉴클레오타이드 서열은 항체의 친화도, 또는 다른 특징들을 개선하기 위해, 본 발명의 이중특이적 분자뿐 아니라 키메라 항체, 사람화된 항체, 또는 개화된 항체를 생성하기 위한 유전자 조작에 사용될 수도 있다. 항체 사람화의 일반적인 원칙은 항체의 에피토프-결합 부분의 근본적인 서열을 유지하는 한편, 항체의 비-사람 나머지 부분을 사람 항체 서열로 바꾸는 것을 수반한다. 단클론성 항체를 사람화하기 위해서는 네 개의 일반적인 단계가 있다. 이것들은 다음과 같다: (1) 시작하는 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 뉴클레오타이드 및/또는 예측된 아미노산 서열의 결정; (2) 사람화된 항체 또는 개화된 항체의 설계, 즉, 사람화 또는 개화 과정 중에 어떤 항체 프레임워크 영역(들)이 사용되는지의 결정; (3) 실제 사람화 또는 개화 방법/기술의 적용; 및 (4) 사람화된 또는 개화된 항체의 트랜스펙션 및 발현(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호; 제5,807,715호; 제5,866,692호; 및 제6,331,415호 참조).
여기 사용된 바와 같은, 항체 또는 그것의 에피토프-결합 단편은, 그것이 다른 에피토프에 비해 해당 에피토프와 더 큰 친화성 또는 결합활성으로 및/또는 더 긴 지속기간으로 더 빈번히, 더 빠르게 반응하거나 회합한다면, 다른 분자(즉, 에피토프)의 영역에 "면역특이적으로" 결합한다고 한다. 또한, 이 정의를 읽음으로써, 예를 들어 제1 표적에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 에피토프-결합 단편은 제2 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있거나 그렇지 않을 수 있다는 것이 이해된다.
B. 이중특이적 항체, 다중-특이적 디아바디 및 DART® 디아바디
비-단일-특이적 "디아바디"의 공급은 항체 이상의 중요한 이점, 다른 에피토프를 발현하는 세포를 동시-결찰 및 동시-국소화시키는 능력을 제공한다. 따라서, 이중특이적 디아바디는 치료 및 면역진단을 포함한 광범위한 용도를 가진다. 이중특이성은 다양한 용처에서 디아바디의 설계 및 조작에 큰 유용성을 허용하며, 멀티머 항원에 대한 향상된 결합력, 다른 항원의 교차-결합, 및 두 개의 표적 항원의 존재에 따라 특이적 세포 유형에 직접적인 표적화를 제공한다. 그것들의 2가성, 낮은 해리율, 및 순환에서 신속한 클리어런스로 인해(작은 크기, ~50 kDa 이하의 디아바디에 대해서), 업계에 공지된 디아바디 분자는 또한 종양 이미지화의 분야에서 특별한 용도를 가진다(Fitzgerald et al.(1997) "Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris ," Protein Eng. 10:1221). 다른 세포의 동시-결찰, 예를 들어, 종양 세포에 대한 세포독성 T 세포의 교차결합은 특히 중요하며(Staerz et al.(1985) "Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells," Nature 314:628-631, 및 Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bi -specific Diabody ," Protein Eng. 9:299-305), 이로써 T 세포가 종양 세포의 부위들에 동시에 국소화될 수 있다.
T 세포에 결합하도록 이러한 디아바디를 표적화하는 것의 대안으로서 디아바디 에피토프 결합 도메인은 B 세포의 표면결정소, 예컨대 CD19, CD20, CD22, CD30, CD37, CD40 및 CD74에 지정될 수 있다(Moore, P.A. et al. (2011) "Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma," Blood 117(17):4542-4551; Cheson, B.D. et al. (2008) "Monoclonal Antibody Therapy For B-Cell Non-Hodgkin's Lymphoma," N. Engl. J. Med. 359(6):613-626; Castillo, J. et al. (2008) "Newer monoclonal antibodies for hematological malignancies," Exp. Hematol. 36(7):755-768). 많은 연구에서, 효과기 세포 결정 요인, 예를 들어, Fcγ 수용체(FcγR)에 대한 디아바디 결합은 또한 효과기 세포를 활성화시키는 것이 발견되었다(Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody ," Protein Eng. 9:299-305; Holliger et al. (1999) " Carcino -embryonic Antigen ( CEA )-Specific T-Cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti- CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti- CEA Bispecific Fusion Proteins," Cancer Res. 59:2909-2916; WO 2006/113665; WO 2008/157379; WO 2010/080538; WO 2012/018687; WO 2012/162068). 일반적으로, 효과기 세포 활성화는 Fc-도메인-FcγR 상호작용을 통해 효과기 세포에 대한 항원 결합 항체의 결합에 의해 촉발되며; 따라서, 이 점에 있어서, 디아바디 분자는 그것들이 Fc 도메인을 포함하는지에 독립적으로 Ig-유사 기능성을 나타낼 수도 있다(예를 들어, 업계에 공지되어 있거나 본원에서 예시된 임의의 효과기 기능 검정(예를 들어, ADCC 검정)으로 분석됨). 종양 및 효과기 세포를 교차-결합시킴으로써, 디아바디는 종양 세포의 근거리 내에 효과기 세포를 가져오며 효과적인 종양 살해를 유도한다(예를 들어, Cao et al. (2003) " Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics," Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197).
하지만, 상기 이점은 현저한 비용이 든다. 이러한 비-단일-특이적 디아바디의 형성은 둘 이상의 별개의 다른 폴리펩타이드의 성공적인 조립을 필요로 한다(즉, 이러한 형성은 디아바디가 다른 폴리펩타이드 사슬 종의 헤테로다이머화를 통해 형성될 것을 필요로 한다). 이 사실은 단일-특이적 디아바디와는 대조적이며, 이것들은 동일한 폴리펩타이드 사슬의 호모다이머화를 통해 형성된다. 비-단일-특이적 디아바디를 형성하기 위해 적어도 두 개의 상이한 폴리펩타이드(즉, 두 개의 폴리펩타이드 종)이 제공되어야 하기 때문에, 및 이러한 폴리펩타이드의 호모다이머화가 비활성 분자로 이어지기 때문에(Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588), 이러한 폴리펩타이드의 생성은 같은 종의 폴리펩타이드 간의 공유 결합을 다루기 위해(즉, 호모다이머화를 최소화하기 위해) 이러한 방법으로 달성되어야 한다(Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588). 따라서, 업계에서는 이러한 폴리펩타이드의 비-공유 회합을 교시한다(예를 들어, Olafsen et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti- CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications," Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain," Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588; Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG -Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672 참조).
하지만, 업계에서는 비-공유 회합된 폴리펩타이드로 구성된 이중특이적 디아바디가 불안정하고 비-기능적 단일 폴리펩타이드 사슬 모노머로 쉽게 해리된다는 것을 인식했다(예를 들어, Lu, D. et al.(2005) "A Fully Human Recombinant IgG -Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672 참조).
이런 도전에 직면하여 업계는 DART®(이중-친화성 재-표적화 시약)라고 명명된 안정한 공유 결합된 헤테로다이머 비-1특이적 디아바디를 개발하는데 성공했다. 예를 들어, Chichili, G.R. et al. (2015) "A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity and Safety In Non사람 Primates," Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82; Johnson, S. et al. (2010) "Effector Cell Recruitment With Novel Fv -Based Dual- AffinityRe -TargetingProtein Leads To Potent TumorCytolysis and In Vivo B-Cell Depletion" J. Molec. Biol. 399(3):436-449; Veri, M.C. et al. (2010) "Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIB ( CD32B ) Inhibitory FunctionWith A Novel Bispecific Antibody Scaffold," Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; Moore, P.A. et al.(2011) "Application Of DualAffinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T cell Killing Of B-Cell Lymphoma," Blood 117(17):4542-4551; 미국특허 8,044,180; 8,133,982; 8,187,593; 8,193,318; 8,530,627; 8,669,349; 8,778,339; 8,784,808; 8,795,667; 8,802,091; 8,802,093; 8,946,387; 8,968,730; 및 8,993,730; 미국 특허 공개 2009/0060910; 2010/0174053; 2011/0081347; 2011/0097323; 2011/0117089; 2012/0009186; 2012/0034221; 2012/0141476; 2012/0294796; 2013/0149236; 2013/0295121; 2014/0017237; 및 2014/0099318; 유럽 특허 EP 1868650; EP 2158221; EP 2247304; EP 2252631; EP 2282770; EP 2328934; EP 2376109; EP 2542256; EP 2601216; EP 2714079; EP 2714733; EP 2786762; EP 2839842; EP 2840091; 및 PCT 공개 WO 2006/ 113665; WO 2008/157379; WO 2010/027797; WO 2010/033279; WO 2010/080538; WO 2011/109400; WO 2012/018687; WO 2012/162067; WO 2012/162068; WO 2014/159940; WO 2015/021089; WO 2015/026892; 및 WO 2015/026894 참조). 이러한 디아바디는 둘 이상의 공유 복합체화된 폴리펩타이드를 포함하고, 이용된 폴리펩타이드 종들의 각각에 하나 이상의 시스테인 잔기를 조작해 넣는 것을 수반한다. 예를 들어, 이러한 구성물의 C-말단에 시스테인 잔기의 첨가는 폴리펩타이드 사슬 간 이황화물 결합을 허용함으로써 2가 분자의 결합 특징의 방해 없이 결과의 헤테로다이머를 안정화하는 것으로 나타났다.
가장 단순한 DART® 디아바디는 각각 세 개의 도메인을 포함하는 두 개의 폴리펩타이드 사슬을 포함한다(도 1). 제1 폴리펩타이드 사슬은 (i) 제1 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인의 결합 영역을 포함하는 도메인 (VL1), (ii) 제2 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인의 결합 영역을 포함하는 제2 도메인 (VH2), 및 (iii) 제2 폴리펩타이드 사슬과의 헤테로다이머화를 촉진하고 디아바디의 제2 폴리펩타이드 사슬에 제1 폴리펩타이드를 공유 결합시키는 역할을 하는 제3 도메인("헤테로다이머-촉진 도메인")을 포함한다. 제2 폴리펩타이드는 상보성 제1 도메인 (VL2 도메인), 상보성 제2 도메인 (VH1 도메인) 및 제1 폴리펩타이드 사슬과의 헤테로다이머화 및 공유 결합을 촉진하기 위해서 제1 폴리펩타이드 사슬의 제3 도메인과 복합체를 형성하는 제3 도메인을 함유한다("헤테로다이머-촉진 도메인"). 이러한 분자들은 안정하고, 강력하며 둘 이상의 항원에 동시에 결합하는 능력을 가진다. 그것들은 표적 항원을 발현하는 세포의 재방향성 T 세포 중재된 살해를 촉진할 수 있다.
한 구체예에서, 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬의 제3 도메인은 각각 시스테인("C") 잔기를 함유하며, 이것은 이황화 결합을 통해 함께 폴리펩타이드에 결합하는 역할을 한다. 폴리펩타이드 사슬 중 하나 또는 둘 다의 제3 도메인은 추가적으로 디아바디 폴리펩타이드의 복합체 형성이 세포(예컨대 B 림프구, 수지상세포, 자연 살해 세포, 대식 세포, 호중구, 호산구, 호염기구 및 비만 세포)의 Fc 수용체에 결합할 수 있는 Fc 도메인을 형성하도록 CH2-CH3 도메인의 서열을 소유할 수도 있다. 이러한 분자의 많은 변화가 기술되어 있다(예를 들어, 미국 특허 공개 제2013-0295121호; 제2010-0174053호 및 제2009-0060910호; 유럽 특허 공개 제EP 2714079호; 제EP 2601216호; 제EP 2376109호; 제EP 2158221호 및 PCT 공개 WO 2012/162068호; WO 2012/018687; WO 2010/080538 참조).
본 발명의 바람직한 Fc-보유 DART® 디아바디는 세 개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하며, 이들은 도 2a-2b에 묘사된다. 이러한 디아바디의 제1 폴리펩타이드 사슬은 네 개의 도메인을 함유한다: (i) VL1-함유 도메인, (ii) VH2-함유 도메인, (iii) 디아바디의 제2 폴리펩타이드 사슬과의 공유 결합 및 헤테로다이머화("헤테로다이머-촉진 도메인")를 촉진하는 도메인, 및 (iv) CH2-CH3 서열을 함유하는 도메인. 이러한 DART® 디아바디의 제2 폴리펩타이드는 (i) VL2-함유 도메인, (ii) VH1-함유 도메인 및 (iii) 디아바디의 제1 폴리펩타이드 사슬과의 공유 결합 및 헤테로다이머화("헤테로다이머-촉진 도메인")를 촉진하는 도메인을 함유한다. 이러한 DART®의 제3 폴리펩타이드는 CH2-CH3 서열을 포함한다. 따라서, 이러한 DART® 디아바디의 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬은 함께 회합하여 제1 에피토프에 결합할 수 있는 VL1/VH1 결합 부위(1)뿐 아니라, 제2 에피토프에 결합할 수 있는 VL2/VH2 결합 부위(2)를 형성한다. 본 발명의 바람직한 Fc-보유 DART® 디아바디는 CD3 또는 B7-H3일 수 있는 "제1 에피토프", 및 제1 에피토프가 CD3일 때는 B7-H3이고 제1 에피토프가 B7-H3일 때는 CD3인 "제2 에피토프"에 결합할 수 있는 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 디아바디이다. 제1 및 제2 폴리펩타이드는 각각의 링커 및/또는 제3 도메인에서 시스테인 잔기를 수반하는 하나 이상의 이황화물 결합을 통해서 서로 결합된다. 특히, 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬은 서로 복합체를 형성하여 이황화물 결합을 통해 안정화된 Fc 도메인을 형성한다. 이러한 디아바디는 향상된 효능을 가진다. 본 발명의 바람직한 Fc-보유 DART® 디아바디는 두 배향 중 하나를 가질 수도 있다(표 1):
제1 배향 3rd 사슬 NH2-CH2-CH3-COOH
1st 사슬 NH2-VL1-VH2-헤테로다이머-촉진 도메인-CH2-CH3-COOH
2nd 사슬 NH2-VL2-VH1-헤테로다이머-촉진 도메인-COOH
제2 배향 3rd 사슬 NH2-CH2-CH3-COOH
1st 사슬 NH2-CH2-CH3-VL1-VH2-헤테로다이머-촉진 도메인-COOH
2nd 사슬 NH2-VL2-VH1-헤테로다이머-촉진 도메인-COOH
II. 본 발명의 바람직한 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 디아바디
본 발명은 특히 B7-H3과 CD3에 동시에 결합할 수 있는 이러한 Fc-보유 DART® 디아바디, 즉 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 DART® 디아바디, 및 암 및 다른 질환 및 상태의 치료에서 이러한 분자의 사용에 관한 것이다. 비-최적화된 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 디아바디는 충분히 기능적이지만, 코돈 최적화를 통해 유전자 발현에서 얻어진 개선과 유사하게(예를 들어, Grosjean, H. et al.(1982) "Prefer-ential Codon Usage In Prokaryotic Genes: The Optimal Codon - Anticodon Inter-action Energy and The Selective Codon Usage In Efficiently Expressed Genes" Gene 18(3):199-209), 이들의 서열을 변형하거나 개정함으로써 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 디아바디의 안정성 및/또는 기능을 더 증진시키는 것이 가능하다.
바람직하게, 도 2a에 도시된 대로, 이러한 3개의 폴리펩타이드 중 첫 번째는 N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단, "제1" 항원(VL1)의 에피토프에 결합할 수 있는 경쇄 가변 도메인(VL)(CD3 또는 B7-H3), "제2" 항원(VH2)의 에피토프에 결합할 수 있는 중쇄 가변 도메인(VH)(제1 항원이 CD3이면 B7-H3; 제1 항원이 B7-H3이면 CD3), 헤테로다이머-촉진 도메인, 및 C-말단을 함유할 것이다. 개재 링커 펩타이드(링커 1)는 중쇄 가변 도메인(VH2)으로부터 경쇄 가변 도메인(VL1)을 분리한다. 바람직하게, 중쇄 가변 도메인(VL2)은 개재 링커 펩타이드(링커 2)에 의해 헤테로다이머-촉진 도메인에 연결된다. 바람직한 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디 구체예에서, 헤테로다이머-촉진 도메인의 C-말단은 개재 링커 펩타이드(링커 3) 또는 개재 스페이서-링커 펩타이드(스페이서-링커 3)에 의해 Fc 영역의 CH2-CH3 도메인("Fc 도메인")에 연결된다. 가장 바람직하게, 3개의 폴리펩타이드 사슬의 첫 번째는 따라서 N-말단에서 C-말단 방향으로 VL1 - 링커 1 - VH2 - 링커 2 - 헤테로다이머-촉진 도메인 - 스페이서-링커 3 - Fc 도메인을 함유할 것이다.
또는 달리, 도 2b에 도시된 대로, 이러한 3개의 폴리펩타이드 사슬의 첫 번째는 N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단, 링커 3, Fc 영역의 CH2-CH3 도메인("Fc 도메인"), 예를 들어 아미노산 서열 APSSS(SEQ ID NO:51) 또는 아미노산 서열 APSSSPME(SEQ ID NO:52)를 가진 개재 스페이서 펩타이드(링커 4), "제1" 항원(VL1)의 에피토프에 결합할 수 있는 경쇄 가변 도메인(VL)(CD3 또는 B7-H3), "제2" 항원(VH2)의 에피토프에 결합할 수 있는 중쇄 가변 도메인(VH)(제1 항원이 CD3이면 B7-H3; 제1 항원이 B7-H3이면 CD3), 헤테로다이머-촉진 도메인, 및 C-말단을 함유할 것이다. 개재 링커 펩타이드(링커 1)는 중쇄 가변 도메인(VH2)으로부터 경쇄 가변 도메인(VL1)을 분리한다. 바람직하게, 중쇄 가변 도메인(VH2)은 개재 링커 펩타이드(링커 2)에 의해 헤테로다이머-촉진 도메인에 연결된다. 가장 바람직하게, 이러한 대안적 배향에서, 3개의 폴리펩타이드 사슬의 첫 번째는 따라서 N-말단에서 C-말단 방향으로, 링커 3 - Fc 도메인 - 링커 4 - VL1 - 링커 1 - VH2 - 링커 2 - 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유할 것이다.
바람직하게, 이러한 두 바람직한 배향 중 어느 것에서, 이러한 3개의 폴리펩타이드 사슬의 두 번째는 N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단, "제2" 항원(VL2)의 에피토프에 결합할 수 있는 경쇄 가변 도메인(VL), "제1" 항원(VH1)의 에피토프에 결합할 수 있는 중쇄 가변 도메인(VH), 헤테로다이머-촉진 도메인 및 C-말단을 함유할 것이다. 개재 링커 펩타이드(링커 1)는 중쇄 가변 도메인(VH1)으로부터 경쇄 가변 도메인(VL2)을 분리한다. 바람직하게, 중쇄 가변 도메인(VH1)은 개재 링커 펩타이드(링커 2)에 의해 헤테로다이머-촉진 도메인에 연결된다. 가장 바람직하게, 3개의 폴리펩타이드 사슬의 두 번째는 따라서 N-말단에서 C-말단 방향으로, VL1 - 링커 1 - VH2 - 링커 2 - 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유할 것이다.
바람직하게, 이러한 두 바람직한 배향 중 어느 것에서, 이러한 3개의 폴리펩타이드 사슬의 세 번째는 링커 펩타이드(링커 3) 및 Fc 영역의 CH2-CH3 도메인("Fc 도메인")을 함유할 것이다. 세 번째 폴리펩타이드 사슬은 VL 도메인 또는 VH 도메인을 포함하지 않기 때문에, 제3 폴리펩타이드 사슬은 본 발명의 둘 이상의 상이한 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디에서 동일할 수 있다.
제1 폴리펩타이드 사슬(VL1)의 경쇄 가변 도메인은 그것이 제2 폴리펩타이드 사슬(VH1)의 중쇄 가변 도메인과 상호작용하여 제1 항원(즉, B7-H3 또는 CD3)의 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 기능적 에피토프-결합 부위를 형성하도록 적절히 선택된다. 마찬가지로, 제2 폴리펩타이드 사슬(VL2)의 경쇄 가변 도메인은 그것이 제1 폴리펩타이드 사슬(VH2)의 중쇄 가변 도메인과 상호작용하여 제2 항원(즉, B7-H3 또는 CD3)의 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 기능적 에피토프-결합 부위를 형성하도록 적절히 선택된다. 따라서, 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인의 선택은 두 폴리펩티드 사슬이 전체적으로 B7-H3 및 CD3에 결합할 수 있는 에피토프-결합 부위를 포함하도록 조화된다.
A. 바람직한 링커
가장 바람직하게는, 폴리펩타이드 사슬의 이러한 VL 및 VH 도메인을 분리하는 링커 1의 길이는 이러한 VL 및 VH 도메인이 서로 결합하는 것을 실질적으로 또는 완전히 방지하도록 선택된다(예를 들어, 12개 이하의 아미노산 잔기 길이). 따라서 제1 폴리펩타이드 사슬의 VL1 및 VH2 도메인은 서로 실질적으로 또는 완전히 결합할 수 없고, 제1 또는 제2 항원에 실질적으로 결합할 수 있는 에피토프 결합 부위를 형성하지 않는다. 마찬가지로, 제2 폴리펩타이드 사슬의 VL2 및 VH1 도메인은 서로 실질적으로 또는 완전히 결합할 수 없고, 제1 또는 제2 항원에 실질적으로 결합할 수 있는 에피토프 결합 부위를 형성하지 않는다. 바람직한 개재 스페이서 펩타이드(링커 1)는 서열(SEQ ID NO:1): GGGSGGGG를 가진다.
링커 2의 목적은 폴리펩타이드 사슬의 VH 도메인을 상기 폴리펩타이드 사슬의 선택적으로 존재하는 헤테로다이머-촉진 도메인으로부터 분리하는 것이다. 다양한 링커들 중 어느 것도 링커 2의 목적을 위해서 사용될 수 있다. 이러한 링커 2에 바람직한 서열은 이황화물 결합을 통해서 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 서로 공유 결합시키는데 사용될 수 있는 시스테인 잔기를 지닌 아미노산 서열: GGCGGG(SEQ ID NO:2), 또는 IgG CH1 도메인으로부터 유래된 ASTKG(서열번호:3)를 가진다. 링커 2, ASTKG(SEQ ID NO:3)는 이러한 시스테인을 가지고 있지 않기 때문에, 이러한 링커 2의 사용은 바람직하게 시스테인-함유 헤테로다이머-촉진 도메인, 예컨대 서열번호:12의 E-코일 또는 SEQ ID NO:13의 K-코일의 사용과 관련된다(하기 참조).
링커 3의 목적은 폴리펩타이드 사슬의 헤테로다이머-촉진 도메인을 상기 폴리펩타이드 사슬의 Fc 도메인로부터 분리하는 것이다. 다양한 링커 중 어느 것도 링커 3의 목적을 위해 사용될 수 있다. 이러한 링커 3에 바람직한 서열은 아미노산 서열: DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:4)를 가진다. 스페이서-링커 3에 바람직한 서열은 아미노산 서열: GGGDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:5)를 가진다.
B. 바람직한 헤테로다이머 -촉진 도메인
제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬의 헤테로다이머의 형성은 헤테로다이머-촉진 도메인의 포함으로 구동될 수 있다. 이러한 도메인은 하나의 폴리펩타이드 사슬에는 GVEPKSC(SEQ ID NO:6) 또는 VEPKSC(SEQ ID NO:7)를, 다른 폴리펩타이드 사슬에는 GFNRGEC(SEQ ID NO:8) 또는 FNRGEC(SEQ ID NO:9)를 포함한다(US2007/0004909).
하지만, 더 바람직하게는, 본 발명의 헤테로다이머-촉진 도메인은 적어도 6, 적어도 7 또는 적어도 8개의 하전된 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 반대 전하의 1, 2, 3 또는 4개의 나란히 반복되는 코일 도메인으로부터 형성된다 (Apostolovic, B. et al. (2008) "pH-Sensitivity of the E3/K3 Heterodimeric Coiled Coil," Biomacromolecules 9:3173-3180; Arndt, K.M. et al. (2001) "Helix-stabilized Fv (hsFv) Antibody Fragments: Substituting the Constant Domains of a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled-coil Domain," J. Molec. Biol. 312:221-228; Arndt, K.M. et al. (2002) "Comparison of In Vivo Selection and Rational Design of Heterodimeric Coiled Coils," Structure 10:1235-1248; Boucher, C. et al. (2010) "Protein Detection By Western Blot Via Coiled-Coil Interactions," Analytical Biochemistry 399:138-140; Cachia, P.J. et al. (2004) "Synthetic Peptide Vaccine Development: Measurement Of Polyclonal Antibody Affinity And Cross-Reactivity Using A New Peptide Capture And Release System For Surface Plasmon Resonance Spectroscopy," J. Mol. Recognit. 17:540-557; De Crescenzo, G.D. et al. (2003) "Real-Time Monitoring of the Interactions of Two-Stranded de novo Designed Coiled-Coils: Effect of Chain Length on the Kinetic and Thermodynamic Constants of Binding," Biochemistry 42:1754-1763; Fernandez-Rodriquez, J. et al. (2012) "Induced Heterodimerization And Purification Of Two Target Proteins By A Synthetic Coiled-Coil Tag," Protein Science 21:511-519; Ghosh, T.S. et al. (2009) "End-To-End And End-To-Middle Interhelical Interactions: New Classes Of Interacting Helix Pairs In Protein Structures," Acta Crystallographica D65:1032-1041; Grigoryan, G. et al. (2008) "Structural Specificity In Coiled-Coil Interactions," Curr. Opin. Struc. Biol. 18:477-483; Litowski, J.R. et al. (2002) "Designing Heterodimeric Two-Stranded α-Helical Propensity On Protein Folding, Stability, And Specificity," J. Biol. Chem. 277:37272-37279; Steinkruger, J.D. et al. (2012) "The d'--d--d′' Vertical Triad is Less Discriminating Than the a'--a--a' Vertical Triad in the Antiparallel Coiled-coil Dimer Motif," J. Amer. Chem. Soc. 134(5):2626-2633; Straussman, R. et al. (2007) "Kinking the Coiled Coil - Negatively Charged Residues at the Coiled-coil Interface," J. Molec. Biol. 366:1232-1242; Tripet, B. et al. (2002) "Kinetic Analysis of the Interactions between Troponin C and the C-terminal Troponin I Regulatory Region and Validation of a New Peptide Delivery/Capture System used for Surface Plasmon Resonance," J. Molec. Biol. 323:345-362; Woolfson, D.N. (2005) "The Design Of Coiled-Coil Structures And Assemblies," Adv. Prot. Chem. 70:79-112; Zeng, Y. et al. (2008) "A Ligand - Pseudoreceptor System Based On de novo Designed Peptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With Altered Tropism," J. Gene Med. 10:355-367).
이러한 반복되는 코일 도메인은 정확한 반복 부분일 수도 있거나 치환을 가질 수도 있다. 예를 들어, 하나의 폴리펩타이드 사슬의 헤테로다이머-촉진 도메인은 음전하의 아미노산 잔기의 서열을 포함할 수도 있고, 나머지 폴리펩타이드 사슬의 헤테로다이머-촉진 도메인은 음전하의 아미노산 잔기의 서열을 포함할 수도 있다. 특정 구체예에서, 코일 도메인은 8개의 음전하의 아미노산 잔기 또는 8개의 양전하의 잔기를 포함한다. 어느 코일이 제1 또는 제2 폴리펩타이드 사슬에 제공되는지는 중요하지 않으며, 단 반대 전하의 코일은 다른 폴리펩타이드 사슬에 사용된다. 하지만, 본 발명의 바람직한 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 음전하의 코일을 가진 제1 폴리펩타이드 사슬을 가진다. 양전하의 코일 도메인의 양전하의 아미노산은 리신, 아르기닌, 히스티딘 등일 수 있고, 바람직하게 리신이다. 음전하의 코일의 음전하의 아미노산은 글루탐산, 아스파르트산 등일 수 있고, 바람직하게 글루탐산이다.
본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 DART® 디아바디는 단일 헤테로다이머-촉진 도메인을 지닐 수도 있고(즉, 제1 폴리펩타이드 사슬 또는 제2 폴리펩타이드 사슬), 아니면 둘 다 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유할 것이다. 이러한 단일 헤테로다이머-촉진 도메인의 존재는 호모다이머인 디아바디의 형성을 방해함으로써 헤테로다이머화를 촉진한다(이러한 분자는 헤테로다이머-촉진 도메인을 결여하거나 또는 2개의 반발하는(유사-하전된) 헤테로다이머-촉진 도메인을 지닌다). 그러나, 본 발명의 디아바디의 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬이 둘 다 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유하는 것이 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 헤테로다이머-촉진 도메인 중 하나는 pH 7에서 음전하를 형성하는 4개의 탠덤 "E-코일" 나선 도메인(SEQ ID NO:10: E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K)을 포함하는 한편, 헤테로다이머-촉진 도메인 중 다른 하나는 리신 잔기가 pH 7에서 양전하를 형성하는 4개의 탠덤 "K-코일" 도메인(SEQ ID NO:11: K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E)을 포함할 것이다. 이러한 하전된 도메인의 존재는 제1 및 제2 폴리펩타이드 간의 회합을 촉진하고, 따라서 헤테로다이머화를 촉진한다. 다른 바람직한 구체예에서, SEQ ID NO:10의 4개의 탠덤 "E-코일" 나선 도메인 중 하나가 시스테인 잔기를 함유하도록 변형된 헤테로다이머-촉진 도메인: E VAAC E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K(SEQ ID NO:12)이 이용된다. 유사하게, 다른 바람직한 구체예에서, SEQ ID NO:11의 4개의 탠덤 "K-코일" 나선 도메인 중 하나가 시스테인 잔기를 함유하도록 변형된 헤테로다이머-촉진 도메인: K VAAC K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E(SEQ ID NO:13)이 이용된다.
C. 폴리펩타이드 사슬의 공유 결합
본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬이 그것들의 길이에 따라 배치된 하나 이상의 시스테인 잔기를 통해 서로 공유 결합하도록 조작된다. 이러한 시스테인 잔기는 폴리펩타이드의 VL 및 VH 도메인을 분리하는 개재 링커로 도입될 수도 있다. 대안으로, 링커 2는 시스테인 잔기를 함유할 수도 있다. 추가적으로 또는 대안으로, 링커 3은 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:5에서와 같이, 시스테인 잔기를 함유할 수도 있다. 가장 바람직하게는, 헤테로다이머-촉진 도메인의 하나 이상의 코일 도메인은 SEQ ID NO:12 또는 SEQ ID NO:13에서와 같이 시스테인 잔기를 함유하도록 치환될 것이다.
D. 바람직한 Fc 도메인
본 발명의 바람직한 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디의 Fc 도메인은 완전한 Fc 영역(예를 들어, 완전한 IgG Fc 영역) 또는 단지 완전한 Fc 영역의 단편일 수도 있다. 본 발명의 바람직한 이중특이적 1가 Fc 디아바디의 Fc 도메인은 하나 이상의 Fc 수용체(예를 들어, FcγR(s))에 결합하는 능력을 가지고 있을 수도 있으며, 더 바람직하게는 이러한 Fc 도메인은 FcγRIA(CD64), FcγRIIA(CD32A), FcγRIIB(CD32B), FcγRIIIA(CD16a) 또는 FcγRIIIB(CD16b)에 대하여 감소된 결합을 유발하도록 변형되거나(야생형 Fc 영역에 의해 억제된 결합에 비해), 또는 이러한 수용체(들)에 결합하는 이러한 Fc 도메인의 능력을 실질적으로 제거하도록 변형된다. 따라서, 본 발명의 바람직한 이중특이적 1가 Fc 디아바디의 Fc 도메인은 완전한 Fc 영역의 CH2 도메인의 일부 또는 모두 및/또는 CH3 도메인의 일부 또는 모두를 포함할 수도 있거나, 또는 변이체 CH2 및/또는 변이체 CH3 서열(예를 들어, 완전한 Fc 영역의 CH2 또는 CH3 도메인에 관하여 하나 이상의 삽입 및/또는 하나 이상의 결실을 포함할 수도 있음)을 포함할 수도 있다. 본 발명의 이중특이적 1가 Fc 디아바디의 Fc 도메인은 비-Fc 폴리펩타이드 부분을 포함할 수도 있거나, 또는 비-천연 완전한 Fc 영역의 일부를 포함할 수도 있거나, 또는 CH2 및/또는 CH3 도메인의 비-자연 발생한 방향(예컨대, 예를 들어, 두 개의 CH2 도메인 또는 두 개의 CH3 도메인, 또는 N-말단에서 C-말단 방향으로, CH2 도메인에 연결된 CH3 도메인 등)을 포함할 수도 있다.
바람직한 구체예에서 본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디의 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬은 각각 면역글로불린(IgG) Fc 도메인을 형성하기 위해 함께 복합체를 형성한 CH2-CH3 도메인을 포함한다. 사람 IgG1의 예시적인 CH2-CH3 도메인의 아미노산 서열은 다음과 같다(SEQ ID NO:14):
Figure pct00001
IgG 중쇄 불변 영역의 잔기 넘버링은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991)에서와 같은 EU 인덱스를 따르며, 이것은 여기 참고로 포함된다. "Kabat에서와 같은 EU 인덱스"는 사람 IgG1 EU 항체의 넘버링을 말한다. 항체 불변 영역 내에서 다수의 상이한 위치에서 다형성이 관찰되었고(예를 들어, 제한은 아니지만 Kabat에 제시된 EU 인덱스에 의해 넘버링된 위치 270, 272, 312, 315, 356 및 358을 포함하는 Fc 위치들), 따라서 제시된 서열과 선행기술의 서열 간에 약간의 차이가 존재할 수 있다. 사람 면역글로불린의 다형성 형태는 잘 특정되었다. 현재 18개 Gm 알로타입이 알려져 있다: G1m(1, 2, 3, 17) 또는 G1m(a, x, f, z), G2m(23) 또는 G2m(n), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) 또는 G3m(b1, c3, b3, b0, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5)(Lefranc, et al., "The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis Of Structure, Function And Regulation." Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211). 본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 임의의 면역글로불린 유전자의 임의의 알로타입, 이소알로타입, 또는 하플로타입을 통합할 수 있다는 것이 구체적으로 고려되며, 여기 제공된 서열의 알로타입, 이소알로타입 또는 하플로타입에 제한되지 않는다. 또한, 일부 발현 시스템에서, CH3 도메인의 C-말단 아미노산 잔기(상기 굵은 글씨체)는 번역 후 제거될 수 있다. 따라서, CH3 도메인의 C-말단 잔기는 본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디에서 선택적인 아미노산 잔기이다. SEQ ID NO:14의 C-말단 잔기를 포함하는 예시적인 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디가 아래 제공된다. 또한, SEQ ID NO:14의 C-말단 리신 잔기를 결여한 이러한 구성물이 본 발명에 의해 구체적으로 포함된다.
제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬의 CH2 및/또는 CH3 도메인은 둘 다 SEQ ID NO:14, 또는 이것의 변이체으로 구성될 수도 있다.
특히, 본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디의 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬의 CH2-CH3 도메인은 FcγRIA(CD64), FcγRIIA(CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA(CD16a) 또는 FcγRIIIB(CD16b)에 대하여 감소된 결합(또는 실질적으로는 결합하지 않음)을 나타내는 것이 바람직하다(야생형 Fc 영역(SEQ ID NO:14)에 의해 나타난 결합에 비해). 이러한 변경된 결합을 중재할 수 있는 Fc 변이체 및 돌연변이 형태는 업계에 널리 공지되어 있고 위치 234 및 235에서 아미노산 치환, 위치 265에서 치환 또는 위치 297에서 치환을 포함하며, 여기서 상기 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스를 따른다(예를 들어, 미국 특허 제5,624,821호 참조, 본원에 참고로 포함됨). 바람직한 구체예에서, 본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디의 제1 및/또는 제3 폴리펩타이드 사슬의 CH2-CH3 도메인은 위치 234에서 알라닌으로 및 235에서 알라닌으로 치환을 포함하며, 여기서 상기 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스를 따른다.
제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬의 CH2 및/또는 CH3 도메인은 서열이 동일할 필요는 없고, 유리하게는 두 개의 폴리펩타이드 사슬 사이에서 복합체 형성을 촉진하도록 변형된다. 예를 들어, 아미노산 치환(바람직하게는 '놉(knob)'을 형성하는 부피가 큰 측기를 포함하는 아미노산, 예를 들어, 트립토판과의 치환)은 입체 간섭이 유사하게 돌연변이된 도메인과의 상호작용을 방지하고 돌연변이된 도메인이 상보적 돌연변이, 또는 수용 돌연변이가 조작된 도메인, 즉, '홀(hole)'(예를 들어, 글리신으로의 치환)과 쌍을 이루도록 강요되도록 도록 CH2 또는 CH3 도메인으로 도입될 수 있다. 돌연변이의 이러한 설정은 이중특이적 1가 Fc 디아바디 분자를 포함하는 폴리펩타이드의 임의의 쌍으로 조작될 수 있고, 또한 상기 쌍의 폴리펩타이드 사슬의 임의의 부분으로 조작될 수 있다. 호모다이머화보다 헤테로다이머화를 선호하는 단백질 조작 방법은 특히 면역글로불린-유사 분자에 관하여 업계에 널리 공지되어 있으며, 본원에 포함되어 있다(예를 들어, Ridgway et al. (1996) "'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization," Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) "Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library," J. Mol. Biol. 270: 26-35, 및 Xie et al. (2005) "A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization , Expression And Tumor Cell Lysis ," J. Immunol. Methods 296:95-101 참조; 이들 문헌의 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨). 바람직하게는 '놉'은 제1 폴리펩타이드 사슬의 CH2-CH3 도메인으로 조작되고 '홀'은 제3 폴리펩타이드 사슬의 CH2-CH3 도메인으로 조작된다. 따라서, '놉'은 제1 폴리펩타이드 사슬의 2개 분자가 그들의 CH2 및/또는 CH3 도메인을 통한 호모다이머화의 방지를 도울 것이다. 제3 폴리펩타이드 사슬은 바람직하게는 '홀' 치환을 함유하기 때문에, 그것은 제1 폴리펩타이드 사슬과 헤테로다이머화할 뿐 아니라 그 자체와 호모다이머화하는 능력을 가질 것이다(그러나, 이러한 호모다이머화는 에피토프-결합 부위를 지닌 분자를 형성하지 않는다). 바람직한 놉은 변형 T366W를 함유하도록 고유한 IgG Fc 도메인을 변형시킴으로써 생성된다. 바람직한 홀은 변형 T366S, L368A 및 Y407V를 함유하도록 고유한 IgG Fc 도메인을 변형시킴으로써 생성된다. 제1, 제2 및 제3 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 최종 이중특이적 1가 Fc 디아바디로부터 제3 폴리펩타이드 사슬 호모다이머의 정제를 돕기 위해서, 제3 폴리펩타이드 사슬의 CH2 및 CH3 도메인의 단백질 A 결합 부위는 바람직하게는 위치 435에서 아미노산 치환(H435R)에 의해 돌연변이된다. 따라서, 제3 폴리펩타이드 사슬 호모다이머는 단백질 A에 결합하지 않는 반면에, 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 제1 폴리펩타이드 사슬에서 단백질 A 결합 부위를 통해 단백질 A에 결합하는 능력을 보유할 것이다.
본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디의 제1 폴리펩타이드 사슬의 CH2 및 CH3 도메인에 바람직한 서열은 "놉-함유" 서열(SEQ ID NO:15)을 가질 것이다:
Figure pct00002
본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디의 제3 폴리펩타이드 사슬의 CH2 및 CH3 도메인에 바람직한 서열은 "홀-함유" 서열(SEQ ID NO:16)을 가질 것이다:
Figure pct00003
언급된 바와 같이, SEQ ID NO:15 및 SEQ ID NO:16의 CH2-CH3 도메인은 위치 234에서 알라닌으로 및 235에서 알라닌으로 치환을 포함하며, 따라서 Fc 도메인은 FcγRIA(CD64), FcγRIIA(CD32A), FcγRIIB(CD32B), FcγRIIIA(CD16a) 또는 FcγRIIIB(CD16b)에 대한 감소된 결합(또는 실질적으로 결합하지 않음)을 나타내는 Fc 도메인을 형성한다(야생형 Fc 영역(SEQ ID NO:14)에 의해 나타난 결합에 비해). 또한, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 및/또는 SEQ ID NO: 16의 C-말단 리신 잔기를 결여하는 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디 구성물이 본 발명에 의해 구체적으로 포함된다.
제1 폴리펩타이드 사슬은 "놉-함유" CH2-CH3 서열, 예컨대 SEQ ID NO:15의 서열을 갖는 것이 바람직하다. 하지만, 인식되는 바와 같이, "홀-함유" CH2-CH3 도메인 (예를 들어, SEQ ID NO:16)이 제1 폴리펩타이드 사슬에서 이용될 수 있으며, 이 경우에, "놉-함유" CH2-CH3 도메인(예를 들어, SEQ ID NO:15)은 제3 폴리펩타이드 사슬에서 이용될 것이다.
E. 바람직한 B7-H3 가변 도메인
임의의 항-B7-H3 항체의 항원-결합 도메인이 본 발명에 따라서 사용될 수 있다. 사람 B7-H7에 면역특이적인 예시적인 항체("B7-H3 mAb A", "B7-H3 mAb B", 및 "B7-H3 mAb C"로 지칭됨)가 아래 제공된다.
1. B7-H3 mAb A
B7-H3 mAb A의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:17)이 아래 제시된다(CDRL 잔기는 밑줄로 표시된다):
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITC KASQNVD TNVA WYQQKP GKAPKALIY S ASYRYS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YNNYPFT FGQ GTKLEIK
B7-H3 mAb A의 CDRL1:(SEQ ID NO:18) KASQNVDTNVA
B7-H3 mAb A의 CDRL2:(SEQ ID NO:19) SASYRYS
B7-H3 mAb A의 CDRL3:(SEQ ID NO:20) QQYNNYPFT
B7-H3 mAb A의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:21)이 아래 제시된다(CDRH 잔기는 밑줄로 표시된다):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMH WVRQA PGKGLEWVA Y ISSDSSAIYY ADTVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAVYYCGR GR ENIYYGSRLD Y WGQGTTVTV SS
B7-H3 mAb A의 CDRH1:(SEQ ID NO:22) SFGMH
B7-H3 mAb A의 CDRH2:(SEQ ID NO:23) YISSDSSAIYYADTVKG
B7-H3 mAb A의 CDRH3:(SEQ ID NO:24) GRENIYYGSRLDY
2. B7-H3 mAb B
B7-H3 mAb B의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:25)이 아래 제시된다(CDRH 잔기는 밑줄로 표시된다):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQDIS NYLN WYQQKP GKAPKLLIY Y TSRLHS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYC QQ GNTLPPT FGG GTKLEIK
B7-H3 mAb B의 CDRL1:(SEQ ID NO:26) RASQDISNYLN
B7-H3 mAb B의 CDRL2:(SEQ ID NO:27) YTSRLHS
B7-H3 mAb B의 CDRL3:(SEQ ID NO:28) QQGNTLPPT
B7-H3 mAb B의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:29)이 아래 제시된다(CDRH 잔기는 밑줄로 표시된다):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQ WVRQA PGQGLEWMG T IYPGDGDTRY TQKFKG RVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR RG IPRLWYFDV W GQGTTVTVSS
B7-H3 mAb B의 CDRH1:(SEQ ID NO:30) SYWMQ
B7-H3 mAb B의 CDRH2:(SEQ ID NO:31) TIYPGDGDTRYTQKFKG
B7-H3 mAb B의 CDRH3:(SEQ ID NO:32) RGIPRLWYFDV
3. B7-H3 mAb C
B7-H3 mAb C의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:33)이 아래 제시된다(CDRL 잔기는 밑줄로 표시된다):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQSIS SYLN WYQQKP GKAPKLLIY Y TSRLQS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYC QQ GNTLPPT FGG GTKLEIK
B7-H3 mAb C의 CDRL1:(SEQ ID NO:34) RASQSISSYLN
B7-H3 mAb C의 CDRL2:(SEQ ID NO:35) YTSRLQS
B7-H3 mAb C의 CDRL3:(SEQ ID NO:36) QQGNTLPPT
B7-H3 mAb C의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:37)이 아래 제시된다(CDRH 잔기는 밑줄로 표시된다):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQ WVRQA PGQGLEWMG T IYPGGGDTRY TQKFQG RVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR RG IPRLWYFDV W GQGTTVTVSS
B7-H3 mAb C의 CDRH1:(SEQ ID NO:38) SYWMQ
B7-H3 mAb C의 CDRH2:(SEQ ID NO:39) TIYPGGGDTRYTQKFQG
B7-H3 mAb C의 CDRH3:(SEQ ID NO:40) RGIPRLWYFDV
F. 바람직한 CD3 가변 도메인
임의의 항-CD3 항체의 항원-결합 도메인이 본 발명에 따라서 사용될 수 있다. 사람 CD3에 면역특이적인 예시적인 항체("CD3 mAb A"로 지칭됨)가 아래 제공된다.
CD3 mAb A의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:41)이 아래 제시된다(CDRL 잔기는 밑줄로 표시된다):
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TC RSSTGAVT TSNYAN WVQQ KPGQAPRGLI G GTNKRAP WT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWV F GGGTKLTVLG
CD3 mAb A의 CDRL1:(SEQ ID NO:42) RSSTGAVTTSNYAN
CD3 mAb A의 CDRL2:(SEQ ID NO:43) GTNKRAP
CD3 mAb A의 CDRL3:(SEQ ID NO:44) ALWYSNLWV
CD3 mAb A의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:45)이 아래 제시된다(CDRH 잔기는 밑줄로 표시된다):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT YYADSVKD RF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAY WGQGTL VTVSS
CD3 mAb A의 CDRH1:(SEQ ID NO:46) TYAMN
CD3 mAb A의 CDRH2:(SEQ ID NO:47) RIRSKYNNYATYYADSVKD
CD3 mAb A의 CDRH3:(SEQ ID NO:48) HGNFGNSYVSWFAY
특정 구체예에서, CD3 mAb A의 VH 도메인은 Kabat 위치 65에 아스파르테이트의 글리신 치환을 포함하며(D65G 치환, SEQ ID NO:45의 잔기 68에 상응한다), 이로써 CDRH2의 아미노산 서열은 RIRSKYNNYATYYADSVK G ( SEQ ID NO:49)가 된다. D65G 치환(SEQ ID NO:50)을 가진 CD3 mAb A의 VH 도메인의 아미노산 서열이 아래 제시된다(치환된 잔기는 밑줄로 표시된다):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT YYADSVK G RF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
III. 예시적인 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디
본 발명은 B7-H3와 CD3에 동시에 특이적으로 결합할 수 있는 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디를 제공한다. 상기 나타낸 대로, 본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 3개의 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. B7-H3과 CD3에 결합할 수 있는 예시적인 4개 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디("DART-A", "DART-B", "DART-C" 및 "DART-D로 지칭됨)의 폴리펩타이드 사슬이 아래 제공된다.
A. DART-A
DART-A의 제1 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단, B7-H3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인(VLB7 -H3 B7-H3 mAb A)(SEQ ID NO:17), 개재 링커 펩타이드(링커 1; GGGSGGGG(SEQ ID NO:1)), CD3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인(VHCD3 CD3 mAb A)(SEQ ID NO:45), 개재 링커 펩타이드(링커 2; GGCGGG(SEQ ID NO:2)), 헤테로다이머-촉진(E-코일) 도메인( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K(SEQ ID NO:10)), 개재 링커 펩타이드(스페이서-링커 3; GGGDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:5)), "놉-보유" Fc 도메인(SEQ ID NO:15), 및 C-말단을 포함한다.
따라서, DART-A의 제1 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:17 - SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:45 - SEQ ID NO:2 - SEQ ID NO:10 - SEQ ID NO:5 - SEQ ID NO:15로 이루어진다.
DDART-A의 제1 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:53)이다:
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKDRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGEVAA LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK
이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 예시적인 폴리뉴클레오타이드는 (SEQ ID NO:54)이다:
gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga cagagtgacc atcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg cctggtatca gcagaagcct ggcaaggccc ctaaggcgct gatctactcc gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc aggttctccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag ggcaccaagc tggaaatcaa gggaggcgga tccggcggcg gaggcgaggt gcagctggtg gagtctgggg gaggcttggt ccagcctgga gggtccctga gactctcctg tgcagcctct ggattcacct tcagcacata cgctatgaat tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtgggttg gaaggatcag gtccaagtac aacaattatg caacctacta tgccgactct gtgaaggata gattcaccat ctcaagagat gattcaaaga actcactgta tctgcaaatg aacagcctga aaaccgagga cacggccgtg tattactgtg tgagacacgg taacttcggc aattcttacg tgtcttggtt tgcttattgg ggacagggga cactggtgac tgtgtcttcc ggaggatgtg gcggtggaga agtggccgca ctggagaaag aggttgctgc tttggagaag gaggtcgctg cacttgaaaa ggaggtcgca gccctggaga aaggcggcgg ggacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa gccgcggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgtggt gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aa
DART-A의 제2 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단, CD3에 결합할 수있는 단클론성 항체의 VL 도메인(VLCD3 CD3 mAb A)(SEQ ID NO:41), 개재 링커 펩타이드(링커 1; GGGSGGGG(SEQ ID NO:1)), B7-H3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인(VHB7 -H3 B7-H3 mAb A)(SEQ ID NO:21), 개재 링커 펩타이드(링커 2; GGCGGG(SEQ ID NO:2)), 헤테로다이머-촉진(K-코일) 도메인( K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E(SEQ ID NO:11), 및 C-말단을 포함한다.
따라서, DART-A의 제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:41 - SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:21 - SEQ ID NO:2 - SEQ ID NO:11로 이루어진다.
DART-A의 제2 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:55)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGFTFSSF GMHWVRQAPG KGLEWVAYIS SDSSAIYYAD TVKGRFTISR DNAKNSLYLQ MNSLRDEDTA VYYCGRGREN IYYGSRLDYW GQGTTVTVSS GGCGGGKVAA LKEKVAALKE KVAALKEKVA ALKE
이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 예시적인 폴리뉴클레오타이드는 (SEQ ID NO:56)이다:
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggcgg aggcgaggtg cagctggtcg agtctggcgg aggactggtg cagcctggcg gctccctgag actgtcttgc gccgcctccg gcttcacctt ctccagcttc ggcatgcact gggtccgcca ggctccaggc aagggactgg aatgggtggc ctacatctcc tccgactcct ccgccatcta ctacgccgac accgtgaagg gcaggttcac catctcccgg gacaacgcca agaactccct gtacctgcag atgaactccc tgcgggacga ggacaccgcc gtgtactact gcggcagagg ccgggagaat atctactacg gctcccggct ggattattgg ggccagggca ccaccgtgac cgtgtcctcc ggaggatgtg gcggtggaaa agtggccgca ctgaaggaga aagttgctgc tttgaaagag aaggtcgccg cacttaagga aaaggtcgca gccctgaaag ag
DART-A의 제3 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단, 펩타이드(링커 3;DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:4)), "홀-보유" Fc 도메인(SEQ ID NO:16), 및 C-말단을 포함한다.
따라서, DART-A의 제3 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:4 - SEQ ID NO:16로 이루어진다.
DART-A의 제3 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:57)이다:
DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGK
이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 바람직한 폴리뉴클레오타이드는 (SEQ ID NO:58)이다:
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ccgcgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgagttg cgcagtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcgt cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accgctacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a
B. DART-B
DART-B의 제1 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단, B7-H3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인(VLB7 -H3 B7-H3 mAb B)(SEQ ID NO:25), 개재 링커 펩타이드(링커 1; GGGSGGGG(SEQ ID NO:1)), CD3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인(VHCD3 CD3 mAb A)(SEQ ID NO:45), 개재 링커 펩타이드(링커 2; GGCGGG(SEQ ID NO:2)), 헤테로다이머-촉진(E-코일) 도메인( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K(SEQ ID NO:10)), 개재 링커 펩타이드(스페이서-링커 3; GGGDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:5)), "놉-보유" Fc 도메인(SEQ ID NO:15), 및 C-말단을 포함한다.
따라서, DART-B의 제1 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:25 - SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:45 - SEQ ID NO:2 - SEQ ID NO:10 - SEQ ID NO:5 - SEQ ID NO:15로 이루어진다.
DART-B의 제1 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:59)이다:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKDRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGEVAA LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK
DART-B의 제2 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단, CD3에 결합할 수있는 단클론성 항체의 VL 도메인(VLCD3 CD3 mAb A)(SEQ ID NO:41), 개재 링커 펩타이드(링커 1; GGGSGGGG(SEQ ID NO:1)), B7-H3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인(VHB7 -H3 B7-H3 mAb A)(SEQ ID NO:29), 개재 링커 펩타이드(링커 2; GGCGGG(SEQ ID NO:2)), 헤테로다이머-촉진(K-코일) 도메인( K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E(SEQ ID NO:11), 및 C-말단을 포함한다.
따라서, DART-B의 제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:41 - SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:29 - SEQ ID NO:2 - SEQ ID NO:11로 이루어진다.
DART-B의 제2 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:60)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTSY WMQWVRQAPG QGLEWMGTIY PGDGDTRYTQ KFKGRVTITA DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCARRGIP RLWYFDVWGQ GTTVTVSSGG CGGGKVAALK EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE
DART-B의 제3 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단, 펩타이드(링커 3; DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:4)), "홀-보유" Fc 도메인(SEQ ID NO:16), 및 C-말단을 포함한다.
따라서, DART-B의 제3 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:4 - SEQ ID NO:16로 이루어지고, 상기 제공된 DART-A(SEQ ID NO:57)의 제3 폴리펩타이드와 동일한 아미노산 서열을 가진다.
C. DART-C
DART-C의 제1 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단, B7-H3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인(VLB7 -H3 B7-H3 mAb C)(SEQ ID NO:33), 개재 링커 펩타이드(링커 1; GGGSGGGG(SEQ ID NO:1)), CD3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인(D65G 치환을 가진 VHCD3 CD3 mAb A)(SEQ ID NO: 50), 개재 링커 펩타이드(링커 2; GGCGGG(SEQ ID NO:2)), 헤테로다이머-촉진(E-코일) 도메인( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K(SEQ ID NO:10)), 개재 링커 펩타이드(스페이서-링커 3; GGGDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:5)), "놉-보유" Fc 도메인(SEQ ID NO:15), 및 C-말단을 포함한다.
따라서, DART-C의 제1 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:33 - SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:50 - SEQ ID NO:2 - SEQ ID NO:10 - SEQ ID NO:5 - SEQ ID NO:15로 이루어진다.
DART-C의 제1 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:61)이다:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKGRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGEVAA LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK
DART-C의 제2 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단, CD3에 결합할 수있는 단클론성 항체의 VL 도메인(VLCD3 CD3 mAb A)(SEQ ID NO:41), 개재 링커 펩타이드(링커 1; GGGSGGGG(SEQ ID NO:1)), B7-H3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인(VHB7 -H3 B7-H3 mAb B)(SEQ ID NO:37), 개재 링커 펩타이드(링커 2; GGCGGG(SEQ ID NO:2)), 헤테로다이머-촉진(K-코일) 도메인( K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E(SEQ ID NO:11), 및 C-말단을 포함한다.
따라서, DART-C의 제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:41 - SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:37 - SEQ ID NO:2 - SEQ ID NO:11로 이루어진다.
DART-C의 제2 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:62)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTSY WMQWVRQAPG QGLEWMGTIY PGGGDTRYTQ KFQGRVTITA DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCARRGIP RLWYFDVWGQ GTTVTVSSGG CGGGKVAALK EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE
DART-C의 제3 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단, 펩타이드(링커3; DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:4)), "홀-보유" Fc 도메인(SEQ ID NO:16), 및 C-말단을 포함한다.
따라서, DART-C의 제3 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:4 - SEQ ID NO:16로 이루어지고, 상기 제공된 DART-A(SEQ ID NO:57)의 제3 폴리펩타이드와 동일한 아미노산 서열을 가진다.
D. DART-D
예시적인 DART-D의 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬의 일반적인 구조는 DART-D가 시스테인 잔기를 결여한 대안적인 링커 2를 포함하고, 시스테인-함유 헤테로다이머-촉진 도메인을 포함한다는 것을 제외하고는 DART-A, DART-B 및 DART-C와 동일하다. DART-D의 제1 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단, B7-H3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인(VLB7 -H3 B7-H3 mAb C)(SEQ ID NO:33), 개재 링커 펩타이드(링커 1; GGGSGGGG(SEQ ID NO:1)), CD3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인(D65G 치환을 가진 VHCD3 CD3 mAb A)(SEQ ID NO: 50), 개재 링커 펩타이드(링커 2; ASTKG(SEQ ID NO:3)), 헤테로다이머-촉진(E-코일) 도메인( E VAAC E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K(SEQ ID NO:12)), 개재 링커 펩타이드(스페이서-링커 3; GGGDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:5)), a "놉-보유" Fc 도메인(SEQ ID NO:15), 및 C-말단을 포함한다.
따라서, DART-D의 제1 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:33 - SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:50 - SEQ ID NO:3 - SEQ ID NO:12 - SEQ ID NO:5 - SEQ ID NO:15로 이루어진다.
DART-D의 제1 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:63)이다:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKGRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS ASTKGEVAAC EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK
DART-D의 제2 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단, CD3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인(VLCD3 CD3 mAb C)(SEQ ID NO: 41), 개재 링커 펩타이드(링커 1; GGGSGGGG(SEQ ID NO:1)), B7-H3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인(VHB7 -H3 B7-H3 mAb B)(SEQ ID NO:37), 개재 링커 펩타이드(링커2; ASTKG(SEQ ID NO:3)), 헤테로다이머-촉진(K-코일) 도메인( K VAAC K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E(SEQ ID NO:13), 및 C-말단을 포함한다.
따라서, DART-C의 제2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:41 - SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:37 - SEQ ID NO:3 - SEQ ID NO:13로 이루어진다.
DART-D의 제2 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:64)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTSY WMQWVRQAPG QGLEWMGTIY PGGGDTRYTQ KFQGRVTITA DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCARRGIP RLWYFDVWGQ GTTVTVSSAS TKGKVAACKE KVAALKEKVA ALKEKVAALK E
제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬은 상이한 링커와 헤테로다이머-촉진 도메인을 통합하지만, DART-D의 제3 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단, 펩타이드(링커 3; DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:4)), "홀-보유" Fc 도메인(SEQ ID NO:16), 및 C-말단을 포함한다.
따라서, DART-D의 제3 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:4 - SEQ ID NO:16로 이루어지고, 상기 제공된 DART-A(SEQ ID NO:57)의 제3 폴리펩타이드와 동일한 아미노산 서열을 가진다.
IV. 대조군 DART® 디아바디
본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디의 특성을 더 유의미하게 증명하기 위해, 플루오레세인 및 CD3에 결합할 수 있는 대조군 이중특이적 1가 Fc 디아바디가 구성되었다("대조군 DART"로 지칭됨).
대조군 DART®을 형성하기 위해 사용된 항-플루오레세인 항체는 대조군 디아바디에 사용된 항체 4-4-20였다(Gruber, M. et al.(1994) "Efficient Tumor Cell Lysis Mediated By A Bispecific Single Chain Antibody Expressed In Escherichia coli," J. Immunol. 152(11):5368-5374; Bedzyk, W.D. et al.(1989) "Comparison Of Variable Region Primary Structures Within An Anti- Fluorescein Idiotype Family," J. Biol. Chem. 264(3): 1565-1569). 항-플루오레세인 항체 4-4-20의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인의 아미노산 서열은 다음과 같다:
항-플루오레세인 항체 4-4-20의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:65)이 아래 제시된다(CDRH 잔기는 밑줄로 표시된다):
DVVMTQTPFS LPVSLGDQAS ISC RSSQSLV HSNGNTYLR W YLQKPGQSPK VLIY KVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFC SQSTHVP W TFGGGTKLE IK
항-플루오레세인 항체 4-4-20의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:66)이 아래 제시된다(CDRH 잔기는 밑줄로 표시된다):
EVKLDETGGG LVQPGRPMKL SCVASGFTFS DYWM NWVRQS PEKGLEWVA Q IRNKPYNYET YYSDSVKG RF TISRDDSKSS VYLQMNNLRV EDMGIYYCTG SYYGMDY WGQ GTSVTVSS
대조군 DART의 제1 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단, 플루오레세인에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인(VLFluor 4-4-20)(SEQ ID NO:65), 개재 링커 펩타이드(링커 1; GGGSGGGG(SEQ ID NO:1)), CD3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인(D65G 치환을 가진 VHCD3 CD3 mAb A)(SEQ ID NO:50), 개재 링커 펩타이드(링커 2; GGCGGG(SEQ ID NO:2)), 헤테로다이머-촉진(E-코일) 도메인( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K(SEQ ID NO:10)), 개재 링커 펩타이드(스페이서-링커 3; GGGDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:5)), "놉-보유" Fc 도메인(SEQ ID NO:15), 및 C-말단을 포함한다.
따라서, 대조군 DART의 제1 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:65 - SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:50 - SEQ ID NO:2 - SEQ ID NO:10 - SEQ ID NO:5 - SEQ ID NO:15로 이루어진다.
대조군 DART의 제1 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은(SEQ ID NO:67)이다:
DVVMTQTPFS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSNGNTYLRW YLQKPGQSPK VLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP WTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSSGGCGG GEVAALEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEKG GGDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK
대조군 DART의 제2 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단, CD3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인(VLCD3 CD3 mAb A)(SEQ ID NO:37), 개재 링커 펩타이드(링커 1; GGGSGGGG(SEQ ID NO:1)), 플루오레세인에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인(VHfluor 4-4-20)(SEQ ID NO:65), 개재 링커 펩타이드(링커 2; GGCGGG(SEQ ID NO:2)), 헤테로다이머-촉진(K-코일) 도메인( K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E(SEQ ID NO:11), 및 C-말단을 포함한다.
따라서, 대조군 DART의 제2 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:37 - SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:65 - SEQ ID NO:2 - SEQ ID NO:11로 이루어진다.
대조군 DART의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은(SEQ ID NO:68)이다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV KLDETGGGLV QPGRPMKLSC VASGFTFSDY WMNWVRQSPE KGLEWVAQIR NKPYNYETYY SDSVKGRFTI SRDDSKSSVY LQMNNLRVED MGIYYCTGSY YGMDYWGQGT SVTVSSGGCG GGKVAALKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE
대조군 DART의 제3 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단, 펩타이드(링커 3; DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:4)), "홀-보유" Fc 도메인(SEQ ID NO:16), 및 C-말단을 포함한다.
따라서, 대조군 DART의 제3 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:4 - SEQ ID NO:16로 이루어지고, 상기 제공된 DART-A(SEQ ID NO:57)의 제3 폴리펩타이드와 동일한 아미노산 서열을 가진다.
V. 제약학적 조성물
본 발명의 조성물은 제약학적 조성물(예를 들어, 불순한 또는 비-멸균 조성물) 및 단위 투약 형태의 제조에 사용될 수 있는 제약학적 조성물(즉, 대상 또는 환자에게 투여에 적합한 조성물)의 제조에 유용한 벌크 약물 조성물을 포함한다. 이러한 조성물은 본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디, 또는 이러한 제제와 제약학적으로 허용되는 담체의 조합을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디의 예방적 또는 치료적 유효량 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디와 면역 반응(예를 들어, 면역 체크포인트 억제인자)을 자극하는데 효과적인 하나 이상의 추가의 분자를 포함하는 및/또는 적어도 하나의 특정 암 항원에 특이적인 암 항원(예를 들어, 종양 특이적 단클론성 항체 또는 디아바디)에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 추가의 분자와 제약학적으로 허용되는 담체와 조합된 제약학적 조성물을 포함한다. 여기 사용된 바와 같은, 용어 "암 항원"은 종양 세포의 표면에서 특징적으로 발현되는 항원을 표시한다. 암 항원의 예들은 A33(결장직장 암종 항원; Almqvist, Y. 2006, NuclMed Biol. Nov;33(8):991-998); B1(Egloff, A.M. et al. 2006, Cancer Res. 66(1):6-9); BAGE(Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84); 베타-카테닌(Prange W. et al. 2003 J Pathol . 201(2):250-9); CA125(Bast, R.C. Jr. et al. 2005 Int J Gynecol Cancer 15 Suppl3:274-81); CD5(Calin, G.A. et al. 2006 Semin Oncol. 33(2):167-73; CD19(Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48); CD20(Thomas, D.A. et al. 2006 Hematol Oncol Clin North Am. 20(5):1125-36); CD22(Kreitman, R.J. 2006 AAPS J. 18;8(3):E532-51); CD23(Rosati, S. et al. 2005 CurrTop Microbiol Immunol. 5;294:91-107); CD25(Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48); CD27(Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9):1234-40); CD28(Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9):1234-40); CD36(Ge, Y. 2005 Lab Hematol. 11(1):31-7); CD40/CD154(Messmer, D. et al. 2005 Ann N Y Acad Sci. 1062:51-60); CD45(Jurcic, J.G. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):339-46); CD56(Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9):1234-40); CD79a/CD79b(Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48; Chu, P.G. et al. 2001 Appl Immunohistochem Mol Morphol. 9(2):97-106); CD103(Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48); CDK4(Lee, Y.M. et al. 2006 Cell Cycle 5(18):2110-4); CEA(암배아 항원; Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46; Tellez-Avila, F.I. et al. 2005 Rev Invest Clin. 57(6):814-9); CTLA4(Peggs, K.S. et al. 2006 CurrOpin Immunol . 18(2):206-13); EGF-R(표피 성장인자 수용체; Adenis, A. et al. 2003 BullCancer. 90 Spec No:S228-32); Erb(ErbB1; ErbB3; ErbB4; Zhou, H. et al. 2002 Oncogene 21(57):8732-40; Rimon, E. et al. 2004 Int J Oncol. 24(5):1325-38); GAGE(GAGE-1; GAGE-2; Akcakanat, A. et al. 2006 Int J Cancer. 118(1):123-8); GD2/GD3/GM2(Livingston, P.O. et al. 2005 Cancer Immunol Immunother. 54(10):1018-25); gp100(Lotem, M. et al. 2006 J Immunother. 29(6):616-27); HER-2/neu(Kumar, Pal S et al. 2006 Semin Oncol. 33(4):386-91); 사람 유두종 바이러스-E6/사람 유두종 바이러스-E7(DiMaio, D. et al. 2006 Adv Virus Res. 66:125-59; KSA(17-1A)(Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-80); MAGE(MAGE-1; MAGE-3; (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84); MART(Kounalakis, N. et al. 2005 CurrOncol Rep. 7(5):377-82; MUC-1(Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46); MUM-1(Castelli, C. et al. 2000 J Cell Physiol. 182(3):323-31); N-아세틸글루코사민일 트랜스페라아제(Dennis, J.W. 1999 Biochim Biophys Acta. 6;1473(1):21-34); p15(Gil, J. et al. 2006 Nat Rev Mol Cell Biol. 7(9):667-77); PSA(전립선 특이적 항원; Cracco, C.M. et al. 2005 Minerva Urol Nefrol. 57(4):301-11); PSMA(Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-80); sTn(Holmberg, L.A. 2001 Expert Opin Biol Ther. 1(5):881-91); TNF-수용체(TNF-α 수용체, TNF-β 수용체; 또는 TNF-γ 수용체; van Horssen, R. et al. 2006 Oncologist. 11(4):397-408; Gardnerova, M. et al. 2000 CurrDrug Targets. 1(4):327-64); VEGF 수용체(O'Dwyer. P.J. 2006 Oncologist. 11(9):992-8); ADAM-9(미국 특허 공개 No. 2006/0172350; PCT 공개 No. WO 06/084075); ALCAM(PCT 공개 No. WO 03/093443); 카복시펩티다아제 M(미국 특허 공개 No. 2006/0166291); CD46(미국 특허 No. 7,148,038; PCT 공개 No. WO 03/032814); 시토케라틴 8(PCT 공개 No. WO 03/024191); Ephrin 수용체(및 특히 EphA2(미국 특허 No. 7,569,672; PCT 공개 No. WO 06/084226); 인테그린 알파-V-베타-6(PCT 공개 No. WO 03/087340); JAM-3(PCT 공개 No. WO 06/084078); KID3(PCT 공개 No. WO 05/028498); KID31(PCT 공개 No. WO 06/076584); LUCA-2(미국 특허 공개 No. 2006/0172349; PCT 공개 No. WO 06/083852); 온코스타틴 M(온코스타틴 수용체 베타)(미국 특허 No. 7,572,896; PCT 공개 No. WO 06/084092); PIPA(미국 특허 No. 7,405,061; PCT 공개 No. WO 04/043239); ROR1(미국 특허 No. 5,843,749); 및 트랜스페린 수용체(미국 특허 No. 7,572,895; PCT 공개 No. WO 05/121179)를 포함한다.
특정 구체예에서, 용어 "제약학적으로 허용되는"은 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 또는 미국 약전 또는 동물, 및 더 특별하게는 사람에 사용되는 다른 일반적으로 인정되는 약전에서 나열된 것을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보조제(예를 들어, 프로인트 보조제(완전 및 불완전), 부형제 또는 비히클을 말한다. 이러한 제약학적 담체는 멸균 액체, 예컨대 물 및 오일일 수 있고, 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 예컨대 땅콩 오일, 대두 오일, 미네랄 오일, 참깨 오일 등을 포함한다. 식염수 용액, 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액과 같은 수성 담체는 제약학적 조성물이 정맥내 투여될 때 바람직하다. 적합한 제약학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 나트륨 클로라이드, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은 또한, 원하는 경우, 소량의 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 타블렛, 알약, 캡슐, 분말, 서방형 제형 등의 형태를 취할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 조성물의 성분은 별도로 공급되거나 또는 단위 투약 형태로, 예를 들어, 활성제의 양을 표시하는 밀폐된 용기, 예컨대 앰플 또는 사세 내 동결건조된 분말 또는 무수 농축물로서 함께 혼합된다. 조성물이 투입에 의해 투여되는 경우에, 그것은 멸균 제약학적 등급 물 또는 식염수를 함유하는 투입 병으로 제공될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우에, 성분들이 투여 전에 혼합될 수 있도록 멸균 주사용수 또는 식염수의 앰플이 제공될 수 있다.
본 발명의 조성물은 중성 또는 염 형태로서 제형화될 수 있다. 제약학적으로 허용 가능한 염은 음이온으로 형성된 것들, 예컨대 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 등으로부터 유래된 것들, 및 양이온으로 형성된 것들, 예컨대 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화 철, 아이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인, 등으로부터 유래된 것들을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디를 단독으로 또는 다른 제제, 바람직하게 제약학적으로 허용되는 담체와 함께 함유하는 하나 이상의 용기를 포함하는 제약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 추가로, 질환의 치료에 유용한 하나 이상의 다른 예방제 또는 치료제가 또한 제약학적 팩 또는 키트에 포함될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 제약학적 조성물의 성분들 중 하나 이상으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 제약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 치료제 또는 생물학적 생성물의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 통지는 이러한 용기(들)과 선택적으로 연관성이 있을 수 있으며, 이 통지는 사람 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매에 관한 기관의 승인을 반영한다.
키트는 본 발명의 B7-H3 x CD3 이중-특이적 1가 Fc 디아바디를 포함할 수 있다. 키트는 하나 이상의 용기 내에 암 치료에 유용한 하나 이상의 다른 예방제 및/또는 치료제를 더 포함할 수 있고; 및/또는 키트는 하나 이상의 암 항원에 결합하는 하나 이상의 세포독성 항체를 더 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 다른 예방제 또는 치료제는 화학치료제이다. 다른 구체예에서, 예방제 또는 치료제는 생물학적 치료제 또는 호르몬 치료제이다.
VI. 투여 방법
본 발명의 조성물은 대상에게 본 발명의 분자, 또는 본 발명의 분자를 포함하는 제약학적 조성물의 유효량을 투여함으로써 암 또는 다른 질환, 또는 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 치료, 예방, 및 개선을 위해 제공될 수도 있다. 바람직한 양태에서, 이러한 이러한 조성물은 실질적으로 정제된다(즉, 효과를 제한하거나 원치않는 부작용을 생성하는 물질이 실질적으로 없음). 특정 구체예에서, 대상은 동물, 바람직하게는 포유동물, 예컨대 비-영장류(예를 들어, 소, 말, 고양이, 개, 설치류, 등) 또는 영장류(예를 들어, 원숭이, 예컨대 게잡이 원숭이, 사람, 등)이다. 바람직한 구체예에서, 대상은 사람이다.
다양한 전달 시스템, 예를 들어, 리포솜, 미세입자, 마이크로캡슐, 항체 또는 융합 단백질을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-중재된 세포 내 섭취(endocytosis)(예를 들어, Wu et al. (1987) "Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System," J. Biol. Chem. 262:4429-4432 참조), 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서 핵산의 구조, 등에 캡슐화가 공지되어 있으며 본 발명의 분자 및 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 분자를 투여하는 방법은 비경구 투여(예를 들어, 피내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내 및 피하), 경막 외, 및 점막(예를 들어, 비강 내 및 경구 투여)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 구체예에서, 본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 근육 내로, 정맥 내로, 또는 피하로 투여된다. 조성물은 임의의 편리한 경로로, 예를 들어, 투입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막 피부 라이닝(예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막, 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수도 있고 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수도 있다. 투여는 전신 또는 국소적일 수 있다. 이에 더하여, 예를 들어, 흡입기 또는 분무기, 및 에어로졸화제를 이용한 제형의 사용에 의한 폐 투여가 또한 이용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,019,968호; 제5,985,320호; 제5,985,309호; 제5,934,272호; 제5,874,064호; 제5,855,913호; 제5,290,540호; 및 제4,880,078호; PCT 공개 제WO 92/19244호; 제WO 97/32572호; 제WO 97/44013호; 제WO 98/31346호; 및 제WO 99/66903호 참조, 이것들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨).
본 발명은 또한 본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디가 분자의 양을 표시하는 밀폐된 용기, 예컨대 앰플 또는 사세에 포장된다는 것을 제공한다. 한 구체예에서, 본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 밀폐된 용기 내 멸균 동결건조된 분말 또는 무수 농축물로서 공급되고, 예를 들어, 물 또는 식염수를 이용하여 대상으로의 투여에 적절한 농도로 복원될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 밀폐된 용기 내 멸균 동결건조된 분말로서 공급된다.
본 발명의 동결건조된 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 원래 용기에서 2 내지 8℃에서 저장되어야 하고 분자들은 복원 후 12시간 내, 바람직하게는 6시간 내, 5시간 내, 3시간 내, 또는 1시간 내에 투여되어야 한다. 대안의 구체예에서, 본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 분자, 융합 단백질, 또는 컨쥬게이션된 분자의 양 및 농도를 표시하는 밀폐된 용기에서 액체 형태로 공급된다. 바람직하게는, 본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디의 액체 형태가 밀폐된 용기에 제공된다.
장애와 관련된 하나 이상의 증상의 치료, 예방 또는 개선에 효과적인 본 발명의 조성물의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 제형에 이용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 상태의 심각성에 따를 것이며, 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효량은 시험관 내 또는 동물 모델 테스트 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 추정될 수도 있다.
여기 사용된 바와 같은, 제약학적 조성물의 "유효량"은, 한 구체예에서, 제한은 없지만, 질환으로 인해 생긴 증상의 감소, 질환의 증상(예를 들어, 암세포의 증식, 종양 존재, 종양 전이 등)을 약화시킴으로써 질환으로 고통받는 대상들의 삶의 질의 증가, 질환을 치료하는데 필요한 다른 의약의 용량의 감소, 표적화 및/또는 중화를 통해서 등 다른 의약의 효과의 증진, 질환 진행의 지연, 및/또는 개체의 생존의 연장과 같은 임상 결과를 포함하여 유리한 또는 원하는 결과를 행하기에 충분한 양이다.
이러한 유효량은 1회 이상의 투여에서 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 약물, 화합물 또는 제약학적 조성물의 유효량은 바이러스의 존재의 증식(또는 효과)를 감소시키고, 직접적으로 또는 간접적으로 질환(예를 들어, 암)의 발생을 감소 및/또는 지연시키기에 충분한 양이다. 일부 구체예에서, 약물, 화합물 또는 제약학적 조성물의 유효량은 다른 약물, 화합물 또는 제약학적 조성물과 함께 달성될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 따라서, "유효량"은 하나 이상의 화학치료제를 투여하는 관점에서 고려될 수 있고, 단일 제제는 하나 이상의 다른 제제와 함께 바람직한 결과가 달성될 수 있거나 달성된다면 유효량으로 제공된다고 고려될 수 있다. 개체에 따라 변하지만 각 성분의 유효량의 최적 범위의 결정은 당업계의 기술 범위 내이다.
본 발명에 의해 포함되는 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디의 경우, 환자에 투여되는 용량은 바람직하게 수혜 대상의 체중(kg)에 기초하여 결정된다. 투여된 용량은 전형적으로 대상의 체중을 기준으로 적어도 약 0.01 ㎍/kg, 적어도 약 0.05 μg/kg, 적어도 약 0.1 ㎍/kg, 적어도 약 0.2 ㎍/kg, 적어도 약 0.5 ㎍/kg, 적어도 약 1 ㎍/kg, 적어도 약 2 ㎍/kg, 적어도 약 3 ㎍/kg, 적어도 약 5 ㎍/kg, 적어도 약 10 ㎍/kg, 적어도 약 20 ㎍/kg, 적어도 약 30 ㎍/kg, 적어도 약 50 ㎍/kg, 적어도 약 0.1 mg/kg, 적어도 약 0.15 mg/kg, 적어도 약 0.2 mg/kg, 적어도 약 0.5 mg/kg, 적어도 약 1.0 mg/kg, 또는 그 이상이다.
본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디의 치료적 또는 예방적 유효량에 의한 대상의 치료는 단일 치료, 또는 바람직하게 동일하거나 상이한 용량을 수반할 수 있는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 예를 들어, 대상은 약 2 내지 약 120주 동안, 또는 120주를 초과하여 주 1회 또는 2주마다 1회 본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디로 치료될 수 있다. 치료를 위해 사용되는 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디의 유효량은 특정 치료 과정에 걸쳐서 증가하거나 감소할 수 있다는 것이 인정될 것이다.
바람직하게, B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 1회 이상의 용량을 포함하는 치료 섭생의 과정을 사용하여 투여되며(이것은 그대로 유지될 수 있거나, 또는 치료에 대한 대상의 반응에 따라서 증가하거나 감소할 수 있다), 여기서 치료 섭생은 2주, 3주, 4주, 6주, 8주에 걸쳐서 또는 8주를 초과하여 투여된다. 전형적으로, 1, 2, 3, 4, 5 또는 5회를 초과하는 치료 과정이 있다. 각 치료 과정은 임의의 이전 섭생과 동일하거나 상이할 수 있다.
특정 구체예에서, 용량 섭생은 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디가 2주마다(즉, 격주 1회) 대상에 투여되는 처음 6주 사이클, 이후 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디가 2주마다 대상에 투여되는 1회 이상의 8주 사이클을 포함한다. 특정 구체예에서, 처음의 6주 사이클 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 14회를 넘는 8주 사이클이 이어진다.
특정 구체예에서, 대상에 투여된, B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디의 용량은 적어도 약 0.1 ㎍/kg, 0.3 ㎍/kg, 1.3 ㎍/kg, 3 ㎍/kg, 10 ㎍/kg, 30 ㎍/kg, 또는 100 ㎍/kg(대상의 체중)이다. 계산된 용량은 베이스라인에서 환자의 체중을 기준으로 투여될 것이다. 그러나, 베이스라인에서 체중에 유의한 변화(≥10%) 또는 확립된 평탄한 체중은 투여된 용량의 재계산을 촉구한다.
본 발명의 H7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디의 투약량 및 투여 빈도는 변형, 예컨대, 예를 들어, 지질화에 의해 H7-H3 x CD3 이중-특이적 1가 Fc 디아바디의 흡수 및 조직 침투를 향상시킴으로써 감소되거나 변화될 수도 있다.
환자에게 투여되는 본 발명의 H7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디의 투약량은 단일 작용제 치료법으로서 사용을 위해 계산될 수도 있다. 대안으로, 본 발명의 H7-H3 x CD3 이중-특이적 1가 Fc 디아바디는 다른 치료 조성물과 조합하여 사용되며, 이 경우 환자에게 투여되는 투약량 상기 분자가 단일 작용제 치료법으로서 사용될 때보다 더 낮다.
본 발명의 제약학적 조성물은 치료가 필요한 영역에 국소적으로 투여될 수도 있고; 이것은 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 국소적 투입, 주사, 또는 임플란트에 의해 달성될 수도 있으며, 상기 임플란트는 막, 예컨대 실라스틱 막, 또는 섬유를 포함하는 다공성, 비-다공성, 또는 젤라틴 물질이다. 바람직하게는, 본 발명의 분자를 투여할 때, 분자가 흡수되지 않는 물질을 사용하기 위해서는 주의를 기울여야 한다.
본 발명의 조성물은 소포, 특히 리포솜에서 전달될 수 있다(Langer (1990) "New Methods Of Drug Delivery," Science 249:1527-1533); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353- 365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 3 17-327 참조).
본 발명의 조성물은 제어된-방출 또는 서방형 시스템으로 전달될 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 임의의 기술이 본 발명의 하나 이상의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디를 포함하는 서방형 제형을 생산하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제4,526,938호; PCT 공개 제WO 91/05548호; PCT 공개 제WO 96/20698호; Ning et al. (1996) " Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; 및 Lam et al. (1997) "Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760 참조, 이것들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 한 구체예에서, 제어된-방출 시스템에서는 펌프가 사용될 수도 있다 (Langer, supra; Sefton, (1987) " Implantable Pumps," CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwald et al. (1980) "Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis," Surgery 88:507-516; 및 Saudek et al. (1989) "A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery," N. Engl. J. Med. 321:574-579 참조). 또 다른 구체예에서, 폴리머 물질이 분자의 제어된-방출을 달성하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Levy et al. (1985) "Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate," Science 228:190-192; During et al. (1989) "Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization," Ann. Neurol. 25:351-356; Howard et al. (1989) " Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits," J. Neurosurg. 7(1):105-112); 미국 특허 번호 제5,679,377호; 미국 특허 번호 제5,916,597호; 미국 특허 번호 제5,912,015호; 미국 특허 번호 제5,989,463호; 미국 특허 번호 제5,128,326호; PCT 공개 번호 제WO 99/15154호; 및 PCT 공개 번호 제WO 99/20253호 참조). 서방형 제형에 사용된 폴리머의 예는 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜리드 (PLG), 폴리무수물, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알콜), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락티드 (PLA), 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLGA), 및 폴리오르토에스터를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 제어된-방출 시스템은 치료 표적 (예를 들어, 폐)에 근접하게 배치될 수 있으며, 따라서 전신 용량의 일부만을 필요로 한다 (예를 들어, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984) 참조). 제어된-방출 임플란트로서 유용한 폴리머 조성물은 Dunn et al.에 따라 사용될 수 있다 (U.S. 제5,945,155호 참조). 이 특정 방법은 폴리머 시스템으로부터 생체 활성 물질의 제자리(in situ) 제어된-방출의 치료 효과를 기반으로 한다. 이식은 일반적으로 치료적 처치가 필요한 환자의 체내 어느 곳에서도 일어날 수 있다. 비-폴리머 지속적 전달 시스템이 사용될 수 있으며, 이로 인해 대상의 체내에서 비-폴리머 임플란트가 약물 전달 시스템으로서 사용된다. 체내에 이식할 때, 임플란트의 유기 용매는 소멸되거나, 분산되거나, 또는 조성물로부터 주위의 조직액으로 침출될 것이고, 비-폴리머 물질은 점진적으로 응고되거나 침전되어 고형물, 미소다공성 매트릭스를 형성한다 (U.S. 제5,888,533호 참조).
제어된-방출 시스템은 Langer에 의한 리뷰에서 논의된다 (1990, "New Methods Of Drug Delivery," Science 249:1527-1533). 당업자에게 공지되어 있는 임의의 기술들은 본 발명의 하나 이상의 치료적 작용제를 포함하는 서방형 제형을 생산하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제4,526,938호; 국제 공개 번호 제WO 91/05548호 및 제WO 96/20698호; Ning et al. (1996) " Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; 및 Lam et al. (1997) " Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760 참조, 이들 문헌의 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 조성물이 본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디를 암호화하는 핵산인 경우, 핵산은 그것의 암호화된 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디의 발현을 촉진하기 위해, 상기 디아바디를 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 구성하고 세포 내로 들어가도록 그것을 투여함으로써, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터의 사용 (미국 특허 번호 제4,980,286호 참조), 또는 직접적인 주사, 또는 미세입자 충격 (예를 들어, 유전자 총; Biolistic, Dupont), 또는 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 트랜스펙션제로의 코팅에 의해, 또는 핵으로 들어가는 것으로 알려져 있는 호메오박스-유사 펩타이드와 결합시켜 상기 디아바디의 투여 (예를 들어, Joliot et al. (1991) "Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis ," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1864-1868 참조), 등에 의해, 생체 내로 투여될 수 있다. 대안으로, 핵산은 세포 내로 도입되고 상동 재조합에 의한 발현을 위해 숙주 세포 DNA 내로 포함될 수 있다.
본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디의 치료적 또는 예방적 유효량으로 대상의 치료는 단일 치료를 포함할 수 있거나, 바람직하게는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 바람직한 예에서, 대상은 이러한 디아바디로 약 1 내지 52주 동안 주 1회, 2주마다 1회(즉, 격주 1회), 또는 3주마다 1회 치료된다. 본 발명의 본 발명의 제약학적 조성물은 하루 1회, 하루 2회, 또는 하루 3회 투여될 수 있다. 대안으로, 제약학적 조성물은 주 1회, 주 2회, 2주마다 1회, 월 1회, 6주마다 1회, 2달마다 1회, 연 2회 또는 연 1회 투여될 수 있다. 또한 치료에 사용된 분자의 유효량은 특정 치료 과정에 걸쳐 증가하거나 감소될 수도 있음을 알 수 있다.
VII. 본 발명의 조성물의 사용
본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 B7-H3-발현 세포에 대해 T 세포를 공-국소화하는 능력을 가지며, 따라서 B7-H3의 발현과 관련되거나 그것을 특징으로 하는 임의의 질환 또는 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 따라서, 제한은 없지만, 이러한 분자를 포함하는 제약학적 조성물은 암세포, 제한은 아니지만 급성 골수성 백혈병, 부신 종양, AIDS- 관련 암, 치조 연부 육종, 성상 세포 종양, 방광암, 골암, 뇌척수암, 전이성 뇌종양, 유방암, 경동맥 소체 종양, 자궁경부암, 연골육종, 척삭종, 혐색소성 신장세포 암종, 투명세포 암종, 결장암, 결장직장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 결합조직성 소원형세포종양, 상의세포종, 유잉 종양, 골외 점액성 연골육종, 골성 불완전 섬유원증, 뼈의 섬유 이형성증, 담낭 또는 담즙관 암, 위암, 임신성 영양막 질환, 생식세포 종양, 두경부암, 간세포 암종, 교모세포종, 섬세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방 육종/악성 지방종성 종양, 간암, 림프종, 폐암, 수모세포종, 흑색종, 수막종, 악성 중피종, 다발성 내분비 신생물, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 신경아세포종, 신경내분비 종양, 비-소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 인두암, 유두 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아암, 말초신경집 종양, 갈색세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후방 포도막 흑색종, 희귀 혈액학적 장애, 신장세포 암종, 신장의 전이성 암, 간상소체 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연조직 육종, 편평세포암, 위암, 활액 육종, 고환암, 흉선 암종, 흉선종, 갑상선의 전이성 암, 및 자궁암의 세포의 존재를 특징으로 하는 암을 포함하는 암의 진단 또는 치료에 이용될 수 있다.
특히, 본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 두경부암의 편평세포암(SCCHN), 방광암, 유방암, 결장직장암, 위암, 교모세포종, 신장암, 비-소세포 폐암(NSCLC)을 포함하는 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 인두암, 전립선암, 신장세포 암종, 및 신경아세포종 및 횡문근육종을 포함하는 소아의 작은 원형 청색 세포 종양의 치료에 유용하며, 이들 각각은 B7-H3을 높게 발현한다.
추가로, 본 발명의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 상기 설명된 상태의 치료를 위한 의약의 제조에서 사용될 수 있다.
이제 본 발명이 일반적으로 설명되는데, 그것은 예시로서 제공되며 명시되지 않는다면 본 발명을 제한하려는 의도가 없는 아래의 구체예들을 참조하여 더욱 쉽게 이해될 것이다.
본 발명의 구체예
본 발명의 특정 구체예들의 비제한적 실시예가 아래 제공된다.
구체예 1:
B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디, 상기 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 B7-H3의 에피토프 및 CD3의 에피토프에 특이적 결합할 수 있고, IgG Fc 도메인을 지니며, 상기 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 제1 폴리펩타이드 사슬, 제2 폴리펩타이드 사슬 및 제3 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬은 서로 공유 결합되며, 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬은 서로 공유 결합되고,
I. 제1 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로:
A. 도메인 IA: 도메인 IA는
(1) B7-H3(VLB7 -H3) 또는 CD3(VLCD3)에 결합할 수 있는 VL 도메인을 포함하는 하위-도메인(IA1); 및
(2) B7-H3(VHB7 -H3) 또는 CD3(VHCD3)에 결합할 수 있는 VH 도메인을 포함하는 하위-도메인(IA2)을 포함하며,
여기서 하위-도메인 IA1 및 IA2는 12개 이하의 아미노산 잔기의 폴리펩타이드 링커에 의해 서로 분리되고 대등하게 선택됨으로써,
(a) 하위-도메인 IA1은 B7-H3(VLB7 -H3)에 결합할 수 있는 VL 도메인을 포함하고, 하위-도메인 IA2는 CD3(VHCD3)에 결합할 수 있는 VH 도메인을 포함하도록 선택되거나; 또는
(b) 하위-도메인 IA1은 CD3(VHCD3)에 결합할 수 있는 VL 도메인을 포함하고, 하위-도메인 IA2는 B7-H3(VHB7 -H3)에 결합할 수 있는 VH 도메인을 포함하도록 선택된다; 및
B. 헤테로다이머-촉진 도메인에 연결된 폴리펩타이드 링커를 포함하는, 선택적으로 존재하는 도메인 IB;
C. 항체의 CH2-CH3 도메인에 연결된 폴리펩타이드 링커를 포함하는, 도메인 IC를 포함하고,
II. 제2 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로:
A. 도메인 IIA: 도메인 IIA는
(1) B7-H3(VLB7 -H3) 또는 CD3(VLCD3)에 결합할 수 있는 VL 도메인을 포함하는 하위-도메인(IIA1); 및
(2) B7-H3(VHB7 -H3) 또는 CD3(VHCD3)에 결합할 수 있는 VH 도메인을 포함하는 하위-도메인(IIA2)을 포함하며,
여기서 하위-도메인 IIA1 및 IIA2는 12개 이하의 아미노산 잔기의 폴리펩타이드 링커에 의해 서로 분리되고 대등하게 선택됨으로써,
(a) 하위-도메인 IA1이 B7-H3(VLB7 -H3)에 결합할 수 있는 VL 도메인을 포함할 때, 하위-도메인 IIA1은 CD3(VHCD3)에 결합할 수 있는 VL 도메인을 포함하도록 선택되고, 하위-도메인 IIA2는 B7-H3(VHB7-H3)에 결합할 수 있는 VH 도메인을 포함하도록 선택되며;
(b) 하위-도메인 IA1이 CD3(VLCD3)에 결합할 수 있는 VL 도메인을 포함할 때, 하위-도메인 IIA1은 B7-H3(VLB7 -H3)에 결합할 수 있는 VL 도메인을 포함하도록 선택되고, 하위-도메인 IIA2는 CD3(VHCD3)에 결합할 수 있는 VH 도메인을 포함하도록 선택된다;
B. 헤테로다이머-촉진 도메인에 연결된 폴리펩타이드 링커를 포함하는, 선택적으로 존재하는 도메인 IIB를 포함하고,
III. 제3 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로 항체의 CH2-CH3 도메인에 연결된 폴리펩타이드 링커를 포함하는 도메인 IIIC를 포함하며;
여기서:
(A) (1) 선택적으로 존재하는 도메인 IB 및 선택적으로 존재하는 도메인 IIB 중 적어도 하나가 존재하고, 존재하는 도메인 IB 또는 IIB는 양전하 또는 음전하를 갖거나; 또는
(2) 선택적으로 존재하는 도메인 IB와 선택적으로 존재하는 도메인 IIB가 둘 다 존재하며, 여기서:
(i) 도메인 1B 및 도메인 IIB 중 하나는 양전하를 가진 헤테로다이머-촉진 도메인을 가지고, 도메인 1B 및 도메인 IIB 중 나머지 하나는 음전하를 가진 헤테로다이머-촉진 도메인을 갖거나; 또는
(ii) 도메인 1B 및 도메인 IIB 중 하나는 아미노산 서열 GVEPKSC(SEQ ID NO: 6) 또는 VEPKSC(SEQ ID NO:7)을 포함하는 헤테로다이머-촉진 도메인을 가지고, 도메인 1B 및 도메인 IIB 중 나머지 하나는 아미노산 서열 GFNRGEC(SEQ ID NO:8) 또는 FNRGEC(SEQ ID NO:9)를 포함하는 헤테로다이머-촉진 도메인을 가지며;
(B) VLB7 -H3과 VHB7 -H3은 상호작용하여 B7-H3의 에피토프에 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인을 형성하고, VLCD3과 VHCD3은 CD3의 에피토프에 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인을 형성하고;
(C) 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬의 CH2-CH3 도메인은 Fc 수용체에 결합할 수 있는 Fc 도메인을 형성한다.
구체예 2:
사람화된 영장류 B7-H3 및 CD3의 둘 다와 교차-반응할 수 있는, 구체예 1의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디.
구체예 3:
구체예 1 또는 2의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디에 있어서,
(A) (1) 도메인 IB 및 IIB는 각각 이황화물 결합을 통해서 제2 폴리펩타이드 사슬에 제1 폴리펩타이드 사슬을 공유 결합시키는 시스테인 잔기를 포함하고;
(2) 도메인 IC 및 IIIC는 각각 이황화물 결합을 통해서 제3 폴리펩타이드 사슬에 제1 폴리펩타이드 사슬을 공유 결합시키는 시스테인 잔기를 포함하며;
(B) (1) 도메인 IA2와 IB 및 도메인 IIA2와 IIB를 분리하는 폴리펩타이드 링커는 각각 이황화물 결합을 통해서 제2 폴리펩타이드 사슬에 제1 폴리펩타이드 사슬을 공유 결합시키는 시스테인 잔기를 포함하고;
(2) 도메인 IC 및 IIIC는 각각 이황화물 결합을 통해서 제3 폴리펩타이드 사슬에 제1 폴리펩타이드 사슬을 공유 결합시키는 시스테인 잔기를 포함하는, B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디.
구체예 4:
구체예 1 내지 3 중 어느 하나의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디에 있어서,
(A) VLB7 -H3은 SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 가지고, VHB7 -H3은 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 갖거나; 또는
(B) VLB7 -H3은 SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 가지고, VHB7 -H3은 SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 갖거나; 또는
(C) VLB7 -H3은 SEQ ID NO:33의 아미노산 서열을 가지고, VHB7 -H3은 SEQ ID NO:37의 아미노산 서열을 갖는, B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디.
구체예 5:
구체예 1 내지 4 중 어느 하나의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디에 있어서, VLCD3은 SEQ ID NO:41의 아미노산 서열을 가지고, VHCD3은 SEQ ID NO:45 또는 50의 아미노산 서열을 갖는, B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디.
구체예 6:
구체예 1 내지 5 중 어느 하나의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디에 있어서,
(A) 도메인 IC의 CH2-CH3 도메인은 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 가지고, 도메인 IIIC의 CH2-CH3 도메인은 SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 갖거나; 또는
(B) 도메인 IC의 CH2-CH3 도메인은 SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 가지고, 도메인 IIIC의 CH2-CH3 도메인은 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 갖는, B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디.
구체예 7:
구체예 1 내지 6 중 어느 하나의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디에 있어서,
(A) 하위-도메인 IA1과 IA2를 분리하는 폴리펩타이드 링커는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 가지고; 및/또는
(B) 하위-도메인 IIA1과 IIA2를 분리하는 폴리펩타이드 링커는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는, B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디.
구체예 8:
구체예 1 내지 7 중 어느 하나의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디에 있어서,
(A) 도메인 IB의 헤테로다이머-촉진 도메인은 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 가지고, 도메인 IIB의 헤테로다이머-촉진 도메인은 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 갖거나; 또는
(B) 도메인 IB의 헤테로다이머-촉진 도메인은 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 가지고, 도메인 IIB의 헤테로다이머-촉진 도메인은 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖거나; 또는
(C) 도메인 IB의 헤테로다이머-촉진 도메인은 SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 가지고, 도메인 IIB의 헤테로다이머-촉진 도메인은 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 갖거나; 또는
(D) 도메인 IB의 헤테로다이머-촉진 도메인은 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 가지고, 도메인 IIB의 헤테로다이머-촉진 도메인은 SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 갖는, B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디.
구체예 9:
구체예 1 내지 8 중 어느 하나의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디에 있어서,
(A) 도메인 IB와 IA를 분리하는 폴리펩타이드 링커는 SEQ ID NO:2 또는 3의 아미노산 서열을 가지고; 및/또는
(B) 하위-도메인 IIB와 IIA를 분리하는 폴리펩타이드 링커는 SEQ ID NO:2 또는 3의 아미노산 서열을 갖는, B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디.
구체예 10:
구체예 1 내지 9 중 어느 하나의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디에 있어서, 도메인 IC는 도메인 IB로부터 CH2-CH3 도메인을 분리하는 폴리펩타이드 링커를 더 포함하고, 도메인 IIIC는 CH2-CH3 도메인을 향한 N-말단 폴리펩타이드 링커를 더 포함하는, B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디.
구체예 11:
구체예 10의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디에 있어서, 도메인 IC 및 IIC의 폴리펩타이드 링커는 SEQ ID NO:4 또는 5의 아미노산 서열을 갖는, B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디.
구체예 12:
구체예 1 내지 11 중 어느 하나의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디에 있어서,
(A) 제1 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:53의 아미노산 서열을 가지고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:55의 아미노산 서열을 가지며, 제3 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 갖거나; 또는
(B) 제1 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:59의 아미노산 서열을 가지고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:60의 아미노산 서열을 가지며, 제3 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 갖거나; 또는
(C) 제1 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:61의 아미노산 서열을 가지고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:62의 아미노산 서열을 가지며, 제3 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 갖거나; 또는
(D) 제1 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:63의 아미노산 서열을 가지고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:64의 아미노산 서열을 가지며, 제3 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 갖는, B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디.
구체예 13:
구체예 1 내지 12 중 어느 하나의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디에 있어서, A498(신장암), JIMT-1/Luc(유방암), A375(흑색종); 22Rv1(전립선암), Detroit562(인두암), DU145(전립선암); BxPC3(췌장암), SKMES-1(폐암), 및 U87(교모세포종)로 구성되는 군으로부터 선택된 표적 사람 종양 셀라인을 이용한 분석에서 사람 T 세포를 사용하고 이펙터 세포로서 정제된 사람 일차 T 세포를 사용하여 1:1, 5:1, 또는 10:1의 이펙터 세포 대 T 세포의 비에서 표적 종양 세포의 전가 살해를 매개할 수 있고, 이러한 전가 살해의 관찰된 EC50은 약 1.5 μg/mL 이하, 약 1.0 ㎍/mL 이하, 약 500 ng/mL 이하, 약 300 ng/mL 이하, 약 200 ng/mL 이하, 약 100 ng/mL 이하, 약 50 ng/mL 이하인, B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디.
구체예 14:
구체예 13의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디에 있어서, 표적 종양 세포 살해는, 세포 사멸시 세포로부터 방출된 LDH의 효소 활성이 정량적으로 측정되는 락테이트 탈수소효소(LDH) 방출 분석을 사용하여, 또는 루시페라제 상대적 광 단위(RLU)가 녹색형광단백질(GFP)과 루시페라제 수용체 유전자를 둘 다 발현하도록 조작된 Raji/GF 표적 세포의 상대적 생육성을 나타내는 판독값인 루시페라제 분석에 의해 측정되는, B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디.
구체예 15:
구체예 1 내지 14 중 어느 하나의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디에 있어서, 5:1의 비로 22Rv1(사람 전립선암) 또는 A498(사람 신장암) 종양 세포 및 활성화된 사람 T 세포와 함께 NOD/SCID 마우스에 이러한 분자가 도입된 공-혼합 이종이식편에서 사람 종양 성장의 억제를 매개할 수 있는, B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디.
구체예 16:
구체예 1 내지 15 중 어느 하나의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디에 있어서, 암컷 NSG B2m-/- 마우스의 이종이식편 모델에서 사람 종양 성장의 억제를 매개하고 및/또는 항-종양 활성을 나타낼 수 있으며, 여기서 마우스는
(A) 제-1일에 복강내(IP) 주사에 의해 사람 PBMC(1 x 107)가 이식되고, 제0일에 Detroit(사람 인두암 종양 세포(5 x 106))가 피내(ID) 이식되며, 제20, 22, 23, 26, 28, 30, 33, 35, 및 37일에 디아바디가 투여되거나; 또는
(B) 제0일에 A498(사람 신장암 종양 세포(5 x 106))가 피내(ID) 이식되고, 제13일에 복강내(IP) 주사에 의해 사람 PBMC(1 x 107)가 이식되며, 제33, 35, 36, 39, 41, 43, 46, 48, 및 50일에 디아바디가 투여되는, B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디.
구체예 17:
구체예 15 또는 16의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디에 있어서, B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디가 약 0.5 mg/kg를 초과하는 농도, 약 0.5 mg/kg의 농도, 약 0.2 mg/kg의 농도, 약 0.1 mg/kg의 농도, 약 0.05 mg/kg의 농도, 약 0.02 mg/kg의 농도, 약 0.01 mg/kg의 농도, 또는 약 0.005 mg/kg의 농도, 또는 0.005 mg/kg 미만의 농도로 제공되었을 때 종양 성장을 억제하고 및/또는 항-종양 활성을 나타내는, B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디.
구체예 18:
제약으로서 사용하기 위한 구체예 1 내지 17 중 어느 하나의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디.
구체예 19:
구체예 1 내지 17 중 어느 하나의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디와 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 조성물.
구체예 20:
B7-H3의 발현과 관련되거나 그것을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료에서 구체예 19의 제약학적 조성물의 사용.
구체예 21:
구체예 20에 있어서, B7-H3의 발현과 관련되거나 그것을 특징으로 하는 질환 또는 상태는 암인, 사용.
구체예 22:
구체예 21에 있어서, 암은 급성 골수성 백혈병, 부신 종양, AIDS- 관련 암, 치조 연부 육종, 성상 세포 종양, 방광암, 골암, 뇌척수암, 전이성 뇌종양, 유방암, 경동맥 소체 종양, 자궁경부암, 연골육종, 척삭종, 혐색소성 신장세포 암종, 투명세포 암종, 결장암, 결장직장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 결합조직성 소원형세포종양, 상의세포종, 유잉 종양, 골외 점액성 연골육종, 골성 불완전 섬유원증, 뼈의 섬유 이형성증, 담낭 또는 담즙관 암, 위암, 임신성 영양막 질환, 생식세포 종양, 두경부암, 간세포 암종, 교모세포종, 섬세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방 육종/악성 지방종성 종양, 간암, 림프종, 폐암, 수모세포종, 흑색종, 수막종, 악성 중피종, 다발성 내분비 신생물, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 신경아세포종, 신경내분비 종양, 비-소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 인두암, 유두 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아암, 말초신경집 종양, 갈색세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후방 포도막 흑색종, 희귀 혈액학적 장애, 신장세포 암종, 신장의 전이성 암, 간상소체 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연조직 육종, 편평세포암, 위암, 활액 육종, 고환암, 흉선 암종, 흉선종, 갑상선의 전이성 암, 및 자궁암의 세포로 구성되는 군으로부터 선택된 암세포의 존재를 특징으로 하는, 사용.
구체예 23:
구체예 22에 있어서, 암은 방광암, 유방암, 결장직장암, 위암, 교모세포종, 신장암, 폐암, 흑색종, 신경아세포종, 난소암, 췌장암, 인두암, 전립선암, 신장세포 암종, 횡문근육종, 및 두경부의 편평세포암(SCCHN)으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 사용.
구체예 24:
구체예 21 내지 23 중 어느 하나에 있어서, B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 2주마다 대상에 투여되는, 사용(즉, 격주로).
구체예 25:
구체예 24에 있어서, B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 베이스라인에서 대상의 체중의 0.1 ㎍/kg, 0.3 ㎍/kg, 1.3 ㎍/kg, 3 ㎍/kg, 10 ㎍/kg, 30 ㎍/kg, 또는 100 ㎍/kg의 용량으로 투여되는, 사용.
지금 본 발명은 일반적으로 설명되었지만, 그것은 아래의 실시예를 참조하여 더 쉽게 이해될 것이며, 실시예들은 예시의 방식으로 제공되고, 명시되지 않는다면 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예
다음의 실시예들은 본 발명의 진단 또는 치료 방법에서 조성물의 사용을 위한 다양한 방법을 예시한다. 이 실시예들은 예시를 위한 것이며, 본 발명의 범위를 어떤 식으로도 제한하지 않는다.
실시예 1: 결합 친화성
사람 또는 사이노몰거스 원숭이 B7-H3에 대한 몇몇 예시적인 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디(DART-A, DART-B, 및 DART-C)의 결합 친화성을 BIACORE™ 분석에 의해 평가했다. BIACORE™ 분석은 해리 오프-레이트, kd를 측정한다. 항체와 그것의 표적 간 결합 친화성(KD)은 식: KD = [kd]/[ka]에 따른 결합(온-레이트, ka) 및 해리(오프-레이트, kd)에 대한 반응속도 상수의 함수이다. BIACORE™ 분석은 표면 플라스몬 공명을 사용하여 이들 반응속도 변수를 직접 측정한다.
표면 플라스몬 공명(SPR) 기술(BIAcore)에 의해 분석된 사람 및 사이노몰거스 원숭이 B7-H3에 DART-A, DART-B, 및 DART-C의 결합의 결과가 표 2에 제시된다.
DART 항원 ka (± SD)
(M-1s-1) 		kd (± SD)
(s-1) 		KD (± SD)
(nM)
DART-A 사람 B7-H3 2.3 x 105 5.6 x 10-3 24.6
DART-A 사이노몰거스 B7-H3 1.7 x 105 5.1 x 10-3 30.2
DART-B 사람 B7-H3 2.4 x 106 7.6 x 10-3 3.2
DART-B 사이노몰거스 B7-H3 21.5 x 106 13.3 x 10-3 8.9
DART-C 사람 B7-H3 4.6 x 106 7.2 x 10-3 1.6
DART-C 사이노몰거스 B7-H3 n.d. n.d. n.d.
n.d. - BIAcore 분석이 수행되지 않음.
DART-A의 결합 친화성은 사람 및 사이노몰거스 원숭이 B7-H3에서 유사하다(각각 KD = 24.6 nM 및 30.2 nM). 사람 B7-H3에 대한 DART-B의 결합 친화성은 사이노몰거스 원숭이 B7-H3에 대한 친화성의 3배 이내이다(각각 KD = 3.2 nM 및 8.9 nM). 그러나, DART-B는 DART-A보다 사람 B7-H3에 대해 대략 8배 더 높은 친화성을 가진다(각각 KD = 3.2 nM 및 24.6 nM). 유사하게, DART-C는 DART-A보다 사람 B7-H3에 대해 대략 15배 더 높은 친화성을 가진다. DART-D는 DART-C와 동일한 B7-H3 결합 도메인을 포함하고, B7-H3에 대해 동일한 결합 친화성을 가질 것으로 예상된다. DART-C 및 DART-D의 B7-H3 결합 도메인은 다른 연구에서 사이노몰거스 원숭이 B7-H3에 결합하는 것으로 나타났다. 사람 및 사이노몰거스 원숭이 CD3에 대한 결합 친화성(KD)은 거의 동일하다(~14 nM). 사람 및 사이노몰거스 원숭이 B7-H3에 대한 유사한 결합 친화성에 비추어, 사이노몰거스 원숭이는 독성 평가를 위한 적절한 종이다.
실시예 2: 종양 셀라인에서 B7-H3 발현의 FACS 분석
예시적인 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디들의 생물학적 활성의 평가를 위한 적합한 표적 셀라인을 확인하기 위해 상이한 사람 조직 종양 타입으로부터 기원한 종양 셀라인들의 패널에서 B7-H3 발현을 평가했다. 도 3은 다양한 암 셀라인에서 검출된 항-B7-H3-PE 항체 결합의 FACS 히스토그램을 도시한다. 9개의 셀라인이 B7-H3 발현에 대해 양성으로 확인되었고, 항-B7-H3-PE 항체 결합의 형광 강도에 기초하여 일정 범위의 B7-H3 발현 수준을 나타냈다. 가장 높은 B7-H3 발현을 가진 셀라인은 A498(신장암)(도 3a), JIMT-1/Luc(유방암)(도 3b) 및 A375(흑색종)(도 3c)이었고, 중간도 B7-H3 발현은 22Rv1(전립선암)(도 3d), Detroit562(인두암)(도 3e) 및 DU145(전립선암)(도 3f), 낮은 B7-H3 발현은 BxPC3(췌장암)(도 1g), SKMES-1(폐암)(도 3h) 및 U87(교모세포종)(도 3i)이었다. B7-H3 발현에 음성인 것으로 알려진 B-림프종 셀라인인 Raji 세포는 사용된 항-B7-H3-PE 항체에서 어떤 형광도 나타내지 않았다(도 3j). 평가된 셀라인의 패널에서 B7-H3 발현의 범위는 다양한 수준의 표적 밀도를 가지며 상이한 사람 조직으로부터 유래된 종양 셀라인에 대한 B7-H3 X CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디(예를 들어, DART-A)의 생물학적 활성을 특정하기 위한 근거를 제공한다.
실시예 3: B7-H3-양성 암 셀라인 및 CD3-발현 T 세포에 대한 결합
예시적인 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디들을 이들의 이중특이적 결합 능력에 대해 시험했다. FACS 분석에 의해 4개 B7-H3-발현 종양 셀라인(A948, JIMT-1/Luc, Detroit562 및 22Rv1) 및 사람 일차 T 세포를 DART-A 세포 표면 결합에 대해 평가했다. DART-A는 CD3에 결합하므로 T 세포에 대한 마커로서 CD3를 사용하는 대신 CD4와 CD8의 조합이 T 세포 마커로서 사용되었다. 따라서, 이 연구에서 일차 사람 백혈구가 사용되었을 때 조합된 CD4+ 더하기 CD8+ 작동 사건은 T 세포 집단을 표시한다.
DART-A 10 ㎍/mL와 함께 인큐베이션 후, 표적 암 셀라인 및 T 세포 상의 세포-결합된 DART-A를, DART-A 단백질의 E-코일/K-코일(EK) 헤테로다이머-촉진 도메인을 인식하는 항-EK-코일 항체를 사용하여 검출했다. DART-A는 사람 B7-H3-발현 종양 세포(도 4a-4d) 및 CD3-발현 T 세포(도 4e) 둘 다에 결합한 것으로 나타났다. DART-B, DART-C, 및 DART-D도 역시 유사한 연구에서 이중특이적 결합 능력을 가진 것으로 판명되었다.
실시예 4: 이펙터 세포로서 정제된 사람 T 세포를 가진 다수의 표적 암 셀라 인에 대한 CTL 활성
CD3-발현 T 세포 및 B7-H3-발현 종양 세포 둘 다에 대한 결합을 확인한 후(실시예 3 참조), 표적 세포로서 9개 사람 종양 셀라인(A498, JIMT-1/Luc, A375, U87, DU145, BxPC-3, SKMES-1, Detroit562, 및 22Rv1)과 이펙터 세포로서 정상 사람 T 세포를 사용하여 B7-H3-발현 표적 세포의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디-매개 전가 T 세포 살해를 시험관내 평가했다. 세포 사멸시 세포로부터 방출되는 안정한 시토졸 효소인 LDH의 효소 활성을 정량적으로 측정하는 LDH 방출 분석을 사용하여 세포독성을 결정했다. LDH 분석은 표적 세포와 이펙터 세포를 모두 함유하는 웰로부터의 상청액에서 LDH 활성을 측정하므로 이펙터 세포 사멸에 의해 간섭될 가능성이 있다. 따라서, LDH 방출 분석에서 측정된 세포독성이 표적 세포의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디-매개 전가 살해에 대해 특이적이었음을 확인하기 위해, 세포독성을 발광(LUM) 분석을 사용하여 다시 평가했다. 이 분석 형식에서는, 루시페라제 유전자(JIMT-1/Luc 세포)를 안정하게 발현하도록 형질감염되고 선택된 표적 세포의 루시페라제 활성이 측정되고, 이것을 사용하여 분석이 끝날 때 남은 생육성 표적 세포가 열거된다. FITC x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디("대조군 DART"로 지칭됨)가 이들 연구에서 대조군 단백질로서 사용되었다. FITC x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 항-플루오레세인(FITC) x 항-CD3 디아바디 단백질인데, 여기서 항-CD3 결합 성분은 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디의 것과 동일하지만 항-FITC 성분은 무관한 결합 표적을 표시한다. 따라서, FITC x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디는 T 세포 상의 CD3와 맞물릴 것이나, 이들이 표적 세포와도 함께 맞물릴 것으로는 예상되지 않는다. GraphPad Prism 6 소프트웨어를 사용하여 3-변수 S자 모양 용량-반응 함수에 데이터를 커브 피팅함으로써 EC50 값을 결정했다.
DART-A는 이펙터 세포로서 정제된 사람 T 세포를 사용하여 B7-H3-발현 표적 세포의 효능 있는 특이적 전가 살해를 매개했다(E:T 세포 비 = 5:1). 대표적인 도너 T 세포하에 표적 세포의 DART-A 용량-의존성 살해가 도 5a-5j에 도시되고, EC50 값 및 최대 세포독성 퍼센트(Emax)가 표 3에 제시된다. 47 내지 1275 ng/mL의 범위의 DART-A EC50 농도가 평가된 9개의 표적 셀라인에서 관찰되었으며, JIMT-1/Luc가 가장 민감한 셀라인이었다(EC50 = 47 ng/mL). 구체적으로 생육성 JIMT-1/Luc 표적 세포를 측정하는 LUM 분석을 사용하여 거의 완벽한 종양 세포 살해가 관찰되었다(도 5c 참조). DART-A 활성은 일반적으로 B7-H3 발현과 상관되었는데, 더 높은 B7-H3 발현을 가진 표적 셀라인에서 더 낮은 EC50 값이 관찰되었다. 평가된 가장 높은 농도(10,000 ng/mL)에서 대조군 DART에서는 최소한 활성이 관찰되거나 또는 활성이 관찰되지 않았다. B7-H3 음성 CHO 세포(도 5k) 또는 Raji 세포(도 5l)에서는 DART-A의 존재하에 세포독성이 관찰되지 않았으며, 이것은 B7-H3 발현 표적 세포에 대한 DART-A 활성의 특이성을 확인한다.
5:1의 E:T 세포 비에서 표적 셀라인의 전가 살해에 대한 DART-A의 대표적인 Emax 및 EC50 농도
표적 셀라인 종양 타입 Emax ( % ) EC50 (ng/mL) B7-H3 발현
JIMT-1/Luc 유방암 78 47 고
A498 신장암 80 64 고
DU145 전립선암 57 84 중간
A375 흑색종 49 97 고
U87 교모세포종 79 99 저
BxPC-3 췌장암 54 196 저
22Rv1 전립선암 34 212 중간
SKMES-1 폐암 73 319 저
Detroit562 인두암 31 1275 중간
Raji B-림프종 활성 없음 음성
CHO 정상 중국 햄스터 난소 활성 없음 음성
A498, 및 JIMT-1을 포함하는 다수의 상이한 표적 셀라인을 사용하여 DART-C 및 DART-D를 가지고 수행된 유사한 연구들은 이들 두 분자가 유사한 최대 세포용해 수준(Emax)을 가졌지만 DART-A보다 전가 세포 살해를 매개하는데 평균 20배 더 효능이 있었음을 증명했다. 또한, DART-B를 A498, THP-1, 및 DU145를 포함하는 다수의 상이한 표적 셀라인을 사용하여 시험했고, DART-A보다 평균 6배 더 효능이 있었다.
실시예 5: 상이한 이펙터 세포:표적 세포( E:T ) 비에서 DART-A의 CTL 활성
E:T 세포비와 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디-매개 전가 살해의 관계를 증명하기 위해, A498(도 6a, 6c 및 6e) 및 A375(도 6b, 6d 및 6f) 표적 세포 및 이펙터 세포로서 정제된 사람 T 세포를 사용하여 LDH 분석에서 10:1(도 6a 및 6b), 5:1(도 6c 및 6d) 및 1:1(도 6e 및 6f)의 E:T 세포비에서 DART-A의 CTL 활성을 더 평가했다. DART-A는 10:1(도 6a 및 6b)의 E:T 세포비에서 최고 효능(EC50) 및 최대 세포독성 퍼센트(Emax)를 나타냈고, E:T 세포 비가 감소함에 따라 효능 및 최대 세포독성이 감소했다(도 6a-6f 및 표 4). 그러나, 평가된 가장 낮은 E:T 세포비(1:1)에서도 더 적은 정도기는 하지만 특이적 활성이 관찰되었다(도 6e 및 6f 및 표 4).
상이한 E:T 세포 비에서 표적 셀라인의 전가 살해에 대한 DART-A의 Emax 및 EC50 농도
표적 셀라인 E:T = 10:1 E:T = 5:1 E:T = 1:1
Emax ( % ) EC50 (ng/mL) Emax ( % ) EC50 (ng/mL) Emax ( % ) EC50 (ng/mL)
A498 83.91 27.2 73.56 42.51 36.3 128.5
A375 41.5 165.6 38.1 242.7 11.01 352.5
실시예 6: B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디 -매개 T 세포 활성화는 표적 세포 맞물림에 의존한다
B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디에 의해 유도된 T 세포 활성화의 수준을 사람 T 세포 단독에서 또는 10:1의 E:T 세포비로 B7-H3-발현 표적 세포(A498)의 존재하에 평가했다. DART-A를 사용한 이들 연구의 결과는 도 7에 도시된다. 유세포계수 분석은 B7-H3-발현 표적 세포의 존재하에 DART-A에 의한 용량 의존적 방식의 CD4+(도 7b 및 7d) 및 CD8+(도 7c 및 7e) T 세포 서브셋 상의 T 세포 활성화 마커 CD25(도 7b 및 7c)와 CD69(도 7d 및 7e)의 상향조절을 드러냈다(도 7b-7d). DART-A-매개 T 세포 활성화는 표적 세포의 세포독성과 상관되었다(도 7a).
DART-A 또는 대조군 DART를 사용하여 평가된 모든 농도에서 B7-H3-발현 표적 세포의 부재하에 T 세포 단독에서는 T 세포 활성화가 관찰되지 않았다(도 7b-7e). 이들 데이터는 DART-A와 같은 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디에 의해 매개된 T 세포 활성화가 이펙터 세포-표적 세포 공-맞물림에 의존한다는 것을 시사한다. 더욱이, CTL 분석에서 T 세포만 DART-A(도 7b-7e) 또는 대조군 DART와 함께 인큐베이션되었을 때는 세포독성이 관찰되지 않았다. 반면, 표적 세포의 존재하에서는 유의한 DART-A-매개 세포독성이 관찰되었다(도 7a). DART-B, DART-C 또는 DART-D를 사용한 유사한 연구에서 비슷한 결과가 발견되었다.
실시예 7: 표적 세포 공- 맞물림시 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디 -매개 T 세포 증식
이중특이적 항체에 의해 유도된 CTL 활성과 관련된 T 세포 확장은 이미 보고되었다(Klinger M et al. (2012) "Immunopharmacologic Response Of Patients With B-Lineage Acute Lymphoblastic Leukemia To Continuous Infusion Of T Cell-Engaging CD19/CD3- Bispecific BiTE Antibody Blinatumomab," Blood 119(26):6226-6233). 따라서, B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디로의 치료가 T 세포 활성화 마커의 증가와 함께 표적 세포의 용량 의존적 고갈을 가져왔다는 것을 관찰한 후, 표적 세포 및 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디와 함께 배양된 T 세포의 확장을 평가했다. 이를 위해, 사람 PBMC를 CFSE로 표지하고, 72 또는 96시간 동안 10 ㎍/mL 농도의 DART-A 또는 대조군 DART의 존재하에 10:1의 E:T 세포비로 A498 표적 세포와 함께 배양했다. 각 세포 분할은 딸 세포에 함유된 염료를 절반까지 감소시키기 때문에, CFSE-표지된 T 세포의 증식을 FACS 분석에 의해 시간에 따른 CFSE의 수준을 측정함으로써 모니터링했다. 도 8a(72시간) 및 도 8b(96시간)는 DART-A 또는 대조군 DART 및 표적 세포의 존재하에 공-배양을 시작한 후 인큐베이션 이후에 CFSE-염색 프로파일을 나타낸다. DART-A의 존재는 CFSE-표지된 T 세포의 증식을 가져왔으며, 증식 퍼센트는 72시간 인큐베이션 후(도 8a) 약 45% 및 96시간 후(도 8b) 73%였다. 반면, 대조군 DART의 존재하에서는 CFSE-표지된 T 세포의 증식이 관찰되지 않았다(도 8a 및 8b).
실시예 8: 사람 및 사이노몰거스 원숭이 B7-H3-발현 CHO 세포에 대한 결합의 특성화 및 전가 살해
사이노몰거스 원숭이 B7-H3과 교차 반응하는 DART-A의 능력을 확인하기 위해, 사람 B7-H3(huB7-H3-CHO)(도 9a) 또는 사이노몰거스 원숭이 B7-H3(cyno-B7-H3-CHO)(도 9b)로 형질감염된 CHO 세포에 대한 DART-A 결합을 유세포계수에 의해 평가했다. 세포를 10 ㎍/mL에서 시작하여 DART-A 또는 대조군 DART 단백질의 5-배 감소하는 농도로 처리했고, 항-EK-코일 항체를 사용하여 세포-결합된 DART-A를 검출했다. 도 9a 및 9b는 사람 B7-H3-발현 및 사이노몰거스 원숭이 B7-H3-발현 CHO 세포에 대한 DART-A의 농도 의존적 결합을 각각 도시한다.
사람 B7-H3 또는 사이노몰거스 원숭이 B7-H3를 발현하는 CHO 세포를 사용하여 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디-매개 전가 살해를 평가하기 위해, 세포를 5:1의 E:T 세포비에서 사람 T 세포의 존재하에 다양한 농도의 DART-A와 함께 인큐베이션했다. 도 9c 및 9d에 도시된 대로, DART-A-매개 살해는 사이노몰거스 원숭이(도 9c) 및 사람(도 9d) B7-H3-발현 CHO 세포에서 모두 관찰되었다.
실시예 9: 이펙터 세포로서 사이노몰거스 원숭이 PBMC하에 표적 세포의 B7-H3 X CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디-매개 전가 살해
유세포계수에 의해 사이노몰거스 원숭이 T 세포에 대한 DART-A 결합을 평가했는데, 여기서 DART-A의 결합은 작동 CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단에서 프로파일화되었다. 사이노몰거스 원숭이 T 세포에 대한 DART-A 결합(도 10a)은 사람 T 세포(도 10b)와 유사했다.
DART-A와 사이노몰거스 원숭이 T 세포의 교차 반응성을 확인한 후, 사이노몰거스 원숭이 PBMC를 사용하여 DART-A-매개 생체외 CTL 활성을 평가했다. DART-A 또는 대조군 DART를 30:1의 E:T 세포비로 B7-H3-발현 표적 세포(JIMT-1/Luc(도 11a 및 11b) 또는 A498(도 11c))와 혼합된 사이노몰거스 원숭이 PBMC에 첨가하고 24시간 동안 인큐베이션했다. 도 11a-11c에 도시된 대로, 용량 의존적 DART-A-매개 생체외 세포독성이 사람 B7-H3-발현 표적 셀라인에 대한 이펙터 세포로서 사이노몰거스 원숭이 PBMC를 사용하여 관찰되었다.
실시예 10: 22Rv1 사람 전립선암의 공-혼합 이종이식편 모델
RosetteSep T 세포 분리 키트(STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada)에 제공된 제조자의 프로토콜에 따라서 사람 T 세포를 헤파린화된 전혈로부터 분리했다. 이어서 정제된 T 세포를, 항-CD3(OKT-3; 1 ㎍/mL) 및 항-CD28(66 ㎍/mL) 항체 또는 항-CD3/CD28 Dynabeads(1:1 비)에 48시간의 기간 동안 세포를 노출시킴으로써 활성화했다. 자극 후, 세포를 최대 3주 동안 IL2(7.6 ng/mL)의 존재하에 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 가진 RPMI 1640 배지에서 성장시켰다.
사람 T 세포(1 x 106)와 22Rv1 종양 세포(5 x 106)를 조합하고, 200μL Ham's F12 배지에 재현탁 후 제0일에 피하(SC) 주사했다. 22Rv1 종양 세포 및 T 세포 이식 후, 마우스를 종양 세포 이식일부터 4일 동안(제0, 1, 2 및 3일) 매일 1회 비히클 대조군(●), 대조군 DART(0.5 mg/kg)(○), 또는 DART-A at 4개의 상이한 용량 수준(0.004(◆), 0.02(▼), 0.1(▲) 또는 0.5(■) mg/kg)의 DART-A로 IV 치료했다.
도 12에 도시된 대로, 0.1(▲) 또는 0.5(■) mg/kg의 용량 수준에서는 제0일에서 제3일까지 매일 1회 DART-A로 IV 치료 후 22Rv1 종양 세포의 성장이 지연되었고 억제되었다. 0.02 mg/kg(▼) DART-A 용량 수준에서는 종양 성장에 부분적 억제가 있었지만 유의성에는 도달하지 않았다. 0.004 mg/kg(◆) DART-A 용량 수준에서는 종양 성장에 억제가 나타나지 않았다.
실시예 11: A498 사람 신장암의 공-혼합 이종이식편 모델
사람 T 세포를 상기와 같이 분리하고 준비했다. 사람 T 세포(1 x 106)와 A498 종양 세포(5 x 106)를 조합하고, 200μL Ham's F12 배지에 재현탁 후 제0일에 SC 주사했다. A498 종양 세포 및 T 세포 이식 후, 마우스를 종양 세포 이식일부터 4일 동안(제0, 1, 2 및 3일) 매일 1회 비히클 대조군(●), 대조군 DART(0.5 mg/kg) (○), 또는 DART-A at 4개의 상이한 용량 수준(0.004(◆), 0.02(▼), 0.1(▲) 또는 0.5(■) mg/kg)의 DART-A로 IV 치료했다.
도 13에 도시된 대로, 활성화된 사람 T 세포의 존재하에 제0일에 주사된 A498 종양 세포는 대조군 동물에서도 일부 초기 종양 수축을 나타냈고, 이것은 생체내 환경에 대한 종양 적응의 결과이다. 그러나, 이후 시점에서는 비히클 대조군(●) 및 대조군 DART(○)를 받은 동물뿐 아니라 0.004(◆) 또는 0.02(▼) mg/kg DART-A로 제0, 1, 2 및 3일에 매일 1회 치료된 동물에서도 빠른 종양 성장이 관찰되었으며, 대조군 동물과 비교하여 종양 성장은 억제되지 않았다. 0.1(▲) 또는 0.5(■) mg/kg의 용량 수준으로 DART-A로 IV 치료 후에는 종양 성장이 지연되고 억제되었다.
실시예 12: 사람 PBMC -재구성 마우스에서 확립된 A498 사람 신장암 모델
NSG B2m-/- 마우스에서 확립된 종양 이종이식편에 대한 DART-A의 활성을 평가하기 위해 사람 이펙터 세포-재구성 모델을 이용했다. 이 모델은 또한 항-종양 활성이, 접목된 사람 T 세포가 DART-A에 의해서 확립된 종양으로 모이는 것에 의존하는 환경을 제공한다.
암컷 NSG B2m-/- 마우스(Jackson Laboratory)를 확립된 종양 연구에 사용했다(n = 7-8/그룹). MHC I형의 발현이 손상된 베타-2 마이크로글로불린(B2m) 녹아웃 마우스를 이용하여 사람 말초단핵세포(PBMC)의 접목과 관련된 이식편-대-숙주 질환(GVHD)의 발생을 지연시키고 중증도를 최소화했다. 그러나, 이들 마우스에서 B2m 발현의 결여는 또한 FcRn의 손상된 발현과도 관련된다는 것이 주지되어야 한다(Israel, E.J. et al. (1996) "Increased clearance of IgG in mice that lack beta 2- microglobulin : possible protective role of FcRn," Immunology 89: 573-578). 따라서, 이들 마우스에서 DART-A의 반감기는 야생형 마우스나 영장류와 비교하여 짧을 것으로 예상되었다. 사람 Fc 영역을 포함하는 분자를 사용한 이 계통의 마우스에서의 이전 연구에 기초하여, 이들 연구에서 충분한 노출을 보장하기 위해 2 내지 4일마다 1회의 투약 빈도를 채택했다.
사람 PBMC를 제조자의 프로토콜에 따라서 Ficoll-Paque를 사용하여 헤파린화된 전혈로부터 분리했다. A498 종양 세포(5 x 106 생육성 세포)를 100μL Ham's F12에 재현탁하고, 제0일에 피내(ID) 주사한 다음, 제13일에 사람 PBMC(1 x 107 생육성 세포)를 복강내(IP) 주사했다(200μL, 식염수). 종양 세포 이식에 대한 PBMC 접종의 타이밍은 종양 세포의 성장 속도와 관련되며, 무작위화 및 치료 개시 때에 대략 150-300mm3의 종양 크기와 함께 최적의 사람 이펙터 세포 재구성을 얻기 위해 실험적으로 결정되었다. 치료 기간은 총 9회 투여 용량의 IV로서 제33, 35, 36, 39, 41, 43, 46, 48 및 50일에 이루어졌고, 비히클 대조군, 대조군 DART(1 mg/kg), 또는 4개의 상이한 용량 수준의 DART-A(0.001, 0.01, 0.1, 또는 1 mg/kg)를 포함했다.
A498 종양은 치료 개시 전 제32일에 대략 250mm3의 종양 부피에 도달했다(도 14). 1 mg/kg(■) DART-A를 받은 그룹에서는 종양 부피가 제32일에 242±19mm3에서 제39일에 106±35mm3로 퇴행했다. 0.1 mg/kg(▲) DART-A를 받은 그룹은 종양 부피에 더 적은 영향이 있었고(249±25에서 181±87mm3), 0.01 mg/kg(▼) 그룹에서는 동일한 기간 동안 세포성색전의 시기가 있었다(제32일에서 제39일). 1 mg/kg(■) DART-A 그룹에서 종양 성장은 연구 종료시까지(제53일) 5마리 동물에서는 계속 퇴행했지만 나머지 2마리에서는 악화되었다. 연구 종료시까지 0.1(▲) 및 0.01(▼) mg/kg 그룹에서 종양 성장은 각각 5/7 및 4/7 동물에서 퇴행이 유지되었다. 종양 성장의 진행은 0.001(◆) mg/kg DART-A로 치료된 모든 동물에서 명백했다. 비히클 대조군(●) 또는 대조군 DART(○)의 경우 종양의 성장에는 아무 효과가 없었다.
사람 PBMC-재구성 마우스에서 A498 사람 신장암 모델을 사용하여 0.02, 0.1 또는 0.5 mg/kg, 대조군 DART(0.5 mg/kg), 또는 비히클 대조군의 용량에서 DART-B의 활성을 또한 평가했다. DART-B로 치료된 동물은 모든 용량에서 종양 성장의 실질적인 억제를 나타냈지만, 비히클 대조군 또는 대조군 DART에서는 종양 성장에 아무 효과가 없었다.
실시예 13: 사람 PBMC -재구성 마우스에서 확립된 Detroit562 사람 인두암 모델
사람 PBMC를 상기 설명된 대로 준비했다. Detroit562 종양 세포(5 x 106 생육성 세포)를 100μL Ham's F12에 재현탁하고, 제0일에 ID 주사했다. 사람 PBMC(1 x 107 생육성 세포)를 종양 세포 이식 하루 전인 제-1일에 NSG B2m-/- 마우스에 IP 주사(200μL, 식염수)에 의해 이식했다. 치료 기간은 총 9회 투여 용량의 IV로서 제20, 22, 23, 26, 28, 30, 33, 35 및 37일에 이루어졌고, 비히클 대조군, 대조군 DART(0.5 mg/kg), 또는 4개의 상이한 용량 수준의 DART-A(0.1, 0.25, 0.5, 또는 1 mg/kg)를 포함했다.
Detroit562 종양은 치료 개시 전 제19일에 대략 150mm3의 종양 부피에 도달했다(도 15). 1(■), 0.5(▲) 및 0.25(▼) mg/kg 용량 수준으로 DART-A를 받은 그룹에서 종양은 치료 기간 동안 크기가 감소했으며, 최악의 상황에서도 0.25(▼) mg/kg에서 제27일(106±21 mm3)에 이르렀다(도 15). 1(■) 및 0.5(▲) mg/kg에서는 연구 마지막 날인 제37일에 최대 감소가 관찰되었고, 평균 종양 부피는 각각 32±6 및 47±7mm3이었다(도 15). 0.1(◆) mg/kg DART-A 그룹에서도 감소된 종양 성장이 관찰되었고, 연구 종료시에(제37일) 대조군 DART(○)(347±36mm3) 및 비히클(390±42mm3)와 비교하여 최대 종양 부피(258±37mm3)가 감소되었다(도 15).
실시예 14: 사람 PBMC -재구성 마우스 투약 연구에서 확립된 Detroit562 사람 인두암 모델
MHCl1-/- 마우스에서 확립된 종양 이종이식편에 대한 DART-A의 활성을 평가하기 위해 사람 이펙터 세포-재구성 모델을 이용했다. 이 모델은 또한 항-종양 활성이, 접목된 사람 T 세포가 DART-A에 의해서 확립된 종양으로 모이는 것에 의존하는 환경을 제공한다. 이들 연구에서 매주 및 2주마다(즉, 격주) 투약하는 섭생이 시험되었다.
사람 PBMC를 상기 설명된 대로 준비했다. Detroit562 종양 세포(5 x 106 생육성 세포)를 50μL Matrigel과 조합된 50μL Ham's F12 배지에 재현탁한 다음, 제0일에 피내(ID) 주사했다. 사람 PBMC(1 x 107 생육성 세포)를 MHCl1-/- 마우스에 제0일에 IP 주사(200μL, Ham's F12 배지)에 의해 이식했다. 치료 기간은 제15일에 개시되었다. 그룹 I 마우스에 총 5회 투여 용량의 IV로서 제15, 22, 29, 36 및 43일에 주 1회(Q1W) DART-A(0.5 mg/kg)를 투여했다. 그룹 II 마우스에 총 3회 투여 용량의 IV로서 제15, 29, 및 43일에 2주마다 1회(Q2W) DART-A(0.5 mg/kg)를 투여했다. 비히클 대조군 동물은 주 1회 투여되었다.
Detroit562 종양은 치료 개시 전 제14일에 200.49±15.58mm3 내지 287.5±48.79mm3 의 범위였다. 두 그룹 I 및 II(▲)에서 DART-A-치료된 동물에서 종양은 비히클 치료된 동물(●)과 비교하여 치료 기간 동안 크기가 감소했다(도 16a 및 16b). 그룹 I의 DART-A-치료된 동물에서 감소된 종양 성장이 관찰되었는데, 제45일의 [최대] 종양 부피(24.3 ± 9.5mm3)가 제31일의 비히클(801.9 ± 155.5mm3)로 치료된 동물과 비교하여 감소되었다(도 16a). 그룹 II의 DART-A-치료된 동물에서 감소된 종양 성장이 관찰되었고, [최대] 종양 부피(47.6 ± 28.5mm3)가 제31일의 비히클(801.9 ± 155.5mm3)로 치료된 동물과 비교하여 감소되었다(도 16b).
실시예 15: 사이노몰거스 원숭이에서 독성동태 연구
사이노몰거스 원숭이에서 DART-A, DART-B, DART-C, 또는 DART-D의 3개의 비-GLP, 파일럿, 탐구, 용량 연구를 수행했다. 1번의 용량-증가 연구에서 두 그룹의 사이노몰거스 원숭이(n = 2/그룹; 1M/1F)에 DART-A 또는 DART-B의 0.5 mg/kg을 1회 용량 투여하고, 이후 1.0 mg/kg을 주 3회 용량으로 투여했다. 어느 그룹에서도 유의한 발견은 없었지만, 주입 후 IL-6 수준의 일시적 증가가 관찰되었다. 증가된 사이토카인 수준과 관련된 뚜렷한 임상적 관찰은 없었다. 이 연구 과정에서 DART-A 및 DART-B의 혈청 농도를 시험했다(도 17). 도 17에 도시된 대로, 두 분자는 모두 허용되는 약동학적 프로파일을 나타냈다. DART-A의 혈청 수준은 연구 과정에 걸쳐서 적은 변동성을 보였다.
단일 용량 연구에서는 두 그룹의 사이노몰거스 원숭이(n = 2/그룹; 1M/1F)에 DART-D 0.5 mg/kg 1회 용량 또는 0.5 mg/kg 1회 용량을 투여하고, 이후 1.0 mg/kg의 대조군 DART를 주 3회 용량으로 투여했다. 0.5 mg/kg의 DART-D로 치료된 양쪽의 동물은 비정상적인 임상 신호를 나타냈다. 추가의 연구에서 4 그룹의 사이노몰거스 원숭이(n = 2/그룹; 1M/1F)에 0.075, 0.15 또는 0.3 mg/kg의 DART-D를 주 4회 용량, 또는 0.5 mg/kg의 DART-C를 주 4회 용량으로 투여했다. 이들 연구에서 모든 용량은 관용되었다. 그러나, 0.15 및 0.3 mg/kg DART-D, 및 0.5 mg/kg DART-C에서 혈소판 수준에 뚜렷한 일시적인 영향이 있었다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허는 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 언급되고 그 전체가 참고로 인용되도록 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 인용된다. 본 발명은 특정 구체예와 관련하여 설명되었지만, 본 발명은 추가의 변형이 가능하며, 본 출원은 일반적으로 본 발명의 모든 변형, 사용 또는 개조를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명은 본 발명이 속하는 기술 분야의 공지된 또는 통상적인 관행에 속하는 것과 본원에서 개시된 본질적인 특징에 적용될 수 있는 본 개시내용으로부터의 벗어난 것도 포함한다.
SEQUENCE LISTING <110> Macrogenics, Inc. Johnson, Leslie Moore, Paul Bonvini, Ezio Huang, Ling Shah, Kalpana Chichili, Gurunadh <120> Bispecific Monovalent Diabodies That Are Capable of Binding B7-H3 and CD3, and Uses Thereof <130> 1301.0123PCT <150> US 62/206,051 <151> 2015-08-17 <160> 68 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 1 <400> 1 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 2 <400> 2 Gly Gly Cys Gly Gly Gly 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alternative Linker 2 <400> 3 Ala Ser Thr Lys Gly 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 3 <400> 4 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spacer-Linker 3 <400> 5 Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heterodimer-Promoting Domain <400> 6 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Chain of B7-H3 x CD3 Bispecific DART-A Diabody <400> 53 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 115 120 125 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 130 135 140 Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 145 150 155 160 Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr 165 170 175 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser 180 185 190 Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 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Ser Arg Glu Glu Met Thr 405 410 415 Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 420 425 430 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 435 440 445 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 450 455 460 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 465 470 475 480 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 485 490 495 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 500 <210> 54 <211> 1512 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide Encoding the First Polypeptide Chain of B7-H3 x CD3 Bispecific DART-A Diabody <400> 54 gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga cagagtgacc 60 atcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg cctggtatca gcagaagcct 120 ggcaaggccc ctaaggcgct gatctactcc gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc 180 aggttctccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag 300 ggcaccaagc tggaaatcaa gggaggcgga tccggcggcg gaggcgaggt gcagctggtg 360 gagtctgggg gaggcttggt ccagcctgga gggtccctga gactctcctg tgcagcctct 420 ggattcacct tcagcacata cgctatgaat tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg 480 gagtgggttg gaaggatcag gtccaagtac aacaattatg caacctacta tgccgactct 540 gtgaaggata gattcaccat ctcaagagat gattcaaaga actcactgta tctgcaaatg 600 aacagcctga aaaccgagga cacggccgtg tattactgtg tgagacacgg taacttcggc 660 aattcttacg tgtcttggtt tgcttattgg ggacagggga cactggtgac tgtgtcttcc 720 ggaggatgtg gcggtggaga agtggccgca ctggagaaag aggttgctgc tttggagaag 780 gaggtcgctg cacttgaaaa ggaggtcgca gccctggaga aaggcggcgg ggacaaaact 840 cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa gccgcggggg gaccgtcagt cttcctcttc 900 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 960 gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 1020 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 1080 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1140 tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1200 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1260 agcctgtggt gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1320 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1380 ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1440 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1500 tctccgggta aa 1512 <210> 55 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Polypeptide Chain of B7-H3 x CD3 Bispecific DART-A Diabody <400> 55 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu 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Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 130 135 140 Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala 145 150 155 160 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn 165 170 175 Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 180 185 190 Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 195 200 205 Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe 210 215 220 Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu 245 250 255 Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys 260 265 270 Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys 275 280 285 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 290 295 300 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 305 310 315 320 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 325 330 335 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 340 345 350 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 355 360 365 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 370 375 380 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 385 390 395 400 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 405 410 415 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys 420 425 430 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 435 440 445 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 450 455 460 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 465 470 475 480 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 485 490 495 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 500 505 <210> 68 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Polypeptide of Anti-Fluorescein Diabody (Control DART) <400> 68 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly 115 120 125 Leu Val Gln Pro Gly Arg Pro Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly 130 135 140 Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu 145 150 155 160 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr 165 170 175 Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 180 185 190 Asp Asp Ser Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val 195 200 205 Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Gly Ser Tyr Tyr Gly Met Asp 210 215 220 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly 225 230 235 240 Gly Gly Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu 245 250 255 Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu 260 265 270

Claims (24)

  1. B7-H3 및 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디로서, 이 디아바디는 제1, 제2 및 제3 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 상기 폴리펩타이드 사슬들은 공유 결합된 복합체를 형성하며,
    (A) 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:53의 아미노산 서열을 가지고,
    (B) 상기 제2 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:55의 아미노산 서열을 가지며,
    (C) 상기 제3 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 갖는, B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디.
  2. 제 1 항의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 조성물.
  3. B7-H3의 발현과 관련되거나 이러한 발현을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료에서 제 1 항의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디 또는 제 2 항의 제약학적 조성물의 사용.
  4. 제 3 항에 있어서, B7-H3의 발현과 관련되거나 이러한 발현을 특징으로 하는 상기 질환 또는 상태는 암인 것을 특징으로 하는 사용.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 암은 급성 골수성 백혈병, 부신 종양, AIDS- 관련 암, 치조 연부 육종, 성상 세포 종양, 방광암, 골암, 뇌척수암, 전이성 뇌종양, 유방암, 경동맥 소체 종양, 자궁경부암, 연골육종, 척삭종, 혐색소성 신장세포 암종, 투명세포 암종, 결장암, 결장직장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 결합조직성 소원형세포종양, 상의세포종, 유잉 종양, 골외 점액성 연골육종, 골성 불완전 섬유원증, 뼈의 섬유 이형성증, 담낭 또는 담즙관 암, 위암, 임신성 영양막 질환, 생식세포 종양, 두경부암, 간세포 암종, 교모세포종, 섬세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방 육종/악성 지방종성 종양, 간암, 림프종, 폐암, 수모세포종, 흑색종, 수막종, 악성 중피종, 다발성 내분비 신생물, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 신경아세포종, 신경내분비 종양, 비-소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 인두암, 유두 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아암, 말초신경집 종양, 갈색세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후방 포도막 흑색종, 희귀 혈액학적 장애, 신장세포 암종, 신장의 전이성 암, 간상소체 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연조직 육종, 편평세포암, 위암, 활액 육종, 고환암, 흉선 암종, 흉선종, 갑상선의 전이성 암, 및 자궁암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사용.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 암은 방광암, 유방암, 결장직장암, 위암, 교모세포종, 신장암, 폐암, 흑색종, 신경아세포종, 난소암, 췌장암, 인두암, 전립선암, 신장세포 암종, 횡문근육종, 및 두경부의 편평세포암(SCCHN)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사용.
  7. B7-H3 및 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디로서, 이 디아바디는 제1, 제2 및 제3 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 상기 폴리펩타이드 사슬들은 공유 결합된 복합체를 형성하며,
    (A) 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:59의 아미노산 서열을 가지고,
    (B) 상기 제2 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:60의 아미노산 서열을 가지며,
    (C) 상기 제3 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 갖는, B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디.
  8. 제 7 항의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 조성물.
  9. B7-H3의 발현과 관련되거나 이러한 발현을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료에서 제 7 항의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디 또는 제 8 항의 제약학적 조성물의 사용.
  10. 제 9 항에 있어서, B7-H3의 발현과 관련되거나 이러한 발현을 특징으로 하는 상기 질환 또는 상태는 암인 것을 특징으로 하는 사용.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 암은 급성 골수성 백혈병, 부신 종양, AIDS- 관련 암, 치조 연부 육종, 성상 세포 종양, 방광암, 골암, 뇌척수암, 전이성 뇌종양, 유방암, 경동맥 소체 종양, 자궁경부암, 연골육종, 척삭종, 혐색소성 신장세포 암종, 투명세포 암종, 결장암, 결장직장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 결합조직성 소원형세포종양, 상의세포종, 유잉 종양, 골외 점액성 연골육종, 골성 불완전 섬유원증, 뼈의 섬유 이형성증, 담낭 또는 담즙관 암, 위암, 임신성 영양막 질환, 생식세포 종양, 두경부암, 간세포 암종, 교모세포종, 섬세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방 육종/악성 지방종성 종양, 간암, 림프종, 폐암, 수모세포종, 흑색종, 수막종, 악성 중피종, 다발성 내분비 신생물, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 신경아세포종, 신경내분비 종양, 비-소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 인두암, 유두 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아암, 말초신경집 종양, 갈색세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후방 포도막 흑색종, 희귀 혈액학적 장애, 신장세포 암종, 신장의 전이성 암, 간상소체 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연조직 육종, 편평세포암, 위암, 활액 육종, 고환암, 흉선 암종, 흉선종, 갑상선의 전이성 암, 및 자궁암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사용.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 암은 방광암, 유방암, 결장직장암, 위암, 교모세포종, 신장암, 폐암, 흑색종, 신경아세포종, 난소암, 췌장암, 인두암, 전립선암, 신장세포 암종, 횡문근육종, 및 두경부의 편평세포암(SCCHN)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사용.
  13. B7-H3 및 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디로서, 이 디아바디는 제1, 제2 및 제3 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 상기 폴리펩타이드 사슬들은 공유 결합된 복합체를 형성하며,
    (A) 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:61의 아미노산 서열을 가지고,
    (B) 상기 제2 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:62의 아미노산 서열을 가지며,
    (C) 상기 제3 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 갖는, B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디.
  14. 제 15 항의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 조성물.
  15. B7-H3의 발현과 관련되거나 이러한 발현을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료에서 제 13 항의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디 또는 제 14 항의 제약학적 조성물의 사용.
  16. 제 15 항에 있어서, B7-H3의 발현과 관련되거나 이러한 발현을 특징으로 하는 상기 질환 또는 상태는 암인 것을 특징으로 하는 사용.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 암은 급성 골수성 백혈병, 부신 종양, AIDS- 관련 암, 치조 연부 육종, 성상 세포 종양, 방광암, 골암, 뇌척수암, 전이성 뇌종양, 유방암, 경동맥 소체 종양, 자궁경부암, 연골육종, 척삭종, 혐색소성 신장세포 암종, 투명세포 암종, 결장암, 결장직장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 결합조직성 소원형세포종양, 상의세포종, 유잉 종양, 골외 점액성 연골육종, 골성 불완전 섬유원증, 뼈의 섬유 이형성증, 담낭 또는 담즙관 암, 위암, 임신성 영양막 질환, 생식세포 종양, 두경부암, 간세포 암종, 교모세포종, 섬세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방 육종/악성 지방종성 종양, 간암, 림프종, 폐암, 수모세포종, 흑색종, 수막종, 악성 중피종, 다발성 내분비 신생물, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 신경아세포종, 신경내분비 종양, 비-소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 인두암, 유두 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아암, 말초신경집 종양, 갈색세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후방 포도막 흑색종, 희귀 혈액학적 장애, 신장세포 암종, 신장의 전이성 암, 간상소체 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연조직 육종, 편평세포암, 위암, 활액 육종, 고환암, 흉선 암종, 흉선종, 갑상선의 전이성 암, 및 자궁암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사용.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 암은 방광암, 유방암, 결장직장암, 위암, 교모세포종, 신장암, 폐암, 흑색종, 신경아세포종, 난소암, 췌장암, 인두암, 전립선암, 신장세포 암종, 횡문근육종, 및 두경부의 편평세포암(SCCHN)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사용.
  19. B7-H3 및 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디로서, 이 디아바디는 제1, 제2 및 제3 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 상기 폴리펩타이드 사슬들은 공유 결합된 복합체를 형성하며,
    (A) 상기 제1 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:63의 아미노산 서열을 가지고,
    (B) 상기 제2 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:64의 아미노산 서열을 가지며,
    (C) 상기 제3 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 갖는, B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디.
  20. 제 19 항의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 조성물.
  21. B7-H3의 발현과 관련되거나 이러한 발현을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료에서 제 19 항의 B7-H3 x CD3 이중특이적 1가 Fc 디아바디 또는 제 20 항의 제약학적 조성물의 사용.
  22. 제 21 항에 있어서, B7-H3의 발현과 관련되거나 이러한 발현을 특징으로 하는 상기 질환 또는 상태는 암인 것을 특징으로 하는 사용.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 암은 급성 골수성 백혈병, 부신 종양, AIDS- 관련 암, 치조 연부 육종, 성상 세포 종양, 방광암, 골암, 뇌척수암, 전이성 뇌종양, 유방암, 경동맥 소체 종양, 자궁경부암, 연골육종, 척삭종, 혐색소성 신장세포 암종, 투명세포 암종, 결장암, 결장직장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 결합조직성 소원형세포종양, 상의세포종, 유잉 종양, 골외 점액성 연골육종, 골성 불완전 섬유원증, 뼈의 섬유 이형성증, 담낭 또는 담즙관 암, 위암, 임신성 영양막 질환, 생식세포 종양, 두경부암, 간세포 암종, 교모세포종, 섬세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방 육종/악성 지방종성 종양, 간암, 림프종, 폐암, 수모세포종, 흑색종, 수막종, 악성 중피종, 다발성 내분비 신생물, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 신경아세포종, 신경내분비 종양, 비-소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 인두암, 유두 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아암, 말초신경집 종양, 갈색세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후방 포도막 흑색종, 희귀 혈액학적 장애, 신장세포 암종, 신장의 전이성 암, 간상소체 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연조직 육종, 편평세포암, 위암, 활액 육종, 고환암, 흉선 암종, 흉선종, 갑상선의 전이성 암, 및 자궁암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사용.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 암은 방광암, 유방암, 결장직장암, 위암, 교모세포종, 신장암, 폐암, 흑색종, 신경아세포종, 난소암, 췌장암, 인두암, 전립선암, 신장세포 암종, 횡문근육종, 및 두경부의 편평세포암(SCCHN)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사용.
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Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ726520A (en) * 2014-05-29 2018-12-21 Macrogenics Inc Tri-specific binding molecules that specifically bind to multiple cancer antigens and methods of use thereof
TN2017000106A1 (en) * 2014-09-26 2018-07-04 Macrogenics Inc Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding cd19 and cd3, and uses thereof
BR112018011781A2 (pt) 2015-12-14 2018-12-04 Macrogenics Inc molécula biespecífica possuindo um ou mais sítios de ligação a epítopo capazes de ligação imunoespecífica a (um) epítopo(s) de pd-1 e um ou mais sítios de ligação a epítopo capazes de ligação imunoespecífica a (um) epítopo(s) de ctla-4, e composição farmacêutica
WO2018156740A1 (en) 2017-02-24 2018-08-30 Macrogenics, Inc. Bispecific binding molecules that are capable of binding cd137 and tumor antigens, and uses thereof
AU2018250641A1 (en) 2017-04-11 2019-10-31 Inhibrx, Inc. Multispecific polypeptide constructs having constrained CD3 binding and methods of using the same
BR112020004543A2 (pt) * 2017-09-08 2020-09-08 Maverick Therapeutics, Inc. proteínas de ligação ativadas condicionalmente restritas
CN109939230A (zh) * 2017-12-21 2019-06-28 张曼 关于cd3×b7h3双特异性抗体定向杀伤耐顺铂膀胱癌细胞t24/ddp的应用
CN109939126A (zh) * 2017-12-21 2019-06-28 张曼 Cd3×b7h3双特异抗体定向杀伤耐阿霉素膀胱癌细胞pumc-91/adm的应用
CN109939231A (zh) * 2017-12-21 2019-06-28 张曼 关于cd3×b7h3双特异性抗体定向杀伤膀胱癌细胞t24的应用
CN109939232A (zh) * 2017-12-21 2019-06-28 张曼 关于cd3×b7h3双特异性抗体定向杀伤膀胱癌细胞pumc-91的应用
CN109971711A (zh) * 2017-12-27 2019-07-05 张曼 关于cd3×b7h3双特异性抗体定向杀伤人膀胱癌细胞的应用
MX2020008489A (es) * 2018-02-15 2020-09-25 Macrogenics Inc Dominios de union a cd3 variantes y su uso en terapias de combinacion para el tratamiento de enfermedades.
TW202010757A (zh) 2018-04-11 2020-03-16 美商英伊布里克斯公司 具有經受限cd3結合的多重特異性多肽構築體以及相關方法及用途
TW202016151A (zh) * 2018-06-09 2020-05-01 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 針對癌症治療之多特異性結合蛋白
TW202035451A (zh) 2018-07-24 2020-10-01 美商英伊布里克斯公司 含有受限cd3結合域及受體結合區之多重特異性多肽構築體及其使用方法
CN109762068A (zh) * 2018-08-09 2019-05-17 源道隆（苏州）医学科技有限公司 一种可靶向ctla4和pd-1的单基因双特异性抗体及其应用
US20230124851A1 (en) 2018-10-11 2023-04-20 Inhibrx, lnc. B7h3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
CA3115285A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. Pd-1 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
KR20210100654A (ko) 2018-12-07 2021-08-17 지앙수 헨그루이 메디슨 컴퍼니 리미티드 Cd3 항체 및 그의 약제학적 용도
CN112969476A (zh) * 2018-12-07 2021-06-15 江苏恒瑞医药股份有限公司 多特异性蛋白分子
KR20210006637A (ko) * 2019-07-09 2021-01-19 주식회사 와이바이오로직스 B7-h3(cd276)에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
CN111454357B (zh) * 2019-08-14 2022-03-15 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种含有抗体的肿瘤治疗剂的开发和应用
EP3822288A1 (en) * 2019-11-18 2021-05-19 Deutsches Krebsforschungszentrum, Stiftung des öffentlichen Rechts Antibodies targeting, and other modulators of, the cd276 antigen, and uses thereof
MX2022009306A (es) 2020-01-29 2022-09-26 Inhibrx Inc Loseta de nucleo de espuma densificada (dfc) con linea de anticuerpos de dominio individual de cd28 y constructos multivalentes y multiespecíficas de los mismos.
CN117751145A (zh) * 2021-04-28 2024-03-22 礼进生物医药科技（上海）有限公司 包括抗b7h3结合分子的双特异性抗体
WO2023086772A1 (en) 2021-11-12 2023-05-19 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind to b7h3 and nkg2d
CN114539420A (zh) * 2022-01-20 2022-05-27 同济大学苏州研究院 抗b7-h3单克隆抗体、抗b7-h3×cd3双特异性抗体、制备方法及其应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ME03447B (me) * 2010-03-04 2020-01-20 Macrogenics Inc Anтitela reakтivna sa b7-нз, njihovi imunološki akтivni fragmenтi i upotreba
MX369220B (es) * 2011-05-21 2019-10-31 Macrogenics Inc Moleculas que enlazan cd3 capaces de enlazar a cd3 humano y no humano.
US10851178B2 (en) * 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
US9487587B2 (en) * 2013-03-05 2016-11-08 Macrogenics, Inc. Bispecific molecules that are immunoreactive with immune effector cells of a companion animal that express an activating receptor and cells that express B7-H3 and uses thereof
US20140302037A1 (en) * 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
UA116479C2 (uk) * 2013-08-09 2018-03-26 Макродженікс, Інк. БІСПЕЦИФІЧНЕ МОНОВАЛЕНТНЕ Fc-ДІАТІЛО, ЯКЕ ОДНОЧАСНО ЗВ'ЯЗУЄ CD32B I CD79b, ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ
EP2839842A1 (en) * 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding CD123 and CD3 and uses thereof
KR20180084772A (ko) * 2015-10-08 2018-07-25 마크로제닉스, 인크. 암 치료를 위한 조합 치료법

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