KR20040101427A

KR20040101427A - 류머티즘 치료제 및 그의 제조 방법

Info

Publication number: KR20040101427A
Application number: KR10-2004-7016140A
Authority: KR
Inventors: 뎅웬롱
Original assignee: 시추안 인스티튜트 오브 차이니즈 머터리아 메디카; 광조우 천리지 파머스티컬 팩토리
Priority date: 2002-04-09
Filing date: 2002-04-09
Publication date: 2004-12-02
Also published as: JP2005530727A; EP1510217B1; CN100502911C; CA2481459C; AU2002254842A1; AU2002254842B2; WO2003086425A1; EP1510217A4; CN1622819A; JP4413013B2; HK1074792A1; US20050220906A1; KR100811873B1; CA2481459A1; EP1510217A1

Abstract

본 발명은 류머티즘 치료제 및 그 제조방법을 제공한다. 본 발명의 류머티즘 치료제는 곤명산해당, 음양곽, 구기자, 토사자를 원재료로 하여 제조되며, 치료 효과가 현저하고 부작용이 적으며 복용이 편리하다는 특징을 갖는다.

Description

류머티즘 치료제 및 그의 제조 방법{AN ANTI-RHEUMATISM MEDICAMENT AND METHOD TO PREPARE THEREOF}

류머티즘과 류마티스 관절염(RA)는 일종의 난치병으로서, 약 18,000,000 명의 RA 환자가 상기 질병으로 장애를 입고 있다. 약 100 여년에 걸쳐서 RA의 치료를 위한 신약 연구가 지속되어 왔다. 그 중에서 RA 치료에 광범위하게 사용된 최초의 약제로 아스피린을 꼽을 수 있다. RA 치료제는 비스테로이드성 소염제(NSAIDs)와 면역 억제제의 2 종류로 대별될 수 있다. NSAIDs는 트리플루오페라진(trifluoperazine), 인도메타신(indomethacin) 및 부신 피질 호르몬(adrenal cortical hormone; corticoid)을 함유한다. 임상 연구를 통하여 NSAIDs의 유효성이 입증된 바 있다. 면역 억제제와 세포 살상제(cytotoxic agent)는 메토트렉세이트(methotrexate), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 페니실라민(penicillamine) 등을 함유한다. 최근에는 면역 조절제도 중요한 치료 수단의 하나가 되고 있다. 그러나, 류머티즘의 치료에 사용되는 전술한 기존의 모든 약제는 심각한 부작용을 갖는다. 류머티즘의 치료 효과가 우수하고, 독성이 없는 치료제는 아직 개발되지 않았다.

류머티즘 치료제의 연구와 개발에 있어서 다음의 세 가지 측면이 중요한 위치를 차지한다. 첫 번째는 NSAIDs 및 사이토카인 억제제(cytokine-antagon)이며, 예컨대, 재조합된 가용성 종양 괴사 인자 억제제(TNF antagon), 인터루킨-1 억제제, 혈소판 활성화 인자(platelet active factor, PAF) 억제제 등이 있다. 두 번째는 신규한 면역 억제제 또는 면역 조절제이며, 예컨대, 사이클로스포린 A 등이 있다. 세 번째는 약제 조성물이다.

중의약학 분야에 있어서, 비병(痺病, RA) 치료제에 관한 연구는 오랜 역사를 가지고 있으며, 최초의 약물로는 장중경(張仲景)의 마행석감탕(麻杏石甘湯), 오두탕(烏頭湯), 방기황기탕(防己黃耆湯) 등이 있다. Gelsemium elegan s Bentll은 사천성에 서식하는 야생 식물의 일종으로, 그 지역(사천)에서 수행된 임상 실험을 통하여 류머티즘 치료에 효과적인 것으로 입증되었다. 그러나, 추가적인 연구를 통하여 생식기에 대한 심각한 부작용과 다른 몇 가지 억제 불가능한 문제점을 갖는 것으로 나타났다.

오랜 기간 동안에 걸친 많은 의학자들의 개발에 의하여 중의약적 방법에 의한 비병의 치료가 상당한 수준에 도달하였다. 지금까지, 많은 효과적인 처방과 약재들이 개발되었다. 1995년 판 및 2000년 판 중국 약전에는 80 종 이상의 비병 치료 약재와 29 종의 비병 치료제가 수록되어 있다. 그러나, 상기 중의학적 치료 방법은 ① 그 효과가 류마티스 관절염과 같은 심각한 비병의 치료에 충분히 이상적이지 못하고, ② 그 투약 형태가 현대 생활 습관에 적절하지 못하고, ③ 뇌공등(雷公藤) 제제와 같은 일부 약물은 우수한 치료 효과를 갖지만 독성과 부작용이 심각하다는 등의 몇 가지 문제점을 갖는다. 따라서, 치료 효과가 좋고 독성이 적으며 현대 생활 습관 및 치료 습관에 맞게 투여가 간편한 류머티즘 치료제의 개발이 요구된다. 특히, 기존의 화학 합성 약제와 유사한 효과를 가지면서도 상대적으로 낮은 부작용 및 독성을 갖는 제제의 연구와 개발이 필요하다.

본 발명은 약학적 조성물 및 그의 제조 방법에 관한 것으로, 특히, 류머티즘 치료에 사용되는 약학적 조성물 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 목적은 류머티즘 치료 효과가 우수하면서 독성이 적고, 복용이 간편한, 류머티즘 치료제 및 그 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 다음과 같은 기술에 의하여 실현된다. 본 발명의 약물의 주요한 약재 구성은 다음과 같다:

곤명산해당(昆明山海棠, Tripterygium hypoglaucun (Levl.) Hutch.)

음양곽(淫羊藿, Epimedium brevicornum Maxim.)

구기자(枸杞子, Lycium barbarum L.)

토사자(兎絲子, Cuscuta chinensis Lam., Cuscuta australis R. Br.).

상기 약재 중에서 곤명산해당은 다른 세 가지 약재 중 임의의 한 가지 또는 두 가지 또는 세 가지와 조합될 수 있다.

본 발명의 약제 조성물의 최적 약재 구성은 다음과 같다:

곤명산해당 1 내지 4 중량부,

음양곽 1 내지 4 중량부,

구기자 1 내지 4 중량부, 및

토사자 1 내지 4 중량부.

또한, 본 발명의 약제 조성물의 최적 약재 구성은 다음과 같을 수 있다:

곤명산해당 2 중량부,

음양곽 2 중량부,

구기자 1 중량부, 및

토사자 1 중량부.

또한, 본 발명의 약제 조성물의 약재 구성은 다음과 같은 수 있다:

곤명산해당 1 내지 4 중량부, 및

음양곽 1 내지 4 중량부.

또한, 본 발명의 약제 조성물의 약재 구성은 다음과 같을 수 있다:

곤명산해당 2 중량부, 및

음양곽 2 중량부.

곤해산명당 1 내지 4 중량부,

음양곽 1 내지 4 중량부, 및

구기자 1 내지 4 중량부.

곤명산해당 2 중량부,

음양곽 2 중량부, 및

구기자 1 중량부.

곤명산해당 1 내지 4 중량부,

음양곽 1 내지 4 중량부, 및

토사자 1 내지 4 중량부.

곤명산해당 2 중량부,

음양곽 2 중량부, 및

토사자 1 중량부.

상기 약제 조성물 중 이카린 C₃₃H₄₀O₁₅의 함량은 2.0 mg 이상이다.

곤명산해당 1 내지 4 중량부와 구기자 1 내지 4 중량부 및/또는 토사자 1 내지 4 중량부.

본 발명의 약제 조성물의 약재 구성은 다음과 같을 수 있다:

곤명산해당 2 중량부와 구기자 1 중량부 및/또는 토사자 1 중량부.

상기와 같은 구성의 약재로 통상적인 조제 기술에 의하여, 예컨대, 환제, 분말제, 연고제, 정제, 연질 또는 경질 캅셀, 과립제, 주사제 등과 같이, 임상에서 사용할 수 있는 여러 가지 약물 완제품을 제조할 수 있다.

본 발명의 약제의 제조 방법은 다음과 같다:

다음과 같은 중량비로 약재를 준비한다:

곤명산해당 1 내지 4 중량부,

음양곽 1 내지 4 중량부,

구기자 1 내지 4 중량부, 및

토사자 1 내지 4 중량부.

곤명산해당과 음양곽은 각각 잘게 썰은 후, 물로 2 내지 4 회 달인다. 구기자와 토사자는 각각 80 ℃ 내지 95 ℃의 물로 1 내지 3 회 침출시킨다. 상기 약재의 달인 액 또는 침출액을 합병하여, 각각에 해당되는 Amberlyst 흡착 컬럼에 흡착시킨다. 흡착 후, 물로 Amberlyst 컬럼을 투명한 액체가 흘러나올 때 까지 세척한다. 그리고 나서, 60 내지 80 %의 알코올로 세척하여 흘러나오는 액체의 색깔이 뚜렷이 짙어질 때 세척액을 수집하기 시작하여, 세척액의 색깔이 극히 연해질 때 물로 Amberlyst 컬럼 내의 알코올을 씻어 내고 세척액과 합병한다. 총 세척액의 무게는 약재의 약 3 내지 8 배 이다. 각각의 약재의 세척액을 1.10 비중으로 회수, 농축한 후 분무 건조시켜 약재 추출물을 얻는다. 4 종의 약재 추출물을 혼합하여 임상에서 사용할 수 있는 여러 제제의 완제 약품을 만든다.

본 발명의 방법의 공정은 다음과 같다:

원료 약재의 중량비:

곤명산해당 2 중량부

음양곽 2 중량부

구기자 1 중량부

토사자 1 중량부.

곤명산해당을 잘게 썰어 각각 13 배, 10 배, 10 배의 물로 1 시간 동안 달인다. 음양곽을 잘게 썰어 각각 15 배, 10 배, 10 배의 물로 1 시간 동안 달인다. 구기자를 굵은 가루로 분쇄한 후 20 배의 물로 80 ℃에서 1 시간씩 연속하여 3 회 침출시킨다. 토사자를 굵은 가루로 분쇄한 후, 31 배의 물로 80 ℃에서 1 시간씩 연속적으로 3 차 침출시킨다. 상기 4 종의 약재를 달인 액 또는 침출액을 합병 및 여과한 후, Amberlyst 흡착 칼럼 JD-1 (WLD)에 통과시킨다. 그리고 나서, 70 % 알코올로 세척하여 세척액의 색깔이 뚜렷이 짙어질 때 세척액의 수집을 시작한다. 세척액의 색깔이 극히 연해질 때 세척을 끝마친다. 약재 세척액 중의 알코올을 회수한 후, 농축 및 건조하여 약재 추출물의 분말을 얻는다. 4 종의 약재 추출물 분말을 혼합하여 임상에서 사용할 수 있는 여러 제제의 완제 약품을 만든다.

본 발명의 약제 조성물은 다음과 같은 공정으로 제조될 수도 있다:

원재료를 칭량한다. 곤명산해당과 음양곽은 따로 잘게 썰고, 구기자와 토사자는 그대로 또는 따로 분쇄하여 사용한다. 상기 4 종의 약재를 각각 따로 또는 혼합하여 0 내지 95 % 알코올로 10 ℃ 내지 98 ℃에서 연속하여 1 내지 4 회 추출한다. 약재 추출액을 각각 또는 혼합하여 알코올을 회수한 후, 농축, 건조, 분쇄, 혼합 또는 비례에 따라 고르게 혼합하여 임상에서 사용할 수 있는 여러 제제의 완제 약품을 만든다.

본 발명의 약제는 상기 약재 중의 유효 성분을 사용하여 제조될 수 있다.

상기 약재 중 음양곽은 이카린(icariin), 이카리사이드 I(icariside I), 이카리사이드 II(icaruside II), 에피메도사이드 A(epimedoside A)를 함유하고 있고,곤명산해당은 디테르펜(diterpene), 트리테르펜(triterpene), 알칼로이드(alkaloid) 류의 화합물을 함유하고 있으며, 토사자와 구기자의 주요 성분은 플라본(flavone) 이다.

그러므로, 본 발명의 약제의 조제에 있어서, 음양곽은 이카린, 이카리사이드 I, 이카리사이드 II, 에피메도사이드 A 중 한 가지 이상의 성분으로 대체할 수 있고, 곤명산해당은 디테르펜, 트리테르펜, 알칼로이드류의 화합물로 대체할 수 있으며, 토사자와 구기자는 플라본으로 대체할 수 있다.

본 발명의 약제 [풍습평(風濕平) 캅셀]에 관한 약리학 연구에 의하면 풍습평을 복용함으로써 프로인트 아쥬반트 관절염(Freund's adjuvant arthritis, AA) 큰쥐의 원발성 손상 및 속발성 손상을 현저하게 억제할 수 있고, 2,4-디니트로플루오로벤젠(DNFB)으로 인한 작은 쥐의 지연형 과민 반응(delayed type hypersensitivity, DTH)을 뚜렷이 억제할 수 있으며, 작은 쥐의 용혈 독소 (hemolysin) 항체 형성 및 대식 세포(macrophage)와 비장세포 IL-1, IL-2, IL-6, TNF의 활성을 현저하게 억제할 수 있다. 풍습평은 ConA로 유도한 림프구 증식 반응(Lymphocyte transformation test)을 현저하게 억제한다. CD₄, CD₈세포에 대하여 모두 뚜렷한 억제 효과를 나타내지만, CD₄세포에 대한 억제가 보다 강하며, CD₄/CD₈비례에 대한 뚜렷한 영향은 없다. 전술한 풍습평의 약리 작용은 모두 용량-반응의 뚜렷한 선형 관계(linear relation)을 나타내며, 최저 유효 약량은 12 ~ 18 (생약) g/kg이다. 풍습평은 NK 세포에 대해서도 현저한 억제 활성을 나타낸다. 그러나, 풍습평은 유효 약량에서 흉선, 비장 등의 면역 기관의 위축을 초래하지 않으며 대식 세포의 탐식 활성에도 지장이 없다.

풍습평은 염증 반응에 대하여 뚜렷한 억제 효과를 나타낸다. 풍습평은 아세트산으로 인한 작은 쥐 복강 모세 혈관 투과도(permeability)의 항진을 억제하고 크로통 오일(Croton oil)로 인한 작은 쥐 귀의 종창을 억제하며, 카라기난(carrageenan)으로 인한 작은 쥐(mouse)의 흉막염 및 큰 쥐(rat) 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose, CMC) 낭의 백혈구 집합을 억제한다. 카라기난성 큰 쥐 발바닥 종창(feet swelling test)과 숨뭉치성 육아 조직의 증식(cotton ball granulating proliferation test)에 대한 풍습평의 억제 작용은 약하다. 풍습평은 아세트산으로 인한 쥐의 통증 증후군(writhing syndrome)에 대하여 뚜렷한 억제 효과를 나타낸다.

실험예 1: 프로인트 아쥬반트 관절염(Freund's adjuvant arthritis, AA)에 대한 영향

1.1. 큰 쥐 AA에 대한 예방 및 치료 작용

체중이 180 ~ 220 g인 SD 큰 쥐를 암컷과 수컷의 수를 동일하게 하여 총 72마리 선별하여 무작위로 6 개 군으로 나누었다. 각각의 군의 큰 쥐는 모두 12 마리이고, 각각의 케이지에서 6 마리씩 따로 사육하였다. 정밀 자로 큰 쥐 양측 뒷발의 발목 관절과 족부의 최대 둘레를 측정하여, 이를 정상 수치로 하였다. 동일 부피의 약량이 다른 풍습평과 서황개 교질액을 큰 쥐에 내복시키고 1 시간 후에 모든 쥐의 좌측 뒷발 발바닥 피부에 프로인트 아쥬반트(0.1 ml/마리)를 주사하였다. 매일 1회씩 연속하여 30 일간 약을 내복시키고 전술한 바와 같이 큰 쥐 양측 뒷발의 발목 관절 및 족부 둘레를 측정하였다. 종창도(Δcm)는 매일 측정한 족부 둘레에서 족부 자극전의 족부 둘레를 감하여 얻을 수 있다. 종창도의 실험 결과를 표 1.1 및 1.2에 나타내었으며, 주요 장기 중량의 변화를 표 1.3 및 1.4에 나타내었다.

1.2. 큰 쥐 AA에 대한 치료 작용

수컷 SD 큰 쥐 50 마리를 선별하여 무작위로 5 개군으로 나누어, 프로인트 아쥬반트를 주사한 후 13 일째부터 매일 1 회씩 연속하여 2 주일 동안 약을 내복시키는 것을 제외하고는, 실험 1.1과 같은 방법으로 연구하였다. 종창도(Δcm)는 매일 측정한 둘레에서 족부 자극 전의 둘레를 감하여 얻을 수 있다. 종창도의 실험 결과를 표 1.5 및 1.6에 나타내었고, 쥐의 장기 중량 변화를 표 1.7에 나타내었다.

표 1.1, 1.2, 1.3 및 표 1.5, 1.6에 나타난 바와 같이, 풍습평은 AA 큰 쥐의 프로인트 보조액을 주사한 쪽의 원발성과 반대쪽의 속발성 관절 손상에 모두에 대하여 강한 억제 작용을 나타내는 것을 알 수 있다. 큰 쥐 족부의 염증 유발과 동시에 또는 2 주일 후에 주입된 풍습평의 치료에 있어서, 모두 현저한 효과를 나타내었는데, 이는 풍습평이 큰 쥐의 프로인트 아쥬반트 관절염에 대하여 예방과 치료 작용이 있음을 나타내는 것이다. 풍습평의 큰 쥐 뒷발 발목 관절에 대한 특이적 면역성 종창과 족부에 대한 비특이적 종창에 대한 작용의 분석에서 알 수 있는 바와 같이, 풍습평은 발목 관절 종창에 대한 치료 작용이 보다 강한 것으로 나타났으며, 이를 통하여 주로 면역성 염증을 치료하는데 효과적이라는 것을 알 수 있다.

표 1.3, 1.4 및 표 1.7에서 알 수 있는 바와 같이, 전제 실험 과정에서 AA 큰 쥐는 체중에 뚜렷한 변화를 보이지 않았다. 이와 반대로 유효 약량 풍습평 군의 쥐의 체중은 증가하였다. 치료군과 예방군 쥐의 체중은 감소하였고, 흉선 및 부신은 현저하게 위축되었으며, 곤명산해당군의 쥐 역시 흉선의 위축을 보였다. 풍습평 군의 쥐는 흉선 및 부신 중량에 있어서 뚜렷한 변화를 보이지 않았다.

1.3. 큰 쥐 AA에 대한 치료 작용의 병리학적 관찰

체중이 180 ± 20 g인 45 마리의 SD 큰 쥐를 선별하여 무작위로 6 개 군으로 나누어 프로인트 아쥬반트액으로 AA를 유발시킨 후, 연속하여 5 일 동안 풍습평을 내복시켰다. 마지막 치료 1 시간 후에 큰 쥐의 관절 지표를 평가하였다. 큰 쥐의 속발성 손상 쪽의 뒷발 관절을 포름알데히드로 고정한 후, HE 염색하여 광학 현미경 아래서 관절 활막 및 연골의 변화를 관찰하였다. 쥐의 관절 지표를 표 1.8에 나타내었다.

큰 쥐를 사지 관절의 홍종 정도를 기준으로 0 ~ 4 점으로 평점하였다. 사지 평점 점수의 합을 관절 지표로 사용하였다. 사지 관절의 평점 표준은 다음과 같다. 0 점: 정상, 1 점: 종창 없이 붉음, 2 점: 붉고 약한 종창, 3 점: 심한 종창, 4 점: 관절 변형과 강직.

현미경 하에서 관찰한 결과, 모델군 큰 쥐의 뒷발 관절은 활막층이 과형성되고, 교원 섬유가 증가되었으며, 림프구 및 원형질 세포가 조직에 침윤되어 뚜렷한 육아종을 형성하였다. 또한, 활막 세포는 변형되었으며, 세포질이 붉게 염색되고 세포핵이 축소되었으며, 부분 활막 세포는 탈락되었다. 연골은 위축되고 표면이 거칠며 울퉁불퉁하고, 연골 세포는 약간 과형성되었다. 풍습평으로 치료한 후 관절 활막 조직의 염증은 감소하고, 비교적 많은 교원 섬유를 형성하였으며, 활막 세포는 부분 탈락되고, 연골 표층 세포가 과형성되고, 표면이 평탄해지고, 연골은 회복 상태에 있었다.

실험예 2: 2,4-디니트로플루오로벤젠(DNFB)으로 인한 작은 쥐 귀의 지연형 과민 반응(delayed type hypersesitivity, DTH)에 미치는 영향

NIH 작은 쥐를 암컷과 수컷의 수를 동일하게 하여 총 50 마리 선별하여 무작위로 5 개 군으로 나누었다. 쥐의 복부 탈모 부위를 1 % DNFB 아세톤 용액 (0.025 ml/마리)으로 감작(sensitization)시킨 후, 하루가 지난 뒤, 같은 방법으로 한 번 더 강화시킨다. 감작 후 5 일째에 작은 쥐의 귀를 1 % DNFB 식용 오일 용액(0.01 ml/마리)으로 자극한 후, 24 시간 후 도살하여 양측 귀를 비틀림 저울(torsion balance)로 측량하고 중량 차이(mg)로 DTH 반응의 강도를 표시하였다. 상기 실험을 약물 치료의 시간에 따라 여러 가지 방법을 적용하여 수행하였다.

2.1. 실험의 전반적인 과정 및 약물 치료가 DTH에 미치는 영향

감작 및 약물 치료 시간에 따른 방법은 다음과 같다:

표 2.1에서 알 수 있는 바와 같이, 풍습평은 DNFG로 인한 작은 쥐의 DTH 반응을 현저하게 억제하였고, 그 억제 작용은 약량과 뚜렷한 비례 관계를 가지며, 약량이 증가할수록 작용이 강해지는 것으로 나타났다. 60.9 g/kg 약량에서 DTH 반응에 대한 억제율은 69.5 %에 이르렀다

2.2. 다양한 치료 시간에서 작은 쥐의 DTH 반응에 미치는 영향

표 2.1의 가운데 및 아래 부분에서 알 수 있는 바와 같이, 감작 전 2 일부터 감작 당일까지, 감작 전 2 일부터 감작 후 2 일까지, 감작 전 2 일부터 감작 후 5 일까지 감작 전후의 풍습평 치료는 모두 작은 쥐 DTH 반응을 현저하게 억제할 수 있는 것으로 나타났으며, 그 중에서도 감작 전후 전반 과정의 치료, 즉, 감작전 2일부터 감작 후 5 일까지의 치료시에 억제 작용이 가장 강한 것으로 나타났다. 이는 풍습평이 DTH를 치료함에 있어서, DTH 반응 초기, 중기 및 말기의 참여 세포에 대하여 모두 억제 작용을 나타낼 수 있는 가능성을 보여주는 것이다. 이와 대조적으로, 감작 전 2일부터 감작 당일 및 감작후 2일까지의 치료에서는 비교적 적은 양의 시클로포스파미드가 쥐 DTH 반응에 대하여 영향을 나타내지 않았다.

표 2.1의 아래 부분에서 알 수 있는 바와 같이, 감작 3 일전 한꺼번에 많은 양의 시클로포스파미드를 투여하였을 때, Ts 세포에 대한 강한 억제 작용으로 인하여 Th 세포의 기능이 상대적으로 강해져서 작은 쥐의 DTH 반응이 오히려 강화되었다. 이 때, 풍습평을 병용한다면 DTH 반응에 대한 풍습평의 억제 작용이 약해지게 된다. 이는 풍습평의 DTH 억제 메커니즘이 시클로포스파미드와 상이하며, 풍습평이 Th 세포의 억제 작용에 대하여 상대적으로 민감할 수 있다는 것을 의미하는 것이다.

실험예 3: 체액성 면역(humoral immunity) 기능에 미치는 영향

3.1. 닭 적혈구 (CRBC) 면역으로 인한 정상 쥐 용혈 독소(hemolysin) 항체 형성에 대한 영향

체중이 18 ~ 22 g인 작은 쥐를 암컷과 수컷의 수를 동일하게 하여 총 190 마리 선별하여 무작위로 19 개 군으로 나누었다. 5 % CRBC 0.2 ml을 ip 주입하여 면역화시킨 후 7 일째에 쥐의 안구를 적출하고 채혈하였다. 혈액을 생리 식염수로 희석한 후 형성된 용혈 독소 항체를 측정하였다. 면역의 부동 시기에 풍습평을 내복시켰다. 그 실험 결과를 표 3.1, 3.2 및 3.3에 나타내었다.

상기 표에서 알 수 있는 바와 같이, 풍습평은 다양한 종류의 작은 쥐 용혈 독소 항체 형성을 현저하게 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 억제 작용은 약량과 뚜렷한 비례 관계를 가지며, 약량이 클수록 억제 작용이 강해진다. 풍습평의 최저억제 약량은 12 g/kg이며, 풍습평의 주요 성분인 곤명산해당과 비교할 때, 항체 형성에 대한 억제 작용이 훨씬 강한 것으로 나타났다. 표 3.1에 나타낸 바와 같이, 풍습평의 작용 강도는 곤명산해당의 약 2.25 배 이상임을 알 수 있다 (13.5 g/kg 곤명산해당의 작용은 6 g/kg 풍습평의 작용과 비교하여 약하였다).

3.2. AA 작은 쥐의 체액성 면역 기능에 미치는 영향

체중이 20 ± 2 g/kg인 NIH 작은 쥐를 선별하여 우측 뒷발 발바닥 피부에 프로인트 아쥬반트 0.05 ml를 주사하고 3 주일 후에 AA 모델 쥐를 형성하였다. 무작위로 6 개 군으로 나눈 후, 연속 5 일 동안 여러 가지 약물을 복용시켰다. 치료 시작과 동시에 10 % SRBC 0.5 ml를 ip 주입하여 면역화시킨 후, 5 일째에 도살하여 비장을 적출하여 Hank's 로 씻은 후, 림프구 현탁액을 만들었다. 세포 농도를 1×10⁷/ml로 조절한 후, 1 ml를 취하여 시험관에 넣고 0.2 % SRBC 1 ml와 1:30 보체 (complement) 1 ml를 첨가하여 37 ℃의 항온 수조 내에서 1 시간 동안 보온하였다. 그리고 나서, 2000 rpm으로 5 분동안 원심 분리한 후. 상청액을 취하여 722 분광 광도계로 415 nm 파장 하에서 광밀도를 측정하여 PFC의 양을 나타내었다.

이와 동시에, 채혈하고, 혈청을 분리한 후, 응집 실험으로 항체의 원자가(valence)를 측정하고, Log2 수치로 나타내었다. 실험 결과를 표 3. 4에 나타내었다.

표 3.4에서 알 수 있는 바와 같이, AA 작은 쥐의 PFC, IgM은 정상 쥐와 비교할 때 현저하게 높게 나타났다. 풍습평은 AA 작은 쥐의 비장 항체 형성 세포 (PFC) 및 항체(IgM)의 생산량을 현저하게 감소시켰다.

실험예 4: 큰 쥐의 수동 피부 과민증 (passive cutaneous aphylaxis, PCA)에 미치는 영향

큰 쥐를 선별하여 난백(albumen) 10 mg/kg을 근육 주사하는 동시에 보르데텔라 백일해균 (Bordetella pertussis)를 복강내 (ip) 주입하여 면역화시켰다. 2 주일 후, 큰 쥐를 희생시켜 채혈하고 혈청을 분리하여 보존하였다.

체중이 150 ~ 200 g인 큰 쥐를 암컷과 수컷의 수를 동일하게 하여 총 60 마리 선별하여 무작위로 6 개 군으로 나누었다. 에틸에테르의 표층 마취하에서 쥐 등의 탈모 부위에 항 난백 혈청(1:5, 1:10으로 희석하고 각각 d1 및 d2로 표기함) 0.1 ml을 피부에 주사하였다. 각각의 희석도에서 2 번씩 주사하였다. 48 시간 후, 난백 1 mg을 함유한 0.5 % Evans Blue 생리 식염수 1 ml로 자극하고, 20 분 후 도살하였다. 큰 쥐 등 피부의 Blue 반점의 면적 및 색조의 짙고 연함에 기초하여 평점한 후, Blue 반점을 잘게 썰어 0.1 % 황산나트륨 아세톤 용액 (7:3) 5 ml에 담그고, 48 시간 후 원심 분리하고 상청액을 취하여 590 nm 하에서 흡광도를 측정하였다. 각 실험군 큰 쥐의 PAC 반응 강도 및 억제 백분율을 표 4에 나타내었다.

표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 풍습평은 큰 쥐의 PAC에 대한 억제 작옹이 강하지 못한 것으로 나타났다. 단지, 큰 약량에서만 대조군과 현저한 차이를 나타내었다.

실험예 5: 사이토카인(cytokine)에 미치는 영향

5.1. 작은 쥐의 TNF α 및 IL-2에 미치는 영향

체중이 18 ~ 22 g인 ICR 작은 쥐를 암컷과 수컷의 수를 동일하게 하여 총 60 마리 선별하고 무작위로 6 개 군으로 나누었다. 매일 1 회씩 연속하여 10 일 동안 약을 내복시켰다. 마지막 치료 후 24 시간이 되는 때 무균 조건 하에서 쥐 복강의 대식 세포와 비장 세포를 수집한 후, Hank's 용액으로 2 회 세척 한 후, 무혈청 RPMI 1640 용액으로 1 회 세척한다. 5 % FCS-RPMI 1640으로 세포 밀도를 1×10⁸/ml로 조절한 후, LPS 10 ng/ml 또는 ConA 10 ng/ml를 첨가하여 37 ℃의 5 % CO₂조건하에서 48 시간 동안 배양한 후, 다음과 같은 방법에 따라서 TNF α 및 IL-2를 측정하였다.

TNF α의 측정 방법:

작은 쥐의 TNF α 단클론 항체 (monoclonal antibody)를 코팅시킨 플레이트를 상온으로 회복시킨 후, 상청액 50 ㎕/웰을 첨가하고 60 분 후에 바이오틴(biotin)이 표지되어 있는 항체를 첨가하여 25 ℃에서 2 시간 동안 보존하였다. 그리고 나서, 아미딘-효소 복합체를 첨가하고, 30 분 후에 기질을 첨가하여, 30분 동안 반응시킨 후, 종료액으로 반응을 종결시켰다. 450nm하에서 OD를 측정하고 OD 표준 곡선을 통하여 TNF α의 함량 (ng/ml)을 계산하였다.

IL-2의 측정 방법:

5 % FCS-RPMI 1640를 사용하여 대수 생장기에 있는 IL-2 의존형 CTLL 세포의 세포 밀도를 1×10⁵/ml로 조절하였다. 96-웰 플레이트에 CTLL 세포 현탁액 100 ㎕/웰과 배양 상청액 100 ㎕/웰을 첨가하였다. 각각의 시료마다 3 개의 웰을 두고 동시에 여러 희석도의 표준 rHIL-1와 배양액 대조군을 확립하였다. 37 ℃, 5 % CO₂조건하에서 24 시간 배양하였다. 이 때, 배양 종료 6 시간 전에 플레이트를 원심 분리하여 상청액 110 ㎕/웰을 제거하고 MTT 10 ㎕/웰을 첨가하여 37 ℃에서 3 시간 배양 후, 570nm와 630nm의 OD를 측정하였다. 각각의 웰의 OD = OD570nm - OD630nm.

표 5.1에 나타난 바와 같이, 풍습평은 TNF α에 대하여 현저한 억제 작용을 나타냈으며, 12 g/kg의 적은 약량에서도 뚜렷한 억제 작용을 보이고 있으며, 또한, 약량이 증가함에 따라서 작용이 강해짐을 알 수 있다. 풍습평은 IL-2에 대해서도 현저한 억제 작용을 나타냈지만 용량-반응 사이에는 뚜렷한 관계를 보이지 않았다.

5.2. IL-1 및 IL-6에 미치는 영향

체중이 18 ~ 22 g인 NIH 작은 쥐를 암컷과 수컷의 수를 동일하게 하여 총 70 마리 선별하고 무작위로 7 개 군으로 나누었다. 매일 1 회씩 연속하여 10 일동안 약을 내복시켰다. 마지막 치료 후 24 시간 되는 때에 쥐를 도살하고 무균 조건하에서 복강의 대식 세포와 비장 세포를 수집한 후, IL-1 및 IL-6을 측정하였다.

IL-1의 측정:

무균 조건하에서 복강의 대식 세포를 수집하여 Hank's 용액으로 2 회 세척한 후, 무혈청 RPMI 1640 용액으로 1 회 세척하였다. 5 % FCS-RPMI 1640으로 세포 밀도를 4×10⁶/ml로 조절한 후, 1 ml를 취하여 코니칼 원심 분리관(cornicalcentrifuge tube)에 옮기고, 37 ℃의 5 % CO₂조건하에서 1 시간 배양 한 후, 고착하지 못한 세포를 버리고, 5 % FCS-RPMI 1640과 LPS 10 ng/ml를 첨가하여 37 ℃ 5 % CO₂조건하에서 72 시간 동안 배양하였다. 그리고 나서, 여러 차례 동결 융해를 반복한 후, 4 ℃에서 보존하였다.

C57 작은 쥐를 선별항 무균 조건하에서 복강의 대식 세포를 수집하여 5 % FCS-RPMI 1640으로 세포 밀도를 1×10⁶/ml로 조절하였다.

대식 세포 현탁액 100 ㎕와 동결 융해 상청액 100 ㎕를 96-웰 플레이트에 첨가한다. 각각의 시료에 3 개의 웰을 두고 동시에 다양한 희석도의 표준 rHIL-1과 배양액 대조군을 확립하였다. 그리고 나서, ConA 2 ng/웰을 첨가하여 37 ℃ 5 % CO₂조건하에서 72 시간 동안 배양하였다. 이 때, 배양 종료 14 시간 전에³H-TdR 0.1 μCi/웰을 첨가하였다. 다중 헤드 세포 콜렉터로 세포를 수집한 후, CPM 수치를 측정하였다.

IL-6의 측정:

무균 조건하에서 복강의 대식 세포를 수집하여 Hank's 용액으로 2 회 세척한 후, 무혈청 RPMI 1640 용액으로 1 회 세척하였다. 5 % FCS-RPMI 1640으로 세포 밀도를 2×10⁶/ml로 조절한 후, 1 ml를 취하여 코니칼 원심 분리관에 옮기고, 37 ℃ 5% CO₂조건하에서 72 시간 동안 배양하였다.

대수 생장기에 있는 IL-6 의존형 MH60 세포를 5 % FCS-RPMI 1640으로 세포밀도를 1×10⁵/ml로 조절하였다.

96-웰 플레이트에 MH60 세포 현탁액 100 ㎕/웰, 배양 상청액 25 ㎕/웰 및 5 % FCS-RPMI 1640 200 ㎕/웰을 첨가하였다. 각각의 시료에 3 개의 웰을 두고 동시에 다양한 희석도의 표준 rHIL-6과 배양액 대조군을 확립하였다. 37 ℃ 5 % CO₂조건하에서 72 시간동안 배양하였다. 이 때, 배양 종료 6 시간 전에 플레이트를 원심 분리하여 상청액 110 ㎕/웰을 제거하고 MTT 10 ㎕/웰을 첨가하여 37 ℃에서 3 시간 배양한 후 570nm와 630nm의 OD를 측정하였다. 각각의 웰의 OD = OD570nm-OD630nm.

표 5.2의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이 풍습평은 IL-1 및 IL-6에 대하여 강한 억제 작용을 나타냈으며, 약량이 증가함에 따라서 작용이 강해졌다.

5.3. 프로인트 아쥬반트성 관절염 큰 쥐의 혈장의 NO에 미치는 영향

체중이 160 ~ 200 g인 SD 큰 쥐를 암컷과 수컷의 수를 동일하게 하여 총 60 마리 션별하여 무작위로 6 개 군으로 나누었다. 대조군의 쥐는 우측 뒷발 발바닥 피부에 NS 0.5 ml를 주사하고 모델군과 풍습평 및 Glucosidorum Trpterygll Totorum 군의 쥐는 우측 뒷발 발바닥 피부에 완전 프로인트 아쥬반트 (Freund's complete adjuvant, FCA)를 주사하였다. 18 일째에 프로인트 아쥬반트성 관절염(AA)이 형성된 후, 매일 1 회씩 연속하여 5 일 동안 약을 내복시켰다. 대조군과 모델 대조군은 동일한 부피의 증류수를 내복시켰다. 마지막 치료 1 시간 후에 복부 주동맥으로부터 2 ml의 혈액을 취하여 혈장을 분리한 후, -70 ℃에서 보존한다. NO의 측정은 NO 시약 설명서에 따라서 수행한다. 즉, 혈장 0.1 ml에 C 시약 0.6 ml를 첨가 및 혼합한 후, 이차 증류수 (twice distilled water) 0.4 ml를 첨가 및 혼합하고, 추가적으로 D 시약 0.1 ml를 첨가 및 혼합하여 얼음 위에서 60 분 동안 보존한 후, 12000 rpm으로 2 분간 원심분리하였다. 얻어진 상청액 0.6 ml에 이차 증류수0.4 ml 및 A 시약 0.1 ml를 첨가하여 얼음물에서 15 분간 보존하고, B 시약 0.1 ml를 첨가하여 실온에서 1 시간 동안 보존한 후, 545nm 하에서 OD를 측정하였다. 시료의 OD의 표준 곡선을 통하여 NO 함량을 계산하였다. 실험 결과를 표 5.3에 나타내었다.

표 5.3에서 알 수 있는 바와 같이, 모델군의 큰 쥐의 NO 함량은 대조군을 훨씬 초월하였다. 풍습평은 AA 큰 쥐의 NO 함량을 현저하게 감소시켰다. Glucosidorum Trpterygll Totorum 역시 AA 큰 쥐의 NO 함량을 감소시켰지만 그 효과가 뚜렷하지 못하였다.

실험예 6: 작은 쥐의 T 림프구, CD₄, CD₈및 NK 세포에 미치는 영향

6.1. 정상 작은 쥐의 림프구 증식에 미치는 영향

NIH 작은 쥐를 암컷과 수컷의 수를 동일하게 하여 총 80 마리 선별하여 무작위로 8 개 군으로 나누고, 매일 1 회씩 연속하여 10 일동안 약을 내복시켰다. 마지막 치료 후 24 시간 되는 때에 쥐를 도살하고, 무균 조건하에서 비장 세포를 수집하여 Hank's 용액으로 2 회 세척한 후, 무혈청 RPMI 1640 용액으로 1 회 세척하였다. 5 % FCS-RPMI 1640으로 세포 밀도를 2×10⁶/ml로 조절한 후, 96-웰 플레이트에 세포 현탁액 100 ㎕/웰 씩 첨가하였다.

각각의 샘플에 3 개의 웰을 두고, 그 중 2 개의 웰은 자극제(ConA 2 ng/웰)를 넣어 증식시키고, 나머지 한 개의 웰은 대조로 하였다. 플레이트를 37 ℃ 5 % CO₂조건하에서 72 시간 배양하고, 종료 14 시간 전에³H-TdR 0.1 μCi/웰을 첨가하였다. 다중 헤드 세포 콜렉터로 세포를 수집한 후, CPM 수치를 측정하였다. 직접 cpm 또는 자극 지표(stimulatory index)로 여러 군을 비교하였다. 자극 지표의 계산 방법은 다음과 같다.

실험 결과를 표 6.1에 나타내었다.

표 6.1에서 알 수 있는 바와 같이, 풍습평은 ConA 자극으로 인한 림프구 증식을 현저하게 억제하며, 일정한 용량-반응 관계를 보였다.

6.2. 정상 작은 쥐의 CD₄, CD₈및 NK 세포에 미치는 영향

실험 과정은 실험예 5.1과 동일하다. 치료 24 시간 후, 5 % FCS-RPMI 1640으로 작은 쥐의 비장 세포 현탁액을 만들어 세포 밀도를 2×10⁸/ml로 조절한 후, 다음과 같은 방법으로 CD₄, CD₈, CD₄/CD₈및 NK 세포를 측정하였다.

CD₄, CD₈의 측정:

비장 세포 현탁액 50 ㎕를 폴리-L-리신으로 처리된 글래스 슬라이드에 떨구어 세포 도말 표본을 만들었다. 나일론으로 분리하여 얻은 작은 쥐의 T 세포를 양성 대조로 하였다. 세포 도말 표본을 아세톤으로 고정한 후, 작은 쥐의 혈청으로 봉입하고, 바이오틴이 표지된 CD₄, CD₈항체를 첨가하여 37 ℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 그리고 나서, 아미딘-효소 복합체를 첨가하여 실온에서 10 분동안 반응시킨 후, 기질을 첨가하여 10 분동안 반응시키고 세척한 후 헤마톡실린(Herris hematoxylin)으로 2 분간 염색하였다. 농도구배(gradient) 알코올로 탈수한 후 글리세린 젤라틴으로 봉입하여 고배율 현미경 하에서 200 개 세포를 관찰하였다.

NK 세포의 측정:

EC 세포의 준비: 무균 조건하에서 비장 세포를 수집하여 Hank's 용액으로 2 회 세척한 후, 무혈청 RPMI 1640 용액으로 1 회 세척하였다. 5 % FCS-RPMI 1640으로 세포 밀도를 2×10⁶/ml로 조절한 후 EC로 사용하였다.

TC 세포의 준비: 대수 생장기에 있는 Yack-1 세포를 4×10⁴/ml로 조절한 후 TC로 하였다.

측정: EC와 TC를 각각 96-웰 플레이트에 100 ㎕/웰 씩 첨가하였다. 각각의 샘플에 3 개의 웰을 두고, 동시에 EC와 TC 대조군 (EC 대조군: EC 100 ㎕ + 5 % FCS-RPMI 1640 100 ㎕, TC 대조군: TC 100 ㎕ + 5 % FCS-RPMI 1640 100 ㎕)를 확립하였다. 37 ℃ 5 % CO₂조건하에서 24 시간 동안 배양하되, 배양 종료 6 시간 전에 플레이트를 원심 분리하여 상청액 110 ㎕/웰을 제거하고 MTT 10 ㎕/웰을 첨가하여, 37 ℃에서 3 시간 배양한 후, 570nm와 630nm의 OD를 측정하였다. 각각의 웰의 OD = OD570nm - OD630nm.

표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 풍습평은 CD₄, CD₈세포를 일정한 정도로 억제하며 평온한 용량-반응 관계를 보였다. CD₄세포에 대한 풍습평의 유효 억제 약량은 24 g/kg이고, CD₈세포에 대해서는 36 g/kg의 약량에서 현저한 억제 효과를 나타냈으며, CD₄/CD₈에 대해서는 아무럭 효과도 나타내지 않았다. 시클로포스파미드는 CD₄, CD₈세포에 대해서 강한 억제 작용을 나타내며, CD₈세포에 대한 억제 작용은 더욱 강하여 그 결과로 CD₄/CD₈수치를 훨씬 제고시켰다.

풍습평은 NK 세포에 대해서도 현저한 억제 효과를 나타냈으나 용량-반응 사이의 관계는 뚜렷하지 않았다. 시클로포스파미드는 NK 세포에 대하여 강렬한 억제 작용이 있으며, 20 mg/kg의 약량에서의 작용과 풍습평의 12, 24 및 36 g/kg의 약량에서의 작용을 비교할 때 현저한 차이를 보였다.

6.3. AA 작은 쥐의 T 림프구의 수량과 기능에 미치는 영향

체중이 20±2 g인 NIH 작은 쥐를 선별하여 우측 뒷발 발바닥 피부에 완전 프로인트 아쥬반트 (FCA) 0.05 ml을 주사하여 3 일 후에 프로인트 아쥬반트성 관절염(AA)을 유발시켰다. 대조군 쥐는 같은 부위에 NS 0.05 ml를 주사하였다. 관절염을 유발시킨 후, 매일 1 회씩 연속하여 5 일간 약을 내복시켰다. 5 일 후에 말초 혈액을 채취하여 박층 도말 (thin smear) 표본을 만든 후, 에스테라아제(esterase)로 염색하고, 유침 렌즈 하에서 염색 양성 세포 백분율 (말초 혈액 중 T 세포의 백분율)을 얻는다. 작은 쥐를 마취한 후 비장을 취하여 단세포 현탁액을 만든다. PBS로 1 차 세척한 후 상청액을 버리고 적혈구 용해액 4 ml를 넣어 2 ~ 3 분간 충분히 흔들어 적혈구를 완전히 용해시킨 후, 원심 분리하여 상청액을 버리고 형광 세척액으로 2 차 세척한다. 원심 분리하여 상청액을 버린 후 세포 농도를 1×10⁶/ml로 조절하고, 각각의 시험관에 희석한 CD₄, CD₈항체를 50 ㎕ 첨가하여 4 ℃에서 1 시간동안 반응시킨다. 그 후에 형광 세척액으로 2 차 세척한 후 2 ml의 고정액을 첨가하여 400 micron으로 FCA 튜브에 여과한 후, 플로우 사이토메트리 (flow cytometry)로 검출하였다. 그 결과를 표 6.3에 나타내었다.

표 6.3에서 알 수 있는 바와 같이, 여러 군의 ANAE 양성 세포에는 뚜렷한 차이가 없었다. 그러나, AA 작은 쥐의 CD₄세포 수량은 현저하게 증가하였고, CD₈세포 수량은 현저하게 감소하였으며, CD₄/CD₈은 현저하게 제고되었다. 풍습평은 AA 잘은 쥐의 CD₄, CD₈및 CD₄/CD₈이상을 정상으로 회복시킬 수 있었다.

실험예 7: 작은 쥐 복강 대식 세포의 탐식 작용(phagocytosis)

체중이 18 ~ 22 g인 NIH 작은 쥐를 암컷과 수컷의 수를 동일하게 하여 총 50마리 선별하여 무작위로 5 개 군으로 나누었다. 매일 1 회씩 연속하여 1 주일동안 약을 내복시켰다. 마지막 치료 후 1 시간 되는 때에 쥐 복강에 10 %의 CRBC 0.2 ml를 주사하고, 4 시간 후 쥐를 희생시키고 복강액을 취하여 후층 도말 (thick smear) 표본을 만들었다. 현미경하에서 CRBC를 탐식한 대식 세포의 수량 및 각각의 대식 세포가 탐식한 CRBC의 수량을 관찰하였다. 그 결과를 표 7에 나타내었다.

표 7에서 알 수 있는 바와 같이, 풍습평은 27, 40.5 및 60.9 g/kg의 약량에서 작은쥐의 복강 대식 세포의 탐식 작용에 대하여 뚜렷한 작용을 나타내지 않았다.

실험예 8: 작은 쥐의 복강 모세 혈관 투과도(permeability) 항진에 미치는 영향

체중이 18 ~ 22 g인 NIH 작은 쥐를 암컷과 수컷의 수를 동일하게 하여 총 90 마리 선별하여 무작위로 9 개 군으로 나누었다. 1 회 또는 매일 1 회씩 연속하여 3 일간 약을 내복시켰다. 마지막 치료 후 1 시간 되는 때에 쥐 복강에 0.7 %의 HAC 생리 식염수를 주사하는 동시에 0.5 % Evans Blue의 생리 식염수를 0.1 ml/10g을i.v. 투여한다. 30 분 후에 쥐를 희생시켜 복강을 가르고, 5 ml의 생리 식염수로 각각의 쥐의 복강을 여러 번 씻어 액체를 수힙하고 병합한 후, 8 ml/마리가 되도록 생리 식염수를 가하였다. 3000 rpm으로 원심 분리한 후 상청액을 취하여 590 nm하에서 OD를 측정하였다. 그 결과를 표 8에 나타내었다.

표 8에서 알 수 있는 바와 같이, 1 회 치료시 풍습평은 아세트산으로 인한 작은 쥐복강 모세 혈관 투과도 항진에 대한 작용이 뚜렷하지 않았지만, 3 회 치료시에는 현저한 효과를 나타내었다.

실험예 9: 카라기난(carrageenan)으로 인한 작은 쥐이 흉막염 삼출과 염증 세포 집합에 미치는 영향

작은 쥐를 무작위로 분군한 후, 꼬리 정맥에 0.5 % Evans Blue의 생리 식염수 0.1 ml/10 g을 i.v. 주입하였다. 그리고 나서, 작은 쥐를 디에틸에테르로 표층 마취시키고, 특제 주사침으로 1 % 카라기닌을 0.03 ml/마리식 우측 흉강에 주사하였다. 염증을 유발시킨 후, 4 시간 및 32 시간 되는 때 각각 쥐를 희생시키고, 복부를 갈라서 격막(diaphragm) 근육으로부터 1 ml 주사기로 2 회 총 2 ml의 흉강 세척액을 주입한다. 세척액을 주입하고 그 중에서 20 ㎕를 취하여 백혈구 희석액 400 ㎕에 첨가한 후, 현미경하에서 백혈구 수를 측정하였다. 나머지 세척액을 3000 rpm으로 10 분간 원심 분리한 후, 상청액을 취하여 600 nm하에서 흡광도를 측정하였다 (흉강 세척액 원액으로 0을 교정함). 그 결과를 표 9에 나타내었다.

표 9에서 알 수 있는 바와 같이, 풍습평은 작은 쥐의 흉막염의 백혈구 집합에 대하여 뚜렷한 억제 작용을 나타내었다. 억제 작용은 초기에 더욱 강하며, 4 시간 되는 때의 회귀 방정식은 y = 44.13 - 2.01x, r = 0.9625이다. 말기에는 집합에 대한 억제 작용이 약해지고, 20 g/kg의 약량에서 뚜렷하 억제 작용을 나타내었다. 풍습평은 쥐 흉막염 삼출에 대하여 뚜렷한 작용을 보이지 않았다.

실험예 10: 큰 쥐 CMC 낭의 백혈구 집합에 미치는 영향

체중이 150 ~ 180 g인 SD 큰 쥐를 암컷과 수컷의 수를 동일하게 하여 총 64 마리 선별하여 무작위로 8 개 군으로 나누었다. 1 회 또는 매일 1 회씩 연속하여 3 일간 약을 내복시켰다. 실험 수행 시, 시험 전날 큰 쥐 등에 공기 20 ml를 주사하여 만든 기낭에 1 % CMC 20 ml를 주사하였다. 그리고 나서, 3.5 시간 및 7.5 시간 되는 때에 0.1 ml의 낭액을 취하여 0.1 % brilliant cresyl blue PBS 용액으로 염색한 후, 현미경하에서 CMC 낭액 중의 백혈구 수량을 측정하였다. 그 결과를 표 10에 나타내었다.

표 10에서 알 수 있는 바와 같이, 풍습평은 큰 쥐 CMC 낭의 백혈구 집합에 대하여 뚜렷한 억제 작용을 나타내고, 명확한 용량-반응 관계를 보였으며, 또한, 치료 시간이 길어직수록 강한 작용을 나타내었다. 연속하여 7 일간 치료시, 18 g/kg 약량에서도 뚜렷한 억제 작용을 나타내었다. CMC 낭에 프레디니손(prednisone)을 주사하는 경우에도 마찬가지로 뚜렷한 억제 작용을 나타내었다.

실험예 11: 크로통 오일로 인한 작은 쥐 귀의 종창에 미치는 영향

체중이 18 ~ 22 g인 NIH 작은 쥐를 암컷과 수컷의 수를 동일하게 하여 총 60마리 선별하여 무작위로 6 개 군으로 나누었다. 1 회 또는 매일 1 회씩 연속하여 3 일간 약을 내복시켰다. 마지막 치료 후 1 시간 되는 때에 쥐의 좌측 귀의 내외측에 2% 크로통 오일 0.02 ml를 균일하게 도포하였다. 4 시간 후, 경추를 탈구시켜 쥐를 희생시킨 후, 좌우 양측 귀를 취해 칭량하였다. 과우 양측 귀의 중량 차이로 종창도를 나타내었다. 그 결과를 표 11에 나타내었다.

표 11에서 알 수 있는 바와 같이, 풍습평은 크로통 오일로 인한 작은 쥐 귀의 종창에 대하여 뚜렷한 억제 작용을 나타내고, 완만한 용량-반응 관계를 보였으며, 13.5 g/kg 약량하에서 뚜렷한 억제 작용을 나타내었다.

실험예 12: 아세트산으로 인한 작은 쥐의 writhing syndrome에 미치는 영향

체중이 18 ~ 22 g인 곤명종 작은쥐를 암컷과 수컷의 수를 동일하게 하여 총 60 마리 선별하여 무작위로 6 개 군으로 나누었다. 약을 투여한 후, 1 시간 되는 때에 쥐 복강 내에 0.7 % HAC 생리 식염수 0.2 ml를 주사한 후, 유리 용기에 넣어 writhing 증상이 나타나는 시간과 20 분 동안의 writhing 증상의 발생 수를 측정하였다. 그 결과를 표 12에 나타내었다.

표 12에서 알 수 있는 바와 같이, 풍습평은 비교적 큰 약량에서 아세트산으로 인한 작은 쥐의 writhing syndrome의 발생 시간을 지연시키고, 20 분 동안의 writhing 증상의 발생 수를 뚜렷하게 감소시킴으로써 일정한 진통 작용을 나타내었다.

실험예 13: AA 큰 쥐의 혈액 유동학에 미치는 영향

체중이 180±20 g인 SD 큰 쥐를 선별하여 우측 뒷발 발바닥 피부에 완전 프로인트 아쥬반트 (FCA) 0.05 ml를 주사하여 프로인트 아쥬반트성 관절염 모델 (AA)를 만들었다. 대조군은 우측 뒷발 발바닥 피부에 NS 0.05 ml를 주사하였다. 3 주일 후에 AA 쥐를 모델군, 다양한 약량의 풍습평군 및 양성 대조군 (Glucosidorum Tripterygll Totorum을 투여함)으로 나누었다. 큰 쥐에 매일 1 회씩 연속하여 5 일 동안 약을 내복시켰다. 마지막 치료 1 시간 후, 복부 주동맥으로부터 혈액을 3 ml 채취하여 1 % 헤파린 항응고제 시험관에 옮긴 후, NXE-I형 점성계롤 230, 115, 46, 23, 11.5 및 5.75S' 전단률하에서 혈액 점도를 측정하고, WTP-B II 형 모세관 점도계로 혈장 점도를 측정하였으며, 헤마토크리트 원심기 (HAEMATOCRIT CENTRIFUGE)로헤마토크리트, 적혈구 집합 지수 (Aggregation Index of RBC, AI)를 측정한 후, 적혈구 강성 지수 (Index of Rigidity, IR)를 계산하였다. 그 결과를 표 13에 나타내었다.

표 13에서 알 수 있는 바와 같이, AA 큰 쥐의 혈액 유동에 있어서 큰 변화가 관찰되었다. 혈액 점도와 혈장 점도가 커지고, 헤마토크리트가 감소하며, 적혈구 집합 지수 및 적혈구 강성 지수가 증가하였다. 이와 같이, 풍습평은 이상 혈액 유동학 지표를 현저하게 개선할 수 있는 것으로 나타났다.

상기 실험 결과들은 풍습평의 약리 작용을 증명하는 것이며, 풍습평의 다양한 약리 작용은 모두 우수한 용량-반응 관계를 갖는 것으로 나타났고, 이는 임상 사용시 풍습평의 용량을 조절하여 최적의 효과를 거둘 수 있음을 제시하는 것이다.

중국, 일본 및 호주에서 진행되는 임상 실험 결과에 따르면, 국제적 관련 병종의 진단, 치료 및 효과 표준하에서 관찰한 결과, 풍습평 캅셀의 단독 사용시 RA에 대한 유효율은 약 94 %이고, 현효율은 약 60 %이며, 조조 강직 현상 (morning stiffness), 종창과 동통 및 RA 관련 지표를 상당히 빠른 시간 내에 개선할 수 있었다. 그 결과를 표 14 내지 21에 나타내었다.

풍습평은 현저한 치료 효과를 거두는 동시에 환자 혈청의 SIL-2R, STNF, SIL-6R 등 지표의 수치를 감소시킬 수 있었다. 그 결과를 표 21에 나타내었다.

검증한 바에 의하면, 하기의 본 발명의 실시예는 모두 상기와 같은 발명의 효과를 실현할 수 있었다.

실시예 1

음양곽 2222 g, 곤명산해당 2222 g, 구기자 1111 g 및 토사자 1111 g.

곤명산해당을 잘게 썰어 각각 13, 10 및 10 배의 물로 매회 1 시간씩 3 회 추출하였다. 음양곽을 잘게 썰어 각각 15, 10 및 10 배의 물로 매회 1 시간씩 3 회 추출하였다. 구기자를 굵은 가루로 분쇄하여 80 ℃에서 20 배의 물로 1 시간 침출하였다. 토사자를 굵은 가루로 분쇄하여 80 ℃에서 31 배 물로 1 시간 침출하였다. 4 종 약재 각각의 달인 액 또는 침출액을 여과하여 각각에 해당되는 Amberlyst 흡착 컬럼에 통과시킨 후, 70 % 알코올로 세척하였다. 그리고 나서, 세척액의 색깔이 뚜렷이 짙어질 때부터 수집을 시작하여 색깔이 극히 옅어질 때 세척을 끝냈다. 각각의 약재의 세척액 중 알코올을 회수한 후, 농축, 건조시켜 추출물 분말을 얻었다. 4 종 약재의 추출물 분말에 약용 전분을 200 g 될 때까지 첨가한 후, 혼합하여 1000 개 캅셀에 넣었다. 본 발명의 방법으로 조제된 각각의 캅셀의 내용물은 0.2 g이었다. 각각의 캅셀의 내용물 중 이카린(C₃₃H₄₀O₁₅) 함량은 적어도 2.0 mg에 달하였다. 상용 경구 복용량은 매일 3 회, 매회 3 캅셀씩이다.

실시예 2

음양곽 2000 g 및 곤명산해당 2000 g.

곤명산해당을 잘게 썰어서 각각 13, 10, 10 배의 물로 매 회 1 시간씩 3 회 추출하였다. 음양곽을 잘게 썰어서 각각 15, 10, 10 배의 물로 매 회 1 시간씩 3 회 추출하였다. 각각의 약재의 달인 액을 여과하여 각각에 해당되는 Amberlyst 흡착 컬럼에 통과시킨 후, 70 % 알코올로 세척하였다. 그리고 나서, 세척액의 색깔이 뚜렷이 짙어질 때부터 수집을 시작하여 색깔이 극히 연해질 때 세척을 끝냈다. 각각의 약재의 세척액 중 알코올을 회수한 후, 농축, 건조시켜 추출물 분말을 얻었다. 약재의 추출물 분말에 약용 전분을 첨가하고 혼합한 후, 1000 개의 캅셀에 넣었다. 본 발명으로 조제된 각 캅셀의 내용물은 0.2 g이었다. 각 캅셀 내용물 중의 이카린 함량은 적어도 2.0 mg에 달하였다. 상용 경구 복용량은 매일 3 회 매회 3 캅셀씩이다.

실시예 3

곤명산해당 2000 g, 음양곽 2000 g 및 구기자 1000 g.

곤명산해당을 잘게 썰어 각각 13, 10 및 10 배의 물로 매회 1 시간씩 3 회 추출하였다. 음양곽을 썰어 각각 15, 10 및 10 배의 물로 매회 1 시간씩 3 회 추출하였다. 구기자를 굵은 가루로 분쇄하여 80 ℃에서 20 배 물로 1 시간 침출하였다. 각각의 약재 달인 액 또는 침출액을 여과하여 각각에 해당되는 Amberlyst 흡착 컬럼에 통과시킨 후, 70 % 알코올로 세척하였다. 그리고 나서, 세척액의 색깔이 뚜렷이 짙어질 때부터 수집을 시작하여 색깔이 극히 옅어질 때 세척을 끝냈다. 각각의 약재의 세척액 중 알코올을 회수한 후, 농축, 건조시켜 추출물 분말을 얻었다. 3 종 약재의 추출물 분말에 약용 전분을 첨가한 후, 혼합하여, 1000 개 캅셀에 넣었다. 본 발명의 방법으로 조제된 각각의 캅셀의 내용물은 0.2 g이었다. 각각의 캅셀의 내용물 중 이카린(C₃₃H₄₀O₁₅) 함량은 적어도 2.0 mg에 달하였다. 상용 경구 복용량은 매일 3 회, 매회 3 캅셀씩이다.

실시예 4

곤명산해당 2000 g, 음양곽 2000 g 및 토사자 1000 g.

곤명산해당을 잘게 썰어 각각 13, 10 및 10 배의 물로 매회 1 시간씩 3 회 추출하였다. 음양곽을 썰어 각각 15, 10 및 10 배의 물로 매회 1 시간씩 3 회 추출하였다. 토사자를 굵은 가루로 분쇄하여 80 ℃에서 31 배 물로 1 시간 침출하였다. 3 종 약재 달인 액 또는 침출액을 여과하여 각각에 해당되는 Amberlyst 흡착 컬럼에 통과시킨 후, 70 % 알코올로 세척하였다. 그리고 나서, 세척액의 색깔이 뚜렷이 짙어질 때부터 수집을 시작하여 색깔이 극히 옅어질 때 세척을 끝냈다. 각각의 약재의 세척액 중 알코올을 회수한 후, 농축, 건조시켜 추출물 분말을 얻었다. 3 종 약재의 추출물 분말에 약용 전분을 첨가한 후, 혼합하여, 1000 개 캅셀에 넣었다. 본 발명의 방법으로 조제된 각각의 캅셀의 내용물은 0.2 g이었다. 각각의 캅셀의 내용물 중 이카린(C₃₃H₄₀O₁₅) 함량은 적어도 2.0 mg에 달하였다. 상용 경구 복용량은 매일 3 회, 매회 3 캅셀씩이다.

실시예 5

곤명산해당 2000 g 및 토사자 1000 g.

곤명산해당을 잘게 썰어 각각 13, 10 및 10 배의 물로 매회 1 시간씩 3 회 추출하였다. 토사자를 굵은 가루로 분쇄하여 80 ℃에서 31 배 물로 1 시간 침출하였다. 각각의 약재 달인 액 또는 침출액을 여과하여 각각에 해당되는 Amberlyst 흡착 컬럼에 통과시킨 후, 70 % 알코올로 세척하였다. 그리고 나서, 세척액의 색깔이 뚜렷이 짙어질 때부터 수집을 시작하여 색깔이 극히 옅어질 때 세척을 끝냈다. 각각의 약재의 세척액 중 알코올을 회수한 후, 농축, 건조시켜 추출물 분말을 얻었다. 약재의 추출물 분말에 약용 전분을 첨가한 후, 혼합하여, 1000 개 캅셀에 넣었다. 본 발명의 방법으로 조제된 캅셀의 매일 복용량은 생약 30 g/일 용량에 해당된다.

실시예 6

곤명산해당 2000 g 및 구기자 1000 g.

곤명산해당을 잘게 썰어 각각 13, 10 및 10 배의 물로 매회 1 시간씩 3 회 추출하였다. 구기자를 굵은 가루로 분쇄하여 80 ℃에서 20 배 물로 1 시간 침출하였다. 약재 달인 액 또는 침출액을 여과하여 각각에 해당되는 Amberlyst 흡착 컬럼에 통과시킨 후, 70 % 알코올로 세척하였다. 그리고 나서, 세척액의 색깔이 뚜렷이 짙어질 때부터 수집을 시작하여 색깔이 극히 옅어질 때 세척을 끝냈다. 각각의 약재의 세척액 중 알코올을 회수한 후, 농축, 건조시켜 추출물 분말을 얻었다. 약재의 추출물 분말에 약용 전분을 첨가한 후, 혼합하여, 1000 개 캅셀에 넣었다. 본 발명의 방법으로 조제된 캅셀의 매일 복용량은 생약 30 g/일 용량에 해당된다.

Claims

곤명산해당(昆明山海棠, Tripterygium hypoglaucun (Levl.) Hutch.)과, 음양곽(淫羊藿, Epimedium brevicornum Maxim.), 구기자(枸杞子, Lycium barbarum L.) 및 토사자(兎絲子, Cuscuta chinensis Lam., Cuscuta australis R. Br.)로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 약재로 조성된 원재료로부터 조제되는 것을 특징으로 하는 류머티즘 치료제.
제1항에 있어서, 상기 곤명산해당의 함량이 1 내지 4 중량부, 상기 음양곽의 함량이 1 내지 4 중량부, 상기 구기자의 함량이 1 내지 4 중량부, 상기 토사자의 함량이 1 내지 4 중량부인 류머티즘 치료제.
제1항에 있어서, 상기 곤명산해당의 함량이 2 중량부, 상기 음양곽의 함량이 2 중량부, 상기 구기자의 함량이 1 중량부, 상기 토사자의 함량이 1 중량부인 류머티즘 치료제.
제1항에 있어서, 상기 곤명산해당의 유효 성분인 디테르펜, 티르페르펜 및 알칼로이드류 화합물로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 성분, 상기 음양곽의 유효 성분인 이카린, 이카리사이드 I, 이카리사이드 II 및 에피메도사이드 A(epimedoside A)로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 성분, 상기 토사자와 구기자의 유효 성분인 플라본을 사용하여 조제되는 것을 특징으로 하는 류머티즘 치료제.
원재료를 칭량하여, 음양곽과 곤명산해당을 각각 잘게 썰고, 구기자와 토사자는 그대로 또는 분쇄하고, 각각 또는 혼합하여 0 내지 95 % 알코올로 10 내지 98 ℃에서 연속하여 1 내지 4 회 추출하고, 추출액을 각각 또는 혼합하고 알코올을 회수한 후, 농축, 건조, 분쇄, 혼합 또는 비례적으로 혼합하여 임상에 적용 가능한 제제를 제조하는 단계를 포함하거나, 또는

원재료를 칭량하여, 음양곽과 곤명산해당은 각각 잘게 썰어 물로 3 회 달이고, 구기자 또는 토사자는 80 ℃ 내지 95 ℃의 물로 1 내지 3회 침출한 후, 각각의 약재 달인 액 또는 침출액을 혼합한 후, 각각에 해당되는 Amberlyst 흡착 컬럼에 통과시키고, 흡착이 끝난 후 물로 깨끗한 액체가 흘러나올 때까지 컬럼을 세척한 후, 30 내지 99.5 % 알코올로 세척한 다음, 세척액의 색깔이 뚜렷이 짙어질 때부터 수집을 시작하여 색깔이 극히 연해질 때 물로 컬럼 중의 알코올을 씻어 내고, 이 때, 상기 총 세척액의 중량이 약재의 약 1 내지 8 배이며, 각각의 약재의 세척액을 1.10 비중으로 회수, 농축한 후 분무 건조시켜 약재 추출물을 얻은 후, 얻어진 약재 추출물을 일정한 비율로 혼합하여 임상에서 적용 가능한 여러 가지 제제를 조제하는 단계를 포함하는,

제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 류머티즘 치료제의 제조 방법.
임상에서 적용될 수 있는 여러 가지 제제, 예컨대, 경질 캅셀, 연질 캅셀, 정제, 과립제, 주사제 등을 포함하는 약물 완제픔을 만들 수 있는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 류머티즘 치료제의 제조 방법.
곤명산해당은 잘게 썰어 각각 13, 10, 10 배의 물로 매회 1 시간씩 3 회 추출해내고, 음양곽은 썰어 각각 15, 10, 10 배의 물로 매회 1 시간씩 3 회 추출해내고, 구기자는 굵은 가루로 분쇄하여 80 ℃ 내지 95 ℃에서 20 배 물로 1 시간 침출하고, 토사자는 굵은 가루로 분쇄하여 90 ℃에서 31 배 물로 1 시간 침출한 후, 4 종의 약재 각각의 달인액 또는 침출액을 여과하여 각각에 해당되는 WLD 또는 D₁₀₁또는 기타 형의 Amberlyst 흡착 컬럼에 통과시킨 후 70 % 알코올로 세척한 다음, 세척액의 색깔이 뚜렷이 짙어질 때부터 수집을 시작하여 색깔이 극히 연해질 때 세척을 끝내고, 각각의 약재의 세척액 중 알코올을 회수한 후 농축, 건조시켜 추출물 분말을 얻은 후, 얻어진 추출물 분말을 일정한 비율로 혼합하여 임상에서 사용 가능한 여러 제제로 조제하는 단계를 포함하는,

제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 류머티즘 치료제의 제조 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 류머티즘 치료제의 풍습성 관절염 치료제 및 류머티스성 관절염 치료제의 조제에 있어서의 용도.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 류머티즘 치료제의 전신성 혼반성 낭창(systematic lupus erythematosus) 치료제의 조제에 있어서의 용도.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 류머티즘 치료제의 만성 신장염, 크론씨병(Crohn's disease) 나병(leprosy) 등 자체 면역성 질병 치료제 조제에 있어서의 용도.