CN112899217A - 含药肝孵育液药理法及麻杏石甘汤含药肝孵育液制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含药肝孵育液药理法及麻杏石甘汤含药肝孵育液的制备方法，本发明将经口服给药的中药按临床方法加工，取水煎液采用外翻肠囊法获得含药肠吸收液，取该含药肠吸收液与肝细胞悬液短时间孵育后，制备成含药肝孵育液，用于离体的组织器官、细胞等药理学试验。本发明所制备的含药肝孵育液，较为真实地反映了中药复方进入体内化学成分的实际移行或转化状况，并具有条件严格可控、干扰少、有效成分含量高、组间标准偏差小等优点，用于体外药理学研究，而无血清本身内源性成分的干扰，故稳定性高、重现性好，更为适合中药复方的体外药理作用及其机制探讨。
Description
技术领域
本发明涉及中药复方新的体外药理学研究方法，尤其是涉及一种含药肝孵育液药理法及麻杏石甘汤含药肝孵育液的制备方法。
背景技术
体外药理研究在药物的活性筛选，毒性评价，深入的细胞、分子药理等研究中起重要作用。西药多为单一化合物，故溶于适当溶媒后即可直接开展体外药理学实验研究。中药尤其是复方因其组成药味多、成分复杂，直接添加法因其粗提液的理化性质如杂质、酸碱度、渗透压、pH值等都可对离体实验带来干扰；血清药理法作为中药复方经典的体外药理研究方法，广泛运用于其作用机理、物质基础和配伍理论等方面的探讨，然而由于涉及血清这一复杂体系，致使其稳定性、重现性、假阳性等困扰均难以克服；含药肠吸收液药理法有操作简便、成分含量高、干扰少、重现性好等优点，可用于中药复方药效物质基础的研究和有效成分的辨识，但因其未模拟口服中药复方体内的肠吸收后通过门静脉经肝入血的全过程，故与中药成分体内的实际移行或转化状况不完全相符；脑脊液药理学是用含药脑脊液代替含药血清进行体外中药神经药理学研究，由于脑脊液量少、获取不易，仅限于体外神经药理研究。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种含药肝孵育液药理法，该方法通过体外肠吸收法获取中药复方的含药肠吸收液，再经肝细胞短时间孵育而制备的，并用之于体外药理研究的新方法。
本发明的第二个目的在于通过正交试验设计提供一种麻杏石甘汤含药肝孵育液的制备方法。
本发明的第一个目的是这样实现的：
一种含药肝孵育液药理法，特征是：经口服给药的中药按临床方法加工，得到该中药的水煎液；将该水煎液采用外翻肠囊法37℃温育，获得含药肠吸收液；取该含药肠吸收液与肝细胞悬液孵育30分钟以内，制备成含药肝孵育液，用于离体的组织器官、细胞等药理学试验。
本发明的第二个目的是这样实现的：
一种麻杏石甘汤含药肝孵育液的制备方法，特征是：具体步骤如下：
A、按临床煎煮方法，先将麻黄、石膏加入方药总量的8倍水，浸泡30分钟，加热至沸腾，改用小火煎煮30min，依次加入甘草和苦杏仁，煎煮40min，趁热过滤得到麻杏石甘汤，将麻杏石甘汤浓缩后定容于1g生药/mL的药液，取该药液采用外翻肠囊法温育2小时，取肠囊液得到含药肠吸收液；
B、取肝细胞悬液1×104个/mL-1×106个/mL与含药肠吸收液按体积比1:8-1:12混合均匀，37℃孵育10-30分钟，离心取上清液，即得麻杏石甘汤含药肝孵育液。
本发明将经口服给药的中药按临床方法加工，取水煎液采用外翻肠囊法获得含药肠吸收液，取该含药肠吸收液与肝细胞悬液短时间孵育后，制备成含药肝孵育液，用于离体的组织器官、细胞等药理学试验。本发明所制备的含药肝孵育液，较为真实地反映了中药复方进入体内化学成分的实际移行或转化状况，并具有条件严格可控、干扰少、有效成分含量高、组间标准偏差小等优点；用于体外药理学研究而无血清本身内源性成分的干扰，故稳定性高、重现性好，更为适合中药复方的体外药理作用及其机制探讨。
附图说明
图1为麻黄碱和伪麻黄碱的HPLC色谱图，(A)混合对照品；(B)阴性对照；(C)供试品；
图2为苦杏仁苷的HPLC色谱图，(A)苦杏仁苷对照品；(B)阴性对照；(C)供试品；
图3为甘草酸铵的HPLC色谱图，(A)甘草酸铵对照品；(B)阴性对照；(C)供试品；
图4为麻黄碱的标准曲线图；
图5为伪麻黄碱的标准曲线图；
图6为苦杏仁苷的标准曲线图；
图7为甘草酸铵的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
1.正交试验设计含药肝孵育液制备工艺
选用L9(34)正交表，将肝细胞密度(A，细胞悬液个/mL)、体积比(B，肝细胞悬液：肠吸收液)、孵育时间(C，min)作为3个因素，各取3个水平，采用HPLC检测麻杏石甘汤含药肠吸收液制备的9组含药肝孵育液中麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草酸铵的含量，得出较优制备条件。正交试验见表1和表2。
表1含药肝孵育液制备工艺正交试验因素水平
| 试验号 | A细胞密度(个/mL) | B体积比 | C时间(min) |
| 1 | 1×10<sup>4</sup> | 1:8 | 10 |
| 2 | 1×10<sup>5</sup> | 1:10 | 20 |
| 3 | 1×10<sup>6</sup> | 1:12 | 30 |
表2含药肝孵育液制备工艺L9(34)正交试验设计
2.色谱条件麻黄碱、伪麻黄碱：色谱柱为Syncrgi olar-RP(250mm×4.6mm，4μm)；流动相为0.1％磷酸水(含0.04％三乙胺和0.02％二正丁胺)-甲醇＝99.9：0.1，柱温为30℃，流速为1.0mL·min-1，检测波长为210nm，进样量为10μL。苦杏仁苷：色谱柱为SyncrgiPolar-RP(250mm×4.6mm，4μm)，流动相为纯水-乙腈＝90:10，柱温为30℃，流速为1.0mL·min-1，检测波长为210nm，进样量为10μL。甘草酸铵：色谱柱为TC-C18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为0.05％磷酸水-乙腈＝60:40，柱温为30℃，流速为1.0mL·min-1，检测波长为237nm，进样量为10μL。
3.溶液的制备
3.1对照品溶液的制备精密称取对照品甲基麻黄碱(0.0188g)、甲基伪麻黄碱(0.0126g)、苦杏仁苷(0.0325g)、甘草酸铵(0.005g)，用适量50％甲醇溶解，超声5min后定容至50ml，配置得到相应浓度的混合对照品储备液。
3.2供试品溶液的制备将冻存备用的放入37℃的水浴锅中解冻10min，室温静置2h，精密吸取9个试验号的麻杏石甘汤肝细胞孵育液1.5mL，加入等量甲醇，涡旋10s，12000rpm离心10min，取上清液，0.22μm微孔膜滤过，得供试品溶液。
3.3阴性样品溶液的制备按处方工艺分别制备缺麻黄、缺苦杏仁、缺炙甘草的阴性样品，精密吸取1.5mL，加入等量甲醇，涡旋10s，12000rpm离心10min，取上清液，0.22μm微孔膜滤过，得供试品溶液。
4.制备工艺方法学考察
4.1专属性试验分别精密吸取麻黄碱和伪麻黄碱混合对照品溶液、苦杏仁对照品溶液和甘草酸铵对照品溶液以及对应的供试品溶液和阴性样品溶液各10μL，按2.项下色谱条件进样分析，记录色谱峰。结果显示，阴性样品无对照品色谱峰出现，表明供试品中其他药味对结果无影响。色谱峰见附图1-3。
4.2标准曲线的制备精确吸取麻黄碱、伪麻黄碱混合对照品储备液2，4，6，8，10mL分别置于10mL容量瓶中，用50％甲醇稀释至刻度，制得系列浓度梯度的标准曲线溶液。溶液经0.22μm有机微孔滤膜滤过后，按2.项下色谱条件进样分析，记录峰面积。以质量浓度(μg·mL-1)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，见图4。经计算得，麻黄碱的线性回归方程为Y＝18415X-26470(R2＝0.9989)，在37.6g·mL-1～376.0μg·mL-1浓度范围内线性关系稳定。伪麻黄碱的线性回归方程为Y＝20687X-39930(R2＝0.9986)，在25.14μg·mL-1～251.40μg·mL-1浓度范围内线性关系稳定。标准曲线见见附图4、5。
分别精确吸取苦杏仁苷和甘草酸铵对照品储备液各2，4，6，8，10mL，分别置于10mL容量瓶中，用50％甲醇稀释至刻度，制得系列浓度梯度的标准曲线溶液。溶液经0.22μm有机微孔滤膜滤过后，按2.项下色谱条件进样分析，记录峰面积。以质量浓度(μg·mL-1)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，见图7。经计算得苦杏仁苷的线性归回方程为Y＝7807.6X-151382(R2＝0.9990)，在0.625μg·mL-1～650.000μg·mL-1浓度范围内线性关系稳定。甘草酸铵的线性回归方程为Y＝6486.6X-106397(R2＝0.9989)，在20μg·mL-1～100μg·mL-1浓度范围内线性关系稳定。标准曲线见见附图6、7。
4.3精密度试验分别精密吸取麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草酸铵对照品溶液各10μL，按2.项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草酸铵峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.07％、0.09％、0.12％、0.15％，表明方法精密度良好。
4.4重复性试验平行制备麻杏石甘汤含药肝孵育液供试品溶液6份，0.22μm微孔滤膜滤过，进样10μL，按2.3项下色谱条件进样分析，记录峰面积。结果样品中麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草酸铵峰面积RSD分别为1.32％、1.45％、0.98％、1.12％，表明建立的HPLC检测方法有着良好的重复性。
4.5稳定性试验取麻杏石甘汤含药肝孵育液供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、12、24h后进样10μL，记录峰面积。结果样品中麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草酸按峰面积RSD分别为0.88％、1.32％、1.21％，表明供试品溶液在室温条件下24h内稳定。
5.供试品溶液的含量测定
按3.2项下制备供试品溶液，按2.项下色谱条件进样分析，每个试验号检测3个样品，记录色谱图，得出峰面积，代入标准曲线，分别计算供试样品的含量，并以上述四个成分的含量作为总指标进行方差分析，结果见表3、表4。
表3供试品含量测定结果
表4方差分析表
| 方差来源 | 自由度(f) | 离均差平方和 | 均方 | F | P |
| A | 2 | 2906.910 | 1453.455 | 75.793 | 0.013 |
| B | 2 | 13953.537 | 6976.769 | 363.815 | 0.003 |
| C | 2 | 8097.358 | 4048.679 | 211.125 | 0.005 |
结合以上正交试验表以及供试品含量测定表可知，麻杏石甘汤含药肝孵育液最佳制备工艺为A2B3C1，即当BRL-3A细胞密度为1×105个/mL、肝细胞悬液：含药肠吸收液＝1：12、孵育时间为10min时，四种供试品成分含量均最高，故选择该条件为含药肝孵育液的最佳制备条件。根据方差分析表可知，各因素对供试品含量的影响为B>C>A，说明体积比(细胞悬液：肠吸收液)对供试品含量的影响最为显著。
Claims (2)
1.一种含药肝孵育液药理法，其特征在于：经口服给药的中药按临床方法加工，得到该中药的水煎液；将该水煎液采用外翻肠囊法37℃温育，获得含药肠吸收液；取该含药肠吸收液与肝细胞悬液孵育30分钟以内，制备成含药肝孵育液，用于离体的组织器官、细胞这些药理学试验。
2.一种麻杏石甘汤含药肝孵育液的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
A、按临床煎煮方法，先将麻黄、石膏加入方药总量的8倍水，浸泡30分钟，加热至沸腾，改用小火煎煮30 min，依次加入甘草和苦杏仁，煎煮40 min，趁热过滤得到麻杏石甘汤，将麻杏石甘汤浓缩后定容于1 g生药/mL的药液，取该药液采用外翻肠囊法温育2小时，取肠囊液得到含药肠吸收液；
B、取肝细胞悬液1×104个/mL-1×106个/mL与含药肠吸收液按体积比1:8-1:12混合均匀，37℃孵育10-30分钟，离心取上清液，即得麻杏石甘汤含药肝孵育液。
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