KR101470690B1 - Ｉｌ－６ｒ에 대한 개선된 아미노산 서열 및 ｉｌ－６ｒ 관련 질환 및 질병의 치료를 위한 그를 포함하는 폴리펩티드 - Google Patents

Ｉｌ－６ｒ에 대한 개선된 아미노산 서열 및 ｉｌ－６ｒ 관련 질환 및 질병의 치료를 위한 그를 포함하는 폴리펩티드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인터루킨-6 수용체에 대한 것, 및/또는 개선된 친화도 및/또는 결합력으로 그에 특이적으로 결합할 수 있는 것으로서, 유효성 및/또는 효능이 개선되고, IL-6/IL-6R 상호작용을 (부분적으로 또는 바람직하게는 전체적으로) 차단할 수 있고/거나, IL-6, IL-6R 및/또는 IL-6/IL-6R 복합체를 통해 일어나는 신호전달을 억제시키는 아미노산 서열에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상기 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 그로 구성된 화합물 또는 컨스트럭트, 및 특히 단백질 및 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 아미노산 서열 및 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 상기 아미노산 서열 및 폴리펩티드를 제조하는 방법, 상기 아미노산 서열 또는 폴리펩티드를 발현하거나 또는 발현시킬 수 있는 숙주 세포, 상기 아미노산 서열, 폴리펩티드, 핵산 및/또는 숙주 세포를 포함하는 약학 조성물, 및 특히 예방학적, 치료학적, 또는 진단학적 목적을 위한 상기 아미노산 서열 또는 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포 및/또는 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

ＩＬ－６Ｒ에 대한 개선된 아미노산 서열 및 ＩＬ－６Ｒ 관련 질환 및 질병의 치료를 위한 그를 포함하는 폴리펩티드{IMPROVED AMINO ACID SEQUENCES DIRECTED AGAINST IL-6R AND POLYPEPTIDES COMPRISING THE SAME FOR THE TREATMENT OF IL-6R RELATED DISEASES AND DISORDERS}
본 발명은 인터루킨-6 수용체(IL-6R: Interleukin-6R Receptor)에 대한, 및/또는 (본원에 정의된 바와 같이) 그에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열 뿐만 아니라, 하나 이상의 상기 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 그로 구성된 화합물 또는 컨스트럭트, 및 특히 단백질 및 폴리펩티드(이는 또한 본원에서 "본 발명의 아미노산 서열," "본 발명의 화합물," "본 발명의 컨스트럭트," 및 "본 발명의 폴리펩티드"로도 지칭된다)에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 아미노산 서열 및 폴리펩티드를 코딩하는 핵산(이는 또한 본원에서 "본 발명의 핵산" 또는 "본 발명의 뉴클레오티드 서열"로도 지칭된다); 상기 아미노산 서열 및 폴리펩티드를 제조하는 방법; 상기 아미노산 서열 또는 폴리펩티드를 발현하거나 발현할 수 있는 숙주 세포; 상기 아미노산 서열, 폴리펩티드, 핵산 및/또는 숙주 세포를 포함하는 조성물, 특히 약학 조성물; 및 상기 아미노산 서열, 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포 및/또는 조성물의 용도, 특히 예방학적, 치료학적 또는 진단학적 목적, 예컨대, 본원에 언급된 예방학적, 치료학적 또는 진단학적 목적을 위한 이들의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면, 실시양태, 이점 및 적용성은 본원의 추가의 설명으로부터 명백해질 것이다.
원래는 B 세포 분화 인자로서 동정된 단백질인 IL-6(문헌 ([Hirano et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 5490-4]; EP 0257406))과 IL-6R(문헌 ([Yamasaki et al., 1988, Science, 241: 825-8]; EP 0325474))의 상호작용을 통해 IL-6/IL-6R 복합체가 형성된다. 이러한 복합체는 IL-6의 다양한 생리학적 작용을 전달하는 표적 세포 상의 막 단백질인 gp130에 결합한다(문헌 ([Taga et al., 1989, Cell, 58: 573-81]; EP 0411946)). IL-6은 현재 그 중에서도 특히 면역 반응, 조혈, 급성기 반응, 골 대사, 혈관형성, 및 혈관형성 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다. IL-6 생산의 탈조절화는 수개의 자가면역 및 만성 염증 증식성 질환 과정의 병상과 관련이 있다(문헌 [Ishihara and Hirano, 2002, Biochim. Biophys. Acta, 1592: 281-96]). 그 결과, IL-6 유도성 신호전달의 억제제가 과거에는 많은 관심을 불러 일으켰다(문헌 [Hirano et al., 1990, Immunol, Today, 11: 443-9]). IL-6(문헌 ([Klein et al., 1991, Blood, 78: 1198-204]; EP 0312996)), IL-6R (EP 0409607) 또는 gp130(문헌 [Saito et al., 1993, J. Immunol. Methods, 163:217-223]; EP 057211))에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드가 IL-6의 기능 발휘를 효율적으로 억제시키는 억제 효과를 나타낸다는 것이 입증되었다.
IL-6의 과잉생산 및 신호전달(및 특히 트랜스 신호전달)은 각종 질환 및 질병, 예컨대, 패혈증(문헌 [Starnes et al., 1999, J. Immunol., 148:1968]) 및 각종 형태의 암, 예컨대, 다발 골수종(MM: multiple myeloma) 질환, 신장 세포 암종(RCC: renal cell carcinoma), 혈장 세포 백혈병(문헌 [Klein et al., 1991]), 림프종, B 림프구증식 질병(BLPD: B lymphoproliferative disorder) 및 전립선암에 관여한다. 과도한 IL-6 생산 또는 신호전달에 의해 유발되는 다른 질환의 예로서 비제한적으로는 골재흡수(골다공증)(문헌 ([Roodman et al., 1992, J. Bone Miner. Res, 7:475-8]; [Jilka et al., 1992, Science, 257:88-91]), 악액질(문헌 ([trassman et al. 1992, J. Clin. Invest. 89:1681-1684]), 건선, 혈관사이세포 증식성 사구체신염, 카포시 육종, AIDS 관련 림프종(문헌 [Emilie et al., 1994 Int. J. Immunopharmacol 16:391-6]), 염증성 질환 및 질병, 예컨대, 류마티스 관절염, 전신적으로 발병된 청소년성 특발성 관절염, 고감마글로불린혈증(문헌 [Grau et al., 1990, J. Exp. Med. 172:1505-8]), 크론병, 궤양성 대장염, 전신 홍반 루푸스(SLE: systemic lupus erythematosus), 다발 경화증, 캐슬만씨 병, IgM 감마글로불린병증, 심장 점액종, 천식(특히, 알레르기성 천식) 및 자가면역 인슐린 의존 당뇨병(문헌 [Campbell et al., 1991, J. Clin. Invest. 87:739-742])을 포함한다. 다른 IL-6 관련 질병도 숙련가에게는 명백해질 것이다.
예를 들면, 상기 참고 문헌으로부터 알 수 있는 바와 같이, 선행 기술에는 IL-6 관련 질병 예방용 및 치료용의, 인간 IL-6, 인간 IL-6R 및 인간 gp130 단백질에 대한 항체 및 항체 단편이 기술되어 있다. 일례로 토실리주맙(문헌 ([Woo et al., 2005, Arthritis Res. Ther. 7:1281-8], [Nishimoto et al., 2005, Blood 106:2627-32], [Ito et al., 2004, Gastroenterology, 126:989-96], [Choy et al., 2002, Arthritis Rheum 46:3143-50]) 참조), BE8(문헌 ([Bataille et al., 1995, Blood 86:685-91], [Emilie et al., 1994, Blood 84:2472-9], [Beck et al., 1994 N. Engl. J. Med. 330:602-5], [Wendling et al., 1993, J. Rheumatol. 20:259-62]) 참조) 및 센토코어(Centocor)의 CNTO-328(문헌 ([Journal of Ciinical Oncology, 2004, 22/14S:2560], [Journal of Clinical Oncology, 2004, 22/14S 2608, Int. J. Cancer, 2004, 111:592-5]) 참조)이 있다. IL-6 관련 질병의 예방용 및 치료용으로서 당업계에 공지되어 있는 또 다른 활성 성분으로는 가용성 gp130의 Fc 융합체(문헌 ([Becker et al.2004, Immunity, 21:491-501], [Doganic et al., 2005, J. Clin. Invest. 115:313-25], [Nowell et al., 2003, J. Immunol. 171:3202-9], [Atreya et al., 2000, Nat. Med. 6:583-8]) 참조)가 있다. IL-6R에 대한 아미노산 서열 및 나노바디, 및 이를 포함하는 폴리펩티드가 WO 08/020079에 기술되어 있다.
본 발명의 요약
본 발명의 구체적이지만, 비제한적인 목적은 선행 기술의 아미노산 서열, 항체 및 나노바디와 비교하였을 때, 다른 이로운 특성들(예컨대, 제조 용이성 개선 및/또는 제품 생산 비용 절감) 이외에도 치료학적 및/또는 약리학적 특성이 개선된 아미노산 서열, 폴리펩티드 및 치료학적 화합물 및 조성물을 제공하고자 하는 것이다. 이와 같이 개선된 이로운 특성들은 본원 추가 설명으로부터 명백해질 것이다. 제한없이, 본 발명에 의해 제공되는 아미노산 서열, 폴리펩티드 및 치료학적 화합물 및 조성물은 개선된 결합 및/또는 친화도, 개선된 결합력, 개선된 유효성 및/또는 효능, 증가된 선택성을 가질 수 있고/거나, IL-6/IL-6R 상호작용을 부분적으로 또는 바람직하게는 전체적으로 차단할 수 있고/거나, IL-6, IL-6R 및/또는 IL-6/IL-6R 복합체를 통해 일어나는 신호전달을 억제시킬 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 목적은 (본원에서 정의되는 바와 같은) 하나 이상의 IL-6R 관련 질병의 진단, 예방 및/또는 치료에서 사용될 수 있는, 약리학적 활성제 뿐만 아니라, 상기를 포함하는 조성물, 및 상기 제제 및 조성물의 투여 및/또는 사용을 포함한, 상기 질환 및/또는 질병의 진단, 예방 및/또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 인터루킨-6 수용체에 대한 것, 및/또는 (본원에 정의된 바와 같이) 그에 특이적으로 결합할 수 있는 것으로서, 친화도 및/또는 결합력이 개선되고/거나, 유효성 및/또는 효능이 개선되고, IL-6/IL-6R 상호작용을 (부분적으로 또는 바람직하게는 전체적으로) 차단할 수 있고/거나, IL-6, IL-6R 및/또는 IL-6/IL-6R 복합체를 통해 일어나는 신호전달을 억제시키는 아미노산 서열(이는 또한 본원에서 "본 발명의 아미노산 서열(들)"로도 지칭된다)에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은
하기
a) 서열번호 80-82; 또는
b) 서열번호 80-82 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치; 및/또는
c) 서열번호 84-91; 또는
d) 서열번호 84-91 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치; 및/또는
e) 서열번호 93-95; 또는
f) 서열번호 93-95 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로부터 선택되는 아미노산 잔기의 스트레치를 하나 이상 포함하는 아미노산 서열을 제공한다.
IL-6R 상의 그의 에피토프에 결합하기 위해 아미노산 서열은 보통 그의 아미노산 서열 내에 그를 통해 본 발명의 아미노산 서열이 IL-6R 상의 에피토프에 결합할 수 있도록 하는 것인 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 하나 이상의 아미노산 잔기의 스트레치(이는 본원에서 추가로 정의되는 바와 같다; 즉, 각각의 "스트레치"는 서로서로 인접해 있거나, 또는 서로 근접한 위치에 있는, 즉, 아미노산 서열이 1차 또는 3차 구조로 있는 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다) 포함할 것이다. 따라서, 이러한 아미노산 잔기, 또는 아미노산 잔기의 스트레치는 IL-6R 상의 에피토프에의 결합을 위한 "부위"(본원에서 추가로 정의되는 바와 같이 이는 또한 본원에서 "항원 결합 부위"로서도 지칭된다)를 형성한다.
본 발명은 특히 IL-6R 상의 특이적인 에피토프에의 결합에 적합한 (본원에서 정의되는 바와 같은) 다수의 아미노산 잔기의 스트레치를 제공한다. 이러한 아미노산 잔기의 스트레치는 특히 본 발명의 아미노산 서열의 항원 결합 부위(의 일부)를 형성할 수 있는 방식으로 본 발명의 아미노산 서열 중에 존재하고/거나, 그에 도입되어 있을 수 있다. 그 결과, 생성된 아미노산 서열은 IL-6R 상의 IL-6 결합 부위에 존재하거나, 그의 일부를 형성하거나, (1차 또는 3차 구조로) 그와 중복되어 있거나, 또는 (1차 또는 3차 구조로) 그와 근접한 위치에 있는 IL-6R 상의 특이적인 에피토프와 (예를 들면, IL-6과 경쟁적으로) 결합하고, 그 결과, 생성된 아미노산 서열은 IL-6/IL-6R 상호작용을 부분적으로 또는 바람직하게는 전체적으로 차단할 수 있고/거나, IL-6, IL-6R 및/또는 IL-6/IL-6R 복합체를 통해 일어나는 신호전달을 억제시킨다. 이와 관련하여, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 IL-6 수용체에의 결합에 대해 IL-6과 경쟁할 수 있는 것이 바람직하다. 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 예를 들어, 실시예 11에 기술되어 있는 것과 같은 분석법에서, 상업적으로 이용가능한 인간과 마우스로 재구성된 키메라 모노클로날 항IL-6R 항체인 토실리주맙(MRA)(Chugai/Roche) 또는 그의 항원 결합 단편(예를 들어, 문헌 (WO 92/19759 및 그에 상응하는 유럽 특허 EP 0628639 뿐만 아니라, [Shinkura et al., 1998, Anticancer Research 18:1217-1222]) 참조)과 IL-6 수용체에의 결합에 대해 경쟁할 수 있는 것이 바람직하고/거나, 토실리주맙과 동일한 IL-6R 상의 에피토프 또는 결합 부위에, 또는 상기 결합 부위에 근접해 있는 에피토프 및/또는 상기 결합 부위와 중복되어 있는 에피토프에 결합할 수 있는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 아미노산 서열은 IL-6 수용체에의 결합에 대해 서열번호 1 및 2에 정의된 바와 같은 참조 IgG 및/또는 서열번호 3 및 4(실시예 1 참조)에 정의된 바와 같은 참조 Fab와 경쟁할 수 있고/거나, 상기 참조 IgG 또는 상기 참조 Fab와 동일한 IL-6R 상의 에피토프 또는 결합 부위에, 또는 상기 결합 부위에 근접해 있는 에피토프 및/또는 상기 결합 부위와 중복되어 있는 에피토프에 결합할 수 있는 것이 바람직하다. 서열번호 1 및 4 뿐만 아니라, 상기 참조 IgG 및 참조 Fab의 제조 및 서열에 대해서는 하기 실시예 1을 참조한다.
이러한 아미노산 잔기의 스트레치가 본 발명의 아미노산 서열이 (본원에서 추가로 정의되는 바와 같이) 특정의 친화도 및/또는 효능을 가지고 IL-6R 상의 특이적인 에피토프에 결합할 수 있도록 하는 한, 본 발명은 그의 가장 광범위한 의미에 있어 이러한 아미노산 잔기의 스트레치가 본 발명의 아미노산 서열에서 가질 수 있는 특이적인 구조적인 역할 또는 기능으로 제한되는 것은 아니라는 점에 주의하여야 한다. 따라서, 일반적으로 본 발명은 그의 가장 광범위한 의미에서 IL-6R 상의 특이적인 에피토프에 결합할 수 있고, 전체 아미노산 서열이 IL-6R 상의 특이적인 에피토프에 결합할 수 있는 결합 도메인 및/또는 결합 유닛을 형성할 수 있도록 하기 위해 하나 이상의 추가의 아미노산 서열을 통해 서로서로 적합하게 연결되어 있는, 본원에서 정의된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 잔기의 스트레치(및 특히 2개 이상의 상기 아미노산 잔기의 스트레치의 적합한 조합물)를 포함하는 임의의 아미노산 서열을 포함한다. 그러나, 또한 본 발명의 아미노산 서열 중 단 하나의 상기와 같은 아미노산 잔기의 스트레치가 단독으로 존재하는 것도 이미 IL-6R 상의 특이적인 에피토프에 결합할 수 있는 본 발명의 아미노산 서열을 제공하는 데에는 충분할 수 있다는 것에도 주의하여야 한다(예를 들어, WO 03/050531에 소위 "Expedite fragments"이라고 지칭되는 것을 재차 참조할 수 있다).
이러한 특이적인 아미노산 잔기의 스트레치를 하나 이상 포함하는 아미노산 서열은 IL-6/IL-6R 상호작용을 부분적으로 또는 전체적으로 차단할 수 있고/거나, IL-6, IL-6R 및/또는 IL-6/IL-6R 복합체를 통해 일어나는 신호전달을 억제시킬 수 있는 능력 이외에도 개선된 특성, 예컨대, 개선된 결합 및/또는 친화도, 개선된 결합력, 개선된 유효성 및 효능, 및/또는 증가된 선택성을 보인다.
더욱 특히, 이러한 특이적인 아미노산 잔기의 스트레치를 하나 이상 포함하는 본 발명의 아미노산 서열은 바람직하게는:
- 1 nM 내지 1 pM 또는 그 이하, 바람직하게, 500 pM 내지 1 pM 또는 그 이하, 더욱 바람직하게, 100 pM 내지 1 pM 또는 이하, 또는 더욱더 바람직하게, 약 50 pM 내지 1 pM 또는 그 이하의 해리 상수(KD)로 hIL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 1 nM 내지 1 pM 또는 그 이하, 바람직하게, 500 pM 내지 1 pM 또는 그 이하, 더욱 바람직하게, 100 pM 내지 1 pM 또는 그 이하, 또는 더욱더 바람직하게, 약 50 pM 내지 1 pM 또는 그 이하의 해리 상수(KD)로 시아노 IL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 104 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 바람직하게, 105 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1 , 더욱 바람직하게, 약 106 M-1s-1 또는 그 이상인 k온 속도로 hIL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 104 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 바람직하게, 105 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 더욱 바람직하게, 약 106 M-1s-1 또는 그 이상인 k온 속도로 시아노 IL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 10-3 s-1 (t½=0.69 s) 내지 10-6 s-1(이는 t½이 여러 일인 거의 비가역적인 복합체 제공), 바람직하게, 10-4 s-1 내지 10-6 s-1, 더욱 바람직하게, 10-5 s-1 내지 10-6 s-1, 예컨대, 약 10-5 s-1 또는 그 이하인 k오프 속도로 hIL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 10-3 s-1 (t½=0.69 s) 내지 10-6 s-1(이는 t½이 여러 일인 거의 비가역적인 복합체 제공), 바람직하게, 10-4 s-1 내지 10-6 s-1, 더욱 바람직하게, 10-5 s-1 내지 10-6 s-1, 예컨대, 약 10-5 s-1 또는 그 이하인 k오프 속도로 시아노 IL-6R에 결합할 수 있도록 하는 (적합하게는 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, KD 값(실제값 또는 겉보기 값), KA 값(실제값 또는 겉보기 값), k온 속도 및/또는 k오프 속도, 또는 별법으로 IC50 값으로 측정되고/거나 표현되는) 친화도로 IL-6에 결합할 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열의 IL-6R에의 결합에 대한 일부 바람직한 IC50 값은 본원 추가의 설명 및 실시예로부터 명백해질 것이다.
예를 들면, 문헌 [Kitamura et al., (1989, J. Cell Physiol., 140:323])에 기술되어 있는 바와 같은 TF1 분석법에서, 본 발명의 아미노산 서열은 (100 IU/mL IL-6에서) 10 nM 내지 50 pM, 바람직하게, 5 nM 내지 50 pM, 더욱 바람직하게, 1 nM 내지 50 pM 또는 그 이하, 예컨대, 약 750 또는 500 pM 또는 그 이하의 IC50 값을 가질 수 있다. TF1 분석법에서, 본 발명의 아미노산 서열은 (5,000 IU/mL IL-6에서) 50 nM 내지 1 nM, 바람직하게, 25 nM 내지 1 nM, 더욱 바람직하게, 10 nM 내지 1 nM 또는 그 이하, 예컨대, 약 8 nM 또는 그 이하의 IC50 값을 가질 수 있다. 이러한 TF1 분석법에서, 본 발명의 아미노산 서열은 서열번호 1 및 2에 의해 정의되는 바와 같은 참조 IgG 또는 서열번호 3 및 4에 의해 정의되는 바와 같은 참조 Fab에 대하여 관찰된 IC50 값과 비교하여 적어도 동일, 및 바람직하게는 적어도 2배, 바람직하게, 3배, 더욱 바람직하게, 4배, 더욱더 바람직하게, 5배, 7배 또는 7배 초과로 더 우수한 IC50 값을 가질 수 있다(실시예 1 참조). 이러한 TF1 분석법에서, 본 발명의 아미노산 서열은 토실리주맙(MRA)에 대하여 관찰된 IC50 값과 비교하여 적어도 동일, 및 바람직하게는 적어도 2배, 바람직하게, 3배, 더욱 바람직하게, 4배, 더욱더 바람직하게, 5배, 7배 또는 7배 초과로 더 우수한 IC50 값을 가질 수 있다.
(예컨대, 실시예 45에 기술되어 있는 바와 같이, 27.29 ng/mL IL-6의 존재하에서) IL-6 EC50 값에서의 혈장 효능 분석법에서, 본 발명의 아미노산 서열은 500 pM 내지 50 pM, 바람직하게, 250 pM 내지 50 pM, 더욱 바람직하게, 200 pM 내지 50 pM 또는 그 이하, 예컨대, 150 pM 또는 그 이하의 IC50 값을 가질 수 있다. (예컨대, 실시예 45에 기술되어 있는 바와 같이, 885 ng/mL IL-6의 존재하에서) IL-6 EC95 값에서의 혈장 효능 분석법에서, 본 발명의 아미노산 서열은 1,000 pM 내지 100 pM, 바람직하게, 750 pM 내지 100 pM, 더욱 바람직하게, 500 pM 내지 100 pM 또는 그 이하, 예컨대, 400 pM 또는 그 이하의 IC50 값을 가질 수 있다. 이러한 혈장 효능 분석법에서, 본 발명의 아미노산 서열은 서열번호 1 및 2에 의해 정의되는 바와 같은 참조 IgG 또는 서열번호 3 및 4에 의해 정의되는 바와 같은 참조 Fab에 대하여 관찰된 IC50 값과 비교하여 적어도 동일, 및 바람직하게는 적어도 2배, 바람직하게, 3배, 더욱 바람직하게, 4배, 더욱더 바람직하게, 5배, 7배 또는 7배 초과로 더 우수한 IC50 값을 가질 수 있다(실시예 1 참조). 이러한 혈장 효능 분석법에서, 본 발명의 아미노산 서열은 토실리주맙(MRA)에 대하여 관찰된 IC50 값과 비교하여 적어도 동일, 및 바람직하게는 적어도 2배, 바람직하게, 3배, 더욱 바람직하게, 4배, 더욱더 바람직하게, 5배, 7배 또는 7배 초과로 더 우수한 IC50 값을 가질 수 있다.
CHO 세포 상의 막 IL-6R에의 결합에 대해 정의하는 분석법에서, 본 발명의 아미노산 서열은 10 nM 내지 100 pM, 바람직하게, 5 nM 내지 100 pM, 더욱 바람직하게, 2 nM 내지 10 pM 또는 그 이하, 예컨대, 2 nM 또는 그 이하의 IC50 값을 가질 수 있다.
바람직한 한 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열은
(i) 제1 아미노산 잔기의 스트레치가 a) 또는 b)에 따른 아미노산 서열 중 하나에 상응할 경우, 제2 아미노산 잔기의 스트레치는 c), d), e) 또는 f)에 따른 아미노산 서열 중 하나에 상응하거나, (ii) 제1 아미노산 잔기의 스트레치가 c) 또는 d)에 따른 아미노산 서열 중 하나에 상응할 경우, 제2 아미노산 잔기의 스트레치는 a), b), e) 또는 f)에 따른 아미노산 서열 중 하나에 상응하거나, 또는 (iii) 제1 아미노산 잔기의 스트레치가 e) 또는 f)에 따른 아미노산 서열 중 하나에 상응할 경우, 제2 아미노산 잔기의 스트레치는 a), b), c) 또는 d)에 따른 아미노산 서열 중 하나에 상응하도록, 하기
a) 서열번호 80-82; 또는
b) 서열번호 80-82 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치; 및/또는
c) 서열번호 84-91; 또는
d) 서열번호 84-91 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치; 및/또는
e) 서열번호 93-95; 또는
f) 서열번호 93-95 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로부터 선택되는 아미노산 잔기의 스트레치를 2개 이상 포함할 수 있다.
더욱더 바람직하게, 본 발명의 아미노산 서열은
제1 아미노산 잔기의 스트레치가
a) 서열번호 80-82; 또는
b) 서열번호 80-82 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로 구성된 군으로부터 선택되고;
제2 아미노산 잔기의 스트레치가
c) 서열번호 84-91; 또는
d) 서열번호 84-91 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로 구성된 군으로부터 선택되고;
제3 아미노산 잔기의 스트레치가
e) 서열번호 93-95; 또는
f) 서열번호 93-95 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 아미노산 잔기의 스트레치를 3개 이상 포함한다.
본 발명은 본 발명의 아미노산 서열의 (또는 그를 발현시키는 데 사용되는 본 발명의 뉴클레오티드 서열의) 기원에 관하여, 또는 본 발명의 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열이 생성 또는 수득되는(또는 생성 또는 수득된) 방식에 관하여 제한하지 않는다는 것에 주의하여야 한다. 따라서, 본 발명의 아미노산 서열은 (임의의 적합한 종으로부터의) 천연적으로 발생된 아미노산 서열, 또는 합성 또는 반합성 아미노산 서열일 수 있다.
하나의 구체적이지만, 비제한적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열은 면역글로불린 폴드를 포함하는 아미노산 서열, 또는 적합한 조건(예컨대, 생리학적 조건)하에서 (즉, 폴딩에 의해) 면역글로불린 폴드를 형성할 수 있는 아미노산 서열일 수 있다. 특히, 문헌 [Halaby et al., (1999, J. Protein Eng. 12:563-71)]의 리뷰를 참고할 수 있다. 바람직하게, 면역글로불린 폴드를 형성하기 위해 적절하게 폴딩된 경우, 아미노산 잔기의 스트레치는 IL-6R 상의 특이적인 에피토프에의 결합을 위한 항원 결합 부위를 적절하게 형성할 수 있고, 더욱 바람직하게는 본원에서 정의되는 바와 같은 (적합하게는 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, KD 값(실제값 또는 겉보기 값), KA 값(실제값 또는 겉보기 값), k온 속도 및/또는 k오프 속도, 또는 별법으로 IC50 값으로 측정되고/거나 표현되는) 친화도로 IL-6R 상의 그의 에피토프에 결합할 수 있다.
또 다른 구체적이지만, 비제한적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열은 면역글로불린 서열이다. 특히, 그러나, 비제한적으로, 본 발명의 아미노산 서열은 본질적으로 4개의 골격 부위(FR: framework region, 각각, FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 부위(CDR: complementarity determining region, 각각 CDR1 내지 CDR3)로 구성된 아미노산 서열, 또는 여전히 IL-6R 상의 특이적인 에피토프에 결합하는 상기 아미노산 서열의 임의의 적합한 단편일 수 있다.
상기와 같은 본 발명의 아미노산 서열에서, 골격 서열은 임의의 적합한 골격 서열일 수 있고, 적합한 골격 서열의 일례는 예를 들어, 표준 편람 및 추가의 개시 내용 및 본원에서 언급된 선행 기술에 기초하여 숙련가에게 명백해질 것이다.
골격 서열은 바람직하게는 면역글로불린 골격 서열, 또는 (예를 들어, 서열 최적화, 예컨대, 인간화 또는 카멜화에 의해) 면역글로불린 골격 서열로부터 유래된 골격 서열(의 적합한 조합물)이다. 예를 들면, 골격 서열은 경쇄 가변 도메인(예컨대, VL 서열) 및/또는 중쇄 가변 도메인(예컨대, VH 서열)으로부터 유래된 골격 서열일 수 있다. 본 발명의 아미노산 서열이 중쇄 가변 도메인 서열일 경우, 종래의 4쇄 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인 서열(예컨대, 제한없이, 인간 항체로부터 유래된 VH 서열) 또는 (본원에서 정의되는 바와 같은) 소위 "중쇄 항체"로부터 유래된 소위 (본원에서 정의되는 바와 같은) VHH 서열일 수 있다. 하나의 특히 바람직한 측면에서, 골격 서열은 VHH 서열로부터 유래된 것인 골격 서열(여기서, 상기 골격 서열은 임의로는 부분적으로 또는 전체적으로 인간화된 것일 수 있다)이거나, 또는 (본원에서 정의되는 바와 같이) 카멜화된 종래의 VH 서열인 골격 서열이다.
중쇄 항체 및 그의 가변 도메인에 관한 일반 설명을 위해서는 특히 본원에서 인용된 선행 기술 뿐만 아니라, WO 08/020079 59페이지에서 언급한 선행 기술 및 국제 출원 WO 06/040153 41-43페이지에서 언급한 참고 문헌 목록(여기서, 선행 기술 및 참고 문헌은 본원에서 참고로 인용된다)을 참고할 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열은 특히, 도메인 항체(또는 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열), 단일 도메인 항체(또는 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열), "dAb"(또는 dAb로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열), 또는 나노바디(본원에서 정의되는 바와 같으며, 이는 VHH 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다); 다른 단일 가변 도메인, 또는 그의 어느 하나의 임의의 적합한 단편일 수 있다.
특히, 본 발명의 아미노산 서열은 (본원에서 정의되는 바와 같은) 나노바디® 또는 그의 적합한 단편일 수 있다. [주석: 나노바디 ®, 나노바디들 ® 은 Abiynx N. V의 등록 상표이다]. IL-6R에 대한 상기와 같은 나노바디 또한 본원에서는 "본 발명의 나노바디"로서 지칭할 것이다.
일반적으로, 나노바디는 하기 (일반) 구조식을 가진 아미노산 서열로서 정의할 수 있으며:
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
여기서, FR1 내지 FR4는 각각 골격 부위 1 내지 4를 지칭하며, 여기서, CDR1 내지 CDR3은 각각 상보성 결정 부위 1 내지 3을 지칭하고, 여기서, 홀마크 잔기 중 하나 이상은 WO 08/020079(표 A-3 내지 A-8)에 정의되어 있는 바와 같다.
일반적으로, 나노바디(특히, VHH 서열 및 부분적으로 인간화된 나노바디)는 특히 (예컨대, 추가로 WO 08/020079 61페이지 24번째줄부터 98페이지 3번째줄까지에 기술되어 있는 것과 같이) 골격 서열 중 하나 이상에 하나 이상의 "홀마크 잔 기"가 존재하는 것을 특징으로 할 수 있다.
이와 관련하여, 본 발명의 아미노산 서열은 본질적으로 4개의 골격 부위(각각 FR1 내지 FR4)와 3개의 상보성 결정 부위(각각 CDR1 내지 CDR3)로 구성될 수 있으며, 여기서:
- CDR1은
a) 서열번호 80-82; 또는
b) 서열번호 80-82 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로 구성된 군으로부터 선택되고/거나,
- CDR2는
c) 서열번호 84-91; 또는
d) 서열번호 84-91 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로 구성된 군으로부터 선택되고/거나,
- CDR3은
e) 서열번호 93-95; 또는
f) 서열번호 93-95 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로 구성된 군으로부터 선택된다.
이러한 바람직한 상보성 결정 부위(각각 CDR1 내지 CDR3) 또한 "본 발명의 CDR(들)"로서 지칭된다.
바람직하게, 본 발명의 아미노산 서열은 본질적으로 4개의 골격 부위(각각 FR1 내지 FR4)와 3개의 상보성 결정 부위(각각 CDR1 내지 CDR3)로 구성되며, 여기서:
- CDR1은
a) 서열번호 80-82; 또는
b) 서열번호 80-82 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로 구성된 군으로부터 선택되고/거나,
- CDR2는
c) 서열번호 84-91; 또는
d) 서열번호 84-91 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로 구성된 군으로부터 선택되고/거나,
- CDR3은
e) 서열번호 93-95; 또는
f) 서열번호 93-95 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로 구성된 군으로부터 선택된다.
그러한 나노바디는 임의의 적합한 방식으로 임의의 적합한 공급원으로부터 유래될 수 있으며, 예를 들어, (즉, 적합한 카멜리드(Camelid) 종으로부터 유래된) 천연적으로 발생된 VHH 서열이거나, 또는 합성 또는 반합성 아미노산 서열일 수 있다.
구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 서열번호 80; 또는 적어도 서열번호 80과 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열 또는 나노바디는 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열 또는 나노바디와 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합한다.
또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도, 서열번호 84, 89 또는 91로부터 선택되는 아미노산 잔기의 스트레치; 또는 서열번호 84, 89 또는 91 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열 또는 나노바디는 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열 또는 나노바디와 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합한다.
추가의 또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 서열번호 84; 또는 적어도 서열번호 84와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열 또는 나노바디는 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열 또는 나노바디와 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합한다.
추가의 또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 서열번호 93-94로부터 선택되는 아미노산 잔기의 스트레치; 또는 서열번호 93-94 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열 또는 나노바디는 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열 또는 나노바디와 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합한다.
추가의 또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 서열번호 93; 또는 적어도 서열번호 93과 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열 또는 나노바디는 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열 또는 나노바디와 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합한다.
추가의 또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 서열번호 80 및 서열번호 84를 포함한다.
추가의 또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 서열번호 80 및 서열번호 93을 포함한다.
추가의 또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 서열번호 84 및 서열번호 93을 포함한다.
추가의 또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 서열번호 80, 서열번호 84 및 서열번호 93을 포함한다.
CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열로 이루어진 다른 바람직한 조합도 표 A-1에 제시되어 있다.
바람직한 본 발명의 아미노산 서열은 서열번호 60-69; 서열번호 60-69 중 하나와 그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가지며, 단, 그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 서열번호 60-69 중 하나에 의해 이루어지는 결합과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 서열; 및 서열번호 60-69 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가지며, 단, 서열번호 60-69 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 서열번호 60-69 중 하나에 의해 이루어지는 결합과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
상기와 같은 본 발명의 아미노산 서열은 바람직하게는 IL-6R 상의 특이적인 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있고, 더욱더 바람직하게, 본원에서 정의되는 바와 같은 (적합하게는 KD 값(실제값 또는 겉보기 값), KA 값(실제값 또는 겉보기 값), k온 속도 및/또는 k오프 속도, 또는 별법으로 IC50 값으로 측정되고/거나 표현되는) 친화도로 IL-6R 상의 특이적인 에피토프에 결합할 수 있다. 상기와 같은 본 발명의 아미노산 서열은 바람직하게는 또한 본원에서 정의되는 바와 같이 세포 기반 효능 및 혈장 효능을 가져야 한다.
본 발명에 의해 제공되는 아미노산 서열 및 나노바디는 바람직하게는 본질적으로 (본원에서 정의되는 바와 같은) 단리된 형태이거나, 또는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디를 하나 이상 포함하거나 또는 본질적으로는 그로 구성될 수 있고, 임의로는 (모두가 하나 이상의 적합한 링커를 통해 연결된) 하나 이상의 추가의 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있는 것인 (또한 "본 발명의 폴리펩티드"로서 또는 "본 발명의 단백질"로서 지칭되기도 하는) 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드의 일부를 형성한다.
따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디(또는 그의 적합한 단편)를 하나 이상 포함하거나, 본질적으로 그로 구성되고, 임의로는 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛을 추가로 포함하는 화합물 또는 컨스트럭트, 및 특히 단백질 및 폴리펩티드(이는 또한 본원에서 각각 "본 발명의 화합물," 또는 "본 발명의 폴리펩티드"로도 지칭된다)에 관한 것이다. 숙련가에게는 본원의 추가로 개시 내용으로부터 명백해질 수 있는 바, 상기 추가의 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛 또는 아미노산 서열은 본 발명의 아미노산 서열(및/또는 그가 존재하는 화합물, 컨스트럭트, 또는 폴리펩티드)에 관능성을 제공하거나, 또는 제공하지 않을 수 있고, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디의 특성을 변형시키거나, 또는 변형시키지 않을 수 있다.
예를 들면, 상기 추가의 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛은 화합물, 컨스트럭트 또는 폴리펩티드가 (융합) 단백질 또는 (융합) 폴리펩티드가 되도록 하는 하나 이상의 추가 아미노산 서열일 수 있다. 바람직하지만, 비제한적인 측면에서, 상기의 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛은 면역글로불린 서열이다. 더욱더 바람직하게, 상기의 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛은 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, "dAb," dAb로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열 또는 나노바디로 구성된 군으로부터 선택된다.
별법으로, 상기와 같은 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛은 예를 들면, 단독으로도 생물학적 및/또는 약리학적으로 활성일 수 있거나, 그렇지 않을 수 있는 화학기, 잔기, 모이어티일 수 있다. 예를 들면, 제한없이, 상기와 같은 기는 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, 본 발명의 아미노산 서열 또는 폴리펩티드의 "유도체"를 제공할 수 있도록 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디 하나 이상에 연결될 수 있다.
본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, 하나 이상의 유도체를 포함하거나, 그로 구성되고, 임의로는 (임의로 하나 이상의 적합한 링커를 통해 연결된) 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛을 추가로 포함하는 화합물, 컨스트럭트 또는 폴리펩티드 또한 본 발명의 범주내 포함된다. 바람직하게, 상기의 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛은 아미노산 서열이다.
상기 기술된 바와 같은 화합물, 컨스트럭트 또는 폴리펩티드에서 하나 이상의 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디 및 하나 이상의 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛은 서로서로 직접 및/또는 하나 이상의 적합한 링커 또는 스페이서를 통해 연결될 수 있다. 예를 들면, 생성된 화합물, 컨스트럭트, 또는 폴리펩티드가 융합체(단백질) 또는 융합체(폴리펩티드)가 될 수 있도록 하나 이상의 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛이 아미노산 서열일 때, 링커 또한 아미노산 서열일 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디로부터 출발하는, 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드를 디자인/선택 및/또는 제조하는 방법 또한 상기의 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디를 "포맷팅"하는 것으로서 지칭되며, 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드의 일부가 되는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 "포맷팅된" 것이거나, 상기의 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드"의 포맷으로" 존재하는 것으로 언급될 수 있다. 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디를 포맷팅시킬 수 있는 방법의 예, 및 그러한 포맷의 예는 본원 개시 내용을 기초로 하여 숙련가에게 명백해질 것이고, 상기와 같이 포맷팅된 아미노산 서열 또는 나노바디는 본 발명의 추가의 측면을 형성한다.
예를 들면, 제한없이, 하나 이상의 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 모두 본원에서 기술되는 바와 같이, 각각 본 발명의 1가, 다가, 다중파라토프 또는 다중특이성인 본 발명의 폴리펩티드를 제공하기 위하여 임의로는 (즉, IL-6R 상의 또 다른 에피토프에 대해, 및/또는 IL-6R 이외의 하나 이상의 다른 항원, 단백질, 또는 표적에 대해) 결합 유닛으로서 작용할 수 있는 하나 이상의 추가 아미노산 서열을 함유할 수 있는 상기 단백질 또는 폴리펩티드 중에서 결합 유닛으로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디를 포함하거나, 또는 본질적으로 그로 구성된 1가 컨스트럭트인 화합물, 컨스트럭트 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 다가 컨스트럭트, 예컨대, 2가 또는 3가 컨스트럭트인 화합물, 컨스트럭트 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 다중특이성 컨스트럭트, 예컨대, 이특이성 또는 삼특이성 컨스트럭트인 화합물, 컨스트럭트 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 다중파라토프 컨스트럭트, 예컨대, 비스파라토프 또는 트리파라토프 컨스트럭트인 화합물, 컨스트럭트 또는 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 구체적인 측면에서, 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 폴리펩티드는 상응하는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디와 비교하여 증가된 반감기를 가질 수 있다. 그러한 화합물 및 폴리펩티드에 대한 일부 바람직하지만, 비제한적인 일례는 숙련가에게 본원의 추가 개시 내용에 기초하여 명백해질 것이고, 이는 예를 들어, (예를 들어, 페길화에 의해) 그의 반감기 증가를 위해 화학적으로 변형된 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드, 혈청 단백질(예컨대, 혈청 알부민)에의 결합을 위해 적어도 하나의 추가 결합 부위를 포함하는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디, 또는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디의 반감기를 증가시키기 위해 적어도 하나의 모이어티(및 특히, 적어도 하나의 아미노산 서열)에 연결된 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디를 적어도 하나 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 포함한다. 상기와 같은 반감기 연장 부분을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드, 아미노산 서열 또는 나노바디의 예는 숙련가에게 본원의 추가 개시 내용에 기초하여 명백해질 것이고, 이는 예를 들어, 제한없이, 하나 이상의 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디가 하나 이상의 혈청 단백질 또는 그의 단편(예컨대, (인간) 혈청 알부민 또는 그의 적합한 단편)에, 또는 혈청 단백질에 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 유닛(예컨대, 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, "dAb," dAb로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열 또는 나노바디는 혈청 단백질, 예컨대, 혈청 알부민(예컨대, 인간 혈청 알부민), 혈청 면역글로불린, 예컨대, IgG, 또는 트랜스페린에 결합할 수 있으며; 이는 추가의 설명 및 본원에서 언급된 참고 문헌을 참조할 수 있다)에 적합하게 연결되어 있는 폴리펩티드; 아미노산 서열 또는 본 발명의 나노바디가 Fc 부분(예컨대, 인간 Fc) 또는 그의 적합한 부분, 또는 단편에 적합하게 연결되어 있는 폴리펩티드; 또는 하나 이상의 아미노산 서열 또는 본 발명의 나노바디가 혈청 단백질에 결합할 수 있는 하나 이상의 소형 단백질 또는 펩티드(예컨대, 제한없이, WO 91/01743, WO 01/45746, WO 02/076489에 기술되어 있는 단백질 및 펩티드)를 포함한다.
일반적으로, 반감기가 증가된 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드는 바람직하게, 상응하는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디 그 자체가 갖는 반감기보다 더 큰, 적어도 1.5배, 바람직하게, 적어도 2배, 예컨대, 적어도 5배, 예를 들면, 적어도 10배 또는 20배 초과의 반감기를 가진다.
바람직하지만, 비제한적인 측면에서, 상기와 같은 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드는 상응하는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디 그 자체와 비교하였을 때, 1시간 초과, 바람직하게, 2시간 초과, 더욱 바람직하게, 6시간 초과, 예컨대, 12시간 초과, 또는 심지어는 24, 48 또는 72시간 초과로 증가한 혈청 반감기를 가진다.
또 다른 바람직하지만, 비제한적인 측면에서, 상기와 같은 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드는 인간에서 적어도 약 12시간, 바람직하게, 적어도 24시간, 더욱 바람직하게, 적어도 48시간, 더욱더 바람직하게, 적어도 72시간 초과의 혈청 반감기를 나타낸다. 예를 들면, 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드는 적어도 5일(예컨대, 약 5 내지 10일), 바람직하게, 적어도 9일(예컨대, 약 9 내지 14일), 더욱 바람직하게, 적어도 약 10일(예컨대, 약 10 내지 15일), 또는 적어도 약 11일(예컨대, 약 11 내지 16일), 더욱 바람직하게, 적어도 약 12일(예컨대, 약 12 내지 18일 이상), 또는 14일 초과(예컨대, 약 14 내지 19일)의 반감기를 가질 수 있다.
그러한 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 컨스트럭트는 또한 (본원에서 정의되는 바와 같이) 본질적으로 단리된 형태일 수 있다.
일부 바람직한 본 발명의 화합물, 컨스트럭트 또는 폴리펩티드는 하기 폴리펩티드 서열:
a) 서열번호 70-72;
b) 서열번호 70-72 중 하나와 본 발명의 그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 폴리펩티드 서열이며, 단, 본 발명의 그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 폴리펩티드 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 서열번호 70-72 중 하나에 의해 이루어지는 결합과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 폴리펩티드 서열;
c) 서열번호 70-72 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 폴리펩티드 서열이며, 단, 서열번호 70-72 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 폴리펩티드 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 서열번호 70-72 중 하나에 의해 이루어지는 결합과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 폴리펩티드 서열을 포함한다.
이러한 서열을 가진 폴리펩티드는 IL-6/IL-6R 상호작용을 (부분적으로 또는 전체적으로) 차단할 수 있고/거나, IL-6, IL-6R 및/또는 IL-6/IL-6R 복합체를 통해 일어나는 신호전달을 억제시킬 수 있는 능력 이외에도, 약리학적 활성제로서 사용하기에 이로운 특성들, 예컨대, 우수한 결합 특징(고친화도 및/또는 결합력), 고도한 유효성 및/또는 효능을 나타낸다.
더욱 특히, 이러한 본 발명의 폴리펩티드 및 화합물은 바람직하게는
- 1 nM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 바람직하게, 500 pM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 더욱 바람직하게, 100 pM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 또는 더욱더 바람직하게, 약 50 pM 내지 1 pM 또는 그 이하의 해리 상수(KD)로 hIL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 1 nM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 바람직하게, 500 pM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 더욱 바람직하게, 100 pM 내지 1 pM 몰/ℓ 이하, 또는 더욱더 바람직하게, 약 50 pM 내지 1 pM 이하의 해리 상수(KD)로 시아노 IL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 104 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 바람직하게, 105 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 더욱 바람직하게, 약 106 M-1s-1 또는 그 이상인 k온 속도로 hIL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 104 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 바람직하게, 105 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 더욱 바람직하게, 약 106 M-1s-1 또는 그 이상인 k온 속도로 시아노 IL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 10-3 s-1 (t½=0.69 s) 내지 10-6 s-1(이는 t½이 여러 일인 거의 비가역적인 복합체 제공), 바람직하게, 10-4 s-1 내지 10-6 s-1, 더욱 바람직하게, 10-5 s-1 내지 10-6 s-1, 예컨대, 약 10-5 s-1 또는 그 이하인 k오프 속도로 hIL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 10-3 s-1 (t½=0.69 s) 내지 10-6 s-1(이는 t½이 여러 일인 거의 비가역적인 복합체 제공), 바람직하게, 10-4 s-1 내지 10-6 s-1, 더욱 바람직하게, 10-5 s-1 내지 10-6 s-1, 예컨대, 약 10-5 s-1 또는 그 이하인 k오프 속도로 시아노 IL-6R에 결합할 수 있도록 하는 (적합하게는 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, KD 값(실제값 또는 겉보기 값), KA 값(실제값 또는 겉보기 값), k온 속도 및/또는 k오프 속도, 또는 별법으로 IC50 값으로 측정되고/거나 표현되는) 친화도로 IL-6에 결합할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 및 화합물의 IL-6R에의 결합에 대한 일부 바람직한 IC50 값은 본원 추가의 설명 및 실시예로부터 명백해질 것이다.
예를 들면, 문헌 [Kitamura et al., (1989, J. Cell Physiol., 140:323])에 기술되어 있는 바와 같은 TF1 분석법에서, 본 발명의 폴리펩티드 및 화합물은 (100 IU/mL IL-6에서) 10 nM 내지 50 pM, 바람직하게, 5 nM 내지 50 pM, 더욱 바람직하게, 1 nM 내지 50 pM 또는 그 이하, 예컨대, 약 750 또는 500 pM 또는 그 이하의 IC50 값을 가질 수 있다. 이러한 TF1 분석법에서, 본 발명의 폴리펩티드 및 화합물은 (5,000 IU/mL IL-6에서) 50 nM 내지 1 nM, 바람직하게, 25 nM 내지 1 nM, 더욱 바람직하게, 10 nM 내지 1 nM 또는 그 이하, 예컨대, 약 8 nM 또는 그 이하의 IC50 값을 가질 수 있다. 이러한 TF1 분석법에서, 본 발명의 폴리펩티드 및 화합물은 서열번호 1 및 2에 의해 정의되는 바와 같은 참조 IgG 또는 서열번호 3 및 4에 의해 정의되는 바와 같은 참조 Fab에 대하여 관찰된 IC50 값과 비교하여 적어도 동일, 및 바람직하게는 적어도 2배, 바람직하게, 3배, 더욱 바람직하게, 4배, 더욱더 바람직하게, 5배, 7배 또는 7배 초과로 더 우수한 IC50 값을 가질 수 있다(실시예 1 참조). 이러한 TF1 분석법에서, 본 발명의 아미노산 서열은 토실리주맙(MRA)에 대하여 관찰된 IC50 값과 비교하여 적어도 동일, 및 바람직하게는 적어도 2배, 바람직하게, 3배, 더욱 바람직하게, 4배, 더욱더 바람직하게, 5배, 7배 또는 7배 초과로 더 우수한 IC50 값을 가질 수 있다.
(예컨대, 실시예 45에 기술되어 있는 바와 같이, 27.29 ng/mL IL-6의 존재하에서) IL-6 EC50 값에서의 혈장 효능 분석법에서, 본 발명의 폴리펩티드 및 화합물은 500 pM 내지 50 pM, 바람직하게, 250 pM 내지 50 pM, 더욱 바람직하게, 200 pM 내지 50 pM 또는 그 이하, 예컨대, 150 pM 또는 그 이하의 IC50 값을 가질 수 있다. (예컨대, 실시예 45에 기술되어 있는 바와 같이, 885 ng/mL IL-6의 존재하에서) IL-6 EC95 값에서의 혈장 효능 분석법에서, 본 발명의 폴리펩티드 및 화합물은 1,000 pM 내지 100 pM, 바람직하게, 750 pM 내지 100 pM, 더욱 바람직하게, 500 pM 내지 100 pM 또는 그 이하, 예컨대, 400 pM 또는 그 이하의 IC50 값을 가질 수 있다. 이러한 혈장 효능 분석법에서, 본 발명의 폴리펩티드 및 화합물은 서열번호 1 및 2에 의해 정의되는 바와 같은 참조 IgG 또는 서열번호 3 및 4에 의해 정의되는 바와 같은 참조 Fab에 대하여 관찰된 IC50 값과 비교하여 적어도 동일, 및 바람직하게는 적어도 2배, 바람직하게, 3배, 더욱 바람직하게, 4배, 더욱더 바람직하게, 5배, 7배 또는 7배 초과로 더 우수한 IC50 값을 가질 수 있다(실시예 1 참조). 이러한 혈장 효능 분석법에서, 본 발명의 아미노산 서열은 토실리주맙(MRA)에 대하여 관찰된 IC50 값과 비교하여 적어도 동일, 및 바람직하게는 적어도 2배, 바람직하게, 3배, 더욱 바람직하게, 4배, 더욱더 바람직하게, 5배, 7배 또는 7배 초과로 더 우수한 IC50 값을 가질 수 있다.
CHO 세포 상의 막 IL-6R에의 결합에 대해 정의하는 분석법에서, 본 발명의 폴리펩티드 및 화합물은 10 nM 내지 100 pM, 바람직하게, 5 nM 내지 100 pM, 더욱 바람직하게, 2 nM 내지 10 pM 또는 그 이하, 예컨대, 2 nM 또는 그 이하의 IC50 값을 가질 수 있다.
또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드, 화합물 또는 컨스트럭트는 본질적으로 서열번호 70의 아미노산 서열로 구성된다.
또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드, 화합물 또는 컨스트럭트는 본질적으로 서열번호 71의 아미노산 서열로 구성된다.
본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드는 일반적으로 하나 이상의 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 1가 컨스트럭트를 임의로 하나 이상의 적합한 링커를 통해 하나 이상의 추가의 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛에 적합하게 연결시켜 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드를 수득하는 단계를 포함하는 방법에 제조될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 일반적으로 적어도 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공하는 단계, 적합한 방식으로 상기 핵산을 발현시키는 단계, 및 발현된 본 발명의 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 방법에 제조될 수 있다. 상기와 같은 방법은 숙련가에게 명백한 것으로서 그 자체가 공지되어 있는 방식으로, 예를 들면, 본원에 추가로 기술된 방법 및 기법에 기초하여 실시될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 다가 화합물, 컨스트럭트 또는 폴리펩티드의 제조에서의 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 1가 컨스트럭트의 용도에 관한 것이다. 다가 화합물, 컨스트럭트 또는 폴리펩티드를 제조하는 방법은 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 1가 컨스트럭트를 임의로 하나 이상의 링커를 통해 적어도 하나의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛에 연결시키는 단계를 포함할 것이다.
일반적으로, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디(또는 그를 포함하는 화합물, 컨스트럭트 또는 폴리펩티드)를 (예를 들면, 본원에서 기술되어 있는 바와 같은 치료학적 및/또는 진단학적 목적을 위해) 피험체에게 투여하고자 하는 경우, 상기 피험체에서 천연적으로 발생되지 않은 아미노산 서열 또는 나노바디가 바람직하거나, 또는 상기 피험체에서 천연적으로 발생된 것인 경우에는, (본원에서 정의되는 바와 같은) 본질적으로 단리된 형태가 바람직하다.
본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드 및 화합물은 인간으로부터 유래된 IL-6R에 대한 것이다. 그러나, 이는 또한 시노몰구스 원숭이(마카카 파스시쿨라리스(Macaca fascicularis))로부터 유래된 IL-6R과 교차 반응성을 띠어야 하는데, 이는 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드 및 화합물이 또한 (본원에서 정의되는 바와 같이) 시노몰구스 원숭이(마카카 파스시쿨라리스)로부터 유래된 IL-6R"에 대한" 것이고/거나, (본원에서 정의되는 바와 같이) 상기로부터 유래된 IL-6R에 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 의미한다. 인간 IL-6R에 대한 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드 및 화합물을 질환을 앓는 시노몰구스 원숭이 모델에서 테스트할 수 있기 때문에, 그러한 교차 반응성은 약물 개발이라는 관점에서 보면 이로울 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디(뿐만 아니라, 그를 포함하는 화합물, 컨스트럭트 및 폴리펩티드)가 인간으로부터, 및 시노몰구스 원숭이로부터 유래된 IL-6R과 "교차 반응성"이라는 것은 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디(뿐만 아니라, 그를 포함하는 화합물, 컨스트럭트 및 폴리펩티드)가, 상기 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디(뿐만 아니라, 그를 포함하는 화합물, 컨스트럭트 및 폴리펩티드)가 인간으로부터 유래된 IL-6R에 결합하는 친화도와 동일하거나, 또는 적어도 70%(바람직하게, 적어도 80%, 더욱 바람직하게, 적어도 90%, 또는 더욱더 바람직하게, 적어도 95%)인 (적합하게는 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, KD 값(실제값 또는 겉보기 값), KA 값(실제값 또는 겉보기 값), k온 속도 및/또는 k오프 속도, 또는 별법으로 IC50 값으로 측정되고/거나 표현되는) 친화도로 시노몰구스 원숭이로부터 유래된 IL-6R에 결합한다는 것을 의미한다. 시노몰구스 원숭이의 IL-6R 서열 및 상응하는 cDNA 서열에 대해서는 또한 2008년 7월 16일자로 출원된 WO 09/010539(Ablynx N.V., 발명의 명칭: "Receptor for interleukin -6 ( IL -6) from Macaca fascicularis")를 참조하는데; cDNA 서열에 대해서는 서열번호 3 및 도 1B를, 및 아미노산 서열에 대해서는 서열번호 4 및 도 3B를 참조한다.
본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드의 부분, 단편, 유사체, 돌연변이체, 변이체, 대립인자 및/또는 유도체를 사용하고/거나, 이러한 부분, 단편, 유사체, 돌연변이체, 변이체, 대립인자 및/또는 유도체 중 하나 이상을 포함하거나, 본질적으로 그로 구성된 단백질 또는 폴리펩티드를 사용하는 것은, 이것이 본원에 포함되어 있는 용도에 적합하다면 본 발명의 범주내에 역시 포함된다. 이러한 부분, 단편, 유사체, 돌연변이체, 변이체, 대립인자 및/또는 유도체는 대체로 IL-6R 상의 특이적인 에피토프에 대한 결합을 위해 작용성 항원 결합 부위(의 적어도 일부분)를 포함할 것이며; 더욱 바람직하게는, IL-6R 상의 특이적인 에피토프에 특이적인 결합을 할 수 있을 것이며; 더욱더 바람직하게는, 본원에서 정의되는 바와 같은 (적합하게는 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, KD 값(실제값 또는 겉보기 값), KA 값(실제값 또는 겉보기 값), k온 속도 및/또는 k오프 속도, 또는 별법으로 IC50 값으로 측정되고/거나 표현되는) 친화도로 IL-6R 상의 특이적인 에피토프에 결합할 수 있을 것이다. 이러한 부분, 단편, 유사체, 돌연변이체, 변이체, 대립인자 및/또는 유도체는 또한 일반적으로는 본원에서 정의되는 바와 같은 세포 기반 효능 및 혈장 효능을 가질 것이다. 이러한 부분, 단편, 유사체, 돌연변이체, 변이체, 대립인자, 유도체, 단백질 및/또는 폴리펩티드의 일부 비제한적인 예는 본원의 추가 설명으로부터 명백해질 것이다. 본 발명의 추가의 단편 또는 폴리펩티드는 또한 본원에 기술되어 있는 바와 같은 하나 이상의(더 작은) 부분 또는 단편을 (연결하여 또는 유전적 융합에 의해) 적합하게 조합함으로써 제공할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 본 발명의 아미노산 서열, 본 발명의 나노바디 또는 본 발명의 폴리펩티드(또는 적합한 그의 단편)을 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 그러한 핵산 또한 "본 발명의 핵산"으로서 지칭될 것이며, 이는 예를 들면, 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, 유전자 컨스트럭트의 형태일 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 유전자 컨스트럭트 형태의 핵산 또는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
본 발명의 뉴클레오티드 서열은 천연적으로 발생된 뉴클레오티드 서열 또는 합성 또는 반합성 서열일 수 있고, 예를 들면, PCR에 의해 적합한 천연적으로 발생된 주형(예를 들어, 세포로부터 단리된 DNA 또는 RNA)으로부터 단리된 서열, 라이브러리(특히, 발현 라이브러리)로부터 단리되어진 뉴클레오티드 서열, (자체 공지의 임의의 적합한 기법, 예컨대, 미스매치 PCR을 사용하여) 천연적으로 발생된 뉴클레오티드 서열 내로 돌연변이를 도입하여 제조된 뉴클레오티드 서열, 중첩 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 제조된 뉴클레오티드 서열, 또는 자체 공지의 DNA 합성을 위한 기법을 사용하여 제조된 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 아미노산 서열, 본 발명의 나노바디 및/또는 본 발명의 폴리펩티드를 발현하고/거나(또는 적합한 환경하에서 발현시킬 수 있는), 본 발명의 핵산을 포함하는 숙주 또는 숙주 세포에 관한 것이다. 그러한 숙주 또는 숙주 세포의 일부 바람직하지만, 비제한적인 예는 본원의 추가 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 발명은 추가로 적어도 하나의 본 발명의 아미노산 서열(또는 적합한 그의 단편), 적어도 하나의 본 발명의 나노바디, 적어도 하나의 본 발명의 폴리펩티드, 적어도 하나의 본 발명의 화합물 또는 컨스트럭트, 적어도 하나의 본 발명의 1가 컨스트럭트 및/또는 적어도 하나의 본 발명의 핵산, 및 본 조성물의 의도된 용도에 따라 임의로 자체 공지된, 상기 조성물을 구성하는 하나 이상의 추가 성분들을 함유 또는 포함하는 제품 또는 조성물에 관한 것이다. 그러한 제품 또는 조성물은 예를 들면, (본원에 기술되어 있는 바와 같은) 약학 조성물, 수의학적 조성물 또는 제품, 또는 (이 또한 본원에 기술되어 있는 바와 같은) 진단용 제품 또는 조성물일 수 있다. 그러한 제품 또는 조성물의 일부 바람직하지만, 비제한적인 예는 본원의 추가 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 발명은 추가로 본원에 기술된 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포, 생성물 및 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 아미노산 서열, 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 1가 컨스트럭트를 제조하는 방법은 하기 단계;
a) 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체 또는 또 다른 적합한 발현 시스템에서 본 발명의 핵산 또는 뉴클레오티드 서열, 또는 본 발명의 유전자 컨스트럭트를 발현시키는 단계; 및 임의로 후속되는
b) 이렇게 수득된 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 또는 1가 컨스트럭트를 단리 및/또는 정제하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 또는 1가 컨스트럭트를 제조하는 방법은
a) 본 발명의 숙주 또는 숙주 세포가 본 발명의 적어도 하나의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 또는 1가 컨스트럭트를 발현 및/또는 생산하도록 하는 조건하에서 상기 본 발명의 숙주 또는 숙주 세포를 배양 및/또는 유지시키는 단계; 및 임의로 후속되는
b) 이렇게 수득된 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 또는 1가 컨스트럭트를 단리 및/또는 정제하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로 본원에 기술된 아미노산 서열 폴리펩티드, 화합물, 컨스트럭트, 핵산, 숙주 세포, 생성물 및 조성물의 적용 및 용도 뿐만 아니라, IL-6R과 관련된 질환 및 질병의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것이다. 일부 바람직하지만, 비제한적인 적용 및 용도는 본원의 추가 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물, 컨스트럭트 및 조성물은 일반적으로는 IL-6R의 IL-6에의 결합, 및 그 이후의 IL-6/IL-6R 복합체의 gp130에의 결합을 조정하는 데, 및 특히, 그를 억제 및/또는 방해하는 데 사용될 수 있고, 이에 따라 IL-6R, IL-6, IL-6/IL-6R 복합체 및/또는 gp130에 의해 매개되는 신호전달을 조정하는 데, 및 특히, 그를 억제 및/또는 방해하는 데 사용될 수 있고, IL-6R, IL-6, IL-6/IL-6R 복합체 및/또는 gp130이 관여하는 생물학적 경로 및/또는 상기와 같은 신호전달 또는 이들 경로와 관련이 있는 생물학적 기전, 반응 및 효과를 조정하는 데 사용될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 IL-6R의 길항제, IL-6R에 의해 매개되는 신호전달의 길항제, 및/또는 IL-6R 및/또는 IL-6R에 의해 매개되는 신호전달이 관여하는 생물학적 경로, 기전, 반응 및/또는 효과의 길항제이고/거나, 및/또는 그로서 사용될 수 있는 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 컨스트럭트 및 화합물을 제공한다.
이와 관련하여, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물, 컨스트럭트 및 조성물은 (a) IL-6 수용체에 (본원에서 정의되는 바와 같이) 특이적으로 결합하고, (b) IL-6 수용체를 하향조절할 수 있고/거나, IL-6 수용체의 신호전달 및/또는 IL-6 또는 IL-6R이 관여하는 경로(들), 기전(들) 또는 신호전달을 억제, 감소, 또는 하향조절할 수 있는 것이다. 숙련가에게 명백한 바와 같이, 상기 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 또는 컨스트럭트는 일반적으로 IL-6R의 길항제, IL-6 수용체의 길항제, 및/또는 IL-6, IL-6R 및/또는 IL-6/IL-6R 복합체에 의해 매개되는 신호전달이 관여하는 생물학적 경로, 기전 또는 효과의 길항제로서 사용될 수 있다. 임의의 상기와 같은 감소 또는 하향조절(아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 또는 컨스트럭트가 IL-6 수용체에 결합하지 않는 조건하의 동일 파라미터와 비교하여 관련 파라미터의 적어도 1%, 예컨대, 적어도 5%, 적어도 10%, 또는 10% 초과, 또는 최대 50% 또는 100% 또는 그 이상일 수 있다)은 임의의 적합한 자체 공지 방식으로, 예를 들면, 상기 및/또는 본원 실험부에서 기술되고/거나, 본원에서 언급된 분석법들 중 하나를 사용하여 측정될 수 있다.
더욱 특히, 및 상기 (a) 및 (b) 이외에도, 상기와 같은 길항성 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 및 컨스트럭트는 (c) 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드의 부재하에서 이루어진 IL-6의 그의 수용체에의 결합과 비교하였을 때, IL-6의 IL-6R에의 결합이 차단, 억제, 또는 감소되는 방식으로 IL-6R에 결합한다.
제한없이, 상기와 같은 길항성 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 및 컨스트럭트는 IL-6R 상의 IL-6 상호작용 부위에 가까운 IL-6R 상의 특이적인 에피토프에 결합할 수 있다.
또한, 및 상기 (a) 및 (b) 이외에도, 및 및 상기 (c) 및 (d) 이외에도, 상기와 같은 길항성 아미노산 서열 및 폴리펩티드는, IL-6/IL-6R 복합체의 형성이 억제되거나 영향을 받거나(예로서, 전체적으로 또는 부분적으로 파괴되거나) 하는 방식으로, 상기 복합체의 gp130에의 결합-예컨대, 그에 대한 친화도가 감소되는(또는 역으로, gp130의 상기 복합체에의 결합-예컨대, 그에 대한 친화도가 감소되는) 방식으로 IL-6R(즉, 그 자체, 또는 IL-6/IL-6R 복합체에 존재하는 것)에 결합함으로써, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 또는 컨스트럭트의 부재하에서 이루어진 복합체의 형성 및 그의 gp130에의 결합과 비교하여 상기 복합체의 gp130에의 결합에 의해 유도/매개되는 신호전달이 조정(예로서, 감소)될 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드 화합물, 컨스트럭트 및 조성물은 또한 바람직하게, (그러나 제한없이) 치료학적으로 관련된 양으로 해당 포유동물에게 투여되었을 때에 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물, 컨스트럭트 또는 조성물을 투여받지 않은 포유동물과 비교하여, 포유동물에서의(예컨대, 인간 피험체에서, 또는 혈관형성에 대해 적합한 동물 모델, 예컨대, 시노몰구스 원숭이에서)의 C 반응성 단백질(CRP: C-reactive protein)의 유도를 감소(즉, 적어도 1%, 예컨대, 적어도 10%, 바람직하게, 적어도 30%, 더욱 바람직하게, 적어도 50%, 더욱더 바람직하게, 적어도 75% 또는 그 이상) 감소시키거나, 또는 전체적으로 완전하게 감소시킬 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드 화합물, 컨스트럭트 및 조성물은 또한 바람직하게, (그러나 제한없이) 치료학적으로 관련된 양으로 해당 포유동물에게 투여되었을 때에 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물, 컨스트럭트 또는 조성물을 투여받지 않은 포유동물과 비교하여, 포유동물에서의(예컨대, 인간 피험체에서, 또는 혈관형성에 대해 적합한 동물 모델, 예컨대, 시노몰구스 원숭이에서)의 혈소판 계수의 유도를 감소(즉, 적어도 1%, 예컨대, 적어도 10%, 바람직하게, 적어도 30%, 더욱 바람직하게, 적어도 50%, 더욱더 바람직하게, 적어도 75% 또는 그 이상) 감소시키거나, 또는 전체적으로 완전하게 감소시킬 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드 화합물, 컨스트럭트 및 조성물은 또한 바람직하게, (그러나 제한없이) 치료학적으로 관련된 양으로 해당 포유동물에게 투여되었을 때에 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물, 컨스트럭트 또는 조성물을 투여받지 않은 포유동물과 비교하여, 포유동물에서의(예컨대, 인간 피험체에서, 또는 혈관형성에 대해 적합한 동물 모델, 예컨대, 시노몰구스 원숭이에서)의 피브리노겐의 유도를 감소(즉, 적어도 1%, 예컨대, 적어도 10%, 바람직하게, 적어도 30%, 더욱 바람직하게, 적어도 50%, 더욱더 바람직하게, 적어도 75% 또는 그 이상) 감소시키거나, 또는 전체적으로 완전하게 감소시킬 수 있다.
그 자체로서, 본 발명의 아미노산 서열, 폴리펩티드, 화합물, 컨스트럭트 및 조성물은 IL-6과, IL-6R과, IL-6/IL-6R 복합체(임의로는 gp130와의 추가 복합체 형태의 것)와 관련이 있고/거나, IL-6과, IL-6R과, IL-6/IL-6R 복합체(임의로는 gp130와의 추가 복합체 형태의 것)가 관여하는 신호전달 경로(들) 및/또는 생물학적 작용 및 반응과 관련된 질환 및 질병을 예방 및/또는 치료하는 데, 및 특히, IL-6과, IL-6R과, IL-6/IL-6R 복합체(임의로는 gp130와의 추가 복합체 형태의 것)와 관련이 있고/거나, IL-6과, IL-6R과, IL-6/IL-6R 복합체(임의로는 gp130와의 추가 복합체 형태의 것)가 관여하는 신호전달 경로(들) 및/또는 생물학적 작용 및 반응과 관련되고, IL-6R, 또는 IL-6R이 관여하는 경로(들)에 의해 매개되는 과량의 및/또는 원치않는 신호전달을 특징으로 하는 질환 및 질병을 예방 및/또는 치료하는 데 사용될 수 있다. IL-6과, IL-6R과, IL-6/IL-6R 복합체와 관련이 있고/거나, IL-6, IL-6R 및/또는 IL-6/IL-6R 복합체가 관여하는 신호전달 경로(들) 및/또는 생물학적 작용 및 반응과 관련된 질환 및 질병의 예는 본원의 개시 내용을 기초로 하여 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들면, 하기 질환 및 질병을 포함한다: 패혈증(문헌 [Starnes et al., 1999 J. Immunol., 148:1968] 및 각종 형태의 암, 예컨대, 다발 골수종질환(MM), 신장 세포 암종(RCC), 혈장 세포 백혈병(문헌 [Klein et al., 1991, Blood 78:1198-1204]), 림프종, B 림프구증식 질병(BLPD) 및 전립선암. 과량의 IL-6 생산 또는 신호전달에 의해 유발되는 다른 질환의 비제한적인 예로는 골재흡수(골다공증)(문헌 [Roodman et al., 1992, J. Clin. Invest., 89:45-52], [Jilka et al., 1992, Science, 257:88-91)]), 악액질(문헌 [Strassman et al., 1992, J. Clin. Invest., 89:1681-1684]), 건선, 혈관사이세포 증식성 사구체신염, 카포시 육종, AIDS 관련 림프종(문헌 [Emilie et al., 1994 Blood, 84:2472-2479]), 염증성 질환 및 질병, 예컨대, 류마티스 관절염, 전신적으로 발병된 청소년성 특발성 관절염, 고감마글로불린혈증(문헌 [Grau et al., 1990, J. Exp. Med., 172:1505-1508]), 크론병, 궤양성 대장염, 전신 홍반 루푸스(SLE), 다발 경화증, 캐슬만씨 병, IgM 감마글로불린병증, 심장 점액종, 천식(특히, 알레르기성 천식) 및 자가면역 인슐린 의존 당뇨병(Campbell, et al., 1991, J. Clin. Invest., 87:739-742])을 포함한다. 다른 IL-6R, IL-6 및/또는 IL-6/IL-6R 복합체 관련 질병은 숙련가에게 명백할 것이다. 상기 질환 및 질병 또한 일반적으로는 본원에서 "IL-6R 관련 질환 및 질병"으로서 지칭된다.
따라서, 제한없이, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물, 컨스트럭트 및 조성물은 예를 들면, IL-6R에 의해 매개되는 신호전달을 조정할 수 있는 활성 성분, 예컨대, 상기에서 인용된 선행 기술에서 언급된 것으로 현재 예방 또는 치료되고 있는 모든 질환 및 질병을 예방 및/또는 치료하는 데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물, 컨스트럭트 및 조성물은, 상기 활성 성분을 이용한 치료법이 현재 개발 중에 있거나, 제안된 바 있거나, 또는 추가에 제안되거나 개발되는 모든 질환 및 질병을 예방 및/또는 치료하는 데 사용될 수 있다는 것도 구현된다. 추가로, 본원에 추가로 기술된 바와 같은 그의 바람직한 특성에 기인하여, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물, 컨스트럭트 및 조성물은, 이들 공지의 활성 성분이 사용되고 있거나, 제안되거나 개발되는 질환 및 질병 이외의 다른 질환 및 질병을 예방 및/또는 치료하는 데 사용될 수 있다는 것도 구현되고/거나, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물, 컨스트럭트 및 조성물은 본원에 기술된 질환 및 질병을 치료하기 위한 신규의 방법 및 요법을 제공할 것이라는 것도 구현된다.
따라서, 본 발명은 또한 아미노산 서열, 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 화합물, 또는 본 발명의 (1가) 컨스트럭트, 또는 본 발명의 조성물 중 적어도 하나를 약제학적으로 활성인 양으로 그를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 아미노산 서열, 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 화합물, 또는 본 발명의 (1가) 컨스트럭트를 그를 필요로 하는 피험체에게 투여함으로써 예방 및/또는 치료될 수 있는 적어도 하나의 질환 또는 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 IL-6과, IL-6R과, IL-6/IL-6R 복합체와 관련이 있고/거나, IL-6, IL-6R 및/또는 IL-6/IL-6R 복합체가 관여하는 신호전달 경로 및/또는 생물학적 작용 및 반응과 관련된 질환 및 질병들 중 적어도 하나의 예방 및/또는 치료를 위한 약학 조성물의 제조에서 사용하기 위한, 및/또는 본원에 기술된 방법들 중 하나 이상의 것에서 사용하기 위한 아미노산 서열, 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 화합물, 또는 본 발명의 (1가) 컨스트럭트의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 IL-6과, IL-6R과, IL-6/IL-6R 복합체와 관련이 있고/거나, IL-6, IL-6R 및/또는 IL-6/IL-6R 복합체가 관여하는 신호전달 경로 및/또는 생물학적 작용 및 반응과 관련된 질환 및 질병들 중 적어도 하나의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한, 및/또는 본원에 기술된 방법들 중 하나 이상의 것에서 사용하기 위한 아미노산 서열, 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 화합물, 또는 본 발명의 (1가) 컨스트럭트에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 온혈 동물, 특히, 포유동물 및 더욱 특히, 인간에서 예방용, 치료용 및/또는 진단용으로 적합한 아미노산 서열, 나노바디 단백질, 폴리펩티드, 화합물 및/또는 컨스트럭트를 제공한다.
더욱 특히, 본 발명은 온혈 동물, 특히, 포유동물 및 더욱 특히, 인간에서 (본원에서 정의되는 바와 같은) 하나 이상의 IL-6R 관련 질병의 예방, 치료, 완화, 및/또는 진단용으로 사용될 수 있는 상기 아미노산 서열, 나노바디, 단백질, 폴리펩티드, 화합물 및/또는 컨스트럭트를 제공한다.
본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드 및 화합물의 다른 적용성 및 용도는 숙련가에게 본원의 추가 개시 내용으로부터 명백해질 것이다.
도 1: 실시예 2에 기술된 ELISA에 의해 수행된, 라마 81 및 82에서의 면역 반응 분석.
도 2: 실시예 2에 기술된 FACS에 의해 수행된, 라마 81 및 82에서의 면역 반응 분석. 설명: Ll81 면역전: 라마 81로부터 유래된 면역전 혈청; Ll81 PBL1: 라마 81로부터 28일째에 수집된 혈청; Ll82 면역전: 라마 82로부터 유래된 면역전 혈청; Ll82 PBL2: 라마 82로부터 43일째에 수집된 혈청.
도 3: IL-6R 상의 IL-6 결합 부위에 대한 나노바디를 확인하는 데 사용되는 알파스크린(Alphascreen) 분석법을 나타내는 개략도.
도 4: 항IL-6R 나노바디의 아미노산 서열.
도 5: 실시예 6에 기술된 바와 같이 수득된 정제된 나노바디의 SDS-PAGE.
도 6: 알파스크린으로 측정된, 선택된 나노바디에 의한 IL-6/IL-6R 상호작용 억제. MAb BR-6 및 참조 Fab 단편(실시예 1에 기술)은 대조군으로서 사용되었다.
도 7: FACS에 의해 분석된, 항IL-6R 나노바디의 U266 세포에의 결합.
도 8: 인간 혈장의 부재(상단) 및 존재(하단)하에서 항IL-6R 나노바디의 U266 세포에의 결합.
도 9: 1 mg/kg(○), 5 mg/kg(△), 10 mg/kg(＋), 25 mg/kg(×) 및 100 mg/kg(◇)의 IL-6R304의 i.v. 투여 이후, 시노몰구스 원숭이에서 개별적으로 관찰된 혈장 농도(기호로 표시) 및 모델을 통해 예측된 혈장 농도(실선으로 표시)-시간 프로파일.
도 10: 나노바디의 마우스 및 인간 IL-6R에의 결합. 3개의 막대로 구성된 각 군에서, 좌측 막대는 인간 IL-6R을 나타내고, 중간에 있는 막대는 마우스 IL-6R을 나타내며, 우측 막대는 블랭크를 나타낸다.
도 11: 정제된 이특이성 나노바디의 SDS-PAGE.
도 12: 알파스크린으로 측정된, 이특이성 나노바디에 의한 IL-6/IL-6R 상호작용 억제.
도 13: 2가 나노바디의 U266 세포에의 결합에 대한 FACS 분석.
도 14: 3가 나노바디의 U266 세포에의 결합에 대한 FACS 분석.
도 15: 가장 높은 상동성을 띠는 5개의 인간 생식계열과 함께, IL-6R03, IL-6R04 및 IL-6R13 서열의 정렬. 추가 설명을 위해서는 실시예 23을 참조한다.
도 16A 및 B: IL-6R03, IL-6R04 및 IL-6R13의 서열이 최적화된 변이체의 아미노산 서열. 추가 설명을 위해서는 실시예 23을 참조한다.
도 17: IL-6R03의 서열이 최적화된 변이체에 의한 IL-6/IL-6R 상호작용 억제.
도 18: IL-6R04의 서열이 최적화된 변이체에 의한 IL-6/IL-6R 상호작용 억제.
도 19: IL-6R13의 서열이 최적화된 변이체에 의한 IL-6/IL-6R 상호작용 억제.
도 20: IL-6R13의 서열이 최적화된 변이체에 의한 IL-6/IL-6R 상호작용 억제.
도 21: 야생형 및 서열이 최적화된 항IL-6R 나노바디에 의한 IL-6/IL-6R 상호작용 억제.
도 22: 서열이 최적화된 나노바디 대 야생형 나노바디의 세포 기반 효능.
도 23: 인간(A) 및 시아노(B) 혈장에서 서열이 최적화된 나노바디에 관한 혈장 효능 ELISA.
도 24: EC50(좌측) 및 EC95(우측)의 IL-6에서 서열이 최적화된 나노바디에 관한 혈장 효능 ELISA.
도 25: 실시예 29에 기술된 바와 같이 수행된 IL-6R 나노바디에 관한 에피토프 지도화: IL-6R로 코팅된 칩(A-C) 또는 IL-6으로 코팅된 칩 상에서의 경쟁 분석법.
도 26: 친화도 성숙된 IL-6R65 변이체의 아미노산 서열.
도 27: 나노바디 IL-6R65(모체 나노바디로 언급) 및 그의 친화도 성숙된 변이체의 결합 곡선.
도 28: 인간 및 시아노 혈장 효능 분석법으로 수행된 IL-6R65 및 5개의 친화도 성숙된 변이체에 관한 평가.
도 29. 친화도 성숙된 나노바디에 의한 TF1 세포의 IL-6 의존성 증식 억제. 2 ng/ml의 인간 IL-6, 및 다양한 농도의 나노바디의 존재하에서 세포를 성장시켰다. 증식은 3H 티미딘 혼입에 의해 측정하였다.
도 30: 비아코어에 의해 측정된, IL-6과 IL-6R65의 경쟁(A)과 비교된, IL-6과 2개의 친화도 성숙된 나노바디의 경쟁(B-C).
도 31: 2회차 친화도 성숙 이후의 IL-6R 결합 나노바디(조합 라이브러리 CDR1/2 + CDR3)의 서열.
도 32: TF1 세포의 IL-6 의존성 증식 억제. 2 ng/ml의 인간 IL-6, 및 다양한 농도의 나노바디의 존재하에서 세포를 성장시켰다. 증식은 3H 티미딘 혼입에 의해 측정하였다.
도 33: 인간 및 시아노 혈장 효능 분석법으로 수행된 IL-6R65 및 2회차 친화도 성숙된 변이체에 관한 평가. 모체 = IL-6R65.
도 34: 전혈 중 IL-6R65 및 PMP20A11의 인간 PBMC에의 결합.
도 35: 포맷팅된 나노바디 및 참조 IgG에 의한 IL-6R 활성 억제. TF1 세포를 IL-6R304(■), IL-6R305(▲), IL-6R306(▼) 또는 참조 IgG(●)의 일련의 희석액과 함께 사전 인큐베이션시킨 후, 이어서, 100 IU/mL IL-6으로 증식을 유도하였다. 72h 동안 인큐베이션시킨 후, 3H 티미딘 혼입에 의해 세포 증식을 평가하였다. 3중으로 측정하여 얻은 측정값에 대한 평균 ± s. e.이 제시되어 있다.
도 36: IL-6이 고수준일 때의 포맷팅된 나노바디 및 참조 IgG에 의한 막 IL-6R 억제. TF1 세포를 20A11(◆), IL-6R304(■), IL-6R305(▲), IL-6R306(▼) 또는 참조 IgG(●)의 일련의 희석액과 함께 사전 인큐베이션시킨 후, 이어서, 5,000 IU/mL IL-6으로 증식을 유도하였다. 72h 동안 인큐베이션시킨 후, 3H 티미딘 혼입에 의해 세포 증식을 평가하였다. 3중으로 측정하여 얻은 측정값에 대한 평균 ± s. e.이 제시되어 있다.
도 37: IL-6R304 및 IL-6R305가 TF1 세포 증식에 미치는 효과. TF1 세포를 밀도 12,500 세포/웰로 시딩하고, 50 nM IL-6R304 또는 IL-6R305와 함께, 또는 미포함 상태로 인큐베이션시켰다. 100 IU/mL IL-6으로 증식을 유도하거나, 성장 인자의 부재하에서 세포를 인큐베이션시켰다. 72h 동안 인큐베이션시킨 후, 3H 티미딘 혼입에 의해 세포 증식을 평가하였다. 각 데이터를 30회에 걸쳐 측정하였다. 평균 ± s. e.이 제시되어 있다.
도 38: 인간 혈장에서 혈장 효능 ELISA. 참조 IgG(●), IL-6R20A11(◆), IL-6R304(■), IL-6R305(▲), IL-6R306(▼) 또는 상관이 없는 NB(×)에 의한 인간 IL-6의 혈장 sIL-6R에의 결합에 대한 중화. 2중으로 측정하여 얻은 측정값에 대한 평균 ± s. e.이 제시되어 있다. A, B: 25 ng/mL의 IL-6(EC50)과의 경쟁. C, D: 885 ng/mL의 IL-6(EC95)과의 경쟁.
도 39: IL-6R20A11 및 포맷팅된 변이체의 CHO 세포에의 결합. IL-6R 발현 CHO 세포(A) 또는 음성 CHO 세포(B)를 20A11(◆), IL-6R304(■), IL-6R305(▲), 또는 IL-6R306(▼)과 함께 인큐베이션시켰다. 결합된 나노바디는 MAb cl. 5. 3. 1. 및 항마우스-PE를 사용하여 검출하였다.
도 40: 전혈 중 인간 PBL 상의 IL-6R 나노바디 결합. 좌측: 림프구(L, 검은색), 단핵구(M, 진한 회색) 및 과립구(G, 밝은 회색)를 FSC/SSC 특성에 기초하여 게이팅하였다. 중간: 3개의 게이팅된 군집의 배경 PE 형광값. 우측: 1 μM IL-6R305와의 인큐베이션 이후의 PE 형광값.
도 41: IL-6R 나노바디의 인간 PBL에의 결합. 2명의 기증자로부터 유래되고 EDTA로 처리된 혈액을 20A11(◆), IL-6R304(■), IL-6R305(▲), 또는 IL-6R306(▼)과 함께 인큐베이션시켰다. 결합된 나노바디는 MAb cl. 5. 3. 1. 및 항마우스-PE를 사용하여 검출하였다. A: 림프구, B 단핵구, C 과립구.
도 42: 인간 및 시아노 혈청 알부민 상의 포맷팅된 친화도 성숙된 나노바디의 결합 곡선.
도 43: 포맷팅된 친화도 성숙된 나노바디의 인간 및 시아노 IL-6R에의 결합 곡선.
도 44: 시아노 혈장에서 혈장 효능 ELISA. 참조 IgG(●), IL-6R20A11(◆), IL-6R304(■), IL-6R305(▲), IL-6R306(▼) 또는 상관이 없는 NB(×)에 의한 인간 IL-6의 시아노 혈장 sIL-6R에의 결합에 대한 중화.
도 45: IL-6R20A11의 다른 종으로부터 유래된 sIL-6R과의 교차 반응성. 좌측: 인간(●), 시아노(■) 또는 마우스(▲)로부터 유래된 재조합 sIL-6R과의 인큐베이션 이후, 플레이트 상의 인간 sIL-6R에의 IL-6R20A11의 결합. 우측: 인간(●), 시아노(■), 마우스(▲) 또는 기니아 피그(▼) 혈장과의 인큐베이션 이후, IL-6R20A11의 인간 sIL-6R에의 결합.
도 46: 경쟁 결합 ELISA. IL-6R20A11(0.05 nM)을 상이한 농도의 IL-6R(●), LIF-R(■), CNTF-R(▲), OSM-R(▼) 또는 IL-11R/Fc(◆)와 함께 사전 인큐베이션시켰다. 유리형 IL-6R20A11을 sIL-6R 상에 포획시키고, 항His를 통해 검출하였다.
도 47: IL-6R304 및 IL-6R305의 생체내 PK/PD 분석을 위한 연구 디자인.
도 48: 개별 시노몰구스 원숭이에서 hIL-6에 의해 증가된 CRP 수준에 대해 참조 IgG, IL-6R304 및 IL-6R305가 미치는 효과. (A) 27, 28 및 29번 동물이 음성 대조군으로서의 역할을 하였고, 이들은 오직 hIL-6만을 투여받았다. 참조 IgG(B, 폐쇄형의 검은색 기호), 상이한 용량의 IL-6R304(C, 청색 기호) 및 상이한 용량의 IL-6R305(D, 적색 기호)를 i.v. 투여한 후, hIL-6을 5 ㎍/kg의 용량으로 7일 동안 1일 1회로 s. c. 주사하였다.
도 49: IL-6R304 및 IL-6R305를 사용하여 수행된 생체내 PK/PD 연구에서 수득된, 모든 군들의 평균 CRP 수준.
도 50: 개별 시노몰구스 원숭이에서 hIL-6에 의해 증가된 피브리노겐 수준에 대해 참조 IgG, IL-6R304 및 IL-6R305가 미치는 효과. (A) 27, 28 및 29번 동물이 음성 대조군으로서의 역할을 하였고, 이들은 오직 hIL-6만을 투여받았다. 참조 IgG(B, 폐쇄형의 검은색 기호), 상이한 용량의 IL-6R304(C, 청색 기호) 및 상이한 용량의 IL-6R305(D, 적색 기호)를 i.v. 투여한 후, hIL-6을 5 ㎍/kg의 용량으로 7일 동안 1일 1회로 s. c. 주사하였다. 결과를 기준 수준으로 정규화하였다.
도 51: IL-6R304 및 IL-6R305를 사용하여 수행된 생체내 PK/PD 연구에서 수득된, 모든 군들의 평균 피브리노겐 수준.
도 52: 개별 시노몰구스 원숭이에서 hIL-6에 의해 증가된 혈소판 계수에 대해 참조 IgG, IL-6R304 및 IL-6R305가 미치는 효과. (A) 27, 28 및 29번 동물이 음성 대조군으로서의 역할을 하였고, 이들은 오직 hIL-6만을 투여받았다. 참조 IgG(A, 폐쇄형의 검은색 기호), 상이한 용량의 IL-6R304(B, 청색 기호) 및 상이한 용량의 IL-6R305(C, 적색 기호)를 i.v. 투여한 후, hIL-6을 5 ㎍/kg의 용량으로 7일 동안 1일 1회로 s. c. 주사하였다. 결과를 기준 수준으로 정규화하였다.
도 53: IL-6R304 및 IL-6R305를 사용하여 수행된 생체내 PK/PD 연구에서 수득된, 모든 군들의 평균 혈소판 계수.
도 54: 시노몰구스 원숭이에서의 IL-6R304(0.4-2-10 mg/kg)의 i.v. 볼루스 투여 이후의 개별적으로 관찰된 혈장 농도-시간 플롯. 11m, 12m 및 13f는 좌측의 3개의 그래프이고, 17m, 18f 및 14m은 중간에 있는 그래프이고, 15m 및 16f는 우측에 있는 그래프이다.
도 55: 시노몰구스 원숭이에서의 IL-6R305(0.4-2-10 mg/kg)의 i.v. 볼루스 투여 이후의 개별적으로 관찰된 혈장 농도-시간 플롯. 19m, 20f 및 21f는 좌측의 3개의 그래프이고, 25m, 26f 및 22m은 중간에 있는 그래프이고, 23m 및 24f는 우측에 있는 그래프이다.
도 56: 시노몰구스 원숭이에서의 IL-6R304(0.4-2-10 mg/kg) 및 IL-6R202(2 mg/kg, 0.4-10 mg/kg으로 용량-정규화된 것)의 i.v. 볼루스 투여 이후의 관찰된 혈장 농도의 평균값 대 시간 플롯.
도 57: IL-6R304 투여 이전 및 IL-6R304의 i.v. 투여 이후의 다른 경과일의 항IL-6R304 항체의 면역검출. ELISA 플레이트를 IL-6R304로 코팅하였다. 각 도면에 대한 설명은 좌측에서 출발하여 우측으로 진행되는 막대 그래프 군에 상응한다.
도 58: IL-6R304 투여 이전 및 IL-6R304의 i.v. 투여 이후의 다른 경과일의 항IL-6R304 항체의 면역검출. ELISA 플레이트를 IL-6R300으로 코팅하였다. 각 도면에 대한 설명은 좌측에서 출발하여 우측으로 진행되는 막대 그래프 군에 상응한다.
도 59: IL-6R304 투여 이전 및 IL-6R304의 i.v. 투여 이후의 다른 경과일의 항IL-6R304 항체의 면역검출. ELISA 플레이트를 ALB8로 코팅하였다. 각 도면에 대한 설명은 좌측에서 출발하여 우측으로 진행되는 막대 그래프 군에 상응한다.
도 60: IL-6R305 투여 이전 및 IL-6R305의 i.v. 투여 이후의 다른 경과일의 항IL-6R305 항체의 면역검출. ELISA 플레이트를 IL-6R305로 코팅하였다. 각 도면에 대한 설명은 좌측에서 출발하여 우측으로 진행되는 막대 그래프 군에 상응한다.
도 61: IL-6R305 투여 이전 및 IL-6R305의 i.v. 투여 이후의 다른 경과일의 항IL-6R305 항체의 면역검출. ELISA 플레이트를 IL-6R300으로 코팅하였다. 각 도면에 대한 설명은 좌측에서 출발하여 우측으로 진행되는 막대 그래프 군에 상응한다.
도 62: IL-6R305 투여 이전 및 IL-6R305의 i.v. 투여 이후의 다른 경과일의 항IL-6R305 항체의 면역검출. ELISA 플레이트를 ALB8로 코팅하였다. 각 도면에 대한 설명은 좌측에서 출발하여 우측으로 진행되는 막대 그래프 군에 상응한다.
도 63: IL-6R 나노바디의 단일 IV 볼루스 투여 이후, 시노몰구스 원숭이에서의 혈장 sIL-6R 수준. A: Ref IgG (5 mg/kg)(■, ●) 또는 비히클(▲)로 처리된 2마리의 동물, B: IL-6R304(0.04 mg/kg)로 처리된 3마리의 동물, C: IL-6R305(0.04 mg/kg)로 처리된 3마리의 동물.
도 64: IL-6R 나노바디의 단일 IV 볼루스 투여 이후, 시노몰구스 원숭이에서의 전체 혈장 sIL-6R 수준. A: IL-6R304(▲, ■, ●), Ref IgG(▼) 또는 비히클(◇)로 처리된 동물, B: IL-6R305(0.04 mg/kg)(▲, ■, ●), Ref IgG(▼) 또는 비히클(◇)로 처리된 동물. 각 군당 평균 ± s.e.를 제시한다.
도 65: IL-6R 나노바디의 단일 IV 볼루스 투여 이후, 시노몰구스 원숭이에서의 전체 혈장 sIL-6R 수준. 기로랩(Gyrolab) 플랫폼을 통해 내인성 시아노 및 주사된 인간 IL-6, 둘 모두의 전체 혈장 IL-6 농도를 측정하였다. 정량 한계 아래의 값을 갖는 샘플은 9.6 pg/mL인 것으로 도시되어 있다. A: IL-6R304; B: IL-6R305; C: 양성(Ref IgG) 및 음성(완충액) 대조군. 각 처리군당 평균 ± s.e. (0.4 및 2 mg/kg에 대해 n=3; 10 mg/kg에 대해 n=2)이 도시되어 있다. D: 10 mg/kg IL-6R304(■, ●), IL-6R305(▲, ▼) 또는 상관이 없는 나노바디(◇, ·)의 IV 볼루스 투여 이후 개별 동물에서의 내인성 시아노 혈장 IL-6 농도. 2개의 측정값의 평균 ± s.e.이 제시되어 있다.
도 66: 상이한 용량의 IL-6R304의 i.v. 투여 이후, 시노몰구스 원숭이에서의 전체(A) 및 유리형(B) sIL-6R 혈장 수준. 각 군당 바이오마커의 혈장 농도 평균값 ± SD가 제시되어 있다. 제시된 용량의 비히클 또는 IL-6R304를 시점 0에 투여하였다. 설명을 위해서는 도 66B를 참조한다.
도 67: 25 mg/kg IL-6R304의 i.v. 투여 이후, 시노몰구스 원숭이에서의 전체 및 유리형 sIL-6R 혈장 수준 및 IL-6R304 농도. 특정 투여군에 대한 평균 ± SD가 제시되어 있다. 제시된 용량의 비히클 또는 IL-6R304를 시점 0에 투여하였다. 설명을 위해서는 도 66B를 참조한다. 전체 sIL-6R (실선, 사각형 기호), 유리형 sIL-6R (실선, 동그라미 기호) 및 IL-6R304 농도(점선, 델타 모양 기호)를 시간(경과일수)에 대해 플롯팅하였다.
도 68: 1 mg/kg(○), 5 mg/kg(△), 10 mg/kg(+) 25 mg/kg(x) 및 100 mg/kg(◇)의 IL-6R304의 i.v. 투여 이후, 개별적으로 관찰된 전체 sIL-6R 농도(기호로 표시) 및 모델을 통해 예측된 전체 sIL-6R 농도(실선으로 표시)-시간 플롯.
도 69: 1, 5, 10, 25 또는 100 mg/kg의 IL-6R304의 i.v. 볼루스 주사 이후, 시노몰구스 원숭이에서의 IL-6R304의 평균 혈장 농도-시간 프로파일.
도 70: 중앙 구획으로부터의 선형 및 비선형 제거를 보이는 개방형 3 구획 약물동력학적 모델. CL비 IL -6R은 선형 비IL-6R 매개성 제거이고, Vc는 중앙 구획의 부피이고, Vd는 심층의 주변 구획의 부피이고, CLd는 중앙 구획과 심층 구획 사이의 구획간 유량이고, Vs는 피상의 주변 구획의 부피이고, CLs는 중앙 구획과 피상 구획 사이의 구획간 유량이고, CLIL -6R은 비선형 IL-6R 매개성 제거이다(V최대는 최대 대사 속도이고, Km은 V최대의 50%에 상응하는 IL-6R304 농도이다).
상세한 설명
본 개시 내용, 실시예 및 특허청구범위에서는:
a) 달리 명시되거나 정의되지 않는 한, 사용된 모든 용어는 숙련가에게 명백한 것으로서, 당업계에서 사용되는 그의 종래의 의미를 가진다. 예를 들면, 표준 편람, 예컨대, 문헌 ([Sambrook et al., "Molecular Cloning A Laboratory Manual" (2nd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]; [F. Ausubel et al., eds, "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley interscience, New York (1987)]; [Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N Y, (1985)]; [Old et al., "Principles of Gene Manipulation An introduction to Genetic Engineering", 2nd edition, University of California Press, Berkeley, CA (1981)]; [Roitt et al., "Immunology" (6th Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001)]; [Roitt et al., Roitt's Essential immunology, 10th Ed. Blackweli Publishing, UK (2001)]; 및 [Janeway et al., "Immunobiology" (6th Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005)] 뿐만 아니라, 본원에 인용된 일반 배경 기술을 참조한다;
b) 달리 명시되지 않는 한, "면역글로불린 서열"이라는 용어는, 본원에서 중쇄 항체를 지칭하거나 또는 종래의 4쇄 항체를 지칭하기 위해 사용되든지 간에, 전체 크기의 항체, 그의 개별 쇄 뿐만 아니라, 그의 모든 부분, 도메인 또는 단편(이는 각각 항원 결합 도메인 또는 단편, 예컨대, VHH 도메인 또는 VH/VL 도메인을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 모두를 포함하는 일반 용어로서 사용된다. 또한, 본원에서 사용되는 "서열"이라는 용어는 (예를 들면, "면역글로불린 서열," "항체 서열," "가변 도메인 서열," "VHH 서열" 또는 "단백질 서열" 과 같은 용어에서), 그 의미가 보다 제한된 해석을 요구하지 않는 한, 일반적으로 관련 아미노산 서열 뿐만 아니라, 이를 코딩하는 핵산 서열 또는 뉴클레오티드 서열, 둘 모두를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에서 사용되는 "뉴클레오티드 서열"이라는 용어는 또한 상기 뉴클레오티드 서열을 가진 핵산 분자를 포함하며, 따라서, "뉴클레오티드 서열" 및 "핵산"이라는 용어는 등가물로서 간주되어야 하며, 이는 본원에서 상호교환적으로 사용된다;
c) 달리 명시되지 않는 한, 구체적으로 상세히 설명되지 않은 모든 방법, 기법 및 조작은 숙련가에게 명백한 바와 같이, 자체 공지된 방식으로 수행될 수 있거나 수행되었다. 예를 들면, 다시 표준 편람 및 본원에서 언급된 일반 배경 기술, 및 본원에서 인용된 추가의 참고 문헌 뿐만 아니라, 예를 들면, 하기 검토 문헌 ([Presta, 2006, Adv. Drug Deliv. Rev., 58 (5-6): 640-56]; [Levin and Weiss, 2006, Mol. Biosyst, 2(1): 49-57]; [Irving et al., 2001, J. Immunol. Methods, 248(1-2): 31-45]; [Schmitz et al., 2000, Placenta, 21 Suppl. A, S106-12]; [Gonzales et al., 2005, Tumour Biol., 26(1): 31-43])(상기 문헌에는 예컨대, 친화도 성숙과 같은 단백질 조작 기법, 및 단백질, 예컨대, 면역글로불린의 특이성 및 다른 원하는 특성을 개선시키기 위한 다른 기법이 기재되어 있다)을 참조한다;
d) 아미노산 잔기는 하기 표 A-2에 언급되어 있는 바와 같이 표준 3문자 또는 1문자 아미노산 코드에 따라 표시될 것이다;
<표 A-2>
Figure 112011088504629-pct00001
Figure 112011088504629-pct00002
e) 2개 이상의 뉴클레오티드 서열을 비교하기 위하여, 제1 뉴클레오티드 서열과 제2 뉴클레오티드 서열 사이의 "서열 동일성(%)"은 [제2 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 위치의 뉴클레오티드와 동일한 제1 뉴클레오티드 서열 내의 뉴클레오티드의 개수]를 [제1 뉴클레오티드 서열 내의 뉴클레오티드의 총 개수]로 나누고, 그 값에 [100%]를 곱함으로써 계산될 수 있고, 여기서 제2 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드의 각각의 결실, 삽입, 치환 또는 부가는 제1 뉴클레오티드 서열과 비교하여 단일 뉴클레오티드(위치)에서의 차이로 간주된다.
별법으로, 2개 이상의 뉴클레오티드 서열 사이의 서열 동일성의 정도는 서열 정렬을 위한 공지의 컴퓨터 알고리즘, 예컨대, NCBI 블라스트(Blast) v2.0을 사용하여 표준 설정을 사용함으로써 계산될 수 있다.
서열 동일성의 정도를 측정하는 일부 다른 기법, 컴퓨터 알고리즘 및 설정 방법은 예를 들면, WO 04/037999, EP 0967284, EP 1085089, WO 00/55318, WO 00/78972, WO 98/49185 및 GB 2357768-A에 기술되어 있다.
일반적으로, 상기 개략적으로 설명된 계산 방법에 따라 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 "서열 동일성(%)"을 측정하기 위해, 뉴클레오티드 개수가 가장 큰 뉴클레오티드 서열이 "제1" 뉴클레오티드가 될 것이며, 나머지 뉴클레오티드 서열이 "제2" 뉴클레오티드 서열이 될 것이다;
f) 2개 이상의 아미노산 서열을 비교하기 위하여, 제1 아미노산 서열과 제2 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성(%)"(본원에 "아미노산 동일성"으로도 지칭된다)은 [제2 아미노산 서열에서 상응하는 위치의 아미노산과 동일한 제1 아미노산 서열 내의 아미노산 잔기의 개수]를 [제1 아미노산 서열 내의 아미노산 잔기의 총 개수]로 나누고, 그 값에 [100%]를 곱함으로써 계산될 수 있고, 여기서 제2 아미노산 서열에서 아미노산 잔기의 각각의 결실, 삽입, 치환 또는 부가는 제1 아미노산 서열과 비교하여 단일 아미노산 잔기(위치)에서의 차이, 즉, 본원에서 정의되는 바와 같은 "아미노산 차이"로 간주된다.
별법으로, 두 아미노산 서열 사이의 서열 동일성의 정도는 공지의 컴퓨터 알고리즘, 예컨대, 뉴클레오티드 서열에 대한 서열 동일성의 정도를 측정하기 위한 것으로서 상기 언급되어 있는 것을 사용하고, 다시 표준 설정을 사용함으로써 계산될 수 있다.
일반적으로, 상기 개략적으로 설명된 계산 방법에 따라 두 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성(%)"을 측정하기 위해, 아미노산 잔기의 개수가 가장 큰 아미노산 서열이 "제1" 아미노산 서열이 될 것이며, 나머지 아미노산 서열이 "제2" 아미노산 서열이 될 것이다;
또한, 2 개의 아미노산 서열 사이의 서열 동일성의 정도를 측정하는 데 있어서, 숙련가라면 소위 "보존적" 아미노산 치환을 고려할 수 있는데, 이는 일반적으로 아미노산 잔기가 유사 화학 구조의 또 다른 아미노산 잔기로 대체되고 폴리펩티드의 기능, 활성 또는 다른 생물학적 특성에는 거의 영향을 주지 않거나, 또는 본질적으로 전혀 영향을 주지 않는 아미노산 치환으로서 설명될 수 있다. 이러한 보존적 아미노산 치환은 당업계, 예를 들면, WO 04/037999, GB 335768-A, WO 98/49185, WO 00/46383 및 WO 01/09300에 공지되어 있고; 이러한 치환의 (바람직한) 유형 및/또는 조합은 WO 04/037999 뿐만 아니라, WO 98/49185 및 본원에서 인용된 추가의 참고 문헌으로부터의 적절한 교시에 기초하여 선택될 수 있다.
이러한 보존적 치환은 바람직하게는 하기 군 (a) 내지 (e) 중 하나의 아미노산이 동일한 군 내의 또 다른 아미노산 잔기로 치환되는 치환이다: (a) 작은 지방족 비극성 또는 약간 극성을 띠는 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; (b) 극성의 음으로 하전된 잔기 및 그의 (비하전된) 아미드: Asp, Asn, Glu 및 Gln; (c) 극성의 양으로 하전된 잔기: His, Arg 및 Lys; (d) 큰 지방족 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및 (e) 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp.
특히 바람직한 보존적 치환은 하기와 같다: Ala의 Gly 또는 Ser로의 치환; Arg의 Lys로의 치환; Asn의 Gln 또는 His로의 치환; Asp의 Glu로의 치환; Cys의 Ser로의 치환; Gln의 Asn로의 치환; Glu의 Asp로의 치환; Gly의 Ala 또는 Pro로의 치환; His의 Asn 또는 Gln로의 치환; Ile의 Leu 또는 Val로의 치환; Leu의 Ile 또는 Val로의 치환; Lys의 Arg, Gln 또는 Glu로의 치환; Met의 Leu, Tyr 또는 Ile로의 치환; Phe의 Met, Leu 또는 Tyr로의 치환; Ser의 Thr로의 치환; Thr의 Ser로의 치환; Trp의 Tyr로의 치환; Tyr의 Trp로의 치환; 및/또는 Phe의 Val, Ile 또는 Leu로의 치환.
본원에 기재된 폴리펩티드에 적용되는 임의의 아미노산 치환은 또한 (Schulz) 등(문헌 [Schulz et al., (1978, "Principles of Protern Structure", Springer Verlag)])에 의해 개발된 상이한 종들의 상동 단백질 사이의 아미노산 변이의 빈도에 대한 분석, (Chou 및 Fasman)(문헌 [Chou and Fasman (1974, Biochemistry 13:211, and 1978, Adv. Enzymol., 47:45-149)])에 의해 개발된 구조 형성 전위에 관한 분석, 및 (Eisenberg) 등(문헌 [Eisenberg et al., (1984 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:140-144)]), (Kyte 및 Doolittle)(문헌 [Kyte and Doohttle (1981, J. Molec. Biol. 157:105-132)], 및 (Goldman) 등(문헌 [Goldman et al., 1986, Ann Rev. Biophys. Chem. 15:321-353)]에 의해 개발된 단백질에서의소수성 패턴의 분석에 기초할 수 있고, 상기 참고 문헌 모두의 전문이 본원에서 참고로 인용된다. 나노바디의 1차, 2차 및 3차 구조에 대한 정보는 본원의 설명 및 상기 인용된 일반 배경 기술에서 제공된다. 또한, 이러한 목적으로 라마로부터 유래된 VHH 도메인의 결정 구조는 예를 들면, 문헌 ([Desmyter et al., (1996, Nature Structural Biology, 3(9):803)], [Spinelli. et al., (1996, Natural Structural Biology, 3:752-757] 및 [Decanniere et al. (1999, Structure, 7(4):361)])에 의해 제공된다. 종래의 VH 도메인에서 VH/VL 계면 및 이들 위치 상의 유효한 카멜화 치환을 형성하는 일부 아미노산 잔기에 대한 추가의 정보는 상기 인용된 선행 기술에서 살펴볼 수 있다;
g) 아미노산 서열 및 핵산 서열은 이들이 그의 전체 길이에 걸쳐 (본원에서 정의되는 바와 같은) 100%의 서열 동일성을 갖는다면, 이들은 "정확히 동일"한 것이라고 언급된다;
h) 2개의 아미노산 서열을 비교할 때, "아미노산 차이"라는 용어는, 제2 서열과 비교하여 제1 서열 위치 상의 단일 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환을 지칭하고; 2개의 아미노산 서열은 1개, 2개 이상의 이러한 아미노산 차이를 갖는 것으로 이해된다;
i) 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이 각각 또 다른 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 "포함"하거나, 또 다른 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열로 "본질적으로 구성"된다고 언급되는 경우, 이는 후자의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이 각각 먼저 언급된 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열 내로 혼입됨을 의미할 수 있으나, 보다 통상적으로 이는 일반적으로 먼저 언급된 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이 실제로 어떻게 생성되거나 수득되는지와는 상관없이(이는 예를 들면, 본원에 기재된 임의의 적합한 방법에 의한 것일 수 있다), 전술된 서열이 그의 서열 내에 각각 후자의 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 갖는 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 스트레치를 포함함을 의미한다. 비제한적 예로서, 본 발명의 아미노산 서열이 아미노산 잔기의 스트레치를 포함한다고 언급되는 경우, 이는 상기 아미노산 잔기의 스트레치가 본 발명의 아미노산 서열 내로 혼입됨을 의미할 수 있으나, 보다 통상적으로 이는 일반적으로 본 발명의 아미노산 서열이 어떻게 생성되거나 수득되는지와는 상관없이, 상기의 본 발명의 아미노산 서열이 그의 서열 내에 아미노산 잔기의 스트레치를 포함함을 의미한다. 본 발명의 나노바디가 CDR 서열을 포함한다고 언급되는 경우, 이는 상기 CDR 서열이 본 발명의 나노바디 내로 혼입되었음을 의미할 수 있으나, 보다 통상적으로 이는 일반적으로, 본 발명의 나노바디가 어떻게 생성되고 수득되었는지와 상관없이 상기 본 발명의 나노바디가 그의 서열 내에 상기 CDR 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 아미노산 잔기의 스트레치를 함유함을 의미한다. 또한, 후자의 아미노산 서열이 특이적인 생물학적 또는 구조적 기능을 가질 경우, 이는 바람직하게는 본질적으로 동일하거나, 유사하거나 등가의 생물학적 또는 구조적 기능을 전술된 아미노산 서열 중에 가짐(다시 말해, 전술된 아미노산 서열은, 바람직하게는 후자의 서열이 본질적으로 동일하거나, 유사하거나 등가의 생물학적 또는 구조적 기능을 수행할 수 있도록 함)을 주지해야 한다. 예를 들면, 본 발명의 나노바디가 각각 CDR 서열 또는 골격 서열을 포함한다고 언급되는 경우, CDR 서열 및 골격은 바람직하게는 상기 나노바디에서 각각 CDR 서열 또는 골격 서열처럼 작용할 수 있다. 또한, 뉴클레오티드 서열이 또 다른 뉴클레오티드 서열을 포함한다고 언급될 경우, 먼저 언급된 뉴클레오티드 서열은, 바람직하게는 이것이 발현 생성물(예컨대, 폴리펩티드) 로 발현될 경우, 후자의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 상기 발현 생성물의 일부를 형성하게 한다(다시 말해, 후자의 뉴클레오티드 서열은 먼저 언급된 보다 큰 뉴클레오티드 서열과 동일한 리딩프레임 내에 있다);
j) 핵산 서열 또는 아미노산 서열은, 예를 들면, 그의 천연 생물학적 공급원 및/또는 그가 수득되는 반응 배지 또는 배양 배지와 비교하여, 그 서열이 상기 공급원 또는 배지에서 통상적으로 회합되는 적어도 하나의 다른 성분, 예컨대, 또 다른 핵산, 또 다른 단백질/폴리펩티드, 또 다른 생물학적 성분 또는 거대분자 또는 적어도 하나의 오염원, 불순물 또는 소수의 성분으로부터 분리되어진 경우, "본질적으로 단리된 (형태)"인 것으로 간주된다. 특히, 핵산 서열 또는 아미노산 서열은, 그가 적어도 2배, 특히, 적어도 10배, 더욱 특히, 적어도 100배, 및 1,000배 이상까지 정제되어진 경우, "본질적으로 단리"된 것으로 간주된다. "본질적으로 단리된 형태"의 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 적합한 기법, 예컨대, 적합한 크로마토그래피 기법, 예컨대, 폴리아크릴아미드-겔 전기영동을 사용하여 측정되는 바와 같이, 바람직하게는 본질적으로 균질하다;
k) 본원에서 사용된 "도메인"이라는 용어는 일반적으로 아미노산 서열의 구형 부위(예컨대, 항체 쇄, 특히 중쇄 항체의 구형 부위), 또는 이러한 구형 부위로 본질적으로 구성된 폴리펩티드를 지칭한다. 통상적으로, 이러한 도메인은, 예를 들면, 쉬트로서 또는 이황화 결합에 의해 펩티드 루프(예를 들면, 3개 또는 4개의 펩티드 루프)를 포함할 것이다. "결합 도메인"이라는 용어는 (본원에 정의된 바와 같은) 항원 결정기에 대한 상기와 같은 도메인을 지칭한다;
l) "항원 결정기"라는 용어는 항원 결합 분자(예컨대, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드), 더욱 특히, 상기 분자의 항원 결합 부위에 의해 인식되는 항원 상의 에피토프를 지칭한다. "항원 결정기" 및 "에피토프"라는 용어는 또한 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다;
m) 특이적인 항원 결정기, 에피토프, 항원 또는 단백질(또는 그의 적어도 하나의 부분, 단편 또는 에피토프)에 (특이적으로) 결합할 수 있거나, 그에 대해 친화성 및/또는 특이성을 갖는 아미노산 서열(예컨대, 본 발명의 나노바디, 항체, 폴리펩티드, 또는 일반적으로 항원 결합 단백질 또는 폴리펩티드 또는 그의 단편)은 상기 항원 결정기, 에피토프, 항원 또는 단백질에 "~에 대한"("against" 또는 "directed against") 것으로 언급된다;
n) "특이성"이라는 용어는 특정 항원 결합 분자 또는 항원 결합 단백질(예컨대, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드) 분자가 결합할 수 있는 상이한 유형들의 항원 또는 항원 결정기의 수를 지칭한다. 항원 결합 단백질의 특이성은 친화도 및/또는 결합력에 기초하여 결정될 수 있다. 항원과 항원 결합 단백질과의 해리에 대한 평형 상수(KD)로 표시되는 친화도는 항원 결합 단백질 상에서 항원 결정기와 항원 결합 부위 사이의 결합 강도에 대한 측정값이고; KD 값이 적을 수록, 항원 결정기와 항원 결합 부위 사이의 결합 강도는 강해진다(별법으로, 친화도는 또한 1/KD인 친화도 상수(KA)로 표시될 수 있다). (예를 들면, 본원의 추가의 개시 내용에 기초하여) 숙련가에게는 명백한 바와 같이, 친화도는 관심의 대상이 되는 특이적인 항원에 따라서 자체 공지된 방식으로 측정될 수 있다. 결합력은 항원 결합 분자(예컨대, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드) 및 적절한 항원 사이의 결합 강도에 대한 측정값이다. 결합력은 항원 결합 분자 상의 항원 결정기 및 그의 항원 결합 부위 사이의 친화도, 및 항원 결합 분자 상에 존재하는 적절한 결합 부위의 수, 둘 모두에 관한 것이다. 전형적으로, 항원 결합 단백질은 10-5 내지 10-12 몰/ℓ 또는 그 이하, 및 바람직하게, 10-7 내지 10-12 몰/ℓ 또는 그 이하 및 더욱 바람직하게, 10-8 내지 10-12 몰/ℓ의 해리 상수(KD)(즉, 105 내지 1012 ℓ/몰 또는 그 이상, 및 바람직하게, 107 내지 1012 ℓ/몰 또는 그 이상 및 더욱 바람직하게, 108 내지 1012 ℓ/몰의 회합 상수(KA))로 그의 항원에 결합할 것이다. 104 몰/ℓ 초과의 임의의 KD 값(또는 104 M-1 미만의 임의의 KA 값)은 일반적으로 비특이적 결합을 지시하는 것으로 간주된다. 바람직하게는, 본 발명의 1가 면역글로불린 서열은 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 더욱 바람직하게는 10 nM 미만, 예컨대, 500 pM 미만의 친화도로 원하는 항원에 결합하게 될 것이다. 항원 또는 항원 결정기로의 항원 결합 단백질의 특이적인 결합은 예를 들면, 스카차드(Scatchard) 분석법 및/또는 경쟁적 결합 분석법, 예컨대, 방사성면역측정법(RIA: radioimmunoassay), 효소 면역측정법(EIA: enzyme immunoassay) 및 샌드위치 경쟁 분석법, 및 당업계에 자체 공지된 그의 상이한 변형법 뿐만 아니라, 본원에 언급된 다른 기법들을 비롯한, 자체 공지된 임의의 적합한 방식으로 측정될 수 있다.
숙련가에게 명백한 바와 같이, 해리 상수는 실제 또는 겉보기 해리 상수일 수 있다. 해리 상수를 결정하는 방법은 숙련가에게는 명백할 것이고, 예를 들면, 본원에서 언급된 기법들을 포함한다. 이와 관련하여서는 또한 10-4 몰/ℓ 또는 10-3 몰/ℓ 초과(예를 들면, 10-2 몰/ℓ)의 해리 상수는 측정할 수 없다는 것이 명백할 것이다. 임의로는 또한 숙련가에게 명백한 바와 같이, (실제값 또는 겉보기 값) 해리 상수는 (실제값 또는 겉보기 값) 회합 상수(KA)에 기초하여 관계식 [KD = 1/KA]에 의해 계산될 수 있다. 친화도는 분자 상호작용의 강도 또는 안정성을 의미한다. 친화도는 통상 KD, 또는 해리 상수로 제공되고, 이는 몰/ℓ(또는 M)의 단위를 가진다. 친화도는 또한 회합 상수, KA로서 표현될 수 있고, 이는 1/KD와 같고, (몰/ℓ)-1(또는 M-1)의 단위를 가진다. 본 명세서에서, 두 분자(예컨대, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드 및 그의 의도된 표적) 사이의 상호작용의 안정성은 주로 이들 상호작용의 KD 값으로 표현될 수 있고; KA = 1/KD 관계식에 있어서, 이의 KD 값에 의한 분자 상호작용의 강도를 구체화하는 것은 또한 상응하는 KA 값을 계산하기 위해 사용될 수 있다는 것이 숙련가에게 명백할 것이다. KD-값은 또한 열역학적 의미에서 분자 상호작용의 강도를 특징짓는데, 이것은 주지된 관계식 DG = RT.ln(KD)(등가적으로, DG = RT.ln(KA))(여기서 R은 기체 상수이고, T는 절대 온도이고, ln은 자연 로그를 의미한다)에 의한 결합의 자유 에너지(DG)에 관련되기 때문이다.
의미있는 것으로 간주되는(예를 들면, 특이적인) 생물학적 상호작용을 위한 KD는 전형적으로 10-10 M(0.1 nM) 내지 10-5 M(10,000 nM)의 범위이다. 상호작용이 강하면 강할수록, 그의 KD는 더 낮아진다.
KD는 또한 복합체의 해리 속도 상수(k오프로 표시)의 그의 회합 속도(k온으로 표시)에 대한 비율로서 표현될 수 있다(따라서, KD = k오프/k온 및 KA = k온/k오프). 오프 속도인 k오프의 단위는 s-1(여기서 s는 초의 SI 단위 표시법이다)이다. 온 속도인 k온의 단위는 M-1s-1이다. 온 속도는 102 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1 사이에서 다양할 수 있고, 2분자 상호작용에 대한 확산 제한된 해리 속도 상수에 근접한다. 오프 속도는 관계식 t½ = ln(2)/k오프에 의해 소정의 분자 상호작용의 반감기와 관련된다. 오프 속도는 10-6 s-1(t½이 다수일인 거의 비가역적인 복합체) 내지 1 s- 1(t1/2 =0.69 s) 사이에서 다양할 수 있다. 두 분자 사이의 분자 상호작용의 친화도는 자체 공지된 상이한 기법, 예컨대, 주지된 표면 플라스몬 공명(SPR: surface plasmon resonance) 바이오센서 기법(예를 들면, 문헌 [Ober et al., Intern. Immunology, 13, 1551-1559, 2001] 참조)을 통해 측정될 수 있고, 여기서, 하나의 분자는 바이오센서 칩에 고정화되고, 나머지 분자는 고정화된 분자 위를 유동 조건 하에 통과되어 k온, k오프 측정값을 산출하고, 이에 따라 KD(또는 KA) 값을 산출한다. 이는 예를 들면, 주지된 비아코어(BIACORE) 기기를 사용하여 수행될 수 있다. 또한, 측정 과정이 예를 들면, 한 분자의 바이오센서 상의 코팅에 대한 인공산물에 의해 내포된 분자들의 고유 결합 친화도에 어느 정도 영향을 미친다면, 측정된 KD가 겉보기 KD에 상응할 수 있다는 것도 숙련가에게 명백할 것이다. 또한, 한 분자가 나머지 분자에 대해 1 초과의 인식 부위를 함유한다면 겉보기 KD가 측정될 수 있다. 이러한 상황에서, 측정된 친화도는 두 분자에 의한 상호작용의 결합력에 의해 영향받을 수 있다.
친화도를 평가하기 위해 사용될 수 있는 또 다른 접근법은 문헌 [Friguet et al., (1985, J. Immunol. Methods, 77:305-19)]의 2 단계 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 절차이다. 이 방법은 용액 상 결합 평형 측정법을 확립하고, 지지체, 예컨대, 플라스틱 상의 분자 중 하나의 흡착과 관련된 가능한 인공산물을 방지한다. 그러나, KD의 정확한 측정은 매우 노동집약적일 수 있어, 결과적으로는 종종 겉보기 KD 값이 두 분자의 결합 강도를 평가하기 위해 측정된다. 모든 측정이 일관된 방식으로 이루어지는 한(예를 들면, 분석 조건을 유지하는 한), 겉보기 KD 측정값은 진정한 KD의 근사값으로서 사용될 수 있고, 따라서, 본 문서에서 KD 및 겉보기 KD는 동일한 중요성 및 연관성을 가지고 처리되어야 함을 주지해야 한다.
마지막으로, 여러 상황하에서 실험 과학자는 일부 참조 분자에 관한 결합 친화도를 측정하는 것이 편리한 지를 판단할 수 있음을 주지해야 한다. 예를 들면, 분자 A와 B 사이의 결합 강도를 평가하기 위해, 예를 들면, B에 결합하는 것으로 공지되고, 형광단 또는 발색단 기 또는 다른 화학 부분, 예컨대, ELISA 또는 형광 활성화된 세포 분류(FACS: Fluorescent activated cell sorting)에서 용이하게 검출하기 위한 비오틴 또는 다른 포맷(형광 검출을 위한 형광단, 광 흡수 검출을 위한 발색단, 스트렙타비딘 매개 ELISA 검출을 위한 비오틴)으로 적합하게 표지된 참조 분자 C를 사용할 수 있다. 전형적으로, 참조 분자 C는 고정된 농도로 유지되고, A의 농도는 B의 소정의 농도 또는 양에 대해 달라진다. 결과로서, IC50 값은 A의 부재하에 C에 대해 측정된 신호가 반감되는 A의 농도에 상응하여 수득된다. 참조 분자의 KD(KDref) 뿐만 아니라, 참조 분자의 총 농도(cref)가 공지되어 있다면, 상호작용 A-B에 대한 겉보기 KD는 하기 식으로부터 수득될 수 있다: KD = IC50/(1+cref/KDref). cref << KDref인 경우, KD
Figure 112011088504629-pct00003
IC50이다. IC50의 측정이 비교되는 결합제에 대해 일정한 방식으로(예를 들면, cref를 고정시킨 채로 유지하여) 수행된다면, 분자 상호작용의 강도 또는 안정성은 IC50에 의해 평가될 수 있고, 이러한 측정값은 본 명세서 전역에 걸쳐 KD 또는 겉보기 KD에 등가인 것으로 판단된다.
o) 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드의 반감기는 일반적으로 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드의 혈청 농도가 생체내에서, 예를 들면, 서열 또는 화합물의 분해 및/또는 천연 기전에 의한 서열 또는 화합물의 제거 또는 소실로 인하여, 50% 만큼 감소되는 데 소요되는 시간으로서 정의될 수 있다. 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드의 생체내 반감기는 자체 공지된 임의의 방식으로, 예컨대, 약물동력학적 분석에 의해 측정될 수 있다. 적합한 기법은 당업계의 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들면, 일반적으로 온혈 동물(즉, 인간 또는 또 다른 적합한 포유동물, 예컨대, 마우스, 토끼, 래트, 돼지, 개 또는 영장류, 예를 들면, 마카카(Macaoca) 속으로부터의 원숭이(예컨대, 특히, 시노몰구스 원숭이(마카카 파스시쿨라리스) 및/또는 레서스 원숭이(마카카 물라타(Macaca mulatta)) 및 개코원숭이(파피오 우르시너스(Papio ursinus))에게 적합한 용량의 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드를 적합하게 투여하는 단계; 상기 동물로부터 혈액 샘플 또는 다른 샘플을 수집하는 단계; 상기 혈액 샘플 중 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드의 수준 또는 농도를 측정하는 단계; 및 이렇게 수득된 데이터(의 플롯)로부터, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드의 수준 또는 농도가 투여시 초기 수준과 비교하여 50% 만큼 감소될 때까지의 시간을 계산하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 하기 실험부 뿐만 아니라, 표준 편람, 예컨대, 문헌 ([Kenneth A et al., (Chemical Stability of Pharmaceuticals A Handbook for Pharmacists)] 및 [Peters et al. (1996, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach)])을 참조한다. 또한, 문헌 [Gibaldi M and Perron D (1982, "Pharmacokinetics", published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition)]을 참조한다.
또한 숙련가에게 명백한 바와 같이(예를 들면, WO 04/003019의 6 및 7페이지와, 본원에 인용된 추가의 문헌을 참조한다), 반감기는 파라미터, t½-알파, t½-베타 및 곡선하 면적(AUC: area under the curve)을 사용하여 표현될 수 있다. 본 명세서에서, "반감기의 증가"는 이러한 파라미터 중 어느 하나, 예컨대, 2개의 파라미터 중 어느 2개, 또는 본질적으로 이들 파라미터 3개 모두에서의 증가를 지칭한다. 본원에서 사용되는 "반감기의 증가," 또는 "증가된 반감기"는 특히 t½-알파 및/또는 AUC, 또는 이 둘 모두의 증가와 함께 또는 이들의 증가없이 t½-베타의 증가를 지칭한다.
p) 본 발명과 관련하여, "조정" 또는 "조정하는"은 일반적으로 적합한 시험관내, 세포성 또는 생체내 분석법을 사용하여 측정한 바, 표적 또는 항원의 활성을 감소 또는 억제시키거나, 별법으로 이를 증가시키는 것을 의미한다. 특히, "조정" 또는 "조정하는"은 적합한 시험관내, 세포성 또는 생체내 분석법(이는 통상적으로 관여하는 표적 또는 항원에 따라 달라질 것이다)을 사용하여 측정한 바, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 또는 컨스트럭트가 존재하지 않는다는 것을 제외하면 동일한 조건하에서 동일한 분석법으로 분석된 표적 또는 항원의 활성과 비교하여, 적어도 1%, 바람직하게, 적어도 5%, 예컨대, 적어도 10% 또는 적어도 25%, 예를 들면, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 90% 이상 표적 또는 항원의 (관련된 또는 의도된) 생물학적 활성을 감소 또는 억제시키거나, 별법으로 이를 증가시키는 것을 의미할 수 있다.
숙련가에게 명백한 바와 같이, "조정"은 또한 표적 또는 항원의 그의 리간드, 결합 파트너, 동종다량체성 또는 이종다량체성 형태로의 회합을 위한 파트너, 또는 기질 중 하나 이상에 대한 친화성, 결합력, 특이성 및/또는 선택성에 변화(이는 증가이거나 감소일 수 있다)를 일으키고/거나; 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 또는 컨스트럭트가 존재하지 않는다는 것을 제외하면 동일한 조건과 비교하여, 표적 또는 항원이 존재하는 매질 또는 환경에서의 하나 이상의 조건(예컨대, pH, 이온 강도, 보조인자의 존재 등)에 대한 표적 또는 항원의 감도에 변화(이는 증가이거나 감소일 수 있다)를 일으키는 것을 포함할 수 있다. 숙련가에게 명백한 바와 같이, 이는 또한 관여하는 표적 또는 항원에 따라서 임의의 적합한 방식으로 및/또는 자체 공지된 임의의 적합한 분석법을 사용하여 결정될 수 있다.
"조정"은 또한 표적 또는 항원이 관여하는 하나 이상의 생물학적 또는 생리학적 기전, 효과, 반응, 기능, 경로 또는 활성(또는 상기 표적 또는 항원의 기질(들), 리간드(들) 또는 경로(들)이 관여하는 하나 이상의 생물학적 또는 생리학적 기전, 효과, 반응, 기능, 경로 또는 활성, 예컨대, 그의 신호전달 경로 또는 대사 경로 및 그와 관련된 생물학적 또는 생리학적 효과)과 관련된 변화(즉, 표적 또는 항원 및 원하는 생물학적 또는 생리학적 효과에 따른, 각각의 작용제, 길항제 또는 역작용제로서의 활성)를 일으키는 것을 포함할 수 있다. 이 또한 숙련가에게 명백한 바와 같이, 작용제 또는 길항제로서의 이러한 작용은 관여하는 표적 또는 항원에 따라서 임의의 적합한 방식으로 및/또는 자체 공지된 임의의 적합한 (시험관내 및 통상적으로 세포성 또는 생체내) 분석법을 사용하여 측정될 수 있다. 특히, 작용제 또는 길항제로서의 작용은 의도된 생물학적 또는 생리학적 활성이 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 또는 컨스트럭트가 존재하지 않는다는 것을 제외하면 동일한 조건하에서 동일한 분석법으로 분석된 생물학적 또는 생리학적 활성과 비교하여, 각각 적어도 1%, 바람직하게, 적어도 5%, 예컨대, 적어도 10% 또는 적어도 25%, 예를 들면, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 90% 이상 증가 또는 감소되도록 하는 것일 수 있다.
조정은 또한 예를 들면, 표적 또는 항원의 알로스테릭 조정; 및/또는 표적 또는 항원의 그의 기질 또는 리간드 중 하나에의 결합을 감소 또는 억제; 및/또는 표적 또는 항원에의 결합을 위한 천연 리간드, 기질과의 경쟁을 포함할 수 있다.
조정은 또한 표적 또는 항원, 또는 상기 표적 또는 항원이 관여하는 기전 또는 경로를 활성화시키는 것을 포함할 수 있다. 조정은 또한 예를 들면, 표적 또는 항원의 폴딩 또는 입체구조에 관한 변화, 또는 표적 또는 항원이 폴딩하거나, 그의 입체구조(예를 들면, 리간드 결합시)를 바꾸거나, 다른 (서브) 유닛과 회합되거나, 해리되는 능력에 변화를 일으키는 것을 포함할 수 있다. 조정은 또한 예를 들면, 표적 또는 항원이 다른 화합물을 수송하거나, 다른 화합물(예컨대, 이온)을 위한 통로로서 작용할 수 있는 능력에 변화를 일으키는 것 포함할 수 있다.
조정은 가역적이거나 비가역적일 수 있지만, 약제학적 및 약리학적 목적을 위해서는 통상적으로 가역적인 방식일 것이다.
본 발명과 관련하여, "조정" 또는 "조정하는"은 일반적으로 IL-6, IL-6R, 및/또는 IL-6 및/또는 IL-6R이 관여하는 생물학적 경로, 반응, 신호전달, 기전 또는 효과와 관련하여 작용성 또는 길항성 효과를 발휘하는 것을 의미한다. 특히, "조정" 또는 "조정하는"이라는 것은 적합한 시험관내, 세포성 또는 생체내 분석법(예컨대, 본원에서 언급된 분석법)을 사용하여 측정한 바, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 또는 컨스트럭트가 존재하지 않는다는 것을 제외하면 동일한 조건하에서 동일한 분석법으로 분석된 경우의 동일한 파라미터와 비교하여, 적어도 1%, 바람직하게, 적어도 5%, 예컨대, 적어도 10% 또는 적어도 25%, 예를 들어, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 90% 이상 관련 파라미터에 변화를 일으키는, 작용성 또는 길항성 효과(즉, 각각 전체 또는 부분적인 작용성 또는 길항성 효과)를 의미할 수 있다.
본 발명과 관련하여, "IL -6/ IL -6R 복합체의 gp130 에의 결합을 조정, 억제 및/또는 방해하는"이라는 것은 IL-6/IL-6R 복합체의 형성이 영향을 받거나, 억제되거나 및/또는 방해를 받거나(예로서, 전체적으로 또는 부분적으로 파괴되거나) 하는 방식으로, 상기 복합체의 gp130에의 결합-예컨대, 그에 대한 친화도가 감소되거나, 억제되거나, 및/또는 방해를 받거나(또는 역으로, gp130의 상기 복합체에의 결합-예컨대, 그에 대한 친화도가 감소되거나, 억제되거나, 및/또는 방해를 받거나) 하는 방식으로 작용함으로써 상기 복합체의 gp130에의 결합에 의해 유도/매개되는 신호전달이 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 또는 컨스트럭트의 부재하에서 이루어진 복합체의 형성, 및 그의 gp130에의 결합과 비교하여 조정되는 (예로서, 감소, 억제, 및/또는 방해를 받는 것) 것인, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 또는 컨스트럭트가 IL-6R 상의 특이적인 에피토프(즉, 그 자체, 또는 IL-6/IL-6R 복합체에 존재하는 것)에 결합하는 것을 의미한다.
q) 표적 또는 항원에 있어서, 표적 또는 항원 상의 "상호작용 부위"라는 용어는 표적 또는 항원의 리간드, 수용체 또는 다른 결합 파트너에 결합하기 위한 부위, 촉매적 부위, 절단 부위, 알로스테릭 상호작용을 위한 부위, 다량체화에 관여하는 부위(예컨대, 동종다량체화 또는 이종이량체화)인 표적 또는 항원 상의 아미노산 잔기의 부위, 에피토프, 항원 결정기, 부분, 도메인 또는 스트레치; 또는 표적 또는 항원의 생물학적 작용 또는 기전에 관여하는, 표적 또는 항원 상의 아미노산 잔기의 임의의 다른 부위, 에피토프, 항원 결정기, 부분, 도메인 또는 스트레치를 의미한다. 더욱 일반적으로, "상호작용 부위"는 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 또는 컨스트럭트가 결합하여 표적 또는 항원(및/또는 표적 또는 항원이 관여하는 임의의 경로, 상호작용, 신호전달, 생물학적 기전 또는 생물학적 효과)이 (본원에서 정의되는 바와 같이) 조정되도록 하는, 표적 또는 항원 상의 아미노산 잔기의 임의의 부위, 에피토프, 항원 결정기, 부분, 도메인 또는 스트레치일 수 있다;
r) "아미노산 잔기의 스트레치"는 서로 인접한 위치에, 또는 서로 매우 근접하게 위치하고 있는, 즉 아미노산 서열의 1차 또는 3차 구조로 있는 2개 이상의 아미노산 잔기를 의미한다. 본 발명과 관련하여, "아미노산 잔기의 스트레치"가 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 또는 컨스트럭트가 IL-6R 상의 그의 특이적인 에피토프에의 결합을 (적어도 부분적으로) 담당할 것이다;
s) 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 또는 컨스트럭트가 제2 표적 또는 폴리펩티드에 결합하는 친화도에 비하여 적어도 10배, 예컨대, 적어도 100배, 및 바람직하게, 적어도 1,000배, 및 10,000배 이상까지 더 우수한 친화도(상기 기술되어 있는 바와 같이, 적합하게는 KD 값, KA 값, K오프 속도 및/또는 K온 속도로 표현)를 가지고 제1 항원에 결합할 경우, 제2 표적 또는 항원에 비하여 제1 항원 또는 항체"에 대해 특이적"이라고 언급된다. 예를 들면, 제1 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 또는 컨스트럭트는, 상기 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 또는 컨스트럭트가 제2 표적 또는 폴리펩티드에 결합할 때의 KD 값에 비하여 적어도 10배 더 작은, 예컨대, 적어도 100배 더 작은, 및 바람직하게, 적어도 1,000배 더 작은, 예컨대, 10,000배 더 작은, 또는 그보다 더 작은 KD 값으로 표적 또는 항원에 결합할 수 있다. 바람직하게, 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 또는 컨스트럭트가 제2 표적 또는 항원에 비하여 제1 표적 또는 항원"에 대해 특이적"인 경우, 이는 (본원에 정의된 바와 같이) 상기 제1 표적 또는 항원에 대한 것이지만, 상기 제2 표적 또는 항원에 대한 것은 아니다;
t) 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디(뿐만 아니라, 그를 포함하는 화합물, 컨스트럭트 및 폴리펩티드)가 2개의 상이한 종(즉, 제1 종 및 제2 종)으로부터 유래된 IL-6R과 "교차 반응성"이라는 것은 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디(뿐만 아니라, 그를 포함하는 화합물, 컨스트럭트 및 폴리펩티드)가, 상기 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디(뿐만 아니라, 그를 포함하는 화합물, 컨스트럭트 및 폴리펩티드)가 제1 종으로부터 유래된 IL-6R에 결합하는 친화도와 동일하거나, 또는 거의 적어도 70%(바람직하게, 적어도 80%, 더욱 바람직하게, 적어도 90%, 또는 더욱더 바람직하게, 적어도 95%인 (적합하게는 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, KD 값(실제값 또는 겉보기 값), KA 값(실제값 또는 겉보기 값), k온 속도 및/또는 k오프 속도, 또는 별법으로 IC50 값으로 측정되고/거나 표현되는) 친화도로 제2 종으로부터 유래된 IL-6R에 결합한다는 것을 의미한다.
u) 본원에 추가로 기술되어 있는 바와 같이, 나노바디 중 아미노산 잔기의 총 개수는 110-120개, 바람직하게, 112-115개 범위, 가장 바람직하게는 113개일 수 있다. 그러나, (본원에 추가로 기술되어 있는 바와 같이) 나노바디의 부분, 단편, 유사체 또는 유도체는, 이러한 부분, 단편, 유사체 또는 유도체가 본원에 개략적으로 설명된 추가의 요건을 충족하고, 또한 바람직하게는 본원에 기술된 목적에 적합하는 한, 그의 길이 및/또는 크기에 관한 특별한 제한이 없다는 것에 주의하여야 한다;
v) 나노바디의 아미노산 잔기는, 논문 [Riechmann and Muyldermans, (2000, J. Immunol. Methods 240(1-2):185-195)](예를 들면, 상기 공개 문헌의 도 2 참조)에서 카멜리드(Camelid)로부터의 VHH 도메인에 적용된 바와 같이, 문헌 [Kabat et al., "Sequence of Proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91]에 제시되어 있거나, 또는 본원에서 언급된 VH에 대한 일반적 번호매김에 따라 번호매김이 이루어진다. 이러한 번호매김에 따라, 나노바디의 FR1은 위치 1 내지 30에서의 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 CDR1은 위치 31 내지 35에서의 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 FR2는 위치 36 내지 49에서의 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 CDR2는 위치 50 내지 65에서의 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 FR3은 위치 66 내지 94에서의 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 CDR3은 위치 95 내지 102에서의 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 FR4는 위치 103 내지 113에서의 아미노산 잔기를 포함한다. [이와 관련하여, VH 도메인 및 VHH 도메인에 대해 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 각각의 CDR 내 아미노산 잔기의 총 개수는 다양할 수 있고, 카바트 번호매김에 의해 지시된 아미노산 잔기의 총 개수와 일치하지 않을 수 있다(즉, 카바트 번호매김에 따른 하나 이상의 위치는 실제 서열에서 점유하지 않거나, 실제 서열은 카바트 번호매김에 의해 허용되는 수보다 더 많은 아미노산 잔기를 함유할 수 있다). 이는, 일반적으로 카바트에 따른 번호매김이 실제 서열에서 아미노산 잔기의 실제 번호매김과 일치하거나 일치하지 않을 수 있음을 의미한다. 그러나, 일반적으로, 카바트의 번호매김에 따라 CDR내 아미노산 잔기의 개수와 상관없이, 카바트 번호매김에 따른 위치 1은 FR1의 시작점과 일치하고 또 그 반대일 수도 있으며, 카바트 번호매김에 따른 위치 36은 FR2의 시작점과 일치하고 또 그 반대일 수도 있으며, 카바트 번호매김에 따른 위치 66은 FR3의 시작점과 일치하고 또 그 반대일 수도 있으며, 카바트 번호매김에 따른 위치 103은 FR4의 시작점과 일치하고 또 그 반대일 수도 있다고 말할 수 있다].
카멜리드로부터의 VHH 도메인 및 나노바디에도 또한 유사한 방식으로 적용될 수 있는, VH 도메인의 아미노산 잔기의 번호매김을 위한 대체 방법은 소위 "AbM 정의" 및 소위 "접촉 정의(contact definition)"라는, 문헌 [Chothia et al., (1989, Nature 342:877-883)]에 기재되어 있는 방법이다. 그러나, 본 명세서, 특허청구범위 및 도면에서는 달리 명시되지 않는 한, (Riechmann) 및 (Muyldermans)에 의해 VHH 도메인에 적용된 것과 같은, 카바트에 따른 번호매김이 수행될 것이다; 그리고
w) 도면, 서열 목록 및 실험부/실시예는 단지 본 발명을 추가로 예시하기 위해 제공되고, 본원에서 달리 명확하게 명시되지 않는 한, 본 발명 및/또는 첨부된 특허청구범위의 범주를 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로서 해석되거나 이해되서는 안된다.
본 발명은 특별히 IL-6R에 결합할 수 있도록 적합화된 아미노산 잔기의 스트레치(서열번호 80-82, 서열번호 84-91 및 서열번호 93-95)를 제공한다. 이러한 아미노산 잔기의 스트레치는 특히 본 발명의 아미노산 서열의 항원 결합 부위(의 부분)를 형성할 수 있도록 본 발명의 아미노산 서열에 존재하고/거나, 그에 도입될 수 있다. 이러한 아미노산 잔기의 스트레치는, IL-6R에 대해 유발되고, IL-6/IL-6R 상호작용을 부분적으로 또는 전체적으로 차단할 수 있고/거나, IL-6, IL-6R 및/또는 IL-6/IL-6R 복합체를 통해 일어나는 신호전달을 억제시킬 수 있는 그의 능력 이외에도, IL-6R에의 결합에 대한 그의 친화도 뿐만 아니라, 다른 특성, 예컨대, 그의 유효성 및/또는 효능, 및/또는 그의 선택성을 추가로 증가시키기 위해 추가로 친화도 성숙된(실시예 부분 참조) 중쇄 항체 또는 VHH 서열의 CDR 서열로서 생성되었다. 이러한 아미노산 잔기의 스트레치는 또한 "본 발명의 CDR 서열"로서(즉, 각각 "본 발명의 CDR1 서열," "본 발명의 CDR2 서열," 및 "본 발명의 CDR3 서열")로서 지칭된다.
그러나, 이러한 아미노산 잔기의 스트레치가 본 발명의 아미노산 서열이 IL-6R에 결합할 수 있도록 하는 한, 본 발명은 그의 가장 광범위한 의미에 있어 이러한 아미노산 잔기의 스트레치가 본 발명의 아미노산 서열에서 가질 수 있는 특이적인 구조적인 역할 또는 기능으로 제한되는 것은 아니라는 점에 주의하여야 한다. 따라서, 일반적으로 본 발명은 그의 가장 광범위한 의미에서 IL-6/IL-6R 상호작용을 부분적으로 또는 전체적으로 차단할 수 있고/거나, IL-6, IL-6R 및/또는 IL-6/IL-6R 복합체를 통해 일어나는 신호전달을 억제시킬 수 있는 그의 능력 이외에도, 특정의 구체화된 친화도, 결합력, 유효성 및/또는 효능을 가지고 IL-6R에 결합할 수 있으며, 전체 아미노산 서열이 IL-6R에 결합할 수 있는 결합 도메인 및/또는 결합 유닛을 형성할 수 있도록 하기 위해 하나 이상의 추가의 아미노산 서열을 통해 서로서로 적합하게 연결되어 있는, 본원에 기술된 하나 이상의 CDR 서열, 및 2개 이상의 상기 CDR 서열의 적합한 조합을 포함하는 아미노산 서열을 제공한다. 그러나, 또한 본 발명의 아미노산 서열 중 단 하나의 상기와 같은 CDR 서열이 단독으로 존재하는 것도 이미 IL-6R에 결합할 수 있는 본 발명의 아미노산 서열을 제공하는 데에는 충분할 수 있다는 것에도 주의하여야 한다(예를 들어, WO 03/050531에 소위 "Expedite fragments"이라고 지칭되는 것을 재차 참조할 수 있다).
따라서, 구체적이지만, 비제한적적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열은
- CDR1 서열:
a) 서열번호 80-82; 또는
b) 서열번호 80-82 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가지는 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치; 및/또는
- CDR2 서열:
c) 서열번호 84-91; 또는
d) 서열번호 84-91 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가지는 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치; 및/또는
- CDR3 서열:
e) 서열번호 93-95; 또는
f) 서열번호 93-95 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가지는 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기의 스트레치 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
특히, 본 발명의 아미노산 서열은, 상기 기술된 것과 같은 CDR1 서열, CDR2 서열 및 CDR3 서열(또는 그의 임의의 적합한 조합)로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기의 스트레치 중 적어도 하나를 포함하는 것인, 적어도 하나의 항원 결합 부위를 포함하는 아미노산 서열일 수 있다. 그러나, 바람직한 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열은 본 발명의 CDR1 서열, 본 발명의 CDR2 서열, 및/또는 본 발명의 CDR3 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기의 스트레치를 1 초과, 예컨대, 2개 이상 포함한다.
따라서, 본 발명은 또한
(i) 제1 아미노산 잔기의 스트레치가 a) 또는 b)에 따른 아미노산 서열 중 하나에 상응할 경우, 제2 아미노산 잔기의 스트레치는 c), d), e) 또는 f)에 따른 아미노산 서열 중 하나에 상응하거나, (ii) 제1 아미노산 잔기의 스트레치가 c) 또는 d)에 따른 아미노산 서열 중 하나에 상응할 경우, 제2 아미노산 잔기의 스트레치는 a), b), e) 또는 f)에 따른 아미노산 서열 중 하나에 상응하거나, 또는 (iii) 제1 아미노산 잔기의 스트레치가 e) 또는 f)에 따른 아미노산 서열 중 하나에 상응할 경우, 제2 아미노산 잔기의 스트레치는 a), b), c) 또는 d)에 따른 아미노산 서열 중 하나에 상응하도록, 하기
- CDR1 서열:
a) 서열번호 80-82; 또는
b) 서열번호 80-82 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가지는 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치; 및/또는
- CDR2 서열:
c) 서열번호 84-91; 또는
d) 서열번호 84-91 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가지는 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치; 및/또는
- CDR3 서열:
e) 서열번호 93-95; 또는
f) 서열번호 93-95 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가지는 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로부터 선택되는 아미노산 잔기의 스트레치를 2개 이상 포함하는 아미노산 서열에 관한 것이다.
구체적인 측면에서, 본 발명은 또한
제1 아미노산 잔기의 스트레치가 하기 CDR1 서열:
a) 서열번호 80-82; 또는
b) 서열번호 80-82 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가지는 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로부터 선택되고,
제2 아미노산 잔기의 스트레치가 하기 CDR2 서열:
c) 서열번호 84-91; 또는
d) 서열번호 84-91 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가지는 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로부터 선택되고,
제3 아미노산 잔기의 스트레치가 하기 CDR3 서열:
e) 서열번호 93-95; 또는
f) 서열번호 93-95 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가지는 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로부터 선택되는 것인, 아미노산 잔기의 스트레치를 3개 이상 포함하는 아미노산 서열에 관한 것이다.
본원에 기술되어 있는 바와 같이, 본 발명은 또한 a), c) 및/또는 e)에 명시되어 있는 아미노산 잔기의 스트레치 중 하나, 즉, 명시된 CDR1 서열 중 하나(즉, 서열번호 80-82 중 하나), 명시된 CDR2 서열 중 하나(즉, 서열번호 84-91 중 하나), 및/또는 명시된 CDR3 서열 중 하나(즉, 서열번호 93-95 중 하나)와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가지는 아미노산 잔기의 스트레치를 하나 이상 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
"아미노산 차이"라는 용어는 각각 a), c) 또는 e)의 아미노산 잔기의 스트레치(또는 CDR 서열)와 비교하였을 때, b), d) 또는 f)에서 명시된 아미노산 잔기의 스트레치(또는 CDR 서열) 상의 단일 아미노산 잔기의 삽입, 결실, 또는 치환을 의미하며; 이는 b), d) 및 f)의 아미노산 잔기의 스트레치(또는 CDR 서열)가 각각 a), c) 또는 e)의 아미노산 잔기의 스트레치와 비교하여 하나 또는 최대 2개의 상기와 같은 아미노산 차이를 포함할 수 있다는 것으로 이해된다.
"아미노산 차이"는 본 발명의 아미노산 서열의 특성을 개선시키거나, 또는 본 발명의 아미노산 서열의 원하는 특성을, 또는 균형을, 또는 원하는 특성의 조합을 적어도 크게 감소시키지는 않는, 임의의 하나 또는 최대 2개의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 이와 관련하여, 생성된 본 발명의 아미노산 서열은 적어도, 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 하나 또는 최대 2개의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하지 않는 아미노산 잔기의 스트레치를 하나 이상 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하여야 한다.
예를 들면, 본 발명의 아미노산 서열을 발현시키는 데 사용되는 숙주 유기체에 따라, 상기와 같은 결실 및/또는 치환은 당업계의 숙련가의 능력 범위내에서 번역 후 변형에 대한 하나 이상의 부위(예컨대, 하나 이상의 글리코실화 부위)가 제거되는 방식으로 디자인될 수 있다.
본 발명의 바람직한 측면에서, "아미노산 차이"는 아미노산 치환이다. 아미노산 치환은 본 발명의 아미노산 서열의 특성을 개선시키거나, 또는 본 발명의 아미노산 서열의 원하는 특성을, 또는 균형을, 또는 원하는 특성의 조합을 적어도 크게 감소시키지는 않는, 임의의 하나 또는 최대 2개의 치환일 수 있다. 이와 관련하여, 생성된 본 발명의 아미노산 서열은 적어도, 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 하나 또는 최대 2개의 치환을 포함하지 않는 아미노산 잔기의 스트레치를 하나 이상 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하여야 한다.
하나 이상의 아미노산 잔기의 스트레치 중의 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환일 수 있다. "보존적" 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 잔기가 유사 화학 구조의 또 다른 아미노산 잔기로 대체되고 생성된 아미노산 서열의 기능, 활성 또는 다른 생물학적 특성에는 거의 영향을 주지 않거나, 또는 본질적으로 전혀 영향을 주지 않는 아미노산 치환이다. 이러한 보존적 아미노산 치환은 당업계, 예를 들면, WO 04/037999, GB 335768-A, WO 98/49185, WO 00/46383 및 WO 01/09300에 주지되어 있고; 이러한 치환의 (바람직한) 유형 및/또는 조합은 WO 04/037999 뿐만 아니라, WO 98/49185 및 본원에서 인용된 추가의 참고 문헌으로부터의 적절한 교시에 기초하여 선택될 수 있다.
이러한 보존적 치환은 바람직하게는 하기 군 (a) 내지 (e) 중 하나의 아미노산이 동일한 군 내의 또 다른 아미노산 잔기로 치환되는 치환이다: (a) 작은 지방족 비극성 또는 약간 극성을 띠는 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; (b) 극성의 음으로 하전된 잔기 및 그의 (비하전된) 아미드: Asp, Asn, Glu 및 Gln; (c) 극성의 양으로 하전된 잔기: His, Arg 및 Lys; (d) 큰 지방족 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및 (e) 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp.
특히 바람직한 보존적 치환은 하기와 같다: Ala의 Gly 또는 Ser로의 치환; Arg의 Lys로의 치환; Asn의 Gln 또는 His로의 치환; Asp의 Glu로의 치환; Cys의 Ser로의 치환; Gln의 Asn로의 치환; Glu의 Asp로의 치환; Gly의 Ala 또는 Pro로의 치환; His의 Asn 또는 Gln로의 치환; Ile의 Leu 또는 Val로의 치환; Leu의 Ile 또는 Val로의 치환; Lys의 Arg, Gln 또는 Glu로의 치환; Met의 Leu, Tyr 또는 Ile로의 치환; Phe의 Met, Leu 또는 Tyr로의 치환; Ser의 Thr로의 치환; Thr의 Ser로의 치환; Trp의 Tyr로의 치환; Tyr의 Trp로의 치환; 및/또는 Phe의 Val, Ile 또는 Leu로의 치환.
본 발명의 또 다른 측면에서, 하나 이상의 아미노산 잔기의 스트레치 중의 아미노산 치환은 아미노산 서열의 IL-6R에 결합에 대한 친화도를 증가시킬 수 있다. 기법, 예컨대, 무작위 또는 부위 지정 돌연변이유발법 및/또는 예컨대, WO 09/004065, WO 2009/004066, WO 05/003345, WO 06/023144, EP 527809, EP 397S34에 기술되어 있는 것과 같은 자체 공지의 친화도 성숙을 위한 다른 기법에 의해 수행될 수 있다.
제한없이, CDR 중의 아미노산 잔기 치환에 대한 규칙(이러한 치환을 위해 부분적으로 또는 전체적으로 본 규칙에 따라 진행)은 하기와 같을 수 있다(즉, 측쇄의 화학적 성질이 유사한 아미노산으로의 치환)
- K는 R로 치환,
- R은 K로 치환,
- A는 S 또는 T로 치환,
- S는 A 또는 T로 치환,
- T는 A 또는 S로 치환,
- I는 L 또는 V로 치환,
- L은 I 또는 V로 치환,
- V는 I 또는 L로 치환,
- F는 Y로 치환,
- Y는 F로 치환,
- N는 D로 치환,
- D는 N으로 치환,
- Q는 E로 치환,
- E는 Q로 치환,
- G는 A로 치환,
- M은 L로 치환,
- H, C, W, 및 P는 그대로 유지된다.
추가로, 및 비제한적으로, CDR 중의 아미노산 잔기 치환에 대한 규칙(이러한 치환을 위해 부분적으로 또는 전체적으로 본 규칙에 따라 진행)은 별법으로 (카바트 번호매김 체계를 사용하여) 위치 27 내지 35, 및 위치 50 내지 58에 대해 하기와 같을 수 있다:
위치 27 내지 35에 대한 경우:
- 위치 27(카바트 번호매김 사용)의 원래의 아미노산 잔기는 F; G; R; S로; F; G; R; S 중 2개로; F; G; R; S 중 3개로; 또는 그들 모두로, 바람직하게, 그들 모두로 치환되고;
- 위치 28(카바트 번호매김 사용)의 원래의 아미노산 잔기는 A; I; S; T로; A; I; S; T 중 2개로; A; I; S; T 중 3개로; 또는 그들 모두로, 바람직하게, 그들 모두로 치환되고;
- 위치 29(카바트 번호매김 사용)의 원래의 아미노산 잔기는 F; G; L; S로; F; G; L; S 중 2개로; F; G; L; S 중 3개로; 또는 그들 모두로, 바람직하게, 그들 모두로 치환되고;
- 위치 30(카바트 번호매김 사용)의 원래의 아미노산 잔기는 D; G; S; T로; D; G; S; T 중 2개로; D; G; S; T 중 3개로; 또는 그들 모두로, 바람직하게, 그들 모두로 치환되고;
- 위치 31(카바트 번호매김 사용)의 원래의 아미노산 잔기는 D; I; N; S; T로; D; I; N; S; T 중 2개로; D; I; N; S; T 중 3개로; 또는 그들 모두로, 바람직하게, 그들 모두로 치환되고;
- 위치 32(카바트 번호매김 사용)의 원래의 아미노산 잔기는 D; N; Y로; D; N; Y 중 2개로; 또는 그들 모두로, 바람직하게, 그들 모두로 치환되고;
- 위치 33(카바트 번호매김 사용)의 원래의 아미노산 잔기는 A; G; T; V로; A; G; T; V 중 2개로; A; G; T; V 중 3개로; 또는 그들 모두로, 바람직하게, 그들 모두로 치환되고;
- 위치 34(카바트 번호매김 사용)의 원래의 아미노산 잔기는 I: M으로; 또는 그들 모두로, 바람직하게, 그들 모두로 치환되고;
- 위치 35(카바트 번호매김 사용)의 원래의 아미노산 잔기는 A; G; S로; A; G; S 중 2개로; 또는 그들 모두로, 바람직하게, 그들 모두로 치환되고;
원래의 아미노산 서열이 위치 52a(카바트 번호매김 사용)에 아미노산 서열을 가질 경우, 위치 50 내지 58에 대한 경우:
- 위치 50(카바트 번호매김 사용)의 원래의 아미노산 잔기는 A; C; G; S; T로; A; C; G; S; T 중 2개로; A; C; G; S; T 중 3개로; A; C; G; S; T 중 4개로; 또는 그들 모두로, 바람직하게, 그들 모두로 치환되고;
- 위치 51(카바트 번호매김 사용)의 원래의 아미노산 잔기는 I로 치환되고;
- 위치 52(카바트 번호매김 사용)의 원래의 아미노산 잔기는 N; R; S; T로; N; R; S; T 중 2개로; N; R; S; T 중 3개로; 또는 그들 모두로, 바람직하게, 그들 모두로 치환되고;
- 위치 52a(카바트 번호매김 사용)의 원래의 아미노산 잔기는 R; S; T; W로; R; S; T; W 중 2개로; R; S; T; W 중 3개로; 또는 그들 모두로, 바람직하게, 그들 모두로 치환되고;
- 위치 53(카바트 번호매김 사용)의 원래의 아미노산 잔기는 D; G; N; S; T로; D; G; N; S; T 중 2개로; D; G; N; S; T 중 3개로; D; G; N; S; T 중 4개로; 또는 그들 모두로, 바람직하게, 그들 모두로 치환되고;
- 위치 54(카바트 번호매김 사용)의 원래의 아미노산 잔기는 D; G로; 또는 그들 모두로, 바람직하게, 그들 모두로 치환되고;
- 위치 55(카바트 번호매김 사용)의 원래의 아미노산 잔기는 D; G; S로; D; G; S 중 2개로; 또는 그들 모두로, 바람직하게, 그들 모두로 치환되고;
- 위치 56(카바트 번호매김 사용)의 원래의 아미노산 잔기는 I; N; R; S; T로; I; N; R; S; T 중 2개로; I; N; R; S; T 중 3개로; I; N; R; S; T 중 4개로; 또는 그들 모두로, 바람직하게, 그들 모두로 치환되고;
- 위치 57(카바트 번호매김 사용)의 원래의 아미노산 잔기는 T로 치환되고;
- 위치 58(카바트 번호매김 사용)의 원래의 아미노산 잔기는 D; H; N; S; Y로; D; H; N; S; Y 중 2개로; D; H; N; S; Y 중 3개로; D; H; N; S; Y 중 4개로; 또는 그들 모두로, 바람직하게, 그들 모두로 치환되고;
원래의 아미노산 서열이 위치 52a(카바트 번호매김 사용)에 아미노산 서열을 가지지 않을 경우, 위치 50 내지 58에 대한 경우:
- 위치 50(카바트 번호매김 사용)의 원래의 아미노산 잔기는 A; G; R; S; T로; A; G; R; S; T 중 2개로; A; G; R; S; T 중 3개로; A; G; R; S; T 중 4개로; 또는 그들 모두로, 바람직하게, 그들 모두로 치환되고;
- 위치 51(카바트 번호매김 사용)의 원래의 아미노산 잔기는 I로 치환되고;
- 위치 52(카바트 번호매김 사용)의 원래의 아미노산 잔기는 N; S; T로; N; S; T 중 2개로; 또는 그들 모두로, 바람직하게, 그들 모두로 치환되고;
- 위치 53(카바트 번호매김 사용)의 원래의 아미노산 잔기는 N; R; S; T; Y로; N; R; S; T; Y 중 2개로; N; R; S; T; Y 중 3개로; N; R; S; T; Y 중 4개로; 또는 그들 모두로, 바람직하게, 그들 모두로 치환되고;
- 위치 54(카바트 번호매김 사용)의 원래의 아미노산 잔기는 D; G; R; S로;D; G; R; S 중 2개로; D; G; R; S 중 3개로; 또는 그들 모두로, 바람직하게, 그들 모두로 치환되고;
- 위치 55(카바트 번호매김 사용)의 원래의 아미노산 잔기는 G로 치환되고;
- 위치 56(카바트 번호매김 사용)의 원래의 아미노산 잔기는 G; N; R; S; T로; D; N; R; S; T 중 2개로; D; N; R; S; T 중 3개로; D; N; R; S; T 중 4개로; 또는 그들 모두로, 바람직하게, 그들 모두로 치환되고;
- 위치 57(카바트 번호매김 사용)의 원래의 아미노산 잔기는 T로 치환되고;
- 위치 58(카바트 번호매김 사용)의 원래의 아미노산 잔기는 D; N; T; Y로; D; N; T; Y 중 2개로; D; N; T; Y 중 3개로; 또는 그들 모두로, 바람직하게, 그들 모두로 치환된다.
이후, 상기와 같이 결정된 잠재적으로 유용한 치환 중 하나 이상(또는 그이 조합)이 (자체 공지된 방식으로, 본원에 추가로 기술되어 있는 바와 같이) 상기 CDR 서열 내로 도입될 수 있고, 생성된 아미노산 서열(들)은 IL-6R에 대한 친화성, 및/또는 다른 원하는 특성, 예컨대, IL-6/IL-6R 상호작용을 (부분적으로 또는 바람직하게는 전체적으로) 차단할 수 있고/거나, IL-6, IL-6R 및/또는 IL-6/IL-6R 복합체를 통해 일어나는 신호전달을 억제시킬 수 있는 능력에 대해 테스트할 수 있다. 이러한 방식으로, 제한된 정도의 시행착오법(trial and error)에 의해, CDR 중의 다른 적합한 치환(또는 그의 적합한 조합)은 본원의 개시 내용에 기초하여 숙련가에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열은 아미노산 잔기의 스트레치가 본원에서 정의된 CDR 서열 중 적어도 하나의 서열에 상응하는 아미노산 서열을 가지는 것인 아미노산 잔기의 스트레치를 적어도 하나 포함하는 임의의 아미노산 서열일 수 있다. 그러한 아미노산 서열은 면역글로불린 폴드를 포함하거나, 포함하지 않을 수 있다. 예를 들면, 제한없이, 그러한 아미노산 서열은 적어도 하나의 그러한 CDR 서열을 포함하지만 (완전한) 면역글로불린 폴드를 형성할 만큼 충분히 크지는 않은 면역글로불린 서열의 적합한 단편일 수 있다(예를 들면, 다시 WO 03/050531에 기재된 "Expedite fragments"을 참조). 별법으로, 그러한 아미노산 서열은 본 발명의 아미노산 서열(즉, 그의 항원 결합 부위)에 대해 본원에서 정의되는 바와 같은 CDR 서열에 상응하는 아미노산 잔기의 스트레치를 적어도 하나 포함하는 적합한 "단백질 스캐폴드"일 수 있다. 아미노산 서열을 제시하기에 적합한 스캐폴드는 숙련가에게 명백해질 것이고, 예를 들면, 제한없이, 면역글로불린에 기초하거나 그로부터 유도된 결합 스캐폴드(즉, 본원에 이미 기술된 면역글로불린 서열 이외의 것), 단백질 A 도메인으로부터 유도된 단백질 스캐폴드(예컨대, 아피바디즈(Affibodies)™), 텐다미스테트(tendamistat), 피브로넥틴, 리포칼린, CTLA-4, T 세포 수용체, 고안된 안키린 반복부, 아비머 및 PDZ 도메인(문헌 [Binz et al., 2005, Nat. Biotech., 23: 1257]), 및 DNA 또는 RNA에 기초한 결합 부분, 제한하는 것은 아니지만, DNA 또는 RNA 압타머(문헌 [Ulnch et al., 2006, Comb. Chem. High Throughput Screen 9(8):619-32])를 포함한다.
추가로, 본 발명의 아미노산 서열에 대해 본원에서 정의되는 바와 같은 CDR 서열 중 하나 이상(즉, "본 발명의 CDR")을 포함하는 임의의 본 발명의 아미노산 서열은 바람직하게, IL-6R에 (본원에서 정의되는 바와 같이) 특이적으로 결합할 수 있는 것이 바람직하고, 더욱 특히, 본원에서 정의되는 바와 같은 (적합하게는 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, KD 값(실제값 또는 겉보기 값), KA 값(실제값 또는 겉보기 값), k온 속도 및/또는 k오프 속도, 또는 별법으로 IC50 값으로 측정되고/거나 표현되는) 친화도로 IL-6R 에 결합할 수 있는 것이 바람직하다. 본 발명의 아미노산 서열에 대해 본원에서 정의되는 바와 같은 CDR 서열 중 하나 이상을 포함하는 임의의 본 발명의 아미노산 서열은 본원에서 정의되는 바와 같이 세포 기반 효능 및 혈장 효능을 가지는 것이 바람직하다.
추가로, 본 발명의 아미노산 서열에 대해 본원에서 정의되는 바와 같은 CDR 서열 중 하나 이상(즉, "본 발명의 CDR")을, 인간 스캐폴드 또는 비면역글로불린 스캐폴드를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 "스캐폴드" 상에 "이식"시킬 수 있다는 것 또한 숙련가에게는 명백해질 것이다. 적합한 스캐폴드 및 상기 CDR 이식 기법은 숙련가에게는 명백해질 것이고, 이는 당업계에 주지되어 있다. 예를 들면, US 7,180,370, WO 01/27160, EP 0605522, EP 0460167, US 7,054,297, 문헌 ([Nicaise et al., (2004, Protein Science, 13:1882-1891)], [Ewert et al., (2004, Methods, 34(2):184-199)], [Kettleborough et al., (1991, Protein Eng. 4(7):773-783)], [O'Brien and Jones (2003, Methods Mol. Biol. 207:81-100)], [Skerra (2000, J. Mol. Recognit. 13:167-187)], 및 [Saerens et al.(2005, J. Mol. Biol. 352(3) 597-607)], 및 상기 문헌에서 인용된 추가의 참고 문헌을 참조할 수 있다. 예를 들면, 마우스 또는 래트 CDR을 인간 골격 및 스캐폴드 상에 이식시키는 자체 공지의 기법을 유사한 방식으로 사용하여 본 발명의 아미노산 서열에 대해 본원에서 정의되는 바와 같은 CDR 서열 중 하나 이상 및 하나 이상의 인간 골격 부위 또는 서열을 포함하는 키메라 단백질을 제공할 수 있다.
따라서, 구체적인 측면에서, 본 발명은 또한 (본 발명의 아미노산 서열에 대해 본원에서 정의되는 바와 같은) 본 발명의 CDR1 서열, 본 발명의 CDR2 서열, 및 본 발명의 CDR3 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR 서열을 적어도 하나 포함하는 키메라 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게, 그러한 키메라 아미노산 서열은 (본 발명의 아미노산 서열에 대해 본원에서 정의되는 바와 같은) 본 발명의 CDR1 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR 서열을 적어도 하나, 및 또한, (본 발명의 아미노산 서열에 대해 본원에서 정의되는 바와 같은) 본 발명의 CDR2 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR 서열을 적어도 하나, 또는 (본 발명의 아미노산 서열에 대해 본원에서 정의되는 바와 같은) 본 발명의 CDR1 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR 서열을 적어도 하나 및 (본 발명의 아미노산 서열에 대해 본원에서 정의되는 바와 같은) 본 발명의 CDR3 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR 서열을 적어도 하나를 포함하거나; 또는 그러한 키메라 폴리펩티드는 (본 발명의 아미노산 서열에 대해 본원에서 정의되는 바와 같은) 본 발명의 CDR2 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR 서열을 적어도 하나 및 (본 발명의 아미노산 서열에 대해 본원에서 정의되는 바와 같은) 본 발명의 CDR3 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR 서열을 적어도 하나를 포함할 수 있다. 예를 들면, 그러한 키메라 폴리펩티드는 (본 발명의 아미노산 서열에 대해 본원에서 정의되는 바와 같은) 본 발명의 CDR3 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 CDR 서열, (본 발명의 아미노산 서열에 대해 본원에서 정의되는 바와 같은) 본 발명의 CDR1 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 CDR 서열 및 (본 발명의 아미노산 서열에 대해 본원에서 정의되는 바와 같은) 본 발명의 CDR2 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 CDR 서열을 포함할 수 있다. 본원에서 본 발명의 아미노산 서열로 바람직한 것으로서 언급된 CDR의 조합(표 A-1 참조) 또한 일반적으로는 이러한 키메라 폴리펩티드에 바람직할 것이다.
상기 키메라 폴리펩티드에서, CDR은 추가 아미노산 서열에 연결될 수 있고/거나, 아미노산 서열을 통해 서로에 연결될 수 있으며(여기서, 상기 아미노산 서열은 바람직하게, 골격 서열이거나, 또는 골격 서열로서 작용하는 아미노산 서열이다), 이를 통해서 그들은 함께 CDR을 제시하는 스캐폴드를 형성할 수 있다.
한 비제한적인 실시양태에 따라, 키메라 아미노산 서열은 CDR1 또는 CDR2 서열인 다른 CDR 서열과 함께, 적어도 하나의 골격 서열을 통해 연결된 (본 발명의 아미노산 서열에 대해 본원에서 정의되는 바와 같은) 적어도 2개의 CDR 서열을 포함하며, 여기서, 상기 2개의 CDR 서열 중 적어도 하나는 CDR3 서열인 것이 바람직하다. 바람직하지만, 비제한적인 실시양태에 따라, 키메라 아미노산 서열은 CDR1 또는 CDR2 서열인 다른 2개의 CDR 서열, 및 바람직하게는 하나는 CDR1 서열이고, 또 다른 하나는 CDR2 서열인 다른 2개의 CDR 서열과 함께, 적어도 2개 골격 서열에 연결된 (본 발명의 아미노산 서열에 대해 본원에서 정의되는 바와 같은) 본 발명의 CDR 서열을 적어도 3개 포함하며, 여기서, 3개의 CDR 서열 중 적어도 하나는 CDR3 서열인 것이 바람직하다. 한 구체적을 바람직하지만, 비제한적인 실시양태에 따라, 키메라 아미노산 서열은 구조식 FR1' - CDR1 - FR2' - CDR2 - FR3' - CDR3 - FR4'를 가지며, 여기서, CDR1, CDR2, 및 CDR3은 본 발명의 아미노산 서열에 대해 본원에서 정의되는 바와 같고, FR1,' FR2,' FR3,' 및 FR4'는 골격 서열이다. 특히, FR1.' FR2.' FR3' 및 FR4'는 각각 인간 항체(예컨대, VH3 서열)의 골격 1, 골격 2, 골격 3 및 골격 4, 및/또는 상기 골격 서열의 부분 또는 단편 서열일 수 있다. 구조식 FR1' - CDR1 - FR2' - CDR2 - FR3' - CDR3 - FR4'를 가진 키메라 폴리펩티드의 부분 또는 단편을 사용할 수도 있다. 상기와 같은 부분 또는 단편은 본 발명의 아미노산 서열에 대해 기술된 기준을 충족시켜 주는 것이 바람직하다.
상기와 같은 본 발명의 아미노산 서열에서, 골격 서열은 임의의 적합한 골격 서열일 수 있고, 적합한 골격 서열의 예는 표준 편람 및 추가의 개시 내용 및 본원에서 언급된 선행 기술에 기초하여 숙련가에게 명백해질 것이다.
골격 서열은 바람직하게는 면역글로불린 골격 서열, 또는 (예를 들어, 서열 최적화, 예컨대, 인간화 또는 카멜화에 의해) 면역글로불린 골격 서열로부터 유래된 골격 서열(의 적합한 조합물)이다. 예를 들면, 골격 서열은 경쇄 가변 도메인(예컨대, VL 서열) 및/또는 중쇄 가변 도메인(예컨대, VH 서열)으로부터 유래된 골격 서열일 수 있다. 하나의 특히 바람직한 측면에서, 골격 서열은 VHH 서열로부터 유래된 것인 골격 서열(여기서, 상기 골격 서열은 임의로는 부분적으로 또는 전체적으로 인간화된 것일 수 있다)이거나, 또는 (본원에서 정의되는 바와 같이) 카멜화된 종래의 VH 서열인 골격 서열이다.
골격 서열은, 본 발명의 아미노산 서열이 도메인 항체(또는 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열), 단일 도메인 항체(또는 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열), "dAb"(또는 dAb로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열), 또는 나노바디(본원에서 정의되는 바와 같으며, 이는 VHH 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)인 것이 바람직할 수 있다. 추가로, 적합한 골격 서열은 표준 편람 및 추가의 개시 내용 및 본원에서 언급된 선행 기술에 기초하여 숙련가에게 명백해질 것이다.
특히, 본 발명의 아미노산 서열에 존재하는 골격 서열은 (WO 08/020079(표 A-3 내지 A-8)에 정의되어 있는 바와 같은) 홀마크 잔기 중 하나 이상을 포함하며, 이로써 본 발명의 아미노산 서열은 나노바디이다. 상기 골격 서열(의 적합한 조합)에 대한 일부 바람직하지만, 비제한적인 예는 본원에 개시된 추가의 개시 내용(표 A-1 참조)으로부터 명백해질 것이다. 일반적으로, 나노바디(특히, VHH 서열 및 (부분적으로) 인간화된 VHH 서열)는 특히 (예컨대, 추가로 WO 08/020079 61페이지 24번째줄부터 98페이지 3번째줄까지에 기술되어 있는 것과 같이) 골격 서열 중 하나 이상에 하나 이상의 "홀마크 잔기"가 존재하는 것을 특징으로 할 수 있다.
바람직한 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열은 면역글로불린 폴드를 포함하거나, 적합한 조건하에서 면역글로불린 폴드를 형성할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 아미노산 서열은 면역글로불린 서열이고, 더욱더 바람직하게, 본 발명의 아미노산 서열은 하기 구조식:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 가진다.
따라서, 본 발명은 또한 본질적으로 4개의 골격 부위(각각 FR1 내지 FR4)와 3개의 상보성 결정 부위(각각 CDR1 내지 CDR3)로 구성되며,
여기서:
- CDR1이
a) 서열번호 80-82; 또는
b) 서열번호 80-82 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로 구성된 군으로부터 선택되고/거나,
- CDR2가
c) 서열번호 84-91; 또는
d) 서열번호 84-91 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로 구성된 군으로부터 선택되고/거나,
- CDR3이
e) 서열번호 93-95; 또는
f) 서열번호 93-95 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 아미노산 서열에 관한 것이다.
이러한 실시양태에서, 아미노산 서열은 (본 발명의 아미노산 서열에 대해 본원에서 정의되는 바와 같은) 본 발명의 CDR1 서열, 본 발명의 CDR2 서열, 또는 본 발명의 CDR3 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR 서열을 적어도 하나 포함한다. 바람직하게, 아미노산 서열은 (본 발명의 아미노산 서열에 대해 본원에서 정의되는 바와 같은) 본 발명의 CDR1 서열, 본 발명의 CDR2 서열, 또는 본 발명의 CDR3 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR 서열을 적어도 2개 포함하고, 예컨대, (본 발명의 아미노산 서열에 대해 본원에서 정의되는 바와 같은) 본 발명의 CDR1 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR 서열을 적어도 하나 및 (본 발명의 아미노산 서열에 대해 본원에서 정의되는 바와 같은) 본 발명의 CDR2 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR 서열을 적어도 하나, 또는 (본 발명의 아미노산 서열에 대해 본원에서 정의되는 바와 같은) 본 발명의 CDR1 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR 서열을 적어도 하나 및 (본 발명의 아미노산 서열에 대해 본원에서 정의되는 바와 같은) 본 발명의 CDR3 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR 서열을 적어도 하나, 또는 (본 발명의 아미노산 서열에 대해 본원에서 정의되는 바와 같은) 본 발명의 CDR2 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR 서열을 적어도 하나 및 (본 발명의 아미노산 서열에 대해 본원에서 정의되는 바와 같은) 본 발명의 CDR3 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR 서열을 적어도 하나를 포함하거나; 또는 그러한 아미노산 서열은 (본 발명의 아미노산 서열에 대해 본원에서 정의되는 바와 같은) 본 발명의 CDR1 서열, 본 발명의 CDR2 서열, 또는 본 발명의 CDR3 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 CDR 서열을 3개 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본질적으로 4개의 골격 부위(각각 FR1 내지 FR4)와 3개의 상보성 결정 부위(각각 CDR1 내지 CDR3)로 구성되며,
여기서:
- CDR1이
a) 서열번호 80-82; 또는
b) 서열번호 80-82 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로 구성된 군으로부터 선택되고/거나,
- CDR2가
c) 서열번호 84-91; 또는
d) 서열번호 84-91 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로 구성된 군으로부터 선택되고/거나,
- CDR3이
e) 서열번호 93-95; 또는
f) 서열번호 93-95 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 아미노산 서열에 관한 것이다.
본 발명의 아미노산 서열에 대한 CDR 서열의 바람직한 조합은 표 A-1에 제시되어 있다.
본 발명의 아미노산 서열은 본질적으로 종래의 4쇄 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인 서열로 구성될 수 있거나, 또는 본질적으로 중쇄 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인 서열로 구성될 수 있다. 본 발명의 아미노산 서열은 본질적으로 도메인 항체(또는 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열), 단일 도메인 항체(또는 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열), "dAb"(또는 dAb로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열), 또는 나노바디로 구성될 수 있다.
(단일) 도메인 항체에 대한 일반적인 설명을 위해서는 상기 인용된 선행 기술 뿐만 아니라, EP 0368684를 참조한다. 용어 "dAb"에 대해서는 예를 들면, 문헌 ([Ward et al., (1989, Nature 341:544-6)], [Holt et al., (2003, Trends Biotechnol. 21:484-490)]) 뿐만 아니라, 예를 들면, WO 06/030220 WO 06/003388 및 (Domantis Ltd.)의 다른 공개된 특허 출원을 참조한다. 또한, 본 발명과 관련하여 포유동물 기원이 아니기 때문에 덜 바람직할지라도, 단일 도메인 항체 또는 단일 가변 도메인은 특정 종의 상어로부터 유도될 수 있음에 또한 주목하여야 한다.(예를 들면, 소위 "IgNAR 도메인," 예를 들면, WO 05/18629 참조).
특히, 본 발명의 아미노산 서열은 본질적으로 (본원에 정의된 바와 같은) 나노바디® 또는 그의 적합한 단편으로 구성되거나, 또는 (본원에 정의된 바와 같은) 나노바디® 또는 그의 적합한 단편일 수 있다[주의: 나노바디 ( Nanobody )®, 나노바 디즈( Nanobodies )® 및 나노클론( Nanoclone )®은 아블린쓰 엔.브이.(Ablynx N. V.)의 등록 상표이다]. 상기와 같은 IL-6R에 대한 나노바디는 또한 본원에서 "본 발명의 나노바디"로서 지칭될 것이다.
나노바디에 대한 일반적인 설명을 위해, 하기의 추가의 개시 내용, 뿐만 아니라 본원에 인용된 선행 기술, 예를 들어, WO 08/020079(16 페이지)를 참조한다.
구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 서열번호 80; 또는 서열번호 80과 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합한다.
또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 서열번호 84, 89 또는 91로부터 선택되는 아미노산 잔기의 스트레치; 또는 서열번호 84, 89 또는 91 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합한다.
추가의 또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 서열번호 84; 또는 서열번호 84와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합한다.
추가의 또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 서열번호 93-94로부터 선택되는 아미노산 잔기의 스트레치; 또는 서열번호 93-94 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합한다.
추가의 또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 서열번호 93; 또는 서열번호 93과 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합한다.
추가의 또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 서열번호 80; 또는 서열번호 80과 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치; 및 적어도 서열번호 84, 89 또는 91로부터 선택되는 아미노산 잔기의 스트레치; 또는 서열번호 84, 89 또는 91 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합한다.
추가의 또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 서열번호 80; 또는 서열번호 80과 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치; 및 적어도 서열번호 84; 또는 서열번호 84와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합한다.
추가의 또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 서열번호 80; 또는 서열번호 80과 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치; 및 적어도 서열번호 93-94로부터 선택되는 아미노산 잔기의 스트레치; 또는 서열번호 93-94 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합한다.
추가의 또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 서열번호 80; 또는 서열번호 80과 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치; 및 적어도 서열번호 93; 또는 서열번호 93과 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합한다.
추가의 또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 서열번호 84, 89 또는 91로부터 선택되는 아미노산 잔기의 스트레치; 또는 서열번호 84, 89 또는 91 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치; 및 적어도 서열번호 93-94로부터 선택되는 아미노산 잔기의 스트레치; 또는 서열번호 93-94 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합한다.
본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 서열번호 84, 89 또는 91로부터 선택되는 아미노산 잔기의 스트레치; 또는 서열번호 84, 89 또는 91 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치; 및 적어도 서열번호 93; 또는 서열번호 93과 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합한다.
추가의 또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 서열번호 84; 또는 서열번호 84와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치; 및 적어도 서열번호 93-94로부터 선택되는 아미노산 잔기의 스트레치; 또는 서열번호 93-94 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합한다.
추가의 또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 서열번호 84; 또는 서열번호 84와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치; 및 적어도 서열번호 93; 또는 서열번호 93과 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합한다.
추가의 또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 서열번호 80 및 서열번호 84를 포함한다.
추가의 또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 서열번호 80 및 서열번호 93을 포함한다.
추가의 또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 서열번호 84 및 서열번호 93을 포함한다.
추가의 또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 서열번호 80; 또는 서열번호 80과 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치; 및 적어도 서열번호 84, 89 또는 91로부터 선택되는 아미노산 잔기의 스트레치; 또는 서열번호 84, 89 또는 91 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치; 및 적어도 서열번호 93-94로부터 선택되는 아미노산 잔기의 스트레치; 또는 서열번호 93-94 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합한다.
추가의 또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 서열번호 80; 또는 서열번호 80과 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치; 및 적어도 서열번호 84, 89 또는 91로부터 선택되는 아미노산 잔기의 스트레치; 또는 서열번호 84, 89 또는 91 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치; 및 적어도 서열번호 93; 또는 서열번호 93과 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합한다.
추가의 또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 서열번호 80; 또는 서열번호 80과 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치; 및 적어도 서열번호 84; 또는 서열번호 84와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치; 및 적어도 서열번호 93-94로부터 선택되는 아미노산 잔기의 스트레치; 또는 서열번호 93-94 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합한다.
추가의 또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 서열번호 80; 또는 서열번호 80과 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치; 및 적어도 서열번호 84; 또는 서열번호 84와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치; 및 적어도 서열번호 93; 또는 서열번호 93과 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합한다.
또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 서열번호 80, 서열번호 84 및 서열번호 93을 포함한다.
본 발명의 아미노산 서열에 대한, 본원에서 정의된 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열로 이루어진 바람직한 조합 또한 표 A-1에 제시되어 있다.
바람직한 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열은
a) 서열번호 60-69;
b) 서열번호 60-69 중 하나와 그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가지는 서열이며, 단, 그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 서열번호 60-69 중 하나에 의해 이루어지는 결합과 비교하여 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 서열;
c) 서열번호 60-69 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가지는 서열이며, 단, 서열번호 60-69 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 서열번호 60-69 중 하나에 의해 이루어지는 결합과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 서열로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열은
a) 서열번호 65-69;
b) 서열번호 65-69 중 하나와 그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가지는 서열이며, 단, 그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 서열번호 65-69 중 하나에 의해 이루어지는 결합과 비교하여 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 서열;
c) 서열번호 65-69 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가지는 서열이며, 단, 서열번호 60-69 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 서열번호 65-69 중 하나에 의해 이루어지는 결합과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 서열로 구성된 군으로부터 선택된다.
추가의 또 다른 바람직한 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열은
a) 서열번호 66,
b) 서열번호 66과 그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가지며, 단, 그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 서열번호 66에 의해 이루어지는 결합과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 서열; 및
c) 서열번호 66과 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가지며, 단, 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 서열번호 65-69 중 하나에 의해 이루어지는 결합과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 서열로 구성된 군으로부터 선택된다.
2개의 아미노산 잔기의 스트레치(또는 2개의 CDR 서열)를 비교하였을 때, "그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서의 아미노산 차이"라는 용어는 a)에서 명시된 본 발명의 아미노산 서열에 포함되어 있는 아미노산 잔기의 스트레치(또는 CDR 서열)와 비교하여, b)에서 명시된 본 발명의 아미노산 서열에 포함되어 있는 아미노산 잔기의 스트레치(또는 CDR 서열) 위치 상에 단일 아미노산 잔기의 삽입, 결실, 또는 치환을 의미하며; 이는 2개의 아미노산 잔기의 스트레치(또는 CDR 서열)가 하나 또는 최대 2개의 상기와 같은 아미노산 차이를 포함할 수 있다는 것으로 이해된다.
"그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서의 아미노산 차이"는, 본 발명의 아미노산 서열이 a)의 아미노산 서열 중 하나(즉, 서열번호 60-69 중 하나) 중의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3과 비교하여 그의 CDR1에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이, 그의 CDR2에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이, 및/또는 그의 CDR3에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이; 예컨대, a)의 아미노산 서열 중 하나(즉, 서열번호 60-69 중 하나) 중의 CDR1과 비교하여 그의 CDR1에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이; 또는 a)의 아미노산 서열 중 하나(즉, 서열번호 60-69 중 하나) 중의 CDR2와 비교하여 그의 CDR2에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이; 또는 a)의 아미노산 서열 중 하나(즉, 서열번호 60-69 중 하나) 중의 CDR과 비교하여 그의 CDR3에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이; 또는 a)의 아미노산 서열 중 하나(즉, 서열번호 60-69 중 하나) 중의 CDR1과 비교하여 그의 CDR1에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이 및 a)의 아미노산 서열 중 하나(즉, 서열번호 60-69 중 하나) 중의 CDR2와 비교하여 그의 CDR2에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이; 또는 a)의 아미노산 서열 중 하나(즉, 서열번호 60-69 중 하나) 중의 CDR1과 비교하여 그의 CDR1에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이 및 a)의 아미노산 서열 중 하나(즉, 서열번호 60-69 중 하나) 중의 CDR3과 비교하여 그의 CDR3에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이; 또는 a)의 아미노산 서열 중 하나(즉, 서열번호 60-69 중 하나) 중의 CDR2와 비교하여 그의 CDR2에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이 및 a)의 아미노산 서열 중 하나(즉, 서열번호 60-69 중 하나) 중의 CDR3과 비교하여 그의 CDR3에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이; a)의 아미노산 서열 중 하나(즉, 서열번호 60-69 중 하나) 중의 CDR1과 비교하여 그의 CDR1에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이, a)의 아미노산 서열 중 하나(즉, 서열번호 60-69 중 하나) 중의 CDR2와 비교하여 그의 CDR2에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이 및 a)의 아미노산 서열 중 하나(즉, 서열번호 60-69 중 하나) 중의 CDR3과 비교하여 그의 CDR3에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가질 수 있다는 것을 의미한다.
"그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서의 아미노산 차이"는, 본 발명의 아미노산 서열의 특성을 개선시키거나, 또는 본 발명의 아미노산 서열의 원하는 특성을, 또는 균형을, 또는 원하는 특성의 조합을 적어도 크게 감소시키지는 않는, CDR 중 하나 이상, 또는 그의 임의 조합에서의 임의의 하나, 또는 최대 2개의 치환, 결실, 또는 삽입일 수 있다. 이와 관련하여 생성된 본 발명의 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 하나 또는 최대 2개의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하지 않는 하나 이상의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하여야 한다. 생성된 아미노산 서열은 바람직하게, 본원에서 정의되는 바와 같은 (적합하게는 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, KD 값(실제값 또는 겉보기 값), KA 값(실제값 또는 겉보기 값), k온 속도 및/또는 k오프 속도, 또는 별법으로 IC50 값으로 측정되고/거나 표현되는) 친화도로 IL-6 수용체 상의 특이적인 에피토프에 결합할 수 있도록 한 것이다. 생성된 아미노산 서열은 또한 바람직하게 본원에서 정의되는 바와 같은 세포 기반 효능 및 혈장 효능을 가진다.
본 발명의 한 측면에서, "그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서의 아미노산 차이"는 아미노산 치환이다. 아미노산 치환은 본 발명의 아미노산 서열의 특성을 개선시키거나, 또는 본 발명의 아미노산 서열의 원하는 특성을, 또는 균형을, 또는 원하는 특성의 조합을 적어도 크게 감소시키지는 않는, CDR 중 하나 이상에서의 임의의 하나, 또는 최대 2개의 치환일 수 있다. 이와 관련하여, 생성된 본 발명의 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 하나 또는 최대 2개의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하지 않는 하나 이상의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하여야 한다. 생성된 아미노산 서열은 바람직하게, 본원에서 정의되는 바와 같은 (적합하게는 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, KD 값(실제값 또는 겉보기 값), KA 값(실제값 또는 겉보기 값), k온 속도 및/또는 k오프 속도, 또는 별법으로 IC50 값으로 측정되고/거나 표현되는) 친화도로 IL-6 수용체 상의 특이적인 에피토프에 결합할 수 있도록 한 것이다. 생성된 아미노산 서열은 또한 바람직하게 본원에서 정의되는 바와 같은 세포 기반 효능 및 혈장 효능을 가진다.
상기에서 논의된 바와 같이, CDR 중의 아미노산 치환은 임의의 가능한 치환, 예컨대, (본원에서 정의되는 바와 같은) "보존적 치환"일 수 있고, 이는 (본원에서 정의되는 바와 같은) 특정 규칙을 통해 유도될 수 있고/거나, 이는 (본원에서 추가로 정의되는 바와 같이) 생성된 아미노산 서열에 개선된 특성을 유도할 수 있다.
본 발명은 또한 (전장의) 서열번호 60-69 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 서열에 관한 것이다.
2개의 아미노산 서열을 비교하였을 때, "아미노산 차이"라는 용어는 제2의 아미노산 서열과 비교하였을 때, 제1의 아미노산 서열의 위치 상의 단일 아미노산 잔기의 삽입, 결실, 또는 치환을 의미하며; 이는 2개의 아미노산 서열이 하나 또는 최대 2개의 상기와 같은 아미노산 차이를 포함할 수 있다는 것으로 이해된다.
"아미노산 차이"는 본 발명의 아미노산 서열의 특성을 개선시키거나, 또는 본 발명의 아미노산 서열의 원하는 특성을, 또는 균형을, 또는 원하는 특성의 조합을 적어도 크게 감소시키지는 않는, 골격 부위 중 하나 이상, 또는 CDR 중 하나 이상에서의 임의의 하나 또는 최대 2개의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 이와 관련하여, 생성된 본 발명의 아미노산 서열은 적어도, 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 하나 또는 최대 2개의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하지 않는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하여야 한다. 생성된 아미노산 서열은 바람직하게, 본원에서 정의되는 바와 같은 (적합하게는 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, KD 값(실제값 또는 겉보기 값), KA 값(실제값 또는 겉보기 값), k온 속도 및/또는 k오프 속도, 또는 별법으로 IC50 값으로 측정되고/거나 표현되는) 친화도로 IL-6 수용체 상의 특이적인 에피토프에 결합할 수 있도록 한 것이다. 생성된 아미노산 서열은 또한 바람직하게 본원에서 정의되는 바와 같은 세포 기반 효능 및 혈장 효능을 가진다. 숙련가는 일반적으로는 적합한 치환, 결실 또는 삽입, 또는 적합한 그의 조합을 결정하고 선택할 수 있으며, 그러한 치환, 결실 또는 삽입, 또는 그의 조합이 수득된 아미노산 서열의 특성에 미치는 영향을 측정할 수 있을 것이다.
본 발명의 한 측면에서, "아미노산 차이"는 아미노산 치환이다. 아미노산 치환은 본 발명의 아미노산 서열의 특성을 개선시키거나, 또는 본 발명의 아미노산 서열의 원하는 특성을, 또는 균형을, 또는 원하는 특성의 조합을 적어도 크게 감소시키지는 않는, 골격 부위 중 하나 이상, 또는 CDR 중 하나 이상에서의 임의의 하나 또는 최대 2개의 치환일 수 있다. 이와 관련하여, 생성된 본 발명의 아미노산 서열은 적어도, 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 하나 또는 최대 2개의 치환을 포함하지 않는 아미노산 서열과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하여야 한다. 생성된 아미노산 서열은 바람직하게, 본원에서 정의되는 바와 같은 (적합하게는 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, KD 값(실제값 또는 겉보기 값), KA 값(실제값 또는 겉보기 값), k온 속도 및/또는 k오프 속도, 또는 별법으로 IC50 값으로 측정되고/거나 표현되는) 친화도로 IL-6 수용체 상의 특이적인 에피토프에 결합할 수 있도록 한 것이다. 생성된 아미노산 서열은 또한 바람직하게 본원에서 정의되는 바와 같은 세포 기반 효능 및 혈장 효능을 가진다. 숙련가는 일반적으로는 적합한 치환을 결정하고 선택할 수 있으며, 그러한 치환이 수득된 아미노산 서열의 특성에 미치는 영향을 측정할 수 있을 것이다.
상기에서 언급한 바와 같이, 치환, 삽입 또는 결실은 골격 부위 중 하나 이상, 및/또는 CDR 중 하나 이상 중에 존재할 수 있다. 상기에서 논의된 바와 같이, CDR 중 하나 이상 중에서의 아미노산 치환은 임의의 치환, 예를 들어, (본원에서 정의되는 바와 같은) "보존적 치환"일 수 있고, 이는 (본원에서 정의되는 바와 같은) 특정 규칙을 통해 유도될 수 있고/거나, 이는 (본원에서 추가로 정의되는 바와 같이) 생성된 아미노산 서열에 개선된 특성을 유도할 수 있다.
상기와 같은 치환, 삽입 또는 결실이 골격 부위 중 하나 이상에서 이루어지는 경우, (본원에 기술되어 있는 바와 같은 적합한 인간화 치환이 아니라면) 홀마크 잔기에서의 치환, 삽입, 또는 결실이 일반적으로는 덜 바람직하지만, 상기와 같은 임의의 가능한 치환, 삽입 또는 결실은 홀마크 잔기 중 하나 이상(예를 들어, WO 08/020079(표 A-3 내지 A-8)에 정의되어 있는 바와 같은 것)에서, 및/또는 골격 잔기 중 다른 위치 중 하나 이상에서 이루어질 수 있다. 비제한적일 일례로, 비록 본 발명이 일반적으로 하기와 같은 치환으로 제한되는 것은 아니지만, 치환은 예를 들면, (본원에 기술되어 있는 바와 같은) 보존적 치환일 수 있고/거나, 아미노산 잔기는 또 다른 VHH 도메인 중 동일 위치에서 천연적으로 발생된 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있다(WO 08/020079(표 A-5 내지 A-8) 참조).
(바람직하게) 골격 부위 중 하나 이상에서 이루어진 치환, 삽입 또는 결실은 골격 부위의 서열 최적화를 위한 치환, 예컨대, 인간화 치환일 수 있다. 일부 바람직하지만, 비제한적인 인간화 치환(및 그의 적합한 조합)은 본원 개시 내용을 기초로 하여 숙련가에게 명백할 것이다. a)에서 정의된 본 발명의 아미노산 서열 중 하나의 골격 부위의 서열을 하나 이상의 밀접한 관계에 있는 인간 VH 서열의 상응하는 골격 서열과 비교하여 잠재적으로 유용한 인간화 치환을 확인한 후, 그렇게 결정된 잠재적으로 유용한 인간화 치환 중 하나 이상(또는 그의 조합)을 (본원에 추가로 기술된 자체 공지의 임의 방식으로) a)에서 정의된 본 발명의 상기 아미노산 서열 내로 도입하고, 생성된 인간화된 아미노산 서열을 IL-6R에 대한 친화도, 안정성, 발현의 용이성 및 수준, 및 본원에 정의되어 있는 다른 바람직한 특성에 대하여 테스트할 수 있다. 이러한 방식으로, 제한된 정도의 시행착오법에 의해, 다른 적합한 인간화된 치환(또는 그의 적합한 조합)은 본원의 개시 내용에 기초하여 숙련가에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드를 발현시키는 데 사용되는 숙주 유기체에 따라, 결실 및/또는 치환은 또한, 당업계의 숙련가의 능력 범위내에서 번역 후 변형에 대한 하나 이상의 부위(예컨대, 하나 이상의 글리코실화 부위)가 제거되는 방식으로 디자인될 수 있다. 별법으로, 치환 또는 삽입은 (본원에 기술된 바와 같은) 작용기의 부착을 위한 하나 이상의 부위를 도입할 수 있도록, 예를 들면, (또한 본원에 기술된 바와 같은) 부위 특이적인 페길화를 허용할 수 있도록 디자인될 수 있다.
WO 08/020079의 표 A-5 내지 A-8에 제시된 VHH 엔트로피 및 VHH 변이성에 대한 데이터로부터 알 수 있듯이, 골격 부위 중의 일부 아미노산 잔기는 다른 잔기에 비하여 보다 더 보존적이다. 일반적으로, 본 발명은 그의 가장 광범위한 의미에서 이에 제한되지 않지만, 임의의 치환, 결실 또는 삽입은 바람직하게는 덜 보존적인 위치에서 이루어질 수 있다. 또한, 일반적으로, 아미노산 치환은 아미노산 결실 또는 삽입보다 바람직하다.
생성된 본 발명의 아미노산 서열 또는 본 발명의 나노바디는 바람직하게
- 1 nM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 바람직하게, 500 pM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 더욱 바람직하게, 100 pM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 또는 더욱더 바람직하게, 약 50 pM 내지 1 pM 또는 그 이하의 해리 상수(KD)로 hIL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 1 nM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 바람직하게, 500 pM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 더욱 바람직하게, 100 pM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 또는 더욱더 바람직하게, 약 50 pM 내지 1 pM 또는 그 이하의 해리 상수(KD)로 시아노 IL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 104 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 바람직하게, 105 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 더욱 바람직하게, 약 106 M-1s-1 또는 그 이상인 k온 속도로 hIL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 104 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 바람직하게, 105 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 더욱 바람직하게, 약 106 M-1s-1 또는 그 이상인 k온 속도로 시아노 IL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 10-3 s-1 (t½=0.69 s) 내지 10-6 s-1(이는 t½이 여러 일인 거의 비가역적인 복합체 제공), 바람직하게, 10-4 s-1 내지 10-6 s-1, 더욱 바람직하게, 10-5 s-1 내지 10-6 s-1, 예컨대, 약 10-5 s-1 또는 그 이하인 k오프 속도로 hIL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 10-3 s-1 (t½=0.69 s) 내지 10-6 s-1(이는 t½이 여러 일인 거의 비가역적인 복합체 제공), 바람직하게, 10-4 s-1 내지 10-6 s-1, 더욱 바람직하게, 10-5 s-1 내지 10-6 s-1, 예컨대, 약 10-5 s-1 또는 그 이하인 k오프 속도로 시아노 IL-6R에 결합할 수 있도록 하는 (적합하게는 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, KD 값(실제값 또는 겉보기 값), KA 값(실제값 또는 겉보기 값), k온 속도 및/또는 k오프 속도, 또는 별법으로 IC50 값으로 측정되고/거나 표현되는) 친화도로 IL-6에 결합하여야 한다.
본 발명의 아미노산 서열의 IL-6R의 결합에 대한 일부 바람직한 IC50 값은 본원의 추가 설명 및 실시예로부터 명백해질 것이다.
본 발명의 아미노산 서열 및 본 발명의 나노바디, 그를 포함하는 조성물의 효능 및/또는 유효성은 관여하는 특정 질환 또는 질병에 따라, 임의의 적합한 시험관내 분석법, 세포 기반 분석법, 생체내 분석법 및/또는 자체 공지된 동물 모델, 또는 그의 임의의 조합을 사용함으로써 테스트될 수 있다. 적합한 분석법 및 동물 모델은 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들면, 그 예로는 TF1, XG1 및 7TD1, 콜라겐 유도성 관절염 모델, SCID 마우스 중 윤활 조직 이식편 모델, 각종 인간 암(림프종, 골수종, 전립선암 및 신장 세포 암종 포함)의 이종이식편 모델, IBD 모델(TNBS 포함), 영장류 모델(예컨대, 문헌 [Shinkura et al., 1998, Anticancer Research 18:1217-1222]에 기술되어 있는 것), 관절염성 질환을 앓는 인간을 제외한 영장류 모델(예컨대, 문헌 [Vierboom et al., 2008, Drug Discov. Today:Dis Model doi:10.1016/j.ddmod. 2008.06.003)을 비롯한 IL-6 의존성 세포를 사용하는 증식 분석법 뿐만 아니라, 하기 실험부 및 본원에서 인용된 선행 기술(문헌 ([Peake et al., 2006, Rheumatology 45:1485-9], [Wahid et al., 2000, Clin. Exp. Immunol, 122:133-142], [Matsuno et al., 1998, Arthritis and rheumatism 41:2014-2021], WO 08/020079))에서 사용된 분석법 및 동물 모델을 포함한다.
예를 들면, 문헌 [Kitamura et al., (1989, J. Cell Physiol. 140:323)]에 기술되어 있는 것과 같은 TF1 분석법에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 본 발명의 나노바디는 (100 IU/mL IL-6에서) 10 nM 내지 50 pM, 바람직하게, 5 nM 내지 50 pM, 더욱 바람직하게, 1 nM 내지 50 pM 또는 그 이하, 예컨대, 약 750 또는 500 pM 또는 그 이하의 IC50 값을 가질 수 있다. 이러한 TF1 분석법에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 본 발명의 나노바디는 (5,000 IU/mL IL-6에서) 50 nM 내지 1 nM, 바람직하게, 25 nM 내지 1 nM, 더욱 바람직하게, 10 nM 내지 1 nM 또는 그 이하, 예컨대, 약 8 nM 또는 그 이하의 IC50 값을 가질 수 있다. 이러한 TF1 분석법에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 본 발명의 나노바디는 서열번호 1 및 2에 의해 정의되는 바와 같은 참조 IgG 또는 서열번호 3 및 4에 의해 정의되는 바와 같은 참조 Fab에 대하여 관찰된 IC50 값과 비교하여 적어도 동일, 및 바람직하게는 적어도 2배, 바람직하게, 3배, 더욱 바람직하게, 4배, 더욱더 바람직하게, 5배, 7배 또는 7배 초과로 더 우수한 IC50 값을 가질 수 있다(실시예 1 참조). 이러한 TF1 분석법에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 본 발명의 나노바디는 토실리주맙(MRA)에 대하여 관찰된 IC50 값과 비교하여 적어도 동일, 및 바람직하게는 적어도 2배, 바람직하게, 3배, 더욱 바람직하게, 4배, 더욱더 바람직하게, 5배, 7배 또는 7배 초과로 더 우수한 IC50 값을 가질 수 있다.
(예컨대, 실시예 45에 기술되어 있는 바와 같이, 27.29 ng/mL IL-6의 존재하에서) IL-6 EC50 값에서의 혈장 효능 분석법에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 본 발명의 나노바디는 500 pM 내지 50 pM, 바람직하게, 250 pM 내지 50 pM, 더욱 바람직하게, 200 pM 내지 50 pM 또는 그 이하, 예컨대, 150 pM 또는 그 이하의 IC50 값을 가질 수 있다. (예컨대, 실시예 45에 기술되어 있는 바와 같이, 885 ng/mL IL-6의 존재하에서) IL-6 EC95 값에서의 혈장 효능 분석법에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 본 발명의 나노바디는 1,000 pM 내지 100 pM, 바람직하게, 750 pM 내지 100 pM, 더욱 바람직하게, 500 pM 내지 100 pM 또는 그 이하, 예컨대, 400 pM 또는 그 이하의 IC50 값을 가질 수 있다. 이러한 혈장 효능 분석법에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 본 발명의 나노바디는 서열번호 1 및 2에 의해 정의되는 바와 같은 참조 IgG 또는 서열번호 3 및 4에 의해 정의되는 바와 같은 참조 Fab에 대하여 관찰된 IC50 값과 비교하여 적어도 동일, 및 바람직하게는 적어도 2배, 바람직하게, 3배, 더욱 바람직하게, 4배, 더욱더 바람직하게, 5배, 7배 또는 7배 초과로 더 우수한 IC50 값을 가질 수 있다(실시예 1 참조). 이러한 혈장 효능 분석법에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 본 발명의 나노바디는 토실리주맙(MRA)에 대하여 관찰된 IC50 값과 비교하여 적어도 동일, 및 바람직하게는 적어도 2배, 바람직하게, 3배, 더욱 바람직하게, 4배, 더욱더 바람직하게, 5배, 7배 또는 7배 초과로 더 우수한 IC50 값을 가질 수 있다.
CHO 세포 상의 막 IL-6R에의 결합에 대해 정의하는 분석법에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 본 발명의 나노바디는 10 nM 내지 100 pM, 바람직하게, 5 nM 내지 100 pM, 더욱 바람직하게, 2 nM 내지 10 pM 또는 그 이하, 예컨대, 2 nM 또는 그 이하의 IC50 값을 가질 수 있다.
본원의 개시 내용으로부터 명백한 바와 같이, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디의 부분 또는 단편, 또는 2개 이상의 부분 또는 단편의 조합, 및 특히, 서열번호 60-69의 아미노산 서열의 부분 또는 단편을 사용하는 것은 본 발명의 범주내에 속한다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에 따라, "본 발명의 아미노산 서열" 또는 "본 발명의 나노바디"라는 용어는 또한 가장 광범위한 의미에서 그러한 부분 또는 단편을 포함한다.
일반적으로, 상기와 같은, 본 발명의 부분 또는 단편(그의 유사체 포함)은, 상응하는 전장의 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디의 아미노산 서열과 비교하였을 때, N 말단 단부에서의 하나 이상의 아미노산 잔기, C 말단 단부에서의 하나 이상의 아미노산 잔기, 하나 이상의 인접 내부 아미노산 잔기, 또는 그의 임의의 조합이 결실 및/또는 제거된 아미노산 서열을 가진다.
부분 또는 단편은 바람직하게 본원에서 정의되는 바와 같은 (적합하게는 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, KD 값(실제값 또는 겉보기 값), KA 값(실제값 또는 겉보기 값), k온 속도 및/또는 k오프 속도, 또는 별법으로 IC50 값으로 측정되고/거나 표현되는) 친화도로 IL-6R 상의 그의 에피토프에 결합할 수 있도록 한 것이다.
특히, 아미노산 서열, 나노바디 및 부분 또는 단편은 바람직하게
- 1 nM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 바람직하게, 500 pM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 더욱 바람직하게, 100 pM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 또는 더욱더 바람직하게, 약 50 pM 내지 1 pM 또는 그 이하의 해리 상수(KD)로 hIL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 1 nM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 바람직하게, 500 pM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 더욱 바람직하게, 100 pM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 또는 더욱더 바람직하게, 약 50 pM 내지 1 pM 또는 그 이하의 해리 상수(KD)로 시아노 IL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 104 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 바람직하게, 105 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 더욱 바람직하게, 약 106 M-1s-1 또는 그 이상인 k온 속도로 hIL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 104 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 바람직하게, 105 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 더욱 바람직하게, 약 106 M-1s-1 또는 그 이상인 k온 속도로 시아노 IL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 10-3 s-1 (t½=0.69 s) 내지 10-6 s-1(이는 t½이 여러 일인 거의 비가역적인 복합체 제공), 바람직하게, 10-4 s-1 내지 10-6 s-1, 더욱 바람직하게, 10-5 s-1 내지 10-6 s-1, 예컨대, 약 10-5 s-1 또는 그 이하인 k오프 속도로 hIL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 10-3 s-1 (t½=0.69 s) 내지 10-6 s-1(이는 t½이 여러 일인 거의 비가역적인 복합체 제공), 바람직하게, 10-4 s-1 내지 10-6 s-1, 더욱 바람직하게, 10-5 s-1 내지 10-6 s-1, 예컨대, 약 10-5 s-1 또는 그 이하인 k오프 속도로 시아노 IL-6R에 결합할 수 있도록 한 것이 바람직하다.
IL-6 수용체에 대한 부분 또는 단편의 친화도는 예를 들면, 본원에 기술된 분석법을 사용하여 자체 공지된 방식으로 측정될 수 있다.
임의의 부분 또는 단편은, 상응하는 전장의 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디의 서열 중 적어도 10개의 인접한 아미노산 잔기, 바람직하게, 적어도 20개의 인접 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게, 적어도 30개의 인접 아미노산 잔기, 예컨대, 적어도 40개의 인접 아미노산 잔기를 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 임의의 부분 또는 단편은 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 중 적어도 하나 또는 적어도 그의 부분(및 특히, 적어도 CDR3 또는 적어도 그의 부분)을 포함하는 것이 바람직하다. 임의의 부분 또는 단편이 바람직하게 적합한 골격 서열(들) 또는 적어도 그의 부분에 의해 연결된, CDR 중 적어도 하나(및 바람직하게, 적어도 CDR3 또는 그의 부분) 및 적어도 하나의 다른 CDR(즉, CDR1 또는 CDR2) 또는 적어도 그의 부분을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 임의의 부분 또는 단편이 추가로 바람직하게 적합한 골격 서열(들) 또는 적어도 그의 부분에 의해 연결된, CDR 중 적어도 하나(및 바람직하게, 적어도 CDR3 또는 그의 부분) 및 남은 2개의 CDR 중 적어도 일부를 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
특히 바람직하지만, 비제한적인 또 다른 실시양태에 따라, 상기와 같은 부분 또는 단편은 즉, 예를 들면, 국제 출원 WO 03/050531(Lasters et al.)에 기재된 바와 같이, 적어도 상응하는 전장의 본 발명의 나노바디의 CDR3, 예컨대, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다.
이미 상기에 언급된 바와 같이, 2개 이상의 상기와 같은 부분 또는 단편(즉, 동일하거나 상이한 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디로부터의 것)을 조합할 수 있고, 즉, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디의 (본원에 정의된 바와 같은) 추가의 부분 또는 단편을 제공할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디의 하나 이상의 부분 또는 단편을 인간 VH 도메인의 하나 이상의 부분 또는 단편과 조합할 수도 있다.
한 바람직한 실시양태에 따라, 부분 또는 단편은 서열번호 60-69의 아미노산 서열 또는 나노바디 중 하나와 적어도 50%, 바람직하게, 적어도 60%, 더욱 바람직하게, 적어도 70%, 더욱더 바람직하게, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 90%, 95% 또는 99% 또는 그 이상의 서열 동일성의 정도를 가진다.
상기 부분 및 단편, 및 이를 코딩하는 핵산 서열은 자체 공지된 임의의 방식으로 제공되고, 임의로는 조합될 수 있다. 예를 들면, 상기와 같은 부분 또는 단편은 전체 크기의 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디를 코딩하는 핵산에 종결 코돈을 삽입하고, 이어서 이렇게 수득된 핵산을 (예를 들면 본원에 기재된 바와 같은) 자체 공지된 방식으로 발현시킴으로써 수득될 수 있다. 별법으로, 상기와 같은 부분 또는 단편을 코딩하는 핵산은 전체 크기의 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디를 코딩하는 핵산을 적합하게 제한하거나, 또는 이러한 핵산을 자체 공지된 방식으로 합성함으로써 수득될 수 있다. 부분 또는 단편은 또한 자체 공지된 펩티드 합성 기법을 사용하여 제공될 수도 있다.
본 발명은 추가로 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디를 하나 이상 포함하거나, 본질적으로 그로 구성되고, 임의로는, 임의로 하나 이상의 링커를 통해 연결된 하나 이상의 다른 기, 잔기, 부분, 또는 결합 유닛을 추가로 포함하는 화합물 또는 컨스트럭트에 관한 것이다. 바람직한 측면에서, 상기의 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛은 아미노산 서열이다. 또 다른 바람직한 측면에서, 상기의 하나 이상의 링커는 하나 이상의 아미노산 서열이다. 그러한 화합물 또는 컨스트럭트는 또한 "본 발명의 폴리펩티드"로서 지칭된다.
본 발명의 폴리펩티드는 그의 아미노 말단 단부, 그의 카르복시 말단 단부, 또는 그의 아미노 말단 단부 및 그의 카르복시 말단 단부 둘 모두에서 적어도 하나의 추가의 아미노산 서열에 융합되어, 즉, 상기 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디 및 하나 이상의 추가의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 제공하는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디를 포함할 수 있다.
하나 이상의 추가의 아미노산 서열은 임의의 적합한 및/또는 원하는 아미노산 서열일 수 있다. 추가의 아미노산 서열은 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디의 (생물학적) 특성을 변화시키거나, 바꾸거나, 다르게는 영향을 주거나, 또는 그렇지 않을 수 있고, 추가의 관능성을 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드에게 부가하거나 부가하지 않을 수 있다. 추가의 아미노산 서열은 이것이 하나 이상의 원하는 특성 또는 관능성을 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드에게 부여하는 것이 바람직하다.
그러한 아미노산 서열의 예는 숙련가에게 명백할 것이고, 일반적으로 종래의 항체 및 그의 단편(ScFv 및 단일 도메인 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)에 기초한 펩티드 융합에 사용되는 모든 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136 (2005)] 를 참조한다.
예를 들면, 그러한 아미노산 서열은, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디 그 자체와 비교하여, 본 발명의 폴리펩티드의 반감기, 가용성, 또는 흡수성을 증가시키고, 면역원성 또는 독성을 감소시키고, 원치않는 부작용을 제거 또는 약화시키고/거나, 다른 유리한 특성을 부여하고/거나, 원치않는 특성을 감소시키는 아미노산 서열일 수 있다. 상기 아미노산 서열의 일부 비제한적인 예는 혈청 단백질, 예컨대, 인간 혈청 알부민(예를 들면, WO 00/27435 참조) 또는 합텐 분자(예를 들면, 혈중 항체에 의해 인식되는 합텐, 예를 들면, WO 98/22141 참조)일 수 있다.
추가의 아미노산 서열은 또한 임의의 원하는 단백질, 폴리펩티드, 항원, 항원 결정기 또는 에피토프(본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디에 대한 동일의 단백질, 폴리펩티드, 항원, 항원 결정기 또는 에피토프, 또는 상이한 단백질, 폴리펩티드, 항원, 항원 결정기 또는 에피토프를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)에 대해 결합할 수 있는 것인 제2 결합 부위를 제공할 수 있다. 예를 들면, 추가 아미노산 서열은 혈청 중에서 반감기를 증가시킬 수 있도록 혈청 단백질(예컨대, 인간 혈청 알부민 또는 또 다른 혈청 단백질, 예컨대, IgG)에 대한 제2 결합 부위를 제공할 수 있다. 그러한 아미노산 서열은 예를 들면, WO 91/01743 WO 01/45746 및 WO 02/076489에 기술되어 있는 소형 펩티드 및 결합 단백질, 및 WO 03/002609 및 WO 04/003019에 기술되어 있는 dAb 뿐만 아니라, 나노비드를 포함한다. 문헌 [Harmsen et al., (2005, Vaccine, 23(41):4926-42)] 뿐만 아니라, EP 0368684 뿐만 아니라, WO 08/028977, WO 08/043821, WO 08/043822 및 WO 08/068280(Abiynx N. V.)을 참조한다.
본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디의 반감기를 증가시켜 줄 수 있는 바람직한 아미노산 서열은 서열번호 97-99로부터 선택될 수 있다.
그러한 아미노산 서열은 특히 혈청 알부민(더욱 특히, 인간 혈청 알부민) 및/또는 IgG(더욱 특히 인간 IgG)에 대한 것일 수 있다. 예를 들면, 그러한 아미노산 서열은 (인간) 혈청 알부민에 대한 아미노산 서열, 및 혈청 알부민의 FcRn에의 결합에 관여되지 않은 (인간)혈청 알부민 상의 아미노산 잔기에 결합할 수 있는 아미노산 서열(예를 들면, WO 06/0122787 참조); 및/또는 혈청 알부민의 도메인 III의 부분을 형성하지 않는 혈청 알부민 상의 아미노산 잔기에 결합할 수 있는 아미노산 서열(다시 예를 들면, WO 06/0122787 참조); 증가된 반감기를 갖거나 제공할 수 있는 아미노산 서열(예를 들면, WO 08/028977 참조); 적어도 하나의 포유동물 종, 및 특히 적어도 하나의 영장류 종(예컨대, 제한없이, 마카카 속으로부터의 원숭이(예컨대, 특히, 시노몰구스 원숭이(마카카 파스시쿨라리스) 및/또는 레서스 원숭이(마카카 물라타) 및 개코원숭이(파피오 우르시너스)(다시 WO 08/028977 참조)으로부터의 혈청 알부민과 교차 반응성인 인간 혈청 알부민에 대한 아미노산 서열; pH에 독립적인 방식으로 혈청 알부민에 결합할 수 있는 아미노산 서열(예를 들면, WO 08/043821 참조) 및/또는 조건부 결합제인 아미노산 서열(예를 들면, WO 08/043822 참조)일 수 있다.
또 다른 실시양태에 따라, 하나 이상의 추가 아미노산 서열은 종래의 4쇄 항체(특히, 인간 항체) 및/또는 중쇄 항체의 하나 이상의 부분, 단편 또는 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들면, 일반적으로는 덜 바람직하지만, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 다시 임의로는 링커 서열(다른 (단일) 도메인 항체, 예컨대, (Ward et al.,)에 의해 기재된 dAb를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 통해 종래의 (바람직하게는 인간) VH 또는 VL 도메인에, 또는 VH 또는 VL 도메인의 천연 또는 합성 유사체에 연결될 수 있다.
따라서, 본 발명의 화합물 또는 컨스트럭트에서, 상기의 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛은 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, "dAb," dAb로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열 또는 나노바디로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 하나의 구체적인 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디를 적어도 하나 포함하는 본 발명의 컨스트럭트 또는 폴리펩티드는 상응하는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디와 비교하여 증가된 반감기를 가질 수 있다. 그러한 화합물, 컨스트럭트 및 폴리펩티드에 대한 일부 바람직하지만, 비제한적인 일례는 숙련가에게 본원의 추가 개시 내용에 기초하여 명백해질 것이고, 이는 예를 들어, (예를 들어, 페길화에 의해) 그의 반감기 증가를 위해 화학적으로 변형된 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 본 발명의 나노바디의 반감기를 증가시키는 적어도 하나의 부분(및 특히, 1 이상의 아미노산 서열)에 연결된 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디를 적어도 하나 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 화합물, 컨스트럭트 및 폴리펩티드일 수 있다. 상기와 같은 반감기 연장 부분 또는 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 화합물, 컨스트럭트 또는 폴리펩티드의 예는 숙련가에게 본원의 추가 개시 내용에 기초하여 명백해질 것이고, 이는 예를 들어, 제한없이, 하나 이상의 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디가 하나 이상의 혈청 단백질 또는 그의 단편(예컨대, 혈청 알부민 또는 그의 적합한 단편)에, 또는 혈청 단백질에 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 유닛(예컨대, 예를 들면, 혈청 단백질 예컨대, 혈청 알부민, 혈청 면역글로불린, 예컨대, IgG, 또는 트랜스페린에 결합할 수 있는 나노바디 또는 (단일) 도메인 항체)에 적합하게 연결되어 있는 폴리펩티드; 하나 이상의 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디가 혈청 단백질(예컨대, 제한없이, WO 91/01743, WO 01/45746, WO 02/076489에 기술되어 있는 단백질 및 펩티드)에 적합하게 연결되어 있는 것인, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디가 Fc 부분(예컨대, 인간 Fc) 또는 그의 적합한 부분, 또는 단편, 또는 폴리펩티드에 연결되어 있는 폴리펩티드를 포함한다.
1 이상의 아미노산 서열 또는 나노바디는 또한 임의로는 링커 서열을 통해 하나 이상의 (바람직하게, 인간) CH1, CH2 및/또는 CH3 도메인에 연결될 수 있다. 예를 들면, 적합한 CH1 도메인에 연결된 아미노산 서열 또는 나노바디는, 예를 들면-적합한 경쇄와 함께-종래의 Fab 단편 또는 F(ab')2 단편과 유사한 항체 단편/구성체를 생성하기 위해 사용될 수 있지만, 여기서, 종래의 VH 도메인들 중 하나, 또는 ((F(ab')2 단편의 경우) 그 둘 모두는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디에 의해 대체되어 졌다. 또한, 2개의 아미노산 서열 또는 나노바디는 (임의로는 링커를 통해) CH3 도메인에 연결됨으로써 생체내의 반감기가 증가된 컨스트럭트를 제공할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 한 구체적인 측면에 따라, 하나 이상의 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 (임의로는 적합한 링커 또는 힌지 부위를 통해) 하나 이상의 불변 도메인(예를 들면, Fc 부분의 일부로서/이를 형성하기 위해 사용될 수 있는 2 또는 3개의 불변 도메인)에, Fc 부분에, 및/또는 본 발명의 폴리펩티드에 하나 이상의 효과기 기능을 부여하고/거나 하나 이상의 Fc 수용체에 결합할 수 있는 능력을 부여할 수 있는 하나 이상의 항체 부분, 단편 또는 도메인에 연결될 수 있다. 예를 들면, 이 목적을 위해, 이에 한정되는 것은 아니지만, 하나 이상의 추가의 아미노산 서열은 항체, 예컨대 (본원에 기재된 바와 같은) 중쇄 항체, 더욱 바람직하게는 종래의 인간 4쇄 항체로부터의 하나 이상의 CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함할 수 있고/거나; 예를 들면, IgG(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)로부터, IgE로부터 또는 또 다른 인간 Ig, 예컨대 IgA, IgD 또는 IgM으로부터 Fc 부위(의 일부)를 형성할 수 있다. 예를 들면, 낙타과(Camelidae) CH2 및/또는 CH3 도메인이 인간 CH2 및 CH3 도메인으로 대체되어 각각 나노바디 및 인간 CH2 및 CH3 도메인(그러나, CH1 도메인은 아니다)을 포함하는 2개의 중쇄로 구성된 면역글로불린을 제공하고, 이러한 면역글로불린은 CH2 및 CH3 도메인에 의해 제공받은 효과기 기능을 가지고, 이러한 면역글로불린은 임의의 경쇄의 부재하에 작용할 수 있는 것인, 카멜리드 VHH 도메인 또는 그의 인간화된 유도체(즉, 나노바디)를 포함하는 중쇄 항체가 WO 94/04678에 기술되어 있다. 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디에 적합하게 연결되어 효과기 기능을 제공할 수 있는 다른 아미노산 서열은 숙련가에게 명백할 것이고, 원하는 효과기 기능(들)에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들면, WO 04/058820, WO 99/42077, WO 02/056910 및 WO 05/017148 뿐만 아니라, 문헌 [Holhger and Hudson, 상기 문헌 동일], 및 WO 09/068628을 참조한다. 또한, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디를 Fc 부분에 커플링함으로써 상응하는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디와 비교하여 반감기를 증가시킬 수 있다. 일부 적용을 위해, 임의의 생물학적으로 유의적인 효과기 기능 없이 반감기를 증가시키는 Fc 부분 및/또는 불변 도메인(즉, CH2 및/또는 CH3 도메인)을 사용하는 것 또한 적합할 수 있거나, 심지어는 바람직할 수 있다. 생체내 반감기가 증가된, 하나 이상의 아미노산 서열 또는 나노바디 및 하나 이상의 불변 도메인을 포함하는 다른 적합한 컨스트럭트는 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들면, 임의로 링커 서열을 통해 CH3 도메인에 연결된 2개의 아미노산 서열 또는 나노바디를 포함할 수 있다. 일반적으로, 반감기가 증가된 임의의 융합 단백질 또는 유도체는 바람직하게는 신장 흡수에 대한 한계(cut-off) 값인, 50 kD 초과의 분자량을 가질 것이다.
구체적이지만, 비제한적인 또 다른 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드를 형성하기 위해 하나 이상의 본 발명의 아미노산 서열은 (즉, 종래의 4쇄 항체에서 천연적으로 발생된 불변 도메인과 비교하여) 이량체로 자가 회합되는 경향이 감소된 (또는 본질적으로 없는) 천연적으로 발생된, 합성 또는 반합성 불변 도메인(또는 그의 유사체, 변이체, 돌연변이체, 부분 또는 단편)에 (임의로는 적합한 링커 또는 힌지 부위를 통해) 연결될 수 있다. 이러한 단량체성(즉, 자가 회합되지 않는) Fc 쇄 변이체, 또는 그의 단편은 숙련가에게 명백할 것이다. 예를 들면, 문헌 [Helm et al., (1996, J. Biol. Chem. 271:7494]에는 본 발명의 폴리펩티드 쇄에 사용될 수 있는 단량체성 Fc 쇄 변이체가 기재되어 있다.
또한, 이러한 단량체성 Fc 쇄 변이체는 (이들이 유도되는 Fc 부분에 따라) 이들이 보충 또는 관련 Fc 수용체(들)에 여전히 결합할 수 있고/거나, 이들이 유도되는 Fc 부분의 효과기 기능의 일부 또는 그 모두를 (또는 의도된 용도에 여전히 적합한 감소된 정도로) 가지는 것이 바람직하다. 별법으로, 상기의 본 발명의 폴리펩티드 쇄에서, 단량체성 Fc 쇄는 폴리펩티드 쇄에 반감기를 증가시키는 데 사용될 수 있고, 이 경우 단량체성 Fc 쇄 또한 효과기 기능을 갖지 않거나 본질적으로 가지지 않을 수 있다.
일반적으로, 반감기가 증가된 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디(또는 그를 포함하는 화합물, 컨스트럭트 또는 폴리펩티드)는 바람직하게는 상응하는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디, 그 자체의 반감기보다 적어도 1.5배, 바람직하게, 적어도 2배, 예컨대, 적어도 5배, 예를 들면, 적어도 10배, 또는 20배 초과로 더 큰 반감기를 가진다. 예를 들면, 반감기가 증가된 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물, 컨스트럭트 또는 폴리펩티드는 상응하는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디, 그 자체와 비교하여 1시간 초과, 바람직하게, 2시간 초과, 더욱 바람직하게, 6시간 초과, 예컨대, 12시간 초과, 또는 심지어 24, 48 또는 72시간 초과로 증가된 반감기를 가질 수 있다.
바람직하지만, 비제한적인 본 발명의 측면에서, 상기와 같은 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물, 컨스트럭트 또는 폴리펩티드는 인간에서 적어도 약 12시간, 바람직하게, 적어도 24시간, 더욱 바람직하게, 적어도 48시간, 더욱더 바람직하게, 적어도 72시간 초과의 혈청 반감기를 나타낸다. 예를 들면, 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드는 적어도 5일(예컨대, 약 5 내지 10일}, 바람직하게, 적어도 9일(예컨대, 약 9 내지 14일), 더욱 바람직하게, 적어도 약 10일(예컨대, 약 10 내지 15일), 또는 적어도 약 11일(예컨대, 약 11 내지 16일), 더욱 바람직하게, 적어도 약 12일(예컨대, 약 12 내지 18일 이상), 또는 14일 초과(예컨대, 약 14 내지 19일)의 반감기를 가질 수 있다.
추가의 아미노산 서열은 또한 (예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키는 데 사용되는 숙주 세포에 따라, 본 발명의 폴리펩티드를 프리(pre), 프로(pro) 또는 프리프로(prepro) 형태로 제공하기 위해) 합성시 숙주 세포로부터의 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드의 분비를 이끄는 신호 서열 또는 리더 서열을 형성할 수 있다.
추가의 아미노산 서열은 또한 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드가 특정 기관, 조직, 세포, 또는 세포의 부분 또는 구획쪽으로 향하고/거나, 그 안으로 침투하거나, 또는 진입할 수 있도록 하고/거나, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드가 생물학적 장벽, 예컨대, 세포막, 세포층, 예컨대, 상피 세포층, 종양(고형 종양 포함), 또는 혈뇌 장벽을 침투하거나 가로질러 통과할 수 있도록 하는 서열 또는 신호를 형성할 수 있다. 이러한 아미노산 서열의 적합한 예는 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들면, 상기 언급된 "펩트랜스" 벡터, (Cardinale et al.)에 의해 기술된 서열, 및 예를 들면, (WO 94/02610, WO 95/22618, US 7,004,940, WO 03/014960, WO 99/07414, WO 05/01690, EP 1512696, 및 문헌 [Cattaneo A. and Biocca S. (1997, Intracellular Antibodies: Development and Applications Landes and Spnnger-Veriag)] 및 [Kontermann, (2004, Methods 34:163-170]), 및 상기 문헌에 기술되어 있는 추가의 참조 문헌에 기술되어 있는 바와 같은, 소위 "인트라바디"로 지칭되는, 본 발명의 나노바디 및 폴리펩티드의 발현 또는 생산에 사용될 수 있는 자체 공지의 아미노산 서열 및 항체 단편을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직하지만, 비제한적인 한 실시양태에 따라, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디는 적어도 2, 예컨대, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산 서열 또는 나노바디를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 제공하기 위해 적어도 하나의 추가의 아미노산 서열 또는 나노바디를 포함하는데, 여기서, 상기 아미노산 서열 또는 나노바디는 임의로는 (본원에 정의된 바와 같은) 하나 이상의 링커 서열을 통해 연결될 수 있다. 2개 이상의 아미노산 서열 또는 나노바디(이중 적어도 하나는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디이다)를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드는 또한 본원에서 본 발명의 "다가" 폴리펩티드로서 지칭될 것이고, 이러한 폴리펩티드에 존재하는 아미노산 서열 또는 나노바디는 또한 "다가 포맷"으로 존재하는 것으로 본원에 지칭될 것이다. 예를 들면 본 발명의 "2가" 폴리펩티드는, 임의로는 링커 서열을 통해 연결된 2개의 아미노산 서열 또는 나노바디를 포함하는 한편, 본 발명의 "3가" 폴리펩티드는, 임의로는 2개의 링커 서열을 통해 연결된 3개의 나노바디를 포함하는 등등의 것이고; 여기서 폴리펩티드에 존재하는 아미노산 서열 및/또는 나노바디 중 적어도 하나 내지 폴리펩티드에 존재하는 모든 아미노산 서열 및/또는 나노바디는 본 발명의 아미노산 서열 및/또는 나노바디이다.
본 발명의 다가 폴리펩티드에서, 2개 이상의 아미노산 서열 또는 나노바디는 동일하거나 상이할 수 있고, 동일한 항원 또는 항원 결정기(예를 들면, 동일한 부분(들) 또는 에피토프(들)에 대해, 또는 상이한 부분 또는 에피토프에 대해)에 대한 것일 수 있거나, 별법으로는 상이한 항원 또는 항원 결정기, 또는 그의 임의의 적합한 조합에 대한 것일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 2가 폴리펩티드는 (a) 2개의 동일한 아미노산 서열 또는 나노바디; (b) 단백질 또는 항원의 제1 항원 결정기에 대한 제1 아미노산 서열 또는 나노바디, 및 제1 아미노산 서열 또는 나노바디와는 상이한, 상기 단백질 또는 항원의 동일한 항원 결정기에 대한 제2 아미노산 서열 또는 나노바디; (c) 단백질 또는 항원의 제1 항원 결정기에 대한 제1 아미노산 서열 또는 나노바디, 및 상기 단백질 또는 항원의 또 다른 항원 결정기에 대한 제2 아미노산 서열 또는 나노바디 ; 또는 (a) 3개의 동일한 아미노산 서열 또는 나노바디, (d) 제1 단백질 또는 항원에 대한 제1 나노바디, 및 상기 제1 항원과 상이한, 제2 단백질 또는 항원에 대한 제2 아미노산 서열 또는 나노바디를 포함할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 3가 폴리펩티드는, 예를 들면 제한없이, (a) 3개의 동일한 아미노산 서열 또는 나노바디; (b) 항원의 제1 항원 결정기에 대한 2개의 동일한 아미노산 서열 또는 나노바디 및 동일한 항원의 상이한 항원 결정기에 대한 제3 아미노산 서열 또는 나노바디; (c) 항원의 제1 항원 결정기에 대한 2개의 동일한 아미노산 서열 또는 나노바디 및 상기 제1 항원과 상이한 제2 항원에 대한 제3 아미노산 서열 또는 나노바디; (d) 제1 항원의 제1 항원 결정기에 대한 제1 아미노산 서열 또는 나노바디, 상기 제1 항원의 제2 항원 결정기에 대한 제2 아미노산 서열 또는 나노바디, 및 상기 제1 항원과 상이한 제2 항원에 대한 제3 아미노산 서열 또는 나노바디; 또는 (e) 제1 항원에 대한 제1 아미노산 서열 또는 나노바디, 상기 제1 항원과 상이한 제2 항원에 대한 제2 아미노산 서열 또는 나노바디, 및 상기 제1 및 제2 항원과 상이한 제3 항원에 대한 제3 아미노산 서열 또는 나노바디를 포함할 수 있다.
적어도 2개의 아미노산 서열 및/또는 나노바디(여기서, 적어도 하나의 아미노산 서열 또는 나노바디는 제1 항원(즉, IL-6 수용체에 대해)에 대해 유도되고, 적어도 하나의 아미노산 서열 또는 나노바디는 (즉, IL-6 수용체와는 다른) 제2 항원에 대한 것)를 함유하는 본 발명의 폴리펩티드는 또한 본 발명의 "다중특이성" 폴리펩티드로서 지칭될 것이고, 이러한 폴리펩티드에 존재하는 아미노산 서열 또는 나노바디는 "다중특이성 포맷"으로 존재하는 것으로 본원에 언급될 것이다. 따라서, 예를 들면, 본 발명의 "이특이성" 폴리펩티드는 제1 항원(즉, IL-6 수용체)에 대한 적어도 하나의 아미노산 서열 또는 나노바디 및 제2 항원(즉, IL-6 수용체와는 다른 것)에 대한 적어도 하나의 추가 아미노산 서열 또는 나노바디를 포함하는 폴리펩티드인 반면, 본 발명의 "삼특이성" 폴리펩티드는 제1 항원(즉, IL-6 수용체)에 대한 적어도 하나의 아미노산 서열 또는 나노바디, 제2 항원(즉, IL-6 수용체와는 다른 것)에 대한 적어도 하나의 추가의 아미노산 서열 또는 나노바디 및 제3 항원(즉, IL-6 수용체 및 제2 항원, 둘 모두와 다른 것)에 대한 적어도 하나의 추가의 아미노산 서열 또는 나노바디를 포함하는 폴리펩티드 등이다.
따라서, 본 발명의 이특이성 폴리펩티드는 그의 가장 간단한 형태로, IL-6 수용체에 대한 제1 아미노산 서열 또는 나노바디 및 제2 항원에 대한 제2 아미노산 서열 또는 나노바디를 포함하고, 여기서, 상기 제1 및 제2 아미노산 서열 또는 나노바디는 임의로는 (본원에 정의된 바와 같은) 링커 서열을 통해 연결될 수 있는 본 발명의 (본원에 정의된 바와 같은) 2가 폴리펩티드인 반면, 본 발명의 삼특이성 폴리펩티드는 그의 가장 간단한 형태로 IL-6 수용체에 대한 제1 아미노산 서열 또는 나노바디, 제2 항원에 대한 제2 아미노산 서열 또는 나노바디, 및 제3 항원에 대한 제3 아미노산 서열 또는 나노바디를 포함하고, 여기서, 상기 제1, 제2 및 제3 아미노산 서열 또는 나노바디가 임의로는 하나 이상, 특히 하나 및 더욱 특히, 2개의 링커 서열을 통해 연결될 수 있는 본 발명의 (본원에 정의된 바와 같은) 3가 폴리펩티드이다.
구체적인 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 3가, 이특이성 폴리펩티드이다. 본 발명의 3가, 이특이성 폴리펩티드는 그의 가장 간단한 형태로 IL-6 수용체에 대한 2개의 동일한 아미노산 서열 또는 나노바디 및 또 다른 항원에 대한 제3 아미노산 서열 또는 나노바디를 포함하고, 여기서, 상기 제1, 제2 및 제3 아미노산 서열 또는 나노바디가 임의로는 하나 이상, 특히 하나 및 더욱 특히, 2개의 링커 서열을 통해 연결될 수 있는 본 발명의 (본원에 정의된 바와 같은) 3가 폴리펩티드일 수 있다.
또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 이특이성 폴리펩티드이다. 본 발명의 이특이성 폴리펩티드는 그의 가장 간단한 형태로 IL-6 수용체에 대한 제1 아미노산 서열 또는 나노바디, 및 또 다른 항원에 대한 제2 아미노산 서열 또는 나노바디를 포함하고, 여기서, 상기 제1, 및 제2 아미노산 서열 또는 나노바디가 임의로는 링커 서열을 통해 연결될 수 있는 본 발명의 (본원에 정의된 바와 같은) 2가 폴리펩티드일 수 있다.
바람직하지만, 비제한적인 일례로, 본 발명의 다중특이성 폴리펩티드는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디를 적어도 하나 및 반감기를 증가시켜 주는 나노바디를 적어도 하나 포함한다. 그러한 나노바디에 대한 바람직하지만, 비제한적인 일례로는 혈청 단백질, 예컨대, 인간 혈청 알부민, 티록신 결합 단백질, (인간) 트랜스페린, 피브리노겐, 면역글로불린 예컨대, IgG, IgE 또는 IgM, 또는 WO 04/003019에 열거되어 있는 다른 혈청 단백질 중 하나에 대하 나노바디를 포함한다.
마우스에서의 실험인 경우에는 마우스 혈청 알부민(MSA: mouse serum albumin)에 대한 나노바디가 사용될 수 있는 반면, 약제학적 용도를 위해서는 인간 혈청 알부민에 대한 나노바디가 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 상기 적어도 하나의 (인간) 혈청 단백질이 (인간) 혈청 알부민, (인간) 혈청 면역글로불린, (인간) 티록신 결합 단백질, (인간) 트랜스페린, (인간) 피브리노겐 중 어느 것인, 상기 기술된 폴리펩티드 컨스트럭트이다.
따라서, 구체적인 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 2개의 동일한, IL-6 수용체에 대한 아미노산 서열 또는 나노바디 및 (인간) 혈청 알부민에 대한 제3의 아미노산 서열 또는 나노바디를 포함하며, 여기서, 상기 제1, 제2, 및 제3의 아미노산 서열 또는 나노바디는 하나 이상, 및 특히, 하나 이상, 특히 2개의 링커 서열을 통해 임의로 연결될 수 있는 것인 3가, 이특이성 폴리펩티드이다.
또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 IL-6 수용체에 대한 제1의 아미노산 서열 또는 나노바디, 및 (인간) 혈청 알부민에 대한 제2의 아미노산 서열 또는 나노바디를 포함하며, 여기서, 상기 제1, 및 제2의 아미노산 서열 또는 나노바디는 링커 서열을 통해 임의로 연결될 수 있는 것인 이특이성 폴리펩티드이다.
또 다른 구체적이지만, 비제한적인 본 발명의 측면에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 하나 이상의 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디 이외에도, 인간 혈청 알부민에 대한 나노바디를 적어도 하나는 포함한다. 비록 이와 같은 인간 혈청 알부민에 대한 나노바디가 일반적으로 상기 인용된 아블린쓰 엔.브이.의 출원(예를 들면, W04/062551 참조)에 기술되어 있기는 하지만, 특히 바람직하지만, 비제한적인 실시양태에 따라, 상기 인간 혈청 알부민에 대한 나노바디는 서열번호 97-99로부터 선택되는 아미노산 서열로 본질적으로 구성된다.
IL-6R에 대한 적어도 하나의 아미노산 서열 또는 나노바디, 및 반감기를 증가시키는 적어도 하나의 아미노산 서열 또는 나노바디를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드의 일부 바람직하지만, 비제한적인 일례는
a) 서열번호 70-72; 또는
b) 서열번호 70-72 중 하나와 본 발명의 그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 폴리펩티드 서열이며, 단, 본 발명의 그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 폴리펩티드 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 서열번호 70-72 중 하나에 의해 이루어지는 결합과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 폴리펩티드 서열, 및
c) 서열번호 70-72 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 폴리펩티드 서열이며, 단, 서열번호 70-72 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 서열번호 70-72 중 하나에 의해 이루어지는 결합과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 폴리펩티드 서열이다.
본 발명의 3가, 이특이성 폴리펩티드의 일부 바람직하지만, 비제한적인 일례는
a) 서열번호 71-72;
b) 서열번호 71-72 중 하나와 본 발명의 그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 폴리펩티드 서열이며, 단, 본 발명의 그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 폴리펩티드 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 서열번호 71-72 중 하나에 의해 이루어지는 결합과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 폴리펩티드 서열, 및
c) 서열번호 71-72 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 폴리펩티드 서열이며, 단, 서열번호 71-72 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 서열번호 71-72 중 하나에 의해 이루어지는 결합과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 폴리펩티드 서열이다.
IL-6R에 대한 아미노산 서열 또는 나노바디, 및 반감기를 증가시키는 아미노산 서열 또는 나노바디를 포함하는 본 발명의 이특이성 폴리펩티드의 일부 바람직하지만, 비제한적인 일례는
a) 서열번호 70;
b) 서열번호 70과 본 발명의 그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 폴리펩티드 서열이며, 단, 본 발명의 그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 폴리펩티드 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 서열번호 70에 의해 이루어지는 결합과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 폴리펩티드 서열, 및
c) 서열번호 70과 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 폴리펩티드 서열이며, 단, 서열번호 70과 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 서열번호 71-72 중 하나에 의해 이루어지는 결합과 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 폴리펩티드 서열이다.
2개의 아미노산 잔기의 스트레치(또는 2개의 CDR 서열)을 비교하였을 때, "본 발명의 그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서의 아미노산 차이"라는 용어는 a)에서 명시된 본 발명의 폴리펩티드에 포함되어 있는 본 발명의 아미노산 잔기의 스트레치(또는 CDR 서열)와 비교하여, b)에서 명시된 본 발명의 폴리펩티드에 포함되어 있는 본 발명의 아미노산 잔기의 스트레치(또는 CDR 서열) 위치 상에 단일 아미노산 잔기의 삽입, 결실, 또는 치환을 의미하며; 이는 본 발명의 2개의 아미노산 잔기의 스트레치(또는 CDR 서열)가 하나 또는 최대 2개의 상기와 같은 아미노산 차이를 포함할 수 있다는 것으로 이해된다.
"본 발명의 그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서의 아미노산 차이"는, 본 발명의 폴리펩티드에 포함되어 있는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디가 a)의 폴리펩티드 중 하나(즉, 서열번호 60-69 중 하나)에 포함되어 있는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디 중의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3과 비교하여 그의 CDR1에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이, 그의 CDR2에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이, 및/또는 그의 CDR3에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이(즉, 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드가 IL-6R 상의 특이적인 에피토프에 결합할 수 있도록 하는 항원 결합 부위를 형성하는 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3에서의 아미노산 차이); 예컨대, a)의 폴리펩티드 중 하나(즉, 서열번호 60-69 중 하나 중의 CDR1)에 포함되어 있는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디 중의 CDR1과 비교하여 그의 CDR1에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이(즉, 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드가 IL-6R 상의 특이적인 에피토프에 결합할 수 있도록 하는 항원 결합 부위를 형성하는 CDR1에서의 아미노산 차이); a)의 폴리펩티드 중 하나(즉, 서열번호 60-69 중 하나 중의 CDR2)에 포함되어 있는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디 중의 CDR2와 비교하여 그의 CDR2에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이(즉, 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드가 IL-6R 상의 특이적인 에피토프에 결합할 수 있도록 하는 항원 결합 부위를 형성하는 CDR2에서의 아미노산 차이); a)의 폴리펩티드 중 하나(즉, 서열번호 60-69 중 하나 중의 CDR3)에 포함되어 있는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디 중의 CDR3과 비교하여 그의 CDR3에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이(즉, 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드가 IL-6R 상의 특이적인 에피토프에 결합할 수 있도록 하는 항원 결합 부위를 형성하는 CDR3에서의 아미노산 차이); a)의 폴리펩티드 중 하나(즉, 서열번호 60-69 중 하나 중의 CDR1)에 포함되어 있는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디 중의 CDR1과 비교하여 그의 CDR1에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이(즉, 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드가 IL-6R 상의 특이적인 에피토프에 결합할 수 있도록 하는 항원 결합 부위를 형성하는 CDR1에서의 아미노산 차이) 및 a)의 폴리펩티드 중 하나(즉, 서열번호 60-69 중 하나 중의 CDR2)에 포함되어 있는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디 중의 CDR2와 비교하여 그의 CDR2에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이(즉, 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드가 IL-6R 상의 특이적인 에피토프에 결합할 수 있도록 하는 항원 결합 부위를 형성하는 CDR2에서의 아미노산 차이); 또는 a)의 폴리펩티드 중 하나(즉, 서열번호 60-69 중 하나 중의 CDR1)에 포함되어 있는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디 중의 CDR1과 비교하여 그의 CDR1에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이(즉, 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드가 IL-6R 상의 특이적인 에피토프에 결합할 수 있도록 하는 항원 결합 부위를 형성하는 CDR1에서의 아미노산 차이) 및 a)의 폴리펩티드 중 하나(즉, 서열번호 60-69 중 하나 중의 CDR3)에 포함되어 있는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디 중의 CDR3과 비교하여 그의 CDR3에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이(즉, 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드가 IL-6R 상의 특이적인 에피토프에 결합할 수 있도록 하는 항원 결합 부위를 형성하는 CDR3에서의 아미노산 차이); 또는 a)의 폴리펩티드 중 하나(즉, 서열번호 60-69 중 하나 중의 CDR2)에 포함되어 있는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디 중의 CDR2와 비교하여 그의 CDR2에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이(즉, 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드가 IL-6R 상의 특이적인 에피토프에 결합할 수 있도록 하는 항원 결합 부위를 형성하는 CDR2에서의 아미노산 차이) 및 a)의 폴리펩티드 중 하나(즉, 서열번호 60-69 중 하나 중의 CDR3)에 포함되어 있는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디 중의 CDR3과 비교하여 그의 CDR3에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이(즉, 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드가 IL-6R 상의 특이적인 에피토프에 결합할 수 있도록 하는 항원 결합 부위를 형성하는 CDR3에서의 아미노산 차이); a)의 폴리펩티드 중 하나(즉, 서열번호 60-69 중 하나 중의 CDR1)에 포함되어 있는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디 중의 CDR1과 비교하여 그의 CDR1에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이(즉, 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드가 IL-6R 상의 특이적인 에피토프에 결합할 수 있도록 하는 항원 결합 부위를 형성하는 CDR1에서의 아미노산 차이) 및 a)의 폴리펩티드 중 하나(즉, 서열번호 60-69 중 하나 중의 CDR2)에 포함되어 있는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디 중의 CDR2와 비교하여 그의 CDR2에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이(즉, 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드가 IL-6R 상의 특이적인 에피토프에 결합할 수 있도록 하는 항원 결합 부위를 형성하는 CDR2에서의 아미노산 차이) 및 a)의 폴리펩티드 중 하나(즉, 서열번호 60-69 중 하나 중의 CDR3)에 포함되어 있는 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디 중의 CDR3과 비교하여 그의 CDR3에서의 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이(즉, 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드가 IL-6R 상의 특이적인 에피토프에 결합할 수 있도록 하는 항원 결합 부위를 형성하는 CDR3에서의 아미노산 차이)를 가질 수 있다는 것을 의미한다.
"그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서의 아미노산 차이"는, 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드의 특성을 개선시키거나, 또는 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드의 원하는 특성을, 또는 균형을, 또는 원하는 특성의 조합을 적어도 크게 감소시키지는 않는, 본 발명의 CDR 중 하나 이상에서의 임의의 하나, 또는 임의의 최대 2개의 치환, 결실, 또는 삽입일 수 있다. 이와 관련하여 생성된 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드는 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 하나 또는 최대 2개의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하지 않는 본 발명의 CDR을 하나 이상 포함하는 화합물 또는 폴리펩티드와 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하여야 한다. 생성된 화합물 또는 폴리펩티드는 바람직하게, 본원에서 정의되는 바와 같은 (적합하게는 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, KD 값(실제값 또는 겉보기 값), KA 값(실제값 또는 겉보기 값), k온 속도 및/또는 k오프 속도, 또는 별법으로 IC50 값으로 측정되고/거나 표현되는) 친화도로 IL-6 수용체 상의 특이적인 에피토프에 결합할 수 있도록 한 것이다. 생성된 화합물 또는 폴리펩티드는 또한 바람직하게 본원에서 정의되는 바와 같은 세포 기반 효능 및 혈장 효능을 가진다.
본 발명의 한 측면에서, "그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서의 아미노산 차이"는 아미노산 치환이다. 아미노산 치환은 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드의 특성을 개선시키거나, 또는 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드의 원하는 특성을, 또는 균형을, 또는 원하는 특성의 조합을 적어도 크게 감소시키지는 않는, 본 발명의 하나 이상의 CDR에서의 임의의 하나, 또는 임의의 최대 2개의 치환일 수 있다. 이와 관련하여, 생성된 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드는 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 하나 또는 최대 2개의 치환을 포함하지 않는 본 발명의 CDR을 하나 이상 포함하는 화합물 또는 컨스트럭트와 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하여야 한다. 생성된 화합물 또는 폴리펩티드는 바람직하게, 본원에서 정의되는 바와 같은 (적합하게는 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, KD 값(실제값 또는 겉보기 값), KA 값(실제값 또는 겉보기 값), k온 속도 및/또는 k오프 속도, 또는 별법으로 IC50 값으로 측정되고/거나 표현되는) 친화도로 IL-6 수용체 상의 특이적인 에피토프에 결합할 수 있도록 한 것이다. 생성된 화합물 또는 폴리펩티드는 또한 바람직하게 본원에서 정의되는 바와 같은 세포 기반 효능 및 혈장 효능을 가진다. 숙련가는 일반적으로는, 본원의 개시 내용을 기초로 하여, 임의로는 예를 들면, 제한된 개수의 가능한 치환을 도입하고, 그러한 도입이 수득된 화합물 또는 폴리펩티드의 특성에 미치는 영향을 측정하는 단계를 포함할 수 있는 제한된 정도의 통상적 실험을 수행한 후, 적합한 치환을 결정하고 선택할 수 있을 것이다.
본 발명의 CDR 중 하나 이상에서의 아미노산 치환은 임의의 가능한 치환, 예컨대, (본원에서 정의되는 바와 같은) "보존적 치환"일 수 있고, 이는 (본원에서 정의되는 바와 같은) 특정 규칙을 통해 유도될 수 있고/거나, 이는 (본원에서 추가로 정의되는 바와 같이) 생성된 화합물 또는 폴리펩티드에 개선된 특성을 유도할 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 70-72(의 전장 서열) 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 화합물 또는 폴리펩티드에 관한 것이다.
2개의 화합물 또는 폴리펩티드를 비교하였을 때, "아미노산 차이"라는 용어는 제2의 화합물 또는 폴리펩티드와 비교하였을 때, 제1의 화합물 또는 폴리펩티드의 위치 상의 단일 아미노산 잔기의 삽입, 결실, 또는 치환을 의미하며; 이는 2개의 화합물 또는 폴리펩티드가 하나 또는 최대 2개의 상기와 같은 아미노산 차이를 포함할 수 있다는 것으로 이해된다.
"아미노산 차이"는 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드의 특성을 개선시키거나, 또는 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드의 원하는 특성을, 또는 균형을, 또는 원하는 특성의 조합을 적어도 크게 감소시키지는 않는, 화합물 또는 폴리펩티드, 즉, 골격 부위 중 하나 이상, 또는 CDR(이는 본 발명의 CDR(즉, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디에 존재하는 것) 중에 또는 또 다른 CDR(즉, 서열번호 98에 존재하는 것) 중에 존재하는 것일 수 있다) 중 하나 이상, 링커 서열, 또는 그의 임의의 조합 중의 임의의 하나 또는 최대 2개의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 이와 관련하여, 생성된 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드는 적어도, 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 하나 또는 최대 2개의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하지 않는 화합물 또는 폴리펩티드와 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하여야 한다. 생성된 화합물 또는 폴리펩티드는 바람직하게, 본원에서 정의되는 바와 같은 (적합하게는 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, KD 값(실제값 또는 겉보기 값), KA 값(실제값 또는 겉보기 값), k온 속도 및/또는 k오프 속도, 또는 별법으로 IC50 값으로 측정되고/거나 표현되는) 친화도로 IL-6 수용체 상의 특이적인 에피토프에 결합할 수 있도록 한 것이다. 생성된 화합물 또는 폴리펩티드는 또한 바람직하게 본원에서 정의되는 바와 같은 세포 기반 효능 및 혈장 효능을 가진다.
본 발명의 한 측면에서, "아미노산 차이"는 아미노산 치환이다. 아미노산 치환은 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드의 특성을 개선시키거나, 또는 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드의 원하는 특성을, 또는 균형을, 또는 원하는 특성의 조합을 적어도 크게 감소시키지는 않는, 골격 부위, 또는 CDR(이는 본 발명의 CDR(즉, 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디에 존재하는 것) 중에 또는 또 다른 CDR(즉, 서열번호 98에 존재하는 것) 중에 존재하는 것일 수 있다) 중 하나 이상, 링커 서열, 또는 그의 임의의 조합 중의 임의의 하나 또는 최대 2개의 치환일 수 있다. 이와 관련하여, 생성된 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드는 적어도, 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 하나 또는 최대 2개의 치환을 포함하지 않는 화합물 또는 폴리펩티드와 비교하여 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하여야 한다. 생성된 화합물 또는 폴리펩티드는 바람직하게, 본원에서 정의되는 바와 같은 (적합하게는 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, KD 값(실제값 또는 겉보기 값), KA 값(실제값 또는 겉보기 값), k온 속도 및/또는 k오프 속도, 또는 별법으로 IC50 값으로 측정되고/거나 표현되는) 친화도로 IL-6 수용체 상의 특이적인 에피토프에 결합할 수 있도록 한 것이다. 생성된 화합물 또는 폴리펩티드는 또한 바람직하게 본원에서 정의되는 바와 같은 세포 기반 효능 및 혈장 효능을 가진다.
상기에서 언급한 바와 같이, 치환, 삽입 또는 결실은 골격 부위 중 하나 이상, CDR의 하나 이상, 및/또는 링커 서열 중 하나 이상 중에 존재할 수 있다. CDR 중의 치환, 삽입 또는 결실은 임의의 가능한 치환, 삽입 또는 결실, 예컨대, (본원에서 정의되는 바와 같은) "보존적 치환"일 수 있고, 이는 (본원에서 정의되는 바와 같은) 특정 규칙을 통해 유도될 수 있고/거나, 이는 (본원에서 추가로 정의되는 바와 같이) 생성된 화합물 또는 폴리펩티드에 개선된 특성을 유도할 수 있다.
상기와 같은 치환, 삽입 또는 결실이 골격 부위 중 하나 이상에서 이루어지는 경우, 이는 임의의 가능한 치환, 삽입 또는 결실일 수 있다. (본원에 기술되어 있는 바와 같은 적합한 인간화 치환이 아니라면) 홀마크 잔기에서의 치환, 삽입, 또는 결실이 일반적으로는 덜 바람직하지만, 상기와 같은 임의의 가능한 치환, 삽입 또는 결실은 홀마크 잔기 중 하나 이상(예를 들어, WO 08/020079(표 A-3 내지 A-8)에 정의되어 있는 바와 같은 것)에서, 및/또는 골격 잔기 중 다른 위치 중 하나 이상에서 이루어질 수 있다. 비제한적일 일례로, 비록 본 발명이 일반적으로 하기와 같은 치환으로 제한되는 것은 아니지만, 치환은 예를 들면, (본원에 기술되어 있는 바와 같은) 보존적 치환일 수 있고/거나, 아미노산 잔기는 또 다른 VHH 도메인 중 동일 위치에서 천연적으로 발생된 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있다(WO 08/020079(표 A-5 내지 A-8) 참조).
(바람직하게) 골격 부위 중 하나 이상에서 이루어진 치환, 삽입 또는 결실은 서열 최적화 치환, 예컨대, 인간화 치환일 수 있다. 일부 바람직하지만, 비제한적인 인간화 치환(및 그의 적합한 조합)은 본원 개시 내용을 기초로 하여 숙련가에게 명백할 것이다. a)에서 정의된 본 발명의 폴리펩티드 중 하나에 포함되어 있는 아미노산 서열 또는 나노바디 중 하나의 골격 부위의 서열을 하나 이상의 밀접한 관계에 있는 인간 VH 서열의 상응하는 골격 서열과 비교하여 잠재적으로 유용한 인간화 치환을 확인한 후, 그렇게 결정된 잠재적으로 유용한 인간화 치환 중 하나 이상(또는 그의 조합)을 (본원에 추가로 기술된 자체 공지의 임의 방식으로) a)에서 정의된 본 발명의 폴리펩티드 중 하나에 포함되어 있는 상기 아미노산 서열 또는 나노바디 내로 도입하고, 생성된 인간화된 폴리펩티드를 IL-6R에 대한 친화도, 안정성, 발현의 용이성 및 수준, 및 본원에 정의되어 있는 다른 바람직한 특성에 대하여 테스트할 수 있다. 이러한 방식으로, 제한된 정도의 시행착오법에 의해, 다른 적합한 인간화된 치환(또는 그의 적합한 조합)은 본원의 개시 내용에 기초하여 숙련가에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드를 발현시키는 데 사용되는 숙주 유기체에 따라, 결실 및/또는 치환은 또한, 당업계의 숙련가의 능력 범위내에서 번역 후 변형에 대한 하나 이상의 부위(예컨대, 하나 이상의 글리코실화 부위)가 제거되는 방식으로 디자인될 수 있다. 별법으로, 치환 또는 삽입은 (본원에 기술된 바와 같은) 작용기의 부착을 위한 하나 이상의 부위를 도입할 수 있도록, 예를 들면, (또한 본원에 기술된 바와 같은) 부위 특이적인 페길화를 허용할 수 있도록 디자인될 수 있다.
WO 08/020079의 표 A-5 내지 A-8에 제시된 VHH 엔트로피 및 VHH 변이성에 대한 데이터로부터 알 수 있듯이, 골격 부위 중의 일부 아미노산 잔기는 다른 잔기에 비하여 보다 더 보존적이다. 일반적으로, 본 발명은 그의 가장 광범위한 의미에서 이에 제한되지 않지만, 임의의 치환, 결실 또는 삽입은 바람직하게는 덜 보존적인 위치에서 이루어질 수 있다. 또한, 일반적으로, 아미노산 치환은 아미노산 결실 또는 삽입 보다 바람직하다.
생성된 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는
- 1 nM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 바람직하게, 500 pM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 더욱 바람직하게, 100 pM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 또는 더욱더 바람직하게, 약 50 pM 내지 1 pM 또는 그 이하의 해리 상수(KD)로 hIL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 1 nM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 바람직하게, 500 pM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 더욱 바람직하게, 100 pM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 또는 더욱더 바람직하게, 약 50 pM 내지 1 pM 또는 그 이하의 해리 상수(KD)로 시아노 IL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 104 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 바람직하게, 105 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 더욱 바람직하게, 약 106 M-1s-1 또는 그 이상인 k온 속도로 hIL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 104 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 바람직하게, 105 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 더욱 바람직하게, 약 106 M-1s-1 또는 그 이상인 k온 속도로 시아노 IL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 10-3 s-1 (t½=0.69 s) 내지 10-6 s-1(이는 t½이 여러 일인 거의 비가역적인 복합체 제공), 바람직하게, 10-4 s-1 내지 10-6 s-1, 더욱 바람직하게, 10-5 s-1 내지 10-6 s-1, 예컨대, 약 10-5 s-1 또는 그 이하인 k오프 속도로 hIL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 10-3 s-1 (t½=0.69 s) 내지 10-6 s-1(이는 t½이 여러 일인 거의 비가역적인 복합체 제공), 바람직하게, 10-4 s-1 내지 10-6 s-1, 더욱 바람직하게, 10-5 s-1 내지 10-6 s-1, 예컨대, 약 10-5 s-1 또는 그 이하인 k오프 속도로 시아노 IL-6R에 결합할 수 있도록 하는 (적합하게는 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, KD 값(실제값 또는 겉보기 값), KA 값(실제값 또는 겉보기 값), k온 속도 및/또는 k오프 속도, 또는 별법으로 IC50 값으로 측정되고/거나 표현되는) 친화도로 IL-6에 결합하여야 한다.
본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드의 결합에 대한 일부 바람직한 IC50 값은 본원의 추가 설명 및 실시예로부터 명백해질 것이다.
본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드, 및 그를 포함하는 조성물의 효능 및/또는 유효성은 관여하는 특정 질환 또는 질병에 따라, 임의의 적합한 시험관내 분석법, 세포 기반 분석법, 생체내 분석법 및/또는 자체 공지된 동물 모델, 또는 그의 임의의 조합을 사용함으로써 테스트될 수 있다. 적합한 분석법 및 동물 모델은 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들면, 그 예로는 TF1, XG1 및 7TD1, 콜라겐 유도성 관절염 모델, SCID 마우스 중 윤활 조직 이식편 모델, 각종 인간 암(림프종, 골수종, 전립선암 및 신장 세포 암종 포함)의 이종이식편 모델, IBD 모델(TNBS 포함), 영장류 모델(예컨대, 문헌 [Shinkura et al., 1998, Anticancer Research 18:1217-1222]에 기술되어 있는 것), 관절염성 질환을 앓는 인간을 제외한 영장류 모델(예컨대, 문헌 [Vierboom et al., 2008, Drug Discov. Today:Dis Model doi:10.1016/j.ddmod. 2008.06.003)을 비롯한 IL-6 의존성 세포를 사용하는 증식 분석법 뿐만 아니라, 하기 실험부 및 본원에서 인용된 선행 기술(문헌 ([Peake et al., 2006, Rheumatology 45:1485-9], [Wahid et al., 2000, Clin. Exp. Immunol, 122:133-142], [Matsuno et al., 1998, Arthritis and rheumatism 41:2014-2021], WO 08/020079))에서 사용된 분석법 및 동물 모델을 포함한다.
예를 들면, 문헌 [Kitamura et al., (1989, J. Cell Physiol. 140:323)]에 기술되어 있는 것과 같은 TF1 분석법에서, 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 폴리펩티드는 (100 IU/mL IL-6에서) 10 nM 내지 50 pM, 바람직하게, 5 nM 내지 50 pM, 더욱 바람직하게, 1 nM 내지 50 pM 또는 이하, 예컨대, 약 750 또는 500 pM 또는 그 이하의 IC50 값을 가질 수 있다. 이러한 TF1 분석법에서, 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 폴리펩티드는 (5,000 IU/mL IL-6에서) 50 nM 내지 1 nM, 바람직하게, 25 nM 내지 1 nM, 더욱 바람직하게, 10 nM 내지 1 nM 또는 그 이하, 예컨대, 약 8 nM 또는 그 이하의 IC50 값을 가질 수 있다. 이러한 TF1 분석법에서, 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 1 및 2에 의해 정의되는 바와 같은 참조 IgG 또는 서열번호 3 및 4에 의해 정의되는 바와 같은 참조 Fab에 대하여 관찰된 IC50 값과 비교하여 적어도 동일, 및 바람직하게는 적어도 2배, 바람직하게, 3배, 더욱 바람직하게, 4배, 더욱더 바람직하게, 5배, 7배 또는 7배 초과로 더 우수한 IC50 값을 가질 수 있다(실시예 1 참조). 이러한 TF1 분석법에서, 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 폴리펩티드는 토실리주맙(MRA)에 대하여 관찰된 IC50 값과 비교하여 적어도 동일, 및 바람직하게는 적어도 2배, 바람직하게, 3배, 더욱 바람직하게, 4배, 더욱더 바람직하게, 5배, 7배 또는 7배 초과로 더 우수한 IC50 값을 가질 수 있다.
(예컨대, 실시예 45에 기술되어 있는 바와 같이, 27.29 ng/mL IL-6의 존재하에서) IL-6 EC50 값에서의 혈장 효능 분석법에서, 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 폴리펩티드는 500 pM 내지 50 pM, 바람직하게, 250 pM 내지 50 pM, 더욱 바람직하게, 200 pM 내지 50 pM 또는 그 이하, 예컨대, 150 pM 또는 그 이하의 IC50 값을 가질 수 있다. (예컨대, 실시예 45에 기술되어 있는 바와 같이, 885 ng/mL IL-6의 존재하에서) IL-6 EC95 값에서의 혈장 효능 분석법에서, 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 폴리펩티드는 1,000 pM 내지 100 pM, 바람직하게, 750 pM 내지 100 pM, 더욱 바람직하게, 500 pM 내지 100 pM 또는 그 이하, 예컨대, 400 pM 또는 그 이하의 IC50 값을 가질 수 있다. 이러한 혈장 효능 분석법에서, 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 1 및 2에 의해 정의되는 바와 같은 참조 IgG 또는 서열번호 3 및 4에 의해 정의되는 바와 같은 참조 Fab에 대하여 관찰된 IC50 값과 비교하여 적어도 동일, 및 바람직하게는 적어도 2배, 바람직하게, 3배, 더욱 바람직하게, 4배, 더욱더 바람직하게, 5배, 7배 또는 7배 초과로 더 우수한 IC50 값을 가질 수 있다(실시예 1 참조). 이러한 혈장 효능 분석법에서, 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 폴리펩티드는 토실리주맙(MRA)에 대하여 관찰된 IC50 값과 비교하여 적어도 동일, 및 바람직하게는 적어도 2배, 바람직하게, 3배, 더욱 바람직하게, 4배, 더욱더 바람직하게, 5배, 7배 또는 7배 초과로 더 우수한 IC50 값을 가질 수 있다.
CHO 세포 상의 막 IL-6R에의 결합에 대해 정의하는 분석법에서, 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 폴리펩티드는 10 nM 내지 100 pM, 바람직하게, 5 nM 내지 100 pM, 더욱 바람직하게, 2 nM 내지 10 pM 또는 그 이하, 예컨대, 2 nM 또는 그 이하의 IC50 값을 가질 수 있다.
바람직한 측면에서, 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드는 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖거나, 또는 본질적으로 그로 구성된다. 또 다른 바람직한 측면에서, 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드는 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖거나, 또는 본질적으로 그로 구성된다. 이러한 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드는 IL-6/IL-6R 상호작용을 부분적으로 또는 전체적으로 차단할 수 있고/거나, IL-6, IL-6R 및/또는 IL-6/IL-6R 복합체를 통해 일어나는 신호전달을 억제시킬 수 있는 능력 이외에도 개선된 특성, 예컨대, 개선된 결합 및/또는 친화도, 개선된 결합력, 개선된 유효성 및 효능, 및/또는 증가된 선택성을 보인다.
본 발명은 또한 본 발명의 아미노산 서열 또는 나노바디를 포함하거나, 본질적으로 그로 구성된 1가 컨스트럭트(이는 또한 "본 발명의 1가 컨스트럭트"로도 지칭된다). 본 발명의 바람직한 1가 컨스트럭트는 서열번호 60-69, 예컨대, 서열번호 65-69, 예컨대, 서열번호 66을 포함하거나, 본질적으로 구성된다. 본 발명의 아미노산 서열 및 나노바디 뿐만 아니라, 상기 1가 컨스트럭트도 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드 제조에, 예컨대, 본 발명의 다가 및/또는 다중특이성 화합물 또는 폴리펩티드의 제조에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 화합물, 컨스트럭트 또는 폴리펩티드의 제조를 위한 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 1가 컨스트럭트의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 1가 컨스트럭트를 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛에 연결시키는 단계를 포함하는, 본 발명의 화합물, 컨스트럭트 또는 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 1가 컨스트럭트를 하나 이상의 링커를 통해 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛에 연결시키는 것을 포함한다.
바람직한 측면에서, 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛은 결합 유닛, 예컨대, 아미노산 서열 또는 나노바디이다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 다가 및/또는 다중특이성 화합물, 컨스트럭트 또는 폴리펩티드의 제조를 위한 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 1가 컨스트럭트의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 1가 컨스트럭트를 하나 이상의 다른 결합 유닛, 예컨대, 아미노산 서열 또는 나노바디에 연결시키는 단계를 포함하는, 본 발명의 다가 및/또는 다중특이성 화합물, 컨스트럭트 또는 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 1가 컨스트럭트를 하나 이상의 링커를 통해 하나 이상의 결합 유닛에 연결시키는 것을 포함할 수 있다.
구체적인 측면에서, 본 발명은 또한 본 발명의 다가 및/또는 다중특이성 화합물, 컨스트럭트 또는 폴리펩티드의 제조를 위한, 서열번호 60-69(바람직하게, 서열번호 65-69, 더욱 바람직하게, 서열번호 66) 중 하나를 포함하거나, 본질적으로 그로 구성된 1가 컨스트럭트의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 서열번호 60-69(바람직하게, 서열번호 65-69, 더욱 바람직하게, 서열번호 66) 중 하나를 포함하거나, 본질적으로 그로 구성된 1가 컨스트럭트를 하나 이상의 다른 결합 유닛, 예컨대, 아미노산 서열 또는 나노바디에 연결시키는 단계를 포함하는, 본 발명의 다가 및/또는 다중특이성 화합물, 컨스트럭트 또는 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 서열번호 60-69(바람직하게, 서열번호 65-69, 더욱 바람직하게, 서열번호 66) 중 하나를 포함하거나, 본질적으로 그로 구성된 1가 컨스트럭트를 하나 이상의 링커를 통해 하나 이상의 결합 유닛에 연결시키는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 구체적인 측면에서, 본 발명은 서열번호 70-72(바람직하게, 서열번호 70-71, 더욱 바람직하게, 서열번호 70 또는 서열번호 71)를 포함하거나, 본질적으로 그로 구성된 다가 및/또는 다중특이성 화합물, 컨스트럭트 또는 폴리펩티드의 제조를 위한 서열번호 60-69(바람직하게, 서열번호 65-69, 더욱 바람직하게, 서열번호 66) 중 하나를 포함하거나, 본질적으로 그로 구성된 1가 컨스트럭트의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 서열번호 60-69(바람직하게, 서열번호 65-69, 더욱 바람직하게, 서열번호 66) 중 하나를 포함하거나, 본질적으로 그로 구성된 1가 컨스트럭트를 하나 이상의 링커를 통해 서열번호 98을 포함하거나, 본질적으로 그로 구성된 아미노산 서열에 연결시키는 단계를 포함하는, 서열번호 70-72(바람직하게, 서열번호 70-71, 더욱 바람직하게, 서열번호 70 또는 서열번호 71)를 포함하거나, 본질적으로 그로 구성된 다가 및/또는 다중특이성 화합물, 컨스트럭트 또는 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
다가 및/또는 다중특이성 폴리펩티드에 사용하기 위한 적합한 스페이서 또는 링커는 숙련가에게 명백할 것이고, 이는 일반적으로 당업계에서 아미노산 서열을 연결시키는 데 사용되는 임의의 링커 또는 스페이스일 수 있다. 바람직하게, 상기 링커 또는 스페이스는 약제학적 용도를 위한 단백질 또는 폴리펩티드의 구성에 사용하는 데 적합하다.
특히 바람직한 일부 스페이서로는 당업계에서 항체 단편 또는 항체 도메인을 연결시키는 데 사용되는 링커 및 스페이스를 포함한다. 이는 상기 인용된 일반적 배경 기술에서 언급된 링커 뿐만 아니라, 예를 들면, 당업계에서 디아바디 또는 ScFv 단편를 구성하는 데 사용되는 링커를 포함한다(그러나, 이와 관련하여, 디아바디 및 ScFv 단편에서 사용되는 링커는 적절한 VH 및 VL 도메인이 함께 완전한 항원 결합 부위를 형성할 수 있도록 허용하는 길이, 가요성 정도 및 다른 특성을 가져야 하는 반면, 본 발명의 폴리펩티드에 사용되는 링커의 길이 또는 가요성에 있어서는 어떤 특별한 제한이 없는데, 그 이유는 각각의 아미노산 서열 또는 나노바디가 그 스스로 완전한 항원 결합 부위를 형성할 수 있기 때문이라는 것에 주의하여야 한다).
예를 들면, 링커는 적합한 아미노산 서열, 특히, 1 내지 50개, 바람직하게, 1 내지 30개, 예컨대, 1 내지 20개 또는 1 내지 10개의 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열일 수 있다. 그러한 아미노산 서열의 일부 바람직한 예로는 gly-ser 링커, 예를 들면, (glyxsery)z 유형의 링커, 예컨대, WO 99/42077에 기재된 바와 같은 (gly4ser)3 또는 (gly3ser2)3, 힌지 유사 부위, 예컨대, 천연적으로 발생된 중쇄 항체의 힌지 부위 또는 유사 서열(예컨대, WO 94/04678에 기재된 것)을 포함한다.
특히 바람직한 일부 다른 링커는 폴리-알라닌(예컨대, AAA) 뿐만 아니라, 표 B-8에서 언급되는 링커이며, 이중 AAA, GS-7 및 GS-9가 특히 바람직하다.
다른 적합한 링커는 일반적으로 유기 화합물 또는 중합체, 특히 약제학적 용도를 위해 단백질에 사용하기에 적합한 것들을 포함한다. 예를 들면, 폴리(에틸렌글리콜) 부분이 항체 도메인을 연결시키는 데 사용되어 왔으며, 예를 들면, WO 04/081026을 참조할 수 있다.
사용된 링커(들)의 길이, 가요성 정도 및/또는 (중요하진 않지만, 일반적으로 ScFv 단편에 사용되는 링커의 경우와 같은) 다른 특성이, IL-6 수용체, 또는 하나 이상의 다른 항원에 대한 친화도, 특이성, 또는 결합력을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 최종의 본 발명의 폴리펩티드의 특성에 어떤 영향을 미칠 수 있다는 것이 본 발명의 범주내에 포함된다. 본원의 개시 내용에 기초하여, 숙련가는 임의로는 일부 제한된 일상적 실험 이후에 특정의 본 발명의 폴리펩티드에 사용하기 위한 최적의 링커(들)를 결정할 수 있을 것이다.
또한 사용된 링커(들)가 하나 이상의 다른 바람직한 특성 또는 작용성을 본 발명의 폴리펩티드에 부여하고/거나, 유도체의 형성 및/또는 작용기의 부착을 위한 하나 이상의 부위를 제공하는 것(예를 들면, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 및 폴리펩티드의 유도체에 대해 본원에 기재된 바와 같다)은 본 발명의 범주내에 있다. 예를 들면, 하나 이상의 하전된 아미노산 잔기를 함유하는 링커는 개선된 친수성 특성을 제공할 수 있는 반면, 작은 에피토프 또는 태그를 형성하거나 함유하는 링커는 검출, 확인 및/또는 정제 목적으로 사용될 수 있다. 추가로, 본원의 개시 내용에 기초하여, 숙련가는 임의로는 일부 제한된 종래의 실험 이후에 특정의 본 발명의 폴리펩티드에 사용하기 위한 최적의 링커를 결정할 수 있을 것이다.
마지막으로, 2개 이상의 링커가 본 발명의 폴리펩티드에 사용되는 경우, 이들 링커는 동일하거나 상이할 수 있다. 추가로, 본원의 개시 내용에 기초하여, 숙련가는 임의로는 일부 제한된 종래의 실험 이후에 특정의 본 발명의 폴리펩티드에 사용하기 위한 최적의 링커를 결정할 수 있을 것이다.
일반적으로, 발현 및 생산의 용이함을 위해 본 발명의 폴리펩티드는 선형 폴리펩티드일 것이다. 그러나, 본 발명은 그의 가장 광범위한 의미에서 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드가 3개 이상의 아미노산 서열 또는 나노바디를 포함하는 경우, 이들을 3개 이상의 "아암"(각각의 "아암"은 아미노산 서열 또는 나노바디에 연결되어 있다)을 갖는 링커의 사용에 의해 연결시켜 "성상형의" 컨스트럭트를 제공할 수 있다. 또한 일반적으로는 덜 바람직하지만, 환형 컨스트럭트를 사용할 수도 있다.
본 발명은 그의 가장 광범위한 의미에서 또한 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드의 유도체를 포함한다. 그러한 유도체는 일반적으로 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드, 및/또는 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드를 형성하는 하나 이상의 아미노산 잔기의 변형, 특히 화학적 및/또는 생물학적(예를 들면, 효소에 의한) 변형에 의해 수득할 수 있다.
이러한 변형의 예 뿐만 아니라, 이러한 방식으로 변형될 수 있는 아미노산 서열, 나노바디 서열, 화합물 또는 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기의 예(즉, 단백질 골격, 그러나 바람직하게는 측쇄 상의 것), 이러한 변형을 도입하기 위해 사용될 수 있는 방법 및 기법, 및 이러한 변형의 유효한 용도 및 이점은 숙련가에게 명백할 것이다.
예를 들면, 이러한 변형은 하나 이상의 작용기, 잔기 또는 부분를 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드 내로의 또는 그 상으로, 및 특히, 하나 이상의 원하는 특성 또는 관능성을 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드에 부여하는 하나 이상의 작용성 기, 잔기 또는 부분을(예를 들면, 공유적 결합에 의해 또는 다른 적합한 방식으로) 도입하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 작용기는 숙련가에게 명백할 것이다.
예를 들면, 이러한 변형은 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드의 반감기, 가용성 및/또는 흡수성을 증가시키고, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드의 면역원성 및/또는 독성을 감소시키고, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드의 원치않는 부작용을 제거 또는 약화시키고/거나, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드에게 다른 유리한 특성을 부여하고/거나 그의 원치않는 특성을 감소시키거나, 전술된 2개 이상의 임의의 조합된 특성을 갖는 하나 이상의 작용기를 (예를 들어, 공유적 결합에 의해 또는 다른 적합한 방식으로) 도입하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 작용기 및 이를 도입하는 기법의 예는 숙련가에게 명백할 것이고, 일반적으로 상기 본원에 인용된 일반적 배경 기술에서 언급된 모든 작용기 및 기법 뿐만 아니라, 약제학적 단백질의 변형, 특히 항체 또는 항체 단편(ScFv 및 단일 도메인 항체를 포함)의 변형에 대해 자체 공지된 작용기 및 기법을 포함할 수 있고, 이를 위해 예를 들어, 문헌 [Remington s Pharmaceutical Sciences (1980, 16th ed, Mack Publishing Co, Easton, PA)]을 참조한다. 다시 숙련가에게 명백한 바와 같이, 이러한 작용기는 예를 들어, 임의로 적합한 링커 또는 스페이서를 통해 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드에 직접 (예를 들면, 공유적으로) 연결될 수 있다.
약제학적 단백질의 반감기를 증가시키고/거나 면역원성을 감소시키기 위한 방법으로서 가장 널리 사용되는 기법 중 하나는 적합한 약리학으로 허용가능한 중합체, 예컨대, 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 또는 그의 유도체(예컨대, 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 mPEG)의 부착을 포함한다. 일반적으로, 임의의 적합한 형태의 페길화, 예컨대, 항체 및 항체 단편((단일) 도메인 항체 및 ScFv's를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 위해 당업계에서 사용되는 페길화를 사용할 수 있고, 예를 들면, 문헌 ([Chapman (2002, Nat. Biotechnol., 54:531-545)], [Veronese and Harris (2003, Adv. Drug. Deliv. Rev. 54:453-456)], [Harris and Chess (2003, Nat. Rev. Drug Discov., 2:214-21)] 및 WO 04/060965를 참조한다. 단백질의 페길화를 위한 각종 시약, 예를 들면, 넥타 테라퓨틱스(Nektar Therapeutics)(미국 소재)의 시약은 또한 상업적으로 이용가능하다.
바람직하게는, 부위 지정 페길화는 특히 시스테인 잔기를 통해 사용된다(예를 들면, 문헌 [Yang et al., (2003, Protein Engineering, 16(10): 761-770)] 참조). 예를 들면, 이를 위해, PEG는 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드에서 천연적으로 발생된 시스테인 잔기에 부착될 수 있고, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드는 PEG의 부착을 위한 하나 이상의 시스테인 잔기를 적합하게 도입하기 위해 변형될 수 있거나, PEG의 부착을 위한 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 아미노산 서열이 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드의 N 및/또는 C 말단에 융합될 수 있고, 이들 모두 숙련가에게 자체 공지된 단백질 조작의 기법을 사용한다.
바람직하게는, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드에 대하여, 분자량이 5,000 초과, 예컨대, 10,000 초과 및 200,000 미만, 예컨대, 100,000 미만; 예를 들면, 20,000-80,000 범위인 PEG가 사용된다.
또 다른, 다만 덜 바람직한 변형은 일반적으로는 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드를 발현하기 위해 사용되는 숙주 세포에 따라, 동시 번역 변형 및/또는 번역후 변형의 일부로서, N 연결 또는 O 연결된 글리코실화를 포함한다.
추가의 또 다른 변형은 표지된 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드의 의도된 용도에 따라, 하나 이상의 검출가능한 표지 또는 신호 발생기 또는 부분을 도입하는 것을 포함할 수 있다. 이를 부착하고, 사용하고, 검출하는 데 적합한 표지 및 기법은 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들면, 형광 표지(예컨대, 플루오레세인, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 및 플루오레스카민 및 형광 금속, 예컨대, 152Eu 또는 란탄계족으로부터의 다른 금속), 인광성 표지, 화학발광성 표지 또는 생물발광성 표지(예컨대, 루미날, 이소루미놀, 쎄로마틱 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염, 옥살레이트 에스테르, 디옥세탄 또는 GFP 및 그의 유사체), 방사성 동위원소(예컨대 3H, 125I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 36Cl, 57Co, 58Co, 59Fe, 및 75Se), 금속, 금속 킬레이트 또는 금속성 양이온(예를 들면, 금속성 양이온, 예컨대, 99 mTc, 123I, 111In, 131I, 97Ru, 67Cu, 67Ga, 및 68Ga, 또는 생체내, 시험관내에서, 또는 계내 진단 및 영상화에서의 사용을 위해 특히 적합화된 다른 금속 또는 금속성 양이온(예컨대, 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr, 및 56Fe) 뿐만 아니라, 발색단 및 효소(예컨대, 말레이트 데히드로게나제, 스타필로코커스 뉴클레아제, 델타-V-스테로이드 이소머라제, 효모 알올 데히드로게나제, 알파 글리세로포스페이트 데히드로게나제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 비오티나비딘 퍼옥시다제, 호오스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코스 옥시다제, β 갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스 VI 포스페이트 데히드로게나제, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린 에스테라제)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 적합한 표지는 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들어, NMR 또는 ESR 분광기를 사용하여 검출될 수 있는 부분을 포함한다.
이와 같이 표지된 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드는 생체내 진단 및 영상화 목적을 위해서 뿐만 아니라, 예를 들면, 특이적 표지의 선택에 따라, 시험관내, 생체내 또는 계내 분석법(자체 공지된 면역분석법, 예컨대, ELISA, RIA, EIA 및 다른 "샌드위치 분석법" 등 포함)을 위해 사용될 수 있다.
숙련가에게 명백한 바와 같이, 또 다른 변형은, 예를 들면, 상기 언급된 금속 또는 금속성 양이온 중 하나를 킬레이트화하기 위해 킬레이팅기를 도입하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 킬레이팅기로는 예를 들면, 제한없이, 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA: diethylenetriaminepentaacetic acid) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid)을 포함한다.
또 다른 변형은 특이적인 결합 쌍, 예컨대, 비오틴-(스트렙트)아비딘 결합 쌍의 한 부분인 작용기의 도입을 포함할 수 있다. 이러한 작용기는 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드를 결합 쌍의 나머지 반에, 즉, 결합 쌍을 형성하는 것을 통해 또 다른 단백질, 폴리펩티드 또는 화학적 화합물에 연결시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드는 비오틴에 접합되고, 아비딘 또는 스트렙타비딘에 접합된 또 다른 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 캐리어에 연결될 수 있다. 예를 들면, 이러한 접합된 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드는, 예를 들어, 검출가능한 신호 발생 제제가 아비딘 또는 스트렙타비딘에 접합되어 있는 진단 시스템에서 리포터로서 사용될 수 있다. 이러한 결합 쌍은, 예를 들어, 또한 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드를 약제학적 목적에 적합한 캐리어를 비롯한 캐리어에 결합시키는 데 사용될 수 있다. 한 비제한적인 예는 문헌 [Cao and Suresh (2000, Journal of Drug Targeting, 8(4):257)]에 기재된 리포솜 제형이다. 이러한 결합 쌍은 또한 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드에 치료 활성제를 연결시키기 위해 사용될 수 있다.
다른 유효한 화학적 및 효소적 변형은 숙련가에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 또한 연구 목적을 위해(예를 들면, 기능과 활성과의 상관관계를 연구하기 위해) 도입될 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Lundblad and Bradshaw (1997, Biotechnol Appl. Biochem., 26:143-151)]을 참조한다.
바람직하게, 유도체는 (적합하게는 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, KD 값(실제값 또는 겉보기 값), KA 값(실제값 또는 겉보기 값), k온 속도 및/또는 k오프 속도, 또는 별법으로 IC50 값으로 측정되고/거나 표현되는) 친화도로 IL-6 수용체 상의 특이적인 에피토프에 결합할 수 있도록 한 것이다.
특히, 상기와 같은 본 발명의 유도체는 바람직하게는:
- 1 nM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 바람직하게, 500 pM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 더욱 바람직하게, 100 pM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 또는 더욱더 바람직하게, 약 50 pM 내지 1 pM 또는 그 이하의 해리 상수(KD)로 hIL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 1 nM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 바람직하게, 500 pM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 더욱 바람직하게, 100 pM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 또는 더욱더 바람직하게, 약 50 pM 내지 1 pM 또는 그 이하의 해리 상수(KD)로 시아노 IL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 104 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 바람직하게, 105 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 더욱 바람직하게, 약 106 M-1s-1 또는 그 이상인 k온 속도로 hIL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 104 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 바람직하게, 105 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 더욱 바람직하게, 약 106 M-1s-1 또는 그 이상인 k온 속도로 시아노 IL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 10-3 s-1 (t½=0.69 s) 내지 10-6 s-1(이는 t½이 여러 일인 거의 비가역적인 복합체 제공), 바람직하게, 10-4 s-1 내지 10-6 s-1, 더욱 바람직하게, 10-5 s-1 내지 10-6 s-1, 예컨대, 약 10-5 s-1 또는 그 이하인 k오프 속도로 hIL-6R에 결합할 수 있도록, 및/또는
- 10-3 s-1 (t½=0.69 s) 내지 10-6 s-1(이는 t½이 여러 일인 거의 비가역적인 복합체 제공), 바람직하게, 10-4 s-1 내지 10-6 s-1, 더욱 바람직하게, 10-5 s-1 내지 10-6 s-1, 예컨대, 약 10-5 s-1 또는 그 이하인 k오프 속도로 시아노 IL-6R에 결합할 수 있도록 한 것이다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명은 또한 적어도 하나의 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드로 본질적으로 구성되거나, 그를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. "본질적으로 구성된다"라는 것은 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열이, 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드의 아미노 말단 단부, 카르복시 말단 단부, 또는 아미노 말단 단부 및 카르복시 말단 단부 둘 모두에 첨가된 제한된 개수의 아미노산 잔기, 예컨대, 1-20개의 아미노산 잔기, 예를 들면, 1-10개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 1-6개의 아미노산 잔기, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 잔기를 갖는 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열과 정확히 동일하거나, 또는 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드에 상응한다는 의미이다.
상기 아미노산 잔기는 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드의 (생물학적) 특성을 변화시키거나, 변경시키거나, 또는 다르게는 그에 영향을 줄 수 있거나, 그렇지 않을 수 있고, 추가의 관능성을 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드에게 부가하거나 부가하지 않을 수 있다. 예를 들면, 그러한 아미노산 잔기는:
a) 예를 들면, 이종성 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서의 발현의 결과로서, N 말단 Met 잔기를 포함할 수 있고;
b) 합성시 숙주 세포로부터의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드의 분비를 이끄는 신호 서열 또는 리더 서열을 형성할 수 있다. 적합한 분비 리더 펩티드는 숙련가에게 명백할 것이고, 본원에 추가로 기술된 바와 같다. 일반적으로, 그러한 리더 서열은 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드의 N 말단에 연결되어 있지만, 본 발명에서는 그의 가장 광범위한 의미에서 이에 제한되지 않으며;
c) 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드가 특정 기관, 조직, 세포, 또는 세포의 부분 또는 구획쪽으로 향하고/거나, 그 안으로 침투하거나, 또는 진입할 수 있도록 하고/거나, 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드가 생물학적 장벽, 예컨대, 세포막, 세포층, 예컨대, 상피 세포층, 종양(고형 종양 포함), 또는 혈뇌 장벽을 침투하거나 가로질러 통과할 수 있도록 하는 서열 또는 신호를 형성할 수 있다. 이러한 아미노산 서열의 예는 숙련가에게 명백할 것이다. 일부 비제한적인 예는 WO 03/026700 및 문헌 ([Temsamani, et al., Expert Opin. Biol. Ther., 1, 773 (2001)]; [Temsamani and Vidal, Drug Discov. Today, 9, 1012 (004)] 및 [Rousselle, J. Pharmacol. Exp. Ther., 296, 124-131 (2001)])에 기재된 작은 펩티드 벡터("펩트랜스 벡터(Pep-trans vectors)"), 문헌 [Zhao et al., Apoptosis, 8,631-637 (2003)]에 기재된 막 전위자 서열이다. 항체 단편의 세포내 표적화를 위한 C 말단 및 N 말단 아미노산 서열은 예를 들면, 문헌 [Cardinale et al., Methods, 34, 171 (2004)]에 기재되어 있다. 세포내 표적화를 위한 적합한 기법으로는 하기에 언급되는 바와 같이, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드를 포함하는 소위 "인트라바디의 발현 및/또는 사용을 포함한다;
d) 예를 들면, 서열 또는 잔기에 대해 유도되는 친화도 기법을 사용하여 아미노산 서열, 나노바디 화합물 또는 폴리펩티드의 정제를 허용하거나 촉진시키는 "태그," 예를 들면, 아미노산 서열 또는 잔기를 형성할 수 있다. 이후, 상기 서열 또는 잔기는 (예를 들면, 화학적 또는 효소적 절단에 의해) 제거됨으로써 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드가 제공될 수 있다(이러한 목적으로, 태그는 임의으로 절단가능한 링커 서열을 통해 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드 서열에 연결될 수 있거나, 절단가능한 부분을 함유할 수 있다). 이러한 잔기의 일부 바람직하지만, 비제한적인 예로는 다중 히스티딘 잔기, 글루타티온 잔기 및 myc 태그(예를 들면, AAAEQKLISEEDLNGAA (서열번호 100)이다.
e) 작용화되고/거나 작용기의 부착을 위한 부위로서 작용할 수 있는 하나 이상의 아미노산 잔기일 수 있다. 적합한 아미노산 잔기 및 작용기는 숙련가에게 명백할 것이고, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 폴리펩티드의 유도체에 대해 본원에 언급된 아미노산 잔기 및 작용기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드 및 핵산은, 본원의 추가의 개시 내용으로부터 숙련가에게 명백한 바와 같이, 자체 공지된 방식으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드는 항체의 제조, 특히 항체 단편((단일) 도메인 항체 및 ScFv 단편을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)의 제조에 대해 자체 공지된 임의의 방식으로 제조될 수 있다. 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드 및 핵산을 제조하기 위한 방법으로서 바람직하지만, 비제한적인 일부 방법으로는 본원에 기재된 방법 및 기법을 포함한다.
숙련가에게 명백한 바와 같이, 본 발명의 아미노산 서열, 아미노산 서열, 나노바디 및/또는 폴리펩티드를 제조하기 위한 방법으로서 특히 유용한 방법은 일반적으로:
- 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체(또한 본원에서 "본 발명의 숙주"로 지칭된다) 또는 또 다른 적합한 발현 시스템에서 본 발명의 상기 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산(또한 본원에서 "본 발명의 핵산"으로 지칭된다)을 발현시키는 단계; 및 임의로 후속되는
- 이렇게 수득된 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티를 단리 및/또는 정제하는 단계를 포함한다.
특히, 이러한 방법은:
- 본 발명의 숙주가 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및/또는 폴리펩티드를 적어도 하나 발현 및/또는 생산하도록 하는 조건하에서 상기 본 발명의 숙주를 배양 및/또는 유지시키는 단계; 및 임의로 후속되는
- 이렇게 수득된 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드를 단리 및/또는 정제하는 단계를 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드 또는 1가 컨스트럭트를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열(또한 본원에서 "본 발명의 핵산" 또는 "본 발명의 뉴클레오티드 서열"로 지칭된다)에 관한 것이다. 본 발명의 핵산은 싱글 또는 더블 스트랜드 DNA 또는 RNA일 수 있고, 바람직하게는 더블 스트랜드 DNA의 형태이다. 예를 들면, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 게놈 DNA, cDNA 또는 합성 DNA(예컨대, 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서의 발현을 위해 특별히 적합화된 코돈 선호도를 가진 DNA)일 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에 따라, 본 발명의 핵산은 본원에 정의된 바와 같이 본질적으로 단리된 형태이다. 본 발명의 핵산은 또한 벡터, 예를 들면, 플라스미드, 코스미드 또는 YAC의 형태이고/거나, 이에 존재하고/거나, 그의 일부일 수 있으며, 이는 다시 본질적으로 단리된 형태일 수 있다.
본 발명의 핵산은 본원에서 제공된 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및/또는 폴리펩티드에 대한 정보에 기초하여, 자체 공지된 방식으로 제조되거나 수득될 수 있고/거나, 적합한 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 또한, 숙련가에게 명백한 바와 같이, 본 발명의 핵산을 제조하기 위해, 또한 수개의 뉴클레오티드 서열, 예컨대, 아미노산 서열 또는 나노바디를 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열, 및 예를 들면, 하나 이상의 링커를 코딩하는 핵산을 함께 적합한 방식으로 연결할 수 있다.
본 발명의 핵산을 생성하기 위한 기법은 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들면, 자동화 DNA 합성; 부위 지정 돌연변이유발법; 2개 이상의 천연적으로 발생된 서열 및/또는 합성 서열(또는 그의 2개 이상의 부분)의 조합; 끝이 절단된 발현 생성물의 발현을 유도하는 돌연변이의 도입; 하나 이상의 제한 부위의 도입(예를 들면, 적합한 제한 효소를 사용하여 쉽게 분해 및/또는 결찰될 수 있는 카세트 및/또는 부휘를 생성하기 위한 것), 및/또는 하나 이상의 "미스매치된" 프라이머를 사용하는 PCR 반응에 의한 돌연변이의 도입을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 이들 및 다른 기법은 숙련가에게 명백할 것이고, 다시 표준 편람, 예컨대, 상기 언급된 문헌 [Sambrook et al., and Ausubel et al.] 뿐만 아니라, 하기 실시예를 참조한다.
본 발명의 핵산은 또한, 당업계의 숙련가에게 명백한 바와 같이, 유전자 컨스트럭트의 형태일 수 있고, 그에 존재하고/거나, 그의 일부일 수 있다. 일반적으로, 그러한 유전자 컨스트럭트는, 임의로는 자체 공지된 유전자 컨스트럭트의 하나 이상의 요소, 예컨대, 하나 이상의 적합한 조절 요소(예컨대, 적합한 프로모터(들), 인핸서(들), 터미네이터(들) 등) 및 본원에 지칭된 유전자 컨스트럭트의 추가의 요소에 연결되어 있는 적어도 하나의 본 발명의 핵산을 포함한다. 적어도 하나의 본 발명의 핵산을 포함하는 이러한 유전자 컨스트럭트는 또한 본원에서 "본 발명의 유전자 컨스트럭트"로서 지칭될 것이다.
본 발명의 유전자 컨스트럭트는 DNA 또는 RNA일 수 있고, 바람직하게는 더블 스트랜드 DNA이다. 본 발명의 유전자 컨스트럭트는 또한 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체의 형질전환에 적합한 형태, 의도된 숙주 세포의 게놈 DNA 내로의 통합에 적합한 형태, 또는 의도된 숙주 유기체에서의 독립적인 복제, 유지 및/또는 승계에 적합한 형태일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 유전자 컨스트럭트는 벡터, 예컨대, 플라스미드, 코스미드, YAC, 바이러스성 벡터 또는 트랜스포손의 형태일 수 있다. 특히, 벡터는 발현 벡터, 즉, 시험관내 및/또는 생체내에서(예를 들면, 적합한 숙주 세포, 숙주 유기체 및/또는 발현 시스템에서)의 발현을 제공할 수 있는 벡터일 수 있다.
바람직하지만, 비제한적인 실시양태에서, 본 발명의 유전자 컨스트럭트는
a) 하기 b) 및 임의로는 c)에 임의로 연결되어 있는, 적어도 하나의 본 발명의 핵산;
b) 하나 이상의 조절 요소, 예컨대, 프로모터 및 임의로는 적합한 터미네이터; 및 임의로는 또한
c) 자체 공지된 유전자 컨스트럭트의 하나 이상의 추가의 요소를 포함하고;
여기서, "조절 요소," "프로모터," "터미네이터" 및 "작동가능하게 연결"이라는 용어는 당업계에서의 그의 일반적인 (본원에 추가로 기재된 바와 같은) 의미를 가지고; 여기서, 유전자 컨스트럭트에 존재하는 상기 "추가의 요소"는 예를 들면, 3'- 또는 5'-UTR 서열, 리더 서열, 선별 마커, 발현 마커/리포터 유전자, 및/또는 형질전환 또는 통합(의 유효성)을 촉진시키거나 증가시킬 수 있는 요소일 수 있다. 그러한 유전자 컨스트럭트에 적합한 이들 및 다른 요소는 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들면, 사용된 컨스트럭트의 유형, 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체, 관심의 대상이 되는 본 발명의 뉴클레오티드 서열이 (예를 들면, 구성적, 일시적 또는 유도적인 발현을 통해) 발현되는 방식; 및/또는 사용된 형질전환 기법에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 항체 및 항체 단편((단일) 도메인 항체 및 ScFv 단편을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)의 발현 및 생산을 위해 자체 공지된 조절 서열, 프로모터 및 터미네이터가 본질적으로 유사한 방식으로 사용될 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 유전자 컨스트럭트에서, 상기의 적어도 하나의 본 발명의 핵산 및 상기 조절 요소, 및 임의로 상기의 하나 이상의 추가의 요소는 서로 "작동가능하게 연결"되어 있고, 이는 일반적으로 이들이 서로에 대해 작용적 관계에 있음을 의미한다. 예를 들면, 프로모터가 코딩 서열의 전사 및/또는 발현을 개시하거나, 또는 다르게는 제어/조절할 수 있다면, 이러한 프로모터는 코딩 서열에 "작동가능하게 연결"되어 있는 것으로 간주된다(여기서, 상기 코딩 서열은 상기 프로모터의 "제어하"에 있는 것으로 이해되어야 한다). 일반적으로, 2개의 뉴클레오티드 서열이 작동가능하게 연결되어 있는 경우, 이들은 동일한 배향에 놓이고, 일반적으로는 또한 동일한 리딩 프레임에 있을 것이다. 반드시 필요한 것은 아니지만, 이들은 일반적으로는 본질적으로 인접해 있을 것이다.
바람직하게는, 유전자 컨스트럭트의 조절 및 추가의 요소는 그가 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 그의 의도된 생물학적 기능을 제공할 수 있도록 한다.
예를 들면, 프로모터, 인핸서 또는 터미네이터는 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 "작동가능"해야 하고, 이는 (예를 들면) 상기 프로모터가 (본원에 정의된 바와 같이) 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열, 예컨대, 코딩 서열의 전사 및/또는 발현을 개시하거나, 또는 다르게는 제어/조절할 수 있어야 함을 의미한다.
특히 바람직한 일부 프로모터로는, 본원에 언급된 숙주 세포에서의 발현을 위한 자체 공지된 프로모터; 특히 세균 세포에서의 발현을 위한 프로모터, 예컨대, 본원에 언급되고/거나 실시예에서 사용된 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
선별 마커는, 적절한 선택 조건하에서 본 발명의 뉴클레오티드 서열로 (성공적으로) 형질전환된 숙주 세포 및/또는 숙주 유기체가 (성공적으로) 형질전환되지 않은 숙주 세포/유기체와 구별될 수 있도록 하여야 한다. 이러한 마커의 바람직하지만, 비제한적인 일부 예로는 항생제(예컨대, 카나마이신 또는 암피실린)에 내성을 제공하는 유전자, 내온성을 제공하는 유전자, 또는 숙주 세포 또는 숙주 유기체가 형질전환되지 않은 세포 또는 유기체의 생존에 필수적인 특정 인자, 화합물 및/또는 (식품) 성분이 배지 중에 존재하지 않는 경우 유지될 수 있도록 허용하는 유전자이다.
리더 서열은 (의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서) 원하는 번역후 변형을 허용가고/거나, 전사된 mRNA가 세포의 원하는 부분 또는 세포기관을 향하도록 해야 한다. 리더 서열은 또한 상기 세포로부터 발현 생성물이 분비되는 것을 허용할 수 있다. 따라서, 리더 서열은 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 작동가능한 임의의 프로, 프리 또는 프리프로 서열일 수 있다. 리더 서열은 세균 세포에서 발현을 위해 반드시 필요한 것은 아닐 수 있다. 예를 들면, 항체 및 항체 단편(단일 도메인 항체 및 ScFv 단편을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)의 발현 및 생산을 위해 자체 공지의 리더 서열은 본질적으로 유사한 방식으로 사용될 수 있다.
발현 마커 또는 리포터 유전자는 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 유전자 컨스트럭트 (상에 존재하는 유전자 또는 뉴클레오티드 서열)의 발현을 검출할 수 있도록 해야 한다. 발현 마커는 임의로는 또한 발현된 생성물의 편재화를, 예컨대, 세포의 특정 부분 또는 세포기관 및/또는 다세포 유기체의 특정 세포(들), 조직(들), 기관(들) 또는 부분(들)에서 허용할 수 있다. 이러한 리포터 유전자는 또한 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드과의 단백질 융합물로서 발현될 수 있다. 일부 바람직하지만, 비제한적인 예로는 형광 단백질, 예컨대, GFP를 포함한다.
적합한 프로모터, 터미네이터 및 추가의 요소의 바람직하지만, 비제한적인 일부 예로는 본원에 언급된 숙주 세포에서의 발현을 위해 사용될 수 있는 것들, 특히 세균 세포에서의 발현에 적합한 것들, 예컨대, 본원에 언급된 것들 및/또는 하기 실시예에 사용된 것들을 포함한다. 프로모터, 선별 마커, 리더 서열, 발현 마커 및 본 발명의 유전자 컨스트럭트에 존재하고/사용될 수 있는 추가의 요소-예컨대, 터미네이터, 전사 및/또는 번역 인핸서 및/또는 통합 인자-의 (추가의) 일부 비제한적인 예를 위해, 표준 편람, 예컨대, 상기 언급된 문헌 [Sambrook et al.,] 및 [Ausubei, et al.,] 뿐만 아니라, WO 95/07463, WO 96/23810, WO 95/07463, WO 95/21191, WO 97/11094, WO 97/42320, WO 98/06737, WO 98/21355, US 7,207,410, US 5,593,492 및 EP 1085089에 기술되어 있는 실시예를 참조한다. 다른 예는 숙련가에게 명백할 것이다. 또한 상기 인용된 일반적 배경 기술 및 본원에 인용된 추가의 문헌을 참조한다.
본 발명의 유전자 컨스트럭트는 일반적으로 예를 들면, 표준 편람, 예컨대, 상기 언급된 문헌 [Sambrook et al.] 및 문헌 [Ausubel et al.]에 기재된 기법을 사용하여 본 발명의 뉴클레오티드 서열(들)을 상기 기재된 하나 이상의 추가의 요소에 적합하게 연결시킴으로써 제공될 수 있다.
종종, 본 발명의 유전자 컨스트럭트는 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 자체 공지된 적합한 (발현) 벡터에 삽입함으로써 수득될 것이다. 적합한 발현 벡터에 대한 바람직하지만, 비제한적인 일부 예는 하기 실시예에 사용된 벡터 뿐만 아니라, 본원에 언급된 벡터이다.
본 발명의 핵산 및/또는 본 발명의 유전자 컨스트럭트는 숙주 세포 또는 숙주 유기체를 형질전환시키기 위해, 즉, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드의 발현 및/또는 생산을 위해 사용될 수 있다. 적합한 숙주 또는 숙주 세포는 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들면, 임의의 적합한 진균 세포, 원핵 세포 또는 진핵 세포 또는 세포주, 또는 임의의 적합한 진균 유기체, 원핵 유기체 또는 진핵 유기체, 예를 들면:
- 세균 균주(제한하는 것은 아니지만, 그람 음성 균주, 예컨대, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 균주; 프로테우스(Proteus) 균주, 예를 들면, 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 균주; 슈도모나스(Pseudomonas) 균주, 예를 들면, 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens) 균주; 및 그람 양성 균주, 예컨대, 바실러스(Bacillus) 균주, 예를 들면, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 바실러스 브레비스(Bacillus brevis) 균주; 스트렙토마이세스(Streptomyces) 균주, 예를 들면, 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 균주; 스타필로코커스(Staphylococcus) 균주, 예를 들면, 스타필로코커스 카르노서스(Staphylococcus carnosus) 균주; 및 락토코커스(Lactococcus) 균주, 예를 들면, 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주 포함);
- 진균 세포(제한하는 것은 아니지만, 예를 들면, 트리코더마(Trichoderma) 종, 예를 들면, 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei); 뉴로스포라(Neurospora) 종, 예를 들면, 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 소르다르아(Sordaria) 종, 예를 들면, 소르다리아 마크로스포라(Sordaria macrospora); 아스퍼길러스(Aspergillus) 종, 예를 들면, 아스퍼길러스 니거(Aspergillus niger) 또는 아스퍼길러스 소제(Aspergillus sojae); 또는 다른 섬유상 진균으로부터의 세포 포함);
- 효모 세포(제한하는 것은 아니지만, 예를 들면, 사카로마이세스(Saccharomyces), 예를 들면, 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae); 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 예를 들면, 스키조사카로마이세스폼베(Schizosaccharomyces pombe); 피키아(Pichia), 예를 들면, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 피키아 메탄올리카(Pichia methanolica); 한세눌라(Hansenula), 예를 들면, 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 예를 들면, 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis); 아르슐라(Arxula), 예를 들면, 아르슐라 아데니니포란스(Arxula adeninivorans); 야로위아(Yarrowia), 예를 들면, 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 종으로부터의 세포 포함);
- 양서류 세포 또는 세포주, 예컨대, 제노퍼스(Xenopus) 난모세포;
- 곤충 유래 세포 또는 세포주, 예컨대, 인시류로부터 유래된 세포/세포주(제한하는 것은 아니지만, 스포돕테라(Spodoptera) SF9 및 Sf21 세포, 또는 드로소필라(Drosophila)로부터 유도된 세포/세포주, 예컨대, 슈나이더(Schneider) 및 Kc 세포 포함);
- 식물 또는 식물 세포, 예를 들면, 담배 식물; 및/또는
- 포유동물 세포 또는 세포주, 예를 들면, 인간으로부터 유래된 세포 또는 세포주, 포유동물로부터의 세포 또는 세포주(제한하는 것은 아니지만, 예를 들면, CHO 세포, BHK 세포(예를 들면, BHK-21 세포) 포함) 및 인간 세포 또는 세포주, 예컨대, HeLa, COS(예를 들면, COS-7) 및 PER.C6 세포 뿐만 아니라, 항체 및 항체 단편((단일) 도메인 항체 및 ScFv 단편을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)의 발현 및 생산을 위해 자체 공지된 다른 숙주 또는 숙주 세포(이는 숙련가에게 명백할 것임)이다. 또한 본원에 상기 인용된 일반적 배경 기술 뿐만 아니라, 예를 들면, WO 94/29457, WO 96/34103, WO 99/42077, 문헌 ([Frenken et al., (1998, Res. Immunol. 149(6):589-99)], [Riechmann and Muyldermans (1999, J. Immunol. Methods, 231(1-2):25-38)], [van der Linden (2000, J. Biotechnol. 80(3):261-70)], [Joosten et al., (2003, Microb. Cell. Fact. 2(1):1)], [Joosten et al., (2005, Appl. Microbiol. Biotechnol. 66(4):384-92)]), 및 본원에 인용된 추가의 문헌을 참조한다.
본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드는 또한 다세포 유기체의 하나 이상의 세포, 조직 또는 기관에서, 예를 들면, 예방적 및/또는 치료학적 목적을 위해(예를 들면, 유전자 치료법으로서) 도입되고 발현될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 임의의 적합한 방식으로, 예를 들면, 그 자체로서(예를 들면,리포솜을 사용하여) 또는 이들이 (예를 들면, 레트로바이러스, 예컨대, 아데노바이러스, 또는 파라보바이러스, 예컨대, 아데노 연관 바이러스로부터 유도된) 적합한 치료 벡터 내로 삽입된 후, 세포 또는 조직 내로 도입될 수 있다. 또한 숙련가에게 명백한 바와 같이, 이러한 유전자 치료법은 본 발명의 핵산 또는 이를 코딩하는 적합한 유전자 치료 벡터를 환자, 또는 환자의 특정 세포 또는 특정 조직 또는 기관에 투여함으로써 환자의 신체내 동소에서 및/또는 생체내에서 수행될 수 있거나; 또는 적합한 세포(종종 치료하고자 하는 환자의 신체, 예컨대, 외식된 임파구, 골수 흡인물 또는 조직 생검으로부터 채취된 것)는 본 발명의 뉴클레오티드 서열로 시험관내에서 처리된 다음 환자의 신체내로 적합하게 (재)도입될 수 있다. 이들 모두는 숙련가에게 주지된 유전자 치료 벡터, 기법 및 전달 시스템을 사용하여 수행될 수 있고, 예를 들면, 문헌 ([Culver K. W. (1994, "Gene Therapy", p. xii, Mary Ann Liebert, Inc., Publishers, New York, N.Y)], [Giordano (1996, Nature F Medicine 2:534-539)], [Schaper (1996, Circ. Res. 79:911-919)], [Anderson (1992, Science 256:808-813)], [Verma (1994, Nature 389:239)], [Isner (1996, Lancet 348:370-374)], [Muhlhauser (1995, Circ. Res. 77:1077-1086)], [Onodera (1998, Blood 91:30-36)], [Verma (1998, Gene Ther. 5:692-699)], [Nabel (1997, Ann. N.Y. Acad. Sci., 811:289-292)], [Verzeletti (1998, Hum. Gene Ther. 9:2243-51)], [Wang 1996, Nature Medicine 2:714-716)], WO 94/29459, WO 97/00957, US 5,580,859, 또는 [Schaper (1996, Current Opinion in Biotechnology 7:635-640)])에 기재되어 있다. 예를 들면, ScFv 단편의 동소 발현(문헌 [Afanasieva et al., (2003 Gene Ther, 10:1850-1859]) 및 디아바디의 동소 발현(문헌 [Blanco et al., 2003, J. Immunol., 171:1070-1077])은 당업계에 기술되어 있다.
세포에서의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드의 발현을 위해, 이들은 또한, 예를 들면, WO 94/02610, WO 95/22618, US 7,004,940, WO 03/014960, 문헌 ([Cattaneo A and Biocca S. (1997 intracellular Antibodies: Deveiopment and Applications Landes and Springer Verlag)] 및 [Kontermann (2004, Methods 34:163-170)])에 기술되어 있는 바와 같이, 소위 "인트라바디"로서 발현될 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드는 예를 들면, 트랜스제닉 포유동물에서의 유즙, 예를 들면, 토끼, 소, 염소 또는 양의 유즙에서(포유동물내로 트랜스진을 도입하기 위한 일반적 기법에 관해서는 예를 들면, US 6,741,957, US 6,304,489 및 US 6,849,992를 참조), 식물 또는 식물의 부분(제한하는 것은 아니지만, 예를 들면, 그의 잎, 꽃, 과일, 씨앗, 뿌리 또는 구근(예를 들면, 담배, 옥수수, 대두 또는 알파파(alfalfa))에서)), 또는 예를 들면, 누에 봄빅스 모리(Bombix mori)의 번데기에서 생산될 수 있다.
추가로, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드는 또한 무세포 발현 시스템에서 발현 및/또는 생산될 수 있고, 이러한 시스템의 적합한 예는 숙련가에게 명백할 것이다. 바람직하지만, 비제한적인 일부 예로는 맥아 시스템, 토끼 망상적혈구 용해물 또는 E. 콜라이 주베이(Zubay) 시스템에서의 발현을 포함한다.
상기 언급된 바와 같이, 나노바디 사용의 이점 중 하나는 이에 기초한 폴리펩티드가 적합한 세균 시스템에서의 발현을 통해 제조될 수 있다는 점이고, 적합한 세균 발현 시스템, 벡터, 숙주 세포, 조절 요소 등은 상기 인용된 문헌으로부터 숙련가에게 명백할 것이다. 그러나, 본 발명은 그의 가장 광범위한 의미에서 세균 시스템에서의 발현에 제한되지 않음을 주지해야 한다.
바람직하게, 본 발명에서는 약제학적 용도에 적합한 형태로 본 발명의 폴리펩티드를 제공하는 (생체내 또는 시험관내) 발현 시스템, 예컨대, 세균 발현 시스템이 사용되고, 이러한 발현 시스템은 다시 숙련가에게 명백할 것이다. 또한 숙련가에게 명백한 바와 같이, 약제학적 용도에 적합한 본 발명의 폴리펩티드는 펩티드 합성을 위한 기법을 사용하여 제조될 수 있다.
산업적 규모로 생산하기 위해, 나노바디 또는 나노바디 함유 단백질 치료제의 (산업적) 생산을 위한 바람직한 이종성 숙주로는 대규모 발현/생산/발효, 특히 대규모 약제학적 발현/생산/발효에 적합한 E. 콜라이, 피키아 파스토리스, S. 세레비지에(S. cerevisiae) 균주를 포함한다. 이러한 균주의 적합한 예는 숙련가에게 명백할 것이다. 이러한 균주 및 생산/발현 시스템 또한 바이오비트룸(Biovitrum)(스웨덴 웁살라 소재)과 같은 회사에 의해 입수가능하다.
별법으로, 포유동물 세포주, 특히, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포는 대규모 발현/생산/발효, 특히, 대규모 약제학적 발현/생산/발효에 사용될 수 있다. 추가로, 이러한 발현/생산/발효 시스템은 또한 상기 언급된 일부 회사에 의해 입수가능하다.
특정 발현 시스템을 선택하는 것은 부분적으로는 특정 번역후 변형, 보다 구체적으로 글리코실화를 위한 요건에 따라 달라질 것이다. 글리코실화가 요망되거나 요구되는 나노바디 함유 재조합 단백질의 생산은 발현된 단백질을 글리코실화할 수 있는 포유동물 발현 숙주의 사용을 필요로 할 것이다. 이와 관련하여, 수득된 글리코실화 패턴(즉, 부착된 잔기의 종류, 개수 및 위치)은 발현에 사용된 세포 또는 세포주에 따라 달라질 것이라는 것은 숙련가에게 명백할 것이다. 바람직하게는, 인간 세포 또는 세포주가 사용되거나(즉, 본질적으로 인간 글리코실화 패턴을 갖는 단백질을 유도하는 것), 또는 본질적으로 및/또는 기능적으로 인간 글리코실화와 동일하거나 적어도 인간 글리코실화를 모사하는 글리코실화 패턴을 제공할 수 있는 또 다른 포유동물 세포주가 사용된다. 일반적으로, 원핵 숙주, 예컨대, E. 콜라이는 단백질을 글리코실화할 수 있는 능력이 없고, 하등 진핵 생물, 예컨대, 효모를 사용할 경우, 일반적으로는 인간 글리코실화와 상이한 글리코실화 패턴이 유도된다. 그럼에도 불구하고, 모든 이전의 숙주 세포 및 발현 시스템은 수득하고자 하는 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드에 따라 본 발명에 사용될 수 있음을 이해하여야 한다.
따라서, 본 발명의 비제한적인 한 실시양태에 따라, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드는 글리코실화된다. 본 발명의 또 다른 비제한적인 실시양태에 따라, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드는 비글리코실화된다.
본 발명의 바람직하지만, 비제한적인 실시양태에 따라, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드는 세균 세포, 특히 대규모 약제학적 생산에 적합한 세균 세포, 예컨대, 상기 본원에 언급된 세포 균주에서 생산된다.
본 발명의 바람직하지만, 비제한적인 또 다른 실시양태에 따라, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드는 효모 세포, 특히 대규모 약제학적 생산에 적합한 효모 세포, 예컨대, 상기 본원에 언급된 종의 세포에서 생산된다.
본 발명의 바람직하지만, 비제한적인 추가의 또 다른 실시양태에 따라, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드는 포유동물 세포, 특히 인간 세포 또는 인간 세포주의 세포, 및 더욱 특히, 대규모 약제학적 생산에 적합한 인간 세포 또는 인간 세포주의 세포, 예컨대, 상기 본원에 언급된 세포주에서 생산된다.
본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드를 제조하는 데 숙주 세포에서의 발현이 사용되는 경우, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드는 세포내에서 생산되고(예를 들면, 시토졸, 주변 세포질 또는 봉입체 내에서), 이어서 숙주 세포로부터 단리되고, 임의로는 추가로 정제될 수 있거나; 또는 세포외에서 생산되고(예를 들면, 숙주 세포가 배양되는 배지 중에서)), 이어서 배양 배지로부터 단리되고, 임의로는 추가로 정제될 수 있다. 진핵 숙주 세포가 사용될 경우, 세포외 생산이 대체적으로 바람직한데, 그 이유는 이것이 수득된 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드 및 단백질의 추가의 단리 및 하류 공정과정을 상당부 촉진시키기 때문이다. 세균 세포, 예컨대, 상기 언급된 E. 콜라이 균주는 보통 몇몇 부류의 단백질, 예컨대, 독소 및 용혈소를 제외하고는 단백질을 세포외로 배출하지 않으며, E. 콜라이에서의 분비 생산은 내막을 가로질러 주변 세포질 공간으로 단백질을 전위시키는 것이다. 주변 세포질 생산은 시토졸 생산에 비하여 우수한 여러 이점을 제공한다. 예를 들면, 분비된 생성물의 N 말단 아미노산 서열은 특이적인 신호 펩티다제에 의한 분비 신호 서열의 절단 이후에 천연 유전자 생성물과 동일할 수 있다. 또한, 세포질보다는 주변 세포질에서 훨씬 더 작은 프토레자에 활성을 나타낸다. 또한, 단백질 정제는 주변 세포질에 오염 단백질이 더 적기 때문에 더 간단하게 이루어질 수 있다. 또 다른 이점은 주변 세포질이 세포질에 비하여 보다 산화적인 환경을 제공하므로 정확한 이황화 결합이 형성될 수 있다는 점이다. 종종 E. 콜라이에서 과발현된 단백질이 소위 봉입체라고 불리는 불용성 응집체에서 발견된다. 이들 봉입체는 시토졸 또는 주변 세포질에 위치할 수 있고; 이들 봉입체로부터 생물학적 활성 단백질을 회수하기 위해서는 변성/리폴딩 과정이 필요하다. 치료학적 단백질을 비롯한 많은 재조합 단백질은 봉입체로부터 회수된다. 별법으로, 숙련가에게 명백한 바와 같이, 원하는 단백질, 특히, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드를 분비하도록 유전자적으로 변형된 세균의 재조합 균주가 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 비제한적인 한 실시양태에 따라, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드는 세포내에서 생산되고, 숙주 세포, 특히, 세균 세포 또는 세균 세포 중의 봉입체로부터 단리된 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드이다. 본 발명의 또 다른 비제한적인 실시양태에 따라, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드는 세포외에서 생산되고, 숙주 세포가 배양되는 배지로부터 단리된 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드이다.
이러한 숙주 세포와 함께 사용하기에 바람직하지만, 비제한적인 일부 프로모터로는,
- E. 콜라이에서의 발현을 위해: lac 프로모터(및 그의 유도체, 예컨대, lacUV5 프로모터); 아라비노스 프로모터; 파지 람다의 좌향(PL) 및 우향(PR) 프로모터; trp 오페론의 프로모터; 하이브리드 lac/trp 프로모터(tac 및 trc); T7 프로모터(더욱 구체적으로 T7 파지 유전자 10의 프로모터) 및 다른 T 파지 프로모터; Tn10 테트라사이클린 내성 유전자의 프로모터; 외인성 조절 오퍼레이터 서열의 하나 이상의 카피를 포함하는 상기 프로모터의 조작된 변이체;
- S. 세레비지아에에서의 발현을 위해: 구성적 프로모터: ADH1(알콜 데히드로게나제 1), ENO(에놀라아제), CYC1(시토크롬 c 이소 1), GAPDH(글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제: glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase), PGK1(포스포글리세레이트 키나제: phosphoglycerate kinase), PYK1(피루베이트 키나제); 조절성 프로모터: GAL1,10,7(갈락토스 대사 효소), ADH2(알콜 데히드로게나제 2: alcohol dehydrogenase 2), PHO5(산 포스파타제), CUP1(구리 메탈로티오네인); 이종성 프로모터: CaMV(콜리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터);
- 피키아 파스토리스에서의 발현을 위해: AOX1 프로모터(알올 옥시다제 I);
- 포유동물 세포에서의 발현을 위해: 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV: 인간 cytomegalovirus) 조기 반응 인핸서/프로모터; 프로모터가 Tet 리프레서에 의해 조절될 수 있도록 2개의 테트라사이클린 오퍼레이터 서열을 함유하여 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV) 조기 반응 프로모터 변이체; 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제(TK: thymidine kinase) 프로모터; 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복부(RSV LTR: Rous Sarcoma Virus long terminal repeat) 인핸서/프로모터; 인간, 침팬지, 마우스 또는 래트로부터 유래된 신장 인자 1α(hEF-1α) 프로모터; SV40 조기 프로모터; HIV-1 긴 말단 반복부 프로모터; β 액틴 프로모터를 포함한다.
이러한 숙주 세포와 함께 사용하기에 바람직하지만, 비제한적인 일부 프로모터로는,
- 포유동물 세포에서의 발현을 위한 벡터: pMAM네오(Clontech), pcDNA3(Invitrogen), pMC1네오(Stratagene), pSG5(Stratagene), EBO-pSV2-네오(ATCC37593), pBPV-1(8-2)(ATCC37110), pdBPV-MMT네오(342-12)(ATCC37224), pRSVgpt(ATCC37199), pRSV네오(ATCC37198), pSV2-dhfr(ATCC 37146), pUCTag(ATCC37460) 및 1ZD35(ATCC37565) 뿐만 아니라, 바이러스 기재의 발현 시스템, 예컨대, 아데노바이러스에 기초한 시스템;
- 세균 세포에서의 발현을 위한 벡터: pET 벡터(Novagen) 및 pQE 벡터(Qiagen);
- 효모 또는 다른 진균 세포에서의 발현을 위한 벡터: pYES2(Invitrogen) 및 피키아 발현 벡터(Invitrogen);
- 곤충 세포에서의 발현을 위한 벡터: pBlueBacII(Invitrogen) 및 다른 바큘로바이러스 벡터;
- 식물 또는 식물 세포에서의 발현을 위한 벡터: 예를 들면, 콜리플라워 모자이크 바이러스 또는 담배 모자이크 바이러스, 아그로박테리움(Agrobacterium)의 적합한 균주에 기초한 벡터, 또는 Ti 플라스미드에 기초한 벡터를 포함한다.
이러한 숙주 세포와 함께 사용하기에 바람직하지만, 비제한적인 일부 분비 서열로는,
- 세균 세포, 예컨대, E. 콜라이에서 사용하기 위해: PelB, Bla, OmpA, OmpC, OmpF, OmpT, StII, PhoA, PhoE, MalE, Lpp, LamB 등; TAT 신호 펩티드, 용혈소 C 말단 분비 신호;
- 효모에서 사용하기 위해: α 교배 인자 프리프로 서열, 포스파타제(pho1), 인버타제(Sue) 등;
- 포유동물 세포에서 사용하기 위해: 표적 단백질이 진핵생물 기원인 경우, 고유의 신호; 뮤린 Igκ 쇄 V-J2-C 신호 펩티드 등을 포함한다.
본 발명의 숙주 또는 숙주 세포를 형질전환하기에 적합한 기법은 숙련가에게 명백할 것이고, 의도된 숙주 세포/숙주 유기체 및 사용되는 유전자 컨스트럭트에 따라 달라질 수 있다. 추가로, 상기 언급된 편람 및 특허 출원을 참조한다.
형질전환 후, 본 발명의 뉴클레오티드 서열/유전자 컨스트럭트로 성공적으로 형질전환된 이들 숙주 세포 또는 숙주 유기체를 검출 및 선별하는 단계를 수행할 수 있다. 이는 예를 들면, 본 발명의 유전자 컨스트럭트에 존재하는 선별가능한 마커에 기초한 선별 단계, 또는 본 발명의 아미노산 서열의 검출을 포함하는 단계(예를 들면, 특이적 항체를 사용함으로써 이루어지는 단계)일 수 있다.
형질전환된 숙주 세포(이는 안정한 세포주 형태일 수 있다) 또는 숙주 유기체(이는 안정한 돌연변이주 또는 균주의 형태일 수 있다)는 본 발명의 추가의 측면을 형성한다.
바람직하게는, 이러한 숙주 세포 또는 숙주 유기체는 이들이 (예를 들면, 적합한 조건하에서) (숙주 유기체의 경우, 적어도 하나의 그의 세포, 부분, 조직 또는 기관에서) 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드를 발현하거나, 또는 (적어도) 발현할 수 있도록 한다. 본 발명은 또한 추가로 세포 분열 또는 유성 또는 무성 생식에 의해 수득될 수 있는, 본 발명의 숙주 세포 또는 숙주 유기체의 세대, 자손 및/또는 자식을 포함한다.
본 발명의 아미노산 서열의 발현을 생산/수득하기 위해, 형질전환된 숙주 세포 또는 형질전환된 숙주 유기체는 일반적으로 본 발명의 (원하는) 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드가 발현/생산되는 조건하에서 보존, 유지 및/또는 배양될 수 있다. 적합한 조건은 숙련가에게 명백할 것이고, 일반적으로는 사용되는 숙주 세포/숙주 유기체 뿐만 아니라, (관련된) 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 발현을 제어하는 조절 요소에 따라 달라질 것이다. 추가로, 본 발명의 유전자 컨스트럭트에 대한 문단에서 상기 언급된 편람 및 특허 출원을 참조한다.
일반적으로, 적합한 조건으로는 적합한 배지의 사용, 적합한 식품 공급원 및/또는 적합한 영양분의 존재, 적합한 온도의 사용, 및 임의로는 적합한 유도 인자 또는 화합물의 존재(예를 들면, 본 발명의 뉴클레오티드 서열이 유도성 프로모터의 제어하에 있는 경우)를 포함할 수 있고; 이들 모두는 숙련가에 의해 선택될 수 있다. 추가로, 이러한 조건하에서 본 발명의 아미노산 서열은 구성적 방식으로, 일시적 방식으로, 또는 단지 적합하게 유도될 경우에만 발현될 수 있다.
또한, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드가 (먼저) (상기 언급된 바와 같은) 미성숙 형태로 발생된 후, 이어서, 사용된 숙주 세포/숙주 유기체에 따라 번역후 변형을 거칠 수 있다는 것이 숙련가에게는 명백할 것이다. 또한, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드는 또 다시 사용된 숙주 세포/숙주 유기체에 따라 글리코실화될 수 있다.
이어서, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드는 자체 공지된 단백질 단리 및/또는 정제 기법, 예컨대, (분취용) 크로마토그래피 및/또는 전기영동 기법, 분별 침전 기법, 친화도 기법(예를 들면, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드와 융합된 특이적인 절단가능한 아미노산 서열 사용) 및/또는 분취용 면역학적 기법(즉, 단리하고자 하는 아미노산 서열에 대한 항체 사용)을 사용함으로써 숙주 세포/숙주 유기체로부터 및/또는 상기 숙주 세포 또는 숙주 유기체가 배양된 배지로부터 단리될 수 있다.
일반적으로, 약제학적 용도를 위해 본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드를 적어도 하나 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 애주번트, 및 임의로는 하나 이상의 추가의 약제학적으로 활성인 폴리펩티드 및/또는 화합물을 포함하는 약제학적 제제 또는 조성물로서 제형화될 수 있다. 비제한적 예로서, 상기와 같은 제형은 경구 투여용, 비경구 투여용(예컨대, 정맥내, 근육내 또는 피하 투여 또는 정맥 주입에 의해), 국소 투여용, 흡입, 피부 패치, 임플란트, 좌제 등에 의한 투여용으로서 적합한 형태일 수 있다. 상기와 같은 적합한 투여 형태-이는 투여 방식에 따라 고체, 반고체 또는 액체일 수 있다-뿐만 아니라, 그의 제조에 사용하기 위한 방법 및 담체는 숙련가에게 명백할 것이고, 이는 추가로 본원에 기술되어 있다.
따라서, 추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 아미노산을 적어도 하나, 본 발명의 나노바디를 적어도 하나 또는 본 발명의 폴리펩티드를 적어도 하나 및 적어도 하나의 적합한 담체, 희석제 또는 부형제(즉, 약제학적 용도로 적합한 것), 및 임의로는 하나 이상의 추가의 활성 물질을 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다. 특정 측면에서, 본 발명은 서열번호 70 및 적어도 하나의 적합한 담체, 희석제 또는 부형제(즉, 약제학적 용도로 적합한 것), 및 임의로는 하나 이상의 추가의 활성 물질을 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다. 또 다른 특정 측면에서, 본 발명은 서열번호 71 및 적어도 하나의 적합한 담체, 희석제 또는 부형제(즉, 약제학적 용도로 적합한 것), 및 임의로는 하나 이상의 추가의 활성 물질을 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.
일반적으로, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드는 자체 공지된 임의의 적합한 방식으로 제형화되고, 투여될 수 있으며, 이를 위해 예를 들면, 상기 인용된 일반 배경 기술(특히 WO 04/041862, WO 04/041863, WO 04/041865 및 WO 04/041867) 뿐만 아니라, 표준 편람, 예컨대, 문헌 ([Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed, Mack Publishing Company, USA (1990)] 또는 [Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005)])을 참조한다.
예를 들면, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드는 종래의 항체 및 항체 단편(ScFv 및 디아바디 포함) 및 다른 약제학적으로 활성인 단백질에 대해 자체 공지된 임의의 적합한 방식으로 제형화되고 투여될 수 있다. 이러한 제형 및 제조 방법은 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들면, 비경구 투여(예를 들면, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 내강내, 동맥내 또는 척추강내 투여) 또는 국소(즉, 경피 또는 진피내) 투여용으로 적합한 제제를 포함한다.
비경구 투여용 제제는 예를 들면, 주입 또는 주사에 적합한 멸균 용액, 현탁액, 분산액 또는 에멀젼일 수 있다. 이러한 제제에 적합한 담체 또는 희석제로는, 예를 들면, 멸균수 및 수성 완충액 및 용액, 예컨대, 생리학적 포스페이트 완충처리된 염수, 링거액(Ringer's solutions), 덱스트로스 용액, 및 행크 용액 (Hank's solution); 워터 오일; 글리세롤; 에탄올; 글리콜, 예컨대, 프로필렌 글리콜 뿐만 아니라, 광유, 동물유 및 식물유, 예를 들면, 땅콩유, 대두유 뿐만 아니라, 그의 적합한 혼합물을 포함한다. 일반적으로, 수성 용액 또는 현탁액이 바람직할 것이다.
본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드는 전달 유전자 치료 방법을 사용하여 투여될 수도 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,399,346호를 참조할 수 있다(이는 그 전문이 본원에 참고로 인용된다). 전달 유전자 치료 방법을 사용하여, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로 형질감염된 1차 세포는 추가로 표적 특이적 기관, 조직, 이식편, 종양 또는 세포에 조직 특이적인 프로모터로 형질감염되고, 추가로 세포하에 위치하는 발현을 위한 신호 및 안정화 서열로 형질감염될 수 있다.
따라서, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드는 약제학적으로 허용되는 비히클, 예컨대, 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체와 함께 조합되어 전신, 예를 들면, 경구적으로 투여될 수 있다. 이들은 경질 또는 연질 막 젤라틴 캡슐내로 봉입되거나, 정제로 압축되거나, 환자 식이 식품에 직접 혼입될 수 있다. 경구를 통한 치료학적 투여를 위해, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드는 하나 이상의 부형제와 조합되어, 섭취가능한 정제, 구강 정제, 트로키제, 캡슐, 엘릭시르, 현탁제, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 상기와 같은 조성물 및 제제는 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드를 적어도 0.1% 함유해야 한다. 조성물 및 제제 중 그의 비율(%)은 물론 다양할 수 있고, 편리하게는 소정의 단위 투여형의 약 2 내지 약 60 중량%일 수 있다. 이러한 치료학적으로 유용한 조성물 중 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드의 양은 효과적인 투여량 수준이 수득될 수 있도록 하는 양이 된다.
예컨대, 정제, 트로키, 환제, 캡슐 등은 또한 하기를 포함할 수 있다: 결합제, 예컨대, 고무 트라가칸트, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대, 인산이칼슘; 붕해제, 예컨대, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등; 윤활제, 예컨대, 마그네슘 스테아레이트; 및 감미제, 예컨대, 수크로스, 프럭토스, 락토스 또는 아스파탐; 또는 향미제, 예컨대, 페퍼민트, 윈터그린 오일, 또는 체리향이 첨가될 수 있다. 단위 투여형이 캡슐인 경우, 이는 상기 유형의 물질 이외에도, 액체 담체, 예컨대, 식물성 오일 또는 폴리에틸렌 글리콜을 함유할 수 있다. 각종의 다른 물질이 코팅제로서 존재할 수 있거나, 또는 다르게는, 고체 단위 투여형의 물리적 형태를 변형시키기 위해 존재할 수 있다. 예를 들면, 정제, 환제 또는 캡슐은 젤라틴, 왁스, 셸락 또는 당 등으로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르는 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드, 감미제로서의 수크로스 또는 프럭토스, 보존제로서 메틸 및 프로필파라벤, 염료, 및 예컨대, 체리 또는 오렌지향과 같은 향미제를 함유할 수 있다. 물론, 임의의 단위 투여형을 제조하는 데 사용되는 임의의 물질은 사용되는 양으로 약제학적으로 허용가능하고 실질적으로 무독성이어야 한다. 또한, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드는 서방성 제제 및 장치 내로 혼입될 수 있다.
경구 투여를 위한 제제 및 제형에는 또한 본 발명의 컨스트럭트가 위 환경에 저항하여 소장으로 통과되도록 허용하는 장용 코팅물이 제공될 수 있다. 더욱 일반적으로, 경구 투여용 제제 및 제형은 위장관의 임의의 원하는 부분으로 전달되기 위해 적합하게 제형화될 수 있다. 또한 적합한 좌제가 위장관 내로 전달되기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드는 또한 주입 또는 주사에 의해 정맥내 또는 복강내로 투여될 수 있다. 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드의 용액 및 그의 염은 물에서, 임의로는 무독성 계면활성제와 혼합되어 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 트리아세틴 및 그의 혼합물, 및 오일에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 통상적인 조건 하에, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위해 보존제를 함유한다.
주사 또는 주입에 적합한 약제학적 투여형으로는 멸균 주사액 또는 주입액 또는 분산액(임의로는 리포솜에 캡슐화된 것)의 즉석 제조에 적합화된 활성 구성분을 포함하는 멸균 수용액 또는 분산액 또는 멸균 분말을 포함할 수 있다. 모든 경우에, 최종 투여형은 멸균성이고, 유동성을 띠며, 제작 및 저장 조건하에서 안정하여야 한다. 액체 담체 또는 비히클은 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 식물성 오일, 무독성 글리세릴 에스테르, 및 그의 적합한 혼합물을 포함하는 용매 또는 액체 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들면, 리포솜의 형성, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지, 또는 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미세물 작용은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 방지될 수 있다. 여러 경우에 있어서, 등장성 제제, 예를 들면, 당, 완충제 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물은 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 조성물에서 사용함으로써 흡수가 연장될 수 있다.
멸균 주사액은 필요한 양의 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드를 상기 나열된 다양한 다른 구성 성분들과 함께 적절한 용매 내로 혼입시키고, 필요에 따라, 이어서 여과 멸균시킴으로써 제조된다. 멸균 주사액 제조용의 멸균 분말인 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조 기법이고, 이를 통해 활성 성분 분말 + 미리 멸균 여과된 용액에 존재하는 임의의 추가의 원하는 성분을 얻을 수 있다.
국소 투여를 위해, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드는 순수한 형태로, 즉, 이들이 액체인 경우에 적용될 수 있다. 그러나, 일반적으로 이들을 고체 또는 액체일 수 있는 피부학적으로 허용가능한 담체와 함께 조합하여 피부에 조성물 또는 제형으로서 투여하는 것이 바람직할 것이다.
유용한 고체 담체로는 미분된 고체, 예컨대, 활석, 클레이, 미세결정질 셀룰로스, 실리카, 알루미나 등을 포함한다. 유용한 액체 담체로는 물, 히드록시알킬 또는 글리콜 또는 물 알코올/글리콜 혼화물을 포함하는데, 여기서, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드는 효과적인 수준으로, 임의로는 무독성 계면활성제의 도움으로 용해되거나 분산될 수 있다. 소정의 용도를 위한 특성을 최적화시키기 위해 예컨대, 방향제 및 추가의 항미생물제와 같은 애주번트가 첨가될 수 있다. 생성된 액체 조성물은 흡수 패드로부터 적용되거나, 밴드 및 기타 드레싱을 함침하기 위해 사용되거나, 펌프형 또는 에어로졸 스프레이기를 사용하여 환부에 분사될 수 있다.
증점제, 예컨대, 합성 중합체, 지방산, 지방산 염 및 에스테르, 지방산 알코올, 변형된 셀룰로스 또는 변형된 무기 물질은 또한 액체 담체와 함께 사용되어, 사용자의 피부에 직접 적용하기 위한 펴 바를 수 있는 페이스트, 겔, 연고, 비누 등을 형성할 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드를 피부에 전달하기 위해 사용될 수 있는 유용한 피부학적 조성물의 예는 당업계에 공지되어 있고; 예를 들면, 미국 특허 4,608,392(Jacquet et al.), 미국 특허 4,992,478(Geria), 미국 특허 4,559,157(Smith et al.) 및 US 4,820,508(Wortzman)를 참조한다.
본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드의 유용한 투여량은 이들의 시험관내 활성, 및 동물 모델에서의 생체내 활성을 비교하여 결정될 수 있다. 마우스 및 다른 동물에서의 유효 투여량을 인간으로 외삽하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있고; 예를 들면, 미국 특허 4,938,949를 참조한다.
일반적으로, 액체 조성물, 예컨대, 로션 중 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드의 농도는 약 0.1 내지 25 중량%, 바람직하게는 약 0.5 내지 10 중량%이다. 반고체 또는 고체 조성물, 예컨대, 겔 또는 분말에서의 농도는 약 0.1 내지 5 중량%, 바람직하게는 약 0.5 내지 2.5 중량%이다.
치료에 사용하기 위해 필요한 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드의 양은 선택된 특정 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드 뿐만 아니라, 투여 경로, 치료될 증상의 성질, 및 환자의 연령 및 증상에 따라 달라질 것이고, 궁극적으로 담당 의사 또는 임상학자의 재량일 것이다. 또한, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드의 투여량은 표적 세포, 종양, 조직, 이식편 또는 기관에 따라 달라질 것이다.
원하는 용량은 편리하게 단일 용량으로 존재하거나, 적절한 간격을 두고, 예를 들면, 1일 2회, 3회, 4회 또는 그 이상의 하위 용량으로 투여되는 분할된 용량으로 존재할 수 있다. 하위 용량은 그 자체로, 예를 들면, 대략적인 간격을 두고 수행된 다수의 다른 투여로 추가로 분할될 수 있고; 예컨대, 취입기로부터의 다중 흡입 또는 다수의 점안제를 눈으로 적용시킴으로써 이루어질 수 있다. 투여 요법은 장기간의 매일 치료를 포함할 수 있다. "장기간"은 적어도 2주, 바람직하게는, 수 주, 수 개월, 또는 수년간의 기간을 의미한다. 이러한 투여 범위에서의 필수적인 변형은 당업계의 숙련가에 의해 오직 본원의 교시에 제공된 종래의 실험만을 사용함으로써 결정될 수 있다. 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA]을 참조할 수 있다. 투여량은 또한 임의의 합병증이 있는 경우에 개인 담당 의사에 의해 조정될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 아미노산 서열, 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 화합물, 본 발명의 컨스트럭트 및/또는 그를 포함하는 약학 조성물을 약제학적으로 활성인 양으로 그를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 IL-6R 관련 질환 및/또는 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명과 관련하여, "예방 및/또는 치료"라는 용어는 질환을 예방 및/또는 치료하는 것을 포함할 뿐만 아니라, 일반적으로 질환의 발병을 방지하고, 질환의 진행을 저속화시키거나 역전시키고, 질환과 관련된 하나 이상의 증상의 발병을 방지하거나 저속화시키고, 질환과 관련된 하나 이상의 증상을 감소 및/또는 경감시키고, 질환 및/또는 그와 관련된 임의의 증상의 중증도 및/또는 지속 기간을 감소시키고/거나, 질환 및/또는 그와 관련된 임의의 증상의 중증도의 추가의 증가를 방지하고, 질환에 의해 유발되는 임의의 생리학적 손상을 방지, 감소 또는 역전시키는 것, 및 치료되는 환자에게 유리한 임의의 약리학적 작용을 포함한다.
치료받는 피험체는 임의의 온혈 동물일 수 있으나, 특히, 포유동물이고, 더욱 특히 인간이다. 숙련가에게 명백한 바와 같이, 치료받는 피험체는 특히 본원에 언급된 질환 및 질병을 앓거나, 그에 걸릴 위험이 있는 사람일 것이다.
본 발명은 본 발명의 아미노산 서열, 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 화합물, 본 발명의 컨스트럭트 및/또는 그를 포함하는 약학 조성물을 약제학적으로 활성인 양으로 그를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, IL-6과, IL-6R과, IL-6/IL-6R 복합체와, 그의 생물학적 또는 약리학적 활성과 관련이 있고/거나, IL-6, IL-6R 및/또는 IL-6/IL-6R 복합체가 관여하는 생물학적 경로 또는 신호전달과 관련된 적어도 하나의 질환 및 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 본 발명의 아미노산 서열, 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 화합물, 본 발명의 컨스트럭트 및/또는 그를 포함하는 약학 조성물을 약제학적으로 활성인 양으로 그를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, IL-6, IL-6R, IL-6/IL-6R 복합체, 그의 생물학적 또는 약리학적 활성, 및/또는 IL-6, IL-6R 및/또는 IL-6/IL-6R 복합체가 관여하는 생물학적 경로 또는 신호전달을 조정함으로써 예방 및/또는 치료될 수 있는 적어도 하나의 질환 및/또는 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 특히, 상기 특히, 상기 약제학적 유효량은 IL-6, IL-6R, IL-6/IL-6R 복합체, 그의 생물학적 또는 약리학적 활성, 및/또는 IL-6, IL-6R 및/또는 IL-6/IL-6R 복합체가 관여하는 생물학적 경로 또는 신호전달을 조정하는 데 충분한 양일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 아미노산 서열, 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 화합물, 본 발명의 컨스트럭트 및/또는 그를 포함하는 약학 조성물을 약제학적으로 활성인 양으로 그를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 본 발명의 아미노산 서열, 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩티드를 환자에게 투여함으로써 예방 및/또는 치료될 수 있는 적어도 하나의 질환 및/또는 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
더욱 특히, 본 발명은 본 발명의 아미노산 서열, 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 화합물, 본 발명의 컨스트럭트 및/또는 그를 포함하는 약학 조성물을 약제학적으로 활성인 양으로 그를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 본원에 열거된 질환 및 질병으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 질환 및/또는 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 본 발명의 아미노산 서열, 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 화합물, 본 발명의 컨스트럭트 및/또는 그를 포함하는 약학 조성물을 약제학적으로 활성인 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 패혈증, 각종 형태의 암, 골재흡수, 골다공증, 악액질, 건선, 혈관사이세포 증식성 사구체신염, 카포시 육종, AIDS 관련 림프종, 및 염증성 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 각종 형태의 암은 다발 골수종질환(MM), 신장 세포 암종(RCC), 혈장 세포 백혈병, 림프종, 림프종, B 림프구증식 질병(BLPD), 및 전립선암으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 염증성 질환은 류마티스 관절염, 전신적으로 발병된 청소년성 특발성 관절염, 고감마글로불린혈증, 크론병, 궤양성 대장염, 전신 홍반 루푸스(SLE), 다발 경화증, 캐슬만씨 병, IgM 감마글로불린병증, 심장 점액종, 천식, 알레르기성 천식 및 자가면역 인슐린 의존 당뇨병으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 측정 측면에서, 본 발명은 서열번호 70, 및/또는 그를 포함하는 약학 조성물을 약제학적으로 활성인 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 패혈증, 각종 형태의 암, 골재흡수, 골다공증, 악액질, 건선, 혈관사이세포 증식성 사구체신염, 카포시 육종, AIDS 관련 림프종, 및 염증성 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 특정 측면에서, 본 발명은 서열번호 71, 및/또는 그를 포함하는 약학 조성물을 약제학적으로 활성인 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 패혈증, 각종 형태의 암, 골재흡수, 골다공증, 악액질, 건선, 혈관사이세포 증식성 사구체신염, 카포시 육종, AIDS 관련 림프종, 및 염증성 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 각종 형태의 암은 다발 골수종질환(MM), 신장 세포 암종(RCC), 혈장 세포 백혈병, 림프종, 림프종, B 림프구증식 질병(BLPD), 및 전립선암으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 염증성 질환은 류마티스 관절염, 전신적으로 발병된 청소년성 특발성 관절염, 고감마글로불린혈증, 크론병, 궤양성 대장염, 전신 홍반 루푸스(SLE), 다발 경화증, 캐슬만씨 병, IgM 감마글로불린병증, 심장 점액종, 천식, 알레르기성 천식 및 자가면역 인슐린 의존 당뇨병으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 아미노산 서열, 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 화합물, 본 발명의 컨스트럭트 및/또는 그를 포함하는 약학 조성물을 약제학적으로 활성인 양으로 본원에서 언급된 질환 및 질병을 앓거나 그에 걸릴 위험이 있는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역치료, 특히 수동적 면역치료를 위한 방법에 관한 것이다.
상기 방법에서, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 및/또는 컨스트럭트 및/또는 그를 포함하는 조성물은 사용된 특정 약제학적 제형 또는 조성물에 따라, 임의의 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 및/또는 컨스트럭트 및/또는 그를 포함하는 조성물은 다시 사용된 특정 약제학적 제형 또는 조성물에 따라, 예를 들면, 경구적으로, 복강내로(예를 들면, 정맥내로, 피하로, 근육내로, 또는 위장관을 우회하는 임의의 다른 투여 경로를 통해), 비강내로, 경피적으로, 국소적으로, 좌제의 의해, 흡입에 의해 투여될 수 있다. 임상의는 예방 또는 치료하고자 하는 질환 및/또는 질병, 및 임상의에게 공지된 다른 인자에 따라 적합한 투여 경로 및 이러한 투여에 사용되는 적합한 약제학적 제형 또는 조성물을 선택할 수 있을 것이다.
본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 및/또는 컨스트럭트 및/또는 그를 포함하는 조성물은 예방 또는 치료하고자 하는 질환 또는 질병을 예방 및/또는 치료하기에 적합한 치료 요법에 따라 투여된다. 임상의는 일반적으로, 예컨대, 예방 또는 치료하고자 하는 질환 또는 질병, 치료하고자 하는 질환의 중증도 및/또는 그의 증상의 중증도, 사용되는 특정의 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 또는 컨스트럭트, 특정 투여 경로 및 사용되는 약제학적 제형 또는 조성물, 환자의 연령, 성별, 체중, 식이, 일반적인 건강 상태와 같은 인자, 및 임상의에게 공지된 유사한 인자에 따라 적합한 치료 요법을 결정할 수 있을 것이다.
일반적으로, 치료 요법은 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 및/또는 컨스트럭트 및/또는 그를 포함하는 조성물을 하나 이상의 약제학적 유효량 또는 용량으로 투여하는 단계를 포함할 것이다. 투여되는 특정 양(들) 또는 용량은 다시 상기 인용된 인자들에 기초하여 임상의에 의해 결정될 수 있다.
일반적으로, 일반적으로, 본원에 언급된 질환 및 질병을 예방 및/또는 치료하기 위해, 치료하고자 하는 특정 질환 또는 질병, 사용되는 특정의, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 및 컨스트럭트의 효능, 특정 투여 경로, 및 사용되는 특정 제형 또는 조성물에 따라, 일반적으로 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 및 컨스트럭트는 1 g 내지 0.01 ㎍/체중 ㎏/일 사이, 바람직하게는, 0.1 g 내지 0.1 ㎍/체중 ㎏/일, 예컨대, 약 1, 10, 100 또는 1,000 ㎍/체중 ㎏/일의 양으로, 연속적으로(예를 들면, 주입에 의해), 단일 1일 용량으로서, 또는 1일 동안 수회 분할된 용량으로서 투여될 것이다. 임상의는 일반적으로 본원에 언급된 인자에 따라 적합한 1일 용량을 결정할 수 있을 것이다. 또한, 특정한 경우에, 임상의는 예를 들면, 상기 인용된 인자들 및 임상의의 숙련된 판단에 기초하여 상기 양으로부터 벗어나는 용량을 선택할 수 있음이 명백할 것이다. 일반적으로, 투여되는 양에 대한 일부 지침은 본질적으로 동일한 경로를 통해 투여되는 동일한 표적에 대한 필적할만한 종래의 항체 또는 항체 단편에 대한 일반 투여량으로부터, 그러나, 친화도/결합력, 유효성, 생물분포, 반감기 및 숙련가에게 공지된 유사 인자를 고려하여 수득할 수 있다.
일반적으로, 상기 방법에서는 단일의, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 또는 컨스트럭트가 사용될 것이다. 그러나, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 및/또는 컨스트럭트를 2개 이상 조합하여 사용하는 것은 본 발명의 범주내에 속한다.
본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 및 컨스트럭트는 또한 상승 효과를 유도하거나 유도하지 않는 하나 이상의 추가의 약제학적으로 활성인 화합물 또는 성분과, 즉, 조합 치료 요법으로서 함께 사용될 수 있다. 추갈, 임상의는 상기 인용된 인자 및 임상의의 숙련된 판단에 기초하여, 추가의 화합물 또는 성분 뿐만 아니라, 적합한 조합 치료 요법을 선택할 수 있을 것이다.
특히, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 및 컨스트럭트는 본원에 인용된 질환 및 질병을 예방 및/또는 치료하거나, 또는 이를 위해 사용될 수 있는 다른 약제학적으로 활성인 화합물 또는 성분과 함께 사용될 수 있고, 그 결과로서 상승 효과를 얻거나, 얻지 못할 수도 있다. 이러한 화합물 및 성분의 이례 뿐만 아니라, 이를 투여하기 위한 경로, 방법 및 약제학적 제형 또는 조성물은 임상의에게 명백할 것이다.
2개 이상의 물질 또는 성분이 조합 치료 요법의 일부로서 사용되는 경우, 이들은 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로를 통해, 본질적으로 동일하거나 상이한 시간에(예를 들면, 본질적으로 동시에, 연속적으로, 또는 교대 요법에 따라) 투여될 수 있다. 이러한 물질 또는 성분이 동일한 투여 경로를 통해 동시에 투여되는 경우, 이는 숙련가에게 명백한 바와 같이, 상이한 약제학적 제형 또는 조성물로서, 또는 조합된 약제학적 제형 또는 조성물의 일부로서 투여될 수 있다.
또한, 2개 이상의 활성 물질 또는 성분이 조합 치료 요법의 일부로서 사용될 경우, 각각의 물질 또는 성분은, 그 화합물 또는 성분이 그 자체로 사용되는 경우와 동일한 양으로 동일한 요법에 따라 투여될 수 있고, 이러한 조합된 사용은 상승 효과를 유도하거나 유도하지 않을 수 있다. 그러나, 2개 이상의 활성 물질 또는 성분의 조합된 사용이 상승 작용을 유도할 경우에는 또한 투여되는 하나 이상 또는 모든 물질 또는 성분의 양을 감소시키지만, 여전히 원하는 치료 작용을 달성할 수 있다. 이는 예를 들면, 이들이 원하는 약제학적 또는 치료학적 효과는 여전히 수득하면서 그의 일반적 양으로 사용될 경우, 하나 이상의 물질 또는 성분의 사용과 관련된 임의의 원치않는 부작용을 방지, 제한 또는 감소시키는 데 유용할 것이다.
본 발명에 따라 사용되는 치료 요법의 유효성은 임상의에게 명백한 바와 같이, 관여하는 질환 또는 질병에 대해 자체 공지된 임의의 방식으로 결정되고/거나 수행될 수 있다. 임상의는 또한 적절한 경우 사항별로 그에 근거하여, 특정 치료 요법을 변경 또는 변화시켜, 원하는 치료 효과를 달성하고, 원치않는 부작용을 방지, 제한 또는 감소시키고/거나, 한편으로는 원하는 치료 효과를 달성하고 다른 한편으로는 원치않는 부작용을 방지, 제한 또는 감소시키는 적절한 균형을 달성할 수 있을 것이다.
일반적으로, 치료 요법은 원하는 치료 효과를 달성할 때까지, 및/또는 원하는 치료 효과가 유지되는 한 수행될 것이다. 추가로, 이는 임상의에 의해 결정될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 IL-6R 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 약학 조성물의 제조에서 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 또는 (1가) 컨스트럭트의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 IL-6과, IL-6R과, IL-6/IL-6R 복합체와 관련이 있고/거나, IL-6, IL-6R 및/또는 IL-6/IL-6R 복합체가 관여하는 신호전달 경로 및/또는 생물학적 작용 및 반응과 관련된 질환 및 질병들 중 적어도 하나의 예방 및/또는 치료를 위한 약학 조성물의 제조에서, 및/또는 본원에 기술된 방법들 중 하나 이상에서 사용하기 위한, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 또는 (1가) 컨스트럭트의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 IL-6, IL-6R, IL-6/IL-6R 복합체, 그의 생물학적 또는 약리학적 활성, 및/또는 IL-6, IL-6R 및/또는 IL-6/IL-6R 복합체가 관여하는 생물학적 경로 또는 신호전달을 조정함으로써 예방 및/또는 치료될 수 있는 적어도 하나의 질환 또는 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 약학 조성물의 제조에서 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 또는 컨스트럭트의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 또는 컨스트럭트를 환자에게 투여함으로써 예방 및/또는 치료될 수 있는 적어도 하나의 질환 및/또는 질병을 예방 및/또는 치료하기 위한 약학 조성물의 제조에서 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 또는 컨스트럭트의 용도에 관한 것이다.
더욱 특히, 본 발명은 본 발명의 아미노산 서열, 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩티드, 및/또는 그를 포함하는 약학 조성물을 약제학적으로 활성인 양으로 투여하는 단계를 포함하는, IL-6R 관련 질병을 예방 및/또는 치료하기 위한, 및 특히 패혈증, 각종 형태의 암, 골재흡수, 골다공증, 악액질, 건선, 혈관사이세포 증식성 사구체신염, 카포시 육종, AIDS 관련 림프종, 및 염증성 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 약학 조성물의 제조에서 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 또는 컨스트럭트의 용도에 관한 것이다. 상기 각종 형태의 암은 다발 골수종질환(MM), 신장 세포 암종(RCC), 혈장 세포 백혈병, 림프종, 림프종, B 림프구증식 질병(BLPD), 및 전립선암으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 염증성 질환은 류마티스 관절염, 전신적으로 발병된 청소년성 특발성 관절염, 고감마글로불린혈증, 크론병, 궤양성 대장염, 전신 홍반 루푸스(SLE), 다발 경화증, 캐슬만씨 병, IgM 감마글로불린병증, 심장 점액종, 천식, 알레르기성 천식 및 자가면역 인슐린 의존 당뇨병으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 추가로 적어도 하나의 IL-6R 관련 질환 및/또는 질병을 예방 및/또는 치료하는 데 사용하기 위한 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 컨스트럭트, 폴리펩티드, 1가 컨스트럭트, 또는 그를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 IL-6과, IL-6R과, IL-6/IL-6R 복합체와, 그의 생물학적 또는 약리학적 활성과 관련이 있고/거나, IL-6, IL-6R 및/또는 IL-6/IL-6R 복합체가 관여하는 생물학적 경로 또는 신호전달과 관련된 적어도 하나의 질환 및 질병을 예방 및/또는 치료하는 데 사용하기 위한 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 컨스트럭트, 폴리펩티드, 1가 컨스트럭트, 또는 그를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 IL-6, IL-6R, IL-6/IL-6R 복합체, 그의 생물학적 또는 약리학적 활성, 및/또는 IL-6, IL-6R 및/또는 IL-6/IL-6R 복합체가 관여하는 생물학적 경로 또는 신호전달을 조정함으로써 예방 및/또는 치료될 수 있는 적어도 하나의 질환 및/또는 질병을 예방 및/또는 치료하는 데 사용하기 위한 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 컨스트럭트, 폴리펩티드, 1가 컨스트럭트, 또는 그를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 본 발명의 아미노산 서열, 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩티드를 환자에게 투여함으로써 예방 및/또는 치료될 수 있는 적어도 하나의 질환 및/또는 질병을 예방 및/또는 치료하는 데 사용하기 위한 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 컨스트럭트, 폴리펩티드, 1가 컨스트럭트, 또는 그를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 본 발명의 아미노산 서열, 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩티드, 및/또는 그를 포함하는 약학 조성물을 약제학적으로 활성인 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 패혈증, 각종 형태의 암, 골재흡수, 골다공증, 악액질, 건선, 혈관사이세포 증식성 사구체신염, 카포시 육종, AIDS 관련 림프종, 및 염증성 질환을 예방 및/또는 치료하는 데 사용하기 위한 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 화합물 또는 컨스트럭트, 폴리펩티드, 1가 컨스트럭트, 또는 그를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 각종 형태의 암은 다발 골수종질환(MM), 신장 세포 암종(RCC), 혈장 세포 백혈병, 림프종, 림프종, B 림프구증식 질병(BLPD), 및 전립선암으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 염증성 질환은 류마티스 관절염, 전신적으로 발병된 청소년성 특발성 관절염, 고감마글로불린혈증, 크론병, 궤양성 대장염, 전신 홍반 루푸스(SLE), 다발 경화증, 캐슬만씨 병, IgM 감마글로불린병증, 심장 점액종, 천식, 알레르기성 천식 및 자가면역 인슐린 의존 당뇨병으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
치료받는 피험체는 임의의 온혈 동물일 수 있으나, 특히, 포유동물이고, 더욱 특히 인간이다. 숙련가에게 명백한 바와 같이, 치료받는 피험체는 특히 본원에 언급된 질환 및 질병을 앓거나, 그에 걸릴 위험이 있는 사람일 것이다.
추가로, 이러한 약학 조성물에서, 하나 이상의 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 화합물 또는 컨스트럭트 또한 적합하게는 예컨대, 본원에 언급된 바와 같은 하나 이상의 다른 활성 성분과 조합될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예를 통해 추가 설명되지만, 어느 방식으로든 추가적인 제한으로서 해석되어서는 안된다. 본 출원 명세서 전역에서 인용된 참조 문헌(문헌, 참조 문헌, 등록된 특허, 공개된 특허 출원, 및 계류 중인 특허 출원) 모두의 전문은 특히 본원 상기에서 참조된 교시를 위해 본원에서 참고로 명백하게 인용된다.
측면
측면 1. 하기
a) 서열번호 80-82; 또는
b) 서열번호 80-82 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치; 및/또는
c) 서열번호 84-91; 또는
d) 서열번호 84-91 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치; 및/또는
e) 서열번호 93-95; 또는
f) 서열번호 93-95 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로부터 선택되는 아미노산 잔기의 스트레치를 하나 이상 포함하는, IL-6R에 대한 아미노산 서열.
측면 2. 측면 1에 있어서,
(i) 제1 아미노산 잔기의 스트레치가 a) 또는 b)에 따른 아미노산 서열 중 하나에 상응할 경우, 제2 아미노산 잔기의 스트레치는 c), d), e) 또는 f)에 따른 아미노산 서열 중 하나에 상응하거나, (ii) 제1 아미노산 잔기의 스트레치가 c) 또는 d)에 따른 아미노산 서열 중 하나에 상응할 경우, 제2 아미노산 잔기의 스트레치는 a), b), e) 또는 f)에 따른 아미노산 서열 중 하나에 상응하거나, 또는 (iii) 제1 아미노산 잔기의 스트레치가 e) 또는 f)에 따른 아미노산 서열 중 하나에 상응할 경우, 제2 아미노산 잔기의 스트레치는 a), b), c) 또는 d)에 따른 아미노산 서열 중 하나에 상응하도록, 하기
a) 서열번호 80-82; 또는
b) 서열번호 80-82 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치; 및/또는
c) 서열번호 84-91; 또는
d) 서열번호 84-91 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치; 및/또는
e) 서열번호 93-95; 또는
f) 서열번호 93-95 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로부터 선택되는 아미노산 잔기의 스트레치를 2개 이상 포함하는, 아미노산 서열.
측면 3. 측면 1 또는 측면 2 중 어느 한 측면에 있어서,
제1 아미노산 잔기의 스트레치가
a) 서열번호 80-82; 또는
b) 서열번호 80-82 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로 구성된 군으로부터 선택되고;
제2 아미노산 잔기의 스트레치가
c) 서열번호 84-91; 또는
d) 서열번호 84-91 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로 구성된 군으로부터 선택되고;
제3 아미노산 잔기의 스트레치가
e) 서열번호 93-95; 또는
f) 서열번호 93-95 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 아미노산 잔기의 스트레치를 3개 이상 포함하는 것인 아미노산 서열.
측면 4. 측면 1 내지 3 중 어느 한 측면에 있어서, 면역글로불린 폴드를 포함하거나, 또는 적합한 조건하에서 면역글로불린 폴드를 형성할 수 있는 것인 아미노산 서열.
측면 5. 측면 1 내지 4 중 어느 한 측면에 있어서, 면역글로불린 서열인 것인 아미노산 서열.
측면 6. 측면 1 내지 5 중 어느 한 측면에 있어서,
본질적으로 4개의 골격 부위(각각, FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 부위(각각 CDR1 내지 CDR3)로 구성되고, 여기서:
- CDR1은
a) 서열번호 80-82; 또는
b) 서열번호 80-82 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로 구성된 군으로부터 선택되고/거나,
- CDR2는
c) 서열번호 84-91; 또는
d) 서열번호 84-91 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로 구성된 군으로부터 선택되고/거나,
- CDR3은
e) 서열번호 93-95; 또는
f) 서열번호 93-95 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 아미노산 서열.
측면 7. 측면 6에 있어서,
본질적으로 4개의 골격 부위(각각, FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 부위(각각 CDR1 내지 CDR3)로 구성되고, 여기서:
- CDR1은
a) 서열번호 80-82; 또는
b) 서열번호 80-82 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로 구성된 군으로부터 선택되고/거나,
- CDR2는
c) 서열번호 84-91; 또는
d) 서열번호 84-91 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로 구성된 군으로부터 선택되고/거나,
- CDR3은
e) 서열번호 93-95; 또는
f) 서열번호 93-95 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치이며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여, 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 잔기의 스트레치로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 아미노산 서열.
측면 8. 측면 1 내지 7 중 어느 한 측면에 있어서, 적어도
a) 서열번호 80; 또는
b) 서열번호 80과 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 서열.
측면 9. 측면 1 내지 8 중 어느 한 측면에 있어서, 적어도
하기
a) 서열번호 84, 89 또는 91; 또는
b) 서열번호 84, 89 또는 91 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 서열.
측면 10. 측면 1 내지 9 중 어느 한 측면에 있어서,
a) 서열번호 84; 또는
b) 서열번호 84와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 서열.
측면 11. 측면 1 내지 10 중 어느 한 측면에 있어서, 적어도
하기
a) 서열번호 93-94; 또는
b) 서열번호 93-94 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 비교하여 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 서열.
측면 12. 측면 1 내지 11 중 어느 한 측면에 있어서,
a) 서열번호 93; 또는
b) 서열번호 93과 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하며, 단, 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 포함하지 않는 상기의 아미노산 잔기의 스트레치를 포함하는 아미노산 서열과 비교하여 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 서열.
측면 13. 측면 1 내지 12 중 어느 한 측면에 있어서,
a) 서열번호 80 및 서열번호 84;
b) 서열번호 80 및 서열번호 93; 또는
c) 서열번호 84 및 서열번호 93으로부터 선택되는 아미노산 잔기의 스트레치를 적어도 2개 포함하는 것인 아미노산 서열.
측면 14. 측면 1 내지 13 중 어느 한 측면에 있어서, 서열번호 80, 서열번호 84 및 서열번호 93을 포함하는 아미노산 서열.
측면 15. 측면 1 내지 14 중 어느 한 측면에 있어서, 본질적으로 종래의 4쇄 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인 서열로 구성되거나, 또는 본질적으로 중쇄 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인 서열로 구성된 것인 아미노산 서열.
측면 16. 측면 1 내지 15 중 어느 한 측면에 있어서, 본질적으로 도메인 항체(또는 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열), 단일 도메인 항체(또는 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열), "dAb"(또는 dAb로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열), 또는 나노바디로 구성된 것인 아미노산 서열.
측면 17. 측면 1 내지 16 중 어느 한 측면에 있어서,
a) 서열번호 60-69;
b) 서열번호 60-69 중 하나와 그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가지는 서열이며, 단, 그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 서열번호 60-69 중 하나에 의해 이루어지는 결합과 비교하여 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 서열;
c) 서열번호 60-69 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가지는 서열이며, 단, 서열번호 60-69 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 서열번호 60-69 중 하나에 의해 이루어지는 결합과 비교하여 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 아미노산 서열.
측면 18. 측면 17에 있어서,
a) 서열번호 65-69;
b) 서열번호 65-69 중 하나와 그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가지는 서열이며, 단, 그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 서열번호 65-69 중 하나에 의해 이루어지는 결합과 비교하여 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 서열;
c) 서열번호 65-69 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가지는 서열이며, 단, 서열번호 65-69 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 서열번호 65-69 중 하나에 의해 이루어지는 결합과 비교하여 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 아미노산 서열.
측면 19. 측면 18에 있어서,
a) 서열번호 66;
b) 서열번호 66과 그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가지는 서열이며, 단, 그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 서열번호 66에 의해 이루어지는 결합과 비교하여 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 아미노산 서열; 및
c) 서열번호 66과 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가지는 서열이며, 단, 서열번호 66과 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 서열번호 66에 의해 이루어지는 결합과 비교하여 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 아미노산 서열.
측면 20. 측면 1 내지 19 중 어느 한 측면에 있어서, 1 nM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 바람직하게, 500 pM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 더욱 바람직하게, 100 pM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 또는 더욱더 바람직하게, 약 50 pM 내지 1 pM 또는 그 이하의 해리 상수(KD)로 hIL-6R에 특이적으로 결합하는 아미노산 서열.
측면 21. 측면 1 내지 20 중 어느 한 측면에 있어서, 1 nM 내지 1 pM 또는 그 이하, 바람직하게, 500 pM 내지 1 pM 또는 그 이하, 더욱 바람직하게, 100 pM 내지 1 pM 또는 그 이하, 또는 더욱더 바람직하게, 약 50 pM 내지 1 pM 또는 그 이하의 해리 상수(KD)로 시아노 IL-6R에 특이적으로 결합하는 아미노산 서열.
측면 22. 측면 1 내지 21 중 어느 한 측면에 있어서, 104 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 바람직하게, 105 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 더욱 바람직하게 약 106 M-1s-1 또는 그 이상인 k온 속도로 hIL-6R에 특이적으로 결합하는 아미노산 서열.
측면 23. 측면 1 내지 22 중 어느 한 측면에 있어서, 104 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 바람직하게, 105 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 더욱 바람직하게 약 106 M-1s-1 또는 그 이상인 k온 속도로 시아노 IL-6R에 특이적으로 결합하는 아미노산 서열.
측면 24. 측면 1 내지 23 중 어느 한 측면에 있어서, 10-3 s-1 (t½=0.69 s) 내지 10-6 s-1(이는 t½이 여러 일인 거의 비가역적인 복합체 제공), 바람직하게, 10-4 s-1 내지 10-6 s-1, 더욱 바람직하게, 10-5 s-1 내지 10-6 s-1, 예컨대, 약 10-5 s-1 또는 그 이하인 k오프 속도로 hIL-6R에 특이적으로 결합하는 아미노산 서열.
측면 25. 측면 1 내지 24 중 어느 한 측면에 있어서, 10-3 s-1 (t½=0.69 s) 내지 10-6 s-1(이는 t½이 여러 일인 거의 비가역적인 복합체 제공), 바람직하게, 10-4 s-1 내지 10-6 s-1, 더욱 바람직하게, 10-5 s-1 내지 10-6 s-1, 예컨대, 약 10-5 s-1 또는 그 이하인 k오프 속도로 시아노 IL-6R에 특이적으로 결합하는 아미노산 서열.
측면 26. 측면 1 내지 25 중 어느 한 측면에 있어서, TF1 분석법에서 (100 IU/mL IL-6에서) 10 nM 내지 50 pM, 바람직하게, 5 nM 내지 50 pM, 더욱 바람직하게, 1 nM 내지 50 pM 또는 그 이하, 예컨대, 약 750 또는 500 pM 또는 그 이하의 IC50 값을 갖는 아미노산 서열.
측면 27. 측면 1 내지 26 중 어느 한 측면에 있어서, TF1 분석법에서 (5,000 IU/mL IL-6에서) 50 nM 내지 1 nM, 바람직하게, 25 nM 내지 1 nM, 더욱 바람직하게, 10 nM 내지 1 nM 또는 그 이하, 예컨대, 약 8 nM 또는 그 이하의 IC50 값을 갖는 아미노산 서열.
측면 28. 측면 1 내지 27 중 어느 한 측면에 있어서, TF1 분석법에서 서열번호 1 및 2에 의해 정의되는 바와 같은 참조 IgG 또는 서열번호 3 및 4에 의해 정의되는 바와 같은 참조 Fab에 대해 수득된 IC50 값과 비교하여 적어도 동일, 및 바람직하게는 적어도 2배, 바람직하게, 3배, 더욱 바람직하게, 4배, 더욱더 바람직하게, 5배, 7배 또는 7배 초과로 더 우수한 IC50 값을 갖는 아미노산 서열.
측면 29. 측면 1 내지 28 중 어느 한 측면에 있어서, TF1 분석법에서 토실리주맙(MRA)에 대해 수득된 IC50 값과 비교하여 적어도 동일, 및 바람직하게는 적어도 2배, 바람직하게, 3배, 더욱 바람직하게, 4배, 더욱더 바람직하게, 5배, 7배 또는 7배 초과로 더 우수한 IC50 값을 갖는 아미노산 서열.
측면 30. 측면 1 내지 29 중 어느 한 측면에 있어서, IL-6 EC50 값에서의 혈장 효능 분석법에서, 500 pM 내지 50 pM, 바람직하게, 250 pM 내지 50 pM, 더욱 바람직하게, 200 pM 내지 50 pM 또는 그 이하, 예컨대, 150 pM 또는 그 이하의 IC50 값을 갖는 아미노산 서열.
측면 31. 측면 1 내지 30 중 어느 한 측면에 있어서, IL-6 EC95 값에서의 혈장 효능 분석법에서, 1,000 pM 내지 100 pM, 바람직하게, 750 pM 내지 100 pM 더욱 바람직하게, 500 pM 내지 100 pM 또는 그 이하, 예컨대, 400 pM 또는 그 이하의 IC50 값을 갖는 아미노산 서열.
측면 32. 측면 1 내지 31 중 어느 한 측면에 있어서, 측면 30 또는 31의 혈장 효능 분석법에서 서열번호 1 및 2에 의해 정의되는 바와 같은 참조 IgG 또는 서열번호 3 및 4에 의해 정의되는 바와 같은 참조 Fab에 대해 수득된 IC50 값과 비교하여 적어도 동일, 및 바람직하게는 적어도 2배, 바람직하게, 3배, 더욱 바람직하게, 4배, 더욱더 바람직하게, 5배, 7배 또는 7배 초과로 더 우수한 IC50 값을 갖는 아미노산 서열.
측면 33. 측면 1 내지 32 중 어느 한 측면에 있어서, 측면 30 또는 31의 혈장 효능 분석법에서 토실리주맙(MRA)에 대해 수득된 IC50 값과 비교하여 적어도 동일, 및 바람직하게는 적어도 2배, 바람직하게, 3배, 더욱 바람직하게, 4배, 더욱더 바람직하게, 5배, 7배 또는 7배 초과로 더 우수한 IC50 값을 갖는 아미노산 서열.
측면 34. 측면 1 내지 33 중 어느 한 측면에 있어서, CHO 세포 상의 막 IL-6R에의 결합에 대해 10 nM 내지 100 pM, 바람직하게, 5 nM 내지 100 pM, 더욱 바람직하게, 2 nM 내지 10 pM 또는 그 이하, 예컨대, 2 nM 또는 그 이하의 IC50 값을 갖는 아미노산 서열.
측면 35. 측면 1 내지 34 중 어느 한 측면에 따른 아미노산 서열을 하나 이상 포함하거나, 본질적으로 그로 구성되고, 임의로는, 임의로 하나 이상의 링커를 통해 연결된 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛을 추가로 포함하는 것인 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 36. 측면 35에 있어서, 상기의 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛이 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, "dAb," dAb로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열 또는 나노바디로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 37. 측면 35 또는 36 중 어느 한 측면에 있어서, 다가 컨스트럭트, 예컨대, 2가 또는 3가 컨스트럭트인 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 38. 측면 35 내지 37 중 어느 한 측면에 있어서, 다중특이성 컨스트럭트, 예컨대, 이특이성 또는 삼특이성 컨스트럭트인 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 39. 측면 35 내지 38 중 어느 한 측면에 있어서, 측면 1 내지 34 중 어느 한 측면에 따른 상응하는 아미노산 서열 그 자체와 비교하여 반감기가 증가된 것인 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 40. 측면 39에 있어서, 상기의 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛이 화합물 또는 컨스트럭트의 반감기를 측면 1 내지 20 중 어느 한 측면에 따른 상응하는 아미노산 서열과 비교하여 증가시켜 주는 것인 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 41. 측면 39에 있어서, 화합물 또는 컨스트럭트의 반감기를 증가시켜 주는 상기의 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛이 혈청 단백질 또는 그의 단편, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 결합 유닛, Fc 부분, 및 혈청 단백질에 결합할 수 있는 소형 단백질 또는 펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 42. 측면 39에 있어서, 화합물 또는 컨스트럭트의 반감기를 증가시켜 주는 상기의 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛이 인간 혈청 알부민 또는 그의 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 43. 측면 39에 있어서, 화합물 또는 컨스트럭트의 반감기를 증가시켜 주는 상기의 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛이 혈청 알부민(예컨대, 인간 혈청 알부민) 또는 혈청 면역글로불린(예컨대, IgG)에 결합할 수 있는 결합 유닛으로부터 선택되는 것인 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 44. 측면 39에 있어서, 화합물 또는 컨스트럭트의 반감기를 증가시켜 주는 상기의 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛이 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, "dAb," dAb로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열 또는 혈청 알부민(예컨대, 인간 혈청 알부민) 또는 혈청 면역글로불린(예컨대, IgG)에 결합할 수 있는 나노바디로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 45. 측면 39에 있어서, 화합물 또는 컨스트럭트의 반감기를 증가시켜 주는 상기의 하나 이상의 다른 결합 유닛이 서열번호 97-99로부터 선택되는 것인 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 46. 측면 35 내지 45 중 어느 한 측면에 있어서, 하기 폴리펩티드 서열:
a) 서열번호 70-72;
b) 서열번호 70-72 중 하나와 본 발명의 그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 폴리펩티드 서열이며, 단, 본 발명의 그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 폴리펩티드 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 서열번호 70-72 중 하나에 의해 이루어지는 결합과 비교하여 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 폴리펩티드 서열;
c) 서열번호 70-72 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 폴리펩티드 서열이며, 단, 서열번호 70-72 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 서열번호 70-72 중 하나에 의해 이루어지는 결합과 비교하여 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 폴리펩티드 서열로부터 선택되는 것인 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 47. 측면 35 내지 46 중 어느 한 측면에 있어서, 하기 폴리펩티드 서열:
a) 서열번호 70-71;
b) 서열번호 70-71 중 하나와 본 발명의 그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 폴리펩티드 서열이며, 단, 본 발명의 그의 CDR 중 1개, 2개, 또는 그 모두에서 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 폴리펩티드 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 서열번호 70-71 중 하나에 의해 이루어지는 결합과 비교하여 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 폴리펩티드 서열;
c) 서열번호 70-71 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 폴리펩티드 서열이며, 단, 서열번호 70-71 중 하나와 2개 이하, 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 차이를 가진 아미노산 서열은 표면 플라스몬 공명에 의해 그 친화도를 측정하였을 때, 서열번호 70-71 중 하나에 의해 이루어지는 결합과 비교하여 거의 동일하거나, 또는 그보다 더 높은 친화도로 IL-6R에 결합하는 것인 폴리펩티드 서열로부터 선택되는 것인 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 48. 측면 35 내지 47 중 어느 한 측면에 있어서, 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖거나, 또는 본질적으로 그로 구성된 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 49. 측면 35 내지 47 중 어느 한 측면에 있어서, 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖거나, 또는 본질적으로 그로 구성된 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 50. 측면 35 내지 49 중 어느 한 측면에 있어서, 1 nM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 바람직하게, 500 pM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 더욱 바람직하게, 100 pM 내지 1 pM 몰/ℓ 또는 그 이하, 또는 더욱더 바람직하게, 약 50 pM 내지 1 pM 또는 그 이하의 해리 상수(KD)로 hIL-6R에 특이적으로 결합하는 것인 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 51. 측면 35 내지 50 중 어느 한 측면에 있어서, 1 nM 내지 1 pM 또는 그 이하, 바람직하게, 500 pM 내지 1 pM 또는 그 이하, 더욱 바람직하게, 100 pM 내지 1 pM 또는 그 이하, 또는 더욱더 바람직하게, 약 50 pM 내지 1 pM 또는 그 이하의 해리 상수(KD)로 시아노 IL-6R에 특이적으로 결합하는 것인 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 52. 측면 35 내지 51 중 어느 한 측면에 있어서, 104 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 바람직하게, 105 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 더욱 바람직하게 약 106 M-1s-1 또는 그 이상인 k온 속도로 hIL-6R에 특이적으로 결합하는 것인 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 53. 측면 35 내지 52 중 어느 한 측면에 있어서, 104 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 바람직하게, 105 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1, 더욱 바람직하게 약 106 M-1s-1 또는 그 이상인 k온 속도로 시아노 IL-6R에 특이적으로 결합하는 것인 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 54. 측면 35 내지 53 중 어느 한 측면에 있어서, 10-3 s-1 (t½=0.69 s) 내지 10-6 s-1(이는 t½이 여러 일인 거의 비가역적인 복합체 제공), 바람직하게, 10-4 s-1 내지 10-6 s-1, 더욱 바람직하게, 10-5 s-1 내지 10-6 s-1, 예컨대, 약 10-5 s-1 또는 그 이하인 k오프 속도로 hIL-6R에 특이적으로 결합하는 것인 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 55. 측면 35 내지 54 중 어느 한 측면에 있어서, 10-3 s-1 (t½=0.69 s) 내지 10-6 s-1(이는 t½이 여러 일인 거의 비가역적인 복합체 제공), 바람직하게, 10-4 s-1 내지 10-6 s-1, 더욱 바람직하게, 10-5 s-1 내지 10-6 s-1, 예컨대, 약 10-5 s-1 또는 그 이하인 k오프 속도로 시아노 IL-6R에 특이적으로 결합하는 것인 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 56. 측면 35 내지 55 중 어느 한 측면에 있어서, TF1 분석법에서 (100 IU/mL IL-6에서) 10 nM 내지 50 pM, 바람직하게, 5 nM 내지 50 pM, 더욱 바람직하게, 1 nM 내지 50 pM 또는 그 이하, 예컨대, 약 750 또는 500 pM 또는 그 이하의 IC50 값을 갖는 것인 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 57. 측면 35 내지 56 중 어느 한 측면에 있어서, TF1 분석법에서 (5,000 IU/mL IL-6에서) 50 nM 내지 1 nM, 바람직하게, 25 nM 내지 1 nM, 더욱 바람직하게, 10 nM 내지 1 nM 또는 그 이하, 예컨대, 약 8 nM 또는 그 이하의 IC50 값을 갖는 것인 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 58. 측면 35 내지 57 중 어느 한 측면에 있어서, TF1 분석법에서 서열번호 1 및 2에 의해 정의되는 바와 같은 참조 IgG 또는 서열번호 3 및 4에 의해 정의되는 바와 같은 참조 Fab에 대해 수득된 IC50 값과 비교하여 적어도 동일, 및 바람직하게는 적어도 2배, 바람직하게, 3배, 더욱 바람직하게, 4배, 더욱더 바람직하게, 5배, 7배 또는 7배 초과로 더 우수한 IC50 값을 갖는 것인 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 59. 측면 35 내지 58 중 어느 한 측면에 있어서, TF1 분석법에서 토실리주맙(MRA)에 대해 수득된 IC50 값과 비교하여 적어도 동일, 및 바람직하게는 적어도 2배, 바람직하게, 3배, 더욱 바람직하게, 4배, 더욱더 바람직하게, 5배, 7배 또는 7배 초과로 더 우수한 IC50 값을 갖는 것인 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 60. 측면 35 내지 59 중 어느 한 측면에 있어서, IL-6 EC50 값에서의 혈장 효능 분석법에서, 500 pM 내지 50 pM, 바람직하게, 250 pM 내지 50 pM, 더욱 바람직하게, 200 pM 내지 50 pM 또는 그 이하, 예컨대, 150 pM 또는 그 이하의 IC50 값을 갖는 것인 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 61. 측면 35 내지 60 중 어느 한 측면에 있어서, IL-6 EC95 값에서의 혈장 효능 분석법에서, 1,000 pM 내지 100 pM, 바람직하게, 750 pM 내지 100 pM, 더욱 바람직하게, 500 pM 내지 100 pM 또는 그 이하, 예컨대, 400 pM 또는 그 이하의 IC50 값을 갖는 것인 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 62. 측면 35 내지 61 중 어느 한 측면에 있어서, 측면 60 또는 61의 혈장 효능 분석법에서 서열번호 1 및 2에 의해 정의되는 바와 같은 참조 IgG 또는 서열번호 3 및 4에 의해 정의되는 바와 같은 참조 Fab에 대해 수득된 IC50 값과 비교하여 적어도 동일, 및 바람직하게는 적어도 2배, 바람직하게, 3배, 더욱 바람직하게, 4배, 더욱더 바람직하게, 5배, 7배 또는 7배 초과로 더 우수한 IC50 값을 갖는 것인 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 63. 측면 35 내지 62 중 어느 한 측면에 있어서, 측면 60 또는 61의 혈장 효능 분석법에서 토실리주맙(MRA)에 대해 수득된 IC50 값과 비교하여 적어도 동일, 및 바람직하게는 적어도 2배, 바람직하게, 3배, 더욱 바람직하게, 4배, 더욱더 바람직하게, 5배, 7배 또는 7배 초과로 더 우수한 IC50 값을 갖는 것인 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 64. 측면 35 내지 63 중 어느 한 측면에 있어서, CHO 세포 상의 막 IL-6R에의 결합에 대해 10 nM 내지 100 pM, 바람직하게, 5 nM 내지 100 pM, 더욱 바람직하게, 2 nM 내지 10 pM 또는 그 이하, 예컨대, 2 nM 또는 그 이하의 IC50 값을 갖는 것인 화합물 또는 컨스트럭트.
측면 65. 측면 1 내지 34 중 어느 한 측면에 따른 아미노산 서열 하나를 포함하거나, 본질적으로 그로 구성된 1가 컨스트럭트.
측면 66. 측면 37 내지 64 중 어느 한 측면에 따른 다가 화합물 또는 컨스트럭트의 제조에서 측면 1 내지 34 중 어느 한 측면에 따른 아미노산 서열 또는 측면 65에 따른 1가 컨스트럭트의 용도.
측면 67. 측면 1 내지 34 중 어느 한 측면에 따른 아미노산 서열 또는 측면 65에 따른 1가 컨스트럭트를 하나 이상의 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛에 연결시키는 단계를 포함하는, 측면 37 내지 64 중 어느 한 측면에 따른 다가 화합물 또는 컨스트럭트를 제조하는 방법.
측면 68. 측면 67에 있어서, 측면 1 내지 34 중 어느 한 측면에 따른 아미노산 서열 또는 측면 65에 따른 1가 컨스트럭트를 하나 이상의 링커를 통해 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛에 연결시키는 단계를 포함하는, 측면 37 내지 64 중 어느 한 측면에 따른 다가 화합물 또는 컨스트럭트를 제조하는 방법.
측면 69. 측면 1 내지 34 중 어느 한 측면에 따른 아미노산 서열, 해당 화합물 또는 컨스트럭트를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 수득될 수 있는 것인 측면 35 내지 64 중 어느 한 측면에 따른 화합물 또는 컨스트럭트, 또는 측면 65에 따른 1가 컨스트럭트를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열.
측면 70. 측면 69에 있어서, 유전자 컨스트럭트 형태의 것인 핵산 또는 뉴클레오티드 서열.
측면 71. 측면 1 내지 34 중 어느 한 측면에 따른 아미노산 서열, 해당 화합물 또는 컨스트럭트를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 수득될 수 있는 것인 측면 35 내지 64 중 어느 한 측면에 따른 화합물 또는 컨스트럭트, 또는 측면 65에 따른 1가 컨스트럭트를 발현하거나, 또는 적합한 환경하에서 발현시킬 수 있고/거나; 측면 69에 따른 핵산 또는 뉴클레오티드 서열, 또는 측면 70에 따른 유전자 컨스트럭트를 포함하는 것인 숙주 또는 숙주 세포.
측면 72. 적어도
a) 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체 중에서, 또는 또 다른 적합한 발현 시스템에서 측면 69에 따른 핵산 또는 뉴클레오티드 서열, 또는 측면 70에 따른 유전자 컨스트럭트를 발현시키는 단계, 이어서 임의로
b) 상기와 같이 수득된 측면 1 내지 34 중 어느 한 측면에 따른 아미노산 서열, 해당 화합물 또는 컨스트럭트를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 수득될 수 있는 것인 측면 35 내지 64 중 어느 한 측면에 따른 화합물 또는 컨스트럭트, 또는 측면 65에 따른 1가 컨스트럭트를 단리 및/또는 정제시키는 단계를 포함하는, 측면 1 내지 34 중 어느 한 측면에 따른 아미노산 서열, 해당 화합물 또는 컨스트럭트를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 수득될 수 있는 것인 측면 35 내지 64 중 어느 한 측면에 따른 화합물 또는 컨스트럭트, 또는 측면 65에 따른 1가 컨스트럭트를 제조하는 방법.
측면 73. 적어도
a) 측면 71에 따른 숙주 또는 숙주 세포가 측면 1 내지 34 중 어느 한 측면에 따른 적어도 하나의 아미노산 서열, 해당 화합물 또는 컨스트럭트를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 수득될 수 있는 것인 측면 35 내지 64 중 어느 한 측면에 따른 화합물 또는 컨스트럭트, 또는 측면 65에 따른 1가 컨스트럭트를 발현 및/또는 생산할 수 있도록 하는 조건하에서 상기 숙주 또는 숙주 세포를 배양 및/또는 유지시키는 단계, 이어서 임의로
b) 상기와 같이 수득된 측면 1 내지 34 중 어느 한 측면에 따른 아미노산 서열, 해당 화합물 또는 컨스트럭트를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 수득될 수 있는 것인 측면 35 내지 64 중 어느 한 측면에 따른 화합물 또는 컨스트럭트, 또는 측면 65에 따른 1가 컨스트럭트를 단리 및/또는 정제시키는 단계를 포함하는, 측면 1 내지 34 중 어느 한 측면에 따른 아미노산 서열, 해당 화합물 또는 컨스트럭트를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 수득될 수 있는 것인 측면 35 내지 64 중 어느 한 측면에 따른 화합물 또는 컨스트럭트, 또는 측면 65에 따른 1가 컨스트럭트를 제조하는 방법.
측면 74. 측면 1 내지 34 중 어느 한 측면에 따른 적어도 하나의 아미노산 서열, 측면 35 내지 64 중 어느 한 측면에 따른 화합물 또는 컨스트럭트, 또는 측면 65에 따른 1가 컨스트럭트, 또는 측면 69 또는 70에 따른 핵산 또는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물.
측면 75. 측면 74에 있어서, 약학 조성물인 조성물.
측면 76. 측면 74에 있어서, 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제, 및/또는 애주번트를 추가로 포함하고, 임의로 하나 이상의 추가로 약제학적으로 활성인 폴리펩티드 및/또는 화합물을 포함하는 약학 조성물인 조성물.
측면 77. 측면 1 내지 34 중 어느 한 측면에 따른 적어도 하나의 아미노산 서열, 측면 35 내지 64 중 어느 한 측면에 따른 화합물 또는 컨스트럭트, 또는 측면 65에 따른 1가 컨스트럭트, 또는 측면 75 내지 76 중 어느 한 측면에 따른 조성물을 약제학적으로 활성인 양으로 그를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, IL-6과, IL-6R과, IL-6/IL-6R 복합체와 관련이 있고/거나, IL-6 및/또는 IL-6, IL-6R 및/또는 IL-6/IL-6R 복합체가 관여하는 신호전달 경로 및/또는 생물학적 작용 및 반응과 관련된 질환 및 질병 중 적어도 하나를 예방 및/또는 치료하는 방법.
측면 78. 측면 77에 따라, IL-6R과, IL-6/IL-6R 복합체와 관련이 있고/거나, IL-6 및/또는 IL-6/IL-6R 복합체가 관여하는 신호전달 경로 및/또는 생물학적 작용 및 반응과 관련된 상기 질환 및 질병이 패혈증, 각종 형태의 암, 골재흡수, 골다공증, 악액질, 건선, 혈관사이세포 증식성 사구체신염, 카포시 육종, AIDS 관련 림프종, 및 염증성 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
측면 79. 측면 78에 따라, 상기 각종 형태의 암이 다발 골수종질환(MM), 신장 세포 암종(RCC), 혈장 세포 백혈병, 림프종, 림프종, B 림프구증식 질병(BLPD), 및 전립선암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
측면 80. 측면 78에 따라, 상기 염증성 질환이 류마티스 관절염, 전신적으로 발병된 청소년성 특발성 관절염, 고감마글로불린혈증, 크론병, 궤양성 대장염, 전신 홍반 루푸스(SLE), 다발 경화증, 캐슬만씨 병, IgM 감마글로불린병증, 심장 점액종, 천식, 알레르기성 천식 및 자가면역 인슐린 의존 당뇨병으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
측면 81. 측면 1 내지 34 중 어느 한 측면에 따른 적어도 하나의 아미노산 서열, 측면 35 내지 64 중 어느 한 측면에 따른 화합물 또는 컨스트럭트, 또는 측면 65에 따른 1가 컨스트럭트, 또는 측면 75 내지 76 중 어느 한 측면에 따른 조성물을 약제학적으로 활성인 양으로 그를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 측면 1 내지 34 중 어느 한 측면에 따른 아미노산 서열, 측면 35 내지 64 중 어느 한 측면에 따른 화합물 또는 컨스트럭트, 또는 측면 65에 따른 1가 컨스트럭트를 그를 필요로 하는 피험체에게 투여함으로써 예방 및/또는 치료될 수 있는 적어도 하나의 질환 또는 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법.
측면 82. IL-6과, IL-6R과, IL-6/IL-6R 복합체와 관련이 있고/거나, IL-6, IL-6R 및/또는 IL-6/IL-6R 복합체가 관여하는 신호전달 경로 및/또는 생물학적 작용 및 반응과 관련된 질환 및 질병들 중 적어도 하나의 예방 및/또는 치료를 위한 약학 조성물의 제조에서, 및/또는 측면 77 내지 81 중 어느 한 측면에 따른 방법들 중 하나 이상에서 사용하기 위한 측면 1 내지 34 중 어느 한 측면에 따른 아미노산 서열, 측면 35 내지 64 중 어느 한 측면에 따른 화합물 또는 컨스트럭트, 또는 측면 65에 따른 1가 컨스트럭트의 용도.
측면 83. 측면 1 내지 34 중 어느 한 측면에 있어서, 측면 35 내지 64 중 어느 한 측면에 있어서, 또는 측면 65에 있어서, IL-6과, IL-6R과, IL-6/IL-6R 복합체와 관련이 있고/거나, IL-6, IL-6R 및/또는 IL-6/IL-6R 복합체가 관여하는 신호전달 경로 및/또는 생물학적 작용 및 반응과 관련된 질환 및 질병들 중 적어도 하나의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한, 및/또는 측면 77 내지 81 중 어느 한 측면에 따른 방법 중 하나 이상에서 사용하기 위한, 아미노산 서열, 화합물 또는 컨스트럭트, 또는 1가 컨스트럭트.
측면 84. 측면 1 내지 34 중 어느 한 측면에 따른 아미노산 서열, 측면 35 내지 64 중 어느 한 측면에 따른 화합물 또는 컨스트럭트, 또는 측면 65에 따른 1가 컨스트럭트의 유도체.
측면 85. 측면 84에 있어서, IL-6R에 특이적으로 결합할 수 있는 유도체.
측면 86. 측면 84 내지 85 중 어느 한 측면에 있어서, 측면 1 내지 34 중 어느 한 측면에 따른 아미노산 서열 그 자체, 측면 35 내지 64 중 어느 한 측면에 따른 화합물 또는 컨스트럭트 그 자체, 또는 측면 65에 따른 1가 컨스트럭트 그 자체보다 적어도 1.5배, 바람직하게, 적어도 2배, 예컨대, 적어도 5배, 예를 들면, 적어도 10배, 또는 20배 초과로 더 큰 혈청 반감기를 갖는 것인 유도체.
측면 87. 측면 84 내지 86 중 어느 한 측면에 있어서, 측면 1 내지 34 중 어느 한 측면에 따른 상응하는 아미노산 서열 그 자체, 측면 35 내지 64 중 어느 한 측면에 따른 상응하는 화합물 또는 컨스트럭트 그 자체, 또는 측면 65에 따른 상응하는 1가 컨스트럭트 그 자체와 비교하여, 1시간 초과, 바람직하게, 2시간 초과, 더욱 바람직하게, 6시간 초과, 예컨대, 12시간 초과, 또는 심지어는 24, 48 또는 72시간 초과로 증가한 혈청 반감기를 갖는 것인 유도체.
측면 88. 측면 84 내지 87 중 어느 한 측면에 있어서, 인간에서 적어도 약 12시간, 바람직하게, 적어도 24시간, 더욱 바람직하게, 적어도 48시간, 더욱더 바람직하게, 적어도 72시간 이상; 예를 들면, 적어도적어도 5일(예컨대, 약 5 내지 10일), 바람직하게, 적어도 9일(예컨대, 약 9 내지 14일), 더욱 바람직하게, 적어도 약 10일(예컨대, 약 10 내지 15일), 또는 적어도 약 11일(예컨대, 약 11 내지 16일), 더욱 바람직하게, 적어도 약 12일(예컨대, 약 12 내지 18일 이상), 또는 14일(예컨대, 약 14 내지 19일) 초과의 혈청 반감기를 갖는 것인 유도체.
측면 89. 측면 84 내지 88 중 어느 한 측면에 있어서, 페길화된 유도체인 것인 유도체.
측면 90. 측면 84 내지 89 중 어느 한 측면에 따른 적어도 하나의 유도체를 포함하는 조성물.
실시예
I. IL -6R 결합 나노바디의 단리
실시예 1: 물질
IL-6R 결합 나노바디의 단리에 사용된 물질은 표 C-1에 제시되어 있다.
EP 0628639에 기술되어 있는 항인간 IL-6R 면역글로불린에 대한 대표적인 예 2가지(Fab 단편 및 전체 크기의 IgG)를 생성하고, 이를 참조 화합물로서 사용하였다. 소위 "RVLa"라 불리는 L쇄(EP 0628639 B1, 표 2, 버전 (a) 참조), 및 "RVHf"라 불리는 H쇄(EP 0628639 B1, 표 3, 버전 (f) 참조)에 기초하여 Fab 단편 및 전체 크기의 IgG를 구성하였다. EP 0528639 B1(예를 들면, [0074]번째 문단 참조)에 따르면, 상기 L쇄 및 상기 H쇄를 포함하는 재성형화된 인간 항체는 인간 IL-6R에 대한 마우스 모노클로날 항체인 PM1(다시 EP 0628639 B1 [009]번째 문단, 및 상기 문헌에서 인용되는 추가의 참고 문헌 참조)과 동일한 수준으로 인간 IL-6R에 결합할 수 있는 능력을 보였기 때문에 참조 화합물을 구성하고자 하는 목적을 위해 이들 특정 L쇄 및 H쇄를 선택하였다.
전장의 참조 IgG는 서열번호 1(중쇄) 및 서열번호 2(경쇄)로 이루어진 아미노산 서열로 구성되었다. Fab 단편은 서열번호 3(인간 IgG1의 CH1 부위에 융합된 중쇄 부위 VLb 및 VHf) 및 서열번호 4(인간 C카파에 융합된 재성형화된 인간 PM1 경쇄 가변)로 이루어진 아미노산 서열로 구성되었다.
부분적으로 중복되는 올리고뉴클레오티드를 사용하는 조립 PCR에 의해 코딩 DNA 단편을 생성하였다. E. 콜라이(E. coli)의 주변 세포질에서 작용성의 이황화 결합된 Fab 단편을 발현시킬 수 있는 단일, 비시스트론 벡터 내로 PCR 생성물을 클로닝하였다. 경쇄 및 중쇄에 대한 유전자를 함유하는 2개의 발현 벡터로 형질감염된 CHO 세포 중에서 전장의 IgG를 생산하였다. 중쇄를 코딩하는 유전자는 VHf를 인간 IgG1의 불변 부위에 융합시킴으로써 제조하였다. 경쇄는 EP 0628639에 기술되어 있다.
실시예 2: 면역화
표 C-2에 기술된 면역화 스케줄에 따라 인간 IL-6R(Peprotech)로 라마 2마리(81 및 82)를 면역화시켰다.
면역화 스케줄 종결 후, ELISA에 의해 각 동물에서 면역 반응을 분석하였다. 이를 위해 비오틴화된 IL-6R(2 ㎍/ml)을 뉴트라비딘으로 코팅된 마이크로타이터 플레이터에 포획시켰다. 0, 28, 39 및 43일째 수집된 혈청 샘플에 대한 일련의 희석액(출발 희석율 1/500)을 첨가하고, 결합된 라마 IgG는 염소 항라마 IgG HRP 표지된 것을 첨가함으로써 검출하였다. TMF를 기질로서 사용하였다. 결과는 도 1에 제시되어 있다.
면역 반응 또한 FACS에 의해 분석하였다: 0, 28, 및 43일째 수집된 혈청 샘플에 대한 일련의 희석액(출발 희석율 1/100)을 U266 세포(인간 골수종)와 함께 인큐베이션시켰다. 결합된 라마 IgG는 염소 항라마 IgG FITC 표지된 것에 의해 검출하였다. 결과는 도 2에 제시되어 있다.
종합하면, 상기 데이터는 두 동물 모두가 IL-6R에 대해 우수한 면역 반응을 생성하였고, 라마 IgG 분획 중 적어도 하나가 U266 세포의 표면 상에 있는 IL-6R을 인식한다는 것을 나타낸다.
실시예 3: 라이브러리 구성
나노바디 코딩 유전자 단편을 증폭시키기 위해 RT-PCR에 대한 출발 물질로서 PBL 및 림프절로부터 추출된 RNA를 사용하였다. LacZ 프로모터, 콜리파지 plll 단백질 코딩 서열, 암피실린 또는 카르베니실린에 대한 내성 유전자, 다중클로닝 부위 및 gen3 리더 서열을 함유하는 pUC119로부터 유도된 발현 벡터 내로 상기 단편을 클로닝하였다. 나노바디 코딩 서열의 프레임내에서, 벡터는 C 말단 c-myc 태그 및 (His)6 태그에 대해 코팅하였다. 표준 프로토콜에 따라 파지를 제조하고, 4℃에서 필터 멸균화를 수행한 후, 추가 사용을 위해 보관하였다. 컨스트럭트 라이브러리의 특징은 표 C-3에 제시되어 있다.
실시예 4: 선별
표 C-4에 요약되어 있는 바와 같은 다양한 조건을 사용하여 상기 라이브러리로 선별을 수행하였다.
모든 조건에 대해 단 1회 주기로 선별을 수행하였다. 각각의 선별 산출물을 농축 배수(대조군에 대해 상대적인, 용리액 중에 존재하는 파지의 수), 다양성(Hinfl 프로파일링), 및 IL-6R 양성 클론의 비율(%)(ELISA)에 대해 분석하였다. 이러한 파라미터에 기초하여 추가 분석을 위한 최고의 선별물을 선택하였다. 이를 위해, LacZ 프로모터, 암피실린 또는 카르베니실린에 대한 내성 유전자, 다중클로닝 부위 및 gen3 리더 서열을 함유하는 pUC119로부터 유도된 발현 벡터 내로 각 선별로부터 얻은 산출물을 풀로서 재클로닝하였다. 나노바디 코딩 서열의 프레임내에서, 벡터는 C 말단 c-myc 태그 및 (His)6 태그에 대해 코팅하였다. 콜로니를 채취하고, 96 딥 웰 플레이트 (부피 1 ml) 중에서 성장시키고, 나노바디 발현을 위해 IPTG를 첨가함으로써 유도시켰다. 표준 프로토콜에 따라 주변 세포질 추출물을 제조하였다.
실시예 5: 스크리닝
주변 세포질 추출물을 먼저 IL-6-IL-6R 상호작용을 억제시킬 수 있는 그의 능력에 대해 분석하였다. 이를 위해, 도 3에 개략적으로 도시되어 있는 2개의 독립적인 알파스크린 분석법을 셋업하였다. 분석법 1에서, 주변 세포질 추출물을 가용성 IL-6 수용체(1 nM), 비오틴화된 IL-6(3 nM), 스트렙타비딘으로 코팅된 공여체 비드 및 MAb BN-12로 코팅된 억셉터 비드(20 ㎍/ml)와 함께 인큐베이션시켰다. 상기 분석법에서, 양성인 나노바디는 IL-6/IL-6R 상호작용 또는 IL-6R-MAb BN-12 상호작용을 억제시킬 수 있다. 이들 2가지의 가능성 간의 식별을 위하여 제2 분석법을 셋업하였다(분석법 2). 상기 분석법에서는 주변 세포질 추출물을 바이오-IL-6(0.3 nM), 스트렙타비딘으로 코팅된 공여체 비드 및 MAb BN-12로 코팅된 억셉터 비드(10 ㎍/ml)와 함께 인큐베이션시켰다. 분석법 1에서는 양성이지만, 분석법 2에서는 음성을 띠는 나노바디를 IL-6-IL-6R 억제제로서 간주하였다.
상기 두 분석법 모두에서 주변 세포질 추출물을 25배로 희석시켰는데, 그의 최종 농도는 대략 40 nM이었다. 스크리닝 노력의 성과로 얻은 통계학적 결과에 관한 개요는 하기 표 C-5에 제시되어 있다. 비아코어에서의 오프 속도 분석 및 DNA 서열 분석을 위해 가장 큰 저해능을 보이는 나노바디를 선별하였다. 도 4는 세포 기반 분석법으로의 추가 분석을 위해 선별된 억제성 나노바디의 단백질 서열을 제시한다. 표 C-6은 상기 억제성 나노바디의 K오프 값을 제시한다.
실시예 6: 나노바디 발현 및 정제
c-myc, (His)6 태깅된 단백질로서 선별된 나노바디를 배양물 부피 50 또는 250 ml로 E. 콜라이 중에서 발현시켰다. 1 mM IPTG를 첨가하여 발현을 유도하고, 37℃에서 4h 동안 계속하여 유지시켰다. 세포 배양물을 스피닝한 후, 펠릿을 냉동-해동시켜 주별 세포질 추출물을 제조하였다. 이러한 추출물을 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC: immobilized metal affinity chromatography)에 대한 출발 물질로서 사용하였다. 150 mM 이미다졸을 사용하여 칼럼으로부터 나노바디를 용리시킨 후, 이어서 PBS에 대해 투석시켰다. 전체 수율 및 세포 배양물 1 ℓ당 수율은 표 C-7에 열거되어 있다. 정제된 나노바디(PMP28E11 제외)의 SDS PAGE는 도 5에 제시되어 있다.
실시예 7: 단백질 기반 경쟁 분석법
IL-6/IL-6R 상호작용의 억제에 대해 14개의 정제된 나노바디를 알파스크린으로 테스트하였다. 정제된 단백질의 일련의 희석액(농도 범위 500 nM-10 pM)을 IL-6R(0.3 nM)에 첨가한 후, 15min 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 3 nM 바이오-IL-6 및 BN-12로 코팅된 억셉터 비드를 첨가하고, 상기 혼합물을 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 최종적으로, 스트렙타비딘 공여체 비드를 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이터에서 인큐베이션시킨 후, 인비전(Envision) 마이크로플레이트 판독기 상에서 플레이트를 판독하였다. 실시예 1에 기술되어 있는 BR-6 및 Fab 단편은 참조로서 포함되었다. 결과는 도 6에 제시되어 있다.
14개의 나노바디 모두에 대해 투여량-반응 곡선을 관찰하였고, IC50 값의 범위는 48 pM 내지 1.7 nM이었다(표 C-8). 상기 분석법에서 효능이 가장 큰 나노바디는 PMP32C9 및 PMP35H4였다. PMP33A3의 경우에는 IL-6/IL-6R 상호작용에 대해 단지 부분적인(~50%) 억제만이 이루어질 수 있었다.
실시예 8: 수득된 나노바디의 친화도 측정
비아코어 3000 기기 상에서 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 실시예 1에 기술되어 있는 개별 나노바디 및 참조 Fab 단편의 친화도 상수(Kd)를 측정하였다. 간략하면, IL-6R을 800-1,000 RU의 밀도로 CM5 센서 칩에 아민 커플링시켰다. 1 내지 50 nM 사이의 5개의 다른 농도로 나노바디를 주입하였다. 모든 실험에서 유속은 45 ㎕/min이었다. 회합 및 해리 단계는 각각 3 및 10min이었다. 글리신/HCl(pH 1.5)을 사용하여 칩을 재생시켰다. 상이한 농도의 나노바디에 대한 결합 곡선을 사용하여 동력학적 파라미터 k온, k오프 및 Kd를 계산하였다(표 C-9).
실시예 9: XG1 분석법에서 나노바디의 세포 기반 효능
정제된 나노바디 모두를 XG1 분석법으로 테스트하였다. XG1은 IL-6 의존성 인간 골수종 세포주이다. ~20 pg/ml의 IL-6에서 최대 증식의 절반 만큼의 증식이 이루어졌다. 분석법은 본질적으로 문헌 [Zhang et al., (1994, Blood 83:3654-3663)]에 기술되어 있는 바와 같이, 수행하였다. 실시예 1에 기술되어 있는 참조 Fab 단편은 참조로서 포함되었다. IC50 값의 범위는 표 C-10에 열거되어 있는 바와 같이 90 pM 내지 50 nM이었다. 나노바디로 이루어진 작은 서브세트를 또한 상기 분석법으로 1 mg/ml HSA 존재하에 테스트하였다.
실시예 10: TF1 분석법에서 나노바디의 세포 기반 효능
또한, IL-6이 세포 표면 상에 있는 IL-6R에 결합하는 것을 차단함으로써 TF1 세포(ECACC 번호 93022307, 문헌 [1989, J. Cell Physiol., 140: 323; 1993, Exp. Cell Res., 208:35)의 IL-6 의존성 증식을 억제시킬 수 있는 그의 능력에 대해 나노바디를 테스트하였다. 이를 위해, 나노바디의 일련의 희석액을 고정량의 TF1 세포와 함께 37℃에서 2시간 동안 사전 인큐베이션시켰다. 이어서, IL-6을 최종 농도 2 ng/ml까지 첨가하였다. 72시간 동안 계속하여 IL-6 의존성 세포 증식이 이루어지도록 하고, 이를 삼중수소로 표지된 티미딘의 혼입에 의해 측정하였다. IC50 값은 표 C-11에 열거되어 있다.
실시예 11: IL -6R에의 결합에 대한 참조 Fab 와의 경쟁
알파스크린 기반 분석법으로 실시예 1에 기술되어 있는 참조 Fab의 IL-6R에의 결합을 억제시킬 수 있는 그의 능력에 대해 14개의 나노바디 모두를 테스트하였다. 본 분석법에서, 100 nM의 정제된 나노바디를 0.4 nM의 비오틴화된 IL-6R과 함께 인큐베이션시켰다. 참조 Fab로 코팅된 억셉터 비드 및 스트렙타비딘으로 코팅된 공여체 비드를 첨가하고, 참조 Fab/IL-6R 복합체의 농도를 측정하였다. 나노바디 존재하에서 수득한 값을, 나노바디가 첨가되지 않은 대조군과 비교하였고, 두 값들 사이의 비(%로 표시)는 표 C-12에 열거되어 있다. IL-6R03을 제외한 나노바디 모두 참조 Fab의 IL-6R에의 결합을 억제시키지 못하거나, 또는 단지 부분적으로만 억제시키는 것으로 나타났고, 이는 그의 에피토프가 참조 Fab의 에피토프와 중복되지 않거나, 단지 부분적으로만 중복된다는 것을 시사한다.
실시예 12: 나노바디의 U266 세포에의 결합
나노바디의, U266 세포 상에 발현된 막 결합 IL-6R에의 결합에 대해 FACS로 분석하였다. 선별된 클론(IL-6R04, IL-6R09, IL-6R11, IL-6R13 및 IL-6R14)으로부터의 정제된 나노바디에 대해 분석을 수행하였다. 결과는 도 7에 제시되어 있다. 나노바디 모두 세포 표면에 발현된 인간 IL-6R에 결합할 수 있었다.
실시예 13: 나노바디의 혈장 유래의 인간 IL -6R에의 결합
가용성 IL-6R은 80-400 ng/ml의 농도로 인간 혈장 중에 존재한다. 나노바디 IL-6R03 IL-6R04 및 IL-6R13이 혈장 유래의 IL-6R에 결합할 수 있는지에 대해 측정하기 위해, 인간 혈장이 나노바디의 U266 세포에의 결합에 대해 미치는 효과를 평가하였다. 인간 혈장은 U266 세포에의 결합을 억제시켰는데, 이는 나노바디 3개 모두가 혈장 유래의 인간 IL-6R에 결합할 수 있다는 것을 시사한다(도 8 참조).
실시예 14: 마우스 IL -6R에의 나노바디의 교차 결합성
나노바디의 마우스 IL-6R에의 교차 결합성을 ELISA로 분석하였다. 이를 위해, 500 nM의 나노바디를 1 ㎍/ml 마우스 및 인간 IL-6R로 코팅된 마이크로타이터 플레이터에 적용시켰다. 항myc 및 항마우스-HRP를 각각 제1 및 제2 항체로서 사용하여 검출을 수행하였다. 광학 밀도가 도 10에 제시되어 있다. 나노바디 테스트 중 어느 경우에도 마우스 IL-6R에의 결합은 관찰되지 않았다.
실시예 15: IL -6R 결합 나노바디의 단리에 관한 요약
2마리의 라마를 재조합 IL-6R로 면역화시킨 결과, IL-6과 IL-6R 사이의 상호작용을 차단할 수 있는 독특한 나노바디 14개로 이루어진 패널을 얻을 수 있었다. 상기 패널을 상세하게 모든 실험 데이터에 기초하여 분석하였다. 추가 개발을 위해 나노바디 IL-6R03, IL-6R04 및 IL-6R13을 선별하였다. 가장 중요한 나노바디의 특징을 표 C-13에 요약해 두었다.
II . 항 IL -6R 나노바디 포맷팅
실시예 16: 다가 컨스트럭트 제조
이전 문단에 기술되어 있는 항IL-6R 나노바디 또한 C 말단 항SA 나노바디(ALB1), 9 아미노산 Gly/Ser 링커 및 N 말단 항IL-6R 나노바디로 이루어진 이특이성 컨스트럭트로서 발현되었다. 추가로, 모두가 9 아미노산 Gly/Ser 링커로 연결되어 있는 C 말단 및 N 말단 항IL-6R 나노바디, 중간에 항SA 나노바디(ALB1)로 이루어진 3가의 이특이성 나노바디 4개를 구성하였다. 이들 나노바디의 ID는 표 C-14에 열거되어 있다.
실시예 17: 이특이성 항 IL -6R 나노바디의 발현
이특이성 나노바디 컨스트럭트를 c-myc, (His)6-태깅된 단백질로서 E. 콜라이에서 발현시킨 후, 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC: size exclusion chromotagraphy)에 의해 배양 배지로부터 정제시켰다. 전체 수율 및 세포 배양물 1 ℓ당 수율은 표 C-15에 열거되어 있다. 정제된 나노바디의 SDS-PAGE는 도 11에 제시되어 있다.
실시예 18: 단백질 기반 경쟁 분석법
알파스크린 분석법으로 IL-6/IL-6R 상호작용 억제에 대해 정제된 이특이성 나노바디를 테스트하였다. 정제된 단백질의 일련의 희석액(농도 범위 250 nM - 5 pM)을 IL-6R(0.3 nM)에 첨가한 후, 15min 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 3 nM 바이오-IL-6 및 BN-12로 코팅된 억셉터 비드를 첨가하고, 상기 혼합물을 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 최종적으로, 스트렙타비딘 공여체 비드를 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이터에서 인큐베이션시킨 후, 인비전 마이크로플레이트 판독기 상에서 플레이트를 판독하였다. 실시예 1에 기술되어 있는 BR-6 및 Fab 단편은 참조로서 포함되었다. 결과는 도 12에 제시되어 있다.
나노바디 모두에 대해 투여량-반응 곡선을 관찰하였고, IC50 값의 범위는 123 pM 내지 1.67 nM이었다(표 C-16).
실시예 19: XG1 분석법에서 나노바디의 세포 기반 효능
이특이성 나노바디를 XG1 증식 분석법으로 테스트하였다. IC50 값의 범위는 60 pM 내지 65 nM이었다. 나노바디를 또한 상기 분석법으로 1 mg/mL 인간 혈청 알부민 존재하에 분석하였다. 이특이성 나노바디의 경우 IC50 값의 범위는 190 pM 내지 90 nM이었다. 실시예 1에 기술되어 있는 참조 IgG는 참조로서 포함되었다. IC50 값은 표 C-17에 제시되어 있다.
포맷팅된 나노바디를 알부민 존재하에서 XG1 분석법으로 테스트하였을 때 효능 손실이 관찰되었다. 혈청 알부민 존재하에서 포맷팅된 나노바디 IL-6R24, IL-6R44 및 IL-6R49의 효능은 참조 IgG보다 우월하거나, 또는 그와 동일한 범위에 있었다.
실시예 20: IL -6R에 대한 친화도 측정
이특이성 나노바디의 IL-6R에의 결합을 표면 플라스몬 공명에 의해 분석하였다. 동력학적 파라미터를 측정하고, 이는 표 C-18에 열거되어 있다. 2가 포맷형의 나노바디(IL-6R23, IL-6R24, IL-6R33)의 경우, IL-6R에 대한 친화도에 있어서 어떤 유의적인 손실은 관찰되지 않았다.
실시예 21: 혈청 알부민에 대한 친화도 측정
포맷팅된 나노바디의 혈청 알부민에의 결합을 표면 플라스몬 공명에 의해 분석하였다. 친화도 상수(Kd)를 측정하였고, 이는 표 C-19에 제시되어 있다. 비교를 위해 알부민 결합 나노바디 ASb-1(서열번호 97)을 포함시켰다. 친화도는, 동일한 항혈청 알부민 빌딩 블록을 함유하는 앞서 포맷팅된 나노바디의 범위였는데, 그러나, 일반적으로 친화도는 더 낮게 관찰되었다. 이는 특히 마우스 혈청 알부민 친화도의 경우에 그러하였다.
실시예 22: 포맷팅된 나노바디의 U266 세포에의 결합
선별된 클론으로부터의 포맷팅된 나노바디(IL-6R23 IL-6R24, IL-6R29 IL-6R33, IL-6R44 및 IL-6R53)의 U266 세포에의 결합을 FACS에 의해 분석하였다. 결과는 도 13 및 14에 제시되어 있다. 2가 나노바디 IL-6R23, IL-6R24, IL-6R29 및 IL-6R33은 1가 빌딩 블록과 비교하여 결합이 감소된 것으로 나타난 반면, 3가 나노바디 IL-6R44 및 IL-6R53의 경우, 결합은 유사한 것으로 관찰되었다.
III . 항 IL -6R 나노바디의 서열 최적화
실시예 23: 서열 최적화 전략법
나노바디 IL-6R03, IL-6R04 및 IL-6R13의 단백질 서열을 각각 가장 높은 정도로 상동성을 공유하는 5개의 가장 가까운 인간 생식계열과 함께 정렬하였다(도 15). 인간 생식계열 컨센서스 서열과 비교하여 나타나는 골격 부위 중의 아미노산 차이를 색상으로 표시하였다. 인간 대응부로 전환시키기 위해서는 밝은 회색으로 강조 표시된 아미노산 차이를 선택한 반면, 진한 회색으로 강조 표시된 아미노산은 원상태 그대로 남겨두었다. 먼저, 3개의 나노바디 각각에 대한, 서열이 최적화된 변이체 4개로 이루어진 패널을 생성하였다(1 단계). 이들 변이체를 다수의 파라미터에 대해 분석하고, 수득한 결과를 사용하여 제2 나노바디 세트를 디자인하였다(2 단계). 서열이 최적화된 변이체 모두의 단백질 서열은 도 16에 제시되어 있다.
실시예 24: 서열 최적화 1 단계
서열 최적화 과정 중 1 단계에서, 하기 12개의 변이체를 생성하고 분석하였다:
IL-6R03: IL-6R61, IL-6R62, IL-6R63 및 IL-6R64
IL-6R04: IL-6R71, IL-6R72, IL-6R73 및 IL-6R74
IL-6R13: IL-6R81, IL-6R82, IL-6R83 및 IL-6R84
상기 상이한 변이체를 이루는 아미노산 서열은 도 16에 제시되어 있다.
IL -6/ IL -6R 경쟁 분석법에서의 서열이 최적화된 나노바디에 대한 평가
IL-6/IL-6R 상호작용의 억제에 대해 IL-6R03, IL-6R04 및 IL-6R13의 서열이 최적화된 클론을 알파스크린에서 테스트하였다. 정제된 나노바디의 일련의 희석액을 IL-6R(0.3 nM)에 첨가한 후, 15min 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 3 nM 바이오-IL 6 및 BN-12로 코팅된 억셉터 비드를 첨가하고, 상기 혼합물을 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 최종적으로, 스트렙타비딘 공여체 비드를 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이터에서 인큐베이션시킨 후, 인비전 마이크로플레이트 판독기 상에서 플레이트를 판독하였다. 모체 클론은 참조로서 포함되었다. 결과는 도 17, 18, 및 19에 제시되어 있다.
IL-6R03의 서열이 최적화된 변이체(IL-6R61, 62 및 64)의 IC50 값은 모두 IL-6R03의 IC50 값의 2배 이내인 반면, IL-6R63은 ~4배 더 낮은 IC50 값을 나타내었다.
IL-6R04의 서열이 최적화된 변이체의 경우, IC50 값에 있어 IL-6R04와 4개의 서열이 최적화된 변이체 사이에는 어떤 유의적인 차이도 관찰되지 않았다.
IL-6R13의 서열이 최적화된 변이체의 경우, IL-6R81 및 IL-6R83의 IC50 값은 IL-6R13의 값과 거의 동일한 반면, 골격 2 중에 RAT→KGL 돌연변이를 보유하는 2개의 변이체(IL-6R82 및 IL-6R84)의 경우에는 그 효능이 하락하였다.
친화도 측정
IL-6R03, IL-6R04 및 IL-6R13의 서열이 최적화된 변이체를 또한 IL-6R에의 결합에 대해 비아코어 상에서 분석하였다. 동력학적 파라미터는 표 C-20에 열거되어 있다.
IL-6R03의 서열이 최적화된 변이체의 경우, IL-6R61, 62 및 63의 Kd 값은 모두 IL-6R03의 Kd 값의 2배 이내였다. IL-6R64의 Kd 값은 측정되지 않았다.
IL-6R04의 서열이 최적화된 변이체의 경우, Kd 값에 있어 IL-6R04와 4개의 서열이 최적화된 변이체 사이에는 어떤 유의적인 차이도 관찰되지 않았다.
IL-6R13의 서열이 최적화된 변이체의 경우, IL-6R81 및 IL-6R83의 Kd 값은 IL-6R13의 Kd 값과 매우 유사한 반면, 골격 2 중에 RAT→KGL 돌연변이를 보유하는 2개의 변이체(IL-6R82 및 IL-6R84)의 경우에는 그 친화도가 현저하게 하락하였다.
종합적으로, 이러한 관찰 결과는 알파스크린 기반 경쟁 분석법에서 수득한 결과와 완벽하게 일치한다.
실시예 25: 서열 최적화 2 단계
1 단계의 친화도 및 효능 데이터에 기초하여, 하기 변이체 세트를 생성할 것을 결정하였다:
● IL-6 R03의 경우, 변이체 IL-6R61, 62, 63 및 64에 존재하는 모든 돌연변이를 조합하여 ILR65를 수득하였다.
● IL -6 R04의 경우, 변이체 IL-6R71 72, 73 및 74에 존재하는 모든 돌연변이를 조합하여 ILR75를 수득하였다.
● IL -6 R13의 경우, FR2 중 RAT 서열에 상이한 돌연변이(돌연변이의 조합)를 보유하는 6개의 새로운 변이체(IL-6R85-90)로 구성된 세트를 생성하였다. 상기 서열이 최적화된 변이체는 친화도 및 효능, 둘 모두에 있어서 IL-6R13과 식별이 불가능하기 때문에, 상기 돌연변이를 IL-6R83 배경에 도입하였다.
서열이 최적화된 IL-6 R13 변이체의 오프 속도 분석
주변 세포질 추출물로서 서열이 최적화된 변이체 IL-6R85-90을 비아코어 상에서 분석하였다. 해리 곡선을 사용하여 k오프 값을 계산하였다(표 C-21). 나노바디 IL-6R87-89의 오프 속도는 IL-6R13과 유사한 반면, 나노바디 IL-6R85, 86 및 90의 오프 속도는 10배 더 높았다.
IL -6/ IL -6R 경쟁 분석법에서의 서열이 최적화된 나노바디에 대한 평가
주변 세포질 추출물로서 서열이 최적화된 변이체 IL-6R85-90을 알파스크린에서 IL-6/IL-6R 상호작용을 차단할 수 있는 그의 능력에 대해 테스트하였다. 결과는 도 20에 제시되어 있다.
IL-6/IL-6R 상호작용을 차단하는 데 있어 나노바디 IL-6R87, 88 및 89가 IL-6R13 변이체 85, 86 및 90보다 더 큰 효능을 갖고 있었다. 이러한 관찰 결과는 비아코어 상에서 관찰된 결과와 완변하게 일치하였다. 서열이 최적화된 IL-6R13 변이체의 아미노산 서열을 분석함으로써 돌연변이 T45L이 오프 속도 및 효능 감소의 원인이 된다는 것이 밝혀졌다. 그러므로, T45L 돌연변이를 포함하지 않는 대부분의 인간 변이체, 즉, IL-6R88을 추가의 특징 규명을 위해 선택하였다.
정제된 클론 IL-6R65 및 IL-6R75와 함께, 상기 변이체를 발현시키고, 정제하고, IL-6/IL-6R 상호작용 억제에 대해 분석하였다. 다른 서열이 최적화된 클론(IL-6R65, IL-6R75 및 IL-6R88)과, 그에 상응하는 서열이 최적화되지 않는 버전(각각 IL-6R03, IL-6R04 및 IL-6R13) 사이에는 어떤 유의적인 차이도 관찰되지 않았다(도 21)
친화도 측정
비아코어 3000 기기 상에서 표면 플라스몬 공명에 의해 IL-6R65, 75 및 88의 서열이 최적화된 클론의 인간 IL-6R에 대한 친화도 상수(Kd)를 측정하였다. 간략하면, 인간 IL-6R을 800-1,000 RU의 밀도로 CM5 센서 칩에 아민 커플링시켰다. 남아 있는 반응기는 불활성화시켰다. 0.5 내지 50 nM 범위의 다양한 농도에서 나노바디 결합을 평가하였다. 45 ㎕/min의 유속에서 4min 동안 각 샘플을 주입하여 칩에 결합되어 있는 항원에 결합할 수 있도록 하였다. 이어서, 나노바디를 포함하지 않는 결합 완충액을 동일한 유속으로 칩 위로 흘려 보냄으로써 결합된 나노바디의 해리가 일어날 수 있도록 하였다. IL-6R03, 04 및 13의 서열이 최적화된 변이체의 동력학적 파라미터는 표 C-22에 제시되어 있다.
친화도 상수에 있어 모체 나노바디와 서열이 최적화된 나노바디 사이에는 중요한 유의적인 차이도 관찰되지 않았다.
세포 기반 효능 분석법
서열이 최적화된 나노바디를 XG1 분석법으로 분석하였다. 결과는 도 22에 제시되어 있다. IC50 값은 표 C-23에 요약되어 있다. 세포 기반 분석법에서 IL-6 유도성 증식을 중화시키는 효능에 대해 최적화는 어떤 유의적인 효과도 없었다.
IV . 서열이 최적화된 나노바디에 대한 추가의 특징 규명
실시예 26; 시아노 IL -6R에 대한 친화도 측정
비아코어 3000 기기 상에서 SPR에 의해 시아노 IL-6R에 대한 IL-6R03-IL-6R65, IL-6R04-IL-6R75 및 IL-6R13-IL-6R88의 친화도를 측정하였다. 간략하면, 시아노 IL-6R을 760 RU의 밀도로 CM5 센서 칩에 아민 커플링시켰다. 남아 있는 반응기는 불활성화시켰다. 1.25 내지 100 nM 범위의 다양한 농도에서 나노바디 결합을 평가하였다. 45 ㎕/min의 유속에서 4min 동안 각 샘플을 주입하여 칩에 결합되어 있는 항원에 결합할 수 있도록 하였다. 이어서, 나노바디를 포함하지 않는 결합 완충액을 동일한 유속으로 칩 위로 흘려 보냄으로써 결합된 나노바디의 해리가 일어날 수 있도록 하였다. 동력학적 파라미터는 표 C-24에 제시되어 있다.
비록 IL-6R04 및 IL-6R75의 친화도 상수에서 상당한 차이가 있기는 하였지만, 시아노 IL-6R에 대한 두 분자 모두의 친화도는 인간에 대한 것보다는 훨씬 더 낮다는 것이 본 실험으로부터 명백해졌다. 대조적으로, 시아노 IL-6R에 대한 IL-6R03 및 IL-6R65의 친화도 상수는 인간 IL-6R에 대한 것과 동일 범위에 있었다. 놀랍게도, IL-6/IL-6R/gp130 복합체의 결정 구조(문헌 [Boulanger et al.])를 통해 IL-6R 상의 IL-6 결합 부위가 인간과 시아노 사이에는 완전하게 보존된다는 것이 밝혀졌으며, 이는 IL-6R04가 다른 에피토프에 결합한다는 것을 시사한다.
실시예 27: 인간 및 시아노 혈장을 사용한 혈장 효능 분석법에서의 서열이 최적화된 나노바디 테스트
IL-6R65 및 IL-6R75와 시노몰구스 원숭이 IL-6R과의 교차 반응성을 평가하기 위하여, sIL-6R의 공급원으로서 인간 또는 시아노 혈장을 사용함으로써 혈장 효능 ELISA를 수행하였다. 본 분석법에서, 나노바디의 일련의 희석액을 혈장 및 인간 IL-6(50 ng/mL)과 함께 사전 인큐베이션시켰다. 이어서, sIL-6R을 BN-12로 코팅된 플레이트 상에 포획시키고, 비오틴화된 폴리클로날 항체 및 스트렙타비딘-HRP를 사용하여 결합된 IL-6을 검출하였다.
도 23A에서 관찰할 수 있는 바와 같이, IL-6R201 및 IL-6R65, 둘 모두 IL-6의 인간 sIL-6R에의 결합을 완전하게 차단시킬 수 있었지만, IL-6R65는 IL-6R201보다, 및 실시예 1에 기술되어 있는 참조 IgG 및 참조 Fab보다 그 효능이 더 낮은 것으로 나타났다. 도 23B에서 관찰할 수 있는 바와 같이, IL-6R65는 실시예 1에 기술되어 있는 참조 Fab과 유사한 효능으로, IL-6의 시아노 sIL-6R에의 결합을 완전하게 차단시킬 수 있다.
실시예 28: IL -6이 고농도일 때 혈장 효능 분석법에서의 서열이 최적화된 나 노바디 테스트
또한, 인간 혈장에서의 혈장 효능 분석법을 사용하여 고농도의 IL-6을 차단시킬 수 있는 나노바디의 능력에 관해 시험하였다. IL-6R04, IL-6R65 및 실시예 1에 기술되어 있는 참조 Fab를 IL-6의 EC50(50 ng/mL) 및 IL-6의 EC95(885 ng/mL)에서 테스트하였다. 결과는 도 24에 도시되어 있다. 분명하게는, IL-6R04가 IL-6의 EC50에서 효능이 가장 큰 화합물인 것으로 나타났다. EC95에서 참조 Fab 및 IL-6R65는 특히 고농도에서 혈장 sIL-6R을 한층 더 완전하게 차단시킬 수 있었는데, 이는 상기 두 분자가 IL-6 결합 부위와 중복되는 에피토프에 결합한다는 것을 시사한다. 참조 Fab의 IC50은 0.55 nM로부터 8.47 nM로 증가하였고, IL-6R65의 IC50은 2.61 nM로부터 66.25 nM로 증가하였다.
실시예 29: 비아코어 경쟁 연구
IL-6 및 IL-6R65가 동시에 IL-6R에 결합할 수 있는지 여부에 관해 조사하기 위해 비아코어 실험을 수행하였다. 참조 Fab(도 25A), IL-6R201/75(도 25B) 또는 IL-6R65(도 25C)를 IL-6R 상에 포획시키고, 이어서, IL-6이 복합체에 결합할 수 있도록 하였다. 참조 Fab 및 IL-6R65과 IL-6의 결합은 거의 없는 것으로 관찰되었다. IL-6을 IL-6R 상에 포획시키고, 나노바디를 주입하였을 때, 3개의 나노바디 모두 복합체에 결합할 수 있는 것처럼 보였다. 그러나, 참조 Fab 및 IL-6R65의 경우, 이는 가능하게는 IL-6R에 대한 IL-6의 친화도가 더 낮은 것에 기인하여 IL-6이 치환되었기 때문이다.
마지막으로, 나노바디의 존재 또는 부재하에서 IL-6R이 IL-6으로 코팅된 칩에 결합할 수 있도록 하였다(도 25D). 이를 통해, 이전 결과, 즉, IL-6R은 참조 Fab 또는 IL-6R65의 존재하에서는 포획될 수 없다는 결과를 확인할 수 있었다.
결론적으로, 비아코어 에피토프 지도화 실험을 통해 참조 Fab 및 IL-6R65, 둘 모두가 IL-6과 동일한 에피토프를 표적화한다는 것이 밝혀졌다. IL-6R65 및 참조 Fab는 IL-6가 IL-6R에 결합하는 것을 경쟁적으로 차단시킬 수 있는 반면, IL-6R201은 이 나노바디가 상기 수용체에 결합된 상태일 때에는 IL-6이 IL-6R에 결합하는 것을 방해할 수 없었다.
V. IL-6 R65 의 친화도 성숙
실시예 30: 친화도 성숙에 대한 다양화 전략법
하기의 2가지 전략법을 사용하여 나노바디 IL-6R65의 CDR 부위를 무작위화시켰다.
1. 각 CDR 잔기를 측쇄의 화학적 성질이 유사한 잔기 세트로 대체시켰다:
K↔R
A↔S↔T
I↔L↔V
F↔Y
N↔D
Q↔E
G→A
M→L
H,C,W,P는 그대로 유지시켰다.
2. 각 CDR 잔기를 상기 위치 상에서 천연적으로 존재하는 아미노산 잔기로 이루어진 패널로 대체시켰다. 각 위치 마다의 다양성을 제한하기 위해 오직 각 위치에서 가장 빈번하게 존재하는 아미노산만을 도입하였다. 이러한 접근법은 CDR1 및 CDR2를 무작위하는 데에만 사용하였다.
상기 기술된 2가지 전략법을 사용하여 CDR1 및 2를 동시에 무작위화하고, CDR3은 별개로 전략법 1에 따라 무작위화시킴으로써 총 3개의 라이브러리를 얻었다. 축퇴성 올리고를 사용하여 PCR 중복 신장에 의해 3개의 라이브러리 모두를 그 내부로 도입시켰다(in-housing)시켰다. 라이브러리 각각에 대한 이론상의 다양도는 대략 1x10e6이었다. 나노바디 변이체를 코딩하는 단편을 파지 디스플레이 벡터 내로 클로닝하였다. 3개의 라이브러리 모두의 실제 크기는 약 1x10e8(100 x 이론상의 다양도의 적용 범위)이었다. 용액 중 상이한 농도의 비오틴화된 IL-6R(0, 1, 10 및 100 pM)을 사용하여 1회의 선별을 수행하였다. 상기 조건하에서 CDR3 라이브러리에 대한 농축이 관찰되지 않은 반면, CDR1/2 라이브러리 둘 모두에 대해서는 용량 의존성 농축이 일어난 것이 관찰되었다. ELISA에서 CDR1/2 라이브러리로부터 얻은 산출물을 주변 세포질 추출물로서 분석하고, 이어서, 신호가 가장 높은 클론을 비아코어 상에서 테스트하였다. ELISA에서 상위 30개의 클론은 2.1x10e-3 내지 2.6x10e-4 s-1 사이의 오프 속도를 나타내었다. 오프 속도가 가장 느린 나노바디 5개의 서열을 분석하고, 이를 발현시키고, 정제하였다(도 26).
실시예 31: 나노바디 발현 및 정제
c-myc, (His)6 태깅된 단백질로서 친화도 성숙된 나노바디를 배양물 부피 250 ml로 E. 콜라이 중에서 발현시켰다. 1 mM IPTG를 첨가하여 발현을 유도하고, 37℃에서 4h 동안 계속하여 유지시켰다. 세포 배양물을 스피닝한 후, 펠릿을 냉동-해동시켜 주별 세포질 추출물을 제조하였다. 이러한 추출물을 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)에 대한 출발 물질로서 사용하였다. 150 mM 이미다졸을 사용하여 칼럼으로부터 나노바디를 용리시킨 후, 이어서 하이프렙(Hiprep)26/10 칼럼 상에서 탈염시켰다.
실시예 32: 비아코어 상에서의 친화도 성숙된 변이체의 친화도 측정
비아코어 상에서 (서열이 최적화된) 나노바디 IL-6R65 및 5개의 친화도 성숙된 변이체를 분석하였다. 상이한 농도의 정제된 나노바디에서의 결합 곡선을 기록하고, 이를 사용하여 친화도 상수를 계산하였다. 상기 5개의 클론에 대한 KD 값은 0.34 내지 0.95 nM 사이였는데, 이는 최고의 변이체의 경우, IL-6R65(모체 나노바디)와 비교하여 13배 개선된 것과 일치한다(도 27).
실시예 33: 혈장 효능 분석법에서의 친화도 성숙된 변이체 평가
또한, 5개의 친화도 성숙된 나노바디 모두와 서열이 최적화된 나노바디를 혈장 효능 분석법으로 테스트하였다. 상기 분석법에서, 상이한 농도의 나노바디를 인간 또는 시노몰구스 원숭이로부터 유래된 가용성 IL-6R 함유 혈장 및 고정 농도의 인간 IL-6(2.4 또는 42 nM)을 혼합하였다. 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 항IL-6R MAb BN-12로 코팅된 맥시포르프(Maxisorp) 플레이트(Diaclone)로 혼합물을 옮겨 놓았다. 이어서, 비오틴화된 항IL-6 폴리클로날 항체 (R&D Systems) 및 스트렙타비딘-HRP를 첨가하여 IL-6 결합량을 측정하였다. TMB를 기질로서 사용하였다. 450 nm에서 기질 전환을 측정하였다(도 28).
실시예 34: TF1 분석법에서의 친화도 성숙된 변이체 평가
또한, IL-6이 세포 표면 상에 있는 IL-6R에 결합하는 것을 차단하는 것에 기인하여 TF1 세포(ECACC 번호 93022307, 문헌 [1989, J. Cell Physiol., 140: 323; 1993, Exp. Cell Res., 208:35)의 IL-6 의존성 증식을 억제시킬 수 있는 그의 능력에 대해 친화도 성숙된 나노바디를 테스트하였다. 이를 위해, 나노바디의 일련의 희석액을 고정량의 TF1 세포와 함께 37℃에서 2시간 동안 사전 인큐베이션시켰다. 이어서, IL-6을 최종 농도 2 ng/ml까지 첨가하였다. 72시간 동안 계속하여 IL-6 의존성 세포 증식이 이루어지도록 하고, 이를 삼중수소로 표지된 티미딘의 혼입에 의해 측정하였다(도 29).
친화도 성숙된 나노바디의 IC50 값은 IL-6R65보다 17배까지 더 우수한 것으로 나타났지만, 모든 변이체는 참조 IgG보다는 그 효능이 훨씬 낮은 것으로 나타났다.
실시예 35: 비아코어 경쟁 연구
IL-6이 IL-6R65 및 그의 친화도 성숙된 변이체 중 2개(7D6 및 7C4)와 함께 동시에 IL-6R에 결합할 수 있는지 여부에 관해 조사하기 위해 비아코어 실험을 수행하였다. 상기 실험에서, IL-6R을 BN-12로 코팅된 칩 상에 포획시키고, 나노바디 IL-6R65(도 30A), 7D6(도 30B) 또는 7C4(도 30C)로 포화시켰다. 이어서, 100 nM 농도의 사이토카인을 주입함으로써 IL-6의 IL-6R-나노바디 복합체에의 결합을 평가하였다. 추가로, 또한 IL-6과의 복합체 중의 IL-6R에 대한 3개의 나노바디의 결합에 대해서도 측정하였다.
IL-6R65(도 30A)에 대한 결과는 앞서 관찰된 결과와 유사하였고, 이로써 IL-6R65 및 IL-6이 IL-6R 상의 동일한 에피토프를 인식한다는 것을 확인하게 되었다. 예상대로, IL-6R65 친화도 성숙된 변이체 및 IL-6 또한 IL-6R 상의 동일한 에피토프를 인식하였다(도 30B-C).
실시예 36: 추가의 친화도 성숙
이어서, CDR1/2 및 CDR3 중 유익한 돌연변이로 이루어진 상이한 조합을 포함하는 47개의 나노바디로 구성된 패널을 생성하였다. 이러한 돌연변이는 CDR 무작위화 라이브러리로부터 단리된 나노바디 클론 모두의 단백질 서열과 오프 속도에 대한 전반적인 분석을 통해 확인하였다. 이들 2세대 클론의 오프 속도 범위는 4.2E-04 내지 4.5E-05 s- 1였다. 추가 분석을 위해 오프 속도가 가장 느린 5개의 클론(20F6, 20A11, 20E10, 21A10, 21D11)을 선별하였다. 서열은 도 31에 열거되어 있다.
실시예 37: 2회차 변이체의 나노바디 발현 및 정제
c-myc, (His)6 태깅된 단백질로서 친화도 성숙된 나노바디를 배양물 부피 250 ml로 E. 콜라이 중에서 발현시켰다. 1 mM IPTG를 첨가하여 발현을 유도하고, 37℃에서 4h 동안 계속하여 유지시켰다. 세포 배양물을 스피닝한 후, 펠릿을 냉동-해동시켜 주별 세포질 추출물을 제조하였다. 이러한 추출물을 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)에 대한 출발 물질로서 사용하였다. 150 mM 이미다졸을 사용하여 칼럼으로부터 나노바디를 용리시킨 후, 이어서 하이프렙26/10 칼럼 상에서 탈염시켰다.
실시예 38: 융점 측정
열 이동 분석법으로 나노바디의 온도 안정성을 분석하였다. 친화도 성숙된 나노바디 모두의 Tm 값은 유사하였고, IL-6R65보다는 약간 높았다. Tm 값은 표 C-25에 열거되어 있다.
실시예 39: 비아코어 상에서의 2회차 변이체의 친화도 측정
비아코어 T100 상에서 (서열이 최적화된) 나노바디 IL-6R65 및 5개의 친화도 성숙된 변이체에 대한 동력학적 파라미터를 측정하였다. 2개의 상이한 농도의 정제된 나노바디 및 mAb BN-12를 통해 칩 상에 포획된 고정 농도의 IL-6R에서의 결합 곡선으로부터 회합 속도(ka)를 측정하였다. 칩에 공유적으로 커플링된 IL-6R을 사용하여 단일 나노바디 농도에서 오프 속도를 측정하였다. ka, kd 및 Kd 값은 표 C-26에 열거되어 있다.
실시예 40: TF1 분석법에서의 2회차 변이체 평가
2회차 변이체의 생물학적 활성을 TF1로 평가하였고, 데이터는 도 32에 제시되어 있다. 2회차의 친화도 성숙된 클론은 1회차 클론 7C4보다 5-8배 더 높은 효능을 가졌고, 실시예 1에 기술되어 있는 벤치마크 참조 IgG보다 2.5-4배 더 큰 효능을 보였다. 수행능이 가증 큰 클론은 20A11이며, 그의 IC50은 0.4 nM(벤치마크와 비교하여 4배 더 큰 효능)였다.
실시예 41: 혈장 효능 분석법에서의 2회차 변이체 평가
혈장 효능 분석법으로 고농도 및 저농도의 IL-6에서 가용성 IL-6R의 억제에 대해 분석하였다. 혈장 효능 분석법에서 2회차 변이체는 적어도 참조 IgG 만큼의 효능(0.1-0.2 nM)을 나타내었는데, 이는 본 분석법의 감도 한계에서 이루어졌다. IL-6이 고농도일 때(EC95), 친화성 돌연변이체는 IL-6의 sIL-6R에의 결합을 여전히 차단시킬 수 있었고, 이는 참조 IgG보다 3-4개 더 큰 효능을 발휘하는 것으로 나타났다. 본 분석법에서 1회차 변이체와 2회차 변이체 사이에는 어떤 차이도 관찰되지 않았다. 예상대로, 테스트 클론 모두 시아노와 교차 반응성을 보였다(도 33).
실시예 42: 전혈 중 인간 PBMC 에의 결합
인간 PBMC에의 결합에 대해 정제된 나노바디 IL-6R65 및 PMP20A11을 FACS로 테스트하였다. 비오틴화된 항His mAb 및 PE 표지된 스트렙타비딘을 사용하여 세포 결합을 검출하였다(도 34). IL-6R65 및 친화도 성숙된 변이체 PMP20A11 둘 모두 호중구, 단핵구 및 림프구 서브집단에 결합할 수 있었다. 이는 IL-6R의 발현 프로파일과 일치하는 것이다.
VI . 친화도 성숙된 난바디의 포맷팅
실시예 43: 다가 컨스트럭트 제조
알부민 결합 나노바디 ALB8을 사용하여 2가 및 3가 나노바디로서 PMP20A11을 포맷팅하였다. 상이한 나노바디에 대한 개요는 표 C-27에 제시되어 있다.
실시예 44: TF1 분석법에서의 막 IL -6R의 중화
1차 실험에서, 모델 시스템으로서 TF1 세포주를 사용함으로써 포맷팅된 나노바디가 IL-6R을 통한 신호전달을 억제시키는지 여부를 확인하였다. 나노바디 20A11, IL-6R304, IL-6R305 및 IL-6R306은 막 IL-6R에 의해 매개되는 TF1 세포의 IL-6 유도성 증식을 용량에 의존하는 방식으로 완전하게 차단시킨다(도 35, 표 C-28).
이러한 결과는, 막 IL-6R 활성을 억제시키는 것에 있어 포맷팅된 나노바디 모두가 실시예 1에 기술되어 있는 참조 IgG와 비교하여 효능이 더 크다는 것을 입증한다. 그의 1가 등가물 IL-6R304와 비교하였을 때, IL-6R305는 IL-6 매개성 반응을 ~7배 더 강한 효능을 가지고 억제시키는데, 이는 막 IL-6R과 IL-6R305의 적극적인 상호작용을 입증한다. IL-6R306은 IL-6R305보다 효능이 더 작고, 단지 IL-6R304보다는 2배 더 우수한 효능을 나타낸다. 이는 IL-6R306 포맷이 덜 바람직하며, 추가로 IL-6R306의 적극적인 결합은 가능하지 않다는 것을 시사한다.
이어서, 포맷팅된 나노바디는 병리학적 농도의 IL-6에서 IL-6R을 통한 신호전달을 여전히 완전하게 억제시키는지 여부를 확인하였다. 실제로, 20A11, IL-6R304, IL-6R305 및 IL-6R306은 5,000 IU/mL IL-6에 의해 유도된 TF1 세포의 증식을 용량에 의존하는 방식으로 완전하게 차단시킨다(도 36, 표 C-29). 예상대로, 100 IU/mL을 사용하여 수행된 실험과 비교하였을 때 IC50은 이동하였다. 이전 결과와 일치하게, 막 IL-6R을 통한 IL-6 유도성 신호전달을 차단하는 것에 있어 IL-6R305의 효능이 가장 컸다.
나노바디가 IL-6R과 상호작용하기 때문에, 나노바디의 상기 수용체에의 결합이 세포 활성화를 유도함으로써 세포 증식을 일으키는지 여부를 확인하였다. 100 IU/mL IL-6의 존재 또는 부재하에서 TF1 세포를 과량의 나노바디와 함께 인큐베이션시켰다(도 37). 예상대로, IL-6R304 및 IL-6R305, 둘 모두 IL-6 매개성 증식을 완전하게 방해하였다. 실제로, IL-6R305 및 IL-6R306은 배경(성장 인자의 부재하에서 측정된 3H-티미딘 혼입)과 동일한 수준까지 IL-6 증식을 억제시켰는데, 이는 IL-6R304 및 IL-6R305가 IL-6의 효과를 완전하게 차단한다는 것을 입증한다.
IL-6R304 및 IL-6R305는 성장 인자의 부재하에서는 TF1 세포의 증식을 유도하지 못하였는데, 이는 이들 화합물이 TF1 세포에 대해 효현 작용을 발휘하지 못한다는 것을 제안한다.
실시예 45: ELISA 에서의 포맷팅된 친화도 성숙된 나노바디에 의한 sIL -6R의 중화
혈장 효능 ELISA로 인간 IL-6의 혈장 sIL-6R에의 결합을 방해할 수 있는 빌딩 블록 IL-6R20A11 및 그의 포맷팅된 변이체의 능력을 분석하였다. 혈장 sIL-6R의 농도는 가변성을 띠고 있기 때문에, 나노바디의 효능을 비교하기 위해서는 동일한 혈장이 상이한 분석법 모두에 걸쳐서 사용되어야 했다. 또한, 먼저 적정량의 IL-6을 혈장 중에서 인큐베이션시켜 나노바디와 함께 사용되는 IL-6의 농도를 측정하였다. 인간 혈장 중 EC50 및 EC95 값은 각각 27.29 ng/mL 및 885 ng/mL인 것으로 측정되었다. 이어서, 이러한 농도를 사용하여 정상 농도 및 고농도의 IL-6에서의 나노바디의 효능에 대해 테스트하였다.
IL-6R20A11 및 포맷팅된 변이체를 실시예 1에 기술되어 있는 참조 IgG와 비교하였다. 상이한 나노바디에 대해 생성된 IC50 값은 표 C-30에 요약되어 있다. IL-6 EC50에서(도 38A, B), 1가 및 2가 IL-6R 나노바디는 참조 IgG와 동일한 범위에 있었다. 비록 IL-6R304가 단 하나의 결합 부위를 가지고 있기는 하지만, 참조 IgG와 유사한 IC50을 가졌다(0.229 nM 대 0.258 nM). IL-6R305는 IL-6R304에 비해 2배 큰 효능(IC50 = 0.137 nM)을 가진 것으로 나타났고, 이는 그가 2개의 결합 부위를 갖고 있다는 것과 일치한다. 그러나, IL-6R306은 IL-6R304 및 참조 IgG보다 더 작은 효능을 나타내었고, 그의 IC50은 0.412 nM이었다.
아마도 감도에 의해 분석 한계에 도달했을 가능성이 가장 크다. 실제로, 혈장 sIL-6R의 농도는 ~30 ng/mL 또는 0.6 nM이었다. 그러므로, 단지 0.3 nM의 sIL-6R이 나노바디에 의해 차단되어야 하는데(50% 혈장), 이는 수득될 수 있는 최소 IC50이 0.15 nM이라는 것을 의미한다. 이는 수득된 IC50 값과 일치한다. 그러나, IL-6 농도가 885 ng/mL까지 증가하였다면, 나노바디가 IL-6과 경쟁하기는 더욱 어려웠을 것이며, 그 효능에 있어서도 더욱더 큰 차이가 검출될 수 있었을 것이다. 실제로, IL-6이 고농도일 때, IL-6R20A11, IL-6R304 및 IL-6R305의 효능은 참조 IgG보다 분명하게 더 큰 반면, IL-6R306은 그렇지 않았다(도 38C, D), IL-6이 고농도 및 저농도일 때의 IC50의 비는 표 C-30에 제시되어 있다. 다른 나노바디보다는 참조 IgG 및 IL-6R306이 IL-6의 증가에 의해 영향을 더 많이 받았다는 것은 분명하다. 이는 또한 TF1 분석법에서도 관찰되었다(실시예 44 참조).
실시예 46: 포맷팅된 친화도 성숙된 나노바디의 막 IL -6R에의 결합
IL-6의 신호전달을 차단시키기 위해서는 가용성 및 막 IL-6R, 둘 모두가 나노바디에 의해 중화될 필요가 있다. 그러므로, 상이한 포맷팅된 나노바디의 IL-6R 발현 세포에의 결합을 유식세포측정법에 의해 분석하였다.
IL -6R 발현 CHO 세포에의 결합
인간 IL-6R을 발현하는 안정적으로 형질감염된 CHO 세포를 사용하여 항IL-6R 나노바디의 막 IL-6R에의 결합에 대해 분석하였다(도 39A). IL-6R 음성 CHO 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다(도 39B). 4개의 나노바디 모두 IL-6R 발현 세포에 대해 포화 결합을 보인 반면, IL-6R 음성 세포에서는 나노바디가 고농도일 때 단지 극도로 낮은 신호만이 검출되었다.
PE 형광값의 중앙값을 그래프패드(GraphPad)로 송출한 후, 4PL 곡선을 피팅하여 EC50 값을 측정하였다. 이는 표 C-31에 요약되어 있다. TF1 분석법과는 대조적으로, 이러한 셋업에서는 결합력 효과가 IL-6R305에는 도움이 되지 못하는 것으로 보였다: IL-6R304과 비교하여 단지 2배 더 큰 효능을 보였다(0.8984 대 1.939 nM). 또한, TF1 및 혈장 ELISA에서의 경우와 같이, IL-6R306은 IL-6R 양성 세포에는 잘 결합하지는 못했다.
말초 혈액 백혈구에의 결합
인간 PBL을 사용하여 생리학적 조건하에서 나노바디의 막 IL-6R에의 결합에 대해 입증하였다. 상기 기질은 HSA(~50 mg/mL), sIL-6R(~30 ng/mL), 막 IL-6R(CD4+ T 세포, 단핵구, 과립구) 발현 세포 및 IL-6R 음성 세포(대개의 혈중 B 세포, CD8+ T 세포)를 함유하고 있기 때문에, 생체내 환경으로는 고도로 적절하다. 2명의 기증자로부터 유래되고 EDTA로 처리된 혈액 중에서 나노바디를 인큐베이션시키고, 결합된 나노바디를 유식세포측정법에 의해 검출하였다. 림프구, 단핵구 및 과립구를 FSC/SSC 특성에 기초하여 게이팅하고(도 40), 결합된 나노바디를 PE 채널에서 검출하였다.
도 40(우측)에서 관찰할 수 있는 바와 같이, 과립구 및 단핵구는 나노바디에 의해 균일하게 염색되었다. 대조적으로, 림프구는 단지 일부분만이 염색되었다. 이는 PE 히스토그램에서 이중 피크로서 관찰될 수 있다. 상이한 농도의 나노바디와의 인큐베이션 이후 게이팅된 군집 3개의 평균 형광값은 도 41에 도시되어 있다. 생성된 EC50 값은 표 C-32에 요약되어 있다.
실시예 47: 인간 및 시아노 혈청 알부민에 대한 포맷팅된 친화도 성숙된 나노바디의 친화도
비아코어 3000 기기 상에서 SPR에 의해 실시예 1에 기술되어 있는 인간 및 시아노 혈청 알부민 상의 이특이성의 2가 및 3가 나노바디 IL-6R304 IL-6R305 및 IL-6R306의 동력학적 분석을 수행하였다. 결과는 도 42에 제시되어 있고, 표 C-33에 요약되어 있다. 나노바디 IL-6R304 305 및 306은 인간 및 시아노 SA에 대하여 유사한 동력학적 속도 상수 및 친화도(17-23 nM)를 보였다. SA에 대한 포맷팅된 IL-6R 나노바디의 친화도는 회합 속도는 2.5배 감소 및 해리 상수는 2.5배 증가함으로써 1가 항SA 나노바디 ALB11과 비교하여 6.5배 더 낮았다.
실시예 48: 인간 및 시아노 IL -6R에 대한 친화도
비아코어 T100 기기 상에서 SPR에 의해 인간 및 시아노 IL-6R의 동력학적 분석을 수행하였다. IL-6R을 칩에 직접적으로 고정화시키면 IL-6R의 구조 변화가 나타나기 때문에, 온 속도를 BN-12에 의해 포획된 IL-6R 상에서 측정하였다. 나노바디-IL-6R 상호작용보다 낮은 해리 속도를 가진 포획 도구의 이용가능성이 부족하기 때문에 오프 속도는 직접 고정화된 IL-6R 상에서 측정하였다. 결과는 표 C-34 및 도 43에 제시되어 있다.
항SA 빌딩 블록(IL-6R304)으로 포맷팅함으로써 20A11(IL-6R300; 서열번호 66)의 온 속도를 2배 미만 만큼 감소시켰다. 인간 IL-6R 상에서의 IL-6R304에 대한 오프 속도는 비아코어 기기의 검출 한계이거나, 또는 그 아래였다. 시아노 IL-6R 상에서의 오프 속도는 인간 IL-6R 상에서보다 ≥ 2배 더 높았지만, 여전히 검출 한계에 가까운 값을 나타내었다. IL-6R304에 대한 친화도의 계산치는 인간 IL-6R 상에서 ≤ 14 pM, 및 시아노 IL-6R 상에서 25 pM이었다.
실시예 49: IL-6 R20A11 의 종 교차 반응성
시아노 혈장을 사용하여 혈장 효능 ELISA로 IL-6R20A11 및 그의 포맷팅된 변이체와 시노몰구스 sIL-6R의 교차 반응성을 분석하였다. 또한, 경쟁 ELISA를 사용하여 IL-6R20A11과 시아노 및 마우스 sIL-6R의 교차 반응성을 측정하였다.
혈장 효능 EISA
먼저 적정량의 인간 IL-6을 시아노 혈장 중에서 인큐베이션시켰고, IL-6의 EC50 값은 50.11 ng/mL로 측정되었다. 이어서, 상기 농도의 IL-6을 사용하여 나노바디와 시아노 혈장 sIL-6R의 교차 반응성을 테스트하였다. 도 44에서 관찰할 수 있는 바와 같이, IL-6R20A11 및 포맷팅된 변이체가 시노몰구스 sIL-6R과 교차 반응성을 뚜렷하게 나타내었다. 인간 혈장과 동일하게 순위 매김이 일어났음을 관찰할 수 있었고, 인간 대 시아노 혈장에서 IC50 값의 비는 모든 화합물에 대하여 유사하게 나타났다(표 C-35).
경쟁 ELISA
혈장 효능 ELISA는 오직 BN-12가 상기 특정 종으로부터 유래된 혈장 sIL-6R을 포획할 수 있는지 여부, 및 IL-6의 sIL-6R에의 결합이 검출될 수 있는지 여부에 대해서만 사용될 수 있다. 그러므로, 보다 일반적인 경쟁 ELISA가 개발되었다. 상기 분석법은 IL-6R20A11의 뉴트라비딘에 포획된 IL-6R-바이오에의 결합에 기초하였다. 간략하면, 0.4 nM의 IL-6R20A11을 내인성 sIL-6R을 함유하는, 상이한 종으로부터 유래된 혈장에 대한 일련의 적정량과 함께 사전 인큐베이션시킨 후, 유리형 IL-6R20A11을 뉴트라비딘으로 코팅된 플레이트 상에 고정화된 비오틴화된 인간 sIL-6R 상에 포획시키고, 항 VHH mAb FITC 및 항FITC HRP를 사용하여 검출하였다. IL-6R20A11 농도 0.4 nM은 최대 신호의 50%를 제공하는 농도(EC50 = 0.35 ± 0.021 nM, n=4)에 상응한다.
도 45에서 관찰할 수 있는 바와 같이, IL-6R20A11은 시아노 sIL-6R과 교차 반응성을 뚜렷하게 나타내었는데, 이를 통해 비아코어 결과를 확인할 수 있었다. 대조적으로, 마우스 sIL-6R에의 결합은 관찰할 수 없었다. 인간 및 시아노 혈장은 또한 IL-6R20A11의 재조합 sIL-6R에의 결합에 대해 경쟁한 반면, 마우스 혈장은 경쟁하지 않았다. 실제로, 마우스 혈장이 고농도일 때 신호가 증가하는 것이 관찰되었는데, 이는 아마도 상기 분석법으로 마우스 면역글로불린을 검출할 수 있었기 때문에 가능한 것이었다.
실시예 50: IL -6R에 대한 IL-6 R20A11 의 특이성
IL-6R은 I형 사이토카인 수용체 패닐리에 속한다. 이들 수용체의 사이토카인 결합 부위가 보존되기 때문에, IL-6R과 관련된 수용체에의 결합을 분석함으로써 IL-6R20A11의 IL-6R에 대한 특이성을 분석하였다. IL-6R20A11의 LIF-R, CNTF-R, OSM-R 및 IL-11R/Fc에의 분석을 경쟁 결합 ELISA로 분석하였다. 도 46에서 관찰할 수 있는 바와 같이, 양성 대조군 sIL-6R은 IL-6R20A11의 플레이트에의 결합을 억제시켰다. sIL-6R에 대한 IC50(0.03 nM)은 IL-6R20A11의 사용량에 기초한 IC50 예상치(0.025 nM 대 0.05 nM)와 일치하였다. 심지어 100배 몰 과량(5 nM)에서도 조차 IL-6R 관련 단백질 중 어느 것도 IL-6R20A11의 sIL-6R에의 결합에 대해 경쟁하는 것처럼 보이지는 않았다. 유사한 셋업에서, CLF-1/CLC, IL12-p40, IL-27B 및 gp130/Fc 또한 심지어 100 nM 만큼 고농도인 경우에서도 조차 0.05 nM의 IL-6R20A11과는 상호작용을 하지 않았다(결과는 나타내지 않았다).
VII . IL-6 R304 및 IL-6 R305 의 생체내 PK / PD 분석
본 연구의 목적은 단일 정맥내 볼루스 투여 이후, 시노몰구스 원숭이에서 서열이 최적화된, 친화도 성숙된 항인터루킨 6 수용체(IL-6R) 나노바디 2개, 즉, IL-6R304 및 IL-6R305의 혈장 약물동력학적 성질(PK), 약물력학적 성질(PD) 및 면역원성을 분석하는 것이었다. 나노바디를 투여하고, 그 후 24시간이 경과하였을 때를 출발점으로 하여 7일 동안 매일 재조합 인간(h) IL-6을 피하 주사하였다. 본 생체내 유효성 연구의 궁극적인 목적은 이들 항IL-6R 나노바디가 hIL-6 유도성 파라미터를 억제시킬 수 있는 능력을 평가하고, 그의 유효성을 서로서로, 및 실시예 1의 벤치마크 참조와 비교하는 것이었다.
인간을 제외한 영장류 및 인간에서, 재조합 hIL-6이 급성기 단백질의 합성을 유도한다고 보고된 바 있다. 급성기 단백질은 주로 간세포에 의한 그의 생산 변화에 기인하여 혈관형성에 대한 반응에서 그의 혈장 농도가 적어도 25% 만큼 증가하거나 감소하는 것인 혈장 단백질 부류, 예컨대, C 반응성 단백질, 혈청 아밀로이드 A, 합토글로빈, 피브리노겐, 알부민 및 트랜스페린으로서 정의된다. 사이토카인 생산 및 급성기 반응의 패턴은 염증성 병태에서 차이가 난다. 그러므로, 급성기 변화가 혈관형성의 존재 및 강도를 반영하며 이를 통해 진단학적으로 관련성을 나타낼 수 있다. 급성기 단백질 생산의 주된 자극 인자는 염증 과정 동안 생산되는 염증 관련 사이토카인: IL-6, IL-1β 종양 괴사 인자 α (TNF-α: tumor necrosis factor-α), 인터페론 γ(INF γ), 전환 성장 인자 β(TGF-β: transforming growth factor-β) 및 가능하게는 IL-8로서 정의된다.
실시예 51: 연구 디자인
본 연구에서는 2-3마리의 동물로 이루어진 6개의 군(6군 내지 11군, 표 C-36)에 IL-6R304 또는 IL-6R305를 단일 i.v. 주사하였다. 두 나노바디 둘 모두를 3개의 다른 용량, 즉, 0.4, 2 또는 10 mg/kg으로 테스트하였다. 추가로, 12군의 동물(n = 3)에는 비히클을 투여하였고, 이는 음성 대조군으로서의 역할을 하였으며, 13군의 동물(n = 3)에는 5 mg/kg의 참조 IgG를 주사하였다(표 C-36).
TD1 착수시, 즉, 테스트 아이템 투여 이후 24시간이 경과하였을 때, 7일 동안 매일 1일 1회에 걸쳐 모든 동물에 hIL-6(5 ㎍/kg, 도 47)을 주사하였다.
hIL-6 주사 전후로 미리 결정된 시점에 요측피정맥 또는 대복재정맥을 통해 혈액 샘플을 수집하였다(도 47 참조). PK 분석을 위해 TD0째에 추가 혈액 샘플을 채취하였다(표 C-37 참조).
실시예 52: 나노바디가 hIL -6 유도성 급성기 반응(2 단계)에 미치는 효과
7일 동안 매일 연속하여 hIL-6을 주사함으로써 나노바디 및 양성 참조 IgG가 급성기 반응 유도에 미치는 효과에 대해 분석하였다. 판독값은 CRP 수준, 피브리노겐 수준, 및 혈소판 계수에 관한 것이었다.
음성 대조군(12군)에서, CRP 수준은 hIL-6의 1차 주사 후에 즉시 상승하였고, 2일째에는 이미 최고 수준에 도달하였다. 도달한 최고 수준은 0.2 - 0.8 mg/mL 사이였고, 마지막 IL-6 주사가 이루어진 그 다음날인 8일째까지 상기 평탄역은 유지되었다(도 48A).
이러한 변화는 5 mg/kg 참조 IgG를 사용한 전처리에 의해 완전하게 억제되었다(도 48B). 또한, 유사한 용량(2 mg/kg) 또는 5배 더 많은 고용량(10 mg/kg)의 나노바디 IL-6R304 및 IL-6R305로 단일 전처리하였을 때 실험이 진행되는 전 과정 동안 CRP 유도가 거의 완전하게 억제되었다(도 48C 및 D). 최고 용량의 IL-6R304 군 중 오직 18번 동물만이 약간의 유도 현상을 보였고, 최대 혈청 CRP 수준은 약 0.1 mg/mL에 도달하였다. 최저 용량(0.4 mg/kg) 군에서, 나노바디 둘 모두 7일 동안 완전하게 억제시켰다. CRP 수준은 음성 대조군에서와 같이 오직 8일째에만 유사한 수준으로 증가하였다(도 48). 모든 군의 평균 CRP 수준은 도 49에서 살펴볼 수 있다.
피브리노겐 수준은 기준 수준의 평균 최대값의 5배가 되는 수준까지 서서히 증가하였다(도 50A). 상기 최대값은 6일째 도달하였고, 2일 동안 유지되었다. 14일째, 피브리노겐 수준은 기준 수준으로 회복되었다. 참조 IgG는 피브리노겐의 유도를 완전하게 억제시킬 수 있었다(도 50B). 두 나노바디 모두 용량에 의존하는 방식으로 피브리노겐 유도를 억제하는 것으로 나타났다(도 50C 및 D). 최고 용량 군에서, IL-6R304로 전처리된 두 동물 모두, 및 IL-6R305로 전처리된 두 동물 중 1마리에서 억제가 거의 완전하게 일어났다. 25번 동물(10 mg/kg IL-6R305) 및 중간 및 최저 용량 군의 두 나노바디 모두의 모든 동물에서의 피브리노겐 수준은 일부만이 소규모로 증가가 이루어졌다. 그러나, 이러한 동물에서 피브리노겐 수준은 기준 수준의 2-3배를 초과하지 않았다. 모든 군의 피브리노겐 수준의 평균은 도 51에서 살펴볼 수 있다.
음성 대조군 중의 모든 동물의 경우, 혈소판 계수는 5일째부터 계속하여 서서히 증가하였다. 최대 수준은 8일째 도달하여 14일째까지 유지되었고, 그 값은 기준 수준의 160-190% 사이였다. hIL-6이 혈소판 계수에 미치는 효과는 5 mg/kg의 참조 IgG 또는 ≥ 2 mg/kg의 나노바디의 단일 전처리에 의해 완전하게 차단되었다. 혈소판 계수의 유도는 오직 최저 용량 군의 나노바디에서만 관찰되었고, 이는 8일째 모든 동물에서 시작되었다. IL-6R304의 경우, 최대 유도는 기준 수준의 약 120-150%였고, IL-6R305에 대한 최대 혈소판 계수는 기준 수준의 160-180% 사이였다(도 52 및 53).
결론적으로, IL-6R304 및 IL-6R305는 유사하게 3개의 급성기 반응 파라미터 모두를 용량에 의존하는 방식으로 완전하게 억제시켰다.
실시예 53: 시노몰구스 원숭이에서 IL-6 R304 또는 IL-6 R305 (0.4-2-10 mg / kg )의 i.v. 투여 이후의 혈장 농도
ELISA 샘플 분석법으로 혈장 약물동력학적 성질(PK)을 분석하기 위해 혈액 샘플을 IL-6R304 또는 IL-6R305의 투여 이전, 및 투여 후 하기 시점: 5 및 30분, 3 및 8시간, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 14, 21 및 29일째 채취하였다.
시노몰구스 원숭이에게로의 IL-6R304(0.4-2-10 mg/kg) 및 IL-6R305(0.4-2-10 mg/kg) i.v. 투여 이후 개별적으로 관찰된 혈장-농도 플롯은 각각 도 54 및 55에 제시되어 있다.
실시예 54: 시노몰구스 원숭이에서의 IL-6 R304 및 IL-6 R305 (0.4-2-10 mg / kg )에 대한 비구획적 약물동력학적 성질에 관한 분석
시노몰구스 원숭이에서의 IL-6R304(0.4-2-10 mg/kg) 및 IL-6R305(0.4-2-10 mg/kg)에 대한 비구획적 PK 분석에 의해 수득된 기본 PK 파라미터에 관한 개요는 표 C-38, 표 C-39, 표 C-40, 표 C-A41, 표 C-42 및 표 C-43에 기재되어 있다. 본원에서 논의되는 PK 파라미터는 윈놀린 프로페셔널 소프트웨어 버전 5.1(WinNonlin Professional Software Version 5.1)(Pharsight Corp)을 사용하여 비구획적 분석법(NCA: non-compartmental analysis)을 사용함으로써 수득한다. 단지 2개의 데이터 점만을 사용하여 동물 중 일부의 최종 파라미터를 계산하였다(R2는 디폴트 값 1이다).
시노몰구스 원숭이에 정맥내로 투여된 두 나노바디 모두에 있어서 혈장 농도는 3단계 방식으로 감소하는 것처럼 보였다. 투여 이후 처음 2일 동안, 초기 배치 단계에 이어, 보다 저속의 주요 단계로 이어진다. 보다 저농도에서 점차적으로 감소함으로써 짧은 반감기를 특징으로 하는 최종 단계에 이르게 된다.
대부분의 시노몰구스 원숭이의 혈장 샘플 중에서 항약물 항체가 검출되었기 때문에, 보다 저농도에서의 최종 반감기의 변화는 면역 매개성 제거 기전과 연관시킬 수 있다. 그러나, 최저 용량에서의 PK 프로파일을 조사하였을 때, 면역원성이 검출되지 않는 시점에 가장 짧은 반감기가 관찰될 가능성은 없다. 또한, 보다 고용량에서 검출가능한 역가가 존재함에도 불구하고, 여전히 반감기는 보다 연장될 수 있는 경향이 있다(즉, IL-6R304 10 mg/kg i.v.).
PK 프로파일 관찰 결과에 기초하면, 두 나노바디 모두 적어도 2개의 기전을 통해 순환으로부터 제거된다고 예측할 수 있다. 이러한 상황하에서, 선형의 비포화성 제거 기전이 화합물의 비특이적인 분해를 나타낼 것이다. 제2의 포화성 제거 기전은 표적 매개성(즉, 막 결합된 IL-6R에의 약물의 결합 내재화 및 이후 제거)이 될 것이다. 나노바디가 보다 고농도일 때, 후자의 제거 기전은 비포화성 제거 기전과 비교하여 포화성이고 극히 미비하며: 선형 제거가 우세하다(이를 통해 주요 반감기에 이르게 된다). 그러나, 보다 저농도에서는 주어진 나노바디 농도에 대해 기전 속도가 보다 더 높으며, 이를 통해 최종 기울기는 변하게 된다.
표적 매개성 제거로 인해, NCA 분석을 통해 수득한 PK 파라미터, 예컨대, 제거 및 반감기는 용량 및 시간에 의존하는 것처럼 보인다. 총 제거는 보다 고용량에서의 IL-6R304 및 IL-6R305의 경우 10.4-9.00 및 5.93-7.76 mL/일/kg인 것과 비교하여, 0.4 mg/kg i.v. 이후, 최저 용량에서의 IL-6R304 및 IL-6R305의 경우 최고치는 24.8 및 35 mL/일/kg이었다. 따라서, 용량으로 정규화된 노출량은 최저 용량에서 보다 낮을 것이다(용량 = CL xAUC).
IL-6R304의 주요 반감기는 10, 2 및 0.4 mg/kg의 i.v. 투여 이후 6.61일로부터 5.00일 내지 1.73일로 감소하였다. IL-6R305의 주요 반감기는 10, 2 및 0.4 mg/kg의 i.v. 투여 이후 7.37일로부터 4.29일 내지 1.64일로 감소하였다. 조기 시점에 더 많은 데이터 점들을 이용할 수 있기 때문에, 최종 단계에서의 특징 규명은 최저 용량에서 가장 이루어졌다: 0.4 mg/kg의 IL-6R304 및 IL-6R305 i.v. 투여 이후 각각 0.530일 및 0.470일의 짧은 최종 반감기가 관찰되었다.
이러한 PK 관찰 결과에 기초하여, IL-6R304 및 IL-6R305의 약물동력학적 특성은 유사한 것으로 간주된다.
원숭이 14m 및 원숭이 15f에 대한 테스트일 29일째(i.v. 2 mg/kg), 저농도 수준의 IL-6R304가 여전히 검출가능하였다. 다른 원숭이들의 PK 프로파일에 기초하였을 때, 이와 같은 관찰 결과는 예상할 수 없었고, 오직 극도로 낮은 저농도에서만 뚜렷이 나타나는, 제2형의 포화성 표적 결합을 시사할 수는 있다. 그러나, 이러한 관찰 결과는 또한 PK ELISA 샘플 분석의 허상일 수 있다.
NCA 분석을 통해 계산된, 기록상의 분포량은 두 나노바디 모두, 대략 40 mL/kg의 혈장 부퓌의 1 내지 2배 정도의 범위로 낮았는데, 이는 혈관 공간 바깥쪽으로 제한적으로 분포되어 있음을 제안한다. 그러나, 실제 Vss는 NCA와 연관된 방법론적인 오류에 기인하여 매우 낮게 평가된 것일 수 있다(즉, 주변 공간에서의 나노바디 분포와 그 이후의 분해는 분포 기간이 아닌, 전체 전신성 제거가 원인이 될 것이다). Vss는 상이한 용량 수준 전역에 걸쳐 매우 일정하게 유지되는 것처럼 보인다.
표적 결합이 PK 프로파일에 미치는 가능한 효과를 설명하기 위해, 도 56에서는 IL-6R304(i.v. 0.4-2-10 mg/kg) 및 IL-6R202(i.v. 2 mg/kg, 서열번호 73)의 평균 PK 프로파일을 비교한다. 또한, 설명하기 위한 목적으로, IL-6R202(i.v. 2 mg/kg) PK 프로파일을 0.4 mg/kg 및 10 mg/kg 용량으로 정규화하였다. IL-6R304는 시노몰구스 원숭이에서 IL-6R에 결합하는 것으로 나타난 반면, IL-6R202의 경우, 시노몰구스 원숭이에서 표적 결합성은 부족한 것으로 나타났다(WO 09/010539). 따라서, 선형 제거가 우세한 고농도에서 두 나노바디의 프로파일(및 그에 상응하는 반감기)는 유사하였다. 저농도에서는 IL-6R304의 경우, 가장 가능성 큰 이유인 표적 매개성 제거에 기인하여 기울기의 점차적인 변화가 관찰된 반면, IL-6R202의 경우 최종 기울기에는 변화가 없었다. 그러나, 보다 저농도의 IL-6R304 및 IL-6R305 또한 PK ELISA에서의 IL-6R 간섭에 기인하여, 특히, IL-6R이 고수준으로 존재할 때, 다소 매우 낮게 평가된 것일 수 있다.
실시예 55: 항IL-6R 304 및 항IL-6R 305 항체 검출
IL-6R304 또는 IL-6R305의 투여 이전, 및 투여 이후 다른 경과일에 채취된 일련의 혈장 샘플을, 나노바디 또는 그의 빌딩 블록 중 하나 이상에 결합할 수 있는 원숭이 항체(IgG 이소형)의 존재 여부에 대하여 스크리닝하였다. IL-6R304를 투여받은 동물로부터 유래된 샘플을 IL-6R304(도 57), IL-6R300(도 58) 또는 ALB8(도 59)로 코팅된 플레이트 상에서 분석하였다. IL-6R305를 투여받은 동물로부터 유래된 샘플을 IL-6R305(도 60), IL-6R300(도 61) 또는 ALB8(도 62)로 코팅된 플레이트 상에서 분석하였다.
전체 나노바디(IL-6R304 및 IL-6R305)에 대한 항약물 항체(ADA: anti-drug antibody)의 출현에 관한 요약은 표 C-44에 제시되어 있다. IL-6R300 및 Alb8에 대해서는 더 낮은 반응이 관찰되거나, 또는 어떤 반응도 관찰되지 않았다. 결론적으로, IL-6R304의 i.v. 주사 후, ADA는 모두 원숭이에서 검출가능하였다(단, 예외적으로, 사전용량 값이 높았기 때문에 ADA 측정값이 측정될 수 없었던 16번 동물은 제외). 0.4 mg/kg으로 투여받은 원숭이의 경우에는 투여 이후 1주째에, 및 2 mg/kg 및 10 mg/kg으로 투여받은 원숭이의 경우에는 투여 이후 2주째에 항체가 출현하였다. 11번 및 13번 원숭이(두 동물 모두 투여량이 0.4 mg/kg인 것)에서 가장 높은 ADA 역가가 관찰되었다. IL-6R305의 i.v. 주사 후, ADA는 모두 원숭이에서 검출가능하였다(단, 예외적으로, ADA가 측정되지 않은 23번 동물은 제외). 0.4 mg/kg으로 투여받은 원숭이의 경우에는 투여 이후 1주째에, 및 2 mg/kg 및 10 mg/kg으로 투여받은 원숭이의 경우에는 투여 이후 2주째에 항체가 출현하였다. 22번 및 24번 원숭이(두 동물 모두 투여량이 2 mg/kg인 것) 및 25번 26번 원숭이(두 동물 모두 투여량이 10 mg/kg인 것)에서 가장 높은 ADA 역가가 관찰되었다.
실시예 56: 나노바디가 sIL -6R 수준에 미치는 효과
공개적으로 이용가능한 데이터(문헌 [Nishsmoto et al., 2008, Blood 112(10): 3959-64])에 기초하여 예상한 바와 같이, Ref IgG로 처리하면 혈장 sIL-6R은 증가한 반면, 비히클로 처리하면 증가는 일어나지 않았다(도 63A). 유사하게, 저용량의 IL-6R304는 원숭이 3마리 모두에서 sIL-6R 수준의 신속한 증가를 유도하였다(도 63B). IL-6R305로 처리된 동물에서도 또한 혈장 sIL-6R은 증가하였지만, 다른 처리군 만큼 현저하지는 않았다(도 63C).
VIII . IL-6 R304 의 유효성
실시예 57: 유효성 연구에서 나노바디가 sIL -6R 수준에 미치는 효과
ELISA를 통해 혈장 중 전체 sIL-6R 수준(유리형, 나노바디 결합형 및 IL-6 결합형)을 측정하였다. 공개적으로 이용가능한 데이터(문헌 [Nishsmoto et al., 2008, Blood 112(10): 3959-64])에 기초하여 예상한 바와 같이, Ref IgG로 처리하면 혈장 sIL-6R은 증가한 반면, 비히클로 처리하면 증가는 일어나지 않았다(도 54A). 유사하게, 나노바디로 처리된 모든 동물에서는 sIL-6R 수준이 신속하게 증가하였다. 이는 유리형 sIL-6R과 비교하여 Ref IgG- 또는 NB-sIL-6 복합체의 보다 느린 제거 때문인 것으로 설명될 수 있다.
최대 sIL-6R 수준 및 효과의 지속 기간은 뚜렷하게 용량 의존성을 띠었다. 또한, 나노바디의 효과는 Ref IgG에 대한 것보다 더 현저한 것으로 보인다(도 64에서 2 mg/kg 용량의 나노바디와 Ref IgG 비교). 이는 가능하게는 보다 빠른 Fc에 의해 매개되는, 항체 면역 복합체의 제거에 기인하는 것으로 설명될 수 있다. 그러나, 놀랍게도, sIL-6R 증가 및 효과의 지속 기간은 IL-6R305(도 64B)와 비교하여 IL-6R304(도 64A)의 경우에 더욱 현저하였다.
실시예 58: 유효성 연구에서 나노바디가 IL -6R 수준에 미치는 효과
기로랩 플랫폼을 통해 혈장 중 전체 IL-6R 수준(유리형, sIL-6R 결합형)을 측정하였다. 상기 분석법을 위해, 검출을 위해 비오틴화된 래트 항인간 IL-6 mAb를 사용하여 IL-6 및 알렉사(Alexa) 표지된 마우스 항인간 IL-6 mAb를 포획하였다. 본 분석법을 통해서는 내인성 시노몰구스 원숭이 IL-6과, 1일째부터 8일째까지 매일 주사된 재조합 인간 IL-6, 둘 모두가 측정된다. 그러므로, 1일째까지(= 오직 내인성 시아노 IL-6만) 측정될 수 있는 IL-6과, 2일째부터 29일째까지(= 투여된 인간 IL-6 + 내인성 시아노 IL-6) 측정될 수 있는 IL-6 사이에는 구별될 필요가 있다.
도 65에서 관찰할 수 있는 바와 같이, IL-6R304, IL-6R305, Ref IgG, 및 작은 한도의 플라세보를 투여하면 IL-6은 일시적으로 증가하고, 투여 이후 8h이 경과하였을 때 피크에 이르게 되었다. 그러나, 이러한 증가는 나노바디 처리군에서 현저하게 더 높았다. 상관이 없는 나노바디를 투여하였을 때에도 역시 일시적인 IL-6 반응이 일어났기 때문에(도 65D), IL-6에 미치는 효과는 IL-6R 표적 나노바디에 대해 특이적인 것처럼 보이지는 않았다. 조기의 IL-6 증가는 동물 취급에 따른 스트레스와, 잠재적으로는 나노바디 제조시 소량의 내독소에 의한 IL-6 생산에서의 추가적인 증가에 의한 것으로 설명될 수 있는 가능성이 가장 크다.
IL-6 처리 단계 동안, 매일 IL-6 주사 이전에 혈액을 샘플링하였다. IL-6은 투여받았으나, 나노바디 또는 Ref IgG는 투여받지 않은 플라세보 군에서, IL-6은 거의 검출되지 않았다(도 65C). 이는 SC 주사 후의 인간 IL-6의 짧은 반감기와 일치한다(문헌 [Tsigos, et al., 1997, J. Clin. Endocrinol. Metab. 82:4167-70]). 그러나, 2-10 mg/kg Ref IgG, IL-6R304 또는 IL-6R305로 처리된 모든 동물에서는 2-8일째부터 IL-6이 검출되었다. 이는 수용체에 의해 매개되는 IL-6의 제거를 차단함으로써 그의 반감기가 연장되는 것으로 설명될 수 있다(문헌 [Nishimoto et al., 2008, Blood 112(10):3959-64]). 그러므로, 혈중 IL-6이 IL-6R의 중화를 위한 약물력학적 바이오마커로서의 역할을 할 수 있다.
IX . IL-6 R304 의 약물력학적 성질
실시예 59: 시노몰구스 원숭이에서의 단일 투여 이후 약물력학적 효과
건강한(즉, 자극을 받지 않은) 시노몰구스 원숭이에 IL-6R304를 단일 i.v. 투여한 후, sIL-6R 혈장 농도 변화 또한 측정하였다. 상기 단일 투여 PK/PD 연구에서, 투여량의 범위는 1-100 mg/kg이었다. 약물동력학적 성질, 면역원성 및 약물력학적 성질 분석을 위해 혈액 샘플링을 실시하였다. ELISA 기반 분석법을 사용하여 전체 sIL-6R 수준을 측정하고, 기로랩™ 플랫폼을 사용하는 리간드 결합 분석법을 사용하여 유리형 sIL-6R 수준을 측정하였다. 전체 sIL-6R을 분석하는 경우, 비중화 항IL-6R 모노클로날 항체를 사용하여 sIL-6R(유리형 + 복합체형)와, 검출을 위해 스트렙타비딘-HRP와 조합된 폴리클로날 비오틴화된 항IL-6R 도구를 포획하였다. 유리형 sIL-6R을 분석하는 경우, 비오틴화된 20A11 빌딩 블록을 사용하여 유리형 sIL-6R과, 검출을 위해 알렉사로 표지된 비중화 항IL-6R 모노클로날 항체를 포획하였다.
IL-6R304가 용량에 의존적인 방식으로 (i) 최대 전체 sIL-6R 농도(도 66A), (ii) 전체 sIL-6R의 증가 지속 시간(도 66A) 및 (iii) 유리형 sIL-6R의 억제 지속 시간(도 66B)에 미치는 효과를 단일 투여 PK/PD 연구의 결과를 통해 확인하였다. 일반적으로, 지정 기간이 경과한 후, 전체 및 유리형 sIL-6R 농도는 기준 수준으로 회복되었다(용량에 의존하는 방식으로, 최고 용량일 경우, 가장 장기간 동안의 상승과 억제가 관찰되었다). 저용량의 1 mg/kg IL-6R304 투여 이후, 유리형 sIL-6R의 농도는 대략 8일 동안 감소하였고, 이후 비히클로 처리된 동물의 농도보다 높은 농도고 증가하였다.
전체 sIL-6R 수준, 유리형 sIL-6R 수준(PD) 및 IL-6R304 농도 사이에는 우수한 역상관 관계가 있는 것으로 관찰되었고, 이를 통해 sIL-6R이 활성 약물의 존재에 대한 바이오마커로서 사용될 수 있음을 확인하게 되었다. 도 67은 3개의 파라미터 간의 상호작용을 설명하는 일례를 제시한다(중간 용량으로 투여받은 투여군에서 기준으로의 회복이 입증될 수 있기 때문에 상기 군을 선택하였다): IL-6R304를 투여하면 전체 sIL-6R 농도는 증가하고, 안정화된 약물-sIL-6R 복합체가 형성되었다. IL-6R304 혈장 농도가 감소함에 따라, 전체 sIL-6R 농도도 함께 감소하였는데, 이는 전체 sIL-6R 대부분이 복합형 수용체를 구성하였기 때문이다. 이는 순환으로부터 IL-6R304를 제거하였을 때 기준 수준으로 회복되는 저농도의 유리형 sIL-6R을 통해 확인하게 되었다. 저농도의 유리형 sIL-6R을 통해, 측정된 전체 sIL-6R은 실제로는 불활성이며 IL-6R304와 복합체를 형성한다는 것을 확인하였다(도 67).
실시예 60: PK / PD 모델링을 통한 약물력학적 효과의 설명
IL-6R304 투여가 전체 sIL-6R 수준에 미치는 효과는 IL-6R304의 수용체에의 직접적인 결합을 통해 설명될 수 있다-복합체는 IL-6R304의 반감기 연장 부분(즉, 알부민 결합)을 통해 순환 중에 남아 있다. 전체 sIL-6R 농도의 측정가능한 변화는 시간 지연형 동력학적 성질을 따르기 때문에, 간접적인 반응 모델이 PK/PD의 상관관계를 가장 잘 설명하며, 이를 사용하여 i.v. 투여된 IL-6R304가 sIL-6R-IL-6R304 복합체 수준의 축적에 미치는 효과를 설명하였다. 본 모델은 IL-6R304에 결합하였을 때 sIL-6R의 제거를 억제시키는 것으로부터 일어나는 약물 반응을 설명한다. 이러한 간접적인 반응 모델에서, 전체 sIL-6R-IL-6R304 복합체의 변화율(반응 R)은 하기로 기술될 수 있다:
Figure 112011088504629-pct00004
여기서, K인은 0차 합성율이고; R은 전체 sIL-6R이고; I최대는 최대 저해율이고; C는 IL-6R304 혈장 농도이고; n은 용량 반응 형상 계수이고; K아웃은 sIL-6R의 1차 제거율 상수이다.
간접 반응 PK/PD 모델에 대한 입력 함수로서 실시예 61에 기술된 약물동력학적 함수를 사용함으로써 단일 투여 PK/PD 연구로부터 얻은 모든 이용가능한 i.v. 전체 sIL-6R 데이터를 모델(WinNonlin Professional Software Version 5.1(미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재의 Pharsight Corporation)로 동시에 피팅하였다.
도 68은 1, 5, 10, 25 또는 100 mg/kg의 i.v. 투여 이후, 시노몰구스 원숭이에서 개별적으로 관찰된 전체 sIL-6R 농도에 대한 관측치 및 모델을 통해 예측된 전체 sIL-6R 농도에 대한 예측치-시간 데이터를 제시한다. 시노몰구스 원숭이에서 IL-6R304의 약물력학적 파라미터에 대한 예측치는 표 C-45에 열거되어 있다. 모든 파라미터는 CV% 값이 50% 미만인 것으로 명시되는 바와 같이, 충분한 정도의 정확도를 가지고 예측되었다.
i.v. 투여 이후의, 단일 투여 PK/PD 연구로부터 얻은 모든 데이터를 sIL-6R, IL-6R304 및 sIL-6R-IL-6R304의 복합체에 양상을 설명하는 간접 반응 모델로 동시에 피팅하였다.
sIL-6R의 평균 반감기는 대략 5.8 h(=ln2/K아웃, 여기서, K아웃=K인/R0)인 것으로 예측되었고, 예측 생산율은 2.49 ng/mL/h였다. IL-6R304는 1차 경로를 통해 sIL-6R의 제거를 거의 완전하게 억제시킬 수 있었다(I최대=97%). 따라서, 제거율은 시노몰구스 원숭이 혈청 알부민의 것과 상관관계에 있는, 새로 감소된 최대 K아웃으로 변경되었다. 이어서, 전체 sIL-6R의 새로운 기준 수준이 확립되었다. IC50의 예측치가 125 ng/mL 또는 4.48 nM일 경우, IL-6R304는 시노몰구스 원숭이에서 비복합형 sIL-6R의 제거를 억제시키는 효능을 가진 억제제인 것으로 나타났다.
X. IL-6 R304 의 약물동력학적 성질
실시예 61: 시노몰구스 원숭이에서의 약물동력학적 성질
본 섹션에는 하나의 교차 반응성을 지닌 종(시노몰구스 원숭이)에서 i.v. 투여된 IL-6R304의 약물동력학적 양상에 대한 특징을 규명하는 데이터가 요약되어 있다.
건강한(비유도성) 시노몰구스 원숭이에서 적격의 DELFIA(해리 증가된 란탄족 원소 형광면역분석법: dissociation enhanced lanthanide fluoroimmunoassay) 방법을 사용하여 IL-6R304의 농도를 측정하였다. IL-6R 의존성 분석법에 의해 전체 활성 IL-6R304 농도를 측정하였다.
단일 투여 PK/PD 연구에서는 건강한 수컷 시노몰구스 원숭이에게 IL-6R304를 0, 1, 5, 10, 25 및 100 mg/kg의 단일 i.v. 볼루스로서 투여하였다. PK, ADA(항약물 항체) 및 PD를 분석하기 위한 목적으로 투여 이전, 및 투여 이후 선택된 시점에 모든 동물로부터 혈액 샘플을 채취하였다. 샘플을 PK, PD 및 ADA에 대해 분석하였다(또한, 실시예 62 참조).
인증받은 전기화학발광(ECL: electrochemiluminescent) 연결 스크리닝 및 확인 분석법을 사용하여 항IL-6R304 항체를 검출하였다. 간략하면, MSD 섹터 미이저 2400(MSD Sector Imager 2400)을 사용함으로써 균질 분석 포맷으로 IL-6R304를 사용하여 항약물 항체(ADA)를 포획하고 검출하였다.
PK 분석을 위해 IL-6R304를 스트렙타비딘으로 코팅된 플레이트 상에 비오틴화된 항나노바디 도구(3E8비브-바이오(3E8biv-bio))를 통해 포획하였다. IL-6R과의 복합체 형성 단계 이후, IL-6R에 대한, 유로퓸으로 표지된 mAb를 사용하여 증강 용액 중 형광 신호를 생성하였다.
IL-6R304의 평균 혈장 농도-시간 프로파일은 도 69에 제시되어 있다. 1, 5, 10, 25 또는 100 mg/kg의 단일 i.v. 볼루스로서의 IL-6R304 투여 이후, 그의 중요한 약물동력학적 파라미터에 관한 요약은 표 C-46에 제시되어 있다.
i.v. 투여 이후의 약물동력학적 프로파일은 3단계식 감소를 나타내었다. 투여 이후 처음 2일 동안, 분포 단계에 이어, 보다 저속의 주요 단계로 이어진 후, 보다 빠른 최종 단계에 이르게 되는 것으로 관찰되었다. 분포 단계는 추가로 고속(피상 구획) 및 저속 분포(심층 구획)로 구분될 수 있다. 제거 단계에 기초하면, 가정컨대, IL-6R304는 2개의 기전, 즉, 선형 비포화성(비특이적인 제거 또는 CL비IL-6R), 및 비선형 포화성(표적 매개성 또는 특이적인 제거 또는 CLIL -6R) 제거 기전을 통해 제거될 수 있다. 후자는 막 결합된 IL-6R에 결합된 IL-6R304의 내재화 및 이후 IL-6R304-mIL-6R 복합체 제거의 결과일 수 있다.
IL-6R304의 제거는 포화성 및 비포화성 경로의 조합으로 이루어지기 때문에, 시노몰구스 원숭이에서 혈장 동력학적 성질은, 용량에 의존성이며, 주어진 용량 수준에서는 또한 시간에 의존성인 반감기를 통해 비선형 양상으로 나타났다.
CLIL-6R이 포화성이고, 전체 CL이 주로 CL비IL-6 R에 의해 결정되는 경우, 시노몰구스 원숭이에서 IL-6R304의 기록된 반감기 범위는 5.8 내지 8.9일이었고, 이는 시노몰구스 원숭이 혈청 알부민에서 기록된 것과 유사하였다(문헌 [Nguyen et al., 2006, Protein Eng. Des. Sel. 19:291]). 이는 IL-6R304의 알부민 결합 부위의 시노몰구스 원숭이 알부민에의 교차 반응성에 관한 예상 결과 및 확인된 결과와도 일치하였다.
단일 용량 투여 이후 평균 노출량은 다소 1 내지 5 mg/kg 및 10 내지 25 mg/kg 사이로 용량에 비례하는 방식, 및 5 내지 10 mg/kg 사이로 용량에 비례하는 방식, 그 이상으로 증가하였다. 100 mg/kg 투여군에는 단 1마리의 동물만이 포함되어 있기 때문에, 상기 투여군에 대한 결과는 주의를 기울여 얻었다. 전반적으로 투여군당 원숭이의 마리수는 제한되어 있기 때문에, 용량에 비례하는 방식으로 이루어지는 평가는 시험적인 것이었다.
IL-6R304가 sIL-6R에 결합하자, sIL-6R 및 sIL-6R-IL-6R304 복합체로 구성된 sIL-6R의 총 측정 농도는 증가하였는데; 이러한 증가는 sIL-6R만 단독으로 존재하는 것과 비교하여 복합체의 제거가 보다 느리게 진행되었기 때문인 것으로 간주된다.
이용가능한 면역원성, PK 및 PD 데이터에 기초하여, 출현 ADA가 가능하게는 최고 용량으로 투여받은 최고 투여군으로부터의 동물 2마리(15번 및 17번 동물)에서 IL-6R304의 PK/PD 프로파일에 영향을 주었다고 결론지었다. 두 동물 모두에서 측정가능한 ADA가 출현함과 동시에, 약물력학적 효과는 감소하였고, 예상외로 IL-6R304 혈장 수준은 감소하였다. 따라서, PK/PD 분석에서는 이들 동물을 고려하지 않았다. 다른 동물에서는 출현 ADA가 PK/PD 프로파일에 대해서 뚜렷한 효과를 발휘하는 것처럼 보이지는 않았다. 따라서, 이러한 데이터는 본 분석에 포함시켰다.
1 mg/kg 투여군 중의 한 동물(3번 동물)의 경우, 비록 저용량인 경우에 예측된 것이지만, 어떤 표적 매개성 제거도 관찰되지 않았다. 5 mg/kg 투여군 중의 한 동물(6번 동물)의 경우, 보다 고용량이고, 상기 경로는 포화성인 것으로 예측되었지만, 이는 여전히 표적 매개성 제거인 것으로 관찰되었다. 동물 간의 내인성 IL-6R 농도에 대한 가변성이 매우 높을 수가 있기 때문에, 표적 매개성 제거는 개체간 가변성이 높을 수 있다. 추가로, IL-6R304 농도가 KM 예측치(여기서, 0.718 ㎍/mL)와 가까울 경우, IL-6R304 농도에 작은 변화가 생기면 비선형 제거는 크게 변경된다. 둘 모두를 조합하면 최종 반감기 값의 높은 가변성을 반영하는, 저용량 군에서의 표적 또는 단지 비표적인 매개성 제거를 입증할 수 있는 측정가능한 증거에 이르게 될 수 있다. 생물학적 가변성은 적용된 방법에 대한 정확한 의미있는 평가를 불가능하게 만들기 때문에, 3번 및 6번 동물의 PK 파라미터를 기술 통계학적 데이터로부터 제외시켰다(표 C-46).
플라세보 군으로부터의 어떤 동물도 IL-6R304에 전신 노출되지는 않았다. IL-6R304 처리 동물의 전처리 샘플 모두 최저 정량 한계(LLOQ: lower limit of quantification) 아래였다. 활성 처리군으로부터의 동물에서는 용량 수준이 증가함에 따라 IL-6R304의 혈장 농도고 증가한 것으로 나타났다. 최고 용량으로 투여받은 최고 투여군(100 mg/kg)에서 평균 전체 노출량(AUC무한대)이 가장 높은 것으로 관찰되었고, 그 값은 540612 ㎍.h/mL였다.
용량으로 정규화된 평균 AUC무한대 값은 5 내지 10 mg/kg 용량 범위에 걸쳐 용량에 비례하는 방식으로 증가하였고, 다소 1 내지 5 mg/kg 및 10 내지 25 mg/kg 사이로 용량에 비례하는 방식(각각, 1.3 및 1.4), 그 이상으로 증가하였다. 최고 용량으로 투여받은 최고 투여군에는 단 1마리의 동물만이 포함되어 있기 때문에, 25 내지 100 mg/kg 사이로 용량에 비례하는 방식, 그 이상으로의 증가에 대해서는 주의를 기울여야 했다. 전반적으로 투여군당 원숭이의 마릿수는 제한되어 있기 때문에, 용량에 비례하는 방식으로 이루어지는 평가는 시험적인 것이었다.
특히, 비구획 분석으로부터 얻은 데이터는 고용량의 수준에서의 테스트와 비교하여 1 mg/kg 용량 수준에서의 반감기 차이를 시사하였다. 이는 비포화성 기전이 우세하게 작용하는 고용량과 비교하여 포화성의 표적 매개성 제거 기전이 더 크게 기여하기 때문이다.
제거 단계에 기초하면, 가정컨대, IL-6R304는 2개의 기전, 선형 및 비선형 제거 기전을 통해 제거될 수 있다. 선형 제거 기전은 IL-6R30의 비포화성의 비IL-6R 매개성 제거와 관련이 있을 수 있으며, 이는 IL-6R304의 저속의 비특이적인 단백질 분행성 분해에 상응한다. 비선형의 IL-6R 매개성 제거 과정은 포화성 제거 기전이며; IL-6R304가 막 결합된 IL-6R에 결합한 후, 이어서 내재화 및 제거가 일어나는 것으로 제시될 수 있는 가능성이 가장 크다.
중앙 구획으로부터의 선형 및 비선형 제거를 보이는 개방형 3 구획 약물동력학적 모델로 데이터를 피팅함으로써 시노몰구스 원숭이에서의 IL-6R304의 비선형 약물동력학적 양상을 포착하였다. 구조 모델은 도 70에 도시되어 있다.
반복형의 재가중
Figure 112011088504629-pct00005
(여기서,
Figure 112011088504629-pct00006
는 혈장 농도 예측치이다)을 사용함으로써 단일 투여 PK/PD 연구로부터 얻은 모든 이용가능한 개별 i.v. 혈장 농도 데이터를 모델(WinNonlin Professional Software Version 5.1(미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재의 Pharsight Corporation)로 동시에 피팅하였다. 도 71은 1, 5, 10, 25 또는 100 mg/kg의 i.v. 투여 이후, 시노몰구스 원숭이에서 개별적으로 관찰된 IL-6R304의 혈장 농도에 대한 관측치 및 모델을 통해 예측된 IL-6R304의 혈장 농도에 대한 예측치-시간 플롯을 제시한다. 예측된 IL-6R304의 약물동력학적 파라미터는 표 C-47에 제시되어 있다.
단일 투여 PK/PD 연구로부터 얻은 모든 데이터를 중앙 구획으로부터의 선형(CL비 IL -6R) 및 비선형(CLIL -6R) 제거를 보이는 개방형 3 구획 모델로 동시에 피팅하였다. IL-6R304가 저농도일 때(C<<<Km), IL-6R 매개성 제거(CLIL -6R)의 기여도는 우세하며, 이는 V최대/Km과 같다. IL-6R304가 고농도일 때(C>>>Km), IL-6R 매개성 제거 경로는 포화성이 되고, 최대 질량 전환점(즉, Vmax)에서 진행될 것이다. 결과적으로 전체 제거(CL)는 선형 비IL-6R 매개성 경로(CL비IL-6 R)에 의해 지배된다.
제거에서 비선형 IL-6R 매개성 구성 요소가 시노몰구스 원숭이에서 IL-6R304의 반감기의 시간 및 용량 의존성, 둘 모두를 설명한다.
표
<표 A-1>
Figure 112011088504629-pct00007
<표 B-1>
Figure 112011088504629-pct00008
<표 B-2>
Figure 112011088504629-pct00009
Figure 112011088504629-pct00010
<표 B-3>
Figure 112011088504629-pct00011
Figure 112011088504629-pct00012
<표 B-4>
Figure 112011088504629-pct00013
Figure 112011088504629-pct00014
<표 B-5>
Figure 112011088504629-pct00015
<표 B-6>
Figure 112011088504629-pct00016
<표 B-7>
Figure 112011088504629-pct00017
<표 B-8>
Figure 112011088504629-pct00018
<표 C-1>
Figure 112011088504629-pct00019
<표 C-2>
Figure 112011088504629-pct00020
<표 C-3>
Figure 112011088504629-pct00021
<표 C-4>
Figure 112011088504629-pct00022
<표 C-5>
Figure 112011088504629-pct00023
<표 C-6>
Figure 112011088504629-pct00024
<표 C-7>
Figure 112011088504629-pct00025
<표 C-8>
Figure 112011088504629-pct00026
<표 C-9>
Figure 112011088504629-pct00027
<표 C-10>
Figure 112011088504629-pct00028
<표 C-11>
Figure 112011088504629-pct00029
<표 C-12>
Figure 112011088504629-pct00030
<표 C-13>
Figure 112011088504629-pct00031
<표 C-14>
Figure 112011088504629-pct00032
<표 C-15>
Figure 112011088504629-pct00033
<표 C-16>
Figure 112011088504629-pct00034
<표 C-17>
Figure 112011088504629-pct00035
<표 C-18>
Figure 112011088504629-pct00036
<표 C-19>
Figure 112011088504629-pct00037
<표 C-20>
Figure 112011088504629-pct00038
<표 C-21>
Figure 112011088504629-pct00039
<표 C-22>
Figure 112011088504629-pct00040
<표 C-23>
Figure 112011088504629-pct00041
<표 C-24>
Figure 112011088504629-pct00042
<표 C-25>
Figure 112011088504629-pct00043
<표 C-26>
Figure 112011088504629-pct00044
<표 C-27>
Figure 112011088504629-pct00045
<표 C-28>
Figure 112011088504629-pct00046
<표 C-29>
Figure 112011088504629-pct00047
<표 C-30>
Figure 112011088504629-pct00048
<표 C-31>
Figure 112011088504629-pct00049
<표 C-32>
Figure 112011088504629-pct00050
<표 C-33>
Figure 112011088504629-pct00051
<표 C-34>
Figure 112011088504629-pct00052
<표 C-35>
Figure 112011088504629-pct00053
<표 C-36>
Figure 112011088504629-pct00054
<표 C-37>
Figure 112011088504629-pct00055
<표 C-38>
Figure 112011088504629-pct00056
<표 C-39>
Figure 112011088504629-pct00057
<표 C-40>
Figure 112011088504629-pct00058
<표 C-41>
Figure 112011088504629-pct00059
<표 C-42>
Figure 112011088504629-pct00060
<표 C-43>
Figure 112011088504629-pct00061
<표 C-44>
Figure 112011088504629-pct00062
<표 C-45>
Figure 112011088504629-pct00063
<표 C-46>
Figure 112011088504629-pct00064
<표 C-47>
Figure 112011088504629-pct00065
SEQUENCE LISTING <110> Ablynx N.V. <120> Improved amino acid sequences directed against IL-6R and polypeptides comprising the same for the treatment of IL-6R related diseases and disorders <130> P09-007-PCT-1 <150> US 61/168,410 <151> 2009-04-10 <160> 105 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant antibody <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 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Artificial Sequence <220> <223> Nanobody <400> 97 Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 98 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanobody <400> 98 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 99 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanobody <400> 99 Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Glu Arg Ile Phe Asp Leu Asn 20 25 30 Leu Met Gly Trp Tyr Arg Gln Gly Pro Gly Asn Glu Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Cys Ile Thr Val Gly Asp Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Met Asp Tyr Thr Lys Gln Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu His Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Lys Ile Arg Arg Thr Trp His Ser Glu Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 100 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Myc tag <400> 100 Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala 1 5 10 15 Ala <210> 101 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 101 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 102 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 102 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 103 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 103 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 104 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 104 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 105 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 105 Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala Ala 1 5 10

Claims (23)

  1. 4개의 골격 부위 및 3개의 상보성 결정 부위(각각 CDR1 내지 CDR3)로 구성되는, IL-6R에 대한 폴리펩티드로서, CDR1, CDR2 및 CDR3이
    - 서열번호 80, 서열번호 89, 및 서열번호 94;
    - 서열번호 80, 서열번호 84, 및 서열번호 93;
    - 서열번호 80, 서열번호 89, 및 서열번호 93; 또는
    - 서열번호 80, 서열번호 91, 및 서열번호 93
    으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 80, 서열번호 84 및 서열번호 93을 포함하는 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 서열번호 65-69로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
  4. 제1항에 따른 1 이상의 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 컨스트럭트.
  5. 제4항에 있어서, 제1항에 따른 1 이상의 폴리펩티드를 포함하거나 또는 그로 구성되고, 1 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛을 더 포함하는 폴리펩티드 컨스트럭트.
  6. 제5항에 있어서, 제1항에 따른 1 이상의 폴리펩티드를 포함하거나 또는 그로 구성되고, 1 이상의 링커를 통해 연결된 1 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛을 더 포함하는 폴리펩티드 컨스트럭트.
  7. 제5항에 있어서, 상기 1 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛은 반감기가 증가된 폴리펩티드 컨스트럭트를 제공하고, 상기 1 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛은 도메인 항체, 단일 도메인 항체, "dAb", 또는 혈청 알부민 또는 혈청 면역글로불린에 결합할 수 있는 나노바디로 구성된 군에서 선택되는 것인 폴리펩티드 컨스트럭트.
  8. 제7항에 있어서, 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민인 폴리펩티드 컨스트럭트.
  9. 제7항에 있어서, 혈청 면역글로불린은 IgG인 폴리펩티드 컨스트럭트.
  10. 제4항에 있어서, 폴리펩티드 컨스트럭트가 서열번호 70-72로부터 선택되는 것인 폴리펩티드 컨스트럭트.
  11. 제4항에 있어서, 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 컨스트럭트.
  12. 제4항에 있어서, 1 nM 내지 1 pM의 해리 상수(KD)로 hIL-6R에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 컨스트럭트.
  13. 제4항에 있어서, 500 pM 내지 1 pM의 해리 상수(KD)로 hIL-6R에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 컨스트럭트.
  14. 제4항에 있어서, 100 pM 내지 1 pM의 해리 상수(KD)로 hIL-6R에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 컨스트럭트.
  15. 제4항에 있어서, 50 pM 내지 1 pM의 해리 상수(KD)로 hIL-6R에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 컨스트럭트.
  16. 제1항에 따른 하나의 폴리펩티드를 포함하는 1가 폴리펩티드 컨스트럭트.
  17. 제1항에 따른 폴리펩티드 또는 제16항에 따른 1가 폴리펩티드 컨스트럭트를 1 이상의 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 유닛에 연결시키는 것을 포함하는, 제4항에 따른 다가 폴리펩티드 컨스트럭트의 제조 방법.
  18. 제1항에 따른 폴리펩티드, 제4항에 따른 폴리펩티드 컨스트럭트를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 수득될 수 있는 상기 폴리펩티드 컨스트럭트, 또는 제16항에 따른 1가 폴리펩티드 컨스트럭트를 코딩하는 핵산.
  19. 제1항에 따른 폴리펩티드, 제4항에 따른 폴리펩티드 컨스트럭트를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 수득될 수 있는 상기 폴리펩티드 컨스트럭트, 또는 제16항에 따른 1가 폴리펩티드 컨스트럭트를 발현하고; 상기 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드 컨스트럭트, 또는 상기 1가 폴리펩티드 컨스트럭트를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 컨스트럭트를 포함하는 인간을 제외한 숙주 또는 단리된 숙주 세포.
  20. 제1항에 따른 폴리펩티드, 제4항에 따른 폴리펩티드 컨스트럭트를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 수득될 수 있는 상기 폴리펩티드 컨스트럭트, 또는 제16항에 따른 1가 폴리펩티드 컨스트럭트를 제조하는 방법으로서, 적어도
    a) 단리된 숙주 세포 또는 인간을 제외한 숙주 유기체 또는 다른 발현 시스템에서, 제1항에 따른 폴리펩티드, 제4항에 따른 폴리펩티드 컨스트럭트를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 수득될 수 있는 상기 폴리펩티드 컨스트럭트, 또는 제16항에 따른 1가 폴리펩티드 컨스트럭트를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 컨스트럭트를 발현시키거나; 또는
    제1항에 따른 폴리펩티드, 제4항에 따른 폴리펩티드 컨스트럭트를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 수득될 수 있는 상기 폴리펩티드 컨스트럭트, 또는 제16항에 따른 1가 폴리펩티드 컨스트럭트를 발현하고, 상기 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드 컨스트럭트, 또는 상기 1가 폴리펩티드 컨스트럭트를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 컨스트럭트를 포함하는 인간을 제외한 숙주 또는 단리된 숙주 세포를, 상기 숙주 또는 숙주 세포가 1 이상의 제1항에 따른 폴리펩티드, 제4항에 따른 폴리펩티드 컨스트럭트를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 수득될 수 있는 상기 폴리펩티드 컨스트럭트, 또는 제16항에 따른 1가 폴리펩티드 컨스트럭트를 발현 또는 생산하도록 하는 조건하에서 배양 또는 유지시키는 단계를 포함하는 제조 방법.
  21. 제1항에 따른 폴리펩티드, 제4항에 따른 폴리펩티드 컨스트럭트를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 수득될 수 있는 상기 폴리펩티드 컨스트럭트, 또는 제16항에 따른 1가 폴리펩티드 컨스트럭트를 제조하는 방법으로서, 적어도
    a) 단리된 숙주 세포 또는 인간을 제외한 숙주 유기체 또는 다른 발현 시스템에서, 제1항에 따른 폴리펩티드, 제4항에 따른 폴리펩티드 컨스트럭트를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 수득될 수 있는 상기 폴리펩티드 컨스트럭트, 또는 제16항에 따른 1가 폴리펩티드 컨스트럭트를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 컨스트럭트를 발현시키거나; 또는
    제1항에 따른 폴리펩티드, 제4항에 따른 폴리펩티드 컨스트럭트를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 수득될 수 있는 상기 폴리펩티드 컨스트럭트, 또는 제16항에 따른 1가 폴리펩티드 컨스트럭트를 발현하고, 상기 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드 컨스트럭트, 또는 상기 1가 폴리펩티드 컨스트럭트를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 컨스트럭트를 포함하는 인간을 제외한 숙주 또는 단리된 숙주 세포를, 상기 숙주 또는 숙주 세포가 1 이상의 제1항에 따른 폴리펩티드, 제4항에 따른 폴리펩티드 컨스트럭트를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 수득될 수 있는 상기 폴리펩티드 컨스트럭트, 또는 제16항에 따른 1가 폴리펩티드 컨스트럭트를 발현 또는 생산하도록 하는 조건하에서 배양 또는 유지시키는 단계,
    후속하여
    b) 이렇게 얻어진 제1항에 따른 폴리펩티드, 제4항에 따른 폴리펩티드 컨스트럭트를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 수득될 수 있는 상기 폴리펩티드 컨스트럭트, 또는 제16항에 따른 1가 폴리펩티드 컨스트럭트를 단리 또는 정제하는 단계
    를 포함하는 제조 방법.
  22. 패혈증, 각종 형태의 암, 골다공증, 악액질, 건선, 혈관사이세포 증식성 사구체신염, 카포시 육종, AIDS 관련 림프종, 류마티스 관절염, 전신적으로 발병된 청소년성 특발성 관절염, 고감마글로불린혈증, 크론병, 궤양성 대장염, 전신 홍반 루푸스(SLE), 다발 경화증, 캐슬만씨 병, IgM 감마글로불린병증, 심장 점액종, 천식, 알레르기성 천식 및 자가면역 인슐린 의존 당뇨병으로 구성된 군에서 선택되는, IL-6, IL-6R, IL-6/IL-6R 복합체, 및 IL-6, IL-6R 및 IL-6/IL-6R 복합체로 구성된 군에서 선택된 1 이상이 관여하는 신호전달 경로 또는 생물학적 기능 및 반응으로 구성된 군으로부터 선택된 1 이상과 관련된 질병 및 질환 중 1 이상을 예방, 치료 또는 둘다를 위한, 1 이상의 제1항에 따른 폴리펩티드, 제4항에 따른 폴리펩티드 컨스트럭트, 제16항에 따른 1가 폴리펩티드 컨스트럭트, 또는 상기 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드 컨스트럭트 또는 상기 1가 폴리펩티드 컨스트럭트를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 약학 조성물인 조성물.
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