CN111875706B - 一种抗人IgE蛋白的单域抗体及其应用 - Google Patents

一种抗人IgE蛋白的单域抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及血液净化领域，尤其涉及一种抗人IgE蛋白的单域抗体及其应用。所述的单域抗体的氨基酸序列的结构通式如下：MDVQLQESGGG‑X1‑LSC‑X2‑GRFTIS‑X3‑GQGTQVTVSS；其中X1为含1‑9个氨基酸的氨基酸序列，X2为含1‑43个氨基酸的氨基酸序列，X3为含1‑38个氨基酸的氨基酸序列。本发明通过噬菌体展示技术筛选到可用原核或真核表达的可溶性单域抗体，生产成本低。将所得到的单域抗体偶联至固相载体后合成的免疫吸附剂对人IgE的吸附量高，特异性好；且对人IgG的非特异性吸附较低。本发明的抗人IgE蛋白的单域抗体为治疗过敏性疾病提供了新的选择。

Description

一种抗人IgE蛋白的单域抗体及其应用
技术领域
本发明涉及血液净化领域，尤其涉及一种抗人IgE蛋白的单域抗体及其应用。
背景技术
超敏反应有着极大的发病人群，正影响着超过25％的世界总人口数。其中，I型***反应亦称速发型过敏反应或过敏反应，是由IgE通过结合肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的高亲和力受体而引起的一种免疫***疾病，如临床常见的过敏性哮喘、过敏性荨麻疹、过敏性皮炎、过敏性鼻炎和青霉素引起的过敏性休克等。过敏反应发生时，患者体内的IgE浓度达到正常值的10倍以上，尤其是致敏原特异性IgE的浓度可以达到正常值的1000倍左右(GOULD H J,SUTTON B J等2003)。
目前药物治疗是治疗过敏反应性疾病的主要方法，以采用免疫抑制剂类药物为主。这些药物疗法对偶发性过敏反应治疗效果良好，但对需要长期服药的过敏性哮喘等慢性、顽固性过敏疾病治疗副作用很大。近年来，血液吸附净化治疗由IgE介导的I型***反应已成为一种选择趋势。德国美天旎公司和德国费森尤斯公司相继开发了特异性IgE吸附产品。
单域抗体于1993年在哺乳类骆驼科(Camelidae)动物的体液免疫***中发现，由单一的可变区、1个铰链区和2个恒定区(CH2和CH3)组成，分子量15KD。重链抗体具有易表达、可溶性好、稳定性强等优点，其结合亲和性接近传统抗体，可低至100pmol/L(GOULD HJ,SUTTON B J等，2004)，近年来被广泛应用于药物研发等领域。
发明内容
因此，针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抗人IgE蛋白的单域抗体及其应用，可对人体IgE进行特异性吸附。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种抗人IgE蛋白的单域抗体，所述的单域抗体的氨基酸序列的结构通式如下：
MDVQLQESGGG-X1-LSC-X2-GRFTIS-X3-GQGTQVTVSS；
其中X1为含1-9个氨基酸的氨基酸序列，X2为含1-43个氨基酸的氨基酸序列，X3为含1-38个氨基酸的氨基酸序列。
含有本发明氨基酸序列结构通式：MDVQLQESGGG-X1-LSC-X2-GRFTIS-X3-GQGTQVTVSS的单域抗体，均可对人体IgE进行特异性吸附，从而达到清除IgE的目的。
作为本发明所述的单域抗体的优选实施方式，所述单域抗体的氨基酸序列如SEQID NO.1～SEQ ID NO.10任一所示。
另外，本发明提供了编码所述单域抗体的核苷酸。
本发明还提供了一种免疫吸附剂，所述免疫吸附剂含有所述的单域抗体。
作为本发明所述的免疫吸附剂的优选实施方式，所述免疫吸附剂是将所述单域抗体偶联至固相载体所得。
作为本发明所述的免疫吸附剂的优选实施方式，所述固相载体为壳聚糖微球、琼脂糖微球、葡聚糖凝胶、树脂、纤维素微球中的至少一种。
作为本发明所述的免疫吸附剂的优选实施方式，所述固相载体优选琼脂糖载体。
琼脂糖载体因表面富含羟基，其生物相容性是最好的，适于血液净化方面的应用。
作为本发明所述的免疫吸附剂的优选实施方式，所述偶联为采用环氧活化法进行偶联。
通过活化后的环氧基接入乙二胺及戊二醛，增加了间隔臂长度，能够最大限度保证偶联量，提高填料的吸附性能。
作为本发明所述的免疫吸附剂的优选实施方式，所述偶联的步骤如下：
(1)取固相载体填料，加入碱性溶液、环氧氯丙烷溶液，反应后清洗填料，抽干；
(2)往步骤(1)抽干后的填料中加入PBS溶液、乙二胺溶液，反应后清洗填料，抽干；
(3)往步骤(2)抽干后的填料中加入PBS溶液、戊二醛溶液，反应后用反渗水清洗填料，抽滤；
(4)往步骤(3)抽滤后的填料中加入所述单域抗体、碳酸盐缓冲液，反应后清洗填料，抽干。
作为本发明所述的免疫吸附剂的优选实施方式，所述的碱性溶液为NaOH溶液。
作为本发明所述的免疫吸附剂的优选实施方式，所述偶联的具体步骤如下：
(1)取固相载体填料，加入3倍体积的2M NaOH，按照体积比1:0.3～1:0.9加入环氧氯丙烷溶液，35～42℃，100～200rpm，反应1～4h后清洗填料，抽干；
(2)往步骤(1)抽干后的填料中加入等体积的PBS溶液，按照体积比1:0.3～1:0.9加入乙二胺溶液，35～42℃，100～200rpm，反应1～5h后清洗填料，抽干；
(3)往步骤(2)抽干后的填料中加入等体积的PBS溶液，按照体积比1:1.0～1:2.0加入戊二醛溶液，35～42℃，100～200rpm，反应1～5h后用反渗水清洗填料，抽滤；
(4)往步骤(3)抽滤后的填料中，按照投料量10mg/mL加入所述单域抗体蛋白溶液，缓冲液为与填料等体积的碳酸盐缓冲液，25～35℃，100～200rpm，反应1～5h后清洗填料，抽干。
本发明还提供所述单域抗体在制备治疗和/或预防IgE引起的过敏性疾病的药物中的应用。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述IgE引起的过敏性疾病包括哮喘、特应性皮炎、变应性支气管肺曲霉病、过敏性鼻炎、湿疹或荨麻疹、食物过敏。
本发明还提供所述免疫吸附剂在血液净化领域中的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明用真核表达的人IgEcε2-4区免疫羊驼，收集外周血单核细胞PBMC，通过分子生物学方法扩增出可变区序列，构建特异性的单域抗体噬菌体库。然后加入辅助噬菌体，通过包被人IgE，用ELISA板3-4轮淘选后，选择特异性高的菌株进行测序，获得单域抗体的基因序列。所构建的噬菌体库库容量达到1013，保证了基因的多样性，为后续筛选到特异性更好的序列奠定了良好的基础。
(2)本发明用大肠杆菌或酵母菌作为宿主细胞，在体外重组表达单域抗体，筛选出可溶性表达的菌株。大肠杆菌优点是生产速度快，生产控制比较容易。也可以选用酿酒酵母进行表达，酿酒酵母是一种公认的不产生任何毒素的安全真核微生物，在生长过程中不分泌太多同源蛋白，可以简化下游处理过程。酵母含有内质网和高尔基体等类似哺乳动物细胞***的分泌细胞器，可以有效形成分子内二硫键，产生糖基化的外源蛋白。
(3)本发明通过噬菌体展示技术筛选到可用原核或真核表达的可溶性单域抗体，生产成本低。将所得到的单域抗体偶联至固相载体后合成的免疫吸附剂对人IgE的吸附量高，特异性好；且对人IgG的非特异性吸附较低，IgG是人免疫球蛋白中含量最高的，约7-16g/L，对IgG的吸附性能如果比较高会屏蔽抗体结合人IgE的位点，降低IgE吸附性能。本发明的IgE免疫吸附剂为治疗过敏性疾病提供了新的选择。
附图说明
图1：实施例3制备得到的单域抗体的SDS-PAGE电泳检测结果图；其中单域抗体的分子量为14KD。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何形式限制本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均应当属于本申请要求保护的范围之中。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂盒生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1结合人免疫球蛋白E(IgE)羊驼噬菌体抗体库的建立
用真核表达的人IgEcε2-4免疫羊驼，收集外周血单核细胞PBMC，提取RNA，反转录为cDNA，通过PCR扩增后，用hindIII和NotI酶切后连接至噬菌粒载体pHIAT-1上，转化至大肠杆菌TG1，形成原始噬菌体库。将辅助噬菌体M13KO7加入到生长至对数期的TG1菌株中，培养过夜后，离心收集上清，PEG沉淀噬菌粒，用PBS重悬噬菌体后经0.45um的滤器过滤除菌，即获得噬菌体VHH抗体库，库容量为4.8×1013。
实施例2单克隆噬菌体抗体的筛选
辅助噬菌体M13KO7测定的滴度为1×1012pfu/ml。用辅助噬菌体M13KO7侵染TG1。
(1)第一轮筛选：在ELISA板上包被天然的人IgE，5μg/孔，4℃过夜，洗板3次；用PBST溶解BSA至浓度3％，200μL/孔，37℃封闭2h，洗板3次；每孔加入100μL的噬菌体库溶液，37℃孵育2h，洗板6次；每孔加入100μL的甘氨酸缓冲液(gly-HCL)室温下轻摇10min，吸出洗脱液，加入80μL的Tris-HCl缓冲液中和。取10μL洗脱液测滴度，其余加入至5mL生长至对数期的TG1菌种，37℃感染30min，加入预热的2×YT培养基至总体积为10mL，37℃，250rpm，30min，加入氨苄至终浓度为100μg/mL，培养2h。加入卡那霉素至终浓度为70μg/mL，过夜培养，4℃，4000rpm，离心15min，收集上清液加入5mLPEG/NaCl，冰浴1h，4℃，9000rpm，离心20min，弃去上清。将离心管倒置于吸水纸上拍干。然后用1ml的PBS重悬，4℃，14000rpm，离心10min，去除残留的细胞碎片，沉淀即为噬菌体抗体颗粒。
2)第二轮筛选：在ELISA板上包被天然的人IgE，1μg/孔，洗板3次；用3％的脱脂奶粉，洗板3次；每孔加入100μL的噬菌体库溶液，37℃孵育2h，洗板10次；其余操作同第一轮筛选。
3)第三轮筛选：在ELISA板上包被天然的人IgE，0.1μg/孔，洗板3次；用3％的BSA封闭，洗板3次；每孔加入100μL的噬菌体库溶液，37℃孵育2h，洗板15次；其余操作同第一轮筛选。
经过三轮筛选后，抗IgE噬菌体单链抗体的回收率由第一轮的2.0×10-6提升至第3轮的7.5×10-3，共达到3750倍的富集。
4)用噬菌体感染TG1细菌，涂布于培养皿中，从培养后的平板上随机挑取44个单克隆，以原始文库为阴性对照，ELISA检测，挑选OD450值大于原始文库2.1倍的为初步阳性克隆。共筛选出41个阳性克隆，测序。41个阳性克隆送去测序。根据测序结果，去除重复序列后筛选其中的10条序列作为备选序列，10条序列的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.10所示。
实施例3体外重组表达及抗体纯化
将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因序列，通过酶切位点NcoI和XhoI转入PET28质粒中，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。用含有70μg/mL卡那霉素的LB培养基扩大培养后，收集菌体，超声破碎(开5s，停10s，工作时间20min)后，10000rpm离心10min，收集上清液。利用his标签用镍离子螯合填料进行纯化，收集洗脱峰即得到羊驼单域抗体SD1。测定单域抗体SD1的表达量为30mg/L。
实施例4体外重组表达及抗体纯化
将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的基因序列，通过酶切位点BamH1和EcoRI转入YCPIac33质粒中，在酿酒酵母BJ5457中表达。用含有50μg/mL氨苄的YPDA培养基扩大培养，收集上清液。利用his标签用镍离子螯合填料进行纯化，收集洗脱峰即得到羊驼单域抗体。测定单域抗体的表达量为20mg/L。
实施例5免疫吸附剂的合成
(1)取10mL的琼脂糖(GE sepharose 4FF)填料，加入30mL的2M NaOH溶液，6mL的环氧氯丙烷溶液，40℃，180rpm，反应2.5h后将填料倒入砂芯漏斗中，用200mL反渗水冲洗至清洗液中无环氧基残留，真空抽干3min。
(2)上述填料加入10mL PBS溶液及8mL乙二胺溶液，37℃，180rpm，反应4h。用反渗水清洗填料，抽滤。
(3)上述填料加入10mL PBS溶液及12mL的戊二醛，37℃，180rpm，反应4h。用反渗水清洗填料，抽滤。
(4)加入10mL的含10mg/mL单域抗体(实施例3制备得到，氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示)的碳酸盐缓冲液(碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.94g，定容至100mL，pH＝8.3)，25℃，180rpm，反应4h。用反渗水清洗填料，抽干，加入20％乙醇保存，备用。
实施例6吸附剂对人免疫球蛋白的吸附性能检测
参照实施例3的方法表达纯化得到蛋白SD3、SD4(氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示)，并参照实施例5的方法分别制备得到免疫吸附剂，采用静态吸附检测得到的免疫吸附剂的吸附性能，1ml免疫吸附剂与10ml健康人血浆(加入1500IU/ml的真核IgE蛋白)混合常温振荡反应40min，用IgE试剂盒(abcam)测定吸附前后血浆中IgE差值。用生化分析仪(迈瑞)测定吸附前后血浆中人IgG的含量，测定非特异性吸附量。
表1吸附剂对人免疫球蛋白的吸附性能检测
Figure BDA0002588383500000071
从表1中可以看出，将所得到的单域抗体偶联至固相载体后合成的免疫吸附剂对人IgE的吸附量高，特异性好；且对人IgG的非特异性吸附较低，IgG是人免疫球蛋白中含量最高的，约7-16g/L，对IgG的吸附性能如果比较高会屏蔽抗体结合人IgE的位点，降低IgE吸附性能。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州康盛生物科技股份有限公司
<120> 一种抗人IgE蛋白的单域抗体及其应用
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
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35 40 45
Val Ala Ile Ile Thr Ser Asp Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Glu Asn Thr Ile
65 70 75 80
Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Tyr Ala Gly Arg Arg Tyr Gly Thr Tyr Gly Ser Ser Asn Asn Asp
100 105 110
Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 7
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 7
Met Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Met Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Pro Ser Thr Ile Thr Leu Asp Tyr
20 25 30
Tyr Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu
35 40 45
Val Ser Ser Ile Ser His Lys Asn Gly Gly Pro Cys Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Glu Asn Val Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Ala Ala Leu Tyr Ser
85 90 95
Cys Ala Ala Arg Arg Gly Leu Ser Thr Leu Cys Arg Leu Gly Lys Asp
100 105 110
Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 8
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 8
Met Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ala Leu Asp Tyr
20 25 30
Tyr Thr Ile Asn Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly
35 40 45
Val Ala Cys Ile Asn Ser Lys Tyr Gly Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Met Arg Leu Val Thr Asn His Gln Ala Thr Cys Leu Asn Pro
100 105 110
Asp Arg Tyr Asp Leu Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 9
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 9
Met Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Thr Ser Ser Gly Thr Arg Leu Asp Tyr
20 25 30
Tyr Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly
35 40 45
Val Ser Ala Ile Gly Arg Thr Asp Asp Arg Ile His Tyr Val Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ala Glu Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu His Met Asn Asn Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Asp Arg Gly Tyr Ser Ser Phe Thr Pro Leu Ala Leu Gly
100 105 110
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115 120 125
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<211> 128
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 10
Met Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
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Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Phe His Ser Asp Tyr
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Trp Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly
35 40 45
Val Ser Cys Ile Thr Thr Lys Tyr Gly Ala Ser Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Ala Met Arg Leu Ile Thr Asn His Gln Ala Thr Cys Leu Asn Pro
100 105 110
Ser Arg Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

Claims (10)

1.一种抗人IgE蛋白的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4任一所示。
2.编码权利要求1所述单域抗体的核苷酸。
3.一种免疫吸附剂，其特征在于，所述免疫吸附剂含有权利要求1所述的单域抗体。
4.根据权利要求3所述的免疫吸附剂，其特征在于，所述免疫吸附剂是将所述单域抗体偶联至固相载体所得。
5.根据权利要求4所述的免疫吸附剂，其特征在于，所述固相载体为壳聚糖微球、琼脂糖微球、葡聚糖凝胶、树脂、纤维素微球中的至少一种。
6.根据权利要求4所述的免疫吸附剂，其特征在于，所述偶联为采用环氧活化法进行偶联。
7.根据权利要求4所述的免疫吸附剂，其特征在于，所述偶联的步骤如下：
（1）取固相载体填料，加入碱性溶液、环氧氯丙烷溶液，反应后清洗填料，抽干；
（2）往步骤（1）抽干后的填料中加入PBS溶液、乙二胺溶液，反应后清洗填料，抽干；
（3）往步骤（2）抽干后的填料中加入PBS溶液、戊二醛溶液，反应后用反渗水清洗填料，抽滤；
（4）往步骤（3）抽滤后的填料中加入所述单域抗体、碳酸盐缓冲液，反应后清洗填料，抽干。
8.权利要求1所述单域抗体在制备治疗和/或预防IgE引起的过敏性疾病的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述IgE引起的过敏性疾病包括哮喘、特应性皮炎、变应性支气管肺曲霉病、过敏性鼻炎、湿疹或荨麻疹、食物过敏。
10.权利要求3-7任一所述免疫吸附剂在制备血液净化领域相关产品中的应用。
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