DE69434447T2 - Für die gentherapie verwendbare plasmide - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Plasmide, die in der Gentherapie eingesetzt werden können, und zugehörige Verfahren.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Bei menschlichem Krebs treten verschiedene genetische Anomalien auf, die zu neoplastischen Transformationen und Malignität beitragen. Eine Instabilität des Genoms führt zu Mutationen, die Zellproliferation, Angiogenese, Metastasen und Tumorimmunogenität beeinflussen. Obwohl man heute schon mehr über die molekulare Grundlage von Krebs weiß, sind immer noch viele Malignitäten resistent gegenüber herkömmlichen Behandlungsformen. Die Definition von tumorassoziierten genetischen Mutationen hat jedoch erhöhtes Interesse an Krebs als Ziel der Gentherapie geweckt. Immuntherapie hat sich als viel versprechender erster Ansatz zur Behandlung von Malignität herausgestellt. Tatsächlich sprechen bestimmte Krebsarten, wie beispielsweise Melanome oder Nierenzellkarzinome, besser auf eine Modulation der Immunfunktion an, möglicherweise weil das Immunsystem dazu gebracht werden kann, mutierte Genprodukte in diesen Zellen zu erkennen. Herkömmlicherweise umfassten immuntherapeutische Ansätze die Verabreichung von nichtspezifischen Immunmodulatoren, wie z.B. Bacillus-Calmette-Guerin (BCG), Cytokinen und/oder passive T-Zellen-Immunisierung, die in Tiermodellen (B. Zbar et al., J. Natl. Canc. Inst. 46, 831 (1971); S.A. Rosenberg et al., J. Exp. Med. 16, 1169 (1985); S. Shu und S.A. Rosenberg, Cancer Res. 45, 1657 (1985); P.J. Spiess et al., J. Natl. Canc. Inst. 79, 1067; T. Chou et al., J. Immunol. 140, 2453 (1988); H. Yoshizawa et al., J. Immunol. 147, 729 (1991)) und beim Menschen (D.L. Morton et al., Ann. Surg. 180, 635 (1974); S.A. Rosenberg et al., Ann. Surg. 210, 474 (1989); S.A. Rosenberg et al., N. Eng. J. Med. 319, 1676 (1988); R.L. Kradin et al., Lancet 577 (1989)) zu viel versprechenden Ergebnissen führten. Vor kurzem wurden beim Versuch, die Wirksamkeit der Immuntherapie zu verbessern, molekulargenetische Eingriffe entworfen. Arbeitsvorschriften für den Transfer von menschlichen Genen wurden ausgearbeitet, um den Transport von Lymphozyten in Melanomtumoren zu überwachen (S.A. Ro senberg et al., N. Eng. J. Med. 323, 570 (1990)) oder um Cytokingene in Tumorzellen einzuführen, um eine Immunreaktion des Wirten auf den verbleibenden Tumor zu stimulieren (S.A. Rosenberg, Hum. Gene Ther. 3, 57 (1992)).
  • Vor kurzem wurde ein neuer molekulargenetischer Eingriff für menschliche Malignität entwickelt. Dieser Ansatz basiert auf der direkten Übertragung von rekombinanten Genen in etablierte Tumoren in vivo, um sie während ihres Wachstums in situ genetisch zu modifizieren. In Tiermodellen signalisiert die Einführung eines Gens, das für ein fremdes Haupthistokompabilitätskomplex- (MHC-) Protein (Klasse I) kodiert, in vivo dem Immunsystem, auf das fremde Antigen zu reagieren (G.E. Plautz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 4645 (1993); E.G. Nabel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5157 (1992)). Noch wichtiger ist, dass, wenn das Gen in vivo in etablierte Tumoren transduziert wird, auch eine zytolytische T-Zell-Reaktion gegen unmodifizierte Tumorzellen ausgelöst wird. In Mäusemodellen führte dieser Ansatz zu signifikanten Verringerungen des Tumorwachstums und in manchen Fällen sogar zu einer kompletten Remission (G.E. Plautz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 4645 (1993)). Aufgrund dieser Studien erteilte das Recombinant DNA Advisory Committee of the National Institutes of Health vor kurzem die Genehmigung zur Durchführung eines klinischen Versuchs an Menschen, bei dem die direkte Übertragung eines menschlichen Transplantationsantigens eingesetzt wurde, um Malignität zu behandeln. In diesem Versuchsprotokoll wurden die Durchführung eines direkten Gentransfers an Menschen und die Verwendung eines nichtviralen Vektors vorgeschlagen, der einige Sicherheitsbedenken in Bezug auf virale Vektoren zerstreute. Dieser klinische Versuch umfasste die Behandlung von Patienten mit metastatischen Melanomen an subkutanen Läsionen. Die Behandlung bestand aus einer intratumoralen Injektion des menschlichen Klasse-I-MHC-Gens HLA-B7, das an ein kationisches Liposom, DC-Cholesterin, komplexiert worden war (G.J. Nabel, Hum. Gene Ther. 3, 705 (1992); X. Gao und L. Huang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 179, 280 (1991)). Diese Patienten erhielten steigende Dosen des DNA-Liposom-Komplexes. Die Expression von rekombinanten Genen, die Toxizität und die Immunantwort auf die Behandlung werden bewertet. Wie schon in Tierstudien gezeigt wurde, führt diese Art des direkten Gentransfers in vivo weder in kurzfristigen noch in langfristigen Studien zu Toxizität (G.J. Nabel, Hum. Gene Ther. 3, 399 (1992); G.J. Nabel, Hum. Gene Ther. 3, 705 (1992); M.J. Stewart et al., Hum. Gene Ther. 3, 267 (1992)). Alles in allem zielten diese Studien darauf ab, zu bestimmen, ob direkter Gentransfer eine geeignete Behandlungsform für Malignität darstellt.
  • Direkter Gentransfer und Modulation des Immunsystems
  • Die Verwendung von In-vivo-Genanlieferung mithilfe eines Katheters stellte eine Modellsystem zur Einführung von rekombinante Gene enthaltenden Molekülen an bestimmten Stellen in vivo bereit. Frühe Studien konzentrierten sich auf den Nachweis, dass spezifische Reportergene in vivo exprimiert werden konnten (E.G. Nabel et al., Science 249, 1285 (1990); E.G. Nabel et al., Science 244, 1342 (1989)). Nachfolgende Studien waren darauf ausgerichtet, zu bestimmen, ob an Transferstellen von rekombinanten Genen spezifische biologische Reaktionen ausgelöst werden können. Um diese Frage zu beantworten, wurde ein stark immunogenes Molekül, ein fremder Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC), verwendet, um in der iliofemoralen Arterie eines Schweinemodells eine Immunreaktion auszulösen. Das menschliche HLA-B7-Gen wurde unter Verwendung von direktem Gentransfer mit einem retroviralen Vektor oder einem DNA-Liposom-Komplex eingeführt (E.G. Nabel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5157 (1992)). Bei beiden Verabreichungssystemen konnte an bestimmten Stellen innerhalb der Gefäßwand die Expression des rekombinanten HLA-B7-Genprodukts nachgewiesen werden. Noch wichtiger ist, dass die Expression dieses fremden Histokompatibiltiätsantigens an genetischen Modifikationsstellen eine immunologische Reaktion auslöste. Diese Reaktion umfasste ein granulomatöses mononucleares Zellinfiltrat ab dem 10. Tag nach der Einführung des rekombinanten Gens. Diese Reaktion hörte 75 Tage nach dem Gentransfer auf; eine spezifische zytolytische Z-Zellreaktion gegen das HLA-B7-Molekül blieb aber. Diese Studie zeigte, dass durch die Einführung eines fremden rekombinanten Gens an einer spezifischen Stelle in vivo eine spezifische immunologische Reaktion ausgelöst werden kann. Außerdem wies diese Studie erstmals darauf hin, dass direkter Gentransfer von spezifi schen rekombinanten Genen eine Immunantwort auf das Produkt dieses Gens in vivo auslösen kann (E.G. Nabel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5157 (1992)).
  • Diese Studien ließen vermuten, dass die Einführung der geeigneten rekombinanten Gene verwendet werden könnte, um das Immunsystem zu stimulieren, ihre Produkte in vivo zu erkennen. Außerdem ergab dieser Ansatz ein allgemeines Verfahren zur Induktion einer spezifischen Stelle in vivo. Um zu bestimmen, ob direkter Gentransfer zur Behandlung einer Krankheit eingesetzt werden kann, wurde ein Mäusemodell einer Malignität entwickelt. Der direkte Gentransfer eines allogenen Histokompatibilitätskomplexgens in einen Mäusetumor löste nicht nur eine Immunantwort auf das fremde MHC-Protein aus, sondern auch auf vorher nicht erkannte tumorassoziierte Antigene. Diese Immunantworten hingen von der T-Zelle ab, und diese tumorassoziierten Proteine wurden im Kontext des Selbst-Haupthistokompatibilitätskomplexes erkannt. Bei Tieren, die gegenüber einem spezifischen MHC-Haplotyp präsensibilisiert worden waren, konnte direkter Gentransfer in etablierte Tumoren das Tumorwachstum verringern, und in manchen Fällen führte er sogar zu einer kompletten Tumorregression (G.E. Plautz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 4645 (1993)). Diese Studien zeigten, dass der direkte Gentransfer von fremden MHC-Genen in Tumoren möglicherweise therapeutische Wirkungen aufweist, die eventuell zur Behandlung von Malignität genutzt werden können.
  • Immuntherapie von Malignität
  • In manchen Fällen scheint das Immunsystem zur Überwachung und Zerstörung von neoplastischen Zellen beizutragen, und zwar durch die Mobilisierung von entweder zellulären oder humoralen Immuneffektoren. Zelluläre Mediatoren einer Antitumoraktivität umfassen MHC-restringierte zytotoxische T-Zellen, natürliche Killer- (NK-) Zellen (R.K. Oldham, Canc. Metast. Rev. 2, 323 (1983); R.B. Herberman, Concepts Immunopathol. 1, 96 (1985)) und lymphokinaktivierte Killer- (LAK-) Zellen (S.A. Rosenberg, Immunol. Today 9, 58 (1988)). Zytolytische T-Zellen, die Tumoren infiltrieren, wurden isoliert und charakterisiert (I. Yron et al., J. Immunol. 125, 238 (1980)).
  • Diese tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TIL) lysieren Zellen vom Tumor, von dem sie stammen, selektiv (P.J. Spiess et al., J. Natl. Canc. Inst. 79, 1067; S.A. Rosenberg, et al., Science 223, 1318 (1986)). Makrophagen können ebenfalls neoplastische Zellen durch antikörperabhängige Mechanismen (J. Marcelletti und P. Furmanski, J. Immunol. 120, 1 (1978); P. Ralph et al., J. Exp. Med. 167, 712 (1988)) oder durch eine durch Substanzen, wie z.B. BCG, ausgelöste Aktivierung töten (P. Alexander, Natl. Cancer Inst. Monogr. 39, 127 (1973)).
  • Cytokine können auch an der Antitumorreaktion teilnehmen, entweder durch direkte Wirkung auf das Zellwachstum oder durch die Aktivierung von zellulärer Immunität. Die zytostatischen Wirkungen des Tumor-Nekrose-Faktors-α (TNF-α) (L.J. Old, Science 230, 630 (1985)) und von Lymphotoxin (M.B. Powell et al., Lymphokin Res. 4, 13 (1985)) können zum Tod von neoplastischen Zellen führen. Interferon-γ (IFN-γ) erhöht die Klasse-I-MHC-Zelloberflächenexpression deutlich (P. Lindahl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70, 2785 (1973); P. Lindahl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 1284 (1976)) und wirkt mit TNF-α bei der Erzeugung dieses Effekts zusammen (L.J. Old, Nature 326, 330 (1987)). Koloniewachstum stimulierende Faktoren, wie z.B. G-CSF und GM-CSF, aktivieren Neutrophile und Makrophagen, sodass diese Tumorzellen direkt lysieren (S.C. Clark und R. Kamen, Science 236, 1229 (1987)), und Interleukin-2 (IL-2) aktiviert Leu-19+-NK-Zellen, sodass diese lymphokinaktivierte Killerzellen (LAK) erzeugen, die zur Lyse von autologen, syngenen oder allogenen Tumorzellen, nicht aber von normalen Zellen, fähig sind (S.A. Rosenberg, Immunol. Today 9, 58 (1988); M.T. Lotze et al., Cancer Res. 41, 4420 (1981); C.S. Johnson et al., Cancer Res. 50, 5682 (1990)). Die LAK-Zellen lysieren Tumorzellen ohne Präimmunisierung oder MHC-Restriktion (J.H. Phillips und L.L. Lanier, J. Exp. Med. 164, 814 (1986)). Interleukin-4 (IL-4) erzeugt ebenfalls LAK-Zellen und agiert synergistisch mit IL-2 bei der Erzeugung von tumorspezifischen Killerzellen (J.J. Mule et al., J. Immunol. 142, 726 (1989)).
  • Da die meisten Malignitäten in immunkompetenten Wirten auftreten, ist es wahrscheinlich, dass Tumorzellen Mechanismen entwickelt haben, um der Abwehr des Wirten zu entkommen, vielleicht durch die Entwicklung von sukzessive weniger immunogenen Klonen (G. Klein und E. Klein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 2121 (1977)). Verschiedene Studien lassen vermuten, dass eine verringerte Expression von MHC-Molekülen einen Mechanismus bereitstellen könnte, um der Detektion durch das Immunsystem zu entkommen. Normalerweise wird das Klasse-I-MHC-Glykoprotein auf unterschiedlichsten Geweben stark exprimiert, und in Zusammenhang mit β-2-Mikroglobulin präsentiert es CD8-positiven T-Zellen endogen synthetisierte Peptidfragmente durch spezifische Wechselwirkungen mit dem CD8/T-Zellrezeptorkomplex (P.J. Bjorkman und P. Parham, Ann. Rev. Biochem. 59, 253 (1990)). Eine defiziente Expression von Klasse-I-MHC-Molekülen könnte die Fähigkeit von Tumorzellen einschränken, zytotoxischen T-Zellen Antigene zu präsentieren. Frisch isolierten Zellen von natürlich vorkommenden Tumoren fehlen Klasse-I-MHC-Antigene oft vollständig oder sie weisen eine verringerte Expression auf (C.A. Holden et al., J. Am. Acad. Dermatol. 9, 867 (1983); N. Isakov et al., J. Natl. Canc. Inst. 71, 139 (1983); W. Schmidt et al., Immunogen. 14, 323 (1981); K. Funa et al., Lab Invest. 55, 185 (1986); L.A. Lampson et al., J. Immunol. 130, 2471 (1983)). Eine verringerte Klasse-I-MHC-Expression könnte auch das Wachstum dieser Tumoren erleichtern, wenn sie in syngene Rezipienten transplantiert werden. Verschiedene Tumorzelllinien, die geringe Werte an Klasse-I-MHC-Proteinen aufweisen, werden weniger onkogen, wenn Expressionsvektoren, die für das relevante Klasse-I-MHC-Antigen kodieren, eingeführt werden (K. Tanaka et al., Science 228, 26 (1985); K. Hui et al., Nature 311, 750 (1984); R. Wallich et al., Nature 315, 301 (1985); H-G. Ljunggren und K. Karre, J. Immunogenet. 13, 141 (1986); G.J. Hammerling et al., J. Immunogenet. 13, 153 (1986)). In einigen Versuchen verliehen Tumorzellen, die ein Klasse-I-MHC-Gen exprimieren, naiven Rezipienten Immunität gegen den parentalen Tumor (K. Hui und F. Grosveld, N. Festenstein, Nature 311, 750 (1984); R. Wallich et al., Nature 315, 301 (1985)). Der absolute Wert der Klasse-I-MHC-Expression stellt jedoch nicht den einzigen Faktor dar, der die Tumorigenität oder Immunogenität von Tumorzellen beeinflusst. In einer Studie wiesen Mäusemammaadenokarzinomzellen, die mit 5-Azacytidin behandelt und aufgrund erhöhter Werte der Klasse-I- MHC-Expression selektiert worden waren, im Vergleich zur Elternlinie keine veränderte Tumorigenität auf (D.A. Carlow et al., J. Natl. Canc. Inst. 81, 759 (1989)).
  • Die Immunantwort auf Tumorzellen kann durch systemische Verabreichung von IL-2 (M.T. Lotze et al., J. Immunol. 135, 2865 (1985)) oder IL-2 mit LAK-Zellen (S.A. Rosenberg et al., N. Eng. J. Med. 316, 889 (1987); C.S. Johnson et al., Leukemia 3, 91 (1989)) stimuliert werden. Klinische Studien unter Verwendung von tumorinfiltrierenden Lymphozyten sind ebenfalls im Laufen (S.A. Rosenberg et al., N. Eng. J. Md. 232, 570 (1990)). Vor kurzem untersuchten mehrere Studien die tumorsuppresive Wirkung der Lymphokinproduktion durch genetisch veränderte Tumorzellen. Die Einführung von Tumorzellen, die mit einem IL-2-Expressionsvektor transfiziert wurden, in syngene Mäuse stimulierte eine MHC-Klasse-I-restringierte zytolytische T-Lymphozytenreaktion, die gegen darauf folgende Provokation mit der parentalen Tumorzelllinie schützte (E.R. Fearon et al., Cell 60, 397 (1990)). Die Expression von IL-4 durch Plasmazytome oder Mammaadenokarzinomzellen führte zur einer starken Antitumorwirkung, die durch die Infiltration von Eosinophilen und Makrophagen vermittelt wurde (R.I. Tepper et al., Cell 57, 503 (1989)). Diese Studien zeigen, dass Cytokine, die in hohen lokalen Konzentrationen exprimiert werden, wirksame Antitumorwirkstoffe darstellen.
  • Ein alternativer Ansatz wurde kürzlich vorgeschlagen, bei dem eine Antitumorreaktion durch die Einführung eines allogenen Klasse-I-MHC-Gens in etablierte menschliche Tumoren (w.o.) stimuliert wird. Die Antigenität von Tumorzellen wurde vorher durch die Expression von viralen Antigenen durch Infektion von Tumorzellen (J. Lindenmann und P.A. Klein, J. Exp. Med. 126, 93 (1967); Y. Shimizu et al., Eur. J. Immunol. 14, 839 (1984); H. Yamaguchi et al., Cancer Immunol. Immunother. 12, 119 (1982); M. Hosokama, Cancer Res. 43, 2301 (1983); V. Shirrmacher und R. Heicappell, Clin. Exp. Metastasis 5, 147 (1987)) oder Expression von allogenen Antigenen, die durch die Hybridisierung von somatischen Zellen eingeführt wurden (J.F. Watkins und L. Chen, Nature 223, 1018 (1969); N. Kuzumaki et al., Eur. J. Cancer. 15, 1253 (1979)) verändert. Allogene Klasse-I-MHC-Gene wurden durch Transfektion und darauf folgende Selektion in vitro in Tumorzellen eingeführt. Diese Versuche erga ben einige widersprüchliche Ergebnisse. In einem Fall führte die Transfektion eines allogenen Klasse-I-MHC-Gens (H-2Ld) in einen H-2b-Tumor zu einer immunologischen Abstoßung der transduzierten Zellen und löste außerdem eine Transplantationsresistenz gegen die Elterntumorzellen aus (T. Itaya et al., Cancer Res. 47, 3136 (1987)). In einem anderen Fall führte die Transfektion von H-2b-Melanomzellen mit dem H-2Dd-Gen zu keiner Abstoßung (J.E. Talmadge et al., Proc. Amer. Assoc. for Cancer Res. 26, 59 (1985)), aber die erhöhte differenzielle Expression von H-2D-Produkten in Bezug auf H-2K könnte sich auf das metastatische Potenzial und die Immunogenität von Tumorzellen ausgewirkt haben (J. Gopas et al., Adv. Cancer Res. 53, 89 (1989)). Die Auswirkungen der Expression des allogenen H-2K-Gens in Tumorzellen wurde in einer weiteren Studie untersucht (G.A. Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8613 (1987)). Mehrere Subklone, die in vitro selektiert worden waren und ein allogenes Gen exprimierten, wurden in Mäusen abgestoßen, die für die Elterntumorlinie syngen waren, aber andere Subklone unterschieden sich bei der Bildung von Tumoren nicht von der parentalen, untransduzierten Linie. Diese Erkenntnisse lassen vermuten, dass Unterschiede von Klon zu Klon beim In-vivo-Wachstum und bei der tumorigenen Kapazität zu anderen Modifikationen von Zellen führen können, die durch die Transfektion oder das Subklonierungsverfahren ausgelöst werden, was sich auf ihre Tumorigenität auswirkt. Diese Klonunterschiede können minimiert werden, indem eine Population von Zellen direkt in vivo transduziert wird.
  • Gentherapeutische Ansätze
  • Das Immunsystem kann vor Krebs schützen und eine wichtige Rolle als Zusatzbehandlung von Malignität spielen. Lymphokinaktivierte Killerzellen (LAK) und tumorinfiltrierende Lymphozyten (TIL) können neoplastische Zellen lysieren und eine teilweise oder vollständige Tumorabstoßung auslösen. Die Expression von Cytokingenen in malignen Zellen hat ebenfalls die Tumorregression gefördert. Da derzeitige Strategien zur Stimulation einer Immunantwort gegen Tumorzellen Tumoren oft nicht auslöschen, besteht ein wichtiges Ziel der Immuntherapie in der Verbesserung derzeiti ger Verfahren und in einem besseren Verständnis der Mechanismen der Immunerkennung.
  • Ein Modell für die Immuntherapie von Malignität unter Verwendung eines Gens, das für ein Transplantationsantigen, ein allogenes Klasse-I-Haupthistokompatibilitätskomplex- (MHC-) Antigen, kodiert und in vivo durch DNA/Liposom-Transfektion in menschliche Tumoren eingeführt wird, wurde beschrieben (G.J. Nabel, Hum. Gene Ther. 3, 399 (1992); G.J. Nabel, Hum. Gene Ther. 3, 705 (1992)). Die Expression von allogenen MHC-Antigenen auf Tumorzellen stimuliert die Immunität gegen sowohl das allogene MHC-Gen auf transduzierten Zellen sowie gegen vorher unerkannte Antigene in unmodifizierten Tumorzellen (G.E. Plautz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 4645 (1993)). Die Einführung eines allogenen MHC-Gens in vivo direkt in Tumoren führte zu teilweisen Tumorregressionen sowie zu der spezifischen zytotoxischen T-Zellreaktion auf andere Antigene. In einer kürzlichen Studie an Menschen wurde bei solch einer Behandlungsform keine Toxizität nachgewiesen. Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Optimierung dieses gentherapeutischen Ansatzes.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung stellt einen polycistronischen Plasmidvektor bereit, worin der Vektor ein erstes Cistron, das für ein MHC-Klasse-I-Antigen kodiert, und ein zweites Cistron umfasst, das für ein β-2-Mikroglobulin kodiert.
  • Der Vektor kann außerdem eine Ribosomenbindungsstelle umfassen, z.B. eine Ribosomenbindungsstelle, die vom EMC-Virus stammt.
  • Der Vektor kann einen Promotor umfassen, der operabel mit einem der Cistrone verbunden ist, wobei der Promotor von einer RSV-LTR stammt. In einer Ausführungsform wurde das zu dem RSV native Polyadenylierungssignal mutiert. Solch ein Vektor kann ein Rinderwachstumshormongen-Polyadenylierungssignal umfassen.
  • Ein Vektor der Erfindung kann eine Kozak-Translationsinitiationssequenz CACCATGG umfassen, welche die Expression eines beliebigen der Cistrone erleichtert.
  • Ein Vektor der Erfindung kann außerdem einen selektierbaren Marker umfassen, der Resistenz gegen Kanamycin verleiht.
  • Ein Vektor der Erfindung kann außerdem einen Replikationsstartpunkt umfassen, der von pBR322 stammt.
  • In dem Vektor kann das MHC-Antigen HLA-B7 sein.
  • Der Vektor kann eine Transkriptionseinheit, worin die Cistrone in der Transkriptionseinheit unter der Kontrolle eines einzelnen RSV-LTR-Promotors organisiert sind, eine interne Eintrittsstelle für Ribosomen, die zwischen den Cistronen positioniert ist, eine Rinderwachstumshormongen-Polyadenylierungssignalsequenz, die operabel mit der Transkriptionseinheit verbunden ist, einen selektierbaren Marken, der operabel für Kanamycinresistenz kodiert, und eine pBR322-Sequenz, die einen prokaryotischen Replikationsstartpunkt enthält, umfassen.
  • Der Vektor kann die in Seq.-ID Nr. 1 angeführte DNA-Sequenz aufweisen.
  • Der Vektor kann ein Cytokingen umfassen.
  • Die Erfindung stellt ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die einen der oben angeführten Vektoren umfasst.
  • In der pharmazeutischen Zusammensetzung kann der Vektor zusammen mit einem transfervereinfachendes Vehikel vorliegen. Das Vehikel kann eine transfektionsvereinfachende kationische Lipidformulierung umfassen. Die kationische Lipidformulierung kann DMRIE-DOPE sein. Das DMRIE-DOPE kann ein Molverhältnis von 5:5 aufweisen. Das Vehikel kann einen infektionsvereinfachenden viralen Vektor umfassen.
  • Eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung kann in einem gentherapeutischen Verfahren verwendet werden, z.B. einer Gentherapie zur Behandlung von Melanomkrebs. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann zur Verabreichung mithilfe eines Katheters oder mittels intratumoraler Injektion bestimmt sein.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner die Verwendung eines Vektors gemäß der Erfindung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer neoplastischen Erkrankung, z.B. Melanomkrebs, bereit. Das Medikament umfasst vorzugsweise außerdem eine transfektionsvereinfachende kationische Lipidformulierung, z.B. DMRIE-DOPE. Das DMRIE-DOPE kann ein Molverhältnis von 5:5 aufweisen. Das Medikament kann zur Verabreichung mithilfe eines Katheters oder mittels intratumoraler Injektion bestimmt sein.
  • BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die vorliegende Erfindung betrifft den Transfer eines menschlichen Transplantationsantigens zur Behandlung von Malignität. Sie umfasst (1) Modifikationen des Vektoraufbaus, welche die Expression in vivo fördern; (2) die Entwicklung eines wirksameren kationischen Liposoms und anderer Vehikel zur Verbesserung der Effizienz der Genanlieferung; (3) die Optimierung der Genanlieferung; und (4) die Anwendung an unterschiedlichen Tumorzelltypen.
  • Die Antitumor-Immunantwort kann durch Präimmunisierung und Verabreichung von Cytokinen, einschließlich Nekrosefaktor-α, Interferon-γ und Interleukin-2, verstärkt werden oder in Kombination mit passiver Immunisierung oder TIL-Therapie verwendet werden. Die vorliegende Erfindung betrifft eine alternative Strategie für die Immuntherapie von Malignität und optimierte Vektoren zur Verwendung bei solch einer Behandlung. Anpassungen dieses Verfahrens können auch bei der Behandlung anderer menschlicher Erkrankungen eingesetzt werden.
  • Vektormodifikationen
  • Vektoren werden bereitgestellt, die einige oder alle der hierin beschriebenen Modifikationen enthalten, um ihre Wirksamkeit und Sicherheit zu erhöhen, z.B. ein Plasmid mit der in Seq.-ID Nr. 1 dargelegten Sequenz. Außerdem sind die Merkmale, die diesen Vektor und einen zweiten Vektor mit der Sequenz Seq.-ID Nr. 2 charakterisieren, in den nachstehenden Tabellen 1 und 2 zusammengefasst. Ferner sind in den Beispielen 1 und 2 Herstellungsmöglichkeiten für diese beiden Vektoren erläutert; andere Herstellungsverfahren sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
  • TABELLE 1
    Figure 00130001
  • TABELLE 2
    Figure 00140001
  • Die Optimierung der Vektoren umfasst die Inkorporation von Sequenzen, die für geeignete Peptide kodieren, und die Maßschneiderung von Stellen, um die Genexpression zu maximieren. Ein Peptid wird als Translationsprodukt gesehen, egal wie groß es ist und ob es nach der Translation modifiziert wurde oder nicht, wie das beispielsweise bei der Glykosylierung und Phosphorylierung der Fall ist.
  • In einem Versuch wurde beobachtet, dass die Expression von HLA-B7 durch die Entfernung eines nativen Introns und das Hinzufügen einer Consensus-Translationsinitiationssequenz verbessert wird. Siehe Beispiel 3.
  • In einem weiteren Versuch wurde der Einschluss des β-2-Mikroglobulingens auf dem gleichen Vektor, der für ein Klasse-I-MHC-Gen kodiert, in Bezug auf die Synthese des gesamten Histokompatiblitätsmoleküls untersucht, das aus diesen beiden Genprodukten besteht. Normalerweise werden diese beiden Ketten gemeinsam zur Zelloberfläche transportiert. Einige menschliche Krebszellen exprimieren jedoch kein endogenes β-2-Mikroglobulin, wodurch ihre Fähigkeit eingeschränkt wird, Klasse 1 stabil auf der Zelloberfläche zu exprimieren. Die Erfinder haben herausgefunden, dass der Einschluss des β-2-Mikroglobulingens auf dem gleichen Plasmid die Expression in diesen sonst resistenten Zellen erlaubt und die Expression in anderen Zellen verbessert, wodurch ein möglicher Resistenzmechanismus umgangen wird. Siehe Beispiel 4.
  • Eine weitere Modifikation der Vektoren umfasst die Expression eines Cytokingens zusätzlich zu Klasse-I-MHC und β-2-Mikroglobulin. Die Entwicklung von Cytokinen, wie z.B. IL-2 oder GM-CSF, könnte weitere lokale T-Zellimmunität gegen Tumoren stimulieren und die Erkennung von tumorassoziierten Antigenen verbessern. In Versuchen an Tiermodellen führte die Einführung von IL-2 zu verbesserter Antitumorwirksamkeit (E.R. Fearon et al., Cell 60, 397 (1990)). Siehe Beispiel 5.
  • Demgemäß werden Vektoren bereitgestellt, die von bakteriellen Plasmiden stammen. Plasmidvektoren sind wahrscheinlich zumindest genauso sicher wie herkömmliche virale Vektoren, da sie nicht in eine Verpackungszelllinie eingeführt werden, wodurch die Inkorporation von anderen rekombinanten Genprodukten in das Anlieferungsvehikel ausgeschlossen wird. Außerdem könnten Plasmidvektoren sogar sicherer sein, da das Anlieferungsvehikel wahrscheinlich nicht in das Wirtsgenom eingeführt wird, wodurch die Gefahr von Insertionsmutagenese verringert wird. Ferner müssen Zellen, die für fremde Histokompatibilitätsantigene kodierende Gene exprimieren, nach einigen Wochen durch das Immunsystem des Wirts in situ entfernt werden, wodurch Bedenken in Bezug auf eine andauernde Expression von implantierten Genen in vivo minimiert werden. Um die Sicherheit zu maximieren, werden vorzugsweise immunmodulierende Wirkstoffe, wie z.B. Cytokine, auf dem gleichen Transkript wie MHC-Antigene inkludiert, wodurch die Expression des Cytokingens mit der Expression des fremden Histokompatibilitätsantigens in Verbindung gesetzt wird, wodurch wiederum sichergestellt wird, dass andere exogene Sequenzen nur vorübergehend exprimiert werden.
  • Die Optimierung von Plasmidvektoren kann auf jede beliebige Stufe im Lebenszyklus des Plasmids ausgerichtet sein, sowohl in Kultur als auch im Tier, und sowohl während der Transkription von Genen als auch während der Translation in Peptide stattfinden. In einer Ausführungsform der Erfindung wird Plasmid-DNA bis zur endgültigen Herstellung zur Verwendung in beispielsweise Patienten in herkömmlichen E.-Coli-Wirtsstämmen, wie z.B. DH5α, DH10B, HB101, JM109 oder XL1-Blue, gezüchtet. Die Einführung der Plasmid-DNA in die E.-coli-Wirtszelle wird beispielsweise durch eine Calciumchloridtransfektion oder Elektroporation erreicht, wobei das Plasmid sich in extrachromosomaler Form repliziert. In dieser Ausführungsform enthält das Plasmid somit einen Replikationsstartpunkt, der eine DNA-Synthese in Prokaryoten erleichtert. (Andere Replikationsstartpunkte, die eine DNA-Synthese in Eukaryoten erleichtern, werden in anderen Ausführungsformen angesprochen, worin der Vektor beispielsweise in eukaryotischen Zellen vermehrt wird.) Solche Replikationsstartpunkte, die für das Wachstum in prokaryotischen Zellen geeignet sind, umfassen beispielsweise jene, die auf dem Plasmid pBR322, Plasmid ColE1 oder auf Plasmiden auf pUC-Basis vorhanden sind. Die Anmelder bevorzugen den von pBR322 abgeleiteten Replikationsstartpunkt.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Vektoren bereitgestellt, welche die Fähigkeit besitzen, Wirtszellen eine leicht selektierbare phänotypische Eigenschaft zu verleihen, die verwendet wird, um Transformanten zu selektieren. In einer bevorzugten Ausführungsform verleiht der selektierbare Marker Antibiotikaresistenz. Antibiotika können jedoch in beispielsweise Patienten, die während einer Gentherapie Restmengen ausgesetzt werden, Nebenwirkungen auslösen. Ein Antibiotikum, wie z.B. Ampicillin, kann z.B. einen anaphylaktischen Schock oder andere allergische Reaktionen auslösen, wenn es dafür anfälligen Personen verabreicht wird. Ampicillin neigt auch dazu, sich in Kultur zu zersetzen, wodurch es zur Selektion von Transformation ungeeignet ist. Um den Verlust von Plasmiden während einer In-vitro-Vermehrung auszuschließen, werden häufig verschwenderische Mengen von Ampicillin verwendet. Demgemäß verleiht in dieser bevorzugten Ausführungsform der selektierbare Marker insbesondere Resistenz gegen ein Antibiotikum, das sicher und billig ist. Solche Antibiotika umfassen Neomycin, Tetracyclin, Geneticin, Chloramphenicol, Spectinomycin, Streptomycin, Hygromycin und Kanamycin, das insbesondere bevorzugt ist.
  • Die Expression von rekombinanten Genen hängt von der Transkription des geeigneten Gens und der effizienten Translation der Nachricht ab. Wird einer dieser beiden Vorgänge nicht korrekt durchgeführt, kann das dazu führen, dass ein bestimmtes Gen nicht exprimiert wird. Die Transkription eines klonierten Inserts erfordert die Gegenwart eines Promotors, der von der Wirt-RNA-Polymerase erkannt wird. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden also Vektoren bereitgestellt, die Promotorsequenzen zur Wechselwirkung mit RNA-Polymerasen umfassen, um die Transkription von klonierten Genen zu initiieren. In einer bevorzugten Ausführungsform wechselwirken die Promotoren mit eukaryotischen RNA-Polymerasen. Solche Promotoren umfassen unmittelbare frühe CMV, HSV-Thymidinkinase, frühe und späte SV40, LTRs vom Retrovirus und Mäuse-Metallothionein-I. CMV und lange terminale Wiederholungen vom Rous-Sarkom-Virus (RSV-LTR) sind bevorzugt.
  • Eine effiziente Translation erfordert, dass die mRNA ein Ribosomenbindungsstelle trägt. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Ribosomenbindungsstellen in die Vektoren eingeführt, um eine effiziente Translation von exprimierten Transkripten zu erreichen. In Eukaryoten, die keine multiplen Cistrone unter Kotrolle eines einzelnen Promotors stellen und sie als einzelne Nachricht transkribieren, ist die Expression von Polycistronen ein Problem. Bei polycistronischen Plasmiden stammt die Ribosomenbindungsstellen deshalb vorzugsweise vom Enzephalomyokarditis- (EMC-) Virus. Diese Stelle wird dort in den Vektor inkorporiert, wo sie als interne Eintrittsstelle für die Initiation einer Translation durch eukaryotische Ribosomen fungieren kann.
  • Es hat sich herausgestellt, dass die Translationseffizienz durch spezifische Sequenzelemente in der 5'-nichtkodierenden oder -untranslatierten Region (5'UTR) der RNA reguliert werden kann. Positive Sequenzmotive umfassen die Translationsinitiationsconsensussequenz (GCC)ACCATGG (Kozak, Nucleic Acids Res. 15, 8125 (1987)) und die 5'-7-Methyl-GpppG-cap-Struktur (Drummond et al., Nucleic Acids Res. 13, 7375 (1985)). Negative Elemente umfassen stabile intramolekulare 5'-UTR-Bäumchenstrukturen (Muesing et al., Cell 48, 691 (1987)) und AUG-Sequenzen oder kurze offene Leseraster, denen eine geeignete AUG in der 5'-UTR vorangeht (Kozak, w.o.; Rao et al., Mol. and Cell. Biol. 8, 284 (1988)). Vektoren, die durch positive Sequenzmotive gekennzeichnet sind, welche die Translation erleichtern, und worin negative Elemente entfernt wurden, sind in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung bereitgestellt. In diesem Zusammenhang ist die Kozak-Consensus-Translationsinitiationssequenz, insbesondere die Sequenz "CACCATGG", bevorzugt. Außerdem ist die oben genannte RSV-LTR bevorzugt, worin eine ungeeignete Poly-A-Additionssequenz verändert wurde, um eine negative Auswirkung auf die Genexpression auszuschließen.
  • Neben der Transkription und Translation muss auch die mRNA-Stabilität bedacht werden. Allgemein kann festgehalten werden, dass Capping und 3'-Polyadenylierung die wichtigsten positiven Determinanten der mRNA-Stabilität sind (Drummond et al., Nucleic Acids Res. 13, 7375 (1985); Ross, Mol. Biol. Med. 5, 1 (1988)) und das 5'- bzw. 3'-Ende der mRNA vor Abbaus schützen. Andere regulatorische Elemente, welche die Stabilität von mRNAs beeinflussen, wurden ebenfalls definiert. Die wichtigsten und am klarsten definierten sind die destabilisierenden Sequenzen der uridinreichen 3'-untranslatierten Region (3' UTR), die in vielen mRNAs mit kurzer Halbwertszeit vorkommen (Shaw und Kamen, Cell 46, 659 (1986)), obwohl es Beweise dafür gibt, dass diese nicht die einzigen Sequenzmotive sind, die zu mRNA-Destabilisierung führen (Kabnick und Housman, Mol. und Cell. Biol. 8, 3244 (1988)). Vektoren, die darauf ausgerichtet sind, die Destabilisierung von mRNA zu umgehen, werden in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung bereitgestellt, worin sie beispielsweise 3'-untranslatierte Regionen umfassen, die klonierten Genen nativ sind. Vektoren, die positive Determinanten der mRNA-Stabilität inkorporieren, sind eben falls bereitgestellt, wobei die Determinanten vorzugsweise Poly-A-Additionssequenzen darstellen. Polyadenylierungsstellen, die von nichtviralen Quellen stammen, sind bevorzugt, um eine Kontamination mit viralen Genprodukten zu verhindern; eine Poly-A-Additionssequenz vom Rinderwachstumshormongen ist beispielsweise bevorzugt. Auch virale Quellen von Poly-A-Signalen, wie z.B. SV40, worin im Wesentlichen alle darin enthaltenen offenen Leseraster, die für virale Proteine kodieren, deletiert wurden, werden genau betrachtet und sind bevorzugt.
  • Die Genexpression kann auch durch Intronsequenzen vermittelt werden. Solche Stellen können einer RNA-Reifung im Kern und dem darauf folgenden Transport von mRNAs zum Zytoplasma zur Translation zugrunde liegen. Solche Introns scheinen zu funktionieren, indem das Spleißen von exprimierten Tranksripten vereinfacht wird. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Vektoren optimiert, indem Introns eingeführt werden, die das Spleißen vereinfachen. Ein bevorzugtes Intron stammt von SV40, worin im Wesentlichen alle offenen Leseraster deletiert wurden, um eine Kontamination mit viralen Genprodukten zu vermeiden. In diesem Zusammenhang können Vektoren auch durch die Deletion von Introns optimiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung fehlt der für HLA-B7 kodierenden cDNA ein natives Intron, was zu einer erhöhten Genexpression führt.
  • Die hierin bereitgestellten optimierten Vektoren können als Kassetten dienen, in denen Cistrone oder Polycistrone von Interesse Cistrone oder Polycistrone ersetzen, deren Expression nicht länger erwünscht ist.
  • pHLA-B7/β-2-Mikroglobulinplasmid
  • Der pHLA-B7/β-2-M.-Plasmidvektor ist ein kovalent geschlossenes ringförmiges DNA-Makromolekül, das in bakteriellen Zellen biosynthetisiert werden kann, die in einem Selektionsmedium gezüchtet werden, was die Expression des Kanamycinresistenzproteins erfordert.
  • Neben dem Kanamycinresistenzgen kodiert die Plasmid-DNA für die schweren (menschliches HLAB7) und leichten (β-2-Mikroglobulin) Proteine eines Klasse-I-Haupthistokompatibilitätskomplex- (MHC-) Antigens. Das Plasmid ist darauf ausgerichtet, diese beiden Proteine über eine bicistronische mRNA in eurkaryotischen Zellen zu exprimieren. Die Initiation der Transkription der mRNA hängt von einer Rous-Sarkom-Virus-Promotorsequenz ab, die von der langen 3'-terminalen Wiederholung (3'-LTR) stammt. Die Termination der Transkription hängt von der Polyadenylierungssignalsequenz ab, die vom Rinderwachstumshormongen stammt. Eukaryotische Zelltranslation der schweren Kette wird durch die 5'-Kappen-abhängige Proteinstartstelle reguliert. Die Translation der leichten Kette wird durch eine kappenunabhängige Translationsenhancer- (CITE-) Sequenz kontrolliert, die vom Encephalomyocarditis-Virus stammt. Die Replikation des Plasmids in bakteriellen Zellen, schließlich, wird durch die Gegenwart eines bakteriellen Replikationsstartpunkts geregelt. Es gibt keine anderen bedeutenden offenen Leseraster noch irgendwelche bekannte onkogene Sequenzen.
  • Das Plasmid wurde durch eine DNA-Sequenzanalyse charakterisiert (Seq.-ID Nr. 1). Es ist 4965 bp groß, mit einer Basenzusammensetzung aus 2335 Adeninen, 2630 Cytosinen, 2630 Guaninen und 2335 Thyminen. Das ergibt ein Molekulargewicht von 3,298437 × 106 g.m.u.
  • Das pHLA-B7/β-2-M.-Plasmid kann unter Verwendung von unabhängigen Segmenten von DNA hergestellt werden, die in eine bakterielle Plasmid-DNA mit hoher Kopienzahl kloniert wurde. Die Plasmidkomponenten dienen zur leichteren Erreichung hoher Replikationswerte in Bakterienzellen, zur Expression eines dominanten selektierbaren Resistenzproteins während der bakteriellen Zellkultivierung und, wenn sie in eukaryotische Zellen eingeführt werden, zur Erreichung eines hohen Expressionsgrades der beiden Klasse-I-MHC-Komponentenproteine HLA-B7 und β-2-Mikroglobulin.
  • Die Rückgrat-Plasmid-DNA stammt von pBR322, einem Vektor, der in molekularbiologischen Laboratorien gerne verwendet wird, und dessen Replikationsstartpunkt vom natürlich vorkommenden bakteriellen Plasmid ColE1 stammt (Bolivar, R., et al., Gene 2, 95 (1977)). Dieses 952 bp lange Fragment von pBR322, das im Plasmid verwendet wird, stellt die Region von pBR322 von der Basennummer 2244 (Acc-1-Restriktionsendonucleasenstelle; stumpfes Ende) bis zur Basennummer 3193 (Bsp-H1-Restriktionsendonucleasenstelle) dar, wobei die einzigartige Eco-R1-Restriktionsendonucleasenstelle als pBR322-Base 1 verwendet wird. Dieses Rückgratplasmidfragment befindet sich zwischen der Basennummer 4014 und 4965 des pNLA-B7/β-2-M.-Plasmids und umfasst einen bakteriellen Replikationsstartpunkt. Es enthält keine offenen Leseraster, von denen bekannt wäre, dass sie in Bakterien- oder Tierzellen exprimiert werden.
  • Eukaryotische Genexpression wird durch die Promotorsequenz der langen 3'-terminalen Wiederholung (3'-LTR) des Rous-Sarkom-Virus (RSV) geregelt. Diese Sequenz stammt vom Schmidt-Rupin-Stamm von RSV (Swanstrom, R., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 78, 124 (1981)) und wurde durch Isolation von DNA kloniert, die durch die Pvu-II-Stelle an der viralen Basenummer 8673 und der Bfa-I-Stelle an der Basennummer 9146 gebunden war. Die Verwendung dieser Promotorsequenz zur Regulierung der Expression von heterologen Genen in eukaryotischen Zellen wurde vor mehr als 10 Jahren von Gorman, C., et al. (Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 79, 5777 (1982)) beschrieben. Das RSV-DNA-Fragment, das beim Aufbau des pHLA-B7/β2-M.-Plasmids verwendet wurde, wurde vom pRSVβ-Globin genommen (Gorman, C., et al., Science 221, 551 (1983)). Obwohl diese Regulationssequenz in einem Vogelretrovirus gefunden wurde, zeigte ein Test mit dieser 3'-LTR, dass keine intrinsische onkogene Aktivität in Vogel- oder Säugetierzellen vorhanden war (Westphal, C., et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50, 411 (1985); Mahon, M., et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 85, 1165 (1988); Overbeek, U., et al., Science 231, 1574 (1986)). Die RSV-LTR-Promotordomäne in pHLA-B7/β-2-M.-Plasmid umfasst die Basenpaare 1 bis 529. Dies umfasst eine 56 Basenpaare lange Region mit einer chemisch synthetisierten Olignucleotid-DNA, die diese Regulationssequenz so modi fiziert, dass die stromab gelegenen kodierenden Sequenzen in einer eukaryotischen Zelle stärker exprimiert werden. Das Oligonucleotid entfernt eine Polyadenylierungssignalsequenz (d.h. AATAAA mit TCTAGA, eine Xba-I-Restriktionsendonucleasestelle), die ursprünglich in der RSV-DNA-Sequenz entdeckt wurde. Sie führt außerdem eine starke Translationssignalsequenz ein (Kozak, M., et al.), die proximal zum Translationsinitiationscodon A535TG liegt. Außerdem wurde dieses synthetische Oligonucleotid verwendet, um eine Reihe von Restriktionsendonculeasestellen zu inkorporieren (d.h. Sal I, Hind III und Nco I), um so die Subklonierung von sowohl 5'- als auch 3'-DNA-Elementen zu vereinfachen.
  • Die für menschliche HLA-B7- und β-2-Mikroglobulinproteine kodierenden Sequenzen befinden sich 3' zur oben beschriebenen RSV-LTR. Während die beiden Gene für diese Proteine an unterschiedlichen Stellen im menschlichen Genom zu finden sind, scheint die Expression der Gene und die Anordnung der beiden Proteine zusammenzuhängen. Deshalb wurden, um eine höhere Expressionsstärke und eine Anordnung des korrekten Oberflächen-HLA-Antigens in einem heterologen Expressionssystem zu fördern, die beiden cDNA-Sequenzen proximal zueinander und 3' zum RSV-Promotor kloniert. Die Transkription beider Sequenzen findet mittels eines einzelnen, bicistronischen mRNA-Moleküls statt und wird durch die RSV-Promotordomäne initiiert und durch die distale Rinderwachstumshormon-Transkriptionsterminator-/Polyadenylierungssignalsequenz terminiert. Die Translation dieser bicistronischen mRNA wird sowohl durch CAP-abhängige (für HLA-B7) als auch CAP-unabhängige (β-2-Mikroglobulin) Ribosomenerkennungssequenzen erreicht. Das CAP-unabhängige Signal wird vom Mäuseenzephalomyokarditis- (EMC-) Virusgenom genommen und zwischen den für HLA-B7-Schwer- und -Leichtketten kodierenden Sequenzen und als Teil der bicistronischen mRNA kloniert.
  • Die HLA-B7-cDNA-Sequenz wurde aus einer menschlichen B-Lymphozyten-cDNA-Bibliothek isoliert und ähnelt der in der GENBANK gefundenen Sequenz (HUMMHB7A). Außerdem wurde gezeigt, dass sie eine Immunantwort induziert, die charakteristisch für ein fremdes Klasse-I-Haupthistokompatibilitätskomplexantigen ist (Nabel, E., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci U.S.A. 89, 5157 (1992)). Die cDNA-Sequenz beginnt mit A535TG (innerhalb einer Nco-I-Restriktionsendonucleasestelle) und endet an der Basennummer 1853. Das offene Leseraster (d.h. A535TG bis T1621GA) innerhalb dieser Sequenz kodiert für ein Protein mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 44.200. Die restlichen 230 Basenpaare stellen einen Abschnitt der 3'-untranslatierten mRNA-Sequenz dar.
  • Die Sequenz vom Basenpaar 1854 bis 1888 ist ein Abschnitt einer multiplen Klonierungsstelle, die ursprünglich von einem synthetischen Oligonucleotid stammt. Sie bildet eine Verbindung zwischen der HLA-B7-Sequenz und der CAP-unabhängigen Mäuseenzephalomyokarditis-Translationsenhancersequenz (EMCV-CITE) und wurde verwendet, um die Subklonierung von sowohl stromauf als auch stromab gelegenen Sequenzen zu vereinfachen.
  • Die 588 bp umfassende EMCV-CITE-Sequenz wird von einem Abschnitt der 5'-Region (255 bis 843) von klonierter genomischer EMCV-DNA entnommen (Duke, G., et al., J. Virology 66, 1602 (1992)). Es handelt sich um eine nichtkodierende Regulationssequenz, die als interne Eintrittsstelle für die eukaryotischen Ribosomenuntereinheiten dient, wenn sie sich innerhalb eines mRNA-Moleküls befindet. Deshalb ermöglicht es, dass das Translationsstartcodon (A2480TG) von β-2-Mikroglobulin, das sich stromab vom HLA-B7-Stoppcodon auf dieser bicistronischen mRNA befindet, vom Ribosom erkannt wird (Parks, G., et al., J. Virology 60, 376 (1986)).
  • Die partielle cDNA-Sequenz für das menschliche β-2-Mikroglobulin (die leichte Kette des Klasse-I-MHC-Heteroduplexoberflächenantigens) wurde ursprünglich von Suggs, S., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 78, 6613 (1991), veröffentlicht. Nachfolgende Arbeiten von Alejandro Madrigal (Standford University Medical School, Palo Alto, USA) haben gezeigt, dass sich β-2-Mikroglobulin-cDNA von Schimpansen nur in 4 Basen von der menschlichen Sequenz unterscheidet und für ein homologes β-2-Mikroglobulinprotein kodiert. Folglich wurde die Schimpansen-cDNA im DNA-Konstrukt verwendet. Das offene Leseraster des β-2-Mikroglobulins beginnt, wie o ben erwähnt, bei A2480TG und endet bei T2837AA. 10 Basen der 3'-untranslatierten Schimpansendomäne bleiben vor dem Spleißen der Sequenz zu einer heterologen 3'-untranslatierten Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungssignalsequenz vom Rinderwachstumshormongen stromab von diesem offenen Leseraster. Das Spleißen an dieser Verbindung wird unter Verwendung eines synthetischen Oligonucleotids (pHLA-B7/β2-M.-Plasmid-Basenpaare 2847 bis 2870) durchgeführt, das von sowohl Hind-III- als auch Bam-HI-Restriktionsendonucleasen erkannt wird.
  • Die Basenpaare 2871 bis 3111 stammen vom Rinderwachstumshormon- (bgh-) Gen (Gordon et al., Mol. Cell. Endocrinology 33, 81 (1983)). Es beginnt an einer Bgl-II-Stelle mit stumpfem Ende innerhalb der 3'-untranslatierten Region der mRNA-Kodiersequenz und erstreckt sich bis zu einem Punkt, der etwa 110–115 Basenpaare hinter dem Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungspunkt liegt. Dort befindet sich eine Polyadenylierungssignalsequenz (A2979ATAAA) innerhalb dieser Domäne. Die 39 Basenpaare von 3112 bis 3151 stellen ein synthetisches Oligonucleotidfragment zur Vereinfachung des Klonierens dar.
  • Die Enddomäne des pHLA-B7/β-2-M.-Plasmids umfasst die bakteriell exprimierte Kanamycinresistenz- (Kanamycinr-) Gensequenz. Das Gen wird vom transponiblen Element Tn903 genommen, das vollständig charakterisiert wurde (Oka, A., et al., J. Mol. Biol. 147, 217 (1981)) und nachgewiesenerweise durch die Expression eines Aminoglykosid-3'-phosphotransferaseproteins mit einem Molekulargewicht von 30.7000 Arzneimittelresistenz verleiht (Berg, D., et al., Microbiology, S. 13–15, Schlessinger, D., Hrsg., American Society for Microbiology, Washington D.C., USA (1978)). Die für Kanamycinr kodierende Sequenz befindet sich auf dem Strang gegenüber dem, der für die eukaryotische HLA-B7- und die β-2-Mikroglobulinsequenzen kodiert, und wird deshalb in die andere Richtung von den eurkaryotischen Genen gelesen. Das offene Leseraster für Kanamycinr beginnt bei A3967TG und endet bei T3154AA. Diese Sequenz wurde von einem Plasmid-PET9a, einem im Handel erhältlichen Plasmid von Novagen, Inc. (Madison, Wisconsin, USA), kloniert.
  • Kationische Liposomen und Vehikel zur Genanlieferung
  • Der Transfer der hierin bereitgestellten optimierten Vektoren in Zellen oder Gewebe von Organismen kann durch die Injektion von nackter DNA erreicht oder durch die Verwendung von Vehikeln, wie beispielsweise viralen Vektoren, Ligand-DNA-Konjugaten, Adenovirus-Ligand-DNA-Konjugaten, Calciumphosphat und Liposomen, erleichtert werden. Transferverfahren, wie beispielsweise Transfektionsverfahren unter Verwendung von Liposomen und Infektionsarbeitsvorschriften unter Verwendung von viralen Vektoren, einschließlich Retrovirusvektoren, Adenovirusvektoren, adenoassoziierten Virusvektoren, Herpes-Virus-Vektoren, Vaccinia-Virus-Vektoren, Polio-Virus-Vektoren und Sindbis- und andere RNA-Virus-Vektoren, sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
  • Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung werden die hierin bereitgestellten Vektoren mit kationischen Liposomen oder Lipidvesikeln komplexiert. Kationische oder positiv geladene Liposomen sind Formulierungen von kationischen Lipiden (CLs) in Kombination mit anderen Lipiden. Die Formulierungen können aus einem Gemisch aus positiv geladenen Lipiden, negativ geladenen Lipiden, neutralen Lipiden und Cholesterin oder einem ähnlichen Sterin hergestellt werden. Das positiv geladene Lipid kann eines der Kationischen Lipide, wie z.B. DMRIE, das in der US-Anmeldung mit der Seriennummer 07/686.746 beschrieben ist, die durch Verweis hierin aufgenommen ist, oder eines der kationischen Lipide DOTMA, DOTAP oder ein Analogon davon oder eine Kombination daraus sein. DMRIE ist 1,2-Dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethylammoniumbromid (siehe z.B. J. Felgner et al., J. Biol. Chem. 269, 1 (1994)) und ist bevorzugt.
  • Neutrale und negativ geladene Lipide können natürliche oder synthetische Phospholipide oder Mono-, Di- oder Triacylglycerine sein. Die natürlichen Phospholipide können aus tierischen oder pflanzlichen Quellen stammen, wie z.B. Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Sphingomyelin, Phosphatidylserin oder Phosphatidylinosit. Synthetische Phospholipide können jene mit identischen Fettsäuregruppen sein, ein schließlich, nicht jedoch eingeschränkt auf, Dimyristoylphosphatidylcholin, Dioleoylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin, Distearoylphosphatidylcholin und die entsprechenden synthetischen Phosphatidylethanolamine und Phosphatidylglycerine. Das neutrale Lipid kann Phosphatidylcholin, Kardiolipin, Phosphatidylethanolamin, Mono-, Di- oder Triacylglycerine oder ein Analogon davon sein, wie z.B. Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), das bevorzugt ist. Das negativ geladene Lipid kann Phosphatidylglycerin, Phosphatidsäure oder ein ähnliches Phospholipidanalogon sein. Andere Additive, wie z.B. Cholesterin, Glykolipide, Fettsäuren, Sphingolipide, Prostaglandine, Ganglioside, Neobee, Niosome oder ein beliebiges natürliches oder synthetisches Amphophil, können ebenfalls in Lipidformulierungen verwendet werden, wie auf dem Gebiet der Herstellung von Liposomen allgemein bekannt ist.
  • Eine Substitution der kationischen Lipidkomponenten von Liposomen kann die Transfektionseffizienz verändern. Vor allem die Modifikation der kationischen Spezies scheint ein wichtiger Faktor in diesem Vorgang zu sein. Eine neue Formulierung aus kationischen Lipiden ist bevorzugt, in der ein anderes kationisches Lipid, 1,2-Dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyetheylammoniumbromid (DMRIE), mit Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) verwendet wird. Diese Formulierung weist zwei Eigenschaften auf, die es für Transfektionen geeigneter machen. Erstens weist sie in vitro eine bis zu 7-mal verbesserte Transfektionseffizienz auf als die Formulierung DC-Cholesterin/DOPE. Siehe Beispiel 6.
  • Wichtig ist, dass diese DMRIE/DOPE-Formulierung in hohen Konzentrationen zu keiner Aggregation führt, im Gegensatz zu dem DC-Chol-Liposom. Dieses Merkmal ermöglicht also die Einführung von höheren absoluten Konzentrationen von DNA und Liposomen in Versuchstiere, ohne dass es zu Toxizität kommt. Siehe Beispiel 7. Aufgrund dieser Eigenschaften ist es nun möglich, 100- bis 1000-mal mehr DNA einzuführen, was die Genexpression in vivo deutlich verbessern könnte. Siehe Beispiel 8.
  • Ein bevorzugtes Molverhältnis zwischen DMRIE und DOPE beträgt etwa 9:1 bis 1:9; ein Molverhältnis von etwa 5:5 ist insbesondere bevorzugt.
  • Unter Verwendung von herkömmlichen kationischen Lipidtechniken und -verfahren können die Lipidzusammensetzungen verwendet werden, um die intrazelluläre Anlieferung von genetischen Material zu vereinfachen, das für therapeutisch oder immunogen aktive Peptide kodiert. Kurz gesagt umfassen solche Verfahren die Schritte der Herstellung von Lipidvesikeln, die aus kationischen Lipiden bestehen, und die Verwendung dieser Lipidvesikel zur Vermittlung der Transfektion oder des Transports von therapeutisch oder immunogen aktiven Wirkstoffen in die Zellen. Der intrazelluläre Transport kann erreicht werden, indem der Wirkstoff in das Lipidvesikel inkorporiert oder darin eingekapselt wird und die Zelle mit den Lipidvesikeln kontaktiert wird, wie dies auch bei herkömmlichen Liposomverfahren gemacht wird; alternativ dazu können die Zellen gleichzeitig mit leeren Lipidvesikeln kontaktiert werden, welche die kationischen Lipidformulierungen zusammen mit dem Wirkstoff enthalten, wie es bei herkömmlichen Transfektionsverfahren durchgeführt wird. Bei beiden Verfahren wird der Wirkstoff von der Zelle aufgenommen. Der Kontaktierschritt kann in vitro oder in vivo erfolgen.
  • Solche Verfahren können bei der Behandlung eines Leidens eines Organismus eingesetzt werden, welche den Schritt der Verabreichung eines Präparats, das eine kationische Lipidformulierung zusammen mit einer pharmazeutisch effektiven Menge eines therapeutisch aktiven Wirkstoffs umfasst, der spezifisch für die Behandlung des Leidens des Organismus ist, und das Ermöglichen des Wirkstoffs umfasst, in eine Zelle inkorporiert zu werden, wodurch das Leiden effektiv behandelt wird. Der Wirkstoff kann den Zellen des Organismus in vitro oder in vivo verabreicht werden. Die In-vitro-Anlieferung eines Wirkstoffs wird an Zellen durchgeführt, die aus einem Organismus entfernt wurden. Die Zellen werden wieder in den Körper des Organismus zurückgeführt, wodurch der Organismus behandelt wird. Im Gegensatz dazu umfasst die In-vivo-Anlieferung eine direkte Transduktion von Zellen im Körper des Organismus, um eine Behandlung durchzuführen. Eine durch kationische Lipide vermittelte Anlieferung von Vektoren, die für therapeutische Wirkstoffe kodieren, kann so eine Therapie für genetische Krankheiten darstellen, indem defiziente oder nicht vorhandene Genprodukte bereitgestellt werden, um eine Krankheit zu behandeln, bei der das defektive Gen oder sein Produkt identifiziert wurde, wie z.B. bei Duchenne-Dystrophie (Kunkel, L., und Hoffman, E., Brit. Med. Bull. 45(3), 630–643 (1989)) und zystischer Fibrose (Goodfellow, P., Nature, 341(6238), 102–3 (14. Sept. 1989)).
  • Die beschriebene, durch kationische Lipide vermittelte intrazelluläre Anlieferung kann auch eine Immunisierung von Peptiden bereitstellen. Die oben genannten Transfektionsverfahren können durch direkte Injektion von kationischen Lipidformulierungen zusammen mit einem Vektor, der für ein Immunogen kodiert, in die Zellen eines Tiers in vivo oder durch Transfektion von Zellen eines Tiers in vitro, gefolgt von einer darauf folgenden Wiedereinführung der transduzierten Zellen in das Tier, durchgeführt werden. Die Fähigkeit, Zellen mit kationischen Lipiden zu transfizieren, stellt somit ein alternatives Immunisierungsverfahren dar. Das Gen für ein Antigen wird mittels durch kationische Lipide vermittelter Anlieferung in die Zellen eines Tiers eingeführt. Die transfizierten Zellen, die das Antigen exprimieren, werden wieder in das Tier injiziert oder befinden sich schon im Tier, wodurch das Immunsystem auf das Antigen reagieren kann. Das Verfahren kann verstärkt werden, indem gleichzeitig ein Adjuvans oder Cytokine, wie z.B. Lymphokine, oder ein Gen, das für ein solches Adjuvans oder für solche Cytokine oder Lymphokine kodiert, verabreicht werden, um die Lymphzellen und andere Zellen zu stimulieren, welche die Immunantwort vermitteln.
  • Die Verabreichung von DNA-Liposom-Komplexen an Patienten, bei denen eine neoplastische Erkrankung diagnostiziert wurde, um Neoplasie zu behandeln, umfassen vorzugsweise die intratumorale Injektion der Komplexe mithilfe einer Nadel und einer Spritze oder einem Katheter (siehe unten). Plasmid-DNA in einer Menge von etwa 0,1 μg bis etwa 5 mg wird in etwa 0,15 nM bis etwa 1,5 mM Liposomlösung verabreicht. Bei einer bevorzugten Arbeitsvorschrift werden 0,1 ml Plasmid-DNA (0,05–50 mg/ml) in einer laktierten Ringer-Lösung zu 0,1 ml DMRIE/DOPE-Liposomlösung (0,15–15 μM) zugesetzt, und 0,8 ml laktierte Ringer-Lösung werden zur Liposom- DNA-Lösung zugesetzt. In dieser bevorzugten Arbeitsvorschrift werden drei Aliquoten von jeweils 0,2 ml in einen Knoten injiziert, oder eine Aliquote von 0,6 ml wird mithilfe eines Katheters verabreicht. Dem Patienten wird in dieser bevorzugten Arbeitsvorschrift somit eine Dosis im Bereich von etwa 3 μg bis etwa 3 mg DNA und etwa 4,5 nM bis etwa 4,5 μM DMRIE/DOPE verabreicht. Die Dosierungen werden in zweiwöchigen Intervallen wiederholt.
  • Optimale Transfektionsparameter in Bezug auf Aspekte wie Toxizität und Zusammensetzung können bestimmt werden, indem die Wirksamkeit von Formulierungen aus DNA und kationischen Lipiden bei der Transfektion von Zellen unter Verwendung des 96-Well-Mikrotiterplattentests verglichen wird, der in Beispiel 12 dargelegt ist und in einschlägiger Literatur detailliert beschrieben ist (z.B. Felgner, J.H., und Felgner, P.L., Lipofection, Protocols in Cell & Tissue Culture, John Wiley & Sons (1993)), wonach sie vor der Verabreichung an Patienten in Versuchstieren bestätigt werden können. Siehe unter anderem Beispiel 14.
  • Gentherapie auf Katheterbasis
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung dient ein Pharmazeutikum oder Medikament, das den Vektor umfasst, zum direkten Gentransfer in Zielzellen, wie z.B. Tumorzellen, in situ, um die Anlieferung von Genen in vivo zu optimieren. Traditionellerweise konzentrierten sich Gentransferverfahren auf die Modifikation von Zielzellen in vitro, gefolgt vom Transfer der modifizierten Zellen. Bei solchen Ansätzen werden diese Zellen anderen Selektions- und Wachstumsbedingungen ausgesetzt als in vivo. Da die Zelllinien außerdem für jede Anwendung neu etabliert werden müssen, ist eine Anpassung an menschliche Krankheiten schwieriger und erfordert mehr Zeit.
  • Vorzugsweise werden rekombinante Gene durch direkte intrazelluläre Injektion angeliefert, und insbesondere bevorzugt ist die Verwendung eines Katheters. Katheter werden schon länger zur Einführung von rekombinanten Genen in vivo verwendet (siehe z.B. E.G. Nabel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5157 (1992); E.G. Nabel et al., Science 249, 1285 (1990); E.G. Nabel et al., Science 244, 1342 (1989); E.G. Nabel et al., J. Clin. Invest. 91, 1822 (1993); G. Plautz et al., Circ. 83, 578 (1991); E. Nabel et al., Nature 362, 844 (1993)). In einem klinischen Versuch an einem Menschen wurde ein Katheter an einem Patienten mit Lungenmetastasen verwendet, wobei die Melanomerkrankung durch Gentherapie behandelt werden sollte. Die Behandlung mithilfe eines Katheters wurde vom Patienten gut vertragen. Es traten keine Komplikationen oder Toxizitäten auf (siehe Beispiel 13). Im Vergleich zu einer intratumoralen Injektion stellt diese Erfindung die Möglichkeit bereit, einen größeren Prozentsatz an Zellen innerhalb der Tumormikrozirkulation zu transduzieren, um eine größere Wirksamkeit der Genexpression zu erreichen, wobei gleichzeitig die Möglichkeit einer unabsichtlichen mikroskopischen Aussaat von Tumorzellen an entfernten Stellen minimiert wurde.
  • Beim oben genannten Patienten wurde das Gen durch die Lungenarterie verabreicht, die den Tumor nicht direkt mit sauerstoffbeladenem Blut versorgt. Alternativ dazu kann das Gen auch durch Versorgungsarterien eingeführt werden. Beispielsweise kann die Leberarterie genutzt werden, um DNA-Liposom-Komplexe zu primären oder sekundären Tumoren an der Leber zu führen.
  • Da bei diesem Ansatz direkter Gentransfer in vivo verwendet wird, kann er leicht in klinischer Umgebung eingesetzt werden, um spontan auftretende Tumoren alleine oder in Kombination mit einer Cytokin- oder Adjuvansbehandlung, einschließlich passiver Lymphozytenimmunisierung, zu behandeln und die Tumorimmunität zu erhöhen.
  • Expression in unterschiedlichen Tumorzelltypen in vivo
  • Es ist bekannt, dass das HLA-B7-Gen in einigen wenigen Tumorzellen in vivo exprimiert werden kann (G.E. Plautz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 4645 (1993)). Die Daten der Erfinder lassen vermuten, dass eine erfolgreiche Expression eines HLA-B7- und β-2-Mikroglobulingens in menschlichen Melanomen erreicht werden kann (siehe Beispiel 4). Somit wird gemäß einer Ausführungsform der Erfindung die Behandlung von menschlichen Melanomen bereitgestellt. Außerdem werden Behandlungen anderer menschlicher Krebsarten, wie z.B. Dickdarmkarzinome, Nierenzellkarzinome, Brustadenokarzinome, Hepatome, Lungenkarzinome und Pankreaskarzinome, bereitgestellt.
  • Spezielle Aspekte der Erfindung werden anhand der folgenden Beispiele genauer erläutert, die jedoch lediglich zur Veranschaulichung der Erfindung dienen und diese in keinster Weise in ihrem Schutzumfang auf die in den Beispielen angeführten Ausführungsformen einschränken.
  • BEISPIEL 1
  • Herstellung eines HLA-B7- und β-2-Mikroglobulin-hältigen Plasmids
  • Ein Vektor zur Expression von HLA-B7 und β-2-Mikroglobulin wurde in mehreren Schritten konstruiert. Das Ausgangskonstrukt war das Plasmid RSV-β-Globin (C. Gorman et al., Science 221, 551 (1983), und C. Gorman et al., Mol. Cell. Biol. 2, 1044 (1982)), in das die HLA-B7-Gen-cDNA insertiert werden sollte. Das RSV-β-Globin-Plasmid bestand aus dem Ampicillinresistenzcistron und dem Replikationsstartpunkt vom Plasmid pBR322, der an eine eukaryotische Hybridtranskriptionseinheit gebunden war. Die Transkriptionseinheit in diesem Plasmid bestand aus dem RSV-LTR-Promotor, einer Hasen-β-Globin-Kodiersequenz und SV40-mRNA-Processing-Signalen, einschließlich dem kleinen t-Intron und einer Polyadenylierungsstelle der frühen Region. Das β-Globingen wurde durch Verdau mit Hind III und Bgl II aus dem Plasmid entfernt. Nach einer Behandlung mit Kälberdarmphosphatase (CIP) und einem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase wurde das Rückgrat verwendet, um ein Bam-HI → Sal-I-Fragment von HLA-B7, das mit einem Klenow-Enzym behandelt worden war, einzuführen. Das Fragment wurde vom pLJ-HLA-B7-Vektor erhalten (E.G. Nabel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5157 (1992)).
  • Das resultierende RSV-HLA-B7-Plasmid wurde durch die Entfernung eines Introns in der HLA-B7-Kodiersequenz verbessert. Die Entfernung des Introns führte zu höheren Expressionswerten in vorübergehenden Transfektionstests an kultivierten Zellen. Ortsgerichtete Mutagenese wurde durch das auf das Oligonucleotid gerichtete Gap-Heteroduplexverfahren erzielt (G. Nabel, D. Baltimore, Nature 326, 711 (1987)). Oligonucleotide mit der Sequenz 5'-CCG AGA CCT GGG CCG GCT CCC (Basen 593-613 von Seq.-ID Nr. 1) und ACT CCA TGA G-3' wurden verwendet. Das Plasmid RSV-HLA-B7 (ohne Intron) wurde wie folgt weiter modifiziert.
  • Eine "Kozak"-Consensus-Translationsinitiationssequenz (Kozak, Nucleic Acids Res. 15, 8125 (1987)) wurde hinzugefügt, um die Translationseffizienz der HLA-B7-Nachricht zu erhöhen. Wieder wurde das auf das Oligonucleotid gerichtete Gap-Heteroduplexverfahren verwendet. Die Kozak-Sequenz "CACC" wurde 5' zum Initiationscodon insertiert, und zwar unter Verwendung von Oligonucleotiden mit der Sequenz 5'-CAC CTC CAA GCT TCA CCA TGG (Basen 518–538 von Seq.-ID Nr. 1) und TGG TCA TGG CGC 3' (Basen 539–550 von Seq.-ID Nr. 1). Das Produkt wurde RSV HLA-B7(K) genannt.
  • Um den Vektor bicistronisch zu machen, sodass das β-2-Mikroglobulinpeptid neben dem HLA-B7-Antigen exprimiert würde, war es notwendig, eine interne Ribosomeninitiationsstelle zu inkludieren, um die Translation der zweiten Nachricht zu erlauben. Zu diesem Zweck wurde ein Fragment, das solch eine Stelle vom Encephalomyocarditis- (EMC-) Virus enthielt, durch Verdau mit Eco RI und Xba I aus pCITE-1 entfernt, das von Novagen (Madison, Wi., USA) bezogen wurde. Das Fragment wurde in pBluescript SK, einen Klonierungsvektor von Stratagene (La Jolla, Ca., USA), ligiert, der mit Eco RI und Xba I verdaut worden war. Das die interne Ribosomeninitiationsstelle enthaltende Plasmid, das durch die Gegenwart von mehreren Klonierungsstellen Vorteile aufwies, wurde pBS CITE I genannt.
  • Ein Plasmid, das durch ein β-2-Mikroglobulingen charakterisiert war, wurde wie folgt hergestellt. Das β-2-Mikroglobulingen wurde als Sal-I/Bam-HI-Fragment erhalten, das mit Klenow von pHβ Apr-1-Neo von Dr. Madrigal von der Stanford University behandelt worden war. Das Fragment wurde stromauf eines Polyadenylierungssignals, das vom Rinderwachstumshormongen erhalten wurde, angebunden, und zwar durch Ligation in ein Plasmid, das solch ein Signal enthielt. Das Plasmid, pRSV ADH, von Dr. Culp von der Case Western Reserve University, wurde mit Hind III und Xba I verdaut, um das darin enthaltene, für ADH kodierende Gen zu entfernen, und mit CIP und Klenow behandelt, bevor das β-2-Mikroglobulingen enthaltende Fragment insertiert wurde. Mithilfe von ortsgerichteter Mutagenese wurde das resultierende Plasmid durch das Hinzufügen einer Kozak-Sequenz (CACC) verbessert, um die Translationseffizienz des β-2-Mikroglobulintranskripts zu fördern. Die Oligonucleotide, die verwendet wurden, um den Gapped-Heteroduplex zu steuern, bestanden aus den Sequenzen 5'-CAC CTC CAA GCT TCA CCA TGG CTC und GCT CCG TGG-3' (A CCA TGG CTC GCT CCG TGG entspricht den Basen 2477-2495 von Seq.-ID Nr. 1). So wurde ein Plasmid erhalten, das pRSVβ2(K) bezeichnet wurde, welches das β-2-Mikroglobulingen zwischen einer Kozak-Sequenz und dem vom Rinderwachstumshormongen stammenden Polyadenylierungssignal umfasste.
  • Folglich wurden die multiplen Klonierungsstellen in pBS CITE I genutzt, um das β-2-Mikroglobulingen stromab von der internen Ribosomeninitiationsstelle zu platzieren. Dies wurde erreicht, indem pBS CITE I als Rückgrat eingesetzt wurde, in dem ein Nco-I/Xba-I-Fragment entfernt wurde, zuerst durch Verdau mit Xba I und Behandlung mit Klenow, und zweitens durch Verdau mit Nco I. Das β-2-Mikroglobulingen, versehen mit einer Kozak-Sequenz und einem Poly-A-Signal, wurde durch Verdau von pRSVβ2(K) mit Dra III und Auffüllung mit Klenow sowie darauf folgendem Verdau mit Nco I als Fragment erhalten. Eine Ligation ergab ein Plasmid, das eine Einheit aus einer internen Ribosomeninitiationsstelle, gefolgt vom β-2-Mikroglobulingen und einem Polyadenylierungssignal, ergab.
  • Diese Einheit wurde wie folgt in das oben genannte RSV HLA-B7(K) insertiert. Das HLA-B7 enthaltende Plasmid wurde teilweise durch Bgl II verdaut, und zwar ausreichend, um eher an der Bgl-II-Stelle 3' von der für HLA-B7 kodierenden Sequenz als an der Bgl-II-Stelle innerhalb des HLA-B7-Gens zu schneiden. RSV HLA-B7(K) wurde somit linearisiert, mit CIP behandelt und mit Klenow aufgefüllt. Die β-2-Mikroglobulin umfassende Einheit wurde als Sal-I/Not-I-Fragment entfernt, das danach mit Klenow behandelt wurde. Das Ligationsprodukt enthielt eine bicistronische Transkriptionseinheit, das den RSV-Promotor inkorporiert hatte, gefolgt von (in Transkriptionsrichtung): dem HLA-B7-Gen (an eine Kozak-Sequenz gebunden), einer internen Ribosomeninitiationsstelle, dem β-2-Mikroglobulingen (ebenfalls an eine Kozak-Sequenz gebunden), der von einem Rinderwachstumshormongen stammenden Poly-A-Stelle und einer SV-40-Processing-Sequenz. Die SV40-Sequenz sollte entfernt werden, um die Kontamination mit von Viren stammendem genetischem Material zu verringern, aber nicht bevor das Ampicillinresistenzcistron deletiert und das Kanamycinresistenzgen insertiert war.
  • Um die Reinigung des Plasmids zu erleichtern und die Verwendung von Ampicillinselektion während des Wachstums des Bakterienwirts zu umgehen, wurde das Gen, das für die Ampicillinresistenz kodierte (b-Lactamase) durch das Gen vom bakteriellen Transposon Tn903 ersetzt, das für die Kanamycinresistenz (Aminoglycosidphosphotransferase) kodierte. Zuerst wurde ein Alw-NI-Partial/Eco-RI-Verdau von RSV HLA-B7(K), wie oben, mit einem Alw-NI/Eco-RI-Fragment vom Vektor pET9a (Novagen, Madison, Wi., USA), der für Kanamycinresistenz kodiert, ligiert. Als Zweites wurde das resultierende Konstrukt mit dem Namen kRSV HLA-B7(K) als Donor eines Nde-I/Hpa-I-Kanamycinresistenzgen-hältigen Fragmentes verwendet. Dieses Fragment wurde anstelle eines Nde-I/Hpa-I-Fragments eingesetzt, das für Ampicillinresistenz kodierte und im Plasmid von Interesse vorhanden war. Nachdem der Austausch der Antibiotikaresistenzgene abgeschlossen war, wurde die Entfernung der unerwünschten SV40-Sequenz in Angriff genommen.
  • Die SV40-Processing- und -Polyadenylierungssequenz wurde als Xho-I/Eco-RI-Fragment eliminiert. Durch teilweisen Verdau des Plasmids mit Xho I und Eco RI wurde der Schnitt im Kanamycinresistenzcistron an einer internen Xho-I-Stelle und an drei Eco-RI-Stellen in der bicistronischen Transkriptionseinheit vermieden. Eine darauf folgende Behandlung mit Klenow und eine Ligantion ergaben ein Konstrukt, dass in allen außer einem Aspekt wünschenswert war.
  • Innerhalb der RSV-LTR war ein Polyadenylierungssignal "AATAAA" verschlüsselt, das aufgrund seiner Position innerhalb der gewünschten Sequenz nicht als Promotor fungieren konnte. Unter Verwendung von ortsgerichteter Mutagenese wurde die Poly-A-Sequenz mutiert. Die Oligonucleotide mit der Sequenz 5'-CTA GCT CGA TAC TCT AGA CTC (Basen 470–490 von Seq.-ID Nr. 1) und CAT TTG ACC-3' leiteten den Gapped-Heteroduplex effektiv, was zu einer Mutation des ungewünschten Poly-A-Signals und außerdem zur Schaffung einer Xba-I-Restriktionsstelle führte. So wurde ein Plasmid hergestellt, das für ein HLA-B7-Antigen und ein β-2-Mikroglobulinpeptid kodierte und viele vorteilhafte Eigenschaften aufwies.
  • Das Konstrukt enthielt beispielsweise einen Replikationsstartpunkt von pBR322, eine bicistronische Transkriptionseinheit unter Kontrolle eines einzelnen Promotors, einen Promotor von der langen terminalen Wiederholung des Rous-Sarkom-Virus (RSV-LTR), worin eine Poly-A-Stelle mutierte wurde, eine interne Ribosomeninitiationsstelle, Consensus-Translationsinitiationssequenzen stromauf vom HLA-B7-Cistron (aus dem ein Intron entfernt worden war) und das β-2-Mikroglobulincistron, ein Polyadenylierungssignal vom Rinderwachstumshormongen, sowie genetisches Material, das für Kanamycinresistenz kodierte. Obwohl das rekombinante Plasmid vorzugsweise für HLA-B7 und β-2-Mikroglobulin kodiert, kann jedes Cistron innerhalb der bicistronischen Transkriptionseinheit entfernt werden, und das Rückgrat kann als Kassette für die Einführung anderer Cistrone verwendet werden, für die eine Expression erreicht werden soll.
  • Eine Datenbanksuche der Nucleotidsequenz des beschriebenen Plasmids durch Genbak ergab keine Homologie zu Onkogenen in den vorhergesagten offenen Leserastern. Außerdem zeigten mehrere Dokumente, dass die RSV + pBR322-Sequenzen, die in diesem Plasmid verwendet werden, erfolgreich in transgenen Mäusen verwendet wurden und nicht intrinsisch onkogen sind (Westphal et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 50, 411–416 (1985); Mahon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1165–1168 (1988); Overbeek et al., Science 231, 1574–1577 (1986)). Außerdem wurde das hierin beschriebene Plasmid in einem Rattenfibroblastentransformationstest analysiert und stimulierte keine Steigerung der Kolonietransformation über den Hintergrund.
  • BEZUGSBEISPIEL 2
  • Herstellung eines HLA-B7-hältigen Plasmids
  • Dieses Plasmid wurde hergestellt, indem mit dem oben beschriebenen Plasmid kRSV HLA-B7(K) begonnen wurde. Das kRSV-HLA-B7(K)-Konstrukt enthielt eine Transkriptionseinheit, welche die RSV-LTR als Promotor für eine cDNA enthielt, die für das Gen für HLA-B7 kodierte, aus dem ein Intron entfernt worden war. Eine Kozak-Consensus-Translationsinitiationssequenz war vorhanden. Die Transkriptionseinheit umfasste außerdem Regionen von SV40, die ein Spleißen am 3'-Ende der cDNA erlaubt, und ein Polyadenylierungssignal. Außerdem enthielt der Vektor den Replikationsstartpunkt von pBR322. Ferner umfasste das rekombinante Molekül den dominanten selektierbaren Marker für Kanamycinresistenz.
  • Eine Gesamtreduktion an SV40-Sequenzen von 1612 bp auf 384 bp wurde durchgeführt. Deletionen entfernten zwei offene Leseraster, die für Teile von SV40-Virusproteinen kodierten, das kleine t-Antigen und VPI.
  • Die Polyadenylierungsregion wurde ursprünglich als 993-Basenpaarfragment von einer Bcl-I- → Eco-RI-Stelle vom SV40-Virusgenom kloniert. Fremde Sequenzen in dieser Region kodierten für ein Virusstrukturprotein, VPI. Die Eliminierung von fremden Regionen des SV40-Polyadenylierungssignals wurde erreicht, indem ein 757 bp umfassendes Fragment von Eco RI → Bam HI von kRSV-HLA-B7(K) deletiert wurde, wodurch eine 236-bp-Sequenz übrig blieb, welche die Polyadenylierungsstelle enthielt.
  • Das kleine t-Antigenintron von SV-40 wurde ursprünglich als 610-bp-Fragment kloniert, obwohl die Intronregion selbst 64 bp groß war. Eine 462-bp-Abschnitt wurde von der Pfl-MI- → Bsa-BI-Stelle von kRSV HLA-B7(K) deletiert, wodurch eine 148-op-Region mit dem Intron übrig blieb. Diese Deletion entfernte im Wesentlichen alle offenen Leseraster des kleinen t-Antigens.
  • So wurde ein für ein HLA-B7-Antigen kodierendes Plasmid entwickelt, das viele vorteilhafte Merkmale aufwies. Beispielsweise werden durch den Austausch der Arzneimittelresistenzmarker von Ampicillin zu Kanamycin Patienten, die dem Plasmid ausgesetzt werden, z.B. während einer Gentherapie, vor allergischen Reaktionen in Zusammenhang mit Antibiotika geschützt. Außerdem neigt Ampicillin dazu, sich in Kultur zu zersetzen, sodass das Plasmid bei In-vitro-Züchtung verloren gehen kann; dieses Problem wird umgangen, indem ein kanamycinselektierbarer Marker verwendet wird. Wichtig ist, dass die Auslöschung von zwei offenen Leserastern, die für Teile des SV40-Virusproteins kodieren, das Risiko einer Tumorigenität verringert. Der Vektor kann auch als Kassette dienen, in der Cistrone zur Transkription und darauf folgenden Translation von Peptiden von Interesse beliebig insertiert und wieder entfernt werden können.
  • Eine Datenbanksuche der Nucleotidsequenz des beschriebenen Plasmids durch Genbak ergab keine Homologie zu Onkogenen in den vorhergesagten offenen Leserastern. Außerdem wurde das hierin beschriebene Plasmid in einem Rattenfibroblastentransformationstest analysiert und stimulierte keine Steigerung der Kolonietransformation über den Hintergrund.
  • BEZUGSBEISPIEL 3
  • Expression unter Verwendung eines modifizierten HLA B7 Expressionsvektors
  • Eine FACS-Analyse des Plasmid-HLA-B7-Expressionsvektors ohne Modifikationen oder mit einem entfernten Intron und dem Hinzufügen einer β-Globin-Consensus- Translationsinititationssequenz ergab eine Steigerung der Expression bei diesen beiden Modifikationen.
  • BEISPIEL 4
  • Expression unter Verwendung eines HLA-B7- und β-2-Mikroglobulin-
  • Expressionsvektors
  • Klasse-I-MHC-Proteine werden mit β-2-Mikroglobulin gemeinsam auf die Zelloberflächen transportiert. In 10 % der Melanome fehlt die β-2-Mikroglobulin- und diese Klasse-I-MHC-Expression. Um diese Möglichkeit der Verhinderung der Klasse-I-MHC-Expression zu überwinden, inkludierten die Erfinder β-2-Mikroglobulin in den Vektor. Die Expression von HLA-B7 mit oder ohne β-2-Mikroglobulingen in einer β-2-Mikroglobulin-negativen menschlichen Melanomlinie wurde bewertet. Eine FACS-Analyse zeigte, dass die Inklusion des β-2-Mikroglobulingens die Expression des HLA-B7-Proteins auf der Oberfläche von Zellen ermöglichte, das sonst nicht exprimiert wurde.
  • BEISPIEL 5
  • Verbesserte Therapie unter Verwendung von Cytokingenen
  • Die Einführung eines Klasse-I-MHC-Gens in Tumoren in vivo führt zu einer T-Zell-Reaktion gegen das fremde MHC-Gen, was außerdem zur Erkennung von tumorassoziierten Antigenen führt. Diese Antigenität des Tumors könnte durch die Aufnahme von Cytokinen weiter erhöht werden, welche die T-Zellen weiter vermehren würde, die lokal als Reaktion auf dieses Gen erzeugt werden. Um zu bestimmen, ob diese Reaktion weiter verstärkt werden kann, können andere Cytokingene, wie z.B. IL-2, in Kombination mit HLA-B7 in intratumoralen Injektionen beurteilt werden. Außerdem kann auch die Reaktion auf fremde MHC-Genexpression in dem Modell in vivo untersucht werden, in dem Schweinarterien verwendet werden (E.G. Nabel et al., Proc., Natl. Acad. Sci. USA 89, 5157 (1992)).
  • BEISPIEL 6
  • Transfektionseffizienz von DMRIE/DOPE
  • Kationische Lipidformulierungen, die DC-Cholesterin/DOPE (Molverhältnis 5:5) und DMRIE/DOPE (Molverhältnis 5:5) umfassen, wurden verwendet, um Zellen gemäß dem Verfahren aus Beispiel 12 zu transfizieren. Die In-vitro-Transfektioneffizienz von DC-Cholesterin/DOPE im Vergleich zu der von kationischen DMRIE/DOPE-Lipiden wurde unter Verwendung der β-Galactosidasetransduktion einer Nierenepithelzelle (293), einer menschlichen Melanomlinie (HALL) oder eines Mäusefibrosarkoms (MCA 205) gemessen. Im Vergleich zu DC-Cholesterin/DOPE wies DMRIE/DOPE eine bis zu siebenfache Steigerung der Transfektionseffizienz auf.
  • BEISPIEL 7
  • Toxizität von DNA-Liposom-Komplexen
  • Die mögliche Toxizität von DNA-Liposom-Komplexen wurde in Tieren bewertet, denen DNA-Liposom-Komplexe (Plasmid-HLA-B7, siehe unten, + DMRIE/DOPE) durch eine Schwanzvene in Konzentrationen injiziert wurden, die etwa 100-mal höher waren als die Mengen, die in Versuchen an Menschen eingesetzt würden. Es gab keine signifikanten Veränderungen, die auf eine nennenswerte Organtoxizität hinweisen würden. Um die Bedenken in Zusammenhang mit einer möglichen Herztoxizität zu zerstreuen, wurden die CPK-Werte analysiert, wobei nach einer Injektion keine Veränderungen nachweisbar waren. Eine elektrokardiographische Analyse zeigte keine myokardiale Toxizität auf. Biochemische Serumparameter befanden sich nach einer (1) oder nach mehreren Injektionen (3 × in zweiwöchigen Intervallen) im Normalbereich. Es gab keine Veränderungen in Bezug auf BUN, Kreatinin, SGOT, SGPT, alkalische Phosphatase oder Bilirubin. Amylase, Phosphor und der Gesamtproteingehalt blieben nach diesen Behandlungen ebenfalls stabil, sowohl akut als auch chronisch. Und schließlich zeigten allgemeine Sicherheitstests nach der Verwendung dieser DNA-Liposom-Komplexe keinen Gewichtsverlust oder Anzeichen systemischer Toxizität auf.
  • BEISPIEL 8
  • Verbesserte Therapie mit DNA-DMRIE/DOPE-Komplexen
  • Die Möglichkeit, eine verbesserte Therapie mit der neuen Liposomformulierung DMRIE/DOPE bereitzustellen, wurde untersucht. C57/BL6-Mäusen (H-2Kb) wurden am Tag 0 subkutan Tumorzellen von einem Subklon von MCA 205, einem Mäusefibrosarkom (H-2Kb), in die linke Hinterflanke inokuliert. Eine Präsensibilisierung wurde durchgeführt, indem BALB/c- (H-2Kd-) Milzzellen am Tag –6 (5 × 106) und am Tag +1 (2 × 106) subkutan injiziert wurden. Den Tumoren wurden am Tag 15, 18 und 20 0,1 ml eines 50:50-Gemischs aus DMRIE und DOPE injiziert, das 74,7 mmol DMRIE in einer laktierten Ringer-Lösung enthielt, das mit 5 μg CMVH-2Kb oder CMVH-2Kd komplexiert war. Die Tumorgröße, berechnet als Produkt aus zwei orthogonalen Durchmessern, wurde am Tag 15, 18, 21, 23, 25, 28 und 30 gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass das Mäusefibrosarkom unter Verwendung der Konzentration der DMRIE/DOPE-Formulierung schlecht mit dem DC-Chol-Liposom transfiziert war. Eine ausgeprägte Antitumorwirkung, die mit DC-Chol nicht auftrat, wurde nach Einführung eines fremden MHC-Gens (H-2Kd) erzielt.
  • BEISPIEL 9
  • Herstellung von 1,2-Dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethylammoniumbromid (DMRIE)
  • DMRIE wurde unter Verwendung des zur Synthese von DOTMA entwickelten Verfahrens mit geringen Modifikationen synthetisiert (Felgner, P.L., et al., PNAS 84, 7413-7417 (1987)). So wurde 3-Dimethylamino-1,2-propandiol mit Myristylmesylat kondensiert, wobei eine basische Katalyse eingesetzt wurde, um den entsprechenden Diether herzustellen. Nach der chromatographischen Reinigung dieses lipophilen Amins wurde eine Quaternisierung durch Behandlung mit 2-Bromethanol bei erhöhten Temperaturen durchgeführt. Das chromatographisch gereinigte Produkt ergab in einer IR-, 1H-NMR- und Elementaranalyse die Ergebnisse, die für das gewünschte Hydroxyalkylammoniumsalz vorhergesagt worden waren.
  • BEISPIEL 10
  • Herstellung eines kationischen Liposoms
  • Kationische Liposome wurden hergestellt, indem eine Chloroformlösung des Lipids in einer 2 ml fassenden Wheaton-Glasseptumphiole hergestellt und das Chloroform durch Rotationsverdampfen entfernt wurde, um den getrockneten Lipidfilm zu erhalten. Die Phiolen wurden über Nacht in Vakuum gegeben, um die Lösungsmittelspuren zu entfernen. 1 ml entionisiertes Wasser wurde zugesetzt, und die Phiolen wurden verschlossen und 1 min lang bei Raumtemperatur verwirbelt, um größere multilamellare Vesikel (MSV) herzustellen. Kleine beschallte unilamellare Vesikel (SUV) wurden hergestellt, indem die MLV unter Stickstoff in einem Beschallungsgerät mit umgekehrten Behältern (Heat Sytems) 60 min lang bei 10 °C beschallt wurden.
  • BEISPIEL 11
  • Bildung eines Komplexes aus Polynucleotid und kationischem Lipid
  • Polynucleotidkomplexe wurden hergestellt, indem 0,5 ml einer 10-μg/ml-Polynucleotidlösung mit 0,5 ml Liposomen mit 40–100 μg/ml vermischt wurden. Die verdünnten Polynucleotid- und Liposomlösungen wurden aus konzentrierten Stammlösungen hergestellt, wobei die Verdünnungen bei Raumtemperatur vorgenommen wurden. Dieses Verfahren ergibt positiv geladene Komplexe, die spontan ein Polynucleotid in Zellen abgeben. Je nach Fall können unterschiedliche Verhältnisse zwischen positiv geladenen Liposomen und Polynucleotiden verwendet werden. Diese Verfahren sind im Wesentlichen in Felgner, P.L., et al., PNAS 84, 7413–7417 (1987), und Felgner, P., und M. Holm, Focus 11(2) (Frühling 1989) beschrieben. Siehe auch Beispiel 14.
  • BEISPIEL 12
  • Transfektionsarbeitsvorschriften
  • Transfektionen wurden wie folgt in 96-Well-Platten durchgeführt:
    • (1) Die Wells einer 96-Well-Mikrotiterplatte wurden mit 20.000 bis 40.000 Zellen pro Well beimpft.
    • (2) Verdünnungen von kationischen Lipidpräparaten und Polynucleotidpräparaten aus Stammmlösungen wurden durch 2-dimensionale Reihenverdünnungen in separaten 96-Well-Platten hergestellt.
    • (3) Entsprechende Lipid- und Polynucleotidverdünnungen wurden vermischt, indem ein gleiches Volumen Polynucleotid in einen entsprechenden Lipidmikrowell transferiert wurde.
    • (4) Das serumhältige Medium wurde aus den die Zellen enthaltenden Wells abgedampft.
    • (5) Eine Menge von etwa 100 μl der Komplexe aus kationischen Lipiden und DNA wurde zu den Zellen in den einzelnen Wells der Mikrotiterplatte zugesetzt.
    • (6) Die Platten wurden bei 37 °C (5 % CO2) inkubiert. 4–24 Stunden nach der Transfektion wurde eine Aliquote von 10 % Serum in "OptimemTM Reduced Serum Media" von Gibco/BRL (Gaithersburg, Md., USA) zu den einzelnen Wells zugesetzt.
    • (7) Am Ende der Inkubation wurde das Testmedium aus den Zellen oder ein Ganzzelllysat auf die Expressionsaktivität untersucht.
  • Wenn β-Galactosidase das Reportergen war, wurde die Expression kolorimetrisch überwacht, wobei 2-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (ONPG) oder Chlorphenylrotβ-D-galactopyranosid (CPRG) als Substrat verwendet wurde und die Platten mit einem Mikrotiterlesegerät bei 405 nm abgelesen wurden.
  • BEISPIEL 13
  • Genanlieferung auf Katheterbasis
  • Die Einführung eines fremden MHC-Gens in eine Lungenmelanommetastase mithilfe eines Katheters wurde an einem Patienten angewendet, der vorher eine Gentransferbehandlung erhalten hatte. Dieses Verfahren wurde gut vertragen, und nach dem Gentransfer war zwischen dem Blutdruck vor und nach der Behandlung kein Unterschied zu erkennen (23/12 Mittel = 10 versus 22/10 Mittel = 10). Außerdem trat nach diesen Behandlungen keine akute oder chronische Toxizität auf. Eine Analyse der Hämatologie, chemischen Zusammensetzung und Immunologietests ergaben keine zusätzlichen Anomalitäten bis zu sechs Wochen nach der Erstbehandlung.
  • BEISPIEL 14
  • Menschliche Gentherapie
  • Patienten mit Melanomen wurden in ein klinisches Forschungszentrum überwiesen. Der Tumorknoten, in den injiziert werden sollte, wurde identifiziert und seine Grenzen vor der Injektion abgemessen. Eine Nadelbiopsie wurde durchgeführt, um die Diagnose zu bestätigen. Das Gewebe wird für weitere immunhistochemische Analysen und eine PCR in Form von gefrorenen Schnitten gelagert. Außerdem werden dieser Knoten und andere Kontrollknoten (unbehandelt) direkt vor dem Verfahren durch CT abgebildet, und die Größe wird quantifiziert. Die Haut über dem Tumorknoten wird mit 0,01 % Lidocain sterilisiert und anästhetisiert. Für den Gentransfer wird eine Nadel Nr. 22 verwendet, um den DNA-Liposom-Komplex zu injizieren, der wie folgt hergestellt wird: 10 Minuten vor der Verabreichung werden 0,1 ml Plasmid-DNA (0,05–50 mg/ml) in laktierter Ringer-Lösung zu 0,1 ml DMRIE/DOPE-Liposomlösung (0,15–15 μM) zugesetzt. Die einzelnen Komponenten werden separat in sterilen Phiolen gelagert und von der FDA genehmigt. Die Lösung wird 5–10 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, und 0,8 ml sterile laktierte Ringer-Lösung werden zur Liposom-DNA-Lösung zugesetzt. Die optimale Zusammensetzung des DNA/Liposom-Komplexes wurde für jede Charge durch Titration der DNA-Konzentration und der Liposomkonzentration unabhängig vom menschlichen Melanom- oder Nierenzellkar zinomen in Kultur bestimmt und vor der Verwendung durch direkte Injektion in Melanome oder andere Tumoren in Versuchstieren bestätigt. Jede Komponente, das Liposompräparat und die DNA, wird auf Kontaminanten und Toxizität untersucht und gemäß den zuvor von der FDA festgelegten Richtlinien verwendet. Die Liposomlösung und die DNA werden in einzelnen sterile Phiolen aliquotiert und unter sterilen Bedingungen vermischt.
  • Die optimale Plasmiddosis kann leicht unter Verwendung von herkömmlichen empirischen Verfahren bestimmt werden. Um beispielsweise die Dosierung für eine direkte Injektion der HLA-B7-Plasmide zu bestimmen, werden steigende Dosierungen untersucht. Vier Patientengruppen werden nacheinander untersucht, wobei vor der Bewertung der nächsten Gruppe zumindest 1 Monat Beobachtung liegt. Die Patienten jeder Gruppe erhalten intratumorale Injektionen. Gruppe I erhielt 3 Injektionen mit 0,2 ml im selben Knoten (3 μg DNA + 4,5 nM DMRIE/DOPE). Gruppe II erhält die gleiche Behandlung mit einer 10fach höheren Konzentration des DNA-Lipsom-Komplexes. Gruppe III erhält eine 100fach höhere Dosis, und Gruppe IV erhält eine 1000-mal höhere Menge. Eine Vorbehandlung mit einer geringen Dosis Cytoxan kann die Antitumorreaktion durch Elimination von suppressiven T-Zellen verbessern.
  • Für eine Genanlieferung auf Katheterbasis wird die gleiche Dosissteigerung verwendet, mit der Ausnahme, dass eine einzelne 0,6-ml-Injektion in die Endarterie, die einen isolierten Knoten versorgt, mit einem Okklusionsballonkatheter verwendet wird. In Mäuse- und Schweinemodellen lag die höchste Behandlung 100fach über der vorgeschlagenen Dosis und wurde gut vertragen. Die Dosierungen werden in jenen Probanden wiederholt, bei denen die Toxizitätsbehandlung ≤ Grad II ist. Die Dosissteigerung beginnt, wenn Patienten aufgrund der Behandlung Toxizitäten < Grad III aufweisen. Wenn ein Drittel der Patienten eine Toxizität > Grad II aufweist, wird die Behandlung an weiteren Patienten wiederholt. Wenn mehr als ein Drittel der Patienten eine Toxizität > Grad II entwickelt, wird die Dosierung verringert. Die maximal tolerierte Dosis ist als Dosis definiert, bei der ein Drittel oder mehr der Patienten eine Toxizität des Grades III oder IV entwickeln. Die Behandlungsdosis wird einen Schritt unter der maximal tolerierten Dosis festgesetzt. Sobald die Behandlungsdosis festgelegt ist, werden weitere Patienten mit dieser Dosis behandelt, um die Sicherheit der Dosis für eine breitere Anwendung zu bestätigen.
  • Befindet sich die Nadel an der Injektionsstelle, wird die Spritze vor der Injektion leicht aufgezogen, um sicherzustellen, dass kein Material intravenös injiziert wird. Direkt nach dem Injektionsvorgang wird eine Blutprobe für die Überprüfung der Serumenzyme, der chemischen Zusammensetzung und des Blutbilds entnommen, um die Gegenwart von Plasmid-DNA im peripheren Blut durch eine PCR zu bestimmen. Der Patient wird weitere 48 Stunden im klinischen Forschungszentrum beobachtet. Wenn keine Komplikationen auftreten, wird der Patient nach 48 Stunden entlassen. Sollten Anomalitäten auftreten, wird der Patient weiter zur Beobachtung behalten.
  • Bestätigung des Gentransfers und der Expression
  • Eine Nadelbiopsie des Knotens, der die Injektion erhält, wird nach Verabreichung einer lokalen Anästhesie vor der Injektion und nach der Behandlung durchgeführt. Ein Teil dieses Gewebes wird verarbeitet, um DNA für PCR-Analyse zu erhalten. Das verbleibenden Gewebe wird für eine pathologische Analyse und Immunhistochemie und/oder Immunfluoreszenzfärbung verarbeitet. Wenn ausreichend Material erhalten werden kann, wird auch eine RNA-PCR-Analyse durchgeführt. Bei inneren Organen wird, wenn möglich, auch eine CT- oder ultraschallgesteuerte Feinnadelbiopsie durchgeführt.
  • Analyse der Immunantwort
  • Beweise für einen Gentransfer können auch indirekt durch die Untersuchung spezifischer Immunantworten auf HLA-B7 erhalten werden. Die Analyse wird wie folgt durchgeführt: zwei Wochen vor der ersten Behandlung wird eine Blutprobe entnommen, um Lymphozyten zu erhalten, die unter Verwendung des Epstein-Barr-Virus immortalisiert werden. Eine Aliquote dieser Zellen wird weiter mit einem amphotro pen HLA-B7-Retrovirusvektor infiziert, und die Expression wird auf der Zelloberfläche bestätigt. Diese Zellen werden dann im Labor als Zielzellen für den zytolytischen Z-Zelltest verwendet.
  • Wiederholte Behandlung
  • Wenn keine Nebenwirkungen der Behandlung auftreten, werden in zweiwöchigen Intervallen wiederholte Injektionen vorgenommen. Hierbei werden die gleichen Dosen verwendet wie bei der ersten Behandlung, und auch die Arbeitsvorschrift und die Beobachtung sind wie oben beschrieben.
  • Bestätigung der Expression von rekombinanten Genen
  • Verschiedene unabhängige Verfahren werden verwendet, um die Gegenwart und Expression eines rekombinanten Gens in vivo zu beurteilen. Monoklonale Antikörper gegen HLA-B7 werden verwendet, um das rekombinante Genprodukt in vivo durch Immunhistochemie zu detektieren. Die Fluoreszenzfärbung von frisch dispergierten Zellen wird ebenfalls beurteilt. Die Gegenwart von Plasmid-DNA wird durch eine PCR einer DNA von Tumorgewebe, peripheren Blutlymphozyten oder in Autopsiegewebeproben bestätigt. Wenn ausreichend Gewebe vorhanden ist, wird RNA isoliert und durch eine PCR oder S1-Nucleasenanalyse auf die Gegenwart von HLA-B7-mRNA untersucht.
  • Analyse der Immunantwort
  • Der direkte Gentransfer und die Expression des HLA-B7-Gens können den Patienten gegenüber HLA-B7 sensibilisieren und zur Auslösung einer Immunantwort auf dieses Antigen führen. Grenzverdünnung (LDA) wird verwendet, um Veränderungen in der Häufigkeit von Helfer- und zytolytischen T-Zellen für HLA-B7 im peripheren Blut nach dem direkten Gentransfer zu bestimmen. Periphere Blutlymphozyten (PBL) werden vor dem ersten direkten Gentransfer und in 4-wöchigen Intervallen isoliert und ge frierkonserviert. Nach Beendigung der Behandlung werden PBL-Proben von jedem Zeitpunkt gleichzeitig auf ihre Reaktionsbereitschaft auf HLA-B7 untersucht, indem PBL unter LDA-Bedingungen mit autologen EBV-B-Zellen kultiviert werden, die mit dem HLA-B7-Gen transduziert sind. Antigenspezifische Ausarbeitung von IL-2 oder die Bildung von CTL für HLA-B7-positive Zielzellen sind die Indizes, die in diesen Studien bestimmt werden. Die Gegenwart eines Antikörpers wird durch eine FACS-Analyse an einem übereinstimmenden Paar HLA-B7+- oder HLA-B7–-Zelllinien bestimmt. In manchen Fällen werden Lymphozyten direkt aus dem Tumor isoliert, in einer Gewebekultur vermehrt und auf ihre zytolytische Funktion untersucht. Tumorbiopsien 7–14 Tage nach der Behandlung werden durch Immunhistochemie analysiert. Es könnte versucht werden, drainierende Lymphknoten-T-Zellen oder TIL-Zellen zu vermehren, um ihre zytologische Funktion zu untersuchen. Es könnte auch möglich sein, autologe Zelllinien zu erhalten, die als Ziele in 51Cr-Release-Assays verwendet werden. Es könnte versucht werden, Tumorgewebe vor der Behandlung für eine Diagnose, Immunhistochemie und Gefrierkonservierung herauszuschneiden und verzögerte Überempfindlichkeitsreaktionen auf den Tumor vor und nach der Behandlung zu evaluieren.
  • Obwohl oben bestimmte Ausführungsformen der Erfindung detailliert beschrieben wurden, wird für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung klar sein, dass diese Ausführungsformen lediglich Beispiele sind und nicht zur Einschränkung dienen, sondern dass der wahre Schutzumfang der Erfindung in den folgenden Ansprüchen definiert ist.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001

Claims (28)

  1. Polycistronischer Plasmidvektor, worin der Vektor ein erstes Cistron, das für ein MHC-Klasse-I-Antigen kodiert, und ein zweites Cistron umfasst, das für ein β2-Mikroglobulin kodiert.
  2. Vektor nach Anspruch 1, der außerdem eine Ribosomenbindungsstelle umfasst.
  3. Vektor nach Anspruch 1, einen Promotor umfassend, der operabel mit einem der Cistrone verbunden ist, wobei der Promotor von einer RSV-LTR stammt.
  4. Vektor nach Anspruch 3, worin das zu dem RSV native Polyadenylierungssignal mutiert wurde.
  5. Vektor nach Anspruch 2, eine Ribosomenbindungsstelle umfassend, die vom EMC-Virus stammt.
  6. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, außerdem eine Kozak-Translationsinitiationssequenz CACCATGG umfassend, welche die Expression eines beliebigen der Cistrone erleichtert.
  7. Vektor nach einem der Ansprüche 4 bis 6, ein Rinderwachstumshormongen-Polyadenylierungssignal umfassend.
  8. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, außerdem einen selektierbaren Marker umfassend, der Resistenz gegen Kanamycin verleiht.
  9. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 8, außerdem einen Replikationsstartpunkt umfassend, der von pBR322 stammt.
  10. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin das MHC-Klasse-I-Antigen HLA-B7 ist.
  11. Vektor nach Anspruch 1, umfassend eine Transkriptionseinheit, worin die Cistrone in der Transkriptionseinheit unter der Kontrolle eines einzelnen RSV-LTR-Promotors organisiert sind, eine interne Eintrittsstelle für Ribosomen, die zwischen den Cistronen positioniert ist, eine Rinderwachstumshormongen-Polyadenylierungssignalsequenz, die operabel mit der Transkriptionseinheit verbunden ist, einen selektierbaren Marker, der operabel für Kanamycinresistenz kodiert, und eine pBR322-Sequenz, die einen prokaryotischen Replikationsstartpunkt enthält.
  12. Vektor nach Anspruch 1 mit der in Seq.-ID Nr. 1 angeführten DNA-Sequenz.
  13. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 12, ein Cytokingen umfassend.
  14. Pharmazeutische Zusammensetzung, einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 13 umfassend.
  15. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 14, außerdem eine transfektionsvereinfachende kationische Lipidformulierung umfassend.
  16. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 15, worin die Formulierung DMRIE-DOPE ist.
  17. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 16, worin das DMRIE-DOPE ein Molverhältnis von 5:5 aufweist.
  18. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 14 bis 17 zur Verwendung in einem gentherapeutischen Verfahren.
  19. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18 zur Verabreichung mithilfe eines Katheters.
  20. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18 zur Verabreichung mittels intratumoraler Injektion.
  21. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18, worin die Gentherapie zur Behandlung von Melanomkrebs dient.
  22. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 13 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer neoplastischen Erkrankung.
  23. Verwendung nach Anspruch 22, worin das Medikament außerdem eine transfektionsvereinfachende kationische Lipidformulierung umfasst.
  24. Verwendung nach Anspruch 23, worin die Formulierung DMRIE-DOPE ist.
  25. Verwendung nach Anspruch 24, worin das DMRIE-DOPE ein Molverhältnis von 5:5 aufweist.
  26. Verwendung nach einem der Ansprüche 22 bis 25, worin das Medikament mithilfe eines Katheters verabreicht wird.
  27. Verwendung nach einem der Ansprüche 22 bis 25, worin das Medikament mittels intratumoraler Injektion verabreicht wird.
  28. Verwendung nach Anspruch 22, worin die neoplastische Erkrankung Melanomkrebs ist.
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