KR100218052B1

KR100218052B1 - B형 간염 바이러스의 복제를 억제하는 약학적 제제

Info

Publication number: KR100218052B1
Application number: KR1019920012600A
Authority: KR
Inventors: 장일무
Original assignee: 이병언; 주식회사중외제약
Priority date: 1992-07-15
Filing date: 1992-07-15
Publication date: 1999-09-01
Also published as: JP3571061B2; IT1264923B1; US5929038A; DE4323567A1; ITMI931522A0; CN1047307C; DE4323567B4; ITMI931522A1; CN1082895A; JPH0687740A; KR940001886A

Abstract

본 발명은 다음 구조식 (I)로 표시되는 이리도이드계 화합물, 그 아그리콘 및 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 B형 간염 바이러스(이하 HBV라 칭한다)의 DNA 복제를 억제하는 약학적 제제에 관한 것이다.

식중, R₁은 H 또는 OH이며, R₂는 H 또는 COOR₆(R₆는 H 또는 저급알킬)이며, R₃는 H 또는 글루코스이며, R₄는 OH, CH₂OH 또는 4-페닐프로피오닐옥시기이며, R₅는 H, OH 또는 o-글루코스이며,는 단일 결합, 이중결합 또는(에폭시결합)을 나타낸다.

이때, 상기식에 있어서, 그 화합물은 오쿠빈(Aucubin), 카탈폴(Catalpol), 게니포시드(Geniposide), 레마니오시드(Rehmannioside), 하파고시드(Harpagoside), 하파기드(Harpagide), 게니핀(Genipin)을 나타내며, 한편, 상기 구조식의 화합물과 같은 화학적, 약리학적 특성을 갖는 또 다른 이리도이드계 화합물로서 가르데노시드(Gardenoside) 및 스웨르티아마린(Swertiamarin) 등도 항-HBV 억제 효과를 나타낼 것으로 기대된다.

본 발명에 의한 상기 이리도이드계 화합물들은 모두 사이클로펜타[C]피란 모노테르피노이드의 화학 구조를 가지는 것을 특징으로 하며, 대부분 글루코스를 가지는 배당체들이고,

Description

B형 간염 바이러스(HBV)의 복제를 억제하는 약학적 제제

제1도는 진핵세포에서의 HBV DNA 생합성의 모식도이다.

식중, R₁은 H 또는 OH이며,

R₂는 H 또는 COOR₆(R₆는 H 또는 저급알킬)이며,

R₃는 H 또는 글루코스이며,

R₄는 OH, CH₂OH 또는 4-페닐프로피오닐옥시기이며,

R₅는 H, OH 또는 o-글루코스이며,는 단일 결합, 이중결합 또는(에폭시결합)을 나타낸다.

이때, 상기식에 있어서,

R₁이 OH, R₂가 H, R₃가 글루코스, R₄가 CH₂OH이고 R₅가 H이며, 상기 결합이 이중결합인 경우, 구조식 (I)의 화합물은 다음 구조식 (A)의 오쿠빈(Aucubin)을 나타내며,

R₁이 OH, R₂가 H, R₃가 글루코스, R₄가 CH₂OH이고 R₅가 H이며, 상기 결합이 에폭시결합인 경우, 구조식 (I)의 화합물은 다음 구조식 (B)의 카탈폴(Catalpol)을 나타내며,

R₁이 H, R₂가 COOR₆(R₆가 CH₃), R₃가 글루코스, R₄가 CH₂OH이고 R₅가 H이며, 상기 결합이 이중결합인 경우, 구조식 (I)의 화합물은 다음 구조식 (C)의 게니포시드(Geniposide)를 나타내며,

R₁이 OH, R₂가 H, R₃가 글루코스, R₄가 CH₂OH이고 R₅가 o-글루코스이며, 상기 결합이 이중결합인 경우, 구조식 (I)의 화합물은 다음 구조식 (D)의 레마니오시드(Rehmannioside)를 나타내며,

R₁이 OH, R₂가 H, R₃가 글루코스, R₄가 4-페닐프로피오닐옥시기이고 R₅가 OH이며, 상기 결합이 단일결합인 경우, 구조식 (I)의 화합물은 다음 구조식 (E)의 하르파고시드(Harpagoside)를 나타내며,

R₁이 OH, R₂가 H, R₃가 글루코스, R₄가 OH이고 R₆가 OH이며, 상기 결합이 단일결합인 경우, 구조식 (I)의 화합물은 다음 구조의 (F)의 하르파기드(Harpagide)를 나타내며,

R₁이 H, R₂가 COOR₆(R₆가 CH₃), R₃가 H, R₄가 CH₂OH이고 R₅가 H이며, 상기 결합이 이중결합인 경우, 구조식 (I)의 화합물은 다음 구조식 (G)의 게니핀(Genipin)를 나타내며,

한편, 본 발명자 등의 보고로써 오쿠빈(Aucubin) 등과 같은 이리도이드계 화합물로서 그 화학적, 약리학적 특성을 공유하는 다음 구조식 (H)의 가르데노시드(Gardenoside)와 다음 구조식 (J)의 스웨르티아마린(Swertiamarin)도 항-HBV 억제 효과를 나타낼 것으로 기대되어, 본 발명의 물질에 포함하여 본 발명을 완성 이에 출원하는 바이다.

상기 이리도이드계 화합물은 모두 사이클로펜타[C]피란 모노테르피노이드의 화학 구조를 가지는 것을 특징으로 하며, 대부분 그루코스를 가지는 배당체들이고,-글루코시다제 등으로 분해되어 게닌 형태로 활성화되었을 경우, RNA나 단백질의 생합성을 억제하는 효과가 있음이 보고되었다. [S. O. Huh, J. H. Kim and I. M. Chang, Iridoid Compoundsrk RNA 및 Protein 생합성에 미치는 영향, 한국생화학회지, 16(2), 99-104(1985)]. 특히, 오쿠빈은 이리도이드(Irodoid) 계열의 식물성분으로 식나무(Aucuba Japonica)에서 추출된 물질로 그 구조는 트림(Trim) 및 힐(Hill) 등에 의해서 밝혀졌으며, 화학명은 1,4,5,7-테트라하이드로-5-하이드록시-7-(하이드록시메틸)사이클로펜타[C]피란-1-일--D-글루코피라노스이다[A. R. Tri, R. Hill, Biochem. J. 50, 310(1952)]. 상기 식물성분은 많은 식물에서 보고된 방법으로 제조할 수 있으며, 국내에서도 질경이 및 식나무 등에서 분리되었으며 본 발명자 등에 의해 보고되었다[I. M. Chang, H. S. Yun(Choi), Advances in Chinese Medical Research, World Scientific Pbu. Co., Singapore(1985)].

상세히 하면, 본 이리도이드계 화합물의 생리활성작용, 즉 약리작용중 보고된 것은 다음과 같다.

1). 항균작용: 그람 양성균에 항균작용을 나타낸다.

2). 보간작용: 사염화탄소(CCl₄)를 투여한 실험동물의 간장장애(간독성)을 오쿠빈은 방어한다[I. M. Chang et al. dirgkrghlwl, 28, 35(1984)].

-아마니틴에 의한 간장장애를 방어한다. 즉 실험동물에서 보간작용을 나타냈다[I. M. Chang et al, Proceedings, The 2nd ROK-ROC Symposium on natural Products Sciences, p.94(1985)].

동물세포(sarcoma-180)의 RNA 및 단백질 생합성을 억제시키는 작용이 있다[I. M. Chang et al, 한국생약학회지, 16, 99(1985)] 및 [I. M. Chang, Advances in Chines Medicinal Materials Research, p.269(1985)].

3). 해독작용: 오쿠빈은 독버섯 해동작용이 있다(한국특허 공고 제 92-2290: 본 발명자 출원).

이에 본 발명자는 더욱 연구하여 위와 같은 약리작용이 있는 이리도이드계 배당체물질들이 HBV 복제의 억제에 효과적이며 따라서 간염바이러스에 유용한 약물로 사용될 수 있고, 그 독성이 매우 적다는 새롭고도 놀라운 사실을 발견하고, 그 효과를 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.

HBV에 의한 감염은 세계적으로 수백만이 만성적으로 감염되어 있는 주요한 건강상의 문제이다. HBV의 감염은 급성 및 만성 간질환을 일으킬 뿐만 아니라, 주요 간세포암(Hepatocellular carcinoma; HCC)을 형성하는데 관여하는 것으로 알려진다.

진핵세포에서의 HBV DNA 합성은 제1도와 같다. HBV는 Hepadnaviridae과, Hepadnavirus 속에 속하며, d-s DNA를 가지며, 그 단위체는 42nm의 구형이고 복제과정에서 (+)strand RNA 중간체를 갖는다. HBV는 약 5종이 발견되었는데 복제에 있어서 모두 역전사과정을 필요로 한다[C. R. Howard J. L. Melnick, Classification and Taxonomy of Hepatitis Viruses, Proceedings of the 1990 International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease, P.890(1990)].

본 발명에 의하면 이리도이드계 화합물은 글리코시다제로 전처리하여 2.2.15세포배양물에 가하였을 경우에 효과적인 HBV 복제 억제효과를 나타낸다. 이것은 당이 분해되어 얻어지는 게닌(genin) 형태가 세포내에서 핵산의 복제를 억제하는 활성화형인 것으로 사료되며, 물론 글리코시다제 단독으로는 아무런 효과를 나타내지 않았다.

기존의 치료양생법으로 항바이러스 물질로 보고된 인터페론이나 뉴클레오시드 동족체(nucleoside analogs) 등은 HBV를 억제하는 효과가 일시적이며, 일부의 감염자에게만 그 효과가 있는 단점이 있다. 또한, 인체면역결핍바이러스(HIV)에도 적용되는 뉴클레오시드 동족체인 2',3'-디데옥시사이티딘(ddC)의 경우 중추 및 말초신경계에 부작용을 일으키고[Feldman, Brosnan Anderson, Ultrastructure of peripheral neuropathy induced in rabbits by 2',3'-dideoxycytidine, Lab-Invest., 66(1) p.75-85(1992)], 조혈모세포에 독성이 있다[Mencoboni, Lerza, Bogliolo, Flego, Gasparini and Pannacciulli, Dideoxycytidine toxicity on mouce hemopoietic progenitors, In-Vivo., 4(3), p.171-173(1990)]. 또 다른 뉴클레오시드 동족체인 ara-AMP의 경우, 그 효과가 일시적이고, 장기간 치료시 심각한 독성이 나타난다[J. L. Gerin, Antiviral Agents for Hepatitis B, Hepatology, Vol. 14, No. 1, P.198-199(1991)].

본 발명에 사용된 2.2.15 세포계(Sells et al., 1987)는 정확하게 만성 HBV 감염의 모든 필수적인 바이러스학적 특징을 표본화한다. 즉 DNA 패턴이 안정하고, 복제되는 바이러스가 높은 레벨로 존재하며, 바이러스-특이성 RNA 전사체 및 단백질이 적절한 크기와 패턴으로 존재하고, 침투한 HBV virion이 높은 역가로 방출되는 장점이 있어서, HBV에 대한 활성도의 평가에 매우 적절한 세포계로 인정된다.[Korba and Milman, Antiviral Research, 15, p.217-228(1991)].

본 발명의 오키빈을 비롯한 화합물들은 HBV DNA의 복제를 억제하는데 유효하며, 그 독성이 적은 장점이 있으며, 재래의 많은 약용식물 및 기타 식물로부터 용이하게 제조할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 화합물은 약학적 제제의 제조분야에서 통상으로 사용되는 부형제, 보조제등과 혼합하여 약학적으로 통상으로 사용되는 경구 또는 비경구의 약학적 제제의 형태로 투여할 수 있다.

본 발명의 화합물은 환자의 나이, 성별, 질병의 정도등에 따라서 그 사용량은 증감될 수 있으며, 통상으로 1일 1mg 내지 1000mg을 1회 내지 수회 투여할 수 있다.

본 발명은 특히, 본 발명의 대표적인 성분인 오쿠빈의 HBV 복제 억제효과를 세포배양분석(Cell culture assay)[Korba and Milman, Antiviral Res., 15:217-227(1991)]을 이용하여 수행함으로써, 본 발명의 효과를 확인하였으며, 다음 실시예로써 그 결과를 상세히 한다.

[실시예 1]

[오쿠빈의 HBV 복제 억제 효과]

1). 세포배양

2.2.15 세포계(2.2.15 cell line)는 5% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS), 2mM 글루타민 및 50μg/ml 겐타마이신 설페이트를 포함하는 RPMI1640 배양배지에서 보존되었다. 세포들을 통상적으로 G 418에 대한 저항성과 Mycoplasma 오염에 대해 조사하였다.

세포를 다수井조직배양평판(multi-well tissue culture plate)에 약 1x10⁴/의 농도로 접종하여 약 7일간 융합(Confluence)되도록 배양하여 HBV DNA 레벨(level)이 안정화되도록 2-3일간 융합상태로 세포를 유지하였다. 배양배지를 시료화합물에 노출되기 24시간전에 바꾸었다. 9일간의 처리기간 동안 24시간 간격으로 배지를 교체하였다.

시험화합물의 최초투여 직전 및 3, 6, 9일 후의 배양배지를 취하여 HBV DNA 분석을 위해 -70에서 저장하였다. 실험의 마지막에 세포들을 용해시키고 세포내(intracellular) HBV DNA를 분석하였다.

2). DNA 및 RNA 추출

세포외(extracellular) HBV DNA 분석을 위해 배양배지 시료 0.2ml를 취하여 1M NaOH/10xSSC(1xSSC=0.15M NaCl/).015M 소디움 시트레이트, pH 7.2)에서 25에서 20분간 숙성시키고, 곧바로 슬로트 블로트(slot blot) 장치를 이용하여 20xSSC에 미리 침지(soak)시킨 니트로셀룰로스 막에 적용하였다. 시료를 pH 7.2의 1M Tris/2M NaCl의 0.5ml로 2회, 20xSSC 0.5ml로 한 번 세척하여 중화시켰다. 다음, 필터를 2xSSC로 수세하고 진공에서 1시간 동안 80에서 가열하였다.

세포내 HBV DNA를 분석하기 위해, 세포를 井당 0.5ml 용해완충액(lysis buffer: 4M 구아니딘 이소티오시아네이트, 7% 2-머캅토에탄올 및 2% 사르코실)로 용해시키고 미세투석(microdialysis)장치를 이용하여 6liter의 50mM Tris, pH 8.0-1mM Na₂EDTA에 대하여 1시간 동안 투석시켰다. 용해물을 프로티네이즈(Proteinase) K로 침지시키고, 다시 10mM Tris, pH 8.0-1.0mM EDTA에서 현탁시켰다. 10cm 접시에 보존된 배양물을 6ml 용해완충액에 용해시키고, 세포의 RNA 와 DNA를 코르바 등(Korba et al., 1989)의 방법으로 제조하였다.

3). 겔 전기영동

세포 DNA 시료(10μg/lane)를 Hind III으로 온침(digestion)시키고 1% 아가로스겔에 전기영동시키고, 니트로셀룰로스막에 전이(transfer)시켰다. 비분획(unfractionated) 세포 RNA(30μg/lane)를 변성시키고, 6% 포름알데하이드/NaPO₄(pH 6.5)의 1% 아가로스겔에 전기영동시키고, 니트로셀룰로스막에 전이시켰다.

4). HBV DNA의 혼성교잡분석(Hybridization analysis)

순수한 3.2Kb EcoRI HBV DNA 분절을 [³²P]dCTP로 새김눈 해독(nick translation)을 이용하여 라벨(label)을 붙여서 혼성교잡 소식자(hybridization probe)로 이용하였다. 혼성교잡과 후-세척(post-washing)조건은 코르바 등(Korba et al., 1989)의 방법을 이용하였다. 시로의 HBV 핵산 레벨은 암비스 베타 스캐너(Ambis beta scanner)를 이용하여 측정하였다. 시료에 혼성교잡된³²P 시그날의 상대량은 각각의 니트로셀룰로스 필터(겔 또는 슬로트 블로트)에 적용된 HBV DNA 표준량에 혼성교잡하는 시그날양과 비교하였다. 표준화 곡선을 이용하여 상대적인 cpm 측정치를 HBV DNA양과 대비하였다.

세포내 및 세포외 HBV DNA의 레벨 측정에서는 고유 변이(inherent variation)를 고려하여, HBV virion DNA의 경우, 처리하지 않은 세포에 있어서의 HBV DNA 형성의 평균치의 3.5배 이상, 그리고 HBV DNA 복제중간체의 경우, 3.0배 이상의 억제만을 통계학적으로 의미있는 것으로 간주하였다(P0.05). 각 세포 DNA 제조에 있어서, 본 실험에서 각 세포 기저로 일정하게 남는 합성(integrated) HBV DNA의 레벨을 이용하여 세포내 HBV DNA 형성의 레벨을 계산하여, 블로트 혼성교잡분석(blot hybridization assay)의 기술적 고유변이를 제거하였다. 처리하지 않은 세포에서 세포외 HBV virion DAN의 전형적인 값은 50-150pg/ml 배양배지(평균 약 75pg/ml) 정도이며, 세포내 HBV DNA 복제중간체의 경우, 50-100pg/μg 세포 DNA(평균 약 74pg/ml)범위이다. 본 발명의 혼성교잡분석의 결과 1.0pg 세포내 HBV DNA/μg 세포 DNA는 세포당 2-3게놈복사(genome copy)에 해당하고 1.0pg 세포외 HBV DNA/ml 배양배지는 3x10⁵바이러스/ml에 해당하였다.

이상의 결과를 다음 표 1에 나타냈다.

*: 세포내 HBV DNA의 분석은 9일 처리후 24시간 동안에 행하였다.

#: virion HBV DNA에 대한 감응 감쇄(Sensitivity cut-off)는 0.1pg/ml이었다.

$: 30' GLY.;오쿠빈을 0.1M NaAcetate(pH 5)에서 37의 온도로 2.5mg/ml 글리코시다제 존재하에서 배양 배지에 가하기 전에 30분간 숙성시켰다(원용액을 100배 희석하여 배양 배지에서의 최종 글리코시다제의 농도는 25μg/ml이었음).

GLY.; 상기와 같이 오쿠빈을 혼합하였으나 배양물에 처리하기 전에 숙성시키지 않았다.

상기의 실험예에서 확인되는 바와 같이 본 발명의 이리도이드계 화합물은 HBV DNA에 대하여 우수한 복제억제 활성을 나타내며 따라서 본 발명의 약제는 간염의 예방과 치료에 사용될 수 있다.

[실시예 2]

[세포 독성 시험]

독성분석은 본 물질의 항바이러스 효과가 세포성장에 미치는 일반적인 영향 때문인지의 여부를 평가하기 위해 수행되었다. 이용한 방법은 HSV나 HVI 등 바이러스-숙주(host)의 다양한 관계에서 널리 사용되는 세포생존에 대한 표준조사법인 증성 붉은 염료(neutral red dye) 포획법이었다.

독성 성분은 96-井 조직 배양 평판에서 수행하였다. 세포는 실시예 1과 동일하게 배양되고, 시료 화합물로 처리되었다. 4가지 농도에서 3배수로 시료 화합물을 시험하였다. 염료의 포획정도를 이용하여 상대적인 독성 정도를 결정할 수 있으므로, 내부이행(internalized)된 염료의 흡수도(A₅₁₀)로써 정량분석을 하였다. 측정치를 시료 화합물로 처리하지 않은 9개의 대조군의 평균 A₅₁₀에 대한 백분율(±는 표준편차)로 나타냈다. 9개의 대조군의 염료 포획 백분률은 100±4이었다. 시험 결과 시료 화합물의 유효량의 범위에서는 거의 독성이 없는 것으로 나타났다.

그 결과를 다음 표 2에 나타냈다. 시료 화합물의 조성은 실시예 1과 동일하였다.

상기 표중, 30' GLY. ; 오쿠빈을 0.1M NaAcetate(pH 5)에서 37의 온도로 2.5mg/ml 글리코시다제 존재하에서 배양 배지에 가하기 전에 30분간 숙성시킨 것(원 용액을 100배 희석하여 배양 배지에서의 최종 글리코시다제의 농도는 25μg/ml이었음)이고, GLY.; 상기와 같이 오쿠빈을 혼합하였으나 배양물에 처리하기 전에 숙성시키지 않은 것이다.

[실시예 3]

[급성 독성 시험]

오쿠빈의 약리학적 활성에 관한 독성을 알아보기 위하여, 1회 복용량 각각 100, 300, 600, 900mg/kg으로 하여 마우스 복강내에 투여하고 24시간후의 치사여부를 관찰하였다. 그 결과는 아래의 표 3과 같다.

실험 결과, 각 투여량에 따른 치사는 나타나지 않았다. 즉, 마우스의 복강내 투여의 경우, 오쿠빈의 최소치사량은 900mg/kg 이상으로 나타났다. 한편, 높은 투여량의 경우 SGOT 및 알칼린 포스파타제의 활성이 미미한 정도의 감소를 보였고, 트리글리세리드 함량이 약간 증가하는데 그쳐, 오쿠빈 투여에 의한 혈청의 효소활성에도 심각한 영향이 없는 것으로 보인다.

다음에 본 발명의 제제실시예를 나타낸다.

[제제실시예 1]

[정제]

오쿠빈, 유당, 서당 및 아카시아고무를 혼합하고 적당량의 물을 가하고 연합하고 8호체로 쳐서 과립을 제조하고, 이 습윤과립을 40도에서 건조한후 분쇄하고 10호체를 통과시켜서 소과립으로 한후 탈크, 스테아린산 마그네슘을 가하여 혼합하고 타정한다.

[제제실시예 2]

[캡슐제]

상기 성분을 긴밀히 혼합하고 경질캡슐에 충진한다.

[제제실시예 3]

[주사제]

오쿠빈 50mg을 60도로 가온한 멸균생리식염수 5ml에 용해하고 무균적으로 바이알에 충진하고 밀전한다.

Claims

다음 구조식 (A)의 오쿠빈, 그 아그리콘 또는 약학적으로 허용되는 그 염을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 통상으로 사용되는 부형제 및 보조제를 함유하는 B형 간염 바이러스의 예방과 치료용 약학적 제제.