DE69332576T2 - Glykolisierte Cytokine - Google Patents
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Description
- Aufgrund der jüngsten Fortschritte in der Biotechnologie wurde eine große Zahl von Cytokinen isoliert und gereinigt. Da ihre Massenproduktion möglich wurde, erwartet man jetzt auch, dass sie Kandidatensubstanzen für neue Pharmaka sind. Es bleiben jedoch noch viele Probleme zu lösen, bevor diese Erwartung realisiert werden kann; dazu gehören die Entwicklung eines Zielsteuerungs- Wirkstoffabgabesystems für das gewünschte Cytokin. Das Cytokinverhalten in vivo streng zu steuern ist vermutlich ein Schlüssel zur Verstärkung therapeutischer Wirkungen und Reduzierung von Nebenwirkungen.
- Interferon, eine Art von Cytokin, ist zum Beispiel ein Protein, das verschiedene Bioaktivitäten besitzt, wie antivirale Aktivität und Hemmung des Zellwachstums. Für diese pharmakologische Wirkung wird Interferon verwendet, um eine große Zahl von Krankheiten zu behandeln, insbesondere chronische aktive Hepatitis B und C und Nierenkrebs. Da Interferon jedoch kaum zur Leber wandert, wenn es an den lebenden Körper verabreicht wird, und da es schnell wieder aus dem Körper ausgeschieden wird, ist es schwierig, eine effektive Interferonkonzentration in der Leber aufrechtzuerhalten. Damit eine Behandlung einer Leberkrankheit wirksam ist, ist aus diesem Grund eine Hochdosis-Langzeittherapie notwendig, was die Gefahr von Nebenwirkungen beinhaltet.
- Was den Wirkungsmechanismus von Interferon bei Hepatitis betrifft, wird zum Beispiel ein Wirkungsmechanismus von Interferon-α bei chronischer aktiver Hepatitis C beschrieben. Interferon wirkt angeblich direkt auf virusinfizierte Hepatocyten unter Aktivierung von intrahepatocytischer 2',5'-Oligoadenylat- Synthetase (2-5AS) zur Bildung von 2',5'-Oligoadenylat, das wiederum RNase aktiviert, die vom Virus stammende RNA zu lysieren, wodurch die Proteinsynthese gehemmt wird und damit die Vermehrung von Hepatitis-C-Virus unterdrückt wird [Barson, S.: Tex. Res. Bio. Med., Vol. 35, 1 (1977)].
- Bisher wurden fünf Typen von Hepatitisvirus, nämlich die Typen A bis E, entdeckt; unter diesen ist das Hepatitis-C-Virus (HCV), ein Virus des RNA-Typs, dessen Gen im Serum von posttransfusionalen Non-A-non-B-Hepatitis-Patienten gefunden wurde und gegen das es keine wirksame Therapie gibt. Hepatitis C ist durch das Einsetzen akuter Symptome und eine häufige chronische Manifestation bei Erwachsenen gekennzeichnet. Obwohl diese chronische Hepatitis langsam fortschreitet, tritt eine spontane Heilung nur sehr selten auf, und in vielen Fällen treten als schlimmes Ergebnis eine Leberzirrhose oder ein Hepatom auf. Andererseits ist die Massenproduktion von Interferonen möglich geworden, und von diesen Proteinen wurde gezeigt, dass sie in vitro eine antivirale Wirkung gegen HCV-verwandte Viren des RNA-Typs zeigen [Yasuyuki Ninomiyaa et al.: Clinical Report, 19, 231 (1985)] und dass sie eine prophylaktische Wirkung gegen virusinfizierte Mäuse haben [M. Kramer et al.: J. Interferon Res., 3, 425 (1983)], was eine klinische Wirkung auf Hepatitis C erwarten lässt. Tatsächlich haben rekombinantes Interferon-α und -β eine ausgezeichnete therapeutische Wirkung auf Hepatitis-C-Patienten [J. H. Hoofnagle et al.: N. Eng. J. Med., 315, 1575 (1986)], was einen positiven Ansatz für die Behandlung von chronischer Hepatitis ermöglicht, welche häufig negativ ist; sie werden jetzt verbreitet klinisch verwendet [Masami Yamanaka et al.: Journal of the Japanese Society of Internal Medicine, 79, 1037 (1990); Sadashi Shoji et al.: Japanese Journal of Gastroenterology, 88, 706 (1991)].
- Die Wirksamkeitsrate von Interferon bei Hepatitis C bleibt jedoch unbefriedigend, höchstens 40% [S. Kakuma et al.: Am. J. Gastroenterol., 85, 655 (1990); Hepatitis Study Group, KAN TAN SUI/Journal of Liver, Gall-bladder and Pancreas, 22, 491 (1991)]. Insbesondere in Fällen von hohen Virusgehalten, wie bei Patienten des HCV-II-Genotyps, ist die Wirksamkeitsrate nicht höher als 20% [K. Yoshioka et al.: Hepatology, 16, 293 (1982)]. Es könnte daher möglich sein, die Wirksamkeitsrate in diesen Fällen zu verbessern, indem man die Dosis erhöht oder die Verabreichungszeit verlängert. Außerdem erwartet man von den derzeitigen Niveaus der Interferondosis und Verabreichungszeit fast keine Wirkung in Fällen, bei denen eine chronische Hepatitis zu einer Leberzirrhose fortschreitet.
- Wenn es intravenös, intramuskulär oder subkutan verabreicht wird, wandert Interferon kaum zur Leber, dem Zielorgan, da es in Blut nur eine kurze Halbwertszeit hat; erhebliche Dosen sind erforderlich. Zu den Nebenwirkungen von Interferon gehören im Anfangsstadium grippeartige Symptome mit Fieber, Kopfschmerzen und allgemeinem Unwohlsein und einer Reduktion der Leukocyten und Blutplättchen, im mittleren Stadium anhaltendes leichtes Fieber, Appetitlosigkeit, Schlaflosigkeit und Neigungen zu Depressionen und im letzten Stadium Haarausfall und Schilddrüsenunterfunktion. Aus diesem Grund sollte selbst bei denjenigen Patienten, denen während einer erheblichen Zeitspanne eine ausreichende Interferondosis verabreicht werden sollte, um die gewünschte Medikamentenwirkung zu erhalten, die Medikamentengabe beim Einsetzen solcher Nebenwirkungen abgebrochen werden, oder die Dosis sollte gesenkt werden.
- EP-A-0 251 304 beschreibt Glycosylderivate mit einer Glycosylgruppe, die mit einem Linker an wenigstens eine primäre Aminogruppe eines Cytokins, wie Interferon-α, gebunden ist. Die Zahl der modifizierenden Gruppen wird jedoch nicht offenbart.
- Inzwischen schlägt die Japanische Offenlegungsschrift Nr. 152393/1988 vor, dass Polyethylenglycolderivate mit einer Zuckerkette verwendet werden können, um Cytokine zu modifizieren, und dass das resultierende modifizierte Protein verwendet werden kann, um die Cytokin-Nachhaltigkeit in vivo zu erhöhen oder die Cytokinabgabe an besondere Zellen oder Gewebe zu verbessern. Außerdem beschreibt die Japanische Offenlegungsschrift Nr. 211099/1992 ein Glycosyl- Proteinderivat, das als Träger für die selektive Wirkstoffabgabe an das Knochenmark oder Gehirn geeignet ist. Keine dieser Veröffentlichungen offenbart jedoch ein zuckermodifiziertes Cytokin, das für die selektive Cytokinabgabe an die Leber geeignet wäre.
- Otsubo et al. berichteten, dass eine Art zuckermodifiziertes Protein zur Leber wandert und in intrazellulärem Lysozym verdaut wird [Drug Delivery System, Vol. 6, 13-17 (1991)]. Die hepatische Orientierung dieses zuckermodifizierten Cytokins wird jedoch nicht offenbart.
- Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein zuckermodifiziertes Cytokin bereitzustellen, das die schnelle Wanderung fast der gesamten Cytokindosis zur Leber nach der Verabreichung an den lebenden Körper gewährleistet und das mit Vorteil verwendet werden kann, um die Wirkung der Therapie der Leberkrankheit zu verstärken und Nebenwirkungen zu reduzieren.
- Als Ergebnis einer intensiven Untersuchung der Möglichkeit, Cytokin schnell zur Leber wandern zu lassen, fanden die Erfinder heraus, dass man Cytokin schnell zur Leber wandern lassen kann, indem man es mit Zucker oder Zuckerkette modifiziert.
- Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein zuckermodifiziertes Cytokin bereit, das zwei bis fünf modifizierende Gruppen umfasst, die gleich oder verschieden sein können und die an primäre Aminogruppen eines Cytokins gebunden sind, das aus einem Interferon und Interleukin-2 ausgewählt ist, wobei die modifizierenden Gruppen durch die Formel (I) dargestellt werden:
- R-X- (I)
- wobei R eine Glycosylgruppe darstellt und X folgendes darstellt:
- wobei n eine beliebige positive ganze Zahl ist;
- -C&sub6;H&sub4;-NH-CS-,
- -S-CH&sub2;-CO-NH-CH&sub2;-CH&sub2;-,
- -O-CH&sub2;-CH&sub2;-,
- -CS-NH-C&sub6;H&sub3;(CH&sub3;)-NHCS-,
- -CO-(CH&sub2;)l-CO-
- wobei l eine ganze Zahl von 3 bis 6 ist;
- -CO-CH(OH)-CH(OH)-CO-,
- wobei Y -(CH&sub2;)&sub3;-,
- oder
- ist;
- wobei Z -(CH&sub2;)&sub3;-,
- -CO-NH oder
- ist.
- Fig. 1 zeigt die Ergebnisse einer Überwachung der zeitlichen Veränderungen des Serumspiegels von nichtmodifiziertem oder galactosemodifiziertem Interferon-αA nach der intravenösen Verabreichung von 3 · 10&sup6; Einheiten bei Ratten. O, , Δ und zeigen unmodifiziertes Interferon-αA, das in Beispiel 16 erhaltene galactosemodifizierte Interferon-αA, das in Beispiel 3 erhaltene galactosemodifizierte Interferon-αA bzw. das in Beispiel 1 erhaltene galactosemodifizierte Interferon-αA.
- Fig. 2 zeigt die Ergebnisse eines Experiments, bei dem die hepatische Migration von unmodifiziertem und galactosemodifiziertem Interferon-αA nach dem Rattenleber-Perfusionsverfahren bestimmt wurde. und zeigen ein unmodifiziertes Interferon-αA bzw. das in Beispiel 1 erhaltene galactosemodifizierte Interferon-αA.
- Fig. 3 zeigt die Ergebnisse einer Bestimmung der Aktivität von 2',5'-Oligoadenylat-Synthetase (2-5AS) nach der Verabreichung von unmodifiziertem oder galactosemodifiziertem Interferon-αA in die Primärkultur von Rattenhepatocyten. IFN und galIFN zeigen ein unmodifiziertes Interferon-αA bzw. das in Beispiel 1 erhaltene galactosemodifizierte Interferon-αA.
- Fig. 4 zeigt die Standardkurve für IFN-αA, die in dem im experimentellen Beispiel 4 beschriebenen in-vitro-Test der antiviralen Aktivität erhalten wurde.
- Fig. 5 zeigt die Ergebnisse einer Bestimmung der Aktivität von 2',5'-Oligoadenylat-(2-5A)-Synthetase in der Leber nach intraperitonealen Injektionen von unmodifiziertem Interferon-β (IFN β) oder galactosemodifiziertem IFN β für zwei aufeinanderfolgende Tage mit einer Dosis von 0,2 ug/Tag/Maus als IFN β in Mäuse. mIFN und Gal-mIFN zeigen ein unmodifiziertes Maus-IFN-β bzw. das in Beispiel 28 erhaltene galactosemodifizierte Maus-IFN-β.
- Fig. 6 zeigt die Ergebnisse einer Bestimmung der Aktivitat von 2',5'-Oligoadenylat-(2-5A)-Synthetase in der Leber nach intraperitonealen Injektionen von unmodifiziertem Interferon-β (IFN β) oder galactosemodifiziertem IFN β für zwei aufeinanderfolgende Tage mit einer Dosis von 1,0 ug/Tag/Maus als IFN β in Mäuse. mIFN und Gal-mIFN zeigen ein unmodifiziertes Maus-IFN-β bzw. das in Beispiel 28 erhaltene galactosemodifizierte Maus-IFN-β.
- Zu den Cytokinen für die vorliegende Erfindung gehören Interleukin-2, das erhältlich ist, indem man T-Zellen mit Antigen aktiviert, sowie Interferone, wie Interferon-γ (IFN-γ), das von T-Zellen erzeugt wird, Interferon-α (IFN-α), das von Mikrophagen erzeugt wird, und Interferon-β (IFN-β), das von Fibroblasten erzeugt wird.
- Von den oben genannten Cytokinen kann Interferon (das auch als IFN bezeichnet wird) ein Interferon vom α-Typ, β-Typ oder γ-Typ sein, wobei der α-Typ bevorzugt wird.
- Das IFN-α unterliegt keiner Einschränkung, solange es sich um eine Peptidsubstanz handelt, die IFN-α-Aktivität oder antivirale Aktivität besitzt. Zum Beispiel kann das IFN-α natürlich vorkommendes IFN-α oder durch Gentechnik erhaltenes IFN-α sein, wobei letzterem der Vorzug gegeben wird. Beispiele für durch Gentechnik erhaltenes IFN-α sind rIFN-αA, B, C, D, E, F, G, H, I und J (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 79897/1982 und Europäisches Patent Veröffentlichungs-Nr. 43 980). Das IFN-α kann auch ein Derivat sein, solange die wesentliche Aktivität erhalten bleibt. Zu diesen Derivaten gehören IFN-αA-Derivate, wobei die N-terminale Aminogruppe durch -COCH&sub3; oder -COCH&sub2;OH acyliert ist (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 41500/1988).
- Das IFN-γ unterliegt keiner Einschränkung, solange es sich um eine Peptidsubstanz handelt, die IFN-γ-Aktivität, d. h. antivirale Aktivität, sowie eine Immunsystem aktivierende Aktivität besitzt. Zum Beispiel kann es sich um natürlich vorkommendes IFN-γ oder durch Gentechnik erhaltenes IFN-γ handeln, wobei letzterem der Vorzug gegeben wird. Beispiele für durch Gentechnik erhaltenes IFN-γ sind solche, die nach dem in der Japanischen Offenlegungsschrift Nr. 90514/1983 beschriebenen Verfahren erhalten wurden, und solche, die nach dem in der Japanischen Offenlegungsschrift Nr. 186995/1984 beschriebener Verfahren erhalten wurden. Außerdem umfasst das IFN-γ auch Derivate davon, solange die wesentliche Aktivität erhalten bleibt.
- Außerdem kann das Interferon ein Mutein sein, das aus einer Änderung seiner partiellen Aminosäurezusammensetzung durch Deletion oder Ersatz durch andere Aminosäuren resultiert. Im Falle von IFN-γ umfassen solche Muteine Fragmente, denen eine bis mehrere Aminosäuren vom Aminoterminus und/oder Carboxyterminus fehlen. Zu diesen Fragmenten gehören solche, die aus der Deletion von Cys¹-Tyr²-Cys³ am N-Terminus von IFN-γ und einer bis 17 Aminosäuren oder Peptide vom C-Terminus der Peptidkette von Gly 130 bis Gln 146 am C-Terminus des IFN-γ resultieren (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 202899/1985), partielle Sequenzen von IFN-γ, die die Aminosäuresequenz 5- 127, 1-127 oder 5-146 umfassen (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 233100/ 1985), solche, die aus der Deletion von Cys-Tyr, Cys-Tyr-Cys oder Cys-Tyr-Cys- Gln am N-Terminus von IFN-γ oder einer bis 16 Aminosäuren oder Peptide vom C-Terminus der Peptidkette von Lys 131 bis Gln 146 am C-Terminus des IFN-γ resultieren (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 5096/1986), eine partielle Sequenz von IFN-γ, die die Aminosäuresequenz 1-131 umfasst (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 63295/1986), partielle Sequenzen von IFN-γ, die die Aminosäuresequenz 1-132 oder 1-133 umfassen [Arakawa et al.: J. Biol. Chem., 261, 8534 (1986)], eine partielle Sequenz von IFN-γ, die die Aminosäuresequenz 1-135 umfasst (The Third Annual International Congress for Interferon Research), solche, die aus der Deletion von Cys¹-Tyr²-Cys³-Gln&sup4;-Asp&sup5; am N-Terminus von IFN-γ und 0 bis 19 Aminosäuren oder Peptide vom C-Terminus der Peptidkette von Lys 128 bis Gln 146 am C-Terminus des IFN-γ resultieren (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 99399/1987), und solche, die aus der Deletion von Cys-Tyr-Cys oder Cys-Tyr-Cys-Gln am N-Terminus von IFN-γ und 18 bis 25 Peptiden vom C-Terminus der Peptidkette von Glu 122 bis Gln 146 am C- Terminus des IFN-γ resultieren (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 264500/ 1988).
- Das IL-2 kann eine Peptidsubstanz sein, solange es eine ähnliche Aktivität wie IL-2 besitzt; Beispiele dafür sind Substanzen, die eine Subkultur von T-Zellen ermöglichen, während sie ihre Funktion aufrechterhalten. Insbesondere kann es sich um das Polypeptid (I) (humanes IL-2), das die in Fig. 1 der Japanischen Offenlegungsschrift Nr. 78799/1986 (äquivalent zu EP-A-0 176 299) gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, oder ein Fragment davon, das eine partielle Aminosäuresequenz umfasst, die für seine biologische oder immunologische Aktivität wesentlich ist, handeln. Zu diesen Fragmenten gehören solche, die aus der Deletion einer Aminosäure (EPC Veröffentlichungs-Nr. 91539) oder von vier Aminosäuren (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 126088/1985) vom Aminoterminus von Polypeptid (I) resultieren, und solche, die aus der Deletion mehrerer Aminosäuren vom Carboxyterminus resultieren. Das Fragment kann auch eines sein, bei dem eine oder mehrere Aminosäurekomponenten des Polypeptids (I) deletiert oder durch andere Aminosäuren ersetzt wurden, z. B. eines, bei dem der Cysteinrest auf Position 125 durch einen Serinrest ersetzt wurde (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 93093/1984, äquivalent zu US-Patent Nr. 4,518,584).
- Insbesondere wird in der vorliegenden Erfindung vorzugsweise ein humanes IL-2 verwendet, das die in Fig. 1 der Japanischen Offenlegungsschrift Nr. 78799/ 1986 (äquivalent zu EP-A-0 176 299) gezeigte Aminosäuresequenz hat. In diesem Fall kann es sich bei dem humanen IL-2 um ein Gemisch aus einem, das am Aminoterminus einen zusätzlichen Methioninrest (Met) aufweist, und einem anderen, dem dieser fehlt (Japanische Offenlegungsschriften Nr. 115528/1985 und 78799/1986), oder um eines, das kein Met am Aminoterminus aufweist und mit Alanin (Ala) beginnt (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 78799/1986), handeln.
- Zu den primären Aminogruppen von Cytokin gehören die α-Aminosäure der N- terminalen Aminosäure oder die ε-Aminogruppe eines Lysinrestes.
- Bezüglich der obigen Formel (I) wird X vorzugsweise durch
- oder
- C&sub4;H&sub4;-NH-CS-
- besonders bevorzugt
- dargestellt.
- Außerdem beträgt die für n in der obigen Formel (I) willkürlich gewählte positive ganze Zahl vorzugsweise nicht mehr als 10, besonders bevorzugt 1 bis 3.
- Die Glycosylgruppe in Formel (I) der vorliegenden Erfindung kann ein Monosaccharid oder ein Polysaccharid sein. Zu diesen Glycosylgruppen gehören Glycofuranosyl-, Glycopyranosyl- und Glycoseptanosylgruppen, wobei die Glvcopvranosylgruppe bevorzugt ist.
- Beispiele für das Monosaccharid sind Gruppen, die Aldohexose umfassen, wie die Galactopyranosylgruppe, die Mannopyranosylgruppe, die Glucopyranosylgruppe und die Fucopyranosylgruppe, Gruppen, die Hexosamin umfassen, wie die 2- Amino-2-Desoxygalactopyranosylgruppe, die 2-Amino-2-desoxymannopyranosylgruppe, die 2-Amino-2-desoxyglucopyranosylgruppe und die 2-Amino-2-desoxyfucopyranosylgruppe, sowie Gruppen, die ein Hexosaminderivat umfassen, wie die 2-Acetamid-2-desoxygalactopyranosylgruppe, die 2-Acetamid-2-desoxymannopyranosylgruppe, die 2-Acetamid-2-desoxyglucopyranosylgruppe und die 2-Acetamid-2-desoxyfucopyranosylgruppe. Bevorzugte Monosaccharide sind die Galactopyranosylgruppe, die Mannopyranosylgruppe, die 2-Acetamid-2-desoxygalactopyranosylgruppe und die 2-Acetamid-2-desoxymannopyranosylgruppe, wobei die Galactopyranosylgruppe und die 2-Acetamid-2-desoxygalactopyranosylgruppe besonders bevorzugt sind.
- Das Polysaccharid kann ein beliebiges sein, solange es ein Monosaccharid, wie es oben beschrieben ist, als terminale Monosaccharideinheit-Komponente (nichtreduzierter Terminus) aufweist, und die anderen Monosaccharid-Komponenten als das terminale Monosaccharid können beliebige sein, solange sie in der Lage sind, Polysaccharide zu bilden. Außerdem kann die Glycosidbindung zwischen Monosacchariden vom α- oder vom β-Typ sein. In diesem Zusammenhang ist die terminale Monosaccharideinheit-Komponente der Glycosylgruppe, die ein. Polysaccharid umfasst, eine Monosaccharideinheit-Komponente auf der Seite, die der Bindung gegenüberliegt. Zum Beispiel im Falle eines Polysaccharids mit einer Galactopyranosylgruppe als terminalem Monosaccharid ist das Polysaccharid eine Galactopyranosyl-Glycosylgruppe. Im Falle eines Polysaccharids mit einer 2- Acetamid-2-desoxygalactopyranosylgruppe als terminalem Monosaccharid ist das Polysaccharid eine (2-Acetamid-2-desoxygalactopyranosyl)glycosylgruppe.
- Bei dem zuckermodifizierten Cytokin der vorliegenden Erfindung bindet die modifizierende Gruppe, die eine Zuckerkette aufweist, an ein primäres Amin des Cytokins. Beispiele für das primäre Amin sind die α-Aminogruppe der N-terminalen Aminosäure oder die ε-Aminogruppe eines Lysinrestes.
- In dem zuckermodifizierten Cytokin der vorliegenden Erfindung können die Zuckerkette und das Cytokin nach einem bekannten Modifikationsverfahren chemisch gebunden werden. Ein Verfahren zur Herstellung des zuckermodifizierten Cytokins der vorliegenden Erfindung ist wie folgt:
- (a) Umsetzen der Verbindung, die durch die Formel
- dargestellt wird, wobei R und n dasselbe wie oben bedeuten und Z ein Niederalkyl (z. B. Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl) ist, mit einem Cytokin;
- (b) Umsetzen der Verbindung, die durch die Formel
- dargestellt wird, wobei R dasselbe wie oben bedeutet, mit einem Cytokin;
- (c) Umsetzen der Verbindung, die durch die Formel
- R-C&sub6;H&sub4;-N=C=S
- dargestellt wird, wobei R dasselbe wie oben bedeutet, mit einem Cytokin;
- (d) Umsetzen der Verbindung, die durch die Formel
- R-S-CH&sub2;-CO-NHCH&sub2;-CHO
- dargestellt wird, wobei R dasselbe wie oben bedeutet, mit einem Cytokin;
- (e) Umsetzen der Verbindung, die durch die Formel
- R-O-CH&sub2;-CHO
- dargestellt wird, wobei R dasselbe wie oben bedeutet, mit einem Cytokin;
- (f) Umsetzen der Verbindung, die durch die Formel
- dargestellt wird, wobei R dasselbe wie oben bedeutet, mit einem Cytokin;
- (g) Umsetzen der Verbindung, die durch die Formel
- R-CO-(CH&sub2;)l-CHO
- dargestellt wird, wobei R und l dasselbe wie oben bedeuten, mit einen Cytokin;
- (h) Umsetzen der Verbindung, die durch die Formel
- dargestellt wird, wobei R dasselbe wie oben bedeutet, mit einem Cytokin;
- (i) Umsetzen der Verbindung, die durch die Formel
- R-CO-(CH&sub2;)&sub2;-SH
- dargestellt wird, wobei R dasselbe wie oben bedeutet, mit einem maleinimidierten Cytokin
- wobei Y = -(CH&sub2;)3-,
- oder
- ist;
- (j) Umsetzen der Verbindung, die durch die Formel
- dargestellt wird, wobei R dasselbe wie oben bedeutet, mit einem malein- imidierten Cytokin
- wobei Y = -(CH&sub2;)&sub3;-,
- oder
- ist;
- (k) Umsetzen der Verbindung, die durch die Formel
- R-COOH
- dargestellt wird, wobei R dasselbe wie oben bedeutet, mit einem Cytokin; oder
- (l) Umsetzen der Verbindung, die durch die Formel
- dargestellt wird, wobei R dasselbe wie oben bedeutet, mit einem Cytokin.
- Im Einklang mit dem Verfahren von Lee et al. wird zum Beispiel das Cyanmethyl-1-thioglycosid des oben genannten Monosaccharids in Methanol in Gegenwart von Natriummethoxid umgesetzt, was 2-Imino-2-methoxyethyl-1-thioglycosid, eine aktive Zwischenstufe, ergibt. Diese aktive Zwischenstufe wird dann mit dem Cytokin umgesetzt, so dass es Aminosäurereste des Cytokins, hauptsächlich aminofunktionelle Gruppen, über eine Imidbindung bindet, was das gewünschte zuckermodifizierte Cytokin ergibt [Biochemistry, Vol. 15, 3956-3963 (1976)]. Außerdem kann das gewünschte zuckermodifizierte Cytokin auch durch Verwendung eines Cyanalkyl-1-thioglycosids, wie Cyanethyl-1-thioglycosid oder Cyanpropyl-1-thioglycosid, sowie des oben genannten Cyanmethyl-1-thioglycosids erhalten werden. Selbst wenn der Zucker ein Polysaccharid ist, kann das gewünschte zuckermodifizierte Cytokin im Einklang mit dem oben genannten Verfahren von Lee et al. erhalten werden.
- Wenn X durch
- dargestellt wird, können die Zuckerkette und das Cytokin zur Modifikation des Cytokins zum Beispiel nach einem Verfahren chemisch gebunden werden, bei dem Lactose, ein Disaccharid, das Galactose und Glucose umfasst, reduktiv mit Cyanborhydrid aminiert wird, um es mit einer primären Aminogruppe an das Cytokinmolekül zu binden [B. A. Schwartz et al.: Arch. Biochem. Biophys., 181, 542 (1977); L. Fiume et al.: FEBS Lett., 146, 42 (1982)]. Außerdem kann das zuckermodifizierte Cytokin der vorliegenden Erfindung auch dann, wenn R eine Nichtgalactose ist, im Einklang mit diesem Verfahren erhalten werden.
- Wenn X durch
- -C&sub6;H&sub4;-NH-CS-
- dargestellt wird, können die Zuckerkette und das Cytokin zur Modifikation des Cytokins zum Beispiel nach einem Verfahren chemisch gebunden werden, bei dem Isothiocyanatophenyl-β-galactopyranosid mit einer primären Aminogruppe am Cytokinmolekül gekoppelt wird [M. Monsigny et al.: Biol. Cell, 51, 187 (1984)]. Außerdem kann das zuckermodifizierte Cytokin der vorliegenden Erfindung auch dann, wenn R eine Nichtgalactose ist, im Einklang mit diesem Verfahren erhalten werden.
- Wenn X durch
- -S-CH&sub2;-CO-NH-CH&sub2;-CH&sub2;-
- dargestellt wird, können die Zuckerkette und das Cytokin zur Modifikation des Cytokins nach dem Verfahren chemisch gebunden werden, das in R. T. Lee & Y. C. Lee: Biochem., 19, 156 (1980), beschrieben ist.
- Wenn X durch
- -O-OH&sub2;-CH&sub2;-
- dargestellt wird, können die Zuckerkette und das Cytokin zur Modifikation des Cytokins nach dem Verfahren chemisch gebunden werden, das in J. Bogwald et al.: Carbohydr. Res., 148, 101 (1986), beschrieben ist.
- Wenn X durch
- -CS-NH-C&sub6;H&sub3;(CH&sub3;)-NHCS-
- dargestellt wird, können die Zuckerkette und das Cytokin zur Modifikation des Cytokins nach dem Verfahren chemisch gebunden werden, das in J. C. Rogers & S. Kanfeld: Biochem. Biophys. Res. Commun., 45, 622 (1971), beschrieben ist.
- Wenn X durch
- -CO-(CH&sub2;)n-CO-
- dargestellt wird, können die Zuckerkette und das Cytokin zur Modifikation des Cytokins nach dem Verfahren chemisch gebunden werden, das in S. Avrameas et al.: Immunochem., 6, 43 (1969), oder in M. Tiemeyer et al.: J. Biol. Chem., 264, 1671 (1989), beschrieben ist.
- Wenn X durch
- -CO-CH(OH)-CH(OH)-CO-
- dargestellt wird, können die Zuckerkette und das Cytokin zur Modifikation des Cytokins nach dem Verfahren chemisch gebunden werden, das in J. Biol. Chem., 261, 205 (1986), beschrieben ist.
- Wenn X durch
- dargestellt wird, können die Zuckerkette und das Cytokin zur Modifikation des Cytokins nach dem Verfahren chemisch gebunden werden, das in E. Ishikawa et al.: J. Immunoassay 4, 209 (1983), beschrieben ist.
- Wenn X durch
- dargestellt wird, können die Zuckerkette und das Cytokin zur Modifikation des Cytokins nach dem Verfahren chemisch gebunden werden, das in E. Ishikawa et al.: J. Immunoassay 4, 209 (1983), beschrieben ist.
- Wenn X durch
- -CO-NH- oder
- dargestellt wird, können die Zuckerkette und das Cytokin zur Modifikation des Cytokins nach dem Verfahren chemisch gebunden werden, das in B. F. Erlanger: Methods in Enzymology, 70, 85 (1981), oder in G. W. Anderson et al.: J. Am. Chem. Soc., 85, 1493 (1964), beschrieben ist.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung hat das als Ausgangsmaterial verwendete Cytokin eine N-terminale Aminogruppe, und ein oder mehrere Lysinreste sind in dem Cytokin vorhanden, und eine oder mehrere ε-Aminogruppen davon, vorzugsweise etwa 5 bis 80% (Durchschnitt), besonders bevorzugt etwa 10 bis 50% (Durchschnitt), der ε-Aminogruppen haben eine Gruppe, die durch Formel (I) dargestellt wird. In diesem Fall kann die N-terminale α-Aminogruppe eine durch Formel (I) dargestellte Gruppe aufweisen oder auch nicht. Wenn es sich bei dem Cytokin um Interferon-α handelt, beträgt die Zahl der durch Formel (I) dargestellten modifizierenden Gruppen 2 bis 5 Moleküle, vorzugsweise 4 Moleküle, pro Interferon-α-Molekül. Auch wenn es sich bei dem Cytokin um Interleukin-2 handelt, beträgt die Zahl der durch Formel (I) dargestellten modifizierenden Gruppen 2 bis 5 Moleküle pro Interleukin-2-Molekül. Der Grad der Modifikation kann eingestellt werden, indem man das Stoffmengenverhältnis von modifizierenden Gruppen zum Cytokin in der obigen Reaktion ändert oder indem man die Reaktionskonzentrationen des Cytokins und der modifizierenden Gruppen ändert. Der Modifikationsgrad kann nach dem Schwefelsäure-Phenol-Verfahren [J. F. McKelvy und Y. C. Lee: Arch. Biochem. Biophys., 132, 99 (1969)] und/oder durch Aminosäureanalyse quantitativ bestimmt werden.
- Das Lösungsmittel, das für die Reaktion des Cytokins und einer modifizierenden Gruppe, die einen Zucker oder eine Zuckerkette aufweist, verwendet wird, unterliegt keiner Einschränkung, solange es die Reaktion nicht stört. Zu diesen Lösungsmitteln gehören Puffer, wie Phosphatpuffer, Boratpuffer, Tris-Puffer und Acetatpuffer. Außerdem können organische Lösungsmittel, wie niedere Alkanole (z. B. Methanol, Ethanol, Isopropanol), Acetonitril, Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid, hinzugefügt werden, solange sie das Cytokin nicht inaktivieren oder die Reaktion stören. Obwohl der pH-Wert der Reaktion über einen weiten Bereich von etwa 3 bis 14 ausgewählt werden kann, ist eine schwache Alkalinität zwischen etwa pH 7 und 9 wünschenswert. Der Modifikationsgrad des zuckermodifizierten Cytokins kann auch eingestellt werden, indem man den pH-Wert der Reaktion ändert. Obwohl die Reaktionstemperatur beliebig sein kann, solange sie nicht zu einer Denaturierung des Cytokins führt, wird sie vorzugsweise zwischen etwa 0ºC und 40ºC eingestellt. Die Reaktionszeit beträgt etwa 3 bis 72 Stunden, wobei befriedigende Ergebnisse in etwa 24 bis 30 Stunden Reaktion erhalten werden. Das Reaktionsgemisch kann durch übliche Proteinreinigungsverfahren, wie Dialyse, Aussalzen, Ultrafiltration, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, HPLC (high performance liquid chromatography) und Elektrophorese, zum gewünschten zuckermodifizierten Cytokin aufgereinigt werden.
- Da die Struktur des Cytokins höherer Ordnung für die Expression seiner Bioaktivitäten wichtig ist, besitzt das zuckermodifizierte Cytokin der vorliegenden Erfindung geeignete Bioaktivitäten wie das entsprechende unmodifizierte Cytokin und wird so modifiziert, dass vorzugsweise über 60%, besonders bevorzugt über 80%, Bioaktivitäten erhalten bleiben.
- Die Bioaktivitäten von Cytokinen, die mit Zuckerketten modifiziert sind, können mit verschiedenen Verfahren bewertet werden. Wenn das Cytokin zum Beispiel ein Interferon ist, kann seine antivirale Wirkung in vitro durch die Technik bewertet werden, bei der MDBK-Zellen (Madin-Darby-Rindernierenzellen) mit VSV (vesikuläres Stomatitisvirus) infiziert und in An- oder Abwesenheit des Interferons kultiviert werden und anschließend die cytopathische Wirkung (CPE) nach dem Neutralrotverfahren bestimmt wird [M. Rubinstein et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 640 (1979); R. K. Maheshwari und R. M. Friedman: Virol., 101, 399 (1980)]. Außerdem kann die Wirkung auf die 2-5AS-Aktivität nach einem herkömmlichen Verfahren bestimmt werden, bei dem man einen kommerziell erhältlichen 2-5A-Kit (Eiken Chemical Co., Ltd.) verwendet. Weiterhin können bei in vivo durchgeführten Leberzielsteuerungsexperimenten Blut- und Gewebe- Interferonkonzentrationen bei Versuchstieren mit einem bekannten Immunoassayverfahren (WO 82/01773) oder mit dem oben beschriebenen Test der antiviralen Aktivität oder dem 2,5-AS-Aktivitätstest bestimmt werden.
- Das zuckermodifizierte Cytokin der vorliegenden Erfindung ist durch eine schnellere Entfernung aus dem Serum und eine schnellere Wanderung zur Leber im Vergleich zu dem entsprechenden bekannten unmodifizierten Cytokin gekennzeichnet.
- Das zuckermodifizierte Cytokin der vorliegenden Erfindung kann Säugern (z. B. Affen, Hunden, Schweinen, Kaninchen, Mäusen, Ratten, Menschen) oral oder nichtoral in Form von geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzungen (z. B. Kapseln, injizierbaren Lösungen) zusammen mit bekannten Trägern, Verdünnungsmitteln und anderen Additiven verabreicht werden.
- Das zuckermodifizierte Cytokin der vorliegenden Erfindung bietet bei niedrigen Dosen eine therapeutische Wirkung, da es effizient zum Zielorgan transportiert wird. Mit diesem Merkmal hat das zuckermodifizierte Cytokin der vorliegenden Erfindung nur wenige Nebenwirkungen, wie Fieber und Schüttelfrost, und eine geringe Toxizität und kann daher unbedenklicher mit ähnlichen Verfahren für dieselben Zwecke verwendet werden wie bekannte unmodifizierte Cytokine.
- Zum Beispiel wird das zuckermodifizierte rekombinante Interferon-γ (rIFN-γ) der vorliegenden Erfindung als Pharmakon für antivirale, antitumorale Wirkung und für die Hemmung des Zellwachstums und Immunopotenzierung verwendet. In diesem Fall wird es durch intravenöse oder intramuskuläre Injektion in einer Tagesdosis von 100 000 bis 100 000 000 Einheiten rIFN-γ bei jedem Erwachsenen verabreicht.
- Das zuckermodifizierte rekombinante Interferon-αA (rIFN-αA) der vorliegenden Erfindung wird als Pharmakon für die antitumorale oder antivirale Therapie verwendet. In diesem Fall kann es dem Patienten in einer Dosis von etwa (0,1 bis 10) · 10&sup5; Einheiten/Tag von rIFN-αA injiziert werden.
- Wenn es zum Beispiel erwachsenen humanen Patienten mit Hepatitis B oder C intravenös injiziert wird, wird es in einer Menge von etwa (0,1 bis 100) · 10&sup5; Einheiten rIFNαA täglich, vorzugsweise etwa (0,5 bis 30) · 10&sup5; Einheiten rIFNαA täglich, verwendet.
- Das zuckermodifizierte rekombinante Interleukin-2 (rIL-2) der vorliegenden Erfindung wird als Pharmakon für die antitumorale Therapie verwendet. In diesem Fall kann es dem Patienten in einer Dosis von etwa (0,01 bis 1,0) · 400 000 Einheiten/Tag rIL-2 injiziert werden.
- Wenn es Säugern verabreicht wird, verschwindet das zuckermodifizierte Cytokin der vorliegenden Erfindung viel schneller aus dem Serum und wandert schneller zur Leber als unmodifiziertes Cytokin. Überdies wandert das zuckermodifizierte Cytokin der vorliegenden Erfindung meistens zur Leber, während unmodifiziertes Cytokin kaum zur Leber wandert. Das zuckermodifizierte Cytokin der vorliegenden Erfindung kann daher mit Vorteil verwendet werden, um die Wirkung der Therapie einer Leberkrankheit zu verstärken.
- Die vorliegende Erfindung wird im folgenden ausführlicher anhand der folgenden Arbeitsbeispiele und experimentellen Beispiele beschrieben, die nicht als einschränkend angesehen werden sollen.
- 1,0 g Cyanmethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranosid, das Cyanmethylthioglycosid von Galactose, wurden in 25 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 48,5 ul Natriummethoxid (28% in Methanollösung, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) gegeben, und anschließend erfolgte eine Reaktion bei Raumtemperatur während 48 Stunden unter Rühren. Eine 5-ml- Portion dieser Methanollösung wurde in einen eiförmigen Kolben gegeben, und das Methanol wurde unter Verwendung eines Verdampfers (SIBATA, BUCHI RE111) gründlich verdampft. Zu dem resultierenden trockenen Reaktionsprodukt 2-Imino-2-methoxyethyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurde 1 ml rekombinantes Interferon-αA (rIFN-αA) in einer Menge von 3,3 mg/ml, pH 8,2 (0,1 M Phosphatpuffer), gegeben. Nach 24 Stunden Reaktion bei Raumtemperatur wurden 100 ul einer 1 M wässrigen Essigsäurelösung hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Das nicht umgesetzte Galactopyranosid wurde unter Verwendung einer Gelsäule PD-10 (hergestellt von Pharmacia) entfernt, während der Puffer durch phosphatgepufferte Kochsalzlösung ersetzt wurde.
- So wurden 3,0 mg galactosemodifiziertes rIFN-αA erhalten, wobei die Zahl der an jedes Interferonmolekül gebundenen Galactosemoleküle 10 betrug. Die Proteingehalte und Gehalte an modifizierender Galactose wurden nach dem Pierce- BCA-Verfahren (BCA-Proteinassayreagens, hergestellt von der Pierce Company) bzw. durch Aminosäureanalyse bestimmt.
- 100 mg Cyanmethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurden in 2,5 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 4,9 ul Natriummethoxid (28% in Methanollösung, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) gegeben, und anschließend erfolgte eine Reaktion bei Raumtemperatur während 72 Stunden unter Rühren. Eine 450-ul-Portion dieser Methanollösung wurde in ein Reagenzglas gegeben, und das Methanol wurde unter Verwendung eines Stickstoffstroms gründlich verdampft. Zu dem resultierenden trockenen Reaktionsprodukt 2-Imino-2-methoxyethyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurde 1 ml rIFN-αA in einer Menge von 6,25 mg/ml, pH 6,5 (0,1 M Phosphatpuffer), gegeben. Nach 30 Stunden Reaktion bei Raumtemperatur wurden 100 ul einer 1 M wässrigen Essigsäurelösung hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Das nicht umgesetzte Galactopyranosid wurde unter Verwendung einer Gelsäule PD- 10 (hergestellt von Pharmacia) entfernt, während der Puffer durch einen 25 mM Ammoniumacetatpuffer, der 0,13 M NaCl enthielt, pH 5,5, ersetzt wurde.
- So wurden 4,8 mg galactosemodifiziertes rIFN-αA erhalten, wobei die Zahl der an jedes Interferonmolekül gebundenen Galactosemoleküle 3, 3 betrug. Die Proteingehalte und Gehalte an modifizierender Galactose wurden nach dem Pierce- BCA-Verfahren (BCA-Proteinassayreagens, hergestellt von der Pierce Company) bzw. dem Schwefelsäure-Phenol-Verfahren bestimmt.
- 100 mg Cyanmethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurden in 2,5 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 4,9 ul Natriummethoxid (28% in Methanollösung, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) gegeben, und anschließend erfolgte eine Reaktion bei Raumtemperatur während 72 Stunden unter Rühren. Eine 450-ul-Portion dieser Methanollösung wurde in ein Reagenzglas gegeben, und das Methanol wurde unter Verwendung eines Stickstoffstroms gründlich verdampft. Zu dem resultierenden trockenen Reaktionsprodukt 2-Imino-2-methoxyethyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurde 1 ml rIFN-αA in einer Menge von 6,25 mg/ml, pH 7,0 (0,1 M Phosphatpuffer), gegeben. Nach 30 Stunden Reaktion bei Raumtemperatur wurden 100 ul einer 1 M wässrigen Essigsäurelösung hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Das nicht umgesetzte Galactopyranosid wurde unter Verwendung einer Gelsäule PD- 10 entfernt, während der Puffer durch einen 25 mM Ammoniumacetatpuffer, der 0,13 M NaCl enthielt, pH 5,5, ersetzt wurde.
- So wurden 5,2 mg galactosemodifiziertes rIFN-αA erhalten, wobei die Zahl der an jedes Interferonmolekül gebundenen Galactosemoleküle 3,8 betrug. Die Proteingehalte und Gehalte an modifizierender Galactose wurden nach dem Pierce- BCA-Verfahren (BCA-Proteinassayreagens, hergestellt von der Pierce Company) bzw. dem Schwefelsäure-Phenol-Verfahren bestimmt.
- 100 mg Cyanmethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurder in 2,5 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 4,9 ul Natriummethoxic (28% in Methanollösung, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) gegeben, und anschließend erfolgte eine Reaktion bei Raumtemperatur während 72 Stunden unter Rühren. Eine 450-ul-Portion dieser Methanollösung wurde in ein Reagenzglas gegeben, und das Methanol wurde unter Verwendung eines Stickstoffstroms gründlich verdampft. Zu dem resultierenden trockenen Reaktionsprodukt 2-Imino-2-methoxyethyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurde 1 ml rIFN-αA in einer Menge von 6,25 mg/ml, pH 7,5 (0,1 M Phosphatpuffer), gegeben. Nach 30 Stunden Reaktion bei Raumtemperatur wurden 100 ul einer 1 M wässrigen Essigsäurelösung hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Das nicht umgesetzte Galactopyranosid wurde unter Verwendung einer Gelsäule PD- 10 entfernt, während der Puffer durch einen 25 mM Ammoniumacetatpuffer, der 0,13 M NaCl enthielt, pH 5,5, ersetzt wurde.
- So wurden 5,6 mg galactosemodifiziertes rIFN-αA erhalten, wobei die Zahl der an jedes Interferonmolekül gebundenen Galactosemoleküle 5,3 betrug. Die Proteingehalte und Gehalte an modifizierender Galactose wurden nach dem Pierce- BCA-Verfahren (BCA-Proteinassayreagens, hergestellt von der Pierce Company) bzw. dem Schwefelsäure-Phenol-Verfahren bestimmt.
- 100 mg Cyanmethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurden in 2,5 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 4,9 ul Natriummethoxid (28% in Methanollösung, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) gegeben, und anschließend erfolgte eine Reaktion bei Raumtemperatur während 72 Stunden unter Rühren. Eine 450-ul-Portion dieser Methanollösung wurde in ein Reagenzglas gegeben, und das Methanol wurde unter Verwendung eines Stickstoffstroms gründlich verdampft. Zu dem resultierenden trockenen Reaktionsprodukt 2-Imino-2-methoxyethyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurde 1 ml rIFN-αA in einer Menge von 6,25 mg/ml, pH 8,1 (0,1 M Phosphatpuffer), gegeben. Nach 30 Stunden Reaktion bei Raumtemperatur wurden 100 ul einer 1 M wässrigen Essigsäurelösung hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Das nicht umgesetzte Galactopyranosid wurde unter Verwendung einer Gelsäule PD- 10 entfernt, während der Puffer durch einen 25 mM Ammoniumacetatpuffer, der 0,13 M NaCl enthielt, pH 5,5, ersetzt wurde.
- So wurden 5,8 mg galactosemodifiziertes rIFN-αA erhalten, wobei die Zahl der an jedes Interferonmolekül gebundenen Galactosemoleküle 5,8 betrug. Die Proteingehalte und Gehalte an modifizierender Galactose wurden nach dem Pierce- BCA-Verfahren (BCA-Proteinassayreagens, hergestellt von der Pierce Company) bzw. dem Schwefelsäure-Phenol-Verfahren bestimmt.
- 100 mg Cyanmethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurden in 2,5 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 4,9 ul Natriummethoxid (28% in Methanollösung, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) gegeben, und anschließend erfolgte eine Reaktion bei Raumtemperatur während 72 Stunden unter Rühren. Eine 450-ul-Portion dieser Methanollösung wurde in ein Reagenzglas gegeben, und das Methanol wurde unter Verwendung eines Stickstoffstroms gründlich verdampft. Zu dem resultierenden trockenen Reaktionsprodukt 2-Imino-2-methoxyethyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurde 1 ml rIFN-αA in einer Menge von 6,25 mg/ml, pH 8,7 (0,1 M Phosphatpuffer), gegeben. Nach 30 Stunden Reaktion bei Raumtemperatur wurden 100 ul einer 1 M wässrigen Essigsäurelösung hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Das nicht umgesetzte Galactopyranosid wurde unter Verwendung einer Gelsäule PD- 10 entfernt, während der Puffer durch einen 25 mM Ammoniumacetatpuffer, der 0,13 M NaCl enthielt, pH 5,5, ersetzt wurde.
- So wurden 5,0 mg galactosemodifiziertes rIFN-αA erhalten, wobei die Zahl der an jedes Interferonmolekül gebundenen Galactosemoleküle 6,8 betrug. Die Proteingehalte und Gehalte an modifizierender Galactose wurden nach dem Pierce- BCA-Verfahren (BCA-Proteinassayreagens, hergestellt von der Pierce Company) bzw. dem Schwefelsäure-Phenol-Verfahren bestimmt.
- 1,0 g Cyanmethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurden in 25 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 50 ul Natriummethoxid (28% in Methanollösung, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) gegeben, und anschließend erfolgte eine Reaktion bei Raumtemperatur während 72 Stunden unter Rühren. Eine 4,0-ml-Portion dieser Methanollösung wurde in ein Reagenzglas gegeben, und das Methanol wurde unter Verwendung eines Stickstoffstroms gründlich verdampft. Zu dem resultierenden trockenen Reaktionsprodukt 2- Imino-2-methoxyethyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurde 1 ml rIFN-αA in einer Menge von 6,25 mg/ml, pH 6,5 (0,1 M Phosphatpuffer), gegeben. Nach 24 Stunden Reaktion bei Raumtemperatur wurden 100 ul einer 1 M wässrigen Essigsäurelösung hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Das nicht umgesetzte Galactopyranosid wurde unter Verwendung einer Gelsäule PD-10 entfernt, während der Puffer durch einen 25 mM Ammoniumacetatpuffer, der 0,13 M NaCl enthielt, pH 5,5, ersetzt wurde.
- So wurden 6,4 mg galactosemodifiziertes rIFN-αA erhalten, wobei die Zahl der an jedes Interferonmolekül gebundenen Galactosemoleküle 9,5 betrug. Die Proteingehalte und Gehalte an modifizierender Galactose wurden nach dem Pierce- BCA-Verfahren (BCA-Proteinassayreagens, hergestellt von der Pierce Company) bzw. dem Schwefelsäure-Phenol-Verfahren bestimmt.
- 1,0 g Cyanmethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurden in 25 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 50 ul Natriummethoxid (28% in Methanollösung, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) gegeben, und anschließend erfolgte eine Reaktion bei Raumtemperatur während 72 Stunden unter Rühren. Eine 4,0-ml-Portion dieser Methanollösung wurde in ein Reagenzglas gegeben, und das Methanol wurde unter Verwendung eines Stickstoffstroms gründlich verdampft. Zu dem resultierenden trockenen Reaktionsprodukt 2- Imino-2-methoxyethyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurde 1 ml rIFN-αA in einer Menge von 6,25 mg/ml, pH 7,0 (0,1 M Phosphatpuffer), gegeben. Nach 24 Stunden Reaktion bei Raumtemperatur wurden 100 ul einer 1 M wässrigen Essigsäurelösung hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Das nicht umgesetzte Galactopyranosid wurde unter Verwendung einer Gelsäule PD-10 entfernt, während der Puffer durch einen 25 mM Ammoniumacetatpuffer der 0,13 M NaCl enthielt, pH 5,5, ersetzt wurde.
- So wurden 6,3 mg galactosemodifiziertes rIFN-αA erhalten, wobei die Zahl der an jedes Interferonmolekül gebundenen Galactosemoleküle 8,5 betrug. Die Proteingehalte und Gehalte an modifizierender Galactose wurden nach dem Pierce- BCA-Verfahren (BCA-Proteinassayreagens, hergestellt von der Pierce Company) bzw. dem Schwefelsäure-Phenol-Verfahren bestimmt.
- 1,0 g Cyanmethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurden in 25 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 50 ul Natriummethoxid (28% in Methanollösung, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) gegeben, und anschließend erfolgte eine Reaktion bei Raumtemperatur während 72 Stunden unter Rühren. Eine 4,0-ml-Portion dieser Methanollösung wurde in ein Reagenzglas gegeben, und das Methanol wurde unter Verwendung eines Stickstoffstroms gründlich verdampft. Zu dem resultierenden trockenen Reaktionsprodukt 2- Imino-2-methoxyethyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurde 1 ml rIFN-αA in einer Menge von 6,25 mg/ml, pH 7,5 (0,1 M Phosphatpuffer), gegeben. Nach 24 Stunden Reaktion bei Raumtemperatur wurden 100 ul einer 1 M wässrigen Essigsäurelösung hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Das nicht umgesetzte Galactopyranosid wurde unter Verwendung einer Gelsäule PD-10 entfernt, während der Puffer durch einen 25 mM Ammoniumacetatpuffer, der 0,13 M NaCl enthielt, pH 5,5, ersetzt wurde.
- So wurden 5,9 mg galactosemodifiziertes rIFN-αA erhalten, wobei die Zahl der an jedes Interferonmolekül gebundenen Galactosemoleküle 9,7 betrug. Die Proteingehalte und Gehalte an modifizierender Galactose wurden nach dem Pierce- BCA-Verfahren (BCA-Proteinassayreagens, hergestellt von der Pierce Company) bzw. dem Schwefelsäure-Phenol-Verfahren bestimmt.
- 1,0 g Cyanmethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurden in 25 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 50 ul Natriummethoxid (28% in Methanollösung, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) gegeben, und anschließend erfolgte eine Reaktion bei Raumtemperatur während 72 Stunden unter Rühren. Eine 4,0-ml-Portion dieser Methanollösung wurde in ein Reagenzglas gegeben, und das Methanol wurde unter Verwendung eines Stickstoffstroms gründlich verdampft. Zu dem resultierenden trockenen Reaktionsprodukt 2- Imino-2-methoxyethyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurde 1 ml rIFN-αA in einer Menge von 6,25 mg/ml, pH 8,1 (0,1 M Phosphatpuffer), gegeben. Nach 24 Stunden Reaktion bei Raumtemperatur wurden 100 ul einer 1 M wässrigen Essigsäurelösung hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Das nicht umgesetzte Galactopyranosid wurde unter Verwendung einer Gelsäule PD-10 entfernt, während der Puffer durch einen 25 mM Ammoniumacetatpuffer, der 0,13 M NaCl enthielt, pH 5,5, ersetzt wurde.
- So wurden 5,7 mg galactosemodifiziertes rIFN-αA erhalten, wobei die Zahl der an jedes Interferonmolekül gebundenen Galactosemoleküle 8, 8 betrug. Die Proteingehalte und Gehalte an modifizierender Galactose wurden nach dem Pierce- BCA-Verfahren (BCA-Proteinassayreagens, hergestellt von der Pierce Company) bzw. dem Schwefelsäure-Phenol-Verfahren bestimmt.
- 1,0 g Cyanmethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurden in 25 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 50 ul Natriummethoxid (28% in Methanollösung, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) gegeben, und anschließend erfolgte eine Reaktion bei Raumtemperatur während 72 Stunden unter Rühren. Eine 4,0-ml-Portion dieser Methanollösung wurde in ein Reagenzglas gegeben, und das Methanol wurde unter Verwendung eines Stickstoffstroms gründlich verdampft. Zu dem resultierenden trockenen Reaktionsprodukt 2- Imino-2-methoxyethyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurde 1 ml rIFN-αA in einer Menge von 6,25 mg/ml, pH 8,7 (0,1 M Phosphatpuffer), gegeben. Nach 24 Stunden Reaktion bei Raumtemperatur wurden 100 ul einer 1 M wässrigen Essigsäurelösung hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Das nicht umgesetzte Galactopyranosid wurde unter Verwendung einer Gelsäule PD-10 entfernt, während der Puffer durch einen 25 mM Ammoniumacetatpuffer, der 0,13 M NaCl enthielt, pH 5,5, ersetzt wurde.
- So wurden 5,1 mg galactosemodifiziertes rIFN-αA erhalten, wobei die Zahl der an jedes Interferonmolekül gebundenen Galactosemoleküle 11 betrug. Die Proteingehalte und Gehalte an modifizierender Galactose wurden nach dem Pierce- BCA-Verfahren (BCA-Proteinassayreagens, hergestellt von der Pierce Company) bzw. dem Schwefelsäure-Phenol-Verfahren bestimmt.
- 1,0 g Cyanmethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurden in 25 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 50 ul Natriummethoxid (28% in Methanollösung, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) gegeben, und anschließend erfolgte eine Reaktion bei Raumtemperatur während 72 Stunden unter Rühren. Eine 40-ul-Portion dieser Methanollösung wurde in ein Reagenzglas gegeben, und das Methanol wurde unter Verwendung eines Stickstoffstroms gründlich verdampft. Zu dem resultierenden trockenen Reaktionsprodukt 2- Imino-2-methoxyethyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurde 1 ml rIFN-αA in einer Menge von 6,25 mg/ml, pH 6,5 (0,1 M Phosphatpuffer), gegeben. Nach 24 Stunden Reaktion bei Raumtemperatur wurden 100 ul einer 1 M wässrigen Essigsäurelösung hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Das nicht umgesetzte Galactopyranosid wurde unter Verwendung einer Gelsäule PD-10 entfernt, während der Puffer durch einen 25 mM Ammoniumacetatpuffer, der 0,13 M NaCl enthielt, pH 5,5, ersetzt wurde.
- So wurden 4,7 mg galactosemodifiziertes rIFN-αA erhalten, wobei die Zahl der an jedes Interferonmolekül gebundenen Galactosemoleküle 0,6 betrug. Die Proteingehalte und Gehalte an modifizierender Galactose wurden nach dem Pierce- BCA-Verfahren (BCA-Proteinassayreagens, hergestellt von der Pierce Company) bzw. dem Schwefelsäure-Phenol-Verfahren bestimmt.
- 1,0 g Cyanmethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurden in 25 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 50 ul Natriummethoxid (28% in Methanollösung, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) gegeben, und anschließend erfolgte eine Reaktion bei Raumtemperatur während 72 Stunden unter Rühren. Eine 40-pl-Portion dieser Methanollösung wurde in ein Reagenzglas gegeben, und das Methanol wurde unter Verwendung eines Stickstoffstroms gründlich verdampft. Zu dem resultierenden trockenen Reaktionsprodukt 2- Imino-2-methoxyethyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurde 1 ml rIFN-αA in einer Menge von 6,25 mg/ml, pH 7,0 (0,1 M Phosphatpuffer), gegeben. Nach 24 Stunden Reaktion bei Raumtemperatur wurden 100 ul einer 1 M wässrigen Essigsäurelösung hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Das nicht umgesetzte Galactopyranosid wurde unter Verwendung einer Gelsäule PD-10 entfernt, während der Puffer durch einen 25 mM Ammoniumacetatpuffer, der 0,13 M NaCl enthielt, pH 5,5, ersetzt wurde.
- So wurden 5,1 mg galactosemodifiziertes rIFN-αA erhalten, wobei die Zahl der an jedes Interferonmolekül gebundenen Galactosemoleküle 0,6 betrug. Die Proteingehalte und Gehalte an modifizierender Galactose wurden nach dem Pierce- BCA-Verfahren (BCA-Proteinassayreagens, hergestellt von der Pierce Company) bzw. dem Schwefelsäure-Phenol-Verfahren bestimmt.
- 1,0 g Cyanmethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurden in 25 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 50 ul Natriummethoxid (28% in Methanollösung, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) gegeben, und anschließend erfolgte eine Reaktion bei Raumtemperatur während 72 Stunden unter Rühren. Eine 40-ul-Portion dieser Methanollösung wurde in ein Reagenzglas gegeben, und das Methanol wurde unter Verwendung eines Stickstoffstroms gründlich verdampft. Zu dem resultierenden trockenen Reaktionsprodukt 2- Imino-2-methoxyethyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurde 1 ml rIFN-αA in einer Menge von 6,25 mg/ml, pH 7,5 (0,1 M Phosphatpuffer), gegeben. Nach 24 Stunden Reaktion bei Raumtemperatur wurden 100 ul einer 1 M wässrigen Essigsäurelösung hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Das nicht umgesetzte Galactopyranosid wurde unter Verwendung einer Gelsäule PD-10 entfernt, während der Puffer durch einen 25 mM Ammoniumacetatpuffer, der 0,13 M NaCl enthielt, pH 5,5, ersetzt wurde.
- So wurden 5,0 mg galactosemodifiziertes rIFN-αA erhalten, wobei die Zahl der an jedes Interferonmolekül gebundenen Galactosemoleküle 1,1 betrug. Die Proteingehalte und Gehalte an modifizierender Galactose wurden nach dem Pierce- BCA-Verfahren (BCA-Proteinassayreagens, hergestellt von der Pierce Company) bzw. dem Schwefelsäure-Phenol-Verfahren bestimmt.
- 1,0 g Cyanmethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurden in 25 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 50 ul Natriummethoxid (28% in Methanollösung, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) gegeben, und anschließend erfolgte eine Reaktion bei Raumtemperatur während 72 Stunden unter Rühren. Eine 40-ul-Portion dieser Methanollösung wurde in ein Reagenzglas gegeben, und das Methanol wurde unter Verwendung eines Stickstoffstroms gründlich verdampft. Zu dem resultierenden trockenen Reaktionsprodukt 2- Imino-2-methoxyethyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurde 1 ml rIFN-αA in einer Menge von 6,25 mg/ml, pH 8,1 (0,1 M Phosphatpuffer), gegeben. Nach 24 Stunden Reaktion bei Raumtemperatur wurden 100 ul einer 1 M wässrigen Essigsäurelösung hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Das nicht umgesetzte Galactopyranosid wurde unter Verwendung einer Gelsäule PD-10 entfernt, während der Puffer durch einen 25 mM Ammoniumacetatpuffer, der 0,13 M NaCl enthielt, pH 5,5, ersetzt wurde.
- So wurden 5,1 mg galactosemodifiziertes rIFN-αA erhalten, wobei die Zahl der an jedes Interferonmolekül gebundenen Galactosemoleküle 1,6 betrug. Die Proteingehalte und Gehalte an modifizierender Galactose wurden nach dem Pierce- BCA-Verfahren (BCA-Proteinassayreagens, hergestellt von der Pierce Company) bzw. dem Schwefelsäure-Phenol-Verfahren bestimmt.
- 1,0 g Cyanmethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurden in 25 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 50 ul Natriummethoxid (28% in Methanollösung, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) gegeben, und anschließend erfolgte eine Reaktion bei Raumtemperatur während 72 Stunden unter Rühren. Eine 40-ul-Portion dieser Methanollösung wurde in ein Reagenzglas gegeben, und das Methanol wurde unter Verwendung eines Stickstoffstroms gründlich verdampft. Zu dem resultierenden trockenen Reaktionsprodukt 2- Imino-2-methoxyethyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurde 1 ml rIFN-αA in einer Menge von 6,25 mg/ml, pH 8,7 (0,1 M Phosphatpuffer), gegeben. Nach 24 Stunden Reaktion bei Raumtemperatur wurden 100 ul einer 1 M wässrigen Essigsäurelösung hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Das nicht umgesetzte Galactopyranosid wurde unter Verwendung einer Gelsäule PD-10 entfernt, während der Puffer durch einen 25 mM Ammoniumacetatpuffer, der 0,13 M NaCl enthielt, pH 5,5, ersetzt wurde.
- So wurden 4,6 mg galactosemodifiziertes rIFN-αA erhalten, wobei die Zahl der an jedes Interferonmolekül gebundenen Galactosemoleküle 2,0 betrug. Die Proteingehalte und Gehalte an modifizierender Galactose wurden nach dem Pierce- BCA-Verfahren (BCA-Proteinassayreagens, hergestellt von der Pierce Company) bzw. dem Schwefelsäure-Phenol-Verfahren bestimmt.
- Zeitliche Änderungen der Serumspiegel der in den Beispielen 1, 3 und 16 erhaltenen galactosemodifizierten Interferon-αAs wurden nach intravenöser Verabreichung an Ratten überwacht. Die Bestimmungen erfolgten durch Enzym- Immunoassay. Zur Kontrolle wurde unmodifiziertes Interferon-αA intravenös verabreicht. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt.
- Aus Fig. 1 erkennt man, dass das unmodifizierte Interferon-αA innerhalb von 10 Minuten kaum aus dem Serum verschwindet, während die galactosemodifizierten Interferon-αAs schnell verschwinden.
- Die hepatische Wanderung des in Beispiel 1 erhaltenen galactosemodifizierten Interferon-αA wurde durch das Ratten-Leberperfusionsverfahren bestimmt. Kanülen wurden in die Leberpfortader und in die Hohlvene der Ratte eingeführt. Während das galactosemodifizierte Interferon-αA von der Pfortaderseite her (Cin) perfundiert wurde, wurde das Perfusat auf der Hohlvenenseite (Cout) periodisch aufgefangen, um zeitliche Änderungen des Konzentrationsverhältnisses von Cin und Cout zu überwachen. Bei diesem Experiment wurde die untere Hohlvene mit einer chirurgischen Naht abgebunden. Zur Kontrolle wurde das Verhältnis von Cin und Cout bei unmodifiziertem Interferon-αA bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt.
- Aus Fig. 2 erkennt man, dass das unmodifizierte Interferon-αA ein Cout/Cin- Verhältnis von fast 1 hatte, was das Fehlen von hepatischer Wanderung beweist, während das galactosemodifizierte Interferon-αA ein Cout/Cin-Verhältnis von 0,1 bis 0,4 hatte, was eine hepatische Wanderung beweist.
- Die Erhöhung der 2-5AS-Aktivität bei kultivierten Rattenhepatocyten durch galactosemodifiziertes Interferon-αA wurde untersucht. Rattenhepatocyten wurden durch Collagenase-Behandlung entnommen. Die so erhaltenen 1 · 10² Hepatocyten wurden in 1 ml eines Eagle-MEM (minimalessentielles Medium nach Eagle), das 10% FCS (fetales Kälberserum) enthielt, dispergiert, und das galactosemodifizierte Interferon-αA von Beispiel 1 bzw. unmodifiziertes Interferon-αA wurden bis zu unterschiedlichen Konzentrationen hinzugefügt. Nach 1 Tag Kultur in einem Inkubator bei 37ºC wurden Zellen durch Zentrifugation abgetrennt und zu 0,01% Triton X-100 (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) hinzugefügt und homogenisiert. Nachdem die Zelltrümmer durch ein 0,2-um-Filter entfernt worden waren, wurde in dem Filtrat die 2-5AS-Aktivität bestimmt, wobei ein 2-5A-Assaykit (Eiken Chemical Co., Ltd.) verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt.
- Aus Fig. 3 erkennt man, dass das galactosemodifizierte Interferon-αA die 2- 5AS-Aktivität bei Konzentrationen von 1/100 bis 1/1000 erhöhte, die genauso niedrig waren wie die des unmodifizierten Interferon-αA. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Interferon-αA-Aktivität in Hepatocyten als Ergebnis einer merklichen Verbesserung der Wanderung von galactosemodifiziertem Interferon-αA zu Hepatocyten erhöht wird. Aus diesem Grund führt das galactosemodifizierte Interferon-αA bei niedrigeren Konzentrationen als bei dem unmodifizierten Interferon-αA zu einer erhöhten 2-5AS-Aktivität.
- Ein Experiment wurde im Einklang mit einem bekannten Verfahren durchgeführt [M. Rubinstein et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 640 (1979); R. K. Maheshwari und R. M. Friedman: Virol. 101, 399 (1980)]. Insbesondere wurde Interferon oder galactosemodifiziertes Interferon mit einem Medium, das 10%iges fetales und in einer Menge von 50 ul pro Napf in eine 96-Napf-Mikroplatte gegeben. Anschließend wurden in demselben Medium suspendierte MDBK-Zellen (4 · 10&sup5; Zellen/ml) in einer Menge von 50 ul pro Napfhinzugefügt, und anschließend wurde 3 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. Weiterhin wurde ein mit demselben Medium verdünntes Viruspräparat (VSV) (2 · 10&sup5; PFU oder plaquebildende Einheiten pro ml) in einer Menge von 50 ul pro Napfhinzugefügt, und anschließend wurde 40 Stunden lang bei 37ºC kultiviert.
- Nach Anfärbung mit einer 0,1%igen Neutralrotlösung (25 ul/Napf) wurden die Zellen noch eine weitere Stunde bei 37ºC kultiviert, und danach wurde eine 4%ige Formalinlösung (25 ul/Napf) hinzugefügt, um das Virus zu inaktivieren und die Zellen zu fixieren. Nachdem man die Platte 30 Minuten lang stehen gelassen hatte, wurde sie mit UV bestrahlt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Dann wurde der Farbstoff mit einem 1 : 1-Ethylenglycol-Ethanol-Gemisch (100 ul/Napf), das 2% (w/v) Zitronensäure enthielt, extrahiert, wobei die Extinktion bei 540 nm bestimmt wurde.
- Die Standardarbeitskurve für die antivirale Aktivität des Standardpräparats von IFN-αA ist in Fig. 4 gezeigt.
- 100 mg Cyanmethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranosid, das Cyanmethylthioglycosid von Galactose, wurden in 2,5 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 4,9 ul einer 28%igen NaOCH&sub3;-Methanol-Lösung gegeben, und anschließend erfolgte eine Reaktion bei Raumtemperatur während 72 Stunden. Eine 200- bis 450-ul-Portion des Reaktionsgemischs wurde in ein Reagenzglas gegeben, und das Methanol wurde in einem Stickstoffstrom verdampft. Zu dem so erhaltenen 2-Imino-2-methoxyethyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurden 1,0 ml eines 0,1 M Phosphatpuffers (pH 7,0, 6,25 mg/ml) gegeben, der IFN-αA enthielt, und anschließend erfolgte eine Reaktion bei Raumtemperatur während 30 Stunden. Nachdem die Reaktion durch Zugabe einer 1 M Essigsäurelösung beendet worden war, wurde das Reaktionsprodukt durch PD-10-Säulenchromatographie unter Verwendung von 25 mM Ammoniumacetat/0,13 M NaCl (pH 5,5) als Eluent gereinigt. Es wurden etwa 4,8 bis 5,8 mg galactosemodifiziertes IFN-αA erhalten.
- Die Proteinkonzentrationen wurden bestimmt, wobei man einen kommerziell erhältlichen BCA-Proteinassaykit (Pierce Co.) verwendete. Die Zahl der pro IFN- Molekül gebundenen Galactose-Moleküle wurde durch Aminosäureanalyse bestimmt. Die antivirale Aktivität wurde nach den Anweisungen im experimentellen Beispiel 4 bestimmt.
- Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. Das Interferon mit 4,1 gebundenen Galactosemolekülen hatte eine antivirale Aktivität, die äquivalent zu derjenigen des unmodifizierten Interferons war, während das Interferon mit 5,7 gebundenen Galactosemolekülen eine reduzierte Aktivität von 63% hatte. [Tabelle 1]
- E: Aktivitätseinheit
- Zu 2-Imino-2-methoxyethyl-1-thio-β-D-galactopyranosid, das genauso wie in Beispiel 17 hergestellt wurde (in einer Menge, die zu 150 bis 190 ul Reaktionsgemisch äquivalent war), wurden 1,0 ml eines 0,1 M Phosphatpuffers (pH 7,0, 1,82 mg/ml) gegeben, der IFN-αA enthielt, und anschließend erfolgte eine Reaktion bei Raumtemperatur während 30 Stunden. Dann wurde dieselbe Behandlung wie in Beispiel 17 durchgeführt, was gereinigtes galactosemodifiziertes IFNαA ergab.
- Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben. Unter allen Reaktionsbedingungen betrug die Ausbeute 90 bis 97%, und die Zahl der modifizierenden Galactosemoleküle nahm in Abhängigkeit von der Menge der hinzugefügten aktivierten Galactose zu. [Tabelle 2]
- Zu 2-Imino-2-methoxyethyl-1-thio-β-D-galactopyranosid, das genauso wie in Beispiel 17 hergestellt wurde (in einer Menge, die zu 25 bis 400 ul Reaktionsgemisch äquivalent war), wurden 1,0 ml eines 0,1 M Phosphatpuffers (pH 8,0, 0,54 mg/ml) gegeben, der IFN-αA enthielt, und anschließend erfolgte eine Reaktion bei Raumtemperatur während 30 Stunden. Dann wurde dieselbe Behandlung wie in Beispiel 17 durchgeführt, was gereinigtes galactosemodifiziertes IFN- αA ergab.
- Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben. Die Zahl der modifizierenden Galactosemoleküle nahm in Abhängigkeit von der Menge der hinzugefügten aktivierten Galactose zu. Wenn die Zahl der modifizierenden Galactosemoleküle nicht größer als 5 war, wurden außerdem über 80% der antiviralen Aktivität beibehalten. [Tabelle 3]
- Zu 9,7 mg IFN-αA, das in 1,0 ml 0,2 M Natriumboratpuffer (pH 8,0) gelöst war, wurden 10 mg Lactose und 10 mg Natriumcyanoborhydrid gegeben, und anschließend wurde 5 Tage lang bei 37ºC inkubiert. Nachdem die Reaktion durch Zugabe von 0,1 ml einer 1 M Essigsäurelösung beendet worden war, wurde das Reaktionsprodukt durch Gelfiltrationschromatographie gereinigt, wobei man eine PD-10-Säule verwendete, die mit 25 mM Ammoniumacetat/0,13 M NaCl-Lösung äquilibriert worden war.
- Es wurden 1,6 mg IFN-αA erhalten, das mit 4,7 Galactosemolekülen modifiziert war. Die antivirale Aktivität betrug etwa 81% derjenigen des unmodifizierten Interferon-αA.
- Unmodifiziertes Interferon-αA und das in Beispiel 17 hergestellte IFN-αA mit 4,1 gebundenen Galactosemolekülen wurden jeweils drei Ratten durch intramuskuläre Verabreichung gegeben (4 · 10&sup6; E/Tier). Eine Stunde später wurden die Tiere ausbluten gelassen, und die IFN-αA-Konzentrationen in Leber, Niere und Serum wurden nach einem bekannten Verfahren des Enzym-Immunoassays (ELISA) bestimmt.
- Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben. Das galactosemodifizierte IFN-αA zeigte eine verstärkte hepatische Wanderung mit einer hepatischen Selektivität, die etwa 80mal so groß war wie die von unmodifiziertem IFN-αA. Die zwei IFN- αAs waren bei der Nierenwanderung in Bezug auf die Serumspiegel fast zueinander äquivalent. [Tabelle 4]
- Die Zahlen für die Konzentration sind als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Die Zahlen in Klammern sind Konzentrationsverhältnisse.
- Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), unmodifiziertes Interferon-αA und das in Beispiel 17 hergestellte IFN-αA mit 4,1 gebundenen Galactosemolekülen wurden jeweils Ratten intramuskulär verabreicht (4 · 10&sup6; E/Tier). Drei bzw. 24 Stunden später wurden Lebern herausgeschnitten. Die Leber wurde in 4 ml eines 0,1 M Natriumacetatpuffers (pH 5,0) homogenisiert, und anschließend wurde zentrifugiert. Die IFN-αA-Konzentration im Überstand wurde durch das im experimentellen Beispiel 5 beschriebene ELISA und den im experimentellen Beispiel 4 beschriebenen Test der antiviralen Aktivität bestimmt.
- Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 angegeben. Das galactosemodifizierte LFN-αA zeigte eine bessere hepatische Akkumulation und Retention als das unmodifizierte IFN-αA, wobei auch noch 24 Stunden nach der Verabreichung eine erhebliche antivirale Aktivität in der Leber festgestellt wurde. [Tabelle 5]
- 100 mg Cyanmethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranosid, das Cyanmethylthioglycosid von Galactose, wurden in 2,5 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 49 ul Natriummethoxid (28% in Methanollösung, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) gegeben, und anschließend erfolgte eine Reaktion bei 25ºC während 72 Stunden. Eine 30-ul-Portion dieser Methanollösung wurde in ein Reagenzglas gegeben, und das Methanol wurde unter Verwendung eines Stickstoffstroms gründlich verdampft. Zu dem resultierenden trockenen Reaktionsprodukt 2-Imino-2-methoxyethyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurde 1 ml rekombinantes Interleukin-2 (rIL-2) in einer Menge von 0,7 mg/ml, pH 8,5 (0,1 M Phosphatpuffer), gegeben. Nach 24 Stunden Reaktion bei 25ºC wurden 100 ul einer 1 M wässrigen Essigsäurelösung hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Das nicht umgesetzte Galactopyranosid wurde unter Verwendung einer Gelsäule PD-10 (hergestellt von Pharmacia) entfernt, während der Puffer durch einen 25 mM Ammoniumacetatpuffer, der 0,13 M NaCl enthielt, pH 5,5, ersetzt wurde. So wurden 473 ug galactosemodifiziertes rIL-2 erhalten, wobei die durch Aminosäureanalyse bestimmte Zahl der an jedes rIL-2-Molekül gebundenen Galactosemoleküle 3,4 betrug.
- 100 mg Cyanmethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranosid, das Cyanmethylthioglycosid von Galactose, wurden in 2,5 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 49 ul Natriummethoxid (28% in Methanollösung, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) gegeben, und anschließend erfolgte eine Reaktion bei 25ºC während 72 Stunden. Eine 40-ul-Portion dieser Methanollösung wurde in ein Reagenzglas gegeben, und das Methanol wurde unter Verwendung eines Stickstoffstroms gründlich verdampft. Zu dem resultierenden trockenen Reaktionsprodukt 2-Imino-2-methoxyethyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurde 1 ml rIL-2 in einer Menge von 0,7 mg/ml, pH 8,5 (0,1 M Phosphatpuffer), gegeben. Nach 24 Stunden Reaktion bei 25ºC wurden 100 ul einer 1 M wässrigen Essigsäurelösung hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Das nicht umgesetzte Galactopyranosid wurde unter Verwendung einer Gelsäule PD-10 (hergestellt von Pharmacia) entfernt, während der Puffer durch einen 25 mM Ammoniumacetatpuffer, der 0,13 M NaCl enthielt, pH 5,5, ersetzt wurde. So wurden 493 ug galactosemodifiziertes rIL-2 erhalten, wobei die durch Aminosäureanalyse bestimmte Zahl der an jedes rIL-2-Molekül gebundenen Galactosemoleküle 4,3 betrug.
- 100 mg Cyanmethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranosid, das Cyanmethylthioglycosid von Galactose, wurden in 2,5 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 49 ul Natriummethoxid (28% in Methanollösung, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) gegeben, und anschließend erfolgte eine Reaktion bei 25ºC während 72 Stunden unter Rühren. Eine 50-ul-Portion dieser Methanollösung wurde in ein Reagenzglas gegeben, und das Methanol wurde unter Verwendung eines Stickstoffstroms gründlich verdampft. Zu dem resultierenden trockenen Reaktionsprodukt 2-Imino-2-methoxyethyl-1-thio-β-D- galactopyranosid wurde 1 ml rIL-2 in einer Menge von 0,7 mg/ml, pH 8,5 (0,1 M Phosphatpuffer), gegeben. Nach 24 Stunden Reaktion bei 25ºC wurden 100 ul einer 1 M wässrigen Essigsäurelösung hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Das nicht umgesetzte Galactopyranosid wurde unter Verwendung einer Gelsäule PD-10 (hergestellt von Pharmacia) entfernt, während der Puffer durch einen 25 mM Ammoniumacetatpuffer, der 0,13 M NaCl enthielt, pH 5,5, ersetzt wurde. So wurden 533 ug galactosemodifiziertes rIL-2 erhalten, wobei die durch Aminosäureanalyse bestimmte Zahl der an jedes rIL-2-Molekül gebundenen Galactosemoleküle 5,2 betrug.
- Tabelle 6 zeigt die Ergebnisse einer Bestimmung der spezifischen Restaktivitäten der in den Beispielen 21, 22 und 23 erhaltenen Galactose-gebundenen rIL-2- Spezies. Die Bioaktivität wurde nach dem Verfahren von Tada et al. bestimmt [J. Immunol. Methods 93, 157-165 (1986)], wobei die IL-2-abhängige Maus-Zelllinie NKC3 (natürliche Killerzellen) verwendet wurde. Tabelle 6: Zahl der modifizierenden Galactosemoleküle und Restbioaktivität
- Zu 1,5 ml einer Interferon-αA-Lösung von 0,7 mg/ml, pH 9,5 (0,1 M Natriumcarbonat) wurden 0,15 ml β-D-Galactopyranosylphenylisothiocyanat (hergestellt von Sigma), 0,5 mg/ml, pH 9,5 (0,1 M Natriumcarbonat), gegeben, und anschließend erfolgte eine Reaktion bei 25ºC während 24 Stunden. Das nicht umgesetzte β-D-Galactopyranosylphenylisothiocyanat wurde unter Verwendung einer Gelsäule PD-10 (hergestellt von Pharmacia) entfernt, während der Puffer durch einen 25 mM Ammoniumacetatpuffer, der 0,13 M NaCl enthielt, pH 5,5, ersetzt wurde. So wurden 798 ug galactosemodifiziertes Interferon-αA erhalten, wobei die durch Aminösäureanalyse bestimmte Zahl der an jedes Interferon-αA- Molekül gebundenen Galactosemoleküle 2,0 betrug.
- Zu 1,5 ml einer Interferon-αA-Lösung von 0,7 mg/ml, pH 9,5 (0,1 M Natriumcarbonat) wurden 0,5 ml β-D-Galactopyranosylphenylisothiocyanat (hergestellt von Sigma), 0,5 mg/ml, pH 9,5 (0,1 M Natriumcarbonat), gegeben, und anschließend erfolgte eine Reaktion bei 25ºC während 24 Stunden. Das nicht umgesetzte β-D-Galactopyranosylphenylisothiocyanat wurde unter Verwendung einer Gelsäule PD-10 (hergestellt von Pharmacia) entfernt, während der Puffer durch einen 25 mM Ammoniumacetatpuffer, der 0,13 M NaCl enthielt, pH 5,5, ersetzt wurde. So wurden 860 ug galactosemodifiziertes Interferon-αA erhalten, wobei die durch Aminosäureanalyse bestimmte Zahl der an jedes Interferon-αA- Molekül gebundenen Galactosemoleküle 4,0 betrug.
- Zu 1,5 ml einer Interferon-αA-Lösung von 0,7 mg/ml, pH 9,5 (0,1 M Natriumcarbonat) wurden 0,75 ml β-D-Galactopyranosylphenylisothiocyanat (hergestellt von Sigma), 0,5 mg/ml, pH 9,5 (0,1 M Natriumcarbonat), gegeben, und anschließend erfolgte eine Reaktion bei 25ºC während 24 Stunden. Das nicht umgesetzte β-D-Galactopyranosylphenylisothiocyanat wurde unter Verwendung einer Gelsäule PD-10 (hergestellt von Pharmacia) entfernt, während der Puffer durch einen 25 mM Ammoniumacetatpuffer, der 0,13 M NaCl enthielt, pH 5,5, ersetzt wurde. So wurden 870 ug galactosemodifiziertes Interferon-αA erhalten, wobei die durch Aminosäureanalyse bestimmte Zahl der an jedes Interferon-αA- Molekül gebundenen Galactosemoleküle 4,8 betrug.
- 100 mg Cyanmethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranosid, das Cyanmethylthioglycosid von Galactose, wurden in 2,5 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 4,9 ul Natriummethoxid (28% in Methanollösung, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) gegeben, und anschließend erfolgte eine Reaktion bei 25ºC während 72 Stunden. Eine 360-ul-Portion dieser Methanollösung wurde in ein Reagenzglas gegeben, und das Methanol wurde unter Verwendung eines Stickstoffstroms gründlich verdampft. Zu dem resultierenden trockenen Reaktionsprodukt 2-Imino-2-methoxyethyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurden 120 ul 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gegeben, um das Produkt aufzulösen. Dann wurde zu dem Puffer allmählich rekombinantes Maus- Interferon-β (200 ug/1,2 ml: bezogen von der Funakoshi Company) gegeben, das in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst war. Nach 24 Stunden Reaktion bei 25ºC wurde das nicht umgesetzte Galactopyranosid unter Verwendung einer Gelsäule PD-10 (hergestellt von Pharmacia) entfernt, während der Puffer durch einen 50 mM Ammoniumacetatpuffer (pH 4,5) ersetzt wurde.
- So wurden 208 ug galactosemodifiziertes IFN-β erhalten, wobei die durch Aminosäureanalyse bestimmte Zahl der an jedes IFN-β-Molekül gebundenen Galactosemoleküle 2,5 betrug.
- 100 mg Cyanmethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranosid, das Cyanmethylthioglycosid von Galactose, wurden in 2,5 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 4,9 ul Natriummethoxid (28% in Methanollösung, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) gegeben, und anschließend erfolgte eine Reaktion bei 25ºC während 72 Stunden. Eine 420-ul-Portion dieser Methanollösung wurde in ein Reagenzglas gegeben, und das Methanol wurde unter Verwendung eines Stickstoffstroms gründlich verdampft. Zu dem resultierenden trockenen Reaktionsprodukt 2-Imino-2-methoxyethyl-1-thio-β-D-galactopyranosid wurden 120 ul 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gegeben, um das Produkt aufzulösen. Dann wurde zu dem Puffer allmählich rekombinantes Maus- Interferon-β (200 ug/1,2 ml: bezogen von der Funakoshi Company) gegeben, das in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst war. Nach 24 Stunden Reaktion bei 25ºC wurde das nicht umgesetzte Galactopyranosid unter Verwendung einer Gelsäule PD-10 (hergestellt von Pharmacia) entfernt, während der Puffer durch einen 50 mM Ammoniumacetatpuffer (pH 4,5) ersetzt wurde.
- So wurden 212 ug galactosemodifiziertes IFN-β erhalten, wobei die durch Aminosäureanalyse bestimmte Zahl der an jedes IFN-β-Molekül gebundenen Galactosemoleküle 4,0 betrug.
- Unmodifiziertes Maus-IFN-β und das in Beispiel 28 hergestellte IFN-β mit 4,0 gebundenen Galactosemolekülen wurden jeweils intraperitoneal einmal oder zweimal in einer Dosis von 0,2 oder 1,0 ug/Tag/Maus als IFN-β an Mäuse verabreicht. Jede Gruppe bestand aus vier C3H-Mäusen. Einen Tag später wurden die Tiere ausbluten gelassen, und die Leber wurde um 4racnen Volumen an PBS homogenisiert. Nach der Zentrifugation wurde in den Überständen der Extrakte die 2-5AS-Aktivität bestimmt, wie es im experimentellen Beispiel 3 beschrieben ist.
- Die Ergebnisse sind in den Fig. 5 und 6 angegeben. Aus Fig. 5 ist zu ersehen, dass das galactosemodifizierte IFN-β die 2-5AS-Aktivität sogar bei einer einzigen Dosis von 0,2 ug/Tag/Maus als IFN-β erhöhte, obwohl dies beim unmodifizierten IFN-β nicht der Fall war. Aus Fig. 6 ist auch zu ersehen, dass das galactosemodifizierte IFN-β die Aktivität sowohl bei einer einzigen Dosis als auch bei zwei aufeinanderfolgenden Dosen von 1,0 ug/Tag/Maus als IFN-β signifikanter erhöhte als das unmodifizierte IFN-β.
Claims (10)
1. Zuckermodifiziertes Cytokin, das zwei bis fünf modifizierende Grupper
umfasst, die gleich oder verschieden sein können und die an primäre
Aminogruppen eines Cytokins gebunden sind, das aus einem Interferon und
Interleukin-2 ausgewählt ist, wobei die modifizierenden Gruppen durch diE
Formel (I) dargestellt werden:
R-X- (I)
wobei R eine Glycosylgruppe darstellt und X folgendes darstellt:
wobei n eine beliebige positive ganze Zahl ist;
-C&sub6;H&sub4;-NH-CS-,
-S-CH&sub2;-CO-NH-CH&sub2;-CH&sub2;-,
O-CH&sub2;-CH&sub2;-,
-CS-NH-C&sub6;H&sub3;(CH&sub3;)-NHCS-,
-CO-(CH&sub2;)l-CO-
wobei l eine ganze Zahl von 3 bis 6 ist;
-CO-CH(OH)-CH(OH)-CO-,
wobei Y -(CH&sub2;)&sub3;-,
oder
ist;
wobei Z -(CH&sub2;)&sub3;-,
-CO-NH oder
ist.
2. Zuckermodifiziertes Cytokin gemäß Anspruch 1, wobei X folgendes ist:
wobei n eine beliebige positive ganze Zahl ist;
oder
C&sub6;H&sub4;-NH-CS-
3. Zuckermodifiziertes Cytokin gemäß Anspruch 1, wobei X
ist, wobei n eine beliebige positive ganze Zahl ist.
4. Zuckermodifiziertes Cytokin gemäß Anspruch 1, wobei das Cytokin ein
Interferon ist.
5. Zuckermodifiziertes Cytokin gemäß Anspruch 4, wobei vier Gruppen, die
durch die Formel (I) dargestellt werden, gebunden sind.
6. Zuckermodifiziertes Cytokin gemäß Anspruch 4, wobei es sich bei dem
Interferon um Interferon-α handelt.
7. Zuckermodifiziertes Cytokin gemäß Anspruch 1, wobei die primäre
Aminogruppe die ε-Aminogruppe eines Lysinrestes ist.
8. Zuckermodifiziertes Cytokin gemäß Anspruch 1, wobei die primäre
Aminogruppe die α-Aminogruppe des N-terminalen Aminosäurerestes ist.
9. Zuckermodifiziertes Cytokin gemäß Anspruch 1, wobei die Glycosylgruppe
eine Glycopyranosylgruppe ist.
10. Zuckermodifiziertes Cytokin gemäß Anspruch 9, wobei es sich bei der
Glycopyranosylgruppe um Galactopyranosyl, Mannopyranosyl,
Glucopyranosyl oder Fucopyranosyl handelt.
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