DE4323567B4

DE4323567B4 - Aucubin zur Behandlung einer Hepatitis-B-Virus-Infektion

Info

Publication number: DE4323567B4
Application number: DE4323567A
Authority: DE
Inventors: Il-Moo Chang
Original assignee: BIOHERB CO Ltd
Current assignee: BIOHERB CO. LTD., SEOUL/SOUL, KR
Priority date: 1992-07-15
Filing date: 1993-07-14
Publication date: 2006-12-07
Anticipated expiration: 2013-07-15
Also published as: CN1047307C; IT1264923B1; ITMI931522A1; KR940001886A; JPH0687740A; US5929038A; KR100218052B1; DE4323567A1; JP3571061B2; ITMI931522A0; CN1082895A

Abstract

Verwendung von Aucubin, dem Aglycon von Aucubin oder einem pharmazeutisch verträglichen Salz von Aucubin oder des Aglycons von Aucubin zur Behandlung einer Hepatitis-B-Virus-Infektion.

Description

Die Erfindung betrifft Aucubin, ein Aglycon von Aucubin, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz hiervon, zur Behandlung einer Hepatitis-B-Virus-Infektion.
Das Hepatitis-B-Virus (HBV) gehört zur Gattung der Hepadnaviren aus der Familie der Hepadnaviridae. Das HBV-Genom besteht aus doppelsträngiger DNA (kovalent geschlossene zirkuläre DNA), und das Virion weist eine Größe von 42 nm auf und ist kugelförmig. Es infiziert Wirte wie Schimpansen, Gibbons, Gorillas, Waldmurmeltiere (woodchuck) und Menschen [C. R. Howard und J. L. Melnick, "Classification and Taxonomy of Hepatitis Viruses, in Proceedings of International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease (ed. F. B. Hollinger et al.), Williams and Wilkins, Baltimore, Seite 890 (1990)]. Obwohl HBV ein DNA-Virus ist, ist für die Replikation eine reverse Transkription über die Bildung eines (+)-Strang-RNA-Zwischenprodukts notwendig. Ein Überblick über die HBV-DNA-Replikation ist in 1 gezeigt.
Die durch HBV-Infektion in Menschen verursachte Hepatitis-B stellt weltweit ein großes medizinisches Problem dar. Das Hepatitis-B-Virus verursacht nicht nur eine akute und chronische Hepatitis, sondern es ist auch an der Bildung hepatocellulärer Karzinome beteiligt. Aus diesem Grund wurden bereits viele Anstrengungen unternommen, um klinisch wertvolle Therapeutika zur Behandlung von Hepatitis-B-Virus-Infektionen zu entwickeln.
Beispielsweise wurden Interferon und verschiedene Nucleosidanaloga als antivirale Mittel vorgeschlagen. Es zeigte sich jedoch, daß sowohl Interferone als auch die verschiedenen Nucleosidanaloga nur geringe Heilungsraten von Hepatitis-B in Menschen zeigten; weiterhin bewirken sie häufig ernsthafte Nebenwirkungen. 2',3'-Dideoxycytidin (ddC), ein neu entwickeltes Nucleaosidanalogon, zeigte bei klinischen Untersuchungen zur Behandlung von Hepatitis-B eine hohe Toxizität auf das zentrale und periphere Nervensystem [Feldman et al., Lab-Invest., 66(1), 75 (1992)] und Toxizität auf die hematopoetischen Zellen [Mencoboni et al., In-Vivo, 4(3), 171 (1990)]. Ein weiteres Nucleosidanalogon, ara-AMP, welches klinisch über einen langen Zeitraum verwendet wurde, unterdrückt vorübergehend eine HBV-Infektion, verursacht jedoch ernsthafte Toxizitätsprobleme. Deshalb sollte eine Langzeittherapie mit ara-AMP vermieden werden [J. L. Gerin, Hepatology, 14, 198 (1991)].
Iridoide sind eine Gruppe von Monoterpenoidverbindungen, die im allgemeinen als Glycoside in der Natur vorkommen. Wenn sie durch ein Zucker-hydrolysierendes Enzym wie β-Glucosidase einer enzymatischen Hydrolyse unterworfen werden, entstehen ein Glucosemolekül und ein Aglucon als Hydrolyseprodukt. Die Aglucon (genin)-Formen sind leicht in ihre Dialdehydprodukte umwandelbar, und sie können weiterhin polymerisieren [Chang et al., Clinical Toxicol., 22, 77 (1984)].
Es wurde gefunden, daß die Agluconbildung Voraussetzung dafür ist, daß die Iridoidverbindungen biologische Aktivitäten wie inhibitorische Wirkungen auf die RNA- und Protein-Biosynthesen aufweisen; dies wurde bereits in einer Veröffentlichung mit dem Titel "Effects of Iridoid-Compounds on RNA und Protein Biosynthesis in Sarcoma 180 cells", erschienen im koreanischen Journal of Pharmacognosy, 16, 99, (1985) von S. O. Huh et al. beschrieben.
Blätter von Aucuba japonica (Cornaceae) stellen die Hauptquelle für Aucubin, eine Iridoid-Verbindung, dar. Die chemische Struktur für Aucubin (1,4α,5,7α-Tetrahydro-5-hydroxy-7-(hydroxymethyl)cyclopenta[c]pyran-1-yl-β-D-glucopyranosid) wurde als erstes von A. R. Trim und R. Hill, Biochem. J., 50, 310 (1952) beschrieben.
Weiterhin wurde diese Verbindung auch vom Erfinder der vorliegenden Anmeldung beschrieben [I. M. Chang, H. S. Yun (Choi)], in Advances in Chinese Medicinal Materials Research (ed. H. M. Chang et al.), World Scientific Publishing Company, Singapore, p. 269 (1985).
Weiterhin wurden vom Erfinder wichtige biologische Eigenschaften beschrieben, die im folgenden kurz wiedergegeben werden:
1) Antibakterielle Aktivität
Es wurde hauptsächlich eine antibakterielle Aktivität auf Gram-positive Bakterien festgestellt [I. M. Chang et al., in Proceedings, the 2nd ROK-ROC symposium on Natural Products Sciences p. 94, (1985) (Seoul National University Press)].
2) Leber-schützende Eigenschaften
Experimente, die bei Labortieren durchgeführt wurden, lassen den Schluß zu, daß Iridoidverbindungen einschließlich Aucubin die Leber vor Schäden bewahren, die durch Tetrachlorkohlenstoff-Intoxikation verursacht wurden [I. M. Chang et al., Drug Chem. Toxicol., 6, 443, (1983)]. Aucubin schützt die Leber außerdem vor Schäden, die durch α-Amanitin-Intoxikation in Mäusen verursacht wurden [I. M. Chang et al., Clinical Toxicol., 22, 77 (1984)].
3) Inhibitorische Wirkungen auf die RNA- und Protein-Biosynthesen
Iridoidverbindungen einschl. Aucubin können inhibitorische Wirkungen auf die RNA- und Protein-Biosynthesen in Sarcoma-180-Zellen bewirken (I. M. Chang et al., Korean Journal of Pharmacognosy, 16, 99 (1985), und I. M. Chang und H. S. Yun, in Advances in Chinese Medicinal Materials Research (ed. H. M. Chang et al.), Singapore, S. 269 (1985)].
4) Entgiftungsaktivität
Aucubin wirkt entgiftend bei Vergiftungen mit toxischen Amanita-Pilzen (koreanische Patentanmeldung No. 92-2290; ebenfalls angemeldet von den Erfindern dieser Anmeldung).
Aucubin zeigte eine starke Antidot-Aktivität bei Beaglehunden, die mit toxischen Pilzextrakten vergiftet wurden [I. M. Chang und Y. Yamaura, Phytotherapy Res., 7, 53 (1993)].
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung Aucubin, ein Aglycon von Aucubin oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon bereitzustellen, die zur Behandlung von Hepatitis-B hervorragend geeignet sind und nur eine geringe Cytotoxizität aufweisen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß pharma zeutische Zubereitungen bereitgestellt werden, die neben üblichen Träger-, Verdünnungs- und Zusatzstoffen Aucubin und/oder ihre Aglycone oder deren pharmazeutische verträgliche Salze als Wirkstoff(e) enthalten.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung ist sowohl bei Menschen als auch bei Tieren einsetzbar.
Aucubin ist dargestellt durch die Strukturformel (A);
Iridoidverbindungen wie Aucubin weisen ähnliche chemische und pharmakologische Eigenschaften auf, d.h. sie weisen Leberprotektive Eigenschaften auf, und ihnen kommt eine antivirale Aktivität gegen HBV-Infektionen zu.
Um die erfindungsgemäß gestellte Aufgabe zu lösen, d.h. neue antiviral-wirkende Therapeutika zur Behandlung von Hepatitis-B-Infektionen bereitzustellen, wurden erfindungsgemäß verschiedene Iridoidverbindungen untersucht, die aus Pflanzen mit medizinischen Inhaltstoffen stammten. Es wurde gefunden, daß diese Iridoidverbindungen Leber-schützende Aktivitäten gegen hepatotoxische Chemikalien wie CCl₄ und α-Amanitin und eine biologische Aktivität bei der RNA- und Proteinsynthese aufweisen.
Um mögliche antivirale Aktivitäten von Iridoidverbindungen unter Berücksichtigung ihrer biologischen Eigenschaften wie die inhibitorischen Wirkungen auf die RNA- und die Protein-Biosynthesen zu untersuchen, wurde ein in vitro-Zellkultursystem unter Verwendung von 2.2.15 Zellen (Hep G2 Zellen) ausgewählt [M. A. Sells et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 84, 1005 (1987)]. Das Verfahren zur Bestimmung antiviraler Aktivitäten unter Verwendung dieser Zellinie ist an anderer Stelle beschrieben [B. E. Korba und G. Milman; A cell culture assay for compounds which inhibit hepatitis B virus replication, Antiviral Research, 15, 217 (1991)].
Erfindungsgemäß wurde nunmehr überraschend gefunden, daß die oben beschriebenen Iridoid-Glycoside mit den angegebenen pharmakologischen Eigenschaften sehr effektive natürliche Produkte zur Hemmung der HBV-DNA-Replication darstellen; es wurde wei terhin gefunden, daß diese erfindungsgemäß bereitgestellten Iridoid-Glycoside in pharmazeutischen Zubereitungen zur Behandlung von durch HBV-Infektion verursachter Hepatitis einsetzbar sind und diese pharmazeutischen Zubereitungen relativ geringe Cytotoxizitäten und geringe akute Toxizitäten zeigen (Tabellen 1–3).
Wenn das Iridoid-Glycosid mit β-Glycosidase vorbehandelt und anschließend zu einer mit HBV-DNA-infizierten 2.2.15-Zelle zugegeben wurde, wurde die Replikation der HBV-DNA signifikant unterdrückt. Wenn ausschließlich eine β-Glucosidase-Behandlung ohne Zugabe der Iridoid-Glyuoside durchgeführt wurde, trat keine Hemmung auf. Deshalb ist die Herstellung von Iridoid-Aglucon (genin-Form) aus dem Glycosid durch ein Zucker-hydrolysierendes Enzym Voraussetzung für die antiviralen Eigenschaften, wie vorher beschrieben wurde.
Die Ergebnisse zeigen, daß Aucubin eine bemerkenswerte Hemmung der HBV-DNA-Biosynthese bewirkt. In den nachfolgenden Beispielen werden die Vorteile der erfindungsgemäß bereitgestellten antiviralen pharmazeutischen Zubereitungen zur Behandlung einer Hepatitis-B-Virus-Infektion weiter beschrieben. Die pharmazeutischen Zubereitungen zeigen vorteilhafterweise einen geringen Toxizitätsgrad. Weiterhin sind die Wirkstoffe aus weitverbreiteten Pflanzen ohne weiteres herstellbar.
Die Bestimmung der antiviralen Aktivitäten von Aucubin unter Verwendung der 2.2.15-Zellkultur wurde wie folgt durchgeführt.
BEISPIEL 1
Wirkungen von Aucubin auf die Hemmung der Hepatitis-B-Virus-Replikation
Einzelheiten des Versuchsablaufs sind bei Korba und Milman [An tiviral Res., 15, 217 (1991)] beschrieben.
1) Zellkultur
Die Bestimmung der antiviralen Wirksamkeit wurde bei zwei verschiedenen Zellpassagen von 2.2.15-Zellen durchgeführt. Alle Vertiefungen aller Mikroplatten wurden mit gleicher Dichte und gleichzeitig eingesät. Die Zellinie wurde in RPMI 1640-Kulturmedium, das 5% fötales Rinderserum (fetal bovine serum = FBS), 2 μm Glutamin und 50 μg/ml Gentamycinsulfat enthielt, gehalten. Die Zellkultur wurde auf Mycoplasmenkontamination und auf Resistenz gegen G418 untersucht. Zellen (1 × 10⁴/cm²) wurden in eine Vielloch-Kulturplatte (96 Vertiefungen) eingesät, sieben Tage lang bis zur Konfluenz kultiviert und anschließend weitere 2–3 Tage lang im konfluenten Zustand belassen, um den HBV-DNA-Level zu stabilisieren. Anschließend wurde das Kulturmedium 24 Stunden, bevor die Testproben zu den Zellen gegeben wurden, ersetzt. Während des neuntägigen Zeitraums wurde das Kulturmedium ersetzt, und die Iridoidproben wurden zu den Kulturen in frischem Kulturmedium in 24stündigen Abständen zugegeben. Sofort vor der ersten Dosis der Testverbindung (Tag 0) und nach 3, 6 und 9 Tagen Behandlung wurde das Kulturmedium gesammelt und bei –70°C zur viralen DNA-Analyse aufbewahrt. Anschließend wurden die Zellen präpariert, um den Gehalt an intrazellulärer HBV-DNA zu bestimmen.
2) Extraktion der DNA und RNA
Um den Gehalt an extrazellulärer HBV-DNA zu bestimmen, wurden 0,2 ml des Kulturmediums 20 Minuten lang bei 25°C in 1 M NaOH/10 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl/0,015 M Natriumcitrat, pH 7,2) inkubiert und auf Nitrocellulosemembranen, die vorher in 20 × SSC eingeweicht wurden, unter Verwendung einer slot-blot-Vorrichtung aufgetragen. Die Proben wurden 2 mal in 0,5 ml 1 M Tris/2 M NaCl (pH 7,2) und 1 mal in 0,5 ml 20 × SSC gewaschen. Anschließend wurden die Membranfilter in 2 × SSC gewaschen und bei 80°C eine Stunde lang unter Vakuum erhitzt.
Um die intrazelluläre HBV-DNA zu analysieren, wurden die Zellen in 0,5 ml Lysispuffer (4 M Guanidinisothiocyanat, 7% 2-Mercaptoethanol und 2% Sarkosil) pro Vertiefung gelöst und eine Stunde lang gegen 6 Liter 50 mM Tris, pH 8,0–1 mM Na₂EDTA unter Verwendung eines Mikrodialysiergerätes dialysiert. Die Lysate wurden anschließend mit Proteinase K verdaut, mit Phenol und Chloroform extrahiert, mit Ethanol präzipitiert und in 10 mM Tris pH 8,0–1,0 mM Na₂EDTA resuspendiert. Die in einer 10 cm Schale aufbewahrten kultivierten Zellen wurden in 6 ml Lysispuffer gelöst, und die zelluläre RNA und DNA wurden durch das Verfahren von Korba et al. [Hepatology, 9, 461 (1989)] präpariert.
3. Gelelektrophorese
Die zellulären DNA-Proben (10 μg/Bahn) wurden mit HindIII-Enzym verdaut und auf einem 1% Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen und anschließend auf Nitrocellulosemembranen übertragen. Die nicht fraktionierte zelluläre RNA (30 μg/Bahn) wurde denaturiert und in einem 1% Agarosegel mit 6% Formaldehyd/Na₃PO₄ (pH 6,5) einer Elektrophorese unterzogen und anschließend auf eine Nitrocellulosemembran übertragen.
4. Hybridisierungsanalyse der Hepatitis-B-Virus-DNA
Ein gereinigtes 3,2 kb EcoRI HBV-DNA-Fragment, welches mit [³²P]dCTP durch Nick-Translation markiert war, wurde als Hybridisierungsprobe verwendet. Die Hybridisierungsbedingungen und die anschließenden Waschschritte wurden unter Verwendung des bei Korba et al. [Hepatology, 9, 461 (1989)] beschriebenen Verfahrens durchgeführt. Der Gehalt an HBV-Nukleinsäuren wurde unter Verwendung eines Ambis-β-Scanners bestimmt. Die relativen Mengen an Radioaktivitäten von hybridisiertem ³²P wurden mit bekannten Mengen an HBV-DNA-Standard verglichen, der auf jedes Nitrocellulosemembranfilter (Gel oder slot blot) aufgetragen war. Die Standardkurve wurde verwendet, um die relativen Radioaktivitäten mit den HBV-DNA-Mengen zu korrelieren.
Aufgrund inhärenter Unterschiede in den Gehalten sowohl an intrazellulärer und extrazellulärer HBV-DNA ist nur eine Hemmung um mehr als das 3,5 fache (für HBV-Virion-DNA) oder um das 3,0 fache (für Replikationszwischenprodukte, RI in Tabelle 1) ausgehend vom durchschnittlichen Gehalt für die HBV-DNA-Formen in unbehandelten Zellen in den vorliegenden Versuchen statistisch signifikant (P < 0,05). Die Menge an integrierter HBV-DNA in jeder zellulären DNA-Präparation (die in den vorliegenden Experimenten, bezogen auf eine Zelle, konstant bleibt) wurde verwendet, um die Menge an intrazellulären HBV-DNA-Formen zu berechnen, wodurch technische Unterschiede, die der Blot-Hybridisierungsanalyse inhärent sind, eliminiert wurden. Typische Werte für extrazelluläre HBV-Virion-DNA in unbehandelten Zellen reichten von 50–150 pg/ml Kulturmedium (im Durchschnitt etwa 76 pg/ml). Die intrazellulären HBV-DNA-Replikationszwischenprodukte (RI) in unbehandelten Zellen reichten von 50–100 pg/μg Zell-DNA (durchschnittlich etwa 74 pg/μg Zell-DNA). Im allgemeinen sind die Hemmungen in der intrazellulären HBV-Menge aufgrund der Behandlung mit antiviralen Mitteln weniger ausgeprägt, und sie treten langsamer auf als Suppressionen in den Mengen von HBV-Virion-DNA.
Auf der Grundlage der aus den durchgeführten Hybridisierungsanalysen gewonnenen Ergebnisse wurde ermittelt, daß 1,0 pg intrazellulärer HBV-DNA/μg zellulärer DNA 2-3 genomischen Kopien pro Zelle entsprechen und 1,0 pg extra zellulärer HBV-DNA/ml Kulturmedium 3 × 10⁵ viralen Teilchen/ml entsprechen. Ergebnisse Tabelle 1: Wirkungen von Aucubin auf die HBV-DNA-Replikation in einer 2.2.15-Zellkultur

*: Die Analyse der intrazellulären HBV-DNA wurde 24 Stunden nach der neuntägigen Behandlung durchgeführt.
¹) RI: Replikationszwischenprodukt
**: Die Sensitivitätsgrenze für die Virion-HBV-DNA betrug 0,1 pg/ml.
²) ddC: 2',3'-Dideoxycytidin, eine positive Kontrolle als bekanntes antivirales Mittel.
³) GLY: Aucubin wurde mit β-Glucosidase wie folgt vermischt; es wurde jedoch vor der Zugabe zur Kulturzelle keine Inkubation durchgeführt.
⁴) 30'GLY: Aucubin wurde in Gegenwart von 2,5 mg/ml β-Glucosidase bei 37°C in 0,1 M Natriumacetat (pH 5) 30 Minuten lang inkubiert, bevor es zum Kulturmedium zugegeben wurde. Die Ansatzlösung wurde um das 100fache verdünnt, und die End-β-Glycosidase-Konzentration im Kulturmedium betrug 25 μg/ml.

Dieses Experiment zeigte, daß die erfindungsgemäß genannten Iridoidverbindungen eine wirksame Hemmung der HBV-DNA-Replikation verursachten. Demnach können pharmazeutische Zubereitungen, die die erfindungsgemäß bereitgestellten Wirkstoffe enthalten, zur Prävention und Behandlung von durch Hepatitis-B-Virus verursachter Hepatitis verwendet werden.
BEISPIEL 2
Zelltoxizitätstest
Der Toxizitätstest wurde in 96-Well Gewebekulturplatten mit flachem Boden durchgeführt. Diese Zellen wurde in gleicher Weise wie diejenigen Zellen, die für die Bestimmung der antiviralen Aktivität der Testverbindungen verwendet wurden, kultiviert und behandelt (Beispiel 1). Jede Gruppe wurde bei vier Konzentrationen in drei Kulturen getestet. Die Aufnahme eines neutralen roten Farbstoffs wurde zur Bestimmung des relativen Toxizi tätsgrades verwendet. Die Absorption von aufgenommenen Farbstoff bei 510 nm (A₅₁₀) wurde zur quantitativen Analyse verwendet. Die Werte sind als Prozentzahlen der A₅₁₀-Mittelwerte (Mittelwert ± Standardabweichung) in 9 getrennten Kulturen unbehandelter Zellen, die auf der gleichen 96-Lochplatte, wie sie für die Testverbindung verwendet wurde, verblieben, dargestellt. Der Prozentsatz der Farbstoffaufnahme in den 9 kontrollierten Kulturen auf Platte 23 betrug 1004. Die Ergebnisse zeigten, daß keine signifikante Zelltoxizität im Bereich der Konzentration der Testverbindung beobachtet wurde (Tabelle 2). Tabelle 2 Zelltoxizitätstest Menge der Farbstoffaufnahme bei verschiedenen Konzentrationen (% der Kontrolle)
Menge der Farbstoffaufnahme bei verschiedenen Konzentrationen (% der Kontrolle)

* 30'GLY: Aucubin wurde mit β-Glucosidase 30 Minuten lang bei 37°C in 0,1 M Natriumacetat (ph 5) inkubiert, bevor es zum Kulturmedium zugegeben wurde. (Die Stammlösung wurde um das 100-fache verdünnt, und die β-Glucosidase-Endkonzentration im Kulturmedium betrug 25 μg/ml).
** GLY: Aucubin wurde wie oben beschrieben ohne Vorinkubation mit β-Glucosidase vermischt.
*** ausschließlich GLY: β-Glucosidase alleine, behandelt ohne Zugabe von Aucubin.

BEISPIEL 3
Akuttoxizitätstest in Mäusen
Um die mögliche akute Toxizität von Aucubin zu testen, wurden jeder Maus intraperitonial eine einfache Dosis von 100, 300, 600 und 900 mg/kg verabreicht, und die Todesrate wurde während einer Zeitdauer von 24 Stunden untersucht. Tabelle 3: Akuttoxizitätstest in Mäusen

*Jede Testgruppe bestand aus 10 Mäusen
SGOT: Serumglutaminoxalsäuretransaminase

Das Serum wurde 24 Stunden nach den Behandlungen mit Aucubin gesammelt.
Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen keine Todesfälle, woraus hervorgeht, daß die minimale tödliche Dosis mehr als 900 mg/kg beträgt. Bei Verabreichung einer hohen Dosis zeigten die Aktivitäten von SGOT und alkalischer Phosphatase eine geringe Abnahme und die Triglycerid-Gehalte eine leichte Zunahme, was zeigt, daß keine ernsthafte toxische Wirkung auftrat.
Die erfindungsgemäß bereitgestellten Iridoidverbindungen können sowohl oral als auch parenteral in Form einer pharmazeutischen Zubereitung verabreicht werden. Die Herstellung der pharmazeutischen Zubereitung erfolgt in an sich bekannter Weise durch Vermischen mit einem Träger oder mit einem anderen an sich bekannten Hilfsstoff. Die hierzu notwendigen Materialien und Schritte sind dem auf dem pharmazeutischen Gebiet arbeitenden Fachmann bekannt.
Im folgenden werden Beispiele für erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitungen angegeben: Zubereitung 1 (Tablette)

Aucubin (pro Tablette) 500 mg

Lactose 80 mg

Sucrose 80 mg

Akaziengummi 10 mg

Talkum 10 mg

Magnesiumstearat 1 mg

gereinigtes Wasser geeignete Menge
Aucubin, Lactose, Sucrose und Akaziengummi wurden vermischt, und es wurde eine geeignete Menge an Wasser zugegeben und anschließend abgekocht. Mit Hilfe eines Siebes der Größe Nr. 8 wurden Körnchen hergestellt. Anschließend wurden die feuchten Körnchen bei 40°C getrocknet; anschließend wurden mit Hilfe eines Siebes der Größe Nr. 10 kleine Körnchen hergestellt; anschließend wurden Talkum und Magnesiumstearat zugegeben und die Tablette hergestellt. Zubereitung 2 (Kapselform)

Geniposid 500 mg

Lactose 80 mg

Magnesiumstearat geeignete Menge
Diese Bestandteile wurden vermischt und in Hartkapseln abgefüllt.
Zubereitung 3 (Injektionslösung)
50 mg Aucubin wurden in 5 ml einer sterilisierten physiologischen Kochsalzlösung auf 60°C erhitzt, in eine sterile Ampulle gefüllt und verschlossen.