JPH02503988A - 改変雄蕊細胞を有する植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 改変雄蕊細胞を有する植物 本発明は、外来ＤＮＡ配列が核ゲノム中に安定に組込まれるよう細胞が形質転換 される雄不稔性植物およびその繁殖材料（たとえば種子）に関するものである。

本発明の外来ＤＮＡ配列は少なくとも１個の第１外来ＤＮＡ　（以下、「雄不稔 性ＤＮＡＪと称する）を有し、この雄不稔性ＤＮＡは（１）植物の雄蕊細胞にて 生産もしくは過剰生産された際に雄蕊細胞の代謝、機能および／または発育を顕 著に阻害する第１ＲＮＡまたは蛋白もしくはポリペプチドをコードし、かつ（２ ）植物の雄蕊細胞にて雄不稔性ＤＮＡの発現を選択的に指令しつる第１プロモー タと同じ転写単位に位置しかつその制御下にある。特に本発明はこの種の接離不 稔性（ｎｕｃｌｅａｒ　ｍａｌｅ−ｓｔｅｒｉｌｅ）植物およびその繁殖材料に 関し、ここで本発明の外来ＤＮＡ配列は少なくとも１個の第２外来ＤＮＡ　（以 下「標識ＤＮＡＪと称する）をも含有する外来キメラＤＮＡ配列であって、この 標識ＤＮＡは（１）植物の少なくとも特定組織もしくは特定細胞に存在する際に その全植物を少なくとも特定組織もしくは特定細胞に第２ＲＮＡ、蛋白もしくは ポリペプチドを含有しない他の植物から容易に分離させうるような第２ＲＮＡま たは蛋白もしくはポリペプチドをコードし、（２）植物の少なくとも特定組織も しくは特定細胞にて標識ＤＮＡの発現を指令しうる第２プロモータと同じ転写単 位に位置しかつその制御下にあり、さらに（３）雄不稔性ＤＮＡと同じ植物の細 胞における核ゲノムの遺伝子位置に存在する。

さらに本発明は、第１プロモータの制御下における少なくとも１つの雄不稔性Ｄ ＮＡを含有しかつこの雄不稔性ＤＮＡに隣接して第２プロモータの制御下におけ る少なくとも１つの標識ＤＮＡをも含有しうる外来キメラＤＮＡ配列に関するも のである。

さらに本発明は、本発明の外来ＤＮＡ配列を含有すると共に植物細胞の形質転換 に適し、外来ＤＮＡ配列を細胞の核ゲノム中に安定に組込むベクターに関する。

さらに本発明は、核ゲノムが外来ＤＮＡ配列により形質転換される植物の細胞お よび植物細胞培養物に関するものである。

さらに本発明は、接離不稔性植物およびその繁殖材料、並びに外来Ｄ　Ｎ　Ａ配 列を含有するその細胞培養物にも関し、ここで雄不稔性ＤＮＡは（１）第１プロ モータの制御下にありがっ必要に応じ第２プロモータの制御下で標ｍＤＮＡと同 じ遺伝子位置に存在し、（２）植物細胞の核ゲノム中に安定に組込まれ：かっ（ ３）第１ＲＮ　Ａ　ｓ蛋白もしくはポリペプチドとして植物の雄蕊細胞で選択的 に発現することができる。

さらに本発明は、ハイブリッド植物まで成長するハイブリッド種子の生産方法に も関し、この方法は（１）好ましくは除草剤に対する耐性を植物に付与する蛋白 をコードする標ｍＤＮＡを核ゲノム中に有する本発明の雄不稔性植物と、　（２ ）ゲノム中に標識ＤＮＡを持たない雄稔性植物とを交雑させることを特徴とする 特に本発明は、産業規模において、好ましくは殆んど手作業の必要なしにほぼラ ンダムな集団としてハイブリッド種子を生産する方法に関する。

さらに本発明は、植物ゲノムからのタベート特異性プロモータにも関するもので ある。このプロモータは、植物を接離不稔性となるよう形質転換させるために本 発明の外来ＤＮＡ配列におｊフる第１プロモータとして使用され得る。

発明の背景 植物のハイブリッド化は、親植物の所望の形質の組合せを備えた子孫を生産する ための重要な方法として認識される。得られるハイブリッド子孫は、しばしばた とえば収量、環境変化に対する適応性および病気抵抗性のような各種の形質にお いて親を凌ぐ能力を有する。この能力は「ヘテロ−シス」もしくは「雑種強勢」 と呼ばれる。その結果、ハイブリッド化はたとえばトウモロコシ、甜菜およびヒ マワリのような主作物を改良するため広範に使用されている。主として殆んどの 植物は自家受粉および他家受粉の両者を受けうるという事実に関する多くの理由 から、ハイブリッド種子の収穫を得るべく顕著な自家受粉なしに制御された植物 の他家受粉を行なうことは、産業規模にて達成困難であった。

天然において、大多数の作物は同一植物の雄性および雌性の繁殖器官を通常同じ 花の互いに近接した部位に形成する。これは自家受粉に好適である。しかしなが ら成る種の植物は例外であって、その繁殖器官の特定形態により、他家受粉に好 適である。これらの植物は向上した活力および適応性を持ったハイブリッド子孫 を生産する。Ｃａｎｎａｂｉｓ　ｓｓｐ、　　（麻）におけるこの種の１つの形 態は、別個の植物に雄性繁殖器官および雌性繁殖器官を有する。Ｚｏａ　ｗａｙ ｓ　（トウモロコシ）におけるこの種の他の形態は、同一植物の種々異なる部分 に雄性繁殖器官および雌性繁殖器官を有する。Ｅｌａｅｓｉｓ　ｇｕｌｎｅｅｎ ｓｌｓ　（油椰子）におけるこの種の他の形態は雄性配偶子と稔性の雌性配偶子 とを有しており、植物の発育における種々異なる時期に稔性となる。

たとえば＾ｎａｎａ、ｓ　ｃｏｌｌｏｓｕｓ　（パイナツプル）のような成る種 の他の植物は、その繁殖器官の特定の生理学を介し他家受粉を促進する。この種 の植物はいわゆる「自家不和合系」を発生して、１つの植物の花粉が同じ植物の 雌性配偶子または同じ遺伝子型を有する他の植物の雌配偶子を受精することがで きない。

成る種の他の植物は、いわゆる「雄不稔性」のゲノム特性を天然に示すことによ り他家受粉に好適である。この特徴により、植物の杓はこれら朽により生産され た花粉が成熟に達する前に退化する〔「高等植物における雄不稔性Ｊ　、　Ｍ、 、　Ｌ、　Ｈ。

カウル（１９８７）　　；モノグラスフ・オン・セオレチカル・アンド・アプラ イド・ジニネチックス１０．スブリンガー・フェアシーク出版。参照〕。この種 の天然の雄不稔性の特徴は特にしばしば劣性欠失を含む広範囲の自然突然変異か ら生ずると思われ、かつこの特徴は主として自家受粉する植物種には容易に維持 されない。何故なら、自然条件下において種子が生産されないからである。

天然には、主として４種類の雄不稔性が観察される。これら４種類の雄不稔性を 全て産業上の育種計画に用いて、たとえばトウモロコシ、甜菜、油菜およびヒマ ワリのような作物のハイブリッド種子を生産すべく他家受粉するよう確保する。

１つの種類の雄不稔性は核コード化され、かつ劣性対立形質として遺伝すると思 われる。育種の目的で、劣性の雄不稔性親植物は、これを劣性の雄不稔性対立形 質を持ったヘテロ接合性の雄稔性植物と交雑させることにより維持され、子孫は ５０％劣性の雄不稔性植物である。他の５０％は雄稔性植物であって、劣性雄不 稔性対立形質が選択自在もしくはスクリーニング自在な標識と共に分離される場 合しか効果的に行なうことができない他支配計画により間引かねばならない。米 国特許第４．７２７．２１９　　ｒ号には、ハイブリッドトウモロコシを生産す るため劣性雄不稔性を使用する方法が記載されている。

第２の種類の雄不稔性は核コード化されるか、優性対立形質として遺伝する。劣 性雄不稔性植物と比較して優性雄不稔性植物を維持して５０％優性の雄不稔性植 物の子孫を産生しうる点にある。しかしながら、この優性接離不稔性植物の有用 性は限度がある。何故なら、大抵の場合、その優性雄不稔性対立形質は選択自在 もしくはスクリーニング自在な標識に緊密に結合しないからである（すなわち、 同一の遺伝子部位に存在しない）。

第３の種類の雄不稔性は細胞質（ｃｙｔｏｐｌａｓｍａｔｌｃａｌ　Ｉｙ）コー ド化される。大抵の場合、細胞質コードは植物のミトコンドリアゲノム中に存在 し、極く少数の場合には植物の葉緑体ゲノム中に存在する。細胞質コード化され た雄不稔性の遺伝はメンデル法則にしたがわず、寧ろ細胞質因子に依存する。細 胞質雄不稔性植物と雄稔性植物との間の交雑により得られる子孫は全て細胞質雄 不稔性遺伝子を有し、したがって不稔性である。その結果、この種の植物の子孫 は、この子孫の経済的生産物が種子として使用されずに寧ろたとえば観賞植物お よび甜菜のような植物である場合のみ産業的価値がある。

第４の種類の雄不稔性は、核コード化された雄不稔性と細胞質コード化された雄 不稔性との両者の組合せの結果である。雄不稔性を誘発する核対立遺伝子は一般 に劣性であり、また雄不稔性の細胞質対泣遺伝子を有しかつ雄不稔性を誘発する 核対立遺伝子に対してホモ接合性である植物のみが表現型として雄不稔性である 。この種の植物において、対応の優性雄稔性−誘発対立遺伝子または「稔性の保 持体ｊは雄−稔性表現型を発生する。その結果、この種の植物の雄不稔性子孫は 、これら雄不稔性植物に稔性の保持体を有する花粉を受粉させて雄稔性にするこ とができる。その結果、この種の植物の子孫は、経済的生産物が種子である場合 、すなわちたとえばトウモロコシ、ツルガムおよびヒマワリのような植物につき 産業的価値がある。

典型的にはハイブリッド種子の生産は、細胞質雄不稔性植物および雄稔性植物の 大規模な成育によりかつ得られるハイブリッド種子を非ハイブリッド種子と混合 しないよう成る程度防止することにより（たとえば明確な標識により）達成され ている。

米国特許第３．８４２，５３８号によれば、ハイブリッド種子は色によって非ハ イブリッド種子から面倒に分離される。米国特許第４．３５１，１．３０号によ れば、ハイブリッド種子を非ハイブリッド種子から分離する問題は、背丈の低い 雄不稔性植物と背丈の高い雄稔性植物とを用い、次いで受粉後に背丈の高い雄稔 性植物を死滅させることにより回避される。米国特許第４．６５８．０８５号、 第４，５１７．７６３号および第４．１３５１１．０８４号によれば、雄稔性植 物には存在しない除草剤耐性を細胞質雄不稔性植物に与え、受粉後に雄稔性植物 を除草剤で死滅させる。米国特許第４．３０５．２２５号によれば、雄不稔性の 稲植物に成長ホルモン（たとえばジベレリン）を噴霧して稲の葉鞘から円錐花序 を完全に出現させることにより、花が雄稔性植物から花粉を受入れる能力を増大 させる。

雄不稔性植物からハイブリッド種子を生産するためのこれら全ての方法において 、（１）各雄不稔性植物からの高いハイブリッド種子生産；（２）殆んど専ら雄 稔性植物の花粉と雄不稔性植物の卵とから得られかつ殆んど雄稔性植物からの非 ハイブリッド種子を含まないハイブリッド種子群；（３）雄不稔性植物および雄 稔性植物の両者の容易な生産；および（４）雄不稔性植物に受粉した後の雄稔性 植物のほぼ完全な除去もしくは撲滅、或いは雄稔性植物により生産された非ハイ ブリッド種子の雄不稔性植物により生産されたハイブリッド種子からの選択的分 離を産業的規模で簡単かつ安価に得るための方法が探求されている。

発明の要旨 本発明によれば、外来ＤＮＡ配列、好ましくは外来キメラＤＮＡ配列により形質 転換された核ゲノムを有する植物の細胞において、 （ａ、）　　前記植物の雄蕊細胞で産生されまたは過剰産生された際に前記雄蕊 細胞の代謝、機能および／または発育を顕著に阻害する第１ＲＮＡ、蛋白もしく はポリペプチドをコードする雄不稔性ＤＮＡ、、および （ｂ）　　前記雄不稔性ＤＮＡの発現を前記植物の雄蕊細胞にて選択的に指示し うる第１プロモータ からなり、前記雄不稔性、ＤＮＡは前記第１プロモータと同じ転写単位に位置し かつその制御下にあることを特徴とする植物の細胞が提供される。

形質転換された細胞の核ゲノムにおける外来ＤＮＡ配列は、好ましくは雄不稔性 ＤＮＡと同じ遺伝子部位に：（Ｃ）　　植物の少なくとも特定組織または少なく とも特定細胞に存在する際に前記植物を少なくとも前記特定組織もしくは特定細 胞に第２ＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプチドを含有しない他の植物から容易に分 離しつるようにする前記１２ＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプチドをコードする標 識ＤＮＡ、および（ｄ）　　前記標識ＤＮＡの発現を少なくとも前記特定組織も しくは特定細胞にて指令しうる第２プロモータをさらに含むことができ、標：ｍ ＤＮＡは第２プロモータと同じ転写単位に存在しかつその制御下にある。

さらに本発明によれば、雄不稔性ＤＮＡと第１プロモータとからなりかつ標識Ｄ 　Ｎ　Ａおよび第２プロモータをも含みうる舛来キメラＤＮＡ配９列も提供され 、これはさらに第１蛋白もしくはペプチドまたは第２蛋白もしくはペプチドを外 来キメラＤＮＡ配列が細胞質にて発現される植物細胞の葉緑体もしくはミトコン ドリアに導入しうるトランジットペプチドをコードする少なくとも１つの追加Ｄ ＮＡをも含む。

さらに本発明によれば、それぞれ形質転換細胞よりなる雄不稔性植物および植物 細胞培養物；雄不稔性植物の種子：雄不稔性植物を雄稔性植物と交雑させて得ら れるハイブリッド種子および植物；並びにこの種のハイブリッド種子の生産方法 も提供される。

さらに本発明によれば、タベート特異性の第１プロモータも提供される。

発明の説明 本発明によれば、雄不稔性植物は、植物細胞を周知方法で細胞の核ゲノム中、す なわち本発明の外来ＤＮＡ配列中に安定挿入することにより形質転換させて、植 物の単一細胞から作成される。外来ＤＮＡ配列は、第１プロモータの制御下にあ りかつ５°末端が第１プロモータに融合し、さらにその３゛末端が適する転写制 御信号（ポリアデニル化信号を含む）に融合した少なくとも１個の雄不稔性ＤＮ Ａを含む。これにより第１ＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプチドは植物の雄蕊細胞 にて選択的に生産されもしくは過剰生産されて、植物を雄不稔性にする。好まし くは、外来ＤＮＡ配列は、さらに第２プロモータの制御下にありかつそこに５゛ 末端が融合し、さらにその３°末端が適する転写制御信号（ポリアデニル化信号 を含む）に融合した少なくとも１個の標ｍＤＮＡをも含む。標識ＤＮＡは好まし くは雄不稔性と同じ遺伝子部位に位置し、これにより第２　ＲＮ　Ａ、　、蛋白 もしくはポリペプチドが少なくとも植物の特定組織もしくは特定細胞で産生され て、植物を特定組織もしくは特定細胞に第２ＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプチド を持たない他の植物から容易に区別しかつ／または分離することができる。これ は、高い確信度を持って雄不稔性ＤＮＡと標識ＤＮＡとの両者が植物の子孫で一 緒に分離することを補償する。

植物（特にアグロバクテリウムで感染しうる植物）の細胞は、好ましくは外来Ｄ ＮＡ配列を含有しかつアグロバクテリウムが有する無力（ｄｉｓａｒｍｅｄ）　 Ｔ　ｉ−プラスミドであるベクターを用いて、本発明により形質転換される。こ の形質転換は、たとえばヨーロッパ特許出願公開第０，１ｉｆｔ、７１８号およ び第０，２７０．８２２号に記載された方法を用いて行なうことができる。好適 なＴｉ−プラスミドベクターはＴｉ−プラスミドのＴ−ＤＮＡの境界配列の間、 或いは少なくともＴｉ−プラスミドのＴ−ＤＮＡの右側境界配列の左側に位置す る外来ＤＮＡ配列を有する。勿論、他の種類のベクターを用いて植物細胞を、た とえば直接的遺伝子移動（たとえばヨーロッパ特許公開節０．２２３．２４７号 に記載）、花粉媒介形質転換（たとえばヨーロッパ特許公開節０．２７０．３５ ６号、ＰＣＴ出願公開Ｗ　Ｏ８５７０１８５８号およびヨーロッパ特許公開節０ ．２７５．０１１ｉ９号に記載）、インヒドロのプロトプラスト形質転換（たと えば米国特許第４．［ｉ８４．６１１号）、植物ＲＮＡウィルス媒介形質転換（ たとえばヨーロッパ特許公開節０．０６７．５５３号および米国特許第４，４０ ７，９５６号に記載）、並びにリポソーム媒介形質転換（たとえば米国特許第４ ．５３Ｌ４．７５号に記載）のような方法により形質転換させることができる。

好ましくは、本発明の接離不稔性植物は、第１プロモータの制御下にある雄不稔 性ＤＮＡと第２プロモータの制御下にある標識ＤＮＡとの両者を有する外来ＤＮ Ａ配列を持った無力のＴｉ−プラスミドベクターにより植物細胞を形質転換させ て得られる。標ＥＩＤＮＡはＴｉ−プラスミドベクターにおける雄不稔性ＤＮＡ の上流もしくは下流に存在しうるが、好ましくは両者が互いに隣接しかつ境界配 列の間或いは少なくともＴｉ−プラスミドベクターの右側境界配列の左側に位置 して、これらは−緒になって適切に植物細胞の核ゲノム中に移行する。しかしな がら、所望ならば細胞を先ず最初に雄不稔性ＤＮＡと第１ブＮＡ ロモータとを有する外来片う哨配列により形質転換させることができ、次いで標 識ＤＮＡおよび雄不稔性ＤＮＡと同じ細胞の核ゲノムにおける遺伝子部位に挿入 された第２プロモータにより形質転換させることができる。この目的に適するベ クターは、外来ＤＮＡ配列で細胞を形質転換させるため上記したものと同じであ る。好適ベクターは無力のＴｉ−プラスミドベクターである。

雄不稔性ＤＮＡの選択は臨界的でない。適する雄不稔性ＤＮＡは、これが雄不稔 性ＤＮＡを発現する雄蕊細胞の適切な代謝、機能および／または発育を顕著に阻 害して、好ましくはこれにより全ての雄蕊細胞の死滅をもたらす第ユＲＮＡ、蛋 白もしくはポリペプチドをコードするよう周知方法で選択しかつ分離することが できる。雄不稔性ＤＮＡの好適例は次のものをコードする：たとえばＲＮａｓｅ ＴｌのようなＲＮアーゼ（これはグアニン残基の後で結合を加水分解することに よりＲＮＡ分子を減成する）およびＢａｒｎａｓｅ；たとえばエンドヌクレアー ゼのようなりＮａ５ｅ　　（たとえばＥｃｏＲＩ）；またはたとえばパパインの ようなプロテアーゼ（たとえばパパインチモーゲンおよびパパイン活性蛋白）。

雄不稔性ＤＮＡの他の例は植物ホルモンの合成を触媒する酵素、たとえば、シト キニン生合成における第１過程を触媒すると共にアグロバクテリウムＴ−ＤＮＡ の遺伝子４によりコードされる酵素であるイソペンテニルトランスフェラーゼ； およびオーキシンの合成に関与しかつアグロバクテリウムＴ−ＤＮＡの遺伝子１ および遺伝子２によりコードされる酵素をコードする。雄不稔性ＤＮＡのさらに 他の例は、グルカナーゼ；リパーゼ、たとえばホスホリパーゼＡ２　〔ベルヘイ ジ等（１９８１）　、レビユー・バイオケミカル・フォーマコロジー１第９１巻 、第９２〜２０３頁〕　；脂質ペルオキシダーゼ；または植物細胞壁の阻止剤を コードする。さらに他の雄不稔性ＤＮＡの例は、植物細胞に対し毒性である蛋白 、たとえば細菌毒素（たとえばジフテリアトキシンのＢ−断片、すなわちボッリ ン）をコードする。

さらに他の雄不稔性ＤＮＡの例は、たとえばヨー口・ツノ＜特許公開節０．２２ ３，３９９号に記載されたような内生プロモータの制御下で植物の雄蕊細胞にて 天然に転写されるＤＮＡのストランドに対し相補的なりＮＡストランドをコード するアンチセンスＤＮＡである。この種のアンチセンスＤＮＡは、雄蕊細胞中で 天然に産生されるＲＮＡのコード化および／または非コード化部分に結合しうる ＲＮＡ配列に転写されて、天然産生されたＲＮＡの翻訳を阻止することができる 。この種のアンチセンスＤＮＡの例はＴＡ２９遺伝子のアンチセンスＤＮＡ　（ 実施例２に記載）であって、これは植物における釣のタペート細胞にてＴＡ２９ プロモータの制御下に天然に発現される。

雄不稔性ＤＮＡの他の例は、ハーゼロフおよびゲルラ・ツノ１（１９８ｇ）　、 ネイチャー、第３３４巻、第５８５〜５９１頁に記載されたような所定の標的配 列に対し高特異的の開裂を行ないうる特定のＲＮＡ酵素（すなわち、いわゆる「 リボザイム」）をコードする。この種のりボサイムは、たとえばＴＡ２９遺伝子 によりコードされるＲＮＡを標的とするりボザイムである。

さらに他の雄不稔性ＤＮＡの例は、雄蕊細胞を特定の病気、たとえばカビ感染に 対し感受性にしうる物質をコードする。この種の雄不稔性ＤＮＡは、雄不稔性Ｄ ＮＡを発現しない他の全ての細胞が特定の病気に対し耐性である植物に使用する ことができる。

本発明の外来ＤＮＡ配列に関し「外来」という用語は、この外来ＤＮＡ配列が外 来雄不稔性ＤＮＡおよび／または外来第１プロモータを含有することを意味する 。ＤＮＡ、たとえば雄不稔性ＤＮＡおよび第１プロモータ、並びに標識ＤＮＡ、 第２プロモータおよびその他の外来ＤＮＡ配列における他のＤＮＡに関し「外来 」という用語は、植物細胞における同じゲノム環境に存在せず、本発明によるＤ ＮＡにより形質転換され、たとえば植物、細菌、動物、カビ、ウィルスなどの細 胞に天然に存在してそこから前記ＤＮＡが得られるようなりＮＡを意味する。

これは、たとえば外来雄不稔性ＤＮＡもしくは標識ＤＮＡが次のものであっても よいことを意味する：（１）原植物における核ＤＮＡ；（２）形質転換植物細胞 に対し内生（すなわち形質転換される植物と同じ遺伝子型を持った原植物）；お よび（３）形質転換植物細胞中の本発明による外来ＤＮＡ配列におけるそれ自身 の内生プロモータおよび３“末端転写制御信号（原植物から）と同じ転写単位内 に存在；ただしく４）原種物に存在するとは異なる形質転換植物細胞の核ゲノム における位置に挿入されて、原種物にて天然に包囲する遺伝子により形質転換植 物細胞で包囲されないもの。さらに外来雄不稔性もしくは標識ＤＮＡは、たとえ ば次のものとすることもできる：（１）原種物における核ＤＮＡ　；および（２ ）形質転換植物細胞に対し内生；ただしく３）形質転換植物細胞における本発明 の外来キメラＤＮＡ配列にて異なる（すなわちそれ自身でない）内生プロモータ および／または３“末端転写制御信号と同じ転写単位内に存在するもの。さらに 、外来雄不稔性もしくは標：ｍＤＮＡは次のものとすることもできる＝（１）原 植物内の核ＤＮＡ　、および（２）形質転換植物細胞に対し内生；ただしく３） 形質転換植物細胞における本発明の外来キメラＤＮＡ配列にて異質プロモータお よび／または３”末端転写制御信号と同じ転写単位内に位置するもの。さらに、 外来雄不稔性もしくは標識ＤＮＡは、たとえば形質転換植物細胞に対し異質とし かつ形質転換植物細胞における本発明の外来キメラＤＮＡ配列にて内生プロモー タおよび／または３゛転写制御信号（たとえば形質転換される植物と同じ遺伝子 型を有する植物の核ゲノムからのもの）と同じ転写単位内に位置することもでき る。外来雄不稔性ＤＮＡの例は、転写される植物と同じ遺伝子型を有する植物の 核ゲノムから得られて、たとえば形質転換される植物の雄蕊細胞に対し内生であ るプロテアーゼもしくはりボヌクレアーゼのような接触酵素をコードすることが でき、したがって形質転換された雄蕊細胞にて酵素が過剰産生されてその代謝、 機能および／または発育を顕著に阻害する。好ましくは、雄不稔性ＤＮＡおよび 標１ＤＮＡは、それぞれ形質転換される植物細胞に対し異質である。

ＤＮＡ、たとえば雄不稔性ＤＮＡ、第１プロモータ、標よりＮＡ、第２プロモー タおよびその他任意の外来ＤＮＡ配列におけるＤＮＡに関し「異質」という用語 は、この種のＤＮＡが形質転換される植物と同じ遺伝子型を有する植物の細胞の 核ゲノムには天然に存在しないことを意味する。異ＷＤＮＡの例は、形質転換さ れる植物と同じ遺伝子型を有する植物から得られる葉緑体およびミトコンドリア ＤＮＡを包含するが、好適例は形質転換される植物とは異なる遺伝子型を有する 植物からの葉緑体、ミトコンドリアおよび核ＤＮＡ、動物および細菌ゲノムから のＤＮＡ、並びにカビおよびウィルスゲノムからの染色体およびプラスミドＤＮ Ａを包含する。

本発明の外来ＤＮＡ配列に関し「キメラ」という用語は、その雄不稔性ＤＮＡの 少なくとも１つが（１）前記１つの雄不稔性ＤＮＡのだめの第１プロモータの制 御下で天然には存在せず；かつ／または（２）標識ＤＮＡの少なくとも１つと同 じ遺伝子部位には天然に存在しないことを意味する。本発明の外来キメラＤＮＡ 配列の例は、植物源の第１プロモータの制御下における細菌源の雄不稔性ＤＮＡ 　；並びに植物源の第１プロモータの制御下にありかつ細菌源の標識ＤＮＡと同 じ遺伝子部位にある植物源の雄不稔性ＤＮＡである。

雄不稔性ＤＮＡが植物の雄蕊細胞で選択的に発現されるよう、外来ＤＮＡ配列に て雄不稔性ＤＮＡを制御する第１プロモータが、植物の雄蕊細胞にて遺伝子発現 を選択的に指令しつるプロモータであることが好ましい〔「雄蕊」という用語は 、雄性配偶子を生産しかつ巧および花糸を含む花の器官を意味する〕。

この種の雄蕊特異性プロモータは内生プロモータもしくは外生プロモータとする ことができ、かつ核ゲノムから或いは植物細胞のミトコンドリアもしくは葉緑体 ゲノムから得ることができる。いずれにせよ、第１プロモータは形質転換される 植物細胞の核ゲノムに対し外来性である。好ましくは、第１プロモータは、雄不 稔性ＤＮＡを杓、花粉もしくは花糸細胞においてのみ、特にタペートもしくはｉ り表皮細胞においてのみ発現させる。第１プロモータは、この第１プロモータが 雄蕊細胞における雄不稔性ＤＮＡの発現を選択的に指令して雄蕊を死滅させ或い は無力にすると共に植物を稔性雄配偶子を生産しえなくするよう雄不稔性にする べく、植物の種類から周知方法で選択しかつ分離することもできる。第１プロモ ータは好ましくはさらに、特に植物の雌器官における稔性花粉の生産に関与しな い他の植物部分における雄不稔性ＤＮＡの発現を防止するのに有効となるよう選 択されかつ分離される。たとえば、適する内生の雄蕊特異性第１プロモータは次 の工程により雄不稔性となるよう植物にて同定しかつ分離することができる： １、雄蕊、好ましくは朽、花粉もしくは花糸の発育に際し植物中にのみ存在する ｍＲＮＡを探し； ２、この雄蕊特異性ｍＲＮＡを分離し；３、この雄蕊特異性ｍＲＮＡからｃＤＮ Ａを作成し；４、このｃＤＮＡをプローブとして使用することにより、雄蕊特異 性ｍＲＮＡをコードするＤＮＡを持った植物ゲノムにおける領域を同定し；次い で ５、雄蕊特異性ｍＲＮＡをコードするＤＮＡから上流（すなわち５“）に存在し かつこのＤＮＡのプロモータを含有する植物ゲノムの部分を同定する。

この種の第１プロモータの例はＴＡ２９プロモータ、ＴＡ２Ｂプロモータおよび ＴＡ］３プロモータ（これらについては後記実施例に説明し、タバコから分離さ れている）およびタベート特異性プロモータである。他の植物種から得られる他 のタペート特異性第１プロモータは、上記工程４におけるようにプローブとして ＴＡ２９．ＴＡ２ＧもしくはＴＡ１３造伝子を用いることにより、そのゲノムか ら分離することができる。ハイブリッド化条件の下で、この種のプローブは他の 植物種のゲノムから得られたＤＮＡ配列の混合物においてタベート特異性ｍＲＮ ＡをコードするＤＮＡにハイブリッド化する〔マニアチス等（１９８２）　、モ レキュラ・クローニング、ラボラトリ−・マニニアル、コールド・スプリング・ ハーバ−・ラボラトリ−出版〕。その後、上記工程５におけるように、他のタベ ート特異性第１プロモータを同定することができる。

２ｇ以上の雄不稔性ＤＮＡが本発明の外来ＤＮＡ配列に存在する場合、これら全 ての雄不稔性ＤＮＡは単一の第１プロモータの制御下にあってもよいが、好まし くは各雄不稔性ＤＮＡはそれ自身の別個の第１プロモータの制御下にある。複数 の雄不稔性ＤＮＡが外来ＤＮＡ配列に存在する場合、雄不稔性ＤＮＡは同じもし くは異なる第ユＲＮＡ、ポリペプチドおよび蛋白をコードすることができる。た とえば雄不稔性ＤＮＡがＲＮアーゼ（たとえばＲＮアーゼＴｌ）をコードする場 合、雄不稔性ＤＮＡおよびその第１プロモータの少なくとも３個、特に４〜６個 のコピーを外来ＤＮＡ配列に与えることが好ましい。いずれにせよ、全ての雄不 稔性ＤＮＡおよびその第１プロモータは好ましくは互いに外来ＤＮＡ配列にて隣 接し、かつ外来ＤＮＡ配列により植物細胞を形質転換すべく使用する任意のベク ター中に存在する。

標識ＤＮＡの選択も臨界的でない。適する標識ＤＮＡは周知方法で選択しかつ分 離することができ、標識ＤＮＡを発現する植物を第２ＲＮＡ、蛋白もしくはポリ ペプチドを発現しない植物から容易に区別しかつ分離しつる第２ＲＮＡ、蛋白も しくはポリペプチドをコードするようにする。標識ＤＮＡの例は、植物細胞に対 し識別可能な色を付与しうる蛋白、たとえばジヒドロケルセチン−４−レダクタ ーゼ〔マイヤー等（１９８７）　、ネイチャー、第３３０巻、第６７７〜６７Ｂ 頁〕およびグルクロニダーゼ遺伝子〕ジェファ−ソン等（１９８８）　、プロシ ーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ　（ｒＰＮＡＳＪ　 ）、第８３巻１第８４４７頁〕をコードするＡ１遺伝子或いはたとえば短小な成 長または葉の異なる形状など、特定の形態学的特徴を植物に付与する蛋白をコー ドする。標識ＤＮＡの他の例は植物に対し次の性質を付与する：ヨーロッパ特許 出願第８８／４０２２２２．９号に記載されたようなスーパーオキシダーゼ・ジ スムターゼをコードする遺伝子により付与されるようなストレス耐性；ヨーロッ パ特許出ａ第８６／３００２９１．１号に記載された昆虫耐性を付与するＢａｃ ｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｌｎｇｌｅｎｓｉｓ内生毒素をコードする遺伝子により付 与されるような病気もしくは害虫耐性；またはヨーロッパ特許出願第８８／４０ １［ｉ７３．４号に記載された細菌耐性を付与する細菌ペプチドをコードする遺 伝子。

好適な標識ＤＮＡは除草剤の作用を阻止し、或いは中和する第２蛋白もしくはポ リペプチドをコードし、たとえば次の遺伝子である：ヨーロッパ特許出願第８７ ／４０Ｄ、５４４．０号に記載されたビオラホスおよびホスフィノトリシンのよ うなグルタミンシンセターゼ阻止剤に対する耐性を付与する酵素をコードする１ 工王道伝子および１工ｒｖ遺伝子；ヨーロッパ特許公開第０．２４０．７９２号 に記載されたホスフィノトリシンを標的とする、たとえば改変グルタミンシンセ ターゼおよびヨーロッパ特許公開第０，２１Ｌ５７１号公報に記載されたグリホ スフェート（ｇｌ　ｙｐｈｏｓａｔｅ）を標的とする改変５−エノールビルビル レキメート−３ホスフエートシンセターゼのような天然生産される内生酵素より も低い親和性を除草剤に対して有する成る種の除草剤のための改変標的酵素をコ ードする遺伝子。

標：ａＤＮＡを制御する第２プロモータは、標識ＤＮＡが１個もしくはそれ以上 の特定組織もしくは特定細胞で選択的に或いは全植物内に構成的に発現されるよ う所望に応じ標識ＤＮＡによりコードされる第２ＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプ チドの性質に依存して周知方法で選択しかつ分離することができる。たとえば標 識ＤＮＡが除草剤耐性をコードする場合、標識ＤＮＡは、たとえば３５Ｓプロモ ータ〔オデル等（１９８５）　、ネイチャー。

第３１３巻、第８１０〜８１２頁）、３５Ｓ’３プロモータ〔ハルおよびハウエ ル（１９８７）　、　　パイロロヅｔ１第８６＠、第４８２〜４９３頁）、Ｔｉ −プラスミドにおｊするツバリンシンセターゼ遺伝子（ｒＰＮＯｓＪ　）のプロ モータ〔ヘレラーエストレラ（１９８Ｂ）　。

ネイチャー、第３０３巻、第２０９〜２１３頁〕またはオクトピンシンターゼ遺 伝子（ｒＰＯｃｓＪ　）のプロモータ〔デ・グレブ等（１９８２）　、　　ジャ ーナル・モレキニラ・アプライド・ジニネチックス、第１（６）巻、第４９９〜 ５１１頁〕のような強力な構成第２プロモータを用いて植物の全細胞にて発現さ せるのが有利である。

標！ＤＮＡが病気抵抗性を付与する蛋白をコードする場合、たとえばＴｉ−プラ スミドのＴＲＩ’もしくはＴＲ２’プロモータのようなＴＲプロモータを用いて 標識ＤＮＡを傷組織で発現させるのが有利である〔ベルテン等（１９８４）　、 　　ＥＭＢＯ・ジャーナル、第３巻、第２７２３〜２７３０頁〕。標識ＤＮＡが 除草剤耐性をコードする場合、標識ＤＮＡをたとえばルビスコの小サブ単位をコ ードする遺伝子のプロモータにより緑色組織で選択的に発現させるのが有利であ る〔ヨーロッパ特許出願第８７／４００，５４４．０号〕。標識ＤＮＡが色素を コードする場合は、たとえば花弁細胞、葉細胞もしくは種子細胞のような特定細 胞にて、好ましくは梯子被覆の外側層で標識ＤＮＡを発現させるのが有利である 。

植物を雄不稔性にしかつ非形質転換植物から容易に識別しうるように組織特異性 の第２プロモータを周知方法で次の工程により同定しかつ分離することができる ：１、成る種の組織、たとえばその花弁、葉もしくは種子の発生の際にのみ植物 中に存在するｍＲＮＡを探し；２、この組織特異性ｍＲＮＡを分離し；３、この 組織特異性ｍＲＮＡからｃＤＮＡを作成し；４、このｃＤＮＡをプローブとして 使用することにより、この組織特異性ｍＲＮＡをコードするＤＮＡを持った植物 ゲノムにおける領域を同定し：次いで ５、組織特異性ｍＲＮＡをコードするＤＮＡの上流に位置しかつ前記ＤＮＡのプ ロモータを含有する植物ゲノムの部分を同定する。

１個以上の標ｍＤＮＡが本発明の外来ＤＮＡ配列に存在する場合、全標識ＤＮＡ は単一の第２プロモータの制御下にあってもよいが、好ましくは各標識ＤＮＡは それ自身の別の第２プロそ一夕の制御下にある。より好ましくは、各標識ＤＮＡ はそれ自身の第２プロモータの制御下にあって形質転換植物に異なる識別可能な 特徴を与える異なる第２ＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプチドをコードする。いず れにせよ、標ｍＤＮＡおよび第２１０モータは互いに隣接しかつ本発明の外来Ｄ ＮＡ配列に含まれる１個もしくはそれ以上の雄不稔性ＤＮＡに対し隣接すべきで あり、さらに任意のベクターで使用して外来ＤＮＡ配列により植物細胞を形質転 換させる。

雄不稔性ＤＮＡによりコードされる第１ＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプチドは雄 蕊細胞の細胞質もしくは核にて作用することにより雄蕊細胞の代謝、機能および ／または発育を顕著に阻害するのが一般に好適である。しかしながら、第１蛋白 もしくはポリペプチドおよび／または第２蛋白もしくはポリペプチドを形質転換 植物の細胞の細胞質から葉緑体もしくはミトコンドリア中へ移送することが望ま しければ、外来ＤＮＡ配列はさらにトランジット（ｔｒａｎｓｉｔ）ペプチドを コードする追加外来ＤＮＡを含むこともできる。追加ＤＮＡは、第１蛋白もしく はポリペプチドがこのように移送される場合は雄不稔性ＤＮＡと第１ブロモ〜り との間に位置し、かつ第２蛋白もしくはポリペプチドがこのように移送される場 合は標識ＤＮＡと第２プロモータとの間に位置する。「トランジットペプチドＪ という用語は、葉緑体もしくはミトコンドリア蛋白または蛋白のサブ単位に一般 に関連しかつ細胞の核ＤＮＡによりコードされる先駆体蛋白として細胞内に産生 されるポリペプチド断片を意味する。

トランジットペプチドは、核コードされた葉緑体もしくはミトコンドリヤ蛋白ま たはサブ単位を葉緑体もしくはミトコンドリア中へ移動する過程の原因となり、 かつこの過程に際しトランジットペプチドは葉緑体もしくはミトコンドリア蛋白 もしくはサブ単位から分離され或いは蛋白分解的に除去される。１個もしくはそ れ以上のこの種の追加ＤＮＡを本発明の外来ＤＮＡ配列に供給して、一般にヨー ロッパ特許出願第８５／４Ｑ２．５９６．２号および第８８ノ４０２，２２２． ９号並びにパン・テン・ブレツク等（１９８５）　。

ネイチャー、第３１３巻、第３５８〜３６３頁；シヤフラ（１９１１７）　。

ヨーロピアン・ジャーナル・オフ・バイオケミストリー、第１６５巻、第１〜６ 頁；およびブートリー等（１９ｇ？）　、ネイチャー、第３２８巻、第３４０〜 ３４２頁に記載されたように１個もしくはそれ以上の第１もしくは第２蛋白もし くはポリペプチドを移動させることができる。葉緑体中への移動（ｔｒａｎｓｐ ｏｒｔ）に関し適するトランジットペプチドの例は酵素ＲＵＢＰカルボキシラー ゼの小サブ単位を有するトランジットペプチド（ヨーロッパ特許出願第８５／４ ０２．５９８．２号）であり、かつミトコンドリア中への移動に関するトランジ ットペプチドの例は酵素Ｎｉ　ｎ−スーパーオキシドジスムターゼのトランジッ トペプチドである（実施例１６参ｙ１＠）。

本発明の外来ＤＮＡ配列において、３“転写制御信号は、植物細胞における正確 な転写停止およびｍＲＮＡのポリアデニル化を可能にするものから選択すること ができる。転写制御信号は、天然の転写される遺伝子の１種としうるが、外来も しくは異質であってもよい。異質転写制御信号の例は、オクトピンシンセターゼ 遺伝子〔ギーレン等（１９１！４）　、　　ＥＭＢＯ・ジャーナル。

第３巻、第８３５〜８４５頁〕およびＴ−ＤＮＡ遺伝子７　〔ベルテンおよびシ ェル（１９８５）　、　　ヌクレイツク・アシッド・リサーチ（ｒＮＡＲＪ　） 第１３巻、第６９８１〜６９９８頁〕である。

さらに本発明によれば、第１プロモータが花粉発生の所定段階にて、（より好ま しくは減数***後に）雄不稔性ＤＮＡの発現を行なう本発明の外来ＤＮＡ配列を 持った、たとえば約細胞培養物のような植物細胞培養物を用いて、ホモ接合性の 優性雄不稔性植物を再生させることができる〔「ブラシカ・ナブスからの小胞子 の効率的分離および小胞子由来の胚芽の生成」。

Ｅ、Ｂ、　スワンソン、Ｍ、Ｐ、　　クーマンス、Ｓ、Ｃ，ウー。

セル・リポート（１９８７）　、第６巻、第９４〜９７頁〕。

さらに本発明によれば、ハイブリッド植物まで成長させうるハイブリッド種子の 生産方法も提供される。１つの方法は、少なくとも１つの標識ＤＮＡを有する核 層不稔性植物を標識ＤＮＡを持たない雄稔性植物と交雑させることを含む。雄不 稔性植物と雄稔性植物の両者を互いに近接して別々の列に植える。

他の方法は、少なくとも２つの異なる標識ＤＮＡを有する核層不稔性植物を、こ れら２つの異なる標識ＤＮＡの一方のみを共通してホモ接合型で有する雄稔性植 物と交雑させることを含む。

雄不稔性親植物と雄稔性親植物の両者を実質的にランダムな集団として成長させ 、正確な植付はパターンの必要なしに他家受粉のチャンスを増大させる。雄稔性 親植物を、次いで雄稔性親植物が持たない非共通の標識ＤＮＡによりコードされ る明確な形質により集団から容易に除去することができる。好ましくは、この方 法において雄不稔性植物における非共通の標識ＤＮＡは構成プロモータの制御下 にあって、雄不稔性植物を特定の除草剤に対し耐性にする蛋白もしくはポリペプ チドをコードする。

次いで、雄稔性植物を他家受粉の後に特定の除草剤を用いて死滅させることがで きる。

雄不稔性ＤＮＡにより、好ましくは雄不稔性ＤＮＡと除草剤耐性をコードし、安 定に組込まれかつ世代全体にわたり優性対立形質として遺伝させつる標ｍＤＮＡ との両者により、本発明にしたがって形質転換された植物は、ハイブリッド作物 を育種しかつ生産するための現在使用されている細胞質層不稔性システムの代案 となり、これらシステムよりも幾つかの利点を与える。この種の利点は次のもの を包含する：１、作物を他家受粉させるため、育種手段がずっと簡単になる。

何故なら、産業的に販売されるハイブリッド種子を生産する交雑種の雄稔性親ラ インに回復遺伝子を導入する必要がないからである。事実、産業的な種子生産の ための他の雄稔性親ラインと交雑させたヘテロ接合型接離不稔性親ラインは５０ ％の雄不稔性ハイブリッド子孫と５０％雄稔性ハイブリッド子孫とを生産し、そ の結果として市販作物は充分な結実およびしたがって正常な収量を補償するのに 充分な花粉を生産する。この種の作物の例はトウモロコシおよび油菜である。

２、種子が経済的収穫を示さないような作物につき、育種手段は同様にずっと簡 単になる。何故なら、雄稔性親ラインで発現される回復遺伝子を必要としないか らである。事実、これら作物につき市販されるハイブリッド種子の５０％が雄不 稔性であってもよい。これら作物の例は甜菜およびアルファルファである。

３、このシステムは現存する同型交配種から一操作で核層不稔性ラインと維持系 統ラインとの生産を可能にし、逆交配の必要性を排除する。これはハイブリッド の受胎から市販化までに少なくとも６〜８世代の時間遅延を短縮させる。雄不稔 性ＤＮＡを挿入しかつ発現する植物を親植物として使用するハイブリッド植物の 典型的な生産法の例は、次の工程で構成することができる： （１）同型交配ラインを交配させかつ結合能力および選択された特徴につき試験 することにより手作業で試験ハイブリッドを作成しく２年間）、 （２）選択されたハイブリッドのそれぞれにおける１つの親ラインを本発明の目 的である方法により接離不稔性となしく１年間）、 （３）前記工程から得られた接離不稔性親植物（以下「ＡＳ」と称する）および その維持系統ライン（以下ｒＡＪと称する）、並びに将来の市販作物の受粉用雄 稔性親植物（以下ｒＢＪと称する）を増殖させ（３年間）、この期間中に選択さ れたハイブリッドを公的な収量試験にかけ（３年間）、（４）承認されたハイブ リッド種子を生産しかつ販売する（１年間）。

４．除草剤耐性をコードする標識ＤＮＡを組合せると、この種の接離不稔系は、 必要とされる任意の組合せにて２−１３−および４−ウェイハイブリッドの生産 を可能にする。雄不稔性ＤＮＡとこれに隣接した標識ＤＮＡとを２−もしく１＝ ３−ウェイハイブリッドを得るための祖父母育種ラインの１種として使用される １つの植物の核ゲノムに導入し或いは４−ウニイノ１イブリツドを得るための２ 種の祖父母育種ラインとして使用される２種の植物の核ゲノムに導入すれば充分 であると思われる。各育種ラインを、例として下記する２つの交配（交雑）１こ より維持することができ、ここでｒＳ）！Ｊはそれぞれ雄不稔性（Ｓ）および除 草剤耐性（Ｈ）の優性対立形質を示し、力１つｒｓｈＪはそれぞれ雄稔性（Ｓ） および除草剤感受性（ｈ）の劣性文寸立形質を示す： ａ、ＳＲ／５ｈＸｓｈ／ｓｈは５０％ＳＲおよび５０％ｓｈの子孫を与え、かつ Ｈが耐性を付与する除草剤を噴霧した後（こ１００％の不稔性菌が得られる。

ｂ、ｓｈ／５ｈＸｓｈ／ｓｈは１００％稔性子孫を与える。

５、これは雄不稔系に組込まれた標識ＤＮＡの所有者を保護する。何故なら、競 争相手が自分の所有する育種ラインに前記標識ＤＮＡを組込むことを一層困難に するからである。

例示の目的で、本発明にしたがう２つの作物育種方式を示せば次の通りである： 方式１：隣接した雄不稔性ＤＮＡと除草剤耐性をコードする標識ＤＮＡとを有す る植物の育種 （ＩＡ）雄不稔性ラインＡＳの維持ニ ラインＡＳＨ／ｓｈ　ｘラインＡｓｈ／ｓｈは次のものを与える：５０％ＡＳＨ ／ｓｈ　　＜表現型：雄不稔性、除草剤耐性）、５０％Ａｓｈ／ｓｈ　　（表現 型：雄稔性、除草剤感受性）。

（ＩＢ）ハイブリッド種子作物の生産：（ａ）　Ｂｓｈ／ｓｈ　　ｃ雄植物）の 種子、並びニＡ８Ｈ７ｓｈオヨヒＡＳｈ／Ｓｈよりなる交配（ＩＡ）（ｒ雌」植 物）により得られた種子を別々の列に植え、 （ｂ）雌の列に除草剤を噴霧して遺伝子型ＡＳｈｌＳｈを除去し、（Ｃ）次のよ うに他家受粉を行ない； ＡＳＨ／ｓｈ　ｘＢｓｈ／ｓｈ　オヨヒＢ　ｓｈ／ｓｈ　　　ｓｈ／Ｓｈ　ハＨ 列ニ次ｔｙ）ＩＢ ものを与える： ５０％ｐ、　ＢＳＨ，／　ｓｈ　　（表現型二）〜イブリッド、雄不稔性、除草 剤耐性）、 ５０％ＡＢｓｈ／ｓｈ　　ｃ表現型：ノ＼イブリ・ンド、雄稔性、除草剤感受性 ）、 さらに雄列には次のものを与える： １００　％ＢＳｈ／５ｈ （ｄ）雄列に生じた遺伝子型Ｂｓ　ｈ　／　ｓ　ｈを除草剤ｊの噴霧１こより或 いは機械的手段により除去し、 （ｅ）上記工程（Ｃ）の他家受粉が生じた雌列の７１イブ１ノ・ソド種子を収穫 する。これは市販の種子である。

圧・記還酊上ＡＡ（−態１μ吐犯邊町吐三１ぢ」１１呈射組工■！μ」互燵皇ぢ １ 物の育種 （２人）雄不稔性ラインＡＳの維持： ＡＳ　、　ＡＳ）１１）１２／５ｈｌｈ２ｘＡｓｈｌｈ２／５ｈｌｈ２　、次ｏ ｔ、ｏを与エル。

５０％Ａｓ）ＩＩＨ２／５ｈｌｈ２　　（表現型：雄不稔性１両除草斉］１こ文 寸し耐性）、 ５０％Ａｓｈ１ｈ２１Ｓｈ１ｈ２（表現型：雄稔性１両除草斉１１．：文ｔし感 受性）。

（２Ｂ）受粉ラインＢの維持： ＢｓｈｌＨ２／５ｈｌＨ２５ｈｌＨ２／５ｈｌＨ２、よ次。も。を与える。

ＩＢ １００％ｓ　５ｈｌＨ２／５ｈｌＨ２（表現型：雄稔性、除草剤１（こ対し感受 性かつ除草剤２に対し耐性）。

（２Ｃ）ハイブリッド種子作物の生産：（ａ）上記（２人）から得られた種子お よび（２Ｂ）から得られた種子をランダムに植える。

（ｂ）現場に除草剤２を噴霧して遺伝子型Ａ　５ｈｌｈ２／５ｈｌｈ２を除去す る。

（ｅ）他家受粉を行なう： 、ａ、５）ＩＩＨ２／５ｈｌｈ２　　５ｈｌＨ２／５ｈｌＨ２、ま次。も。を与 える２Ｂ ５０％　ＡＢＳＨＩＨ２／５ｈｌＨ２ ５０％ＡＢｓｈｌｈ２／５ｈｌＨ２ さらに自家受粉を行なう： Ｂｓｈｌ）１２／５ｈ１）１２ｓｈ１．！（２／５ｈｉｎ２．次、、モノヲ４． ．ル。

ＩＢ １００％　ｓ　５ｈｌＨ２／５ｈｌ）１２（ｃｌ）自家受粉が生じた親ラインＢ から得られた遺伝子型ＢｓｈｌＨ２／５ｈｌＨ２を有する植物を、現場に除草剤 １を噴霧して除去する。

（ｅ）上記（Ｃ）の他家受粉により得られた残余の植物人５）ＩＩ）ｔ２／５ｈ ｌＨ２のハイブリッド種子を収穫する。

以下、実施例により本発明を説明する。これら実施例において説明する図面は次 の通りである： 第１図は実施例１のｐＴＡ２９Ｓ３における丁Ａ２９ｃＤＮＡおよびそのＣｌａ ｌ断片の制限マツプを示し、第２図は実施例２のＴＡ２９遺伝子におけるＰｓｔ ｌ断片のｃＤＮＡ配列を示し、 第３Ａ図はＴＡ２９遺伝子のＣｌａｌ部位からＨｊｎｄＩＩ［部位に至るＤＮＡ 配列およびアミノ酸配列を示し、これら配列の上に重要な制限部位を示すと共に 、配列の下にはＯＲＦによりコードされたアミノ酸配列を示し、さらに −ヌクレオチド（ｒｎｔＪ　）　１４４８〜１４５２にはＴＡＴＡボックス（星 印）、 −ｎｔ１４７７にはＴ　Ａ　２９ｍ　ＲＮ　Ａの転写開始部位（星印）、−ｎｔ ｌ、５１４〜１５３７には実施例２に説明する合成オリゴマーの３′〜５゛配列 、および −ｎｔ１９４０〜２２９ｆｔ　（矢印の間）にはＴＡ２９ｃＤＮＡの整列した配 列 をも示し、 第３Ｂ図は実施例４で説明する丁Ａ１３ｃＤＮＡ　（上側ライン）およびＴＡ２ ９ｃ　ＤＮＡ　（下側ライン）の整列（ａ　Ｉ　ｊｇｎｓｅｎｔ）を示し、さら に亘直線により同類ヌクレオチドを示し、第３Ｃ図は実施例４で説明するＴＡ２ ＢｃＤＮＡの配列を示し、ここでＯＲＦに下線を施こし、 第４Ａ図は実施例３のベクターｐ　Ｍ　Ｂ　２の構築（作成）を図示し、 第４Ｂ図は実施例３のベクターｐＭＢ３のマツプを示し、第５図は実施例５のベ クターｐＴＴＭ３のマツプを示し、第６図は実施例７のベクターｐＴＴＭ４のマ ツプを示し、第７Ａ図は実施例９のベクターｐＴＴＭ６のマツプを示し、Ｎ７Ｂ 図は実施例１１のベクターｐＴＴＭ６Ａ−のマツプを示し、 第８図は実施例１２のベクターｐＴＴＭ８のマツプを示し、第９Ａ図は実施例１ ４のベクターｐＴＶＥＰ１のマツプを示し、第９Ｂ図は実施例１４のベクターｐ ＴＶＥＰ２のマツプを示し、第１０Ａ図は実施例１Ｂのベクターｐ’ｒｖＥｐｅ ｓのマツプを示し、第１０Ｂ図は実施例１６のベクターｐＴＶＥＰ６２のマツプ を示し、第１１図は実施例９の雄不稔性ＤＮＡで形質転換されたタバコ植物の花 と比較した正常なタバコ植物の花の写真を示し、第１２図は実施例９の雄不稔性 ＤＮＡで形質転換されたタバコ植物の釣と比較した正常なタバコ植物の朽の横断 面の写真（倍率２５０倍）を示す。

実施例において特記しない限り、組換ＤＮＡを作成しかつ操作する手順は全てア ニアチス等、モレキュラ・クローニング。

ラボラトリ−会マニニアル、コールドースプリング番ノ＼−バー・ラボラトリ− 出版（１９ｇ２）に記載された標準法を用いて行なつた。実施例で用いた次のプ ラスミドおよびベクターは西ドイツ連邦共和国、ブラウンシュバイクＤ　−３３ ００，マシエルオーダー・ウェーク１Ｂ在、ドイツチェ・ザンムルンク・フニル ・ミクロオルガニスメンｅウント・ツエルクルチューレン（ｒＤＳＭＪ　）にブ タベスト条約の規定に従って寄託されている： カリホルニア大学、ロサンゼルス（ＩＪＣＬＡ）のロバート・ゴールドベルク教 授から次のものを入手した：ＧＣテーリングによりｐＢＲ３２９（コバルビアス およびポリバールＣ１９８２）　。

ジイーン、第１７巻、第７９頁〕においてＰｓｔｌ断片としてクローン化したＮ １ｃｏｔｌａｎａ　ｔａｂａｃｕｉの朽特異性ｃＤＮＡ　（ｒＴＡ２９ｃＤＮＡ Ｊ）；並びにＴＡ２９ＣＤＮＡをプローブとして用いることによりに、　ｔａｂ ａｃｕｓ″Ｓａｍｓａｎ”ゲノムライブラリーから分離しかつλファージベクタ ーｃＨ３２［レネンおよびブラットナ−（Ｊ、９８ｇ）　、ジーン、第２６１’ 、　第１７１頁〕のＥｃｏＲ１部位に挿入された対応のゲノムクローン（「λＴ Ａ２９Ｊ）。このＴＡ２９ｃＤＮＡは長さ３６５塩基対（±ｏ、ｎｂ）であって 、Ｎ、　ｔａｂａｃｕｍの巧から得られたポリＡ”　ｍＲＮＡの０．２４％を示 す１，１００ヌクレオチドのタベート特異性ｍＲＮＡにハイブリッド化させた。

第１図に示したように、λＴＡ２９は２個のＥｃｏＲ１断片を有し、全挿入物は １３．２ｋｂの測定値を有する。

第１図に示した如＜ＴＡ２９造伝子を有する内部７．５ｋｂのＣｌａ■断片をλ ＴＡ２９からｐＬＫ３１［ボッチルマンおよびザボー（１９８７）　、　ＤＮＡ 、第６巻、第６頁］にサブクローン化させ、これはｒｐＴＡ２９Ｓ３　Ｊと呼ば れるプラスミドを生産する。

ＥｅｏＲ１／Ｃ１ａＩ／Ｈ１ｎｄ　ｍ／Ｈ１ｎｄ　ｍ−ＥｃｏＲＩの組合せおよ びＣ１ａｌ−ＥｅｏＲｌの組合せで消化されかつＴＡ２９ｃＤＮＡに対しハイブ リッド化されたλＴＡ２９のニトロセルロース結合断片は、ＴＡ２９ｃＤＮＡに 対し同型の配列の存在を示した。

実施例２　：　ｐＴＡ２９Ｓ３からのＴＡ２９ｃＤＮＡおよびその同型配列のヌ クレオチド 配列定法：ＴＡ２９遺伝子およびそのプロモータの地図化ｐＢＲ３２９における ＴＡ２９ｃＤＮＡのＬ鈷１挿入物を完全に配列決定した〔マキサムおよびギルバ ート（１９７７）　、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・ブイエンス ・ＵＳＡ（ｒＰＮＡＳＪ　）、第７４巻、第５６０頁〕。このｃＤＮＡ配列を第 ２図に示す。これは全ｃＤＮＡ配列（示した通り）にわたり１個のオーブンリー ディングフレームの存在を示す。

次いで、ｐＴＡ２９Ｓ３におけるＣ１ａｌ挿入物の配列を旦］１ｃＤＮＡ配列と ｐＴＡ２９Ｓ３配列との比較は、ＴＡ２９ｃＤＮＡ配列と完全に同型であるｐＴ Ａ２９Ｓ３における配列の存在を示した。

第３図はｐＴＡ２９Ｓ３におけるＴＡ２９遺伝子の配列を示している。ＴＡ２９ ｃＤＮオリ稿−であるｐＴＡ２９Ｓ３における配列　・は、第３図において矢印 の間に存在する。オーブンリーディングフレームは、第３図にて対応のアミノ酸 配列により示される。

これは、ＴＡ２９遺伝子が３２１個のアミノ酸残基の蛋白をコードしかつコード 化領域にはイントロンが存在しないことを示している。９６４（＋リーダー）ヌ クレオチドのオーブンリーディングフレームの長さは、若い（長さ１２〜２Ｄｍ ｍ）のタバコ蕾から分離した釣から作成されるタバコｆ５　ｍ　ＲＮ　Ａに存在 しかつ葉および口孔（蕾が開きかつ花弁が発生したもの）から分離されたｍＲＮ Ａには存在しない転写物の寸法と一致する。このｍＲＮＡの寸法は約１１００ヌ クレオチドである。

一方がヌクレオチド（ｒｎｔＪ　）　１５２７に位置しかつ他方がｎｔ１５６０ に位置する２個のＡＴＧフドンが存在し、これらは３３ヌクレオチドの間隔のオ ーブンリーディングフレームに対する開始コドンとして作用しうる。第１ＡＴＧ コドンの８１ヌクレオチド５°上流に位置するｎｔ１４４６には共通配列ＴＡＴ Ａが存在する（第３図に星印で示す）。このｒＴＡＴＡＪ枠がＴＡ２９遺伝子の プロモータの１部であることを確認するため、ＴＡ２９ｍＲＮＡの５′末端を決 定した。これは、プライマ延長〔マツフナイト等（１９８１，）　、セル、第２ ５＠、第３８５頁〕により行なった。この目的で、配列５’　　ＧＧＡ　　ＧＣ Ｔ　　ＡＣＣＡＴＴ　　ＴＴＡＧＣＴ　　ＡＡＴ　　ＴＴＣ８°を有する２４ヌ クレオチドのオリゴマーを使用した。何故なら、これは第３図に示すようにｎｔ １５１４からｎｔ１５３７までＴＡ２９遺伝子に対し相補的であるからである。

このオリゴヌクレオチドを５°末端でのリン酸化（ｋｉｎａｔｊｏｎ）によりＰ ８２標識した。約ｍ　ＲＮ　Ａとハイブリッド化させた後、オリゴヌクレオチド を逆転写酵素により延長させた。得られた延長オリゴヌクレオチドを配列決定ゲ ルに続き配列決定ラダーで分析してその正確な寸法を決定した。この断片は長さ ６１ヌクレオチドであることが示された。これは、ＴＡ２９ｍＲＮＡの転写開始 がｎｔ１４７７で生じたことを示す（第３図にて星印で示す）。

したがって、ＴＡ２９遺伝子は転写開始部位の３１ヌクレオチド上流に位置する ＴＡＴＡ枠を冑する。ｍＲＮＡはｎｔ１４７７からｎｔ１５２７に到る長さ５１ ヌクレオチドのリーダー配列とｎｔ１５２７からｎ１２５９０に到る９８４ヌク レオチドのコード化領域とｎ１２５９０からｎ１２５９０に到る約１００ヌクレ オチドの３′非コード化領域とを存する。

現在持性化されている植物遺伝子〔ジョシン（１９８７）　、ヌクレイツク・ア シッド・リサーチ、　　（ｒＮＡＲＪ　）、第１５巻、第１６号、第８８４３頁 〕の約９２％における場合のように、ｍＲＮＡの最初のＡＵＧコドンは翻訳を開 始させるために使用されると思われる。したがって、ＴＡ２９プロモータはＣ１ ａｌ制限部位とｎｔ１４７７との間に位置すると思われる。

実施例３　：　ＴＡ２９遺伝子から誘導されるプロモータカセット（ｒＰＴＡ２ ９Ｊ　）の構築 第１の異型雄不稔性ＤＮＡと同じ転写単位に位置しかつこれを制御するＴＡ２９ 遺伝子の５゛制制御列（プロモータを含む）を含むキメラＤＮＡ配列を構築する ため、ｐＴＡ２９５３からの２．５ｋｂ見力ｌ／Δ匹１断片をｐＭＡＣ５−８の ポリリンカーム匹１部位にサブクロ・〜ン化させることにより第４図に示したよ うにカセットを作成した（ヨーロッパ特許比ＨＭ８７／４０２３４Ｂ、４号）。

これは、第４図に示したｒｐＭＢ２Ｊと呼ばれるベクターをもたらし、このベク ターを用いて部位指向性突然変異に使用するための一本鎖ＤＮＡを分離すること ができた。

次いで、第１のＡＴＧコドンを包囲する配列ＡＡＡＡＴＧＧＴＡをシトシン残基 の代りに２個のアデニン残基を用いてＡＣｐＭＢ２におけるこの部位指向性突然 変異は、次の配列を有する２４ヌクレオチドの合成オリゴヌクレオチドを用いて 行なった二３“ＧＴＴ　ＴＡＡ　ＴＣＧ　ＡＴＧ　ＧＴＡ　ＣＣＡ　ＴＣＧ　Ａ ＧＧ　５゜有する正確なヌクレオチド配列を決定して、これがＴＡ２９遺伝子の ５“配列とはＡＡ−ＣＣｌ２換だけ相違してＮｃｏＩ部位を形凡朋工をｒ　Ｐ　 Ｔ　Ａ　２９Ｊと名付けた。

他の釣特異性ｍＲＮＡを同定し、次いでこれを使用してＴＡ２９遺伝子と同類の 性質を有するｃＤＮＡクローンを分離しうろことを示すため、他の２ＦＪのＮ、 　ｔａｂａｅｕｓ杓特異性ｃ　ＤＮＡ（ｒＴＡ１３ｃＤＮＡＪおよびｒＴＡ２６ ｃＤＮＡＪ　）をＵＣＬＡのゴールドベルク教授から入手した。

ＴＡＩ：ｆｃＤＮＡは１１００ｂｐのクローンであって、タペート細胞に特異性 でありかつ極めて早期の釣発育段階の際に多量に存在するそれぞれ約１１００お よび】２００ヌクレオチドの２種のｒｎＲＮＡにハイブリッド化したものである 。ＴＡ１３ｃＤＮＡを実施例２の手順により配列決定し、次いで第３Ｂ図に示し たようにＴＡ２９ｃＤＮＡの配列と比較した。この配列の比較は、ＴＡ１３ＣＤ ＮＡおよびＴＡ２９ｃＤＮＡが９２％の類似性を有しかっＯＲＦがグリシン含有 量につき極めて多いことを示す。

３２９中へＰｓｔ４挿入物としてクローン化させた。これは５８０ヌｂｐのクロ ーンであって、前記ｍＲＮＡはタベート細胞に対し特異性であると共に所定の朽 発育段階にて多量に存在する。全ＴＡ２９ｃＤＮＡの配列と比較した際に類似性 （ｈｏｍｏ　ｌ　ｏｇｙ）を全第５図に示す「ｐＴＴＭ３Ｊと生するプラスミド を、次の周知のＤＮＡ断片を組合せて構築した： １、　ｐ　Ｇ　Ｓ　Ｃ１６００から誘導されたＴ−ＤＮＡ境界配列を有するベク ター断片； エファーソン等（１９８Ｂ）　、　　ＰＮＡＳ、第８３巻、第８４４７頁；ジェ ファーソン等（１９８７）　、　ＥＭＢＯ・ジャーナル、第６巻、第３９０１頁 〕）およびオクトビン−シンターゼ遺伝子の３°末端信号（ｒＯｃｓＪ　　［ド ハエズ等（１９８３）　、　　ＥＭＢＯ・ジャーナル。

第２巻、第４１９頁〕）を有するｐＭ８３Ｎｃｃす／旦臼旦Ｉ断片とフＩ／−ム に融合したキメラ配列； 特許出願第８７／４００，５４４．０号）とＴ−ＤＮＡ遺伝子７の３”末端信号 〔ベルテンおよびシェル（１９８５）　、　ＮＡＲ，第１３＠、第６９８１頁〕 とを有するキメラ配列；および ４、ツバリン−シンターゼプロモータ（ｒＰＮＯ９Ｊ　）とカナマイシン耐性を コードするｎｅｏ遺伝子とオクトビンシンターゼ遺伝子（ヨーロッパ特許出願節 ８７／４００，５４４．０号）の３゛末端信号とを有するｐＧｓＦＲ４０１（こ こでｐＧｓＦＲ４０１をｒｐＧＳＲ４Ｊと呼ぶ）からのＥｃｏＲＩ／５ａｃｌ断 片を有するキメラ配列。

ｐＴＴＭ３は、”ｌ”−ＤＮＡ境界配列内に次の２個のキメラ配列を有するＴ− ＤＮＡベクターである：すなわちｓｆｒが第２プロモータとしてのＰＳＳＵの制 御下にある標識ＤＮＡ　（ヨーロッパ特許出願節８７／４００，５４４．０号） となるＰＳＳＵ−ｓｆｒ；およびＧＵＳがリポータ遺伝子であってＴＡ２９プロ モータの制御下における植物および植物細胞でのその発現を容易に確認しかつ定 量化しうるＰＴＡ２９−ＧＵＳ。

有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｌｕｉ　Ｃ５８ＣＩ　ＲｉｆＲ［デ・ブラエレ等（ １９８５）。

ＮＡＲ，第１３巻、第４７７７頁］中へ移動させることにより、組換Ａｇｒｏｂ ａｃｔｅｒｉυ園菌株を作成した。移動ζよ、ヨーロツノく特許公開節０．ｌＩ Ｂ、７１８号に記載されたようにヘルツく−としてｐＲＫ２０１３〔フィブルス キー等（１９７９）　、　　ＰＮＡＳ、第７６巻、第１６４８頁〕を有するＥ、 ｅｏｌ　ＩＨＢ　１０１を用いて行なった。得られたＡｇｒＯｂａｅｔｅｒｉｕ ｌ菌株は、ｐＧＶ２２６０と９７７Ｍ３と力１らなる／１イブリッドＴｉ−プラ スミドを含有して０た。

この菌株を用いて、たとえばヨーロツノク特許出願第８７／４Ｄ０，５４４．０ 号に記載されたような標準法により夕／くコ葉ディ質転換されたカルスとシュー トとを培地中の５■／ｆｌの除草剤ホスフィノスリシンを用いて選択した〔デ・ ブロック等（１９８７）。

ＥＭＢＯ・ジャーナル１第６巻、第２５１３頁〕。形質転換された除蔦剤耐性の カルスおよびシュートには、β−グルりロニダーゼ酵素活性が検出されなかった 。

次いで、形質転換されたシュート組織を発根させ、温室内の土壌に移し、開花す るまで成長させた。花を検査し、雄蕊の約におけるタベート細胞のみがβ−グル クロニダーゼ活性を有することが判明した。これは、ＴＡ２９プロモータがβ− グルクロニダーゼ遺伝子と同様に異型遺伝子の発現を植物のタベート細胞にて選 択的に指令しうろことを示している。

実施例７：ＰＴＡ２９および遺伝子４のキメラＤＮＡ配列の構築第６図に示した 「９７７Ｍ４Ｊと名付けるプラスミドを、次の周知のＤＮＡ断片を組合せて構築 した；１、　ｐ　Ｇ　Ｓ　Ｃ１７００（コルネリセンおよびパンデウイーレ（１ ９１１１９）。

ＮＡＲ，第１７（１）巻、第１９〜２９頁〕から誘導されたＴ−ＤＮＡ境界配列 を有するベクター断片： ２、除草剤耐性遺伝子１土工およびＴ−ＤＮＡ遺伝子７の３°末端の発現を制御 するＰＳＳＵＳＳ上−タを持った実施例５のキメラ配列（嵐３）； ３、ｎｅｏ遺伝子およびオクトビンシンターゼ遺伝子の３゛末端の発現を制御す るＰＮＯＳプロモータを持った実施例５のキメラ配列（嵐４）；および ４、実施例３からのＰＴＡ２９プロモータカセットを含み、それ自身の３゛末末 端転写制御骨を有するイソペンテニルトランスフェラーゼをコードするＡｇｒｏ ｂａｃｔｅｒｌｕｉ　Ｔ　−Ｄ　Ｎ　Ａ遺伝子〔アキヨシ等（１９８４）　、　 　ＰＮＡＳ、第７６巻、第５９９４頁；ノ（リー等（１９８４）　、　　ＰＮＡ Ｓ、第８１巻、第４７７６頁〕とフレームに融合したキメラ配列。

ｐＴＴＭ４は、Ｔ−ＤＮＡ境界配列内に次のキメラ配列を有する２成分型のＴ− ＤＮＡベクターである：すなわちＰＳＳＵ−１エエおよびＰＮＯＳ−ｎ見！〔こ こで１土工およびｎｅ！遺伝子は植物に関する優性の選択可能な標識をコードす ると共に第２プロモータとしてのそれぞれＰＳＳＵおよびＰＮＯＳの制御下にあ る標ＷａＤＮＡである〕　；およびＰＴＡ２９−遺伝子４〔ここで遺伝子４は第 １プロモータとしてのＰＴＡ２９の制御下にありかつサイトキニンの生産向上を 生ぜしめる酵素イソペンテニルトランスフェラーゼをコードする雄不稔性ＤＮＡ である〕。ＴＡ２９プロモータの制御下でのタペート細胞におけるサイトキニン 生産の増大は、タペート細胞の代謝および器官形成を阻害する。

実施例８：タバコ中への実施例７のキメラＤＮＡ配列の導入実施例６に記載した ように、ｐＴＭＭ４　　（実施例７から）を、Ｅ、ｅｏｌｌからの移動によりＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｌｕｉ　Ｃ３ＢＣＩ　ＲｉｆＲ中に導Ｍ４とからなる２成分 型Ｔｉ−プラスミドを含有していた。

また、実施例６に記載したように、この菌株を用いてタバコ葉ディスクを形質転 換させ、形質転換されたカルスおよびシュート組織を５■／ＩＩのホスフィノス リシンを用いて選択した。

形質転換された除草剤耐性のシュート組織を発根させたところ、遺伝子４がまだ 形質転換植物で発現されていないことを示した。

次いで、これら植物を温室内の土壌に移し、開花するまで成長させた。花を検査 し、機能性のタベート細胞はその雄蕊の杓に存在しなかった。これは、ＴＡ２９ プロモータが異型遺伝子４の発現を植物のタベート細胞にて選択的に指令しうろ ことを示す。

第７Ａ図に示した「ｐＴＴＭ６Ｊと生するプラスミドを、次の周知のＤＮＡ断片 を組合せて構築した：１、ｐＧｓｃ１６００からのＴ−ＤＮＡ境界配列を有する ベクター断片； ２、ＰＳＳＵＳＳ上−タと除草剤耐性遺伝子工土工とＴ−ＤＮＡ遺伝子７の３′ 末端とを有する実施例５のキメラ配列（Ｎα３）；および ３、実施例３からのｐＴＡ２９プロモータカセットを有し、Ａ、　ｏｒｈｙｚａ ｅからのＲＮアーゼＴ１．［クアース等、　　ｒビ、ｔ＊スフエートおよびその 同族体の合成、構造、代謝および活性」（１９８７）、エルセビール・サイエン ス・パブリツシャＢ、　Ｖ、アメステルダム；クアース等（１９８ｇ）　、　　 ヨーロピアン・ジャーナル・バイオケミストリー、第１７３巻、第６１７〜８２ ２頁〕およびツバリンシンターゼ（ｒＮＯ５Ｊ　）遺伝子〔アン等（１９８５） 　。

ＥＭＢＯ・ジャーナル、第４（２）巻、第２７７頁〕の３′末端信号をコードす る合成遺伝子とフレームに融合したキメラ配列。

９７７Ｍ６は、Ｔ−ＤＮＡ境界配列内に次の２種のキメラ配列を有するＴ−ＤＮ Ａベクターである：すなわち第２プロモータとしてのＰＳＳＵの制御下にある標 識ＤＮＡであるＰＳＳＵ−ｓ　ｆ　ｒ　；および第１プロモータとしてのＰＴＡ ２９の制御下にある雄不稔性ＤＮＡであるＰＴＡ２９−ＲＡアーゼＴ１遺伝子。

ＴＡ２９プロモータの制御下における雄不稔性ＤＮＡのタベート細胞での発現は 、細胞に対し致死性であるＲＮアーゼＴ１を生産するｒ何故なら、ＲＮアーゼＴ １はこれら細胞の代謝に不可欠なＲＮＡ分子を分解するからである。

２２６０およびｐＴＴＭ８からなるＴｉ−プラスミドが同時に組込まれた＾ｇｒ ｏｂａｃｔｅｒｉυｍ菌株を用いて、タバコ葉ディスクを形質転換させた。形質 転換されたカルスおよびシュート組織を、５ｍｇ／Ｎのホスフィノスリシンを用 いて選択した。ＲＮアーゼＴ１遺伝子が形質転換された除草剤耐性カルスおよび シュートにて発現されないことが、その成長によって示された。

形質転換したシュート組織を発根させ、温室内の土壌に移し、開花するまで成長 させた。形質転換したタバコ植物は、その約以外に正常な花を発生した。これら 釣は正常な形状を有するが、その後の時点で裂開し、形質転換されてないタバコ 植物の弱と対照的である（第１１図参照）。裂開すると、形質転換植物からは殆 んどまたは全く花粉が放出されず、かつ形質転換植物により形成された花粉粒は 正常な花粉粒よりも容積が約５０〜１００倍小さく、さらに不規則な形状であっ た。さらに、形質転換植物からの花粉粒の大部分は発芽せず、形質転換植物から の花粉の発芽効率は正常な花粉粒の発芽効率９約Ｏ〜２０％でありだ。さらに、 形質転換植物は自家受粉により（天然の自家受粉によっても或いは手作業による 自家受粉によっても）種子を生産しなかった。

軽質転換植物の薄層断面による顕微鏡観察は、正常なタベート層が形成されず、 かつ花粉袋が空のままとなることを示した（第１２図参照）、これは、ＴＡ２９ プロモータが異型ＲＮアーゼＴ１遺伝子の発現を形質転換植物のタベート細胞に て選択的に指令しうろことを示し、さらにＲＮアーゼＴ１がタベート細胞の機能 を充分に阻害して植物を雄不稔性にすることを示す。

レキニラ・ゼネラル・ジエネチックス、第２０４巻、第３８３〜３９６頁〕中へ 移動させることにより、組換Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ４ｕｗ菌株を作成した。ｐ　 Ｍ　Ｐ　９０はｖｊｒおよびｔｒａｎｓ機能を与えるが、アンピシリン耐性をコ ードする遺伝子を持たない。第７Ｂ図に示したように、ｐＴＴＭＢＡ−はＰＴＴ Ｍ６　　（実施例９から）の誘導体であって、アンピシリン耐性をコードするβ −ラクタマーゼ遺伝子がこのβ−ラクタマーゼ遺伝子のΣ肛１部位に対するＤＮ Ａ配列の挿入により失活されている。

ｐ　Ｍ　Ｐ　９０とｐＴＴＭＢＡ−とを有する得られたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｌ ｕＩＩ菌株（ｒＡ３１４４Ｊと称する）を用いて、ロイド等（１９１３ｇ）　、 サイエンス、第２３４Ｓ、第４６４〜４８６頁およびクリマスゼウス力等（１９ ８５）　、プラント・セル・テイシニー・オいて、同時培養した後にＡ３１４４ を死滅させた。形質転換したカルスを５ｍｇ／、９のホスフィノトリシンと１０ ０μｇ　／　ｍｌのカナマイシンとを用いて選択し、耐性カルスを植物中に再生 させた。

シュートおよび根を誘発させた後、形質転換体を温室に移し、開花するまで成長 させた。これらの花を検査し、実施例１０に記載した形質転換タバコ植物につき 観察されたと実質的に同じ表現型を示した。これは、ＴＡ２９プロモータが異型 ＲＮアーゼＴｌ遺伝子の発現をタバコ以外の植物のタベート細胞で選択的に指令 して、この種の他の植物を雄不稔性にしうろことを示す。

実施例２９：ＰＴＡ２９およびバルナーゼ遺伝子のキメラＤＮＡ第８図に示した ｒｐＴＴＭ８Ｊと称するプラスミドを、次の周知の断片を結合せて構築した： １、１）　Ｇ　Ｓ　Ｃ１７００ｒコルネリセｊンおよびバンデウＩ−レ（１９８ ９）　、　ＮＡＲ，第１７（１）巻、第１９〜２９頁〕から誘導されかつβ−ラ クタマーゼ遺伝子（第８図の１゛）がそのＳ　ｃａ　１部位中へのＤＮＡ配列の 挿入により失活されているＴ−ＤＮＡ境界配列を有するベクター断片； ２、ＰＳＳＵＳＳ上−タと除草剤耐性遺伝子ｓｆｒとＴ−ＤＮＡ遺伝子７の３゛ 末端とを有する実施例５のキメラ配列（嵐３）； ３、ＰＮＯＳプロモータとｎｅｏ遺伝子とオクトビンシンターゼ遺伝子の３°末 端とを有する実施例５のキメラ配列（Ｎα４）；および ４、実施例３からのＰＴＡ２９プロモータカセットを有し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　 ａｍｌｌｏｌｊｑｕｅｆａｃ！ｅｎｓ　［ハートレーおよびロジャーソン（２９ ７２）　、プレバラティブ・バイオケミストリー、　Ｍ２（３）！＝。

第２４３〜２５０頁〕からのバルナーゼ遺伝子および実施例９０ツバリンシンタ ーゼ遺伝子の３゛末端とフレームに融合したキメラ配列。

９７７Ｍ８は２成分型Ｔ−ＤＮＡベクターであって、Ｔ−ＤＮＡ境界配列内に次 の３種のキメラ配列を有する：ずなわちＰＳＳＵ−ｓｆｒおよびＰＮＯＳ−ｎｅ ｏ　（これらはそれぞれ第２プロモータとしてＰＳＳＵおよびＰＮＯＳを宵する 標識ＤＮＡである〕　；並びにＰＴＡ２９−バルナーゼ遺伝子〔これは第１プロ モータとしてのＰＴＡ２９の制御下にある雄不稔修掟ＤＮＡである〕。ＴＡ２９ プロモータの制御下における雄不稔性ＤＮＡのタヘート細胞での発現はバルナー ゼをタペート細胞にて選択的に産生ずる結果、バルナーゼはこれら細胞の代謝を 阻実施例１１に記載したように、Ｅ、ｃｏｌｉからのｐＴ’ｒｕｇ　　（実施例 １２から）をｐ　Ｍ　Ｐ　９０を有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕＩＤＣ５８Ｃ Ｉ　ＲｌｆＲ〔フンツおよびシェル（１９ＢＢ）　、モレキュラ・ゼネラル・ジ ェネチックス、第２０４巻、第３８３〜３９Ｂ頁〕中に移動させること９７７Ｍ ８とを有する得られた菌株（「Ａ３１３５Ｊと称する）をタバコ葉ディスクの形 質転換および油菜の形質転換に使用した。

形質転換されたカルスおよびシュート組織を５＋ｎｙ／ｇのホスフィノスリシン および１００μｇ　／　ｍｌのカナマイシンを用いて選択した。バルナーゼ遺伝 子は形質転換された除草鼾苦荒スおよびンユートにて発現されないことが、その 成長により示された。

形質転換されたシニ　ｈ組織を発根させ、温室内の土壌に移し、開花するまで成 長させた。タバコおよび油菜の両者の花を検査し、形質転換植物につき表現系を 観察したところ、実施例】０に記載した形質転換タバコ植物の表現型と実質的に 同じであった。これは、ＴＡ２９プロモータが異型バルナーゼ遺伝子の発現を植 物のタベート細胞にて選択的に指令することにより、これら植物を雄不稔性にし うろことを示している。

第９Ａ図に示した「ｐＴＶＥＰＩ　Ｊと称するプラスミドを、次の周知の断片を 組合せて構築した： １、ｐＧｓｃ１７００から誘導されたＴ−ＤＮＡ境界配列を有しかつβ−ラクタ マーゼ遺伝子（第９Ａ図の１°）がΣμす部位中へのＤＮＡ配列の挿入により失 活されているベクター断片；２、ＰＳＳＵＳＳ上−タと除草剤耐性遺伝子ｓｆｒ とＴ−ＤＮＡ遺伝子７の３゛末端とを有する実施例５のキメラ配列（Ｎｏ。

３）； ３、ＰＮＯＳプロモータとｎｅｏ遺伝子とオクトビンシンターゼ遺伝子の３゛末 端とを有する実施例５のキメラ配列（Ｎα４）；および ４、実施例３からのＰＴＡ２９プロモータカセットを有し、これらが次のものと フレームに融合したキメラ配列：（ａ）　　ペプチド結合並びにエステル結合を 攻撃しうる植物エンドペプチダーゼ〔コーヘン等（１９８［ｉ）　、　　ジーン 、第４８Ｓ、第２１９〜２２７頁〕であるパパインチモーゲンをコードし、コー ヘン等（Ｉｎ２）のＤＮＡ配列にて実施例３に記載したような部位指向性突然変 異を用いて次の改変がなされた組■ｅｌ　　ｐａｐａ■果実からのパパイン遺伝 子： １、第１ＡＴＧコドンの上流の位置−１におけるヌクレオチドＡがヌクレオチド Ｃに突然変異して適するＮｃｏｌクローン化部位を得る；かつ するＧＡＡコドンを、グルタミンをコードするＣＡＡコドンに突然変異させる； さらに （ｂ）　　実施例９０ツバリンシンターゼ遺伝子の３゛末端。

ｐＴＶＥＰｌは２成分型ノＴ　−Ｄ　Ｎ　、Ａベクターであッテ、Ｔ−ＤＮＡ境 界配列内に次の３種のキメラ配列を有する：すなわちＰＳＳＵ−ｓｆｒおよびＰ ＮＯＳ−ｎｅｏ　［これらは植物形質転換体に関する選択可能な優性標識を第２ プロモータとしてのそれぞれＰＳＳＵおよびＰＮＯＳの制御下でフードする標識 ＤＮＡである〕　；並びにＰＴＡ２９−パパイン遺伝子〔これは第１プロモータ としてのＰ　Ｔ　Ａ　２９の制御下にある雄不稔性ＤＮ、Ａである〕。ＴＡ２９ プロモータの制御下における雄不稔性ＤＮＡのタベート細胞での発現は、これら タベート細胞にて蛋白を開裂することによりこれら細胞の死滅をもたらすエンド へブチダーゼ（パパインチモーゲン）を生産する。

、第９Ｂ図に示した「ｐＴＶＥＰ２Ｊと称するプラスミドをも、次の周知の断片 を組合せて構築した： １、　ｐＧｓｃ１７００から誘導されたＴ−ＤＮＡ境界配列を有しがつＢ−ラク タマーゼ遺伝子（ｍ９Ｂ図の１°）がＳ　ｃａ　１部位中へのＤＮＡ配列の挿入 により失活されているベクター断片；２、ＰＳＳＵＳＳ上−タと除草剤耐性遺伝 子ｓｆｒとＴ−ＤＮＡ遺伝子７０３゛末端とを存する実施例５のキメラ配列（Ｎ ＩＬり　；３、ＰＮＯＳプロモータとｎｅｏ遺伝子とオクトビンシンターゼ遺伝 子の３°末端とを有する実施例５のキメラ配列（＆４）　；および ４、実施例３のｐＴＡ２９プロモータカセットを有し、次のものとフレームに融 合したキメラ配列： （ａ）　　パパインチモーゲンの活性蛋白をコードし、実施例３に記載した部位 指向性突然変異を用いてコーヘン等（１９８Ｇ）のＤＮＡ配列にて次の改変を行 なったＣａｒｉｃａ　ｐａｐａｙａ果実からのパパイン遺伝子： １、活性蛋白の第１１１ｅ残基の上流にてＡｓｎをコードするれた部位がｐＴＡ ２９カセットに直接融合して、パパインチモーゲンの活性蛋白をコードする配列 とプロモータとの直接的なフレーム内融合を得る；かっ ｊｌ、それぞれ位１４７．　１１８．　１３５におけるグルタメートをコードす るＧＡＡコドンが、グルタミンをコードするＣＡＡコドンに突然変異される；さ らに （ｂ）　　実施例９のツバリンシンターゼ遺伝子の３°末端。

ｐＴＶＥＰ２はｐＴＶＥＰｌと同様に２成分型のＴ−ＤＮＡベクターであって、 Ｔ−ＤＮＡ境界配列内に次の３種のキメラ遺伝子を有する：すなわち植物形質転 換のための選択可能な優性標識をコードするＰＳＳＵ−ｓｆｒおよびＰＮＯＳ− ｎｅｏ；並びにタベート細胞中で蛋白を開裂して、これらの細胞の死滅をもたら すエンドペプチダーゼをコードするｐＴＡ２９−パパイン遺伝子。

実施例１１に記載したように、ｐＴＶＥＰｌおよびｐＴＶＥＰ２をそれぞれＥ、 ｃｏｌｉからｐ　Ｍ　Ｐ　９０を有する別の＾ｒｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＣ５８ ＣＩ　ＲＩｆ”中に移動させた。

ｐ　Ｍ　Ｐ　９０とｐＴＶＥＰｌとを有しかつｐ　Ｍ　Ｐ　９０とｐＴＶＥＰ２ とを有する得られた菌株を用いて、タバコおよび油菜を実施例１１および１３の 手順にしたがって形質転換させた。パパイン遺伝子は形質転換された除草剤耐性 およびカナマイシン耐性のカルス、シニートおよび根に発現されないことが、そ の成長により示された。

形質転換された植物を温室内に移し、開花するまで土壌にて成長させた。タバコ および油菜の両者の花を検査し、表現型を形質転換植物につき観察したところ、 実施例１０に記載した形質転換タバコ植物の表現型と実質的に同じであった。こ れは、ＴＡ２９ブｏモー９がｐＴＶＥＰｌ　およびｐＴＶＥＰ２１：おける異型 パパイン遺伝子の発現を植物のタベート細胞にて選択的に指令することにより、 これら植物を雄不稔性にしうろことを示す。

第１０Ａ図に示したｒｐＴＶＥＢ３Ｊと称するプラスミドを、次の周知の断片を 組合せて構築した： １、ｐＧｓｃ１７０１Ａ２　　（ヨーロッパ特許出願第８７７１１５９８５．１ 号）から誘導されたＴ−ＤＮＡ境界配列を有するベクター断片；２、ＰＳＳＵＳ Ｓ上−タと除草剤耐性遺伝子ｓｆｒとＴ−ＤＮＡ遺伝子７の３°末端とを有する 実施例５のキメラ配列（ＮＩＬ３）： ゼ遺伝子の３“末端とを有する実施例５のキメラ配列（ＮＣＬ４）　；４．実施 例３のｐＴＡ２９プロモータカセットを有し、次のものとフレームに融合したキ メラ配列： （ａ）　　Ｅ、ｃｏＬｔからのＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼをコードし〔 グリーン等（１９８１）　、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２ ５６巻、第２１４３〜２１５３頁；ボッチルマンおよびラフボウ（１９８５）　 、　　ジーン、Ｎ３７巻、第２２９〜２３９頁〕かつ二本鎖ＤＮＡ上の標的配列 ＧＡＡＴＴＣを認識して開裂することができ、実施例３に記載したように部位指 向性突然変異を用いてグリーン等（１９８１，）のＤＮＡ配列につき次の改変を 行なった遺伝子： ｉ、ＡＴＧ開始コドンのヌクレオチドをＡＴＧＣＡにより交換して、開始コドン にＮ５ｉ１部位を形成すると共に次のヌクレオチド配列： を生ぜしめ；かつ 口、　ｐ　ＥｃｏＲｌ２　（ボッチルマンおよびラフボウ（１９８５）　：ｌに てクローン化されたＥｃｏＲＩ遺伝子のＨｉｎｄ　Ｉｆ−Ｈｉｎｄ　ｍ断片をｐ ＭＡＣ５−８部位指向性突然変異ベクターにクローン化させ；さらに （ｂ）　　実施例９のツバリンシンターゼ遺伝子の３′末端；並び１こ５、Ｌ刈 旦またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｅにて且臼亙Ｉ遺伝子の活性を阻止すること により、微生物におけるＥｃｏＲｌの潜在的な１ノ一ク発現（ｐｏｔｅｎｔｉａ ｌ　Ｉｅａｋｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を解消しうる１天然プロモータ〔ボ ッチルマンおよびラフボウ（１９８５）　、　　ジーン、第３７巻、第２２９〜 ２３９頁〕の制御下にあるＥｃｏＲＩメチラーゼをコードする遺伝子。

ｐ　Ｔ　Ｖ　Ｅ　［ｆ３は２成分型の７−ＤＮＡベクターであって、Ｔ−ＤＮＡ 境界配列内に次の３種のキメラ配列を有する：ＰＳＳＵ−ｓｆｒおよびＰＮＯ５ −ｎｅｏ　（これらは第２プロモータとしてのそれぞれＰＳＳＵおよびＰＮＯ５ の制御下にある標識ＤＮＡである〕　；並びにｐＴＡ２９−ＥｃｏＲ１遺伝子〔 これ１＝第１プロモータとしてのｐＴＡ２９の制御下にある雄不稔性ＤＮＡる雄 不稔性ＤＮＡの発現はＥｃｏＲ１制限エンドヌクレアーゼを産生じ、これはタペ ート細胞のＧＡＡＴＴＣ部位にて二本鎖ＤＮＡを切断し〔タイプ■型制限改変系 に関する文献：ウイルソン（１９８８）　、　Ｔ　Ｉ　Ｇ、第４（＋１）巻、第 ３１４〜３１８頁参照〕、これら細胞の死滅をもたらす。

Ｗ、１０Ｂ図に示したｐ　Ｔ　Ｖ　Ｅ　８２と称するプラスミドをも、次の周知 の断片を組合せて構築した： １、ｐＧｓｃ１７０１Ａ２から誘導されたＴ−ＤＮＡ境界配列を有するベクター 断片； ２．５ＳＵプロモータと除草剤耐性遺伝子１エエとＴ−ＤＮＡ遺伝子７の３°末 端とを有する実施例５のキメラ配列（ＮＣＬ３）　；３、ＰＮＯＳプロモータと ｎｅｏ遺伝子とオクトビンシンターゼ遺伝子のｎ　ｅ　ｏ３’末端とを有する実 施例５のキメラ配列（随４）； ４、実施例３のｐＴＡ２９プロモータカセットを有し、ｐｓＯＤＩ　〔ボウラー 等（１９８９）　、　　ＥＭＢＯ・ジャーナル、第８巻、第３１〜３８頁〕から の１凹１一旦ユ回−■断片のＮｃｏｌ−Ｐｓｔｌ断片であるＭｎ−スーパーオキ サイドジスムターゼ（ｒＭｎ−ＳＯＤＪ）のトランジットペプチドをコードする 遺伝子断片とフレームに融合し、実施例３に記載した部位指向性突然変異を用い てボウラー等のＤＮＡ配列で次の改変を行なったキメラ配列： るＡＡヌクレオチドがＣＣヌクレオチドに変化して、開始コドを生成し； １１、トランジットペプチドの処理部位の直ぐ下流に位置するＴ。

ＴＣＧ、ＣＴＣ，ヌクレオチドがＣ，ＴＧＣ，ＡＧＣ，に変化して、処理部位の 背後にＰｓｔ１部位を形成しかつ次のヌクレオチド配列： 〔ここで、矢印はトランジットペプチド配列の処理部位を示しかつ上側ラインは Ｍｎ−５ＯＤコ一ド配列に対応するアミノ酸配列を示す〕を生成し：Ｎｃｏｌ− Ｐｓｔｌ断片はさらにＥ、ｃｏｌｌからのＥｅｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ〔 グリーン等（１９１１１）　。

ジャーナル・バイオロジカル、ケミストリー、第２５６巻、第２１４３〜２１５ ３頁；ボッチルマンおよびラフボウ（１９８５）、　　ジーン。

第３７巻、　ｍ　２２９〜２３９頁〕をコードしかつｐ　Ｔ　Ｖ　Ｅ　６３に存 在する二本鎖ＤＮＡにおける標的配列ＧＡＡＴＴＣを認識して切断しうる遺伝子 とフレームに融合する；および（ｂ）　　実施例９０ツバリンシンターゼ遺伝子 の３゛末端；並びに解消する天然プロモータ〔ボッチルマンおよびツァボウ（１ ，９８５））の制御下におけるＥｅｏＲＩメチラーゼをコードする遺伝子（この 遺伝子は境界配列の外側でベクター断片中に挿入される）。

ｐＴＶＥ８２は２成分型のＴ−ＤＮＡベクターであって、境界配列内に次の３種 のキメラ配列を有する：すなわちＰＳＳＵ−ｓｆｒおよびＰＮＯＳ−ＮＰＴＩｒ 　［これらは第２プロモータとしてのそれぞれＰＳＳＵおよびＰＮＯＳの制御下 にある標識ＤＮＡである］　；並びにｐＴＡ２９−）ランジスペプチドＥｃｏＲ １エンドヌクレアーゼ遺伝子〔これは第１プロモータとしてｐＴＡ２９ををしか つそれらの間にトランジットペプチドコード配列を有する雄不稔性ＤＮＡである 〕。タペート細胞でのＴＡ２９プロモータの制御下における雄不稔性ＤＮＡの発 現はタベート細胞のミトコンドリアを標的としかつこれら細胞にお１ブるＧＡＡ ＴＴＣ部位にて二本鎖ＤＮＡを切断する制限エンドヌクレアーゼを生産する。こ れは、これら細胞の死滅をもたらす。

実施例１１および１５に記載したように、ｐＴＶＥ６２およびｐＴＶＥ６３をＥ 、ｅｏｌｊからｐ　Ｍ　Ｐ　９０を有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｊｕｍＣ５８Ｃ Ｉ　Ｒｊ、ｆ”に移動させた。ｐＴＶＥ６２をｐＭＰ９０と共に、およびｐＴＶ Ｅ６３をｐ　Ｍ　Ｐ　９０と共に有する得られた菌株を用いてタバコを形質転換 させ、さらにこれらを用いて実施例１１および１３に記載した手順にしたがい油 菜を形質転換させた。ＥｃｏＲエエンドヌクレアーゼ遺伝子は形質転換された除 草剤耐性およびカナマイン耐性のカルス、シニートおよび根に発現されなかった ことが、その成長により示される。

形質転換した植物を室温中に移し、開花するまで土壌にて成長させた。タバコと 油菜との両者の花を検査し、形質転換植物につき表現型を観察したところ、実施 例１Ｏに記載した形質転換タバコ植物と実質的に同じであった。これは、ＴＡ２ ９プロモータが異型ＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の発現をｐＴＶＥ６２ およびｐＴＶＥ［ｉ９で形質転換された植物のタベート細胞にて選択的に指令し て、これら植物を雄不稔性にしうろことを示している。

説明する必要はないが、本発明は特定植物の形質転換のみに限定されない。本発 明は、雄不稔性ＤＮＡの発現を植物の雄蕊細胞にて選択的に指令することにより 植物を自家受粉および他家受粉の両者とじつる第１プロモータの制御下にて、雄 不稔性ＤＮＡで形質転換しつる核ゲノムを持った任意の植物に関するものである 。たとえば本発明は、馬鈴薯、トマト、油菜、アルファルファ、ヒマワリ、綿、 セロリ、玉ネギ、トウモロコシ、大豆、タバコ、油菜野菜および甜菜のように植 物に関するものである。

さらに本発明は上記実施例に記載した特定のプラスミドおよびベクターに限定さ れず、寧ろ第１プロモータの制御下にある雄不稔性ＤＮＡを持った全ゆるプラス ミドおよびベクターを包含する。

さらに本発明は上記実施例に記載されたたとえばＴＡ２９プロモータのような特 定プロモータに限定されず、寧ろ雄不稔性ＤＮＡの発現を雄蕊細胞にて選択的に 指令しうるプロモータをコードする全ゆるＤＮＡ配列を包含する。この点に関し 、本発明は第３Ａ図のＴＡ２９プロモータのＤＮＡ配列、並びにその均等なりＮ Ａ配列、たとえば第３Ｂ図におけるＴＡ１３プロモータの配列および第３Ｃ図の ＴＡ２６のプロモータの配列を包含し、これらを用いて雄不稔性ＤＮＡの発現を 植物のタペート細胞にて選択的に制御することができる。事実、ＴＡ２９．ＴＡ ２６およびＴＡ１ＢＡ１上−タのＤＮＡ配列は、（１）成る種のコドンを同じア ミノ酸または他のアミノ酸をコードする他のコドンで置換することにより、かつ ／または（２）成る種のコドンを除去し或いは追加することにより改変すること ができ、ただしこの種の改変は雄不稔性のタベート特異性発現を制御するだめの コード化されたプロモータの性質を実質的に変化させないものとする。

さらに本発明は上記実施例に記載した特定の雄不稔性ＤＮＡに限定されず、寧ろ 第１プロモータの制御下で生産されて雄蕊細胞の代謝、機能および／または発育 を顕著に阻害する第１ＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプチドをコードする全ゆるＤ ＮＡ配列を包含する。

さらに本発明は上記実施例に記載された特定の標識ＤＮＡに限定されず、寧ろこ の種のＤＮＡ配列が発現される少なくとも特定植物組織もしくは特定植物細胞に 、この種のＤＮＡ配列が発現されない特定植物組織もしくは特定植物細胞と対比 して異なる形質を付与する第２ＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプチドをコードする 全ゆるＤＮＡ配列を包含する。

瑚−目へ　　ｇ− 随〜　　Ｉ−１− 肪〜　　９−　　トー ご〜　　　目〜　　　ご− 迭　目　委　運　退　遍　登　ま　； 退　弦　膠　返　茶　　濾　　盗 一一一−ｖ−１ｗ−４− Ｃ〆） ：へ 霜 水　　　相　　　沓　　　退　　） カ　　　Ｎへ ＦｘのＥ４Ａ （〔 江π１髭り至艶二） １七１　際　調　え　ｔ４　　告 喝＋１．ｘ町Ｉ＋１＾ｅｖｖ＋ｕｔ−＋−ｅＰＣ７７：ｐｐ９／ＱＱ４９三；１ ”１ｍ’ｅＨ１ｌｅ’ＮＡＩ”’Ｉ”＠’Ｍ、　　ＰＣＴ／ＥＰ　　８９１００ ４９５国際調査報告 ＥＰ　ε９ＣＤ？９５

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．外来ＤＮＡ配列、好ましくは外来キメラＤＮＡ配列により形質転換される核 ゲノムを有する植物の細胞であって、前記外来ＤＮＡ配列が （ａ）前記植物の雄蕊細胞に産生されまたは過剰産生された際に雄蕊細胞の代謝 、機能および／または発育を顕著に阻害する第１ＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプ チドをコードする雄不稔性ＤＮＡ、および （ｂ）前記雄不稔性ＤＮＡの発現を植物の雄蕊細胞、好ましくは葯、花粉および ／または花糸細胞、特にタペートおよび／または葯の表皮細胞にて選択的に指示 しうる第１プロモータからなり、前記雄不稔性ＤＮＡは前記第１プロモータと同 じ転写単位に位置しかつその制御下にあることを特徴とする植物の細胞。
2. ２．前記外来ＤＮＡ配列が、好ましくは前記雄不稔性ＤＮＡと同じ遺伝子部位に 、 （ｃ）植物の少なくとも特定組織または少なくとも特定細胞に存在する際に植物 を少なくとも前記特定組織もしくは特定細胞に第２ＲＮＡ、蛋白もしくはポリペ プチドを含有しない他の植物から容易に分離しうるようにする前記第２ＲＮＡ、 蛋白もしくはポリペプチドをコードする標識ＤＮＡ、および（ｄ）前記標識ＤＮ Ａの発現を少なくとも前記特定組織もしくは特定細胞にて指令しうる第２プロモ ータをさらに含み、前記標識ＤＮＡは前記第２プロモータと同じ転写単位に位置 しかつその制御下にある請求の範囲第１項記載の細胞。
3. ３．前記外来ＤＮＡ配列が、 （ｅ）前記第１蛋白もしくはポリペプチドを前記雄蕊細胞の葉緑体もしくはミト コンドリア中に導入しうるトランジットペプチドをコードし、前記雄不稔性ＤＮ Ａおよび前記第１プロモータと同じ転写単位に位置すると共に前記雄不稔性ＤＮ Ａと前記第１プロモータとの間に位置する第１ＤＮＡ、および／または（ｆ）第 ２蛋白もしくはポリペプチドを少なくとも前記特定組織もしくは特定細胞の葉緑 体もしくはミトコンドリア中に導入しうるトランジットペプチドをコードし、前 記標織ＤＮＡおよび前記第２プロモータと同じ転写単位に存在すると共に前記標 識ＤＮＡと前記第２プロモータとの間に位置する第２ＤＮＡをさらに含む請求の 範囲第１項または第２項記載の細胞。
4. ４．前記雄不稔性ＤＮＡがＲＮアーゼ、特にＲＮアーゼＴＩも∬ しくはバルナーゼ；ＤＮアーゼ、特にエンドヌクレアーゼ、殊にＥｃｏＲＩ；プ ロテアーゼ、殊にパパイン」、特にパパインチモーゲンもしくはパパイン活性蛋 白；グルカナーゼ；リパーゼ、特にホスホリパーＡ２；脂質パルオキシダーゼ； 細胞壁インヒビター；細胞トキシン；またはリポチーム、特にＴ＾Ａ２９遺伝子 、ＴＡ２６遺伝子もしくはＴＡ１３遺伝子によりコードされるｍＲＮＡに対する リボチームをコードするか、またはアンチセンスＤＮＡ、特にＴＡ２９遺伝子、 ＴＡ２６遺伝子もしくはＴＡ１３遺伝子のアンチセンスＤＮＡである請求の範囲 第１項〜第３項のいずれか一項に記載の細胞。
5. ５．前記雄不稔性ＤＮＡが、植物ホルモンの合成を触媒する酵素、特にＡｇｒｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍＴ−ＤＮＡの遺伝子１、遺伝子２もしくは遺伝子４によりコ ードされる酵素をコードする請求の範囲第１項〜第４項のいずれか一項に記載の 細胞。
6. ６．前記標識ＤＮＡが除草剤耐性遺伝子、特にｓｆｒもしくははｓｆｒＶ遺伝子 ；除草剤に対しより低い親和性を有する除草剤用の改質標的酵素、特にグリホセ ートの標的としての改変５−エノールピルビルスキメート−３−ホスフェートシ ンターゼまたはグルタミンシンセターゼ阻止剤（たとえばホスフィノトリシン） の標的としての改変グルタミンシンセターゼをコードする遺伝子；少なくとも前 記特定組織もしくは特定細胞に色を与える蛋白もしくはポリペプチをコードする 遺伝子、特に遺伝子Ａ１もしくはＧＵＳ遺伝子；前記植物にストレス耐性を付与 する蛋白もしくはポリペプチドをコードする遺伝子、特にＭｎ−スーパーオキシ ドジスムターゼをコードする遺伝子；病気もしくは害虫耐性を付与する蛋白もし くはポリペプチドをコードする遺伝子、特にＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｎｇｉｅ ｎｓｉｓのンドトキシンをコードして昆虫耐性を付与する遺伝子；または殺細菌 住ペプチドをコードして細菌耐性を付与する遺伝子である請求の範囲第２項〜第 ５項のいずれか一項に記載の細胞。
7. ７．前記第１プロモータがＰＴＡ２９，ＰＴＡ２６，ＰＴＡ１３またはＴＡ２９ ，ＴＡ２６もしくはＴＡ１３にハイブリッド化しうるタペート特異性ｍＲＮＡを コードするＤＮＡのプロモータである請求の範囲第１項〜第６項のいずれか一項 に記載の細胞。
8. ８．前記第２プロモータが構成プロモータ、特に３５Ｓプロモータ、３５Ｓ′３ プロモータ、ＰＮＯＳプロモータもしくはＰＯＣＳプロモータ；傷誘発性プロモ ータ、特にＴＲ１もしくはＴＲ２プロモータ；光合成活性を有する植物組織にて 遺伝子発現を選択的に指令するプロモータ、特にＳＳＵプロモータ；または葉細 胞、花弁細胞もしくは種子細胞、特に種子被覆細胞にて遺伝子発現を選択的に指 命ずるプロモータである請求の範囲第２項〜第７項のいずれか一項に記載の細胞 。
9. ９．植物、特にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍで感染しうる植物の細胞を形質転換 させるのに適し、請求の範囲第１項〜第８項のいずれか一項に記載の外来ＰＮＡ 配列、特にｐＴＴＭ４′ｐＴＴＭ６′ｐＴＴＭ６Ａ−，ｐＴＴＭ８，ｐＴＶＥＰ １，ｐＴＶＥＰ２，ｐＴＶＥ６２もしくはｐＴＶＥ６３を含むベクター。
10. １０．細胞の核ゲノムに安定的に組込まれた請求の範囲第２項〜第８項のいずれ か一項に記載の外来ＤＮＡ配列を有し、これにより前記雄不稔性ＤＮＡが植物の 雄蕊細胞にて選択的に発現されて前記雄蕊細胞に前記第１ＤＮＡ、蛋白もしくは ポリペプチドを生成させると共に、前記標識ＤＮＡを前記植物の少なくとも特定 組織もしくは特定細胞にて発現させて前記植物を未形質転換植物から分離しうる ようにする雄不稔性植物、およびこの横物の繁殖材料の生産方法において、（ａ ）前記外来ＤＮＡ配列を前記細胞の核ゲノム中に導入することにより前記植物の 細胞を形質転換させ、次いで（ｂ）前記植物および繁殖材料を前記細胞から再生 させる非生物学的工程を特徴とする堆不稔性植物および二の植物の繁殖材料の生 産方法。
11. １１．請求の範囲第三項〜第８項のいずれか一項に記載のー植物細胞を含有する 植物細胞培養物。
12. １２．請求の範囲第１項〜第８項のいずれか一項に記載の植物細胞を含有する植 物、特にトウモロコシ、馬鈴薯、トマト、菜種、アルファルファ、ヒマワリ、綿 、セロリ、玉ネギ、クローバー、大豆、タバコ、油菜野菜もしくは甜菜。
13. １３．請求の範囲第１２項記載の植物の種子。
14. １４．（ａ）（ｉ）前記第２プロモータと前記標識ＤＮＡとの両者を含み、特に 前記標識ＤＮＡが除草剤に対する耐性を付与し、特に前記雄不稔性植物の細胞に おける核ゲノムに安定的に組込まれたｓｆｒもしくはｓｆｒＶ遺伝子である請求 の範囲第２項〜第８項のいずれか一項に記載の外来ＤＮＡ配列を含有する雄不稔 性植物を、（ｉｉ）前記標識ＤＮＡを持たない、特に前記除草剤耐性を付与する 前記標識ＤＮＡを持たないホモ接合性の雄稔性植物と他家受粉させ、次いで（ｂ ）前記雄稔性植物の少なくとも前記特定組織もしくは特定細胞にて前記標識ＤＮ Ａが発現しないことを利用して、前記雄稔性植物を前記他の雄不稔性植物から分 離する工程を特徴とするハイブリッド種子の生産方法。
15. １５．前記雄不稔性植物が細胞の核ゲノム中に安定的に組込まれた少なくとも２ 種の異なる標識ＤＮＡを含有し、かつ前記雄稔性植物が前記２種の標識ＤＮＡの 一方を含有するが他方を含有せず、さらに前記雄不稔性植物の少なくとも前記特 定組織もしくは特定細胞にて前記他方の標識ＤＮＡが発現しないことを利用して 前記雄稔性植物を前記雄不稔性植物から分離し、前記他方の標識ＤＮＡが好まし くは除草剤に対する耐性を付与する請求の範囲第１４項記載のハイブリツド種子 の生産方法。
16. １６．請求の範囲第１４項または第１５項記載の方法により得られるハイブリッ ド種子。
17. １７．請求の範囲第１６項記載のハイブリッド種子を成長させて得られるハイブ リッド植物。
18. １８．請求の範囲第７項記載の第１プロモータ、特にｐＴＡ２９、ｐＴＡ２６も しくはｐＴＡ１３。
19. １９．前記雄不稔性ＤＮＡが第１プロモータの制御下で天然には存在せず、かつ ／または前記標識ＤＮＡと同じ遺伝子部位には天然に存在しない請求の範囲第１ 項〜第８項のいずれか一項に記載の外来キメラＤＮＡ配列。
20. ２０．核ゲノムに安定的に組込まれかつそこでＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプチ ドとして発現しうる外来遺伝子物質を含んだ植物およびこの植物のたとえば種子 のような繁殖材料を生産するに際し、（ａ）前記ＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプ チドを発現しない出発植物細胞もしくは植物組織から前記外来遺伝子物質を含む 形質転換された植物細胞もしくは植物組織を生産し、（ｂ）再生された植物また はこれら植物の繁殖材料またはその両者を前記外来遺伝子物質を含む前記形質転 換された植物細胞もしくは植物組織から生産し、かつ（ｃ）必要に応じ前記再生 された植物もしくは繁殖材料またはその両者を生物学的に複製する非生物学的工 程からな生産方法において、前記外来遺伝子物質を含む前記形質転換された植物 細胞もしくは植物組織を生産する工程は、前記出発植物細胞もしくは植物組織の 核ゲノムを請求の範囲第１項〜第８項のいずれか一項に記載の外来ＤＮＡ配列、 並びに前記植物細胞もしくは植物組織における前記外来ＤＮＡ配列の発現を可能 にする制御要素により形質転換させて、形質転換された植物細胞もしくは植物組 織、並びに後代全体にわたりそれらから生産された植物および繁殖材料にて前記 外来ＤＮＡ配列の安定な組込みを生ぜしめることを特徴とする植物およびその繁 殖材料の生産方法。