CN101525580A

CN101525580A - 一种双倍体组氨酸营养缺陷型酿酒酵母及其构建方法

Info

Publication number: CN101525580A
Application number: CN200810247564A
Authority: CN
Inventors: 李十中; 郑焕娣
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2008-12-30
Filing date: 2008-12-30
Publication date: 2009-09-09
Anticipated expiration: 2028-12-30
Also published as: CN101525580B

Abstract

本发明公开了一种双倍体组氨酸营养缺陷型酿酒酵母及其构建方法，属于微生物生物工程领域，本发明酿酒酵母是指该酿酒酵母为双倍体的含有组氨酸营养缺陷标记和g418抗性标记的酿酒酵母菌株。该菌株是TSH－Sc－001(His3－/－)。本发明双倍体组氨酸营养缺陷型酿酒酵母的构建方法，是以双倍体酿酒酵母菌株为出发菌株，用带有目的基因的片段进行两次转化，通过发生两次同源重组，得到2条染色体都发生了同源重组的双倍体组氨酸营养缺陷型酿酒酵母菌株。本发明所得酿酒酵母，易于识别和保护；其次，本发明构建方法为双倍体或多倍体酵母的基因工程改造提供了一种新的途径和方法；本发明构建方法简单、高效，保持酵母的原有特性不变。

Description

一种双倍体组氨酸营养缺陷型酿酒酵母及其构建方法

技术领域

本发明属于微生物生物工程领域，具体涉及一种双倍体组氨酸营养缺陷型酿酒酵母及其构建方法。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Hansen)是传统的酒精生产菌株，具备良好的工业生产性状，耗糖快、乙醇耐受力高、对水解糖液中有毒物质抗性强；其全序列已测定，遗传操作技术也已经成熟。

营养缺陷型酵母菌株在基因工程和遗传改造领域扮演着重要的角色，其中组氨酸营养缺陷是最为常用的营养缺陷型之一；此外，遗传霉素(g418)抗性基因也是酵母常用的筛选标记。

一种用于甜高粱秸秆固态发酵生产乙醇的双倍体酿酒酵母TSH-Sc-001(保藏编号为CGMCC NO.1949)，具有非常好的发酵能力(见专利《一种基于甜高粱茎杆固体发酵制备乙醇的方法及***》(申请号为：200710080388.0)。为了对其保护和进行进一步基因工程改造，需要为其添加遗传和筛选标记。

现有的对酿酒酵母进行基因工程或遗传改造的方法，都是以单倍体菌株作为初始菌株，但工业生产上应用的酵母菌株绝大多数都是双倍体或多倍体，如果将其单倍体化后再进行改造会导致某些特性的改变。

发明内容

本发明的目的在于提供一种双倍体组氨酸营养缺陷型酿酒酵母。该酿酒酵母保持原有酿酒酵母菌株的特性，易于识别。

本发明的另一目的是提供上述双倍体组氨酸营养缺陷型酿酒酵母的构建方法；该方法为双倍体或多倍体酵母的基因工程改造提供了一种新途径。

实现本发明的技术方案如下：

一种双倍体组氨酸营养缺陷型酿酒酵母，是指该酿酒酵母为双倍体的含有组氨酸营养缺陷标记和g418抗性标记的酿酒酵母菌株。

所述的双倍体的组氨酸营养缺陷是指该双倍体酿酒酵母菌株的两条染色体的His3基因均发生了突变，丧失了合成组氨酸的能力，不能在基本培养基(MD)上生长；所述的含有双倍体的g418抗性标记是指该酿酒酵母的两条染色体均含有g418抗性基因，能在含0.5g/L g418的YPD培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，固体培养基加20g/L的琼脂)上生长。

上述双倍体组氨酸营养缺陷型酿酒酵母是指双倍体的含有组氨酸营养缺陷和g418抗性标记的酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)TSH-Sc-001(His3-/-)，该菌株于2008年11月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.2738。该菌株保藏单位地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。

上述双倍体组氨酸营养缺陷型酿酒酵母的构建方法，包括以双倍体酿酒酵母菌株为出发菌株，用带有目的基因的片段进行两次转化，通过发生两次同源重组，得到2条染色体都发生了同源重组的双倍体组氨酸营养缺陷型酿酒酵母菌株。

上述方法中所述的目的基因片段是指目的基因两端分别与His3左臂或His3右臂的DNA序列同源，目的基因片段的中间含有g418抗性基因和/或其他基因。

上述双倍体组氨酸营养缺陷型酿酒酵母的构建方法，包括下述步骤：

(1)根据S.cerevisiae His3基因的序列(Genebank，Accession No.NC001147)和pPIC9K质粒(Invitrogen，Cat.No.V175-20)的序列设计扩增含同源重组左臂和g418抗性基因(His3L-Kan)的引物，在5’端和3’端分别引入EcoR I(GAATTC)和Sal I(GTCGAC)识别序列，以pPIC9K质粒DNA为模板进行PCR扩增，得含同源重组左臂和g418抗性的片段His3L-Kan，纯化；

(2)用EcoR I和Sal I分别双酶切His3L-Kan片段和pUC19载体，纯化酶切产物，然后用T4连接酶进行连接，用所得连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，提取重组质粒DNA，酶切鉴定，得含His3同源重组左臂和g418抗性基因片段的重组质粒pUC19-His3L-Kan；

(3)根据S.cerevisiae His3基因的序列资料(Genebank，Accession No.NC001147)设计扩增含同源重组右臂(His3R)的引物，在5’端和3’端分别引入Sal I(GTCGAC)和Pst I(CTGCAG)识别位点，以S.cerevisiae基因组DNA为模板进行PCR扩增，得His3同源重组右臂片段His3R，纯化；

(4)用Sal I和Pst I分别双酶切His3R和质粒pUC19-His3L-Kan，纯化酶切产物，然后用T4连接酶进行连接，用所得连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，提取重组质粒DNA，酶切鉴定，得含同源重组左臂、g418抗性基因和同源重组右臂的重组质粒pUC19-His3L-Kan-His3R；

(5)用EcoR I和Pst I双酶切重组质粒pUC19-His3L-Kan-His3R，回收纯化1135bp的含同源重组左臂、g418抗性基因和同源重组右臂的片段His3L-Kan-His3R；

(6)通过电穿孔方法将His3L-Kan-His3R片段转化双倍体酿酒酵母感受态细胞，涂含0.25g/L g418的YPD培养基，挑取阳性克隆，提取基因组DNA后进行PCR鉴定，经鉴定在含0.25g/L g418的YPD培养基上生长的阳性单克隆菌株，得一条染色体发生了同源重组，一条染色体未发生同源重组，简写为(His3^+/-)；

(7)通过电穿孔方法将His3L-Kan-His3R片段转化(His3^+/-)感受态细胞，涂含0.5g/L g418的YPD培养基，挑取阳性克隆，提取基因组DNA后进行PCR鉴定，即得本发明在含0.5g/L g418的YPD培养基上生长的两条染色体都发生了同源重组的酿酒酵母菌株(His3^-/-)。

下面以双倍体酿酒酵母(S.cerevisiae)TSH-Sc-001为例，具体说明双倍体组氨酸营养缺陷型酿酒酵母的构建方法。

(1)以pPIC9K质粒DNA为模板，以His3L-1F-Kan和Kan-R为引物进行PCR扩增，扩增得SEQ ID No.9所示的具有Kan抗性基因和His3基因编码区5’端40bp的DNA序列，并在3’端加上Sal I识别位点的DNA序列His3L’-Kan；所述的引物His3L-1F-Kan为SEQ ID No.1所示的DNA序列，所述的引物Kan-R为SEQ ID No.3所示的DNA序列；

(2)以纯化后的PCR产物His3L’-Kan为模板，以His3L-2F和Kan-R为引物进行PCR扩增，扩增得如SEQ ID No.10所示的DNA序列His3L-Kan；纯化；所述的引物His3L-2F为SEQ ID No.2所示的DNA序列；

(3)用EcoR I和Sal I分别双酶切His3L-Kan片段和pUC19载体，纯化酶切产物，然后用T4连接酶进行连接，用所得连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，提取重组质粒DNA，酶切鉴定，得含同源重组左臂和g418抗性基因的重组质粒pUC19-His3L-Kan；

(4)以S.cerevisiae基因组DNA为模板，以His3R-F和His3R-R为引物进行PCR扩增，扩增得如SEQ ID No.11所示的His3同源重组右臂DNA片段His3R，纯化；所述的引物His3R-F为SEQ ID No.4所示的DNA序列，所述的引物His3R-R为SEQ ID No.5所示的DNA序列；

(5)用Sal I和Pst I分别双酶切His3R片段和质粒pUC19-His3L-Kan，纯化，然后用T4连接酶进行连接，用所得连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，提取重组质粒DNA，酶切鉴定，得含同源重组左臂、g418抗性基因和同源重组右臂的重组质粒pUC19-His3L-Kan-His3R；

(6)用EcoR I和Pst I双酶切重组质粒pUC19-His3L-Kan-His3R，回收纯化，得如SEQ ID No.12所示的含His3同源重组左臂、g418抗性基因和His3同源重组右臂的片段His3L-Kan-His3R；

(7)通过电穿孔方法将His3L-Kan-His3R片段转化双倍体酿酒酵母(S.cerevisiae)TSH-Sc-001(保藏编号为：CGMCC NO.1949)感受态细胞，涂含0.25g/Lg418的YPD培养基，挑取阳性克隆，提取基因组DNA后进行PCR鉴定，得到在含0.25g/L g418的YPD培养基上生长的阳性单克隆菌株，一条染色体发生了同源重组，一条染色体未发生同源重组的酿酒酵母菌株，简写为TSH-Sc-001(His3^+/-)；所述的鉴定引物His3L为SEQ ID No.6所示的DNA序列，所述的鉴定引物Kan-ID为SEQ ID No.7所示的DNA序列，所述的鉴定引物His-ID为SEQ IDNo.8所示的DNA序列；

(8)通过电穿孔方法将His3L-Kan-His3R片段转化TSH-Sc-001(His3^+/-)感受态细胞，涂含0.5g/L g418的YPD培养基，挑取阳性克隆，提取基因组DNA，进行PCR鉴定，得到在含0.5g/L g418的YPD培养基上生长的阳性单克隆菌株两条染色体都发生了同源重组酿酒酵母菌株(S.cerevisiae)TSH-Sc-001(His3-/-)(保藏编号为：CGMCC NO.2738)；所述的鉴定引物His3L为SEQ ID No.6所示的DNA序列，所述的鉴定引物Kan-ID为SEQ ID No.7所示的DNA序列，所述的鉴定引物His-ID为SEQ ID No.8所示的DNA序列。

本发明具有的优点：(1)本发明所得酿酒酵母具有组氨酸营养缺陷和g418抗性标记，易于识别和保护；(2)本发明构建方法为双倍体或多倍体酵母的基因工程改造提供了一种新的途径和方法；(3)本发明构建方法简单、高效，而且保持酵母的原有特性不变。

附图说明

图1为His3L-Kan-His3R片段构建过程的流程图。

图2为pUC19-His3L-Kan质粒EcoR I和Sal I双酶切鉴定电泳图谱，

其中M1：DL15000；M2：DL2000；1：pUC19-His3L-Kan。

图3为pUC19-His3L-Kan-His3R质粒EcoR I和Pat I双酶切鉴定电泳图谱，

其中1：pUC19-His3L-Kan-His3R；M1：DL2000；M2：DL15000。

图4为His3L-Kan-His3R片段电泳图谱，

其中1：His3L-Kan-His3R；M1：DL15000；M2：DL2000。

图5为重组菌株用引物His3-F、His-ID、Kan-ID进行鉴定的PCR示意图。

图6为TSH-Sc-001、TSH-Sc-001(His^+/-)和TSH-Sc-001(His3-/-)PCR鉴定电泳图谱，其中

1：His3-F+His-ID空白对照；2：His3-F+Kan-ID空白对照；

3：TSH-Sc-001的DNA为模板，His3-F和His-ID为引物；

4：TSH-Sc-001的DNA为模板，His3-F和Kan-ID为引物；

5：TSH-Sc-001(His^+/-)的DNA为模板，His3-F和His-ID为引物；

6：TSH-Sc-001(His^+/-)的DNA为模板，His3-F和Kan-ID为引物；

7：TSH-Sc-001(His3^-/-)的DNA为模板，His3-F和His-ID为引物；

8：TSH-Sc-001(His3^-/-)的DNA为模板，His3-F和Kan-ID为引物；

M：DL2000。

图7为质粒pUC19-His3L-Kan-His3R的结构示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但不对本发明构成任何限制。

实施例1同源重组片段His3L-Kan-His3R的构建

1.1构建含同源重组左臂和g418抗性基因的pUC19-His3L-Kan质粒

1.1.1扩增含同源重组左臂和g418抗性的His3L-Kan片段(926bp)

根据Genebank中已报道的S.cerevisiae His3基因的序列资料(AccessionNo.NC001147)和pPIC9K质粒(Invitrogen，Cat.No.V175-20)的序列资料，利用Primer Premier 5软件设计PCR引物。

上游引物His3L-1F-Kan

5’-GATTGCGATCTCTTTAAAGGGTGGTCCCCTAGCGATAGAGATGAGCCATATTCAACGGG-3’(SEQ ID No.1)

上游引物His3L-2F

5’-GGAATTCATGACAGAGCAGAAAGCCCTAGTAAAGCGTATTACAAATGAAACCAAGATTCAGATTGCGATCTCTTTAAAG-3’(SEQ ID No.2)

下游引物Kan-R

5’-ACGCGTCGACTTAGAAAAACTCATCGAGCATC-3’(SEQ ID No.3)

1)以pPIC9K质粒为模板，以His3L-1F-Kan和Kan-R为引物扩增Kan抗性基因，同时引入His3基因编码区5’端40bp的序列，并在3’端加上Sal I识别位点。用

DNA Polymerase(Takara，Cat.No.DR005A)，反应体系为：

10×Pyrobest Buffer II 5.00μl

dNTP混合物(每种dNTP 2.5mM) 4.00μl

His3L-1F-Kan or His3L-2F(20μM) 1.00μl

Kan-R(20μM) 1.00μl

Pyrobest DNA聚合酶(5U/μl) 0.25μl

pPIC9K质粒DNA 0.50μl

ddH₂O 38.25μl

总体积 50.00μl

PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，循环30次；72℃10min。

通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将所得片段大小为866bp的PCR产物His3L’-Kan(SEQ ID No.9)用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGEN，Cat.No.DP209-02)进行纯化，操作步骤和方法按产品说明书进行。

2)以His3L’-Kan为模板，以His3L-2F和Kan-R为引物进行PCR扩增，同时引入His3基因编码区5’端93bp的序列，并在5’端加上EcoR I识别位点，3’端加上Sal I识别位点。用

DNA Polymerase(Takara，Cat.No.DR005A)，PCR反应体系、条件和PCR产物纯化方法与1)所述的PCR相同。回收、纯化片段大小为926bp的PCR产物，得含同源重组左臂和g418抗性的His3L-Kan片段(SEQ ID No.10)。

1.1.2构建含同源重组左臂和g418抗性基因的pUC19-His3L-Kan质粒(3568bp)

pUC19(Takara，Cat.No.D3219)质粒经E.coli DH5α(TIANGEN，Cat.No.CB101-02)扩增后，用质粒小提试剂盒(TIANGEN，Cat.No.DP103-02)进行提取，操作步骤和方法按产品说明书进行。将pUC19质粒和上述所得PCR产物His3L-Kan分别用EcoR I(Takara，Cat.No.D1040A)和Sal I(Takara，Cat.No.D1080A)进行双酶切，酶切体系如下：

A B

10×H buffer 5.0μl 10×H buffer 5.0μl

EcoR I 2.0μl EcoR I 2.0μl

Sal I 2.0μl Sal I 2.0μl

pUC19 20.0μl EcoRI-His3L-Kan-SalI 20.0μl

ddH₂O 21.0μl ddH₂O 21.0μl

总体积 50.0μl 总体积 50.0μl

将上述体系混匀，瞬时离心，37℃酶切过夜。酶切产物用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGEN，Cat.No.DP209-02)进行纯化，操作步骤和方法按产品说明书进行。将纯化的酶切片段(EcoRI-pUC19-SalI和EcoRI-His3L-Kan-SalI)用T4 DNA连接酶(Takara，Cat.No.D2011A)进行连接，连接反应体系如下：

10×T4 DNA ligase buffer 2.0μl

EcoRI-pUC19-SalI 2.0μl

EcoRI-His3L-Kan-SalI 10.0μl

T4 DNA ligase 1.0μl

ddH₂O 5.0μl

总体积 20.0μl

将上述体系混匀，瞬时离心，16℃连接过夜。

用连接产物转化E coli DH5α感受态细胞(TIANGEN，Cat.No.CB101-02)，方法步骤如下：

取出于-70℃冻存的E coli DH5α感受态细胞，放于手心使之速融，然后再置于冰上；分别取50μl至灭菌后的eppendorf管中，再加入5μl连接产物，轻轻混匀，置冰浴30min；42℃热休克90s，不要摇动试管，迅速放入冰浴2min；每管加入950μl 37℃预热的LB培养液，于37℃200rpm培养1h，使细胞复苏，并表达质粒编码的抗生素标记基因。

3500rpm离心5min，倒掉900μl上清，将剩余的100μl液体和细胞沉淀混匀，均匀地涂布于含有氨苄青霉素100mg/L和卡那霉素50mg/L的LB平板培养基上，37℃倒置培养过夜。

挑取抗性平板上的单克隆菌落，接种于5ml含有氨苄青霉素100mg/L和卡那霉素50mg/L的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜。用质粒小提试剂盒(TIANGEN，Cat.No.DP103-02)提取质粒，用EcoR I(Takara，Cat.No.D1040A)和Sal I(Takara，Cat.No.D1080A)双酶切进行鉴定(图2)，酶切体系如下：

10×H buffer 2.0μl

EcoR I 1.0μl

Sal I 1.0μl

pUC19-His3L-Kan 10.0μl

ddH₂O 6.0μl

总体积 20.0μl

pUC19-His3L-Kan质粒用EcoR I和Sal I双酶切得到两个大小分别为915bp和2653bp的片段，将鉴定正确的克隆转接于含有氨苄青霉素100mg/L和卡那霉素50mg/L的LB液体培养基中培养并提取质粒。

1.2含同源重组左臂、g418抗性基因和同源重组右臂的pUC19-His3L-Kan-His3R质粒的构建

1.2.1扩增同源重组右臂His3R片段(228bp)

根据Genebank中已报道的S.cerevisiae His3基因的序列资料(AccessionNo.NC001147)，利用Primer Premier5软件设计PCR引物。

上游引物His3R-F

5’-ACGCGTCGACGTAGGAGATCTCTCTTGCGAGATG-3’(SEQ ID No.4)

下游引物His3R-R

5’-AACTGCAGCTACATAAGAACACCTTTGGTGGAG-3’(SEQ ID No.5)

扩增的目的片段为His3R(228bp)(SEQ ID No.11)，用酵母基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN，Cat.No.DP307-02)提取S.cerevisiae(CGMCC NO.1949)基因组DNA，作为扩增His3R片段的模板，以His3R-F和His3R-R为引物扩增His3编码区3’端210bp的序列，并在5’端加上Sal I识别位点，3’端加上Pst I识别位点。用

DNA Polymerase(Takara，Cat.No.DR005A)，反应体系为：

10×Pyrobest Buffer II 5.00μl

dNTP mix(2.5mM each) 4.00μl

His3R-F(20μM) 1.00μl

His3R-R(20μM) 1.00μl

Pyrobest DNA Polymerase(5U/μl) 0.25μl

S.cerevisiae(CGMCC NO.1949)基因组DNA 0.50μl

ddH₂O 38.25μl

总体积 50.00μl

PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，循环30次；72℃10min。

PCR结束后，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将检测结果正确的PCR产物用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGEN，Cat.No.DP209-02)进行纯化，操作步骤和方法按产品说明书进行。

1.2.2含同源重组左臂、g418抗性基因和同源重组右臂的pUC19-His3L-Kan-His3R质粒(3778bp)的构建

1.1构建得到的pUC19-His3L-Kan质粒和1.2.1得到的PCR产物His3R用SalI(Takara，Cat.No.D1080A)和Pst I(Takara，Cat.No.D1073A)双酶切，酶切体系如下：

A B

10×H buffer 5.0μl 10×H buffer 5.0μl

Sal I 2.0μl Sal I 2.0μl

Pst I 2.0μl Pst I 2.0μl

pUC19-His3L-Kan 20.0μl SalI-His3R-PstI 20.0μl

ddH₂O 21.0μl ddH₂O 21.0μl

总体积 50.0μl 总体积 50.0μl

酶切反应条件和酶切产物纯化方法同1.1.2。将酶切所得产物SalI-pUC19-His3L-Kan-PstI和SalI-His3R-PstI用T4 DNA连接酶(Takara，Catalog No.D2011A)进行连接，得连接反应体系如下：

10×T4 DNA ligase buffer 2.0μl

SalI-pUC19-His3L-Kan-Pst I 2.0μl

SalI-His3R-PstI 10.0μl

T4 DNA ligase 1.0μl

ddH₂O 5.0μl

总体积 20.0μl

连接反应条件、转化E coli DH5α感受态细胞的方法同1.1.2。

挑取抗性平板上的单克隆菌落，接种于5ml含有氨苄青霉素100mg/L和卡那霉素50mg/L的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜。用质粒小提试剂盒(TIANGEN，Cat.No.DP103-02)提取质粒，得pUC19-His3L-Kan-His3R质粒(见图7)，用EcoR I(Takara，Catalog No.D1040A)和Pst I(Takara，CatalogNo.D1073A)双酶切进行鉴定(见图3)，酶切体系如下：

10×H buffer 2.0μl

EcoR I 1.0μl

Pst I 1.0μl

pUC19-His3L-Kan-His3R 10.0μl

ddH₂O 6.0μl

总体积 20.0μl

pUC19-His3L-Kan-His3R质粒用EcoR I和Pst I双酶切得到两个大小分别为1135bp和2643bp的片段。将鉴定正确的克隆转接于含有氨苄青霉素100mg/L和卡那霉素50mg/L的LB液体培养基中培养并提取质粒。

1.3含同源重组左臂、g418抗性基因和同源重组右臂的His3L-Kan-His3R打靶片段的获得

pUC19-His3L-Kan-His3R质粒用EcoR I(Takara，Cat.No.D1040A)和PstI(Takara，Cat.No.D1073A)双酶切，酶切体系如下：

10×H buffer 5.0μl

EcoR I 2.0μl

Pst I 2.0μl

pUC19-His3L-Kan-His3R 20.0μl

ddH₂O 21.0μl

总体积 50.0μl

酶切反应条件和酶切产物纯化方法同1.1.2，回收1135bp的含同源重组左臂、g418抗性基因和同源重组右臂的His3L-Kan-His3R片段(SEQ ID No.12)(见图4)。

实施例2单染色体交换酿酒酵母菌株的获得

用实施例1中1.3得到的1135bp的His3L-Kan-His3R片段，通过电穿孔方法转化S.cerevisiae TSH-Sc-001(CGMCC NO.1949)感受态细胞。所用的电穿孔仪是Gene Pulser Xcell^TM Electroporation System(Bio-Rad公司)，S.cerevisiae感受态细胞的制备方法参照该仪器说明书。

对于每个电转的样品，准备一支含1ml 1M山梨醇的YPD液体培养基的小试管并置于冰上冷却，同时准备2mm的电转杯并置于冰上冷却。

将待转化的His3L-Kan-His3R片段(100ng/5μl)于冰上冷却，加入40μl的感受态细胞到DNA样品中，轻轻地混匀，于冰上冰浴约5min。

准备好电转仪，按预设的程序进行酿酒酵母细胞的转化，电转化的参数为C＝25μF；PC＝200ohm；V-1.5kV；2mm cuvettes。

将DNA-感受态细胞转入到冰冷的2mm电转杯底部，盖上盖子，按键进行电击；取出电转杯，立即加入1ml冰冷的含1M山梨醇的YPD液体培养基到电转杯中，然后倒回小试管中。

检查电转记录，电击的时间应该为5ms左右，将电转化后的S.cerevisiae预培养2个小时候涂布于含1M山梨醇及0.25g/L g418的YPD平板培养基上，30℃倒置培养3d。

挑取g418抗性平板上的单克隆菌落，接种于5ml含g418(0.25g/L)的YPD液体培养基中，30℃200rpm培养过夜；

用酵母基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN，Cat.No.DP307-02)进行S.cerevisiae基因组DNA的提取，操作步骤和方法按产品说明书进行。以初始或重组的S.cerevisiae基因组DNA为模板，通过下列引物进行PCR扩增，判定是否发生了同源重组。上游引物His3-F来源于His3基因上游启动子区的一段序列；下游引物His-ID来源于His3基因区(为一段反向互补序列)；下游引物Kan-ID来源于Kan基因区(为一段反向互补序列)。因此，引物His3-F和His-ID的扩增产物代表未发生同源重组(SEQ ID No.13)；引物His3-F和Kan-ID的扩增产物则代表已发生同源重组(SEQ ID No.14)。引物以基因组DNA为模板的PCR示意图(见图5)。

上游引物His3-F：5’-TGCACGGTCCTGTTCCCTAGCATG-3’(SEQ ID No.6)

下游引物Kan-ID：5’-AGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTC-3’(SEQ ID No.7)

下游引物His-ID：5’-GGAATGCTTGGCCAGAGCATGTATC-3’(SEQ ID No.8)

初始菌株TSH-Sc-001分别用这两对引物扩增，仅引物His3-F和His-ID能得到681bp的PCR产物。一条染色体发生了重组、另一条染色体未发生重组的菌株分别用这两对引物扩增，能得到582bp和681bp的PCR产物。两条染色体均发生了重组的菌株分别用这两对引物扩增，仅引物His3-F和Kan-ID能得到582bp的PCR产物。

用rTaq DNA Polymerase(Takara，Cat.No.DR100AM)，反应体系为：

10×PCR Buffer 5.0μl

dNTP mix(2.5mM each) 4.0μl

MgCl₂(25mM) 3.0μl

His3-F(20μM) 1.0μl

Kan-ID or His-ID(20μM) 1.0μl

Taq DNA Polymerase(5U/μl) 0.5μl

S.cerevisiae genome DNA 0.5μl

ddH₂O 35.0μl

总体积 50.0μl

PCR结束后，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物片段大小，结果(见图6)显示经过一次电转化得到的能在含0.25g/L g418的YPD培养基上生长的单克隆菌落，用引物His3-F和Kan-ID扩增能得到582bp的PCR产物(SEQ ID No.14)，用引物His3-F和His-ID扩增能得到681bp的PCR产物(SEQ ID No.13)，证明只有一条染色体发生了同源重组，另一条染色体未发生同源重组，重组菌株简写为TSH-Sc-001(His3^+/-)。

实施例3双染色体交换酿酒酵母菌株的获得

用实施例2得到的TSH-Sc-001(His3^+/-)菌株制备感受态细胞，转化方法同实施例2。转化后的细胞涂布于含1M山梨醇及0.5g/L g418的YPD平板培养基上，30℃倒置培养3d。单克隆菌落的培养方法、基因组DNA提取方法和PCR鉴定方法同实施例2。

PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果显示(见图6)，经过两次电转化得到的能在含0.5g/L g418的YPD培养基上生长的单克隆菌落，仅引物His3-F和Kan-ID能扩增得到582bp的PCR产物(SEQ ID No.14)，引物His3-F和His-ID未能扩增得到PCR产物，证明两条染色体都发生了同源重组，获得了本发明的酿酒酵母(S.cerevisiae)TSH-Sc-001(His3-/-)(CGMCC NO.2738)。

实施例4重组酿酒酵母菌株表型及活性鉴定

将TSH-Sc-001、实施例2所得TSH-Sc-001(His3^+/-)和实施例3所得TSH-Sc-001(His3-/-)分别接种到YPD、YPD-0.25g418(含0.25g/L的g418)、YPD-0.5g418(含0.5g/L的g418)和MD(培养基组成为：无氨基酸酵母氮源YNB13.4g/L，葡萄糖20g/L，生物素4mg/L，琼脂20g/L)平板培养基上，30℃倒置培养48h。

结果在YPD平板培养基上3个菌株均能生长；在YPD-0.25g418平板培养基上TSH-Sc-001不能生长，TSH-Sc-001(His^+/-)和TSH-Sc-001(His3^-/-)能生长。在YPD-0.5g418平板培养基上TSH-Sc-001和TSH-Sc-001(His3^+/-)不能生长，TSH-Sc-001(His3^-/-)能生长。在MD平板培养基上TSH-Sc-001和TSH-Sc-001(His3^+/-)能生长，TSH-Sc-001(His3-/-)不能生长。

上述结果说明TSH-Sc-001(His3^+/-)只有一条染色体发生了重组，因此只能耐受低浓度(0.25g/L)的g418，同时由于未发生重组的一条染色体有完整的His3基因，故能在不含组氨酸的MD培养基上生长；SH-Sc-001(His3-/-)两条染色体均发生了重组，因此能耐受高浓度(0.5g/L)的g418，同时由于两条染色体的His3基因均被破坏，不能合成组氨酸，故不能在不含组氨酸的MD培养基上生长。

同时发酵实验证明，TSH-Sc-001、TSH-Sc-001(His^+/-)和TSH-Sc-001(His3-/-)在发酵产乙醇能力方面没有差别。

本发明在不改变初始菌株其它特征的前提下，为其添加了组氨酸营养缺陷标记和g418抗性标记，得到目的菌株S.cerevisiae Sc001 TSH-Sc-001(His3-/-)(CGMCC NO.2738)。该菌株含有的这些标记既可以作为菌株本身的一个特征，同时为对该菌株进行深入的遗传和基因工程改造提供了基础和可用的筛选标记。

序列表

<110>清华大学

<120>一种双倍体组氨酸营养缺陷型酿酒酵母及其构建方法

<160>14

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>59

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>His3同源左臂的扩增引物

<400>1

gattgcgatc tctttaaagg gtggtcccct agcgatagag atgagccata ttcaacggg 59

<210>2

<211>79

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>His3同源左臂的扩增引物

<400>2

ggaattcatg acagagcaga aagccctagt aaagcgtatt acaaatgaaa ccaagattca 60

gattgcgatc tctttaaag 79

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>g418抗性基因的扩增引物

<400>3

acgcgtcgac ttagaaaaac tcatcgagca tc 32

<210>4

<211>34

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>含同源重组右臂(His3R)的引物

<400>4

acgcgtcgac gtaggagatc tctcttgcga gatg 34

<210>5

<211>33

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>含同源重组右臂(His3R)的引物

<400>5

aactgcagct acataagaac acctttggtg gag 33

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>鉴定引物

<400>6

tgcacggtcc tgttccctag catg 24

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>鉴定引物

<400>7

agacgtttcc cgttgaatat ggctc 25

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>鉴定引物

<400>8

ggaatgcttg gccagagcat gtatc 25

<210>9

<211>866

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>His3L’-Kan DNA序列

<400>9

gattgcgatc tctttaaagg gtggtcccct agcgatagag atgagccata ttcaacggga 60

aacgtcttgc tcgaggccgc gattaaattc caacatggat gctgatttat atgggtataa 120

atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgattgt atgggaagcc 180

cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg atgttacaga 240

tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct cttccgacca tcaagcattt 300

tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg atccccggga aaacagcatt 360

ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gttgatgcgc tggcagtgtt 420

cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg atcgcgtatt 480

tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga gtgattttga 540

tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata agcttttgcc 600

attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc ttatttttga 660

cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag accgatacca 720

ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac agaaacggct 780

ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc atttgatgct 840

cgatgagttt ttctaagtcg acgcgt 866

<210>10

<211>926

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>His3L-Kan DNA序列

<400>10

ggaattcatg acagagcaga aagccctagt aaagcgtatt acaaatgaaa ccaagattca 60

gattgcgatc tctttaaagg gtggtcccct agcgatagag atgagccata ttcaacggga 120

aacgtcttgc tcgaggccgc gattaaattc caacatggat gctgatttat atgggtataa 180

atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgattgt atgggaagcc 240

cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg atgttacaga 300

tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct cttccgacca tcaagcattt 360

tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg atccccggga aaacagcatt 420

ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gttgatgcgc tggcagtgtt 480

cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg atcgcgtatt 540

tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga gtgattttga 600

tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata agcttttgcc 660

attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc ttatttttga 720

cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag accgatacca 780

ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac agaaacggct 840

ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc atttgatgct 900

cgatgagttt ttctaagtcg acgcgt 926

<210>11

<211>228

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>His3R DNA序列

<400>11

acgcgtcgac gtaggagatc tctcttgcga gatgatcccg cattttcttg aaagctttgc 60

agaggctagc agaattaccc tccacgttga ttgtctgcga ggcaagaatg atcatcaccg 120

tagtgagagt gcgttcaagg ctcttgcggt tgccataaga gaagccacct cgcccaatgg 180

taccaacgat gttccctcca ccaaaggtgt tcttatgtag ctgcagtt 228

<210>12

<211>1135

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>His3L-Kan-His3R DNA序列

<400>12

aattcatgac agagcagaaa gccctagtaa agcgtattac aaatgaaacc aagattcaga 60

ttgcgatctc tttaaagggt ggtcccctag cgatagagat gagccatatt caacgggaaa 120

cgtcttgctc gaggccgcga ttaaattcca acatggatgc tgatttatat gggtataaat 180

gggctcgcga taatgtcggg caatcaggtg cgacaatcta tcgattgtat gggaagcccg 240

atgcgccaga gttgtttctg aaacatggca aaggtagcgt tgccaatgat gttacagatg 300

agatggtcag actaaactgg ctgacggaat ttatgcctct tccgaccatc aagcatttta 360

tccgtactcc tgatgatgca tggttactca ccactgcgat ccccgggaaa acagcattcc 420

aggtattaga agaatatcct gattcaggtg aaaatattgt tgatgcgctg gcagtgttcc 480

tgcgccggtt gcattcgatt cctgtttgta attgtccttt taacagcgat cgcgtatttc 540

gtctcgctca ggcgcaatca cgaatgaata acggtttggt tgatgcgagt gattttgatg 600

acgagcgtaa tggctggcct gttgaacaag tctggaaaga aatgcataag cttttgccat 660

tctcaccgga ttcagtcgtc actcatggtg atttctcact tgataacctt atttttgacg 720

aggggaaatt aataggttgt attgatgttg gacgagtcgg aatcgcagac cgataccagg 780

atcttgccat cctatggaac tgcctcggtg agttttctcc ttcattacag aaacggcttt 840

ttcaaaaata tggtattgat aatcctgata tgaataaatt gcagtttcat ttgatgctcg 900

atgagttttt ctaagtcgac gtaggagatc tctcttgcga gatgatcccg cattttcttg 960

aaagctttgc agaggctagc agaattaccc tccacgttga ttgtctgcga ggcaagaatg 1020

atcatcaccg tagtgagagt gcgttcaagg ctcttgcggt tgccataaga gaagccacct 1080

cgcccaatgg taccaacgat gttccctcca ccaaaggtgt tcttatgtag ctgca 1135

<210>13

<211>681

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>引物His3-F和His-ID扩增的目的产物DNA序列

<400>13

tgcacggtcc tgttccctag catgtacgtg agcgtatttc cttttaaacc acgacgcttt 60

gtcttcattc aacgtttccc attgtttttt tctactattg ctttgctgtg ggaaaaactt 120

atcgaaagat gacgactttt tcttaattct cgttttaaga gcttggtgag cgctaggagt 180

cactgccagg tatcgtttga acacggcatt agtcagggaa gtcataacac agtcctttcc 240

cgcaattttc tttttctatt actcttggcc tcctctagta cactctatat ttttttatgc 300

ctcggtaatg attttcattt ttttttttcc acctagcgga tgactctttt tttttcttag 360

cgattggcat tatcacataa tgaattatac attatataaa gtaatgtgat ttcttcgaag 420

aatatactaa aaaatgagca ggcaagataa acgaaggcaa agatgacaga gcagaaagcc 480

ctagtaaagc gtattacaaa tgaaaccaag attcagattg cgatctcttt aaagggtggt 540

cccctagcga tagagcactc gatcttccca gaaaaagagg cagaagcagt agcagaacag 600

gccacacaat cgcaagtgat taacgtccac acaggtatag ggtttctgga ccatatgata 660

catgctctgg ccaagcattc c 681

<210>14

<211>582

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>引物His3-F和Kan-ID扩增的目的产物

<400>14

tgcacggtcc tgttccctag catgtacgtg agcgtatttc cttttaaacc acgacgcttt 60

gtcttcattc aacgtttccc attgtttttt tctactattg ctttgctgtg ggaaaaactt 120

atcgaaagat gacgactttt tcttaattct cgttttaaga gcttggtgag cgctaggagt 180

cactgccagg tatcgtttga acacggcatt agtcagggaa gtcataacac agtcctttcc 240

cgcaattttc tttttctatt actcttggcc tcctctagta cactctatat ttttttatgc 300

ctcggtaatg attttcattt ttttttttcc acctagcgga tgactctttt tttttcttag 360

cgattggcat tatcacataa tgaattatac attatataaa gtaatgtgat ttcttcgaag 420

aatatactaa aaaatgagca ggcaagataa acgaaggcaa agatgacaga gcagaaagcc 480

ctagtaaagc gtattacaaa tgaaaccaag attcagattg cgatctcttt aaagggtggt 540

cccctagcga tagagatgag ccatattcaa cgggaaacgt ct 582

Claims

1、一种双倍体组氨酸营养缺陷型酿酒酵母，其特征在于所述的酿酒酵母为双倍体的含有组氨酸营养缺陷标记和g418抗性标记的酿酒酵母菌株。

2、按照权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于所述的酿酒酵母菌株是指酿酒酵母菌株(S.cerevisiae)TSH-Sc-001(His3-/-)，该菌株已于2008年11月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.2738。

3、权利要求1所述的双倍体组氨酸营养缺陷型酿酒酵母的构建方法，其特征在于以双倍体酿酒酵母菌株为出发菌株，用带有目的基因的片段进行两次转化，通过发生两次同源重组，得到2条染色体都发生了同源重组的双倍体组氨酸营养缺陷型酿酒酵母菌株。

4、按照权利要求3所述的构建方法，其特征在于其所述的目的基因片段是指目的基因的两端分别与His3左臂或His3右臂的DNA序列同源，目的基因片段的中间含有g418抗性基因和/或其他基因。

5、权利要求1或3所述的双倍体组氨酸营养缺陷型酿酒酵母的构建方法，包括下述步骤：

(1)根据S.cerevisiae His3基因的序列和pPIC9K质粒的序列设计扩增含同源重组左臂和g418抗性基因的引物，在5’端和3’端分别引入EcoR I(GAATTC)和Sal I(GTCGAC)识别序列，以pPIC9K质粒DNA为模板进行PCR扩增，得含同源重组左臂和g418抗性的片段His3L-Kan，纯化；

(3)根据S.cerevisiae His3基因的序列设计扩增含同源重组右臂(His3R)的引物，在5’端和3’端分别引入Sal I和Pst I识别位点，以S.cerevisiae基因组DNA为模板进行PCR扩增，得His3同源重组右臂片段His3R，纯化；

(6)通过电穿孔方法将His3L-Kan-His3R片段转化双倍体酿酒酵母感受态细胞，涂含0.25g/L g418的YPD培养基，挑取阳性克隆，提取基因组DNA后进行PCR鉴定，经鉴定在含0.25g/L g418的YPD培养基上生长的阳性单克隆菌株，得一条染色体发生了同源重组，一条染色体未发生同源重组，标记为(His3^+/-)；

(7)通过电穿孔方法将His3L-Kan-His3R片段转化双倍体酿酒酵母(His3^+/-)感受态细胞，涂含0.5g/L g418的YPD培养基，挑取阳性克隆，提取基因组DNA后进行PCR鉴定，即得本发明在含0.5g/L g418的YPD培养基上生长的两条染色体都发生了同源重组的酿酒酵母菌株(His3^-/-)。

6、权利要求1或2所述的双倍体组氨酸营养缺陷型酿酒酵母的构建方法，其特征在于包括下述步骤：

(1)以pPIC9K质粒DNA为模板，以His3L-1F-Kan和Kan-R为引物进行PCR扩增，扩增得如SEQ ID No.9所示的DNA序列His3L’-Kan；所述的引物His3L-1F-Kan为SEQ ID No.1所示的DNA序列，所述的引物Kan-R为SEQ ID No.3所示的DNA序列；

(2)以纯化后的PCR产物His3L’-Kan为模板，以His3L-2F和Kan-R为引物进行PCR扩增，扩增得SEQ ID No.10所示的DNA序列His3L-Kan；纯化；所述的引物His3L-2F为SEQ ID No.2所示的DNA序列；

(4)以S.cerevisiae基因组DNA为模板，以His3R-F和His3R-R为引物进行PCR扩增，得SEQ ID No.11所示的含His3同源重组右臂DNA片段His3R，纯化；其中所述的引物His3R-F为SEQ ID No.4所示的DNA序列，所述的引物His3R-R为SEQ ID No.5所示的DNA序列；

(6)用EcoR I和Pst I双酶切重组质粒pUC19-His3L-Kan-His3R，回收纯化，得如SEQ ID No.12所示的DNA片段His3L-Kan-His3R；

(7)通过电穿孔方法将His3L-Kan-His3R片段转化双倍体酿酒酵母(S.cerevisiae)TSH-Sc-001感受态细胞，涂含0.25g/L g418的YPD培养基，挑取阳性克隆，提取基因组DNA后进行PCR鉴定，得到在含0.25g/L g418的YPD培养基上生长的阳性单克隆菌株，一条染色体发生了同源重组，一条染色体未发生同源重组的酿酒酵母菌株TSH-Sc-001(His3^+/-)；其中PCR鉴定所用的引物His3L为SEQ ID No.6所示的DNA序列，所述的引物Kan-ID为SEQ ID No.7所示的DNA序列，所述的引物His-ID为SEQ ID No.8所示的DNA序列；

(8)通过电穿孔方法将His3L-Kan-His3R片段转化TSH-Sc-001(His3^+/-)感受态细胞，涂含0.5g/L g418的YPD培养基，挑取阳性克隆，提取基因组DNA，进行PCR鉴定，得到在含0.5g/L g418的YPD培养基上生长的阳性单克隆菌株两条染色体都发生了同源重组酿酒酵母菌株(S.cerevisiae)TSH-Sc-001(His3-/-)，其中PCR鉴定所用的引物同步骤(7)。

7、按照权利要求6所述的构建方法，其特征在于其步骤(1)中所述的引物His3L-1F-Kan为SEQ ID No.1所示的DNA序列，所述的引物Kan-R为SEQ IDNo.3所示的DNA序列。

8、按照权利要求6或7所述的构建方法，其特征在于其步骤(2)中所述的引物His3L-2F为SEQ ID No.2所示的DNA序列。

9、按照权利要求8所述的构建方法，其特征在于其步骤(4)中所述的引物His3R-F为SEQ ID No.4所示的DNA序列，所述的引物His3R-R为SEQ ID No.5所示的DNA序列。

10、按照权利要求9所述的构建方法，其特征在于其步骤(8)中PCR鉴定所用的引物His3L为如SEQ ID No.6所示的DNA序列，所述的引物Kan-ID为SEQID No.7所示的DNA序列，所述的引物His-ID为SEQ ID No.8所示的DNA序列。