JP4963488B2 - 変異体酵母及びこれを用いた物質生産方法 - Google Patents
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Description
(1)目的生産物の生産に関与する酵素をコードする外来遺伝子と、構成的に発現可能なHAP4遺伝子又はその相同遺伝子とを導入した変異体酵母。
本発明に係る変異体酵母は、目的生産物の生産に関与する酵素をコードする外来遺伝子と、構成的に発現可能なHAP4遺伝子又はその相同遺伝子とを導入したものである。ここで、HAP4遺伝子とは、ヘミ活性化、グルコース抑制されるHap2p/3p/4p/5p CCAAT-結合性複合体のサブユニットを構成するHAP4タンパク質をコードしている。当該複合体は、種々の遺伝子の転写促進活性を有していることが知られている。特に、HAP4タンパク質及び上記複合体については、Gancedo JM (1998) Yeast carbon catabolite repression. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62(2), p334-61に詳述されている。
LDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊用DNA断片の作製
先ず、宿主となる酵母に対して外来遺伝子として乳酸脱水素酵素(LDH)遺伝子を導入するとともに、アルコール合成に関与するピルビン酸合成酵素遺伝子(PDC1遺伝子)を破壊するためのDNA断片を作製した。
また、本実施例では、PDC5遺伝子を破壊するためのDNA断片を作製した。具体的には、Saccharomyces cerevisiae BY4742株(Invitrogen社)のゲノムDNAを鋳型として、PDC5遺伝子の5'上流非翻訳領域DNA断片と3'下流非翻訳領域DNA断片をそれぞれPCRで増幅した(図2参照)。使用したPCR用プライマーは前者がTB604(5'-TTCGCATCTAAGGGGTGGTG-3':配列番号11)とTB607(5'-GCGTGTACGCATGTAACTTTGTTCTTCTTGTTATT-3':配列番号12)、後者がTB599(5'-CTAACATTCAACGCTAGACGGTTCTCTACAATTGA-3':配列番号13)とTB501(5'-TAAGAAGGCATGTTGGCCTCTGT-3':配列番号14)である。
また、本実施例では、Saccharomyces cerevisiae由来のHAP4遺伝子を過剰発現させるためDNA断片を作製した。具体的には、Saccharomyces cerevisiae BY4742株のゲノムDNAを鋳型として、PDC6遺伝子の一部とその5'上流非翻訳領域を含むDNA断片、HAP4遺伝子とそのターミネーター領域を含むDNA断片、TDH2プロモーター領域を含むDNA断片、CTT1遺伝子の5'上流非翻訳領域を含むDNA断片をPCRで増幅した(図3参照)。使用したPCR用プライマーはそれぞれTB1021(5'-CCTTGATGCGTGCGTAACC-3':配列番号19)とTB910(5'-AAACGCGTGTACGCATGTAATCTCATAAACCTATGCACTG-3':配列番号20)、TB911(5'-TCATATTCGACGATGTCGTCCGAACTACAGTTATCGCCTC-3':配列番号21)とTB679(5'-CACACAAACAAACAAAACAAAATGACCGCAAAGACTTTTCTAC-3':配列番号22)、TB680(5'-GTAGAAAAGTCTTTGCGGTCATTTTGTTTTGTTTGTTTGTGTG-3':配列番号23)とTB900(5'-ATATATCTGCAGGGATCCCTTGACGGGTATTCTGA-3':配列番号24)、TB899(5'-TCAGAATACCCGTCAAGGGATCCCTGCAGATATAT-3':配列番号25)とTB349(5'-CCATATTTTCGTTAGGTCATTT-3':配列番号26)である。
Frozen-EZ Yeast Transformation IIキット(ZYMO RESEARCH社製)を用いて、上述したLDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊用DNA断片をBY4742株に導入して刑資転換を行った。この形質転換はキット添付のプロトコールに従った。形質転換後、ロイシン選択培地(SD-Leu)のプレートにまいて、30℃で3日間培養し、形質転換体を選抜した。形質転換体よりゲノムDNAを調製し、PCR法によって、LDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊用DNA断片が染色体に組み込まれていることを確認した。このPCRではLDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊用DNA断片の外側に位置するプライマーとして、TB324(5'-CTCATACATGTTTCATGAGGGT-3':配列番号33)とTB304(5'-ACACCCAATCTTTCACCCATCA-3':配列番号34)を使用した。その結果、BY4742株におけるPDC1遺伝子を破壊して、LDH遺伝子が染色体に組込まれていることを確認した。以下、この形質転換酵母を「LDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊株」と称する。
次に、PDC5遺伝子破壊用DNA断片を用いて、LDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊株を形質転換した。なお、形質転換方法は上記と同様である。形質転換後、200μg/mlのハイグロマイシンを含むYPD培地のプレートにまいて、30℃で3日間培養し、形質転換体を選抜した。形質転換体よりゲノムDNAを調製し、PCR法によりPDC5遺伝子破壊用DNA断片が染色体に組み込まれていることを確認した。このPCRではPDC5遺伝子破壊用DNA断片の外側に位置するプライマーとしてTB077(5'-GGAACCCATAGATGAAGAGG-3':配列番号35)とPDC5遺伝子破壊用DNA断片内部に位置するプライマーとしてTB434(5'-ATCCGCTCTAACCGAAAAGG-3':配列番号36)を使用した。その結果、LDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊株におけるPDC5遺伝子が破壊されていることを確認した。以下、この形質転換酵母を「LDH遺伝子導入/PDC1及びPDC5遺伝子破壊株」と称する。
次に、上述したHAP4遺伝子過剰発現用DNA断片を用いて、上記LDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊株及びLDH遺伝子導入/PDC1及びPDC5遺伝子破壊株を形質転換した。なお、形質転換方法は上記と同様である。形質転換後、100μg/mlのフレオマイシンを含むYPD培地のプレートにまいて、30℃で3-5日間培養し、形質転換体を選抜した。形質転換体よりゲノムDNAを調製し、PCR法によりHAP4遺伝子過剰発現用DNA断片が染色体に組み込まれていることを確認した。このPCRではHAP4遺伝子過剰発現用DNA断片の外側に位置するプライマーであるTB315とHAP4遺伝子過剰発現用DNA断片内部に位置するプライマーであるTB1020(5'-TCCTGCGCCTGATACAGAAC-3':配列番号37)を使用した。その結果、LDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊株及びLDH遺伝子導入/PDC1及びPDC5遺伝子破壊株の染色体中にHAP4遺伝子過剰発現用DNA断片が導入されていることを確認した。
上述したように作製したLDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊株(本項ではHAP4非導入株)及びHAP4遺伝子過剰発現用DNA断片を導入したLDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊株(本項ではHAP4導入株)について比増殖速度を算出した。具体的には、YPD(イーストエキストラクト 1%、ペプトン 2%及びグルコース2%)液体培地を100ml分注した500ml容バッフル付きフラスコに供試株を植菌し、30℃、120rpm(振幅35mm)で15〜20時間振盪培養後、菌体濃度0.7〜1.0%の状態で集菌した。再度、同条件にて供試株を菌体濃度0.01%の濃度で植菌し、増殖開始後約2時間毎にサンプリングを行い、菌体濃度を測定した。比増殖速度は増殖開始2〜10時間の間、対数増殖期であることを確認し、下記式に従って算出した。
上述したように作製したLDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊株(本項ではHAP4非導入株)及びHAP4遺伝子過剰発現用DNA断片を導入したLDH遺伝子導入/PDC1遺伝子破壊株(本項ではHAP4導入株)について発酵試験を行った。具体的には、供試株をYPD培地(イーストエキストラクト 1%、ペプトン 2%及びグルコース2%)に植菌し、30℃で24時間培養を行った。培養終了後、遠心分離(2000g、3分)により菌体を回収した。
発酵試験の結果を図4に示した。図4から判るように、HAP4導入株は、HAP4非導入株と比較して、乳酸収率が62%から70%に向上し、エタノール最高濃度が2.2%から1.4%に低下した。なお、発酵速度は同程度であった。
上述したように作製したLDH遺伝子導入/PDC1及びPDC5遺伝子破壊株(本項ではHAP4非導入株)及びHAP4遺伝子過剰発現用DNA断片を導入したLDH遺伝子導入/PDC1及びPDC5遺伝子破壊株(本項ではHAP4導入株)について発酵試験を行った。本発酵試験では、YPD培地に代えてYPE培地(イーストエキストラクト 1%、ペプトン 2%及びエタノール1%)を使用した以外は、上記発酵試験1と同様にして行った。
Claims (9)
- 目的生産物の生産に関与する酵素をコードする外来遺伝子と、下記(a)又は(b)のタンパク質をコードする、構成的に発現可能なHAP4遺伝子とを導入し、
(a)配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号2のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、Hap2p/3p/4p/5p CCAAT-結合性複合体のサブユニットを構成するHAP4タンパク質
ピルビン酸脱炭酸酵素及び/又はアルコール脱水素酵素の酵素活性が低下し、野性型と比較してアルコール生産性が低下した変異株である変異体酵母。 - 上記ピルビン酸脱炭酸酵素は、PDC1遺伝子、PDC5遺伝子及びPDC6遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも1の遺伝子によりコードされることを特徴とする請求項1記載の変異体酵母。
- 上記アルコール脱水素酵素は、ADH1遺伝子によりコードされることを特徴とする請求項1記載の変異体酵母。
- Saccharomyces属に属することを特徴とする請求項1乃至3いずれか一項記載の変異体酵母。
- Saccharomyces cerevisiaeの菌株に属することを特徴とする請求項1乃至3いずれか一項記載の変異体酵母。
- 上記外来遺伝子は、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項1乃至5いずれか一項記載の変異体酵母。
- 請求項1乃至6いずれか一項記載の変異体酵母を培養し、目的生産物を菌体内外に生成する工程と、
上記目的生産物を回収する工程とを含む、酵母を用いた物質生産方法。 - 上記目的生産物が有機酸であることを特徴とする請求項7記載の物質生産方法。
- 上記目的生産物が乳酸であることを特徴とする請求項7記載の物質生産方法。
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