JP4611524B2 - ピロロ[2,3d]ピリミジン組成物およびその使用 - Google Patents
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Description
【発明の背景】
アデノシンは特に循環器と神経系において数多くの生理学的活性を有する偏在する調節物質である。アデノシンの作用は特異的な細胞表面受容体タンパク質によって仲介されるように見える。アデノシンは鎮静の誘導、血管拡張、心拍と心収縮の抑制、血小板凝集の阻害、糖新生の活性化と脂肪分解の抑制を含む種々の生理的機能を調節する。アデニル酸シクラーゼに対するそれらの作用に加え、アデノシンはカリウムチャンネルを開き、カルシウムチャンネルを通る流動を減少させ、受容体を介した機構によりホスホイノシチドのターンオーバーを阻害または活性化することが示されている(たとえば、C.E.Muller and B.Stein ”Adenosine Receptor Antagonists:Structures and Potential Therapeutic Applications, ”Current Pharmaceutical Design,2:501(1996) 及びC.E. Muller ”A1-Adenosine Receptor Antagonists,” Exp. Opin. Ther. Patents 7(5): 419(1997)を参照のこと)。
【0002】
アデノシン受容体は現在P1(アデノシン)およびP2(ATP、ADPおよび他のヌクレオチド)受容体とに分類される、プリン受容体のスーパーファミリーに属している。これまでのところ、ヒトを含めた様々な種から4つのヌクレオシドアデノシンの受容体サブタイプがクローン化されている。2つの受容体サブタイプ(A1およびA2a)はナノモル範囲での親和性を示すが、他の周知のサブタイプA2bおよびA3は低親和性の受容体であり、アデノシンに対する親和性は低マイクロモルの範囲である。A1およびA3アデノシン受容体の活性化はアデニル酸シクラーゼの活性の抑制をもたらすが、A2aとA2bの活性化はアデニル酸シクラーゼの活性化を引き起こす。
【0003】
少数のA1アンタゴニストが、認識疾患、腎不全、心不整脈の治療のために開発されてきた。A2aアンタゴニストはMorbus Parkinson(パーキンソン病)に苦しむ患者に有効だろうと示唆されている。特に局所輸送の可能性の態様において、アデノシン受容体アンタゴニストはアレルギー性炎症と喘息の治療に有用であろう。入手可能な情報(例えば Nyce & Metzger ”DNA antisense Therapy for Asthma in an Animal Model” Nature(1997)385: 721-5)は、この病理生理学の見地において、A1アンタゴニストは呼吸上皮下の平滑筋収縮を阻害し、一方、A2bやA3受容体アンタゴニストは肥満細胞の脱顆粒を阻害し、ヒスタミンや他の炎症性仲介物質の放出を緩和するであろうことを示している。A2b受容体は消化器官全体、特に結腸と腸上皮で発見されている。A2b受容体はcAMP応答を仲介することが示唆されている(Strohmeierら, J. Bio. Chem. (1995) 270: 2387-94)。
【0004】
アデノシン受容体は、ウシ、ブタ、サル、ラット、モルモット、マウス、ウサギ、ヒトを含めた様々な哺乳動物の網膜にも存在していることが示されている(Blazynskiら, Discrete Distributions of Adenosine Receptors in Mammalian Retina, Journal of Neurochemistry, volume 54,pages 648-655(1990);Woodsら, Characterization of Adenosine A1-Receptor Binding Sites in Bovine Retinal Membranes, Experimental Eye Research, volume 53, pages 325-331(1991);Braasら, Endogenous adenosine and adenosine receptors localized to ganglion cells of the retina, Proceedings of the National Academy of Science, volume 84, pages 3906-3910(1987)を参照のこと)。最近、Williamsはヒト網膜培養細胞株のアデノシン輸送部位の観察について報告している(Williamsら, Nucleoside Transport Sites in a Cultured Human Retinal Cell Line Established By SV-40 T Antigen Gene, Current Eye Research, colume 13, pages 109-118(1994))。
【0005】
アデノシン取り込みを調節する化合物は、以前に網膜と視神経乳頭部損傷の治療の有用な治療薬物であると示唆されている。Shadeに付与された米国特許第5,780,450号において、Shadeは眼障害の治療にアデノシン取り込み阻害剤を用いることについて議論している。Shadeは特異的A3受容体阻害剤の使用については開示していない。米国特許第5,780,450号の全内容は、ここでの引用により本明細書の一部をなす参照として援用される。
【0006】
付加的なアデノシン受容体アンタゴニストは薬物的ツールとして必要とされ、また上に参照した疾患状態および/または状況への薬物としてかなりの関心が持たれている。
【0007】
【発明の概要】
本発明は、少なくとも部分的には、以下に記述されたあるN−6置換7−デアザプリンが、N−6置換7−デアザプリン応答状態の治療に用いることができるという発見に基づく。このような状態の例には、アデノシン受容体の活性が増加するようなもの、たとえば、気管支炎、消化器官障害、あるいは喘息が含まれる。これらの状態はアデノシン受容体活性化がアデニル酸シクラーゼ活性の阻害または活性化をもたらすことと特徴づけられる。本発明の組成物と方法はエナンチオマー的またはジアステレオマー的に純粋なN−6置換7−デアザプリンを含む。好ましいN−6置換7−デアザプリンはアセトアミド、カルボキサミド、たとえばシクロヘキサノールのような置換シクロヘキシル、またはアルキル鎖を介してN−6窒素に結合したウレア部分を有するものを含む。
【0008】
本発明は、アデノシン受容体活性の調節が起こるような治療に効果的な量のN−6置換7−デアザプリンを哺乳動物に投与することにより、哺乳動物のアデノシン受容体(類)を調節する方法に関する。適切なアデノシン受容体はA1、A2、またはA3ファミリーを含む。好ましい実施態様においては、N−6置換7−デアザプリンはアデノシン受容体アンタゴニストである。
【0009】
本発明は、さらに、哺乳動物内で障害の治療が生じるように、治療的に効果的な量のN−6置換7−デアザプリンを哺乳動物に投与することにより、N−6置換7−デアザプリン疾患、たとえば喘息、気管支炎、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患、腎障害、消化器障害、及び眼障害などを治療する方法に関する。適切なN−6置換7−デアザプリンは一般式Iに図示するもの
【化21】
およびそれらの薬学的に許容可能な塩を含む。R1およびR2はそれぞれ独立に、水素原子または、置換または非置換アルキル、アリール、またはアルキルアリール部分であるか、一緒に置換、非置換複素環式環を形成する。R3は置換または非置換のアルキル、アリール、またはアルキルアリール部分である。R4は水素原子または置換または非置換アルキル、アリール、またはアルキルアリール部分である。R5およびR6はそれぞれ独立して、たとえば塩素、フッ素、または臭素のようなハロゲン原子、水素原子または置換または非置換アルキル、アリール、またはアルキルアリール部位であり、またはR4およびR5またはR5およびR6は一緒に置換、非置換複素環式または炭素環式環を形成する。
【0010】
特定の実施態様においては、R1およびR2は互いに独立に置換または非置換シクロアルキルまたはヘテロアリールアルキル部位でありうる。別の実施態様においては、R3は水素原子、または置換または非置換ヘテロアリール部分である。さらに別の実施態様においては、R4、R5およびR6は独立してヘテロアリール部分でありうる。好ましい実施態様においては、R1は水素原子であり、R2はたとえばトランス−シクロヘキサノールのようなシクロヘキサノールであり、R3はフェニルであり、R4は水素原子であり、R5はメチル基であり、そしてR6はメチル基である。さらに別の実施態様においては、R1は水素原子であり、R2は
【化22】
であり、R3はフェニルであり、R4は水素原子であり、R5およびR6はメチル基である。
【0011】
本発明はさらに哺乳動物のN−6置換7−デアザプリン応答状態、たとえば喘息、気管支炎、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患、腎障害、消化器障害、及び眼障害などの治療のための薬物組成物に関する。この薬物組成物は治療的に効果的な量のN−6置換7−デアザプリンおよび薬学的に許容可能な担体を含む。
【0012】
本発明はまた、哺乳動物のN−6置換7−デアザプリン応答状態を治療するための包装された薬物組成物を含む。この包装された薬物組成物は、少なくとも1つのN−6置換7−デアザプリンの治療的に効果的な量を保持した容器および哺乳動物のN−6置換7−デアザプリン応答状態を治療するためのN−6置換7−デアザプリンの使用の指示を含む。
【0013】
本発明はさらに式Iの化合物:
(式中:
R1は水素であり、
R2は置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換アルキル、またはR1およびR2が一緒に置換または非置換複素環式環を形成し、
R3は非置換または置換アリールであり
R4は水素であり、そして
R5およびR6がそれぞれ独立して水素またはアルキルである)、また薬学的に許容可能な塩に関する。この実施態様のデアザプリンは有利に選択的A3受容体アンタゴニストとなりうる。これらの化合物はたとえば、喘息、心不全に伴う腎不全、緑内障の治療のような、多数の治療的使用に有用であり得る。特に好ましい実施態様においては、デアザプリンは インビボにおいて、たとえば、エステラーゼ触媒加水分解によって、活性薬物に代謝されることの可能な水溶性プロドラッグである。
【0014】
また別の実施態様においては、本発明は細胞をN−6置換7−デアザプリン(たとえば、好ましくは、アデノシン受容体アンタゴニスト)に接触させることにより、アデノシン受容体(たとえばA3)の活性を阻害する方法を特徴とする。
【0015】
別の態様において、本発明は、動物に効果のある量の式IのN−6置換7−デアザプリンを投与することにより、動物(たとえばヒト)の眼障害を治療する方法を特徴とする。好ましくは、N−6置換7−デアザプリンは動物の細胞のA3アデノシン受容体のアンタゴニストである。傷害は網膜または視神経乳頭部に対するものであり、また急性または慢性のものでありうる。傷害は、たとえば、緑内障、浮腫、虚血、低酸素症、または外傷の結果でありうる。
【0016】
本発明はまた、式IのN−6置換7−デアザプリンを含む薬物学的実施態様を特徴とする。好ましくは、薬物調製は眼科的処方(例えば、眼球周囲、眼球後、または眼球内注射処方、全身的処方、または外科的灌流液)である。
【0017】
また別の実施態様においては、本発明は式IIを有するデアザプリンを特徴とし、
【化23】
(式中、
XはNまたはCR6であり、
R1およびR2は、共に両方とも水素でないという条件のもと、それぞれ独立して水素、または置換または非置換アルコキシ、アミノアルキル、アルキル、アリールまたはアルキルアリールであり、または一緒に置換または非置換複素環式環を形成し、
R3は置換または非置換アルキル、アリールアルキル、またはアリールであり;
R4は水素または置換または非置換C1−C6アルキルであり;
Lは水素、置換または非置換アルキル、またはR4とLが一緒に置換または非置換複素環式または炭素環式環を形成し、
R6は水素、置換または非置換アルキル、またはハロゲンであり、
QはCH2、O、SまたはNR7であり、式中、R7は水素、または置換または非置換C1−C6アルキルであり、そして
Wは非置換、または置換アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、バイアリール、ヘテロアリール、置換カルボニル、置換チオカルボニル、または置換スルホニルであり、
ただし、R3がピロリジノの場合は、R4はメチルでないという条件である。本発明はまた、本発明の化合物の薬学的に許容可能な塩とプロドラッグを含む。
【0018】
有利な実施態様において、式II中、XはCR6であり、QはCH、O、SまたはNHであり、式中R6は上記に定義するとおりである。
【0019】
式IIの別の実施態様においては、XはNである。
【0020】
さらに本発明は細胞に本発明の化合物を接触させることにより、細胞のアデノシン受容体(たとえばA2bアデノシン受容体)の活性を阻害するための方法に関する。好ましくは、化合物は受容体のアンタゴニストである。
【0021】
本発明はまた、式II(たとえばA2bのアンタゴニスト)の効果的な量を動物に投与することにより、動物の消化管障害(たとえば下痢)または呼吸障害(たとえばアレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患)を治療するための方法にも関する。
【0022】
【発明の詳細な記述】
本発明の特徴および他の詳細については、以下で更に説明すると共に、特許制窮の範囲で特定する。本発明の特定の実施様態が例示により示され、本発明を限定するものでないことが理解されるであろう。本発明の本質的な特徴は本発明の範囲から逸脱することなしに様々な実施様態で使用されうる。
【0023】
本発明は哺乳動物のN−6置換7−デアザプリン反応状態の治療のための方法に関する。前記方法には、哺乳動物でN−6置換7−デアザプリン応答状態の治療が起こるように、下に記述したような、哺乳動物へのN−6置換7−デアザプリンの薬物的に効果的な量の投与を含む。
【0024】
語句「N−6置換7−デアザプリン応答状態(N-6 substituted 7-deazapurine responsive state)」は以下に記述するような本発明のN−6置換7−デアザプリンでの治療への応答によって特徴づけられる疾病状態または状況を含むことを意図し、たとえば治療には本発明のN−6置換デアザプリンにて達成されたその状態の少なくとも1つの症状の減少または効果が含まれる。典型的にはそのような状態は、宿主がしばしば毒素の放出、炎症、昏睡、水貯留、体重増加または体重減少、膵炎、気腫、リウマチ様関節炎、変形性関節炎、多重臓器不全、幼児および成人呼吸窮迫症候群、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患、眼障害、消化管障害、皮膚腫瘍促進、免疫不全および喘息を含むが、限定されない病理学的症状を患うような宿主内のアデノシンの増加と関連する(たとえばC.E. Muller and B.Stein 「アデノシン受容体アンタゴニスト:構造および可能性のある治療的適用」、Current Pharmacerutical Design,2:501 (1996)およびC.E.Muller、「A1−アデノシン受容体アンタゴニスト」、Exp. Opin. Ther. Patents 7(5):419(1997)およびI.Feoktistove,R.Polosa,S.T.Holgate and I.Biaggioni、「アデノシンA2B受容体:喘息の新規治療標的?」, TiPS 19;148(1998)を参照のこと)。効果はしばしば発熱、呼吸短縮、吐気、下痢、柔弱、頭痛および死をも含むが、限定されないような症状に関連する。1つの実施様態において、N−6置換7−デアザプリン応答状態は、細胞内のカルシウム濃度および/またはPLC(ホスホリパーゼC)の活性化が調節されるようなアデノシン受容体、たとえばA1、A2a、A2b、A3などの刺激によって仲介されるような疾患状態を含む。好ましい実施様態において、N−6置換7−デアザプリン応答状態はアデノシン受容体(群)に関連し、たとえばN−6置換7−デアザプリンはアンタゴニストとして働く。たとえば生物学的効果を仲介するアデノシン受容体サブタイプのような本発明の化合物によって治療されうる適切な応答状態の例としては、中枢神経系(CNS)効果、心臓血管効果、腎臓効果、呼吸効果、免疫学的効果、消化管効果及び代謝効果が含まれる。対象内のアデノシンの相対的な量は以下に列記した効果に関連しうる。すなわちアデノシンのレベルの増加がたとえば喘息発作などの好ましくない生理学的応答などの効果を引き起こしうる。
【0025】
CNS効果には伝達物質放出の減少(A1)、沈静(A1)、運動活性の減少(A2a)、鎮痙性活性、化学受容器刺激(A2)および感覚過敏が含まれる。本発明の化合物の治療的適用には痴呆、アルツハイマー病および記憶増強が含まれる。
【0026】
心臓血管効果には血管拡張(A2a)、(A2b)および(A3)、血管収縮(A1)、除脈(A1)、血小板阻害(A2a)、陰性心臓線維診断法および変伝導(A1)、不整脈、頻拍および血管新生が含まれる。本発明の化合物の治療的適用には、たとえば心臓の虚血誘導傷害および狭心症の予防、心筋組織保護および心機能の修復が含まれる。
【0027】
腎効果にはGFRの減少(A1)、糸球体間質細胞収縮(A1)、坑利尿(A1)、およびレニン放出の阻害(A1)が含まれる。本発明の化合物の適切な治療的適用には利尿薬、ナトリウム***増加薬、カリウム保持性利尿薬、急性腎不全の腎臓保護/予防、坑高血圧薬、坑浮腫剤、坑腎炎薬としての本発明の化合物の使用が含まれる。
【0028】
呼吸効果には、気管支拡張(A2)、気管支収縮(A1)、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性鼻炎、粘液分泌および呼吸抑制(A2)が含まれる。本発明の化合物のための適切な治療的適用には坑肺炎適用、移植および呼吸不全の後の肺疾病の治療が含まれる。
【0029】
免疫学的効果には免疫抑制(A2)、好中球走化性(A1)、好中球スーパーオキシド生成(A2a)および肥満細胞脱顆粒(A2bおよびA3)が含まれる。アンタゴニストの治療的適用には、たとえばヒスタミンまたは他の炎症仲介物質の放出などのアレルギー性および非アレルギー性炎症が含まれる。
【0030】
消化管効果には、酸分泌抑制(A1)が含まれる。治療的適用には還流および潰瘍性状態が含まれる。消化管効果はまた、たとえば直腸炎症に関連する下痢疾病(A2b)などの結腸、直腸および下痢疾病が含まれる。
【0031】
眼の障害には、網膜および視神経乳頭傷害および不全に関連した外傷(A3)が含まれる。好ましい実施様態において、眼の障害は緑内障である。
【0032】
本発明の化合物の他の治療的適用には、肥満症(脂肪分解特性)の治療、高血圧、鬱病の治療、鎮静剤、坑不安薬、たとえば下痢を引き起こさない運動性に影響する防腐薬として、および緩下薬としての使用が含まれる。
【0033】
用語「疾病状態(disease state)」は所望されないレベルのアデノシン、アデニルシクラーゼ活性、アデノシン受容体の異常刺激またはこれらに関連した生理的な活性の上昇および/またはcAMPの増加によって引き起こされる。1つの実施態様において、疾病状態はたとえば喘息、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性鼻炎、気管支炎、腎障害、消化管障害または眼障害である。さらなる例には、慢性気管支炎および嚢胞性線維症が含まれる。炎症疾患の適切な例には非リンパ性白血病、心臓血管虚血、アンギナ、亀裂骨折、脳血管虚血、間欠性跛行、重症肢虚血、静脈高血圧、拡張蛇行静脈、静脈瘤性潰瘍および動脈硬化症が含まれる。障害再灌流状態には、たとえば***再建手術などの任意の手術後損傷、血栓崩壊または血管形成などが含まれる。
【0034】
「N−6置換7−デアザプリン応答状態の治療(treatment of a N-6 substituted 7-deazapurine responsive state)」または「N−6置換7−デアザプリン応答状態を治療すること(treating a N-6 substituted 7-deazapurine responsive state)」の用語は、哺乳動物での生理的症状が明らかに減少し、または縮小し得るように、上述したような疾患状態または状況の変化が含まれる。この用語はまた生理学的な症状の制御、予防または阻害、または異常量のアデノシンと関連する影響をも含む。1つの好ましい実施様態において、疾患状態または状況の制御は、疾患状態または状況が根絶するようなことである。他の好ましい実施様態において、制御は異常レベルのアデノシン受容体活性が他の生理学的な系およびパラメータが無効であるときに制御される様に選択性である。
【0035】
用語「N−6置換7−デアザプリン(N-6 substituted 7-deazapurine)」は当技術分野で認識され、式Iを持つような化合物を含む。
【0036】
【化24】
「N−置換 7−デアザプリン(N-substituted 7-deazapurine)」には薬学的に許容可能なその塩が含まれ、そして1つの実施様態において、また本明細書に記述された特定のN−6置換プリンが含まれる。
【0037】
ある実施様態において、N−6置換 7−デアザプリンはN−6ベンジルまたはN−6フェニルエチル置換ではない。他の実施様態において、R4はベンジルまたはフェニルエチル置換ではない。好ましい実施様態において、R1およびR2は両方とも水素原子ではない。また他の好ましい実施様態では、R3は水素原子ではない。
【0038】
以下記述された語N−6置換7−デアザプリンの「治療的に効果的な量(therapeutically effective amount)」はその哺乳動物内で意図した機能、たとえばN−6置換7−デアザプリン応答状態、または哺乳動物の疾患状態の治療を成し遂げるのに必要かまたは十分な治療的化合物の量のことである。効果的な量の治療的化合物は、哺乳動物にすでに存在している原因薬剤の量、哺乳動物の年齢、性別および体重、および哺乳動物でのN−6置換7−デアザプリン応答状態に作用する本発明の治療的化合物の能力に依存して変化できる。当業者は前述の因子について研究できるだろうし、実験を行わずに治療化合物の効果量に関した決定を行うことができるであろう。インビトロまたはインビボのアッセイはまた、以下に記述された治療的化合物の「効果的な量(effective amount)」を決定するのにも使用できる。当業者は前述したアッセイで、または治療処置として使用するための治療的化合物の好ましい量を選択するであろう。
【0039】
治療的に効果的な量は、好ましくは処置されたN−6置換7−デアザプリン応答状態または状況に関連した少なくとも1つの症状または影響を、治療しない対象と比べて少なくとも約20%まで(より好ましくは少なくとも約40%まで、さらにより好ましくは少なくとも約60%まで、さらに好ましくは少なくとも約80%まで)減少させる。アッセイもまた当業者によってそのような症状および/または影響の減少を測定するために計画されうる。そのようなパラメータを測定することのできる任意の当技術分野で認識されたアッセイは本発明の一部分として含まれるつもりである。たとえば、喘息が治療される状態であった場合、ここで対象の肺より膨張された空気体積を、本発明分野で認識されている技術を用いて体積の増加の測定のために治療の前後で測定できる。同様に、炎症が治療されている状態である場合、そこで、炎症を起こしている領域を、当技術分野で認識されている技術を用いて炎症を起こしている領域の減少の測定のために治療の前後で測定できる。
【0040】
「細胞(cell)」の用語は、真核細胞および原核細胞両方を含む。
【0041】
「動物(animal)」の用語は、アデノシン受容体を持つ任意の有機体またはN−6−置換7−デアザプリン応答状態を受けやすい任意の有機体を含む。動物の例には酵母、哺乳動物、爬虫類、鳥類が含まれる。トランスジェニック動物も含まれる。
【0042】
「哺乳動物(mammal)」の用語は、当技術分野で認識されており、動物、さらに好ましくは温血動物、最も好ましくはウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ラット、マウスおよびヒトを含む。たとえばN−6置換7−デアザプリン応答状態、炎症、気腫、喘息、中枢神経系状態または急性呼吸窮迫症候群を受けやすい哺乳動物がたとえば本発明の一部分として含まれる。
【0043】
他の態様では、本発明は哺乳動物に治療的に効果的な量のN−6置換7−デアザプリンを投与することで哺乳動物内のアデノシン受容体(群)を調節するための方法に関し、それによって哺乳動物内のアデノシン受容体の調節が起こる。適切なアデノシン受容体には、A1、A2、またはA3のファミリーが含まれる。好ましい実施様態において、N−6置換7−デアザプリンはアデノシン受容体アンタゴニストである。
【0044】
「アデノシン受容体を調節すること(modulating an adenosine receptor)」の用語は、化合物がアデノシン受容体(群)と相互作用し、結果アデノシン受容体に関連した増加した、減少したまたは異常な生理学的活性、または引き続くアデノシン受容体の調節の結果のカスケード効果を引き起こす例を含む。アデノシン受容体に関連した生理学的な活性には、鎮静、血管拡張、心速度および収縮の抑制、血小板凝集の阻害、糖新生の刺激、脂質分解の阻害、カリウムチャネルの開放、カルシウムチャネル流動の減少などが含まれる。
【0045】
「調節する(modulate)」、「調節すること(modulating)」および「調節(modulation)」の用語は、たとえば本発明の治療的方法の文脈において、アデノシン受容体の異常な刺激に関連した望ましくない生理学的活性の結果の増加を予防すること、根絶させることまたは阻害することを含む。他の実施様態において、用語、調節は、たとえばアデノシン受容体(類)の過剰刺激の結果のアレルギーおよびアレルギー性炎症の伝達物質の活性または産出の減少のようなアンタゴニスト効果を含む。たとえば、本発明の治療的デアザプリンはアデノシン受容体と相互作用し、たとえばアデニル酸シクラーゼ活性を阻害する。
【0046】
「異常なアデノシン受容体活性によって特徴づけられる症状(condition characterized by aberrant adenosine receptor activity)」の用語は、受容体の刺激が、直接的にまたは間接的に疾患、障害または症状と関連している生化学的なおよびまたは生理学的な連続的な事象を引き起こすような、アデノシン受容体の異常な刺激に関連した疾患、障害または症状を含む。このアデノシン受容体の刺激は、疾患、障害または症状の唯一の原因である必要はなく、単に試験されている疾患、障害または症状に典型的に関連した症候群の幾つかを引き起こす原因となるものである。受容体の異常な刺激が唯一の因子であってもよく、または少なくとも1つの他の試薬が治療されている状態に関連することができる。症状の例には、炎症、消化管障害およびアデノシン受容体活性の増加が存在することで明らかになったな疾病状態を含む以下に列記した疾患が含まれる。好ましい例には喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患、気腫、気管支炎、消化管不全および緑内障に関連した症候群が含まれる。
【0047】
「異常なアデノシン受容体活性によって特徴づけられる症状を治療することまたは治療(treating or treatment of a condition characterized by aberrant adenosine receptor activity)」の用語は、典型的には、その状態に関連している少なくとも1つの症状の緩和または減少を含む。治療はまた1つ以上の症状の緩和、または減少を含む。好ましくは、治療は、その状態と関連している症候を治療し、たとえば実質的に排除する。
【0048】
本発明は式Iを含む化合物N−6置換7−デアザプリンに関し、
【化25】
式中、
R1およびR2はそれぞれ独立して水素原子、または置換または非置換アルキル、アリールまたはアルキルアリール部分であり、または一緒に置換または非置換複素環式環を形成し、
R3は水素原子、または置換または非置換アルキル、アリール、またはアルキルアリール部分であり、
R4は水素原子、または置換または非置換アルキル、アリール、またはアルキルアリール部分である。R5およびR6はそれぞれ独立にハロゲン原子、たとえば塩素、フッ素または臭素原子であり、または水素原子、または置換または非置換アルキル、アリールまたはアルキルアリール部分であり、またはR4およびR5、またはR5およびR6がともに置換または非置換複素環式環または炭素環式環を形成する。また、N−6置換7−デアザプリンの薬学的に許容可能な炎も含まれる。
【0049】
特定の実施態様において、R1およびR2はそれぞれ独立して置換または非置換シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル部分である。他の実施様態において、R3は水素原子、または置換または非置換へテロアリール部分である。また他の実施様態では、R4、R5およびR6はそれぞれ独立にヘテロアリール部分である。
【0050】
1つの実施様態において、R1は水素原子であり、R2は置換または非置換シクロヘキサン、シクロペンチル、シクロブチル、またはシクロプロパン部位であり、R3は置換または非置換フェニル部位であり、R4は水素原子であり、R5およびR6は両方ともメチル基である。
【0051】
他の実施様態において、R2はシクロヘキサノール、シクロヘキサンジオール、シクロへキシルスルホンアミド、シクロヘキサンアミド、シクロヘキシルエステル、シクロヘキサン、シクロペンタノールまたはシクロペンテンジオールであり、R3はフェニル部分である。
【0052】
また他の実施様態において、R1は水素原子であり、R2はシクロヘキサノールであり、R3は置換または非置換フェニル、ピリジン、フラン、シクロペンタンまたはチオフェン部分であり、R4は水素原子、置換アルキル、アリールまたはアリールアルキル部分であり、R5およびR6はそれぞれ独立して水素原子、または置換または非置換アルキル、アリール、またはアルキルアリール部分である。
【0053】
また他の実施様態において、R1は水素原子であり、R2は置換または非置換アルキルアミン、アリールアミン、またはアルキルアリールアミン、置換または非置換アルキルアミド、アリールアミド、またはアルキルアリールアミド、置換または非置換アルキルスルホンアミド、アリールスルホンアミド、またはアルキルアリールスルホンアミド、置換または非置換アルキルウレア、アリールウレア、アルキルアリールウレア、置換または非置換アルキルカルバメート、アリールカルバメート、アルキルアリールカルバメート、置換または非置換アルキルカルボキシル酸、アリールカルボキシル酸、アルキルアリールカルボキシル酸であり、R3は置換または非置換フェニル部分であり、R4は水素原子であり、R5およびR6はメチル基である。
【0054】
また他の実施様態において、R2はグアニジン、修飾グアニジン、シアノグアニジン、チオウレア、チオアミドまたはアミジンである。
【0055】
1つの実施様態において、R2は
【化26】
であることができ、式中R2a−R2cはそれぞれ独立して水素原子、または、飽和または不飽和アルキル、アリール、またはアルキルアリール部分であり、R2dは水素原子または、飽和または不飽和アルキル、アリールまたはアルキルアリール部位、NR2eR2fまたはOR2gであり、式中R2e−R2gはそれぞれ独立して水素原子または、飽和または不飽和アルキル、アリール、またはアルキルアリール部分である。あるいは、R2aおよびR2bは一緒にたとえばシクロプロピル、シクロペンチル、シクロへキシル基のような3〜8個の間の環サイズを持つ炭素環式または複素環式環を形成することができる。
【0056】
本発明の1つの側面において、R5およびR6両方はメチル基ではなく、好ましくはR5およびR6の1つはアルキル基、たとえばメチル基であり、他は水素原子である。
【0057】
本発明のもう一つの側面おいて、R4は1−フェニルエチルであり、R1は水素原子であるときは、R3はフェニル、2−クロロフェニル、3−クロロフェニル、4−クロロフェニル、3,4−ジクロロフェニル、3−メトキシフェニルまたは4−メトキシフェニルではなく、R4およびR1が1−フェニルエチルである場合は、R3は水素原子ではなく、またはR4が水素原子でR3がフェニルの場合は、R1はフェニルエチルではない。
【0058】
本発明の他の態様において、R5およびR6は一緒にたとえば
【化27】
ピリミド[4,5−6]インドールのような炭素環式環を形成する場合、R4が1−(4−メチルフェニル)エチル、フェニルイソプロピル、フェニルまたは1−フェニルエチルのときはR3はフェニルではなく、またはR4が1−フェニルエチルのときはR3は水素原子ではない。R5及びR5により形成される炭素環式環は、芳香族または脂肪族どちらでもありえ、ナフチル、フェニルシクロへキシルなどの4から12炭素原子、好ましくはたとえばシクロペンチルまたはシクロへキシルなどの5から7の間の炭素原子を有し得るR5およびR6より形成される。あるいはR5およびR6は一緒に、以下に開示されるような複素環式環を形成しうる。典型的な複素環式環には、4〜12炭素原子、好ましくは5〜7炭素原子が含まれ、芳香族または脂肪族のいずれかでありえる。複素環式環はさらに置換されることができ、環式構造の1つ以上の炭素原子の、1つ以上のヘテロ原子での置換が含まれる。
【0059】
本発明の更にもう一つの側面において、R1およびR2は複素環式環を形成する。代表的な例には、モルフォリノ、ピペラジンおよびたとえば4−ヒドロキシピペリジン、4−アミノピペリジンなどの類似体のような以下に列記した複素環式環が含まれるが、限定されない。R1およびR2は一緒にピペラジノ基
【化28】
を形成し、R7は水素原子または、置換または非置換アルキル、アリールまたはアルキルアリール部分であり得る。
【0060】
本発明のさらに他の側面において、R4およびR5は一緒に、たとえば
【化29】
のような複素環式環を形成しうる。複素環式環は芳香族または脂肪族のいずれかであり得、またたとえばナフチル、フェニルシクロへキシルなどの4〜12炭素原子を有する環を形成でき、たとえばシクロへキシル、シクロペンチルのような芳香族または脂肪族のいずれかであり得る。複素環式環はさらに、置換されることができ、環式構造の炭素原子の、1つ以上のヘテロ原子での置換が含まれる。あるいはR4およびR5は一緒に以下に開示されたような複素環式環を形成できる。
【0061】
特定の実施様態において、N−6置換7−デアザプリンはN−6ベンジルまたはN−6フェニルエチル置換ではない。他の実施様態において、R4はベンジルまたはフェニルエチル置換ではない。好ましい実施様態において、R1およびR2は両方とも水素原子ではない。さらに他の好ましい実施様態において、R3は水素原子ではない。
【0062】
本発明の化合物は、たとえばエステラーゼ触媒加水分解によってインビボで活性薬剤に代謝される水溶性プロドラッグを含んでよい。可能性のあるプロドラッグの例には、たとえばR2が−OC(O)(Z)NH2によって置換されたシクロアルキルで、式中Zが天然のまたは人工のアミノ酸またはその類似体、α、β、γまたはωアミノ酸、またはジペプチドの側鎖であるジアザプリンが含まれる。好ましいアミノ酸側鎖には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、リシン、α−メチルアラニン、アミノシクロプロパンカルボン酸、アゼチジン−2−カルボン酸、β−アラニン、γ−アミノブチル酸、アラニン−アラニンまたはグリシン−アラニンの側鎖が含まれる。
【0063】
さらなる態様において、本発明は式(I):
(式中、
R1は水素であり、
R2は置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換アルキルであり、またはR1およびR2は一緒になって置換または非置換複素環式環を形成し、
R3は非置換または置換アリールであり、
R4は水素であり、
R5およびR6はそれぞれ独立に水素またはアリールである)のジアザプリンおよびその薬学的に許容可能な塩を特色とする。本実施様態のデアザプリンは潜在的に選択的A3受容体アンタゴニストであってよい。
【0064】
1つの実施様態において、R2は置換(たとえばヒドロキシ置換)または非置換シクロアルキルである。有利な副次的実施様態において、R1およびR4は水素であり、R3は非置換または置換フェニルであり、およびR5およびR6はそれぞれアルキルである。好ましくはR2はモノ−ヒドロキシシクロペンチルまたはモノ−ヒドロキシシクロへキシルである。R2はまた−NH−C(=O)Eで置換されてよく、式中、Eは置換または非置換C1−C4アルキル(たとえばアルキルアミン、たとえばエチルアミン)である。
【0065】
R1およびR2はまた一緒に置換または非置換複素環式環を形成し、アミンまたはアセトアミド基で置換されうる。
【0066】
他の側面において、R2は−A−NHC(=O)Bであってよく、式中Aは非置換C1−C4アルキル(たとえばエチル、プロピル、ブチル)であり、Bは置換または非置換C1−C4アルキル(たとえばメチル、アミノアルキル、たとえばアミノメチルまたはアミノエチル、アルキルアミノ、たとえばメチルアミノ、エチルアミノ)であり、好ましくはR1およびR4が水素である場合、R3は非置換または置換フェニルであり、R5およびR6はそれぞれアルキルである。Bは置換または非置換シクロアルキル、たとえばシクロプロピルまたは1−アミノ−シクロプロピルである。
【0067】
他の実施様態において、好ましくはR5およびR6がそれぞれアルキルであるとき、R3は置換または非置換フェニルであってよい。好ましくは、R3は1つ以上の置換基(たとえばo−、m−またはp−クロロフェニル、o−、m−またはp−フルオロフェニル)を有してよい。
【0068】
有利には、好ましくはR5およびR6がそれぞれアルキルであるとき、R3は置換または非置換ヘテロアリールであってよい。ヘテロアリール基の例にはピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、ピラジニル、ピロリル、トリアゾリル、チオアゾリル、オキサゾリル、オキサジアソリル、フラニル、メチレンジオキシフェニルおよびチオフェニルが含まれる。好ましくは、R3は2−ピリジル、3−ピリジル、4−ピリジル、2−ピリミジルまたは3−ピリミジルである。
【0069】
好ましくは1つの実施様態において、R5およびR6はそれぞれ水素である。他においてR5およびR6はそれぞれメチルである。
【0070】
特に好ましい実施様態において、本発明のデアザプリンは、インビボでたとえばエステラーゼ触媒加水分解によって活性薬物に代謝されうる水溶性プロドラッグである。好ましくはプロドラッグには−OC(O)(Z)NH2で置換されたシクロアルキルであって、式中、Zは天然のまたは人工のアミノ酸、その類似体、α、β、γまたはωアミノ酸、またはジペプチドの側鎖である、R2基を含む。好ましいアミノ酸側鎖の例には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、リシン、α−メチルアラニン、アミノシクロプロパンカルボン酸、アゼチジン−2−カルボン酸、β−アラニン、γ−アミノブチル酸、アラニン−アラニンまたはグリシン−アラニンの側鎖が含まれる。
【0071】
特に好ましい実施様態において、Zはグリシンの側鎖であり、R2はシクロへキシルであり、R3はフェニルであり、R5およびR6はメチルである。
【0072】
他の実施様態において、デアザプリンは4−(シス−3−ヒドロキシシクロペンチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジンである。
【0073】
他の実施様態において、デアザプリンは4−(シス−3−(2−アミノアセトキシ)シクロペンチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジントリフルオロ酢酸塩である。
【0074】
他の実施様態において、デアザプリンは4−(3−アセトアミド)ピペリジニル−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジンである。
【0075】
他の実施様態において、デアザプリンは4−(2−N’−メチルウレアプロピル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジンである。
【0076】
他の実施様態において、デアザプリンは4−(2−アセトアミドブチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジンである。
【0077】
他の実施様態において、デアザプリンは4−(2−N’−メチルウレアブチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジンである。
【0078】
他の実施様態において、デアザプリンは4−(2−アミノシクロプロピルアセトアミドエチル)アミノ−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジンである。
【0079】
他の実施様態において、デアザプリンは4−(トランス−4−ヒドロキシシクロへキシル)アミノ−2−(3−クロロフェニル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジンである。
【0080】
他の実施様態において、デアザプリンは4−(トランス−4−ヒドロキシシクロへキシル)アミノ−2−(3−フルオロフェニル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジンである。
【0081】
他の実施様態において、デアザプリンは4−(トランス−4−ヒドロキシシクロへキシル)アミノ−2−(4−ピリジル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジンである。
【0082】
また、他の実施様態において、本発明は、細胞をN−6置換7−デアザプリン(たとえば好ましくはアデノシン受容体アンタゴニスト)と接触させることによって、細胞内のアデノシン受容体(たとえばA1、A2A、A2Bまたは好ましくはA3)の活性を抑制する方法を特徴とする。
【0083】
他の態様において、本発明は、動物に効果的な量のN−6置換7−デアザプリンを投与することにより、動物(たとえばヒト)の眼への障害を治療する方法を特色とする。好ましくはN−6置換7−デアザプリンは動物の細胞内のA3アデノシン受容体のアンタゴニストである。障害は網膜または視神経乳頭に対してであり、急性または慢性でありうる。障害はたとえば緑内障、浮腫、虚血、低酸素、外傷の結果でありうる。
【0084】
好ましい実施様態において、本発明は以下の式IIを持つジアザプリンを特徴とし、(式中、
XはNまたはCR6であり、
R1およびR2はそれぞれ独立して水素、または置換または非置換あるアルコキシ、アミノアルキル、アルキル、アリール、またはアルキルアリールであり、または一緒に置換または非置換複素環式環を形成し、ただし、R1およびR2は両方とも水素ではなく、
R3は置換または非置換アルキル、アリールアルキル、またはアリールであり、
R4は水素または、置換または非置換C1−C6アルキルであり、
Lは水素、置換または非置換アルキルであり、またはR4およびLは一緒に置換または非置換複素環式または炭素環式環を形成し、
R6は水素、置換または非置換アルキル、またはハロゲンであり、
QはCH2、O、SまたはNR7であり、式中、R7は水素または、置換または非置換C1−C6アルキルであり、
Wは置換または非置換アルキル、シクロアルキル、アクケニル、アリール、アリールアルキル、バイアリール、ヘテロアリール、置換カルボニル、置換チオカルボニルまたは置換スルホニルであり、R3がピロリジノである場合、R4はメチルではない。
【0085】
1つの実施様態において、式IIの化合物中、XはCR6であり、QはCH2、O、SまたはNHである。他の実施様態において、XはNである。
【0086】
式IIの化合物のさらなる実施様態において、Wは置換または非置換アリール、5−または6−員のヘテロアリールまたはバイアリールである。Wは1つ以上の置換基で置換されてよい。置換基の例には、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アミノアルキル、アミノカルボキサミド、CN、CF3、CO2R8、CONHR8、CONR8R9、SOR8、SO2R8およびSO2NR8R9が含まれ、式中、R8およびR9はそれぞれ独立して水素、または置換または非置換アルキル、シクロアルキル、アリールまたはアリールアルキルである。好ましくはWは置換または非置換フェニル、たとえばメチレンジオキシフェニルであってよい。Wはまた、置換または非置換5員ヘテロアリール環、たとえばピロール、ピラゾール、オキサゾール、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、フラン、チオフェン、チアゾールおよびオキサジアゾールであってよい。好ましくは、Wは6員ヘテロアリール環、たとえばピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、ピラジナルおよびチオフェニルであってよい。好ましい実施様態において、Wは2−ピリジル、3−ピリジル、4−ピリジル、2−ピリミジル、4−ピリミジルまたは5−ピリミジルである。
【0087】
式IIの化合物の1つの有利な実施様態において、QはNHであり、Wは非置換、または置換または非置換アルキル、シクロアルキル、アリール、またはアリールアルキルによってN−置換された3−ピラゾール環である。
【0088】
式IIの化合物の他の実施様態において、Qは酸素であり、Wは非置換か、置換または非置換アルキル、シクロアルキル、アリールまたはアリールアルキルで置換された2−チアゾール環である。
【0089】
式IIの化合物の他の実施様態において、Wは置換または非置換アルキル、シクロアルキルであり、たとえばシクロペンチルまたはアリールアルキルである。置換基の例には、ハロゲン、ヒドロキシ、置換または非置換アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキルまたはNHR10が含まれ、式中、R10は水素または、置換または非置換アルキル、シクロアルキル、アリールまたはアリールアルキルである。
【0090】
また他の実施様態において、本発明は、式IIのデアザプリンを特色とし、式中、Wは−(CH2)a−C(=O)Yまたは−(CH2)a−C(=S)Yであり、aは0から3の整数であり、Yはアリール、アルキル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、アルキニル、NHR11R12であり、またはQはNH、OR13であり式中R11、R12およびR13はそれぞれ独立してハロゲンまたは、非置換または置換アルキル、アリール、アリールアルキルまたはシクロアルキルである。好ましくは、Yは5−または6−員ヘテロアリール環である。
【0091】
さらにWは−(CH2)b−S(=O)jYであってよく、式中、jは1または2、bは0、1、2または3であり、Yはアリール、アルキル、アリールアルキル、シクロアルキル、アルキニル、ヘテロアリール、NHR14R15であり、bが1のときQはCH2であり、式中、R14、R15およびR16はそれぞれ独立してハロゲンまたは、非置換または置換アルキル、アリール、アリールアルキルまたはシクロアルキルである。
【0092】
他の実施様態において、R3は置換および非置換フェニル、ピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、ピラジナル、ピロリル、トリアゾリル、チオアゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、ピラゾリル、フラニル、メチレンジオキシフェニル、およびチオフェニルからなる群より選択される。R3がフェニルの場合、たとえばヒドロキシル、アルコキシ8たとえばメトキシ)、アルキル(たとえばトリル)、およびハロゲン(たとえばo−、m−またはp−フルオロフェニル、o−、m−またはp−クロロフェニル)で置換されてよい。有利にはR3は2−、3−、または4−ピリジルまたは2−、3−ピリミジルであってよい。
【0093】
本発明はまた、R6が水素またはC1−C3アルキルであるデアザプリンにも関する。好ましくは、R6は水素である。
【0094】
本発明はまた、R1が水素であり、R2が置換または非置換アルキルまたはアルコキシ、置換または非置換アルキルアミン、アリールアミンまたはアルキルアリールアミン、置換または非置換アミノアルキル、アミノアリールまたはアミノアルキルアリール、置換または非置換アルキルアミド、アリールアミドまたはアルキルアリールアミド、置換または非置換アルキルスルホンアミド、アリールスルホンアミドまたはアルキルアリールスルホンアミド、置換または非置換アルキルウレア、アリールウレアまたはアルキルアリールウレア、置換または非置換アルキルカルバメート、アリールカルバメートまたはアルキルアリールカルバメート、または置換または非置換アルキルカルボン酸、アリールカルボン酸、アルキルアリールカルボン酸であるデアザプリンも含む。好ましくは、R2は置換または非置換シクロアルキル、たとえばモノ−、またはジヒドロキシ−置換シクロへキシルまたはシクロペンチル(好ましくは、モノヒドロキシ−置換シクロへキシルまたはモノヒドロキシ−置換シクロペンチル)である。
【0095】
有利には、R2は以下の式のものであってよい:
【化30】
(式中、AはC1−C6アルキル、C3−C7シクロアルキル、1〜7原子の鎖、または3〜7原子の環であり、任意にC1−C6アルキル、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボキシル、チオールまたはアミノ基で置換されており、
Bはメチル、N(Me)2、N(Et)2、NHMe、NHEt、(CH2)rNH3+、NH(CH2)rCH3、(CH2)rNH2、(CH2)rCHCH3NH2、(CH2)rNHMe、(CH2)rOH、CH2CN、(CH2)mCO2H、CHR18R19またはCHMeOHであり、式中rは0から2までの整数、mは1または2、R18はアルキル、R19はNH3+またはCO2HまたはR18およびR19は一緒に
【化31】
であり、式中、pは2または3であり、
R17はC1−C6アルキル、C3−C7シクロアルキル、1〜7原子の鎖、3〜7原子の環であり、任意にC1−C6アルキル、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボキシル、チオール、またはアミノ基で置換されている)。
【0096】
有利には、Aは非置換または置換C1−C6アルキルである。Bは非置換または非置換C1−C6アルキルであってよい。
【0097】
好ましい実施様態において、R2は式−A−NHC(=O)Bである。特に有利な実施様態において、Aは−CH2CH2−であり、Bはメチルである。
【0098】
本発明の化合物は、たとえばエステラーゼ触媒加水分解によってインビボで活性化薬剤に代謝される水溶性プロドラッグを含んでよい。可能性のあるプロドラッグの例には、たとえばR2が−OC(O)(Z)NH2によって置換されたシクロアルキルであって、式中、Zが天然のまたは人工のアミノ酸またはその類似体、α、β、γまたはωアミノ酸、またはジペプチドの側鎖であるジアザプリンが含まれる。好ましいアミノ酸側鎖には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、リシン、α−メチルアラニン、アミノシクロプロパンカルボン酸、アゼチジン−2−カルボン酸、β−アラニン、γ−アミノブチル酸、アラニン−アラニンまたはグリシン−アラニンの側鎖が含まれる。
【0099】
他の実施様態において、R1およびR2は一緒に
【化32】
であり、式中、nは1または2であり、および式中、環は任意に1つ以上のヒドロキシ、アミノ、チオール、カルボキシル、ハロゲン、CH2OH、CH2NHC(=O)アルキル、またはCH2NHC(=O)アルキル基によって置換されてよい。好ましくはnは1または2であり、前記環は−NHC(=O)アルキルで置換される。
【0100】
1つの有利な実施様態において、R1は水素であり、R2は置換または非置換C1−C6アルキルであり、R3は置換または非置換フェニルであり、R4は水素であり、Lは水素、または置換または非置換C1−C6アルキルであり、QはO、SまたはNR7であり、式中、R7は水素または、置換または非置換C1−C6アルキルであり、Wは置換または非置換アリールである。好ましくは、R2は−A−NHC(=O)Bであり、式中、AおよびBはそれぞれ独立して非置換または置換C1−C4アルキルである。たとえば、AはCH2CH2であってよい。Bはたとえばアルキル(たとえばメチル)またはアミノアルキル(たとえばアミノメチル)であってよい。好ましくはR3は非置換フェニルであり、Lは水素である。R6はメチルまたは好ましくは水素であってよい。好ましくはQはO、SまたはNR7であり、式中、R7は水素または、置換または非置換C1−C6アルキル、たとえばメチルである。Wは非置換または置換フェニル(たとえばアルコキシ、ハロゲン置換)である。好ましくは、Wはp−フルオロフェニル、p−クロロフェニルまたはp−メトキシフェニルである。Wはまたヘテロアリール、たとえば2−ピリジルであってよい。
【0101】
特に好ましい実施様態において、デアザプリンは4−(2−アセチルアミノエチル)アミノ−6−フェノキシメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジンである。
【0102】
特に好ましい実施様態において、デアザプリンは4−(2−アセチルアミノエチル)アミノ−6−(4−フルオロフェノキシ)メチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジンである。
【0103】
特に好ましい実施様態において、デアザプリンは4−(2−アセチルアミノエチル)アミノ−6−(4−クロロフェノキシ)メチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジンである。
【0104】
特に好ましい実施様態において、デアザプリンは4−(2−アセチルアミノエチル)アミノ−6−(4−メトキシフェノキシ)メチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジンである。
【0105】
特に好ましい実施様態において、デアザプリンは4−(2−アセチルアミノエチル)アミノ−6−(2−ピリジルオキシ)メチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジンである。
【0106】
特に好ましい実施様態において、デアザプリンは4−(2−アセチルアミノエチル)アミノ−6−(N−フェニルアミノ)メチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジンである。
【0107】
特に好ましい実施様態において、デアザプリンは4−(2−アセチルアミノエチル)アミノ−6−(N−メチル−N−フェニルアミノ)メチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジンである。
【0108】
特に好ましい実施様態において、デアザプリンは4−(2−N’−メチルウレアエチル)アミノ−6−フフェノキシメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジンである。
【0109】
本発明はさらに、細胞を本発明の化合物に接触させることによって細胞内のアデノシン受容体(たとえばA2bアデノシン受容体)の活性を阻害するための方法に関する。好ましくは化合物は受容体のアンタゴニストである。
【0110】
本発明はまた、動物に効果量の本発明の化合物(たとえばA2bのアンタゴニスト)を投与することにより、動物の消化管障害(たとえば下痢)を治療するための方法に関する。好ましくは、動物はヒトである。
【0111】
他の実施様態において、本発明は本発明のN−6置換7−デアザプリンを含む薬物組成物および薬学的に許容可能な担体に関する。
【0112】
本発明はまた、N−置換7−デアザプリン応答状態が動物で起こるように、哺乳類動物に薬物的に効果的な量の本発明のデアザプリンを投与することにより、動物におけるN−6置換7−デアザプリン応答状態を治療するための方法に関する。有利には、疾病状態はアデノシンによって仲介される障害であってよい。好ましい疾病状態の例には、中枢神経系障害、心臓血管障害、腎障害、炎症障害、アレルギー性障害、消化管障害、眼障害および呼吸障害が含まれる。
【0113】
「アルキル(alkyl)」の用語は、飽和した脂肪族基を表し、直鎖アルキル基、分岐鎖アルキル基、シクロアルキル(脂環式)基、アルキル置換シクロアルキル基およびシクロアルキル置換アルキル基が含まれる。アルキルの用語は、さらに1つ以上の炭化水素骨格の炭素原子を置換している酸素、窒素、硫黄またはリン原子、たとえば酸素、窒素、硫黄、またはリン原子を含んでよいアルキル基をさらに含む。好ましい実施様態において、直鎖または分岐鎖アルキルは、その骨格には30以下の炭素原子を有し(たとえば、直鎖ではC1−C30、分岐鎖ではC3−C30)、さらに好ましくは20以下である。同様に、好ましいシクロアルキル類は4−10の炭素原子をその環構造内に持ち、さらに好ましくはその環構造内に5、6または7炭素を持つ。
【0114】
さらに、本明細書および請求項を通して使用するアルキルの用語は、「非置換アルキル(unsubstituted alkyls)」および「置換アルキル(substituted alkyls)」両方を含み、後者は炭化水素骨格の1つ以上の炭素上の水素を置き換えている置換基を持つアルキル部分を指す。そのような置換基には、たとえばハロゲン、ヒドロキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニル、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、(アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む)アミノ、(アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む)アシルアミノ、アミジノ、イミノ、スルフィドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、スルフォネート、スルファモイル、スルフォンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族またはヘテロ芳香族部分が含まれる。当業者によって、もし適切であるならば炭化水素素上で置換した部位がそれ自身置換され得ることが理解されるであろう。シクロアルキル類はさらに、たとえば上記した置換基によって置換されうる。「アルキルアリール(alkylaryl)」部分は、アリールで置換されたアルキルである(たとえばフェニルメチル(ベンジル))。また、「アルキル(alkyl)」の用語は、上述したアルキルと長さおよび可能性のある置換が類似する不飽和脂肪族基を含むが、少なくとも1つの二重または三重結合をそれぞれ持つ。
【0115】
本明細書で使用する語「アリール(aryl)」は、0〜4ヘテロ原子を含みうる5−および6−員単環芳香族基、たとえばベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ベンズオキサゾール、ベンゾチアゾール、トリアゾール、テトラゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジンおよびピリミジン等を含む基本アリール基を示す。アリール基はまた、ナフチル、キノリル、インドリル等のような多環式結合芳香族基も含む。環構造中にヘテロ原子をもつようなアリール基はまた、「アリール複素環(aryl heterocycles)」、「ヘテロアリール(heteroaryls)」または「ヘテロ芳香族(heteroaromatics)」と呼ぶ。芳香族環は1つ以上の環部分が以上で記述したような置換基、たとえばハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカアルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、(アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む)アミノ、(アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む)アシルアミノ、アミジノ、イミノ、スルフィドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、スルフォネート、スルファモイル、スルフォナンアド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族またはヘテロ芳香族部位で置換されうる。アリール基はまた多重環を形成するために、芳香族ではない脂環式またはヘテロ環と縮合するか架橋されうる(たとえばテトラリン)。
【0116】
「アルケニル(alkenyl)」および「アルキニル(alknyl)」の用語は、長さおよび可能な置換基の点で上述したアルキルと類似している不飽和脂肪基をいうが、少なくともそれぞれ1つ以上の二重または三重結合を含むものをいう。たとえば、本発明はシアノおよびプロパギル基を想定している。
【0117】
炭素数は特に明記しないかぎり、本明細書で使用する「低級アルキル(lower alkyl)」は上述したようなアルキル基を意味するが、1〜10炭素、さらに好ましくはその骨格構造中に1〜6炭素原子を、さらに好ましくは1〜3炭素原子をその骨格構造内に持っている。同様に「低アルケニル(lower alkenyl)」および「低アルキニル(lower alkynyl)」は同様の鎖長を持つ。
【0118】
用語「アルコキシアルキル(alkoxyalkyl)」、「ポリアミノアルキル(polyaimoalkyl)」および「チオアルコキシアルキル(thioalkoxyalkyl)」は上述したようなアルキル基で、さらに炭化水素骨格の1つ以上の炭素を置換している酸素、窒素、または硫黄原子、たとえば炭素、窒素または硫黄原子を含むものを言う。
【0119】
用語「ポリシクリル(polycyclyl)」または「ポリシクリル基(polycyclic radical)」は、その中で2つ以上の炭素が2つの結合環において共通であり、たとえばその環が「縮合環(fused rings)」であるような2つ以上の環式環(たとえばシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリールおよび/またはヘテロシクリル)の基を示す。非隣接原子を介して結合している環は、「架橋した(bridged)」環の用語で示す。多環式のそれぞれの環は上述したような置換基、たとえばハロゲン、ヒドロキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルノニルオキシ、アルコキシカアルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、シアノ、(アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む)アミノ、(アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む)アシルアミノ、アミジノ、イミノ、スルフィドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、スルフォネート、スルファモイル、スルフォンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキル、アルキルアリール、または芳香族またはヘテロ芳香族部分によって置換されうる。
【0120】
本明細書で使用する「ヘテロ原子(heteroatom)」の用語は、炭素または水素以外の任意の元素の原子を意味する。好ましいヘテロ原子は、窒素、酸素、硫黄およびリンである。
【0121】
用語「アミノ酸(amino acids)」は、グリシン、アラニン、バリン、システイン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、メチオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リジン、アルギニン、プロリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンのようなタンパク質中にみられる天然または人工のアミノ酸をさす。アミノ酸類似体は伸長したまたは短縮した側鎖、または適切な官能基を持つ変形側鎖を持つアミノ酸が含まれる。アミノ酸は、アミノ酸の構造が立体異性体を許容する場合、アミノ酸のDおよびL立体異性体型をも含む。用語「ジペプチド(dipeptide)」は互いに結合した2つ以上のアミノ酸を含む。好ましくは、ジペプチドはペプチド結合を介して連結している2つのアミノ酸である。特に好ましいジペプチドはたとえば、アラニン−アラニンおよびグリシン−アラニンを含む。
【0122】
本発明の化合物の幾つかの構造は不整炭素原子を含むことに注意されたい。よって特に示さない限り、そのような不整からできる異性体(たとえばすべての鏡像異性体およびジアステレオマー)が本発明の意図の範囲内に含まれることが理解される。そのような異性体は、古典的分離技術によって、および立体化学的に制御された合成によって、実質的に精製形態として入手できる。
【0123】
本発明はさらに、たとえば呼吸障害(たとえば喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺障害およびアレルギー性鼻炎)、腎障害、消化管障害および眼障害のような、哺乳動物でのN−6置換7−ジアザプリン応答状態を治療するための薬物組成物に関する。薬物組成物には、上に記述したような治療的な効果量のN−6置換7−ジアザプリンおよび、薬学的に許容可能な担体を含む。上述したすべてのジアザプリンが治療処置のために含まれることが理解される。さらに本発明のジアザプリンは単体で、または本発明の他のジアザプリンとの組合せで、またはたとえば抗生物質、坑炎症剤または坑腫瘍剤のようなさらなる治療化合物との組合せで使用できることが理解される。
【0124】
用語「抗生物質(antibiotic)」は当技術分野で理解されており、病原体の増殖を排除しまたは阻害し、感染した宿主対象に対して有害な効果が最小であるかまたはない一方、病原体に対して選択的に毒性である、微生物の増殖によって産出された物質およびその合成的派生物を含む。適切な抗生物質の例には、アミノグリコシド類、セファロスポリン類、クロロアンフェニコール類、フシジル酸、マクロライド類、ペニシリン類、ポリミキシン類、テトラサイクリン類およびストレプトマイシン類の原則的な部類が含まれるが、限定されない。
【0125】
用語「坑炎症剤(antiinflammatory)」は当技術分野で理解されており、グルココルチコイド、アスピリン、イブプロフェン、NSAIDSなどのような、直接的に炎症の原因となる薬物を中和することなしに体機構上で働く薬剤を含む。
【0126】
「抗癌剤(anticancer agent)」という用語は当技術分野で受け入れられ、好ましくは、他の生理学的機能に影響せずに癌細胞の増殖を減少させ、根絶させ、あるいは予防する薬剤を含む。代表的な例には、シスプラチンおよびシクロフォスファミドが含まれる。
【0127】
本発明の化合物をヒトや哺乳動物に薬剤として投与した時、それ自体で、あるいは、例えば、薬学的に許容可能な担体との組合せで化合物の活性成分の0.1から99.5%(さらに好ましくは0.5から90%)を含む薬剤的化合物として与えられうる。
【0128】
本明細書で用いる「薬学的に許容可能な担体(pharmaceutically acceptable carrier)」の用語は、その意図した機能を発揮できるように対象中で、または対象に本発明の化合物を運搬や輸送することに関連する液体あるいは固体の溶加剤、希釈剤、補形薬、溶媒、被包性物質のような薬学的に許容可能な物質、化合物、あるいは賦形剤を意味する。典型的に、そのような化合物は1つの有機体あるいは体の一部から別の有機体あるいは体の一部へ運搬、輸送される。どの担体も、処方のほかの成分のそれぞれの作用に影響を及ぼさず、また患者に有害でないという意味で「許容可能(acceptable)」なものでなくてはならない。薬学的に許容可能な担体として使用できる物質の幾つかの例には、ラクト−ス、グルコース、スクロースのような糖類、トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプンのようなデンプン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、セルロースアセテートなどのセルロースおよびセルロース誘導体、粉末状のトラガカントゴム、麦芽、ゼラチン、タルク、ココアバターおよび座薬ロウのような補形薬、落花生油、綿実油、ベニバナ油、ごま油、オリーブ油、トウモロコシ油、大豆油などの油類、プロピレングリコールのようなグリコール類、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコールのような多価アルコール類、オレイン酸エチル、ラウリン酸エチルのようなエステル類、寒天、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムのような緩衝剤、アルギニン酸、発熱物質を含まない水、等張塩水、リンガー液、エチルアルコール、リン酸緩衝溶液、およびその他の薬剤的調剤物に使用された無害でそれぞれの作用に影響を及ぼさない物質が含まれる。
【0129】
上で述べたように、本化合物のある実施様態は、アミノ、アルキルアミノのような基本的な官能基を含むことができ、したがって薬学的に許容可能な酸とともに薬学的に許容可能な塩を作ることができる。この点での「薬学的に許容可能な塩(pharmaceutically acceptable salts)」という用語は、比較的無害な、本発明の化合物の無機酸、有機酸付加塩を指す。これらの塩は本発明の化合物の最終単離、精製段階で、または本発明の精製された化合物をその遊離塩基を適合する有機または無機酸と単独で反応させて形成された塩を単離することにより、インサイチューで調製できる。代表的な塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフタール酸塩、メスカリン酸塩、グルコヘプタン酸塩、重乳酸塩、ラウリン硫酸塩等が含まれる(例えば、Bergら, (1977) “Pharmaceutical Salts”, J. Pharm, Sci. 66:1-19を参照のこと)。
【0130】
他の場合では、本発明の化合物は1つ以上の酸性官能基を持ちえ、それゆえ、薬学的に許容可能な塩基とともに薬学的に許容可能な塩を作ることができる。この場合での「薬学的に許容可能な塩(pharmaceutically acceptable salts)」”という言葉は、本発明の化合物の比較的無害な、無機酸、有機酸付加塩を指す。これらの塩は同様に化合物の最終単離、精製段階で、あるいは精製された化合物中の遊離の酸性基と薬学的に許容可能な金属カチオンの水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩のような適合する塩と、アンモニアと、あるいは薬学的に許容可能な有機一級、二級、三級アミンとの単独反応により、インサイチューで調製できる。代表的なアルカリ塩、アルカリ土類塩には、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム塩等が含まれる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミン類には、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンとその類縁体が含まれる。
【0131】
用語「薬学的に許容可能なエステル(pharmaceutically acceptable esters)」は、比較的無害な、本発明の化合物のエステル化された生成物を指す。これらのエステルは、化合物の最終単離、生成段階、あるいは精製された化合物の遊離酸性基、または水酸基と、適合するエステル化試薬との単独反応によりインサイチューで調製できる。カルボン酸は、触媒存在下でアルコールでの処理によりエステルに変換できる。水酸基を含む誘導体はアルカノイルハロゲン化物のようなエステル化試薬処理によりエステルに変換できる。この用語はさらに生理的状況下で溶解されることのできる低炭化水素基、例えば、アルキルエステル類、メチル、エチル、プロピルエステル類も含むことが意図される。(例えば、Bergeら,supraを参照のこと)
本発明はさらにインビボで本発明の治療的化合物に変換されるプロドラッグの使用を企図している(例えば、R.B. Silverman, 1992, “The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action”, Academic Press, Chp.8を参照のこと)。そのようなプロドラッグは生物的分解(例えば、化合物を典型的にはプロテアーゼの反応部位に入らないようにすること)、または治療的化合物の薬物動学を改変するために用いることができる。例えば、カルボン酸基は、たとえばメチル基やエチル基でエステル化し、エステルを得る。被験者にエステルを投与すると、エステルは酵素的に、あるいは非酵素的に、還元的にあるいは加水分解的に開裂して、アニオン基を生成する。アニオン基は、続いて分解される中間体を示すように開裂する部分(例えば、アシルオキシメチルエステル)でエステル化でき、活性化合物を産出する。他の実施様態では、プロドラッグは硫酸塩あるいはスルホン酸塩の還元型であり、例えばチオールは、インビボで治療的化合物へ酸化される。さらに、アニオン部分はインビボで活発に輸送される基、あるいは標的器官に選択的に取り込まれる基にエステル化できる。下で担体部位について述べたように、エステルは特異的反応部位への治療的部分の特異的標的を可能にするために選択できる。
【0132】
ラウリル硫酸ナトリウム塩およびステアリン酸マグネシウム塩のような湿潤剤、乳化剤、潤滑剤、および着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、薬味料、香料、保存料および抗酸化剤もまた、組成物の中に存在しうる。
【0133】
薬学的に許容可能な抗酸化剤の例には、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム塩、メタ重硫酸ナトリウム塩等ような水溶性抗酸化剤、アスコルビルパルミチン酸塩、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、レシチン、プロピルガレート、アルファ−トコフェロールおよびそれらの類縁体のような油溶性抗酸化剤、クエン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)、ソルビトール、酒石酸、リン酸、それらの類縁体のような金属キレート試薬が含まれる。
【0134】
本発明の処方は経口、経鼻、局所、経皮、頬、舌下、直腸、膣および/または非経口投与に適したものが含まれる。この処方は簡単に単位投与形態に調製でき、調剤分野にて周知の任意の方法によって調製されよい。単一投与形態を作製するために担体物質と結合しうる活性成分の量は一般的に治療的効果を産出する化合物量であろう。一般的に、百パーセントのうち、この量は活性成分の約1パーセントから約99パーセント、好ましくは約5パーセントから約70パーセント、最も好ましくは約10パーセントから約30パーセントの範囲であろう。
【0135】
これらの処方または組成物の調製のための方法には、本発明の化合物の担体および任意に1つ以上の付属成分との会合を行う工程が含まれる。一般的に、処方は均一にそして詳細に本発明の化合物を液体担体、またはよく分離された固体担体、または両方と結合をさせ、ついで必要であれば産生物を成型することで調製する。
【0136】
経口投与に適切な本発明の処方は、カプセル、カシェ剤、丸剤、錠剤、(調味主成分、通常スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントゴムを使用している)菱形剤、粉剤、顆粒剤の形態であってよく、または水性または非水性液体中の溶液または懸濁液として、または水中油型または油中水型液体エマルションとして、またはエリキシルまたはシロップとして、または(ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアゴムなどのような不活性基材を使用した)トローチ剤としておよび/または口洗浄剤等としてあってよく、それぞれ活性成分として決められた量の本発明の化合物を含んでいる。本発明の化合物はまた巨丸剤、舐剤またはパスタとして投与されてよい。
【0137】
経口投与(カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、粉剤、顆粒剤等)のための本発明の固体投与形態において、活性成分は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸ジカルシウムなどの1以上の薬学的に許容可能な担体、および/または以下、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよび/またはケイ酸などの充填剤または増量剤、たとえばカルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび/またはアラビアゴムのような接着剤、グリセロールのような湿潤剤、アガー−アガー、カルボン酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギニン酸、特定のケイ酸塩およびカルボン酸ナトリウムのような崩壊剤、パラフィンのような溶液遅延剤、4級アンモニア化合物のような吸収促進剤、たとえばセチルアルコールおよびグリセロールモノステアリン酸塩などの加湿剤、カオリンおよびベントナイトクレーのような吸着剤、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびその混合物のような潤滑剤および着色剤の任意のものと混合する。カプセル、錠剤、丸剤の場合、薬物組成物はまた緩衝剤を含んでよい。同様の型の固体組成物をまた、ラクトースまたは牛乳糖、および高分子量ポリエチレングリコール等のような賦形剤を用いて軟および硬充満ゼラチンカプセル中の充填剤として使用してよい。
【0138】
錠剤は任意に1つ以上の付属成分と圧縮または成形によって作製してよい。圧縮錠剤は(たとえばゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースのような)結合剤、潤滑剤、不活性希釈液、保存薬、(たとえばグリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムなどの)崩壊剤、表面活性または分散剤を用いて調製してよい。成形錠剤は適切な機械の中で、不活性液体希釈液でぬらした粉末状化合物の混合物を成形することで作製してよい。
【0139】
錠剤、および糖衣錠、カプセル、丸剤および顆粒剤のような本発明の薬物組成物の他の固体投与形態は、任意に腸溶性コーティングおよび他の薬物的処方分野で周知のコーティングのようなコーティングまたはシェルで刻み目を付けるか調製してよい。これらはまた、たとえば望ましい放出プロフィールを提供するために特性が変化するヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマー鋳型、リポソームおよび/またはミクロスフェアを用いてその活性成分の除放出性のまたは制御された放出を提供するために処方されてもよい。これらはたとえば細菌保持フィルターを通した濾過によって、または使用の直前に滅菌水、または他の滅菌注射可能溶媒に溶解することができるような滅菌固体組成物の形態での滅菌剤を組み込むことによって滅菌されてよい。これらの組成物はまた、任意に懸濁剤を含んでよく、またこれらが活性成分のみを、好ましくは消化管の特定の部位で、任意に遅延した様式で放出するような組成物であってよい。使用することのできる包埋組成物の例には重合物質およびロウが含まれる。活性成分はまた、適切な場合、1つ以上の上述した賦形剤による微小被包性形態でありうる。
【0140】
本発明の化合物の経口投与のための液体投与形態には、薬学的に許容可能なエマルション、ミクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤が含まれる。活性成分に加えて、液体投与形態には、たとえば水または他の溶剤、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、カルボン酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、油(特に綿実、アメリカホドイモ、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ベニバナおよびごま油)、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルおよびその混合物のような可溶性剤および乳化剤などの当技術分野で一般的に使用される不活性希釈液を含んでよい。不活性希釈液に加えて、経口組成物はまた加湿剤、乳化、浮遊剤、甘味剤、薬味剤、着色剤、香料および保存剤のような補助薬を含んでよい。
【0141】
活性化合物に加えて、懸濁液は、たとえばエトキシ化イソステアリールアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微晶質セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガー−アガーおよびトラガカントゴムおよびこれらの混合物のような懸濁剤を含んでよい。
【0142】
直腸または膣投与のための本発明の薬物組成物の処方は、座剤として存在してよく、本発明の1つ以上の化合物を、たとえばココアバター、ポリエチレングリコール、坐薬ロウまたはサリチル酸塩などを含む1つ以上の好ましい非炎症性賦形剤または担体と混合することにより、調製してよく、室温で固体であり、しかし体温では液体であり、したがって腸または膣腔で溶解し、活性化合物を放出するであろう。
【0143】
膣投与に好ましい本発明の処方はまた、当技術分野で望ましいと知られているような担体を含む膣坐薬、タンポン、クリーム、ゲル、パスタ、泡またはスプレー処方も含む。
【0144】
本発明の化合物の局所または経皮投与のための投与形態には、粉剤、スプレー、軟膏、パスタ、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入薬が含まれる。活性化合物は無菌条件下で薬学的に許容可能な担体、および必要である可能性のある任意の保存剤、緩衝液または促進剤と混合してよい。
【0145】
軟膏、パスタ、クリームおよびゲルは、本発明の活性化合物に加えて、動物または植物脂肪、油、ロウ、パラフィン、デンプン、トラガカントゴム、セルロース派生物、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび亜鉛酸化物またはそれらの混合物のような賦形剤を含んでよい。
【0146】
粉剤およびスプレーは、本発明の化合物に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末またはこれらの物質の混合物を含みうる。スプレーはさらに、クロロフルオロ炭化水素およびブタンおよびプロパンのような揮発性非置換炭化水素のような慣例促進剤を含みうる。
【0147】
経皮パッチは体への本発明の化合物の制御した輸送を提供するというさらなる利点を持つ。このような投与形態は適切な溶媒中に化合物を溶解させまたは拡散させること作製できる。吸収促進剤はまた皮膚を通した化合物の流量を増加させるのに使用できる。そのような流動速度は速度調節膜を提供すること、または重合マトリックスまたはゲル中で活性化合物を分散させることのいずれかで制御できる。
【0148】
眼病用処方、眼軟膏、粉剤、溶液等はまた本発明の範囲内にあると企画されている。好ましくは、薬物的調製は眼病用処方(たとえば、眼周辺、眼球後または眼内注射処方、全身処方、または外科的灌注溶液など)である。
【0149】
本発明の眼病用処方は、1つ以上のデアザプリンおよび薬学的に許容可能な賦形剤を含んでよい。様々な形の賦形剤が使用されてよい。賦形剤は一般的にその特性が水性であろう。影響を受けている眼に1または2滴の溶液を垂らす方法によってそのような化合物を患者が簡単に得られるのと同時に、処方の場合を基準にして、水性溶液が一般的に好ましい。しかしながら、本発明のデアザプリンはまた容易に、懸濁液、粘性のまたは半粘性のゲルまたは他の型の固体または半固体組成物のような他の型の組成物内に組み入れることができてよい。本発明の眼用の組成物はまた、緩衝液、保存剤、共溶媒および粘性結合剤などの様々な他の成分も含んでよい。
【0150】
(たとえば硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウムまたはホウ酸ナトリウムなどの)適切な緩衝液系を保存状態下でのpH変化を防ぐために加えてよい。
【0151】
眼病用産物は典型的に多投与形態で包装される。したがって使用中の微生物混合を防ぐために保存剤が必要である。好ましい保存剤には、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、クロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデト酸二ナトリウム、ソルビン酸、ポリクアテルニウム−1、または当業者に周知の他の試薬が含まれる。このような保存剤は典型的には0.001から1.0%重量/容量(「%w/v」)までのレベルで使用される。
【0152】
本発明のデアザプリンが、眼後または眼周辺注射および眼内灌流または注射のような眼内外科手術中に投与される場合、賦形剤としてバランス塩灌流溶液の使用が最も好ましい。BSS(登録商標)無菌灌流溶液およびBSS Plus(登録商標)無菌眼内灌流溶液(Alcon Laboratories, Inc., Fort Worth, Tex. USA)は薬物的なバランス眼内灌流溶液の例である。後者の型の溶液は米国特許第4,550,022号(Garabedian,ら)に記述されており、そのすべての内容が参考により本明細書に組み込まれる。眼球後および言及前注射は当業者に周知であり、たとえばOphthalmic Surgery: Principles of Pracrice, Ed., G.L. Spaeth. W.B. Sanders Co., Philadelphia, Pa, U.S.A., 85-87(1990)を含む多くの発行物に記述されている。
【0153】
上で示したように、細胞内レベルでの網膜および視神経乳頭組織への損傷を予防または減少させるデアザプリンの使用は、特に本発明の実施様態の重要な側面である。治療されうる眼状態には網膜症、黄斑変性、眼虚血、緑内障および虚血再灌流障害、光学活性障害などの眼の組織への損傷に関連した障害、および眼の外科的手術に関連した障害、特に光または外科的器具への曝露による網膜または視神経乳頭への障害が含まれるが、限定されない。この化合物はまた、眼の手術後の水晶体または結膜下注射によってのように、眼の手術への補助として使用してよい。この化合物は一時的状態の急性治療のために使用してよく、または特に退行性疾患の場合に、慢性的に投与されてよい。この化合物はまた、特に眼の手術または非浸潤性眼治療、または他の型の手術の前に、予防的に使用してもよい。
【0154】
非経口投与に好ましい本発明の薬物組成物は、1つ以上の薬学的に許容可能な無菌等張水性または非水性溶液、分散、懸濁液またはエマルション、または使用の直前に無菌の注射可能溶液または分散内に再構築されうる無菌粉末との組合せでの1つ以上の本発明の化合物を含み、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、処方等張が意図したレシピエンの血液と等張である溶質、または懸濁剤または濃化剤を含んでよい。
【0155】
本発明の薬物組成物中で使用しうる適切な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、(グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよびその類似体などの)ポリオール、およびそれらの適切な混合物、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルが含まれる。適当な流動性はたとえばレシチンのようなコーティング物質の使用によって、分散の場合要求された粒子サイズの保持によって、および界面活性剤の使用によって保持できる。
【0156】
これらの組成物はまた保存剤、加湿剤、乳化剤および分散剤などの補助剤を含んでもよい。微生物の活性の防止は、たとえばパラベン、クロロブタノール、ソルビン酸フェノール等のようなさまざまな坑細菌および坑真菌剤の含有によって保証されうる。また糖、塩化ナトリウム、および類似体などの等張剤が組成物内へ含まれることが好ましい。さらに、注射可能な薬物形態の吸収が引き延ばされることは、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる試薬の含有によって行われる。
【0157】
幾つかの場合、薬剤の効果を引き延ばすために、皮内注射または筋肉内注射からの薬物の吸収をゆっくりさせることが望ましい。このことは、水溶性のほとんどない結晶性または非晶性物質の液体懸濁液によって成し遂げられ得る。薬物の吸収速度はそこで、その溶解速度に依存し、言い換えれば結晶の大きさおよび結晶性形態に依存してよい。あるいは、非経口投与薬物形態の遅延吸収は、油賦形剤中の薬物を溶解することまたは懸濁することによって行われる。
【0158】
注射可能な貯蔵形態はポリアクリルアミド−ポリグリコライドのような生物分解性重合体中の対象化合物の微小被包性鋳型形成によって生成される。薬物の重合体に対する比に依存して、特定の重合体の特性が用いられ、薬物放出の速度が制御されうる。他の生物分解性重合体の例には、ポリ(オルトエステル)およびポリ(無水物)が含まれる。貯蔵注射可能処方はまた、体組織に適合可能であるリポソームまたはミクロエマルション中に薬物を閉じこめることでも調製できる。
【0159】
本発明の調製品は、経口で、非経口で、局所で、または直腸で与えられる。これらはもちろんそれぞれの投与系に適用した形態によって与えられる。たとえば、錠剤またはカプセル形態で、注射、吸入、眼ローション、軟膏、坐薬などで与えられ、注射、点滴または吸入によって投与され、ローションまたは軟膏によって局所で、そして坐薬によって直腸で投与される。経口投与が好ましい。
【0160】
本明細書で使用する語句「非経口投与(parenteral administration)」および「非経口で投与した(administered parenterally)」は通常注射による腸および局所投与以外の投与方法を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、小管内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹膜内、経気管、皮下、表皮下、関節内、皮膜下、クモ膜下、脊髄内および胸骨内注射または点滴を含むが限定されない。
【0161】
本明細書で使用する語句「全身投与(systemic administration)」、「全身性に投与した(administered systematicall)」。「末梢投与(peripheral administration)」、「末梢に投与した(administrated peripherally)」は、化合物、薬剤または他の物質を、たとえば皮下投与など、直接的に中枢神経系に投与する以外の投与を意味し、したがって、患者の経路に入り、代謝および類似の処理を受ける。
【0162】
これらの化合物は治療のために、たとえばスプレーによってのように経口、経鼻で、経頬、舌下を含む粉末、軟膏または滴下でのように直腸、膣内、非経口で、クモ膜下槽内および局所で、任意の好ましい投与経路によってヒトまたは動物に投与されうる。
【0163】
選択した投与経路に関わらず、適切な水和物形態および/または本発明の薬物組成物で使用されうる本発明の化合物は、当業者に知られている従来の方法によって薬学的に許容可能な投与形態中に処方される。
【0164】
本発明の薬物組成物中の活性成分の実際の投与レベルは、患者に毒性でないように、特定の患者、組成物および投与方法に対して望ましい治療応答を起こすのに十分効果的である活性成分の量を持つように変化させてよい。
【0165】
選択した投与レベルは、使用した本発明の特定の化合物、またはそのエステル、塩またはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用した特定の化合物の排出速度、治療期間、使用した特定の化合物との組合せで使用した他の薬物、化合物および/または物質、治療した患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康、以前の病歴および医学分野で周知の類似因子を含む様々な因子に依存するであろう。
【0166】
当分野の通常の技術を有する医者または獣医は、必要な薬物組成物の効果的な量をたやすく決定し、処方できる。たとえば医者または獣医は、適切な治療効果を得るために、必要な量よりも少ないレベルでの薬物組成物で本発明の化合物の投与をはじめ、徐々に望ましい異効果が得られるまで投与量を増加させることができる。
【0167】
一般的に、本発明の化合物の適切な日用量は、治療効果を産出するのに効果的な最も低い投与量の化合物量であるだろう。そのような効果的な投与量は一般的に上述した因子に依存する。一般的に、患者に対する本発明の化合物の静脈内および皮下投与量は、望ましい鎮静作用のために使用した場合、1日あたり体重キログラムあたり約0.0001から約200mg、また好ましくは1日あたりkgあたり約0.01から約150mg、またさらに好ましくは1日あたりkgあたり約0.2から約140mgの範囲であろう。
【0168】
望ましい場合、効果的な活性化合物の日用量は、1日を通して好ましい間隔で、任意には単位投与形態で、分割して投与した2、3、4、5、6またはそれ以上の補投与として投与してよい。
【0169】
本発明の化合物に対して、それのみで投与することも可能である一方、薬物組成物として化合物を投与することが好ましい。
【0170】
本発明はまた、N−6置換7デアザプリン応答状態、たとえば哺乳動物での望ましくないアデノシン受容体活性の上昇などを治療するための包装された薬物組成物に関する。この包装された薬物組成物には、上述したような少なくとも1つのデアザプリンの薬物的に効果的な量を保持している容器、および哺乳動物でのデアザプリン応答状態を治療するためのデアザプリンの使用のための指示が含まれる。
【0171】
本発明のデアザプリンは有機合成の標準の方法を用いて調製されうる。デアザプリンは逆相HPLC、クロマトグラフィー、再結晶などによって精製でき、その構造は質量スペクトル解析、元素分析、IRおよび/またはNMR分光学によって確認した。
【0172】
典型的に、本発明のデアザプリンと同様に、中間体の合成は溶液内で行う。1つ以上の保護基の添加および除去もまた典型的な実施であり、当業者に周知である。本発明のデアザプリン中間体の調製のための典型的な合成図式を図式Iでその概略をのべる。
【0173】
本発明はさらに、さらなる制限であるという解釈にはならない以下の実施例によって例証される。背景部分で引用したものを含む本明細書を通して引用された、出願中特許明細書および開示された特許明細書のすべての参考文献の内容は、本明細書で参考により組み込む。実施例を通して使用したモデルは受諾されたモデルであり、それらのモデルでの効果の立証はヒトでの効果の予測となることを理解すべきである。
【0174】
本発明のデアザプリンは有機合成の標準の方法を用いて準備されうる。デアザプリンは逆送HPLC、クロマトグラフィー、再結晶などによって精製でき、その構造は質量スペクトル解析、元素分析、IRおよび/またはNMR分光学によって確認した。
【0175】
典型的には、本発明のデアザプリンと同様に、中間体の合成は溶液内で行う。1つ以上の保護基の添加および除去もまた典型的な実施であり、当業者に周知である。本発明のデアザプリン中間体の調製のための典型的な合成図式について、スキームIで概略をのべる。
【0176】
【化33】
式中R3、R5およびR6は上で定義されたようなものである。
【0177】
一般的に、保護された2−アミノ−3−シアノ−ピロールはアシルハロゲン化物で処理でき、カルボキサミド−3−シアノ−ピロールを形成し、これは蟻酸メタノールと反応でき、ピロール[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オンへの閉環を行う(Muller, C.E.ら、J.Med.Chem.40:4396(1997))。ピロール保護基の除去と引き続くたとえばリン酸酸塩化物などの塩素化試薬での処理により置換または非置換4−クロロ−7H−ピロール[2,3d]ピリミジンが生成される。クロロピリミジンのアミンでの処理で7−デアザプリンができる。
【0178】
たとえば図式Iで示したように、N−(1−dl−フェニルエチル)−2−アミノ−3−シアノ−ピロールをピリジンおよびジクロロメタン中でアシルハロゲン化物で処理した。結果えられたN−(1−dl−フェニルエチル)−2−フェニルカルボキサミド−3−シアノ−ピロールを、メタノール/硫酸の10:1混合液で処理し、閉環を行い、結果とし、てdl−7H−7−(1−フェニルエチル)ピロロ[2、3d]ピリミジン−4(3H)−オンを得た。ピリミジンのポリリン酸(PPA)、引き続きPOCl3での処理でフェニルエチル基を除去し、鍵となる中間体、4−クロロ−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジンを得た。さらに4−クロロ−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジンの、表1に列記した各種アミンでの処理で式(I)および(II)の化合物を得た。
【0179】
【表1−1】
【0180】
【表1−2】
【0181】
【表1−3】
6−置換ピロールの調製のための一般的なアプローチを以下の図式(スキームII)で描写する。
【0182】
【化34】
式中、R1からR5は上で定義したようなものである。
【0183】
エチルシアノ酢酸のα−ハロケトンでのエステル交換およびアルキル化でケトメチルエステルを得た。ケトンの保護と引き続く塩酸アミジン(たとえばアルキル、アリールまたはアルキルアリール)での処理により、ケタール保護ピリミジンを得た。保護基の除去と、引き続く環化およびリン酸酸塩化物での処理で塩化中間体を得、さらにアミノで処理してアミノ6−置換ピロールを得た。さらに、ピロール窒素のアルキル化を当技術分野で認められている条件下で行いうる。
【0184】
5−置換ピロールを調製するための一般的なアプローチを以下の図式(スキームIII)で描写する。
【0185】
【化35】
式中、R1からR6は上述したように定義され、Rは除去可能な保護基である。
【0186】
マロンニトリルおよび過剰ケトンの濃縮とそれに引き続く産生物の臭素化で開始物質、アルキルアミン、アリールアミンまたはアルキルアリールアミンで処理したモノ臭素化およびジ臭素化産生物を得た。得られたアミン産生物を酸塩化物でアシル化し、モノシアン化ピロールを酸存在下環化し、相当するピリミジンを得た。ピロール保護基をポリリン酸で除去し、リン酸酸塩化物で処理して塩素化産生物を産出した。塩素化ピロールを続いてアミンで処理し、アミノ5−置換ピロールを産出した。ピロール窒素のアルキル化を当技術分野で知られている条件下で行うことができる。
【0187】
図式IVおよびVは本発明のデアザプリン1および2を調整するための方法を描写している。
【0188】
【化36】
式中R5およびR6は上述されたようであり、たとえばCH3である。
【0189】
6−メチルピロロピリミジンの特異的調製
6−メチルピロロピリミジン(1)[R5=CH3]への鍵となる反応は、シアノ酢酸のベンザミジンとのピリミジンへの環化であった。メチルシアノ酢酸はピリミジンへ、相当するエチルエステルよりもベンザミジンとより効率的に環化するであろうことが信じられていた。したがって、NaOMeおよび過剰のα−ハロアセチル部分、たとえばクロロアセトンの存在下、エチルシアノ酢酸のエステル交換およびアルキル化で79%の収率で望ましいメチルエステル(3)を得た(図式IV)。ケトエステル(3)を81%の収率でアセタール(3)として保護した。ピリミジン(5)への新規環化方法を2当量のDBUで塩酸アミジン、たとえば塩酸ベンザミジンでおこない、54%の単離収率で5を得た。この方法はグアニジンでの環化の間NaOMeを使用する公表された状態を用いた20%より収率を改善した。ピロール−ピリミジン(6)への環化を78%の収率で水和HCl中でアセタールの脱保護を介して行った。還流での(6)のリン酸酸塩化物の反応で相当する4−クロロ派生物(7)を得た。135℃でのジメチルスルホキシド中のトランス−4−アミノシクロヘキサノールとのカップリングにより、(7)より57%で(1)を得た。当業者は、試薬の選択が、望ましい置換基R5を選択するのに高い柔軟性を与えることを認めるであろう。
【0190】
【化37】
5−メチルピロロピリミジンの特異的調製
還流中でのマロノニトリルおよびたとえばアセトンのような過剰ケトンのノーベンゲル濃縮で蒸留後50%の収率で8を得た。クロロホルム中ベンゾイルペルオキシドの存在下、N−ブロモスクシンイミドでの8の臭素化で、蒸留後、開始物質、モノ−(9)およびジ−臭素化産生物(5/90/5)を得た(70%)。混合液をたとえばα−メチルベンジルアミンなどのα−メチルアルキルアミンまたはα−メチルアリールアミンと反応させ、アミノピロール(10)を得た。短いシリカゲルカラムを通した後、部分的に精製したアミン(31%収率)をたとえば塩化ベンゾイルなどの酸塩化物でアシル化し、モノ−(11)およびジアシル化(12)ピロールを得、これをフラッシュクロマトグラフィーにて分離した。2置換ピロール(12)の酸加水分解でアシルピロール(11)対して29%の合計収率を得た。濃硫酸およびDMF存在下での環化で(13)を産出し(23%)、ポリリン酸で脱保護し(14)を得た。還流での(14)のリン酸酸塩化物との反応で相当する4−クロロ派生物(15)を得た。135℃でのジメチルスルホキシド中のトランス−4−アミノシクロヘキサノールとのカップリングで(14)より30%で(2)[R6=CH3]を得た(図式Vを参照のこと)。当業者は、試薬の選択が、望ましい置換基R6を選択するのに高い柔軟性を与えることを認識するであろう。
【0191】
【化38】
R 6 −置換ピロール、たとえば5−メチルピロロピリミジンへの他の合成経路 このR6−置換ピロール、たとえば5−メチルピロロピリミジンへの他の経路には(16)へのエチルシアノ酢酸のエステル交換およびアルキル化が伴う(図式VI)。(16)の2当量のDBUと塩酸ベンザミジンとの縮合でピリミジン(17)を産出した。ピロール−ピリミジン(14)への環化は水和HCl中のアセタールの脱保護を介して行う。還流での(14)のリン酸酸塩化物との反応で相当する4−クロロ派生物(15)を得た。135℃でのジメチルスルホキシド中のトランス−4−アミノシクロヘキサノールとのカップリングにより、2を得た。この手順は標的化合物(2)への合成反応の数を9から4工程へ減少させる。さらに、収率が劇的に改善される。また、当業者は、試薬の選択が、望ましい置換基R6を選択するのに高い柔軟性を与えることを認識するであろう。
【0192】
【化39】
des−メチルピロール
【化40】
への一般的なアプローチを以下の図式(図示VII)で描写する。
【0193】
【化41】
式中,R1からR3は上のように定義した。
【0194】
塩基の存在下、ジエチルアセタールでのアルキルシアノ酢酸のアルキル化でシアノジエチルアセテートを生成し、アミジン塩で処理してメチルピロールピリミジン前駆体を産出した。この前駆体を炭素化し、アミンで処理して上で示したようなdes−メチルピロロピリミジンを形成した。
【0195】
たとえば、図式VIIIは化合物(18)の合成を描写する。
【0196】
【化42】
商業的に入手可能なメチルシアノ酢酸を炭酸カリウムおよびNaI存在下において、ブロモアセトアルデヒドジエチルアセタールでアルキル化し、(19)を生成した。ピリミジン(20)への環化は2つの工程で行った。まず、ピリミジン−アセタールを2当量のDBUと塩酸ベンザミジンでの(19)の反応を介して形成させた。得られたピリミジン−アセタールを水和1N HClで精製することなしに脱保護し、得られたアルデヒドをピロール−ピリミジン(20)へ環化し、濾過により単離した。還流での(20)のリン酸酸塩化物との反応で相当する4−クロロ派生物(21)を得た。DMSO中135℃でのこのクロロ派生物とトランス−4−アミノシクロヘキサノールのカップリングにより化合物(21)から化合物(18)を得た。
【0197】
図式II−VIIIは、ピロロピリミジン環の5−および6−位を官能基化できることを例証している。異なる出発試薬および上記反応図式のわずかな変更を使用することで、様々な官能基を式(I)および(II)の5−および6−位に導入することができる。表2は幾つかの例を明示している。
【0198】
【表2】
本発明はさらに、さらなる制限としては解釈されない以下の実施例によって例示される。
【0199】
背景部分で引用したものを含む本明細書を通して引用された、係属中の特許明細書および開示された特許明細書のすべての参考文献の内容は、本明細書で参考により組み込んだ。実施例を
30通して使用したモデルは受諾されたモデルであり、それらのモデルでの効果の立証はヒトでの効果の予測となることを理解すべきである。
【0200】
【実施例】
調製1:
Seela及びLupkeのアルキル化の方法を部分的に変更したものを用いた。1MeOH(20mL)中のシアノ酢酸エチル(6.58g、58.1mmol)の氷冷した(0℃)溶液に、NaOMe(25%w/v;58.1mmol)溶液を徐々に添加した。10分後に、クロロアセトン(5mL;62.8mmol)を徐々に添加した。4時間後に、溶媒を除去した。褐色オイルをEtOAc(100mL)で希釈し、H2O(100mL)で洗浄した。有機相を乾燥させ、濾過し、濃縮して褐色オイル(7.79g;79%)を得た。オイル(3)(スキームIV)は、メチル/エチルエステル生成物の混合物(9/1)であり、それを更に精製することなく用いた。
1H NMR(200 MHz, CDCl3) δ4.24(q, J=7.2Hz, OCH2), 3.91(dd, 1H, J=7.2, 7.0Hz, CH), 3.62(s, 3H, OCH3), 3.42(dd, 1H, J=15.0, 7.1Hz, 1×CH2); 3.02(dd, 1H, J=15.0, 7.0Hz, 1×CH2); 2.44(s, 3H, CH3), 1.26(t, J=7.1Hz, エステル-CH3).
1Seela,F. ;Lupke,U. Chem. Ber. 1977, 110, 1462-1469。
【0201】
調製2:
Seela及びLupkeの方法を用いた。1TsOH(100mg)の存在下にてエチレングリコール(4mL、64.4mmol)を用いてケトン(3)(スキームIV;5.0g、32.2mmol)を保護し、フラッシュクロマトグラフィ(SiO2;3/7 EtOAc/Hex、Rf 0.35)をした後に、オイルとして(4)(スキームIV;5.2g、81.0)を得た。依然として〜5%のエチルエステルが含まれている。
1H NMR(200 MHz, CDCl3) δ4.24(q, J=7.2Hz, OCH2), 3.98(s, 4H, 2×アセタール-CH2), 3.79(s, 3H, OCH3), 3.62(dd, 1H, J=7.2, 7.0Hz, CH), 2.48(dd, 1H, J=15.0, 7.1Hz, 1×CH2), 2.32(dd, 1H, J=15.0, 7.0Hz, 1×CH2); 1.35(s, 3H, CH3),1.26(t, J=7.1Hz, エステル-CH3);
MS(ES): 200.1(M++1).
1Seela,F. ;Lupke,U. Chem. Ber. 1977, 110, 1462-1469。
【0202】
調製3:
乾燥したDMF(15mL)中のアセタール(4)(スキームIV、1g、5.02mmol)、ベンズアミジン(786mg、5.02mol)、及びDBU(1.5mL、10.04mmol)の溶液を85℃にて15時間加熱した。該混合物をCHCl3(30mL)で希釈し、0.5N NaOH(10mL)及びH2O(20mL)で洗浄した。有機層を乾燥させ、濾過し、濃縮して褐色オイルを得た。フラッシュクロマトグラフィ(SiO2;1/9 EtOAc/CH2Cl2、Rf 0.35)を試みたが、カラム中で該物質が結晶化した。シリカゲルをMeOHで洗浄した。生成物(5)(スキームIV)を含むフラクションを濃縮し、更に精製することなく用いた:
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ8.24(m, 2H, Ar-H),7.45(m, 3H, Ar-H),5.24(br s, 2H, NH2),3.98(s, 4H, 2×アセタール-CH2),3.60-3.15(m, 2H, CH2),1.38(s, 3H, CH3);
MS(ES): 288.1(M++1)。
【0203】
化合物(20)(スキームVIII)の調製:乾燥したDMF(20mL)中のアセタール(19)(4.43g、20.6mmol)1、ベンズアミン塩酸塩(3.22g、20.6mmol)、及びDBU(6.15mL、41.2mmol)の溶液を85℃にて15時間加熱した。該混合液をCHCl3100mLで希釈し、H2O(2×50mL)で洗浄した。有機相を乾燥させ、濾過し、濃縮して暗褐色オイルを得た。1N HCL(100mL)中にて該暗褐色オイルを室温にて2時間攪拌した。得られたスラリーを濾過して(20)のHCl塩を黄褐色固体(3.60g、70.6%)として得た;
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) 11.92(s, 1H), 8.05(m, 2H, Ar-H), 7.45(m, 3H, Ar-H), 7.05(s, 1H, ピロール-H);
MS(ES): 212.1(M++1)。
【0204】
調製4:
1N HCl(40mL)中のアセタール(5)(700mg、2.44mmol)の溶液をRTにて2時間攪拌した。得られたスラリーを濾過して、2−フェニル−6−メチル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オンのHCl塩を、黄褐色固体(498mg、78.0%)として得た:
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ11.78(s, 1H), 8.05(m, 2H, Ar-H), 7.45(m, 3H, Ar-H), 6.17(s, 1H, ピロール-H), 2.25(s, 3H, CH3);
MS(ES): 226.1(M++1)。
【0205】
調製5:
Chenらの環化の方法を部分的に変更したものを用いた。1イソプロピルアルコール(60mL)中の臭化物(9)(スキームV;20.0g、108mmol;90%純粋)の氷冷(0℃)した溶液に、α−メチルベンジルアミン(12.5mL、97.3mmol)を徐々に添加した。黒色溶液をRTに加温し、15時間攪拌した。該混合液をEtOAc(200mL)で希釈し、0.5N NaOH(50mL)で洗浄した。有機相を乾燥させ、濃縮して黒色タール(19.2g;94%)を得た。残渣をフラッシュクロマトグラフィ(SiO2;4/96 MeOH/CH2Cl2、Rf 0.35)により部分的に精製し、黒色固体(6.38g、31%)を化合物dl−1−(1−フェニルエチル)−2−アミノ−3−シアノ−4−メチルピロールとして得た:
MS(ES): 226.1(M++1)。
1Chen, Y. L.; Mansbach, R. S.; Winter, S. M.; Brooks, E.; Collins, J.; Corman, M. L.; Dunaiskis, A. R.; Faraci, W. S.; Gallaschun, R. J.; Schmidt, A.; Schulz; D. W. J. Med. Chem. 1997, 40, 1749-1754。
【0206】
調製6:
ジクロロメタン(50.0mL)中のdl−1−(1−フェニルエチル)−2−アミノ−3−シアノ−4,5−ジメチルピロール1(14.9g、62.5mmol)及びピリジン(10.0mL)の溶液に、塩化ベンゾイル(9.37g、66.7mmol)を0℃にて添加した。0℃にて1時間攪拌した後に、生成物沈殿の助力としてヘキサン(10.0mL)を添加した。真空中にて(in vacuo)溶媒を除去し、固体をEtOH/H2Oから再結晶させ、dl−1−(1−フェニルエチル)−2−フェニルカルボニルアミノ−3−シアノ−4,5−ジメチルピロール13.9g(65%)を得た。
mp:218-221℃;
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.72(s, 3H), 1.76(d, J=7.3Hz, 3H),1.98(s, 3H),5.52(q, J=7.3Hz, 1H),7.14-7.54(m, 9H),7.68-7.72(dd, J=1.4Hz, 6.9Hz, 2H),10.73(s, 1H);
MS(ES): 344.4(M++1).
1Liebigs Ann. Chem. 1986, 1485-1505。
【0207】
下記の化合物は、調製6と同様の方法で得られた。
dl−1−(1−フェニルエチル)−2−(3−ピリジル)カルボニルアミノ−3−シアノ−4,5−ジメチルピロール。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.83(d, J=6.8Hz, 3H), 2.02(s, 3H), 2.12(s, 3H), 5.50(q, J=6.8Hz, 1H), 7.14-7.42(m, 5H), 8.08(m, 2H), 8.75(m, 3H);
MS(ES): 345.2(M++1).
dl−1−(1−フェニルエチル)−2−(2−フリル)カルボニルアミノ−3−シアノ−4,5−ジメチルピロール。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.84(d, J=7.4Hz, 3H), 1.92(s, 3H), 2.09(s, 3H), 5.49(q, J=7.4Hz, 1H), 6.54(dd, J=1.8Hz, 3.6Hz, 1H), 7.12-7.47(m, 7H); MS(ES): 334.2(M++1), 230.1.
dl−1−(1−フェニルエチル)−2−(3−フリル)カルボニルアミノ−3−シアノ−4,5−ジメチルピロール。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.80(d, J=7Hz, 3H), 1.89(s, 3H), 2.05(s, 3H),5.48(q, J=7Hz, 1H), 6.59(s, 1H), 7.12-7.40(m, 6H), 7.93(s, 1H);
MS(ES): 334.1(M++1), 230.0.
dl−1−(1−フェニルエチル)−2−シクロペンチルカルボニルアミノ−3−シアノ−4,5−ジメチルピロール。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.82(d, J=7.4Hz, 3H), 1.88(s, 3H), 2.05(s, 3H), 1.63-1.85(m, 8H), 2.63(m, 1H), 5.43(q, J=7.4Hz, 1H), 6.52(s, 1H), 7.05-7.20(m,5H);
MS(ES): 336.3(M++1).
dl−1−(1−フェニルエチル)−2−(2−チエニル)カルボニルアミノ−3−シアノ−4,5−ジメチルピロール。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.82(d, J=6.8Hz, 3H), 1.96(s, 3H), 2.09(s, 3H),5.49(q, J=6.8Hz, 1H), 7.05-7.55(m, 8H);
MS(ES): 350.1(M++1), 246.0.
dl−1−(1−フェニルエチル)−2−(3−チエニル)カルボニルアミノ−3−シアノ−4,5−ジメチルピロール。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.83(d, J=7.0Hz, 3H), 1.99(s, 3H), 2.12(s, 3H), 5.49(q, J=7.0Hz, 1H), 6.90(m, 1H), 7.18-7.36(m, 6H), 7.79(m, 1H);
MS(ES): 350.2(M++1), 246.1.
dl−1−(1−フェニルエチル)−2−(4−フルオロフェニル)カルボニルアミノ−3−シアノ−4,5−ジメチルピロール。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.83(d, J=7.4Hz, 3H), 1.96(s, 3H), 2.08(s, 3H), 5.51(q, J=7.4Hz, 1H), 7.16-7.55(m, 9H);
MS(ES): 362.2(M++1), 258.1.
dl−1−(1−フェニルエチル)−2−(3−フルオロフェニル)カルボニルアミノ−3−シアノ−4,5−ジメチルピロール。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.83(d, J=7.4Hz, 3H), 1.97(s, 3H), 2.10(s, 3H), 5.50(q, J=7.4Hz, 1H), 7.05-7.38(m, 7H), 7.67-7.74(m, 2H);
MS(ES): 362.2(M++1), 258.1.
dl−1−(1−フェニルエチル)−2−(2−フルオロフェニル)カルボニルアミノ−3−シアノ−4,5−ジメチルピロール。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.85(d, J=7.2Hz, 3H), 1.94(s, 3H), 2.11(s, 3H), 5.50(q, J=7.2Hz, 1H), 7.12-7.35(m, 6H), 7.53(m, 1H), 7.77(m, 1H), 8.13(m, 1H);
MS(ES): 362.2(M++1), 258.0.
dl−1−(1−フェニルエチル)−2−イソプロピルカルボニルアミノ−3−シアノ−4,5−ジメチルピロール。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.19(d, J=7.0Hz, 6H), 1.82(d, J=7.2Hz, 3H), 1.88(s, 3H), 2.06(s, 3H), 2.46(m, 1H), 5.39(m, J=7.2Hz, 1H), 6.64(s, 1H), 7.11-7.36(m, 5H);
MS(ES): 310.2(M++1), 206.1.
dl−1−(1−フェニルエチル)−2−アミノ−3−シアノ−4−メチルピロールのアシル化に関しては、モノアシル化されたdl−1−(1−フェニルエチル)−2−ベンゾイルアミノ−3−シアノ−4−ジメチルピロール及びジアシル化されたピロールであるdl−1−(1−フェニルエチル)−2−ジベンゾイルアミノ−3−シアノ−4−メチルピロールが得られた。
【0208】
モノアシル化されたピロール:
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ7.69(d, 2H, J=7.8Hz, Ar-H), 7.58-7.12(m, 8H, Ar-H), 6.18(s, 1H, ピロール-H), 5.52(q, 1H, J=7.2Hz, CH-CH3), 2.05(s, 3H, ピロール-CH3), 1.85(d, 3H, J=7.2Hz, CH-CH 3);
MS(ES): 330.2(M++1);
ジアシル化されたピロール:
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ7.85(d, 2H, J=7.7Hz, Ar-H), 7.74(d, 2H, J=7.8Hz, Ar-H), 7.52-7.20(m, 9H, Ar-H), 7.04(m, 2H, Ar-H), 6.21(s, 1H, ピロール-H), 5.52(q, 1H, J=7.2Hz, CH-CH3), 1.77(d, 3H, J=7.2Hz, CH-CH 3), 1.74(s, 3H, ピロール-CH3);
MS(ES): 434.1(M++1)。
【0209】
調製7:
メタノール(10.0mL)中のdl−1−(1−フェニルエチル)−2−フェニルカルボキシアミド−3−シアノ−4,5−ジメチルピロール(1.0g、2.92mmol)の溶液に、濃硫酸(1.0mL)を0℃にて添加した。得られた混合液を15時間還流させ、室温にまで冷却した。沈殿物を濾過し、dl−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−7−(1−フェニルエチル)ピロロ[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オン0.48g(48%)を得た。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ2.02(d, J=7.4Hz, 3H), 2.04(s, 3H), 2.41(s, 3H), 6.25(q, J=7.4Hz, 1H), 7.22-7.50(m, 9H), 8.07-8.12(dd, J=3.4Hz, 6.8Hz, 2H), 10.51(s, 1H);
MS(ES): 344.2(M++1).
下記の化合物は、調製7と同様の方法にて得られた。
dl−5,6−ジメチル−2−(3−ピリジル)−7H−7−(1−フェニルエチル)ピロロ[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ2.03(d, J=7.2Hz, 3H), 2.08(s, 3H), 2.42(s, 3H), 6.24(q, J=7.2Hz, 1H), 7.09-7.42(m, 5H), 8.48(m, 2H), 8.70(m, 3H);
MS(ES): 345.1(M++1).
dl−5,6−ジメチル−2−(2−フリル)−7H−7−(1−フェニルエチル)ピロロ[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.98(d, J=7.8Hz, 3H), 1.99(s, 3H), 2.37(s, 3H), 6.12(q, J=7.8Hz, 1H), 6.48(dd, J=1.8Hz, 3.6Hz, 1H), 7.17-7.55(m, 7H), 9.6(s, 1H);
MS(ES): 334.2(M++1).
dl−5,6−ジメチル−2−(3−フリル)−7H−7−(1−フェニルエチル)ピロロ[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.99(d, J=7Hz, 3H), 2.02(s, 3H), 2.42(s, 3H), 6.24(q, J=7Hz, 1H), 7.09(s, 1H), 7.18-7.32(m, 5H), 7.48(s, 1H), 8.51(s, 1H);
MS(ES): 334.2(M++1).
dl−5,6−ジメチル−2−シクロペンチル−7H−7−(1−フェニルエチル)ピロロ[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.95(d, J=7.4Hz, 3H), 2.00(s, 3H), 2.33(s, 3H), 1.68-1.88(m, 8H), 2.97(m, 1H), 6.10(q, J=7.4Hz, 1H), 7.16-7.30(m, 5H),9.29(s, 1H);
MS(ES): 336.3(M++1).
dl−5,6−ジメチル−2−(2−チエニル)−7H−7−(1−フェニルエチル)ピロロ[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ2.02(d, J=7.2Hz, 3H), 2.06(s, 3H), 2.41(s, 3H), 6.13(q, J=7.2Hz, 1H), 7.12(dd, J=4.8, 2.8Hz, 1H), 7.26-7.32(m, 5H) ,7.44(d, J=4.8Hz, 1H), 8.01(d, J=2.8Hz, 1H), 11.25(s, 1H);
MS(ES): 350.2(M++1).
dl−5,6−ジメチル−2−(3−チエニル)−7H−7−(1−フェニルエチル)ピロロ[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ2.00(d, J=7.4Hz, 3H), 2.05(s, 3H), 2.43(s, 3H), 6.24(q, J=7.4Hz, 1H), 7.24-7.33(m, 5H), 7.33-7.39(m, 1H), 7.85(m, 1H),8.47(m, 1H), 12.01(s, 1H);
MS(ES): 350.2(M++1).
dl−5,6−ジメチル−2−(4−フルオロフェニル)−7H−7−(1−フェニルエチル)ピロロ[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ2.01(d, J=6.8Hz, 3H), 2.05(s, 3H), 2.42(s, 3H), 6.26(q, J=6.8Hz, 1H), 7.12-7.36(m, 7H), 8.23-8.30(m, 2H), 11.82(s, 1H);
MS(ES): 362.3(M++1).
dl−5,6−ジメチル−2−(3−フルオロフェニル)−7H−7−(1−フェニルエチル)ピロロ[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ2.02(d, J=7.4Hz, 3H), 2.06(s, 3H), 2.44(s, 3H), 6.29(q, J=7.4Hz, 1H), 7.13-7.51(m, 7H), 8.00-8.04(m, 2H), 11.72(s, 1H);
MS(ES): 362.2(M++1).
dl−5,6−ジメチル−2−(2−フルオロフェニル)−7H−7−(1−フェニルエチル)ピロロ[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ2.00(d, J=7.2Hz, 3H), 2.05(s, 3H), 2.38(s, 3H), 6.24(q, J=7.2Hz, 1H), 7.18-7.45(m, 8H), 8.21(m, 1H), 9.54(s, 1H);
MS(ES): 362.2(M++1).
dl−5,6−ジメチル−2−イソプロピル−7H−7−(1−フェニルエチル)ピロロ[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.30(d, J=6.8Hz, 3H), 1.32(d, J=7.0Hz, 3H), 2.01(s, 3H), 2.34(s, 3H), 2.90(m, 1H), 6.13(m, 1H), 7.17-7.34(m, 5H), 10.16(s, 1H);
MS(ES): 310.2(M++1)。
【0210】
調製8:
DMF(13mL)中の濃H2SO4(1mL)を有するdl−1−(1−フェニルエチル)−2−ベンゾイルアミノ−3−シアノ−4−ジメチルピロール(785mg、2.38mmol)の溶液を130℃にて48時間攪拌した。黒色溶液をCHCl3(100mL)で希釈し、1N NaOH(30mL)及び塩水(30mL)で洗浄した。有機相を乾燥させ、濾過し、濃縮して、フラッシュカラムクロマトグラフィ(SiO2;8/2 EtOAc/Hex、Rf 0.35)により精製し、褐色固体(184mg、24%)をdl−5−メチル−2−フェニル−7H−7−(1−フェニルエチル)ピロロ[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オンとして得た。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ8.18(m, 2H, Ar-H), 7.62-7.44(m, 3H, Ar-H), 7.40-7.18(m, 5H, Ar-H), 6.48(s, 1H, ピロール-H), 6.28(q, 1H, J=7.2Hz, CH-CH3), 2.18(s, 3H, ピロール-CH3), 2.07(d, 3H, J=7.2Hz, CH-CH 3);
MS(ES): 330.2(M++1)。
【0211】
調製9:
dl−1−(1−フェニルエチル)−2−アミノ−3−シアノ−4,5−ジメチルピロール(9.60g、40.0mmol)及びギ酸(50.0mL、98%)の混合物を5時間還流させた。室温にまで冷却し、フラスコの側面を引っかいた後に、多量の沈殿物が形成し、それを濾過した。洗浄液が中性のpHを示すまで該物質を水で洗浄し、dl−5,6−ジメチル−7H−7−(1−フェニルエチル)ピロロ[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オンを得た。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.96(d, J=7.4Hz, 3H), 2.00(s, 3H), 2.38(s, 3H), 6.21(q, J=7.4Hz, 1H), 7.11-7.35(m, 5H), 7.81(s, 1H), 11.71(s,1H);
MS(ES): 268.2(M++1)。
【0212】
調製10:
dl−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−7−(1−フェニルエチル)ピロロ[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オン(1.0g、2.91mmol)を、ポリリン酸(30.0mL)に懸濁させた。該混合物を100℃にて4時間加熱した。その熱い溶液を氷水に注ぎ、強攪拌させて懸濁液を分散させ、固体KOHを用いてpH6にまで塩基性化した。得られた固体を濾過して収集し、5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オン0.49g(69%)を得た。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.17(s, 3H), 2.22(s, 3H), 7.45(br, 3H), 8.07(br, 2H), 11.49(s, 1H), 11.82(s, 1H);
MS(ES): 344.2(M++1)。
【0213】
下記の化合物は、調製10と同様の方法にて得られた。
5−メチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オン。MS(ES): 226.0(M++1).
5,6−ジメチル−2−(3−ピリジル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オン。
MS(ES): 241.1(M++1).
5,6−ジメチル−2−(2−フリル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.13(s, 3H), 2.18(s, 3H), 6.39(dd, J=1.8, 3.6Hz, 1H), 6.65(dd, J=1.8Hz, 3.6Hz, 1H), 7.85(dd, J=1.8, 3.6Hz, 1H), 11.45(s, 1H), 11.60(s, 1H);
MS(ES): 230.1(M++1).
5,6−ジメチル−2−(3−フリル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.14(s, 3H), 2.19(s, 3H), 6.66(s, 1H), 7.78(s, 1H), 8.35(s, 1H), 11.3(s, 1H), 11.4(s, 1H);
MS(ES): 230.1(M++1).
5,6−ジメチル−2−シクロペンチル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ1.57-1.91(m, 8H), 2.12(s, 3H), 2.16(s, 3H), 2.99(m, 1H), 11.24(s, 1H), 11.38(s, 1H);
MS(ES): 232.2(M++1).
5,6−ジメチル−2−(2−チエニル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.14(s, 3H), 2.19(s, 3H), 7.14(dd, J=3.0, 5.2Hz, 1H), 7.70(d, J=5.2Hz, 1H), 8.10(d, J=3.0Hz, 1H), 11.50(s, 1H);
MS(ES): 246.1(M++1).
5,6−ジメチル−2−(3−チエニル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.17(s, 3H), 2.21(s, 3H), 7.66(m, 1H), 7.75(m, 1H), 8.43(m, 1H), 11.47(s, 1H), 11.69(s, 1H);
MS(ES): 246.1(M++1).
5,6−ジメチル−2−(4−フルオロフェニル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.17(s, 3H), 2.21(s, 3H), 7.31(m, 2H), 8.12(m, 2H), 11.47(s, 1H);
MS(ES): 258.2(M++1).
5,6−ジメチル−2−(3−フルオロフェニル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オン。
1H NMR(200MHz,DMSO-d6) δ2.18(s, 3H), 2.21(s, 3H), 7.33(m, 1H), 7.52(m, 1H), 7.85-7.95(m, 2H), 11.56(s, 1H), 11.80(s, 1H);
MS(ES): 258.1(M++1).
5,6−ジメチル−2−(2−フルオロフェニル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.18 (s, 3H), 2.22(s, 3H), 7.27-7.37(m, 2H), 7.53(m, 1H), 7.68(m, 1H), 11.54(s, 1H), 11.78(s, 1H);
MS(ES): 258.1(M++1).
5,6−ジメチル−2−イソプロピル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ1.17(d, J=6.6Hz, 6H), 2.11(s, 3H), 2.15(s, 3H), 2.81(m, 1H), 11.20(s, 1H), 11.39(s, 1H);
MS(ES): 206.1(M++1).
5,6−ジメチル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.13(s, 3H), 2.17(s, 3H), 7.65(s, 1H);
MS(ES): 164.0(M++1)。
【0214】
調製11:
オキシ塩化リン(25.0mL)中の5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン−4(3H)−オン(1.0g、4.2mmol)の溶液を6時間還流させ、次に真空中で濃縮乾固させた。残渣に水を添加し、結晶化させ、得られた固体を濾過して収集し、4−クロロ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン0.90g(83%)を得た。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.33(s, 3H), 2.33(s, 3H), 7.46-7.49(m, 3H), 8.30-8.35(m, 2H), 12.20(s, 1H);
MS(ES): 258.1(M++1)。
【0215】
下記の化合物は、調製11と同様の方法にて得られた。
4−クロロ−5−メチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
MS(ES): 244.0(M++1).
4−クロロ−6−メチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
MS(ES): 244.0(M++1).
4−クロロ−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) 8.35(2,2H), 7.63(br s, 1H), 7.45(m, 3H), 6.47(br s, 1H);
MS(ES): 230.0(M++1).
4−クロロ−5,6−ジメチル−2−(3−ピリジル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
MS(ES): 259.0(M++1).
4−クロロ−5,6−ジメチル−2−(2−フリル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.35(s, 3H), 2.35(s, 3H), 6.68(dd, J=1.8, 3.6Hz, 1H), 7.34(dd, J=1.8Hz, 3.6Hz, 1H), 7.89(dd, J=1.8, 3.6Hz, 1H);
MS(ES): 248.0(M++1).
4−クロロ−5,6−ジメチル−2−(3−フリル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.31(s, 3H), 2.31(s, 3H), 6.62(s, 1H), 7.78(s, 1H), 8.18(s, 1H), 12.02(s, 1H);
MS(ES): 248.1(M++1).
4−クロロ−5,6−ジメチル−2−シクロペンチル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ1.61-1.96(m, 8H), 2.27(s, 3H), 2.27(s, 3H), 3.22(m, 1H), 11.97(s, 1H);
MS(ES): 250.1(M++1).
4−クロロ−5,6−ジメチル−2−(2−チエニル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.29(s, 3H), 2.31(s, 3H), 7.14(dd, J=3.1Hz, 4.0Hz, 1H), 7.33(d, J=4.9Hz, 1H), 7.82(d, J=3.1Hz, 1H), 12.19(s, 1H);
MS(ES): 264.1(M++1).
4−クロロ−5,6−ジメチル−2−(3−チエニル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.32(s, 3H), 2.32(s, 3H), 7.62(dd, J=3.0Hz, 5.2Hz, 1H), 7.75(d, J=5.2Hz, 1H), 8.20(d, J=3.0Hz, 1H);
MS(ES): 264.0(M++1).
4−クロロ−5,6−ジメチル−2−(4−フルオロフェニル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.33(s, 3H), 2.33(s, 3H), 7.30(m, 2H), 8.34(m, 2H), 12.11(s, 1H);
MS(ES): 276.1(M++1).
4−クロロ−5,6−ジメチル−2−(3−フルオロフェニル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
【0216】
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.31(s, 3H), 2.33(s, 3H), 7.29(m, 1H), 7.52(m, 1H), 7.96(m, 1H), 8.14(m, 1H), 11.57(s, 1H);
MS(ES): 276.1(M++1).
4−クロロ−5,6−ジメチル−2−(2−フルオロフェニル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.34(s, 3H), 2.34(s, 3H), 7.33(m, 2H), 7.44(m, 1H), 7.99(m, 1H), 12.23(s, 1H);
MS(ES): 276.1(M++1).
4−クロロ−5,6−ジメチル−2−イソプロピル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ1.24(d, J=6.6Hz, 6H), 2.28(s, 3H), 2.28(s, 3H), 3.08(q, J=6.6Hz, 1H), 11.95(s, 1H);
MS(ES): 224.0(M++1).
4−クロロ−5,6−ジメチル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ2.31(s, 3H), 2.32(s, 3H), 8.40(s, 1H);
MS(ES): 182.0(M++1).
dl−4−クロロ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−7−(1−フェニルエチル)ピロロ[2,3d]ピリミジン。
【0217】
調製12:
ジオキサン(100.0mL)及び水(100.0mL)中のdl−1,2−ジアミノプロパン(1.48g、20.0mmol)及び炭酸ナトリウム(2.73g、22.0mmol)の溶液に、ジ−tert−ジカーボネート(4.80g、22.0mmol)を室温にて添加した。得られた混合液を14時間攪拌した。真空中にてジオキサンを除去した。沈殿物を濾過して取り除き、濾液を真空中で濃縮乾固した。EtOAcとともに残渣を砕き、次いで濾過した。該濾液を真空中にて濃縮乾固し、dl−1−アミノ−2−(1,1−ジメチルエトキシ)カルボニルアミノ−プロパン及びdl−2−アミノ−1−(1,1−ジメチルエトキシ)カルボニルアミノ−プロパンの混合物を得、それらは標準的なクロマトグラフィ法によって分離しなかった。該混合物は例8の反応に用いられる。
【0218】
調製13:
ジクロロメタン(20.0mL)中のFmoc−β−Ala−OH(1.0g、3.212mmol)及び塩化オキサリル(0.428g、0.29mL、3.373mmol)の溶液に、0℃にてN,N−ジメチルホルムアミド数滴を添加した。該混合液を室温にて1時間攪拌し、次にシクロプロピルメチルアミン(0.229g、0.28mL、3.212mmol)及びトリエチルアミン(0.65g、0.90mL、6.424mmol)を添加した。10分後、該混合液を1M 塩酸(10.0mL)で処理し、該水性混合物をジクロロメタン(3×30.0mL)で抽出した。真空中にて有機相を濃縮乾固した。N,N−ジメチルホルムアミド(20.0mL)中の20%ピペリジン溶液で、残渣を0.5時間処理した。真空中にて溶媒を除去した後に、残渣を1M 塩酸(20.0m)及び酢酸エチル(20.0mL)で処理した。該混合物を分離させ、固体水酸化ナトリウムを用いて水相をpH8にまで塩基性化した。沈殿物を濾過して取り除き、20%ピペリジンを用いて溶出させるイオン交換カラムに水溶液を通して、N−シクロプロピルメチルβ−アラニンアミド0.262g(57%)を得た。
1H NMR(200MHz, CD3OD) δ0.22(m, 2H), 0.49(m, 2H), 0.96(m, 2H), 2.40(t, 2H), 2.92(t, 2H), 3.05(d, 2H);
MS(ES): 143.1(M++1)。
【0219】
調製14:
N−tert−ブトキシカルボニル−トランス−1,4−シクロヘキシルジアミン。
ジクロロメタン(100mL)中にトランス−1,4−シクロヘキシルジアミン(6.08g、53.2mmol)を溶解させた。ジ−t−ブチルジカーボネートの溶液(ジクロロメタン40mL中に2.32g、10.65mmol)を、カニューレ(cannula)を通して添加した。20時間後、該反応液をCHCl3及び水で分配させた。相を分離し、水相をCHCl3(3×)で抽出した。有機相を合わせてMgSO4で乾燥させ、濾過し、濃縮して白色固体1.20g(53%)を得た。
1H NMR(200MHz, CDCl3): δ1.0-1.3(m, 4H), 1.44(s, 9H), 1.8-2.1(m, 4H), 2.62(brm, 1H), 3.40(brs, 1H), 4.37(brs, 1H0);
MS(ES): 215.2(M++1)。
【0220】
4−(N−アセチル)−N−tert−ブトキシカルボニル−トランス−1,4−シクロヘキシルジアミン。
ジクロロメタン(20mL)中にN−tert−ブトキシカルボニル−トランス−1,4−シクロヘキシルジアミン(530mg、2.47mmol)を溶解させた。無水酢酸(250mg、2.60mmol)を滴下した。16時間後、該反応液を水及びCHCl3で希釈した。相を分離し、水相をCHCl3(3×)で抽出した。有機相を合わせてMgSO4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。再結晶(EtOH/H2O)を行い、白色結晶190mg(30%)を得た。
1H NMR(200MHz, CDCl3): δ0.9-1.30(m, 4H), 1.43(s, 9H), 1.96-2.10(m, 7H), 3.40(brs, 1H), 3.70(brs, 1H), 4.40(brs, 1H), 4.40(brs, 1H);
MS(ES): 257.2(M++1), 242.1(M+-15), 201.1(M+-56)。
【0221】
4−(4−トランス−アセトアミドシクロヘキシル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−(1−フェニルエチル)ピロロ[2,3d]ピリミジン。
ジクロロメタン(5mL)中に4−(N−アセチル)−N−tert−ブトキシカルボニル−トランス−1,4−シクロヘキシルジアミン(190mg、0.74mmol)を溶解させ、TFA(6mL)で希釈した。16時間後、該反応液を濃縮した。粗の固体、DMSO(2mL)、NaHCO3(200mg、2.2mmol)及び4−クロロ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン(35mg、0.14mmol)をフラスコ内で混合し、130℃に加熱した。4.5時間後、該反応液を室温に冷却し、EtOAc及び水で希釈した。相を分離し、水相をEtOAc(3×)で抽出した。有機相を合わせてMgSO4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。クロマトグラフィ(シリカ分取用プレート;20:1 CHCl3:EtOH)を行い、黄褐色固体0.3mg(収率1%)を得た。
MS(ES): 378.2(M++1)。
【0222】
4−(N−メタンスルホニル)−N−tert−ブトキシカルボニル−トランス−1,4−シクロヘキシルジアミン。
ジクロロメタン(200mL)中にトランス−1,4−シクロヘキシルジアミン(530mg、2.47mmol)を溶解させ、ピリジン(233mg、3.0mmol)で希釈した。メタンスルホニルクロリド(300mg、2.60mmol)を滴下した。16時間後、該反応液を水及びCHCl3で希釈した。相を分離し、水相をCHCl3(3×)で抽出した。有機相を合わせてMgSO4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。再結晶(EtOH/H2O)を行い、白色結晶206mg(29%)を得た。
1H NMR(200MHz, CDCl3): δ1.10-1.40(m, 4H), 1.45(s, 9H), 2.00-2.20(m, 4H), 2.98(s, 3H), 3.20-3.50(brs, 2H), 4.37(brs, 1H);
MS(ES): 293.1(M++1), 278.1(M+-15), 237.1(M+-56)。
【0223】
4−(4−トランス−メタンスルファミドシクロヘキシル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−(1−フェニルエチル)ピロロ[2,3d]ピリミジン。
ジクロロメタン(5mL)中に4−(N−スルホニル)−N−tert−ブトキシカルボニル−トランス−1,4−シクロヘキシルジアミン(206mg、0.71mmol)を溶解させ、TFA(6mL)で希釈した。16時間後、該反応液を濃縮した。粗の反応混合物、DMSO(2mL)、NaHCO3(100mg、1.1mmol)及び1−クロロ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジンをフラスコ内で混合し、130℃にて加熱した。15時間後に、該反応液を室温に冷却し、EtOAc(3×)で希釈した。有機相を合わせてMgSO4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。クロマトグラフィ(シリカ分取用プレート、20:1 CHCl3/EtOH)を行い、黄褐色固体2.6mg(収率5%)を得た。
MS(ES): 414.2(M++1)。
【0224】
例1:メチルスルホキシド(10.0mL)中の4−クロロ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン(0.50g、1.94mmol)及び4−トランス−ヒドロキシシクロヘキシルアミン(2.23g、19.4mmol)を130℃にて5時間加熱した。室温にまで冷却した後に、水(100mL)を添加し、得られた水溶液をEtOAc(3×10.0mL)で抽出した。EtOAc溶液を合わせて、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濾液を真空中にて濃縮乾固し、残渣に対しシリカゲルクロマトグラフィを行い、4−(4−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン0.49g(75%)を得た。mp 197-199℃;
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.25-1.59(m, 8H), 2.08(s, 3H), 2.29(s, 3H), 3.68-3.79(m, 1H), 4.32-4.38(m, 1H), 4.88(d, J=8Hz, 1H), 7.26-7.49(m, 3H), 8.40-8.44(dd, J=2.2, 8Hz, 2H), 10.60(s, 1H);
MS(ES): 337.2(M++1)。
【0225】
下記の化合物は、例1と同様の方法にて得られた。
4−(4−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ−6−メチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ11.37(s, 1H, ピロール-NH), 8.45(m, 2H, Ar-H), 7.55(m, 3H, Ar-H), 6.17(s, 1H, ピロール-H), 4.90(br d, 1H, NH), 4.18(m, 1H, CH-O), 3.69(m, 1H, CH-N), 2.40-2.20(m, 2H), 2.19-1.98(m, 2H), 2.25(s, 3H, CH3), 1.68-1.20(m, 4H);
MS(ES): 323.2(M++1)。
【0226】
4−(4−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ−5−メチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ11.37(s, 1H, ピロール-NH), 8.40(m, 2H, Ar-H), 7.45(m, 3H, Ar-H), 5.96(s, 1H, ピロール-H), 4.90(br d, 1H, NH), 4.18(m, 1H, CH-O), 3.69(m, 1H, CH-N), 2.38-2.20(m, 2H), 2.18-1.98(m, 2H), 2.20(s, 3H ,CH3), 1.68-1.20(m, 4H);
MS(ES): 323.2(M++1)。
【0227】
4−(4−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
mp: 245.5-246.5℃;
1H NMR(200MHz, CD3OD) δ8.33(m, 2H, Ar-H), 7.42(m, 3H, Ar-H), 7.02(d, 1H, J=3.6Hz, ピロール-H), 6.53(d, 1H, J=3.6Hz, ピロール-H), 4.26(m, 1H, CH-O), 3.62(m, 1H, CH-N), 2.30-2.12(m, 2H), 2.12-1.96(m, 2H), 1.64-1.34(m, 4H);
MS, M+1= 309.3;
元素分析(C18H20N4O)C,H,N。
【0228】
4−(4−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ−5,6−ジメチル−2−(3−ピリジル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.21-1.54(m, 8H); 2.28(s, 3H); 2.33(s, 3H); 3.70(m, 1H), 4.31(m, 1H), 4.89(d, 1H), 7.40(m, 1H), 8.61(m, 2H), 9.64(m, 1H);
MS(ES): 338.2(M++1)。
【0229】
4−(4−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ−5,6−ジメチル−2−(2−フリル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.26-1.64(m, 8H), 2.22(s, 3H), 2.30(s, 3H), 3.72(m, 1H), 4.23(m, 1H), 4.85(d, 1H), 6.52(m, 1H), 7.12(m, 1H), 7.53(m, 1H), 9.28(s, 1H);
MS(ES): 327.2(M++1)。
【0230】
4−(4−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ−5,6−ジメチル−2−(3−フリル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.25-1.63(m, 8H), 2.11(s, 3H), 2.27(s, 3H), 3.71(m, 1H), 4.20(m, 1H), 4.84(d, 1H), 7.03(m, 1H), 7.45(m, 1H), 8.13(m, 1H), 10.38(m, 1H);
MS(ES): 327.2(M++1)。
【0231】
4−(4−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ−5,6−ジメチル−2−シクロペンチル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.26-2.04(m, 16H), 2.26(s, 3H), 2.27(s, 3H), 3.15(m, 1H), 3.70(m, 1H), 4.12(m, 1H), 4.75(d, 1H);
MS(ES): 329.2(M++1)。
【0232】
4−(4−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ−5,6−ジメチル−2−(2−チエニル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.28-1.59(m, 8H), 2.19(s, 3H), 2.29(s, 3H), 3.74(m, 1H), 4.19(m, 1H), 4.84(d, 1H), 7.09(m, 1H), 7.34(m, 1H), 7.85(m, 1H), 9.02(s, 1H);
MS(ES): 343.2(M++1)。
【0233】
4−(4−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ−5,6−ジメチル−2−(3−チエニル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.21-1.60(m, 8H), 1.98(s, 3H), 2.23(s, 3H), 3.66(m, 1H), 4.22(m, 1H), 7.27(m, 1H), 7.86(m, 1H), 8.09(m, 1H), 11.23(s, 1H);
MS(ES): 343.2(M++1)。
【0234】
4−(4−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ−5,6−ジメチル−2−(4−フルオロフェニル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.26-1.66(m, 8H), 1.94(s, 3H), 2.28(s, 3H), 3.73(m, 1H), 4.33(m, 1H), 4.92(d, 1H), 7.13(m, 2H), 8.41(m, 2H), 11.14(s, 1H);
MS(ES): 355.2(M++1)。
【0235】
4−(4−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ−5,6−ジメチル−2−(3−フルオロフェニル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.26-1.71(m, 8H), 2.06(s, 3H), 2.30(s, 3H), 3.72(m, 1H), 4.30(m, 1H), 4.90(d, 1H), 7.09(m, 1H), 7.39(m, 1H), 8.05(m, 1H), 8.20(m, 1H), 10.04(s, 1H);
MS(ES): 355.2(M++1)。
【0236】
4−(4−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ−5,6−ジメチル−2−(2−フルオロフェニル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.30-1.64(m, 8H), 2.17(s, 3H), 2.31(s, 3H), 3.73(m, 1H),4.24(m, 1H), 4.82(d, 1H), 7.28(m, 2H), 8.18(m, 1H), 9.02(m, 1H), 12.20(s, 1H);
MS(ES): 355.3(M++1)。
【0237】
4−(4−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ−5,6−ジメチル−2−イソプロピル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.31(d, J=7.0Hz, 6H), 1.30-1.65(m, 8H), 2.27(s, 3H), 2.28(s, 3H), 3.01(m, J=7.0Hz, 1H), 3.71(m, 1H), 4.14(m, 1H), 4.78(d, 1H);
MS(ES): 303.2(M++1)。
【0238】
dl−4−(2−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ−5,6−ジメチル−2−イソプロピル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) d 1.31-1.42(br, 4H), 1.75-1.82(br, 4H), 2.02(s, 3H), 2.29(s, 3H), 3.53(m, 1H), 4.02(m, 1H), 5.08(d, 1H), 7.41-7.48(m, 3H), 8.30(m, 2H), 10.08(s, 1H);
MS(ES): 337.2(M++1)。
【0239】
4−(3,4−トランス−ジヒドロキシシクロヘキシル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
MS(ES): 353.2(M++1)。
【0240】
4−(3,4−シス−ジヒドロキシシクロヘキシル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
MS(ES): 353.2(M++1)。
【0241】
4−(2−アセチルアミノエチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
mp 196-199℃;
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.72(s, 3H), 1.97(s, 3H), 2.31(s,3H), 3.59(m, 2H), 3.96(m, 2H), 5.63(br, 1H), 7.44-7.47(m, 3H), 8.36-8.43(dd, J=1Hz, 7Hz, 2H), 10.76(s, 1H);
MS(ES): 324.5(M++1)。
【0242】
dl−4−(2−トランス−ヒドロキシシクロペンチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。1
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.62(m, 2H), 1.79(br, 4H), 1.92(s, 3H), 2.29(s, 3H), 4.11(m, 1H), 4.23(m, 1H), 5.28(d, 1H), 7.41-7.49(m,3H), 8.22(m, 2H), 10.51(s, 1H);
MS(ES): 323.2(M++1)。
12−トランス−ヒドロキシシクロペンチルアミンの調製に関して、PCT 9417090を参照。
【0243】
dl−4−(3−トランス−ヒドロキシシクロペンチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。1
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.58-1.90(br, 6H), 2.05(s, 3H), 2.29(s, 3H), 4.48-4.57(m, 1H), 4.91-5.01(m, 2H), 7.35-7.46(m, 3H), 8.42-8.47(m, 2H), 10.11(s, 1H);
MS(ES): 323.2(M++1)。
13−トランス−ヒドロキシシクロペンチルアミンの調製に関して、EP-A-322242を参照。
【0244】
dl−4−(3−シス−ヒドロキシシクロペンチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。1
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.82-2.28(br, 6H), 2.02(s, 3H), 2.30(s, 3H), 4.53-4.60(m, 1H), 4.95-5.08(m, 1H), 5.85-5.93(d, 1H), 7.35-7.47(m, 3H), 8.42-8.46(m, 2H), 10.05(s, 1H);
MS(ES): 323.2(M++1)。
13−シス−ヒドロキシシクロペンチルアミンの調製に関して、EP-A-32242を参照。
【0245】
4−(3,4−トランス−ジヒドロキシシクロヘキシル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。1
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.92-1.99(br, 2H), 2.14(s, 3H), 2.20(br, 2H), 2.30(s, 3H), 2.41-2.52(br, 2H), 4.35(m, 2H), 4.98(m, 2H), 7.38-7.47(m, 3H), 8.38-8.42(m, 2H), 9.53(s, 1H);
MS(ES): 339.2(M++1)。
13,4−トランス−ジヒドロキシシクロペンチルアミンの調製に関して、PCT 9417090を参照。
【0246】
4−(3−アミノ−オキソプロピル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ2.02(s, 3H), 2.29(s, 3H), 2.71(t, 2H), 4.18(m, 2H), 5.75-5.95(m, 3H), 7.38-7.48(m, 3H), 8.37-8.41(m, 2H), 10.42(s, 1H);
MS(ES): 310.1(M++1)。
【0247】
4−(3−N−シクロプロピルメチルアミノ−3−オキソプロピル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CD3OD) δ0.51(q, 2H), 0.40(q, 2H), 1.79-1.95(br, 1H), 2.36(s, 3H), 2.40(s, 3H), 2.72(t, 2H), 2.99(d, 2H), 4.04(t, 2H), 7.58-7.62(m, 3H), 8.22-8.29(m, 2H);
MS(ES): 364.2(M++1)。
【0248】
4−(2−アミノ−オキソエチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CD3OD) δ2.31(s, 3H), 2.38(s, 3H), 4.26(s, 2H), 7.36(m, 3H), 8.33(m, 2H);
MS(ES): 396.1(M++1)。
【0249】
4−(2−N−メチルアミノ−2−オキソエチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.99(s, 3H), 2.17(s, 3H), 2.82(d, 3H), 4.39(d, 2H), 5.76(t, 1H), 6.71(br, 1H), 7.41-7.48(m, 3H), 8.40(m, 2H), 10.66(s, 1H);
MS(ES): 310.1(M++1)。
【0250】
4−(3−tert−ブチルオキシル−3−オキソプロピル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.45(s, 9H), 1.96(s, 3H), 2.29(s, 3H), 2.71(t, 2H), 4.01(q, 2H), 5.78(t, 1H), 7.41-7.48(m, 3H), 8.22-8.29(m, 2H);
MS(ES): 367.2(M++1)。
【0251】
4−(2−ヒドロキシエチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.92(s, 3H), 2.29(s, 3H), 3.81-3.98(br, 4H), 5.59(t, 1H), 7.39-7.48(m, 3H), 8.37(m, 2H), 10.72(s, 1H);
MS(ES): 283.1(M++1)。
【0252】
4−(3−ヒドロキシプロピル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.84(m, 2H), 1.99(s, 3H), 2.32(s, 3H), 3.62(t, 2H), 3.96(m, 2H), 3.35(t, 1H), 7.39-7.48(m, 3H), 8.36(m, 2H), 10.27(s, 1H);
MS(ES): 297.2(M++1)。
【0253】
4−(4−ヒドロキシブチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.71-1.82(m, 4H), 1.99(s, 3H), 2.31(s, 3H), 3.68-3.80(m, 4H), 5.20(t, 1H), 7.41-7.49(m, 3H), 8.41(m, 2H), 10.37(s, 1H);
MS(ES): 311.2(M++1)。
【0254】
4−(4−トランス−アセチルアミノシクロヘキシル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
4−(4−トランス−メチルスルホニルアミノシクロヘキシル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
4−(2−アセチルアミノエチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−7−(1−フェニルエチル)ピロロ[2,3d]ピリミジン。
4−(4−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−(1−フェニルエチル)ピロロ[2,3d]ピリミジン。
4−(3−ピリジルメチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−7−(1−フェニルエチル)ピロロ[2,3d]ピリミジン。
4−(3−メチルプロピル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−7−(1−フェニルエチル)ピロロ[2,3d]ピリミジン。
【0255】
例2:
0℃に冷やしたTHF(1.0mL)中のトリフェニルホスフィン(0.047g、0.179mmol)及び安息香酸(0.022g、0.179mmol)の攪拌懸濁液に、4−(4−トランス−ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン(0.05g、0.149mmol)を0℃にて添加した。次にアゾジカルボン酸ジエチル(0.028mL、0.179mmol)を10分間かけて滴下した。続いて、該反応液を室温に加温した。TLCで反応が完了した後に、該反応混合液を炭酸水素ナトリウム水溶液(3.0mL)を用いて反応停止させた。水相を分離し、エーテル(2×5.0mL)で抽出した。有機抽出相を合わせて乾燥させ、真空中にて濃縮乾固した。エーテル(2.0mL)及びヘキサン(5.0mL)を残渣に添加し、それからトリフェニルホスフィンオキシドのバルクを濾過により除去した。濾液を濃縮し、粘性オイルを得、それをカラムクロマトグラフィ(ヘキサン:酢酸エチル=4:1)で精製し、4−(4−シス−ベンゾイルオキシシクロヘキシル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン5.0mg(7.6%)を得た。
MS(ES): 441.3(M++1).
また、この反応は4−(3−シクロヘキセニル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン50.0mg(84%)を生じた。
MS(ES):319.2(M++1)。
【0256】
例3:エタノール(1.0mL)中の4−(4−シス−ベンゾイルオキシシクロヘキシル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン(5.0mg、0.0114mmol)の溶液に、2M 水酸化ナトリウム10滴を添加した。1時間後に、該反応液を酢酸エチル(3×5.0mL)で抽出し、有機相を乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮乾固させた。残渣に対し、カラムクロマトグラフィ(ヘキサン:酢酸エチル=4:1)を行い、4−(4−シス−ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン3.6mg(94%)を得た。
MS(ES): 337.2(M++1)。
【0257】
下記の化合物は、例3と同様の方法にて得られた。
4−(3−N,N−ジメチル−3−オキソプロピル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ2.01(s, 3H), 2.31(s, 3H), 2.73(t, 2H), 2.97(s, 6H), 4.08(m, 2H), 6.09(t, 1H), 7.41-7.48(m, 3H), 8.43(m, 2H), 10.46(s, 1H);
MS(ES): 338.2(M++1)。
【0258】
4−(2−ホルミルアミノエチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ2.26(s, 3H), 2.37(s, 3H), 3.59-3.78(m, 2H), 3.88-4.01(m, 2H), 5.48-5.60(m, 1H), 7.38-7.57(m, 3H), 8.09(s, 1H), 8.30-8.45(m, 2H), 8.82(s, 1H);
MS(ES): 310.1(M++1)。
【0259】
4−(3−アセチルアミノプロピル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
MS(ES): 338.2(M++1)。
【0260】
例4:
トリフルオロ酢酸:ジクロロメタン(1:1、5.0mL)に4−(3−tert−ブチルオキシ−3−オキソプロピル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン(70.0mg、0.191mmol)を溶解させた。得られた溶液を室温にて1時間攪拌し、次に2時間還流させた。室温にまで冷却した後に、該混合液を真空中にて濃縮乾燥固させた。残渣に対し分取薄層クロマトグラフィ(EtOAc:ヘキサン:AcOH=7:2.5:0.5)を行い、4−(3−ヒドロキシ−3−オキソプロピル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン40.0mg(68%)を得た。
1H NMR(200MHz, CD3OD) δ2.32(s, 3H), 2.38(s, 3H), 2.81(t, 2H), 4.01(t, 2H), 7.55(m, 3H), 8.24(m, 2H);
MS(ES): 311.1(M++1)。
【0261】
下記の化合物は、例4と同様の方法にて得られた。
4−(3−アミノプロピル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
MS(ES): 296.1(M++1), 279.1(M+-NH3)。
【0262】
例5:N,N−ジメチルホルムアミド(0.50mL)、ジオキサン(0.50mL)及び水(0.25mL)の混合液中に、4−(3−ヒドロキシ−3−オキソプロピル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン(50.0mg、0.161mmol)を溶解させた。この溶液に、メチルアミン(0.02mL、水中に40質量%、0.242mmol)、トリエチルアミン(0.085mL)及びN,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(61.2mg、0.203mmol)を添加した。室温にて10分間攪拌した後に、該溶液を濃縮し、残渣に対し分取薄層フロマトグラフィ(EtOAc)を行い、4−(3−N−メチル−3−オキソプロピル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン35.0mg(67%)を得た。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.92(s, 3H), 2.30(s, 3H), 2.65(t, 2H), 4.08(t, 2H), 5.90(t, 1H), 6.12(m, 1H), 7.45(m, 3H), 8.41(m, 2H), 10.68(s, 1H); MS(ES): 311.1(M++1)。
【0263】
下記の化合物は、例5と同様の方法にて得られた。
4−(2−シクロプロパンカルボニルアミノエチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
MS(ES): 350.2(M++1)。
【0264】
4−(2−イソブチリルアミノエチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
MS(ES): 352.2(M++1)。
【0265】
4−(3−プロピオニルアミノプロピル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.00-1.08(t, 3H), 1.71-2.03(m, 4H), 2.08(s, 3H), 2.37(s, 3H), 3.26-3.40(m, 2H), 3.79-3.96(m, 2H), 5.53-5.62(m, 1H), 6.17-6.33(m, 1H), 7.33-7.57(m, 3H), 8.31-8.39(m, 2H), 9.69(s, 1H);
MS(ES):352.2(M++1)。
【0266】
4−(2−メチルスルホニルアミノエチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ2.18(s, 3H), 2.27(s, 3H), 2.92(s, 3H), 3.39-3.53(m, 2H), 3.71-3.88(m, 2H), 5.31-5.39(m, 1H), 6.17-6.33(m, 1H), 7.36-7.43(m, 3H), 8.20-8.25(m, 2H), 9.52(s, 1H);
MS(ES): 360.2(M++1)。
【0267】
例6:
4−クロロ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン(0.70g、2.72mmol)及び1,2−ジアミノエタン(10.0mL、150mmol)の混合物を、不活性雰囲気下にて6時間還流させた。過剰のアミンを真空中にて除去し、次にエーテル及びヘキサンで残渣を洗浄し、4−(2−アミノエチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジンを得た。
MS(ES); 282.2(M++1), 265.1(M+-NH3)。
【0268】
例7:
ジクロロメタン(2.0mL)中の4−(2−アミノエチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン(70.0mg、0.249mmol)及びトリエチルアミン(50.4mg、0.498mmol)の溶液に、塩化プロピオニル(25.6mg、0.024mL、0.274mmol)を0℃にて添加した。1時間後に、該混合液を真空中にて濃縮し、残渣に対し分取薄層クロマトグラフィ(EtOAc)を行い、4−(2−プロピオニルアミノエチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン22.0mg(26%)を得た。
MS(ES): 338.2(M++1)。
【0269】
下記の化合物は、例7と同様の方法にて得られた。
4−(2−N’−メチルウレアエチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ2.13(s, 3H), 2.32(s, 3H), 3.53(d, 3H), 3.55(m, 2H), 3.88(m, 2H), 4.29(m, 1H), 5.68(t, 1H), 5.84(m, 1H), 7.42(m, 3H), 8.36(dd, 2H), 9.52(s, 1H);
MS(ES): 339.3(M++1)。
【0270】
4−(2−N’−エチルウレアエチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
MS(ES): 353.2(M++1)。
【0271】
例8:
ジクロロメタン(2.0mL)中の1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩(41.1mg、0.215mmol)、ジメチルアミノピリジン(2.4mg、0.020mmol)及びピルビン酸(18.9mg、0.015mL、0.215mmol)の溶液に、4−(2−アミノエチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン(55.0mg、0.196mmol)を添加した。該混合液を室温にて4時間攪拌した。通常の後処理、続いてカラムクロマトグラフィ(EtOAc)を行い、4−(2’−ピルビルアミノエチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン10.0mg(15%)を得た。
MS(ES): 352.2(M++1)。
【0272】
例9:
ジクロロメタン(2.0mL)中の4−(2−アミノエチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン(60.0mg、0.213mmol)の溶液に、N−トリメチルシリルイソシアネート(43.3mg、0.051mL,0.320mmol)を添加した。該混合液を室温にて3時間攪拌し、続いて炭酸水素ナトリウム水溶液を添加した。少量のシリカゲルに通して濾過した後に、濾液を真空中にて濃縮乾固して4−(2−ウレアエチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジンを得た。
MS(ES): 325.2(M++1)。
【0273】
下記の化合物は、例9と同様の方法にて得られた。
dl−4−(2−アセチルアミノプロピル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.28-1.32(d, J=8Hz, 3H), 1.66(s, 3H), 1.96(s, 3H), 2.30(s, 3H), 3.76-3.83(m, 2H), 4.10-4.30(m, 1H), 5.60-5.66(t, J=6Hz, 1H), 7.40-7.51(m, 3H), 8.36-8.43(m, 2H), 10.83(s, 1H);
MS(ES): 338.2(M++1)。
【0274】
(R)−4−(2−アセチルアミノプロピル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.31(d, 3H), 1.66(s, 3H), 1.99(s, 3H), 2.31(s, 3H), 3.78-3.83(m, 2H), 4.17-4.22(m, 1H), 5.67(t, 1H), 7.38-7.5(m, 3H), 8.39(m, 2H), 10.81(s, 1H);
MS(ES): 338.2(M++1)。
【0275】
(R)−4−(1−メチル−2−アセチルアミノエチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.41(d, 3H), 1.68(s, 3H), 2.21(s, 3H), 2.34(s, 3H), 3.46-3.52(br, m, 2H), 4.73(m, 1H), 5.22(d, 1H), 7.41-7.46(m, 3H), 8.36-8.40(m, 2H), 8.93(s, 1H);
MS(ES): 338.2(M++1)。
【0276】
(S)−4−(2−アセチルアミノプロピル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.31(d, 3H), 1.66(s, 3H), 2.26(s, 3H), 2.35(s, 3H), 3.78-3.83(m, 2H), 4.17-4.22(m, 1H), 5.67(t, 1H), 7.38-7.5(m, 3H), 8.39(m, 2H), 8.67(s, 1H);
MS(ES): 338.2(M++1)。
【0277】
(S)−4−(1−メチル−2−アセチルアミノエチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.41(d, 3H), 1.68(s, 3H), 2.05(s, 3H), 2.32(s, 3H), 3.46-3.52(m, 2H), 4.73(m, 1H), 5.22(d, 1H) ,7.41-7.46(m, 3H), 8.36-8.40(m, 2H), 10.13(s, 1H);
MS(ES): 338.2(M++1)。
【0278】
例10:例1と同様の方法にて、dl−1−アミノ−2−(1,1−ジメチルエトキシ)カルボニルアミノ−プロパン及びdl−2−アミノ−1−(1,1−ジメチルエトキシ)カルボニルアミノ−プロパンの混合物との4−クロロ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジンの反応を行った。この反応により、dl−4−(1−メチル−2−(1,1−ジメチルエトキシ)カルボニルアミノ)エチルアミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン及びdl−4−(2−メチル−2−(1,1−ジメチルエトキシ)カルボニルアミノ)エチルアミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジンが得られ、それらをカラムクルマトグラフィ(EtOAc:ヘキサン=1:3)により分離した。第一のフラクションは、dl−4−(1−メチル−2−(1,1−ジメチルエトキシ)カルボニルアミノエチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジンであった:
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.29-1.38(m, 12H), 1.95(s, 3H), 2.31(s, 3H), 3.34-3.43(m, 2H), 4.62-4.70(m, 1H), 5.36-5.40(d, J=8Hz, 1H), 5.53(br, 1H), 7.37-7.49(m, 3H), 8.37-8.44(m, 2H), 10.75(s, 1H);
MS(ES): 396.3(M++1)。
【0279】
第二のフラクションは、dl−4−(2−1,1−ジメチルエトキシ)カルボニルアミノプロピル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジンであった:
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.26-1.40(m, 12H), 2.00(s, 3H), 2.31(s, 3H), 3.60-3.90(m, 2H), 3.95-4.10(m, 1H), 5.41-5.44(d, J=6.0Hz, 1H), 5.65(br, 1H), 7.40-7.46(m, 3H), 8.37-8.44(m, 2H), 10.89(s, 1H);
MS(ES): 396.2(M++1)。
【0280】
下記の化合物は、例10と同様の方法にて得られた。
(S,S)−4−(2−アセチルアミノシクロヘキシル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.43(m, 4H), 1.60(s, 3H), 1.83(m, 2H), 2.18(s, 3H), 2.30(m, 2H), 2.32(s, 3H), 3.73(br, 1H), 4.25(br, 1H), 5.29(d, 1H), 7.43-7.48(m, 3H), 8.35-8.40(m, 2H), 9.05(s, 1H)。
【0281】
4−(2−メチル−2−アセチルアミノプロピル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.51(s, 6H), 1.56(s, 3H), 2.07(s, 3H), 2.36(s, 3H), 3.76(d, 2H), 5.78(t, 1H), 7.41-7.48(m, 3H), 7.93(s, 1H), 8.39(m, 2H), 10.07(s, 1H);
MS(ES): 352.3(M++1)。
【0282】
例11:
ジクロロメタン(2.0mL)中にて、dl−4−(1−メチル−2−(1,1−ジメチルエトキシ)カルボニルアミノエチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン(60.6mg、0.153mmol)をトリフルオロ酢酸(0.5mL)で14時間処理した。有機溶媒を真空中にて濃縮し乾固させた。残渣をN,N−ジメチルホルムアミド(2.0mL)及びトリエチルアミン(2.0mL)中に溶解させた。該溶液に無水酢酸(17.2mg、0.016、0.169mmol)を0℃にて添加した。得られた混合液を室温にて48時間攪拌し、次に真空中にて濃縮乾固させた。残渣に対し分取薄層クロマトグラフィ(EtOAc)を行い、dl−4−(1−メチル−2−アセチルアミノエチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン27.0mg(52%)を得た。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.38-1.42(d, J=8Hz, 3H), 1.69(s, 3H), 2.01(s, 3H), 2.32(s, 3H), 3.38-3.60(m, 2H), 4.65-4.80(m, 1H), 5.23-5.26(d, J=6Hz, 1H), 7.40-7.51(m, 3H), 8.37-8.43(m, 2H), 10.44(s, 1H);
MS(ES): 338.2(M++1)。
【0283】
例12:
N,N−ジメチルホルムアミド(10.0mL)中にて、(R,R)−4−(2−アミノシクロヘキシル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン(例1と同様の方法にて、4−クロロ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン(0.15g、0.583mmol)から調製)、及び(1R,2R)−(−)−1,2−ジアミノシクロヘキサン(0.63g、5.517mmol)をトリエチルアミン(0.726g、7.175mmol)及び無水酢酸(0.325g、3.18mmol)で室温にて2時間処理した。真空中にて溶媒を除去した後に、酢酸エチル(10.0mL)及び水(10.0mL)を残渣に添加した。該混合物を分離し、水相を酢酸エチル(2×10.0mL)で抽出した。酢酸エチル溶液を合わせて乾燥させ(MgSO4)、濾過した。濾液を真空中にて濃縮乾固し、残渣に対してカラムクロマトグラフィ(EtOAc:ヘキサン=1:1)を行い、(R,R)−4−(2−アセチルアミノシクロヘキシル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン57.0mg(26%)を得た。 1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.43(m, 4H), 1.60(s, 3H), 1.84(m, 2H), 2.22(s, 3H), 2.30(m, 2H), 2.33(s, 3H), 3.72(br, 1H), 4.24(br, 1H), 5.29(d, 1H), 7.43-7.48(m, 3H), 8.35-8.39(m, 2H), 8.83(s, 1H);
MS(ES): 378.3(M++1)。
【0284】
例13:
ピリジン(1.0mL)中の4−(2−ヒドロキシエチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン(40.0mg、0.141mmol)の溶液に、無水酢酸(0.108g、1.06mmol)を0℃にて添加した。該混合液を室温にて4時間攪拌し、溶媒を真空中にて除去した。残渣に対して分取薄層クロマトグラフィ(EtOAc:ヘキサン=1:1)を行い、4−(2−アセチルオキシエチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン32.3mg(71%)を得た。 1H NMR(200MHz, CDCl3) δ1.90(s, 3H), 2.08(s, 3H), 2.31(s, 3H), 4.05(m, 2H), 4.45(t, 2H), 5.42(m, 1H), 7.41-7.49(m, 3H), 8.42(m, 2H), 11.23(s, 1H)。
【0285】
例14:
N,N−ジメチルホルムアミド1滴を含むジクロロメタン(4.0mL)中のFmoc−β−Ala−OH(97.4mg、0.313mmol)及び塩化オキサリル(39.7mg、27.3μL、0.313mmol)の溶液を0℃にて1時間攪拌し、次に4−(2−アミノエチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン(80.0mg、0.285mmol)及びトリエチルアミン(57.6mg、79.4μL、0.570mmol)を0℃にて添加した。3時間後に、該混合物を真空中にて濃縮し、残渣をN,N−ジメチルホルムアミド(2.0mL)中の20%ピペリジン溶液で0.5時間処理した。真空中にて溶媒を除去した後に、残渣をジエチルエーテル:ヘキサン(1:5)で洗浄し、4−(6−アミノ−3−アザ−4−オキソヘキシル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン3.0mg(3%)を得た。
MS(ES): 353.2(M++1)。
【0286】
例15:
N,N−ジメチルホルアミド1滴を含むジクロロメタン(4.0mL)中の4−(2−アミノエチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン(70.0mg、0.249mmol)及び無水コハク酸(27.0mg、0.274mmol)の溶液を室温にて4時間攪拌した。該反応混合液を20%水酸化ナトリウム(3×5.0mL)で抽出した。該水溶液を、3M塩酸を用いてpH=7.0にまで酸性化した。該混合液全体を酢酸エチル(3×10mL)で抽出した。有機溶液を合わせて乾燥させ(MgSO4)、濾過した。濾液を真空中にて濃縮乾固し、4−(7−ヒドロキシ−3−アザ−4,7−ジオキソヘプチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン15.0mg(16%)を得た。
MS(ES): 382.2(M++1)。
【0287】
例16:
ジメチルホルムアミド(DMF)(10mL)に、4−シス−3−ヒドロキシシクロペンチル)アミノ−2−フェニル−5,6−ジメチル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン(700mg)を室温にて添加し、続いてN−Bocグリシン(455mg)、N,N−ジメチルアミノピリジン(DMAP)(20mg)、ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBT)(293mg)、及び1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩(EDCl)(622mg)を添加した。該反応混合液を一晩中攪拌した。次に減圧下にてDMFを除去し、該反応混合物を酢酸エチル(20mL)及び水(50mL)間で分配させた。更に水相部分を酢酸エチル(2×20mL)で抽出し、有機相部分を合わせて塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。酢酸エチル/ヘキサンで溶出させるシリカゲル精製を行い、所望の生成物:4−(シス−3−(N−t−ブトキシカルボニル−2−アミノアセトキシ)シクロペンチル)アミノ−2−フェニル−5,6−ジメチル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン410mgを得た(MS(ES)(M++1)= 480.2)。次に該エステルを、ジクロロメタン中の20%トリフルオロ酢酸5mLで室温にて一晩処理し、続いて濃縮した。酢酸エチルとともに粉砕し、灰白色固体;4−(シス−3−(2−アミノアセトキシ)シクロペンチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジントリフルオロ酢酸塩300mgを得た(MS(ES)(M++1)= 380.1)。
【0288】
下記の化合物が上述の方法によって合成可能であることは、当業者にとって明らかであろう:
4−(シス−3−ヒドロキシシクロペンチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
MS(ES)(M++1)= 323.1。
4−(シス−(2−アミノアセトキシ)シクロペンチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジントリフルオロ酢酸塩。
【0289】
MS(ES)(M++1)= 380.1。
4−(3−アセトアミド)ピペリジニル−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
MS(ES)(M++1)= 364.2。
4−(2−N’−メチルウレアプロピル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
MS(ES)(M++1)= 353.4。
4−(2−アセトアミドブチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
MS(ES)(M++1)= 352.4。
4−(2−N’−メチルウレアブチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
MS(ES)(M++1)= 367.5。
4−(2−アミノシクロプロピルアセトアミドエチル)アミノ−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
MS(ES)(M++1)= 309.1。
4−(トランス−4−ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ−2−(3−クロロフェニル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
MS(ES)(M++1)= 342.8。
4−(トランス−4−ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ−2−(3−フルオロフェニル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
MS(ES)(M++1)= 327.2。
4−(トランス−4−ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ−2−(4−ピリジル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
MS(ES)(M++1)= 310.2。
【0290】
例17:
【化43】
(7)(スキームIX)のピロールの窒素を塩基性条件下にてt−ブチルジカーボネートで保護し、相当するカルバーメート(22)を得た。続いて(22)のラジカル的臭素化を位置選択的に行い、臭素化物(23)を得た。一般的に、化合物(23)は、種々の求核的カップリングの相手としての重要な求電子性中間体として働いた。ナトリウムフェノラート三水和物を用いた臭化アルキルの置換により化合物(24)を得た。続く塩化アリールの置換、及びt−ブチルカルバメート保護基の除去を一工程で行い、所望の化合物(25)を得た。
【0291】
スキームIXに従った化合物(22)〜(25)の詳細な合成:
【化44】
ジ−t−ブチルジカーボネート(5.37g、24.6mmol)及びジメチルアミノピリジン(1.13g、9.2mmol)を、(7)(1.50g、6.15mmol)及びピリジン(30mL)を含む溶液に添加した。20時間後に、該反応液を濃縮し、残渣をCH2Cl2及び水間に分配させた。CH2Cl2相を分離し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濃縮して黒色固体を得た。フラッシュシリカゲルクロマトグラフィ(SiO2;1/9EtOAc/ヘキサン Rf 0.40)を行い、白色固体(22)1.70g(80%)を得た。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ8.50 (m, 2H, Ar-H), 7.45(m, 3H, Ar-H), 6.39(s, 1H, ピロール-H), 2.66(s, 3H, ピロール-CH3), 1.76(s, 9H, カルバメート-CH3);
MS, M+1: 344.1;
Mpt= 175-177℃。
【0292】
【化45】
N−ブロモスクシンイミド(508mg、2.86mmol)及びAIBN(112mg、0.68mmol)を、(22)(935mg、2.71mmol)及びCCl4(50mL)を含む溶液に添加した。該溶液を加熱還流させた。2時間後に、該反応液を室温に冷却し、真空中にて濃縮して白色固体を得た。フラッシュクロマトグラフィ(SiO2;1/1 CH2Cl2/ヘキサン、Rf 0.30)を行い、白色固体(23)960mg(84%)を得た。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ8.52 (m, 2H, Ar-H), 7.48(m, 3H, Ar-H), 6.76(s, 1H, ピロール-H), 4.93(s, 2H, ピロール-CH2Br), 1.79(s, 9H, カルバメート-CH3);
MS, M+1: 423.9;
Mpt= 155-157℃。
【0293】
【化46】
CH2Cl2(5mL)及びDMF(10mL)中に溶解させた臭化物(23)(410mg、0.97mmol)の溶液に、ナトリウムフェノキシド三水和物(173mg、1.02mmol)を一度に添加した。2時間後に、該反応溶液をCH2Cl2及び水間に分配させた。水相をCH2Cl2で抽出した。CH2Cl2相を合わせて水で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濃縮して黄色固体を得た。フラッシュクロマトグラフィ(SiO2;1/6 EtOAc/ヘキサン、Rf 0.30)を行い、白色固体(24)210mg(50%)を得た。
1H NMR(200MHz, CDCl3) δ8.53(m, 2H, Ar-H), 7.48(m, 3H, Ar-H), 7.34(m, 2H, Ar-H), 7.03(m, 3H, Ar-H), 6.83(s, 1H, ピロール-H), 5.45(s, 2H, ArCH2O), 1.76(s, 9H, カルバメート-CH3);
MS, M+: 436.2。
【0294】
【化47】
(24)(85mg、0.20mmol)、N−アセチルエチレンジアミン(201mg、1.95mmol)及びDMSO(3mL)を含む溶液を100℃に加熱した。1時間後に、温度を130℃に上昇させた。3時間後に、該反応液室温に冷却し、EtOAc及び水間に分配させた。水相をEtOAc(2×)で抽出した。EtOAc相を合わせて水で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィ(SiO2;1/10 EtOH/CHCl3、Rf 0.25)を行い、白色泡状固体(25)73mg(93%)を得た。
1H NMR(200MHz, DMSO-d6) δ11.81(br s, 1H, N-H), 8.39(m, 2H, Ar-H), 8.03(br t, 1H, N-H), 7.57(br t, 1H, N-H), 7.20-7.50(m, 5H, Ar-H), 6.89-7.09(m, 3H, Ar-H), 6.59(s, 1H, ピロール-H), 5.12(s, 2H, ArCH2O), 3.61(m, 2H, NCH2), 3.36(m, 2H, NCH2), 1.79(s, 3H, COCH3);
MS, M+1: 402.6。
【0295】
下記の化合物は、例17と同様の方法にて得られた。
4−(2−アセチルアミノエチル)アミノ−6−フェノキシメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
mp 196-197℃; MS(ES): 401.6(M++1)。
4−(2−アセチルアミノエチル)アミノ−6−(4−フルオロフェノキシ)メチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
MS(ES): 420.1(M++1)。
4−(2−アセチルアミノエチル)アミノ−6−(4−クロロフェノキシ)メチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
MS(ES): 436.1(M++1)。
4−(2−アセチルアミノエチル)アミノ−6−(4−メトキシフェノキシ)メチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
MS(ES): 432.1(M++1)。
4−(2−アセチルアミノエチル)アミノ−6−(N−ピリジン−2−オン)メチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
MS(ES): 403.1(M++1)。
4−(2−アセチルアミノエチル)アミノ−6−(N−フェニルアミノ)メチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3]ピリミジン。
MS(ES): 400.9(M++1)。
4−(2−アセチルアミノエチル)アミノ−6−(N−メチル−N−フェニルアミノ)メチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
MS(ES): 414.8(M++1)。
4−(2−N’−メチルウレアエチル)アミノ−6−フェノキシメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
MS(ES): 416.9(M++1)。
【0296】
ヒトアデノシンA1及びA2a受容体に対する酵母βガラクトシダーゼレポーター遺伝子アッセイ
ヒトアデノシンA1(A1R;CADUS株CY12660)又はヒトA2a(A2a;CADUS株CY8362)と、機能的な読み取りとして使用するためのlacZ(β−ガラクトシダーゼ)レポーター遺伝子の添加によって、酵母の株(サッカロミセス・セレビシアエ)を形質転換した。形質転換の完全な記載は、以下に列記されている(酵母株参照)。全てのアッセイには、A1とA2a受容体に対して同等の親和性を有する強力なアデノシン受容体アゴニストであるNECA(5’−N−エチルカルボキサミドアデノシン)をリガンドとして使用した。テスト化合物は、8つの濃度(0.1〜10,000nM)で、CY12660又はCY8362によるNECA誘導性βガラクトシダーゼ活性を阻害する能力について調べられた。
【0297】
酵母ストック培養の調製 各酵母株それぞれ、CY12660とCY8362をLT寒天プレート上に画線し、コロニーが観察されるまで、30℃でインキュベートした。これらのコロニーからの酵母をLT液(pH6.8)に添加し、30℃で一晩増殖させた。続いて、各酵母株を、分光光度計(Molecular Devices VMAX)で測定したときにOD600=1.0〜2.0(約1〜2×107細胞/mL)になるように希釈した。各6mLの酵母液体培養に対して、4mLの40%グリセロール(1:1.5 vol:vol)を添加した(酵母/グリセロールストック)。この酵母/グリセロールストックから、1mLの分取試料を10個調製し、アッセイに必要になるまで−80℃で保存した。
【0298】
酵母A1RとA2aRアッセイ 1バイアルのそれぞれCY8362とCY12660酵母/グリセロールストックを融解し、補充LT溶液培地、pH6.8(5mLの40%グルコース、0.45mLの1M KOH、及び2.5mLのPipes、pH6.8が添加されているLT液92mL)を接種するために使用した。30℃で16〜18時間(一晩)、液体培養を増殖させた。続いて、CY8362(A2aR)についてはOD600=0.15(1.5×106細胞/mL)が、CY12660(A1R)についてはOD600=0.50(5×106細胞/mL)が得られるように、4U/mLのアデノシンデアミナーゼ(ウシ小腸粘膜からのVI型又はVII型、シグマ)を含有するLT培地に、一晩培養したものからの分取試料を希釈した。
【0299】
96ウェルのマイクロタイタープレート中で、全てのウェルにおいて2%DMSOの最終濃度が達成されるように、100μLの最終容量を用いてアッセイを行った。一次スクリーニングについては、1〜2の濃度のテスト化合物を使用した(10μM、1μM)。化合物のプロフィール決定の場合には、8つの濃度を(10000、1000、500、100.50、10、1、及び0.1nM)テストした。各マイクロタイタープレートに対して、「対照」と「トータル」のウェルには10μLの20%DMSOを添加し、「未知」のウェルには10μLのテスト化合物(20%DMSO中)を添加した。続いて、「トータル」と「未知」のウェルには、10μLのNECA(A1Rには5μM、A2aRには1μM)を添加し、「対照」のウェルには、10μLのPBSを添加した。最後の添加では、80μLの酵母株、CY8362又はCY12660を全てのウェルに添加した。続いて、全てのプレートを短時間攪拌し(LabLine orbital shaker、2〜3分)、乾燥したオーブン中、30℃で4時間インキュベートさせた。
【0300】
比色(例えば、ONPG、CPRG)、冷光(例えば、Galacton−Star)、又は蛍光性基質(例えば、FDG、Resorufin)基質の何れかを用いて、β−ガラクトシダーゼ活性を定量することができる。現在は、S/N比が優れ、相対的に妨害がなく、且つ低コストであるために、蛍光検出が好ましい。蛍光性のβ−ガラクトシダーゼの基質であるフルオレセインジガラクトピラノシド(FDG、Molecular Probes or Marker Gene Technologies)を、20μL/ウェル(最終濃度=80μM)で全てのウェルに添加した。5〜6秒間プレートを揺動させた後(Labline orbital shaker)、37℃で90分間インキュベートした(95%O2/5%CO2インキュベーター)。90分のインキュベーション期間の終わりに、20μL/ウェルの1M Na2CO3を用いて、β−ガラクトシダーゼ活性を停止させ、全てのプレートを5〜6秒間揺動した。続いて、プレートを6秒間攪拌し、蛍光測定機(Tecan Spectrafluor;励起=485nm、蛍光=535nM)を用いて、相対蛍光強度を決定した。
【0301】
計算 「対照」ウェルに対する相対蛍光値をバックグラウンドと解釈し、「Total」及び「Unknown」の値から差し引いた。対数変換(X軸:化合物の濃度)した後、一部位の拮抗曲線のフィッティングを行ってIC50値を算出することにより(GraphPad Prism)、化合物のプロフィールを分析した。
【0302】
酵母株 サッカロミセスセレビシアエ CY12660株[far1*1442tbt1−1 fus1−HIS3 can1 ste14::trp1::LYS2 ste3*1156 gpa1(41)−Gαi3 lys2 ura3 leu2 trp1:his3;LEU2 PGKp−Mfα1Leader−hA1R−PHO5term 2mu−orig REP3 Ampr]、及びCY8362株[gpa1p−rGαsE10K far1*1442 tbt1−1 fus1−HIS3 can1 ste14::trp1:LYS2 ste3*1156lys2 ura3 leu2 trp1 his3;LEU2 PGKp−hA2aR 2mu−ori REP3 Ampr]を発育させた。
【0303】
LT培地 LT(Leu−Trp補充)培地は、100gのDIFCO酵母窒素塩基(base)に、以下のもの:バリン1.0g、アスパラギン酸1.0g、フェニルアラニン0.75g、リシン0.9g、チロシン0.45g、イソロイシン0.45g、メチオニン0.3g、アデニン0.6g、ウラシル0.4g、セリン0.3g、プロリン0.3g、システイン0.3g、アルギニン0.3g、ヒスチジン0.9g、及びトレオニン1.0gが補充されてなる。
【0304】
ヒトA1アデノシン受容体を発現する酵母株の構築
この例では、酵母のフェロモン系経路中に機能的に組み込まれたヒトA1アデノシン受容体を発現する酵母株の構築について記載する。
【0305】
1.発現ベクターの構築
ヒトA1アデノシン受容体用の酵母発現ベクターを構築するために、ヒトA1アデノシン受容体の公表された配列に基づいてデザインされたプライマーと標準的な手法を用いて、ヒト海馬のmRNAの逆転写酵素PCRによって、A1アデノシン受容体のcDNAを得た。酵母発現プラスミドpMP15のNcoI及びXbaI部位にPCR産物をサブクローニングした。
【0306】
pMP15プラスミドは、以下のようにpLPXtから作成した。YEP51(Broach、J.R.et al.,(1983)“Vectors for high−level, inducible expression of cloned genes in yeast”, p.83−117 in M.Inouye(ed.),Experimental Manipulation of Gene Expression. Academic Press,New York)を消化によって取り出し、末端を充填し(end−fill)、再連結してYep51NcoDXbaを作成した。YEP51NcoXtを作成するために、BamHIによる消化、末端充填、リンカー(New England Biolabs、#1081)の連結、XbaI消化、及び再連結により、BamHI部位に別のXbaI部位を作成した。Esp31とNcoIで該プラスミドを消化しPCRによって作成されたLeu2及びPGKp断片に連結された。Esp31とBglII部位を含有するプライマーを用いてYEP51Ncoからの増殖によって、2kbのLeu2PCR産物を作成した。660塩基対のPGKp PCR産物は、BglIIとNcoI部位を含有するPCRプライマーを用いて、pPGKαs(Kang, Y.−S. et al.(1990)Mol.Cell.Biol.10:2582−2590)からの増殖によって作成した。得られたプラスミドは、pLPXtと称する。pLPXtは、a因子プレプロリーダーのコード領域をNcoI部位に挿入することによって修飾した。該プレプロリーダーは、NcoIクローニング部位がリーダーの3’末端に維持され、5’末端に再生されないように挿入された。このように、受容体は、NcoIとXbaIによるプラスミドの消化によってクローニングされ得る。得られたプラスミドは、pMp15と称される。
【0307】
その中にヒトA1アデノシン受容体cDNAが挿入されたpMP15プラスミドは、p5095と表記された。このベクターでは、受容体cDNAは、酵母a因子プレプロリーダーの3’末端に融合されている。タンパク質の取扱い中に、プレプロペプチド配列は切除されて、成熟した完全長の受容体が作られる。これは、酵母分泌経路を介した受容体のプロセッシング中に起こる。該プラスミドは、Leu選別(すなわち、ロイシンを欠如する培地上での増殖)によって維持される。クローニングされたコード領域の配列を決定し、公表された文献のもの(GenBank受付番号S45235及びS56143)と均等であることが見出された。
【0308】
2.酵母株の構築
ヒトA1アデノシン受容体を発現する酵母株を作成するために、酵母株CY7967を初発の親株として使用した。CY7967の遺伝子型は以下のとおりである:MATα gpaD1163 gpa1(41)Gαi3 far1D11442 tbt−1 FUS1−HIS3 can1 ste14::trp1::LYS2 ste3D1156 lys2 ura3 leu2 trp1 his3
遺伝マーカーを以下にまとめる。
【0309】
MATa・・・・・・・・・・・・・・・・・交配型a
gpa1D1163・・・・・・・・内在性酵母Gタンパク質GPA1が欠失されているgpa(41)Gai3・・・・gpa1(41)−Gai3が酵母のゲノムに組み込まれた。このキメラGaタンパク質は、コグネイト(cognate)N末アミノ酸が欠失された哺乳類のGタンパク質Gai3に融合された内在性酵母GaサブユニットGPA1の最初の41アミノ酸から構成される。
【0310】
far1D1442・・・・・・・・FAR1遺伝子(細胞周期の停止に必要とされる)が欠失している(これにより、フェロモン応答経路が活性化したときに細胞周期の停止が妨げられる)
tbt−1・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・電気穿孔法による高形質転換効率を有する株FUS1−HIS3・・・・・・・・・・・・・・FUS1プロモーターとHIS3コード領域との融合物(これにより、フェロモン誘導性のHIS3遺伝子が作り出される)can1・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・アルギニン/カナビニンパーミアーゼ
ste14::trp1:LYS2・・・STE14、C−ファルネシルメチルトランスフェラーゼの遺伝子破壊(これにより、フェロモン経路を介した基礎シグナリングが低下する)
ste3D1156・・・・・・・・・・・・・・・内在性酵母STR、a因子フェロモン受容体(STE3)が破壊された
lys2・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・2−アミノアジピン酸リダクターゼに欠損、酵母は増殖のためにリシンを必要とする
ura3・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼに欠損、酵母は増殖するためにウラシルを必要とする
leu2・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・b−イソプロピルマレイン酸デヒドロゲナーゼに欠損、酵母は増殖のためにロイシンを必要とする
trp1・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ホスホリボシルアンスラニレートに欠損、酵母は増殖するためにトリプトファンを必要とする
his3・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・イミダゾールグリセロリン酸デヒドロゲナーゼに欠損、酵母は増殖するためにヒスチジンを必要とする
電気穿孔法によって、二つのプラスミド:プラスミドp5095(ヒトA1アデノシン受容体をコードする;上記)及びFUS1−β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子のプラスミドであるp1584をCY7967株に形質転換した。プラスミドp1584は、pRS426(Christianson,T.W.et al.(1992)Gene 110:119−1122)に由来していた。プラスミドpRS426は、ヌクレオチド2004〜2016にポリリンカー部位を含有している。FUS1プロモーターとβ−ガラクトシダーゼ遺伝子との融合体を制限部位EagIとXhoIに挿入して、プラスミドp1584を作成した。p1584プラスミドは、Trp選択(すなわち、ロイシンを欠く培地上での増殖)によって維持される。
【0311】
p5095とp1584を担持する、CY12660と称される得られた株は、ヒトA1アデノシン受容体を発現している。液体中又は寒天プレート上で該株を増殖させるために、ロイシンとトリプトファンを欠く最少培地を使用した。プレート上での増殖アッセイ(FUS1−HIS3をアッセイする)を行うために、プレートは、pH6.8であり、0.5〜2.5mMの3−アミノ−1,2,4−トリアゾールを含有し、ロイシン、トリプトファン、及びヒスチジンを欠如していた。特異性の対照として、全ての実験で、1以上の他の酵母をベースとした7回膜貫通受容体スクリーンとの比較を含めた。
【0312】
ヒトA2aアデノシン受容体を発現する酵母株の構築
この例では、酵母フェロモン系経路に機能的に組み込まれたヒトA2aアデノシン受容体を発現する酵母株の構築が記載されている。
【0313】
1.発現ベクターの構築
ヒトA2aアデノシン受容体に対する酵母発現ベクターを構築するために、Phi Murphy(NIH)からヒトA2a受容体のcDNAを入手した。該クローンを受領して、A2a受容体インサートを配列決定し、公表された配列(GenBank受付番号#S46950)と同じであることを見出した。VENTポリメラーゼを用いたPCRによって、プラスミドから受容体cDNAを切り出し、酵母で構成的ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーターによる受容体の発現を駆動するプラスミドpLPBX中にクローニングした。インサート全体の配列をもう一度配列決定し、公表された配列と同じであることを見出した。しかしながら、使用したクローニング戦略のために、該受容体のカルボキシ末端には3つのアミノ酸GlySerVal隣接して存在していた。
【0314】
2.酵母株の構築
ヒトA2aアデノシン受容体を発現する酵母株を作成するために、酵母株CY8342を初発の親株として使用した。CY8342の遺伝子型は以下のとおりである:MATa far1D1442 tbt1−1 lys2 ura3 leu2 trp1 his3 fus1−HIS3 can1 ste3D1156 gpaD1163 ste14::trp1::LYS2 gpa1p−rGαSE10K(又はgpa1p−rGαSD229S又はgpa1p−rGαSE10K+D229S)。
【0315】
Gタンパク質の変異を除いては、遺伝的マーカーは、例1に記載されているとおりである。ヒトA2a受容体発現のためには、内在性酵母Gタンパク質GPA1が欠失し、哺乳類のGαSに置き換えられた酵母株を利用した。3つのラットGαS変異体を利用した。これらの変異株は、それらを、酵母のβγに効率的に結合するタンパク質に転換する1又は2の点変異を含有している。それらは、GαSE10K(10位のグルタミン酸がリシンで置き換えられている)、GαSD229S(229位のアスパラギン酸がセリンで置き換えられている)、及びGαS10K+D229S(両点変異を含有している)として同定されている。
【0316】
CY8342株(3つの変異ラットGαSタンパク質のうちの1つを担持している)を、親ベクターpLPBX(受容体−)又はpLPBX−A2a(受容体+)の何れかで形質転換した。フェロモン応答経路の活性化の規模を評価するために、βガラクトシダーゼのコーディング配列(下記に記載されている)に融合されたFUS1プロモーターを有するプラスミドを付加した。
【0317】
ヒトA1アデノシン受容体を発現する酵母株を使用した機能的アッセイ
この例では、ヒトA1アデノシン受容体のモジュレーター用の酵母での機能的スクリーニングアッセイの開発が記載されている。
【0318】
1.アッセイで使用したリガンド
本アッセイの開発のために、該受容体の天然のアゴニストであるアデノシンと他の合成アゴニスト2つを使用した。サブセットの実験では、約75nMのEC50を有すると報告されているアデノシン、及び約50nMの親和性が報告されている(−)−N6−(2−フェニルイソプロピル)−アデノシン(PIA)を使用した。増殖アッセイでは全て、5’−N−エチルカルボキサミド(NECA)を使用した。増殖培地中にアデノシンが存在することによるシグナリングを阻害するために、全てのアッセイにアデノシンデアミナーゼ(4U/mL)を加えた。
【0319】
2.酵母での生物学的応答
異なるGタンパク質サブユニットを発現した一連の酵母株の中に、A1受容体発現ベクター(p5095、上記)を導入することによって、異種酵母系において機能的に結合するA1アデノシン受容体の能力を評価した。これらの形質転換体の大部分は、Gαi又はGα0サブタイプのGαサブユニットを発現していた。さらなるGαタンパク質も、生じ得る雑多な受容体−Gαタンパク質の結合についてテストした。様々な株において、STE18又はキメラSTE18−Gγ2構築物が、酵母のゲノム中に組み込まれた。該酵母株は、欠損のあるHIS3遺伝子とFUS1−HIS3の組み込まれたコピーを有していることにより、3−アミノ−1,2,4−トリアゾールを含有し(0.2、0.5、及び1.0mM)を含有し、ヒスチジンを欠如する選択培地中での選択が可能となる。形質転換体を単離し、3−アミノ−1,2,4−トリアゾール、4U/mLアデノシンデアミナーゼを含有し、ヒスチジンを欠如する培地上で単一層を調製した。様々な濃度のリガンド5μL(例えば、0、0.1、1.0、及び10mMのNECA)を適用した。増殖は、2日間モニターした。リガンド依存性の増殖応答は、様々な酵母株においてこのようにテストした。結果は、下表1に要約されている。記号(−)は、リガンド依存性の受容体の活性化が検出されなかったことを示しており、(+)は、リガンド依存性応答を示している。「LIRMA」という語は、リガンド非依存性受容体に媒介された活性化(ligand independent receptormediated activation)を意味している。
【0320】
【表3】
表3に示されているように、最も強固なシグナリングは、GPA1(41)−Gαi3キメラを発現している酵母株で起こることが見出された。
【0321】
3.fus1−LacZアッセイ
フェロモン応答経路の活性化をより完全に特性決定するために、アゴニスト刺激に応じたfus1LacZを介したβ−ガラクトシダーゼの合成を測定した。βガラクトシダーゼアッセイを行うために、Ste18−Gγ2キメラとGPA41−Gαi3を同時発現する酵母株で発現されたヒトA1アデノシン受容体の中期対数培養に、徐々に増加する濃度のリガンドを添加した。形質転換体を単離し、ヒスチジンと4U/mLのアデノシンデアミナーゼの存在下で一晩増殖させた。4U/mLのアデノシンデアミナーゼ及びリガンドと5時間インキュベートした後、βガラクトシダーゼの基質としてCPRGを用いて、βガラクトシダーゼの誘導を測定した。アッセイ当たり5×105細胞を使用した。
【0322】
NECA刺激を用いて得られた結果は、10−8Mの濃度のNECAで、約2倍のβ−ガラクトシダーゼ活性の刺激が達成されることが示された。さらに、10−5MのNECA濃度で、約10倍の刺激指標が観察された。
【0323】
該アッセイの利用性は、該株に対するアンタゴニストの活性のヴァリデーションによって拡張された。2つの公知のアデノシンアンタゴニストXACとDPCPXが、βガラクトシダーゼアッセイにおける活性に対して、NECA(5mM)と拮抗する能力についてテストした。これらのアッセイでは、βガラクトシダーゼの誘導は、基質としてFDG、及び1.6×105細胞/アッセイを使用して測定した。XACとDPCPXは共に、強力な酵母発現されたA1アデノシン受容体として働き、それぞれ、44nM及び49nMのIC50を有することを示していた。
【0324】
この阻害的な効果がA1サブタイプに特異的であるかどうかを決定するために、酵母をベースとしたA2a受容体アッセイ(例4に記載されている)を用いて一連の相補性実験を行った。A2a酵母をベースとしたアッセイを用いて得られた結果は、公表された報告と一致して、XACが相対的に有効なA2a受容体アンタゴニストであることを示していた。対照的に、DPCPXは、公表された報告から予測されたように、該受容体では相対的に不活性であった。
【0325】
4.放射性リガンドの結合
A1アデノシン受容体アッセイは、受容体の放射性リガンド結合パラメータ−の測定によってさらに特性決定された。ヒトA1アデノシン受容体を発現している酵母から調製された膜を使用して、数個のアデノシン受容体参照化合物、XAC、DPCPX、及びCGSによる[3H]CPXの置換結合を分析した。ヒトA1アデノシン受容体を発現する酵母膜を用いた結果は、結合の特異性を調べるために、ヒトA2aアデノシン受容体又はヒトA3受容体を発現する酵母膜からのものと比較した。このアッセイを実施するために、0.4nM[3H]CPX及び徐々に増加する濃度のアデノシン受容体リガンドと共に、50mgの膜をインキュベートした。インキュベーションは、プロテアーゼ阻害剤の存在下で、50mM Tris−HCl、pH7.4、1mM EDTA、10mM MgCl2、0.25% BSA、及び2U/mL アデノシンデアミナーゼ中において、室温で60分間行った。結合は、10mM MgCl2を加えた氷冷した50mM Tris−HCl、pH7.4を添加した後、Packard 96ウェル採集器を用いて、予め0.5%のポリエチエンイミンに浸したGF/Bフィルター上で迅速に濾過することによって終結させた。データは、Prism2.01ソフトウェアを用いた非線形最少二乗曲線フィッティング操作によって分析した。この実験で得られたIC50値は、下表4に要約されている。
【0326】
【表4】
これらのデータは、参照化合物が、文献に報告されたものと一致する親和性を有することを示している。該データは、さらに、酵母をベースとするアッセイが、受容体のサブタイプ特異性を識別するのに十分な感度であることを示している。
【0327】
ヒトA2aアデノシン受容体を発現している酵母株を用いた機能的アッセイ
この例では、ヒトA1アデノシン受容体のモジュレーター用の酵母における機能的スクリーニングアッセイの開発が記載されている。
【0328】
1.アッセイで使用したリガンド
酵母の中で機能的に発現されたヒトA2a受容体の研究には、天然のリガンドアデノシンと、他の完全に特性決定された市販のリガンドを使用した。このアッセイの確立では、3つのリガンドが使用された。それらには、
リガンド 報告されたK i 機能
アデノシン 500nM アゴニスト
5’−N−エチルカルボキサミド 10〜15nM アゴニスト
アデノシン (NECA)
(−)−N6−(2−フェニルイソ 100〜125nM アゴニスト
プロピル)−アデノシン(PIA)
が含まれる。
【0329】
増殖培地中のアデノシンの存在によるシグナリングを阻害するために、全てのアッセイにはアデノシンデアミナーゼ(4U/mL)を添加した。
【0330】
2.酵母での生物学的応答
A2a受容体アゴニストが、A2a受容体発現プラスミドで形質転換され、GαSE10K、GαSD229S、又はGαSE10K+D229Sの何れかを発現している酵母中のフェロモン応答経路を刺激する能力についてテストされた。受容体依存性の態様で、フェロモン応答経路を刺激するリガンドの能力は、酵母の表現型の変化によって示された。受容体の活性化は、ヒスチジンの栄養素要求性からヒスチジン原栄養性へと表現型を修正した(fus1−HIS3の活性化)。
【0331】
3つの独立していない形質転換体を単離し、ヒスチジンの存在下で一晩増殖させた。ヒスチジンを除去するために細胞を洗浄し、2×106細胞/mLになるように希釈した。5μLの各形質転換体を、4U/mLのアデノシンデアミナーゼの不存在下、又は存在下で、(ヒスチジンを含む)非選択培地、選択培地(1mM AT)上に滴下した。30℃で24時間プレートを増殖させた。ヒスチジン存在下では、受容体+(R+)と受容体−(R−)株は、ともに増殖することができた。しかし、ヒスチジンの不存在下では、R+細胞のみが増殖した。これらのプレートにはリガントが全く添加されなかったので、この結果に対しては二つの説明が可能であった。1つの可能な解釈としては、受容体を有する酵母は、リガンド非依存性受容体に媒介された活性化(LIRMA)により増殖に有利であるということであった。あるいは、該酵母は、リガンドであるアデノシンを合成することができたのかもしれない。これら2つの可能性を区別するために、増殖している酵母とプレートに、リガンドを分解する酵素、アデノシンデアミナーゼ(ADA)を加えた。アデノシンデアミナーゼの存在下では、R+細胞は、もはや、ヒスチジンの不存在下において増殖することができず、該酵母が実際にリガンドを合成していたことを示している。
【0332】
この解釈は、液体中でのA2a増殖アッセイによって確認された。この実験では、R+酵母(A2a受容体を発現しているGαSE10K株)が、アデノシンデアミナーゼ(4U/mL)の存在下又は不存在下において、3つの密度(1×106細胞/mL;3×105細胞/mL;又は1×105細胞/mL)で播種された。アッセイのストリンジェンシーは、HIS3遺伝子のタンパク質産物であるイミダゾールグリセロールP−デヒドラターゼの拮抗的アンタゴニストである3−アミノ−1,2,4−トリアゾール(AT)の濃度が増加するにつれて(0、0.1、0.2、又は0.4mM)増強された。3−アミノ−1,2,4−トリアゾールの存在下では、酵母は、より不活発に増殖した。しかしながら、3−アミノ−1,2,4−トリアゾールの不存在下では、アデノシンデアミナーゼは殆ど効果を有さなかった。このため、アデノシンデアミナーゼ自体は、フェロモン応答経路に対して直接的な効果を持たなかった。
【0333】
増殖を測定し、高処理量スクリーニングのために小型化することができる代替的なアプローチは、A2a受容体リガンドのスポットアッセイである。A2a受容体(A2aR+)を発現している、又は受容体を欠いている(R−)GαSE10K株を、ヒスチジン及び4U/mLアデノシンデアミナーゼの存在下で一晩増殖した。ヒスチジンを除去するために細胞を洗浄し、1×106細胞/mLになるようになるように希釈した。4U/mLのアデノシンデアミナーゼ、及び0.5又は1.0mMの3−アミノー1,2,4−トリアゾール(AT)を含有する選択的プレート上に
1×106細胞/mLを広げて、1時間乾燥させた。5μLの以下の試薬:10mM アデノシン、38.7mM ヒスチジン、ジメチルスルフォキサイド(DMSO)、10mM PIA、又は10mM NECAを単一層にアプライした。30℃で24時間細胞を増殖した。結果は、受容体を持たない細胞は、ヒスチジンが培地に添加されたときだけ増殖できることを示した。対照的に、R+細胞は、A2a受容体リガンドPIAとNECAが滴下されている領域中だけで増殖した。プレートは、アデノシンデアミナーゼを含有していたので、アデノシンが滴下されたところでの増殖の欠如は、アデノシンデアミナーゼが活性であることを確認した。
【0334】
3.fus1 LacZアッセイ
酵母の交配経路の活性化を定量するために、fus1LacZを介したβガラクトシダーゼの合成を測定した。GαSE10K、GαSD229S、及びGαS10K+D229Sを発現している酵母株は、ヒトA2a受容体をコードするプラスミド(R+)又は受容体を欠如するプラスミド(R−)で形質転換された。形質転換体を単離し、ヒスチジンと4U/mLのアデノシンデアミナーゼの存在下で一晩増殖させた。1×107細胞を1×106細胞/mLに希釈し、徐々に増加する濃度のNECAに4時間接触させた後、細胞中のβガラクトシダーゼ活性を測定した。結果は、R−株では、実質的にβガラクトシダーゼ活性が全く検出されなかったのに対して、GαSE10K、GαSD229S、及びGαS10K+D229Sを発現している酵母株の何れかを発現しているR+株では、NECA濃度が増加するにつれて、増加する量のβ−ガラクトシダーゼ活性が検出され、増加したリガンド濃度への暴露に応じて検出されたβ−ガラクトシダーゼのユニットが用量依存的に増加することを示している。この用量依存性は、A2a受容体を発現している細胞だけに観察された。さらに、A2a受容体に対する最も強力なGαS構築物は、GαSE10Kであった。GαSD229S構築物は、A2a受容体に対して2番目に強力なGαS構築物であったのに対して、GαSE10K+D229S構築物は、容易に検出可能な量のβ−ガラクトシダーゼ活性を刺激したが、GαSE10K+D229S構築物は、テストした3つのGαS構築物の中で最も効力が弱かった。同定した本アッセイについてのさらなる記載については、「Functional Expression of Adenosine Receptors in Yease」と題され、1998年6月2日に出願された米国出願第09/088985号を参照されたい。この内容は全て、参照文献として本明細書に組み込まれる。
【0335】
ヒトアデノシン受容体サブタイプの薬理学的な特性決定
物質と方法
物質 [3H]−DPCPX[シクロペンチル−1,3−ヂプロピルキサンチン,8−[ジプロピル]−2,3−3H(N)](120.0Ci/mmol);[3H]−CGS21680、[カルボキシエチル−3H(N)](30Ci/mmol)、及び[125I]−AB−MECA([125I]−4−アミノベンジルベンジルー5’−N−メチルカルボキサミドアデノシン(2,200Ci/mmol)は、New England Nuclear(Boston,MA)から購入した。Research Biochemicals International(RBI,Natick,MA)からXAC(キサンチン アミン コンジェナー);NECA(5’−N−エチルカルボキサミドアデノシン);及びIB−MECA。アデノシンデアミナーゼと完全プロテアーゼインヒビターカクテルタブレットは、Boehringer Mannheim社(Indianapolis,IN)から購入した。ヒトアデノシン2a[RB−HA2a];アデノシン2b[RB−HA2b]、又はアデノシン3[RB−HA3]受容体サブタイプを安定に発現するHEK−293細胞からの膜は、それぞれ、Receptor Biology(Beltsville,MD)から購入した。細胞培養試薬は、Hyclone(Logan,UT)から入手した血清以外は、Life Technologies(Grand Island,NY)から入手した。
【0336】
酵母株.サッカロミセス・セレビシアエ CY12660株[far1*1442 tbt1−1 fus1−HIS3 can1 ste14::trp1::LYS2 ste3*1156 gpa1(41)−Gαi3 lys2 ura3 leu2 trp1:his3;LEU2 PGKp−Mfα1Leader−hA1R−PHO5term 2mu−orig REP3 Ampr]、及びCY8362株[gpa1p−rGαsE10K far1*1442 tbt1−1 fus1−HIS3 can1 ste14::trp1:LYS2 ste3*1156lys2 ura3 leu2 trp1 his3;LEU2 PGKp−hA2aR 2mu−ori REP3 Ampr]は、上述のように発育させた。
【0337】
酵母の培養 形質転換した酵母は、2%グルコースを補充したLeu−Trp[LT]培地(pH5.4)中で増殖させた。膜を調製するために、一晩培養物30mLから、1〜2×106細胞/mLの開始力価で、250mLのLT培地に播種し、回転による恒常的な酸素化状態下、30℃でインキュベートした。増殖から16時間後、細胞を遠心によって採集し、以下に記載されているように膜を調製した。
【0338】
哺乳類組織の培養 10%ウシ胎児血清と1×ペニシリン/ストレプトマイシンが補充されたダルベッコの最少必須培地(DMEM)中、500mg/mLのG418抗生物質を用いた選択的な圧力下、37℃、湿気を含んだ5%CO2雰囲気中で、ヒトアデノシン2a受容体サブタイプ(Cadusクローン#5)が安定に発現されたHEK−293細胞を増殖させた。
【0339】
酵母細胞膜の調製 一晩インキュベートした後、Sorvall RT6000遠心装置中、2,000×gでの遠心によって、250mLの培養物を採集した。氷冷した水で細胞を洗浄し、4℃で遠心し、プロテアーゼインヒビターカクテルタブレット(25mLの緩衝液につきタブレット1個)が補充された10mLの氷冷した溶解用緩衝液[5mM Tris−HCl、pH7.5;5mM EDTA;及び5mM EGTA]中に、沈降物を再懸濁した。該懸濁液に、ガラスビーズ(17g;Mesh 400〜600;Sigma)を添加し、4℃5分間の激しいボルテックス操作によって細胞を破壊した。プロテアーゼインヒビターを加えた30mLのさらなる溶解用緩衝液でホモジネートを希釈し、3000×gで、5分間遠心した。続いて、36,000×g(Sorvall RC5B,タイプSS34ローター)で45分間、膜を沈降させた。プロテアーゼインヒビターカクテルタブレット(緩衝液50mL当たり1タブレット)を補充した5mLの膜緩衝液[50mM Tris−HCl、pH7.5;0.6mM EDTA;及び5mM MgCl2]中に、得られた膜沈降物を再懸濁し、さらなる実験のために−80℃で保存した。
【0340】
哺乳類の細胞膜の調製 HEK−293細胞膜は、以前記載したように調製した(Duzic E et al.:J.Biol.Chem.,267,9844−9851,1992)。簡潔に述べれば、PBSで細胞を洗浄し、ラバーポリスマンで採集した。Sorvall RT6000遠心機中、4℃、200×gで、細胞を沈降させた。5mL/ディッシュの溶解用緩衝液(5mM Tris−HCl、pH7.5;5mM EDTA;5mM EGTA;0.1mM フェニルメチルスルホニルフルオライド;10mg/mL ペプスタチンA;及び10mg/mL アプロチニン)中に4℃で懸濁物を再懸濁し、Dounceホモゲナイザーでホモゲナイズした。続いて、36,000×g(Sorvall RC5B、タイプSS34ローター)で45分間、細胞溶解物を遠心し、5mLの膜緩衝液[50mM Tris−HCl、pH7.5;0.6mM EDTA;5mM MgCl2;0.1mM フェニルメチルスルホニルフルオライド;10mg/mL ペプスタチンA;及び10mg/mL アプロチニン]の中に沈降物を再懸濁し、さらなる実験のために−80℃で保存した。
【0341】
酵母と哺乳類の膜中に存在する全タンパク質濃度を決定するために、ブラッドフォードの色素結合操作(Bradford,M.:Anal.Biochem.72:248(1976))を基礎としたBio−Radタンパク質アッセイキットを使用した。
【0342】
アデノシン1受容体サブタイプ飽和及び拮抗放射性リガンドの結合
ヒトA1受容体サブタイプで形質転換した酵母細胞からの膜上での飽和及び拮抗結合は、放射性リガンドとしてアンタゴニスト[3H]DPCPXを用いて実施した。膜は、1.0mg/mLの濃度で、結合用緩衝液[10mM MgCl2;1.0mM EDTA;0.25% BSA;2U/mL アデノシン デアミナーゼ、及びプロテアーゼインヒビターカクテルタブレット1個/50mL]を含有する50mM Tris−HCl、pH7.4中に希釈した。飽和結合では、徐々に増加する濃度の[3H]DPCPX(0.05〜25nM)とともに、最終容量100μLの結合用緩衝液の中、25℃で1時間、96ウェルマイクロタイタープレート中で、10μMの未標識XACの不存在下及び存在下において、膜(50μg/ウェル)をインキュベートした。
【0343】
拮抗結合では、96ウェルのマイクロタイタープレート中で、10μMの未標識XAC又は徐々に増加する濃度の拮抗化合物の不存在下及び存在下において、[3H]DPCPX(1.0nM)とともに、最終容量100mLの結合用緩衝液の中、25℃で1時間、膜(50μL/ウェル)をインキュベートした。
【0344】
アデノシン2a受容体サブタイプ拮抗放射性結合
ヒトA2a受容体サブタイプを安定に発現しているHEK293細胞からの膜上への拮抗結合は、放射性リガンドとしてアゴニスト[3H]CGS−21680を用いて実施した。膜は、結合用緩衝液[10mM MgCl2;1.0mM EDTA;0.25% BSA;2U/mL アデノシンデアミナーゼ、及びプロテアーゼインヒビターカクテルブレット1個/50mLを含有する50mM Tris−HCl、pH7.4]中に、0.2mg/mLの濃度で希釈した。96ウェルのマイクロタイタープレート中で、50μMの未標識NECA又は徐々に増加する濃度の拮抗化合物の不存在下及び存在下において、[3H]CGS−21680(100nM)とともに、最終容量100mLの結合用緩衝液の中で、25℃で1時間、膜(10μg/ウェル)をインキュベートした。
【0345】
アデノシン3受容体拮抗放射性リガンド結合
ヒトA3受容体サブタイプを安定に発現しているHEK293細胞から得た膜上での拮抗結合は、放射性リガンドとしてアゴニスト[125I]AB−MECAを用いて行った。結合用緩衝液[10mM MgCl2;1.0mM EDTA;0.25% BSA;2U/mL アデノシンデアミナーゼ、及びプロテアーゼインヒビターカクテルブレット1個/50mLを含有する50mM Tris−HCl、pH7.4]中に、0.2mg/mLの濃度で希釈した。96ウェルのマイクロタイタープレート中で、10μMの未標識IB−MECA又は徐々に増加する濃度の拮抗化合物の不存在下及び存在下において、[125I]AB−MECA(0.75nM)とともに、最終容量100μLの結合用緩衝液の中で、25℃で1時間、膜(10μg/ウェル)をインキュベートした。
【0346】
インキュベーションの終わりに、10mM MgCl2が補充された氷冷した50mM Tris−HCl(pH7.4)緩衝液を添加することによって、A1、A2a、及びA3受容体サブタイプ放射性リガンド結合アッセイを停止させた後、Filtermate196細胞採集装置(Packard)中において、予め0.5%ポリエチレンイミンに前もって浸したガラス繊維フィルター(96ウェルGF/B UniFilters,Packard)上での迅速な濾過を行った。50μL/ウェルのシンチレーション液(MicroScint−20、Packard)で、フィルタープレートを乾燥コートし、TopCount(Packard)中でカウントした。アッセイは、3回反復して行った。非特異的な結合は、それぞれ、A1R、A2aR、及びA3R結合アッセイにおける総結合の5.6±0.5%、10.8±1.4%、及び15.1±2.6%であった。
【0347】
アデノシン2b受容体サブタイプ拮抗放射性リガンド結合
ヒトA2b受容体サブタイプを安定に発現しているHEK293細胞から得た膜上での拮抗結合は、放射性リガンドとしてA1受容体アンタゴニスト[3H]DPCPXを用いて行った。結合用緩衝液[1.0mM EDTA;0.1mM ベンズアミジン;2U/mL アデノシンデアミナーゼを含有する10mM Hepes−KOH、pH7.4]中に、0.3mg/mLの濃度で膜を希釈した。96ウェルのマイクロタイタープレート中で、10μMの未標識XAC又は徐々に増加する濃度の拮抗化合物の不存在下及び存在下において、[3H]DPCPX(15nM)とともに、最終容量100μLの結合用緩衝液の中、25℃で1時間、膜(15μg/ウェル)をインキュベートした。
【0348】
インキュベーションの終わりに、氷冷した10mM Hepes−KOH(pH7.4)緩衝液を添加することによって、アッセイを停止させた後、Filtermate196細胞採集装置(Packard)中において、予め0.5%ポリエチレンイミンに前もって浸したガラス繊維フィルター(96ウェルGF/C UniFilters,Packard)上での迅速な濾過を行った。50μL/ウェルのシンチレーション液(MicroScint−20、Packard)で、フィルタープレートを乾燥コートし、TopCount(Packard)中でカウントした。アッセイは、3回反復して行った。非特異的な結合は、総結合の14.3±2.3%であった。
【0349】
「3H」DPCPX;[3H]CGS−21680;[125I]AB−MECAの特異的結合は、総結合と非特異的結合との差と定義した。化合物のパーセント阻害は、総結合に対して算出した。拮抗データは、一部位モデルへの反復曲線フィッティングによって分析し、Ki値は、GraphPad Prizm 2.01ソフトウェアを用いて、IC50値(Cheng and Prusof, Biochem.Pharmacol.22,3099−3109,1973)から算出した。
【0350】
結果
ある種の細胞表面受容体の第一次的な機能は、適切なリガンドを認識することである。従って、我々は、酵母に発現されたアデノシン1受容体サブタイプの機能的な完全性を確定するためにリガンド結合の親和性を決定した。ヒトアデノシン1受容体サブタイプ構築物を形質転換したサッカロミセス・セレビシアエから調製した粗膜は、4.0±0.19nMのKdで、[3H]DPCPXの特異的な飽和性結合を示した。Kd及びBmax値は、飽和等温式から算出し、データのキャッチャード転換は、単一クラスの結合部位を示した。酵母膜調製物中のアデノシン結合部位の密度は、716.8±43.4fmol/mg膜タンパク質と概算された。ヒトA1受容体サブタイプで形質転換された組換え酵母細胞の薬理学的なサブタイプ特性は、サブタイプ選択的なアデノシンリガンド(XAC、DPCPX;CGS−15943;CDS−046142;CDS−046123;NECA,(R)―PIA;IB−MECA、及びアロキサジン)を用いて調べた。それは、予想されたランクの順番で[3H]DPCPXと拮抗した。これらの化合物を用いて記録された置換曲線は、全てのリガンドと典型的な急峻さを示し、各リガンドに対するデータは、一部位フィットモデルに適合し得た。曲線から概算された各化合物に対する見かけの解離定数(表5)は、他の採取源から得られた受容体に対して公表された値と一致している。
【0351】
【表5】
表6から12は、本発明のデアザプリンの効力と構造活性プロフィールを実証している。表13と14は、デアザプリン構造付近の官能性をモジュレートすることによって、ヒトアデノシン受容体部位に対して選択性が達成され得ることを実証している。表14も、そこに示された化合物がサブnMの活性を有しており、表13の化合物と比較してA2b受容体に対する選択性がより高いという驚くべき発見を実証している。
【0352】
表6:CDS-046142シリーズの活性:N6−置換基の効果
【0353】
【表6−1】
【0354】
【表6−2】
表7:CDS-046142シリーズの活性:C2−置換基の効果
【表7】
表8:CDS-046142シリーズの活性:ピロール環置換基の効果
【表8】
表9:
【表9】
表10:CDS-046123シリーズの活性:N6−置換基の効果
【0355】
【表10−1】
【0356】
【表10−2】
表11:CDS-046123シリーズの活性:N6−置換基の効果
【0357】
【表11−1】
【0358】
【表11−2】
表12:CDS-046123の「レトロ−アミド」類縁体
【表12】
表13:選択的なアデノシン拮抗剤のプロファイル
【0359】
【表13−1】
【0360】
【表13−2】
【0361】
【表13−3】
【0362】
【表13−4】
表14:選択的なA2b拮抗剤のプロファイル
【表14】
本明細書の一部をなす参照文献としての援用
ここで開示した全ての特許、公開された特許出願及び他の参照文献は、明らかに本明細書の一部をなす残照文献として本願に援用する。
【0363】
均等物
当業者は、ここに明確に記載される本発明の特定の態様に対する多くの均等物に関して、ルーチンな実験を用いるだけで、理解し、確認することができるであろう。そのような均等物は、上記の特許請求の範囲内に包含されるものである。
Claims (34)
- R3が無置換又は置換のフェニルであり、R5及びR6が、それぞれアルキルである請求項1に記載のデアザプリン。
- R2が少なくとも1つの水酸基で置換されている請求項2に記載のデアザプリン。
- R2がモノヒドロキシシクロペンチルである請求項3に記載のデアザプリン。
- R2がモノヒドロキシシクロヘキシルである請求項3に記載のデアザプリン。
- R2が、−NH−C(=O)E(ここで、Eは置換又は無置換のC1−C4アルキルである)で置換されている請求項2に記載のデアザプリン。
- Eがアルキルアミンである請求項6に記載のデアザプリン。
- Eが、エチルアミンである請求項7に記載のデアザプリン。
- 前記複素環が、アミンで置換されている請求項1に記載のデアザプリン。
- 前記複素環が、アセトアミドで置換されている請求項1に記載のデアザプリン。
- 以下からなる群より選択される化合物または薬学的に許容可能なそれらの塩:
4−(シス−3−ヒドロキシシクロペンチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン;
4−(シス−3−(2−アミノアセトキシ)シクロペンチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジンのトリフルオロ酢酸塩
4−(3−アセトアミド)ピペリジニル−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン;
4−(2−N’−メチルウレアプロピル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン;
4−(2−アセトアミドブチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン;
4−(2−N’−メチルウレアブチル)アミノ−5,6−ジメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン;
4−(2−アミノシクロプロピルアセトアミドエチル)アミノ−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン;
4−(トランス−4−ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ−2−(3−クロロフェニル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン;
4−(トランス−4−ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ−2−(3−フルオロフェニル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン;および
4−(トランス−4−ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ−2−(4−ピリジル)−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。 - 以下からなる群より選択される化合物またはその薬学的に許容可能な塩:
4−(2−アセチルアミノエチル)アミノ−6−フェノキシメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン;
4−(2−アセチルアミノエチル)アミノ−6−(4−フルオロフェノキシ)メチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン;
4−(2−アセチルアミノエチル)アミノ−6−(4−クロロフェノキシ)メチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン;
4−(2−アセチルアミノエチル)アミノ−6−(4−メトキシフェノキシ)メチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン;
4−(2−アセチルアミノエチル)アミノ−6−(4−ピリジルオキシ)メチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。
4−(2−アセチルアミノエチル)アミノ−6−(N−フェニルアミノ)メチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン;
4−(2−アセチルアミノエチル)アミノ−6−(N−メチル−N−フェニルアミノ)メチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン;および
4−(2−N’−メチルウレアエチル)アミノ−6−フェノキシメチル−2−フェニル−7H−ピロロ[2,3d]ピリミジン。 - 請求項11〜25のいずれか1項に記載のデアザプリンの治療的に有効な量および薬学的に許容可能なキャリアを含んでなる薬剤組成物。
- 呼吸疾患又は胃腸疾患の治療において使用するための、請求項26に記載の薬剤組成物。
- 前記胃腸疾患が下痢である請求項27に記載の薬剤組成物。
- 前記呼吸疾患が、ぜん息、アレルギー性鼻炎、又は慢性閉塞性肺疾患である請求項27に記載の薬剤組成物。
- 前記薬剤組成物が、眼用製剤である請求項26に記載の薬剤組成物。
- 前記薬剤組成物が、眼周囲用注射製剤、眼球後用注射製剤、又は眼内用注射製剤である請求項30に記載の薬剤組成物。
- 前記薬剤組成物が、全身用製剤である請求項30に記載の薬剤組成物。
- 前記薬剤組成物が、外科用灌注溶液である請求項30に記載の薬剤組成物。
- 治療学的に有効な量の少なくとも1つの請求項11〜25の何れか1項に記載のデアザプリンを収容している容器、及び哺乳類における前記N−6置換の7−デアザプリン敏感性状態の治療のための前記デアザプリンの使用に関する説明書を含む、哺乳類におけるN−6置換の7−デアザプリン敏感性状態の治療のための包装された薬剤組成物。
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